Harcban állunk! Régóta…
Az immunrendszer működésének alapja: védelem a kórokozók ellen és tolerancia a saját szervezettel szemben
Gazda immunitás sérülés
Kórokozó
Tolerancia
A veleszületett és az adaptív immunválasz
kórokozó Veleszületett immunitás hámsejtek
Adaptív immunitás B limfociták
Ellenanyagok
T limfociták
Effektor T sejtek
fagociták
komplement
NK sejtek
órák
napok Fertőzéstől eltelt idő
Az ellenanyagok szerepe a kórokozók semlegesítése
Delves & Roitt 2000 NEJM
Az aktív és a passzív immunitás
Veleszületett immunitás Aktív (fertőzés)
Immunitás
Természetes Passzív (anyai) Adaptív immunitás Aktív (vakcináció) Mesterséges Passzív (ellenanyag terápia)
A védőoltások kórokozót semlegesítő ellenanyag termelést serkentenek
(mesterséges aktív immunitás)
A vér ellenanyag koncentrációja az egyedfejlődés során változik
Anyai immuntranszport (természetes passzív)
hónapok
évek
Immun hiányos beteg - intravénás immunglobulin kezelése (IVIG) (mesterséges passzív)
Saját ellenanyag termelés (természetes aktív) Manz et al. 2005. Nature Rev Immunol
Rh negatív vérsejt
Anyai immuntranszport: természetes, passzív immunizálás
Rh pozitív vérsejt
életfontosságú, bár alkalmanként hátrányos Ellenanyag (IgG)
Rh negatív vérsejt Ellenanyag (IgG)
az Rh inkompatibilitás oka az anyai immuntranszport (hemolitikus anaemia)
Rh pozitív vérsejt
http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/presentations/100217_1.htm
Hemolitikus anémia állatokban
x
szamárkanca
mén Kolosztrummal átadott anti-ló vörösvérsejt ellenanyagok
Súlyos beteg öszvércsikó (ugyanannak a párnak a második csikaja)
Lulut, a Budapesti Állatkertben született orrszarvút, mesterséges anyai immuntranszporttal (ló IgG) tettük védetté Születés utáni IgG szint
idő (napok)
Sós és mtsai. 2006
Az ellenanyagok mesterséges alkalmazásai
Terápia Mágikus lövedékek
Diagnosztika
Kígyóméreg elleni antitest terápia (mesterséges, passzív immunizálás) kígyóméreg
Ellenanyag termelés birkában
Állati eredetű fehérje emberben immunreakcióhoz vezet!
Szervkilökődést megelőző antitest terápia (mesterséges, passzív immunizálás)
egészséges vese
Nyúlban termelt T-limfocita specifikus ellenanyagokkal ($ ~400 m/év)
T-limfociták által elpusztított vese - szervkilökődés
Állati eredetű fehérje emberben immunreakcióhoz vezet!
Poliklonális ill. monoklonális ellenanyag tulajdonságai
poliklonális ellenanyag
monoklonális ellenanyag
www.chemicon.com
Monoklonális ellenanyagok előállítása Egér immunizálás a kérdéses molekulával
Lépsejtek izolálása
Mielóma sejtek
Fúzió
Hibridómák
Szelekciós közegben tenyésztés
Monoklonális ellenanyagok termelése
Non-Hodgkin limfóma Tünet: A non-Hodgkin-limfóma legjellemzőbb tünete a fájdalmatlan nyirokcsomó-megnagyobbodás, amely a nyakon, hónaljban vagy a lágyék területén jelentkezik, de más testtájékon is előfordulhat. Ha nagyobb csomót észlelünk, nem kell mindjárt limfómára gondolni, hiszen a különféle fertőzések okozta nyirokcsomóduzzanatok előfordulása gyakoribb, mint a rosszindulatú megbetegedés. Ha ez tartósan, két hét után is fennáll, vagy még a megfigyelési idő alatt tovább nő, és más okra nem derül fény, mindenképpen vizsgálódni kell tovább, részletes orvosi kivizsgálásra van szükség. Ok: a B-limfociták korlátlan osztódása
csecsemőmirigy/tímusz csontvelő lép
nyirokcsomók
A nyaki nyirokcsomó megnagyobbodása utalhat rosszindulatú limfómára. A szervezet nyirok szervei
Kezelés: kemoterápia, sugárkezelés, valamint immunterápia
Non-Hodgkin limfóma – kezelési lehetőségek
„Várj és figyelj”
Besugárzás
Kemoterápia
Immunterápia
Non-Hodgkin limfóma kezelése - kemoterápia A mellkas felső régiójában egy nyirokcsomóból kialakult tumoros szövet.
A tumoros szövet mérete jelentősen csökken a kemoterápia hatására. A daganatos nyiroksejtek gyorsan osztódnak ezért érzékenyek a megfelelő kemoterápiára, röntgenbesugárzásra. A betegek többsége jól reagál ezen kezelés valamelyikére, vagy a kettő kombinációjára. Bizonyos esetekben azonban agresszívabb kezelésre is szükség lehet. Hátránya, hogy nem specifikus, azaz a szervezet valamennyi gyorsan osztódó sejtjét elpusztítja – súlyos mellékhatásokkal, komplikációkkal jár.
CD20 – ideális célpont
An;géntől független érés
Őssejt
Pre-‐B-‐sejt
CD20
Éretlen B-‐sejt
An;géntől függő érés
Ére8 B-‐sejt
Ak;vált B-‐sejt
Plazma sejt
Rituximab - a CD20+ B sejteket célozza és pusztítja 1. Ellenanyagfüggő sejtfüggő sejtölés (ADCC) Természetes ölő sejt
Sejt lízis B-‐limfocita
2. Komplement-függő sejtölés (CDC) Komplement ak;válás
Sejt lízis B-‐limfocita 3. Programozott sejthalál (apoptózis) kiváltása
Sejt lízis B-‐limfocita
Non-Hodgkin limfóma kezelése – monoklonális ellananyaggal (Rituximab)
A hasüregben számos nyirokcsomó megnagyobbodása látható – tumoros nyirokcsomók
Rituximab hatására a tumorok mérete jelentősen csökken, sőt eltűnik.
A limfóma kezelésében mérföldkövet jelentett az immunterápiának az a formája, amely a daganatos nyiroksejtek ellen kifejlesztett ellenanyaggal, a gazdaszervezet jelentős károsítása nélkül csak a beteg sejteket pusztítja el. Ez az új, jól tolerálható immunterápia ma már a kezelés standard részévé vált. A célzott kezelés, egy a daganatsejtek felszínén nagy mennyiségben található fehérjéhez kötődik, és a szervezet védekező rendszerének segítségével az így megjelölt beteg sejtek pusztulását eredményezi. Alkalmazásával a terápiás eredmények javulása észlelhető, a mellékhatások fokozódása nélkül.
Tumorterápia ellenanyagokkal - anti-CD20 monoklonális ellenanyag (Rituximab)
Forrás: Roche (Genentech)
egér MAb-ok (Köhler és Milstein, 1975)
A terápiás monoklonális ellenanyagok “evolúciója”
11 év
muromonab-CD3 (Orthoclone OKT3), 1986 kiméra MAb-ok (Morrison és mtsai, 1984) 10 év
abciximab (ReoPro), 1994 humanizált MAb-ok (Jones és mtsai, 1986) 11 év
daclizumab (Zenapax), 1997 phage display segítségével nyert MAb-ok (McCafferty és mtsai, 1990) 12 év
adalimumab (Humira), 2002
egér szekvenciák glikolizálódás helye humán szekvenciák CDR régiók
humanizált egerek segítségével nyert humán MAb-ok (Lonberg és mtsai, Green és mtsai , 1994) 12 év
panitumumab (Vectibix), 2006
| I I I I | I I I I | I I I I | I I I I | I I I I | I I I I | I I I I | I I I 1980 1985 1990 1995 2000 2005 2010 1975
Lonberg, N. (2005). "Human an;bodies from transgenic animals." Nat Biotechnol 23 (9): 1117-‐1125 alapján módosítva – Nagy Antal Balázs MSc
Humanizált transzgenikus egerek Jakobovits, A., R. G. Amado, et al. (2007). "From XenoMouse technology to panitumumab, the first fully human an;body product from transgenic mice." Nat Biotechnol 25(10): 1134-‐1143 alapján módosítva – Nagy Antal Balázs
Inak^v egér Ig! lánc gén
keresztezés
Inak^v egér IgH lánc gén dupla KO egér törzs (nem képes egér ellenanyagok előállítására)
humán IgL gén beültetése
humán IgH gén beültetése
keresztezés
egér embrionális őssejtek csak humán ellenanyagok előállítására képes egér törzs
humán és egér ellenanyagok előállítására is képes egér törzs
egér IgH gén egér Ig! gén humán IgL gén humán IgH gén
Dupla transzkromoszomális egér: a humán nehéz- és könnyű (k)–láncot hordozzák
Tomizuka et al 2000 PNAS
Humán poliklonális ellenanyagot termelő transzkromoszómális szarvasmarha - Hematech
Kuroiwa et al. 2002 Nature Biotech
Az FcRn szerepe az IgG homeosztázisban
Roopenian and Akilesh 2007 -‐ alapján
A szarvasmarha FcRn-t fokozott mértékben kifejező transzgénikus egerek előállítása bakteriális mesterséges kromoszómával (BAC)
bFcRn mRNS (Northern blot) vt
bovin
Tg#14
he ho
Tg#19
he ho
bFcRn
kDa
Fluorescence In Situ HybridizaJon bFcRn protein (Western blot) B4 vt Tg#14 Tg#19
63.8 -‐ 49.5 -‐
bFcRn
37.4 -‐
Bender és mtsai. 2007, Cervenak és mtsai. 2011
bFcRn Tg egerekben fokozott mértékű antigén-specifikus ellenanyag termelődik
Cervenak és mtsai. 2011
bFcRn Tg egerekben fokozott mértékű a humorális immunválasz: Nagyobb lép, több lépsejt, több antigén-specifikus B-sejt
Cervenak és mtsai. 2011
A bFcRn Tg egerek hatékony immunválasza gyengén immunogén antigénekre az
Ekiert et al. 2009. Science
KLH-‐hoz konjugált HA2-‐pep;d (influenza hemagglu;n konzervált, nem immundomináns epitópja) csak a Tg állatokban válto8 ki megfelelő immunválaszt
Végh és mtsai. 2011
A bFcRn Tg egerek hatékony immunválasza az 1. típusú kannabisz receptorra (CB1) értékes monoklonális ellenanyag előállításához vezetett CB1-‐specifikus IgG Jter
CB1-‐specifikus immunhisztokémiai jelölés agymetszeten
Monoklonális ellenanyag előállítás Egér típus
Hibridómák száma
CB1 pozitív klónok (IgG)
Balb/c
580
0
bFcRn Tg
1634
10
Nagy affinitású CB1-‐specifikus monoklonális ellenanyag 404 (3C2) Kd = 1.7 E-9M
Együttműködés Dr. Katona Istvánnal (MTA, KOKI)
Nyúl FcRn Tg nyúl fokozott immunválasza
Baranyi és mtsai. 2013 PloS One
FcRn Tg nyulak több (4x) humán T-sejt specifikus poliklonális ellenanyagot (rATG) termelnek
Baranyi és mtsai. 2013 PloS One
Ag
ELSŐDLEGES IMMUNVÁLASZ
T cell priming
B
B sejt akJválás
B
T-‐B kooperáció
DC TH
TH
TH
IgM
AFC
RÁOLTÁS, MÁSODLAGOS IMMUNVÁLASZ
AFC
BM
FcRn: hatékonyabb IgG védelem, több IgG
Ag
FOKOZOTT DIVERZITÁS
FcRn: hatékonyabb BM aktiválás
B
Differenciálódás, izocpus váltás, affinitás érés IgG
Az FcRn fokozott kifejeződésének hatása a humorális FcRn: hatékonyabb B sejt aktiválás immunrendszerre
Ag Ag Ag FcRn: több Ag-IgG IC
g
MAGASABB AgSPECIFIKUS IgG TITER, NAGYOBB AFFINITÁS DC
FcRn: több dendritikus sejt, amely nagyobb hatékonysággal prezentálja az NE antigéneket FcRn: több neutrofil, amely nagyobb hatékonysággal szállít antigéneket a nyirokszervekbe
Kacskovics és mtsai. 2011
Az FcRn-t fokozott mértékben kifejező Tg egerek és nyulak jellemzői:
(1) csökken az an-gén(Ag)-‐specifikus IgG lebomlása (2) fokozo? mértékű az Ag-‐specifikus humorális immunválasz; nagyobb lép és a benne lévő Ag-‐specifikus immunsejtek száma jelentősen emelkedik (3) a gyengén immunogén Ag ellen is megfelelő mértékű specifikus immunválasz alakul ki (4) az immunválasz ellenanyag diverzitása fokozódik (5) a lépsejtekből jelentősen nagyobb számú hibridóma állítható elő (6) nem alakul ki autoimmunitás
Creating Transgenic Animals for Quality Antibodies
www.immunogenes.com
Köszönöm a figyelmet!
eGFP transzgénikus sertések – Prof. Bruce Whitelaw - Roslin Istitute, UK, 2007
