Academiejaar 2010 - 2011
Histologische, biochemische en biomoleculaire effecten van pulsed dye laser op de huid.
Charlotte NAEYAERT
Promotor: Prof. Dr. J. Lambert Co-promotor: Dr. E. Verhaeghe
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot
MASTER IN DE GENEESKUNDE
Academiejaar 2010 - 2011
Histologische, biochemische en biomoleculaire effecten van pulsed dye laser op de huid.
Charlotte NAEYAERT
Promotor: Prof. Dr. J. Lambert Co-promotor: Dr. E. Verhaeghe
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot
MASTER IN DE GENEESKUNDE
“De auteur en de promotor geven de toelating dit afstudeerwerk voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit dit afstudeerwerk.”
Datum: 06/05/2011
Charlotte Naeyaert
Dr. E. Verhaeghe
Prof. Dr. J. Lambert
Voorwoord Deze masterproef kon slechts tot stand komen dankzij de hulp van een aantal mensen. In de eerste plaats wil ik mijn promotor Prof. Dr. J. Lambert bedanken, voor de kritische reflectie en het nalezen van deze masterproef. Bijzondere dank gaat uit naar mijn co-promotor Dr. E. Verhaeghe die mij gedurende deze twee jaar telkens opnieuw bijgestaan heeft. Zij stond in voor het aanreiken van het onderwerp, het verstrekken van informatie en de kritische evaluatie van de tekst. Onze samenwerking heeft geleid tot de realisatie van dit werk.
Inhoudstafel 1.
Abstract ........................................................................................................................................... 1
2.
Inleiding........................................................................................................................................... 2 2.1
Mechanisme van laser ............................................................................................................. 2
2.2
Classificatie van lasers ............................................................................................................ 3
2.3
Optische eigenschappen van weefsel ...................................................................................... 4
2.4
Selectieve fotothermolyse ....................................................................................................... 5
2.5
Pulsed dye laser ....................................................................................................................... 6
2.5.1
Laserparameters............................................................................................................... 6
2.5.2
Weefselkoeling ................................................................................................................ 7
2.5.3
Gebruik ............................................................................................................................ 7
2.5.4
Complicaties .................................................................................................................... 8
2.6
Niet-ablatieve lasertherapie ..................................................................................................... 8
2.7
Structuur van de huid .............................................................................................................. 9
2.7.1
Epidermis......................................................................................................................... 9
2.7.2
Dermis ............................................................................................................................. 9
2.7.3
Hypodermis ................................................................................................................... 10
2.8
Wondgenezing ....................................................................................................................... 10
2.8.1
Inflammatiefase ............................................................................................................. 11
2.8.2
Proliferatiefase............................................................................................................... 11
2.8.3
Maturatiefase ................................................................................................................. 12
3.
Methodologie................................................................................................................................. 13
4.
Resultaten ...................................................................................................................................... 14 4.1
Diermodel .............................................................................................................................. 14
4.1.1
Varkenshuid als model voor humane huid .................................................................... 14
4.1.2
Muismodel ..................................................................................................................... 15
4.1.3
Konijnenhuid als model voor cutane vasculaire letsels ................................................. 18
4.2
In vitro model ........................................................................................................................ 20
4.2.1
Effect van PDL op humane fibroblasten van normale huid .......................................... 20
4.2.2 4.3
Normale huid ......................................................................................................................... 23
4.3.1
Immunologische activiteit van de pulsed dye laser ....................................................... 23
4.3.2
Invloed van PDL op collageenproductie ....................................................................... 24
4.3.3
Invloed van energiedensiteit en overlappende laserpulsen bij PDL-therapie ................ 24
4.4
5.
Effect van PDL op keloïdfibroblasten in vitro .............................................................. 21
Pathologische huid ................................................................................................................ 28
4.4.1
Zonbeschadigde huid ..................................................................................................... 28
4.4.2
Acne vulgaris ................................................................................................................. 31
4.4.3
Keloïd ............................................................................................................................ 32
4.4.4
Psoriasis ......................................................................................................................... 34
4.4.5
Wijnvlek, naevus flammeus of port wine stains (PWS) ................................................ 36
Discussie........................................................................................................................................ 42 5.1
Dierstudies ............................................................................................................................. 42
5.2
In vitro studies ....................................................................................................................... 44
5.3
Humane huid ......................................................................................................................... 44
5.4
Pathologische huid ................................................................................................................ 45
5.4.1
Zonbeschadigde huid ..................................................................................................... 45
5.4.2
Acne............................................................................................................................... 46
5.4.3
Keloïd ............................................................................................................................ 47
5.4.4
PWS ............................................................................................................................... 47
6.
Conclusie ....................................................................................................................................... 47
7.
Referentielijst ................................................................................................................................ 48
Lijst met afkortingen CW
Continuous waves
KTP-laser
Kalium-titanyl-fosfaatlaser
APTD-laser
Argon pumped tunable dye laser
Nd:YAG laser
Neodymium: yttriumaluminiumgarnet laser
TRT
Thermale relaxatietijd
GAG
Glycosaminoglycanen
ECM
Extracellulaire matrix
PDEGF
Platelet derived endothelial cell growth factor
TGF
Transforming growth factor
EGF
Epidermal growth factor
MMP
Matrixmetalloproteïnasen
MT-MMP
Membraantype matrixmetalloproteïnasen
TIMP
Tissue inhibitor of metalloproteïnase
RECK
Reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs
UV-licht
Ultraviolet licht
PDL
Pulsed dye laser
FPDL
Flashlamp pumped pulsed dye laser
Er:YAG
Erbium:yttrium-aluminium-garnet laser
KM muizen
Kunming muizen
H&E- kleuring
Haematoxyline-eosine-kleuring
CVL
Cutane vasculaire letsels
CSC
Cryogen spray cooling
TUNEL-assay
Terminaal deoxynucleotidyl transferase- mediated dUTP Nick-End Labeling assay
RT-PCR
Reverse transcriptase-polymerase chain reaction
SMAD
Small Mothers against decapentaplegic
TNF
Tumor necrosis factor
IL
Interleukine
MCR
Melanocortinereceptor
MAP-kinase
Mitogen activated kinase
AP
Activator protein
ERK
Extracellular signal-related kinase
JNK
c-jun N-terminaal kinase
PCNA
Proliferating cell nuclear antigen
VEGF
Vascular endothelial growth factor
PASI-score
Psoriasis Area and Severity Score
PWS
Port wine stain
DEJ
Dermo-epidermale junctie
EM
Elektronenmicroscopie
IF
Immunofluorescentie
1. Abstract Achtergrond: De pulsed dye laser (PDL) berust op het principe van selectieve fotothermolyse. Deze theorie beschrijft de mogelijkheid om doelgericht chromoforen te vernietigen zonder collaterale thermale schade aan te richten. PDL is de gouden standaard voor de behandeling van capillaire vasculaire malformaties. Ook tal van niet-vasculaire letsels worden behandeld met PDL. Deze nonablative laser stimuleert dermale remodelling en collageenproductie, maar het exacte moleculaire mechanisme hiervan is nog niet gekend. Doelstelling: In deze literatuurstudie wil men nagaan wat er gekend is rond de histologische, biochemische en biomoleculaire effecten van pulsed dye lasertherapie op de huid. Men gaat na of deze gegevens inderdaad een verklaring bieden voor de beschreven klinische effecten van pulsed dye laser. Methoden: Er werd een literatuurstudie uitgevoerd aan de hand van artikels gevonden via de databanken PubMed en Isi Web of Science. De besproken artikels zijn gepubliceerd tussen 1981 en 2010. Er werd een onderscheid gemaakt tussen studies uitgevoerd op dieren, in vitro, op normale huid en op pathologische huid. Resultaten: Nonablative pulsed dye lasertherapie induceert mogelijks veranderingen in verschillende moleculen betrokken in de remodelling van de extracellulaire matrix. De meeste studies tonen een toename van de collageenproductie in de dermis met vooral inductie van type I procollageen mRNA. Ook de inductie van type III procollageen, verscheidene matrixmetalloproteïnasen en primaire cytokines wordt aangetoond. PDL heeft niet alleen effect via het principe van selectieve fotothermolyse, maar heeft ook een immunologische activiteit. Men vermoedt dat TGF-β het onderliggend moleculair mechanisme is van de PDL bij de behandeling van zowel zonbeschadigde huid als van inflammatoire acne. Conclusie: De klinische relevantie van deze histologische, biomoleculaire en biochemische effecten is nog niet duidelijk onderzocht. De studies bevatten verschillende beperkingen. De resultaten zijn vaak gebaseerd op slechts één enkele behandeling met de PDL. Dikwijls zijn ze uitgevoerd op een te kleine patiëntenpopulatie en in een te kort tijdsbestek. Bovendien worden verschillende parameters gebruikt als maat voor neocollagenese waardoor het moeilijk is om de resultaten met elkaar te vergelijken.
1
2. Inleiding 2.1
Mechanisme van laser
De term „laser‟ is een acroniem voor „light amplification by stimulated emission of radiation‟. Het fenomeen gestimuleerde emissie werd al door Einstein voorspeld, maar kon pas in de jaren ‟60 experimenteel bewezen worden. Het principe van gestimuleerde emissie is te begrijpen aan de hand van het begrip spontane emissie en de kwantummechanica van materie. Atomen (of moleculen) bestaan uit een kern omgeven door orbitale elektronen. Ieder elektron kan een aantal energieniveaus hebben: de grondtoestand E1 en de aangeslagen toestanden E2, E3,… In deze aangeslagen toestanden bezitten de elektronen een hogere energie. Door absorptie van een foton met net zoveel energie als het energieverschil tussen de twee toestanden, kan het elektron overgaan naar een hogere toestand. Het elektron bevindt zich na absorptie in de geëxciteerde toestand en kan terugvallen naar een lager energieniveau. Deze terugval gaat gepaard met emissie van een foton met golflengte λ en energie gelijk aan het energieverschil tussen de twee toestanden. Dit proces heet spontane emissie (2). Gestimuleerde emissie ontstaat door een interactie tussen het foton en een elektron dat reeds in de geëxciteerde toestand zit. Vermits het elektron al geëxciteerd is, kan het geen foton meer absorberen. Toch geeft deze interactie ook aanleiding tot een emissiereactie waarbij het deeltje terugvalt naar een lager niveau en een foton uitzendt (Figuur 1). In dit proces worden er dus twee fotonen uitgestraald met dezelfde golflengte, richting en fase: het invallende foton en het nieuwe foton dat ontstaan is door de terugval van het geëxciteerde elektron. Deze interactie versterkt dus de intensiteit van het invallend licht (1;2). De energie die nodig is voor dit proces wordt aan de laser geleverd vanuit een externe krachtbron. Bij herhaling van dit proces, neemt het aantal fotonen in de laser gestadig toe. Wanneer het aantal geëxciteerde elektronen groter is dan het aantal elektronen in de grondtoestand, spreekt men van een populatie-inversie. Voor de gewenste werking van laser is het nodig dat deze populatie-inversie gecreëerd
wordt
en
in
stand
gehouden
wordt.
Versterking van het licht treedt immers enkel op wanneer er meer gestimuleerde emissie is dan absorptie,
dus
geëxciteerde
wanneer
elektronen
er
meer
zijn
dan
elektronen in de grondtoestand (2).
Figuur 1: Gestimuleerde emissie (1)
2
Laserlicht heeft een aantal eigenschappen waardoor het zich onderscheidt van licht dat uitgezonden wordt door conventionele lichtbronnen (1;3):
Laserlicht is in de eerste plaats monochromatisch. Alle uitgezonden lichtgolven hebben slechts één golflengte in overeenstemming met het energieverschil tussen de geëxciteerde toestand en het niveau waarop het elektron terugvalt na emissie. De golflengte van de laserstraal laat selectieve absorptie toe door chromoforen in de huid.
Daarnaast heeft de gestimuleerde emissie ook tot gevolg dat laserlicht coherent is: alle stralen zijn in fase zowel in plaats als in tijd.
Ook sturen lasers een relatief smalle bundel uit. De stralen lopen parallel met elkaar zodat ze over een lange afstand kunnen doordringen in het weefsel zonder te divergeren. Het gecollimeerde licht kan gefocusseerd worden in kleine spots. Dit maakt zeer lokale vernietiging mogelijk.
2.2
Classificatie van lasers
In 1959 introduceerde Maiman de eerste laser met een cutane applicatie. Het was een robijnlaser die rood licht uitstuurde met een golflengte van 694 nm. Daarna werden nog verschillende lasers op de markt gebracht. Er zijn verschillende manieren om lasers te classificeren: 1. Volgens golflengte: We maken een onderscheid tussen lasers die ultraviolet (UV) licht (100400 nm) uitzenden, lasers die zichtbaar licht (380-780 nm) emitteren en lasers waarvan de uitgezonden golflengte in het infraroodgebied (>780 nm) ligt (Figuur 2). 2.
Volgens het type geëmitteerde golven: continue golven (CW), quasi-continue golven (quasiCW) of gepulseerde golven (2-4):
CW – lasers emitteren een constante lichtstraal met een lange pulsduur. Dit resulteert in niet-selectieve beschadiging van het weefsel. De CO2-laser en de argonlaser zijn voorbeelden van CW-lasers (2-4).
Bij de quasi - CW lasers is de lichtstraal in verschillende korte segmenten verdeeld waardoor er constante hoeveelheden laserenergie onderbroken worden uitgezonden. Voorbeelden van dergelijke quasi-CW lasers zijn de kalium-titanyl-fosfaatlaser (KTP), krypton, argon pumped tunable dye lasers (APTD), copper vapor en de copper bromidelaser (3;4).
De gepulseerde lasersystemen zenden hoogenergetische laserstralen uit met zeer korte pulsduur met lange pauzes tussen elke puls (0,1-1 seconde) (4). Deze gepulseerde systemen kunnen ofwel long-pulsed ofwel short-pulsed zijn. De pulsed dye laser (PDL) is een voorbeeld van een long-pulsed laser met een pulsduur variërend van 450 tot 1500 microseconden. Short-pulsed lasers zoals de Quality-Switched (QS) ruby, alexandrite of de neodymium (Nd): yttriumaluminiumgarnet (YAG) lasers hebben een pulsduur die 3
varieert
tussen
50
en
100
nanoseconden.
De gepulseerde en quasi-continue lasersystemen zijn ten opzichte van de CW-lasers beter afgestemd op huidlaserchirurgie gebaseerd op het principe van selectieve fotothermolyse. De thermale relaxatietijden (TRT) van de meeste chromoforen zijn immers zeer kort. Om thermale schade van de huid te vermijden moet de pulsduur gelijk of korter zijn dan de TRT van het chromofoor (2-4). 3. Volgens het ablatieve versus non-ablatieve vermogen van de laser. Deze classificatie wordt hoofdzakelijk gebruikt binnen het domein van de „photorejuvenation‟ (2). 4. Volgens het medium in de optische caviteit waarin het laserlicht opgewekt wordt. Dit medium kan een gas, vloeistof, kristal of halfgeleider zijn en bepaalt de golflengte die de laser uitzendt. Bij PDL is het actief medium een complexe organische kleurstof, zoals rhodamine (2).
Figuur 2: Emissiespectra van lasers Figuur 3: Absorptiespectra van weefselchromoforen (5)
2.3
Optische eigenschappen van weefsel
Een laserbehandeling op de huid kan gepaard gaan met absorptie, reflectie, transmissie en verstrooiing van het licht: Volgens de wet van Grotthus-Draper moet licht geabsorbeerd worden door het weefsel om enig klinisch effect te verkrijgen. De geabsorbeerde energie wordt uitgedrukt in J per cm2 en wordt ook de energiedensiteit of fluence genoemd. De hoeveelheid energie die geabsorbeerd wordt, is afhankelijk van het chromofoor dat aanwezig is in de huid. Het chromofoor is het gedeelte van de molecule dat licht van een bepaalde golflengte opvangt en absorbeert. De gebruikte golflengte moet overeenstemmen met de absorptiekarakteristieken van het chromofoor. De belangrijkste endogene chromoforen in de huid zijn melanine, hemoglobine en water. Tatoeage-inkt is een voorbeeld van een exogeen chromofoor. Het absorptiespectrum van melanine bevat ultraviolet licht (UV) en zichtbaar licht met een afnemende absorptie voor infrarood. Hemoglobine heeft een maximale absorptie voor 4
UVA, blauw licht (400 nm), groen licht (541 nm) en geel licht (577 nm). De absorptie van collageen ligt in het zichtbaar licht en near - infraroodspectrum. Water absorbeert goed infraroodstraling (4). Verstrooiing van het licht is minimaal in de epidermis, maar neemt toe in de dermis door de aanwezigheid van collageenvezels. Deze zijn grotendeels verantwoordelijk voor de lichtverstrooiing in de huid. De mate waarin het licht verstrooid wordt, is omgekeerd evenredig met de golflengte van het licht. Hoe groter de golflengte, hoe dieper de golven zullen penetreren in het weefsel en hoe minder het licht verstrooid wordt. Verstrooiing reduceert de energiedensiteit die kan geabsorbeerd worden door het chromofoor en kan daardoor het klinisch effect van de laser verminderen (4). Reflectie en transmissie van het licht zijn minder belangrijk met het oog op het bekomen van een klinisch effect op de huid. Ter hoogte van het stratum corneum wordt 4-6% van het licht gereflecteerd. Residueel licht wordt doorgegeven aan subcutaan weefsel. Deze transmissie is afhankelijk van de golflengte. Langere golflengten penetreren dieper dan kortere golflengten omdat ze minder verstrooid worden (4).
2.4
Selectieve fotothermolyse
Pulsed dye lasertherapie is gebaseerd op het principe van selectieve fotothermolyse, een concept dat in 1983 werd ontwikkeld door Anderson en Parrish (6). Deze theorie beschrijft de mogelijkheid om doelgericht weefsels (chromoforen) te vernietigen zonder thermale schade te berokkenen aan de omliggende normale structuren. Om aan het principe van selectieve fotothermolyse te voldoen, zijn drie eigenschappen van het laserlicht van belang:
Golflengte
Pulsduur
Energiedensiteit
Deze laserparameters dienen voor elke toepassing aangepast te worden om maximaal gecontroleerde destructie te bekomen van het chromofoor met zo min mogelijk collaterale thermale schade (2). Allereerst moet een geschikte golflengte bepaald worden die selectief geabsorbeerd wordt door het chromofoor. Deze golflengte moet zo gekozen worden zodat er een groot verschil bestaat tussen de absorptiecoëfficiënt van het chromofoor en het omgevende weefsel. Sommige golflengten laten specifieke absorptie toe van chromoforen in de huid (2). Ten tweede moet de expositieduur van het weefsel aan het laserlicht of de pulsduur korter zijn dan de TRT van het weefsel. De TRT is de tijd die nodig is om het weefsel af te koelen met 63% van de piektemperatuur onmiddellijk na irradiatie. Op deze manier kunnen we de hoeveelheid energie die op de huid inwerkt beperken en oververhitting van de epidermis en dermis vermijden. Dit zorgt immers voor blaarvorming, depigmentatie en littekenvorming (7). 5
Tot slot moet de energiedensiteit (fluence) per oppervlakte-eenheid (J/cm2) voldoende hoog zijn om het doelorgaan te beschadigen en de expositieduur van het doelwitchromofoor zo laag mogelijk te houden (2).
2.5
Pulsed dye laser
2.5.1
Laserparameters
De pulsed dye laser (PDL, flashlamp-pumped PDL, V-Beam, N-lite) was in 1989 de eerste laser die uitging van het principe van de selectieve fotothermolyse. De eerste PDL emitteerde laserlicht van 577 nm in overeenstemming met het absorptiespectrum van oxyhemoglobine (418, 542, 577 nm). Door selectief in te werken op oxyhemoglobine en in mindere mate op desoxyhemoglobine kan het omliggende bloedvat voldoende energie absorberen (Figuur 3). Conversie van energie naar warmte (fotothermisch effect) zorgt voor coagulatie van het bloedvat. PDL werd dan ook snel de voorkeursbehandeling voor verschillende vasculaire letsels (8). Later werd de golflengte aangepast tot 585 nm waardoor de penetratiediepte in de dermis groter werd met behoud van de vasculaire specificiteit. De huidige pulsed dye lasers emitteren een golflengte van 585 of 595 nm met een langere pulsduur. De penetratiediepte van een golflengte van 595 nm is groter dan deze van 585 nm, maar de absorptie door oxyhemoglobine is lager voor een golflengte groter dan 585 nm. Om deze verminderde absorptie te compenseren wordt de energiedensiteit verhoogd met 2050% (4).
103
102
532 nm Green
Absorptiecoëfficiënt
585-600 nm Yellow 101
100
Red & Near-Infrared 10-1
755 nm Alexandrite 10-2 200
300
500
700
1000
Golflengte (nm)
Figuur 3: Absorptiespectrum van hemoglobine en melanine
6
We gebruiken een energiedensiteit tussen 3 en 10 J/cm2 en een spotsize van 2 tot 10 mm met niet meer dan 10% overlap tussen de verschillende pulsen om thermale schade tot een minimum te beperken. Over het algemeen worden er enkel lagere energiedensiteiten gebruikt bij kinderen en op delicate plaatsen vb. infraorbitaal. Soms is een grotere spotsize nodig om te kunnen penetreren in grotere en dieper gelegen bloedvaten vb. perinasaal (2). Met een pulsduur (450 microseconden) die korter is dan de thermale relaxatietijd (TRT) van kleine en middelgrote bloedvaten (1 milliseconde) is de PDL in overeenstemming met het principe van de selectieve fotothermolyse. De PDL slaagt er dan ook in om selectief bloedvaten te beschadigen zonder thermale schade te berokkenen aan het omliggende weefsel (2). 2.5.2
Weefselkoeling
In de meeste pulsed dye lasersystemen bouwde men een koelingssysteem in omdat het absorptiespectrum van oxyhemoglobine deels overlapt met dat van melanine dat vooral aanwezig is in haarfollikels en de epidermis. Absorptie van energie door melanine produceert warmte in de epidermis. Oververhitting van de epidermis kan resulteren in blaarvorming, depigmentatie of littekenvorming en is vooral een risico bij gepigmenteerde huid. Om deze neveneffecten te vermijden maakt men gebruik van een epidermaal koelingssysteem. Bovendien reduceert epidermale koeling het risico op postoperatieve complicaties zoals epidermale schade en verandering van de pigmentatie en zal ook de pijn waarmee de behandeling gepaard gaat verminderen. Het gebruik van een koelingssysteem laat toe om met hogere energiedensiteiten te werken waardoor de behandeling doeltreffender wordt (3;4). 2.5.3
Gebruik
De introductie van de pulsed dye laser betekende een enorme evolutie in de behandeling van vasculaire letsels. PDL wordt dan ook beschouwd als de laser bij uitstek om de meeste benigne congenitale en verworven vasculaire letsels te behandelen. PDL is voor vasculaire letsels superieur qua doeltreffendheid en bovendien houdt het weinig risico‟s in. Het is de gouden standaard voor de behandeling van capillaire vasculaire malformaties (CVM) of wijnvlekken. Deze laser werd bovendien al meermaals succesvol gebruikt voor de behandeling van faciale telengiëctasieën, hemangiomen, granuloma pyogenicum, Kaposi sarcoom en poikiloderma van Civatte (9). Naast vasculaire letsels zijn er ook rapporten van andere huidaandoeningen die met PDL behandeld werden waaronder hypertrofische littekens en keloïd, striae distensiae, wratten, angiofibromen, lymfangiomen, het syndroom van Goltz, multiple eccriene hidrocystoma, lupus pernio, lupus erythematosis, inflammatoire lineaire verruceuze epidermale naevi, atrophoderma vermiculata, granuloma faciale, necrobiosis lipoidica diabeticorum, xanthelasmata, elastosis perforans serpiginosa, hyperplasie van de sebumklieren en molluscum contagiosum (3;4;10).
7
Ook in het kader van huidveroudering en zonbeschadiging werd een gunstig effect op de huidtextuur beschreven met PDL. Dermale remodelling is het proces waarbij beschadigde en verouderde proteïnen in de huid vervangen worden door nieuwe collageen- en elastinevezels. Dit herstelt de elasticiteit van de huid, verwijdert rimpels en doet littekens vervagen (11). 2.5.4
Complicaties
Postoperatief oedeem en purpura zijn vaak bijwerkingen van de behandeling van PDL. Purpura ontstaat door extravasatie van rode bloedcellen uit bloedvaten die blootgesteld werden aan irradiatie. Blaarvorming of korstvorming worden zelden gezien na PDL – therapie. Voornamelijk bij patiënten met een gepigmenteerde huid zien we na radiatie een verandering van de pigmentatie van de huid door interactie met het epidermale melanine. Zowel hyper- als hypopigmentatie kunnen optreden. Littekenvorming is zeldzaam als complicatie van PDL (3;8). Deze bijwerkingen zijn afhankelijk van de locatie, de gebruikte energiedensiteit, het huidtype van de patiënt en de pulsduur.
2.6
Niet-ablatieve lasertherapie
De laatste jaren werden nog verschillende andere nonablative lasers ontwikkeld met het oog op het behandelen van rimpels, littekens en zonbeschadigde huid. Met deze lasers tracht men de huid te verjongen. Dit proces wordt „photorejuvenation‟ genaamd. Traditionele behandelingsmethodes zoals chemische peeling, dermabrasie of laserresurfacing met de CO2-laser of de erbium:yttrium-aluminium-garnet laser (Er:YAG) zijn gebaseerd op het afschaven van de epidermis, beschadigen van de dermis en de daaropvolgende collageenproductie en remodelling van de extracellulaire matrix. Deze ablatieve methodes zijn klinisch effectief, maar gaan gepaard met een langdurig herstel om de groei van nieuw epitheel en oppervlakkige dermis mogelijk te maken. Bovendien is het risico op infectie, littekenvorming en dispigmentatie groot (2). Met de nonablative lasers probeert men neocollagenese in de dermis te stimuleren zonder daarbij de bovenliggende epidermis te beschadigen. Deze methode geeft minder bijwerkingen en wordt minder onaangenaam geacht voor de patiënt. Er is slechts minimaal of geen herstel nodig na nonablative resurfacing omdat de bovenliggende epidermis niet beschadigd wordt. Het juiste werkingsmechanisme van de niet-schavende lasertechniek is nog niet gekend. Men veronderstelt dat door absorptie van de energie, uitgezonden door de nonablative laser, de dermis specifiek beschadigd wordt. Deze beschadiging brengt een wondhelingsproces op gang en induceert bovendien collageenproductie en dermale remodelling. De initiële cytokinestimulus die hiervoor verantwoordelijk is, is onbekend. Verschillende lasers worden gebruikt voor nonablative therapie waaronder ook de pulsed dye laser (11-13).
8
2.7
Structuur van de huid
De huid bestaat uit drie lagen, van buiten naar binnen, epidermis, dermis en subcutis of hypodermis. Tussen de epidermis en de dermis ligt de basale membraan. De huidaanhangsels of adnexa zijn de haren, zweetklieren, talgklieren en nagels (9). 2.7.1
Epidermis
De epidermis is een meerlagig verhoornd plaveiselepitheel dat opgebouwd wordt door keratinocyten. Hoewel de epidermis zeer dun is (0,1 mm) wordt ze nog eens onderverdeeld in vier lagen. Deze vier lagen vertegenwoordigen de verschillende stadia van celmaturatie. De cellen delen zich in de onderste cellaag en migreren naar boven toe waarbij ze degeneratieve veranderingen ondergaan (9;14).
Het stratum basale is door herhaalde mitotische celdelingen verantwoordelijk voor de constante regeneratie van de andere lagen van de epidermis. De basale cellaag bestaat hoofdzakelijk uit keratinocyten. De cellen bevatten keratinetonofibrillen en zijn met hemidesmosomen aan de basale membraan vastgehecht. Melanocyten vormen 5-10% van de basale celpopulatie. Deze pigmentvormende cellen liggen tussen de basale cellen en hebben celuitlopers tot in het stratum spinosum (9;14).
Het stratum spinosum (stratum van Malpighi) is genoemd naar de intercellulaire desmosomen die op lichtmicroscopisch beeld als stekels voorkomen. Naarmate de cellen verder opschuiven naar de oppervlakte synthetiseren ze keratohyaline. Tussen de keratinocyten worden langerhanscellen teruggevonden die deel uitmaken van het immuunsysteem en een belangrijke rol spelen in antigenpresentatie (9;14).
In de granulaire cellaag (stratum granulosum) platten de keratinocyten progressief af naar de oppervlakte
toe.
Het
cytoplasma
bevat
granules
gevormd
door
confluerende
keratohyalinedruppels. Aan de oppervlakte verliezen deze granulaire cellen hun kern en cytoplasma, waardoor enkel het gevormde keratine overblijft (9;14).
Het stratum corneum is het eindstadium van de maturatie van de keratinocyten en is de eigenlijke bescherming tegen invloeden van buitenaf. De celstructuren zijn onherkenbaar en de nucleï zijn verdwenen. Het cytoplasma van deze corneocyten is bijna volledig gevuld met keratine. De afgeplatte dode cellen schilferen makkelijk af en worden vervangen door de vorming van nieuwe cellen (9;14). 2.7.2
Dermis
De dermis is het steunweefsel van de huid dat bestaat uit een matrix waarin vezels en cellen voorkomen. De matrix of grondstof van de huid is opgebouwd uit hyaluronzuur en andere gesulfateerde glycosaminoglycanen (GAG‟s) die voor de viscositeit en hydratatie van de huid zorgen. In de dermis zijn chondroïtinesulfaat, dermataansulfaat en hyaluronzuur de belangrijkste GAG‟s. De
9
fibroblasten synthetiseren collageen, elastinevezels en glycosaminoglycanen. Collageen vormt het belangrijkste structurele eiwit van de dermis (14;15). De dermis bevat 2 lagen: de papillaire laag en de reticulaire laag. Het losmazig bindweefsel van de papillaire laag is een netwerk van collageen en elastinevezels waarin fibroblasten, bloedcellen en macrofagen gevat zitten. Deze laag vormt een overgang met de bovenliggende epidermis. De reticulaire laag echter heeft een stevig netwerk van parallel gerangschikte collageenvezels en is een veel densere laag (14). De arteriële bloedvoorziening van de huid bestaat uit twee plexussen, één op de grens van hypodermis en dermis en één op de grens van de papillaire laag en de reticulaire laag van de dermis (9). Er bestaan vijf types collageen (I, II, III, IV, V). Specifiek is de aanwezigheid van OH-lysine en OHproline. Vitamine C speelt een belangrijke rol bij de hydroxylering. Collageen wordt gemaakt door fibroblasten en ontstaat uit procollageen. Dit wordt omgezet in tropocollageen waaruit de vezels de eigenlijke collageenfibrillen vormen. Collageen type I is het belangrijkste type collageen in de dermis (85-90%), samen met collageen type III (8-11%). Collageenvezels zorgen voor elasticiteit en stevigheid van de huid en voorkomen de vorming van rimpels. Het doel van nonablative laserbehandeling is het stimuleren van nieuwe collageensynthese in de dermis zonder destructie van de bovenliggende epidermis (14;15). In volwassen huid bestaat de dermis voornamelijk uit collageen type I (80-85%) en type III (10-15%) samen met glycosaminoglycanen en elastinevezels. De afname van collageen type I en III is karakteristiek voor de veroudering van de huid. Collageen type III is het dominante isotype in foetale huid. In de verdere ontwikkeling wordt collageen type I dominant. Tijdens het verouderingsproces, wordt collageen type III geleidelijk aan vervangen door collageen type I (16). 2.7.3
Hypodermis
In de hypodermis of subcutis lopen talrijke fibreuze banden die de dermis met de onderliggende fascia verbinden. Tussen deze lagen zitten vetkussentjes die enerzijds een structurele functie hebben als mechanische buffer en als isolatie tegen warmteverlies en anderzijds als opslagplaats voor vet fungeren (14).
2.8
Wondgenezing
Een wonde wordt gedefinieerd als een onderbreking van de anatomische en/of functionele samenhang van de huid of de mucosa en/of eventueel de dieper gelegen structuren (17). Wondheling is een complex proces dat gepaard gaat met remodelling van de extracellulaire matrix (ECM). Deze remodelling houdt zowel de afbraak en het opruimen van de verschillende componenten in als de productie en afzetting van de nieuw gesynthetiseerde componenten van de ECM. Het evenwicht tussen
10
afbraak en aanmaak resulteert ofwel in het behoud ofwel in de wijziging van de structuur en de functies van het weefsel (18;19). Het wondhelingsproces wordt ingedeeld in drie fasen: inflammatie, proliferatie en maturatie of remodelling (17). 2.8.1
Inflammatiefase
In de inflammatoire fase vinden twee processen plaats: de hemostase en de eigenlijke inflammatie. In een eerste stap reageert het lichaam op de wonde met een vasculaire respons als reactie op de onderbreking van de bloedvatstructuur. Om het bloedverlies te beperken treedt een kortdurende vasoconstrictie op door contractie van de gladde spiercellen in de bloedvatwand. De juncties tussen de endotheelcellen zijn verzwakt waardoor rode bloedcellen en bloedplaatjes migreren vanuit de bloedbaan naar het wondgebied. De bloedplaatjes produceren fibrinogeen met vorming van een plug als reactie op hun contact met extravasculair collageen (17). De inflammatie is het gevolg van de afscheiding van vasoactieve en chemotactische mediatoren. Door de
wonde
worden
immers
diverse
processen
geactiveerd:
coagulatie,
kininecascade,
complementsysteem en arachnoïdinezuurcascade. De gesecreteerde mediatoren zorgen voor een lokale vasodilatatie en een toegenomen permeabiliteit van de capillairen. Dit resulteert in de belangrijkste symptomen van inflammatie: rubor, calor, tumor, dolor en functio laesa (17). Door de chemotaxis worden verschillende cellen aangetrokken tot het wondgebied. De bloedplaatjes produceren adhesieve proteïnen en groeifactoren zoals transforming growth factors (TGF-β) en platelet derived endothelial cell growth factor (PDEGF). Neutrofielen zorgen voor het debrideren van de wonde. Ook lymfocyten worden aangetrokken (17). 2.8.2
Proliferatiefase
In de proliferatiefase spelen zich verschillende processen af (17): 1. De vorming van de extracellulaire matrix: De macrofaag secreteert fibronectine, een glycosaminoglycan dat een belangrijk bestanddeel is van de ECM. Via dit fibronectine kunnen de fibroblasten migreren naar de wonde. 2. De fibroblast staat in voor de verdere vorming van de ECM via de afscheiding van cytokines en groeifactoren door andere cellen en in het bijzonder dan de macrofaag. De macrofaag secreteert ook proteasen die de migratie van de cellen bevorderen. De fibroblast secreteert eerst proteoglycanen en vervolgens collageen. 3. Angiogenese vindt plaats ter hoogte van de wondrand door de vorming van uitstulpingen aan de uiteinden van de capillairen. Deze uitstulpingen ontstaan door mitose van de endotheelcellen onder invloed van een angiogenese stimulerende factor, uitgescheiden door de macrofaag in hypoxisch milieu. 11
4. Tijdens de epithelialisatie prolifereren en migreren de residuele epitheelcellen van de wondbodem en wondrand onder invloed van epidermal growth factor (EGF). Deze cellen differentiëren en verplaatsen zich tot ze met elkaar in contact komen. 5. Gedurende de wondcontractie trekken de wondranden samen met verkleining van de wonde. 2.8.3
Maturatiefase
Tijdens de maturatie of de remodelleringsfase vindt tegelijkertijd synthese en afbraak van collageen plaats. Collageen 3 wordt vervangen door collageen 1, de hoeveelheid vocht en intercellulaire grondstof vermindert en de cross linking tussen de collageenvezels gaat toenemen (17). Intermezzo: Matrixmetalloproteïnasen De resorptie van de ECM gebeurt hoofdzakelijk door matrixmetalloproteïnasen (MMP). Er zijn al 24 verschillende types MMP‟s geïdentificeerd waarvan er 23 bij de mens teruggevonden zijn. De MMP‟s zijn onderverdeeld in 4 subfamilies: interstitiële collagenasen, gelatinasen, stromelysines (MMP-3, -10, -11) en membraantype MMP‟s (MT 1-4-MMP) (19). Collagenasen (MMP-1, -8 -13) knippen interstitieel collageen type I, II en III specifiek ter hoogte van ¾ van de N-terminus. Gelatinasen (MMP-2, -9) ruimen gedenatureerd collageen of gelatine op. Bovendien zal MMP-2 ook collageen type I, II en III verteren (18;19). De activiteit van matrixmetalloproteïnasen wordt sterk gereguleerd door:
controle van de conversie van pro-enzym naar de katalytische vorm (18).
tissue inhibitors of metalloproteïnases (TIMP‟s). Dit is een familie van 4 structureel gerelateerde proteïnen die specifiek de MMP‟s inhiberen (18;19).
membraanverankerd glycoproteïne RECK (reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs). RECK speelt een cruciale rol in het behoud van de integriteit van de ECM. Door MMP- inhibitie, blokkeert RECK ook celmigratie en houdt het tumorinvasie tegen (19).
12
3. Methodologie De doelstelling van dit literatuuronderzoek is om na te gaan wat gekend en beschreven is in de wetenschappelijke literatuur rond de histologische, biomoleculaire en biochemische effecten van pulsed dye lasertherapie op de huid. In de discussie gaan we na of deze gegevens inderdaad een verklaring kunnen bieden voor de beschreven klinische effecten van de PDL. Om tot onze artikels te komen, maken we gebruik van de databanken PubMed en Isi Web of Science. Het design van de studie werd niet als restrictiecriterium gebruikt. In eerste instantie werd gezocht naar het algemene mechanisme van laser en in het bijzonder van de pulsed dye laser. Hiervoor werden in PubMed de MeSH-termen Lasers, Dye/therapeutic use ingegeven. Deze zoekactie werd vervolgens verfijnd met restrict to major topic headings only. Dit leverde een totaal van 96 artikels op. Samen met het boek „Laser and light tissue interactions‟ droegen deze artikels bij tot het schrijven van de inleiding. Voor de resultaten werd specifiek gezocht op de zoektermen: nonablative laser treatment AND skin/radiation effects. Bijkomende zoektermen die gebruikt werden waren: pulsed-dye laser, collagen, hydroxyproline, extracellular matrix, matrix metalloproteinases, mRNA, vascular lesions. Om specifiek te zoeken naar dierstudies hebben we gebruik gemaakt van “Limits: Animals”. Vervolgens werden ook artikels gezocht via referentielijsten van verschenen artikels of werd via ISI Web of Science gezocht naar citaties van een artikel. Er werd afgesproken om tot november 2010 relevante publicaties op te zoeken. In deze masterproef werden enkel artikels gebruikt die binnen de tijdspanne van 1981 tot 2010 gepubliceerd werden. Er wordt een onderscheid gemaakt tussen studies uitgevoerd op 1) dieren, 2) in vitro, 3) normale huid en 4) pathologische huid. Alle resultaten van de gevonden artikels worden volgens deze indeling besproken. Hierbij wordt een onderscheid gemaakt tussen de verschillende fasen van een studie die moeten doorlopen worden om tot een algemene conclusie te komen die toepasbaar is op humane huid.
13
4. Resultaten We onderzoeken welke de histologische, biochemische en biomoleculaire effecten van pulsed dye laser zijn op de huid. Daarvoor kijken we achtereenvolgens welke studies al uitgevoerd zijn op dieren, in vivo, op normale humane huid en daarna in pathologische situaties.
4.1
Diermodel
In de literatuur worden zeven studies teruggevonden waarin pulsed dye laser gebruikt wordt op een diermodel (Tabel 1). De studies van Goldman et al (20) en van Anderson et al (21) worden niet besproken aangezien de elektronische versie niet beschikbaar is. Ook de studie van Lin et al (22) gebruiken we niet in onze resultaten. Zij onderzoeken het effect van PDL op stembanden van ratten. De resultaten van deze studie zijn niet te vergelijken met de uitkomst van pulsed dye lasertherapie op humane huid. 4.1.1
Varkenshuid als model voor humane huid
Dahiya et al. (23) ging op zoek naar de beste instellingen voor de pulsed dye laser op varkenshuid om het meest gunstige resultaat te verkrijgen op vlak van dermale remodelling zonder epidermale schade. Van varkenshuid is gebleken dat dit het meest gelijkenis toont met de humane epidermale en dermale structuur in termen van dikte, wondheling en collageensynthese. De belangrijkste outcome in deze studie was een kwantitatieve bepaling van de breedte van collageenvezels om het effect van zowel de nonablative flashlamp pumped pulsed dye laser (FPDL) als van de ablatieve carbon dioxide laser (positieve controle) te bepalen in vergelijking met niet-behandelde huid (negatieve controle). Daarnaast deden ze ook een kwalitatieve beoordeling van epidermale en dermale veranderingen. Deze outcome werd nagegaan na 10 weken na de interventie (23). 4.1.1.1
Breedte van de collageenband
De breedte van de collageenbanden verschilde significant als we de behandelde huid vergeleken met onbehandelde huid. De mate van collageen remodelling was niet significant verschillend tussen de ablatieve en nonablative lasertherapie. Een hogere energiedensiteit (7 vs. 4 J/cm2), grotere spotsize (10 vs. 7 mm) en langere pulsduur (20.0 vs. 1.5ms) zijn allen statistisch significant gebleken voor toenemende breedte van de collageenband. Naast toegenomen collageen remodelling in de bestraalde huid, nemen de collageenbundels ook een densere configuratie aan in de dermis en is er een toename van interstitieel vocht (23). 4.1.1.2
Epidermale en dermale veranderingen
De dikte van de epidermis veranderde niet. Echter zag men wel vrijstelling van melaninegranules over alle lagen van de epidermis die blootgesteld werden aan de ablatieve laser en de nonablative laser in afwezigheid van koeling. Dit stemde overeen met de klinisch zichtbare postinflammatoire hyperpigmentatie. De dermale dikte nam toe in de behandelde huid (23). 14
4.1.2
Muismodel
Dang et al voerde een studie uit om de efficiëntie van de PDL en de Nd:YAG laser te vergelijken op vlak van huidverjonging. Zowel het effect op de waterhoudende capaciteit als het effect op collageenformatie werd onderzocht. De studie werd uitgevoerd op 48 Kunming (KM) muizen die achtereenvolgens behandeld werden met een 595 nm PDL (7 mm spot, 12 J/cm2, pulsbreedte van 10 ms) en een 1320 nm Nd:YAG laser. De rug van de muizen werd geschoren en verdeeld in vier zones van 2 x 2 cm. De linker zones werden met de PDL- en de Nd:YAG- laser behandeld terwijl de rechter zones fungeerden als bijhorende controlegebieden. Evaluatie van histologische en biochemische veranderingen werd uitgevoerd op dag 0, 1, 7, 21, 30 en 60 na de twee laserbehandelingen. Histologische analyses werden uitgevoerd met enerzijds een hematoxyline en eosine kleuring (H&E) en anderzijds met een Sirius red kleuring. Sirius red wordt gebruikt om collageen type I en collageen type III van elkaar te onderscheiden onder een polarisatiemicroscoop. Collageen I vezels kleuren helderrood aan, terwijl collageen type III vezels zichtbaar worden als groene vezels. Om de mate van verbetering van de waterhoudende capaciteit van de huid en de snelheid van hydroxyprolinesynthese te kwantificeren, wordt de hydratatie en de hydroxyproline-inhoud van de huid geanalyseerd (15). Liu et al voerden een gelijkaardige vergelijkende studie uit tussen 4 nonablative lasers op een KM muismodel (16). Een 595 nm PDL (10 ms pulsduur), 1320 nm Nd:YAG laser (0.35 ms), 1064 nm Nd:YAG laser met lange pulsduur (0.3 ms) en 1064 nm Nd:YAG laser Q-switched (5 ns) werden met elkaar vergeleken om het collageenremodelling proces te evalueren (16). 4.1.2.1
Waterhoudende capaciteit van de huid
Onmiddellijk na de bestraling met een 595 nm PDL observeerden Dang et al een stijging van de hydratatie van de huid. Deze toename normaliseerde 7 dagen na de behandeling als we vergeleken met de niet-behandelde gebieden. De 1320 nm Nd:YAG daarentegen veroorzaakte tot dag 7 geen enkele verandering op gebied van de hydratatie. Na 21 dagen induceerden beide lasersystemen een toename van de waterinhoud van de huid in vergelijking met de controles. Zestig dagen na de behandeling was de huidhydratatie duidelijk hoger vergeleken met de respectievelijke controlegebieden. De hydratatie bedroeg 23.2 % met de 595 nm PDL en 32.9 % met de 1320 nm Nd:YAG. De 1320 nm laser is superieur aan de PDL voor het verbeteren van de waterhoudende capaciteit van de huid (15). Retentie van water is één van de belangrijkste biologische functies van hyaluronzuur. De stijging van de waterhoudende capaciteit van de huid wijst dus op een toename van de concentratie van hyaluronzuur in de extracellulaire matrix. Hierdoor vermoeden we dat de 1320 nm Nd:YAG laser effectiever is in de productie van hyaluronzuur dan de PDL (15). 4.1.2.2
Histologische veranderingen
Bestraling door een 595 nm PDL induceert dilatatie van kleine bloedvaten en extravasatie van rode bloedcellen, wat niet gezien werd bij de 1320 nm Nd:YAG (15;16). Dit wordt verklaard aan de hand 15
van het werkingsmechanisme van beide lasersystemen. De PDL emitteert geel licht wat selectief opgenomen wordt door hemoglobine en oxyhemoglobine. De penetratie van de laser is beperkt omdat het licht verstrooid wordt in de epidermis. Deze vasculaire hemoglobineabsorptie leidt tot endotheeldysruptie, cytokineactivatie en collageenremodelling (15). De penetratiediepte van de laser is beperkt omdat het licht verstrooid wordt in de epidermis. De PDL heeft vooral een thermisch effect, beperkt tot de oppervlakkige lagen van de huid. De 1320 nm Nd:YAG- laser daarentegen heeft een golflengte in het infrarood spectrum die goed penetreert in de papillaire en midreticulaire dermis en daar voornamelijk geabsorbeerd wordt door water (16;24). De long-pulsed 1064 nm laser wordt voornamelijk geabsorbeerd door proteïnen en water. Door de verstrooiing van het licht met deze golflengte ontstaat er een lichte dermale verwonding. Na behandeling met de Q-switched 1064 nm Nd:YAG zien we dilatatie van kleine bloedvaten, oedeem in de dermis en inflammatoire veranderingen. Men vermoedt dat deze laser de morfologie van de huid doet veranderen door middel van een inflammatoire reactie. De Q-switched 1064 nm Nd:YAG heeft een zeer korte pulsduur (5 ns) en veroorzaakt vooral schade door een fotomechanisch effect. De stralen worden minder door water geabsorbeerd en minder verstrooid wat resulteert in een relatief diepere dermale wonde (16). Bij elk van de lasers zien we na 24 u uitgesproken oedeem en een acute inflammatoire reactie in de dermis met neutrofielen en monocyten (15;16). Dit wordt gevolgd door lymfocyten die in groten getale verschijnen 1 week na lasertherapie (16). Na 1 week zijn deze inflammatoire veranderingen verdwenen, maar zien we proliferatie van fibroblasten en een toename van de epidermale dikte. Deze toename is echter niet statistisch significant (15;16). Na vier weken, was de toename van collageen en fibroblasten zeer uitgesproken en geassocieerd met een dikkere epidermis. De grootste toename van het aantal fibroblasten was te merken bij de Q-switched Nd:YAG op 4 weken na de behandeling. Dit aantal nam in dezelfde mate toe tot 8 weken na therapie, terwijl de epidermale dikte op een tijdstip van 8 weken terugkeerde naar normale waarden (16). Op dag 21 observeerden we een toename van het aantal collageenvezels (15;16). Dit varieerde van gedesorganiseerd collageen met een gereduceerde affiniteit voor de Sirius red kleuring tot nieuwe collageensynthese met een verbeterde organisatie van de collageenfibrillen (16). Deze nieuw gevormde collageenvezels hadden een grotere affiniteit voor de kleuring dan de controles (15;16). Op dag 30 en 60 was de epidermale en dermale dikte samen met het aantal collageenvezels opmerkelijk gestegen in vergelijking met de onbehandelde gebieden. De 1064 nm Q-switched Nd:YAG laser induceerde meer histologische verbetering samenhangend met het aantal fibroblasten en collageensynthese (16). De histologische veranderingen van de huid zijn duidelijker na behandeling met de 595 nm PDL dan met de 1320 nm Nd:YAG (15). De long-pulsed 1064 nm laser veroorzaakte minder collageensynthese en remodelling in vergelijking met de andere drie lasers. Hieruit blijkt dat 16
de 1064 nm Q-switched Nd:YAG laser die gepaard ging met de meeste dermale schade ook het meest effectief is in het induceren van collageenremodelling. Fotomechanische interactie tussen laser en weefsel blijkt meer effectief te zijn in collageenremodelling dan fotothermische interactie (16). Bij Dang et al (15) toonde de Sirius red kleuring zowel een stijging van collageen type I als van type III aan. De omvang van de toename van collageen type I was groter met de pulsed dye laser dan met de Nd:YAG- laser: een groei van meer dan 50 % in respectievelijk 75% en 42%. Een toename van collageen type III van meer dan 25% was te zien in 75% van de gebieden behandeld met PDL en in 50 % van de gebieden behandeld met Nd:YAG. Samenvattend levert de pulsed dye laser een grotere winst op aan collageen, voornamelijk collageen type I (15). In de studie van Liu et al (16) zagen we voor de vier laserbehandelingen ook een stijging van zowel collageen type I als van collageen type III. De Q-switched 1064 nm laser geeft meer synthese van collageen type III, terwijl bij de andere lasers de synthese van collageen type I, deze van collageen type III overschrijdt. Fotomechanische interactie tussen laser en weefsel zoals bij de Q-switched 1064 nm Nd:YAG laser bevordert in hoofdzaak de synthese van collageen type III. Dit type van collageen is hoofdzakelijk aanwezig in jonge huid. Hiermee suggereert deze studie dat de Q-switched 1064 nm Nd:YAG laser meer effectief zou zijn in het verhogen van de elasticiteit van de huid. De andere drie lasers die schade aanrichten via een fotothermisch effect, bevorderen voornamelijk de vorming van collageen type I (16). De studie doet dus ook veronderstellen dat collageenremodelling sterk afhankelijk is van de interactie tussen weefsel en laser (16). 4.1.2.3
Hydroxyproline
Hydroxyproline is een belangrijke substantie van collageen en wordt praktisch niet teruggevonden buiten collageenvezels. Daarom kan het gebruikt worden als maat voor de hoeveelheid collageen. Om na te gaan of de fibroblastproliferatie gerelateerd is aan de toename van collageen bepaalde men de hoeveelheid hydroxyproline in de huid (15;16). In de behandelde gebieden was de hoeveelheid hydroxyproline toegenomen vergeleken met de respectievelijke controles (15;16). Bij Dang et al leidde de PDL tot een 8,7% hogere toename van hydroxyproline dan de 1320 nm Nd:YAG laser. Het verschil tussen beide systemen was niet significant (15). Liu et al toonde ook een toename van de hydroxyproline-inhoud aan voor elke geteste laser 4 weken na therapie die aanhield tot 8 weken na bestraling. De hoeveelheid hydroxyproline toonde een uitgesproken toename in relatie tot de fibroblastproliferatie. Deze positieve correlatie tussen de hoeveelheid hydroxyproline en het aantal fibroblasten was zeer significant. Dit suggereert dat de fibroblastproliferatie in stond voor de toename van hydroxyproline in de huid en dus voor de toegenomen collageensynthese (16).
17
4.1.3
Konijnenhuid als model voor cutane vasculaire letsels
Hoewel PDL aanvaard wordt als de optimale behandeling voor cutane vasculaire letsels (CVL) zoals wijnvlekken, wordt er nog steeds geen complete klaring bekomen voor deze letsels. Bovendien zijn er vaak multiple behandelingen nodig om een optimale klaring te verkrijgen. De hoofdreden voor het beperkt therapeutisch effect voor CVL is de beperkte coagulatiediepte van grote bloedvaten of bloedvaten die diep in de huid gelegen zijn als reactie op een 585 nm laser. Een laser met een 595 nm golflengte werd geïntroduceerd met het oog op beschadiging van diepere bloedvaten in vergelijking met 585 nm. Er bestaat nog geen consensus over de optimale golflengte voor deze klaring (25-27). Dai et al gebruikt een konijnenoor als model voor CVL in vivo. Het konijnenoor heeft immers een uitgebreide dermale vasculatuur. De invloed van golflengte (585 nm vs. 595 nm) en cryogene spray koeling (CSC) op de door de lasergeïnduceerde beschadiging van dermale bloedvaten werd onderzocht (25). Tien konijnenoren werden elk 6 tot 7 maal bestraald door een FPDL (585nm of 595 nm) en bespoten met 50 ms cryogen stralen. Twee konijnen werden gebruikt om het effect van CSC te evalueren en werden blootgesteld aan cryogenstralen met een duur van 100, 200 en 300 ms. Bij 5 konijnen werd een biopsie afgenomen 2 uur na therapie. Bij de overige 5 werd de biopsie 4 dagen na de therapie afgenomen. De biopsies werden aangekleurd met H&E om de beschadiging van de bloedvaten te evalueren. Daarnaast deed men een TUNEL (terminaal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP Nick-End Labeling)-assay om in een vroege fase apoptose op te sporen (25). Als de energiedensiteit van de laserstraal hoger is dan 10 J/cm2, geeft de 595 nm golflengte aanleiding tot even veel of meer beschadiging aan de dermale bloedvaten dan de 585 nm golflengte. Twee klinische studies hebben echter aangetoond dat de 585 nm golflengte meer effectief is in het verbleken van wijnvlekken dan de 595 nm golflengte bij gelijke pulsduur en energiedensiteit tussen 5.5-10 J/cm2 (26;28). Bloed absorbeert licht van 595 nm veel minder dan van 585 nm waardoor er bij 595 nm minder energie ter beschikking is om de bloedvaten te vernietigen. Er zijn hogere energiedensiteiten nodig bij een golflengte van 595 nm dan bij 585 nm om een beter resultaat te bekomen. Dai et al suggereren dat de grotere beschadiging van bloedvaten bij 595 nm aan een voldoende energiedensiteit (> 10 J/cm2) te verklaren is doordat een groter volume vernietigd kan worden door de diepere penetratie van de stralen in het bloed (25). CSC met een pulsduur van meer dan 100 ms resulteert in een toename van de diepte van de meest oppervlakkig beschadigde bloedvaten. Dit indiceert dat ook de oppervlakkige bloedvaten nietspecifiek gekoeld worden bij deze duur van de cryogenstralen. De coagulatie van deze oppervlakkige bloedvaten kan daardoor in het gedrang komen als de CSC tussen 100 en 300 ms aanhoudt (25). Lasergeïnduceerde beschadiging van de vasculatuur in het konijnenoor was volledig hersteld 4 dagen na bestraling. Blijvende vasculaire beschadiging kan enkel bekomen worden wanneer de basale membraan van de bloedvatwand irreversibel beschadigd is (25). 18
Tabel 1: Overzicht studies diermodel.
Referentie
Toestel
Doel
Thema
aantal dieren
tijd biopsie
histologisch
Biochemisch
Biomoleculair
Dang et al
-595 PDL -1320 Nd:YAG
Vergelijkende studie tussen 2 toestellen
Dermale remodelling: huidverjonging
48 KM muizen
-H&E -Sirius red staining
Hydroxyproline analyse: waterhoudende capaciteit
Nee
Liu et al
-595nm PDL (10ms) -1320nm Nd:YAG (0,35ms) -1064nm Nd:YAG (5ns) -1064 nm Nd:YAG (0,3ms) -595 nm PDL -Carbon dioxide 2 laser (7J/cm )
Vergelijkende studie tussen 4 toestellen
Collageen remodelling
KM muizen
dag 0 d1 d7 d21 d30 d60 1 uur 1 dag 1 week 3 weken 4 weken 8 weken
-H&E -Von Gieson -Sirius red staining
Hydroxyproline analyse
Nee
Vergelijkende studie tussen verschillende instellingen Lasergeïnduceerde beschadiging nagaan
Dermale remodelling
varken
10 weken
-H&E -breedte collageenband
Nee
Nee
Behandeling CVM
10 konijnen (in elk oor 6-7 bestraalde plaatsen)
2 uur 4 dagen
H&E
Nee
TUNEL-assay om apoptose in een vroeg stadium na te gaan
Dahiya et al
Dai et al
585 nm FPDL 595 nm FPDL
19
4.2
In vitro model
Vijf in vitro studies werden gevonden en besproken (Tabel 2). 4.2.1
Effect van PDL op humane fibroblasten van normale huid
Yu et al (29) evalueerde het effect van een 585 nm pulsed dye laser op de productie van collageen en het effect op mRNA- expressie van collageengerelateerde genen in fibroblasten in vitro. Primaire humane fibroblasten van normaal huidweefsel werden in cultuur gebracht en behandeld met een 585 nm FPDL met een energiedensiteit van 3 J/cm2 of 4 J/cm2 (spot 7 mm, pulsduur 450 μsec). De behandelde fibroblasten en het supernatans werden aanvullend nog 1 of 3 dagen in cultuur gebracht. De productie van collageen werd geanalyseerd aan de hand van de hoeveelheid eiwitgebonden hydroxyproline in het supernatans van de gekweekte fibroblasten met behulp van colorimetrie. De mRNA – expressie van TGF-β, SMAD (Small Mothers against decapentaplegic) 2, SMAD3, SMAD4, SMAD7 en type I procollageen α1, α2 in fibroblasten werd onderzocht met rt-PCR (29). TGF-β1 speelt een belangrijke rol in collageenproductie en oefent dit effect uit via een familie van intracellulaire signaalmoleculen, de SMADs (30). De resultaten uit de studie van Yu et al (29) tonen aan dat in de groep van fibroblasten die 3 dagen extra in cultuur werden gebracht, de behandeling met een PDL met een energiedensiteit van 3 J/cm2 een opregulatie van type I procollageen α1 en α2 mRNA veroorzaakt, maar niet van type III procollageen α1 mRNA. Daarnaast geeft deze irradiatie aanleiding tot een significante toename van de hoeveelheid hydroxyproline in het supernatans wat een toename van de collageenproductie in de fibroblasten betekent. Bovendien zien we met de 3 J/cm2 pulsed dye laser ook een significante toename van de mRNA- expressie van TGF-β1 en zijn cellulaire signaalmoleculen SMAD2, SMAD3, SMAD4 en SMAD7 die een belangrijke rol spelen in de collageenproductie. Deze data suggereren dat de low fluence PDL (3 J/cm2) kan zorgen voor een onmiddellijke opregulatie van de mRNA-expressie van procollageen in fibroblasten. Dit stimuleert de neocollagenese via een opregulatie van de TGF-β signaalpathway (29). De behandeling met een energiedensiteit van 4 J/cm2 heeft geen significante effecten op de collageenproductie noch op de mRNA-expressie van TGF- β1, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD7, type I procollageen α1 of type I procollageen α2. Het zou wel de mRNA- expressie van type III procollageen α1 kunnen downreguleren. Bovendien zag men dat een PDL met een hogere energiedensiteit (14 J/cm2) de mRNA expressie van SMADs in fibroblasten kan tegenhouden (29). Glassberg et al (31;32) onderzochten het mogelijke mechanisme van bloedvatdestructie van een 577 nm FPDL (450 ms pulsduur) door het effect na te gaan op erythrocyten, endotheelcellen en fibroblasten in vitro. Humane endotheelcellen en fibroblasten werden met de 577 nm PDL bestraald aan verschillende energiedensiteiten, waarna de levensvatbaarheid van de cellen, de celproliferatie aan
20
de hand van 3H-thymidine incorporatie en de proteïnesynthese via 3H-leucine-incorporatie werd nagegaan. Bij de in cultuur gebrachte endotheelcellen werd zowel de incorporatie van 3H-thymidine als deze van 3H-leucine geremd bij een energiedensiteit van 5-12 J/cm2. Waarden tussen 5-8.5 J/cm2 bleken geen effect te hebben op de levensvatbaarheid van de cellen. De erythrocyten vertoonden na bestraling een snelle dosisafhankelijke lyse. Wanneer de erythrocyten samen met de endotheelcellen in cultuur gebracht werden verdween het remmende effect wat eerst wel te zien was in culturen die enkel uit endotheelcellen bestonden. Deze resultaten betekenen dat erythrocyten de voornaamste cellen zijn die laserenergie van 577 nm absorberen. Toch draagt het directe effect van de 577 nm laser op de endotheelcellen waarschijnlijk ook bij tot de destructie van bloedvaten (31;32). 4.2.2
Effect van PDL op keloïdfibroblasten in vitro
Zhibo et al onderzocht het moleculaire mechanisme van PDL op keloïdfibroblasten in vitro (33). Het doel van de studie is om de correlatie tussen de PDL-bestraling en apoptose van de keloïdfibroblasten te verklaren. Men verzamelde fibroblasten uit keloïd van 20 patiënten en bracht ze in cultuur. De gekweekte fibroblasten werden gebruikt voor de studie. Eén groep vormde de experimentele fibroblasten die met een 595 nm PDL bestraald werden. De overige fibroblasten vormden de controlegroep. Eén dag na bestraling werden alle fibroblasten (zowel controle als experimentele) opnieuw in cultuur gebracht met 10% foetaal bovien serum. Na 24 u onttrok men dit serum aan de cellen gedurende 48 uur waardoor proapoptotische stress ontstond. De fibroblasten werden nadien behandeld met anti-Fas antilichaam om apoptose te induceren. De distributie van de celcyclus en de inductie van apoptose in de fibroblasten werden onderzocht met flowcytometrie en met anti-Fasantilichamen. De expressie van apoptosegerelateerde proteïnen (Fas, Bcl-2 en p53) werd gemeten met flowcytometrie (33). Er waren geen tekenen van apoptose aanwezig in de fibroblasten die met anti-Fas-antilichaam behandeld werden. Keloïd is het gevolg van een abnormaal wondhelingsproces waarbij de fibroblasten een grotere proliferatiecapaciteit en meer resistentie aan apoptose bevatten dan normale fibroblasten. Analyse van de distributie van de celcyclus toonde aan dat 64% van de experimentele fibroblasten zich in de fase tussen G0 en G1 (groeifase 1), 6.4 % van G2 naar mitose en 29 % in de synthesefase S. Slechts 36 % van de controlefibroblasten waren in de overgang van G0 naar G1 fase, terwijl het grootste deel in de proliferatieve fasen van de celcyclus zaten met 21% van G2 naar mitose en 43% in de S-fase (33). Ondanks dat de fibroblasten immuun zijn voor Fas-gemedieerde apoptose, vertoonden beide groepen Fas-proteïne. Het anti-apoptotisch proteïne Bcl-2 was slechts in kleine mate aanwezig. Experimentele fibroblasten, die voornamelijk in de overgang van G0 naar G1 zaten, brachten significant meer p53 tot expressie dan de controlefibroblasten. Een laag p53-gehalte kan resulteren in een versnelling van de celcyclus van de G1 naar de S-fase. Dit zou kunnen verklaren waarom de controlefibroblasten voornamelijk in de proliferatieve fase zitten (33).
21
Referentie
Doel
Thema
Toestel
Celcultuur
Yu et al
-Effect op collageenproductie
Dermale remodelling
585 nm PDL
Humane fibroblasten
Aantal Bestralinge n 1
Biomoleculair
Biochemisch
Andere methode
RT-PCR: SMAD 2 SMAD 3 SMAD 4 SMAD 7 TGF β1 procollageen mRNA
Hydroxyproline analyse: collageenproductie
Nee
-Effect op mRNAproductie van collageengerelateerde genen Glassberg et al
Effect op endotheelcellen, erythrocyten, fibroblasten in vitro
Mechanisme bloedvatdestructie
577 nm PDL
Erythrocyten Fibroblasten Endotheelcellen
5-12 J/cm2
Incorporatie van 3Hthimidine/leucine in endotheliale celculturen.
Nee
Nee
Zhibo et al
Moleculair mechanisme van PDL op keloïdfibroblasten
Keloïdregressie
595 nm PDL
Keloïdfibroblasten
1
-Flowcytometrie: Celcyclusdistributie Fas Bcl2 P53
Nee
-Anti-Fas antilichamen
Kuo et al 2007
Effect van PDL op TGF-β1 expressie in gecultiveerde keloïdfibroblasten
Mechanisme TGF-β1 expressie
585 nm FPDL
Keloïdfibroblasten
9 pulsen 18 pulsen 27 pulsen
Nee
Nee
Kuo et al 2005
Effect op apoptose en fibroblastproliferatie
Keloïdregressie
585 nm PDL
Keloïdfibroblasten
1
-ELISA: TGF-β1 expressie -Western Blot: MAPK expressie -Elektroforese: AP-1 expressie -TUNEL-assay -Gefragmenteerd caspase-3 activiteit
IHC: PCNA ERK P38 JNK
Nee
Tabel 2: Overzicht van in vitro studies
22
4.3
Normale huid
Zeven studies werden gevonden die handelen over de effecten van PDL op normale humane huid (Tabel 3). De studie van Anderson et al (34) wordt niet gebruikt aangezien geen elektronische versie ter beschikking staat. 4.3.1
Immunologische activiteit van de pulsed dye laser
Het werkingsmechanisme van de meeste nonablative lasers is gebaseerd op het concept van selectieve fotothermolyse beschreven door Anderson en Parrish (6). Hierbij wordt een target selectief vernietigd door een laser met de gepaste golflengte. Chromogenex V3 laser is een low-fluence 585 nm pulsed dye laser die gebruikt wordt voor de behandeling van vasculaire letsels door zijn hoge absorptie van methemoglobine. Ultrastructurele analyse van de behandelde huid toont echter geen beschadigde erythrocyten in de capillairen van de huid na behandeling met deze laser (35). Uit een studie blijkt dat de Chromogenex V3 laser ook effectief is in de behandeling van acne en atopische dermatitis (36). Dergelijke resultaten suggereren dat deze 585nm laser niet alleen door selectieve fotothermolyse invloed kan hebben op de huid, maar ook door directe immunologische activatie in de huid (35). Omi et al (37) onderzocht de immunologische veranderingen uitgelokt door irradiatie met de Chromogenex V3 laser (low fluence 585 nm PDL) op ultrastructureel niveau en door analyse van interleukine (IL)-2 en IL-4 mRNA in migrerende T- lymfocyten in de huid. Acht gezonde vrijwilligers tussen 25 en 66 jaar werden voor deze studie geïmplementeerd. Bij elk van hen werd 3 uur na de behandeling als ook 1 dag, 3 dagen, 1 week, 2 weken, 4 weken en 5 weken later telkens een 3 mm punch biopsie genomen ter hoogte van de fibula voor ultrastructurele analyse. Eén week vóór en 1 week na de laserbehandeling werd bij elke patiënt een 3 mm punch biopsie genomen. Deze biopten werden gedurende 6 weken in cultuur gebracht waarna de Il-2 en Il-4 mRNA‟s in de migrerende Tlymfocyten semikwantitatief gemeten werden met een reverse transcriptase - polymerase chain reaction (RT-PCR) (37). Behandeling van de huid met de 585 nm Chromogenex V3 laser toont oedeem van de endotheelcellen met hemostase in de capillairen. Ook rondom de capillairen wordt oedeem opgemerkt. Deze milde schade leidt tot de productie en vrijstelling van cytokines en groeifactoren die uiteindelijk de aanmaak van nieuw collageen stimuleren. Anderzijds toont deze studie, dat de erythrocyten intact blijven na irradiatie en dat er geen endotheelnecrose optreedt. Deze data in acht genomen, kunnen we vermoeden dat de 585 nm laser niet alleen werkt door de selectieve fotothermolyse, maar ook door immunologische veranderingen in de huid (37). In de extravasculaire dermis vindt men vanaf 3 uur tot 1 dag na de behandeling een infiltraat rijk aan neutrofielen en monocyten. Dit kan wijzen op een vroegtijdige inflammatoire verandering. Bovendien ziet men migratie van mastcellen rondom de capillairen 3 uur tot 4 weken na irradiatie. Het bijzondere
23
aan deze mastcellen is dat de granules hoofdzakelijk van het granulaire type zijn. Humane mastcelgranules kunnen drie verschillende ultrastructurele patronen vertonen: granulair, kristalvormig en scroll-like. Normaal zijn de granules van de mastcellen in het bindweefsel van de huid kristalvormig of scroll-like (38). Het granulaire type wordt doorgaans niet gevonden in normale huid, enkel in zieke of in foetale huid. De mastcelgranules veranderen van het kristal of scroll type naar het granulaire type tijdens degranulatie. Bij ernstige inflammatie ziet men granules van het „ghost type‟. Het ghost type, waarbij er een volledige degranulatie is opgetreden, werd in deze studie niet teruggevonden. Dit impliceert dat de Chromogenex V3 laser enkel milde inflammatie induceert (37). Vier tot vijf weken na de laserbehandeling nam het aantal lymfocyten en fibroblasten toe. Vóór de behandeling waren alle patiënten positief voor β-actine, maar negatief voor de IL-2 en IL-4 mRNA‟s in de homing T-lymfocyten. Eén week na de behandeling werden alle patiënten positief voor IL-2 mRNA en IL-4 mRNA. De toename van IL-4 mRNA was meer uitgesproken dan deze van IL-2 mRNA. T-lymfocyten worden onderverdeeld in Th1 en Th2-cellen afhankelijk van hun cytokinerelease. Th1-cellen produceren IL-2 en interferon-γ, terwijl Th2-cellen IL-4 en IL-5 aanmaken. De toename van IL-2 mRNA duidt op een toegenomen activiteit van Th1-cellen en de toename van IL-4 mRNA wijst op meer geactiveerde Th2-cellen. Deze veranderingen die het gevolg zijn van de laserbehandeling, impliceren nogmaals dat de Chromogenex V3 laser een immunologische rol speelt in de huid (37). 4.3.2
Invloed van PDL op collageenproductie
De concentratie aan aminoterminaal propeptide van procollageen type III wordt in de studie van Bjerring et al gebruikt als een maat voor collageensynthese na behandeling met een 585 nm PDL en wit licht (39). Eén enkele behandeling met de 585 nm laser geeft een toename van 84 % van het niveau van het aminoterminaal propeptide van type III procollageen (p<0.05) in vergelijking met onbehandelde huid. Een tweede behandeling na een interval van 14 dagen verbetert het niveau van procollageenproductie tot 148 % (p<0.05) in vergelijking met onbehandelde huid. De behandeling met wit licht (7 J/cm2) veroorzaakt ook een toename van de procollageenproductie met 17 %, maar deze is niet significant. Behandeling met een hemoglobine-specifieke lichtbron, zoals de 585 nm PDL geeft dus een vijfmaal hogere procollageenproductie in vergelijking met wit licht. Dit suggereert dat specifieke interactie tussen bloedvaten en weefsel een rol speelt in de stimulatie van collageenproductie (39). 4.3.3
Invloed van energiedensiteit en overlappende laserpulsen bij PDL-therapie
Koster et al onderzocht het effect op humane huid van PDL-pulsen met variabele graad van overlap. In deze studie gebruikt men humane huid als model voor de behandeling van wijnvlekken (40). Theoretisch is het risico op weefselbeschadiging bij overlappende laserpulsen groter omdat de
24
overlappende pulsen gedeeltelijk gericht zijn naar een ander doel. De bloedvaten gelegen in dit gebied, zullen op korte termijn andermaal bestraald worden (40). Het doel van de PDL-behandeling bij wijnvlekken is om deze zo homogeen mogelijk te bestralen. Om een reticulair patroon van bestraling te voorkomen, krijgen overlappende pulsen de voorkeur (40). De golflengte en pulsduur van de laser liggen vast, de spot size wordt zo groot mogelijk genomen, om een zo groot mogelijke oppervlakte van de PWS te behandelen. Een parameter die kan variëren is de energiedensiteit van de laserpuls (J/cm2) (40). In de studie van Koster et al (40) gaat men eerst op zoek naar de klinisch meest relevante energiedensiteit van een 585 nm PDL met een pulsduur van 450 μsec. Daarna onderzoekt men het effect van verschillende gradaties van overlap tussen de laserpulsen gegeven aan de gevonden energiedensiteit. Achttien gezonde vrijwilligers werden bestraald met de pulsed dye laser met toenemende energiedensiteit en met verschillende graad van overlap. Biopten werden genomen 24 uur na de behandeling en histologisch onderzocht met H&E (40). De diepste vasculaire schade bevindt zich tussen 1.5 en 2 mm diepte bij een energiedensiteit van 6, 7 en 8 J/cm2. Een energiedensiteit van 9 en 10 J/cm2 geeft schade op meer dan 2 mm diepte. Deze laatste waarden geven echter zeer veel complicaties. Ter hoogte van de epidermis is er vacuolisatie en necrose. Dermaal vindt men perivasculaire infiltratie van inflammatoire cellen met vooral neutrofielen, leukocytoclasie en massieve extravasatie van erythrocyten. De vaatwanden zijn vernietigd en bijna volledig verdwenen. Op basis van deze gegevens zou de energiedensiteit de waarde van 8 J/cm2 niet mogen overschrijden. Bij 8 J/cm2 wordt geen coagulatienecrose van het bindweefsel in de dermis gezien. Een bepaalde graad van bindweefselafbraak en remodelling kan men wel verwachten in een latere fase van de wondheling. De granulocyten waaruit het inflammatoire infiltraat hoofdzakelijk bestaat in een vroege fase van de wondheling, secreteren een heel spectrum van lytische enzymen. Om deze afbraak te evalueren zijn er echter bijkomende biopsies nodig 3 weken na de laserbehandeling (40). Overlappende pulsen veroorzaken significant diepere vasculaire schade dan een enkele puls. Dit geldt zowel voor totaal overlappende pulsen als voor pulsen die 30% overlappen. Er is geen verschil in de diepte van beschadiging tussen volledig en gedeeltelijk overlappende pulsen. Als twee pulsen nietoverlappend, maar toch dicht bij elkaar gegeven worden dan is er een significant verschil tussen de diepte van vasculaire schade die deze pulsen veroorzaken. De studie suggereert dat in normale huid twee afzonderlijke pulsen zich niet gedragen als twee onafhankelijke pulsen. Een tweede puls veroorzaakt veel diepere dermale vasculaire schade dan één afzonderlijke puls. Het exacte mechanisme van dit fenomeen is nog niet opgeklaard (40).
25
Deze studie suggereert dat de behandeling met PDL op normale huid model kan staan voor de behandeling van wijnvlekken. Hoewel de grootte van de bloedvaten en de concentratie aan RBC in wijnvlekken verschillend is in vergelijking met normale huid, is het principe van beschadiging van de vaten hetzelfde. Bovendien ligt de energiedensiteit gebruikt bij normale huid in dezelfde range als bij de behandeling van wijnvlekken. Hieruit concludeert men dat het veilig is om wijnvlekken met overlappende PDL-pulsen te behandelen om zo een homogene bestraling van het letsel te verkrijgen (40). Greenwald et al (41) beschrijft de histologische effecten na behandeling met een 577 nm tunable dye laser met een energiedensiteit variërend tussen 1-5 J/cm2. Het onmiddellijke effect van de dye laser is vooral zichtbaar op vasculair niveau. Ter hoogte van de oppervlakkige vasculaire plexus ziet men clusters van geaggregeerde erythrocyten, endotheliale en transmurale necrose met ruptuur en hemorragie van de bloedvaten. Endotheliale nucleaire pycnose, cytoplasmatische vacuolisatie en condensatie worden opgemerkt. Na 48 uur wordt een patroon van acute vasculitis zichtbaar in de oppervlakkige dermis met necrotische veneuze wanden, polymorfonucleaire leukocyten en karyorrhexis. In de diepere dermis ziet men een perivasculair infiltraat van neutrofielen. Ter hoogte van de epidermis is slechts minimale focale necrose zichtbaar ondanks opvallende vasculaire schade. De drempelwaarde om deze significante vasculaire schade te induceren ligt op 2-3 J/cm2 (41). GayCrosier et al toont aan dat in de vasculaire necrose complement C3, C8 en C9 geactiveerd is. Mogelijks is de activatie van het complement verantwoordelijk voor de inflammatoire respons (42).
26
Referentie
Toestel
Aantal pt.
Doel
Thema
Tijd biopt na therapie
Aantal biopten
Histologisch
Biochemisch
Biomoleculair
Andere methode
Koster et al 2001
585 nm PDL
18
Effect van overlappende pulsen
Behandeling CVM
24 uur
4 tot 6 per borst
H&E
Nee
Nee
Nee
Omi et al 2003
585 nm PDL
8
Dermale veranderingen op ultrastructureel niveau na PDL
Huidverjonging
8
Nee
Nee
Nee
EM
Omi et al 2005
585 nm PDL
8
Immunologische veranderingen nagaan na PDL
Immunologische activiteit
3 uur 1 dag 3 dagen 1 week 2 weken 4 weken 5 weken 3 uur 1 dag 3 dagen 1 week 2 weken 4 weken 5 weken
8
Nee
Nee
RT-PCR: IL-2 en IL-4 mRNA in migrerende T-lymfo‟s in de huid
EM
Bjerring et al 2001
585 nm wit licht
10 (585 nm) 9 (wit licht)
Huidverjonging
3 dagen
10 (585 nm) 9 (wit licht)
Nee
Analyse van procollageen type 3 op blaarvloeistof
Nee
Nee
Gay-Crosier et al 1990
577 nm tunable dye
5
Collageensynthese kwantificeren a.d.h.v. aminoterminaal propeptide van type III procollageen Complementactivatie na PDL-therapie
Immunologische activiteit
1 minuut 7 minuten 1 uur 7 uur 24 uur
na 1 min.: 2 andere tijdstippen: 1
Nee
Nee
Nee
IF detectie van C3, C8 en C9 met specifieke polyclonale antilichamen
Greenwald et al 1981
-577 nm tunable dye -argon laser
10
Vergelijkende histologische studie met argon laser en 577 nm tunable dye laser
Selectieve vaatdestructie
Onmiddellijk 24 uur 48 uur
-Onmiddellijk: 12 (dye) 17 (argon laser) -24 uur: 2 (dye) -48 uur: 16 (dye) 5 (argon laser)
-H&E -Von Gieson -Massons trichroom
Nee
Nee
Nee
Tabel 3: Overzicht studies uitgevoerd op humane huid
27
4.4
Pathologische huid
In tabel 4 en 5 wordt een overzicht gegeven van de besproken studies. 4.4.1
Zonbeschadigde huid
Chronische expositie aan UV -straling veroorzaakt veranderingen in de huid zoals pigmentatie, rimpels en telengiëctasieën. Topische behandelingen zoals retinoïnezuur, α-hydroxyzuren en vitamine C zijn technieken die reeds gebruikt worden om zonbeschadigde huid te behandelen. Daarnaast zijn er de behandelingen met ablatieve lasers, dermabrasie en chemische peeling die gebaseerd zijn op het afschaven van de epidermis en beschadigen van de dermis. Deze beschadiging van de huid resulteert in de productie van collageen en remodelling van de dermale extracellulaire matrix. Hoewel deze methoden effectief zijn, gaan ze gepaard met een belangrijke herstelperiode van de huid. Bovendien moeten we bedacht zijn op mogelijke complicaties zoals littekens, infectie en depigmentatie (11;24). Een alternatief op bovenstaande technieken is de nonablative lasertherapie. Hierbij wordt collageenvorming gestimuleerd zonder de epidermis te beschadigen. De operatieve risico‟s zijn minimaal en de herstelperiode wordt sterk gereduceerd. Zowel clinici als patiënten merken een duidelijke verbetering op van de conditie van de huid. Deze resultaten zijn echter zeer subjectief omdat het effect van nonablative lasertherapie op rimpels en littekens over het algemeen mild is en daardoor moeilijk te objectiveren, ongeacht het gebruik van verschillende meettechnieken (43). Orringer et al onderzocht de biochemische veranderingen in de zonbeschadigde huid die optreden na een eenmalige behandeling met enerzijds een 585 nm PDL en anderzijds een 1320 nm Nd:YAG laser. In deze studie zijn 34 patiënten opgenomen tussen 47 en 78 jaar met klinisch evidente milde tot ernstige zonbeschadigde huid op de voorarmen. Bij 13 patiënten werden focale zones op de voorarmen behandeld met een PDL met de volgende parameters: 585 nm, 7 mm spotsize, pulsduur van 350 μsec en een energiedensiteit van 2,5-3,0 J/cm2. De overige 21 patiënten werden behandeld met een Nd:YAG laser: 1320 nm en 10 mm spotsize. De energiedensiteit werd zodanig aangepast zodat de piektemperatuur in de epidermis tussen 40°C en 46°C bleef. Bijkomend werden deze 21 patiënten ook op focale plaatsen ter hoogte van de billen behandeld met dezelfde Nd:YAG laser (11). Op dag 3, 5 en 7 na de behandeling met PDL werden telkens twaalf 3mm punch biopsies genomen uit de focale zones op de voorarm. Het totale RNA werd geëxtraheerd uit de huidbiopten en mRNA levels van specifieke genen werden gekwantificeerd met behulp van rt-PCR technologie. Er werd een analyse gedaan van de levels van MMP 1, 3 en 9, procollageen type 1 en 3, en de cytokines IL-β en tumor necrosis factor α (TNF-α) (11). 4.4.1.1
Cytokines
Verwonding van de huid geeft een acute activatie van cytokines zoals TNF-α en IL-β. Daarom werd in de studie van Orringer et al (11) het mRNA-level van deze inflammatoire mediatoren geanalyseerd na 28
PDL-behandeling. Uit de studie blijkt dat op dag 5 en 7 na PDL-behandeling van zonbeschadigde huid de TNF-α-levels significant gestegen zijn. IL-β levels namen ook toe maar, behaalden de drempel voor statistische significantie niet (11). 4.4.1.2
Procollageen I en III
Onafhankelijk van deze biochemische mechanismen gelooft men dat nonablative lasers effectief zijn in de behandeling van rimpels en atrofische littekens doordat ze een wondhelingsproces op gang brengen dat resulteert in de synthese van structurele dermale componenten. Uit de studie van Orringer et al (11) blijkt dat PDL procollageen I en III mRNA induceert in menselijke huid in vivo. We zien een statistisch significante stijging (gemiddeld 47% boven de baseline) van procollageen I en III mRNA levels één week na de behandeling. Voor procollageen I mRNA bekomen we een significant resultaat 5 dagen na een eenmalige PDL-therapie. Dit suggereert een toename van de collageensynthese (11). De resultaten van deze studie tonen een sterke correlatie tussen de inductie van procollageen I mRNA en procollageen III mRNA op elk tijdstip van de studie na behandeling met de pulsed dye laser. Belangrijk om te vermelden, is dat deze inductie van procollageen I mRNA na nonablative lasertherapie sterk afhankelijk is van patiënt tot patiënt. Sommige patiënten vertoonden inderdaad een duidelijke toename van de productie van procollageen I en III maar, bij anderen was de reactie na pulsed dye laser therapie minimaal of zelfs helemaal afwezig (11). Om na te gaan of de geobserveerde toename van procollageen I mRNA effectief leidt tot een verhoogde aanmaak van procollageen I werd immunohistologie uitgevoerd op huidbiopten van 4 patiënten die met de PDL behandeld werden. Hiervoor werd gebruik gemaakt van 2 verschillende procollageen I monoclonale antilichamen die ofwel een C-terminaal (PICC5) of N-terminaal (SP1-D8) epitoop van procollageen I detecteren (11). Het C-terminaal antilichaam detecteert procollageen I dat in fibroblasten en de omgevende extracellulaire matrix aanwezig is. Het N-terminale antilichaam spoort procollageen I op ter hoogte van de dermo-epidermale junctie (44). In 3 van de 4 patiënten werd een verhoogde aankleuring gezien van procollageen I zeven dagen na behandeling (11). 4.4.1.3
Dikte van de epidermis en dermis
Zelickson et al (45) waren één van de eerste die het positieve effect van de FPDL op zonbeschadigde huid beschreven. Zij evalueerden het klinische effect van een eenmalige behandeling met een 585 nm FPDL (450 μsec puls, 3-6,5 J/cm2). Negentig procent van de patiënten met milde tot matige rimpels presenteerden zich met een verbetering van 50% of meer met 30% die zelfs een verbetering vertoonden van 75 % of meer. Histologische analyse toonde een verdikte laag van normaal aankleurend collageen in de oppervlakkige dermis. Op ultrastructureel niveau zien we een toegenomen hoeveelheid van normale elastine - en collageenvezels in de oppervlakkige dermis (45).
29
Andere bronnen hebben een verbetering van zonbeschadigde huid aangetoond na gebruik van diverse lasersettings. Goldberg et al (24;43) voerde een studie uit om te kijken of verschillende lasersettings van de flashlamp-pumped 595 nm PDL een invloed hadden op de klinische, histologische en ultrastructurele bevindingen. De periorbitale en omgevende regio werden bij 5 vrouwen met zonbeschadigde huid eenmalig behandeld, terwijl bij 5 andere twee maal behandeld werd met een interval van 1 maand. Elke zijde van de patiënt werd met verschillende lasersettings behandeld (zijde 1: 1.5 msec, 7 mm spot en 5-6 J/cm2; zijde 2: 40 msec, 7 mm spot en 8-11 J/cm2). Telkens werd de hoogst mogelijke energiedensiteit gebruikt zonder purpura te induceren. Vóór en 6 maanden na de behandeling werden biopsies uitgevoerd van de behandelde regio. Standaard histologische analyses en elektronenmicroscopisch onderzoek werden verricht om de dikte van het collageen te evalueren (24). Histologische analyse toont een wisselende graad van bovenste papillaire dermale fibroplasie. Uit elektronenmicroscopisch onderzoek blijkt dat na behandeling er meer dikkere collageenvezels zijn dan voordien, wat samenhangt met een toename van collageen type I vezels. Dit gegeven observeerden we bij alle patiënten onafhankelijk van de gebruikte settings en van het aantal behandelingen. Hieruit blijkt dat het gebruik van verschillende laserinstellingen bij dezelfde patiënt niet tot een verschil in resultaat leidt. De resultaten van deze studie moeten echter gepercipieerd worden gezien de kleine patiëntenpopulatie. Bovendien zou het resultaat van 2 behandelingen versus een eenmalige therapie kunnen verschillen als het interval groter is dan 1 maand (24). 4.4.1.4
Matrixmetalloproteïnasen
Dezelfde studie van Orringer et al rapporteerde een inductie van drie belangrijke MMP‟s (MMP-1, MMP-3 en MMP-9) één week na een enkele behandeling met PDL. De stijging van de mRNA-levels van deze MMP‟s was echter niet statistisch significant (11). Oh et al daarentegen toonden geen stijging aan van de mRNA- levels van MMP-1, -3 en -9 na nonablative lasertherapie, maar een toename van MMP-2 en MT1-MMP. De veranderingen in MT1MMP bereikten echter niet het significantieniveau. Ondanks dat ze een toename van MMP-2 mRNA vaststelden, bleek uit gelatine zymografie dat de hoeveelheid actief MMP-2 eerder verminderd was na laserbehandeling (19). Uit dezelfde studie zagen we dat nonablative laserbehandeling aanleiding geeft tot een verhoogde expressie van RECK- mRNA en van het proteïne zelf. RECK blokkeert de activatie van MMP-2 door zijn inhibitorische activiteit op de MMP‟s. Een stijging van RECK kan mogelijkerwijs de vermindering van MMP-2 na laserbehandeling verklaren. Bovendien zal een stijging van deze MMP- inhibitor de afzetting van nieuwgevormde matrixproteïnen vergemakkelijken door de degradatie van deze proteïnen door MMP te blokkeren (19). Zonbeschadigde huid wordt gekenmerkt door een overvloed aan beschadigde en gedesorganiseerde collageenvezels, het zogenaamde cross - linked collageen en een verlaagde productie van procollageen type I en type III. Dit gefragmenteerd collageen houdt de biosynthese van collageen tegen. MMP‟s 30
zijn in staat om deze collageenfragmenten door proteolytische klaring op te ruimen en de biosynthese opnieuw te herstellen (46;47). Eén van de hypothesen stelt dat therapie met PDL denaturatie van het gefragmenteerde collageen veroorzaakt. Bovendien zou het door inductie van endogene MMP‟s zorgen voor degradatie van de collageenfragmenten, wat resulteert in een toename van de collageenproductie (11). Dit degradatieproces kan verricht zijn door de activatie van reeds gevormde MMP‟s die latent aanwezig zijn of door een verhoogde productie van MMP‟s door fibroblasten in de huid of door aanhoudend lage activiteit van MMP. Zoals al vermeld kan het verwijderen van het gefragmenteerd collageen voor een opregulatie zorgen van de synthese van procollageen type I en type III (11). 4.4.2
Acne vulgaris
Acne vulgaris is één van de meest voorkomende huidaandoeningen bij adolescenten en jong volwassenen. Het is een chronische inflammatie van de talgklieren die in het bijzonder in de puberteit door hormonale stimulatie resulteert in de vorming van comedonen, papels, pustels, noduli, nodi, cysten en littekens (9). Acne kan verklaard worden door (9;13):
een verhoogde sebumsecretie
abnormale vermenigvuldiging en differentiatie van keratinocyten met obstructie van de follikelafvoergang en vorming van comedonen
kolonisatie door Propionibacterium acnes
vrijstelling van inflammatoire mediatoren zoals cytokines die zorgen voor de vorming en het behoud van comedonen en de inflammatie.
Men vermoedt dat het mechanisme van nonablative lasers bij inflammatoire acne gebaseerd is op beschadiging van ofwel Propionibacterium acnes ofwel van de talgklier zelf. Seaton et al onderzocht de in vivo effecten van de NliteV laser (PDL met 585 nm golflengte, 350 μsec pulsduur en een spot van 7 mm diameter) op de densiteit van Propionibacterium acnes in de huid, de sebumsecretie en de cytokine-expressie in de huid onmiddellijk na behandeling (13;36). De 585 nm PDL bracht geen reductie teweeg in de kolonisatie van Propionibacterium acnes 24 u na een eenmalige behandeling van het gelaat. Dit laat vermoeden dat beschadiging van Propionibacterium acnes niet aan de basis ligt van het effect van PDL-behandeling bij acne vulgaris. Wetende dat als we de bacterie helemaal uitroeien ter hoogte van het gelaat, redistributie vanuit andere lichaamsdelen zal leiden tot een rekolonisatie zodat het langdurige effect van PDL op acne niet kan verklaard worden. De sebumsecretie veranderde niet over een periode van 12 weken na de behandeling. Dit suggereert dat verandering van de sebumsecretie geen belangrijk mechanisme is van deze 585 nm laser (13;36).
31
Seaton et al (13) onderzochten het effect van de laserbehandeling op de volgende moleculen met behulp van rt-PCR:
IL-1α en IL-1α receptor antagonist: comedogenese wordt gestimuleerd door IL-1α en geïnhibeerd door IL-1αRA.
TNF-α: belangrijk pro-inflammatoir cytokine en stimuleert bovendien de proliferatie van fibroblasten.
Melanocortine (MCR)-1 receptor bevindt zich op het oppervlak van gezonde humane sebocyten en neemt in aantal toe na UV- blootstelling.
Transforming growth factor (TGF)-β1
Na laserbehandeling werd geen verandering gezien in expressie van het mRNA van IL-1α, IL-1α receptor antagonist, TNF-α of MCR-1. De hoeveelheid TGF-β1 mRNA daarentegen nam zeer snel toe met gemiddeld een vijfvoudige stijging 24 uur na PDL-behandeling en een vijftienvoudige stijging bij 2 patiënten na 24 uur (13). De studie van Seaton et al doet vermoeden dat de sterke opregulatie van TGF-β het onderliggend moleculair mechanisme zou kunnen zijn van de pulsed dye laser bij de behandeling van zowel zonbeschadigde huid als van inflammatoire acne. Dit, door de combinatie van stimulatie van neocollagenese met een sterke inhibitie van inflammatie en keratinocytenproliferatie. Men verwacht dat TGF-β de CD4+ T-lymfocyt gemedieerde inflammatie die men ziet in een vroeg stadium van acne zal inhiberen en dat het er voor zorgt dat letsels met een gemengd ontstekingsinfiltraat sneller resorberen. Bovendien denkt men dat de groeistop van keratinocyten zal interfereren met de comedogenese die immers het resultaat is van een keratinocytenhyperproliferatie ter hoogte van het acroinfundibulum van de talgklier (13). 4.4.3
Keloïd
Keloïd is het resultaat van een overmatige accumulatie van collageen in de wonde door een verhoogde biosynthese van collageen door fibroblasten. De doelstelling van therapie is het onderdrukken van deze ongecontroleerde fibroblastactiviteit (48). De FPDL heeft reeds zijn effect getoond op de regressie of het stopzetten van de evolutie van milde vormen van keloïd. Dit kan men klinisch observeren in het keloïd met een reductie van het erytheem en een afvlakking van de letsels (49). Het effect van PDL is gebaseerd op het onderdrukken van de bloed- en voedingstoevoer voor de fibroblasten in de dermis. Het is ook mogelijk dat het rechtstreekse thermische effect van de laserstralen van PDL het collageen en de fibroblasten wijzigen op moleculair niveau (50). Kuo et al toonde reeds aan dat PDL- behandeling van keloïd aanleiding gaf tot een afname van TGFβ1 met een reductie van de fibroblastproliferatie en collageendepositie en een opregulatie van de MMP- expressie (49;51). In een andere studie gingen ze na of dit proces geïnduceerd werd door 32
activatie van mitogen-activated protein (MAP) kinase en caspasen die apoptose van de cel veroorzaken en daarmee de fibroblastproliferatie reduceren (48). MAP kinasen reguleren celgroei, celdifferentiatie en apoptose. Het zijn de regulatoren van activator proteïne 1 (AP-1). TGF-β is een gekende activator van de AP-1 trancriptiefactor. Er zijn drie subfamilies van MAP kinasen gekend bij zoogdieren: extracellular signal-related kinase (ERK), p38 kinase en c-jun N-terminaal kinase (JNK). Gefosforyleerd ERK en p38 zorgen voor differentiatie van fibroblasten (48). Sayah et al toonde aan dat apoptosegerelateerde genen minder tot uiting kwamen in keloïd in vergelijking met gewone littekens. Zij veronderstellen dat inductie van apoptose in de fibroblasten een strategie zou kunnen zijn om de vorming van keloïd te verminderen (52). In de studie van Kuo et al (48) werden biopten gewonnen uit 10 patiënten met keloïd voor en 7 dagen na behandeling met een SPTL-1 flashlamp-pumped PDL (FPDL) (585 nm, pulsduur 450 μsec, spot 5 mm en energiedensiteit van 10-18 J/cm2, gemiddeld 14 J/cm2). Voor en na therapie werden de prolifererende fibroblasten in het keloïdweefsel immunohistochemisch onderzocht op de expressie van proliferating cell nuclear antigen (PCNA) wat een representatie geeft van de fibroblastproliferatie. Apoptose detecteerde men aan de hand van TUNEL-assay en de expressie van gefragmenteerd caspase 3. De activatie van MAP kinase werd onderzocht op basis van de expressie van ERK, p38 kinase en JNK met behulp van immunohistochemische kleuring (48). Op immunohistochemische kleuring is de PCNA- expressie in keloïdfibroblasten in relatief grotere hoeveelheden aanwezig voor de behandeling met de laser. Na de behandeling is de expressie van PCNA afgenomen in alle biopten. Dit toont aan dat keloïdweefsel normaal een hoger PCNA activiteit heeft dan gezonde huid en dat de fibroblastproliferatie onderdrukt wordt door de laserbehandeling (48). Op TUNEL- kleuring was er voor de behandeling minder apoptose aanwezig in het keloïd. Na behandeling bemerkte men in alle biopten significant meer apoptotische cellen, voornamelijk fibroblasten met een aanzienlijke schade en fragmentatie van het DNA. De expressie van gefragmenteerd caspase 3 in deze cellen was lager voor de behandeling dan na behandeling in alle keloïdbiopten. Dit suggereert dat PDL apoptose induceert en de expressie van gefragmenteerd caspase 3 in keloïdweefsel verhoogt (48). De expressie van ERK en totaal p38 in het cytoplasma van keloïdfibroblasten verandert niet na de behandeling. Daarentegen vertonen de nucleï van de fibroblasten na de irradiatie wel een sterke expressie van gefosforyleerd ERK en p38, terwijl fosfo- ERK voor de behandeling slechts in geringe mate aanwezig was en de expressie van fosfo- p38 gereduceerd was. Zowel voor als na de therapie was er geen toename van totaal JNK noch van het gefosforyleerd JNK merkbaar in de biopten. Deze data suggereren dat PDL de proliferatie van fibroblasten onderdrukt en apoptose induceert via de
33
activatie van ERK en p38 pathways, maar niet van de JNK subfamilie en daarmee regressie van de keloïdletsels veroorzaakt (48). We weten nu dat PDL in keloïd een reductie van TGF-β1-expressie induceert wat de proliferatie van fibroblasten vermindert en bovendien apoptose van fibroblasten veroorzaakt via activatie van MAP kinasen. De link tussen TGF-β1 en MAP kinasen pathway is echter nog onduidelijk (48). 4.4.4
Psoriasis
Psoriasis is een chronische inflammatoire huidaandoening gekenmerkt door goed omschreven erythemateuze plaques met schilferend oppervlak (9). De microcirculatie van de huid bij psoriasis vertoont anatomische en fysiologische verschillen met de circulatie van de normale huid. De capillairen zijn gedilateerd, tortueus en uitgerokken. De bloedflow in een psoriasisplaque is verhoogd in vergelijking met niet aangetaste huid van psoriasispatiënten of de huid van gezonde patiënten. Verschillende studies toonden aan dat deze veranderingen in de microvasculatuur zich in een vroeg stadium van de ziekte ontwikkelen vooraleer epidermale hyperplasie histologisch of klinisch zichtbaar wordt (53). Welke factoren aan de basis liggen van de microvasculaire veranderingen is nog niet helemaal duidelijk. Angiogenetische factoren, zoals TGF-α, vascular endothelial growth factor (VEGF), IL-8 en PDEGF worden in een verhoogde concentratie teruggevonden in de epidermis van psoriasisplaques. Bovendien vindt men in de microcirculatie van deze plaques ook andere potentiële angiogenetische mediatoren met inbegrip van αVβ3 integrine en E-selectine (53). De FPDL wordt gebruikt om deze plaques te behandelen. Selectieve fotothermolyse van de beschadigde capillairen door PDL wordt beschreven als mechanisme voor langdurige verbetering van psoriasisplaques (54). Het geëmitteerde gele licht wordt selectief geabsorbeerd door oxyhemoglobine in de RBC van de capillairen. Histologisch en immunohistochemisch onderzoek hebben aangetoond dat PDL, door de oppervlakkige penetratie in de huid, een reductie van de diameter van de capillairen in de papillaire dermis van de plaque veroorzaakt, maar niet in de reticulaire dermis (55). De behandeling met PDL leidt tot klinische verbetering van de plaques en in sommige gevallen tot een volledige remissie van de letsels. Deze bevindingen indiceren dat er een belangrijk verband bestaat tussen de verandering van de oppervlakkige microvasculatuur en het klinisch stadium van psoriasis (53). Hern et al gaan verder op zoek naar de relatie tussen deze twee factoren. Tien patiënten met psoriasis werden onderzocht. Hun huidige medicatie werd stopgezet van 3 weken voor tot 3 maanden na lasertherapie. Patiënten die onder systemische therapie stonden, werden niet geïncludeerd in de studie. Met behulp van video-capillaroscopie worden de capillairen in psoriasisplaques gevisualiseerd en morfologische abnormaliteiten in beeld gebracht. De onderzochte parameters zijn het aantal capillairen 34
per huidoppervlakte en de lengte van de capillairen per huidoppervlakte. De plaques werden nadien driemaal behandeld met PDL (585 nm, 450 μsec pulsduur en 5 mm spot) telkens met een interval van 14 dagen. Aanvankelijk werd een energiedensiteit gebruikt van 7,5 J/cm2. Capillaroscopie werd 2 weken en 6 weken na de laatste laserbehandeling herhaald. De Psoriasis Area and Severity (PASI)score op basis van de plaqueoppervlakte en de ernst van de plaque, werd in alle patiënten opgetekend voor en 6 weken na de lasertherapie om de klinische verbetering van de plaques te kwantificeren (53;55). PDL-behandeling van psoriasisplaques zorgde voor een significante reductie van het aantal capillairen per oppervlakte aangetaste huid en van de lengte van de capillairen per aangetaste huidoppervlakte. Deze microvasculaire veranderingen waren geassocieerd met belangrijke klinische verbetering. Het effect van PDL op de microvasculatuur was het duidelijkst twee weken na de laatste laserbehandeling, met de minste verandering na 4 weken. De grootste reductie van de PASI-score was merkbaar in de periode tussen 2 en 6 weken na de laserbehandeling. Klinische verandering werd dus voorafgegaan door wijzigingen in de microvasculatuur van de psoriasis plaques. Het in omvang toegenomen vasculaire bed in de papillaire dermis van psoriasisplaques is een noodzakelijke component voor het persisteren van klinische letsels. Deze bloedvaten vormen dan ook een belangrijk target in de laserbehandeling van psoriasis (53). In deze studie van Hern et al zag men op capillaroscopie dat de capillairen geen normale configuratie aannemen hoewel er klinisch verbetering of remissie zichtbaar was. Zellickson et al echter rapporteerden histologische normalisatie 4 weken na vier of vijf opeenvolgende PDL-behandelingen met telkens een interval van 2 of 3 weken (56). Het zou kunnen dat het groter aantal behandelingen in deze studie de remodelling van de plaque microvasculatuur naar een normale configuratie versneld heeft (53). Bovenschen et al voert een vergelijkende studie uit tussen pulsed dye lasertherapie en een behandeling met calcipotriol/betamethasone dipropionaat op psoriasisplaques. Beide behandelingen geven een vergelijkbare verbetering van T-cellen, epidermale proliferatie, differentiatie en epidermale dikte. Na een follow-up van 8 weken ziet men een verdere reductie van dermale CD3+, CD4+, CD45RO+, CD2+ T-cellen en epidermale CD3+, CD8+, CD45RO+, CD2+, CD25+ T-cellen na PDL-therapie in tegenstelling tot de topische behandeling. Men kan besluiten dat PDL resulteert in een persisterende reductie van geactiveerde en memory effector T-helpercellen in de dermis en van cytotoxische Tcellen in de epidermis. Bovendien ziet men ook een normalisatie van de epidermale proliferatie en keratinisatie (54). Andere studies (6;57), zowel bij dieren als op normale huid, toonden aan dat PDL verscheidene klinische reacties kan veroorzaken waaronder hemorragie, intravasculaire aggregatie van erytrocyten in het lumen, beschadiging van de bloedvatwand en zelfs ruptuur van het bloedvat. Endotheelcellen en 35
pericyten vertonen degeneratieve afwijkingen zodanig dat op sommige plaatsen enkel nog resten van cellen zichtbaar zijn. Deze veranderingen werden gezien in huidbiopten 10 minuten na laserbehandeling. Het is mogelijk dat de lasergeïnduceerde degeneratie van de endotheelcellen bijdraagt tot de snelle verbetering van psoriasis in de studie van Hern et al (53). Verlies van endotheelcellen zou immers resulteren in een afname van de densiteit van capillairen, vermindering van de lengte van de capillairen in de plaques en een vermindering van het tortueuze aspect van de microvasculatuur (53). 4.4.5
Wijnvlek, naevus flammeus of port wine stains (PWS)
Een wijnvlek is een congenitale vasculaire malformatie die zich voordoet in 0.3 % van de kinderen. Het is een defect van de vasculaire morfogenese veroorzaakt door een verstoring van pathways die de embryogenese en vasculogenese monitoren. Een wijnvlek bestaat uit uitgezette bloedvaten in de oppervlakkige plexus van de dermis (58). Klinisch presenteert een wijnvlek zich als een onregelmatige roze tot paars gekleurde macula die vaak aanwezig is aan één zijde van de hals en aangezicht, maar ook andere plaatsen kunnen aangetast worden. Bij de geboorte ziet de vlek er meestal vlak en roze uit. In verloop van de ontwikkeling van het kind groeien de capillairen en zetten verder uit, waardoor de wijnvlek een donkerder en dikker aspect krijgt. PWS kunnen geassocieerd zijn met erfelijke huidaandoeningen zoals het syndroom van Sturge-Weber en Klippel-Trenaunay. Nabij het oog kunnen deze letsels samen gaan met glaucoom (9). De pulsed dye laser is een reeds lang aanvaarde behandeling voor PWS (59). De therapie is gebaseerd op het concept van de selectieve fotothermolyse. Door gebruik te maken van een golflengte die goed geabsorbeerd wordt door het doelorgaan of het chromofoor en een pulsduur die korter is dan de relaxatietijd van het doelorgaan kan men specifiek bloedvaten beschadigen zonder naburige structuren te treffen (6;58). Grotere structuren hebben meer tijd nodig om voldoende warmte te absorberen. Daaruit volgt dat voor dergelijke structuren lasers met een grotere pulsduur moeten gebruikt worden. Daarnaast vereisen dieper gelegen bloedvaten het gebruik van langere golflengtes van de laserstralen (in het infraroodgebied) die dieper in de huid kunnen penetreren. Omdat de lasers zeer hoge energiepulsen leveren om diep gelegen vaten te coaguleren, moet de epidermis beschermd worden door een koelingsysteem om schade aan de melanocyten en keratinocyten te verminderen (58). De resultaten van PDL bij wijnvlekken zijn vaak goed, maar de respons is variabel en moeilijk te voorspellen. Slechts zelden zullen de letsels volledig verdwijnen en meerdere behandelingen zijn noodzakelijk om een gunstig effect te bekomen. Bovendien zijn hypertrofische PWS vaak resistent tegen de PDL-therapie en purpura is aanwezig gedurende 7 tot 14 dagen na iedere behandeling door intravasculaire stolsels (59;60). De resultaten van de behandeling voor PWS met PDL zijn afhankelijk van patiëntgerelateerde parameters zoals leeftijd en de kleur en locatie van het letsel, van
36
laserparameters (golflengte, pulsduur, spotsize) en van morfologische parameters van de bloedvaten in de wijnvlek zoals de bloedvatdiameter, de dikte van de bloedvatwand en de diepte in de dermis (61). 4.4.5.1
Invloed van golflengte
Aanvankelijk gebruikte men voor de behandeling van vasculaire malformaties een 577 nm PDL met een pulsduur van 450 μsec. Deze uitgezonden stralen veroorzaakten een kleine absorptiepiek van oxyhemoglobine. Later werden deze parameters aangepast tot 585 nm in een poging om de absorptie door oxyhemoglobine te verminderen en tegelijkertijd de penetratiediepte van de stralen in het weefsel te verhogen om zo dieper gelegen vaten te kunnen vernietigen (59;62). Oxyhemoglobine heeft een maximale absorptiepiek rond 540 nm (alfa-piek) en 580 nm (bèta- piek). Dit geldt voor oppervlakkige bloedvaten ter hoogte van het aangezicht en de hals. Bloedvaten in de benen zijn vaak dieper gelegen en bevatten meer desoxyhemoglobine. Hierdoor verschuift de absorptiecurve naar rechts, van 800 nm tot 1200 nm. Hoe langer de golflengte van de laserstralen, hoe dieper de penetratie in de huid (58). Golflengtes in het infraroodgebied zijn meer effectief in de behandeling van dieper gelegen blauwe bloedvaten, terwijl kortere golflengtes meer effectief zijn voor oppervlakkige rode telengiëctasieën (58). 4.4.5.2
Invloed van pulsduur
PWS bestaan uit abnormale bloedvaten met een diameter van 10 ± 300 μm. De ideale pulsduur voor de behandeling van een wijnvlek ligt tussen 1 en 10 ms voor bloedvaten met een kaliber van 30 ± 150 μm (59).
In de studie van Edström et al wordt de vergelijking gemaakt voor de behandeling van wijnvlekken tussen een FPDL met een pulsduur van 0.45 ms, gemiddelde energiedensiteit van 6.5 J/cm2 (met een interval van 0.25-0.5 J/cm2) en een spotsize van 5 mm en een argon-pumped dye laser (APTD) met een spot size van 1 mm, energiedensiteit van 11-29 J/cm2 en 70-190 ms pulsduur (59). Beide systemen hadden een golflengte van 585 nm. Dertig patiënten werden geïncludeerd in de studie en 33 PWS werden behandeld op twee van vier testoppervlakken met beide lasertypes met verschillende energiedensiteit afhankelijk van de grote van de wijnvlek. Twaalf weken na behandeling werd bij elke patiënt één punchbiopsie genomen van een onbehandeld en een behandeld gebied. Om het aantal bloedvaten te kwantificeren werden de biopten immunohistochemisch aangekleurd met CD34, een marker voor endotheelcellen. De bloedvaten werden onderverdeeld in drie groepen op basis van hun diameter (d): d<10 μm, 10 ≤ d < 20 μm, d ≥ 20 μm (59). De FPDL bleek superieur aan de APTD-laser (59). Vijfentwintig van de 33 PWS vertoonden een beter resultaat en een lichtere kleur na FPDL. In 8 patiënten had de argon-pumped dye laser een even goed of zelfs beter resultaat dan de FPDL. Dit indiceert dat bij patiënten resistent aan FPDL het de moeite waard is om de APTD- laser te gebruiken hoewel er belangrijke complicaties zijn zoals littekenvorming, epidermale atrofie en hyper- of hypopigmentatie. Het grote verschil tussen beide lasersystemen was de pulsduur. De argonpumped dye laser heeft een veel langere pulsduur met een 37
gemiddelde van 120 msec. Dit resulteert in coagulatie met niet-selectieve beschadiging van de bloedvatwand, dermis en epidermis waardoor klinisch de huid verbleekt. Deze perivasculaire collageenschade met fibrose zou kunnen bijdragen tot een verkleining van de vaatdiameter en het voorkomen van rekanalisatie. De FPDL heeft een pulsduur van 0.45 ms wat resulteert in meer selectieve coagulatie (59). Biopsies genomen na behandeling met FPDL tonen aan dat oppervlakkige bloedvaten selectief en volledig gecoaguleerd werden zonder bijkomende collaterale schade (59;63). Ook Dover et al kwam tot de conclusie dat de FPDL superieur is aan de APTD- laser (60). 4.4.5.3
Invloed van spotsize
De therapeutische outcome van lasertherapie bij PWS is ook afhankelijk van de diepte van de bloedvaten. De bloedvaten in een wijnvlek zijn gelokaliseerd in de papillaire en oppervlakkige reticulaire dermis op een gemiddelde diepte van 0.46 mm (58). De penetratiediepte van de stralenbundel hangt af van de spotsize. In de studie van Edström et al hebben de APTD-laser en FPDL respectievelijk een spot size van 1 mm en 5 mm (59). De FPDL penetreert dieper in de dermis in vergelijking met de argon-pumped dye laser door zijn grotere spot size. Tan et al toonde aan dat een FPDL met een spot size van 5 mm bloedvaten tot op een diepte van 0.6 mm van de dermo-epidermale junctie (DEJ) kan vernietigen in vergelijking met 0.2 mm bij een spot size van 1 mm (62). Hohenleutner et al (63) vond dat de maximale coagulatie van de bloedvatwand in de behandeling van PWS met FPDL beperkt is tot een diepte van 0.65 mm van de DEJ. Gelijkaardige resultaten werden ook gezien bij Fiskerstrand et al (61) waar de meeste gecoaguleerde vaten op een diepte van 0.4 mm van de DEJ gelegen waren. 4.4.5.4
Het effect van PDL op PWS is afhankelijk van de bloedvatdiameter, de dikte van de bloedvatwand en de diepte van het bloedvat
Fiskerstrand et al (61) toonden aan dat de klinische respons van PWS op 585 nm PDL (0.45 ms pulsduur, 5mm spotsize) afhankelijk is van de diepte, de diameter en de wanddikte van de bloedvaten: PWS met de kleinste bloedvaten toonden de slechtste klinische respons. Deze letsels zijn gekenmerkt door een homogene gesatureerde roze kleur en zijn het minst verbleekt na therapie met 585 nm PDL. Donkerdere wijnvlekken met grotere bloedvatdiameter reageerden matig tot goed op de behandeling afhankelijk van de diepte van de bloedvaten. Roodgekleurde letsels met relatief oppervlakkig gelegen bloedvaten vertoonden de beste resultaten na 585 nm PDL-therapie. De purpere letsels bevatten de diepst gelegen bloedvaten en hadden klinisch een slecht resultaat. De kleur van de PWS is afhankelijk van de fractie dermaal bloed op de relatieve vasculaire oppervlakte aanwezig in een huidbiopt van PWS. De vasculaire oppervlakte is positief gecorreleerd met de diameter van het bloedvat, maar niet met het aantal bloedvaten (61). Testgebieden met een goed klinisch resultaat hadden meer oppervlakkige vaten dan deze die slechts matig of slecht reageerden. Er is een tendens tot grotere bloedvatwanddikte naarmate de bloedvaten 38
dieper in de dermis gelegen zijn (61). Dit correspondeert met het feit dat de PWS die goed reageren op PDL-therapie en de meest oppervlakkige bloedvaten hebben ook degene zijn met de dunste bloedvatwand. De relatie tussen de dikte van de bloedvatwand en de diepte van de vaten varieert echter ook met de lokalisatie van de PWS (61). De graad van fotothermisch geïnduceerde vaatwandnecrose wordt gedetermineerd door de diameter, de diepte en de dikte van de wand van het bloedvat. Fiskerstrand et al concludeerde dat geen enkel bloedvat met een diameter kleiner dan 12 μm werd gecoaguleerd. Voor de coagulatie van kleinere bloedvaten is er een hogere energiedensiteit van de stralenbundel nodig omdat de energie nodig om de vaatwand op te warmen deel wordt van de geabsorbeerde energie. De primaire plaatsen van warmtegeneratie in het bloedvat zijn de erythrocyten. De maximale temperatuur in de vaatwand en de perivasculaire structuren is afhankelijk van de geleiding van de gegenereerde hitte van het lumen tijdens de laserpuls. De meest gecoaguleerde vaten lagen op een diepte minder dan 400 μm van de DEJ zoals hierboven vermeld. Kleine of diep gelegen vaten zijn buiten het bereik gelegen voor coagulatie met een 585 nm PDL (61). In de studie van Edström et al (59) bestaat er een tendens tot toename van het aantal bloedvaten met een kleinere diameter (d < 10 μm) in PWS behandeld met FPDL in vergelijking met onbehandelde PWS. Deze bevinding wordt enkel gezien bij de FPDL en niet bij de argon-pumped dye laser. Dit zou kunnen weerspiegelen dat de FPDL angiogenese induceert. De FPDL vernietigt bloedvaten op een selectieve manier wat kan resulteren in een gebied van hypoxie en stimulatie van angiogenese. Een andere verklaring zou kunnen zijn dat de kleine bloedvaten niet reageerden op de therapie (59). 4.4.5.5
Aantal PDL-behandelingen nodig voor PWS
De energiedensiteit van de PDL-laserpulsen vermindert exponentieel met de diepte in de huid. Men gaat ervan uit dat het aantal bloedvaten dat in elke opeenvolgende laag van de huid vernietigd wordt, ook exponentieel afneemt. Koster et al stellen de hypothese dat het effect van PDL op het lichter worden van een wijnvlek ook exponentieel vermindert met het aantal behandelingen (64). Koster et al onderzocht of het lichter worden van de PWS door PDL-therapie kan beschreven worden aan de hand van een mono-exponentiële functie van het aantal behandelingen (64). Retrospectief hebben ze aangetoond dat er een mono-exponentiële afname is van het klinische effect van PDL op PWS in functie van het aantal behandelingen. Op basis van 2 of 3 kleurmetingen van een PWS kan men dan een individuele inschatting maken van de best mogelijke verbetering van PWS en het aantal behandelingen dat hiervoor nodig is (64).
39
Ziekte
Ref.
Doel
Toestel
Aantal patiënten
Tijdstip biopsie
Histologisch
Biomoleculair
Andere methode
Zonbeschadigde huid
Goldberg et al 2004
Effect van verschillende lasersettings
595 nm
10: 5->1xPDL 5->2 x PDL
6 maanden
Ja
Nee
-EM: grootte van collageenvezels -Digitale foto‟s voor en 6 maanden na therapie
Zonbeschadigde huid
Goldberg et al 2003
585 nm FPDL
10
6 maanden
Nee
Nee
Zonbeschadigde huid
Orringer et al 2005
Ultrastructurele veranderingen van de huid Biochemische veranderingen in zonbeschadigde huid
585nmPDL 1320nm Nd:YAG
34: 13 PDL 21 Nd:YAG
PDL: dag 3,5,7 Nd:YAG: dag 1,2,3,4,7,11
IHC: procollageen I
Zonbeschadigde huid
Zelickson et al 1999
585 nm PDL
20
12 weken
H&E
Zonbeschadigde huid
Oh et al 2007
Effectiviteit van PDL in reductie van rimpels Effect van PDL op MMP‟s en TIMP‟s
RNA extractie/ RT-PCR: MMP 1, MMP 3, MMP 9 Procollageen type I Procollageen type III IL-β, TNF-α Nee
-EM -Digitale fotografie voor en 6 maanden na therapie Nee
4 behandelingen met een interval van 3 weken met een nonablative laser
24
3 weken
Nee
Acne vulgaris
Seaton et al 2003
585 nm PDL (low fluence)
41
NVT
Nee
Acne vulgaris
Seaton et al 2006
585 nm PDL
19
Onmiddellijk 3 uur 24 uur
Nee
RT- PCR: IL-1α, IL-1αRA, TNFα, TGF-β1, MCR-1, GAPDH
Keloïd
Kuo et al 2004
Invloed van PDL op de ernst en het aantal acne letsels Effect van PDL op P. acnes kolonisatie Sebumsecretie, cytokineproductie Keloïdregressie door onderdrukken van TGF-β1 en fibroblastproliferatie
585 nm FPDL
30
7 dagen
Nee
Keloïd
Kuo et al 2005
Effect op apoptose en proliferatie van fibroblasten
585 nm PDL
10
7 dagen
IHC: PCNA, TGF-β1 Collageen type I Collageen type III HRP-DAB kleuring: TGF-β1, PCNA, collageen IHC: PCNA, ERK, P38, JNK
RT-PCR: Collageen type I TGF-β1 MMP 1, MMP 2 MMP 3, MMP 9 MT1-MMP RECK, TIMP-1, TIMP-2 Western blot: antilichamen tegen type I collageen, elastine en actine Gelatine zymografie Nee
-TUNEL-assay -Gefragmenteerd caspase-3 activiteit
-Foto‟s -Lichtmicroscopie -Elektronenmicroscopie Nee
-vragenlijst en dagboek: bijwerkingen therapie -Tellen van de letsels -Bepaling sebumsecretie m.b.v. tape en digitale foto‟s -scrubwash: densiteit van P. acnes kolonisatie -Klinische observatie -Digitale foto‟s
Nee
Tabel 4: Overzicht studies op basis van pathologie
40
Tabel 5: Vervolg overzicht studies op basis van pathologie Ziekte Keloïd
Referentie Kuo et al 2005 (51)
Doel Effect van PDL op inductie van TGF-β1 en MMP in keloïdregressie
Toestel PDL
Aantal pt. 10
Tijdstip biopsie 7 dagen
Histologisch IHC: TGF-β1, MMP-1, MMP-13 HRP-DAB kleuring: MMP-1, TGF-β1
Biomoleculair Western blot: MMP-1 MMP-13
Andere methode Nee
Keloïd
Alster et al 1995 (50)
Effectiviteit van PDL in keloïdregressie
585 nm FPDL
16
?
H&E Giemsa kleuring
Nee
Psoriasis
Hern et al 2001 (55)
Effect van PDL op capillairen in psoriasisplaques
585 nm PDL: 3x met interval van 2 weken
8
2 weken
Nee
Psoriasis
Hern et al 2005 (53)
Vasculaire veranderingen in psoriasisplaques
10
NVT
Nee
-PASI-score -Capillaroscopie
Psoriasis
Zelickson et al 1996 (56)
39
4 weken
Klinische observatie: digitale foto‟s
Bovenschen et al 2007 (54)
585 nm PDL
8
2 weken 4 weken 12 weken
Nee
Klinische observatie
PWS
Edström et al 2002 (59)
Vergelijkende studie tussen PDL en argon laser in de behandeling van PWS
585 nm PDL
30
12 weken
H&E Acid-orcin-Giemsa Periodic-acid-Schiff H&E IHC: Keratine, Ki67, CD3, CD4, CD8, CD45, CD2, CD25, CD94, CD161, TNFRSF18 IHC: CD34
Nee
Psoriasis
Klinische en histologische effecten van PDL op psoriasis Effect van PDL op Tcelinfiltratie, keratinisatie en epidermale proliferatie
585 nm PDL: 3x met interval van 2 weken FPDL
IHC: CD31, Ki67, α5, α6, β1, β4 en αVβ3 integrine E-selectine CD4, CD8, MIB-1 Nee
Evaluatie van erytheem, dikte en soepelheid van het litteken Nee
Nee
Nee
PWS
Adamic et al 2007
Review
PWS
Dover et al 2000
Review
PWS
Fiskerstrand et al 1996 (61) Hohenleutner et al 1995 (63)
Vaatwandnecrose
585 nm PDL
51
15 min.
Nee
Nee
Coagulatiediepte en epidermale schade na PDLtherapie Voorspellen van outcome en het aantal behandelingen met PDL
PDL
11
15-45 min.
H&E NBTC NBTC
Nee
585 nm FPDL
70
NVT
NVT
NVT
Meting van diepte van de bloedvaten door oculaire micrometer Chromameter: kleur van PWS
PWS
PWS
Koster et al 2001 (64)
41
5. Discussie De doelstelling van deze literatuurstudie is om na te gaan wat beschreven is in de wetenschappelijke literatuur rond de histologische, biomoleculaire en biochemische effecten van pulsed dye lasertherapie op de huid. Men gaat na of deze gegevens inderdaad een verklaring kunnen bieden voor de beschreven klinische effecten van de PDL. De vraag stelt zich of de vooropgestelde hypothesen over het werkingsmechanisme van PDL correct zijn of dat er eventueel nog een ander werkingsmechanisme is van PDL op de huid? Het aantal studies dat over dit topic handelt, is beperkt. Natuurlijk zou het ideaal zijn om humane huid als model te nemen voor histologische en moleculaire analyse na lasertherapie. Het preleveren van een hele reeks biopten op een patiënt brengt echter heel wat praktische en ethische problemen met zich mee. Daarom worden diermodellen gebruikt als model voor humane huid of worden de studies in vitro uitgevoerd. De pulsed dye laser is de gouden standaard voor de behandeling van vasculaire huidletsels zoals PWS. Momenteel wordt PDL algemeen toegepast voor huidverjonging en rimpels door de inductie van collageenremodelling. Deze nonablative laser is ontwikkeld met het oog op het verkrijgen van een dermaal effect zonder beschadiging van de epidermis. De verschillende klinische studies geven aan dat de PDL effectief geen schade aanbrengt aan de epidermis mede door het ingebouwde koelingssysteem. De meest beschreven bijwerkingen van PDL zijn erytheem en zwelling onmiddellijk na de behandeling. Purpura wordt occasioneel vermeld, maar verdwijnt na enkele dagen. Deze bijwerkingen zijn volledig reversibel. Schadelijke effecten van PDL zijn afwezig. Dit strookt met de algemene opvatting van nonablative lasers. Het exacte moleculair mechanisme dat de basis vormt van de klinische effecten van PDL is nog niet gekend. Verscheidene hypothesen worden vooropgesteld en aangetoond in morfologische studies:
Een eerste hypothese stelt dat de verhitting van de dermis, door absorptie van de laserenergie, een wondhelingsproces op gang brengt in de dermis. Dit impliceert activatie van fibroblasten, verhoogde expressie van procollageen III en daaropvolgend collageenremodelling.
Een tweede hypothese suggereert dat laserenergie geabsorbeerd wordt door hemoglobine in de microvasculatuur van de dermis. Dit kan leiden tot endotheeldysruptie, vrijlating van cytokines en bijgevolg inductie van collageenremodelling.
5.1
Dierstudies
Bij elk van de diermodellen die besproken werden, ziet men een toename van de collageenproductie na lasertherapie met collageenremodelling tot gevolg. Met de PDL ziet men door het fotothermische effect op de huid een duidelijke stijging van de productie van collageen type I, terwijl de 1064 nm Q42
switched laser een stijging geeft van de synthese van collageen type III door zijn fotomechanische effect (15;16;65). De collageenremodelling is dus duidelijk afhankelijk van de interactie tussen het weefsel en de laser. Dai et al (25) toont aan dat er meer of evenveel beschadiging van de bloedvaten in een konijnenoor bekomen wordt met de 595 nm PDL bij een energiedensiteit van >10 J/cm2 in vergelijking met de 585 nm PDL. In de studie van Koster et al (40) op humane huid ziet men echter dat bij een energiedensiteit hoger dan 8 J/cm2 epidermale beschadiging optreedt. Deze waarde mag niet overschreden worden. De grotere effectiviteit van een 595 nm aan 10 J/cm2 is niet klinisch relevant omdat het de veiligheid van de patiënt in de weg staat. Extrapolatie van een diermodel naar humane huid: Het uitvoeren van verscheidene biopten op humane huid is praktisch en ethisch niet verantwoord. Toch moeten we herkennen dat het extrapoleren van resultaten gevonden op een diermodel ook zijn beperkingen heeft. Verschillende dieren (muizen, konijnen, hamster) worden gebruikt als model voor humane huid, maar verschillen sterk van de humane structuur van de huid en het wondhelingsproces. Zo moet men met de nodige kritiek kijken naar de resultaten van PDL op konijnenhuid. De grootte en de diepte van de bloedvaten zijn duidelijk verschillend tussen konijn en mens. De huid van het varken vertoont echter sterke gelijkenissen met de humane huid waaronder de epidermale en dermale dikte en het kaliber en de distributie van de bloedvaten (23). De PDL veroorzaakt dermale remodelling door zich specifiek te richten naar de dermale bloedvaten. Aangezien de bloedvaten van mens en varken sterk vergelijkbaar zijn, kan het gebruik van het varken als model voor PDL-behandeling op humane huid meer gestaafd worden. De biopten die genomen worden, zijn slechts momentopnames van een continu proces dat aan de gang is. Het bestuderen hiervan is moeilijk. In feite zou men de effecten van PDL op lange termijn moeten kunnen onderzoeken. Hiervoor zouden meerdere biopten nodig zijn en een herevaluatie van de behandelde huid na een bepaald interval. Outcomeparameters: In de besproken dierstudies worden verschillende parameters gebruikt als maat voor neocollagenese: hydroxyprolinesynthese, breedte van de collageenband, dermale dikte, aantal fibroblasten, collageen type I en collageen type III. Hierdoor is het moeilijk om de studies met elkaar te vergelijken. In de toekomst zijn gelijkaardige studies nodig met dezelfde outcomeparameters om het effect van PDL te concluderen. Bovendien zegt de keuze van deze intermediaire outcomeparameters weinig over de klinische effecten van PDL op de huid. Gebruik van verschillende lasersettings: In de besproken studies wordt vaak een vergelijking gemaakt tussen nonablative lasers. Verschillende types lasers worden op dit moment gebruikt voor de
43
behandeling van huidverjonging en geven gelijkaardige histologische effecten. Toch is het moeilijk om hieruit conclusies te trekken zolang er niet meer studies uitgevoerd worden met dezelfde setting.
5.2
In vitro studies
Uit verschillende studies (29;48;49;66) blijkt dat het biologisch effect van PDL op fibroblasten in vitro verschilt naargelang de energiedensiteit. Yu et al vermoedt dat de PDL met lage energiedensiteit (3 J/cm2) de TGF-β transductiepathway kan opreguleren (29). Echter in de studies van Kuo et al (48;49;66) komt naar voor dat PDL- behandeling bij patiënten met keloïd zorgt voor een downregulatie van de TGF-β1 expressie. In hun experiment maken ze gebruik van een hogere energiedensiteit (14 J/cm2) waardoor de resultaten niet te vergelijken zijn met deze uit Yu et al. Het doet alleen vermoeden dat PDL met hoge energiedensiteit de genexpressie van TGF-β1 kan onderdrukken met een verminderde collageenproductie tot gevolg, terwijl de low-fluence PDL deze expressie juist kan verhogen (29;48;49;66). Dit is een interessante uitgangspositie om in de toekomst uit te zoeken of dit verschil in genexpressie ook effectief leidt tot andere klinische effecten. De TGF-β transductiepathway is al grondig onderzocht. Er is aangetoond dat TGF-β zijn diverse cellulaire reacties uitoefent door te binden op specifieke oppervlaktereceptoren die een intrinsieke serine/threonine kinase activiteit bezitten (29). Deze geactiveerde TGF-β-receptoren stimuleren de fosforylatie van receptorgereguleerde SMAD-proteïnen. Deze vormen complexen met SMAD4 dat accumuleert in de kern en de transcriptie van genen reguleert. De initiatie van type I procollageen expressie vindt plaats na de translocatie van een dergelijk SMAD-proteïne naar de kern. Dit activeert de type I procollageen 5‟specifieke promotor en leidt tot een toename van de type I collageenproductie (29;67). De correlatie tussen moleculaire, biochemische en histologische veranderingen en de kliniek is nog niet aangetoond. Translationeel onderzoek is nodig om te kijken of de bevindingen op gecultiveerde fibroblasten ook gezien worden na PDL-behandeling van humane huid.
5.3
Humane huid
Werkingsmechanisme van de PDL: Naast selectieve fotothermolyse heeft PDL ook een immunologische activiteit op de huid. Dit wordt enerzijds geïmpliceerd doordat de PDL zorgt voor een toename van IL-2 en IL-4 mRNA wat leidt tot activatie van Th1 en Th2-cellen. Anderzijds ziet men na therapie het optreden van oedeem in de endotheelcellen en rondom de capillairen wat zorgt voor de inductie van cytokines en groeifactoren en daaruit neocollagenese, maar geen endotheelnecrose (37). Dit bevestigt de vooropgestelde hypothesen. Het is niet uitgesloten dat een nonablative laser de huid kan verjongen via een mechanisme dat niet gebaseerd is op collageenproductie. Verschrompeling van collageen of collageen remodelling door de hitte gegenereerd door het laserlicht zou ook de huid kunnen verjongen zonder daarbij nieuwe 44
collageenvezels aan te maken. Deze mogelijk mechanismen moeten in de toekomst verder uitgewerkt worden (11). Ethische beperkingen: Studies op humane huid zijn niet evident. Vaak moeten er verschillende biopten genomen worden om de effecten van PDL na te gaan door middel van histologisch en immunohistochemisch onderzoek. Patiënten staan dikwijls weigerachtig tegenover het uitvoeren van een huidbiopt uit vrees voor een litteken. Een biopt in een primair letsel wordt zeker niet met dank aanvaard uit angst voor verslechtering van het letsel. Relevantie van de resultaten: In vele studies worden resultaten weergegeven die statistisch nietsignificant zijn. Deze resultaten mag men niet zomaar aannemen en zijn in principe niet betrouwbaar. Dit kan deels het gevolg zijn van een te kleine patiëntenpopulatie waardoor de power van de test te klein is. Om de resultaten de bevestigen, zouden de studies herhaald moeten worden in een grotere populatie. Dit gegeven geldt voor vele van de gebruikte studies. Daarnaast beschrijft men enkel de resultaten van therapie na een korte periode. In de kliniek zijn de effecten op lange termijn juist belangrijk, deze worden echter niet beschreven. Data over hoe lang de initieel aanwezige biomoleculaire en histologische veranderingen persisteren, zijn niet gekend.
5.4
Pathologische huid
5.4.1
Zonbeschadigde huid
Uit verschillende studies blijkt dat nonablative lasertherapie zonbeschadigde huid klinisch verbetert. Zonbeschadigde huid wordt gekenmerkt door een overvloed aan beschadigde en gedesorganiseerde collageenvezels, het zogenaamde cross - linked collageen en een verlaagde productie van procollageen type I en type III (47;68). Dit gefragmenteerd collageen houdt de biosynthese van collageen tegen. MMP‟s zijn in staat om deze collageenfragmenten door proteolytische klaring op te ruimen en de biosynthese opnieuw te herstellen (46;68;69). Eén van de hypothesen is dat pulsed dye lasertherapie denaturatie van het gefragmenteerde collageen veroorzaakt. Bovendien zou PDL endogene MMP‟s activeren waardoor de collageenfragmenten afgebroken worden. Dit zorgt voor een opregulatie van de synthese van procollageen type I en type III (11). Goldberg et al (24) toont aan dat onafhankelijk van de gebruikte settings en van het aantal behandelingen men bij alle patiënten na pulsed dye lasertherapie een toename van collageen type I ziet. Hieruit blijkt dat het gebruik van verschillende laserinstellingen bij dezelfde patiënt niet tot een verschil in resultaat leidt. De resultaten van deze studie moeten echter gepercipieerd worden gezien de kleine patiëntenpopulatie. Bovendien zou het resultaat van 2 behandelingen versus een eenmalige therapie kunnen verschillen als het interval groter is dan 1 maand (24).
45
Klinische relevantie van collageenremodelling: Studies tonen aan dat er collageenremodelling optreedt na PDL therapie, maar het is echter niet duidelijk of dit wel een klinisch effect heeft. Het gebrek aan consequente klinische veranderingen na therapie hangt samen met het feit dat de behandeling bij de ene patiënt de huid verjongt, maar geen of weinig effect heeft bij de andere (11). De vraag is of demografische kenmerken zoals leeftijd, geslacht of de graad van huidaantasting het resultaat van de behandeling kan beïnvloeden. Dit blijkt uit de studie van Orringer et al (11) waar de inductie van procollageen I mRNA sterk verschilt van patiënt tot patiënt. Er is nog translationeel onderzoek nodig om te kijken of de bevindingen in het labo ook kunnen vertaald worden in klinische verbetering voor de patiënt. Bovendien is het klinisch effect van collageenremodelling moeilijk te objectiveren. De verbetering van rimpels is vaak mild, zeer subjectief en moeilijk weer te geven. 5.4.2
Acne
TGF-β speelt een centrale rol in de initiatie van het wondhelingsproces. Het stimuleert de fibroblastproliferatie en verhoogt de synthese van collageen, proteoglycanen, glycosaminoglycanen en fibronectine. Daartegenover inhibeert TGF-β de afbraak van deze matrixproteïnen door een reductie van de synthese van matrixmetalloproteïnasen (70-72). De biologische effecten van TGF-β zijn afhankelijk van de context waarin het geproduceerd is. In normale huid staat TGF-β in voor de chemotaxis van neutrofielen, lymfocyten en monocyten (71). In geïnflammeerd weefsel zoals acne is TGF-β cruciaal voor het beperken van inflammatie en wijzigen van zowel de aangeboren als de verworven immuniteit (71). TGF-β zorgt voor een sterke onderdrukking van IL-2 gemedieerde T- en B-lymfocytenproliferatie, deactivatie van macrofagen, wijziging van de immunoglobulinesynthese en suppressie
van
cytotoxische
T-cellen
(71;73).
Bovendien
inhibeert
TGF-β
ook
de
keratinocytenproliferatie (13). De studie van Seaton et al (13) toont een duidelijke toename van de hoeveelheid TGF-β1 mRNA na pulsed dye lasertherapie. Dit verklaart waarom we drie dagen na therapie een infiltraat vinden dat neocollagenese en fibroplasie voorafgaat (35). Bovendien vermoedt men dat de sterke opregulatie van TGF-β het onderliggend moleculair mechanisme is van de PDL bij de behandeling van zowel zonbeschadigde huid als van inflammatoire acne. Dit, door de combinatie van stimulatie van neocollagenese met een sterke inhibitie van inflammatie en keratinocytenproliferatie. Men verwacht dat TGF-β de CD4+ T-lymfocyt gemedieerde inflammatie die men ziet in een vroeg stadium van acne zal inhiberen en dat het er voor zorgt dat letsels met een gemengd ontstekingsinfiltraat sneller resorberen. Bovendien denkt men dat de groeistop van keratinocyten zal interfereren met de comedogenese die immers het resultaat is van een keratinocytenhyperproliferatie ter hoogte van het acroinfundibulum van de talgklier (13).
46
5.4.3
Keloïd
Uit studies op keloïdweefsel blijkt dat pulsed dye lasertherapie zorgt voor een reductie van TGF-β1expressie. Dit vermindert de proliferatie van fibroblasten en induceert bovendien apoptose van fibroblasten via activatie van MAP kinasen. De link tussen TGF-β1 en MAP kinasen pathway is echter nog onduidelijk (66). 5.4.4
PWS
Om de therapeutische outcome van PWS te verbeteren, moet men de laserparameters selecteren op basis van de morfologische karakteristieken van de bloedvaten in de letsels. De diameter en de diepte van de bloedvaten kan enigszins voorspeld worden aan de hand van de kleur en locatie van het letsel. Toch is er nog verder onderzoek nodig om een niet-invasieve techniek te ontwikkelen om de vasculaire morfologie in wijnvlekken te bepalen (61). Aantal behandelingen met PDL: Verschillende studies beschrijven de histologische en moleculaire veranderingen op de huid na blootstelling aan één enkele PDL-behandeling. In de klinische praktijk bestaat de behandeling uit verschillende sessies. Het is mogelijk dat een reeks opeenvolgende behandelingen stelselmatig meer uitgesproken veranderingen in de dermis veroorzaakt in vergelijking met één sessie. Deze veranderingen zouden op hun beurt aanleiding kunnen geven tot meer klinische verbetering. In de toekomst moet het effect op de huid van meerdere PDL-behandelingen nagegaan worden.
6. Conclusie Op basis van het voorgaande kan besloten worden dat pulsed dye laser therapie mogelijks veranderingen induceert in verschillende moleculen betrokken bij remodelling van de extracellulaire matrix in de dermis. Bij de studies moeten echter een aantal bedenkingen geformuleerd worden. De informatie die al gekend is over dit topic is beperkt. Het grootste deel van de studies wordt uitgevoerd bij een klein aantal patiënten en binnen een kort tijdsinterval. De resultaten worden niet gecorreleerd met de klinische praktijk en zijn vaak gebaseerd op slechts één enkele behandeling met de pulsed dye laser. Bovendien worden verschillende parameters gebruikt als maat voor neocollagenese waardoor het moeilijk is om de resultaten met elkaar te vergelijken.
47
7. Referentielijst (1) Thierens H. Fysica. De Cel I: Organische Chemie, Algemene Chemie en Fysica. 2006. (2) Barlow R, Hruza G. Lasers and Light Tissue Interactions. In: Goldberg D, editor. Procedures in Cosmetic Dermatology Series: Lasers and Lights: Volume 1. Elsevier; 2008. p. 1-9. (3) Alster TS, Lupton JR. Lasers in dermatology. An overview of types and indications. Am J Clin Dermatol 2001;2(5):291-303. (4) Tanzi EL, Lupton JR, Alster TS. Lasers in dermatology: four decades of progress. J Am Acad Dermatol 2003 Jul;49(1):1-31. (5)
Emissiespectra van lasers. [ 2011 Available from: http://www.tobrix.com/dermatologie/.
(6) Anderson RR, Parrish JA. Selective photothermolysis: precise microsurgery by selective absorption of pulsed radiation. Science 1983 Apr 29;220(4596):524-7. (7) Watanabe S. Basics of laser application to dermatology. Arch Dermatol Res 2008 Apr;300 Suppl 1:S21-S30. (8) Karsai S, Roos S, Hammes S, Raulin C. Pulsed dye laser: what's new in non-vascular lesions? J Eur Acad Dermatol Venereol 2007 Aug;21(7):877-90. (9) Gawkrodger D. Dermatology: an illustrated colour text. Sheffield: Elsevier; 2007. (10) Smit JM, Bauland CG, Wijnberg DS, Spauwen PH. Pulsed dye laser treatment, a review of indications and outcome based on published trials. Br J Plast Surg 2005 Oct;58(7):981-7. (11) Orringer JS, Voorhees JJ, Hamilton T, Hammerberg C, Kang S, Johnson TM, et al. Dermal matrix remodeling after nonablative laser therapy. J Am Acad Dermatol 2005 Nov;53(5):775-82. (12) Alam M, Hsu TS, Dover JS, Wrone DA, Arndt KA. Nonablative laser and light treatments: histology and tissue effects--a review. Lasers Surg Med 2003;33(1):30-9. (13) Seaton ED, Mouser PE, Charakida A, Alam S, Seldon PM, Chu AC. Investigation of the mechanism of action of nonablative pulsed-dye laser therapy in photorejuvenation and inflammatory acne vulgaris. Br J Dermatol 2006 Oct;155(4):748-55. (14) Kanitakis J. Anatomy, histology and immunohistochemistry of normal human skin. Eur J Dermatol 2002 Jul;12(4):390-9. (15) Dang Y, Ren Q, Hoecker S, Liu H, Ma J, Zhang J. Biophysical, histological and biochemical changes after non-ablative treatments with the 595 and 1320 nm lasers: a comparative study. Photodermatol Photoimmunol Photomed 2005 Aug;21(4):204-9. (16) Liu H, Dang Y, Wang Z, Chai X, Ren Q. Laser induced collagen remodeling: a comparative study in vivo on mouse model. Lasers Surg Med 2008 Jan;40(1):13-9. (17) Monstrey S. Fasen van de wondgenezing. De beginselen van de chirurgische technieken. 2008. p. 4-7.
48
(18) Ulrich D, Ulrich F, Unglaub F, Piatkowski A, Pallua N. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids. J Plast Reconstr Aesthet Surg 2009 May 21. (19) Oh J, Kim N, Seo S, Kim IH. Alteration of extracellular matrix modulators after nonablative laser therapy in skin rejuvenation. Br J Dermatol 2007 Aug;157(2):306-10. (20) Goldman MP, Martin DE, Fitzpatrick RE, Ruiz-Esparza J. Pulsed dye laser treatment of telangiectases with and without subtherapeutic sclerotherapy. Clinical and histologic examination in the rabbit ear vein model. J Am Acad Dermatol 1990 Jul;23(1):23-30. (21) Anderson RR, Jaenicke KF, Parrish JA. Mechanisms of selective vascular changes caused by dye lasers. Lasers Surg Med 1983;3(3):211-5. (22) Lin Y, Yamashita M, Zhang J, Ling C, Welham NV. Pulsed dye laser-induced inflammatory response and extracellular matrix turnover in rat vocal folds and vocal fold fibroblasts. Lasers Surg Med 2009 Oct;41(8):585-94. (23) Dahiya R, Lam SM, Williams EF, III. A systematic histologic analysis of nonablative laser therapy in a porcine model using the pulsed dye laser. Arch Facial Plast Surg 2003 May;5(3):218-23. (24) Goldberg DJ, Sarradet D, Hussain M, Krishtul A, Phelps R. Clinical, histologic, and ultrastructural changes after nonablative treatment with a 595-nm flashlamp-pumped pulsed dye laser: comparison of varying settings. Dermatol Surg 2004 Jul;30(7):979-82. (25) Dai T, Diagaradjane P, Yaseen MA, Pikkula BM, Thomsen S, Anvari B. Laser-induced thermal injury to dermal blood vessels: analysis of wavelength (585 nm vs. 595 nm), cryogen spray cooling, and wound healing effects. Lasers Surg Med 2005 Sep;37(3):210-8. (26) Greve B, Raulin C. Prospective study of port wine stain treatment with dye laser: comparison of two wavelengths (585 nm vs. 595 nm) and two pulse durations (0.5 milliseconds vs. 20 milliseconds). Lasers Surg Med 2004;34(2):168-73. (27) Hohenleutner S, Badur-Ganter E, Landthaler M, Hohenleutner U. Long-term results in the treatment of childhood hemangioma with the flashlamp-pumped pulsed dye laser: an evaluation of 617 cases. Lasers Surg Med 2001;28(3):273-7. (28) Chang CJ, Hsiao YC, Mihm MC, Jr., Nelson JS. Pilot study examining the combined use of pulsed dye laser and topical Imiquimod versus laser alone for treatment of port wine stain birthmarks. Lasers Surg Med 2008 Nov;40(9):605-10. (29) Yu HY, Chen DF, Wang Q, Cheng H. Effects of lower fluence pulsed dye laser irradiation on production of collagen and the mRNA expression of collagen relative gene in cultured fibroblasts in vitro. Chin Med J (Engl ) 2006 Sep 20;119(18):1543-7. (30) Moustakas A, Heldin CH. The regulation of TGFbeta signal transduction. Development 2009 Nov;136(22):3699-714. (31) Glassberg E, Lask GP, Tan EM, Uitto J. The flashlamp-pumped 577-nm pulsed tunable dye laser: clinical efficacy and in vitro studies. J Dermatol Surg Oncol 1988 Nov;14(11):1200-8. (32) Glassberg E, Lask GP, Tan EM, Uitto J. Cellular effects of the pulsed tunable dye laser at 577 nanometers on human endothelial cells, fibroblasts, and erythrocytes: an in vitro study. Lasers Surg Med 1988;8(6):567-72. 49
(33) Zhibo X, Miaobo Z. Molecular mechanism of pulsed-dye laser in treatment of keloids: an in vitro study. Adv Skin Wound Care 2010 Jan;23(1):29-33. (34) Anderson RR, Parrish JA. Microvasculature can be selectively damaged using dye lasers: a basic theory and experimental evidence in human skin. Lasers Surg Med 1981;1(3):263-76. (35) Omi T, Kawana S, Sato S, Honda M. Ultrastructural changes elicited by a non-ablative wrinkle reduction laser. Lasers Surg Med 2003;32(1):46-9. (36) Seaton ED, Charakida A, Mouser PE, Grace I, Clement RM, Chu AC. Pulsed-dye laser treatment for inflammatory acne vulgaris: randomised controlled trial. Lancet 2003 Oct 25;362(9393):1347-52. (37) Omi T, Kawana S, Sato S, Takezaki S, Honda M, Igarashi T, et al. Cutaneous immunological activation elicited by a low-fluence pulsed dye laser. Br J Dermatol 2005 Dec;153 Suppl 2:57-62. (38) Dvorak AM, Morgan ES, Lichtenstein LM, Weller PF, Schleimer RP. RNA is closely associated with human mast cell secretory granules, suggesting a role(s) for granules in synthetic processes. J Histochem Cytochem 2000 Jan;48(1):1-12. (39) Bjerring P, Clement M, Heickendorff L, Lybecker H, Kiernan M. Dermal collagen production following irradiation by dye laser and broadband light source. J Cosmet Laser Ther 2002 Jun;4(2):39-43. (40) Koster PH, van der Horst CM, van Gemert MJ, van der Wal AC. Histologic evaluation of skin damage after overlapping and nonoverlapping flashlamp pumped pulsed dye laser pulses: A study on normal human skin as a model for port wine stains. Lasers Surg Med 2001;28(2):176-81. (41) Greenwald J, Rosen S, Anderson RR, Harrist T, MacFarland F, Noe J, et al. Comparative histological studies of the tunable dye (at 577 nm) laser and argon laser: the specific vascular effects of the dye laser. J Invest Dermatol 1981 Sep;77(3):305-10. (42) Gay-Crosier F, Polla LL, Tschopp J, Schifferli JA. Complement activation by pulsed tunable dye laser in normal skin and hemangioma. J Invest Dermatol 1990 Apr;94(4):426-31. (43) Goldberg D, Tan M, Dale SM, Gordon M. Nonablative dermal remodeling with a 585-nm, 350-microsec, flashlamp pulsed dye laser: clinical and ultrastructural analysis. Dermatol Surg 2003 Feb;29(2):161-3. (44) Talwar HS, Griffiths CE, Fisher GJ, Hamilton TA, Voorhees JJ. Reduced type I and type III procollagens in photodamaged adult human skin. J Invest Dermatol 1995 Aug;105(2):28590. (45) Zelickson BD, Kilmer SL, Bernstein E, Chotzen VA, Dock J, Mehregan D, et al. Pulsed dye laser therapy for sun damaged skin. Lasers Surg Med 1999;25(3):229-36. (46) Quan T, Qin Z, Xia W, Shao Y, Voorhees JJ, Fisher GJ. Matrix-degrading metalloproteinases in photoaging. J Investig Dermatol Symp Proc 2009 Aug;14(1):20-4. (47) Varani J, Spearman D, Perone P, Fligiel SE, Datta SC, Wang ZQ, et al. Inhibition of type I procollagen synthesis by damaged collagen in photoaged skin and by collagenase-degraded collagen in vitro. Am J Pathol 2001 Mar;158(3):931-42.
50
(48) Kuo YR, Wu WS, Jeng SF, Huang HC, Yang KD, Sacks JM, et al. Activation of ERK and p38 kinase mediated keloid fibroblast apoptosis after flashlamp pulsed-dye laser treatment. Lasers Surg Med 2005 Jan;36(1):31-7. (49) Kuo YR, Jeng SF, Wang FS, Chen TH, Huang HC, Chang PR, et al. Flashlamp pulsed dye laser (PDL) suppression of keloid proliferation through down-regulation of TGF-beta1 expression and extracellular matrix expression. Lasers Surg Med 2004;34(2):104-8. (50) Alster TS, Williams CM. Treatment of keloid sternotomy scars with 585 nm flashlamppumped pulsed-dye laser. Lancet 1995 May 13;345(8959):1198-200. (51) Kuo YR, Wu WS, Jeng SF, Wang FS, Huang HC, Lin CZ, et al. Suppressed TGF-beta1 expression is correlated with up-regulation of matrix metalloproteinase-13 in keloid regression after flashlamp pulsed-dye laser treatment. Lasers Surg Med 2005 Jan;36(1):3842. (52) Sayah DN, Soo C, Shaw WW, Watson J, Messadi D, Longaker MT, et al. Downregulation of apoptosis-related genes in keloid tissues. J Surg Res 1999 Dec;87(2):209-16. (53) Hern S, Stanton AW, Mellor RH, Harland CC, Levick JR, Mortimer PS. In vivo quantification of the structural abnormalities in psoriatic microvessels before and after pulsed dye laser treatment. Br J Dermatol 2005 Mar;152(3):505-11. (54) Bovenschen HJ, Erceg A, Van Vlijmen-Willems I, Van De Kerkhof PC, Seyger MM. Pulsed dye laser versus treatment with calcipotriol/betamethasone dipropionate for localized refractory plaque psoriasis: effects on T-cell infiltration, epidermal proliferation and keratinization. J Dermatolog Treat 2007;18(1):32-9. (55) Hern S, Allen MH, Sousa AR, Harland CC, Barker JN, Levick JR, et al. Immunohistochemical evaluation of psoriatic plaques following selective photothermolysis of the superficial capillaries. Br J Dermatol 2001 Jul;145(1):45-53. (56) Zelickson BD, Mehregan DA, Wendelschfer-Crabb G, Ruppman D, Cook A, O'Connell P, et al. Clinical and histologic evaluation of psoriatic plaques treated with a flashlamp pulsed dye laser. J Am Acad Dermatol 1996 Jul;35(1):64-8. (57) Nakagawa H, Tan OT, Parrish JA. Ultrastructural changes in human skin after exposure to a pulsed laser. J Invest Dermatol 1985 May;84(5):396-400. (58) Adamic M, Troilius A, Adatto M, Drosner M, Dahmane R. Vascular lasers and IPLS: guidelines for care from the European Society for Laser Dermatology (ESLD). J Cosmet Laser Ther 2007 Jun;9(2):113-24. (59) Edstrom DW, Hedblad MA, Ros AM. Flashlamp pulsed dye laser and argon-pumped dye laser in the treatment of port-wine stains: a clinical and histological comparison. Br J Dermatol 2002 Feb;146(2):285-9. (60) Dover JS, Arndt KA. New approaches to the treatment of vascular lesions. Lasers Surg Med 2000;26(2):158-63. (61) Fiskerstrand EJ, Svaasand LO, Kopstad G, Ryggen K, Aase S. Photothermally induced vessel-wall necrosis after pulsed dye laser treatment: lack of response in port-wine stains with small sized or deeply located vessels. J Invest Dermatol 1996 Nov;107(5):671-5. (62) Tan OT, Stafford TJ, Murray S, Kurban AK. Histologic comparison of the pulsed dye laser and copper vapor laser effects on pig skin. Lasers Surg Med 1990;10(6):551-8. 51
(63) Hohenleutner U, Hilbert M, Wlotzke U, Landthaler M. Epidermal damage and limited coagulation depth with the flashlamp-pumped pulsed dye laser: a histochemical study. J Invest Dermatol 1995 May;104(5):798-802. (64) Koster PH, van der Horst CM, Bossuyt PM, van Gemert MJ. Prediction of portwine stain clearance and required number of flashlamp pumped pulsed dye laser treatments. Lasers Surg Med 2001;29(2):151-5. (65) Dang Y, Ren Q, Li W, Yang Q, Zhang J. Comparison of biophysical properties of skin measured by using non-invasive techniques in the KM mice following 595 nm pulsed dye, 1064 nm Q-Switched Nd:YAG and 1320 nm Nd:YAG laser non-ablative rejuvenation. Skin Res Technol 2006 May;12(2):119-25. (66) Kuo YR, Wu WS, Wang FS. Flashlamp pulsed-dye laser suppressed TGF-beta1 expression and proliferation in cultured keloid fibroblasts is mediated by MAPK pathway. Lasers Surg Med 2007 Apr;39(4):358-64. (67) Chen SJ, Yuan W, Mori Y, Levenson A, Trojanowska M, Varga J. Stimulation of type I collagen transcription in human skin fibroblasts by TGF-beta: involvement of Smad 3. J Invest Dermatol 1999 Jan;112(1):49-57. (68) Fisher GJ, Datta S, Wang Z, Li XY, Quan T, Chung JH, et al. c-Jun-dependent inhibition of cutaneous procollagen transcription following ultraviolet irradiation is reversed by all-trans retinoic acid. J Clin Invest 2000 Sep;106(5):663-70. (69) Orringer JS, Rittie L, Baker D, Voorhees JJ, Fisher G. Molecular mechanisms of nonablative fractionated laser resurfacing. Br J Dermatol 2010 Oct;163(4):757-68. (70) Ling E, Robinson DS. Transforming growth factor-beta1: its anti-inflammatory and profibrotic effects. Clin Exp Allergy 2002 Feb;32(2):175-8. (71) Wahl SM, Swisher J, McCartney-Francis N, Chen W. TGF-beta: the perpetrator of immune suppression by regulatory T cells and suicidal T cells. J Leukoc Biol 2004 Jul;76(1):15-24. (72) Schmidt-Weber CB, Blaser K. Regulation and role of transforming growth factor-beta in immune tolerance induction and inflammation. Curr Opin Immunol 2004 Dec;16(6):709-16. (73) Gorelik L, Flavell RA. Transforming growth factor-beta in T-cell biology. Nat Rev Immunol 2002 Jan;2(1):46-53.
52
