GGO: BEVESTIGING. Versie 04 Datum van toepassing

Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen FLVVM

LAB 24 I-MET-038b

GGO: BEVESTIGING Versie

04

Datum van toepassing

2014-01-15

Opgesteld door :

Kristien Orye, sectieverantwoordelijke GGO, 2013-10-07

Nazicht door :

Ronny Martens, QAM FLVVM, 2013-10-10

Goedkeuring vrijgave door :

Tony Vanhove, Labmanager FLVVM a.i., 2014-01-15

Beheer & locatie geldende versie :

FLVVM, Centrale server FLVVM

Bestemmelingen :

Sectie GGO

Trefwoorden :

GGO, bevestiging, identificatie en kwantificatie

LAB 24 I-MET 038b GGO Bevestiging v.04 1/15

GGO: BEVESTIGING OVERZICHT WIJZIGINGEN (*) Herziening Reden van de herziening * door/datum IDV Opmerking interne audit FLVVM2010/09 13/12/2010 TVDS 21/11/2011 RM 18/07/2012 KO 07/10/2013

Tekstdeel/draag-wijdte van de herziening Punt 8

Nieuwe lay-out Aanpassing referenties

volledige tekst

Aanpassing gebruik software PCR Aanpassing locatie templates Aanpassen verwijzing documenten Aanpassen toepassingsgebied Aanpassen benaming tabblad in excell-doc

10.3 13.2 10 2 12.2 en 12.4

*

Het verschil tussen de huidige datum en de laatste herziening mag niet meer dan 5 jaar bedragen.


GGO: BEVESTIGING INHOUDSTABEL 1

DOEL .................................................................................................................................. 4

2

TOEPASSINGSGEBIED .................................................................................................... 4

3

WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN........................................................... 4

4

DEFINITIES EN AFKORTINGEN ...................................................................................... 4

5

PRINCIPE........................................................................................................................... 5

6

PRESTATIEKENMERKEN ................................................................................................ 5

7

VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN .......................... 6

8

REAGENTIA EN HULPSTOFFEN..................................................................................... 6 8.1 REAGENTIA ................................................................................................................................. 6 8.1.1 Producten.......................................................................................................................... 6 8.1.2 Oplossingen ...................................................................................................................... 6 8.1.3 Referenties ........................................................................................................................ 6 8.2 VERBRUIKSMATERIALEN ............................................................................................................ 6 8.3 GEBRUIKSGOEDEREN .................................................................................................................. 7

9

TOESTELLEN .................................................................................................................... 7

10 WERKWIJZE...................................................................................................................... 7 10.1 10.2

VOORBEREIDING - ALGEMEEN ................................................................................................ 7 VOORBEREIDING – BEPALEN IDENTIFICATIE EN/OF KWANTIFICATIE, PLAATSCHEMA, VERDUNNINGEN EN MIX......................................................................................................................... 7 10.2.1 Identificatie ....................................................................................................................... 8 10.2.2 Kwantificatie ..................................................................................................................... 9 10.3 UITVOERING ......................................................................................................................... 10 10.4 AFWERKING ......................................................................................................................... 11 11 KWALITEITSCONTROLE ............................................................................................... 11 11.1 11.2

IDENTIFICATIE ...................................................................................................................... 11 KWANTIFICATIE ................................................................................................................... 12

12 BEREKENING EN RAPPORTERING ............................................................................. 12 12.1 12.2 12.3 12.4 12.5

VERLOOP .............................................................................................................................. 12 UITVOERING IDENTIFICATIE ................................................................................................. 12 RAPPORTERING IDENTIFICATIE ............................................................................................. 13 UITVOERING KWANTIFICATIE ............................................................................................... 14 RAPPORTERING KWANTIFICATIE .......................................................................................... 15

13 VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURE, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN, FORMULIEREN OF LIJSTEN ................................................................................................ 15 13.1 13.2 13.3

PROCEDURES/INSTRUCTIES .................................................................................................. 15 FORMULIEREN ...................................................................................................................... 15 LIJSTEN ................................................................................................................................ 15


GGO: BEVESTIGING 1

Doel

Dit werkvoorschrift beschrijft de werkwijze voor de bevestiging (identificatie en kwantificatie) van genetische modificaties in DNA-oplossingen van plantaardig materiaal met real-time PCR.

2

Toepassingsgebied

De methode is geschikt voor de identificatie en kwantificatie op DNA-extracten verkregen met de CTAB-extractiemethode. Identificatie en kwantificatie gebeuren met real-time PCR met probes als indicator. Voor elk van de gezochte modificaties wordt een specifieke combinatie van primerpaar en probe gebruikt (zie 3). Identificatie en kwantificatie wordt enkel toegepast in het onderzoek naar EU-geautoriseerde GGO’s. In het labo wordt dit toegepast voor maïs-GGO’s en soja-GGO (vermeld in punt 3).

3 -

-

4

Wettelijke en normatieve documenten ISO 21570: 2005 Foodstuffs – Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products – Quantitative nucleic acid based methods + bijlagen. Primers en probe: MON40-3-2: Le/RR4: ISO21570, Bt176: Zm1/176: ISO21570, Bt11: Adh2/Bt1011: ISO21570, MON810: Zm1/810: CRL Protocol MON810 / ISO21570, MON863: Adh1/863: CRL Protocol MON863, TC1507: Mhm/1507: CRL Protocol TC1507, NK603: Adh1/603: CRL Protocol NK603, GA21: Adh1/GA21: CRL Protocol GA21, DAS59122: Mhm/DAS: CRL Protocol 59122, MIR604: Adh2/604: CRL Protocol MIR604.

Definities en afkortingen

Definities/afkorting

Verklaring

PCR real-time PCR

Polymerase Chain Reaction, een PCR-reactie waarbij het verloop van de reactie continu gevolgd wordt, dubbelstrengig DNA, enkelstrengig DNA, totale hoeveelheid DNA van niet-gemodificeerd organisme, een GGO met een welbepaalde plaats van invoegen van de modificatie in het genomisch DNA korte sequentie ssDNA die zich bindt aan het begin of einde van de gezochte sequentie, korte sequentie ssDNA die chemisch gebonden is aan een detectiesysteem (fluorochroom + quencher),

dsDNA ssDNA genomisch DNA event primer probe


GGO: BEVESTIGING amplicon epje PC NC CRM

5

het gevormde DNA tijdens de PCR-reactie, meer bepaald de gezochte sequentie, eppendorfbuisje positieve controle negatieve controle gecertificeerd referentiemateriaal

Principe

PCR is een analysetechniek waarbij geselecteerde DNA-fragmenten vermenigvuldigd worden zodat de concentratie ervan hoog genoeg wordt voor detectie. De uitvoering van PCR bestaat uit de volgende stappen: - denaturatie (‘smelten’) van dsDNA tot ssDNA door verwarming, - afkoelen van het ssDNA waarbij korte specifieke sequenties (primers / probes) zich kunnen binden aan hun complementaire plaatsen op het ssDNA en zo korte fragmenten dsDNA vormen, - verlengen van de dubbelstrengige primer/DNA-fragmenten door het enzyme TaqPolymerase met vorming van een nieuwe dubbelstrengige DNA-sequentie. Hierbij wordt de probe afgebroken waarbij de fluorofoor vrijgesteld wordt, - herhalen van de vorige drie stappen. Er worden twee primers gebruikt (de forward en reverse primer) die samen een bepaalde DNA-sequentie afbakenen. Na een aantal cycli gebeurt vooral vermenigvuldiging van de sequentie tussen de twee primers waardoor bij elke cyclus het aantal nieuwe sequenties verdubbelt. Deze exponentiële vermenigvuldiging leidt er toe dat zelfs een gering aantal originele kopijen van een sequentie kan aangroeien tot een meetbare concentratie. De detectie bij real-time PCR gebeurt aan de hand van meting van fluorescentie: de fluorescentie van de probes wordt onderdrukt door een quenchermolecule zolang de probe intact is. Bij de afbraak van de probe tijdens de verlenging komt de fluorofoor vrij in oplossing terecht en wordt de fluorescentie niet langer onderdrukt. De totale fluorescentie is dan evenredig met het aantal afgebroken probes en dus met het aantal gevormde kopijen. De belangrijkste aspecten van real-time PCR zijn: - de gebruikte primers: die bepalen welke DNA-sequentie opgespoord wordt, - het aantal cycli dat herhaald wordt. De bevestiging kan bestaan uit 2 stappen: - identificatie van de modificatie (welke modificaties zijn aanwezig?) en/of - kwantificatie (bepaling van het gehalte als de concentratie van het event > 0,1 % m/m).

6

Prestatiekenmerken

Identificatie: LOD 0,03% m/m. Kwantificatie: LOQ 0,10% m/m.


GGO: BEVESTIGING

7

Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen

Voor veiligheidsmaatregelen en bijzondere voorzorgsmaatregelen: zie LAB 24 P 005 I 011 PCR Algemene instructies voor uitvoering.

8 8.1 8.1.1 -

8.1.2 8.1.3

-

Reagentia en hulpstoffen Reagentia Producten Bleekwater, DNA away, Fastmix UNG, primers en probes voor soja, maïs en het gezochte event (LAB 24 I-MET 038b L 001 Primers en probes bevestiging GGO). Oplossingen DNAse/RNAsevrij steriel water OPLOS 107, verdund bleekwater 1:6 OPLOS 116, primers OPLOS 118. Referenties maïs TC1507, maïs DAS59122, maïs Bt11, maïs Bt176, maïs GA21, maïs MIR604, maïs MON810, maïs MON863, maïs NK603, soja RR (MON40-3-2).

De originele referentiemonsters worden bewaard in de frigo; de DNA-extracten worden in de diepvries bewaard. Volgens het certificaat zijn de referentiemonsters 1 jaar houdbaar. De opgegeven houdbaarheidsdatum kan verlengd worden : de referenties zijn bruikbaar zolang de ijklijnen van de events voldoen aan de gestelde criteria.

8.2 -

Verbruiksmaterialen epjes van 1,5 ml, gele containers voor biologisch afval, handschoenen,


GGO: BEVESTIGING -

8.3 -

9 -

-

PCR-buisje van 10 ml, pipettips met filters van 1- 20 µl, 20-200 µl en 100-1000 μl, PCR-plaat GGO, afdekstrips PCR-plaat.

Gebruiksgoederen Aandrukplaat voor afsluitstrips, aandrukrol voor aandrukken plaat in thermocycler, bekers voor afval, bewaardozen voor epjes, houder voor microtiterplaat, koelblok voor epjes, regelbare pipetten van 2-20 µl , 20-200 µl en 100- 1000 μl, specifiek gelabeld “Mix” en “DNA”, rekjes voor epjes.

Toestellen Microcentrifuge, PCR workbench, thermocycler, vortexmixer Plaatcentrifuge

10 Werkwijze Alle stappen van de bevestiging worden uitgevoerd in lokaal 1.06. 10.1 Voorbereiding - algemeen -

Bewaar de koelblokken in de diepvriezer, open de PCR-workbench om hem op te starten, decontamineer de werktafel, de pipetten “Mix”, de vortex en de microcentrifuge, decontamineer het werkblad van de PCR workbench, de pipetten “DNA”, de vortex en de microcentrifuge, vul 2 bekers met verdund bleekwater (werktafel + workbench).

10.2 Voorbereiding – Bepalen verdunningen en mix

identificatie

en/of

kwantificatie,

plaatschema,

De aanwezigheid van genetische modificatie wordt bevestigd indien bij de screening van een monster voor de parameters p35S en/of tNos en/of EPSPS een Ct < 35 (= LOD 0,03%) teruggevonden wordt. Evalueer de Ct-verhoudingen van de merkers bij de screening: Ct p35S / Ct tNos en Ct p35S / Ct EPSPS en Ct tNos / Ct EPSPS.


GGO: BEVESTIGING Is er soja aanwezig in het monster en zijn deze verhoudingen allemaal ongeveer 1 (criterium: 0.95 – 1.05), dan betekent dit dat er enkel soja MON40-3-2 (=RRS) aanwezig is en dat er geen andere modificatie met één van deze merkers aanwezig is boven de LOD. Is er voor minstens 1 van deze 3 merkers geen signaal en/of is er geen soja aanwezig in het monster, dan moet de mogelijke aanwezigheid van andere events onderzocht worden. Is er voor de 3 merkers een signaal en is er soja aanwezig in het monster, maar voldoet minstens 1 van de verhoudingen niet aan het criterium, dan moet naast de aanwezigheid van MON40-3-2 ook die van andere events onderzocht worden. Zoek de in aanmerking komende events op in de lijst LAB 24 I-MET 038b L 001 Primers en probes bevestiging GGO. 10.2.1

Identificatie

Voer de identificatie uit op alle te analyseren events die in het monster aanwezig kunnen zijn. Is soja MON40-3-2 aanwezig en is het Ct-verschil tussen de merkers en soja (Ct merkers – Ct soja) kleiner dan 10,5 voer dan alleen een kwantificatie uit voor soja MON40-3-2 en geen identificatie (concentratie > 0,1%). Voor (ring)monsters wordt de identificatie uitgevoerd op 2 DNA-extracten van het GGOpositief gescreende monster en elk extract in duplo. Open de gewenste template in M:\Templates\GGO M:\QAM-EMAS-OHSAS\DOC-QSE\LAB 24 I-MET\I-MET 038 GGO en sla deze op onder de folder M:\Berekeningen\GGO\Resultaten als JJJJMMDD_Tq_identificatie_monsternummer(s).xlsx. Open de tab “Plaatschema” en vervolledig door de primer/probe combinatie van genomisch DNA en event, de CRM en de monsternummers met de bijbehorende nummers van de epjes in te vullen. Indien nodig extra monsters toevoegen of de eerste 3 kolommen kopiëren voor meerdere events. o Druk de plaatlayout af. o Vul naam en datum in. - Open de tab “DNAVerdunning” voor het berekenen van de verdunningen van de DNAextracten. Vul in: o de gewenste eindconcentratie in ng/µl (standaard: 10 ng/µl), o het benodigde volume (aantal te vullen wells met het monster x 5 µl/well + benodigd volume voor eventuele verdunningen + 5-10 µl om verliezen te compenseren); per volume een nieuwe tabel gebruiken, o de identificatie van de monsters / controles, (1 tabel per gewenst volume), o de overeenstemmende concentraties van de controles en monsters worden overgenomen van LAB 24 I-MET 038 F 003 GGO DNA Concentratie de werkbladen afkomstig van de spectrofotometer (INVAPP398, C:\Jasco Data\DNA concentratie\Werkblad\JJJJ\MM: DNA concentratie_datum.ufwd) en LAB 24 I-MET 038 L 001 Overzichtslijst CRM’s GGO. OPMERKING: indien de concentratie van het monster kleiner is dan 10 μg/ml, dan wordt het extract onverdund gebruikt en wordt “onverdund” ingevuld als concentratie. o In de tabel worden de volumes (μl) DNA-extract en water berekend die moeten gemengd worden om het gewenste volume met de gewenste concentratie te krijgen. o Druk dit blad af. -


GGO: BEVESTIGING

-

-

o Vul naam en datum in. Open de tab “TAQMAN” voor het berekenen van de volumes voor het aanmaken van de mix. o Vul het totaal aantal wells in (aantal te vullen wells met de mix + 1-2 om verliezen te compenseren). Per aantal een nieuwe tabel gebruiken en de primer/probe boven de tabel noteren. o In de tabellen worden de volumes (μl ) Fastmix UNG, forward en reverse primer, probe en water berekend voor elke benodigde primer/probe combinatie. o Druk dit blad af. Sla het rekenblad op.

10.2.2

Kwantificatie

Voer de kwantificatie uit op alle geïdentificeerde events (12.2) waarvan de concentratie > 0,1 % bedraagt en op monsters zonder voorafgaande identificatie indien soja MON40-3-2 aanwezig en het Ct-verschil tussen de merkers p35S, tNOS en EPSPS aanwezig (>LOD) zijn in een onderlinge verhouding (gelegen tussen 0.95 en 1.05) en soja (Ct merkers – Ct soja) kleiner is dan 10,5 (concentratie > 0,1 %). Voor (ring)monsters wordt de kwantificatie uitgevoerd op 2 DNA-extracten van het GGOpositief gescreende monster en elk extract in duplo. De criteria voor de identificatie van de GGO-positieve monsters zijn: concentratie > 0,1 %. Open de gewenste template in M:\Templates\GGO en sla deze op onder de folder M:\Berekeningen\GGO\Resultaten als JJJJMMDD_Tq_kwantificatie_monsternummer(s).xlsx. Open de tab “Plaatschema” en vervolledig door de primer/probe combinatie van genomisch DNA en event, de CRM’s van de ijklijn en de monsternummers met de bijbehorende nummers van de epjes in te vullen. Indien nodig extra monsters toevoegen. Niet gebruikte wells wissen. o Druk de plaatlayout af. o Vul naam en datum in. - Open de tab “DNAVerdunning” voor het berekenen van de verdunningen van de DNAextracten. Vul in: o de gewenste eindconcentratie in ng/µl (standaard: 10 ng/µl), o het benodigde volume (aantal te vullen wells met het monster x 5 µl/well + benodigd volume voor eventuele verdunningen + 5-10 µl om verliezen te compenseren); per volume een nieuwe tabel gebruiken, o de identificatie van de monsters / controles, (1 tabel per gewenst volume), o de overeenstemmende concentraties van de controles en monsters worden overgenomen van LAB 24 I-MET 038 F 003 GGO DNA Concentratie werkbladen afkomstig van de spectrofotometer (INVAPP398, C:\Jasco Data\DNA concentratie\Werkblad\JJJJ\MM: DNA concentratie_datum.ufwd) en LAB 24 IMET 038 L 001 Overzichtslijst CRM’s GGO. OPMERKING: indien de concentratie van het monster kleiner is dan 10 μg/ml, dan wordt het extract onverdund gebruikt en wordt “onverdund” ingevuld als concentratie. o In de tabel worden de volumes (μl) DNA-extract en water berekend die moeten gemengd worden om het gewenste volume met de gewenste concentratie te krijgen. -


GGO: BEVESTIGING

-

-

o Druk dit blad af. o Vul naam en datum in. Open de tab “TAQMAN” voor het berekenen van de volumes voor het aanmaken van de mix. o Vul het totaal aantal wells in (aantal te vullen wells met de mix +1-2 om verliezen te compenseren). Per aantal een nieuwe tabel gebruiken en de primer/probe boven de tabel noteren. o In de tabellen worden de volumes (μl ) Fastmix UNG, forward en reverse primer, probe en water berekend voor elke benodigde primer/probe combinatie. o Druk dit blad af. Sla het rekenblad op.

10.3 Uitvoering -

Verdunnen van het DNA-extract (uitvoeren op de voorziende tafel naast de PCRworkbench): o neem de nodige DNA-extracten (ook extractie- en/of maalblanco’s blanco’s en controles), o pipetteer in een epje van 1.5 ml volgens de tabel DNAVerdunning (10.2) de vereiste hoeveelheden DNAse/RNAsevrij steriel water en DNA-extract. Vortex en centrifugeer kort. (2x). Bewaar de verdunningen en de blanco’s in de koelblok frigo tot het pipetteren van de plaat en plaats de originele extracten terug in de diepvries.

-

Maken van de mix (uitvoeren in de PCR-workbench): o bepaal de totale hoeveelheid Fastmix UNG die nodig is op basis van de tabel SYBRGREEN Taqman en neem het vereiste aantal buisjes Fastmix UNG uit de diepvriezer. Laat ontdooien. o Neem voor elke primer (forward en reverse) en probe een epje (evt. reserve) uit de diepvriezer en laat ontdooien, o vul een epje met DNAse/RNAsevrij steriel water, o maak voor elke primer/probecombinatie een mix door de berekende volumes uit de tabel in een epje te pipetteren. Er worden dus evenveel mixen klaargemaakt als er primer/probe-combinaties zijn, o vortex en centrifugeer kort af. (2x). o Plaats de resten van de Fastmix UNG en de primers terug in de diepvriezer.

-

Verdelen van de mix over de microtiterplaat (uitvoeren in de PCR-workbench): o plaats de microtiterplaat, met well A1 linksboven, in de houder, o pipetteer voor elke primer/probe-combinatie 20 μl van de mix in de wells volgens het plaatschema.

-

Verdelen van de DNA-extracten / blanco’s over de microtiterplaat (uitvoeren op de tafel naast de PCR workbench): o pipetteer 5 μl (verdund) extract / blanco in de wells volgens het plaatschema.

-

Sluit de gebruikte kolommen van de plaat af met afdekstrips: o niet gebruikte kolommen mogen open blijven, o druk de strips goed aan met de aandrukplaat (rij per rij en kolom per kolom).


GGO: BEVESTIGING -

Centrifugeer de plaat gedurende 1 min. bij 4000 rpm in de plaatcentrifuge

-

Start de PC en de thermocycler op: o Wanneer de self-test van de thermocycler goed verlopen is, dubbelklikken op het ikoontje BioRad CFX Manager IDE: username: GGO, paswoord: niets invoeren, enter. o Plaats de plaat in de thermocycler en druk die vast met de aandrukrol, let op de oriëntatie: well A1 = linksboven. o View / Startup Wizard / OK of klik op het ikoontje “User-Defined Run Setup” o Klik op “User Defined” o Tab 1: Protocol: Express Load: GGO Protocol Taqman 02/ Select existing: M:\Berekeningen\GGO\protocols PCR GGO_ProtocolTaqMan_02.prcl/ next o Tab 2: Plate: Select existing: My Computer M Templates GGO TqCFX.pltd M:\Berekeningen\GGO\ protocols PCR Quick Plate_96 wells Tq.pltd/ next, o Tab 3: Start Run: indien protocol en plate OK: Start Run rechts onder en opslaan onder de folder M:\Berekeningen\GGO\Ruwe data in het mapje van de huidige maand; indien NOK, tab 1 en/of 2 eerst corrigeren.

-

Verwijder de bekers met afval (in de gele bak voor biologisch afval), decontamineer de werktafel, het werkblad van de PCR-workbench en de pipetten.

-

Sluit de PCR workbench.

10.4 Afwerking Na afloop van de analyse de plaat uit de thermocycler verwijderen en in een plastic zakje in de gele bak voor biologisch afval leggen.

EEN PLAAT NA PCR-ANALYSE NOOIT OPENEN ! 11 Kwaliteitscontrole 11.1 Identificatie Voor de kwaliteitscontrole worden per plaat de volgende controles meegenomen: - Positieve controles van het te bepalen event. Afhankelijk van het te bepalen event wordt de CRM gebruikt met de overeenkomstige genetische modificatie. - Blanco’s: DNAse/RNAsevrij steriel water. De criteria voor de controlemonsters zijn: - PC’s moeten positief zijn voor genomisch DNA en voor het event. - Blanco’s moeten negatief zijn voor genomisch DNA en voor het event. Indien aan een of meerdere van deze voorwaarden niet is voldaan, dan moet de oorzaak gezocht worden en kunnen bv. een of meer van de volgende acties ondernomen worden: - herhalen van de analyse, - herhalen van de analyse met een andere CRM als PC, - indien alle resultaten negatief zijn: probleem opsporen en oplossen.


GGO: BEVESTIGING

11.2 Kwantificatie Voor de kwaliteitscontrole worden per plaat de volgende controles meegenomen (zie plaatschema): - Positieve controles van het te kwantificeren event. Afhankelijk van het te kwantificeren event worden de CRM’s gebruikt met de overeenkomstige genetische modificatie voor het opstellen van de ijklijn. De criteria voor de controlemonsters zijn: - PC’s moeten positief zijn voor genomisch DNA en voor het event. Indien aan deze voorwaarde niet is voldaan, dan moet de oorzaak gezocht worden en kunnen bv. een of meer van de volgende acties ondernomen worden: - herhalen van de analyse, - herhalen van de analyse met een andere CRM als PC, - indien alle resultaten negatief zijn: probleem opsporen en oplossen.

12 Berekening en rapportering 12.1 Verloop De berekening van de resultaten omvat de volgende stappen: - bepalen van de Ct’s, - bij kwantificatie: opstellen van de kalibratierechte, - evalueren van de Ct’s (controles, kalibratie, blanco’s, monsters), - berekenen van het resultaat.

12.2 Uitvoering identificatie -

Open het rekenblad (10.2) en kopieer het plaatschema van “Plaatschema” naar “Evaluatie”.

-

Open de file met de ruwe data. o Linksboven worden de reactiecurves van alle wells getoond; ga na of het verloop van de curves de typische uitgerokken S-vorm vertoont. Zo niet dan kan dit wijzen op een probleem. o Vink het vakje ‘Log Scale’ aan. De grafiek wordt nu getoond met een logaritmische schaal voor de Y-as. De curves vertonen nu een lineair deel. o Horizontaal loopt er in de grafiek een lijn door het lineair deel van de curves; deze lijn bepaalt de threshold, de drempelwaarde die gebruikt wordt om het nummer van de cyclus te bepalen waar de curve die threshold overschrijdt. Deze lijn wordt vastgelegd door de software, maar kan eventueel manueel verschoven worden.


GGO: BEVESTIGING

-

o

Rechtsonder wordt een tabel getoond met als meest linkse kolom de identificatie van de well en de meest rechtse kolom de Ct-waarde, de cyclus (de X-waarde) waarbij de curve de threshold snijdt.

o

Linksonder staat de plaatlayout: van de blauwe wells is de Ct terug te vinden in de tabel ernaast. Klik in de linkerbovenhoek van de plaat (blauw wordt grijs) en selecteer kolom 1 (enter op 1 en grijs wordt blauw). Controleer de vorm van de curves en kopieer de Ct’s in kolom 1 van de plaatlayout ‘Overzicht alle resultaten Evaluatie’ op het rekenblad. Selecteer kolom 2 (enter op 1 en blauw wordt grijs en enter op 2 en grijs wordt blauw), controleer de vorm van de curves en kopieer de Ct’s in kolom 2 van het rekenblad. Herhaal dit voor alle gebruikte kolommen. Wijkt de vorm van de curve af, noteer dit dan in de kolom opmerkingen in het rekenblad.

o

Vergelijk de Ct waarden van de wells die negatief moeten zijn met die van de positieve controles. De positieve controles moeten een duidelijk lagere Ct hebben dan de negatieve wells. Het Ct-verschil tussen CRM 0,1% en CRM 0,03% bedraagt theoretisch 1,6.

o

Bereken in het werkblad het verschil Ct event - Ct genomisch voor alle CRM’s en monsters.

Beoordeel de resultaten: o indien bij een monster voor een event geen typisch uitgerokken S-vorm aangetroffen wordt in de curves, dan is het resultaat ‘Event X afwezig’. o Indien bij een monster het verschil Ct event - Ct genomisch groter is dan het verschil van de CRM 0,03%, dan is het resultaat ‘Event X aanwezig, maar < LOD’. o Indien bij een monster het verschil Ct event - Ct genomisch ligt tussen de verschillen van de CRM 0,03% en de CRM 0,1%, dan is het resultaat ‘Event X aanwezig, maar < LOQ’. o Indien bij een monster het verschil Ct event - Ct genomisch kleiner is dan het verschil van de CRM 0,1%, dan is het resultaat ‘Event X aanwezig’ en dan moet er kwantificatie uitgevoerd worden.

12.3 Rapportering identificatie Vul de resultaten in de LIMS in als ‘aangetoond’ of ‘niet aangetoond’, aangevuld met een eventuele opmerking. Op het beproevingsverslag komen de volgende vermeldingen: - indien ‘niet aangetoond’ ingevuld wordt: ‘de aanwezigheid is niet aangetoond in concentraties boven LOD’, - indien ‘aangetoond’ ingevuld wordt: ‘de aanwezigheid is aangetoond in concentratie boven LOD’, - eventuele opmerkingen. Praktisch: - aangetoond boven referentie LOD en boven LOQ: ‘aangetoond’: kwantificatie (10.2.2) nodig,


GGO: BEVESTIGING -

aangetoond boven referentie LOD en onder LOQ: ‘aangetoond’ en opmerking ‘parameter gedetecteerd in concentraties < LOQ’, aangetoond onder referentie LOD: ‘niet aangetoond’ en opmerking ‘parameter gedetecteerd in concentraties < LOD’, niet aangetoond: ‘niet aangetoond’.

12.4 Uitvoering kwantificatie

-

Open het rekenblad (10.2) en kopieer het plaatschema van “Plaatschema” naar “Evaluatie”.

-

Open de file met de ruwe data. o Linksboven worden de reactiecurves van alle wells getoond; ga na of het verloop van de curves de typische uitgerokken S-vorm vertoont. Zo niet dan kan dit wijzen op een probleem. o Vink het vakje ‘Log Scale’ aan. De grafiek wordt nu getoond met een logaritmische schaal voor de Y-as. De curves vertonen nu een lineair deel. o Horizontaal loopt er in de grafiek een lijn door het lineair deel van de curves; deze lijn bepaalt de threshold, de drempelwaarde die gebruikt wordt om het nummer van de cyclus te bepalen waar de curve die threshold overschrijdt. Deze lijn wordt vastgelegd door de software, maar kan eventueel manueel verschoven worden. o

Rechtsonder wordt een tabel getoond met als meest linkse kolom de identificatie van de well en de meest rechtse kolom de Ct-waarde, de cyclus (de X-waarde) waarbij de curve de threshold snijdt.

o

Linksonder staat de plaatlayout: van de blauwe wells is de Ct terug te vinden in de tabel ernaast. Klik in de linkerbovenhoek van de plaat (blauw wordt grijs) en selecteer kolom 1 (enter op 1 en grijs wordt blauw). Controleer de vorm van de curves en kopieer de Ct’s in kolom 1 van de plaatlayout ‘Overzicht alle resultaten Evaluatie’ op het rekenblad. Selecteer kolom 2 (enter op 1 en blauw wordt grijs en enter op 2 en grijs wordt blauw), controleer de vorm van de curves en kopieer de Ct’s in kolom 2 van het rekenblad. Herhaal dit voor alle gebruikte kolommen. Wijkt de vorm van de curve af, noteer dit dan in de kolom opmerkingen in het rekenblad.

o

Vergelijk de Ct-waarden voor genomisch DNA van de CRM’s; deze moeten dicht bij elkaar liggen.

o

Voor de bepaling van het gehalte event in het monster als fractie van het taxon (soja, maïs):  in het rekenblad worden voor de kalibratie met de CRM’s de Ct verschillen (Ct event – Ct genomisch) berekend evenals de 2log van de concentratie. Uit deze twee reeksen waarden wordt de regressierechte 2 berekend met helling a, snijpunt b en determinatiecoëfficiënt r . 2  beoordeel de berekende waarden voor a en r :  a moet vallen in het interval 0,9 – 1,1 2  r moet > 0,98.


GGO: BEVESTIGING  

indien de kalibratierechte niet voldoet aan deze eisen, moet de analyse herhaald worden. in het rekenblad wordt het Ct-verschil van het monster berekend. Uit de ijklijn wordt het corresponderend gehalte (% m/m) van de event op taxonbasis berekend.

12.5 Rapportering kwantificatie Vul de resultaten in de LIMS in. Wanneer het teruggevonden percentage tussen de gehaltes van de kleinste en de grootste CRM van de ijklijn valt wordt het gehalte event in % ingevoerd. Is het percentage lager dan het gehalte van de kleinste CRM dan wordt ‘< LOQ’ ingevoerd. Is het percentage hoger dan het gehalte van de grootste CRM dan wordt ‘> “% van de hoogste CRM”’ ingevoerd.

13 Verwijzing naar bijhorende procedure, instructies, documenten, formulieren of lijsten 13.1 Procedures/Instructies LAB 24 P 005 I 011 PCR Algemene instructies voor uitvoering LAB 24 I-MET 038a GGO: screening

13.2 Formulieren LAB 24 I-MET 038 F 003 DNA concentratie LAB 24 I-MET 038 F 005 Werklijst GGO Templates identificatie onder M:\Templates\GGO M:\QAM-EMAS-OHSAS\DOC-QSE\LAB 24 I-MET\I-MET 038 GGO\ Templates kwantificatie onder M:\Templates\GGO M:\QAM-EMAS-OHSAS\DOC-QSE\LAB 24 I-MET\I-MET 038 GGO\

13.3 Lijsten LAB 24 I-MET 038b L 001 Primers en probes bevestiging GGO LAB 24 I-MET 038 L 001 Overzichtslijst CRM’s GGO


GGO: BEVESTIGING. Versie 04 Datum van toepassing

Recommend Documents