Hitte-inactivatie van pathogenen bij het bereiden van vlees

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2012 – 2013

Hitte-inactivatie van pathogenen bij het bereiden van vlees

Elien De Boeck Promotor: Prof. dr. ir. Mieke Uyttendaele Tutor: MSc. Evy Lahou

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: Levensmiddelenwetenschappen en voeding

TOESTEMMING TOT BRUIKLEEN De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van auteursrecht, in bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie. The author and promotor give permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more specifically the source must be extensively specified when using from this thesis. Gent, juni 2013

Promotor:

Tutor:

Auteur:

Prof. dr. ir. Mieke Uyttendaele

MSc. Evy Lahou

Elien De Boeck

WOORD VOORAF Deze masterproef kwam tot stand in het kader van het behalen van de graad van Master in de bioingenieurswetenschappen: Levensmiddelenwetenschappen en voeding. Vijf jaar geleden had ik nooit gedacht dat dit moment zo snel zou aanbreken. Het indienen van mijn masterproef, de kers op de taart na vijf jaar hard werken. Dit is dan ook het uitgelezen moment om de mensen te bedanken die mij de voorbije jaren tot steun zijn geweest en ook de personen die mij geholpen hebben om deze masterthesis tot een goed einde te brengen. Vooreerst wil ik mijn promotor Prof. dr. ir. Mieke Uyttendaele en mijn tutor MSc. Evy Lahou bedanken. Zij stonden steeds klaar om mijn vragen te beantwoorden en maakten tijd vrij om dit werk in goede banen te leiden. Verder gaat mijn dank ook uit naar Elien Verguldt en MSc. Xiang Wang, die me hebben bijgestaan tijdens de labexperimenten en waarmee ik veel plezier heb beleefd. Tenslotte zou ik ook mijn ouders, mijn vriend en mijn zus willen bedanken voor hun hulp en steun gedurende de vijf afgelopen jaren. Zonder hen zou ik deze studies nooit tot een goed einde kunnen gebracht hebben. Ook mijn vrienden ben ik zeer dankbaar voor de onvergetelijke momenten die zij mij hebben bezorgd.

Gent, juni 2013 Elien De Boeck

Inhoud 1.Inleiding...............................................................................................................................................5 2. Literatuurstudie ..................................................................................................................................6 2.1.Voedselinfectanten: ‘The Big Four’ ..............................................................................................6 2.1.1.Salmonella spp. .....................................................................................................................6 2.1.2.Campylobacter jejuni/coli ......................................................................................................6 2.1.3.Listeria monocytogenes .........................................................................................................6 2.1.4.Escherichia coli O157 .............................................................................................................7 2.2.Hygiëne indicatoren .....................................................................................................................7 2.2.1.Enterobacteriaceae, coliformen, fecale coliformen en Escherichia coli ................................7 2.3. Belang van ‘the Big Four’ .............................................................................................................8 2.3.1. Ziektegevallen en uitbraken .................................................................................................8 2.3.2. Associatie met vlees en vleesproducten bedoeld voor consumptie na bereiding ................9 2.3.3. Locatie en omstandigheden van uitbraken.........................................................................11 2.4.Consumentengedrag en invloed op de microbiologische voedselveiligheid ..............................11 2.4.1. Consumenten trends ..........................................................................................................11 2.4.2. Kennis en uitvoering van goede hygiëne praktijken bij voedselbereiding ..........................12 2.5.Hitte-inactivatie ..........................................................................................................................15 2.5.1.Mechanisme van hitte-inactivatie .......................................................................................15 2.5.2.Factoren die de hitte resistentie van micro-organismen beïnvloeden ................................16 2.5.3. D-waarden ..........................................................................................................................19 2.6. Recente studies en proefopzetten voor hitte-inactivatie experimenten ...................................21 2.7.Belang van het onderzoek ..........................................................................................................22 3. Materiaal en methode ......................................................................................................................22 3.1.Keuze van de stammen ..............................................................................................................22 3.2.Aanmaak stockcultuur ................................................................................................................24 3.3.Aanmaak werkcultuur ................................................................................................................24 3.4.Gebruikte selectieve media ........................................................................................................25 3.5.Afdoding van bacteriën in bouillon ............................................................................................26 3.5.1. Onverdunde cultuur ...........................................................................................................26 3.5.2.Verdunde cultuur ................................................................................................................27 3.5.3.Verdunde cultuur en aangepaste bouillon ..........................................................................28 3.5.4.Telling van de resultaten via de spiraalenter .......................................................................28 3.6. Fitting via GInaFiT en vergelijking D-waarden ...........................................................................29

3.7.Afdoding van bacteriën op vlees ................................................................................................31 3.7.1.Aankoop varkensvlees .........................................................................................................31 3.7.2.Beënten van het vlees .........................................................................................................31 3.7.3.Bakken van het vlees ...........................................................................................................31 3.7.4.Temperatuurmeting ............................................................................................................32 3.7.5.Telling ..................................................................................................................................32 3.7.6. Aanrijking en detectie .........................................................................................................32 3.7.7. Bewaring van de gebakken burger in de koelkast ..............................................................33 3.7.8. Berekening pasteurisatie waarden .....................................................................................34 4.Resultaten .........................................................................................................................................34 4.1.Karakterisatie bouillon en vlees .................................................................................................34 4.2.Afdoding van onverdunde werkcultuur in bouillon ....................................................................35 4.3.Afdoding van verdunde werkcultuur in onaangepaste en aangepaste bouillon ........................39 4.4.Afdoding van bacteriën in vlees .................................................................................................45 5.Discussie ............................................................................................................................................49 5.1.Tailing effect en mogelijke oorzaken ..........................................................................................49 5.2.De safe harbour en D-waarden ..................................................................................................50 5.3.Effect van verlaagde pH en verhoogd NaCl gehalte ...................................................................52 5.4.Effect van de verhitting van vlees ...............................................................................................53 5.5.Betekenis van de resultaten voor consument en horeca ...........................................................56 6.Algemene conclusie ..........................................................................................................................58 7.Suggesties voor verder onderzoek ....................................................................................................60 8.Referentielijst ....................................................................................................................................61 9.Bijlagen..............................................................................................................................................69 Bijlage 1: Patroon spiraalenter (IUL instruments) ............................................................................69 Bijlage 2: Protocol Vidas ...................................................................................................................70 Bijlage 3 : Protocol GeneDisc ............................................................................................................71 Bijlage 4: Ruwe data van het onverdund inoculum experiment (bouillon) ......................................72 Bijlage 5: Fitting bifasisch model via GInaFiT (onverdund inoculum) ...............................................77 Bijlage 6: Ruwe data verdund inoculum experiment in normale bouillon ........................................82 Bijlage 7: Ruwe data verdund inoculum in aangepaste bouillon ......................................................85 Bijlage 8: Fitting bifasisch model verdund inoculum in normale en aangepaste bouillon ................88

LIJST VAN AFKORTINGEN ACMSF:

Advisory Committee on the Microbiological Safety of Food

A/EEC:

Attaching en Effacing E.coli

ALOA:

Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti

BB:

Bolton Broth

BHI:

Brain Heart Infusion

CODA:

Centrum voor Onderzoek in Diergeneeskunde en Agrochemie

DS:

Droge Stof

EAggEC:

Entero-Aggregatieve E.coli

ECDC:

European Centre for Disease Prevention and Control

E. coli:

Escherichia coli

EFSA:

European Food Safety Authority

EHEC:

Enterohemorragische E.coli

EIEC:

Entero-Invasieve E.coli

EPEC:

EnteroPathogene E.coli

ETEC:

EnteroToxigene E.coli

FAVV:

Federaal Agentschap voor de Veiligheid in de Voedselketen

HUS:

Hemolytisch Uremisch Syndroom

ICMSF:

International Commission on Microbiological Specifications for Foods

Kve:

Kolonievormende eenheden

LFMFP:

Laboratory of Food Microbiology and Food Preservation

PCA:

Plate Count Agar

PPS:

Pepton fysiologische zoutoplossing

REC:

RAPID’E.coli 2 Medium

SPSS:

Statistics Package for the Social Sciences

STEC:

Shiga-toxine-producerende E.coli

TSA:

Tryptone Soya Agar

1

TSB:

Tryptic Soy Broth

VTEC:

Verotoxine-producerende E.coli

WHO:

World Health Organisation

w/w:

Gewichtspercent

XLD:

Xylose-Lysine-Desoxycholate Agar

YOPI:

Young, Old, Pregnant, Immunosuppressed

2

SAMENVATTING Dit onderzoek is een eerste onderdeel van het project Pathogencook, dat werd opgestart in samenwerking met de Federale Overheidsdienst Volksgezondheid, Veiligheid van de Voedselketen en Leefmilieu (FOD VVL), om de hitte-inactivatie van pathogene kiemen bij de bereiding van voedsel via diverse kooktechnieken te onderzoeken. In een eerste luik wordt de hitteresistentie van ‘the Big Four’ (Campylobacter jejuni, Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp. en Listeria monocytogenes) in bouillon (Brain Heart Infusion of Bolton Broth) onderzocht, aangezien soortgelijke studies dateren van de jaren 1980-1990. Verschillende stammen worden verhit bij 60°C en 65°C (65°C en 70°C voor Listeria monocytogenes) in een warmwaterbad, waarna afdodingscurven worden opgesteld. De bekomen curven vertonen eerder een bifasisch verloop dan een loglineair verloop. Dit werd vastgesteld voor alle stammen van alle micro-organismen, waardoor de variabiliteit tussen stammen dus beperkt blijkt te zijn. De bifasische curve kan duiden op de aanwezigheid van een meer hitteresistente subpopulatie, die voor het onverdund inoculum experiment (initiële concentratie: 8 log kve/ml) gemiddeld 0,4% van de totale populatie uitmaakt en voor het verdund inoculum experiment (initiële concentratie: 5 log kve/ml) gemiddeld 0,02%. De D-waarden (bekomen via GInaFiT) voor de minder hitteresistente populatie komen vrij goed overeen met gepubliceerde D-waarden. Uit een statistische vergelijking van deze Dwaarden tussen de micro-organismen komt enkel naar voor dat Campylobacter jejuni bij 60°C gevoeliger is voor hitte dan Salmonella spp. en E. coli O157:H7. De safe harbour ‘2 minuten 70°C’ kan geen 6 log reductie in Listeria monocytogenes cellen verwezenlijken, omwille van de aanwezigheid van de hitteresistente subgroep. Na deze 2 minuten verhitting wordt in het onverdund inoculum experiment slechts een 2,5 à 3 log reductie bekomen. De aanpassing van de bouillon (pH 5,6 en 1,5 % NaCl) heeft weinig tot geen effect op de afdoding van de micro-organismen. Echter, voor E. coli O157:H7 bij 60°C wordt de schouder, die reeds aanwezig was in de normale bouillon, aanzienlijk verlengd (1,14-1,24 minuten versus 1,93-2,58 minuten) en voor E. coli als hygiëne indicator wordt in aangepaste bouillon wel een schouder waargenomen (0,82-1,91 minuten), terwijl dit in normale bouillon niet het geval was. Bovendien verloopt de helling van het eerste loglineair gedeelte van de afdodingscurve van E. coli O157:H7 veel minder steil dan in het normale bouillon experiment. De aangepaste bouillon zorgt dus voor een verhoogde hitteresistentie voor E. coli O157:H7, E. coli en enkele stammen van Salmonella spp. Het is mogelijk dat door het toevoegen van NaCl de optimale pH range voor overleving van deze micro-organismen wordt verschoven naar lagere waarden. In een tweede luik wordt de inactivatie van ‘the Big Four’ op varkensvlees (pitavlees, mignonettes en hamburger) nagegaan bij het bakken in de pan. Tijdens het bakken van het pitavlees worden zeer hoge temperaturen (>90°C) bereikt en wordt de safe harbour ‘P70=2 minuten’ dus steeds ruimschoots gehaald. Toch worden hier nog af en toe Listeria monocytogenes cellen gedetecteerd. Na het bakken van de mignonette (10,5 minuten) wordt de P70=2 minuten in de kern in geen enkele herhaling bereikt. Hier is dit minder van belang, aangezien de temperaturen aan het oppervlak snel stijgen tot boven 100°C, waardoor de P70=2 minuten aan het oppervlak dus vrij snel wordt gehaald. Toch wordt hier in één van de aanrijkingen nog Salmonella spp. gedetecteerd. Wat betreft de burger, wordt Listeria monocytogenes bij elke herhaling telbaar teruggevonden na het bakken, ook Campylobacter jejuni kan na elke herhaling gedetecteerd worden (één maal telbaar). E. coli O157:H7 en Salmonella

3

spp. worden in twee van de drie herhalingen nog gedetecteerd na het bakken. In één van de herhalingen kan E. coli O157:H7 zelfs geteld worden. De beduidend betere overleving van de microorganismen in de burger kan verklaard worden doordat de micro-organismen ook in de kern van de burger aanwezig zijn. Toch blijven deze resultaten vrij merkwaardig aangezien de P70 van 2 minuten in twee van de drie gevallen reeds wordt overschreden na de 9 minuten baktijd, en in alle herhalingen na 5 minuten nagaren op het bord. Een herziening van de safe harbour ‘2 minuten 70°C’ is dus aan te raden, aangezien dit niet voldoende blijkt te zijn om veilig voedsel te garanderen, zeker ingeval van sterk gemanipuleerde vleesbereidingen zoals hamburgers.

4

1.Inleiding Dit onderzoek kadert in het project Pathogencook, dat werd opgestart in samenwerking met de Federale Overheidsdienst Volksgezondheid, Veiligheid van de Voedselketen en Leefmilieu (FOD VVL). Binnen dit project is het de bedoeling om de hitte-inactivatie van pathogene kiemen bij de bereiding van voedsel via diverse kooktechnieken te onderzoeken. In deze masterproef wordt een eerste deel van dit project behandeld, namelijk het uitvoeren van een validatie van gepubliceerde D-waarden voor ‘the Big Four’ (Campylobacter jejuni, Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes en Salmonella spp.) en het nagaan van de hitte-inactivatie van deze pathogenen in verschillende varkensvleesbereidingen door het bakken in de pan. Vers vlees is nog af en toe besmet met pathogene kiemen als Campylobacter jejuni, Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes en Salmonella spp. De hittebehandeling van dit vers vlees bij de consument thuis en in de horeca is dus van groot belang om voldoende afdoding van deze pathogenen te verwezenlijken. Het onderzoek naar de hitteresistentie en D-waarden van deze pathogene kiemen dateert echter vaak van de jaren 1980-1990. Als startpunt van deze thesis worden hitte-inactivatie experimenten in bouillon uitgevoerd, waarbij de bekomen D-waarden voor Salmonella spp., Campylobacter jejuni, E.coli O157:H7, Listeria monocytogenes en E.coli als hygiëne indicator zullen vergeleken worden met deze uit de literatuur. Na de experimenten in bouillon wordt de overstap gemaakt naar de hitte-inactivatie van deze microorganismen op een vleesmatrix, meer bepaald op varkensvlees. Pitavlees, mignonettes en varkensgehakt worden geïnoculeerd met een bacteriemix (Salmonella spp., Campylobacter jejuni, E.coli O157:H7, Listeria monocytogenes en E.coli) en vervolgens wordt de inactivatie nagegaan via bakken in de pan, net zoals dit door de consument thuis wordt uitgevoerd. Op basis van het temperatuursprofiel in de kern van het vlees zal de P70 -waarde berekend worden van elk bakproces, die dan zal vergeleken worden met het alom aanvaarde barema van ‘2 minuten 70°C’. Op basis van deze experimenten kan meer inzicht verkregen worden in de hitte-inactivatie van pathogene micro-organismen en kan de variabiliteit nagegaan worden ten gevolge van type stam, type verhittingsmedium en type vleesbereiding. Zo wordt het ook mogelijk om richtlijnen naar de horeca en naar de consument toe te formuleren.

5

2. Literatuurstudie 2.1.Voedselinfectanten: ‘The Big Four’ Als belangrijkste voedselinfectanten in West-Europa worden Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Campylobacter jejuni/coli en Escherichia coli O157:H7 genoemd. De voedselinfectie resulteert uit de opname van een infectueus pathogeen micro-organisme via voedsel. Dit in tegenstelling tot de voedselintoxicatie, waarbij de opname en werking van microbiële toxines in het gastro-intestinaal stelsel verantwoordelijk zijn. Voedselinfecties worden over het algemeen gekenmerkt door een lagere infectueuze dosis (10-106 kve) dan een voedselintoxicatie (meer dan 105 kve/g) en door een korte incubatieduur van enkele dagen. Meestal zal er bij een voedselinfectie ook koorts optreden (Devlieghere et al., 2011). 2.1.1.Salmonella spp. Salmonella spp. is een Gram-negatief beweeglijk staafje uit de familie van de Enterobacteriaceae. Reeds sinds 1930 eist deze pathogeen onze aandacht op (Uyttendaele, 2012). Deze typische darmbacterie wordt geassocieerd met heel wat producten, mede door het groot aantal bestaande serotypes. Zo komt dit organisme vaak voor in eieren en zuivelproducten, bakkerijproducten, vers vlees, gevogelte en schelpdieren (Devlieghere et al., 2011). Zelfs in chocolade en confiserie werd Salmonella spp. ondanks de lage aw reeds gerapporteerd (Komitopoulou and Penaloza, 2009;Mattick et al., 2001;Aljarallah and Adam, 2007). Verder werd Salmonella spp. ook teruggevonden in groenten en fruit via besmet irrigatiewater (Uyttendaele, 2012;Jacobson and Bech, 2012). De infectueuze dosis van Salmonella spp. bedraagt 10-104 kve. Vooral kinderen en ouderen zijn kwetsbaar voor salmonellose. Deze infectie kan leiden tot gastro-enteritis en eventueel hospitalisatie (Uyttendaele, 2012). 2.1.2.Campylobacter jejuni/coli Dit beweeglijk spiril is micro-aerofiel en wordt voornamelijk geassocieerd met gevogeltevlees. Het is dan ook een typische darmbacterie in pluimvee. Ook consumptie van rauwe melk en zwemmen in besmet water kan campylobacteriose veroorzaken (Park, 2002). Het merendeel (30-40%) van de humane campylobaceriose gevallen is echter te wijten aan kruiscontaminatie of onderverhitting van gevogeltevlees (Devlieghere et al., 2011;Keener et al., 2004;Park, 2002). In de literatuur wordt voor dit opkomend pathogeen een infectueuze dosis beschreven van 800-106 organismen om in 10%-50% van de personen ziekte te veroorzaken (Allos, 2001).Teunis et al. (2005) echter beweren dat hun aangepast dosis respons model bij lage dosissen een hogere kans op infectie weergeeft dan voorheen werd gerapporteerd. Het zijn vooral kinderen en jong volwassenen die getroffen worden door campylobacteriose. Deze ziekte uit zich in gastro-enteritis en is niet zo ernstig. Soms kunnen er echter complicaties optreden zoals het Guillain-Barré syndroom (Devlieghere et al., 2011;Uyttendaele, 2012;Keener et al., 2004). 2.1.3.Listeria monocytogenes Deze Gram-positieve bacterie is vrij resistent t.o.v. ongunstige omgevingsfactoren. Typisch voor Listeria monocytogenes is zijn psychrotroof of koudetolerant karakter. Listeriose wordt gekenmerkt door koorts en spierpijn en eventueel misselijkheid en diarree. Bij de YOPI-groep (jongeren, ouderen, zwangere vrouwen en immuun-gesupprimeerden) kan infectie leiden tot meningitis en spontane abortus. Door onder andere de vergrijzing stijgt deze YOPI-groep in aantal, waardoor de risicogroep voor listeriose dus vergroot. Sinds 1980 wordt dit organisme als belangrijk voedselgebonden

6

pathogeen beschouwd (Uyttendaele, 2012;ILSI, 2005). Over de infectueuze dosis heerst nog onzekerheid (McLaughlin et al., 2004). Men vermoedt wel dat er meer dan 100 levensvatbare cellen zouden nodig zijn (ICMSF, 1996). Als risicoproducten worden voornamelijk verduurzaamde producten vermeld met een verlengde houdbaarheid in de koeling, bijvoorbeeld rauwmelkse kazen, versneden voorverpakte vleeswaren, sandwichspreads… Ook met verse levensmiddelen zoals vlees, vis en groenten met een korte houdbaarheid (maximum 5 dagen) wordt Listeria monocytogenes nu en dan geassocieerd (Devlieghere et al., 2011;ILSI, 2005). 2.1.4.Escherichia coli O157 Escherichia coli is een normale darmbewoner bij mens en dier en deze micro-organismen zijn dus niet allemaal ziekteverwekkend. Er worden echter verschillende groepen pathogene E. coli onderscheiden naargelang hun virulentiefactoren en/of symptomen. Zo onderscheidt men EnteroPathogene E. coli (EPEC), Attaching en Effacing E. coli (A/EEC), EnteroToxigene E. coli (ETEC), Entero-Invasieve E. coli (EIEC), EnteroHemorragische E. coli (EHEC) en EnteroAggregatieve E.coli (EAggEC). Een E. coli die verotoxinegenen bezit of Shiga-like toxinegenen wordt VTEC (verotoxine producerend) of STEC (Shiga-like toxine producerend) genoemd. Indien deze VTEC of STEC bovendien ook drager is van een eae-gen (verantwoordelijk voor aanhechting aan de darmwand) en meestal ook van een hly-gen (codeert voor enterohemolysine), dan wordt van een enterohemorragische E.coli gesproken (EHEC) (Devlieghere et al., 2011). Dit micro-organisme veroorzaakt enterohemorragische colitis en kan vooral bij ouderen en kinderen leiden tot het hemolytisch uremisch syndroom (HUS) (WHO, 2013). De infectieuze dosis van VTEC zou tussen 1 en 100 cellen liggen (Stringer et al., 2000). In dit werk zal de hitte-inactivatie van E.coli O157:H7 bestudeerd worden aangezien dit serotype dominant blijkt te zijn als veroorzaker van bloederige diarree en HUS (Devlieghere et al., 2011).

2.2.Hygiëne indicatoren 2.2.1.Enterobacteriaceae, coliformen, fecale coliformen en Escherichia coli Aangezien het in het begin van de 19e eeuw niet steeds mogelijk was om pathogenen te detecteren, werden hygiëne indicatoren gebruikt. Indien een hygiëne indicator een bepaalde limiet overschrijdt, kan dit wijzen op onvoldoende hygiëne tijdens het productieproces. Pathogenen zijn vaak ook van fecale oorsprong, vandaar dat de aanwezigheid in grote aantallen van een hygiëne indicator, de kans op de aanwezigheid van een pathogeen vergroot. Als hygiëne indicatoren worden vooral de Enterobacteriaceae, de coliformen, de fecale coliformen en E. coli beschouwd. Enterobacteriaceae en coliformen zijn echter psychrotroof en kunnen dus groeien in de koeling. Er is dus geen één op één relatie tussen de telling van een monster net na het slachten en de telling van een monster in de distributie. Bovendien zijn de Enterobacteriaceae, de coliformen en de fecale coliformen niet noodzakelijk van fecale oorsprong. E. coli echter, is niet psychrotroof en vormt als typische darmbewoner van mens en dier een echte indicator van fecale oorsprong (Uyttendaele, 2012). In een advies van het Wetenschappelijk Comité van het FAVV (FAVV, 2001) wordt E. coli aangeraden als hygiëne indicator bij de bemonstering van karkassen in het slachthuis. Aangezien E. coli niet psychrotroof is, kan er zowel meteen na het slachten, als op een later moment in de koude keten bemonsterd worden om de hygiënische omstandigheden tijdens het slachtproces na te gaan. Om deze redenen werd in dit werk E.coli gebruikt als hygiëne indicator.

7

2.3. Belang van ‘the Big Four’ 2.3.1. Ziektegevallen en uitbraken Zoönoses worden gedefinieerd als “infecties en ziekten die natuurlijk overdraagbaar zijn, direct of indirect (bijvoorbeeld via gecontamineerde voeding), tussen mensen en dieren” (EFSA and ECDC, 2012). Elk jaar wordt informatie van de lidstaten van de Europese Unie in combinatie met informatie van de ECDC (European Center for Disease Prevention and Control) over zoönose gevallen in mensen geanalyseerd door EFSA (European Food Safety Authority) en de ECDC. Deze bevindingen worden telkens gepubliceerd in een rapport, namelijk in het “EU summary report on zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks“. In Tabel 1 worden de gerapporteerde notificatie rates van zoönoses van ‘the Big Four’ voor bevestigde humane gevallen in de EU weergegeven (per 100 000 populatie) en dit voor de vijf recentste rapporten (EFSA and ECDC, 2007;EFSA and ECDC, 2009;EFSA and ECDC, 2010;EFSA and ECDC, 2011;EFSA and ECDC, 2012). In Tabel 2 worden ook de uitbraakgegevens weergegeven voor deze ‘Big Four’ in de EU (van 2006 tot en met 2010). Tabel 1: Gerapporteerde notificatie rates van zoönoses voor bevestigde humane gevallen in de EU (gevallen per 100 000 populatie) voor 2006, 2007, 2008, 2009 en 2010.

Notificatie rate per 100 000 populatie Campylobacteriose Salmonellose VTEC Listeriose

2006 46,1 34,6 1,1 0,3

2007 45,2 31,1 1,6 0,3

2008 43,9 26,4 0,7 0,3

2009 45,6 23,7 0,75 0,36

2010 48,6 21,5 0,83 0,35

Tabel 2: Totaal aantal gerapporteerde voedselgebonden uitbraken en het aantal uitbraken geassocieerd met 'the Big Four' in de EU van 2006 tot en met 2010. (* Andere bacteriële oorzaken, in 2006 : Listeria; in 2007: Brucella, Francisella, Listeria en Shigella; in 2009: Brucella, Listeria, Shigella, Vibrio en Yersinia; in 2010: Brucella, Listeria, Shigella en Yersinia)

Totaal aantal uitbraken Salmonella spp. Campylobacter Pathogene E. coli Andere bacteriële oorzaken*

2006 5705 3131 400 48 9

Aantal uitbraken 2007 2008 5733 5332 2253 1888 465 488 65 75 41 20

2009 5550 1722 333 75 52

2010 5262 1604 470 31 64

Hierbij is het belangrijk om op te merken dat niet enkel het aantal gevallen een rol speelt in de significantie van een zoönose voor de volksgezondheid. Naast Salmonella spp. en Campylobacter jejuni/coli worden ook Listeria monocytogenes en VTEC genoemd bij ‘the Big Four’ omwille van de ernst van de ziekte, hoewel deze voorkomen met een lagere notificatie rate. Uit Tabel 1 blijkt dat de humane salmonellose gevallen een dalende trend vertonen. Deze daling zou te wijten zijn aan de Salmonella spp. controleprogramma’s op gevogelte, voornamelijk in leghennen. Toch blijft salmonellose na campylobacteriose de tweede meest gerapporteerde zoönotische humane ziekte in Europa. Salmonella spp. is jaar na jaar verantwoordelijk voor het merendeel van de

8

voedselgebonden uitbraken. Als oorzaken van de uitbraken worden meestal eieren, varkensvlees en gevogeltevlees vermeld. Reeds sinds 2005 is campylobacteriose de vaakst gerapporteerde menselijke zoönose in de EU. In verse kip en ander gevolgeltevlees werd Campylobacter spp. het meest gedetecteerd (EFSA and ECDC, 2012). Humane campylobacteriose wordt meestal niet gedetecteerd in uitbraken (Tabel 2), maar eerder als op zich staande gevallen (Uyttendaele, 2012;Keener et al., 2004;Park, 2002). Listeriose wordt voornamelijk via voedsel overgedragen. Hoewel deze zoönotische ziekte niet vaak voorkomt, zijn de gevolgen ernstig, vooral voor kwetsbare bevolkingsgroepen. 17 à 20,5 % van de bevestigde gevallen resulteerde in sterfte volgens de gegevens van 2006 tot en met 2010. Indien legale limieten worden overschreden, gaat het vooral om besmetting van RTE (ready-to-eat) visserijproducten, RTE producten van vlees origine en kazen (vooral zacht en halfzacht). Net zoals bij campylobacteriose, worden de listeriose gevallen niet echt gedetecteerd in uitbraken, maar eerder als op zich staande gevallen (Uyttendaele, 2012). Wat betreft bevestigde humane VTEC infecties werd er een stijging waargenomen vanaf 2008. Het hoogste risico voor de ontwikkeling van HUS door VTEC O157 ligt bij kinderen jonger dan vier jaar. Serotype O157:H7 werd het vaakst gerapporteerd. Een kritische interpretatie is echter nodig, aangezien verschillende onderzoeken niet direct kunnen vergeleken worden door verschillen in staalname strategieën en analytische methoden. Ook hier worden voornamelijk op zich staande gevallen gerapporteerd. Uitbraken van VTEC komen weinig voor (Health protection Agency, 2012). In 2010 werden er in totaal 31 uitbraken gemeld, waaronder 2 uitbraken met sterk bewijs. Beide uitbraken vonden plaats in huiselijke setting of in de horeca (EFSA and ECDC, 2012). Bij deze gegevens moet steeds rekening gehouden worden met onderrapportering, vooral indien er zich geen ernstige symptomen voordoen, waardoor het aantal gevallen steeds wordt onderschat. 2.3.2. Associatie met vlees en vleesproducten bedoeld voor consumptie na bereiding Het Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen (FAVV) voert in België jaarlijks microbiologische controles uit op monster uit de volledige voedselketen, waarbij o.a. Salmonella spp., Campylobacter spp., Listeria monocytogenes, pathogene E.coli en E. coli als hygiëne indicator worden opgespoord. In Tabel 3 worden de resultaten weergegeven van de monitoring van rund-, varkens- en pluimveekarkassen in slachthuizen uit het jaarverslag van het FAVV van 2011 (FAVV, 2012). In Tabel 4 worden ook het aantal analyses en het percentage van de monsters conform met de wetgeving weergegeven voor de analyses in de uitsnijderijen. Tabel 3: Gegevens (aantal analyses en percentage van de monsters conform met de wetgeving) omtrent de monitoring van Salmonella spp., Campylobacter spp., VTEC en E. coli (hygiëne indicator) op rund-, varkens- en pluimveekarkassen uit het jaarverslag van het FAVV van 2011.

Monitoring van rund-, varkens- en pluimveekarkassen Aantal analyses Conform (%) Salmonella spp. 1553 89,8 Campylobacter spp. 1323 73,2 VTEC 826 97,8 E. coli (hygiëne indicator) 1139 94,0

9

Tabel 4: Gegevens (aantal analyses en percentage van de monsters conform met de wetgeving) uit het jaarverslag van het FAVV van 2011 omtrent microbiologische analyses in de uitsnijderijen.

Microbiologische analyses in de uitsnijderijen Aantal analyses Salmonella spp. 722 Campylobacter spp. 711 VTEC 292 E. coli (hygiëne indicator) 825

Conform (%) 95,8 86,1 99,7 99,0

Naast de analyses in uitsnijderijen werden 1696 analyses uitgevoerd op vleesbereidingen en 1866 analyses op vleesproducten in de transformatiesector. Hierbij werden o.a. filet américain, hamburgers, worsten, rundcarpaccio, ham, pastei van gebakken vlees, kipsla en vleessla geanalyseerd. 2,3 % van deze analyses bleken niet conform te zijn (FAVV, 2012). In de groot- en detailhandel werden 2388 analyses uitgevoerd op vlees, 2498 analyses op vleesbereidingen en 1933 analyses op vleesproducten. De monsters werden genomen van o.a. filet américain, hamburgers, worsten, ham, pastei van gebakken vlees, kipsla, vleessla, versneden vlees en volledige kippen. In totaal bleken 95,8 % van de monsters conform te zijn. In Tabel 5 worden de gegevens voor filet américain en versneden vlees van pluimvee (zonder vel) weergegeven (FAVV, 2012). Tabel 5: Gegevens (aantal analyses en percentage van de monsters conform met de wetgeving) van de microbiologische analyses op versneden vlees van pluimvee zonder vel en op filet américain uit het jaarverslag van het FAVV van 2011.

Versneden vlees van pluimvee zonder vel Aantal analyses Conform (%) Listeria monocytogenes Salmonella spp. E.coli O157 Campylobacter spp. E.coli (hygiëne indicator)

118

97,5

91 90

98,9 98,9

Filet américain Aantal analyses 589 246 588 240

Conform (%) 99,8 100 99,3 99,6

Uit Tabel 3, Tabel 4 en Tabel 5 kan afgeleid worden dat vers vlees mogelijks besmet is met pathogene micro-organismen. Het valt op dat Campylobacter spp. verantwoordelijk is voor het grootste aantal niet-conformiteiten in slachthuizen en in uitsnijderijen (Tabel 3 en Tabel 4). Dit organisme wordt zoals eerder vermeld vooral geassocieerd met gevogeltevlees, waarop vaak vrij hoge aantallen worden gedetecteerd (Devlieghere et al., 2011). In Tabel 5 kan men afleiden dat ook op het versneden pluimveevlees niet-conformiteiten werden vastgesteld. Salmonella spp., Campylobacter spp. en VTEC vertonen eveneens niet-conformiteiten zowel op karkassen als in de uitsnijderijen. VTEC wordt vooral geassocieerd met rundvlees. Zo werd VTEC in 2011 teruggevonden op 18 runderkarkassen (FAVV, 2012). Listeria monocytogenes komt zoals reeds eerder vemeld vooral voor op rauwmelkse kazen, gerookte zalm, gekookte vleeswaren… en is minder van belang voor vlees en vleesproducten bedoeld voor consumptie na bereiding. De aanwezigheid van dit organisme op rauw vlees bedoeld om te verhitten is echter wel mogelijk en aangezien Listeria monocytogenes de meest hitte-resistente vegetatieve

10

pathogeen is, is het noodzakelijk om ook rekening te houden met dit pathogeen bij het bereiden van rauw vlees (Devlieghere et al., 2011;ILSI, 2005). 2.3.3. Locatie en omstandigheden van uitbraken In Tabel 6 worden de plaatsen en/of omstandigheden, waar de uitbraken met sterk bewijs 1 zich in 2010 hebben voorgedaan in de EU weergegeven (EFSA and ECDC, 2012). Ook de gegevens uit 2011 voor België worden vermeld in Tabel 6 (FAVV, 2012). Uit deze tabel kan men afleiden dat het merendeel van de uitbraken zich voordoet bij de consument thuis en in de horeca. Dit duidt de noodzaak aan voor duidelijke richtlijnen naar de consument en naar de horeca toe. Tabel 6: Verdeling van de omstandigheden van salmonellose en campylobacteriose uitbraken met sterk bewijs in de EU in 2010 en van de uitbraken van zoönoses in België in 2011.

Plaats/omstandigheden

Huishouden, keuken thuis Restaurant, café, bar, hotel, pub (horeca) Take away (Kleuter)school Niet gekend Kantine, werkplaats Tijdelijke massacatering (festival, kermis) Residentiële instelling (gevangenis, verpleeginrichting, kostschool…) Boerderij, primaire productie Kamp, recreatief domein Andere

EU: Salmonellose uitbraken met sterk bewijs in 2010 (%) (n*=341) 55,6 18,7

6,4 4,7 3,2 1,8

EU: Campylobacteriose uitbraken met sterk bewijs in 2010 (%) (n*=27) 3,7 74,1

België: Uitbraken in 2011 (%) (n**=281) 20 51 14 1

3,7 3,7

6 2

1,5

7,4

8,2

3,7 3,7

2 4

n*: totaal aantal uitbraken met sterk bewijs n**: totaal aantal uitbraken

2.4.Consumentengedrag en invloed op de microbiologische voedselveiligheid 2.4.1. Consumenten trends De 21e eeuwse consumenten zou men een ‘convenience’ generatie kunnen noemen (de Haan et al., 2001;Geeroms et al., 2008). Omwille van een drukke loopbaan of recreatieve activiteiten is een groot aantal consumenten op zoek naar gebruiksgemak bij de bereiding van maaltijden. Dit uit zich in een preferentie voor koelverse maaltijden, die weinig moeite kosten om te bereiden, nog lekker vers smaken en liefst zo weinig mogelijk behandeld zijn. Dit resulteert in de stijging van de verkoop van 1

Vanaf 2010 werden uitbraken gecatalogiseerd als ‘uitbraak met sterk bewijs’ of ‘uitbraak met zwak bewijs’. Wanneer het bewijs met betrekking tot een bepaald voedselproduct sterk is, wordt de term ‘uitbraak met sterk bewijs’ gebruikt (EFSA and ECDC, 2012).

11

gekookte vleeswaren bewaard onder koeling, ready-to-eat foods, voorverpakte verse groenten en voorverpakte versneden vleeswaren (Uyttendaele et al., 2011). Een andere trend die wordt gemerkt is dat mensen vaker buitenshuis eten, vaak gaat het om restaurants, kantines, cafetaria’s, fast food verkooppunten en bars. Zo bleek uit een nationale voedselconsumptie bevraging in 2004 dat meer dan 35% van de Belgische populatie meer dan 25% van zijn dagelijkse energie inname buitenshuis nuttigt (Uyttendaele et al., 2011). Bovendien worden nieuwe types voedsel geconsumeerd, zoals bijvoorbeeld sushi en pastasalades. Ook in de bereidingswijze worden vaak nieuwigheden toegepast, waarbij wokken en verhitting in de microgolf kunnen vermeld worden als zeer populaire kooktechnieken. Anderzijds stijgt ook de interesse in rauwe voedingswaren, zoals bijvoorbeeld carpaccio‘s en rauwe melkproducten (Uyttendaele et al., 2011). In een studie van Fischer et al. (2007) beweerden de deelnemers dat ze indien ze veel moeite moeten doen om voedselveiligheid te handhaven of indien de smaak negatief beïnvloed zou worden, ze zouden opteren voor gemak en smaak in plaats van voedselveiligheid. Zo bleek ook uit een bevraging in de Europese Unie in 2005 dat kwaliteit en prijs vooral bepalend zijn bij de aankoop van voedsel, terwijl er minder rekening wordt gehouden met gezondheid en voedselveiligheid (Eurobarometer, 2006). Wanneer echter de mogelijke voedsel gerelateerde risico’s werden opgelijst en de respondenten werd gevraagd om welke risico’s ze het meest bezorgd zijn, bleek de grootste bezorgdheid uit te gaan naar risico’s veroorzaakt door externe factoren, die men zelf niet in de hand heeft. Hiertoe behoren risico’s met betrekking tot pesticide residuen, nieuwe virussen (bijvoorbeeld vogelgriep), residuen in vlees, bacteriële contaminaties en onhygiënische condities buitenshuis. Een gematigde bezorgdheid gaat uit naar risico’s gerelateerd aan contaminanten uit de omgeving (bijvoorbeeld kwik), GMO’s, voedingsadditieven, dierenwelzijn en BSE (Bovine Spongiform Encephalopathy). Eveneens bleek uit deze bevraging dat consumenten minder bezorgd zijn om persoonlijke factoren (bijvoorbeeld vatbaarheid voor allergieën) en factoren gelinkt aan het persoonlijk gedrag (bereiding van voedsel, voedsel hygiëne thuis) (Eurobarometer, 2006). Algemeen kan men dus stellen dat consumenten voedsel gerelateerde risico’s eerder linken aan externe oorzaken en dat men risico’s van eigen handelingen in de keuken thuis, bijvoorbeeld tijdens het bereiden van voedsel, minder zwaar inschat. Uit de studie van Kher et al. (2013) bleek bovendien dat consumenten bij het concept ‘voedselveiligheid’ eerder denken aan chemische contaminanten dan aan de microbiologische. Chemische gevaren zouden volgens de consumenten ernstigere gevolgen met zich mee brengen. Bovendien werden chemische contaminanten door de consumenten beschouwd als een gevaar waarvan men de persoonlijke blootstelling niet zelf onder controle heeft, terwijl men denkt dat dit voor de microbiologische blootstelling wel het geval is. 2.4.2. Kennis en uitvoering van goede hygiëne praktijken bij voedselbereiding 2.4.2.1. Kennis en zelfrapportering van handelingen bij voedselbereiding Uit de studie van Fischer et al. (2007) bleek dat de voornaamste richtlijnen met betrekking tot goede hygiënische praktijken bij het bereiden van voedsel wel gekend zijn voor de consument, maar dat de meeste consumenten niet weten waarom ze handelingen op een bepaalde manier moeten uitvoeren. Men kan zich de richtlijnen, vervat in de vijf sleutels voor veilig voedsel (FAVV, 2013)(Tabel 7) of de Amerikaanse variant van het Partnership for Food Safety Education(PFSE, 2010) (Figuur 1),

12

dus wel herinneren. Maar toch maken consumenten gedurende het bereiden van voedsel heel wat fouten tegen deze regels (Fischer et al., 2007;Anderson et al., 2004;Redmond and Griffith, 2003). Dit kan dan resulteren in een groter risico op voedselgebonden ziekten.

Tabel 7: Vijf sleutels voor veilig voedsel. Richtlijnen van het FAVV (FAVV, 2013).

Vijf sleutels voor veilig voedsel 1.Gebruik drinkbaar water en goede producten. 2.Hou rauwe en bereide levensmiddelen apart. 3.Verwarm voedsel goed (minstens 60°C). 4.Hou voedsel bij de goede temperatuur. 5.Hou het netjes.

Figuur 1: Fight Bac richtlijnen van het Partnership for Food Safety Education (PFSE, 2010).

Uit een bevraging (Sampers et al., 2012) bleek bijvoorbeeld dat 11,2 % van de respondenten bereid vlees op hetzelfde bord legt als het rauwe vlees en 11 % van de respondenten bleek de handen niet te wassen na contact met het rauwe vlees. 6,7 % van de respondenten beweerde hetzelfde mes te gebruiken voor rauw vlees en groenten en 8,2 % zou dezelfde snijplank gebruiken. Naast deze kruiscontaminatiefouten kan ook onderverhitting beschouwd worden als een fout tijdens de bereiding van voedsel (Sampers et al., 2012). De meeste op zich staande gevallen en een groot aandeel van de voedselgebonden uitbraken zouden te wijten zijn aan onzorgvuldige handelingen door de consument bij het bereiden van voedsel in de keuken (Sampers et al., 2012;FAVV, 2012;EFSA and ECDC, 2012). De gevaren van kruiscontaminatie en van onvoldoende verhitting werden reeds vaak aangehaald als risicofactoren, voornamelijk in verband met Campylobacter spp. in gevogelte (Sampers et al., 2012). Door de introductie en het populairder worden van vele vleesbereidingen, zoals bijvoorbeeld gevogeltebereidingen (burgers, worsten, vermalen vlees, gemarineerde vleugels of filets) op de Belgische markt, wordt hitte-inactivatie steeds belangrijker. Aangezien deze bereidingen extensief werden gemanipuleerd, is er niet enkel besmetting op het oppervlak mogelijk, maar ook binnenin het vlees. Hierdoor vergroot het risico op overleving en kruiscontaminatie van pathogene micro-organismen (Sampers et al., 2012). 2.4.2.2.Observationele studies Verschillende onderzoekers voerden reeds bevragingen uit omtrent het gedrag van consumenten in de keuken bij het bereiden van voedsel (Sampers et al., 2012;Anderson et al., 2004). De resultaten van deze studies echter, moeten op de juiste manier geïnterpreteerd worden. Zo zal men bij dit soort bevragingen eerder een antwoord geven dat in het kader van de studie aanvaardbaar lijkt, dan een antwoord dat men in werkelijkheid zal navolgen buiten de context van de studie (Anderson et al., 2004;Fischer et al., 2007). Om aan deze bias te ontsnappen werd in de studie van Fischer et al.

13

(2007) het consumentengedrag tijdens de bereiding van een salade met kip observationeel bestudeerd via een camera. De deelnemers voerden dit experiment uit in hun eigen keuken met hun eigen keukenmateriaal zonder te weten dat het om een microbiologisch onderzoek ging. Hierna werd gevraagd een vragenlijst in te vullen om de kennis omtrent voedselveiligheid te toetsen. Uit deze bevraging bleek dat het belang van goed verhitten en het voorkomen van kruiscontaminatie niet onbekend was voor de meeste deelnemers. De kennis wordt echter niet steeds omgezet in de praktijk. Een mogelijke oorzaak is dat gedrag eerder resulteert uit gewoonte dan uit beredeneerde acties (Fischer et al., 2007). Koken is voor velen een routineklus, waar niet zwaar over wordt nagedacht. Bovendien vermeldden deelnemers dat er tijdens het koken heel wat andere activiteiten de aandacht opeisen (Fischer et al., 2007). De reducties in Lactobacillus casei (indicator organisme voor Campylobacter jejuni) behaald door de verschillende deelnemers varieerden tussen 7,4 log en 1,9 log. Aangezien in de retail een contaminatie wordt gerapporteerd tussen 0 en 4 log kve/kipfilet (Bergsma et al., 2007) en aangezien uit een geüpdatete dosis respons relatie voor Campylobacter spp. blijkt dat enkele cellen reeds ziekte kunnen veroorzaken (Bergsma et al., 2007;Fischer et al., 2007), zou dit dus kunnen leiden tot campylobacteriose. Het grootste effect wat besmetting betreft, werd veroorzaakt door kruiscontaminatie. Indien kruiscontaminatie echter onder controle was, werd er wel een positieve correlatie gevonden tussen de kooktijd van het vlees en de log reductie van de micro-organismen (Fischer et al., 2007). Ook Anderson et al. (2004) bestudeerden het gedrag in de keuken van consumenten. Deze wisten ook in deze studie meer over voedselveiligheid dan uit hun gedrag viel af te leiden. Alle deelnemers maakten wel een kruiscontaminatiefout ergens in het bereidingsproces. Dit gebeurde vooral via de handen, het aanrecht en keukengereedschap (Anderson et al., 2004). Ook in heel wat andere studies bleek kruiscontaminatie een heikel punt bij de bereiding door de consument (Sampers et al., 2012;Redmond and Griffith, 2003). Naast de kruiscontaminaties werden er ook heel wat fouten gemaakt wat betreft de gaarheid van het vlees (Anderson et al., 2004). Bij 61 % van de deelnemers was de kippenborst niet gaar en 46 % van de deelnemers bereidden ongaar gehaktbrood. Slechts 5 % van de deelnemers gebruikte een thermometer om de gaarheid te bepalen (Anderson et al., 2004). Ook de studie van Sampers et al. (2012) vermeldt dat een thermometer slechts door een minderheid wordt gebruikt. De meeste consumenten snijden het vlees door om de gaarheid na te gaan, hoewel kleine kleurverschillen soms moeilijk kunnen waargenomen worden voor deze kipbereidingen, wat deze methode weinig betrouwbaar maakt (Sampers et al., 2012). Onvoldoende verhitting werd bovendien aangehaald als (mede)verantwoordelijke factor in 67 % van de uitbraken waarbij Salmonella spp. als oorzaak werd gedefinieerd (Juneja et al., 2001;Blackburn et al., 1997). Hoewel in verschillende studies wordt gerapporteerd dat kruiscontaminatie de dominante route is wat betreft blootstelling aan pathogene micro-organismen bij de bereiding van voedsel (Fischer et al., 2007;Anderson et al., 2004;Sampers et al., 2012), is het zeker niet onbelangrijk om meer inzicht te verwerven in het effect van onvoldoende hitte-inactivatie en om na te gaan wat ‘voldoende’ verhitting precies inhoudt. Blackburn et al. (1997) vermelden immers dat verschillende uitbraken van Salmonella spp. en E.coli O157:H7 konden verklaard worden door onvoldoende verhitting.

14

2.5.Hitte-inactivatie Om verhittingsprocessen te beschrijven wordt vaak gebruik gemaakt van de decimale reductietijd of de D-waarde. Dit is de tijd die nodig is om een log reductie te bewerkstelligen in het aantal microorganismen (Dewettinck et al., 2012;Devlieghere et al., 2011). Ook de z(temperatuur)-waarde of hitteresistentie wordt algemeen gebruikt. Dit is het aantal graden Celsius noodzakelijk om een tienvoudige (1 log) verandering in D-waarde te verwezenlijken (Dewettinck et al., 2012). 2.5.1.Mechanisme van hitte-inactivatie Het dodelijk effect van hoge temperaturen is niet toe te schrijven aan één enkele oorzaak (Russel, 2003). Als belangrijkste doelwitten bij hitte-inactivatie worden volgende celcomponenten aangeduid: DNA, RNA en ribosomen, het cytoplasmatisch membraan en specifieke enzymen (Devlieghere et al., 2011). Op DNA niveau doen zich vooral bij droge verhitting (omwille van de hogere temperaturen nodig bij droge verhitting in vergelijking met vochtige verhitting) enkelstrengige breuken voor. Dubbelstrengige breuken van het DNA kunnen direct of indirect optreden. Indirect gebeurt dit door de versnelling van de endogene nucleaseactiviteit, waardoor de breuken pas optreden na de verhitting (Devlieghere et al., 2011;Russel, 2003;Williams-Hill and Grecz, 1983). Op het niveau van het RNA en de ribosomen wordt gesteld dat de hittestabiliteit toeneemt naarmate de maximale groeitemperatuur van het organisme hoger ligt (Jay, 2000). De destructie van de ribosomen is te wijten aan het ontstaan van lekken in het celmembraan waardoor de cel zijn Mg 2+ verliest (Devlieghere et al., 2011;Digella and Sobota, 1980). De hitteresistentie van micro-organismen wordt beïnvloed door de basensamenstelling van het rRNA (Jay, 2000). Micro-organismen met een hogere maximale groeitemperatuur bezitten een hoger GC (Guanine, Cytosine) gehalte in het rRNA en minder AU (Adenine, Uracil). Aangezien Guanine en Cytosine via drie waterstofbruggen worden gelinkt, terwijl bij Adenine en Uracil slechts twee waterstofbruggen aanwezig zijn, zal een hoger GC gehalte leiden tot een hogere hittestabiliteit (Jay, 2000;Van Damme and Gheysen, 2011). Verhitting heeft dus ook tot gevolg dat er lekken komen in het celmembraan, waardoor de cel zijn ionen, aminozuren en laag moleculaire nucleïnezuurcomponenten verliest. Beschadiging kan beperkt worden door de aanwezigheid van een grote hoeveelheid aan opgeloste stoffen in de omgeving (Devlieghere et al., 2011). Door verhitting zullen ook enzymen geïnactiveerd worden. Door bepaalde aminozuursubstituties op enkele plaatsen, blijken de proteïnen en enzymen van thermofielen en hyperthermofielen op een andere manier op te vouwen en deze zijn hierdoor veel meer bestand tegen denaturatie door hitte (Russel, 2003). Meerdere targets worden dus getroffen door de verhitting en het is dus moeilijk om uit te maken welke gebeurtenissen direct leiden tot de celdood. Door Brock (1967) werd beweerd dat de sleutelfactor voor afdoding het celmembraan is. Het celmembraan is een kritische factor voor groei en overleving bij hoge temperaturen. Er wordt aangetoond dat inactivatie van macromoleculen zoals hittegevoelige enzymen en ribosomen niet de echte doodsoorzaak is, aangezien er hiervan vele kopijen zijn per cel en de afdoding in dat geval niet volgens een eenvoudig eerste orde proces zou verlopen. De afdodingscurves gaven een eerste orde proces aan, overeenkomend met het effect op een grote structuur. Het celmembraan wordt aangewezen als de verantwoordelijke grote structuur,

15

waarin lekken kunnen ontstaan doordat de lipideconstituenten smelten. Op die manier verliest de cel zijn celconstituenten met de dood tot gevolg (Brock, 1967;Jay, 2000). Bij Gram-negatieve micro-organismen wordt ook het buitenste membraan getroffen door hitte. Zo bleek dat de permeabiliteitbarrière werd ontregeld door morfologische en structurele veranderingen en het verlies van lipopolysacchariden uit het buitenste membraan (Russel, 2003;Tsuchido et al., 1985). Gram-positieven hebben een grotere hoeveelheid vernet peptidoglycaan, waardoor hun celwand sterker is en dus meer bestand is tegen hitte dan het buitenmembraan van Gramnegatieven (Devlieghere et al., 2011;Russel, 2003). 2.5.2.Factoren die de hitte resistentie van micro-organismen beïnvloeden 2.5.2.1. Invloed van micro-organisme en voorgeschiedenis Een eerste belangrijke factor is eigen aan het micro-organisme zelf. Indien enkele minuten bij 70 à 80 °C wordt verhit zullen de meeste vegetatieve micro-organismen worden afgedood en bij een temperatuur van 100°C zijn er geen vegetatieve bacteriën, schimmels of gisten meer die zullen kunnen overleven (Devlieghere et al., 2011). De DNA-structuur, de membraansamenstelling en de tertiaire structuur van de eiwitten zijn eigen aan een specifiek micro-organisme en dragen zo bij tot de constitutieve resistentie van de vegetatieve cel. Het DNA-herstelsysteem en de bescherming tegen DNA-denaturatie van bepaalde micro-organismen zal beter functioneren dan dezelfde systemen bij andere micro-organismen (Devlieghere et al., 2011). Ook de membraansamenstelling is van belang. Hoe meer verzadigde vetzuren, hoe hoger de smelttemperatuur en hoe resistenter de cel (Devlieghere et al., 2011;Russel, 2003). In het geval van verzadigde vetzuren zijn er sterkere hydrofobe bindingen aanwezig in vergelijking met de onverzadigde (Jay, 2000). Dit alles maakt dat de D-waarden stamafhankelijk zijn en dat indien D-waarden worden vergeleken tussen studies, er wordt aangeraden om dezelfde stammen en methodologie te gebruiken (Shen et al., 2011). Zo gaven verschillende serotypes van Salmonella vrij verschillende D-waarden bij eenzelfde behandeling. Zelfs op stamniveau worden significante verschillen gemerkt in D-waarde voor eenzelfde serotype (ICMSF, 1996). Een D-waarde van 36,2 minuten in HIA (Heat Infusion Agar) bij 60°C werd gerapporteerd voor een hoog resistente stam van Salmonella Senftenberg. Terwijl deze voor een hittegevoelige stam slechts 4,9 minuten bedroeg. Een stam van Salmonella Typhimurium gaf onder deze condities een D-waarde van slechts 0,2 à 3 minuten (ICMSF, 1996). Ook het aantal micro-organismen kan een invloed uitoefenen. Hogere aantallen micro-organismen zouden beschermend kunnen werken. Men denkt dat er beschermende excreties, waarschijnlijk proteïnen, worden geproduceerd. Een grotere populatie houdt ook een grotere kans in om een inherent resistenter micro-organisme te bevatten (Jay, 2000). Naast het aantal, is ook de leeftijd of fysiologische toestand van de cellen van belang. Wanneer de microbiële cellen minder actief zijn, zoals bijvoorbeeld tijdens de stationaire fase, wordt een hogere hitteresistentie waargenomen (exacte mechanisme niet helemaal duidelijk). Zo zijn micro-organismen minder hitteresistent tijdens de exponentiële groeifase dan tijdens de stationaire fase. In het begin van de lag fase, de late exponentiële fase en de vroege stationaire fase zijn hitteresistenties het hoogst (Jay, 2000;Devlieghere et al., 2011). Hierom is naast de voorafgaandelijke incubatietemperatuur ook de duur van de incubatie van belang (O'Bryan et al., 2006).

16

Wat betreft factoren die de hittebehandeling voorafgaan worden de groeitemperatuur, het groeimedium en subletale stressfactoren vermeld. Wanneer micro-organismen voorafgaandelijk aan de verhittingsstap bij een hogere temperatuur worden opgekweekt zullen deze resistenter zijn t.o.v. hitte (Jay, 2000;O'Bryan et al., 2006;Stringer et al., 2000). Men vermoedt dat dit resulteert uit genetische selectie. Zo zal de groei van de meer hitteresistente stammen bevorderd worden indien ze aan hoge temperaturen worden blootgesteld (Jay, 2000). De optimale groeitemperatuur van een organisme speelt hier ook een rol. Hoe hoger de optimale groeitemperatuur, hoe hoger de hitteresistentie (Devlieghere et al., 2011). Katsui et al. (1981) en Juneja et al. (1998) merkten dat wanneer de groeitemperatuur werd verlaagd, er een toename was in het gehalte onverzadigde vetzuren van de membraanfosfolipiden. Dit doet de vloeibaarheid van het membraan toenemen, waardoor het membraan minder bestand is tegen hitte, maar dus meer bestand is tegen koude temperaturen (Juneja et al., 1998). De invloed van het groeimedium bleek o.a. uit een studie van Schultze et al. (2007). Hier werden bij verhitting van Listeria monocytogenes in frankfurter slurry verschillende D-waarden bekomen afhankelijk van het groeimedium (vóór de verhitting). Cellen opgegroeid in TSBYE (Tryptic Soy Broth met gistextract) zonder quaternair ammonium componenten vertoonden een hogere D 60°C dan deze opgegroeid in TSBYE met quaternair ammonium componenten. Alvarez-Ordonez et al. (2008) toonden aan dat wanneer Salmonella Typhimurium werd opgekweekt in een aangezuurd groeimedium, deze een verhoogde hitteresistentie vertonen t.o.v. cellen opgekweekt in niet aangezuurd groeimedium. Juneja et al. (1998) vermelden dat subletale hittestress ervoor kan zorgen dat het micro-organisme meer resistent wordt t.o.v. hitte, wanneer het er later nogmaals aan wordt blootgesteld. Het is ook mogelijk dat blootstelling aan één type stress, een organisme meer resistent maakt t.o.v. een ander type stress. Zo kan het gebeuren dat, indien bacteriën vóór de hittebehandeling worden blootgesteld aan een zuurbehandeling, deze vervolgens resistenter zijn t.o.v. hitte (Juneja et al., 1998;Hill et al., 2002). 2.5.2.2. Invloed van het levensmiddel of verhittingsmedium Een eerste belangrijke factor die hier kan vermeld worden is de wateractiviteit (aw) en het zoutgehalte. Een lagere vochtigheid of wateractiviteit resulteert in een hogere hitteresistentie (Jay, 2000;Devlieghere et al., 2011). De exacte oorzaak hiervan is niet gekend, men vermoedt echter sterk dat het te maken heeft met de proteïnedenaturatie, welke (mede) verantwoordelijk zou zijn voor de afdoding via verhitting (Jay, 2000). In waterige milieus zal proteïnedenaturatie sneller gebeuren. Hoe dit exact in zijn werk gaat, is nog niet helemaal duidelijk. Maar er werd wel reeds aangetoond dat er vrije sulfhydril groepen worden gevormd bij verhitting van proteïnen in vochtige milieus. Deze kunnen op hun beurt meer water binden en in de aanwezigheid van water zullen de peptidebindingen gemakkelijker breken (Jay, 2000). In een studie wordt bovendien beweerd dat meer gebonden water en dus minder vrij water zorgt voor een verminderde warmtepenetratie doorheen het verhittingsmedium tijdens het koken (Osaili et al., 2007). Met moet wel opletten met deze veralgemening, aangezien een aantal studies (Aljarallah and Adam, 2007;Mattick et al., 2001) aantonen dat Salmonella anders kan reageren op een lage aw naargelang de temperatuur. Bij verhitting bij temperaturen lager dan 53°C (Aljarallah and Adam, 2007) of lager dan 65°C (Mattick et al., 2001) zal een lage aw zorgen voor een snellere afdoding, terwijl een lage aw

17

bij temperaturen hoger dan 53°C (Aljarallah and Adam, 2007) of hoger dan 70°C (Mattick et al., 2001) eerder beschermend werkt. Als mogelijke oorzaak wordt vermeldt dat celdood bij lagere temperaturen vooral wordt veroorzaakt door schade aan het cytoplasmatisch membraan, waarbij de lage aw bijdraagt tot een verhoogde osmotische stress. Bij hogere temperaturen zou vooral ribosomale inactivatie van belang zijn in de afdoding (Aljarallah and Adam, 2007). Deze bevindingen kunnen stamafhankelijk zijn of er kan bijvoorbeeld een invloed zijn van de koolhydraten die worden gebruikt in de studie om de aw te verlagen (Aljarallah and Adam, 2007;Mattick et al., 2001;Goepfert et al., 1970). Afhankelijk van het soort zout en de concentratie kan de hitteresistentie verhoogd of verlaagd worden (Jay, 2000). Bijvoorbeeld Ca2+ en Mg2+ zorgen voor een verlaagde hitteresistentie door het verhogen van de wateractiviteit (Jay, 2000), terwijl Na+- en K+ -zouten de wateractiviteit kunnen verlagen, waardoor de hitteresistentie verhoogd wordt (Jay, 2000;Devlieghere et al., 2011). Een aantal studies waarin de hitteresistentie van Listeria monocytogenes, Salmonella spp. en E.coli O157:H7 werd bepaald in varkensgehakt met een hoog vetgehalte (40,2%), werden vergeleken met een andere studie waarin dezelfde stammen en dezelfde methodologie werd gebruikt ter bepaling van de hitteresistentie in gepaneerde varkenspastei (Osaili et al., 2007). In de gepaneerde varkenspastei werden hogere D-waarden bekomen, hoewel deze een veel lager vetpercentage bevatte (23%). Men verklaart dit door het zout (NaCl en NaPO4) en de paneeringrediënten (voornamelijk koolhydraten, zie verder) die werden toegevoegd bij de varkenspastei, waardoor de a w van het verhittingsmedium werd verlaagd en zo de hitteresistentie werd verhoogd. Voor natriumlactaat is het effect nog onduidelijk. In een aantal studies wordt een verhoging van hitteresistentie waargenomen (Osaili et al., 2007;Tuntivanich et al., 2008;Juneja et al., 2010) en in een andere studie (O'Bryan et al., 2006) rapporteert men dan weer een lagere D-waarde. Een aantal auteurs (Osaili et al., 2007) beweren dat natriumfosfaat zorgt voor een verhoging van de hittestabiliteit van het horseradish peroxidase enzym en chymotrypsine. Ook het vetgehalte kan een aanzienlijke invloed uitoefenen. Algemeen kan gesteld worden dat hoe hoger het vetgehalte is, hoe hoger ook de geobserveerde hitteresistentie zal zijn (Devlieghere et al., 2011;Jay, 2000). In een studie van Juneja en Eblen. (2000) werden in rundvlees met 7, 12, 18 en 24% vet, D-waarden bij 65°C bekomen voor Salmonella Typhimurium van 1,01; 2,24; 2,3 en 2,88 minuten, respectievelijk (de lagfase werd bij de D-waarde opgeteld omwille van de afwijking van eerste orde gedrag). Listeria monocytogenes in kippenvel (47,4% vet) gaf hogere D-waarden dan in het kippenvlees (10,3% vet), namelijk een D60°C van 3,95 in vel t.o.v. 2,04 minuten in het vlees. Ook dit bevestigt dat een hoger vetgehalte leidt tot een hogere hitteresistentie aangezien kippenvel een hoger vetpercentage bezit dan het vlees (O'Bryan et al., 2006). Bovendien impliceert een hoger vetgehalte dat er minder vrij water aanwezig is (Jay, 2000). Uit studies blijkt ook dat lange keten vetzuren meer bescherming bieden dan korte keten vetzuren (Jay, 2000). In de aanwezigheid van koolhydraten en ethanol zullen andere D-waarden verkregen worden. Suikers verlagen de wateractiviteit, wat leidt tot een daling in de gevoeligheid t.o.v. hitte (Devlieghere et al., 2011;Jay, 2000). Het type suiker is bepalend voor de mate van deze daling. Zo bleek voor Salmonella Senftenberg sucrose voor de grootste daling te zorgen, gevolgd door glucose, sorbitol, fructose en glycerol (Jay, 2000). Men vermoedt dat paneeringrediënten, die voornamelijk bestaan uit koolhydraten, een beschermend effect hebben t.o.v. hitte (Osaili et al., 2007). Er is echter nog geen specifieke studie uitgevoerd over het effect van paneren op de hittestabiliteit van micro-

18

organismen (Osaili et al., 2007). Uit de studie van Casadei et al. (2001) bleek ethanol zeer effectief te zijn om de hitteresistentie te verlagen. Bij pH 7,0 resulteerde een toename in ethanolgehalte van 10% in een afname van de D-waarde van Salmonella Typhimurium met factor 100. Proteïnen en colloïdale deeltjes in het medium zouden dan weer beschermend werken t.o.v. hitte (Jay, 2000;Devlieghere et al., 2011). Als laatste invloedsfactor eigen aan het verhittingsmedium kan de pH beschouwd worden. Hoe groter de afwijking van de optimale pH voor groei (meestal 7,0), hoe gevoeliger de micro-organismen zijn voor hitte (Jay, 2000;Blackburn et al., 1997). Casadei et al. (2001) rapporteerden voor Salmonella Typhimurium in Nutriënt Broth een D-waarde bij 50°C van 28,7 minuten bij pH 7 en van 1,2 minuten bij pH 3. 2.5.2.2. Andere factoren Hitteresistente antibiotica in combinatie met verhitting of nitriet in combinatie met verhitting blijken bederf beter te inhiberen dan elk van deze factoren apart. Men kan dus inhibitoren zoals hitteresistente antibiotica en SO2 toevoegen vóór de verhitting om de hoeveelheid benodigde warmte te reduceren (Jay, 2000;Devlieghere et al., 2011). Doyle en Mazzotta vermelden (2000) dat bepaalde voedseladditieven zorgen voor een verlaging van de hitteresistentie van Salmonella spp., maar dat sommigen hiervan vooral effectief zijn in cultuurmedia. In meer complexe voedingsmiddelen is het mogelijk dat de component minder beschikbaar is voor de bacteriële cel, omwille van een mogelijke interactie met bijvoorbeeld proteïnen en vet. 2.5.3. D-waarden 2.5.3.1. ‘The Big Four’: gerapporteerde D-waarden en temperatuur voor afdoding Het temperatuurbereik voor groei van Salmonella spp. ligt tussen 8 en 49,5°C (Devlieghere et al., 2011;ICMSF, 1996). Boven een temperatuur van 49,5°C zal dit mesofiel micro-organisme afgedood worden. Er kan gesteld worden dat hitteresistente Salmonella spp. stammen zeldzaam zijn. Salmonella Senftenberg (775W) is zo een zeldzame hitteresistente stam. Stammen hiervan in TSB (Tryptone Soy Broth) medium met gist extract hebben D-waarden bij 55°C die variëren van 2,4 (exponentiële groeifase) tot 42 minuten (stationaire groeifase)(ICMSF, 1996). Wat Listeria monocytogenes tot een belangrijk pathogeen maakt in de voedingsindustrie is het psychrotroof (koudetolerant) karakter van dit micro-organisme, waardoor groei in de koeling mogelijk is (ICMSF, 1996;Devlieghere et al., 2011). Het temperatuurbereik voor groei ligt tussen 0 en 45°C met een optimum bij 30 à 37°C (Devlieghere et al., 2011). Deze omgevingsbesmetter wordt gezien als de meest hitteresistente vegetatieve pathogeen (Devlieghere et al., 2011). Door ICMSF 5 (1996) wordt een D60°C vermeldt van 0,63 minuten in een fosfaatbuffer en van 3,8 minuten in gemalen rundsvlees (Tabel 8). In een ander handboek echter (Devlieghere et al., 2011), worden Dwaarden van 2,5-4,0 minuten vermeld bij 60°C. Dit illustreert nogmaals het belang van de experimentele condities bij het vergelijken van D-waarden en de nood aan recentere hitteinactivatiestudies. Een verhitting van 2 minuten bij 70°C wordt voldoende geacht om een 6 log reductie in Listeria monocytogenes te verwezenlijken (Devlieghere et al., 2011;ACMSF, 2007). Campylobacter jejuni is thermofiel en zal optimaal groeien bij een temperatuur van 42°C (Devlieghere et al., 2011;ICMSF, 1996;Uyttendaele, 2012). Boven of onder het temperatuurbereik van 32 tot 45°C treedt afdoding op (ICMSF, 1996). E.coli O157 H:7 kan optimaal groeien bij een

19

temperatuur van 37 °C, met een boven- en ondergrens voor groei van respectievelijk 8 en 44 à 55°C. E. coli O157:H7 is dus een mesofiel micro-organisme (ICMSF, 1996). In het handboek: Micro-organisms in Foods 5 : Microbiological Specifications of Food pathogens (ICMSF, 1996), daterend uit 1996, worden D-waarden gerapporteerd voor o.a. ‘the Big Four’ voedselinfectanten. Zo vermeldt men voor Salmonella Typhimurium in TSB een D55°C van 8,5 minuten. In dit handboek kunnen ook reeds enkele D-waarden teruggevonden worden op vleesmatrices, o.a. een D57°C van 2,13 à 2,67 minuten voor Salmonella Typhimurium in gemalen rundvlees (Tabel 8). Tabel 8: Overzicht van enkele gepubliceerde D-waarden uit het handboek: Micro-organisms in Foods 5: Microbial Specifications of Food Pathogens (ICMSF, 1996)

Organisme

Medium

Salmonella Typhimurium

TSB (Tryptic Soy Broth) Gemalen rundvlees Pepton/saline Gemalen rundvlees Fosfaatbuffer Rundvlees Nutrient broth + 11Mm fosfaat buffer Gemalen rundvlees

Salmonella Typhimurium Campylobacter Campylobacter Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Intestinale pathogene E.coli

E.coli O157:H7

Temperatuur(°C) D-waarde (minuten) 55 8,5

Jaar onderzoek 1965

57

2,13-2,67

1979

60 56

0,18-0,39 0,62-0,96

1983 1983

60 60 60

0,63 3,8 1,3

1980 1980 1989

60

0,75

1984

2.5.3.2. Opmerkingen bij D-waarden De D-waarden uit het handbook Micro-organisms in Foods 5 (Tabel 8) zijn bekomen in experimenten daterend uit de jaren 1980-1990 en werden uitgevoerd in een warmwaterbad. Aangezien microorganismen kunnen evolueren, andere stammen meer dominant kunnen worden, nieuwe vleesbereidingswijzen en vleesproducten ontstaan doorheen de jaren (Murphy et al., 2004) en er hiaten zijn in de kennis wat betreft afdoding bij hogere temperaturen (>70°C), is verder onderzoek noodzakelijk. In een recente studie (de Jong et al., 2012) werd voor Campylobacter jejuni namelijk een D100°C van 1,9 minuten bekomen bij het koken van kippenborsfillet in water, wat dus een veel hogere waarde is dan men zou verwachten indien men waarden uit de literatuur zou extrapoleren naar hogere temperaturen. Het is niet gemakkelijk om zomaar D-waarden te vergelijken tussen studies. Het is van belang dat dezelfde methodologie wordt gebruikt en dat de geteste micro-organismen zich bevinden in een gelijkaardig verhittingsmedium. Deze factoren zullen immers de gemeten D-waarden beïnvloeden (O'Bryan et al., 2006). Zo merkten Tuntivanich et al. (2008) dat hun eerste orde inactivatiesnelheidsconstante2 voor Salmonella spp. 40 tot 70 % hoger was dan deze in een andere

2

, met N de bacteriële populatie op tijdstip t (kve/g), N0: de initiële bacteriële

populatie (kve/g) , t: verhittingstijd (minuten), k: inactivatiesnelheidsconstante (minuten -1)

20

studie. De laatstgenoemde studie gebruikte echter de Salmonella Senftenberg serovar in de inoculum cocktail, een serovar die veel meer bestand is tegen hitte dan de meeste andere serovars (Tuntivanich et al., 2008). Indien een andere detectie en/of telmethode wordt gebruikt voor opvolging van het aantal overlevende cellen na verhitting, kunnen ook andere resultaten bekomen worden (Tuntivanich et al., 2008;O'Bryan et al., 2006;Czechowicz et al., 1996). Zo wordt door Jasson et al. (2007) vermeld dat subletaal beschadigde micro-organismen, omwille van de membraanschade en veranderingen in permeabiliteit, gevoelig kunnen worden voor selectieve componenten. Dit kan er voor zorgen dat de micro-organismen niet meer in staat zijn om te groeien op selectieve media (Jasson et al., 2007;Besse, 2002). In sommige studies (Tuntivanich et al., 2008;Velasquez et al., 2010) wordt het vlees eerst geïrradieerd om de achtergrondflora af te doden, terwijl dit in andere studies niet gebeurt (Murphy et al., 2004). Earnshaw et al. (1995) en Aldsworth et al. (1998) verklaren de toename in hitteresistentie voor Salmonella Typhimurium na het toevoegen van competitieve flora door de reductie in oxidatieve schade en bijgevolg een betere overleving. De aanwezigheid van deze competitieve flora doet het zuurstofgehalte in het medium dalen door respiratie. Het is ook van belang op welke manier de D-waarde wordt berekend. Wordt de lagperiode bij de Dwaarde opgeteld indien er een lagfase blijkt aanwezig te zijn of wordt de D-waarde rechtstreeks uit de lineaire regressie afgeleid (Juneja et al., 2001). Bij D-waarden in handboeken echter, staan deze specificaties vaak niet vermeld.

2.6. Recente studies en proefopzetten voor hitte-inactivatie experimenten In de voedingsindustrie zal men vaak teruggrijpen naar D- en z-waarden uit de literatuur om de tijd/temperatuur combinaties van industriële verhittingsprocessen te karakteriseren. Zomaar inactivatieparameters overnemen uit de literatuur kan echter nefaste gevolgen hebben. Het is belangrijk om steeds de specifieke experimentele condities van de gepubliceerde werken na te gaan en deze te vergelijken met de procescondities (O'Bryan et al., 2006). Zo is het niet evident om zich zomaar te baseren op D-waarden, bekomen in een opkweekmedium of bouillon, om een inactivatieproces in een vleesmedium op te zetten. Juneja et al. (2001) bemerkten een significant hogere D-waarde voor Salmonella spp. in een echte vleesstructuur (rund, varken, kalkoen en kip) in vergelijking met kippenbouillon. Dit is voornamelijk te wijten aan het verschil in samenstelling tussen bouillon en een echte vleesstructuur. Bovendien bleek de inactivatie in de kippenbouillon volgens een eerste orde proces te verlopen, terwijl in de vleesstructuur een schouder of lag effect werd waargenomen. Dit werd ook reeds in andere studies gerapporteerd (Juneja and Eblen, 2000). Juneja et al. (2001) gaven als verklaring voor dit schoudereffect dat de warmteoverdracht doorheen het verhittingsmedium veel geringer was of dat de schade aan de bacteriële cellen eerst een drempelwaarde moest overschrijden alvorens het eerste orde proces in gang werd gezet. Een andere oorzaak die wordt aangehaald is dat de hitteresistentie binnen de bacteriële populatie zou kunnen variëren. Interessante resultaten omtrent de invloed van de matrix, waarin de micro-organismen zich bevinden, werden bekomen door de Jong et al.(2012). Zoals reeds eerder vermeld, zowel in dit werk als door talrijke auteurs (Devlieghere et al., 2011;Jay, 2000) kan de hitteresistentie verhoogd worden

21

door een lage aw en een hoog vetgehalte. De Jong et al. (2012) echter voerden een experiment uit waarbij een stuk kippenfilet werd vergeleken met een wortel die net zoals de kippenfilet een laag vetgehalte en een hoge aw bezit. Hoewel deze factoren voor beide matrices hetzelfde waren, was voor de kippenfilet toch een langere verhittingstijd vereist om afdoding van micro-organismen te bewerkstelligen dan voor de wortel. Deze studie toonde dus aan dat de hitteresistentie ook wordt beïnvloedt door het kippenvlees zelf. Dit zou bijvoorbeeld kunnen te wijten zijn aan de aanwezigheid van specifieke componenten zoals ijzer of een aminozuur (de Jong et al., 2012). Aanhechting aan een vaste matrix zou de hitteresistentie kunnen verhogen in vergelijking met vrije cellen (Stringer et al., 2000).

2.7.Belang van het onderzoek Zoals kan bemerkt worden in Tabel 8 werden D-waarden veelal bepaald in de range 50-60°C en vele waarden dateren reeds uit de jaren 1980-1990. Deze temperatuursrange ligt echter lager dan de temperaturen die voorkomen bij het bereiden van vlees door de consument. Zo raadt het FAVV aan om voedsel steeds te verwarmen tot minstens 60°C (FAVV, 2013). Om deze reden zal in een eerste fase in dit werk de afdoding nagegaan worden in opkweekmedium bij temperaturen van 60 en 65°C. Voor Listeria monocytogenes zullen de experimenten bij 65 en 70°C worden uitgevoerd, aangezien dit de meest hitteresistente vegetatieve pathogeen is. Op die manier kan ook nagegaan worden of er werkelijk een 6 log reductie wordt gehaald na 2 minuten verhitting bij 70°C. Bovendien werd ook een tekort aan data gemerkt voor de ontwikkeling van modellen omtrent hitte-inactivatie (Stringer et al., 2012), wat het belang van dit onderzoek nogmaals benadrukt. Zoals reeds vermeld in sectie 2.3.2. kunnen ‘the Big Four’ voedselinfectanten mogelijks voorkomen op rauw vlees, wat kan leiden tot voedselgebonden infecties. Uit de data van de uitbraken met sterk bewijs van het EFSA blijkt bovendien dat een groot aandeel van deze uitbraken zich situeren in de horeca en bij de consument thuis (Tabel 6). Data van 2011 voor België van het FAVV ondersteunen deze bevinding (Tabel 6). Dit maakt dat er meer inzicht nodig is in de voedselhandelingen met betrekking tot de bereiding van vlees ter hoogte van de consument/horeca. Hierom zal in dit werk in een tweede fase de overstap gemaakt worden naar het bakken van vlees in de pan, net zoals dit gebeurt bij de consument thuis.

3. Materiaal en methode 3.1.Keuze van de stammen Bij de keuze van de stammen werd telkens getracht om minstens één klinisch isolaat mee te nemen, aangevuld met isolaten afkomstig van vlees of van de dieren zelf. De gebruikte stammen kunnen bekomen worden via de cultuurcollectie van het labo voor levensmiddelenmicrobiologie en conservering (LFMFP). Een aantal stammen werden bekomen via het Centrum voor Onderzoek in Diergeneeskunde en Agrochemie (CODA). Een overzicht van de gebruikte stammen wordt weergegeven in Tabel 9.

22

Tabel 9: Overzicht van de gebruikte stammen. Micro-organisme

LFMFPstamnummer

Origine

Opmerking


736

humaan isolaat

/


877

gevogelte

CODA stam 2011/01081.9

Salmonella Enteritidis

875

gevogelte

CODA stam 2011/00166

Salmonella Enteritidis

874

rund


Salmonella Derby

872

varken


Listeria monocytogenes 4b

810

melk


392

leverpaté


421

klinisch isolaat

Listeria monocytogenes 1/2b

491

tonijn-mayonaise salade

Listeria monocytogenes 4d

809

schaap

E. coli O157:H7

811

klinisch isolaat (HUS)

geattenueerde stam resistent tegen 50µg/ml naldixinezuur

E. coli O157:H7

849

rund feces

E. coli O157:H7

848

rund feces

E. coli O157:H7

847

humaan feces

E. coli O157:H7

846

rundscarpaccio

geattenueerde stam resistent tegen 50µg/ml naldixinezuur geattenueerde stam resistent tegen 50µg/ml naldixinezuur geattenueerde stam resistent tegen 50µg/ml naldixinezuur geattenueerde stam resistent tegen 50µg/ml naldixinezuur

Campylobacter jejuni

595

rund feces


864

kip


865

humaan feces


866

pluimvee isolaat


867

humaan feces

E. coli

137

karkas

E. coli

134

karkas

E. coli

063

klinisch isolaat

E. coli

168

humaan feces

De gebruikte serotypes van Salmonella werden bepaald op basis van twee rapporten van EFSA, waarin de prevalentie van Salmonella spp. onder de loep werd genomen in fokkerijen van varkens (EFSA, 2009b) en op kippenkarkassen (EFSA, 2009a) in de EU in 2008. Op kippenkarkassen waren de aandelen van de vaakst voorkomende serotypes in het totaal aantal positieve monsters als volgt: Salmonella Infantis: 29,2%, Salmonella Enteritidis: 13,6%, Salmonella Kentucky: 6,2% en Salmonella Typhimurium: 4,4%. Voor de isolaten in varkensfokkerijen werden volgende waarden gerapporteerd: Salmonella Derby: 29,6%, Salmonella Typhimurium: 25,4% en Salmonella London, Infantis en Rissen telkens 7%. Vanwege het hoge aandeel in varkensfokkerijen werden Salmonella Derby (29,6%) en Salmonella Typhimurium (25,4%) alvast meegenomen in dit experiment. Hoewel Salmonella Infantis meer prevalent was op de kippenkarkassen, werd toch geopteerd om Salmonella Enteritidis op te nemen in het experiment, aangezien Salmonella Infantis en Kentucky minder gelinkt zijn aan humane infecties dan Salmonella Enteritidis (EFSA, 2009a).

23

Wat betreft Listeria monocytogenes werden vooral stammen meegenomen met serotype 4b, aangezien dit serotype het vaakst wordt geassocieerd met ziekte (Gorski et al., 2006;Verbunt, 2012). Voor E. coli O157:H7 werden geattenueerde stammen gekozen, omwille van veiligheidsredenen. Campylobacer jejuni wordt het vaakst geassocieerd met humane infecties. In 2010 ging het in 93,4% van de bevestigde campylobacteriose gevallen in België om Campylobacter jejuni en slechts in 2,3% van de gevallen om Campylobacter coli (FAVV, 2012). LFMFP 595 werd reeds gebruikt in de studie van Sampers et al.(2010), waarbij de afdoding van Campylobacter spp. door hitte werd nagegaan via bakken in de pan. Voor LFMFP 864, 865, 866 en 867 werd beroep gedaan op de studie van de Jong et al. (2012). Uit deze studie, waarbij kippenborstfilet geïnoculeerd met Campylobacter jejuni stammen werd gekookt in water, bleken extreem hoge D-waarden voor Campylobacter jejuni. Om deze reden werden vier van de vijf Campylobacter jejuni stammen uit het experiment van de Jong et al. (2012) ook meegenomen in dit werk.

3.2.Aanmaak stockcultuur Voor de aanmaak van de stockcultuur werden vanuit een cryobuisje uit de cultuurcollectie van het laboratorium voor levensmiddelenmicrobiologie en conservering (LFMFP) enkele parels overgebracht in bouillon. E. coli, E. coli O157:H7, Listeria monocytogenes en Salmonella spp. werden opgekweekt in Brain Heart Infusion (BHI) bouillon (Oxoid CM1135). De stammen werden dan geïncubeerd gedurende 24 h bij 37°C. Bij Campylobacter jejuni gebeurde dit in Bolton Broth (BB), gevolgd door een micro-aërofiele incubatie (5% O2, 10% CO2, 85% N2) bij 41,5°C gedurende 48 h. Voor de bereiding van het BHI en het BB medium werden de instructies van de fabrikant gevolgd. Proefbuizen werden gevuld met telkens 9 ml oplossing en vervolgens werden deze geautoclaveerd gedurende 15 minuten bij 121°C. Voor de opkweek van de naldixinezuurresistente E.coli O157:H7 werd na het autoclaveren naldixinezuur toegevoegd aan het BHI medium (50 µg/ml). Naldixinezuur zorgt voor de inhibitie van de DNA gyrase activiteit (Sugino et al., 1977). Vanuit de bouillons werden twee Tryptone Soya Agar (TSA)-slants per stam beënt en geïncubeerd gedurende 24 h bij 37°C. Deze slants kunnen dan vier weken bewaard worden in de koelkast bij 2°C à 8°C. Het TSA medium werd bereid zoals voorgeschreven door de fabrikant. Voor de E.coli O157:H7 stammen werd er naldixinezuur toegevoegd aan de TSA-slants, zodat deze hun naldixinezuurresistentie zouden behouden. Campylobacter jejuni werd niet op slants bewaard, maar wel in het BB medium zelf. Om de zuiverheid van de stockcultuur te testen werd een 4x4 streepenting uitgevoerd vanuit de bouillon op een niet-selectieve plaat (TSA). Deze 4x4 streepenting werd ook uitgevoerd op een selectieve plaat (zie sectie 3.4.) om na te gaan of de stammen typische kolonies vormen. Zowel de selectieve als de niet-selectieve platen werden geïncubeerd bij 37°C gedurende 24 h. Dit geldt niet voor de selectieve (CampyFood-agarplaten bioMérieux, Ref. 39502) en niet-selectieve (TSA) platen van Campylobacter jejuni. Deze werden micro-aërofiel geïncubeerd bij 41,5°C gedurende 48 h met behulp van het CampyGenTM (Oxoid) systeem in een afgesloten zak.

3.3.Aanmaak werkcultuur In proefbuisjes met 9 ml BHI werd, voor elke stam afzonderlijk, koloniemateriaal vanop de slants van Salmonella spp., Listeria monocytogenes en E.coli gebracht met behulp van een oognaald. Bij E. coli O157:H7 bevatte de proefbuis naast 9 ml BHI ook 50 µg/ml naldixinezuur. Deze proefbuizen werden

24

vervolgens geïncubeerd bij 37°C gedurende 24 h. Voor de stammen van Campylobacter jejuni werd 0,1 ml vanuit de vloeibare stockcultuur overgebracht in een nieuwe proefbuis met 9 ml BB medium. Vervolgens werden ook de Campylobacter jejuni stammen geïncubeerd, maar opnieuw onder microaërofiele condities en gedurende 48 h bij 41,5°C.

3.4.Gebruikte selectieve media Het aantal kolonies van E. coli wordt bepaald op RAPID’E.coli 2 Medium (Bio-Rad, REC). Dit selectief chromogeen medium is gebaseerd op de detectie van het β-D-glucuronidase en het β-Dgalactosidase enzym. E. coli bezit beide enzymen en vormt violet tot roze kolonies. Andere coliformen bezitten enkel β-D-galactosidase en kunnen herkend worden als blauwe tot groene kolonies. Het medium wordt bereid zoals voorgeschreven door de fabrikant (Bio-Rad, 2013). Er werd geopteerd om gebruik te maken van chromocult (Merck Chromocult® Coliform Agar) medium om de E. coli O157:H7 kolonies te tellen. Het substraat X-glucuronide wordt omgezet door het β-D-glucuronidase enzym, aanwezig in E.coli. Om specifiek E.coli O157:H7 te kunnen detecteren wordt aan het medium naldixinezuur toegevoegd, aangezien naldixinezuurresistente stammen van E.coli O157:H7 worden gebruikt. Er wordt 26,5 gram chromocult poeder opgelost en vervolgens gekookt in 1 liter gedestilleerd water. Na afkoelen in het warmwaterbad tot ongeveer 48°C wordt het naldixinezuur toegevoegd (50 µg/ml) en kan het medium in de petrischalen verdeeld worden (Merck, 2013). Om selectief het aantal Listeria monocytogenes kolonies te bepalen wordt Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti (ALOA) medium gebruikt. Het medium differentieert de Listeria spp.-stammen via het chromogeen substraat X-glucoside. Dit substraat wordt gesplitst door het enzym βglucosidase, eigen aan alle Listeria spp. Op basis van het fosfolipase C enzym, aanwezig in Listeria monocytogenes, en de aanwezigheid van het substraat L-α-fosfatidylinositol kan vervolgens verder onderscheid gemaakt worden tussen Listeria spp. en Listeria monocytogenes. De eerstgenoemde zullen namelijk blauwgroene kolonies vormen zonder opake halo, terwijl er zich rond de Listeria monocytogenes kolonies wel een opake halo zal ontwikkelen . De groei van andere organismen wordt tegengehouden door de aanwezigheid van LiCl en antimicrobiële selectieve componenten. Voor de bereiding van dit medium wordt gebruik gemaakt van ALOA poeder (Chromogenic Listeria Agar (ISO), CM1084, Oxoid Micobiology Products, UK) en de supplementen OCLA (ISO) SELECTIVE SUPLEMENT (SR0226) (CM1084, Oxoid Microbiology Products, UK) en OCLA (ISO) DIFFERENTIAL SUPPLEMENT (SR0244) (CM1084, Oxoid Microbiology Products, UK)(Oxoid, 2013a). Salmonella spp. wordt geteld via Xylose-Lysine-Desoxycholate Agar (XLD-Agar, CM0469, Oxoid Microbiology Products, UK). Salmonella spp. is in staat om xylose te fermenteren, lysine te decarboxyleren en H2S te produceren. Dit resulteert in rode kolonies met zwarte centra. XLD-agar wordt bereid volgens de instructies van de fabrikant (Oxoid, 2013b). Voor Campylobacter jejuni worden kant-en-klare platen aangekocht, namelijk CampyFoodagarplaten (bioMérieux). Deze platen bevatten paard serum om de groei van Campylobacter spp. te promoten, maar ook neutralizerende agentia om het toxisch effect van O2 tegen te gaan. Bovendien wordt specifieke groei van Campylobacter spp. verkregen door de combinatie van een kleurindicator en antibiotica. Op deze manier kunnen voor Campylobacter spp. roodbruine kolonies op een beige achtergrond teruggevonden worden (bioMérieux, 2013).

25

Alle stammen werden op elke soort selectief medium en op TSA beënt via een 4x4 streepenting. Zo kon nagegaan worden welke typische kolonies werden gevormd en ook of sommige stammen soms kolonies vormen op selectieve media, bedoeld voor andere soorten, die lijken op de typische kolonies van deze andere soort. Aangezien in latere experimenten met een cocktail van soorten en stammen zal worden gewerkt, is het belangrijk om hier een duidelijk zicht op te hebben. Hiermee werd ook rekening gehouden bij de selectie van stammen voor toepassing op het vlees. Een overzicht van de duur en omstandigheden van incubatie voor de verschillende micro-organismen en de respectievelijke selectieve platen wordt weergegeven in Tabel 10. Ook voor incubatie van de TSA platen werden dezelfde duur, temperatuur en omstandigheden toegepast. Tabel 10: Overzicht van de duur en omstandigheden van incubatie voor de verschillende micro-organismen en respectievelijke selectieve platen.

Micro-organisme Salmonella spp. Listeria monocytogenes E. coli O157:H7

Campylobacter jejuni E. coli

Selectieve platen/media XLD ALOA Chromocult (+ 50 µg/ml Naldixinezuur) CampyFoodAgar (kant-en-klaar) REC

Incubatie duur

Incubatie temperatuur 37°C 37°C

Omstandigheden

37°C

aeroob

48 h

41,5°C

micro-aerofiel

24 h

37°C

aeroob

24 h 48 h ( verhit)* 24 h (niet verhit)* 24 h

aeroob aeroob

*Bij uitplating nadat de cellen werden verhit, werden de platen 48 h geïncubeerd. Indien de cellen niet werden verhit volstond 24h incubatie.

3.5.Afdoding van bacteriën in bouillon 3.5.1. Onverdunde cultuur Deze proef heeft als doel om de afdoding voor de verschillende stammen (vijf of vier stammen per micro-organisme, zie Tabel 9) op te volgen bij verhitting in het warmwaterbad en als verhittingsmedium BHI of BB. In deze proef werd gestart vanuit een hoge initiële concentratie microorganismen. Bij opkweek van de verschillende stammen volgens de methode beschreven in sectie 3.3., bleken de werkculturen steeds uit te groeien in de bouillon tot 8 à 9 log kve/ml. De gemiddelde uitgroei van de verschillende stammen per micro- organisme wordt weergegeven in Tabel 11. Tabel 11: Gemiddelde uitgroei van de verschillende stammen van een organisme in BHI na incubatie gedurende 24 h bij 37°C. Behalve voor Campylobacter jejuni: in BB na incubatie gedurende 48 h bij 41,5°C.

Micro-organisme E. coli E. coli O157:H7 Listeria monocytogenes Campylobacter jejuni Salmonella spp.

Stammen LFMFP 134, 137, 168, 063 811, 849, 848, 847, 846 810, 421, 392, 491, 809 595, 867, 865, 864, 866 736, 877, 875, 874, 872

Gemiddelde uitgroei werkcultuur (log(kve/ml)) 9,00 8,80 9,37 8,41 8,97

26

Het experiment werd uitgevoerd bij 60°C en 65°C voor alle micro-organismen, behalve voor Listeria monocytogenes. Aangezien dit pathogeen wordt beschouwd als de meest hitte-resistente vegetatieve cel, werd hier geopteerd voor 65°C en 70°C. Voor elk tijdstip waarvan men een datapunt wou bekomen (behalve voor 0 minuten) werd een proefbuis met 9 ml boullion in het warmwaterbad geplaatst. Voor alle organismen werd BHI gebruikt, behalve voor Campylobacter jejuni. Voor dit organisme bevatte de proefbuis 9 ml BB. Deze proefbuizen werden een vijftal minuten op voorhand in het warmwaterbad geplaatst totdat ze op temperatuur waren (60, 65 of 70°C). De temperatuur werd gemonitord in een extra proefbuis met bouillon via de Testo datalogger (177-T4) Wanneer de proefbuizen op temperatuur waren, werd 1 ml meteen vanuit de werkcultuur overgebracht in de proefbuis voor het datapunt van 20 minuten en de timer werd gestart. De startconcentratie bedraagt dus 7 à 8 log kve/ml. Twee minuten later werd de proefbuis van 18 minuten geïnoculeerd en op deze manier werd verder gewerkt tot de proefbuis die de afdoding van 1 minuut meet. Na de 20 minuten werden alle proefbuisjes uit het warmwaterbad gehaald en meteen afgekoeld op ijs. De uitplating van de verschillende tijdstippen werd uitgevoerd via de Eddy Jet (IUL instruments) spiraalenter, waarbij van elke verdunning 50 µl werd uitgestreken op selectief medium. De platen werden vervolgens geïncubeerd volgens Tabel 10. Aangezien de cellen in dit geval werden verhit vóór het uitplaten, werden de ALOA platen 48 h geïncubeerd i.p.v. 24 h (indien geen voorafgaande verhitting). De Listeria monocytogenes kolonies groeiden na verhitting namelijk trager dan indien niet werd verhit, waardoor de kolonies na 24 h nog vrij klein en moeilijk telbaar waren. De uitplating gebeurde op selectieve platen, met het oog op de latere experimenten op vlees. Op het vlees zou namelijk een bacteriemix worden aangebracht en ook omwille van de endogene flora die steeds aanwezig is op vlees zou een niet-selectief medium niet toelaten om de specifieke microorganismen te tellen. 3.5.2.Verdunde cultuur Bij dit experiment werd op dezelfde manier gewerkt als in het onverdund inoculum experiment (sectie 3.5.1.). Er werd echter verder gewerkt met drie stammen per organisme i.p.v. vier of vijf. Oorspronkelijk zouden uit het onverdund inoculum experiment de meest hitteresistente stammen gekozen worden, maar aangezien de afdodingscurven van alle stammen van een organisme ongeveer hetzelfde verloop vertoonden, kon dit niet gebruikt worden als selectiefactor. Om deze reden werd er gekozen voor de stammen die geen atypische kolonies vertoonden op de selectieve media en geen kolonies vormden op selectieve media, bedoeld voor andere soorten, die lijken op de typische kolonies van deze andere soort. De gekozen LFMFP stammen worden weergegeven in Tabel 12. Voor E. coli werden slechts twee stammen meegenomen, aangezien zowel stam LFMFP 137 als stam LFMFP 134 specifieke kolonies gaven voor Campylobacter jejuni op Campyfood Agar (zelfs na microaerofiele incubatie). Deze stammen werden dus niet meer meegenomen aangezien dit problemen zou kunnen geven in de latere experimenten op vlees.

27

Tabel 12: Gebruikte LFMFP stammen voor het verdund inoculum experiment en het aangepaste bouillon experiment.

Micro-organisme E. coli E. coli O157:H7 Listeria monocytogenes Campylobacter jejuni Salmonella spp.

Stammen LFMFP 168, 063 849, 847, 846 421, 392, 491 595, 867, 866 877, 875, 872

De werkcultuur werd in dit experiment verdund tot 6 log kve/ml en dit verdund inoculum werd vervolgens in de voorverwarmde reageerbuisjes in het warmwaterbad gebracht. De afdoding werd opnieuw 20 minuten opgevolgd en de uitplating van de overlevende cellen gebeurde via de spiraalenter of via een verlaagde detectielimiet. Door 1 ml te verdelen over drie selectieve platen kon een detectielimiet van 1 kve/ml bekomen worden. 3.5.3.Verdunde cultuur en aangepaste bouillon Op basis van de pH en het percentage NaCl die werden gemeten op het varkensvlees, werd het proefopzet voor dit experiment bepaald. De pH van de bouillon (BHI of BB) werd met behulp van melkzuur tot 5,6 gebracht bij kamertemperatuur (de karakterisatie van het varkensvlees werd ook uitgevoerd bij kamertemperatuur). Hiervoor werd melkzuur toegevoegd tot ongeveer 0,27 %(w/w). Aan de bouillon werd ook NaCl toegevoegd tot een totaal van 1,5 %(w/w). Melkzuur is één van de meest gebruikte voedingszuren voor de conservering van voedingsmiddelen en heeft naast het pH verlagend effect ook een antimicrobiële werking (Devlieghere et al., 2011). De opkweek van de cellen gebeurde op dezelfde manier als in de vorige proeven, namelijk in onaangepaste bouillon (BHI of BB). Deze werkcultuur werd vervolgens verdund in de aangepaste bouillon tot ongeveer 6 log kve/ml. Dan werd telkens 1 ml van deze verdunde werkcultuur in de voorverwarmde reageerbuisjes met aangepaste bouillon in het warmwaterbad gebracht. Voor de hoogste temperatuur (65°C of 70°C) werd telkens 12 minuten opgevolgd in plaats van 20 minuten. 3.5.4.Telling van de resultaten via de spiraalenter Via de spiraalenter kan het aantal micro-organismen in een oplossing geteld worden. Een gekende hoeveelheid van het monster wordt op een roterende plaat gebracht in de vorm van een Archimedes spiraal. De incubatie van de platen wordt uitgevoerd zoals weergegeven in Tabel 10. Na de incubatie kunnen, via een bepaald roosterpatroon dat op de plaat kan worden gelegd, bepaalde gebieden van de plaat worden geteld. Het patroon verdeelt de plaat in acht grote radiaal afgebakende gebieden. Concentrische cirkels verdelen deze gebieden verder in kleinere gebiedjes. Bij het tellen wordt steeds van buiten naar het centrum van de plaat toe gewerkt. Men kiest één van de acht grote gebieden uit en telt het aantal kolonies van de buitenrand van de plaat naar het centrum toe. Wanneer een aantal van 20 kolonies wordt overschreden, telt men de rest van het kleiner gebiedje verder tot aan de eerstvolgende concentrische afbakening. Hetzelfde doet men voor het grote gebied dat recht tegenover het gekozen grote gebied ligt. Aan elk gebiedje werd een code toegekend (patroon zie bijlage 1) die wordt gelinkt aan het volume monster dat op de plaat werd gebracht vanaf de buitenrand tot de concentrische cirkel die het getelde gebied afbakent. Men kent dus het aantal kolonies per gebiedje en het volume monster dat werd toegediend per gebiedje. Op deze manier kan worden terug gerekend naar het aantal cellen/ml dat oorspronkelijk aanwezig was in het monster. Volgende formule wordt gebruikt:

28

(1) (2) (3)

Met A: aantal getelde kolonies op gebied 1 (kve), B: aantal getelde kolonies op gebied 2 (kve), V1: volume aangebracht over de totale plaat indien men telt tot een bepaalde concentrische cirkel (A kolonies geteld tot deze concentrische cirkel) (getal uit tabel in handleiding spiraalenter, in µl), V 2: volume aangebracht over de totale plaat indien men telt tot een bepaalde concentrische cirkel (B kolonies geteld tot deze concentrische cirkel) (getal uit tabel in handleiding spiraalenter, in µl), C: volume dat werd aangebracht op het getelde gebied (µl), Z: het aantal kve/ml op de plaat, r: verdunningsfactor van de oplossing aangebracht op de plaat, F: aantal kve/ml oorspronkelijk aanwezig in het monster. In vergelijking (1) wordt het volume dat aangebracht werd op twee tegenovergestelde grote gebieden uitgemiddeld, aangezien voor eenzelfde afstand van de rand een verschillend volume werd aangebracht op tegenover elkaar liggende zijden door het gebruik van de Archimedesspiraal. Er wordt gedeeld door acht aangezien er telkens maar 1/8 van de plaat wordt geteld langs elke zijde. In vergelijking (2) wordt omgerekend naar het aantal kve/ml op de getelde plaat zonder rekening te houden met de verdunningsfactor. Nadien wordt het aantal kve/ml in het oorspronkelijk monster bekomen via vergelijking (3). Wanneer het onmogelijk is om 20 kolonies te tellen over een volledig groot gebied, kan de plaat als een strijkplaat worden geteld. Voor deze proeven werd optie zes van de spiraalenter gebruikt, waarbij in totaal 50 µl monster op de plaat wordt gebracht. Bij gebruik van optie zeven (100 µl) kon de vloeistof niet snel genoeg in het agarmedium dringen waardoor de spiraallijnen in elkaar vloeiden en er dus niet betrouwbaar kon geteld worden. Door Gilchrist et al. (1973) werd de spiraalenter methode reeds vergeleken met de conventionele aerobe gietplaat methode. De grootste voordelen van de spiraalenter methode die in deze studie werden aangehaald, zijn de snelheid en het significant lager verbruik van materialen in vergelijking met de gietplaat methode.

3.6. Fitting via GInaFiT en vergelijking D-waarden De afdodingscurven, die werden bekomen uit de bouillonexperimenten (sectie 3.5.), werden gefit in GInaFIT v1.6 (KuLeuven), een add-in voor Microsoft © Excel. Van de drie herhalingen werd voor elke stam het gemiddelde genomen en hieraan werd het Cerf model (bifasisch model, vergelijking 4) gefit. Het bifasische model gaat er van uit dat er twee celpopulaties zijn, die niet genetisch verschillen van elkaar. De éne celpopulatie zou een meer hitteresistente groep vertegenwoordigen, terwijl de andere celpopulatie meer gevoelig is voor hitte (Geeraerd et al., 2005). Indien ook een schouder aanwezig is, wordt een betere fitting bekomen met het model van Geeraerd et al. (2005), waarbij het Cerf model werd aangevuld met een term verantwoordelijk voor de schouder (vergelijking 5).

29

Bifasisch model (Cerf, 1977): (

)

)

(4)

Met log10(N): microbiële celdensiteit (kve/ml), N(0): initiële microbiële celdensiteit (kve/ml), f: fractie van de initiële populatie die een grote subpopulatie vormt, (1-f): fractie van de initiële populatie die een kleine subpopulatie vormt (die meer hitteresistente cellen bevat), k max1: specifieke inactivatiesnelheid van de grootste subpopulatie (1/minuten), k max2: specifieke inactivatiesnelheid van de kleinste subpopulatie(1/minuten). Bifasisch model met schouder (Geeraerd et al.,2005): (5) (

)

Met Sl: schouder periode (minuten). Hierbij kan opgemerkt worden dat, indien parameter Sl gelijk is aan 0, de laatste term uit vergelijking 5 wegvalt (vet blauw) en vergelijking 4 wordt bekomen (bifasisch zonder schouder). Bovendien zal een loglineair model bekomen worden indien in vergelijking 4 parameter f gelijk is aan 1. In dit geval hebben alle cellen in de populatie eenzelfde hitteresistentie. Op basis van de waarden voor kmax1 en kmax2 uit het model werden D-waarden berekend met behulp van volgende vergelijking: (6)

Aangezien er in het bifasisch model twee kmax waarden kunnen worden geïdentificeerd, namelijk kmax1 voor de minder hitteresistente subpopulatie (eerste deel van de bifasische curve) en kmax2 voor de meer hitteresistente subpopulatie (tweede deel van de bifasische curve), kunnen er ook twee Dwaarden worden berekend. De D-waarden bij 60 en bij 65°C werden op basis van het eerste deel van de curve statistisch vergeleken tussen de micro-organismen. Dit gebeurde zowel voor de onaangepaste als voor de aangepaste bouillon. Om voldoende data te bekomen voor een betrouwbare statistische test werden de D-waarden voor de verschillende stammen van een microorganisme samengenomen en ook de data van het onverdund inoculum experiment en van het verdund inoculum experiment werden samengevoegd voor elk micro-organisme. Op deze manier werden acht waarden per micro-organisme bekomen voor de vergelijking van de D-waarden in onaangepaste bouillon. Voor de vergelijking van de D-waarden in aangepaste bouillon werden de Dwaarden voor elke herhaling van elke stam berekend, zodat negen waarden per micro-organisme werden bekomen. Omwille van de nog steeds vrij lage hoeveelheid data, werd geopteerd voor niet-parametrische tests. Via SPSS (v.19) werd een Independent Samples Kruskal-Wallis test uitgevoerd om na te gaan of er een significant verschil kan gevonden worden in D-waarden tussen de micro-organismen (significantieniveau van 0,05). Indien een significant verschil werd geïdentificeerd, werden paarsgewijs Mann-Whitney U testen uitgevoerd. Om een globaal significantieniveau van 0,05 te verzekeren, werden de afzonderlijke p-waarden verstrengd volgens Dunn-Sidak (significantie als pwaarde < 0,009 ingeval van vier micro-organismen; p-waarde < 0,005 ingeval van vijf microorganismen).

30

3.7.Afdoding van bacteriën op vlees 3.7.1.Aankoop varkensvlees In dit gedeelte werd de overstap gemaakt naar de werkelijke vleesmatrix en werd het bakken in de pan van dit vlees geëvalueerd, zoals dit gebeurt bij de consument thuis. Er werd gekozen om met varkensvlees te werken. In Colruyt Gent werden telkens varkensmignonettes, varkensgehakt en pitavlees aangekocht. De gebruikte porties werden zo realistisch mogelijk gekozen. Zo zal 300 gram pitavlees gebakken worden, een mignonette van ongeveer 150 gram (dikte 1,5 cm) en een burger van varkensgehakt van 120 gram (rond met diameter 8 cm en dikte 1,5 cm). Van het aangekochte vlees werd vóór het beënten telkens de aanwezigheid van ‘the Big Four’ nagegaan en ook van E. coli als hygiëne indicator. De detectie van Salmonella spp., Listeria monocytogenes, E. coli O157:H7 en Campylobacter jejuni wordt verder uitgelegd in sectie 3.7.6. Het totaal kiemgetal werd ook vooraf bepaald door ongeveer 10 gram 1/10 te verdunnen in PPS (Pepton fysiologische zoutoplossing) en het geheel te stomacheren (stomachertoestel, Led Techno). Voor de mignonettes en de burger van varkensgehakt werd hiervoor een dwarsdoorsnede genomen met een massa van ongeveer 10 gram. De suspensie werd vervolgens uitgeplaat op PCA gietplaten, die vervolgens werden geïncubeerd bij 22°C gedurende 5 dagen. Voor het bepalen van E. coli als hygiëne indicator werd 10 gram vlees afgewogen in de stomacherzak, waarna 1/10 werd verdund met PPS. Vervolgens werd na het stomacheren 1 ml van deze suspensie verdeeld over drie REC platen (incubatie volgens Tabel 10). 3.7.2.Beënten van het vlees Voor de bacteriemix werd gewerkt met de stammen weergegeven in Tabel 12. De drie stammen van elk organisme werden samengevoegd en de bedoeling is dat van elke mix (één organisme, drie stammen) 4 log per gram op het vlees wordt aangebracht. De opkweek van de stammen gebeurde zoals beschreven in sectie 3.3. De bacteriemix werd verdund en werd langs beide zijden van de mignonette aangebracht en opengespateld. Bij het pitavlees kon de bacteriemix onder het vlees worden vermengd. Aangezien voor de burger van varkensgehakt er ook micro-organismen in de kern kunnen aanwezig zijn, werd de bacteriemix toegevoegd aan het gehakt, waarna het gehakt werd gekneed en vervolgens tot een burger werd gevormd (rond: 8 cm diameter, dikte 1,5 cm). De hoeveelheid suspensie, aangebracht op het vlees, werd lager gehouden dan 0,1%, op die manier werd de aw waarde van het vlees minimaal veranderd. Onmiddellijk na de beënting werd het aantal Salmonella spp., Listeria monocytogenes, E. coli O157:H7, Campylobacter jejuni en E. coli als hygiëne indicator op het vlees bepaald (methode zie sectie 3.7.5). Na de beënting werd het vlees overnacht gestockeerd (ca.18h) in de koelkast bij 7°C. Na deze stockage stap werd nogmaals een telling uitgevoerd om na te gaan of de micro-organismen nog verder konden uitgroeien in de koelkast. 3.7.3.Bakken van het vlees Voor het bakken werd een steelpan (Point-Virgule, diameter: 20 cm) gebruikt, die werd verhit op een elektrische kookplaat (Schott instruments). De pan werd telkens 2 minuten voorverwarmd op de hoogste stand (7). Hierna werd 10 gram SOLO® bakboter in de pan gebracht, die gedurende 2 minuten gebruind werd op de hoogste stand (7). Vervolgens werd het vlees toegevoegd. De mignonette en de burger werden telkens een aantal minuten gebakken langs één zijde, waarna het vlees werd omgedraaid en verder werd gebakken aan de andere zijde. Het pitavlees werd

31

roergebakken. Het verloop van het bakproces wordt weergegeven in Tabel 13. Bij het bakken van het pitavlees werd geen boter toegevoegd, aangezien de marinade reeds voldoende vetstoffen bevatte. Na het bakken werd opnieuw een telling uitgevoerd (zie sectie 3.7.5.). Indien geen telbare kolonies werden verkregen, werd ook de aanwezigheid nagegaan via de detectiemethoden beschreven in sectie 3.7.6. Tabel 13: Verloop van het bakproces van de mignonette, de burger van varkensgehakt en het pitavlees.

Actie Voorverwarmen pan Bruinen van boter in de pan (10 gram) Bakken vlees één zijde Bakken vlees andere zijde Roerbakken

Duur Burger 2’ 2’ 4’ 30’’ 4’ 30’’

Duur Mignonette 2’ 2’ 5’ 15’’ 5’ 15’’

Duur pitavlees 2’

7’

Stand elektrisch vuur 7 7 5 5 7

‘ : minuten ‘’ : seconden

3.7.4.Temperatuurmeting Tijdens het bakken werd zowel de kerntemperatuur als de randtemperatuur van de mignonette en van de burger van varkensgehakt gemonitord. Voor de kerntemperatuur werd een draadloze temperatuursonde (DataTrace T-logger, MesaLabs) ingebracht in de kern van het vlees. De randtemperatuur werd bovenaan en onderaan gemeten via de Testo datalogger (177-T4). Om tijdens het bakken de temperatuur van het pit vlees na te gaan werd de draadloze temperatuursonde in de pan geworpen en ‘gebakken’ net als het pitavlees. De temperatuur werd opgemeten tot 5 minuten nadat het vlees van de pan werd gehaald, aangezien de temperatuur nog kan stijgen gedurende deze tijd. 3.7.5.Telling Meteen na het beënten, na stockage in de koelkast en na het bakken werd een telling uitgevoerd van Salmonella spp., Listeria monocytogenes, E. coli O157:H7, Campylobacter jejuni en E. coli als hygiëne indicator. Ongeveer 10 gram (mignonette en burger: dwarsdoorsnede) van het vlees werd 1/10 verdund in PPS, waarna het geheel werd gestomacherd. De telling gebeurde op selectieve platen zoals beschreven in sectie 3.4. Er werd gewerkt met strijkplaten, waarbij 0,1 ml suspensie werd opengespateld. Behalve na het bakken, hier werd gebruik gemaakt van een verlaagde detectielimiet. Over drie strijkplaten werd in dit geval 1 ml suspensie verdeeld (detectielimiet: 10 kve/g) (incubatie volgens Tabel 10). 3.7.6. Aanrijking en detectie Voor het beënten en na het bakken werd de aanwezigheid nagegaan van Salmonella spp., Listeria monocytogenes, E. coli O157:H7 en Campylobacter jejuni . Naargelang de hoeveelheid vlees die werd gebakken, werden verschillende herhalingen van de aanrijking op het gebakken vlees uitgevoerd. Voor de burger kon de aanrijking en detectie slechts één maal worden uitgevoerd. Voor de mignonette werd de aanrijking twee maal uitgevoerd en voor het pitavlees drie maal. Er kon dan wel slechts 20 gram van de mignonette gebruikt worden per aanrijking in plaats van 25 gram.

32

Voor de detectie van Campylobacter jejuni werd 25 gram vlees afgewogen (20 gram ingeval van de gebakken mignonette) in een stomacherzak. Hieraan werd dan 225 ml Bolton Broth voor aanrijking 3 toegevoegd en vervolgens werd er gestomacherd. Het geheel werd micro-aerofiel geïncubeerd bij 37°C gedurende 4 à 6 h, gevolgd door een incubatie bij 41,5 °C gedurende 40 à 48 h (eveneens onder micro-aerofiele condities). Na 24 h incubatie werd een 4x4 streepenting uitgevoerd op CampyFoodAgar (incubatie volgens Tabel 10), waarna de aanrijking werd teruggeplaatst bij 41,5°C. Tot slot werd de 4x4 streepenting herhaald na 48 h (incubatie volgens Tabel 10). De aanwezigheid van Listeria monocytogenes werd nagegaan door 25 gram van het vlees af te wegen in een stomacherzak en vervolgens 225 ml Demi Fraser medium toe te voegen (bioMérieux 42727, kant-en-klare 225 ml zakjes) en te stomacheren. Na een incubatie van 24 h bij 30°C werd 0,1 ml overgebracht in een Fraser Broth Tube (bioMérieux 42072, kant-en-klare 10 ml buisjes), die werd geïncubeerd gedurende 24h bij 37°C. Vanuit deze Fraser Broth Tube werd dan een Vidas (Vidas automated Immunoassay System (99735) en Vidas LMO2 kit (30704), bioMérieux) uitgevoerd (Protocol Vidas: zie bijlage 2). Indien uit de Vidas test een positief resultaat bleek, werd ter controle een 4x4 streepenting op ALOA (vanuit Fraser Tube) uitgevoerd (incubatie volgens Tabel 10). Voor Salmonella spp. en E. coli O157:H7 werd opnieuw 25 gram vlees afgewogen in een stomachterzak (met filter). Dit keer werd gebufferd pepton water (BPW) toegevoegd. Na een incubatie van 24 h bij 37°C, werd een real-time PCR uitgevoerd via het GeneDisc systeem (GeneDisc Cycler, Pall EGDCV3A). Dankzij de GeneDisk platen (Pall, GSTECSL206006) is simultane detectie van Salmonella spp. en E. coli O157:H7 mogelijk. De detectie gebeurt op basis van genen coderend voor Shiga toxine 1 en 2 (stx1 en stx2), intimine (eae), een antigen specifiek voor E. coli O157 (rfbE) en genen specifiek voor Salmonella spp. Het protocol voor het gebruik van de GeneDisc wordt weergegeven in bijlage 3. Indien de GeneDisc positief was voor E. coli O157:H7, werd een 4x4 streepenting uitgevoerd op Chromocult agar (met naldixinezuur) (incubatie volgens Tabel 10). Indien de GeneDisc positief was voor Salmonella, werd 0,1 ml uit de aanrijking overgebracht naar RVS broth (Rappaport Vassiliadis broth, bioMérieux 42110, kant-en-klare 10 ml buisjes). De RVS werd 24 h geïncubeerd bij 37°C en vervolgens werd een 4x4 streepenting uitgevoerd op XLD (incubatie volgens Tabel 10). De 4x4 streepenting is nodig om na te gaan of het om levende cellen gaat, aangezien DNA stabiel is en dus het DNA van afgedode cellen nog steeds een positief resultaat kan geven via de GeneDisc. 3.7.7. Bewaring van de gebakken burger in de koelkast Om na te gaan of micro-organismen die na het bakken nog aanwezig, verder kunnen uitgroeien als de burger in de koelkast wordt bewaard, werd telkens een extra burger beënt en gebakken. Na het bakken werd deze in de koelkast bij 7°C bewaard gedurende vier dagen. Hierna werd een telling uitgevoerd zoals beschreven in sectie 3.7.5. Dit onderdeel kan van belang zijn, aangezien consumenten soms gebakken burgers in de koelkast bewaren en deze later consumeren zonder verhittingstap. Dit wordt alleen uitgevoerd voor Listeria monocytogenes op de burgers van varkensgehakt, aangezien mignonettes en pitavlees meestal meteen na het bakken worden 3

Na bereiding van Bolton Broth zoals beschreven door de fabrikant in een Scott fles, wordt na het autoclaveren 25 ml Laked paardenbloed SR0048 en 1 flesje Bolton Broth Selective Supplement SR0183 (na oplossen in 5 ml ethanol) toegevoegd aan ½ liter Bolton Broth en gemengd.

33

geconsumeerd en niet worden bewaard in de koelkast om daarna zonder voorafgaande verhittingstap te consumeren. Enkel Listeria monocytogenes werd geteld, aangezien dit microorganisme psychrotroof is en dus kan uitgroeien in de koelkast. 3.7.8. Berekening pasteurisatie waarden Via de pasteurisatie waarde (P-waarde) kunnen hittebehandelingen vergeleken worden. Aangezien het algemeen aanvaarde barema stelt dat een behandeling van 2 minuten bij 70°C voldoende is om een 6 log reductie in Listeria monocytogenes te verwezenlijken, werd de P70 bepaald voor elk bakexperiment. Op basis van het gemeten temperatuursprofiel tijdens het bakken van het vlees, werd deze P70 berekend voor het pitavlees en voor de kern van de burger en van de mignonette met behulp van vergelijking 7 (Daelman et al., 2013;Claeys et al., 1998). De hittebehandeling door het bakken in de pan wordt dan uitgedrukt als een equivalent van x minuten bij 70°C. (7)

∫

Met t: de tijd (minuten) en T(t): de temperatuur op tijdstip t (°C). 7,5 is de z-waarde van Listeria monocytogenes, aangezien dit organisme als indicator wordt gebruikt. Bij de berekening werd gestart vanaf een temperatuur van 55°C (Claeys et al., 1998).

4.Resultaten 4.1.Karakterisatie bouillon en vlees Van zowel BHI als van BB werden de pH (pH meter: SevenEasy, Mettler Toledo) en de a w (cryometer: Nagy, AWK-20) gemeten. De pH van de bouillon werd bij kamertemperatuur (18°C) gemeten vóór het toevoegen van 1 ml inoculum (8 à 9 log kve/ml) en na het toevoegen van 1 ml inoculum aan 9 ml van de bouillon (Tabel 14). De pH van het onverdund inoculum zelf werd ook gemeten bij kamertemperatuur. De bekomen waarden voor LFMFP 877, LFMFP 168 en LFMFP 595 zijn respectievelijk: 6,00; 6,08 en 6,67. De daling van de pH door toevoeging van onverdund inoculum aan de bouillon bedroeg 0,1 à 0,3 eenheden (Tabel 14) en aangezien de pH van het verdund inoculum bijna niet verschilt van de pH van de pure bouillon zal de toevoeging van 1 ml van dit verdund inoculum aan de bouillon dus geen noemenswaardige pH daling veroorzaken in de bouillon. Tabel 14: pH bij kamertemperatuur van BHI en BB zowel zonder inoculum als na toevoeging van 1 ml onverdund inoculum. Ook de pH van het verdund inoculum wordt weergegeven. ( BHI (1): toevoeging van LFMFP 877 (Salmonella Typhimurium) als inoculum, BHI (2) : toevoeging LFMFP 168 (E.coli) en BB toevoeging LFMFP 595 (Campylobacter jejuni))

Bouillon zonder inoculum Onverdund inoculum (8 à 9 log kve/ml) 1 ml onverdund (8 à 9 log kve/ml) inoculum in 9 ml bouillon Verdund inoculum (6 log kve/ml)

pH BHI (1) 7,27 6,00 7,13

pH BHI (2) 7,27 6,08 6,97

pH BB 7,29 6,67 7,19

7,23

7,25

Indien de temperatuur stijgt zal de pH van de bouillon dalen. De resultaten van de pH metingen van de zuivere bouillons bij 60, 65 en 70°C worden weergegeven in Tabel 15. Zowel de pH van de onaangepaste als van de aangepaste bouillon (pH 5,6 bij kamertemperatuur en 1,5% NaCl) werd

34

gemeten. Vooral bij de onaangepaste bouillons wordt bij overgang van 18°C naar 60°C een aanzienlijke pH daling waargenomen, namelijk een reductie van 0,45 eenheden en 0,64 eenheden voor BHI en BB, respectievelijk. De overgang van 60°C naar 65°C en 70°C zorgt voor een eerder geringe daling. Bij de aangepaste bouillons is de invloed van temperatuur geringer (0,16 eenheden daling tussen 18°C en 60°C). Tabel 15: pH van onaangepaste en aangepaste (pH 5,6 bij 18°C en 1,5% NaCl) bouillon (BHI en BB) bij verschillende temperaturen

BHI (onaangepaste bouillon) BB (onaangepaste bouillon) BHI (aangepaste bouillon) BB (aangepaste bouillon)

18°C 7,27 7,29 5,60 5,60

60°C 6,82 6,65 5,44 5,44

65°C 6,77 6,56 5,42 5,41

70°C 6,74 5,41

De aw waarde van de onaangepaste bouillon bedraagt 0,9963, zowel voor BHI als voor BB. Na toevoeging van NaCl tot 1,5 % daalden de aw-waarden tot 0,9901 en 0,9888 respectievelijk. De gemiddelde parameters bij kamertemperatuur (18°C) voor de verschillende types varkensvlees worden opgesomd in Tabel 16. Op basis van deze parameters werden het zoutgehalte en de pH van de bouillons (BHI en BB) aangepast voor het aangepaste bouillon experiment. Er werd geopteerd voor een pH van 5,6 en een zoutgehalte van 1,5 % NaCl. Tabel 16: Gemiddelde parameters bij kamertemperatuur (18°C) voor drie types varkensvlees (namelijk mignonettes, pitavlees en hamburger).

Type varkensvlees Mignonette Pita vlees Hamburger

pH

aw

5,54 5,81 5,70

0,9946 0,9822 0,9838

%DS (w/w) (Droge Stof) 25,27 35,33 35,21

%NaCl (w/w)

%vet (w/w)

0,08 1,54 1,40

1,25 11,02 14,63

4.2.Afdoding van onverdunde werkcultuur in bouillon Via Excel werd het aantal overlevende cellen voor de drie herhalingen voor elke stam en elke temperatuur samen in een grafiek geplot t.o.v. de verhittingstijd. In Figuur 2 worden telkens voor elke soort, de ruwe data van één stam als voorbeeld weergegeven voor beide temperaturen, aangezien tussen de verschillende stammen binnen een soort geen uitgesproken verschillen werden gemerkt in het verloop van de afdoding. De grafieken voor alle organismen worden weergegeven in bijlage 4. De detectielimiet bedraagt 1,3 log kve/ml. De resultaten van de GInaFiT worden weergegeven in Figuur 3 voor dezelfde voorbeeldstammen als in Figuur 2. De resultaten van de fit voor alle micro-organismen kunnen gevonden worden in bijlage 5. Het gemiddelde van de drie herhalingen wordt voorgesteld door de blauwe datapunten en het resultaat van het gefitte model door de rode doorlopende lijn. De parameters, horend bij het bifasische model, worden gegeven in Tabel 17. D-waarde1 slaat op het eerste loglineair gedeelte van het bifasische model en D-waarde2 op het tweede loglineair gedeelte (Tabel 17). Een opmerking die kan gemaakt worden is dat de D-waarde1 in vele gevallen slechts op twee datapunten is gebaseerd. Voor de D-waarde2 werden steeds meer dan zeven datapunten gebruikt (Figuur 3).

35

Figuur 2: Afdodingscurves met ruwe data van het onverdund inoculum experiment voor de LFMFP stammen 595, 872, 846 en 168 bij 60°C (links) en 65°C (rechts) . Afdodingscurve voor LFMFP 392 bij 65°C (links) en 70°C (rechts). Blauwe doorlopende lijn: detectielimiet bij 1,3 log kve/ml.

36

Figuur 3: Fit met bifasisch model via GInaFiT. Het gemiddelde van de gemeten waarden van het onverdund inoculum experiment wordt weergegeven door de blauwe vierkanten. De fit door het model wordt weergegeven door een doorlopende rode lijn.

37

Tabel 17: Parameters bekomen via GInaFiT en berekende D-waarden voor alle stammen bij de verschillende temperaturen voor het onverdund inoculum experiment.

Organisme


E. coli

E. coli O157:H7

Salmonella spp.

Listeria monocytogenes


E. coli

E. coli O157:H7

Salmonella spp.


Stam (LFMFP)

Temp (°C)

kmax1 (1/min)

kmax2 (1/min)

f (–)

LOG10(N0) (kve/ml)

Schouder (min)

R2

Dwaarde1 (min)*

Dwaarde2 (min)*

595 864 865 866 867 063 134 137 168 811 846 847 848 849 736 872 874 875 877 392 421 491 809 810 595 864 865 866 867 063 134 137 168 811 846 847 848 849 736 872 874 875 877 392 421 491 809 810

60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 65 65 65 65 65 65 65 65 65 65 65 65 65 65 65 65 65 65 65 65 65 65 65 65 70 70 70 70 70

5,92 6,74 4,87 6,32 5,11 2,37 2,29 3,03 2,34 2,38 1,51 1,73 1,36 1,44 5,01 3,54 4,18 3,00 2,48 6,05 5,49 4,44 5,97 5,97 3,61 5,89 27,23 5,21 7,38 6,51 6,08 6,11 7,26 6,55 5,72 5,38 6,35 5,06 6,69 5,37 6,93 5,97 6,42 6,28 0,63 7,88 6,22 5,76

0,24 0,33 0,23 0,23 0,20 0,14 0,06 0,09 0,09 0,13 0 0,12 0,12 0,06 0,13 0,10 0,11 0,09 0,09 0,14 0,21 0,15 0,27 0,24 0,24 0,41 0,34 0,24 0,27 0,29 0,15 0,17 0,24 0,15 0,22 0,13 0,19 0,14 0,23 0,17 0,12 0,09 0,14 0,20 0,00 0,28 0,41 0,16

0,9904 0,9951 0,9942 0,9983 0,9974 0,9986 0,9977 0,9960 0,9963 0,9969 0,9998 0,9994 0,9975 0,9987 0,9972 0,9902 0,9950 0,9962 0,9955 0,9979 0,9945 0,9731 0,9920 0,9978 0,9955 0,9976 0,9868 0,9974 0,9966 0,9934 0,9972 0,9967 0,9966 0,9968 0,9963 0,9984 0,9967 0,9980 0,9963 0,9957 0,9983 0,9962 0,9975 0,9967 1,0000 0,9963 0,9975 0,9984

7,65 7,17 7,49 7,66 7,75 8,08 8,11 8,05 7,70 7,91 7,96 7,61 7,87 7,66 7,84 7,64 8,03 7,87 7,95 8,43 8,27 7,70 8,17 8,49 7,33 7,08 7,24 7,29 7,39 7,98 8,14 8,10 7,79 7,94 7,65 7,52 7,93 7,84 7,77 7,94 8,17 8,02 8,04 8,33 6,83 8,34 8,44 8,50

0 0 0 0 0 0,28 0 0 0,84 1,31 0,23 0,29 0,47 1,65 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0,9718 0,9446 0,9536 0,9983 0,9404 0,9781 0,9936 0,9929 0,9908 0,9943 0,9815 0,9754 0,9909 0,9925 0,9841 0,9584 0,9812 0,9754 0,9933 0,9251 0,9829 0,8666 0,9532 0,9381 0,9733 0,9566 0,9778 0,9544 0,9484 0,9687 0,9578 0,9379 0,9719 0,9394 0,9630 0,9913 0,9352 0,9183 0,9299 0,9807 0,9146 0,9785 0,9841 0,9226 0,8572 0,9785 0,9691 0,9469

0,39 0,34 0,47 0,36 0,45 0,97 1,01 0,76 0,98 0,97 1,52 1,33 1,69 1,60 0,46 0,65 0,55 0,77 0,93 0,38 0,42 0,52 0,39 0,39 0,64 0,39 0,08 0,44 0,31 0,35 0,38 0,38 0,32 0,35 0,40 0,43 0,36 0,46 0,34 0,43 0,33 0,39 0,36 0,37 3,65 0,29 0,37 0,40

9,59 6,98 10,01 10,01 11,51 16,45 38,38 25,58 25,58 17,71 19,19 19,19 38,38 17,71 23,03 20,93 25,58 25,58 16,45 10,96 15,35 8,53 9,59 9,59 5,62 6,77 9,59 8,53 7,94 15,35 13,54 9,59 15,35 10,47 17,71 12,12 16,45 10,01 13,54 19,19 25,58 16,45 11,51 8,22 5,62 14,39

*D-waarde1 wordt berekend op basis van het eerste loglineair deel van de bifasische curve, D- waarde2 op basis van het tweede deel.

38

4.3.Afdoding van verdunde werkcultuur in onaangepaste en aangepaste bouillon De drie herhalingen van de tellingen van de overlevende cellen voor elke stam en elke temperatuur werden samen in een grafiek geplot t.o.v. de verhittingstijd. Deze figuren kunnen voor alle stammen teruggevonden worden in bijlagen 6 en 7, zowel voor het experiment met verdunde werkcultuur in normale bouillon als voor het experiment met verdunde werkcultuur in de aangepaste bouillon. Als voorbeeld worden in Figuur 5 de curven weergegeven met ruwe data voor dezelfde voorbeeldstammen als in Figuur 2, maar dit keer enkel bij de laagste temperatuur. De detectielimiet voor de experimenten met verdunde werkcultuur bedraagt 1 kve/ml. Ook op deze data werd de GInaFiT software toegepast. In Figuur 6 en Figuur 7 worden de fits weergegeven voor alle stammen van Campylobacter jejuni en Listeria monocytogenes. De curven voor de andere micro-organismen kunnen terug gevonden worden in bijlage 8. De bijhorende parameters worden weergegeven in Tabel 18 en Tabel 19, waarin ook de D-waarden worden weergegeven die werden berekend zoals vermeld in sectie 3.6. Wat betreft de D-waarden (eerste deel van de bifasische curve; D-waarde1) bekomen in onaangepaste bouillon werd geen significant verschil gevonden bij 65°C (p-waarde: 0,133), maar wel bij 60°C (p-waarde: 0,001). Campylobacter jejuni bleek significant minder hitteresistent te zijn dan E. coli O157:H7 (p-waarde: <0,001) en dan Salmonella spp.(p-waarde: 0,001)(Figuur 4). Voor de Dwaarden in aangepaste bouillon werden, zowel bij 60°C als bij 65°C, geen significante verschillen gevonden (p-waarden: 0,086 en 0,157). Hierbij moet men wel in het achterhoofd houden dat deze testen gebaseerd zijn op een relatief laag aantal D-waarden per micro-organisme en dat deze Dwaarden vaak slechts op twee datapunten zijn gebaseerd.

Figuur 4: Gemiddelde D-waarden (op basis van het eerste deel van de bifasische curve) voor Campylobacter jejuni, E. coli, E. coli O157:H7 en Salmonella spp. in normale bouillon bij 60°C. Statistisch significante verschillen worden aangeduid door verschillende letters.

39

Figuur 5: Afdodingscurves met ruwe data van het verdund inoculum experiment (links) en het aangepaste bouillon experiment (rechts) voor de LFMFP stammen 595, 872, 846 en 168 bij 60°C. Afdodingscurve voor LFMFP 392 bij 65°C. Detectielimiet bij 1 kve/ml.

40

Figuur 6: Fit met bifasisch model via GInaFiT voor de verschillende stammen van Campylobacter jejuni. Het gemiddelde van de gemeten waarden van het verdund inoculum experiment en van het aangepaste bouillon experiment wordt weergegeven door de blauwe vierkanten. De fit door het model wordt weergegeven door een doorlopende rode lijn.

41

Figuur 7: Fit met bifasisch model via GInaFiT voor de verschillende stammen van Listeria monocytogenes. Het gemiddelde van de gemeten waarden van het verdund inoculum experiment en van het aangepaste bouillon experiment wordt weergegeven door de blauwe vierkanten. De fit door het model wordt weergegeven door een doorlopende rode lijn.

42

Tabel 18: Parameters bekomen via GInaFiT en berekende D-waarden voor alle stammen bij de verschillende temperaturen voor het verdund inoculum experiment.

Organisme

Campylobacter jejuni E.coli E.coli O157:H7

Salmonella spp.

Listeria monocytogenes Campylobacter jejuni E. coli E. coli O157:H7

Salmonella spp.


Stam (LFMFP)

Temp (°C)

kmax1 (1/min)

kmax2 (1/min)

f (–)

LOG10(N0) (kve/ml)

Schouder (min)

Dwaarde1 (min)*

Dwaarde2 (min)*

595 866 867 063 168 846 847 849 872 875 877 392 421 491 595 866 867 063 168 846 847 849 872 875 877 392 421 491

60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 65 65 65 65 65 65 65 65 65 65 65 65 65 65 70 70 70

6,27 7,94 4,73 7,35 1,98 3,53 2,96 2,56 2,87 2,51 2,49 6,34 7,06 2,91 7,90 7,03 7,96 7,35 12,12 6,97 6,89 6,97 7,55 8,04 6,95 6,71 10,08 7,33

0,16 0 0,15 0,18 0,05 0,17 0,02 0,05 0,16 0,03 0,14 0,17 0,21 0,07 0,22 0,08 0,03 0,18 0,10 0,12 0,07 0,12 0,14 0,10 0,14 0,16 0,16 0,13

0,9999 1,0000 1,0000 0,9998 1,0000 0,9992 0,9999 0,9999 0,9993 0,9999 0,9995 0,9995 0,9994 0,9996 0,9998 0,9999 0,9999 0,9998 0,9999 0,9998 0,9999 0,9997 0,9996 0,9998 0,9997 0,9997 0,9999 0,9999

5,24 4,57 5,74 4,89 4,98 4,37 4,48 4,80 5,24 5,23 5,21 5,13 5,32 5,23 5,51 4,52 4,77 4,89 4,66 4,68 4,50 4,68 5,09 4,94 5,00 5,10 5,24 5,10

0 0 0 0 0 1,17 1,24 1,14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0,37 0,29 0,49 0,31 1,16 0,65 0,78 0,90 0,80 0,92 0,92 0,36 0,33 0,79 0,29 0,33 0,29 0,31 0,19 0,33 0,33 0,33 0,31 0,29 0,33 0,34 0,23 0,31

14,39 15,35 12,79 46,05 13,54 115,13 46,05 14,39 76,75 16,45 13,54 10,96 32,89 10,47 28,78 76,75 12,79 23,03 19,19 32,89 19,19 16,45 23,03 16,45 14,39 14,39 17,71


43

Tabel 19: Parameters bekomen via GInaFiT en berekende D-waarden voor alle stammen bij de verschillende temperaturen voor het aangepaste bouillon experiment.

Organisme

Campylobacter jejuni E.coli E.coli O157:H7

Salmonella spp.

Listeria monocytogenes Campylobacter jejuni E. coli E. coli O157:H7

Salmonella spp.


Stam (LFMFP)

Temp (°C)

kmax1 (1/min)

kmax2 (1/min)

f (–)

LOG10(N0) (kve/ml)

Schouder (min)

Dwaarde1 (min)*

Dwaarde2 (min)*

595 866 867 063 168 846 847 849 872 875 877 392 421 491 595 866 867 063 168 846 847 849 872 875 877 392 421 491

60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 65 65 65 65 65 65 65 65 65 65 65 65 65 65 70 70 70

5,30 3,18 4,45 1,64 1,24 1,39 2,35 0,96 1,96 2,18 1,92 7,61 3,51 3,16 7,98 8,60 23,29 4,31 5,65 12,05 6,37 4,82 7,55 30,91 19,56 8,11 8,69 7,41

0,10 0,04 0,18 0,08 0,06 0,02 0,09 0,10 0,09 0,03 0,14 0,21 0,12 0,18 0,15 0,25 0,46 0,10 0,00 0,08 0,13 0,06 0,27 0,14 0,13 0,24 0,16 0,32

1,0000 0,9999 0,9997 0,9999 0,9999 0,9999 0,9997 0,9998 0,9999 1,0000 0,9998 0,9996 0,9999 0,9997 0,9999 0,9997 0,9994 0,9999 1,0000 0,9998 0,9994 0,9998 0,9996 0,9996 0,9999 0,9999 0,9999 0,9995

5,86 4,67 5,61 5,09 4,64 4,26 4,32 4,74 5,09 5,26 5,06 5,34 5,20 5,23 5,43 4,89 5,39 4,91 4,57 4,74 4,73 4,82 5,02 5,04 4,83 5,30 5,17 5,19

0 0 0 0,82 1,91 2,58 2,30 1,93 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,40 0 0 0 0 0 0 0 0

0,43 0,72 0,52 1,40 1,86 1,66 0,98 2,40 1,18 1,06 1,20 0,30 0,66 0,73 0,29 0,27 0,10 0,53 0,41 0,19 0,36 0,48 0,31 0,07 0,12 0,28 0,27 0,31

23,03 57,56 12,79 28,78 38,38 115,13 25,58 23,03 25,58 76,75 16,45 10,96 19,19 12,79 15,35 9,21 5,01 23,03 28,78 17,71 38,38 8,53 16,45 17,71 9,59 14,39 7,20


44

4.4.Afdoding van bacteriën in vlees De temperatuursprofielen van de kern en de rand van het vlees werden drie maal opgemeten. De bekomen profielen en het gemiddeld temperatuursprofiel worden weergegeven in Figuur 8, Figuur 9 en Figuur 10. Men kan hier een grote variatie opmerken tussen de verschillende herhalingen, maar ook in de realiteit bij de consument thuis zal er zich veel variatie voordoen. In Tabel 21 kan een overzicht van de resultaten van dit experiment teruggevonden worden. Het bakken werd voor de burgers zes maal herhaald, aangezien vier burgers natuurlijk gecontamineerd waren met Campylobacter jejuni en één burger met Listeria monocytogenes en aangezien deze burgers ook na bakken nog positief werden getest voor deze organismen. Om deze reden werden ook vier porties pitavlees gebakken i.p.v. drie (natuurlijke contaminatie met Listeria monocytogenes). Op één van de mignonettes werd ook Campylobacter jejuni natuurlijk terug gevonden, toch werden slechts drie mignonettes gebakken, aangezien dit micro-organisme niet werd gedetecteerd na het bakken. Het totaal aeroob kiemgetal bedroeg gemiddeld 5,29 log kve/g voor de burgers, 3,84 log kve/g voor de mignonettes en 4,01 log kve/g voor het pitavlees. Er werd geen natuurlijke contaminatie met E. coli teruggevonden. De resultaten van de tellingen van Listeria monocytogenes op de gebakken burgers die gedurende vier dagen in de koelkast werden bewaard, worden weergegeven in Tabel 20.

Tabel 20: Resultaten van de telling voor Listeria monocytogenes op de gebakken burger, na bewaring bij 7°C gedurende vier dagen.

Herhaling Burger 1 Burger 2 Burger 3

Telling na vier dagen bewaring bij 7°C (log kve/g) 3,43 <2 <2

45

Figuur 8: Temperatuursprofiel tijdens het bakken van het pitavlees. Open blauwe pijl: moment waarop P 70=2 minuten wordt gehaald; rode pijl: moment waarop het vlees van de pan wordt gehaald.

Figuur 9: Temperatuursprofiel tijdens het bakken van de mignonette. Bovenste rij: kerntemperatuur met blauwe open pijl als aanduiding voor het halen van P70=2 minuten. Onderste rij: randtemperatuur, waarbij de eerste rode pijl het omdraaien van het vlees aanduidt en de tweede aanduidt wanneer het vlees van de pan wordt gehaald.

46

Figuur 10: Temperatuursprofiel tijdens het bakken van de burger. Bovenste rij: kerntemperatuur met blauwe open pijl als aanduiding voor het halen van P70=2 minuten. Onderste rij: randtemperatuur, waarbij de eerste rode pijl het omdraaien van het vlees aanduidt en de tweede aanduidt wanneer het vlees van de pan wordt gehaald.

47

Tabel 21: Overzichtstabel van het bakexperiment. De gemiddelde waarde van drie herhalingen wordt weergegeven (twee herhalingen voor Campylobacter jejuni in de burger).

Organisme

L. monocytogenes

Bereiding

Baktijd (min)

Aantal na inoculatie (log kve/g)

pita

7

4,35

Aantal na Aantal na overnachten bakken (log kve/g) (log kve/g) 4,35

0,33

log Aanwezigheid reductie na bakkena na bakken 4,02 + (1/3+1/3+0/3)

Salmonella spp.

pita

7

4,08

4,11

<1

>3,11

pita

7

4,40

4,00

<1

>3,00

(0/3+0/3+0/3)

E. coli O157

P70-waarde (min)c

5’30’’

Na 7 min: 253,59

Na 12 min: 437,60

3’50”

3352,64

5440,30

2’5’’

20414,59

20414,95

>15’30’’

Na 10,5 min: 0,77

Na 15,5 min: 1,53

>15’30’’

0,24

1,28

15’5’’

1,64

2,05

5’55’’

Na 9 min: 3,67

Na 14 min: 53,25

12’20’’

0,08

3,70

3’55’’

2077,42

2110,24

(0/3+0/3+0/3)

Campylobacter

P70= 2 min bereikt op (min’ sec”)b

pita

7

3,53

3,53

<1

>2,53

+

pita mignonette

7 10,5

3,87 4,28

3,95 4,13

<1 <1

>2,95 >3,13

Niet bepaald

(0/3+1/3+0/3)

E.coli L. monocytogenes

(0/2+0/2+0/2)

Salmonella spp.

mignonette

10,5

4,12

3,83

<1

>2,83

+ (0/2+0/2+1/2)

Campylobacter

mignonette

10,5

4,38

4,45

<1

>3,45

(0/2+0/2+0/2)

E. coli O157

mignonette

10,5

3,39

3,34

<1

>2,34

(0/2+0/2+0/2)

E.coli L. monocytogenes

mignonette hamburger

10,5 9

3,83 3,88

3,89 3,94

<1 1,82

>2,89 2,12

Niet bepaald

+ (1/1+1/1+1/1)

Salmonella spp.

hamburger

9

3,90

3,46

<1

>2.46

+ (1/1+1/1+0/1)

Campylobacter

hamburger

9

4,26

4,31

0,50

3,81

+ (1/1+1/1)

E. coli O157

hamburger

9

2,95

2,98

0,33

2,65

+ (1/1+1/1+0/1)

E.coli

hamburger

9

3,69

3,52

0,33

3,18

Niet bepaald

a Per herhaling werd de aanrijking 1, 2 of 3 maal uitgevoerd. De onderste rij geeft telkens voor elke herhaling (gescheiden door “+”) het aantal positieve resultaten weer van de 1, 2 of 3 aanrijkingen. b Aantal minuten verhitting (op basis van het temperatuursprofiel in de kern) om een P70=2 minuten te bekomen. c De P70 -waarde die werd bereikt (op basis van het temperatuursprofiel in de kern) op het moment dat het vlees van de pan wordt gehaald (links) en na vijf minuten nagaren op het bord (rechts).

48

5.Discussie 5.1.Tailing effect en mogelijke oorzaken Een eerste belangrijke bevinding bij de bouillon experimenten is het optreden van tailing. De bekomen curven in dit werk met de uitgesproken tailing lijken in eerste instantie vrij tegenstrijdig met D-waarden gepubliceerd in de literatuur. Vaak echter, worden in de literatuur enkel de bekomen D-waarden vermeld, zonder weergave van de eigenlijke curve die werd bekomen (Goepfert et al., 1970;Whiting and Golden, 2002). Indien de hittebehandeling dan niet voldoende lang werd aangehouden en opgevolgd, kan een tailing effect onopgemerkt gebleven zijn (Whiting and Golden, 2002;McCormick et al., 2003;Goepfert et al., 1970). Bovendien is het rapporteren van D-waarden een reeds lang ingeburgerd objectief voor hitte-inactivatie studies, aangezien D-waarden gemakkelijke interpretatie en implementatie toelaten naar de industrie toe. Het is dus mogelijk dat auteurs om deze reden in het verleden de hittebehandeling niet langer aanhielden dan nodig om een D-waarde te kunnen berekenen. Zo werd het hitte-experiment door McCormick et al. (2003) slechts 1 minuut aangehouden om de D65°C voor Listeria monocytogenes te bepalen. Een mogelijk gevaar is dat deze waarden worden opgenomen in reviews, waarbij deze limitatie niet direct vermeld wordt en over het hoofd wordt gezien door de lezer. Het gevaar bestaat dat deze D-waarden worden geëxtrapoleerd naar langere verhittingstijden, aangezien er in hittebehandelingen over het algemeen een 6 log reductie wordt nagestreefd, terwijl de D-waarden in sommige studies (McCormick et al., 2003;Goepfert et al., 1970) werden berekend op basis van afdodingscurven waarin slechts een 3 à 4 log reductie werd behaald. Bovendien kan enkel een succesvol gebruik van D-waarden gegarandeerd worden bij de implementatie in hittebehandelingen in de voedingsindustrie, indien de inactivatie een loglineair verloop volgt (Humpheson et al., 1998). Afwijkingen van de eerste orde kinetiek werden wel reeds in verschillende studies gerapporteerd (Humpheson et al., 1998;Lianou et al., 2006;Sörqvist, 2003;Geeraerd et al., 2005). Door Stringer et al. (2000) worden enkele limitaties in de experimentele procedure opgesomd die mogelijks zouden kunnen leiden tot een tailing en/of schouder effect. Namelijk het feit dat de behandeling heterogeen kan zijn door de methode, door een niet uniform verhittingsmedium of door het achterblijven van cellen aan wanden van het testrecipiënt (Dhir and Dodd, 1995;Stringer et al., 2000). Deze laatstgenoemde oorzaak zou kunnen aangehaald worden als potentieel verantwoordelijke factor voor de tailing in dit werk. Om dit te minimaliseren werd echter zo dicht mogelijk bij het vloeistofoppervlak geïnoculeerd. Ook zou het in dit werk kunnen dat het inoculum niet homogeen is verdeeld in het verhittingsmedium door het ontbreken van een magnetische roerder en doordat er niet wordt gevortexed wanneer het inoculum is toegediend. Een magnetische roerder kon niet gebruikt worden, aangezien er met reageerbuisjes werd gewerkt en het vortexen zou betekenen dat de reageerbuisjes uit het warmwaterbad zouden moeten gehaald worden, wat zou resulteren in een temperatuursdaling van de bouillon. Door de hoge celdensiteiten in het onverdund inoculum experiment zouden de dode cellen een beschermend effect kunnen hebben op de nog levende (Stringer et al., 2000), hoewel de studie van Humpheson et al. (1998) deze hypothese niet kon bevestigen. Door Humpheson et al. (1998) wordt ook aangehaald dat bepaalde verhittingsmedia in combinatie met hoge celdensiteiten zouden

49

kunnen leiden tot vorming van aggregaten. Hierdoor zullen bepaalde subpopulaties minder blootgesteld worden aan de hitte. Voor Salmonella Enteritidis in Nutrient Broth werd geen aggregatie vastgesteld via microscopie (Humpheson et al., 1998). Bij verhitting van Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis cellen in melk werd echter wel aggregaatvorming vastgesteld (Grant et al., 2008). De gebruikte media in dit werk, namelijk BHI of BB, leunen echter vrij dicht aan bij het Nutrient Broth medium, waardoor aggregaatvorming vrij onwaarschijnlijk is. Men kan dus stellen dat in het protocol werd getracht om deze limitaties zoveel mogelijk te beperken, waardoor het tailing effect eerder zou kunnen voortkomen uit het normale mechanisme van inactivatie. Hier kan de mogelijkheid worden vermeld dat er binnen de genetisch homogene populatie fenotypische verschillen bestaan (Humpheson et al., 1998), waardoor subpopulaties kunnen bekomen worden met een verschillende hitteresistentie. Uit Figuur 2 kan afgeleid worden dat de meer hitteresistente subpopulatie in het onverdund inoculum experiment telkens ongeveer 4 à 5 log kve/ml omvat. Deze cellen bevinden zich dus in het tweede gedeelte van de bifasische curve, geconstrueerd via GInaFiT, en bezitten een hogere D-waarde (D waarde2 in Tabel 17) in vergelijking met de minder hitteresistente populatie (D-waarde1 in Tabel 17). GInaFiT geeft ook het aandeel weer van de meer hitteresistente subpopulatie in de initiële populatie, wat wordt aangeduid als (1-f) (Tabel 17). De f-waarde is voor alle stammen bij beide temperaturen kleiner dan 1 (behalve voor één Listeria monocytogenes stam bij 70°C), wat bevestigt dat er twee subpopulaties kunnen onderscheiden worden. De f-waarde is vrij gelijkaardig voor alle stammen en bedraagt gemiddeld 0,995888. Men kan dus stellen dat gemiddeld 0,4% van de initiële totale populatie behoort tot de meer hitteresistente populatie. Hoewel dit een zeer klein aandeel lijkt, zorgt dit toch voor een aanzienlijke populatie indien het initieel aantal cellen hoog is. Maar zelfs in de realiteit, dus ingeval van een lager initieel celaantal, blijft dit een belangrijk gegeven. Aangezien bepaalde microorganismen slechts een lage infectueuze dosis hebben, is het van belang om ook rekening te houden met deze meer hitteresistente groep. In een studie van Humpheson et al. (1998) werden bifasische curven bekomen met een resistentere subpopulatie die 0,01 à 0,001 % van de initiële populatie uitmaakte. Een duidelijk zichtbaar bifasisch verloop werd enkel bekomen indien de initiële populatie groter was dan 7 log kve/ml. Door een initieel relatief laag celaantal kan het tailing effect verborgen blijven. Dit wordt duidelijk in de experimenten waarbij met een lagere initiële celconcentratie werd gewerkt en het merendeel van de curven (Figuur 5 en bijlage 6) een loglineaire daling lijken te vertonen tot onder de detectielimiet. Toch duiken er op latere tijdstippen nog steeds telbare kolonies op, waaruit blijkt dat er toch een kleine meer hitteresistente subpopulatie aanwezig is. Dit blijkt ook uit de f-waarden voor deze experimenten, die in het merendeel van de gevallen kleiner zijn dan 1, met een gemiddelde van 0,9998. Er doet zich dus een tailing voor rond de detectielimiet, die men mogelijks zou kunnen missen indien het hitte-experiment niet langer wordt aangehouden dan het loglineair gedeelte. Ook een te hoge detectielimiet kan dit tailing effect mogelijks verbergen.

5.2.De safe harbour en D-waarden Eén van de doelstellingen van dit werk was het valideren van de algemeen aanvaarde safe harbour: 2 minuten 70°C, die minstens een 6 log reductie in Listeria monocytogenes zou moeten teweegbrengen (Daelman et al., 2013). Een proces dat een 6 log reductie kan bewerkstelligen wordt algemeen als veilig beschouwd (Bunning et al., 1990). Aangezien Listeria monocytogenes wordt beschouwd als de meest hitteresistente vegetatieve pathogeen (Devlieghere et al., 2011), zou dit

50

zeker moeten voldoende zijn voor een 6 log reductie in Salmonella spp., E coli spp. en Campylobacter spp. Uit het onverdund inoculum experiment echter blijken 2 minuten bij 70°C slechts een 2,5 à 3 log reductie te verwezenlijken voor Listeria monocytogenes. Bovendien wordt deze 6 log reductie in Listeria monocytogenes cellen in de meeste gevallen zelfs niet gehaald na 20 minuten bij 70°C. In het verdund inoculum experiment en het aangepaste bouillon experiment deed er zich een tailing voor rond de detectielimiet waardoor de reductie net geen 5 log bedroeg. De D70°C-waarden voor Listeria monocytogenes (op basis van het eerste gedeelte van de curve), bekomen in de drie verschillende proeven, liggen tussen 0,23 en 0,40 minuten (Tabel 174, Tabel 18 en Tabel 19). Hoewel deze waarden lichtjes hoger zijn dan de D70°C-waarden vermeld door Devlieghere et al. (2011) en ICMSF (1996) (namelijk: 0,1-0,3 minuten), zou men toch een 6 log reductie kunnen verwachten na 1,38 à 2,4 minuten op basis van de bekomen D-waarden. Het is dus de meer hitteresistente subpopulatie die verantwoordelijk is voor het niet behalen van de beoogde reductie en die mogelijks onopgemerkt is gebleven in bepaalde studies (zie sectie 5.1.). De D70°C-waarden voor deze hitteresistente subpopulatie variëren tussen 5,62 en 17,71 minuten (Tabel 17, Tabel 18 en Tabel 19), waardoor 33,72 à 106,26 minuten zouden nodig zijn om een 6 log reductie te bekomen. Hoewel Listeria monocytogenes wordt beschouwd als de meest hitteresistente vegetatieve pathogeen werd bij de vergelijking van de bekomen D65°C -waarden geen significant verschil gevonden met de D-waarden van de andere micro-organismen (zowel in normale als in aangepaste bouillon). Indien de tailing buiten beschouwing wordt gelaten, kan men besluiten dat de bekomen D-waarden (D-waarde1) in normale bouillon van de meeste micro-organismen niet veel afwijken van deze uit de literatuur. Voor Salmonella Typhimurium en Derby in BHI vermelden Doyle en Mazzotta (2000) een D60°C van 0,82 en 0,66 minuten, respectievelijk. In dit werk werd geen uitgesproken verschil gemerkt tussen de serotypes en werd voor de onaangepaste bouillon experimenten een D60°C-waarde bekomen van 0,46 à 0,93 minuten. Ook de D-waarde vermeld door Devlieghere et al. (2011) ligt in deze range: namelijk 0,4 à 0,6 minuten. Studies uitgevoerd bij 65°C voor de gebruikte serotypes in normale bouillon zijn eerder beperkt, meestal wordt slechts tot 60°C gewerkt (Humpheson et al., 1998;ICMSF, 1996;Doyle and Mazzotta, 2000;Goepfert et al., 1970). Het feit dat Campylobacter jejuni vaak beschreven wordt als een vrij gevoelig pathogeen dat minder resistent is t.o.v. stressomstandigheden in vergelijking met andere voedselgebonden pathogenen (Park, 2002), komt wel naar voor uit de statistische tests op de D-waarden1 bij 60°C. Bij 65°C wordt er dan weer geen significant verschil gevonden. Al Sakkaf en Jones (2012) vonden een D60°C van 0,025 à 0,07 minuten in BHI voor Campylobacter jejuni. Deze waarden zijn vrij laag vergeleken met deze in Tabel 17 en Tabel 18 (0,29-0,49 minuten). In ICMSF (1996) worden echter ook hogere waarden vermeld dan gerapporteerd door Al Sakkaf en Jones (2012), namelijk 0,18 à 0,39 minuten (Tabel 8). Hitte-experimenten in buffers of bouillons werden zelden uitgevoerd bij temperaturen hoger dan 60°C voor Campylobacter jejuni (Sörqvist, 1989;Al Sakkaf and Jones, 2012;ICMSF, 1996). Voor E. coli O157:H7 wordt in het ICMSF 5 handboek (Tabel 8) een D60°C vermeldt van 1,3 minuten in Nutrient Broth met fosfaat buffer. Stringer et al. (2000) rapporteren een D60°C in bouillon en buffers van ongeveer 1,7 minuten. Deze waarden liggen iets hoger dan de D-waarden1 bekomen in de 4

De D-waarde voor LFMFP 421 werd niet in beschouwing genomen, aangezien de curve bekomen via GInaFiT een minder goede fit vertoonde met de data.

51

normale bouillon experimenten uit dit werk, maar hier dient ook rekening gehouden te worden met het schouder effect dat optreedt bij alle stammen van E. coli O157:H7 en in sommige gevallen ook bij E. coli. Geeraerd et al. (2005) vermelden dat bifasische afdodingscurven voorafgegaan door een schouder vrij zeldzaam zijn. Schouders werden wel reeds gerapporteerd voor E. coli O157:H7, o.a. door Juneja et al. (1997) in rundvlees en kip. Ook voor E.coli O157:H7 werden hitte-inactivatiestudies in bouillon vooral uitgevoerd bij temperaturen tot 60°C (Whiting and Golden, 2002;ICMSF, 1996). Hoewel op basis van de D-waarden van de minst hitteresistente populatie, veel overeenkomst werd gevonden met waarden uit de literatuur, kan het niet in rekening brengen van de meer resistente subpopulatie leiden tot een grote onderschatting van de hitteresistentie. Om misverstanden te vermijden is het dus aan te raden om ook de D-waarde van de hitteresistente subpopulatie telkens te vermelden. Men kan bovendien opmerken dat de variabiliteit tussen de stammen van een microorganisme in dit werk vrij beperkt is, hoewel in de literatuur voor deze micro-organismen toch wel variaties worden gerapporteerd (Whiting and Golden, 2002;Doyle et al., 2001;Doyle and Mazzotta, 2000;Habib et al., 2010).

5.3.Effect van verlaagde pH en verhoogd NaCl gehalte Indien men de figuren en tabel van het experiment met verlaagde inoculumconcentratie in normale bouillon vergelijkt met deze van het experiment in de aangepaste bouillon (Tabel 18, Tabel 19, bijlage 6 en bijlage 7), kan men voor de meeste micro-organismen weinig verschil opmerken. Echter, voor E. coli O157:H7 heeft de aangepaste bouillon gezorgd voor een verlenging van het schouder effect (1,14-1,24 minuten in het verdund inoculum experiment t.o.v. 1,93-2,58 minuten in het aangepaste bouillon experiment) en voor E. coli als hygiëne indicator werd in het aangepaste bouillon experiment wel een schouder waargenomen (0,82-1,91 minuten), terwijl dit in normale bouillon niet het geval was. Bovendien kan men opmerken, vooral voor E. coli O157:H7, dat de helling van het eerste loglineaire gedeelte minder steil verloopt in het aangepaste bouillon experiment, waardoor de tailing zich pas na 10 à 14 minuten inzet. Dit is het meest uitgesproken voor stam LFMFP 849, waarvoor een D-waarde1 van 0,90 minuten werd bekomen in normale bouillon, terwijl deze in aangepaste bouillon gestegen is tot 2,40 minuten (Tabel 18, Tabel 19, bijlage 6 en bijlage 7). Voor E. coli O157:H7 en in mindere mate voor E. coli en Salmonella spp. kan men dus stellen dat het aanpassen van de bouillon de populatie meer hitteresistent heeft gemaakt. Zoals reeds eerder aangehaald, wordt algemeen aangenomen dat de overleving van een hitteexperiment meestal het grootst is, indien de pH van het medium ongeveer neutraal is (Jay, 2000). Bij een lagere pH zou men dus een daling in hitteresistentie verwachten (Doyle et al., 2001), maar dit wordt niet bevestigd in dit experiment. Nu kan het onverwacht effect, verkregen in dit werk, misschien worden verklaard door de combinatie van de verlaagde pH en verhoogd zoutgehalte. Het beschermend effect van NaCl t.o.v. hitte werd ook reeds besproken in sectie 2.5.2. Blackburn et al. (1997) merkten een beschermend effect van NaCl, toegevoegd in Tryptone Soya Broth, tot de maximum geteste concentratie (namelijk 8,5 % w/w). Voor Salmonella Enteritidis zou de optimale concentratie voor overleving ongeveer 5 à 7 % bedragen (Blackburn et al., 1997). Hierbij is het belangrijk te vermelden dat de toename in hitteresistentie door het verlagen van de a w niet oneindig kan doorgetrokken worden. Kaur et al. (1998) merkten een toename in hitteresistentie van E. coli O157:H7 bij een reductie in de aw van 0,99 naar 0,96 in Nutrient Broth, maar vanaf een waarde van 0,95 en lager werd een lagere hitteresistentie voor E. coli O157:H7 waargenomen. De concentratie

52

van de aw verlagende component zou dan mogelijks zo hoog geworden zijn dat deze op zich schade kan toebrengen aan de cel (Kaur et al., 1998). De aw-waarden werden in dit werk echter slechts verlaagd tot 0,9901 (BHI) en 0,9888 (BB), waardoor we dus nog steeds een beschermend effect verwachten. Het gecombineerd effect van pH en % NaCl op de hitteresistentie van Salmonella Enteritidis en E. coli O157:H7 werd bestudeerd door Blackburn et al. (1997). Hieruit bleek dat de optimale pH voor overleving afhankelijk was van de temperatuur en de NaCl concentratie. Voor E. coli O157:H7 wordt voor temperaturen tussen 54,5 en 64,5°C en een percentage NaCl van 0,5; 3,5 en 8,5 %, een optimale pH range van 5,2 tot 5,9 (kamertemperatuur) vermeld. De optimale pH range voor Salmonella Enteritidis bleek in deze studie 5,9 à 6,5 (kamertemperatuur) te zijn. Buiten deze ranges werd een daling in hitteresistentie waargenomen. Er kan hier dus opgemerkt worden dat de pH van 5,6, die werd gebruikt in dit werk, in de optimale range ligt, die gerapporteerd werd voor E. coli O157:H7 (Blackburn et al., 1997). Dit komt dus overeen met de verhoogde hitteresistentie in de aangepaste bouillon die werd bekomen in dit werk bij 60°C. Ook de optimale range voor Salmonella Enteritidis, gerapporteerd door Blackburn et al. (1997), is licht zuur (5,9-6,5) en ligt dus dicht bij de gebruikte pH in dit werk. Voor Salmonella spp. is het effect in dit werk echter minder uitgesproken.

5.4.Effect van de verhitting van vlees Via de bekomen temperatuursprofielen (Figuur 8, Figuur 9 en Figuur 10) konden de P70–waarden berekend worden en kon dus nagegaan worden of 2 minuten 70°C werd bereikt bij de verschillende bakprocessen. Uit Tabel 21 kan afgeleid worden dat deze safe harbour voor het pitavlees zeker werd gehaald, reeds vóór het vlees van de pan werd gehaald. De hoge P70-waarden kunnen verklaard worden doordat pitavlees bestaat uit kleine stukjes vlees die snel hoge temperaturen kunnen bereiken. Dit bleek echter niet voldoende te zijn om Listeria monocytogenes af te doden, aangezien er na het bakken op twee van de drie porties pitavlees nog cellen werden teruggevonden. Dit bevestigt wel de naam van Listeria monocytogenes als de meest hitteresistente vegetatieve pathogeen. Men zou echter verwachten dat bij het behalen van zo een hoge P 70-waarden, alle microorganismen met zekerheid worden afgedood. In één aanrijking werd ook nog E. coli O157:H7 op het pitavlees terug gevonden. Voor de mignonette kan men het omgekeerde waarnemen. In de kern hiervan werd de P70 van 2 minuten nooit gehaald na 10,5 minuten bakken en slechts in één van de drie gevallen werd deze safe harbour bereikt na de temperatuurstijging tijdens het nagaren op het bord. Toch werden alle microorganismen volledig afgedood, behalve Salmonella spp. die in één van de aanrijkingen werd teruggevonden. Hierbij moet men wel in het achterhoofd houden dat bij de mignonette enkel werd geïnoculeerd op het oppervlak en dat de P70-waarde uit Tabel 21 berekend werd op basis van de kerntemperatuur. Aan de rand werd een zeer snelle temperatuurstijging gemerkt, waardoor de P70waarde voor het oppervlak heel snel heel hoog werd. De overleving van Salmonella spp. is wel vrij merkwaardig, aangezien dit pathogeen niet als zeer hitteresistent wordt beschouwd (ICMSF, 1996). Bovendien is Listeria monocytogenes, die resistenter zou moeten zijn dan Salmonella spp., wel volledig afgedood. De resultaten na het bakken van de burger kan men vrij verontrustend noemen. Listeria monocytogenes werd bij elke herhaling telbaar teruggevonden na het bakken (Tabel 21), ook Campylobacter jejuni werd na elke herhaling teruggevonden (één maal telbaar). E. coli O157:H7 en

53

Salmonella spp. werden in twee van de drie herhalingen nog gedetecteerd na het bakken. In één van de herhalingen kon E. coli O157:H7 zelfs geteld worden op de strijkplaat (1 kve). De beduidend betere overleving van de micro-organismen in de burger kan verklaard worden door het feit dat de micro-organismen ook in de kern van de burger aanwezig zijn. Toch blijven deze resultaten vrij merkwaardig aangezien de P70 van twee minuten in twee van de drie gevallen reeds werd overschreden na de 9 minuten baktijd, en in alle herhalingen na de extra 5 minuten op het bord (Tabel 21). Nochtans werd het 2 minuten 70°C barema vrij recent (2007) herbekeken in een rapport van het Advisory Committee on the Microbiological Safety of Food (ACMSF), specifiek voor het veilig bereiden van burgers (ACMSF, 2007). Hierin werd geconcludeerd dat het huidige advies van 2 minuten verhitting bij 70°C zeker voldoende moet zijn voor een 6 log reductie. Een mogelijke opmerking is dat men zich hierbij voornamelijk heeft gebaseerd op reeds gepubliceerde data. De betere overleving in de burgers is echter wel in tegenspraak met bevindingen van Mogollon et al. (2009), Tuntivanich et al. (2008) en Velasquez et al. (2010). Deze auteurs vermelden dat in grotere stukken onvermalen vlees een hogere hitteresistentie wordt bekomen in vergelijking met vermalen vlees. Door het vermalen worden de microstructuur en de fysische karakteristieken van het vlees veranderd. Tuntivanich et al. (2008) vermelden dat de lagere hitteresistentie in vermalen vlees zou kunnen te maken hebben met het vrijkomen van sarcoplasmatische vloeistof bij het versnijden van de spiervezels, waardoor de wateractiviteit rond de bacteriële cellen zou kunnen worden aangepast. Er wordt ook aangehaald dat door de microstructuur in geheel spiervlees een betere vasthechting voor de micro-organismen zou mogelijk zijn in vergelijking met vermalen vlees, waardoor in vermalen vlees een lagere hitteresistentie wordt gemerkt. In de voorgenoemde studies (Velasquez et al., 2010;Tuntivanich et al., 2008;Mogollon et al., 2009) werd echter een warmwaterbad als verhittingsmedium gebruikt. Bovendien werd een veel kleinere hoeveelheid vlees gebruikt (minder dan 10 gram) dan in dit werk en de gebruikte temperaturen bleven onder 65°C . In dit werk komen de micro-organismen op het oppervlak van de mignonette en het pitavlees meteen in contact met de hete pan (temperaturen > 100°C), terwijl de kern van de burger geleidelijk opwarmt en nooit zo een hoge temperaturen bereikt. In de kern van de burger kunnen de micro-organismen dus gemakkelijker overleven dan aan het oppervlak van de mignonette. Tijdens het opwarmen is het ook mogelijk dat de micro-organismen in de kern, die dus niet meteen aan zeer hoge temperaturen worden blootgesteld, adapteren en meer resistent worden t.o.v. hitte (Kaur et al., 1998). Dit zou mogelijks kunnen te maken hebben met de productie van hitte shock proteïnen tijdens het opwarmen en bovendien zou de hitteresistentie meer toenemen, naarmate de temperatuur trager stijgt (Doyle et al., 2001;Mackey and Derrick, 1987). Dus hoe dikker de burger is, hoe trager de opwarming in de kern zal gebeuren en dus hoe meer kans op overlevende cellen in de kern. Hitte-inactivatie door bakken in de pan, zoals uitgevoerd in deze studie, werd nog maar door enkele auteurs onderzocht en dit slechts voor een klein aantal microbiologische parameters. Bergsma et al. (2007) bestudeerden wel reeds de inactivatie tijdens het bakken in de pan voor Campylobacter jejuni op kippenfilets. Net als in dit werk (vooral wat betreft de burgers) werd in het experiment van Bergsma et al. (2007) een hogere hitteresistentie waargenomen dan verwacht op basis van de literatuur. Voor volledige kippenborstfilet werd een D-waarde van 1,95 minuten bekomen (gemiddelde oppervlakte temperatuur: 127°C). Voor kleinere stukjes kip bedroeg de D-waarde 0,59 minuten bij een gemiddelde oppervlakte temperatuur van 109°C. Een mogelijke verklaring voor de

54

vrij hoge waarden in het experiment van Bergsma et al. (2007) en dus ook voor de vrij hoge hitteresistentie in dit werk, is dat grotere stukken vlees werden gebruikt dan in de gebruikelijke experimenten omtrent hitte-inactivatie in vlees (150 gram versus 10 gram). Bovendien werden er hogere temperaturen toegepast dan gebruikelijk. In veel hitte-inactivatie experimenten worden namelijk temperaturen toegepast onder 70°C (Tuntivanich et al., 2008;Velasquez et al., 2010), terwijl in het experiment van Bergsma et al. (2007) en ook in dit werk randtemperaturen van meer dan 100°C kunnen bereikt worden. Een derde verantwoordelijke factor kan toegeschreven worden aan het feit dat de kip na inoculatie gedurende een volledige nacht gekoeld werd opgeslagen om de situatie van stockage in de retail na te bootsen (Bergsma et al., 2007). In vele andere studies (Velasquez et al., 2010;Murphy et al., 2004;Tuntivanich et al., 2008) worden de producten slechts een half uur tot enkele uren in de koeling bewaard na de inoculatie. Toch bleek uit een studie van de Jong et al. (2012) dat een langere opslagtijd geen significant effect heeft op de vasthechting van de micro-organismen, maar wel verantwoordelijk zou kunnen zijn voor kruisbescherming. Volgens de Jong et al. (2012) zouden de fysiologische eigenschappen van de cellen aangepast kunnen worden door de koudestress in de koelkast, waardoor deze ook resistenter worden t.o.v. hittestress. Eigenlijk zou men eerder verwachten dat de cellen gevoeliger zouden worden t.o.v. hitte, aangezien door Juneja et al. (1998) reeds werd vermeld dat een verlaagde groeitemperatuur, het gehalte onverzadigde vetzuren in het celmembraan laat toenemen, waardoor de cel hittegevoeliger zou worden. Op basis van de bekomen D-waarde (1,95 minuten) in de studie van Bergsma et al. (2007) zou de aanbevolen baktijd die op de verpakking staat (10 à 14 minuten) resulteren in een 5,1 à 7,2 log reductie per kippenfilet. Aangezien de natuurlijke contaminatie voor Campylobacter jejuni in de retail tot 4 log/filet kan bedragen, kan de aanbevolen baktijd wel degelijk veilig vlees garanderen, wat betreft het risico op campylobacteriose. Bergsma et al. (2007) merkten echter wel wat variatie op waardoor de beoogde reductie niet altijd werd gehaald na de aanbevolen baktijd en waaruit men kon besluiten dat er nog steeds een risico bestaat op campylobacteriose. In tegenstelling tot de studie van Bergsma et al. (2007) waar enkel contaminatie van het oppervlak mogelijk was, werd door Sampers et al. (2010) een experiment uitgevoerd op kippenburgers. Hier werd dus ook de kern van de burgers artificieel gecontamineerd met Campylobacter spp. cellen, wat overeen komt met de burger in dit werk. In deze studie bleek dat het aantal Campylobacter spp. na 4 minuten, reeds vóór de kippenburger er gaar uitzag op basis van de kleur (na 6,5 minuten), minder dan 1 log kve/g bedroeg. Met deze bevinding moet wel voorzichtig worden omgesprongen, aangezien er enkel een telling werd uitgevoerd en geen aanrijking en detectie zoals in dit werk. In dit werk werd namelijk voor de burger éénmaal een telbare kolonie gevonden, maar Campylobacter jejuni kon wel in beide herhalingen nog gedetecteerd worden na aanrijking. Een andere opmerking bij de studie van Sampers et al. (2010) is dat er voor een dikkere burger (>1,2cm) een langere baktijd nodig zal zijn en dat het bij wit vlees zoals kip vaak moeilijk is om op basis van kleur de gaarheid in te schatten, omwille van het geringe kleurverschil in vergelijking met rood vlees (Sampers et al., 2010). Maar zelfs bij rood vlees is dit niet altijd betrouwbaar. Zo werd ook in een rapport van het ACMSF vermeld dat het nagaan van de kleurverandering in burgers geen veilig voedsel garandeert en dus beter niet als enige indicator wordt gebruikt (ACMSF, 2007;FSIS, 2008). De Food Safety and Inspection Service (agentschap voor volksgezondheid van de USDA) haalde aan in een rapport dat rundvleesburgers hun roze kleur reeds kunnen verloren hebben voor het vlees

55

voldoende is gekookt. Het gebruik van karkassen van oudere dieren en een lange stockage tijd, waardoor het vlees reeds op voorhand bruin oogt, zijn mogelijke oorzaken. Bovendien is ook het omgekeerde mogelijk, namelijk dat het vlees roze blijft, ook al is het voldoende gekookt. Dit is voornamelijk te wijten aan de pH, het vetgehalte en aanwezige pigmenten in het vlees (FSIS, 2008). Hierom is het gebruik van een vleesthermometer ten zeerste aan te raden. Het (juiste) gebruik van een vleesthermometer5 is echter nog niet voldoende ingeburgerd bij de Belgische bevolking (Sampers et al., 2010). Hoewel uit de bouillon experimenten in dit werk bleek dat Campylobacter jejuni bij 60°C significant gevoeliger is voor hitte dan de andere micro-organismen, kan men zien in Tabel 21 dat dit organisme na het bakken van de burger in beide herhalingen nog aanwezig was. Ook door de Jong et al. (2012) werd een hogere hitteresistentie gerapporteerd dan verwacht voor Campylobacter jejuni. In dit experiment werd een volledige kippenborstfilet artificieel besmet met Campylobacter jejuni, Escherichia coli en Salmonella Typhimurium, waarna deze werd gekookt in water. Net zoals in de studie van Bergsma et al. (2007) werd de filet na inoculatie overnacht gestockeerd in de koelkast en werden hogere temperaturen toegepast (kokend water). De oppervlaktetemperatuur van de kippenborstfilet bedroeg na 1 minuut koken reeds 85°C. De D-waarde die overeen zou komen met een temperatuur van 85°C werd geëxtrapoleerd uit D-waarden gepubliceerd in de literatuur voor Campylobacter jejuni, E.coli en Salmonella Typhimurium. Dit resulteerde in een D-waarde bij 85°C van minder dan 1 seconde. Wanneer het experiment werkelijk werd uitgevoerd, merkte men echter dat er 2 minuten nodig waren om een log reductie in bacteriële cellen te verwezenlijken. Men moet er zich dus van bewust zijn dat D-waarden bekomen bij temperaturen lager dan 70°C, bij extrapolatie naar temperaturen hoger dan 70°C, een significante overschatting van de afdoding kunnen opleveren (de Jong et al.,2012). Hoewel in vele studies omtrent gevogeltevlees wordt beweerd dat kruiscontaminatie een groter risico inhoudt dan ongaar vlees, blijkt onvoldoende bakken of koken toch een belangrijke rol te kunnen spelen (Sampers et al.,2012; de Jong et al.,2012). De gevaren van onvoldoende gebakken vleesbereidingen zoals burgers kunnen groter worden, indien deze na het bakken bij 7°C in de koelkast worden bewaard gedurende enkele dagen en zonder verhittingsstap worden geconsumeerd. Na vier dagen bewaring bevatte één van de drie burgers, die extra werden gebakken, 3,43 log Listeria monocytogenes cellen/g. Aangezien als infectueuze dosis voor Listeria monocytogenes 100 levensvatbare cellen wordt vermeld (ICMSF, 1996), kan consumptie van deze burger ziekte veroorzaken. Op de overige twee burgers waren geen telbare aantallen Listeria monocytogenes cellen aanwezig (< 2 log/g).

5.5.Betekenis van de resultaten voor consument en horeca Het is duidelijk uit Tabel 21 dat ‘zero risk’ niet haalbaar is, waardoor eventuele richtlijnen geen volledige eliminatie als doel zullen hebben, maar eerder een zo sterk mogelijke reductie. Het geven van duidelijke richtlijnen naar consumenten en naar de horeca toe is niet evident, aangezien uit Figuur 8, Figuur 9 en Figuur 10 reeds bleek dat de temperatuursprofielen tijdens een bakproces heel erg kunnen variëren, zelfs indien dit door dezelfde persoon wordt uitgevoerd. Hierom zou het gebruik van een vleesthermometer ten zeerste aan te raden zijn, zeker voor de horecasector, waar het onmogelijk is om bijvoorbeeld een hamburger door te snijden om de gaarheid na te gaan. Maar 5

De consumentenrichtlijn van het FAVV raadt aan om kip steeds te bakken tot een interne temperatuur van minimaal 70°C (FAVV, 2005).

56

zelfs bij de consument thuis zou het gebruik van een vleesthermometer een betere optie zijn, aangezien kleurverschil een onbetrouwbare indicator is (ACMSF, 2007). Bij het bakken van het pitavlees werden zeer hoge temperaturen bereikt en werd de safe harbour ‘P70=2 minuten’ dus steeds ruimschoots gehaald. De kern van de mignonette bereikte in geen van de drie herhalingen een temperatuur van 70°C en ook de safe harbour (P70=2 minuten) werd in de kern niet gehaald. Hier is dit minder van belang, aangezien de micro-organismen enkel op het oppervlak zullen aanwezig zijn en hier de P70=2 minuten wel snel werd bereikt. Hoewel er op het pitavlees en op de mignonette na het bakken af en toe nog bepaalde micro-organismen werden teruggevonden, zou men de aandacht vooral moeten vestigen op vleesbereidingen, zoals bijvoorbeeld hamburgers, die sterk gemanipuleerd zijn en waar de micro-organismen ook in de kern van het vlees kunnen aanwezig zijn. Zo bleek uit het bakexperiment dat de burger veel vaker dan het pitavlees en de mignonette nog pathogenen bevatte (Tabel 21). Uit de temperatuursprofielen voor de burger (Figuur 10) kan men afleiden dat in twee van de drie herhalingen (burger 1 en burger 3) de kerntemperatuur van 70°C duidelijk werd overschreden, reeds voor het vlees van de pan werd gehaald. Problemen zouden zich echter vooral kunnen voordoen ingeval van een temperatuursprofiel zoals bij burger 2. Na de 9 minuten baktijd werd nog geen kerntemperatuur van 70°C gehaald. Dit wordt ook weerspiegeld in de P70-waarde, die slechts 0,08 minuten bedraagt op het moment dat de burger van de pan wordt gehaald. Het is pas later tijdens het nagaren op het bord dat een kerntemperatuur van 70°C net wordt bereikt. Deze temperatuur van 70°C werd mogelijks niet lang genoeg aangehouden om voldoende afdoding te verkrijgen, hoewel na 12 minuten de P70=2 minuten wel werd gehaald. Een mogelijke richtlijn zou dus kunnen gebaseerd zijn op het verzekeren dat de temperatuur lang genoeg boven 70°C blijft en om zich dus minder te focussen op de P 70 -waarde. In de praktijk zal deze toch niet berekend kunnen worden, aangezien men nooit het volledige temperatuurverloop zal registreren. Praktisch zou men kunnen adviseren om er voor te zorgen dat de kerntemperatuur van de burger reeds minstens 70°C heeft bereikt op het moment dat de burger van de pan wordt gehaald en om het vlees dan ook nog enkele minuten (3 à 4 minuten) te laten nagaren op een bord. Gedurende het nagaren zal de temperatuur in de kern nog verder stijgen en zo zullen temperaturen boven 70°C gedurende een langere tijd aangehouden worden. De bedenking kan natuurlijk gemaakt worden dat, hoewel in twee van de drie herhalingen voor de burger de P70-waarde van 2 minuten reeds werd gehaald na 4 à 6 minuten, Campylobacter jejuni en Listeria monocytogenes toch konden gedetecteerd worden in elke herhaling. Salmonella spp. en E. coli O157:H7 werden bovendien in het merendeel van de herhalingen nog gedetecteerd. Deze gegevens in acht genomen, kan men stellen dat het vrij verontrustend is dat vele commerciële vleesbereidingen voor kinderen (bijvoorbeeld ‘kidsburgers’) gebaseerd zijn op gehakt. Aangezien kinderen behoren tot de YOPI groep, is het van belang dat de gevaren van dergelijke vleesbereidingen voldoende onder de aandacht worden gebracht, zodat de consumptie ervan door kinderen wordt gelimiteerd. Een tweede bedenking heeft betrekking op de geldigheid van de safe harbour: 2 minuten 70°C. Een herziening hiervan zou aan te raden zijn, aangezien deze safe harbour niet voldoende bleek te zijn om veilig vlees te garanderen, zeker voor sterk gemanipuleerde vleesbereidingen zoals hamburgers. Men zou eventueel deze safe harbour kunnen verstrengen en opteren voor 2 minuten bij een hogere temperatuur (bijvoorbeeld 75°C) of voor een verlenging van de verhittingstijd bij 70°C.

57

6.Algemene conclusie Uit de afdodingscurves van het bouillon experiment blijkt dat de afdoding van de micro-organismen een bifasisch verloop volgt. Dit is het geval voor alle micro-organismen en ook de variabiliteit tussen de stammen is beperkt. Er is dus een meer hitteresistente subpopulatie aanwezig, die voor het onverdund inoculum experiment gemiddeld 0,4 % van de totale populatie uitmaakt en voor het verdund inoculum experiment 0,02 %. Aangezien bepaalde micro-organismen slechts een lage infectueuze dosis hebben, is het van belang om ook rekening te houden met deze meer hitteresistente groep. Via GInaFiT werd een bifasisch model gefit en kon een D-waarde berekend worden, zowel voor de minder hitteresistente, als voor de meest hitteresistente subpopulatie. De Dwaarden voor de minder hitteresistente populatie komen vrij goed overeen met gepubliceerde Dwaarden. Uit een statistische vergelijking van de bekomen D-waarden tussen de micro-organismen komt enkel naar voor dat Campylobacter jejuni bij 60°C gevoeliger is voor hitte dan Salmonella spp. en E. coli O157:H7. In de literatuur wordt meestal slechts één D-waarde vermeld en wordt er dus uitgegaan van een loglineair verloop. Het is mogelijk dat vele experimenten uit de literatuur niet lang genoeg werden aangehouden, waardoor het tailing effect, veroorzaakt door de meer hitteresistente subpopulatie, onopgemerkt is gebleven. De safe harbour ‘2 minuten 70°C’ kan geen 6 log reductie in Listeria monocytogenes cellen verwezenlijken, omwille van de aanwezigheid van de hitteresistente subgroep. Na deze 2 minuten verhitting wordt in het onverdund inoculum experiment slechts een 2,5 à 3 log reductie bekomen. De aanpassing van de bouillon (pH 5,6 en 1,5 % NaCl) heeft weinig tot geen effect op de afdoding van de micro-organismen. Echter, voor E. coli O157:H7 bij 60°C wordt de schouder, die reeds aanwezig was in de normale bouillon, aanzienlijk verlengd (1,14-1,24 minuten versus 1,93-2,58 minuten) en voor E. coli als hygiëne indicator wordt in aangepaste bouillon wel een schouder waargenomen (0,82-1,91 minuten), terwijl dit in normale bouillon niet het geval was. Bovendien verloopt de helling van het eerste loglineaire gedeelte van de afdodingscurve van E. coli O157:H7 veel minder steil dan in het normale bouillon experiment. Men kan dus stellen dat in de aangepaste bouillon E. coli O157:H7, E. coli en enkele stammen van Salmonella spp. meer hitteresistent zijn. Dit zou kunnen verklaard worden door de combinatie van de verlaagde pH en het verhoogd zoutgehalte. Het is mogelijk dat door het toevoegen van NaCl de optimale pH range voor overleving van deze micro-organismen wordt verschoven naar lagere waarden. Bij het bakken van het pitavlees worden zeer hoge temperaturen bereikt en wordt de safe harbour ‘P70=2 minuten’ dus steeds ruimschoots gehaald. Toch worden hier nog af en toe Listeria monocytogenes cellen gedetecteerd. Na het bakken van de mignonette (10,5 minuten) wordt de P70=2 minuten in de kern in geen enkele herhaling bereikt. Hier is dit minder van belang, aangezien de temperaturen aan het oppervlak snel stijgen tot boven 100°C, waardoor de P70=2 minuten aan het oppervlak dus vrij snel wordt overschreden. Toch wordt hier in één van de aanrijkingen nog Salmonella spp. gedetecteerd. Het zijn echter vooral de resultaten van de burger die zorgwekkend zijn. Listeria monocytogenes wordt bij elke herhaling telbaar teruggevonden na het bakken, ook Campylobacter jejuni kan na elke herhaling gedetecteerd worden (één maal telbaar). E. coli O157:H7 en Salmonella spp. worden in twee van de drie herhalingen nog gedetecteerd na het bakken. In één van de herhalingen kan E. coli O157:H7 zelfs geteld worden. De beduidend betere overleving van de micro-organismen in de burger kan verklaard worden door het feit dat de micro-organismen ook in de kern van de burger aanwezig zijn. Toch blijven deze resultaten vrij merkwaardig aangezien de P 70

58

van 2 minuten in twee van de drie gevallen reeds wordt overschreden na de 9 minuten baktijd, en in alle herhalingen na de extra 5 minuten nagaren op het bord. Omwille van de variabiliteit van de temperatuursprofielen tijdens het bakken, is het niet evident om richtlijnen voor consumenten en de horeca op te stellen. Het gebruik van een vleesthermometer is om deze reden al zeker aan te raden. ‘Zero risk’ is echter niet haalbaar, zelfs wanneer de safe harbour ‘2 minuten 70°C’ wordt gehaald. De gevaren zijn het grootst voor vleesbereidingen, zoals bijvoorbeeld hamburgers, die sterk gemanipuleerd zijn en waar de micro-organismen ook in de kern van het vlees kunnen aanwezig zijn. Hierbij kan opgemerkt worden dat vele commerciële vleesbereidingen voor kinderen vaak gebaseerd zijn op gehakt. Aangezien zij behoren tot de YOPI groep, is het van belang dat de gevaren van dergelijke vleesbereidingen voldoende onder de aandacht worden gebracht, zodat de consumptie ervan door kinderen wordt gelimiteerd. Een tweede advies zou zijn om de safe harbour ‘2 minuten 70°C’ te herzien en eventueel op te trekken naar een hogere temperatuur of een langere verhittingstijd.

59

7.Suggesties voor verder onderzoek Binnen het project Pathogencook zal het bakexperiment herhaald worden voor verschillende types vlees. Zo zal men ook de afdoding van ‘the Big Four’ nagaan bij het bakken van kip, kalkoen, rundvlees en lamsvlees. Aangezien sommige supermarkten tegenwoordig ook exotische vleessoorten aanbieden, is het van belang om ook deze types vlees in het onderzoek op te nemen. Zo werd vermeld door Magnino et al. (2009) dat Salmonella spp. frequent werd teruggevonden op o.a. krokodillenvlees, wat ook reeds bleek uit een advies van EFSA uit 2007 (EFSA, 2007). Bovendien is het ook aan te raden om de doeltreffendheid van verschillende kooktechnieken na te gaan, wat betreft de afdoding van pathogene micro-organismen. Zo is bijvoorbeeld wokken, een kooktechniek die reeds ingeburgerd is in vele Europese huishoudens. Naast de meer traditionele technieken zou men ook opkomende trends zoals bijvoorbeeld slow cooking en sous-vide koken kunnen evalueren. Verder zou het interessant zijn om enkele belangrijke voedselintoxicanten aan een gelijkaardig onderzoek te onderwerpen, aangezien uit het EFSA rapport bleek dat 8,8 % van de gerapporteerde voedselvergiftigingen in 2010 werd veroorzaakt door bacteriële toxines (EFSA and ECDC, 2012). Onder de voedselintoxicanten zijn het vooral Staphylococcus aureus en Clostridium perfringens die worden geassocieerd met vlees en vleesbereidingen. Een evaluatie van de hitteresistentie van deze kiemen kan dus zeker van belang zijn in het kader van dit project. De mogelijkheid om sporen te vormen zorgt, in het geval van Clostridium perfringens, voor een extra factor waarmee rekening zal moeten gehouden worden en die zal moeten onderzocht worden met betrekking tot het garanderen van veilig voedsel.

60

8.Referentielijst 1. ACMSF. 2007. Report on the Safe Cooking of Burgers. Ad Hoc Group on Safe Cooking of Burgers. http://www.food.gov.uk/multimedia/pdfs/acmsfburgers0807.pdf , geraadpleegd op 10/04/2013. 2. Al Sakkaf,A., and G.Jones. 2012. Thermal Inactivation of Campylobacter jejuni in Broth. Journal of Food Protection 75(6):1029-1035. 3. Aldsworth,T.G., R.L.Sharman, C.E.R.Dodd, and G.S.A.B.Stewart. 1998. A Competitive Microflora Increases the Resistance of Salmonella typhimurium to Inimical Processes. Applied Environmental Microbiology 64(4):1323-1327. 4. Aljarallah,K.M., and M.R.Adam. 2007. Mechanisms of heat inactivation in Salmonella serotype Typhimurium as affected by low water activity at different temperatures. Journal of Applied Microbiology 102(1):153-160. 5. Allos,B.M. 2001. Campylobacter jejuni Infections: Update on Emerging Issues and Trends. Clinical Infectious Diseases 32:1201-1206. 6. Alvarez-Ordonez,A., A.Fernandez, M.Lopez, R.Arenas, and A.Bernardo. 2008. Modifications in membrane fatty acid composition of Salmonella typhimurium in response to growth conditions and their effect on heat resistance. International Journal of Food Microbiology 123:212-219. 7. Anderson,J.B., T.A.Shuster, K.E.Hansen, A.S.Levy, and A.Volk. 2004. A Camera's View of Consumer Food-Handling Behaviors. Journal of the American Dietetic Association 104:186-191. 8. Bergsma,N.J., A.R.H.Fischer, E.D.Van Asselt, M.H.Zwietering, and A.E.I.De Jong. 2007. Consumer food preparation and its implication for survival of Campylobacter jejuni on chicken. British Food Journal 109(7):548-561. 9. Besse,N.G. 2002. Influence of various environmental parameters and of detection procedures on the recovery of stressed L. monocytogenes: a review. Food Microbiology 19:221-234. 10. Bio-Rad. 2013. Rapid ' E. coli 2. http://www.biorad.com/webroot/web/pdf/fsd/literature/355-5299_4024_REC2_TechSheet_V1_150207_US.pdf, geraadpleegd op 20/04/2013. 11. bioMérieux. 2013. CampyFood Agar. http://www.biomerieux.com.au/servlet/srt/bio/australia/dynPage?doc=AST_IND_FDA_PRD_G_PRD_ NDY_12, geraadpleegd op 20/04/2013. 12. Blackburn,C.W., L.M.Curtis, L.Humpheson, C.Billon, and P.J.McClure. 1997. Development of thermal inactivation models for Salmonella enteritidis and Escherichia coli O157:H7 with temperature, pH and NaCl as controlling factors. International Journal of Food Microbiology 38:3144. 13.

Brock,T.D. 1967. Life at High Temperatures. Science 158:1012-1019.

61

14. Bunning,V.K., R.G.Crawford, J.T.Tierney, and J.T.Peeler. 1990. Thermotolerance of Listeria monocytogenes and Salmonella typhimurium after Sublethal Heat Shock. Applied Environmental Microbiology 56(10):3216-3219. 15. Casadei,M.A., R.Ingram, E.Hitchings, J.Archer, and J.E.Gaze. 2001. Heat resistance of Bacillus cereus,Salmonella typhimurium and Lactobacillus delbrueckii in relation to pH and ethanol. International Journal of Food Microbiology 63:125-134. 16. Cerf,O. 1977. Tailing of survival curves of bacterial spores. Journal of Applied Microbiology 42:1-19. 17. Claeys,E., N.Lauwers, and D.Demeyer. 1998. Kwaliteit en Technologie van vlees. Brussel Technopol vzw, Brussel, 303p. 18. Czechowicz,S.M., O.Santos, and E.A.Zottola. 1996. Recovery of thermally-stressed Escherichia coli O157:H7 by media supplemented with pyruvate. International Journal of Food Microbiology 33:275-284. 19. Daelman,J., L.Jacxsens, F.Devlieghere, and M.Uyttendaele. 2013. Microbial safety and quality of various types of cooked chilled food. Food Control 30:510-517. 20. de Haan,J., A.van den Broek, and P.Schnabel. 2001. Het nieuw consumeren. Een vooruitblik vanuit demografie en individualisering. Sociaal en Cultureel Planbureau, Den Haag. 21. de Jong,A.E.I., E.D.Van Asselt, M.H.Zwietering, M.Nauta, and R.De Jonge. 2012. Extreme Heat Resistance of Food Borne Pathogens Campylobacter jejuni, Escherichia coli, and Salmonella typhimurium on Chicken Breast Fillet during Cooking. International Journal of Microbiology . 22. Devlieghere,F., J.Debevere, M.Uyttendaele, and A.Vermeulen. 2011. Levensmiddelenmicrobiologie en -conservering. Die Keure, Brugge, 260p. 23. Dewettinck,K., P.Raggaert, F.Depypere, and N.De Clercq. 2012. Food Technology. Cursus.Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, Gent, 425p. 24. Dhir,V.K., andC.E.R.Dodd. 1995. Susceptibility of Suspended and Surface-Attached Salmonella enteritidis to Biocides and Elevated Temperatures. Applied Environmental Microbiology 61(5):17311738. 25. Digella,A.G., andA.E.Sobota. 1980. Degradation of 16S RNA in thermally injured Staphylococcus epidermidis. Ohio Journal of Science 80(1):8-13. 26. Doyle,M.E., andA.S.Mazzotta. 2000. Review of Studies on the Thermal Resistance of Salmonellae. Journal of Food Protection 63(6):779-795. 27. Doyle,M.E., A.S.Mazzotta, T.Wang, D.W.Wiseman, and V.N.Scott. 2001. Review: Heat Resistance of Listeria monocytogenes. Journal of Food Protection 64(3):410-429. 28. Earnshaw,R.G., J.Appleyard, and R.M.Hurst. 1995. Understanding physical inactivation processes: combined preservation opportunities using heat, ultrasound and pressure. International Journal of Food Microbiology 28:197-219.

62

29. EFSA. 2007. Scientific opinion on public health risks involved in the human consumption of reptile meat. EFSA Journal 578. 30. EFSA. 2009a. Scientific report of EFSA: Analysis of the baseline survey on the prevalence of Campylobacter in broiler batches and of Campylobacter and Salmonella on broiler carcasses in the EU, 2008. Rep. 8. 31. EFSA. 2009b. Scientific report of EFSA: Analysis of the baseline survey on the prevalence of Salmonella in holdings with breeding pigs in the EU,2008. Rep. 7. 32. EFSA, and ECDC. 2007. Community Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents, Antimicrobial Resistance and Foodborne Outbreaks in the European Union in 2006. http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/pub/130r.htm, geraadpleegd op 5/10/2012. 33. EFSA, and ECDC. 2009. The Community Summary Report on Trends and Sources of zoonoses and zoonotic agents in the European Union in 2007. http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/pub/223r.htm, geraadpleegd op 5/10/2012. 34. EFSA, and ECDC. 2010. Community Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses and Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in the European Union in 2008. http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/pub/1496.htm, geraadpleegd op 5/10/2012. 35. EFSA, and ECDC. 2011. The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in 2009. http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/doc/2090.pdf, geraadpleegd op 5/10/2012. 36. EFSA, and ECDC. 2012. The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in 2010. http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/pub/2597.htm, geraadpleegd op 5/10/2012. 37.

Eurobarometer. 2006. Special Eurobarometer 238: Risk Issues.

38. FAVV. 2001. Advies 2001/44 van het Wetenschappelijk Comité. http://www.favv.be/home/com-sci/avis01_nl.asp, geraadpleegd op 14/01/2013. 39. FAVV.2005. Consumentenrichtlijn. http://www.afsca.be/nieuwsbrief/_documents/200506_nieuwsbrief-FAVV-13_nl.pdf, geraadpleegd op 01/05/2013. 40. FAVV. 2012. FAVV: Activiteitenverslag 2011. http://www.favv.be/jaarverslagen/_documents/2012-06-26_AV2011Nl_S.pdf , geraadpleegd op 5/10/2012. 41. FAVV.2013. Vijf sleutels voor veilig voedsel. http://www.favv.be/tips/vijfsleutels.asp, geraadpleegd op 30/03/2013. 42. Fischer,A.R.H., A.E.I.De Jong, E.D.Van Asselt, R.De Jonge, L.J.Frewer, and M.J.Nauta. 2007. Food Safety in the Domestic Environment: An Interdisciplinary Investigation of Microbial Hazards During Food Preparation. Risk Analysis 27(4):1065-1082.

63

43. FSIS. 2008. Color of Cooked Ground Beef and Juices As It Relates to Doneness http://www.haccpalliance.org/alliance/fsistechnicalinfo.html, geraadpleegd op 15/02/2013. 44. Geeraerd,A.H., V.P.Valdramidis, and J.F.Van Impe. 2005. GInaFiT, a freeware tool to assess non-log-linear microbial survivor curves. International Journal of Food Microbiology 102:95-105. 45. Geeroms,N., W.Verbeke, and P.Van Kenhove. 2008. Consumer's health-related motive orientations and ready meal consumption behaviour. Appetite 51:704-712. 46. Gilchrist,J.E.C.J.E., C.B.Donnelly, J.T.Peeler, and J.M.Delaney. 1973. Spiral Plate Method for Bacrerial Determination. Applied Microbiology 25(2):244-252. 47. Goepfert,J.M., I.K.Iskander, and C.H.Amundson. 1970. Relation of the Heat Resistance of Salmonellae to the Water Activity of the Environment. Applied Microbiology 19(3):429-433. 48. Gorski,L., D.Flaherty, and R.E.Mandrell. 2006. Competitive fitness of Listeria monocytogenes serotype 1/2a and 4b strains in mixed cultures with and without food in the U.S. Food and Drug Administration enrichment protocol. Applied Environmental Microbiology 72(1):776-783. 49. Grant,I.R., M.R.Rowe, L.Dundee, and E.Hitchings. 2008. Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis: its incidence, heat resistance and detection in milk and dairy products. International Journal of Dairy Technology 54(1):2-13. 50. Habib,I., M.Uyttendaele, and L.De Zutter. 2010. Survival of poultry-derived Campylobacter jejuni of multilocus sequence type clonal complexes 21 and 45 under freeze, chill, oxidative, acid and heat stresses. Food Microbiology 27:829-834. 51. Health protection Agency.2012. Epidemiology of VTEC in England and Wales. http://www.hpa.org.uk/topics/InfectiousDiseases/InfectionsAZ/EscherichiaColiO157/Epidemiological Data/, geraadpleegd op 05/10/2012. 52. Hill,C., P.D.Cotter, R.D.Sleator, and C.G.M.Gahan. 2002. Bacterial response in Listeria monocytogenes: jumping the hurdles imposed by minimal processing. International Dairy Journal 12:273-283. 53. Humpheson,L., M.R.Adams, W.A.Anderson, and M.B.Cole. 1998. Biphasic Thermal Inactivation Kinetics of Salmonella enteritidis PT4. Applied Environmental Microbiology 64(2):459464. 54. ICMSF. 1996. Micro-organisms in Foods 5: Microbiological Specifications of Food Pathogens. 1 ed. London, 513p. 55. ILSI. 2005. Achieving Continuous Improvement in Reductions in Foodborne Listeriosis-A RiskBased Approach. Journal of Food Protection 68(9):1932-1994. 56. Jacobson,T.B., and C.S.Bech. 2012. Soil survival of Salmonella and transfer to freshwater and fresh produce. Food Research International 45:557-566.

64

57. Jasson,V., M.Uyttendaele, A.Rajkovic, and J.Debevere. 2007. Establishment of procedures provoking sub-lethal injury of Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni and Escherichia coli O157 to serve method performance testing. International Journal of Food Microbiology 118(241):249. 58.

Jay,J.M. 2000. Modern Food Microbiology. 6 ed. Gaithersburg,Maryland, 625p.

59. Juneja,V.K., andB.S.Eblen. 2000. Heat inactivation of Salmonella typhimurium DT104 in beef as affected by fat content. Letters in Applied Microbiology 30:461-467. 60. Juneja,V.K., B.S.Eblen, and G.M.Ransom. 2001. Thermal Inactivation of Salmonella spp. in Chicken Broth, Beef, Pork, Turkey and Chicken: Determination of D-and Z-values. Journal of Food Science 66(1):146-152. 61. Juneja,V.K., T.A.Foglia, and B.S.Marmer. 1998. Heat Resistance and Fatty Acid Composition of Listeria monocytogenes: Effect of pH, Acidulant, and Growth Temperature. Journal of Food Protection 61(6):683-687. 62. Juneja,V.K., C.Hwang, and M.Friedman. 2010. Thermal Inactivation and Postthermal Treatment Growth during Storage ofMultiple Salmonella Serotypes in Ground Beef as Affected by Sodium Lactate and Oregano Oil. Journal of Food Science 75(1):1-6. 63. Juneja,V.K., O.P.Snyder, and B.S.Marmer. 1997. Thermal destruction of Escherichia coli O157:H7 in beef and chicken: Determination of D-and Z-values. International Journal of Food Microbiology 35(3):231-237. 64. Katsui,N., T.Tsuchido, M.Takano, and I.Shibasaki. 1981. Effect of Preincubation Temperature on the Heat Resistance of Escherichia coli Having Different Fatty Acid Compositions. Journal of General Microbiology 122:357-361. 65. Kaur,J., D.A.Ledward, R.W.A.Park, and R.L.Robson. 1998. Factofs affecting the heat resistance of Escherichia coli O157:H7. Letters in Applied Microbiology 26:325-330. 66. Keener,K.M., M.P.Bashor, P.A.Curtis, B.W.Sheldon, and S.Kathariou. 2004. Comprehensive review of Campylobacter and Poultry Processing. Comprehensive reviews in Food Science and Food Safety 3:105-116. 67. Kher,S.V., J.De Jonge, M.T.A.Wentholt, R.Delize, J.Cunha de Andrade, H.J.Cnossen, L.J.Frewer, and N.B.L.Luijckx. 2013. Consumer perceptions of risks of chemical and microbiological contaminants associated with food chains: a cross-national study. International Journal of Consumer studies 37:7383. 68. Komitopoulou,E., andW.Penaloza. 2009. Fate of Salmonella in dry confectionery raw materials. Journal of Applied Microbiology 106(6):1892-1900. 69. Lianou,A., J.D.Stopforth, Y.Yoon, M.Wiedmann, and J.N.Sofos. 2006. Growth and stress Resistance Variation in Culture Broth among Listeria monocytogenes Strains of Various Derotypes and Origins. Journal of Food Protection 69(11):2640-2647.

65

70. Mackey,B.M., andC.M.Derrick. 1987. Changes in the heat resistance of Salmonella typhimurium during heating at rising temperatures. Letters in Applied Microbiology 4:13-16. 71. Magnino, S., Colin, P., Dei-Cas, E., Madsen, M., McLauchlin, J., Nöckler, K., Maradona, M. P., Tsigarida, E., Vanopdenbosch, E., and Van Peteghem, C. Biological risks associated with the consumption of reptile products. International Journal of Food Microbiology 134, 163-175. 2009. 72. Mattick,K.L., F.Jorgensen, P.Wang, J.Pound, M.H.Vandeven, L.R.Ward, J.D.Legan, H.M.LappinScott, and T.J.Humphrey. 2001. Effect of Temperature and solute type on heat tolerance of Salmonella serovars at low water activity. Applied Environmental Microbiology 67(9):4128-4136. 73. McCormick,K., I.Y.Han, J.C.Acton, B.W.Sheldon, and P.L.Dawson. 2003. D- and z-values for Listeria monocytogenes and Salmonella Typhimurium in Packaged Low-Fat Ready-to-Eat Turkey Bologna Subjected to a Surface Pasteurization Treatment. Poultry Science 82:1337-1342. 74. McLaughlin,J., R.T.Mitchell, W.J.Smerdon, and K.Jewell. 2004. Listeria monocytogenes and listeriosis: a review of hazard characterisation for use in microbiological risk assessment of foods. International Journal of Food Microbiology 92:15-33. 75. Merck. 2013.Chromocult coliform agar. http://www.amcoinstruments.com/index_files/pdf/chromocult-coliform.pdf, geraadpleegd op 20/04/2013. 76. Mogollon,M.A., B.P.Marks, A.M.Booren, A.Orta-Ramirez, and E.T.Ryser. 2009. Effect of Beef Product Physical Structure on Salmonella Thermal Inactivation. Journal of Food Science 74(7):347351. 77. Murphy,R.Y., E.M.Martin, L.K.Duncan, B.L.Beard, and J.A.Marcy. 2004. Thermal Process Validation for Escherichia coli O157:H7, Salmonella, and Listeria monocytogenes in Ground Turkey and Beef Products. Journal of Food Protection 67(7):1394-1402. 78. O'Bryan,C.A., P.G.Crandall, E.M.Martin, C.L.Griggis, and G.Johnson. 2006. Heat Resistance of Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7, and Listeria innocua M1, a Potential Surrogate for Listeria monocytogenes in Meat and Poultuy: A Review. Journal of Food Science 71(3):23-30. 79. Osaili,T.M., C.L.Grifffis, E.M.Martin, B.L.Beard, A.E.Keener, and J.A.Marcy. 2007. Thermal inactivation of Escherichia coli O157:H7, Salmonella and Listeria monocytogenes in Breaded Pork Patties. Journal of Food Science 72:56-61. 80. Oxoid.2013a. ALOA. http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=CM1084&org=91, geraadpleegd op 20/04/2013. 81. Oxoid.2013b. XLD. http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=CM0469&org=124&c=UK&lang=EN , geraadpleegd op 14/04/2013. 82. Park,F.P. 2002. The physiology of Campylobacter species and its relevance to their role as foodborne pathogens. International Journal of Food Microbiology 74:177-188.

66

83.

PFSE.2010. Fight Bac. http://www.fightbac.org/ , geraadpleegd op 05/05/2013.

84. Redmond,E.C., and C.J.Griffith. 2003. Consumer Food Handling in the Home: A Review of Food Safety Studies. Journal of Food Protection 66(1):130-161. 85. Russel,A.D. 2003. Lethal effects of heat on bacterial physiology and structure. Science Progress 86:115-137. 86. Sampers,I., D.Berkvens, L.Jacxsens, M.C.Ciocci, A.Dumoulin, and M.Uyttendaele. 2012. Survey of Belgian consumption patterns and consumer behaviour of poultry meat to provide insight in risk factors for campylobacteriosis. Food Control 26:293-299. 87. Sampers,I., I.Habib, L.De Zutter, A.Dumoulin, and M.Uyttendaele. 2010. Survival of Campylobacter spp. in poultry meat preparations subjected to freezing, refrigeration, minor salt concentration, and heat treatment. International Journal of Food Microbiology 137:147-153. 88. Schultze,K.K., R.H.Linton, M.A.ousin, J.B.uchansky, and M.L.amplin. 2007. Effect of preinoculation growth media and fat levels on thermal inactivation of a serotype 4b strain of Listeria monocytogenes in frankfurter slurries. Food Microbiology 24(4):352-361. 89. Shen,C., I.Geornaras, K.E.Belk, G.C.Smith, and J.N.Sofos. 2011. Inactivation of Escherichia coli O157:H7 in Moisture-Enhanced Nonintact Beef by Pan-Broiling or Roasting with Various Cooking Appliances Set at Different temperatures. Journal of Food Science 76(1):64-71. 90. Sörqvist,S. 1989. Heat resistance of Campylobacter and Yersinia strains by three methods. Journal of Applied Bacteriology 67:543-549. 91. Sörqvist,S. 2003. Heat Resistance in Liquids of Enterococcus spp., Listeria spp., Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, Salmonella spp. and Campylobacter spp. Acta Veterinaria Scandinavica 44:1-19. 92. Stringer,S.C., M.A.Fernandez, and A.Metris. 2012. Safety of sous vide foods: Feasibility of extending ComBase to describe the growth/survival/death response bacterial foodborne pathogens between 40° C and 60°C. Rapport Food Standards Agency . 93. Stringer,S.C., S.M.George, and M.W.Peck. 2000. Thermal inactivation of Escherichia coli O157:H7. Journal of Applied Microbiology Symposium Supplement 88(79):89. 94. Sugino,A., C.L.Peebles, K.N.Kreuzer, and N.R.Cozzarelli. 1977. Mechanism of action of nalidixic acid: Purification of Escherichia coli nalA gene product and its relationship to DNA gyrase and a novel nicking-closing enzyme. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 74(11):4767-4771. 95. Teunis,P., W.Van Den Brandhof, M.Nauta, J.Wagenaar, H.Van Den Kerkhof, and W.Van Pelt. 2005. A reconsideration of the Campylobacter dose-response relation. Epidemiology and infection 133(4):583-592. 96. Tsuchido,T., T.Katsui, A.Takeuchi, M.Takano, and I.Shibasaki. 1985. Destruction of the outer membrane permeability barrier of Escherichia coli by heat treatment. Applied Environmental Microbiology 50(298):303.

67

97. Tuntivanich,V., A.Orta-Ramirez, B.P.Marks, E.T.Ryser, and A.M.Booren. 2008. Thermal inactivation of Salmonella in Whole Muscle and Ground Turkey Breast. Journal of Food Protection 71(12):2548-2551. 98. Uyttendaele,M. 2012. Microbiologische veiligheid en analyse van levensmiddelen. Cursus. Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, Gent, 131p. 99. Uyttendaele,M., K.Dierick, L.Herman, L.De Zutter, and H.Imberechts. 2011. Emerging Microbial Risks in The Food Chain. Symposium SciCom FASFC 2011: Applications of Microbiological Risk Assessment in The Food Chain :35-43. 100. Van Damme,E., and L.Gheysen. 2011. Gentechnologie en moleculaire diagnostiek.Cursus. Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, Gent. 101. Velasquez,A., T.J.Breslin, B.P.Marks, A.Orta-Ramirez, O.N.Hall, A.M.Booren, and E.T.Ryser. 2010. Enhanced Thermal Resistance of Salmonella in Marinated Whole Muscle Compared with Groud Pork. Journal of Food Protection 73(2):372-375. 102. Verbunt,E. 2012. Risico-gebaseerd monsternameplan voor Listeria monocytogenes in grootkeukens van ziekenhuizen. Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen, Gent, 159p. 103. Whiting,R.C., andM.H.Golden. 2002. Variation among Escherichia coli O157:H7 strains relative to their growth, survival, thermal inactivation and toxin production in broth. International Journal of Food Microbiology 75:127-133. 104. WHO.2013. EHEC. http://who.int.mediacentre/factsheets/fs125/en/ , geraadpleegd op 14/01/2013. 105. Williams-Hill,D.M., andN.Grecz. 1983. Role of AP endonuclease in DNA breakage and cell inactivation of E.coli subjected to mild heat (52°C). Mutation Research 107:13-21.

68

9.Bijlagen Bijlage 1: Patroon spiraalenter (IUL instruments)

69

Bijlage 2: Protocol Vidas 1. Incubatie van 25 gram vlees in 225 ml Demi-Fraser medium (bioMérieux 42727, kant-enklare 225 ml zakjes) gedurende 24 h bij 30°C (stomacherzak). 2. Breng 0,1 ml over vanuit de aanrijking in een Fraser Tube (bioMérieux 42072, kant-en-klare 10 ml buisjes) en incubeer gedurende 24 h bij 37°C. 3. Breng 5 ml van de bijgeleverde standaardoplossing in de opening van de eerste strip van de Vidas LMO2 kit (30704, bioMérieux). 4. Herhaal stap drie voor de tweede strip. 5. Breng 5 ml van de bijgeleverde positieve controle in de opening van de derde strip. 6. Breng 5 ml van de bijgeleverde negatieve controle in de opening van de vierde strip. 7. In de volgende strips kunnen de monsters aangebracht worden. Breng 5 ml vanuit het aangerijkte monster (Fraser Tube) in de opening van de vijfde strip. 8. Herhaal stap zeven voor de rest van de monsters in de volgende strips. 9. Breng de strips in het Vidas Systeem. Indien de standaarden en controles in orde zijn, kunnen de monsters geanalyseerd worden.

70

Bijlage 3 : Protocol GeneDisc 1. Incubatie 25 gram vlees in 225 ml BPW gedurende 24 h bij 37°C (stomacherzak met filter). 2. Homogeniseer en breng 100 µl van het aangerijkte monster in een Lyse Tube (Pall Life Sciences Extraction Pack Food 1). Vortex en bewaar 10 ml van het aangerijkte monster in de koelkast. Ingeval van een positief resultaat kan hieruit een controle worden uitgevoerd om na te gaan of het om levende cellen gaat. (Indien het monster niet op de dag zelf kan worden geanalyseerd, wordt het aangerijkte monster bij -75°C bewaard in 30 % glycerol.) 3. Plaats de Lyse Tube in het hitte blok (100°C) gedurende 10 minuten (DNA-extractie). 4. Ondertussen: opstarten GeneDisc Cycler a. Scan GeneDisc plaat en mastermix b. Benoem de monsters 5. Vortex het monster na de verhitting en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 10000 g 6. Maak een ½ verdunning in de dilutiebuffer (Pall Life Sciences Extraction Pack Food 1) door 36 µl van het supernatans uit de Lyse Tybe over te brengen in een eppendorf met 36 µl dilutiebuffer. 7. Breng 36 µl mastermix in de GeneDisc. 8. Breng het verdunde DNA-extract in de GeneDisc 9. GeneDisc Cycler: a. Start de vacuüm pomp en tik gedurende de werking van de pomp vier maal op de tafel met de GeneDisc plaat om bellen te vermijden (bellen kunnen de verdeling van het monster naar de welletjes verstoren). b. Voeg vier druppels olie toe in elke sector van de GeneDisc plaat. c. Start opnieuw de vacuüm pomp (desinfecteer met ethanol bij beide vacuüm stappen). d. Plaats de GeneDisc plaat in het GeneDisc toestel.

71

Bijlage 4: Ruwe data van het onverdund inoculum experiment (bouillon)

72

73

74

75

76

Bijlage 5: Fitting bifasisch model via GInaFiT (onverdund inoculum)

77

78

79

80

81

Bijlage 6: Ruwe data verdund inoculum experiment in normale bouillon

82

83

84

Bijlage 7: Ruwe data verdund inoculum in aangepaste bouillon

85

86

87

Bijlage 8: Fitting bifasisch model verdund inoculum in normale en aangepaste bouillon

88

89

90

Hitte-inactivatie van pathogenen bij het bereiden van vlees

Recommend Documents