Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen Bestuur Laboratoria
MET-FLVVG-176
BEPALING VAN ANTIBIOTICA MET LC-MS
Versie
06
Datum van toepassing
2014-06-23
Opgesteld door :
Tanja De Bruyn, medewerkers R&C
Nazicht door :
Inge Heymans; medewerker R&C; 2014-06-23
Goedkeuring vrijgave door :
Ingrid Vermeulen; Sectieverantwoordelijke R&C; 2014-06-23
Beheer & locatie geldende versie :
Kwaliteit FLVVG; Lokale server FLVVG
Bestemmelingen :
Medewerkers R&C: alle
Trefwoorden :
ANT, LC-MS
LAB 22 I-MET 176 v.06 1/21
BEPALING VAN ANTIBIOTICA MET LC-MS
Overzicht herziening van het document
Herziening door/datum* TDB-NDPIH/12-03-09 TDB/28-1009 TDB/201212-04 TDB/201307-19
TDB/201406-19
Reden van herziening
Tekstdeel / draagwijdte van de herziening
Versie 1 - Aanpassing standaardmengsel antibiotica - Wijziging indampprocedure - Wijziging lay-out chromatogram Wijziging loopmiddel LC-MS en druk LC-kolom Af te wegen hoeveelheid Nieuwe extractiemethode en meting met HRMS.
Wijziging M209
8.1.1. 10.1.2. + bijlagen 8.3 en 10.2 10 Volledige tekst. Markering van wijzigingen weggelaten omwille van de omvang van de wijzigingen. 8.1. + 10.1.1.2
* Het verschil tussen de datum van toepassing en de huidige datum mag niet meer dan 5 jaar bedragen. Wijzigingen ten opzichte van de vorige versie worden gemarkeerd in rood. Indien omwille van de omvang van de wijzigingen, de tekst door gebruik van markeringen niet meer leesbaar wordt, wordt de markering van wijzigingen weggelaten in de nieuwe versie. Dit wordt vermeld in de historiek van het document.
LAB 22 I-MET 176 v.06 2/21
BEPALING VAN ANTIBIOTICA MET LC-MS INHOUDSTABEL 1
DOEL .................................................................................................................................. 4
2
TOEPASSINGSGEBIED .................................................................................................... 4
3
WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN........................................................... 4
4
DEFINITIES EN AFKORTINGEN ...................................................................................... 4
5
PRINCIPE........................................................................................................................... 5
6
PRESTATIEKENMERKEN ................................................................................................ 5
7
VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN .......................... 5
8
9
7.1
ALGEMENE VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN ..................................................................... 5
7.2
ALGEMENE VOORZORGSMAATREGELEN ....................................................................... 5
7.3
SPECIFIEKE VOORZORGSMAATREGELEN ...................................................................... 5
REAGENTIA EN HULPSTOFFEN..................................................................................... 6 8.1
STANDAARDOPLOSSINGEN (ZIE LAB 22 P 013) ............................................................ 6
8.2
REAGENTIA EN SOLVENTEN ......................................................................................... 6
8.3
OPLOSSINGEN ............................................................................................................ 7
8.4
GLASWERK................................................................................................................. 8
8.5
KLEIN MATERIAAL ....................................................................................................... 8
TOESTELLEN .................................................................................................................... 9
10 WERKWIJZE...................................................................................................................... 9 10.1
EXTRACTIE EN OPZUIVERING ....................................................................................... 9
10.2
LC-MS ANALYSE...................................................................................................... 11
11 KWALITEITSCONTROLE ............................................................................................... 12 11.1
CRITERIA ANALYSESERIE........................................................................................... 12
12 BEREKENING EN RAPPORTERING ............................................................................. 13 12.1
MONSTERS DIE OPNIEUW MOETEN WORDEN OPGEZET ................................................ 13
12.2
INTERPRETATIE RESULTATEN..................................................................................... 14
12.3
RAPPORTERING EN INSCHRIJVING .............................................................................. 14
13 VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURES, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN, FORMULIEREN OF LIJSTEN. ............................................................................................... 15 13.1
BIJLAGEN ................................................................................................................. 15
13.2
PROCEDURES........................................................................................................... 15
13.3
INSTRUCTIES ............................................................................................................ 15
13.4
FORMULIEREN, LIJSTEN EN DOCUMENTEN .................................................................. 15
LAB 22 I-MET 176 v.06 3/21
BEPALING VAN ANTIBIOTICA MET LC-MS
1
Doel
Deze methode beschrijft de extractie-, opzuiverings- en analyseprocedure voor de screening van antibiotica in vlees met behulp van LC-MS detectie.
2
Toepassingsgebied
Met deze LC-MS methode kunnen antibiotica aangetoond worden in vlees op de niveaus zoals weergegeven in LAB 22 I-MET 176 L003. De onderzochte antibiotica behoren tot de families: betalactams (penicillines en cephalosporines), tetracyclines, macroliden, lincosamiden, quinolones, sulfonamiden, amphenicolen, pleuromutilinen, polypeptiden en aminoglycosiden.
3
Wettelijke en normatieve documenten.
Volgende wetgeving is van toepassing voor geneesmiddelenresiduen in dierlijke producten: -
Richtlijn 96/23/EC van 29 april 1996
-
EU Verordening 37/2010 van 22 december 2010 (over MRL-waarden)
De EU bepaalt in deze wetgeving een toegelaten MRL-waarde (maximum residu gehalte), afhankelijk van het soort dier en het soort weefsel.
4
Definities en afkortingen
LC-MS
Liquid Chromatography Mass Spectrometry
MeOH
Methanol
g
Gravitatiekracht / g-kracht
H2O
Water
EtOH
Ethanol
ACN
Acetonitrille
TCA
Trichloorazijnzuur
IS
Inwendige Standaard
HPLC
High Performance Liquid Chromatography
SPE
Solid Phase Extraction
FA
Formic Acid
HFBA
Heptafluorobutyric Acid
PP
Polypropyleen
LAB 22 I-MET 176 v.06 4/21
BEPALING VAN ANTIBIOTICA MET LC-MS 5
Principe
De methode omvat volgende stappen: - bereiding labomonster door malen en homogeniseren - extractie en opzuivering - SPE: een deel van het extract op Strata X kolom - SPE: een ander deel van het extract op Strata X-CW kolom - detectie en identificatie met LC-HRMS
6
Prestatiekenmerken
De methode werd gevalideerd volgens EG-beschikking 2002/657/EG. Het validatieschema en de bekomen prestatiekenmerken zijn terug te vinden in Vmap 176.
7
Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen
7.1
Algemene veiligheidsvoorschriften
Zie Instructie “Instructies voor het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBMs)” LAB 22 I 017
7.2
Algemene voorzorgsmaatregelen
-
Om contaminatie tegen te gaan wordt voor elk monster schone hulpmiddelen gebruikt. Onder schone hulpmiddelen wordt verstaan: hulpmiddelen die niet eerder gebruikt zijn of die in een wasmachine of op een andere manier grondig zijn gereinigd.
-
Plaats de standaarden en oplossingen zo spoedig mogelijk na gebruik terug op de voorziene plaats.
-
7.3
De extractie met organische solventen dient bij voorkeur te gebeuren in een trekkast.
Specifieke voorzorgsmaatregelen
Verschillende antibiotica zijn lichtgevoelig. -
tijdens het schudden: de recipiënten bedekken met een doek
-
bij indampen in turbovap: de glazen plaat afdekken
-
GEEN GLAS gebruiken, altijd plastiek recipiënten/proefbuizen/vials/epjes
LAB 22 I-MET 176 v.06 5/21
BEPALING VAN ANTIBIOTICA MET LC-MS 8
Reagentia en hulpstoffen
Verwijzingen naar een product en/of fabrikant dienen enkel ter informatie en identificatie en houden geen uitsluiting in van andere producten en/of fabrikanten die mogelijk ook voldoen. Deze verwijzingen dienen om vergissingen te vermijden en het uitvoeren van bestellingen te vereenvoudigen. De in de procedure vermelde reagentia en apparatuur kunnen aldus door materiaal vervangen worden van minstens evenwaardige kwaliteit. De houdbaarheid van zelfbereide oplossingen is 1 jaar bij kamertemperatuur, behalve indien anders vermeld. De geschiktheid van gebruikte oplossingen, buffers en standaardoplossingen wordt nagegaan aan de hand van ingebouwde borgingspunten en langetermijnvalidatie. Indien hieraan voldaan wordt, wijst dit op de aanvaardbaarheid van deze reagentia en toont dit eveneens aan dat de kwaliteit van de analyse gewaarborgd blijft. Met ged. water wordt bedoeld: gedemineraliseerd water of water gereinigd over een aquadem-installatie. 8.1 8.1.1.
Standaardoplossingen (zie LAB 22 P 013) M209: standaardmengsel antibiotica (7,5 20 - 200 ng/µl in ACN) Deze M-oplossing wordt bewaard in de diepvriezer –85°C in donkere epjes die slechts één maal gebruikt worden.
8.1.2.
Werkoplossing ANT (0,6 – 16 ng/µl) (0,8 – 8 ng/µl): 20 10 µl M209 (8.1.1.) + 240 230 µl H2O (8.2.2.) Steeds vers aanmaken.
8.1.3.
M210: IS-mengsel antibiotica (25 ng / µl in ACN); Deze M-oplossing wordt bewaard in de diepvriezer –85°C in donkere epjes die slechts één maal gebruikt worden.
8.2
Reagentia en solventen
8.2.1.
LC-MS methanol (01-0369-00578)
8.2.2.
LC-MS water (01-0700-01145)
8.2.3.
ACN (acetonitrille) (01-0046-00079)
8.2.4.
TCA (trichloorazijnzuur) (01-0026-00033)
8.2.5.
Ammoniak (NH4OH) 25 % (01-0062-00107)
8.2.6.
ACN voor LC-MS (01-0046-00077)
8.2.7.
Mierenzuur (Formic Acid, FA) voor LC-MS (01-0260-05712)
8.2.8.
Heptafluorobutyric Acid (HFBA) (01-0825-06340) (Frigo: 4 °C ± 4 °C)
8.2.9.
Citroenzuur monohydraat (01-0156-00230)
8.2.10. Dinatriumwaterstoffosfaat (Na2HPO4.2H2O) (01-0209-00310)
LAB 22 I-MET 176 v.06 6/21
BEPALING VAN ANTIBIOTICA MET LC-MS 8.3
Oplossingen
8.3.1
Mcllvaine-oplossing Antibiotica (bewaren in frigo! (4 °C ± 4 °C))
-
breng + 360 ml citroenzuuroplossing 0,1 M (8.3.7.) in een grote beker (8.4.2.)
-
voeg + 630 ml fosfaatbuffer 0,2 M (8.3.8.) toe
-
meet de pH (9.8) en breng op pH 6 met fosfaatbuffer 0,2 M (8.3.8.) of citroenzuuroplossing 0,1M (8.3.7)
8.3.2
voeg 10 ml ACN voor LC-MS (8.2.6.) toe Ammoniak (NH4OH) 2 M
-
breng 150 ml ammoniak oplossing 25% (8.2.5.) in een maatkolf van 1000 ml (8.4.1.)
-
leng aan tot de ijkstreep met LC-MS water (8.2.2.) en homogeniseer
8.3.3
Loopmiddel Antibiotica screening Oplossing 1:
-
breng 2 ml mierenzuur (8.2.7.) in een maatkolf van 2000 ml (8.4.1.)
-
voeg 523 µl HFBA (8.2.8.) toe
-
leng aan met LC-MS water (8.2.2.) tot 2000 ml en homogeniseer Vervolgens:
-
weeg 78,1 g (+ 0,1g) ACN (8.2.6.) af in een grote beker (8.4.2.)
-
voeg hierbij 1900 g van oplossing 1 toe en homogeniseer
8.3.4
1% TCA in water
-
weeg 10 g TCA (8.2.4.) af in een beker (8.4.2)
-
voeg ongeveer 800 ml water voor LC-MS (8.2.2.) toe en homogeniseer breng over in een maatkolf van 1000 ml (8.4.1.) leng aan tot de ijkstreep met LC-MS water (8.2.2.) en homogeniseer
8.3.5 -
0,01 % FA (mierenzuur) breng 10 µl mierenzuur (8.2.7.) in een maatkolf van 100 ml (8.4.1.) en leng aan tot de ijkstreep met LC-MS water (8.2.2.) en homogeniseer
8.3.6
0,3M HFBA
-
breng 3,9 ml HFBA (8.2.8.) in een maatkolf van 100 ml (8.4.1.)
-
leng aan met LC-MS water (8.2.2.) tot 100 ml en homogeniseer
8.3.7
Citroenzuuroplossing 0,1 M (Bewaren in frigo! (4 °C ± 4 °C))
LAB 22 I-MET 176 v.06 7/21
BEPALING VAN ANTIBIOTICA MET LC-MS -
los 21,0 g (+ 0,1 g) citroenzuur (8.2.9.) op in LC-MS water (8.2.2.)
-
breng over in een maatkolf van 1000 ml (8.4.1.) en leng aan tot de ijkstreep en homogeniseer
8.3.8
Fosfaatbuffer 0,2 M
-
los 35,6 g (+ 0,1 g) Na2HPO4.2 H2O (8.2.10.) op in LC-MS water (8.2.2.)
-
breng over in een maatkolf van 1000 ml (8.4.1.) en leng aan tot de ijkstreep en homogeniseer
8.3.9
Spoelmiddel 1: 0,1% FA in H2O/ACN (95/5)
-
breng 950 ml water LC-MS (8.2.2.) in een grote beker (8.4.2.)
-
voeg 50 ml ACN voor LC-MS (8.2.6.) toe
-
voeg 1 ml mierenzuur (8.2.7.) toe en homogeniseer
8.3.10 Spoelmiddel 2: 0,1% FA in H2O/ACN (5/95) -
breng 50 ml water LC-MS (8.2.2.) in een grote beker (8.4.2.)
-
voeg 950 ml ACN voor LC-MS (8.2.6.) toe
-
voeg 1 ml mierenzuur (8.2.7.) toe en homogeniseer
8.4
Glaswerk
8.4.1.
Maatkolf
8.4.2.
Beker
8.5
Klein materiaal
8.5.1.
Micropipetten met eurotips
8.5.2.
Multipette systeem met combitips
8.5.3.
Lange pipettips (02-0065-01416)
8.5.4.
Centrifugeerbuizen 50 ml (02-0009-01200)
8.5.5.
PP microvial voor LC-MS (02-0040-01328) met schroefdop en septum (02-000701189 tot -01194)
8.5.6.
Plastiek proefbuis van 10 ml (02-0063-01400)
8.5.7.
LC-kolom: Waters Acquity CSH C18 1,7µm; 2,1 x 150 mm (02-0011-06152)
8.5.8.
Prekolom: Waters CSH C18 1,7 µm (02-0011-06287)
8.5.9.
Centrifugeerbuisje van 2 ml (02-0051-01373)
LAB 22 I-MET 176 v.06 8/21
BEPALING VAN ANTIBIOTICA MET LC-MS 9
Toestellen
9.1.
Bovenweger
9.2.
Vortex
9.3.
Centrifuge
9.4.
Indampsysteem: turbovap
9.5.
Schudtoestel
9.6.
LC-HRMS
9.7.
Ultracentrifuge
9.8.
pH-meter
10 Werkwijze 10.1 Extractie en opzuivering 10.1.1 Voorbereiding monsters en controlemonsters Alle monsters worden ingeschreven op het werkblad “Inschrijvingsblad” LAB 22 F 022. Malen en afwegen van de monsters: zie instructie ‘‘Monstervoorbereiding voor de sectie R&C’’ LAB 22 I 011. 10.1.1.1 Monsters Weeg 2 g gemalen vlees af in een centrifugeerbuis van 50 ml (8.5.4.) op de bovenweger (9.1). 10.1.1.2 Controlemonsters Weeg 2 g gemalen vlees af in een centrifugeerbuis van 50 ml (8.5.4.) op de bovenweger (9.1). Per reeks wordt minstens 1 belast monster meegenomen. De belasting gebeurt door het toevoegen van 50 µl werkoplossing ANT (8.1.2.). Nadien wordt deze werkoplossing doorgegeven aan LC-MS. In dit standaardmengsel (8.1.1.) bevinden zich van de belangrijkste groepen van antibiotica telkens minstens één analyt op MRL-niveau (zie onderstaande tabel).
Groep Penicillines
Macroliden
Analyt
MRL (µg/kg)
Belastingsniveau (µg/kg)
Ampicilline
50
50
Amoxicilline
50
100
Nafcilline
300
150
Spiramycine
200
200
Erythromycine
200
400
Tylosine
100
200
Tylosine-3-acetaat
50
100
LAB 22 I-MET 176 v.06 9/21
BEPALING VAN ANTIBIOTICA MET LC-MS Tetracyclines
Doxycycline
100
100
Quinolonen
Norfloxacine
100
100
Sulfonamiden
Sulfapyridine
100
20
Dapsone
Dapsone
/
15
Aminoglycosiden
Gentamycine
50
50
Amphenicolen
Thiamphenicol
50
50
Lincosamiden
Lincomycine
100
100
Polypeptiden
Bacitracine
150
150
10.1.1.3 Blanco monsters Weeg 2 g gemalen vlees af in een centrifugeerbuis van 50 ml (8.5.4.) op de bovenweger (9.1). Bij het uitvoeren van een screening wordt per reeks minimum 1 blanco monster meegenomen. 10.1.1.4 Monsters, controlemonsters en blanco monsters Aan alle analysemonsters (monsters, controlemonsters en blanco monsters) wordt 20 µl ISmengsel M210 (25 ng / µl in ACN) (8.1.3.) toegevoegd. Nadien wordt het restant van M210 doorgegeven aan LC-MS. 10.1.2 Extractie en opzuivering - 10 minuten in donker laten staan - 5 ml 1% TCA oplossing (8.3.4.) toevoegen - 30 minuten schudden (9.5) - 750 µl ammoniakoplossing 2M (8.3.2.) toevoegen - 1000 µl Mcllvaine oplossing Antibiotica (bewaren in frigo!) (8.3.1.) toevoegen - vortexen (9.2) - 2 minuten centrifugeren bij 12000xg (9.3) - 2 ml overnemen in centrifugeerbuisje van 2 ml (8.5.9.) - 15 minuten centrifugeren bij 12500xg (9.7) - 1,2 ml overnemen in plastiek proefbuis (10 ml) (8.5.6.) - SPE-opzuivering (zie 10.1.3. en LAB 22 I-MET 166) - beide bekomen fracties indampen in turbovap (9.4) bij max. 50°C tot net droog - fractie 1 (ANT) (afkomstig van Strata X kolom) heroplossen in 200 µl 0,01 % FA (8.3.5.) en overnemen in microvial voor LC-MS (8.5.5.) - fractie 2 (AG) (afkomstig van Strata X-CW kolom) heroplossen in 200 µl 0,3M HFBA (8.3.6.) en overnemen in microvial voor LC-MS (8.5.5.) 10.1.3 SPE-opzuivering Een deel van het bekomen extract (0,5 ml) wordt opgebracht op een Strata X-CW kolom (fractie 2; AG) voor de meting van de aminoglycosiden en lincomycine; en een ander deel (0,5 ml) op
LAB 22 I-MET 176 v.06 10/21
BEPALING VAN ANTIBIOTICA MET LC-MS een Strata X kolom (fractie 1; ANT) voor de meting van de overige antibiotica. De te volgen procedure wordt beschreven in LAB 22 I-MET 166.
10.2 LC-MS Analyse Deze analyse wordt uitgevoerd op een LC-HRMS toestel. 10.2.1 Bereiding van LC-MS standaarden + LC-MS Solvent St ANT: 50 µl werkoplossing ANT (8.1.2.) + 20 µl M210 (8.1.3.) + 230 µl 0,01% FA (8.3.5.) St AG: 50 µl werkoplossing ANT (8.1.2.) + 20 µl M210 (8.1.3.) + 230 µl 0,3M HFBA (8.3.6.) Solv ANT: 20 µl M210 (8.1.3.) + 280 µl 0,01% FA (8.3.5.) Solv AG: 20 µl M210 (8.1.3.) + 280 µl 0,3M HFBA (8.3.6.) 10.2.2 Instellingen LC-parameters •
Kolom HPLC: Waters Acquity CSH C18 1,7µm; 2,1 x 150 mm (8.5.7.) met prekolom (8.5.8.)
•
Solventen: ACN voor LC-MS (8.2.6.) Loopmiddel Antibiotica screening (8.3.3.) Spoelmiddel 1 (8.3.9.) Spoelmiddel 2 (8.3.10.) LC-MS Methanol (8.2.1.)
•
Kolomtemperatuur: 50 °C
•
Injectievolume: 20 µl voor de meting van aminoglycosiden en lincomycine en 40 µl voor de analyse van de overige antibiotica.
HPLC set-up: •
Voor de aminoglycosiden en lincomycine: zie methode C:\Xcalibur:\methods:\ESI_ AG
•
Voor de overige antibiotica: zie methode C:\Xcalibur:\methods:\ESI_ANT
Opmerking: Altijd eerst de monsters met methode ESI_ANT starten (omdat deze analyten sneller afbreken) en pas daarna de monsters met methode ESI_AG.
10.2.3 Instellingen MS-parameters De analyse gebeurt in de ESI-mode. Acquisitie gebeurt in full scan HRMS in de positieve mode met de methode vermeld in 10.2.2. De instellingen voor de ESI en de acquisitie alsook de te meten exacte massa’s van de analyten zijn vermeld in de Tracefinder methodes ANT en AG.
LAB 22 I-MET 176 v.06 11/21
BEPALING VAN ANTIBIOTICA MET LC-MS
10.2.4 Criteria analysesysteem Controleer vóór elke reeks de massacalibratie van het toestel. Vóór elke bepaling moet gecontroleerd worden of het systeem in orde is a.d.h.v. de begeleidende controlelijst “Kwaliteitsborging MS” (LAB 22 F 027) welke dient ingevuld te worden. De druk van de UHPLC moet gecontroleerd worden om het risico van stilvallen van het systeem te vermijden. Een richtwaarde voor de maximum begindruk voor deze analyse is 900 bar. Een hogere druk wijst waarschijnlijk op verstopping van de prekolom of kolom, deze kan dan eventueel vervangen worden. Injecteer bovenstaand standaardmengsel (10.2.1) en controleer de geschiktheid van het systeem voor analyse aan de hand van het document criteria voor LC-MS (zie log LC-MS). Het chromatogram van de standaard die vooraf werd geïnjecteerd, wordt aan de checklist bevestigd. Voor de goedkeuring van het systeem voor gebruik worden de initialen genoteerd op de begeleidende controlelijst “Kwaliteitsborging MS” (LAB 22 F 027).
10.2.5 Analysevolgorde De analysevolgorde wordt afgedrukt via een ‘batch report’. Elke run start met injectie van tenminste 1 maal de standaard alvorens de monsters te analyseren. Na injectie van de standaard volgt steeds injectie van solvent om contaminatie vanuit het standaardmengsel te voorkomen en te controleren of er geen overdracht is in het systeem. Blanco monsters worden in het begin van de reeks geanalyseerd en belaste monsters worden op het einde van de reeks geanalyseerd. Als eerste worden de monsters met methode ESI_ANT gestart (omdat deze analyten sneller afbreken) en pas daarna de monsters met methode ESI_AG. Na een analysereeks wordt solvent geïnjecteerd met de methode “ESI_STOP” waarbij alle flows geminimaliseerd worden.
11 Kwaliteitscontrole 11.1 Criteria analyseserie
11.1.1 Solvent
LAB 22 I-MET 176 v.06 12/21
BEPALING VAN ANTIBIOTICA MET LC-MS Bij injecties van solvent moeten de analyt(en) afwezig zijn. 11.1.2 Blanco monsters De intensiteit van de inwendige standaard lomefloxacine voor de methode ESI_ANT en tobramycine voor de methode ESI_AG moet minstens op de helft aanwezig zijn van de intensiteit van de inwendige standaard in het belast controlemonster. De opgespoorde analyt(en) moeten afwezig zijn. 11.1.3 Controlemonsters In belaste controlemonsters moeten de belaste analyt(en) teruggevonden worden. De resultaten worden bijgehouden in controlekaarten, terug te vinden onder M:\R&C\Controlekaarten\LC-MS. 11.1.4 Monsters In de monsters moet de inwendige standaard lomefloxacine voor de methode ESI_ANT en tobramycine voor de methode ESI_AG teruggevonden worden op minstens de helft van het niveau in het belaste controlemonster, om na te gaan of het monster goed geanalyseerd werd. 11.1.5 Criteria voor goedkeuring gehele serie Aan de hand van de vastgestelde criteria 11.1.1. t.e.m. 11.1.4. besluit de analist, zonodig in overleg, of de serie goedgekeurd wordt en parafeert hiervoor op de controlelijst (LAB 22 F 027). Indien de borgingspunten van de serie niet voldaan zijn, moet nagegaan worden wat de oorzaak is en welke maatregelen getroffen moeten worden. Deze worden vermeld op de controlelijst (LAB 22 F 027). Afkeuring van de gehele serie houdt automatisch in dat de gehele serie opnieuw moet worden opgewerkt. Daarnaast kan, ondanks dat b.v. een monster niet goedgekeurd wordt, de serie als zodanig wel goedgekeurd worden. In dat geval worden enkel de afgekeurde monsters opnieuw opgezet.
12 Berekening en rapportering 12.1 Monsters die opnieuw moeten worden opgezet Monsters waarvan de borgingscriteria niet voldaan zijn en opnieuw moeten worden opgezet, worden vermeld op de controlelijst “Kwaliteitsborging MS” (LAB 22 F 027) en genoteerd voor heranalyse op het “Inschrijvingsblad” (LAB 22 F 022)
LAB 22 I-MET 176 v.06 13/21
BEPALING VAN ANTIBIOTICA MET LC-MS
12.2 Interpretatie resultaten De resultaten moeten verwerkt worden met het softwarepakket Tracefinder. Voor de aminoglycosiden en lincomycine moet Tracefinder methode ‘AG’ gebruikt worden, voor de overige antibiotica Tracefinder methode ‘ANT’. De te gebruiken calibratiefiles zijn terug te vinden in LAB 22 I-MET 176 L006 en op het toestel onder: •
C:\TracefinderData\Projects\St AG\Calibratie AG\Data\Calibratie AG.raw
•
C:\TracefinderData\Projects\St ANT\Calibratie ANT\Data\Calibratie ANT.raw
De berekening van het gehalte van een analyt in een monster is zo opgebouwd dat het resultaat het “aantal keer cut-off” is. Een waarde van “1” betekent dat de relatieve intensiteit van een analyt even groot is als de cut-off. Een monster wordt beoordeeld als “conform” als het relatief signaal van de analyt (piekoppervlakte van de analyt / piekoppervlakte inwendige standaard) kleiner is dan de cutoff waarde van het overeenkomstig analyt. Waarden kleiner dan de cut-off krijgen op het rapport een ‘calculated concentration’ < 1 of worden niet gerapporteerd indien te klein. Een monster wordt beoordeeld als “verdacht” als het relatief signaal van de analyt (piekoppervlakte van de analyt / piekoppervlakte inwendige standaard) groter is dan of gelijk is aan de cut-off waarde van het overeenkomstig analyt. Waarden groter dan of gelijk aan de cut-off krijgen op het rapport een ‘calculated concentration’ ≥ 1. De chromatogrammen kunnen steeds geïnterpreteerd worden via Tracefinder en XCalibur. De reële cut-off waarden voor ieder analyt zijn terug te vinden in LAB 22 I-MET 176 L005. Indien lincomycine als verdacht wordt gerapporteerd, moet a.d.h.v. het belaste monster geëvalueerd worden of het over lincomycine gaat of de mogelijke stoorpiek. Indien één of meerdere sulfonamiden gerapporteerd worden moet voor het monster de berekening gemaakt worden voor het maximale gehalte aan sulfonamiden via template ‘maximaal gehalte sulfa’s’, te vinden onder: M:\R&C\LC-MS\ANT met LC-MS\Maximaal gehalte sulfa's . Een monster is verdacht als het maximale gehalte aan sulfonamiden ≥ 100 µg/kg.
12.3
Rapportering en inschrijving
Zie procedure “Monsterbeheer” ( LAB 22 P 007)
LAB 22 I-MET 176 v.06 14/21
BEPALING VAN ANTIBIOTICA MET LC-MS 13 Verwijzing naar bijhorende procedures, instructies, documenten, formulieren of lijsten. 13.1 Bijlagen LAB 22 I-MET 176 D001: Flow-chart: “Bepaling van antibiotica in vlees met LC-MS” n
LAB 22 I-MET 176 D002: Voorbeeld LC-MS chromatogram 13.2 Procedures LAB 22 P 007: “Monsterbeheer” LAB 22 P 013: “Aanmaak en beheer van standaarden” 13.3 Instructies LAB 22 I 017: “Instructies voor het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBMs)” LAB 22 I 011: Instructie ‘‘Monstervoorbereiding voor de sectie R&C’’ LAB 22 I-MET 166: SPE procedures – automatische monstervoorbereiding 13.4 Formulieren, lijsten en documenten LAB 22 I-MET 176 L003: Overzicht onderzochte antibiotica en hun MRL-waarden. LAB 22 I-MET 176 L005: Antibiotica met LC-MS: cut-off waarden. LAB 22 I-MET 176 L006: Calibratiefiles LAB 22 F 027: Controlelijst ‘‘Kwaliteitsborging MS’’ LAB 22 F 022: “Inschrijvingsblad” Template: ”maximaal gehalte sulfa’s”
LAB 22 I-MET 176 v.06 15/21
BEPALING VAN ANTIBIOTICA MET LC-MS Flow-chart: Bepaling van antibiotica in vlees met LC-MS OPGELET: - DEZE ANALYSE IS LICHTGEVOELIG!!! - GEEN GLAZEN RECIPIËNTEN GEBRUIKEN Werkoplossing ANT (0,6 – 16 ng/µl) 20 µl M209 (uit diepvriezer -85°C) + 230 µl H2O Steeds vers aanmaken. Blanco monster:
Belaste monsters:
2 g in centrifugeerbuis van 50 ml
Monsters:
2 g in centrifugeerbuis van 50 ml
2 g in centrifugeerbuis van 50 ml
*15- 400ppb: + 50 µl werkoplossing ANT (0,6 – 16 ng/µl) + 20 µl IS-mengsel M210 (25 ng / µl) (uit diepvriezer –85°C)
10 minuten in donker laten staan + 5 ml 1% TCA oplossing 30 minuten schudden + 750 µl ammoniakoplossing 2M + 1000 µl Mcllvaine-oplossing Antibiotica (bewaren in frigo!) vortexen
2 minuten centrifugeren bij 12000xg 2 ml overnemen in centrifugeerbuisje van 2 ml 15 minuten centrifugeren bij 12500xg 1,2 ml overnemen in plastiek proefbuis (12x75mm) SPE opzuivering zie LAB 22 I-MET 166 Beide bekomen fracties indampen in turbovap bij max. 50°C tot net droog
Fractie 1 ANT (afkomstig van Strata X kolom)
Fractie 2 AG (afkomstig van Strata X-CW kolom)
Heroplossen in 200 µl 0,01% FA
Heroplossen in 200 µl 0,3M HFBA
overnemen in microvial voor LC-MS
overnemen in microvial voor LC-MS
DATUM VAN TOEPASSING: 2014-06-23 LAB 22 I-MET 176 D001 v.06 16/21
BEPALING VAN ANTIBIOTICA MET LC-MS Voorbeeld LC-MS chromatogram Voorbeeld chromatogram. Lay-out IS.lyt
LAB 22 I-MET 176 D002 v.06 17/21
BEPALING VAN ANTIBIOTICA MET LC-MS Voorbeeld LC-MS chromatogram Voorbeeld chromatogram. Lay-out ANT_SUL.lyt
LAB 22 I-MET 176 D002 v.06 18/21
BEPALING VAN ANTIBIOTICA MET LC-MS Voorbeeld LC-MS chromatogram Voorbeeld chromatogram. Lay-out ANT_TET_QUIN_LINC.lyt
LAB 22 I-MET 176 D002 v.06 19/21
BEPALING VAN ANTIBIOTICA MET LC-MS Voorbeeld LC-MS chromatogram Voorbeeld chromatogram. Lay-out ANT_PEN_CEF_MAC.lyt
LAB 22 I-MET 176 D002 v.06 20/21
BEPALING VAN ANTIBIOTICA MET LC-MS Voorbeeld LC-MS chromatogram Voorbeeld chromatogram. Lay-out ANT_AG.lyt
LAB 22 I-MET 176 D002 v.06 21/21
LAB 22 I-MET 176 L003: Overzicht onderzochte antibiotica
Versie: Datum van toepassing:
4 10/02/2014
Tekst = niet onder accreditatie De onderstaande antibiotica kunnen aangetoond worden op niveau van de MRL met uitzondering van de sulfonamiden: deze kunnen aangetoond worden op 20 ppb. Groep
Analyt Spectinomycine
Aminoglycosiden
Amphenicolen
Cefalosporines
Lincomycinen
Macroliden
Penicillines
Pleuromutilinen
MRL(ppb) 300
Groep Polypeptiden
Analyt Bacitracine
MRL(ppb) 150
Streptomycine
500
Colistin B
150
DHSTM
500
Marbofloxacine
150
Kanamycine
100
Norfloxacine
100
Apramycine
1000
Danofloxacine
100
Paromomycine
500
Enrofloxacine
100
Gentamicine
50
Sarafloxacine
30
Quinolonen
Neomycine
500
Difloxacine
300
Thiamphenicol
50
Oxolinic zuur
100
Florfenicol
100
Nalidixic zuur
100
Cephapirine
50
Flumequine
Cephalexine
200
S-diazine
200 (**) 100
Ceftiofur
1000
S-thiazole
100
(**)
Pirlimycin
100
S-pyridine
100
(**)
Lincomycine
100
S-merazine
100
(**)
Tilmicosine
50
S-methizole
100
(**)
Erythromycine
200
S-methazine
100
(**)
Tylosine
100
S-methoxypyridazine
100
(**)
Josamycine
200
100
(**)
S-chloorpyridazine
100
(**)
Tulathromycine A
0 (100)
Sulfonamiden S-moxole (*)
Tylvalosin
50
S-doxine
100
(**)
Tildipirosine
400
S-dimethoxine
100
(**)
Spiramycine
200
S-soxazole
100
(**)
Amoxicilline
50
S-quinoxaline
100
(**)
Penicilline G
50
S-monomethoxine
100
(**)
Ampicilline
50
S-methoxazole
100
(**)
Penicilline V
25
Dapsone
0 (5)
Oxacilline
300
Trimethoprim
50
Cloxacilline
300
Tetracycline
100
Nafcilline
300
Chloortetracycline
100
Dicloxacilline
300
Doxycycline
100
Valnemulin
50
Oxytetracycline
100
Tiamulin
100
Tetracyclines
(*): geen MRL, waarde tussen haakjes = niveau waarop de analyt kan aangetoond worden (**): de sulfonamiden kunnen aangetoond worden op 20 ppb
LAB 22 I-MET 176 L003_Overzicht onderzochte antibiotica en hun MRL-waarden_v.04-2014-02-10.doc
(*)
LAB 22 I-MET 176 L005: Bepaling van antibiotica in vlees met LC-MS
Versie:
9
Datum van toepassing:
10/02/2014
Tabel cut-off waarden Onderstaande tabel geeft een overzicht van de cut-off waarden op niveau van de MRL (zie LAB 22-I-MET 176 L003) met uitzondering van de sulfonamiden: voor de sulfonamiden werd de cut-off bepaald op 20 ppb
Analyt
Cut-off
Analyt
Cut-off
Amoxicilline Ampicilline Apramycine Bacitracine Ceftiofur Cephalexine Cephapirine Chloortetracycline Cloxacilline Colistin B Danofloxacine Dapsone DHSTM Dicloxacilline Difloxacine Doxycycline Enrofloxacine Erythromycine Florfenicol Flumequine Gentamicine Josamycine Kanamycine Lincomycine Marbofloxacine Nafcilline Nalidixic zuur Neomycine Norfloxacine Oxacilline Oxolinic zuur Oxytetracycline Paromomycine
0,0003 0,00033 1,6 0,012 0,0023 0,05 0,0005 0,1 0,0089 0,005 0,05 0,001 1,27 0,0021 0,1 0,19 0,05 0,0013 0,0023 0,1 0,073 0,17 0,097 0,19 0,1 0,01 0,2 1,5 0,05 0,013 0,49 0,2 1
Penicilline G Penicilline V Pirlimycin Sarafloxacine S-chloorpyridazine S-diazine S-dimethoxine S-doxine S-merazine S-methazine S-methizole S-methoxazole S-methoxypyridazine S-monomethoxine S-moxole Spectinomycine Spiramycine S-pyridine S-quinoxaline S-soxazole S-thiazole Streptomycine Tetracycline Thiamphenicol Tiamulin Tildipirosine Tilmicosine Trimethoprim Tulathromycine Tylosine Tylvalosin Valnemulin
0,005 0,0006 0,05 0,02 0,016 0,032 0,14 0,075 0,074 0,1 0,037 0,017 0,14 0,05 0,099 0,065 0,054 0,13 0,049 0,026 0,032 0,09 0,2 0,0021 0,048 0,64 0,1 0,48 0,1 0,011 0,01 0,01
Bepaling van antibiotica met LC-MS LAB 22 I-MET 176 L005_Antibiotica met LC-MS cut-off waarden_v 09_2014-02-10.xls
