Transformace ptDNA tab áku ffúzním úzním tabáku genem E7/GUS a eliminace selek čního selekčního genu za vyu žití homologn využití homologníí rekombinace
Jindř Jindřich Bř Bříza1,2, Josef Vlasá Vlasák1, Štěpán Ryba2, Viera Ludví Ludvíková ková3, Hana Niedermeierová Niedermeierová1 1Biologické Biologické centrum AV ČR, v.v.i., Ústav molekulá molekulární rní biologie rostlin, Braniš Branišovská ovská 31, 370 05 České eské Budě Budějovice, ČR 2Biologická Biologická fakulta Jihoč Jihočeské eské univerzity, Braniš Branišovská ovská 31, 370 05 České eské Budě Budějovice, ČR 3Ústav hematologie a krevní krevní transfuze, Oddě Oddělení lení experimentá experimentální lní virologie, U Nemocnice 1, 128 20 Praha 2, ČR http://www.hybridmedicalanimation.com/pages/chloroplast.html
• Úvod Ø
Ø
Ø Ø
Ø
v rámci grantu zabývajícího se produkcí proteinů lidského papilomaviru (HPV16) v rostlinách jsme přistoupili mj. k transformaci ptDNA tabáku naše předchozí práce ukázaly (Šmahel et al. 2006, Bříza et al. 2007), že samotný onkoprotein E7 je v buňkách vysoce nestabilní jeho stabilizace jsme dosáhli fúzováním s βglukuronidázou (Vlasák et. al. 2006) pro transgenozi ptDNA jsme se však nejdříve rozhodli vyzkoušet fúzi onkogenu E7 s genem aadA (Ryba 2006), který kóduje enzym adenosyl-3‘-adenyl transferázu a slouží tedy při plastidové transformaci jako gen selekční (rezistence ke spektinomycinu) ukázalo se však, že protein E7 byl v chloroplastech i ve fúzi se selekčním proteinem aadA velmi nestálý
• Transformace genem E7/GUS Ø
transformační vektor obsahoval mezi sekvencemi plastidové DNA z oblasti sousedících genů rpoB a trnC v oblasti LSC (integrační místo č. 3) fúzní gen E7/GUS s promotorem z genu pro 16S rRNA a s terminační sekvencí z genu rbcL z Chlamydomonas reinhardtii a gen aadA se stejnými regulačními sekvencemi
• Transformace genem E7/GUS listové segmenty velikosti zhruba 2x2 cm z in vitro rostlin tabáku Nicotiana tabacum var. Samsun položených vrchní stranou listu na agarovém médiu RMOP (Svab et al. 1990) bez spektinomycinu Ø zařízení od firmy Bio-Rad PDS 1000/He Ø Au částice velikosti 0,6 µm Ø tlak hélia 1100 (asi 4,7 atm) psi, snížení tlaku v komoře o 28‘‘ Hg, vzdálenost mezi průtržným diskem a nosičem Au částic 6 mm, vzdálenost pohybu nosiče Au částic 11 mm, 0,5 mg Au a 0,8 µg DNA na střelu, vzdálenost letu Au částic 9 cm Ø po dvou dnech kultivace při 24°C a 16 hod. fotoperiodě s nízkou intenzitou osvětlení byly segmenty rozstříhány na velikost zhruba 5x5 mm a umístěny spodní stranou na médium RMOP s 500 mg/l spektinomycinu Ø regenerované prýty byly přeneseny k zakořenění na bezhormonální médium se spektinomycinem Ø
• Transformace genem E7/GUS
• Transformace genem E7/GUS Ø
celkem získáno z 2x12 střel 29 spektinomycin rezistentních prýtů, z toho 20 zakořenilo na spektinomycinu a byla u nich změřena aktivita GUS a PCR ověřena integrace transgenu do ptDNA Č. rostliny
Aktivita*
Č. rostliny
Aktivita*
Č. rostliny
Aktivita*
301
2426
336
169
346
nd
302
1005
337
nd
347
28
303
1087
338
535
348
nd
304
298
339
nd
349
124
305
114
340
nd
350
368
306
123
341
nd
351
462
332
822
342
1285
352
48
333
3948
343
nd
353
273
334
1646
344
nd
354
791
335
nd
345
272
* aktivita GUS v pmol/min/mg listu
• Transformace genem E7/GUS Ø
Ø Ø Ø Ø
potenciálně homoplasmické rostliny byly získány dlouhodobou kultivací případně regenerací (1-2x) listových explantátů na médiu RMOP se spektinomycinem poté byly tyto rostliny (celkem 15) přivedeny do květu a zkříženy s netransgenní samčí rostlinou stejného kultivaru sklizená semena každé rostliny byly v množství 200-400 vyseta na selekční médium (se spektinomycinem) bylo-li potomstvo homogenně zelené, usuzovali jsme na homoplasmii z hlediska genu aadA vyskytly se však i štěpné poměry zel. x žl. resp. zel x bílé, které značily heteroplasmii mateřských rostlin z hlediska genu aadA (Tab. 2)
• Transformace genem E7/GUS Č. rostliny
Počet reg. cyklů
Č. prim. transformanta
Aktivita* mateř. r.
301X
0
301
2426
196
0
0
367X
1
303
1557
198
0
0
406X
1
338
86
200
0
0
407X
1
338
0
197
0
0
429X
2
302
1725
196
4
0
430X
2
302
1913
196
2
0
435X
2
303
2520
199
0
0
437X
2
303
2089
195
0
0
438X
2
302
1136
379
12
0
449X
2
303
376
198
2
0
454X
2
303
1431
146
53
0
462X
1
301
1217
198
0
0
470X
2
301
1900
170
0
27
475X
2
301
2042
95
0
101
502X
1
342
2175
73
0
125
* aktivita GUS v pmol/min/mg listu
Štěpný poměr zel. žl. bíl.
• Transformace genem E7/GUS Ø Ø
část žlutých a bílých semenáčků (tj. senzitivních čili bez genu aadA) byla co nejdříve přenesena ze selekčního média na půdu bez selekční látky tím se podařilo zachránit většinu těchto rostlin (celkem 29 jedinců), které byly dále analyzovány měřením aktivity GUS a PCR Č. rostliny
Aktivita*
Č. rostliny
Aktivita*
Č. rostliny
Aktivita*
429X1
544
438X5
171
470X5
498
429X2
543
438X6
209
470X7
377
429X3
537
438X7
665
470X8
883
429X4
653
438X8
792
470X9
889
430X1
599
438X9
237
502X1
1182
430X2
637
438X10
463
502X2
804
438X1
586
470X1
219
502X3
1825
438X2
559
470X2
582
502X4
652
438X3
460
470X3
650
502X5
774
438X4
772
470X4
462
• Transformace genem E7/GUS Ø
Ø
Ø
9 rostlin s vysokou aktivitou GUS bylo autogamizováno, získaná semena byla vyseta na MS médium a u 15 náhodně vybraných semenáčků každého potomstva byla změřena aktivita GUS z analyzovaných rostlin bylo vybráno 26 jedinců s vysokou aktivitou GUS (a jeden bez aktivity), kteří byli analyzováni PCR s primery P1 a P2 (průkaz přítomnosti genu aadA) resp. P3 a P4 (průkaz přítomnosti genu gus) na základě těchto výsledků bylo vybráno 8 rostlin, které byly dále analyzovány Southernovou hybridizací (sondy gus a rpoB), RT-PCR na E7/GUS i aadA a westernovou hybridizací (antiGUS, antiE7)
• Transformace genem E7/GUS Aktivita*
Prům. aktivita potomstva
438X8
792
206
5; 484; 453
470X2
582
387
539; 494; 538
470X3
650
532
680; 661; 771; 677
470X4
462
405
640; 618
470X5
498
458
506; 529; 813; 855
470X9
889
336
445; 481
502X1
1182
623
1374; 920; 1552
502X2
804
394
475; 635; 673; 469
502X3
1825
428
851; 1010
Č. rostliny
* aktivita GUS v pmol/min/mg listu
Aktivita vybraných rostlin
• Transformace genem E7/GUS
PCR: primery P1+P2
PCR: primery P3+P4
• Transformace genem E7/GUS
SB: sonda rpoB
SB: sonda GUS
• Transformace genem E7/GUS
RT-PCR: E7/GUS
RT-PCR: aadA
• Transformace genem E7/GUS
WB: antiGUS
• Transformace genem E7/GUS výsledkem je získání 6 homoplasmických rostlin nesoucích pouze gen E7/GUS, jedné rostliny pouze s genem aadA a jedné rostliny nesoucí v její ptDNA buď oba geny v původní konfiguraci nebo pouze fúzní gen E7/GUS Ø fúzní protein E7/GUS však, zdá se, ani v tomto případě nevzniká, detekován byl pouze protein GUS
Ø
