Génmutációk és polimorfizmusok vizsgálata szemészeti kórképekben Doktori értekezés
Dr. Szabó Viktória Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola
Témavezető: Dr. Nagy Zoltán Zsolt egyetemi docens Hivatalos bírálók: Dr. Buzás Edit egyetemi docens Dr. Facskó Andrea egyetemi docens Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:
Prof. Dr. Salacz György egyetemi tanár Prof. Dr. Halmos Tamás osztályvezető Dr. Holló Gábor egyetemi docens Dr. Sebestyén Anna tudományos munkatárs
Budapest 2007
Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék ......................................................................................................... 2 Rövidítésjegyzék ......................................................................................................... 4 Fogalomtár .................................................................................................................. 6 Bevezetés ..................................................................................................................... 7 Irodalmi áttekintés...................................................................................................... 8 1. A veleszületett stacioner nyctalopia....................................................................... 8 A fototranszdukció ................................................................................................................................11 Az autoszomális domináns veleszületett stacioner nyctalopia ismert mutációi.....................................16
2.
A PRK-val kezelt betegcsoportban végzett vizsgálatok háttere ...................... 19
2.1. A PRK-t követő corneális sebgyógyulás pathológiája és molekuláris genetikai háttere......19 A corneát felépítő extracelluláris komponensek....................................................................................21 Az extracelluláris mátrix változásai a sebgyógyulás során....................................................................23 Az extracelluláris mátrix komponenseinek vizsgálata knockout egérmodellekben...............................25 2.2. A glükokortikoid receptor gén funkcionális polimorfizmusainak vizsgálata PRK után lokális szteroid készítményekkel kezelt betegcsoportban .....................................................................27 A szteroid-indukált okuláris hipertenzió................................................................................................27 A glükokortikoidok hatásmechanizmusa...............................................................................................28 A glükokortikoid receptor......................................................................................................................29
Célkitűzések .............................................................................................................. 35 Betegek és módszer ................................................................................................... 37 A veleszületett stacioner nyctalopia betegségokozó mutációjának keresése .......................................37 Betegcsoport kiválasztása ......................................................................................................................37 Klinikai vizsgálatok ...............................................................................................................................37 Molekuláris genetikai vizsgálatok .........................................................................................................38 Genotípus elemzés és statisztikai analízis..............................................................................................42 A jelölt GNAT1 gén mutációanalízise ...................................................................................................43 A mutáns fehérje molekuláris modellezése ...........................................................................................45 A fotorefraktív keratektomiát követő corneális sebgyógyulás molekuláris genetikai hátterének vizsgálata ...................................................................................................................................................46 Betegcsoport kiválasztása ......................................................................................................................46 Klinikai vizsgálatok ...............................................................................................................................47 Molekuláris genetikai vizsgálatok .........................................................................................................48
2
A glükokortikoid receptor gén három funkcionális polimorfizmusának vizsgálata PRK után lokális szteroid készítményekkel kezelt betegcsoportban .....................................................................57 Betegcsoport kiválasztása ......................................................................................................................57 Klinikai vizsgálatok ...............................................................................................................................58 Molekuláris genetikai vizsgálatok .........................................................................................................59 Statisztikai analízis ................................................................................................................................64
Eredmények .............................................................................................................. 65 Az autoszomális domináns stacioner nyctalopiában szenvedő betegek vizsgálatainak eredménye ..65 A klinikai vizsgálatok eredményei ........................................................................................................65 A molekuláris genetikai vizsgálatok eredményei ..................................................................................66 A refraktív beavatkozásokat követő corneális sebgyógyulás vizsgálatának eredményei ...................70 A klinikai vizsgálatok eredményei ........................................................................................................70 A molekuláris genetikai vizsgálatok eredményei ..................................................................................73 A glükokortikoid receptor funkcionális polimorfizmusai vizsgálatának eredménye .........................74 A klinikai vizsgálatok leíró statisztikai eredményei ..............................................................................74 A molekuláris genetikai vizsgálatok eredményei ..................................................................................74 Az A1 és A2 vizsgálatok eredményei ....................................................................................................75 A B vizsgálat eredménye .......................................................................................................................75
Megbeszélés ............................................................................................................... 77 Az autoszomális domináns stacioner nyctalopia vizsgálati eredményeinek megbeszélése.................77 A PRK kezelést követő corneális sebgyógyulás vizsgálati eredményeinek megbeszélése...................81 A glükokortikoid receptor polimorfizmusai vizsgálati eredményeinek megbeszélése........................84
Következtetések......................................................................................................... 87 Összefoglaló............................................................................................................... 89 Summary ................................................................................................................... 90 Irodalomjegyzék ....................................................................................................... 91 Saját közlemények jegyzéke ................................................................................... 105 Az értekezés témájához kapcsolódó közlemények .............................................................................. 105 Egyéb közlemények............................................................................................................................. 106 Az értekezés témájához kapcsolódó előadások, poszterek .................................................................. 107 Egyéb előadások, poszterek................................................................................................................. 108
Köszönetnyilvánítás ................................................................................................ 110
3
Rövidítésjegyzék A:
arresztin (S-antigén fehérje)
ar:
autoszomális recesszív öröklődésmenet
ad:
autoszomális domináns öröklődésmenet
AP-1:
AP-1 transzkripciós faktor (Activator Protein 1)
ArF:
argon-fluorid
BMI:
testtömeg index (Body Mass Index)
bp:
bázispár
CA4:
karboanhidráz 4 gén
cGMP:
ciklikus guanozin-monofoszfát
cM:
centiMorgan
CRX:
csap-pálcika homeobox gén (Cone Rod homeobox)
CSNB:
kongenitális stacioner farkasvakság (Congenital Stationary Night Blindness)
DNS:
dezoxiribonukleinsav
EGF:
epidermális növekedési faktor (Epidermal Growth Factor)
F:
forward primer
F-GC:
GC-gazdag véggel módosított forward primer
FDGF:
fibroblast eredetű növekedési faktor (Fibroblast Derived Growth Factor)
FSCN2:
retinális fascin gén
GC-clamp:
GC-gazdag szakasz, mely megváltoztatja a PCR-termék olvadási profilját
GDP:
guanozin-difoszfát
GNAT1:
pálcika-specifikus transzducin gén
GR:
glükokortikoid receptor
GTP:
guanozin-trifoszfát
IOP:
szemnyomás (IntraOcular Pressure)
∆ maxIOP:
a maximális szemnyomás változása
IL:
interleukin
IVS:
intron (InterVening Sequence)
KERA:
keratokán gén
LOD:
a valószínűség logaritmusa (logarithm of the odds, Zmax)
LUM:
lumikán gén
4
mRNS:
hírvivő (messenger) ribonukleinsav
M:
mol
NF-kB:
magi transzkripciós faktor κB (Nuclear Factor-κB)
OMIM:
Online Mendelian Inheritance in Man
P:
polimorfizmust hordozó típus
PCR:
polimeráz láncreakció (Polymerase Chain Reaction)
PDE:
foszfodiészteráz
PDE6B:
foszfodiészteráz β-alegységének génje
PDGF:
thrombocyta eredetű növekedési faktor (Platelet Derived Growth Factor)
PRK:
fotorefraktív keratektomia (PhotoRefractive Keratectomy)
PRPF3, PRPF8, PRPF31: prekurzor mRNS processing gének R:
reverse primer
RFLP:
restrikciós fragmenthossz polimorfizmus (Restriction Fragment Length Polymorphism)
R-GC:
GC-gazdag véggel módosított reverse primer
RGS-9:
G-proteineket szabályozó fehérjecsalád
RHO:
rodopszin gén
RHOK:
rodopszin-kináz
rs:
referencia szekvencia
RP1, RP9:
retinitis pigmentosa 1 és 9 gének
SAG:
s-antigén/arresztin gén
SE:
szférikus ekvivalens (Dsph-Dcyl/2)
SNP:
egypontos nukleotid polimorfizmus (Single Nucleotide Polymorphism)
Sp-1:
Sp1 transzkripciós faktor (Specificity Protein 1)
Taq:
hőstabil DNS polimeráz enzim (Termophilus aquaticus)
TGF:
transzformáló növekedési faktor (Transforming Growth Factor)
TGGE:
hőmérsékletgrádiens
gélelektroforézis
(Temperature
Electrophoresis) YY1:
YY1 transzkripciós faktor (Yin Yang-1 Protein)
WT:
vad típus (wild type)
xl:
X-kromoszómához kötött öröklődésmenet (X-linked)
Θ:
a rekombinációs gyakoriság jele
5
Gradient
Gel
Fogalomtár allél:
egy gén vagy DNS szakasz génváltozata
amplifikáció: a vizsgálandó DNS szakasz kópiaszámának sokszorozása centiMorgan: géntérképezési egység; két lókusz távolsága 1 cM, ha a rekombináció várható gyakorisága a lókuszok között 1% compound heterozigóta: egy génlókuszon két eltérő mutáns allélt hordozó egyén denaturáció: a kettős szálú DNS hő vagy bázikus hatásra történő szétválasztása elektroforézis: DNS vagy fehérjefragmentumok agaróz vagy poliakrilamid gélben történő méret szerinti szétválasztása etidium-bromid: a DNS kettős szálába interkalálódó, UV fényben fluoreszkáló vegyület excimer:
excited dimer; gerjesztett nemesgáz-halogén molekula
fenotípus:
egy sejt vagy szervezet megfigyelhető tulajdonságai
forward:
5’-3’ irány, mely irányban a nukleinsavak és fehérjék szintetizálódnak
genotípus:
egy egyed, vagy egy génlókusz jellemző genetikai összetétele
haplotípus:
egy
DNS
szálon/kromoszómán
viszonylag
közel
elhelyezkedő,
kapcsoltan öröklődő polimorf allélek sora, „mintázata” heterozigóta: egy génlókuszon két különböző allélt hordozó sejt/egyed homozigóta: egy génlókuszon két azonos allélt hordozó sejt/egyed knockout mutáció: egy gén sejten belüli célzott inaktiválása kodon:
az mRNS bázishármasa, mely egy aminosavat határoz meg
konstitutív aktiváció: folyamatos aktiváció lókusz:
gén vagy DNS szakasz helye a kromoszómán, kromoszómális pozíció
misszenz mutáció:
a DNS nukleotidsorrendjének aminosavcserét eredményező
változása nonszenz mutáció: a DNS szál korai végződéséhez vezető mutáció primer:
17-24
bp
hosszú
oligonukleotid,
mely
a
vele
komplementer
célszekvenciához kapcsolódva lehetővé teszi, hogy a DNS polimeráz elkészítse a komplementer DNS szálat promoter:
génszabályozó régió
restrikciós endonukleáz: specifikus, 4-8 bp hosszú szekvenciákat felismerő, bakteriális eredetű enzim, mely hasítja a DNS szálat
6
Bevezetés A humán genommal kapcsolatos ismeretek bővülése és a molekuláris genetikai technikák széleskörű elterjedése lehetővé teszik, hogy az emberi szervezet különböző genetikai eredetű betegségei közül a szemészeti kórképek genetikai hátterét is mélyebben megismerhessük. Az elmúlt évtizedben számos öröklődő humán kórkép etiológiája vált ismertté, mely tudás birtokában újabb összefüggések kerültek felszínre és bizonyos betegségcsoportok klasszifikációja gyökeresen megváltozott. Szélesedett a molekuláris genetikai módszerek, diagnosztikus eljárások palettája és egyre fontosabbá válik a klinikusok számára is a hagyományos diagnosztikai vizsgálatok mellett a molekuláris diagnosztika lehetőségeinek kiaknázása. A molekuláris diagnosztikai eljárások számának megnövekedése egyelőre még megelőzi a terápiás lehetőségek számának növekedését, azonban ígéretesnek tűnnek a génterápiás eljárások jövőbeni felhasználását célzó kutatások eredményei. Jelenleg az információgyűjtés korát éljük: folynak a különböző betegségek mutációinak felderítése, a mutációs spektrumok meghatározása különböző populációkban, a komplex jellegek, polimorfizmusok vizsgálatai, génexpressziós vizsgálatok, genotípus-fenotípus összefüggést vizsgáló és egyéb genomikai kutatások. Napjainkban a szemészet egy-egy területén folytatott kutatások szerteágazóak, mind a mendeli
öröklődésű
betegségeket,
mind
a
nem-mendeli
öröklődést
mutató,
komplex/multifaktoriális kórképeket intenzíven vizsgálják. A doktori munkám szintén egy mendeli öröklődésű és két komplex/multifaktoriális szemészeti betegség vizsgálatát foglalja magában. A hamburg-eppendorfi Egyetem Humángenetikai Intézetében egy többgenerációs dán családban az autoszomális domináns öröklődésű veleszületett stacioner farkasvakság genetikai okát kerestük. A Semmelweis Egyetem Tömő utcai Szemészeti Klinikáján folyó kutatómunkánk során, egy betegcsoporton belül két multifaktoriális kórképet vizsgáltunk: a fotorefraktív keratektomiával kezelt betegek szaruhártyáján megfigyelt kóros perzisztáló homály, valamint a posztoperatív kezelés során jelentkező szteroid-indukált okuláris hipertenzió kialakulását befolyásoló genetikai tényezőket tanulmányoztuk. Értekezésemben e munka eredményeit foglalom össze.
7
Irodalmi áttekintés 1. A veleszületett stacioner nyctalopia
A veleszületett stacioner nyctalopia (kongenitális stacioner farkasvakság, congenital stationary night blindness) egy ritka, klinikailag és genetikailag heterogén rendellenesség, amely a sötétben és félhomályban való látás hiányával vagy zavarával jár. A különböző CSNB formákban a betegek látásélessége, fundusképe, refrakciós hibái és elektrofiziológiai eltéréseik különbözőek, a látótér és a színlátás mindhárom formában normális. A CSNB-ben szenvedők nagy része egyébként egészséges, nappali fényben látásuk ép, mivel a csapok funkciója megtartott [1]. A stacioner nyctalopia oka a non-progresszív pálcika-fotoreceptorokat érintő funkcionális zavar, amely nem jár a retina degenerációjával. Napjainkban több páciens farkasvakságának diagnosztizálása elmaradhat a nagymértékű mesterséges fénnyel történő megvilágítás miatt. Azonban a farkasvakságban szenvedők felismerésének nagy jelentősége van, mivel ezek a személyek sötétben vagy alkonyatban való autóvezetésre nem képesek. A CSNB előfordulhat autoszomális domináns, autoszomális recesszív és Xkromoszómához kötött formában. Az autoszomális domináns formában jellemző a normál látásélesség, esetenként kisfokú myopia, normál funduskép (esetenként myopiás eltérések), kóros szkotópikus ERG (csökkent a- és b-hullám) és kóros sötét adaptometria. Az autoszomális recesszív formában általában jó látásélesség mellett pontszerű elváltozások figyelhetőek meg a funduson, a szkotópikus ERG-n normál ahullám mellett csökkent vagy hiányzó b-hullám látható, a sötét adaptációs görbén hiányzó vagy csökkent pálcika-válasz figyelhető meg. Az X-kromoszómához kötött formában gyakran fordul elő közepes és nagyfokú myopia, a funduskép normál, kóros szkotópikus ERG (normál a-hullám és csökkent vagy hiányzó b-hullám) és kóros sötétadaptációs görbe jellemzi.
8
A klinikai diagnózis felállítása pszichofizikális tesztekkel történik: a statikus és kinetikus látótér, a színlátás, a sötét adaptometriás és az elektroretinográfiás vizsgálat elvégzése szükséges. A farkasvakság differenciáldiagnózisa során az alábbi kórképek merülnek fel: •
Szerzett o A-vitamin hiány o Paraneoplasztikus szindrómák
•
Öröklődő o Retinitis pigmentosa, choroideremia o Stacioner farkasvakság
A diagnózis sarkalatos pontja a sötétadaptáció és az elektroretinográfia, mely módszereket röviden ismertetek. A sötétadaptometria során a szem vizuális küszöbérzékenységének csökkenését vizsgáljuk, amely általában 20-30 perc alatt éri el a legalacsonyabb küszöbértéket. A fényhez adaptált vizsgált személy egy teljesen sötét szobában ül. Rendszeres időközönként egyre növekvő intenzitású fénypontokat mutatunk neki a látótér egy pontján és rögzítjük, hogy érzékelte-e a felvillanásokat. A sötétadaptációs görbén a retinát ingerületbehozó legkisebb hatásos ingerintenzitás tízes alapú logaritmusát ábrázoljuk a sötétben eltöltött idő függvényében. A sötétadaptációs válasznak két összetevője van: az első 5-10 percben gyors, de kisfokú csökkenés a csapok és az asszociált bipoláris és magasabbrendű neuronjaik által alkotott funkcionális egység sötétadaptációjának felel meg. Eközben a pálcikák sötétadaptációja is folyik, de sokkal lassabban. Amikor a csapok elérik a maximális érzékenységüket, megjelenik a görbén a pálcika-csap töréspont, amely mutatja, hogy a pálcikák érzékenyebbé váltak a csapoknál. Ezt követi a második lassabb és nagyfokú csökkenés, amely a pálcikák sötétadaptációjának tulajdonítható (1. Ábra). További 15-30 perc után a teljes mértékben sötétadaptált pálcikák 100x gyengébb fénypontot is képesek érzékelni összehasonlítva a csapokkal. A mutáns pálcikák sötétadaptációja megváltozik; a rodopszin, transzducin és foszfodiészteráz gének mutációi által okozott eltérés az 1. Ábrán látható.
9
1. Ábra Sötétadaptációs görbe [1]. A folytonos vonal a normál, a pontozott vonal a rodopszin mutáció által okozott CSNB, a szaggatott vonal a transzducin mutáció (Nougaret típus) és a foszfodiészteráz mutáció (Rambusch típus) által okozott CSNB sötétadaptációs görbéit jelöli. Az elektroretinográfia a retina külső és belső felszíne között fényinger hatására kialakuló feszültségváltozást méri, alkalmas a pálcikák és csapok funkciójának elkülönített mérésére. Általában corneális kontaktlencse elektródot alkalmazunk, továbbá egy indifferens elektród kerül a halántékra és egy földelő elektród a homlok bőrére. A pálcikák elkülönített vizsgálatát teljes sötétadaptáció után végezhetjük dilatált pupillájú szemen. A szkotópikus ERG során a gyenge fényfelvillanások a csapokat nem hozzák ingerületbe, csak a pálcikákat, az erős fényimpulzusok pedig mindkét fotoreceptortípust aktiválják. A CSNB-ben elkülöníthető két főbb típusú ERG mintázat: a Schubert-Bornschein- illetve a Riggs-típus. A Schubert-Bornschein típusú ERG-re jellemző az intakt a-hullám és a b-hullám hiánya vagy jelentős csökkenése, leggyakrabban X-hez kötött formákban és autoszomális recesszív CSNB-ben fordul elő. Az intakt a-hullám a fotoreceptorok külső szegmensének megfelelő működésére utal, a hiba feltehetően a pálcikák szinaptikus termináljaiban vagy a kapcsolódó bipoláris sejtekben lehet. A Riggs-típusú ERG-n hiányzik az a-hullám, amely a pálcikák külső szegmensének defektusára utal, és a b-hullám gyakran csökkent amplitudójú. Főként autoszomális domináns, vagy nagyon ritkán recesszív CSNB-ben fordul elő. A rodopszin és a transzducin gének mutációi által okozott elektroretinográfiás eltérések a 2. Ábrán láthatók.
10
2. Ábra Az egészséges és a rodopszin, illetve transzducin mutációt hordozó beteg személyek elektroretinogramja [1]. Az első sorban kék fénnyel történt az ingerképzés, normál esetben csak a pálcikák izolált válaszát regisztrálták, a mutációt hordozó betegek pálcikaválasza hiányzik. A második sorban fehér fénnyel történő impulzusleadás után a csapok és pálcikák válaszát detektálták, a mutációt hordozó betegek csap-pálcika válasza csökkent. A harmadik sorban a 30 Hz flickerimpulzus által kiváltott csapválasz látható. A sötét adaptometria időbeni lefolyása és az ERG szerint CSNB-ben a pálcikák jelen vannak, funkcionálnak, de funkciójuk abnormális. A pálcikák deszenzitizálódnak, csak kifejezetten erős fényre jönnek ingerületbe, fényérzékenységük hasonló az egészséges emberek nem sötétadaptált pálcikáinak érzékenységéhez [1].
A fototranszdukció A látás komplex folyamat. Élettani alapja a fotoreceptorokban fény hatására kiváltott jelátviteli útvonal és akciós potenciálváltozás, amely ingerületté alakulva a látókéregben vizuális percepciót eredményez.
11
Az emberi szemben kétféle fotoreceptortípus fordul elő: a pálcika és a csap. A pálcikák már egyetlen foton hatására képesek aktiválódni, ezért a félhomályban, gyenge megvilágításban való szkotópikus látásért felelősek, míg a csapok elsősorban nappali fényben, fotópikus körülmények között működnek és az éleslátásban illetve a színlátásban játszanak szerepet. A retinában jellemző elhelyezkedést mutat a két fotoreceptortípus: a foveában csak csapok helyezkednek el és minden egyes csapot egy bipoláris sejt kapcsol össze egy ganglionsejttel. A retina többi területén a pálcikák vannak túlsúlyban és egy bipoláris sejt több pálcikával áll szinaptikus kapcsolatban, ezért jelentős mértékű konvergencia figyelhető meg. Az alapvető molekuláris folyamatok mindkét fotoreceptorban azonosak, azonban különböző gének kódolják a parallel lépésekben funkcionáló fehérjéket, például a pálcika-specifikus transzducin α-alegységét a GNAT1, a csap-specifikus transzducin αalegységét a GNAT2 gén kódolja. A jelátviteli folyamat, fototranszdukció (3. Ábra), számos összetett kémiai és fizikai lépésből áll, receptora a pálcikákban a rodopszin, a csapokban a konopszin, ligandja (kromofór) a 11-cisz retinal, amely az A-vitamin származéka. A 11-cisz retinal kovalens Schiff-bázis kötéssel kapcsolódik a hét transzmembrán fehérjehurokból álló opszin fehérjedoménjéhez. Az opszinfehérjéhez kapcsolódó kromofór molekulán (11-cisz-retinal) a beeső fény hatására konformációs változás, cisz-transz fotoizomerizáció történik, ezáltal all-transzretinál keletkezik és az opszinfehérje aktiválódik. Az aktivált opszinfehérje aktiválja a transzducint, amely egy 3 alegységből álló G-protein. A G-fehérjék kiemelt jelentőségűek a jelátviteli folyamatban, mivel felerősítik a jelet (1 rodopszin 500 transzducint képes aktiválni), és beépített kikapcsolási mechanizmussal bírnak (belső GTPáz aktivitás). Az aktivált transzducin α-alegységén GDP/GTP csere történik, disszociál a transzducin βγ-alegységektől és a rodopszintól. Hozzákötődik a cGMPfoszfodiészteráz gátló γ-alegységéhez és leválasztja a cGMP-foszfodiészteráz effektor αβ-alegységeit. Az α-transzducin így aktiválja a foszfodiészteráz enzimet, felszabadítva az effektor PDEαβ-alegységeit. A foszfodiészteráz aktiválása a cGMP koncentráció
12
csökkenését eredményezi, amely a cGMP-függő kationcsatornák záródásához vezet, ezáltal a sejtmembrán hiperpolarizálódik és ingerület továbbítódik a látóideg felé. A fototranszdukció kikapcsolása több lépésben történik: az aktivált transzducin disszociál és leválik a rodopszinról, majd a rodopszin kináz foszforilálja a rodopszint. Miután a foszforilált receptorhoz kötődik az arresztin (vagy másnéven S-antigén fehérje) és sztérikusan gátolja a transzducin aktivációját, a 11-transz retinal leválik a receptorról. Az aktivált transzducin α-alegységének GTP hidrolízise szintén jelentős lépése a szignáltranszdukció leállításának, amelyet egyrészt a transzducin αalegységének belső (intrinsic) GTPáz aktivitása, másrészt a pálcika-specifikus RGS9-1 fehérje és a foszfodiészteráz gátló γ-alegységének GTP hidrolízist akceleráló hatása biztosít [2-5]. A GMP-t cGMP molekulává alakító guanilát ciklázt a lecsökkenő intracelluláris Ca2+ szint aktiválja, melynek következtében nő a cGMP szint, ami a Na+ és Ca2+ csatornák megnyitásához vezet. [6]
3. Ábra A fototranszdukció folyamata (R: rodopszin, T: transzducin, PDE: foszfodiészteráz, P: foszfor, A: arresztin, *:aktivált állapot)
13
A CSNB egyes formáinak eddig leírt génjeit és azonosított génmutációit az 1. Táblázat foglalja össze. 1. Táblázat A kongenitális stacioner farkasvakság egyes formáinak eddig megismert génjei és azonosított génmutációi. Fenotípus
Gén (Lokalizáció)
adCSNB 1.
2. Nougaret típus
arCSNB
(3q21-24) GNAT1 (3p22)
3. Rambusch
PDE6B
típus
(4p16.3 )
1. Oguchi típus 2. Oguchi típus 3.
xlCSNB
RHO
1. Aland szigeteki-típus 2.komplett xlCSNB myopiával
SAG (2q37) RHOK (13q34) GRM6 (5q35) (Xp21.1-11.22)
NYX (Xp11.3)
3. inkomplett
CACNA1F
xlCSNB
(Xp11.23)
14
Mutáció
Irodalom
Ala 292 Glu
[7]
Gly 90 Asp
[8]
Thr 94 Ser
[9]
Gly 38 Asp
[10]
His 258 Asn
[11]
1147delA
[12]
1602del 4bp
[13]
6 mutáció
[14]
több génlókusz
[15]
~26 mutáció (misszenz, deléció,
[16]
inzerció) ~20 mutáció (misszenz, deléció, inzerció)
[17, 18]
A domináns módon kifejeződő mutációk általában funkciónyeréssel (gain-of-function), míg a recesszív formában előforduló mutációk általában funkcióvesztéssel (loss-offunction) járnak. A látás jelátviteli kaszkádjában a rodopszin, a transzducin és a foszfodiészteráz
mutációi,
melyek
domináns
hatásúak,
az
inhibitor
funkció
elvesztésével állandó szignált tartanak fenn, ezáltal konstitutívan aktiválják a kaszkád következő tagját. A rodopszin kináz és az arresztin mutációi következtében, melyek recesszív hatásúak, elmarad a rodopszin foszforilációja, és a molekula nem tud visszatérni a nyugalmi fázisába, hogy újra aktiválható legyen (4. Ábra).
4. Ábra. A fototranszdukció folyamatában az aktiválás fehérjéinek mutációi funkciónyeréssel járnak (pirossal jelölve), az inaktiválásért felelős fehérjék mutációi funkcióvesztéshez vezetnek (kékkel jelölve). (R: rodopszin, T: transzducin, RHOK: rodopszin-kináz, PDE: foszfodiészteráz, O: opszin, P: foszfor, SAG: arresztin, *: aktivált állapot) Dryja elmélete szerint a rodopszinmutációk okozta CSNB kialakulása feltehetően az alábbi élettani mechanizmussal magyarázható: sötétben az egészséges fotoreceptorok külső szegmensében a rodopszin molekula alkalmanként kromofór molekula nélküli inaktív állapotba kerül, és nem aktiválódik a fototranszdukciós kaszkád. CSNB-ben a mutáns opszin ugyanebben a kromofór nélküli állapotban képes aktiválni a transzducint, ezáltal a jelátviteli folyamatot. Világosban az egészséges pálcikák fotoaktivált
15
rodopszinmolekulái kvantitatívan érezhető módon aktiválják a fototranszdukciót és látásérzet keletkezik. A mutáns rodopszinmolekulák a beeső fény hatására aktiválódnak, de a már aktivált jelátviteli folyamat újabb aktivációjának növekedése nem érezhető a pálcikák deszenzitizációja miatt és nem keletkezik látásérzet [7].
Az autoszomális domináns veleszületett stacioner nyctalopia ismert mutációi Elsőként 1838-ban dokumentálta Cunier a dél-franciaországi Nougaret családban az adCSNB (OMIM: 163500) előfordulását. 1907-ben ugyanezen család felmenőihez vezettek vissza a szálak, mikor Nettleship újra felfedezte ezt a adCSNB-ben szenvedő kiterjedt és sokgenerációs famíliát [19, 20]. Egy másik érintett nagycsaládot Rambusch írt le 1909-ben, majd Rosenberg és munkatársai fedezték fel újra a leszármazottak diagnosztizálása és genetikai vizsgálata révén [11, 21]. Mindkét családban azonos elektrofiziológiai és pszichofizikális vizsgálati eredményeket írtak le, azonban később bebizonyosodott, hogy különböző gének mutációi okozták az azonos megjelenésű betegséget [10, 11]. Rodopszin A rodopszin gén számos mutációját azonosították autoszomális domináns és recesszív retinitis pigmentosában. A harmadik fenotípus, amely a rodopszin gén mutációjának következménye az autoszomális domináns veleszületett stacioner nyctalopia. Az adCSNB elsőként azonosított mutációját Dryja és munkatársai találták meg egyetlen betegben, 1993-ban. Ez a heterozigóta misszenz mutáció a rodopszin gén (RHO, OMIM: 180380) 292. kodonjában eredményezett egy alanin/glutamát aminosavcserét, Ala292Glu [7], azonban a család nem volt elérhető a további vizsgálatok számára, így nem sikerült kiterjedtebb genetikai vizsgálatot elvégezni. Rao és al Jandal további misszenz mutációkat azonosított a rodopszin génben, 1994-ben a Gly90Asp, glicin/aszparagin aminosavcserét okozó mutációt a 90. kodonban és 1999ben a Thr94Ile, 94. kodont érintő treonin/izoleucin cserét eredményező mutációt [9, 22]. A rodopszin molekula az egyik legtöbbet vizsgált G-proteinfüggő hét transzmembrán receptor. Ligandja, a 11-cisz retinal a II., III., és VII. fehérjehurok által alkotott zsebben
16
helyezkedik el (5. Ábra). A ligand kötőhelyét alkotó aminosavak mutációinak funkcionális
következménye,
hogy
konformációváltozás
következik
be
a
fehérjeszerkezetben és a mutáns opszin kromofór molekula nélkül is állandóan aktiválja a transzducint.
5. Ábra. A rodopszin fehérjeláncok térbeli elhelyezkedése és a ligandkötőhely kialakításában kulcsfontosságú szerepet játszó aminosavak.
A fent leírt mutációk konstitutív aktiváló hatását, mely állandó fototranszdukcióhoz vezet, kísérletes modellekben igazolták [8, 9, 22-24]. A pálcika-specifikus foszfodiészteráz A pálcika-specifikus foszfodiészteráz enzim β-alegységének génjében (PDE6B, OMIM: 180072) először autoszomális recesszív retinitis pigmentosában szenvedő betegekben azonosítottak egy heterozigóta mutációt [25]. Veleszületett stacioner farkasvakságban elsőként Gál és munkatársai találtak egy heterozigóta mutációt (His258Asn) a Rambusch nemzetségben [11, 26]. A His258Asn mutáció eredményeképp a foszfodiészteráz enzim β-alegységéhez nem képes bekötődni a gátló γ-alegység, cGMP depléció alakul ki és a membrán hiperpolarizálódik, ezért a fototranszdukció konstitutív aktivációja következik be. A pálcika-specifikus transzducin A Nougaret családban egy heterozigóta misszenz mutációt fedezett fel Dryja és munkacsoportja pálcika-specifikus transzducin α-alegységének génjében (GNAT1,
17
OMIM:139330) [10]. A Gly38Asp, glicin/aszparagin aminosavcserét hordozó mutáns transzducin α-alegysége nem kötődik a foszfodiészteráz gátló γ-alegységéhez, ezáltal elmarad a cGMP-t hidrolizáló enzimet aktiváló hatása. A mutáció megváltoztatja a GTP/GDP molekulák α- és β-foszfátjai közötti hidrogénhídkötéseket, illetve az aszparagin negatív töltést visz a kötésbe. A pontos mechanizmus, amely a fototranszdukció állandó aktivációját okozza, nem tisztázott. Érdekes megfigyelés azonban, hogy a mutáns Gly38. aminosav homológ pozícióban helyezkedik el egy rokon fehérje, a p21-ras protein, onkogén mutációjával [1].
18
2. A PRK-val kezelt betegcsoportban végzett vizsgálatok háttere 2.1. A PRK-t követő corneális sebgyógyulás pathológiája és molekuláris genetikai háttere A szaruhártya legfőbb funkciója a szem védelmének, transzparenciájának és törőerejének biztosítása. Sejtszegény, avasculáris szövet lévén a cornea sebgyógyulása sajátos jelleggel bír. Sérülés esetén csökken a törőereje és a transzparenciája, amelyhez viszonylagos dehidrált állapotra van szükség. Az ArF excimer lézeres refraktív sebészeti beavatkozásokat világszerte egyre növekvő számban végzik a szem refrakciós hibáinak korrigálására. Az elsőként alkalmazott módszer, a fotorefraktív keratectomia (PRK) mellett megjelentek a továbbfejlesztett, módosított eljárások, a laser in situ keratomileusis (LASIK) és a laser epithelial keratomileusis (LASEK). Az excimer lézeres refraktív sebészet elterjedésével még nagyobb hangsúlyt kapott a corneális sebgyógyulás vizsgálata. Számos kutatócsoport foglalkozott az ArF lézer corneára gyakorolt hatásával szövettani, elektronmikroszkópos, immunhisztokémiai illetve mRNS és fehérje expressziós szempontból [27-32]. A keratocyták apoptosisát szintén több munkacsoport tanulmányozta az excimer lézeres beavatkozásokat követő corneális sebgyógyulás során [33-36]. A PRK egyik legfontosabb szövődménye a kóros corneális subepitheliális homály (haze), mely nem minden esetben alakul ki, de nagymértékben rontja a betegek látásminőségét. Normális corneális sebgyógyulás esetén a haze 1 hónappal a PRK után jelenhet meg, a posztoperatív 3-6 hónap környékén a legkifejezettebb és fokozatosan regrediál a 9-12 hónapban. A subepitheliális homály mértéke általában <1,0 (Hanna skála, [37]). Látásromlást okozó szignifikáns haze az esetek 3-5%-ában marad fenn [38]. Kóros esetben a corneális subepitheliális homály (6. Ábra), melynek szerkezete lehet retikuláris, vattatépésszerű felritkulás ill. flokkuláris, 1 éven túl is fennmarad.
19
6. Ábra A Hanna skála szerint 4.0 fokozatú corneális subepitheliális haze A subepitheliális homály oka egyes szerzők szerint a celluláris hiperreflektivitás, amelyet a keratocyták számának megnövekedése és fokozott metabolikus aktivitása magyaráz [38, 39]. Mások szerint nagyobb szerepet játszanak a cornea transzparencia csökkenésében az extracelluláris mátrixdepozitumok [29, 40], továbbá a károsodott, dezorganizált kollagénszerkezet illetve a hidratáció [41-43]. Mind a cornea megnövekedett víztartalma, mind a sérült szerkezetű kollagénlamellák megváltozott törésmutatójú közeget hoznak létre a szaruhártya szerkezetében, ami szintén transzparencia csökkenéshez vezethet bármilyen típusú refraktív sebészeti műtétet követően. A kóros sebgyógyulás hátterében környezeti hatás is állhat. Nagy és munkacsoportja az UV-B sugárzás káros hatását tanulmányozta állatkísérletes modellben. PRK-val és LASIK-kal kezelt nyulak szemeit UV-B hatásnak kitéve szövettani és transzmissziós elektronmikroszkópos tanulmányokat végeztek. A PRKával és UV-B fénnyel kezelt nyulak corneájában a bazálmembrán feltöredezett, az elülső stromában vakuolumok voltak láthatók, a keratocyták fokozott aktivitást mutattak. A LASIK beavatkozásnak és UV-B hatásnak kitett nyulak szemein a stromaágyban volt megfigyelhető az aktivált keratocyták jelenléte, melyekben enyhébb fokú metabolikus aktivitás mutatkozott [28, 38, 44].
20
A corneát felépítő extracelluláris komponensek A cornea extracelluláris mátrix állományát főként kollagén és proteoglikánok alkotják. Az ismert 19 típusú kollagén közül az emlősök corneájában legalább 10 megtalálható, többek között az I, III, IV, V, VI típusú kollagének. A stromális proteoglikánok kisméretű leucin-gazdag molekulák, melyek 2 fő csoportba sorolhatók, a keratán-szulfát oldalláncú proteoglikánok csoportja: lumikán, keratokán, mimekán, valamint a kondroitin/dermatán-szulfát proteoglikánok csoportja: dekorin, biglikán, fibromodulin [40]. A proteoglikánok szabályozzák a corneális extracelluláris mátrixban kötött víz eloszlását, melynek koncentrációja az elülső stromában magasabb, míg a szabad víz a hátsó stormában fordul elő nagyobb arányban. A kisméretű leucin-gazdag proteoglikán molekulák mindegyike 6-10 leucin-gazdag, ismétlődő egységet tartalmaz a „core protein” (fő tengelyfehérje) N- és C-terminális végén elhelyezkedő globuláris, ciszteinben gazdag doménje (harmadlagos szerkezetű kötőhely) között. Ezek az azonos motívumokat tartalmazó egységek a proteoglikánok közös funkcionális tulajdonságaira utalnak, mint például a kollagénrostokkal való kölcsönhatás. A proteoglikánok szöveti megoszlása viszont eltérő, ezért valószínű, hogy a kisméretű leucin-gazdag proteoglikáncsalád minden tagja más-más szerepet tölt be a kötőszövetben [45]. Mind a keratán-szulfát, mind a kondroitin/dermatán-szulfát proteoglikánok poszttranszlációs modifikációval keletkeznek, azaz a fehérje átíródása után kerül sor a módosító molekulák beépülésére [46]. A keratán-szulfát proteoglikánok szulfatálásáért a karbohidrát-szulfotranszferáz gén terméke felelős. Ezen gén mutációi szerepet játszanak a macularis cornea disztrófiák I- és II-típusának kialakulásában [47]. A lumikán (OMIM: 600616), egy leucin-gazdag keratán-szulfát proteoglikán, a cornea homály kialakulásának jelölt génje. Nagy mennyiségben megtalálható a szaruhártya stromájában és alapvető fontosságú a cornea transzparenciájának biztosításában. A lumikán felnőtt korban kizárólag a corneában található meg proteoglikánként. A szervezet többi szövetében - szívben, aortában, vázizmokban, bőrben, és intervertebrális discusokban – felnőttkorban nem-szulfatált glikoprotein formában fordul elő [48]. A humán izületi porcban található lumikán juvenilis korban még szulfatált, majd felnőttkorban csak keratán-szulfát hiányos változatát figyelték meg [49]. A lumikán e kivételes szöveti megjelenése alapján feltételezhető, hogy a keratán-szulfát forma
21
sajátos szereppel rendelkezik a corneában [45]. A lumikán 3 exonból álló génje a 12. kromoszóma hosszú karján helyezkedik el, az általa kódolt protein 338 aminosavból áll (7. Ábra) [50]. Fiziológiásan a cornea stromájában expresszálódik, illetve a sebgyógyulás korai szakaszában az epitheliumban [27]. Negatív töltésű oldalláncai fontos szerepet töltenek be a cornea hidráltsági állapotának fenntartásában, ezáltal transzparenciájának biztosításában [51]. A lumikán gén mutációit mindeddig nem vizsgálták humán betegcsoportban.
7. Ábra A lumikán és keratokán gének sematikus szerkezete, kromoszóma lokalizációja és a fehérjetermékek mérete A keratokán a lumikánhoz hasonló szöveti eloszlást mutat, szintén csak a corneában tartalmaz keratán-szulfát láncokat [52]. Génje szintén 3 exonból áll, 352 aminosavat kódol és a 12. kromoszóma hosszú karján található a lumikán gén szomszédságában (7. Ábra) [53]. A génjében bekövetkező mutációk autoszomális recesszív módon öröklődő cornea plana kialakulásához vezetnek. A főként a finn lakosság körében leírt betegségben 3 allélikus variánst azonosítottak [54-56]. A dekorin és a biglikán erősen szulfatált dermatán-szulfát proteinek, melyek stimulálják a fibroblasztok migrációját a kollagénrostok között a seb területére [40]. Immunhisztokémiai
és
immunoblotting
vizsgálatokat
végezve
megfigyelték
megnövekedett mennyiségű stromális előfordulását keratoconus és keratopathia bullosa eseteiben [46].
22
Elsőként Rada és munkatársai [41] bizonyították a lumikán szabályozó szerepét a kollagén fibrillogenezisben, míg a dekorinról már ismert volt, hogy szükséges a rostok összerendeződéséhez. Az in vitro vizsgálat során megfigyelték, hogy alkilált és redukált formában mindkét fehérje elveszti a fibrillogenezist szabályozó aktivitását, és az elektronmikroszkópos
képeken
megvastagodott,
szabálytalan
lefutású
rostok
megjelenését észlelték, tehát élettanilag mindkét proteoglikán szükséges a normális kollagénszintézishez. Kimutatták továbbá, hogy ez a funkció nem a glükóz aminoglikán oldalláncokhoz, hanem a core proteinhez kötött, mely képes diszulfidhíd kötésekkel kapcsolódni a kollagénhez.
Az extracelluláris mátrix változásai a sebgyógyulás során A corneális sebgyógyulással kapcsolatos kutatások során az utóbbi években több növekedési faktort, citokint és egyéb fehérjék expressziós változását vizsgálták [43]. A számos növekedési faktor közül kiemelt szerepet játszik az epidermális, a fibroblaszt és a vérlemezkékből származó növekedési faktorokat, valamint a transzformáló növekedési faktorok alfa és béta típusait. A citokineket a beáramló gyulladásos sejtek és aktivált miofibroblasztok szekretálják, míg a növekedési faktorokat főként az epithelium és a keratocyták, ezen kívül a könnymirigy is képes növekedési faktortermelésre. A citokinek főként a sejtmigrációra hatnak, a növekedési faktorok pedig mitogén hatásúak, befolyásolják a sejtek differenciálódását; szintén serkentik az epithelsejtek és a keratocyták migrációját, továbbá stimulálják a keratocyták extracelluláris mátrix ill. kollagénszintézisét. A számos növekedési faktor és citokin összetett kaszkádrendszert alkot, melynek egésze nem ismert még pontosan, de az egyre bővülő tudásanyag révén megismerhetjük a corneális sebgyógyulás azon támadáspontjait, amelyek a jövőben terápiás beavatkozásra nyújthatnak lehetőséget. Tanaka és munkacsoportja [36] részletesen elemezték a radiális keratotomia és az excimer lézer kezelés hatását a corneára. A keratocyták sebgyógyulási válaszát morfológiailag,
az
extracelluláris
mátrix
újrarendeződését
a
stromában
immunhisztokémiailag vizsgálták. Megállapították, hogy a cornea sebgyógyulása nem
23
minőségében, hanem intenzitásában és lezajlásának idejében különbözik. Mindkét sebészi technika alkalmazása után megfigyelték a keratocyták apoptosisát a sebzés helyén, mely egy acelluláris zónát eredményezett. Ezt követően lezajlott a gyulladásos fázis a gyulladásos sejtek infiltrációjával, majd a sejt-aktivációs fázis, melyben az aktivált keratocytákat a regenerálódó epithelium alatt figyelték meg, és az újrarendeződés (remodeling) fázisa, amelyben a migráló keratocyták az extracelluláris mátrix állományát újraszintetizálták. A szerzők a corneális incízió után kifejezett gyulladásos reakciót írtak le. A remodelleződés viszonylag gyorsan lezajlott, az abnormális extracelluláris mátrixkomponensek mennyisége fokozatosan csökkent és a sebgyógyulás, a normális corneaszerkezettel közel azonos szerkezetet mutatva, 3 hónap után lezárult. Ezzel szemben a fotorefraktív keratektomia után a gyulladásos válasz viszonylag enyhe volt, viszont a sejt-aktivációs fázisból az újraképződési fázisba történő átmenet hosszú időt vett igénybe és az abnormális mátrixelemek jelenléte 1 évvel később is megfigyelhető volt. Az újraépülés elhúzódása az aktivált keratocyták citokin (IL-1, IL-6, TNF-α), extracelluláris kötőszöveti komponens és növekedési faktor (TGFβ, PDGF) szekréciójával magyarázható, mely folyamatos szöveti újraképződési választ váltott ki. Saika és munkatársai [57] a sérült cornea mRNS expressziós profilját határozták meg. Eredményeik szerint a sérült hámban a keratán-szulfát proteoglikánok közül átmenetileg csak a lumikán expresszálódik a sérülés utáni 8. órától kezdve 3 napig. Ezután az epitheliumban a sérülés területén sem mutatható ki a lumikán. Bleckman és kutatócsoportja [27] elektronmikroszkópos és immunhisztokémiai vizsgálatokat végzett egy heges corneán, melyet két alkalommal excimer lézeres fotorefraktív keratektomiával kezeltek. Megfigyelték, hogy a megnagyobbodott keratocyták endoplazmatikus retikuluma kitágult és fibroblasztra emlékeztető megjelenésük volt. Extracellulárisan amorf anyag rakódott le, a kollagén rostok dezorganizált szerkezetet mutattak, de csíkoltságuk és átmérőjük megtartott volt. Immunhisztokémiailag a III, IV, és V típusú kollagén erősebb subepitheliális festődését írták le a corneahegben. A dekorin és fibromodulin foltszerűen helyezkedett el a hám alatt, a biglikán a hámban és a stromában egyaránt expresszálódott. A lumikán erősen
24
festődött az epitheliumban, míg eloszlása a normál és az excimer lézerkezelt cornea stromájában nem mutatott különbséget. Az elmúlt évek kutatási eredményei alapján feltételezik az extracelluláris mátrix szerepének kiemelt jelentőségét a hám és a stroma regenerációja során. A jelátviteli folyamatok tanulmányozása révén új ismeretek tárulhatnak fel ezen a területen. Különösen fontos a sebgyógyulás lefolyását szabályozó gének kutatása, mivel a transzkripciós faktor funkciót betöltő gének identifikálásával érthetővé válhat a corneális sebgyógyulás mechanizmusa [40].
Az extracelluláris mátrix komponenseinek vizsgálata knockout egérmodellekben A proteoglikánok corneális kollagénszintézisben betöltött szerepének tisztázására heterozigóta
és
homozigóta
knockout
egérmodelleket
hoztak
létre
[58-61].
Megfigyelték, hogy a dekorin-, biglikán-, fibromodulin- és lumikán-null egerek közül kizárólag a homozigóta lumikán knockout egér corneája vesztette el transzparenciáját. Saika és kutatócsoportja által létrehozott modellben a hátsó stromában figyelték meg a kollagénrostok szabálytalan méretét és elrendeződését, továbbá az elhúzódó hámosodást az epithelium mechanikus eltávolítása után [42]. Párhuzamosan Chakravarti munkacsoportja [47, 60] is kifejlesztett egy lumikán gén knockout egérmodellt. Vizsgálataik során az egerek bőrének nyúlékonyságát mérték, mely szignifikánsan eltért a vad típusú kontroll állatok bőrének nyúlékonyságától. Megfigyeléseik szerint a knockout fenotípus emlékeztet az Ehler-Danlos szindróma bizonyos formáira. A homozigóta mutáns állatokon kétoldali cornea opacitást írtak le a születés utáni 4-5 héten. Mivel a corneájuk kezdetben tiszta volt, feltételezhető, hogy a lumikán nem játszik szerepet a cornea kialakulásának korai embrionális fázisában, viszont elengedhetetlenül szükséges a posztnatális érése során a megfelelő kollagénfelépítéshez. Transzmissziós elektronmikroszkóppal elemezve a bőrben és a corneában abnormálisan vastag kollagénrostokat találtak. A fibrillumok megfelelő
25
elrendeződése és az interfibrilláris rések hiánya szembetűnő volt. A szövettani vizsgálatok a szívbillentyűk kóros fejlődését is kimutatták. In vivo konfokális mikroszkópos vizsgálatok megerősítették az eredményeket [47]. Egy másik kutatócsoport megvizsgálta a lumikán hiányának hatását a sclerában. A homozigóta mutáns egerek vastagabb kollagénrostjai a sclerában a corneához hasonlóan szabálytalan lefutást mutattak. Az egerek szemének mérete megnövekedett, alakja megnyúlt. Chakravarti [58, 59] munkacsoportjának legújabb modellje egy lumikán-fibromodulin két génhiányos, „double null” egér. A mutáns állatok bulbus hossza szignifikánsan nagyobb, a szövettani vizsgálat a sclera elvékonyodását és helyenként a retina leválását mutatta ki. Ez a modell megfelel a myopiás fenotípus modelljének. Következésképp ezen proteoglikánok megváltozott expressziója vagy mutációja szerepet játszhat a myopia kialakulásában.
26
2.2.
A glükokortikoid receptor gén funkcionális polimorfizmusainak vizsgálata PRK után lokális szteroid készítményekkel kezelt betegcsoportban
A PRK kezelést követő posztoperatív kezelés része a lokális szteroid készítmények alkalmazása, mivel a glükokortikoidok dehidráló hatást fejtenek ki a cornea stromájában. E hatás segít megtartani a szaruhártya refraktív stabilitását, gátolja a stromális hegesedési folyamatokat, illetve a stroma visszavastagodását és a következményes refrakciós regressziót [29, 62-64]. A szteroidkezelés azonban mellékhatásokat is eredményezhet, elsősorban szemnyomásemelkedést.
A szteroid-indukált okuláris hipertenzió A
lokális
vagy szisztémás
megemelkedhet,
azonban
a
glükokortikoid szteroidra
kezelés
adott
hatására
válaszkészség
a
szemnyomás (glucocorticoid
responsiveness) illetve a mellékhatások megjelenésének gyakorisága és súlyossága tekintetében jelentős egyéni különbségek mutatkoznak. A szteroid-indukált okuláris hipertenzió kialakulásában szintén lényeges szerepet játszhatnak a genetikai faktorok. A glükokortikoidok iránti eltérő érzékenység hátterében már az 1960’-as években genetikai hatást feltételeztek [65-67]. A glükokortikoidok iránti érzékenység az átlagpopulációban háromféle formában nyilvánul meg: nonresponder, kifejezett szteroid responder (high steroid responder) illetve mérsékelt szteroid responder (moderate steroid responder) egyéneket különböztetünk meg. Az átlagpopuláció 4-6 %-ában 4-6 hetes lokális dexametazon kezelés után a szemnyomás 15 Hgmm-t meghaladóan vagy 31 Hgmm fölé emelkedik, ezek az egyének kifejezett szteroid responderek. A populáció további 30-33 % fordul elő 5 Hgmm-t meghaladó vagy 20 Hgmm fölé emelkedő IOP 46 hetes lokális glükokortikoid szemcseppkezelés után, ez a csoport a mérsékelt szteroid responder egyének csoportja [68]. A szteroid responder egyéneknél nagyobb a primer nyitott zugú glaucoma kialakulásának kockázata a nonresponderekkel összehasonlítva, mivel a primer nyitott zugú glaucomás szemek trabeculáris hálózata különösen érzékeny
27
a glükokortikoid hatásra [25]. A szteroid-indukált okuláris hipertenzió hátterében a myocylin gén érintettségét feltételezték, azonban a primer nyitott zugú glaucomás betegek mutációanalízise során csak az esetek 3-5%-ában találtak mutációt a myocylin génben, tehát a szteroid-indukált emelkedett szemnyomás egyéb okai még nem tisztázottak. További klinikai vizsgálatokban a szteroid-indukált okuláris hipertenzió gyakorisága egészséges egyénekben 4 hetes fluorometolon kezelés után kb. 7%, 4 hetes dexametazon vagy betametazon kezelés után 35-40% volt [63, 69]. A prednizolon acetát, hasonlóan a dexametazonhoz, nagy potenciállal vált ki okuláris hipertenziót [70].
A glükokortikoidok hatásmechanizmusa A glükokortikoid hormonok szabályozzák az immunrendszer és a gyulladásos folyamatok szignáltranszdukcióját, fontos szerepet játszanak a növekedésben és a fejlődésben. A szemben szintén celluláris és morfológiai változásokat váltanak ki a trabekuláris hálózatban: fokozzák az extracelluláris mártix szintézist, hatnak a sejtek és sejtmagok méretére, DNS tartalmára, a citoszkeleton szerkezetére, a fagocitotikus és a proteáz aktivitásra, amely hatások összeségében növelik az ellenállást, gátolhatják a csarnokvíz elfolyását és szemnyomásemelkedéshez vezetnek [25, 70-73]. A glükokortikoid hormonok a glükokortikoid és mineralokortikoid receptorokon keresztül fejtik ki hatásukat. Az emberi szemben a glükokortikoid és mineralokortikoid receptorok mRNS-ének expressziója speciális mintázatot mutat. A glükokortikoid receptor mRNS-e nagy mennyiségben mutatható ki a trabekuláris hálózatban és a lencse epitheliumban, amely magyarázatot ad a glükokortikoidok szemnyomásemelő és kataraktogén hatására [73, 74], valamint a cornea minden főbb sejttípusa expresszálja a glükokortikoid receptort [75]. A mineralokortikoid receptor mRNS expressziója kifejezett a non-pigmentált ciliáris epitheliumban, a cornea epitheliumában és endoteliumában [73, 74].
28
A glükokortikoid receptor A humán glükokortikoid receptor a nukleáris hormon-receptorcsalád tagja (Génbank hivatkozási szám: NM_000176, NT_029289), génje az 5. kromoszóma hosszú karján helyezkedik el (5q31-32.), 9 exonból áll, fehérjeterméke 777 aminosavból épül fel (OMIM 138040). A promoter régióban számos transzkripciós faktor kötőhelye megtalálható (pl. Sp-1, AP-1, YY 1, NF-kB), mely hozzájárulhat az ubiquiter GR nagyon eltérő sejt és szövetspecifikus expressziójának szabályozásához [76]. A GR szerkezete követi a hormonreceptor családra jellemző felépítést: karboxi-terminális végén a ligandkötő domén, középen a DNS-kötő domén, amino-terminális végén egy nem homológ, változó méretű szakasz helyezkedik el. E domének mediálják a hormonkötő, DNS-kötő és transzkripciót moduláló hatását [76, 77]. Az inaktív állapotú GR a citoszolban található különböző hősokkfehérjékkel (hsp90, hsp70, hsp56, hsp40) és egyéb fehérjékkel (pl. calreticulin, immunophilin p59) alkotott hetero-oligomer komplex részeként. A ligand kötődését követően konformációs változás következik be a GR szerkezetében, leválik a hősokkfehérjékről és homodimert alkot (8. Ábra).
8. Ábra A glükokortikoid receptor transzaktivációja
29
A hormon-receptor komplex a citoplazmából a sejtmagba vándorol, kötődik a DNS specifikus, glükokortikoidokra érzékeny, „válaszoló” szekvenciáihoz (glucocorticoid response elements) és transzkripciós faktorként illetve más transzkripciós faktorokkal való kölcsönhatás révén fejti ki génreguláló funkcióját (9. Ábra). A glükokortikoidok nemcsak a direkt DNS szabályozó régiókkal való genomiális interakció révén kontrollálhatják a target gének átíródását, hanem indirekt, más transzkripciós faktorokkal való kapcsolat, DNS kötődés nélküli non-genomiális kölcsönhatás révén is hatnak [78]. A non-genomiális kölcsönhatás létrejöhet továbbá a citoszolban található GR, a sejtmembránhoz kötött GR és a másodlagos jelátvivő molekulák interakciójaként [76].
9. Ábra A glükokortikoid hormonok transzkripciós faktorként kötődnek a DNS szál promoter régiójában elhelyezkedő glükokortikoidra specifikus szekvenciákhoz és szabályozzák a gének átíródását A gyógykezelés során alkalmazott glükokortikoidok genomiális és non-genomiális hatásainak aránya eltérő lehet, amely fontos terápiás következményt von maga után. Egy tanulmányban megfigyelték, hogy a dexametazon és a betametazon genomiális hatása erősebb és non-genomiális hatása gyengébb, míg a predniliden (16metilénprednizolon) viszonylag erősebb genomiális hatással rendelkezik [79]. Leírták továbbá, hogy a glükokortikoidok gyulladásgátló hatása nagyobb részt a génátíródás gátlásán keresztül, a kezeléssel összefüggő mellékhatások nagyrésze pedig a génátíródás aktiválásán keresztül jön létre [80].
30
A glükokortikoid receptor izoformái és klinikai jelentőségük A glükokortikoid receptor gén emberben számos izoformát kódol, legalább 16 monomer és 256 homo- és heterodimer receptor izoformát ismerünk. Ezek az izoformák különböző szövetekben különböző transzkripciós aktivitással rendelkeznek, különböző protein interakciókban vesznek részt és különböző target génekre hatnak [81], amely megmagyarázza a glükokortikoid hormonhatás rendkívüli komplexitását. Az izoformák eltérő transzkripciós aktivitása függhet a ligand kötéstől, a konformciós változásoktól, a chaperonokkal való kapcsolattól, egyéb transzkripciós faktoroktól és fehérjéktől [82]. A GR molekula szintézise során szinte minden lépésben különböző izoformák képződhetnek. A glükokortikoid receptorfehérjének két expressziós formáját vizsgálták legintenzívebben, a GRα és a GRβ izoformákat, melyek alternatív splicing útján képződnek. A két izoforma a karboxi-terminális szakaszon különbözik egymástól. A GRα hossza 777 aminosav, míg a GRβ izoforma hossza 742 aminosav. A GRα-ról kimutatták, hogy a DNS-en a specifikus glükokortikoid reszponzív regióhoz kötődik (glucocorticoid responsive element, GRE) és a glükokortikoid-reszponzív gének expresszióját befolyásolja, a GRβ izoformának nem tudták kimutatni sem a ligandkötő képességét, sem a génexpressziót moduláló hatását [83]. Feltételezik, hogy a GRβ izoforma domináns negatív hatást fejt ki az aktív GRα működésére. A GRβ expresszió növekedés következtében létrejött GRβ/GRα arány növekedésének a glükokortikoidok iránti rezisztencia kialakulásában szintén szerepe lehet [82, 84].
A glükokortikoid receptor gén egypontos polimorfizmusai Az egypontos polimorfizmusok (SNP) normális génszekvencia variánsok, melyek a populáció legalább 1%-ában előfordulnak, megváltoztathatják a fehérjék szerkezetét és funkcióját, ezáltal meghatározzák az egyén genetikai profilját, bizonyos betegségekre való hajlamát. A humán GR génben napjainkig 17 polimorfizmust írtak le, amelyek többsége az amino-terminális szakaszon helyezkedik el. A korábbi tanulmányok szerint e polimorfizmusok egyrésze összefüggést mutat bizonyos betegségekre hajlamosító elváltozásokkal vagy betegségekkel. Feltehetően a receptor működésében okozott enyhe változások állnak a megváltozott funkciók hátterében, mivel ezek a polimorfizmusok
31
megváltoztathatják a GR más fehérjékkel való interakcióit, s ez a mechanizmus magyarázhatja a szteroidkezelésre adott eltérő válaszokat (steroid responsiveness) és a mellékhatások megjelenésének különbözőségét. Az általunk vizsgált funkcionális génvariánsok génen belüli elhelyezkedését a 10. Ábra mutatja.
10. Ábra A glükokortikoid receptor génszerkezetének sematikus ábrája a vizsgált polimorfizmusokkal Az SNP-k kaukázusi populációban leírt allélfrekvenciáit a 2. Táblázat foglalja össze. 2. Táblázat A GR vizsgált polimorfizmusainak allélfrekvenciája normál kaukázusi populációban Polimorfizmus
Allél
Allélfrekvencia a kaukázusi populációban
N363S
G
2,1%-8,3% *
Bcl I
G
25,7-49,2% [85, 86]
ER22/23EK
A
1,3-3% *
* Ensembl Genome Browser SNPView Database (www.ensembl.org) Több tanulmányban megfigyelték az aszparagin/szerin cserét okozó génvariáns (Asn363Ser vagy más jelöléssel N363S) ill. a Bcl I polimorfizmusok asszociációját a glükokortikoid hormon receptor iránti szenzitivitásának növekedésében, tehát mindkét polimorfizmust megnövekedett glükokortikoid érzékenységgel hozták összefüggésbe [86-90]. A ER22/23EK polimorfizmus a glükokortikoidok iránti érzékenység csökkenésével vagy relatív glükokortikoid rezisztenciával áll összefüggésben [88, 9093]. Számos közlemény foglalkozott endokrinológiai, kardiovaszkuláris és anyagcsere
32
szempontból e három polimorfizmussal, de szemészeti vonatkozásaik még nem ismertek. Az N363S polimorfizmus A
2.
exonban
elhelyezkedő,
nonszinonim
aminosavcseréhez
vezető
N363S
polimorfizmus a nukleotid szekvencia 1220. poziciójában található (rs6195). A normál (vad) típusú szekvencia, AAT, aszparagint (Asp, N), míg a mutáns szekvencia, AGT, szerint (Ser, S) kódol. A génvariáns molekuláris hatásmechanizmusa még ismeretlen, de feltételezhetően egy új foszforilációs helyet hoz létre, amely megváltoztathatja a transzkripciós kofaktorok közti fehérje interakciókat [87, 88]. A szerin aminosavat tartalmazó polimorf allél gyakorisága a kaukázusi népességben 2,1-8,3 % körüli, homozigóta formában európai populációban még nem írták le. A polimorf allél előfordulása rasszokon belüll is nagy eltérést mutat, például a japán populációban ez a génvariáns nem fordul elő [94]. A korábbi tanulmányok kimutatták, hogy kis adag dexametazon adását követően a plazma kortizolszint csökkenésének mértéke szignifikánsan nagyobb a génvariánst hordozó egészségesekben [88, 91]. A polimorfizmust hordozó GR transzaktivációs képességének fokozódását transzfektált sejteken végzett in vitro és N363S hordozó egyének fehérvérsejtjein végzett ex vivo vizsgálatokkal is kimutatták [92]. Az N363S génvariánst hordozók vizsgálata során számos klinikai összefüggést találtak: a szívkoszorúér betegségben szenvedő hordozóknál magasabb szérum koleszterin és triglicerid szinteket és alacsonyabb HDLkoleszterin szinteket mértek [95]. Számos tanulmányban leírták a magas BMI értékkel és/vagy a centrális típusú zsírfelhalmozódást jelző derék/csípő aránnyal való összefüggését. A metabolikus változások a megnövekedett glükokortikoid hatással magyarázhatóak [88, 91, 96, 97]. A Bcl I polimorfizmus A Bcl I polimorfizmus a 2. intron 647. (IVS2+647) nukleotidját érintő C/G szubsztitúció, amely egy restrikciós enzimhasítóhelyet változtat meg és nevét a kimutatásához használt hasító enzimről kapta. A Bcl I polimorfizmus a GR glükokortikoidok iránti hiperszenzitivitását befolyásolhatja [86, 90]. A G allél frekvenciája kaukázusi populációban 25,7- 49,2% [85, 86, 97]. A polimorfizmust hordozó homozigótákban a budenozid iránti szenzitivitás fokozódását figyelték meg
33
[93]. Összefüggést mutattak ki a G allél előfordulása és a dexametazon iránti fokozott érzékenység között [90]. A Bcl I polimorfizmust homozigóta formában hordozók fehérvérsejtjeivel végzett in vitro vizsgálatokban azonban nem sikerült bizonyítani a dexametazon iránti érzékenység szignifikáns növekedését [93]. Ezt feltehetően magyarázhatja, hogy a Bcl I génvariáns szövetspecifikus módon hat a glükokortikoidok iránti
érzékenységre.
vizsgálatok
A
eredményei
polimorfizmus közül
a
klinikai
BMI-vel
összefüggéseivel
kapcsolatos
kapcsolatos
eredmények
részben
ellentmondásosak. A G allél hordozását összefüggésbe hozták a centrális típusú illetve a generalizált elhízással, a homozigóta jelleget az esszenciális hipertóniával [90, 97-99]. Az ER22/23EK polimorfizmus A 2. exonban elhelyezkedő ER22/23EK polimorfizmust (rs6189, rs6190) egy szinonim és egy nonszinonim génvariáns alkotja. A 22. kodon GAG szekvenciája helyett GAA áll, de mindkettő a glutamát aminosavat kódolja (Glu, E). A 23. kodonban az AGG nukleotid triplet AAG-ra változik, így az arginin (Arg, R) helyett lizint (Lys, K) kódol [87]. Korábbi in vivo és in vitro tanulmányokban megfigyelték, hogy az ER22/23EK génvariáns a relatív glükokortikoid rezisztenciával és egy előnyös metabolikus profilú és hosszú életkilátással rendelkező fenotípussal mutatott összefüggést. Az ER22/23EK feltehetően megváltoztatja a GR mRNS-ének másodlagos szerkezetét, melynek következtében csökkenhet a transzkripciós aktivitás [5, 89, 92, 100, 101]. A génvariáns allélfrekvenciája a kaukázusi populációban 1,3-3% [91, 92, 97]. A polimorfizmust hordozó egyénekben dexametazon adását követően kismértékű plazma kortizolszint csökkenést figyeltek meg [100]. Transzfektált sejteken végzett in vivo és a génvariánst hordozó egyének fehérvérsejtjein végzett ex vivo vizsgálatokban megfigyelték, hogy az ER22/23EK polimorfizmust hordozó receptor transzaktivációs képessége csökkent, míg a polimorfizmus jelenléte a transzrepressziós képességet nem befolyásolta [92]. A génvariáns klinikai összefüggéseiről még kevés adat áll rendelkezésre, azonban a génvariánst
hordozó
heterozigóta
egészséges
idősekben
alacsonyabb
éhomi
vércukorszintet, inzulinszintet és koleszterinszintet, valamint alacsonyabb LDLkoleszterinszintet mértek [100]. A polimorfizmust hordozó fiatal férfiakban nagyobb izomerőt és testmagasságot, míg idősebb férfiakban hosszabb élettartamot figyeltek meg, tehát összességében egy kedvezőbb metabolikus állapot jellemzi az ER22/23EK polimorfizmust hordozókat [5, 97].
34
Célkitűzések Kutatásunk során az autoszomális domináns öröklődésű kongenitális stacioner farkasvakság
genetikai
okát,
valamint
a
kóros
corneális
homályképződés
patomechanizmusában szereplő jelölt gének, a lumikán és keratokán gének genetikai eltéréseit, illetve a szteroid-indukált okuláris hipertenzió és a glükokortikoid receptor funkcionális gén polimorfizmusainak összefüggését vizsgáltuk. Tanulmányainkban az alábbi kérdések megválaszolását tűztük ki célul: 1. a, Az ismert autoszomális domináns retinitis pigmentosa és adCSNB-t okozó gének közül mely gén patogén mutációja áll a kongenitális stacioner farkasvakságban szenvedő dán család betegségének hátterében? b, Milyen funkcionális hatással bírhat az újonnan leírt mutáció az autoszomális domináns farkasvakság patomechanizmusában?
2.1. a, A kóros corneális homályképződés patomechanizmusában knockout egérmodellek eredményei alapján feltételezett lumikán géndefektus jelenléte bizonyítható-e a PRK-val kezelt betegcsoportban? b, Szerepet játszhatnak-e egy további jelölt gén, a keratokán gén csírasejtes mutációi a kóros corneális homály kialakulásában?
2.2 a, Milyen allélfrekvenciával fordul elő a GR N363S, Bcl I és ER22/23EK polimorfizmusa az általunk vizsgált PRK-val kezelt betegcsoportban? b, Van-e összefüggés a szteroid-indukált okuláris hipertenzió kialakulása és a glükokortikoid receptor gén három funkcionális polimorfizmusának – N363S, Bcl I, ER22/23EK - előfordulása között a PRK után lokális fluorometolon (0.1%) készítménnyel kezelt betegcsoportban?
35
c, Van-e összefüggés a szteroid-indukált okuláris hipertenzió kialakulása és a glükokortikoid receptor gén három funkcionális polimorfizmusának – N363S, Bcl I, ER22/23EK - előfordulása között a PRK után lokális prednizolon acetát (0.5%) készítménnyel kezelt betegcsoportban?
36
Betegek és módszer A veleszületett stacioner nyctalopia betegségokozó mutációjának keresése Betegcsoport kiválasztása A vizsgálat a Hamburg-Eppendorf Egyetem Humángenetikai Intézetében történt egy féléves tanulmányút keretében. Munkánk során egy 3 generációs dán család DNS mintáit vizsgáltuk, amelyben 9 családtag farkasvakságban szenvedett kora gyermekkora óta. A családfa rajzolása során a farkasvakság megléte vagy hiánya lett figyelembe véve (11. Ábra). Minden vizsgált személy írásos beleegyezését adta a genetikai vizsgálathoz.
11. Ábra. Az adCSNB-ben szenvedő 3 generációs dán család családfája
Klinikai vizsgálatok A betegek klinikai vizsgálatát Dr. Thomas Rosenberg végezte a dán Csökkentlátók Nemzeti Szemklinikáján, Hellerupban, először 1986-ban (National Eye Clinic for the Visually Impaired, Hellerup, Dánia). Elsőként egy 59 éves férfibeteg jelentkezett (II:2), akinél látótércsökkenést, farkasvakságot és a szemfenék perifériáján pigmentrögöket figyeltek meg. A kiterjesztett ERG vizsgálat bizonyította, hogy retinitis pigmentosában
37
szenved. A beteg elmondta, hogy lánya és fiúunokája, valamint családjában számos nő és férfirokon szenved farkasvakságban koragyermekkortól kezdve. A standard szemészeti vizsgálaton kívül Goldmann látótér vizsgálat, színlátás vizsgálat (Ishihara, American Optical Hand-Hardy-Rittler, Farnsworth D-15 teszt, Nagel anomaloszkópia), és Ganzfeld ERG vizsgálat (ISCERG ajánlás szerint) történt a család érintett tagjain. A betegek fenotípusos megjelenése jellemző a CSNB-re, a látóélességük, a látótérük és a színlátásuk normális volt. A fundusképen retina degenerációra utaló jel nem volt. Az ERG vizsgálat során Riggs-típusú hiányzó pálcikaválaszt és szubnormális csapválaszt figyeltek meg.
Molekuláris genetikai vizsgálatok DNS izolálás Kilenc betegtől, 2 egészséges személytől és 3 házastárstól vettek vénás vért. Az EDTAstabilizált vérminták feldolgozása DNS izolálás céljából a Hamburg-Eppendorf Egyetem Humángenetikai Intézetében történt egy kit segítségével a gyártó által leírt protokoll szerint (Qiagen DNA Isolation Kit). A DNS mintákat a felhasználásig -20ºCon tárolták 1x Tris-EDTA oldatban.
Két pontos kapcsoltsági analízis (two-points linkage analysis) A kutatás során először a betegséget okozó gén körülbelüli helyét kerestük a kromoszómákon,
ismert
mikroszatellita
kromoszómamarkerek
segítégével.
A
mikroszatellita markerek 1-6 bp hosszú tandemismétlődések, melyek gyakran az intronokban helyezkednek el és szegregálnak bizonyos tulajdonságokkal, allélokkal. Minél közelebb van egy marker egy génhez, annál valószínűbb, hogy a rekombináció során együtt öröklődnek. Ezért, mintegy zászlóként, jelöli a marker a betegségokozó gén helyét a genomban, így a kapcsoltsági vizsgálatokban egy mikroszatellita markerlókusz és egy génlokusz szoros kapcsoltságát keressük. A kapcsoltsági vizsgálat alapja a rekombináció, értékelése statisztikai módszerekkel történik. A rekombináció a csírasejtekben megy végbe, amikor az apai és anyai kromoszómák páronként kicserélik bizonyos DNS szakaszaikat (crossing over). Így egy
38
többgenerációs családban feltérképezhető a szegregáció alapján, hogy egy adott marker mely allélját hordozzák a betegek és melyet az egészséges családtagok. Az analízis során meghatározott Θ értékekhez (általában 0.00, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4) tartozó valószínűségeket számoljuk ki (12. Ábra). Α rekombinációs frakció tízes alapú logaritmusa a LOD-érték (LOD-score). Ezen értékeket egy vizsgált családon belül számoljuk ki a fenotípusos jellemzők figyelembe vételével.
12. Ábra. A centromerhez közeli lókuszok nagy valószínűséggel nem rekombinálódnak (Θ=0.00), a távolabbi génlókuszok rekombinációs gyakorisága nő, a telomer irányába haladva egyre nagyobb a valószínűsége a szabad rekombináció bekövetkezésének (Θ=0.50).
A +3 feletti maximális LOD-értéknél beszélünk kapcsoltságról, mivel annak a valószínűsége, hogy rekombináció következett be 1:1000. A +2 körüli LOD érték esetén a valószínűség, hogy rekombináció történt 1:100. A -2 alatti LOD érték pedig a két lókusz közötti kapcsoltság kizárását jelenti. Minél alacsonyabb Θ értékhez tartozik a maximális LOD-érték, a kapcsoltság annál nagyobb fokú, annál közelebb helyezkedik el a keresett gén az adott markerhez. Az 1%-os rekombinációs gyakoriság (Θ=0.01) körülbelül 1 cM vagy 1000 bp távolságnak felel meg a kromoszómán. Legnagyobb fokú kapcsoltság Θ=0.00 esetén áll fenn, míg a Θ=0.50 a szabad rekombinációt jelenti (12. Ábra).
39
Polimeráz láncreakció és genotipizálás
Kutatásunk első lépéseként minden ismert autoszomális domináns retinitis pigmentosa és adCSNB génlókuszt megvizsgáltunk mikroszatellita markerekkel, melyek 5Mb-nál kisebb távolságra helyezkedtek el az ismert génlókuszoktól. A vizsgált gének, kromoszóma lokalizációjuk, 5 Mb távolságon belüli mikroszatellita markerük a fluoreszcens festék típusának megjelölésével a 3. Táblázatban láthatóak. Feltüntettük továbbá a PCR termékek hosszát és a vizsgált markerek lokalizációját a Marshfield térkép szerint cM-ban és az NCBI Sequence térképe szerint bázispárban kifejezve. 3. Táblázat. A vizsgált gének és mikroszatellita markereik összefoglaló táblázata Gén
Kromoszóma
Mikroszatellita
PCR
marker (festék)
termékhossz
Marker lokalizációja cM bp
(Marshfield)
CRX
19q13.3
D19S902 (FAM)
199-217 bp
53023869
72,72
PRPF31
19q13.4
D19S180 (HEX)
148 p-166 bp
50791605
87,66
CA4
17q23.2
D17S787 (TET)
138-166 bp
50637083
74,99
FSCN2
17q25.3
D17S928 (TET)
135-165 bp
77846169
126,46
PRPF8
17p13.3
D17S849 (TET)
251-261 bp
379301
0,63
NRL
14q11.2
D14S275 (FAM)
194-205 bp
25766620
28,01
RP1
8q12.1
D8S285 (NED)
317-333 bp
57229625
71
RP9
7p14.3
D7S484 (FAM)
102-120 bp
35058147
53,5
IMPDH1
7q32.1
D7S530 (HEX)
109-127 bp
128216770
134,55
PDE6B
4p16.3
D4S412 (HEX)
161-179 bp
3417750
4,74
RHO
3q22.1
D3S1263 (NED)
194-214 bp
11492252
36,1
GNAT1
3p21
D3S1289 (NED)
206-226 bp
54454520
71,41
PRPF3
1q21.2
D1S498 (TET)
182-204 bp
148114637
155,89
40
Hat beteg családtag DNS-ének mikroszatellita markerrégióit amplifikáltuk polimeráz láncreakció révén egy automata PCR készülékben (MJ Research PTC 100 ThermoCycler, Waltham, USA). Az amplifikációhoz speciális, négyféle fluoreszcens festékekkel (TET, FAM, HEX, NED) jelölt markerprimereket használtunk (Applied Biosystems, Linkage Mapping Set v2.5). A PCR során ~50ng genomiális DNS-t alkalmaztunk, a reakcióelegy a következő összetevőket tartalmazta 25µl végtérfogatban: 1µl DNS, 2.5µl 10X puffer (Qiagen Reaction Buffer, pH 8.5, 1.5 mM MgCl, Qiagen, Hilden, Németország), 1µl fluoreszcens festékkel jelölt primermix (Linkage Mapping Set v2.5, Applied Biosystems, Forster City, USA), 0.2 mmol/l minden dNTP-ből (dNTP Set, Qiagen, Hilden, Németország), 2.5 U Taq polimeráz enzim (Qiagen Taq Polymerase, Qiagen, Hilden, Németország) és 20µl desztillált víz. A PCR program változó annealing hőmérséklettel történt („touch down” módszer): a kezdeti denaturációs lépés után az első 10 ciklusban az annealing hőmérséklet 56°C, a következő 15 ciklusban 53˚C, majd a következő 20 ciklusban 51˚C volt, a végső extenzió szintén 72°C-on 10 percig tartott. A PCR termékeket agaróz gélen (2%) megfuttatva ellenőriztük a PCR sikerességét, a csíkok erősségétől függően 0.5-1.0µl PCR termékhez 20µl puffert adtunk a genotipizálás elvégézéséhez, amely egy automata DNS szekvenáló készüléken történt (ABI PRISM 310 Automated DNA Sequencer, Applied Biosystems, Forster City, USA). A TET, HEX és FAM festékkel jelölt PCR amplikonokat TAMRA pufferben, a NED festékkel jelölt termékeket ROX pufferben futtattuk. Az amplikonokat méret alapján a GENESCAN 3.1.2 programcsomag segítségével identifikáltuk (13. Ábra).
41
13. Ábra. A GENESCAN program segítségével identifikált regisztrátumok mutatják a mikroszatellita markerek eltérő hosszát.
Genotípus elemzés és statisztikai analízis A markerrégiók eltérő nagyságú PCR fragmentjei a dinukleotid ismétlődések száma szerint megkülönböztethetőek. A családfán elemezve egy adott marker különböző variánsainak előfordulását a családon belül, a legtöbb esetben az apai, illetve anyai markerallélek elkülöníthetők és a beteg fenotípus összevetésével a kapcsoltság eleve kizárható. Példaként a rodopszin gén D3S1263 mikroszatellita markerének analízisét mutatom be (14. Ábra). A markernek 5 változata van, 5 különböző hosszúságú PCR termék keletkezett, melyet a GENESCAN 3.1.2. szoftverrel elemezve 5 különböző csúcsként értékeltünk, és megszámoztuk őket 1-től 5-ig. A családfára felrajzolva a genotípusokat, látható, hogy a betegek nem hordoznak közös allélt, az egyik családfélben (II:2, III:2, IV:1) a 3-as variáns, a másik családfélben (II:3, III:4, III:6) a 4es variáns azonos, így a marker és a betegségokozó gén kapcsoltsága kizárható.
42
14. Ábra. A rodopszin génhez közel fekvő D3S1263 mikroszatellita marker variánsai (kék számokkal jelölve), melyek a 6 beteg családtag genotípusát mutatják. Nehézséget jelentett, ha több családtag homozigóta volt egy adott marker alléljaira nézve, illetve a kapcsoltság egyértelműen nem volt kizárható, ilyen esetben elvégeztük a két-pontos kapcsoltsági analízist és kiszámoltuk a LOD értéket, melyhez az MLINK programcsomagot használtuk [102, 103].
A jelölt GNAT1 gén mutációanalízise A jelölt GNAT1 gén mutációanalízise során beteg családtagok DNS mintáit használva PCR-t és automata szekvenálást végeztünk. A gén 9 exonjának szekvenciáját az Ensembl Genome Browser génbankjából (www.ensembl.org) töltöttük le, majd a Primer3 interneten elérhető szoftver segítségével primereket terveztünk a proteinkódoló exonokra
(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi.).
A
tervezett
primerek lefedték a GNAT1 gén 1-8. exonjait az exon-intron junctiókkal együtt. A primerek specificitását a BLAST program (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) segítségével ellenőriztük. GNAT1 gén amplifikálásához használt primerszekvenciákat, az alkalmazott annealing hőmérsékleteket és a termékhosszokat a 4. Táblázat fogalja össze. A PCR reakcióelegy összetétele a következő volt: 2µl DNS, 2.5µl 10X puffer (Qiagen Reaction Buffer, pH 8.5, 1.5 mM MgCl, Qiagen, Németország), 25 pmol forward primer és ugyanennyi reverse primer (Invitrogen Life Technologies, Glasgow, 43
United Kingdom), 0.2 mmol/l minden dNTP-ből (Qiagen, Németország), 2.5 U Taq polimeráz enzim (Qiagen Taq Polymerase, Qiagen, Németország) és 18.9µl desztillált víz 25µl végtérfogatban. A GNAT1 gén amplifikálásához szintén az úgynevezett „touch down” PCR programot használtuk 3 lépésben csökkenő annealing hőmérséklettel: kezdeti 2 perces denaturáció 95˚C-on, az első 10 ciklusban az annealing hőmérséklet 62/60˚C, a következő 15 ciklusban 60/58˚C, majd a következő 20 ciklusban 58/56˚C volt, a végső extenzió 72˚Con zajlott 10 percig. 4. Táblázat A GNAT1 gén mutációanalízise során alkalmazott primerek, annealing hőmérsékletük és a keletkező PCR termékek hossza Forward primer
Reverse primer
Anneling
Termék-
(5’-3’)
(5’-3’)
hőmérséklet
hossz
Exon 1.
ctgattggctcttggacacc
gggaatccttgcttcacaga
62-60-58 ˚C
390 bp
Exon 2+3.
gtcctcctggcctccttg
gggtgagagtggctggtg
62-60-58 ˚C
434 bp
Exon 4+5.
tgaccacactcaacatccagt
agggtctatcgcagggatg
62-60-58 ˚C
597 bp
Exon 6.
ccagcagaaagggtggtagt
gttcagcaggcccatctg
60-58-56 ˚C
394 bp
Exon 7+8.
gagcccagagagcaggtg
ctggggtattgaggcaagag
62-60-58 ˚C
566 bp
A PCR termékeket 2 %-os ethidium bromid-tartalmú agaróz gélben futtattuk, majd az elektroforézist követően transzilluminátorral detektáltuk és dokumentáltuk. A PCR termékek NaHO3–mal és etanollal való tisztítása után szekvenálás történt BigDye Terminator Cycle-Sequencing v3.1 Kit felhasználásával poliakrilamid gélen az ABI PRISM® 377 Genetic Analyzer készüléken (Perkin Elmer™, Applied Biosystems, Forster City USA). A feltételezett új nukleotid eltéréseket, két egymástól független módszerrel kell bizonyítani. Ezért a szekvenálás mellett az RFLP módszerét is alkalmaztuk a mutációanalízis során. Az RFLP egy viszonylag egyszerű és költséghatékony módszer, amennyiben a keresett nukleotiddal szomszédos hasítási helyű restrikciós enzimet sikerül találni. Ha egy nukleotideltérés egy restrikciós enzim hasítási helyének
44
elvesztését okozza vagy új hasítási helyet hoz létre, a PCR termékek eltérő hosszúságú fragmentekké darabolódnak a restrikciós enzimmel való emésztés közben. Az eredmény agaróz gélen detektálható. Az új mutáció verifikálásához a Tse I enzimet (New England Biolabs, Beverly, USA) használtuk, mivel a C/G csere az enzim restrikciós helyének elvesztéséhez vezetett. Az enzim felismerési szekvenciája: 5’-G^CWGC-3’, ahol a W adenint vagy timint jelent. A gyártó által leírt protokoll szerint 3 órán keresztül 65˚C emésztettük a PCR termékeket. A 20 µl végtérfogatú reakcióelegy a következő összetevőket tartalmazta: 12 µl PCR termék, 2 µl puffer, 5 µl desztillált víz és 1 µl (3 U) Tse I enzim. A 6. exon 394 bp hosszú PCR termékén a normál allél kettő Tse I restrikciós hasítóhellyel rendelkezik, így 3 fragment keletkezik a hasítás során: egy 111, 128 és egy 155 bp hosszú fragment. A mutáns allél PCR termékén a restrikciós hely megváltozása miatt 1 ponton hasít a Tse I enzim, ezért egy 283 bp hosszú és egy 111 bp hosszú fragment keletkezik. Egy új, feltételezett mutáció esetén ellenőrizni kell az nukleotidváltozás előfordulási frekvenciáját. Legalább 50 nem rokon, egészséges kontroll személy vizsgálata szükséges. Amennyiben csak a betegekben fordul elő az adott mutáció, az eredmény megerősíti a mutáció betegséget okozó szerepét. Vizsgálatunkban 52 nem rokon, egészséges kontroll személy GNAT1 génjének 6. exonját vizsgáltuk a fent ismertetett PCR amplifikáció és Tse I restrikciós enzimes hasítás módszerével.
A mutáns fehérje molekuláris modellezése A transzducin fehérje korábban leközölt röntgenkrisztallográfiás szerkezetéből kiindulva [3] a SWISS-Model program http://swissmodel.expasy.org. segítségével elkészítettük a mutáns fehérje molekuláris modelljét. A modellezéshez egyrészt a transzducin/Gαi-chimera és a PDE-β, RGS9 illetve a GDP.AlF4-
által alkotott
komplex, másrészt az izolált transzducin/GDP.AlF4- -komplex szolgált alapul. A fehérjék 3 dimenziós struktúráját a PDBviewer szoftver segítségével tettük láthatóvá.
45
A
fotorefraktív
keratektomiát
követő
corneális
sebgyógyulás
molekuláris genetikai hátterének vizsgálata Betegcsoport kiválasztása A Semmelweis Egyetem I. Szemészeti Klinikáján 1994 és 2002 között excimer lézeres fotorefraktív keratektomiával (Mel 70, Zeiss Meditec, Jena, Németország) kezelt betegek közül azokat vizsgáltuk, akiknél kóros corneális sebgyógyulást észleltünk és a corneahomály mértéke Hanna szerint ≥1,0 volt 1 évvel a műtét után [37]. A tanulmányban 7 férfi és 3 nőbeteg vett részt (közülük 2 nőbeteg egy testvérpár volt), átlagéletkoruk 33,3 év (18-45 év) volt. Átlagos preoperatív fénytörési hibájuk -8,5±2,3D SE (- 4,75 – - 14,0 D SE), az átlagos fotoablációs mélység 88,94±18,64 µm (56-130 µm) volt. A fotorefraktív beavatkozás célja minden esetben az emmetropia elérése volt. A betegcsoport klinikai jellemzőit az 5. Táblázat foglalja össze. A műtét után a corneális reepitelizáció minden beteg esetében normális lefolyású volt. Minden beteg azonos posztoperatív kezelésben részesült: naponta 5 alkalommal 5 napig ciprofloxacin (0,3 %) szemcseppet, majd csökkenő dózisban fluorometolon (0,1%) szemcseppet használtak 3-5 hónapig. A vizsgálatban résztvevők kitöltöttek egy kérdőívet, amely alapján kizárható volt a korábbi és a családi anamnézisben szereplő kóros vagy elhúzódó sebgyógyulás bőrsebek esetén, kötőszöveti betegségek, autoimmun kórképek és egyéb betegségek előfordulása. A betegek szubjektív panaszait szintén rögzítettük. Kontrollként két, PRK műtéttel kezelt myopiás (fénytörési hibájuk: -8,0 D SE, és -6,5D SE), normális corneális sebgyógyulást mutató páciens véréből származó DNS-t vizsgáltunk. A vizsgálatok az Egészségügyi Tudományos Tanács Tudományos és Kutatásetikai Bizottsága által engedélyezett kutatási terv alapján, a Helsinki Deklarációnak megfelelően folytak. Valamennyi résztvevő írásbeli beleegyező nyilatkozatot írt alá a részletes tájékoztatás után.
46
5. Táblázat A vizsgálatban résztvevő betegek klinikai adatai Kor
Nem
(évek) 1
45
Ffi
Fotoablációs
Preoperatív
Haze
Haze Haze
Haze
mélység (µm)
refrakció (SE)
1 hó
3 hó
6 hó
12 hó
78
- 6,5
2,0
2,0
1,5
1,0
56
- 4,75
2,0
2,0
1,5
1,0
2
18
Ffi
82
- 9,0
0,75
3,0
1,5
1,5
3
44
Ffi
104
- 8,875
0,25
2,5
2,0
1,5
4
36
Ffi
72
- 8,0
1,0
1,0
1,5
1,0
88
- 10,0
1,5
1,0
1,5
1,0
100
- 9,0
1,0
1,0
1,0
1,0
100
- 9,25
1,0
1,0
1,0
1,0
79
- 6,0
0,75
2,0
2,0
1,0
89
- 6,375
0,75
1,0
1,5
1,0
5 6
24 37
Ffi Nő
7
39
Ffi
128
- 14,0
0,25
1,5
1,25
2,0
8
28
Ffi
89
- 10,0
0,25
1,5
1,0
1,0
57
- 5,0
0,25
1,0
1,0
1,0
130
- 12,125
0
1,0
2,0
1,5
130
- 14,375
0
1,0
2,0
2,0
60
- 5,5
0,5
0,75
1,0
1,0
70
- 6,875
0,5
0,75
1,5
1,0
88,94 ± 18,64
- 8,5 ± 2,3
9 10
21 41
Átlag
33,3
±SD
±8,44
Nő Nő
Az 5. Táblázat az alábbi adatokat foglalja össze: kor, nem, fotoablációs mélység, preoperatív fénytörési hiba és a corneális subepiteliális progressziója a posztoperatív első év során. A 2., 3., és 7. jelölésű betegek esetében unilaterális fotorefraktív keratektomia történt.
Klinikai vizsgálatok A pre- és posztoperatív klinikai vizsgálatok a Semmelweis Egyetem I. Szemészeti Klinikájának Excimer Lézer Szakambulanciáján történtek, magukba foglalták a nyers és
47
korrigált látásélesség, a szemnyomás, a cornea topographia (TMS-1, Tomey, Cambridge, MA), és a cornea vastagság meghatározását ultrahangos pachyméterrel (Humphrey Model 855, Carl Zeiss, Oberkochen, Németország), valamint a biomikroszkópos vizsgálatot (Haag-Streit réslámpa, Németország). A corneális subepitheliális homály mértékét egyazon vizsgáló orvos határozta meg a Hanna által leírt beosztás szerint [37]. Vizsgálatok in vivo confocalis mikroszkópiával In vivo confocalis mikroszkópiás vizsgálatot végeztünk 13 szemen a kóros corneális subepitheliális homállyal rendelkező betegek körében, akik a vizsgálat időpontjában elérhetőek voltak, továbbá 6 PRK-val kezelt, de corneális haze nélkül gyógyuló szemen és 5 nem kezelt, egészséges, kontroll szemen, akiknél szemészeti gyulladás és kontalencseviselés nem szerepelt az anamnézisben. Vizsgálatainkat in vivo scanning slit confocalis cornea mikroszkóppal (Confoscan 3, NIDEK Technologies, Gamagori, Japán), 40X/NA=0.75 immerziós objektívvel (Achroplan, Zeiss, Oberkochen, Germany) végeztük. Minden kép egy megközelítőleg 300 x 200 µm nagyságú coronális metszetet ábrázolt, és a gyártó adatai szerint az optikai szeletelés (z-tengely) effektív mélységfelbontása 10 µm volt a fenti objektívvel. A szaruhártya rétegeiről készített képeken elvégeztük a sejtek méretének, alakjának mérését, a fényszórás és a depozitumok reflektivitásának vizsgálatát. Az endothelsejtek számolása manuálisan történt minden területen 3 alkalommal, majd az átlagértéket vettük figyelembe a további analízis elvégzésénél. A sejtszámolás során a kereten túlérő sejteket csak a kiválasztott terület két oldalán számoltuk bele. Az endothelsejtek denzitását az egységnyi felületen előforduló sejtek számával adtuk meg (sejt/mm2). A PRK-val kezelt és az egészséges kontroll szemek endothelsejtszámát egy-mintás t-próbával hasonlítottuk össze, p<0.05 értéket tartottuk statisztikailag szignifikánsnak 95%-os konfidencia intervallum mellett.
Molekuláris genetikai vizsgálatok DNS izolálás és primertervezés A Semmelweis Egyetem I. Szemészeti Klinikájának Genetikai laboratóriumában a levett perifériás vér leukocytáiból genomiális DNS-t izoláltunk kereskedelmi
48
forgalomban elérhető kit segítségével (Wizard Genomic DNA Purification Kit, Promega, Madison WI, USA). A DNS-t a felhasználásig -20ºC-on tároltuk 1x TrisEDTA oldatban. A jelölt gének szekvenciáit a National Center for Biotechnology Information (NCBI) génbankjából (www.ncbi.nlm.nih.gov) töltöttük le, majd a lumikán gén vizsgálatához a Primer3
interneten
elérhető
szoftver
segítségével
(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi.).
primereket A
tervezett
terveztünk primerek
lefedték a lumikán gén teljes 5’-át nem íródó régióját, az 1., 2., 3. exonokat az exonintron junctiókkal együtt és a 3’-át nem íródó régió 197 bp hosszú szakaszát. A keratokán gén esetében irodalomban közölt [104] illetve általunk módosított primereket használtunk. A módosítás mindig csak a primerpár egyikén történt egy 40 bázispár hosszú GC-gazdag véggel másnéven „GC-clamp”-pel, melynek szekvenciája forward primer esetén: •
5'-GCG GCC GCC GCG TCC CGC CGC CCC CGC CCC GCC GCG GCC G3';
reverse primer esetén: •
5'-CGG CCG CGG CGG GGC GGG GGC GGC GGG ACG CGG CGG CCG C-3'.
A GC-véggel való módosításra azért volt szükség, hogy a poliakrilamid-gélen történő heteroduplex analízis során kedvezően változzon az amplikon olvadási profilja. A használt primerek lefedik a keratokán gén teljes 5’-át nem íródó régióját, az 1., 2., 3. exonokat az átérő intronszakaszakokkal és a 3’-át nem íródó régió 161 bp hosszú szakaszát. A lumikán és keratokán gének amplifikálásához használt primerszekvenciákat a 6/A és 6/B Táblázatok foglalják össze. A primerek specificitását a BLAST program (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) segítségével ellenőriztük. A templát szekvencia NCBI Genbank hivatkozási száma: LUM: NM_002345.3, KERA: NM_007035.3.
49
6/A Táblázat A vizsgált gének fragmentjeinek amplifikálásához használt primer szekvenciák, génszakasz rövidítések, annealing hőmérséklet és a fragmentek mérete Fragment
Primer 5'- 3'
Annealing
Fragmenthossz
hőmérséklet LUM exon 1 F
ctt tct ccc cac gtt cac ct
LUM exon 1 R
att ggc aaa att gct ctg ga
LUM exon 2.1 F
atg ttg caa att gaa tgt ctt
LUM exon 2.1 R
ccc ttt tat ctt gga gtt ttc ta
LUM exon 2.2 F
aag gcc ttt gag aat gta act g
LUM exon 2.2 R
tgt tgc tga tct tat tgt tgt c
LUM exon 2.3 F
ctg cct tct ggt ctc cct gtc tct
LUM exon 2.3 R
cca ctt cgg cct ccc aaa atg
LUM exon 3 F
tgg ttg caa att caa aca tat ac
LUM exon 3 R
att cgt gta tat gtg tgt gtt c
58 °C
353 bp
56 °C
421 bp
56 °C
409 bp
65-60-58 °C
428 bp
60 °C
499 bp
6/B Táblázat Fragment
Primer 5'- 3'
Annealing
Fragment
hőmérséklet
hossz
50°C
354 bp
54°C
494 bp
58°C
668 bp 617 bp
KERA exon 1.1 F
tat cac att tac att ttt tc
KERA exon 1.1 R-GC
GC clamp - aaa ttc tta ctt taa tcc t
KERA exon 1.2 F
ttt gct ggg ctg tgt agg cac
KERA exon 1.2 R-GC
GC clamp - cgg gtt ttg gtt tag tta ttg
KERA exon 2.1 F
aca tat ttt cac ctc ttc cc
KERA exon 2.1 R-GC
GC clamp - agg cat tgt cca cta att tg
KERA exon 2.2 F-GC
GC clamp - tg gaa gat aat gag cta gag 58°C gag
KERA exon 2.2 R
taa agg aac att agc ggg gg
KERA exon 3 F-GC
GC clamp - tt tca tat att agg cca cta agc 58°C cc
KERA exon 3 R
ctg gca aaa gca tct ttg aat ag
50
447 bp
Polimeráz láncreakció és automata szekvenálás a lumikán és a keratokán gének vizsgálata során A polimeráz láncreakció révén amplifikáltuk a lumikán és keratokán gének 5’- át nem íródó regióját magába foglaló 1. exont, illetve a fehérjét kódoló 2. és 3. exonokat egy automata PCR készülékben (Termo Hybaid PxE thermal cycler, Thermo Hybaid, Franklin MA, USA). A PCR során genomiális DNS-t alkalmaztunk, a reakcióelegy a következő összetevőket tartalmazta 50µl végtérfogatban: 5X puffer (GoTaq Reaction Buffer, pH 8.5, 1,5 mM MgCl, Promega Corporation, Madison WI, USA), 25 pmol primer (Invitrogen Life Technologies, Glasgow, United Kingdom), 0,2 mmol/l minden dNTP-ből (Promega Corporation, Madison WI, USA) és 2,5 U taq polimeráz enzim (GoTaq Polymerase, Promega Corporation, Madison WI, USA). A PCR reakció a lumikán gén 1. exon, a 2.exon 1. és 2. fragmentje és a 3. exon esetében 95°C-on 5 percig tartó denaturációval kezdődött, amit 35 ciklus követett egyenként 1 perc 95°C -on, 1,5 perc a megfelelő annealing hőmérsékleten (6/A Táblázat), és 1 perc 72 °C-on, végül a program 10 perces extenzióval zárult 72°C-on. A 2.exon 3.fragmentjének amplifikálása úgynevezett “touch-down PCR” program szerint történt, a kezdeti denaturációs lépés után az első 10 ciklusban az annealing hőmérséklet 65°C, a következő 15 ciklusban 60˚C, majd a következő 20 ciklusban 58˚C volt, a végső extenzió szintén 72°C-on 10 percig tartott. A keratokán gén amplifikálásához a következő PCR programot használtuk: 2 perc denaturáció 95˚C-on, 35 ciklus egyenként 1 perc 95˚C-on, 1,5 perc annealing a megfelelő hőmérsékleten (6/B Táblázat), 1,5 perc 72°C-on. A végső extenzió 72°C-on zajlott 10 percig. A heteroduplexképzéshez 5 percig 94 ˚C –on történő denaturáció, majd 1 órás 25 ˚C-on történő inkubáció volt szükséges. A PCR termékeket 1 %-os ethidium bromid-tartalmú agaróz gélben való elektroforézist követően transzilluminátorral detektáltuk, majd Olympus Camedia 3020 típusú digitális kamerával és UVP-Doc-It szoftverrel (Ultra-Violet Products Ltd, Cambride, UK) dokumentáltuk. A PCR termékek tisztítása után (Roche High Pure PCR Purification Kit, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Germany) a DNS szekvencia meghatározása céljából a lumikán gén esetében minden vizsgálandó fragmentnél automata szekvenálás történt,
51
amelyet egy szolgálató cég végzett el a következő reagensek és készülék felhasználásával: BigDye Terminator Cycle-Sequencing v3.1 Kit, ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer (Perkin Elmer™, Applied Biosystems). A keratokán gén esetében csak a pozitív mintákon végeztettük el az automata szekvenálást a fent leírt módon.
Heteroduplex analízisen alapuló mutációkeresés a keratokán génben A keratokán gén esetében a mutációk és a polimorfizmusok meghatározásához a heteroduplex analízist és a hőmérsékletgrádiens gélelektroforézis módszerét (15. Ábra, Temperature Gardient Gel Electrophoresis Maxi System, Biometra, Göttingen, Németország) ötvöző mutációszűrést alkalmaztuk. A heteroduplex analízis azon alapszik, hogy a hetero- és homoduplexek különböző vndorlási sebességgel haladnak a gélelektroforézis során. Hetero- és homoduplexek úgy keletkezhetnek egy Eppendorfcsőben, hogy a kétszálú DNS mintát 94-96°C-on denaturáljuk, ekkor egyszálú DNS keletkezik, majd 25°C-on renaturáljuk, így az egyszálú DNS szálak véletlenszerűen kétszálú DNS-t képeznek. Amennyiben a minta heterozigóta mutációt vagy polimorfizmust hordoz, a vad és mutáns/polimorf típusú DNS szálak homo- és heteroduplexeket alkotnak (16. Ábra), amelyek nem denaturáló körülmények között is másként haladnak a gélben. A homozigóta mutációt vagy polimorfizmust hordozó minták esetében a homoduplexek futási mintázatát a vad típusú kontrollal összehasonlítva egyértelműen megítélhető az eltérő vándorlási sebesség. A homo és heteroduplexek szétválasztását még inkább fokozza egy denaturáló faktor jelenléte a rendszerben. A hőmérsékletgrádiens gélelektroforézis során a denaturáló faktor a hőmérsékletgrádiens illetve a konstans mennyiségű urea. A módszer már 1 bp különbséget is képes kimutatni.
Előnye, hogy ismeretlen nukleotideltérések
kimutatására alkalmas, kellően specifikus illetve költséghatékony előszűrő módszer, mivel csak a pozitív futási mintázatú mintát szükséges szekvenálni, nem a teljes gént.
52
15. Ábra A hőmérsékletgrádiens gélelektroforézis elvégzésére alkalmas készülék
16. Ábra Homo- és heteroduplex képződés A hőmérsékletgrádiens gélelektroforézis során a PCR termék olvadáspontja határozza meg a vándorlási sebességét, amely arányos a DNS összetétellel (GC arány) és a termékhosszal. Egy adott PCR termék olvadási profilja különböző interneten elérhető programok segítségével határozható meg, munkánk során a Steger által kidolgozott [105]
POLAND
szoftvert
alkalmaztuk
(http://www.biophys.uni-
duesseldorf.de/local/POLAND/poland.html). A PCR termék egyik vagy másik végén elhelyezkedő
GC-gazdag
szekvencia
(GC-clamp)
megváltoztatja
a
termék
olvadáspontját, mivel növeli az olvadási domének számát, így a hőmérsékletgrádiens gélelektroforézis során a legmagasabb olvadáspontú domén kivételével minden olvadási domént, azaz génszekvenciát megvizsgálunk. Tehát mutációanalízisünk során GC-
53
véggel
módosított
homo-
és
heteroduplexet
futtattunk
hőmérsékletgrádiens
felhasználásával konstans (8 M) urea tartalmú 2%- os poliakrilamid gélben. A gél összetételét a 7. Táblázat tartalmazza. 7. Táblázat Az urea tartalmú poliakrilamid gél összetétele Összetevők
Mennyiség
urea
4,8 g
Bis-acrylamid keverék
2 ml
10X TAE
1 ml
40%-os glicerol
500 µl
desztillált víz
3,5 ml
4%-os APS
40 µl
TEMED
9 µl
A keratokán gén minden vizsgált szakaszának analizáltuk az olvadási profilját (17. Ábra) a fent említett program segítségével és kiválasztottuk, hogy a forward vagy a reverse primert kell-e ellátni GC-gazdag véggel.
17. Ábra A keratokán gén 1.1 fragmentjének olvadási profilja a 4 olvadási doménnel
54
A módosított primerek szekvenciáit a korábbiakban ismertettük (6/B Táblázat). A PCR termék GC-gazdag véggel való megtoldása nemcsak az olvadási profil megváltoztatása miatt lényeges, hanem az elektroforézis során a GC-vég összetartja a kétszálú DNS egyik végét, miközben a másik vége szétnyílik és lelassítja a kettősszálú DNS-t a gélben. A poliakrilamid gélben a 8 M mennyiségű urea 16ºC-kal csökkentette az olvadási hőmérsékletet,
ezért
a
POLAND
szoftverrel
kiszámolt
olvadási
hőmérséklettartománynál 16ºC-kal alacsonyabb hőmérsékleten végeztük el minden vizsgálandó
génszakasz
esetében
egy
kontroll
PCR
termék
perpendikuláris
gélelektroforézisét (18. Ábra) az optimális hőmérséklettartomány meghatározására, majd a betegek DNS mintáit ebben a tartományban futtattuk meg. Az optimális olvadási hőmérséklettartományok
leírása
a
8.
Táblázatban
látható.
Az
optimális
hőmérséklettartományok meghatározása rendkívül fontos a módszer pontossága szempontjából, túl alacsony hőmérsékleten a DNS denaturációja elégtelen, túl magas hőmérsékleten a DNS teljes mértékben irreverzibilisen denaturálódik és nem választhatók szét a homo- és heteroduplexek. A 0,8 mm vastagságú poliakrilamid gélt ezüstözéssel festettük meg. Egyszálú DNS
Kétszálú DNS
18. Ábra Perpendikuláris gélelektroforézis az optimális hőmérséklettartomány meghatározására a keratokán gén 1.1 szakaszán. Az optimális hőmérséklettartományban
55
a DNS szál szétnyílik a GC-clamppel ellentétes végen és a részlegesen denaturálódott kettős szálú DNS jelentősen meglassul. 8. Táblázat A POLAND szoftverrel számolt olvadási hőmérséklettartomány (Tm POLAND), a 8 M urea jelenlétében 16ºC-kal csökkentett hőmérséklettartomány (Tm POLAND+8M urea) és a perpendikuláris gélelektroforézis során valóban tapasztalt optimális hőmérséklettartomány összehasonlítása látható. Tm POLAND
Perpendikuláris
Exon
Tm POLAND
Exon 1.1 R-GC
44-74°C
28-58°C
30-38°C
Exon 1.2 R-GC
62-76°C
46-60°C
44-52°C
Exon 2.1 R-GC
58-81°C
42-65°C
37,6-45,8°C
Exon 2.2 F-GC
40-80°C
24-64°C
40-48,4°C
Exon 3 F-GC
64-80°C
48-64°C
40-48,4°C
+ 8M urea (-16 C°) elektroforézis szerinti Tm
A pozitív esetekben a nukleotideltérés pontos megismerése céljából automata szekvenálás módszerét (BigDye Terminator Cycle-Sequencing v3.1 Kit, ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer™, Applied Biosystems) alkalmaztuk a PCR termékek tisztítása után (Roche High Pure PCR Purification Kit, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Germany). Az automata szekvenálást azonos a szolgálató cég végezte el, mint a lumikán gén esetében.
56
A glükokortikoid receptor gén három funkcionális polimorfizmusának vizsgálata
PRK
után
lokális
szteroid
készítményekkel
kezelt
betegcsoportban Betegcsoport kiválasztása A Semmelweis Egyetem Tömő utcai Szemészeti Klinikáján excimer lézeres szakambulanciáján kezelt betegeket (n = 102) vizsgáltuk a következő kritériumok alapján: •
fotorefraktív keratektomiás kezelés történt
•
posztoperatív lokális szteroidkezelésben részesültek (fluorometolon és/vagy prednizolon acetát)
•
a preoperatív IOP ≤ 21 Hgmm Goldmann applanációs tonometriával mérve
•
sem a saját, sem a családi anamnézisben nem szerepelt glaukóma
•
legalább két IOP mérés történt a szteroidkezelés során, az első IOP mérés a posztoperatív 21. napnál későbbi időpontban, az utolsó IOP mérés a szteroidkezelés kezdetétől számított 5±1 hónapban történt
•
a szteroidkezelés az utolsó IOP mérés időpontjáig tartott
•
endokrin betegség nem szerepelt az anamnézisben
•
a részletes írásbeli és szóbeli tájékoztatás alapján írásos beleegyezésüket adták
A betegek korábbi anamnéziséről, rendszeresen szedett gyógyszereiről egy részletes kérdőív segítségével nyertünk információt. A vizsgálatban 45 nő és 57 férfibeteg szerepelt, az átlagéletkor 35 év (21-60 év) volt. Az átlagos preoperatív IOP 16.3 Hgmm (10-21 Hgmm). A vizsgálat az Egészségügyi Tudományos Tanács Tudományos és Kutatásetikai Bizottságának etikai engedélyével a Helsinki Deklarációnak megfelelően zajlott.
57
Klinikai vizsgálatok A preoperatív kivizsgálás során a korrigálatlan és a korrigált látásélességet vizsgáltuk, majd réslámpás biomikroszkópia, cornea topográfia (TMS-1, Tomey, Cambridge, MA), Goldmann applanációs tonometriával szemnyomásmérés, ultrahangos pachymetria (Humphrey Model 855, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany), és fundusvizsgálat történt. A betegek teljeskörű felvilágosítást kaptak a PRK előtt a refrakciós változásokról, a lehetséges szövődményekről és írásos beleegyezésüket adták a műtéthez. A PRK beavatkozások Aesculap Meditec Mel 70-es és Mel 80-as 193 nm argon-fluorid excimer lézerkészülékkel (Carl Zeiss, Jena, Németország) történtek. Minden operáció célja az emmetropia elérése volt. A műtét utáni 1. és 5. napon kontrolláltuk a betegeket, minden esetben normálisan zajlott a cornea posztoperatív reepitelizációja. A páciensek naponta 5x helyi tobramycin (0.3%) kezelést kaptak az első 7 napon, majd napi 5x helyi fluorometolon (0.1%) kezelést indítottunk. A betegek fluorometolon kezelése kb. 6-8 hónapig tartott, majd fokozatosan csökkenő dózisban elhagyták. Állapotuktól és együttműködési készségüktől függően a betegek 4-6 hetente jártak kontrollra. Bizonyos esetekben a posztoperatív terápiát fluorometolonról prednizolon acetátra 0.5% állítottuk át a sebgyógyulási reakciótól, a subepiteliális homálytól (haze) és a refrakciós regressziótól függően. A helyi prednizolon acetát kezelés indokolttá vált, ha a subepiteliális homály fokozata Hanna szerint 1.5 vagy nagyobb volt [37] és a refrakciós regresszió elérte a -1.25 Dsph vagy annál nagyobb értéket. Ahhoz, hogy meghatározhassuk a fluorometolon (0.1%) és a prednizolon acetát (0.5%) szemnyomás emelkedésre gyakorolt hatását a posztoperatív kezelés során, a vizsgált betegcsoportot három alcsoportra osztottuk: a csak fluorometolonnal kezelt betegek csoportjára (A1 vizsgálat, 73 beteg 132 szeme), a kezdetben fluorometolonnal, majd prednizolon acetáttal kezelt betegek csoportjára (A2 vizsgálat, 26 beteg 42 szeme), és azon betegek csoportjára, akinél a követés a prednizolon acetát első adásától indult (B vizsgálat, 38 beteg 76 szeme). Az A1 és az A2 vizsgálatban a követés tehát a kezdeti szteroid kezelés időpontjával, míg a B vizsgálatban a követés a prednizolon acetátra való terápiaváltás kezdetétől indult. Az IOP emelkedést szemnyomáscsökkentő terápiával kezeltük, általában 2x1 timolol maleát (0.5%) cseppentésével. A
58
szemnyomáscsökkentő kezelés kezdete után keletkezett adatokat figyelmen kívül hagytuk.
Molekuláris genetikai vizsgálatok DNS izolálás EDTA tartalmú csövekbe gyűjtött perifériás vérmintákból nyertük ki a fehérvérsejtek DNS-ét a WIZARD DNA Isolation Kit (Promega, Madison, USA) segítségével a gyártó által leírt protokoll szerint. Allél-specifikus PCR alkalmazása az N363S polimorfizmus vizsgálatában Vizsgálatunk során Majnik és munkatársai által kidolgozott allél-specifikus PCR módszerét [106] alkalmaztuk. A módszer lényege, hogy egy PCR reakcióelegybe két kontroll primert és egy polimorfizmusra specifikus primert teszünk, így a polimorf allél jelenléte egy PCR reakció során kimutatható, mivel a reakcióban két eltérő hosszúságú amplikon keletkezik. A pozitív esetekben egy verifikáló PCR segítségével bizonyítható a polimorfizmus jelenléte és elkülöníthető, hogy homozigóta vagy heterozigóta formában fordul-e elő. Az eljárás gyors, egyszerű és költégkímélő. Az allél-specifikus PCR módszerének kidolgozásához a korábban Koper és munkacsoportja leírt oligonukleotid primereket használták [87], a kontroll forward primer (K-F): 5’- CCAGTAATGTAACACTGCCCC-3’, és a kontroll reverse primer (K-R): 5’-TTCGACCAGGGAAGTTCAGA-3’. Az allél-specifikus reverse primerek egy nukleotidban különböznek a 3’-végen, a vad típusú aszparagint kódoló (N) allélra specifikus primer szekvenciája (N363N-R): 5’-ATCCTTGGCACCTATTCCAAT-3’, a polimorf típusú szerint kódoló (S) allélra specifikus primer kódoló szekvenciája (N363S-R): 5’-ATCCTTGGCACCTATTCCAAC-3’ [106]. Minden reakcióelegy 200 ng DNS-t, 0.5 µl/l kontroll forward primert, 0.25 µl/l kontroll reverse primert és 0.25 µl/l polimorf allélra specifikus reverse primert, 0.2 mmol/l deoxinukleotid trifoszfátot, puffert (Go Taq Buffer) és 2,5 U Taq polimerázt (Promega, Madison, USA) tartalmazott 50µl végtérfogatban. Az alkalmazott PCR készülék típusa Termo Hybaid PxE thermal cycler (Thermo Hybaid, Franklin MA, USA). Minden primert az Invitrogene Life Technologies cégtől szereztünk be (Invitrogene Life Technologies, Strathclyde, UK). A
59
PCR program a következő lépésekből állt: denaturáció 5 perc 95˚C-on, 35 ciklus egyenként 1 perc 95˚C-on, 1 perc annelálás 62°C-on, 1 perc 72°C-on. A végső extenzió 72°C-on zajlott 10 percig. A PCR reakció során minden csőben keletkezett egy 357 bp hosszú kontroll fragment, és egy 306 bp hosszú specifikus fragment azokban a csövekben, ahol a polimorf allél-specifikus reverse primernek megfelelő polimorf allél jelen volt (19/A Ábra). Az amplikonokat etidium-bromid tartalmú agaróz gélen (3%) elektroforézissel választottuk szét és a gélt UV fénnyel átvilágítva értékeltük, dokumentáltuk az eredményeket (Olympus Camedia 3020 típusú digitális kamera, UVP-Doc-It szoftver, Ultra-Violet Products Ltd, Cambride, UK). A reakcióban egy homozigóta N363N és egy N363S heterozigóta kontroll DNS mintát használtuk, melyek szekvenciája direkt szekvenálással verifikált volt. A pozitív minták esetében verifikáló PCR-t végeztünk. A reakcióelegy tartalma az előbbiekben ismertetett összetevőkkel azonos volt egy kivételével: a kontroll forward és kontroll reverse primerek mellett a vad típusú allélra specifikus reverse primert tettük a reakcióelegybe, így a keletkezett fragmentek számából és hosszából következtettünk a homozigóta vagy heterozigóta státuszra (19/B Ábra).
19. Ábra A GR gén N363S polimorfizmusának vizsgálata allél-specifikus PCR módszerével.
60
A: Az 1. reakcióban a kontroll és specifikus primerek segítségével választ kapunk arra, hogy jelen van-e a génvariáns. Ha nincs jelen, csak a kontroll termék amplifikálódik. Ha jelen van, egy 306 és egy 357 bp hosszú termék amplifikálódik. B: A második PCR reakcióval verifikáljuk a polimorfizmust és megállapítjuk, hogy homozigóta vagy heterozigóta formában fordul-e elő. N363S homozigótaság esetén csak a 357 bp hosszú kontroll termék amplifikálódna (ez európai népességben nem fordul elő), N363S heterozigótaság esetén a vad típusú termék is amplifikálódik. A PCR amplikonokat etidium-bromid tartalmú agaróz gélen (2%) választottuk szét, és UV fényben detektáltuk az eredményt (20/A Ábra). Belső kontrollként homozigóta vad és heterozigóta típusú DNS mintákat használtunk, melyek direkt DNS szekvenálással verifikáltuk.
A Bcl I polimorfizmus vizsgálata PCR-alapú RFLP módszerrel A DNS amplifikálása a már korábban kidolgozott [107] PCR technikával történt 56˚Cos anneláló hőmérsékleten. A következő oligonukleotid primereket használtuk a reakcióban: •
forward primer 5’-GAGAAATTCACCCCTACCAAC-3’
•
reverse primer: 5’-AGAGCCCTATTCTTCAAACTG-3’.
A restrikciós hasítás Bcl I enzimmel történt (New England Biolabs, Beverly, USA). A reakció 24 µl végtérfogatban zajlott, 3 µl puffer, 20 µl PCR termék és 1 µl (10 U) Bcl I enzim hozzáadásával 50˚C-on 10 órán keresztül. A GR gén C/G szubsztitúciós polimorfizmusa a Bcl I restrikciós enzim hasítóhelyét szünteti meg (5’- T^GATCA-3’), a vad típusú allélt hasítja, a génvariánst hordozó allélt nem hasítja az enzim. PCR reakcióban keletkező 418 bp hosszú terméket a homozigóta vad típusú allél esetében 2 fragmentre osztja (263bp, 151 bp), heterozigóta minták esetén az egyik allélt hasítja, a másikat nem, így látható lesz az agarózgélen a 418, 263 és a 151 bp hosszú termék is. A homozigóta polimorf minták esetén nincs hasítóhelye az enzimnek és csak a 418 bp hosszú szakasz látható. A fragmenteket etidium-bromid tartalmú agaróz gélen (2%) választottuk szét, és UV fényben detektáltuk az eredményt (20/B Ábra). Belső
61
kontrollként homozigóta vad típusú, heterozigóta és homozigóta polimorf típusú DNS mintákat használtunk, melyek direkt DNS szekvenálással verifikáltuk. Az ER22/23EK polimorfizmus vizsgálata PCR-alapú RFLP módszerrel A DNS amplifikálása Majnik és mtsai által kidolgozott standard PCR technikával történt 56˚C-os anneláló hőmérsékleten. A következő oligonukleotid primereket használtuk a reakcióban: •
forward primer: 5’-TGCATTCGGAGTTAACTAAAAG-3’
•
reverse primer: 5’- ATCCCAGGTCATTTCCCATC-3’ .
A restrikciós hasítás Mnl I enzimmel történt (New England Biolabs, Beverly, USA). A reakció 20 µl végtérfogatban zajlott, 2 µl puffer, 0,2 µl BSA, 17,3 µl PCR termék és 0,5 µl (10 U) Mnl I enzim hozzáadásával 37˚C-on 4 órán keresztül. Az ER22/23EK polimorfizmus az Mnl I restrikciós enzim egyik hasítóhelyét szünteti meg (5’GA^GAGG-3’). A 448 bp hosszú amplikon hasítása során 149 és 163 bp hosszú fragmentek keletkeznek (és az agaróz gélen nem szétválasztható 50, 49 és 35 bp hosszú kis szakaszok) a vad típusú allél jelenlétében. A génvariánst hordozó allél esetén 163 és 184 bp hosszú fragmentek (és az agaróz gélen nem látható kisebb 50 és 49 bp hosszú szakaszok) keletkeznek az enzimes hasítás során. A fragmenteket etidium-bromid tartalmú agaróz gélen (3%) futtattuk meg, majd UV átvilágítással értékeltük és dokumentáltuk az eredményt (20/C Ábra). Belső kontrollként vad típusú homozigóta és a génvariánst hordozó heterozigóta DNS mintákat használtunk, melyek szekvenciáit direkt szekvenálással verifikáltuk.
62
20. ábra Az N363S génvariáns allél-specifikus PCR termékei (A; C1 homozigóta vad típusú kontroll, C2 heterozigóta kontroll, P1 és P8 az N363S allélt hordozó betegek, P2P7, P9 vad típusú minták, a 357 bp hosszú fragment belső kontrollként szintetizálódik minden reakció során), a Bcl I polimorfizmus PCR-RFLP termékei (B; C1, P2-P5, P8 vad típusú homozigóta minták, C2, P1, P6-P7 heterozigóta minták, C3 homozigóta polimorf kontroll), és az ER22/23EK polimorfizmus PCR-RFLP termékei (C; C1, P1-P9 vad típusú homozigóta minták, C2 heterozigóta minták) agarózgélen való elektroforézis során. M: molekulasúly marker, bp: bázispár, C1-3: kontroll, P1-P9: beteg
63
Statisztikai analízis Covariancia analízist (ANCOVA) végeztünk a változók előrehaladó lépésenkénti szelekciójával (forward stepwise variable selection model), a STATISTICA 5.0 nevű programcsomag segítségével. Az analízis végpontja a követés során mért maximális szemnyomásérték volt. Az N363S, Bcl I és ER22/23EK polimorfizmusok vizsgált prediktorokként szerepeltek a modellben; az ablációs mélység és a szteroidkezelés előtti IOP lehetséges befolyásoló, zavaró tényezőkként (confounder) szerepeltek a modellben. A B vizsgálatban egy további lehetséges zavaró tényező szerepét is vizsgáltuk, a prednizolon acetát kezelést megelőző fluorometolon terápia időtartamát. Az egyoldali PRK-val kezelt szemek adatait 1.0-es súllyal, a kétoldali PRK-val kezelt szemek mindegyikét 0.5-ös súllyal vettük figyelembe az elemzés során, mivel a betegek legmagasabb szemnyomásértékének bal szem-jobb szem korrelációja >0.9.
64
Eredmények Az autoszomális domináns stacioner nyctalopiában szenvedő betegek vizsgálatainak eredménye A klinikai vizsgálatok eredményei A II:2 férfibeteg tájékozódási, olvasási nehézségekre és farkasvakságra panaszkodott, legjobb korrigált látóélessége 0,25 volt mindkét szemén -0,5 Dsph korrekcióval. A biomikroszkópos vizsgálat során hátsó kérgi kataraktát írtak le, a szemfenéken halvány papilla, szűk artériák, a retinális pigment epithelium atrófiája és a periférián kifejezett hiperpigmentáció volt megfigyelhető. A sötétadaptációs görbéje egy kezdeti 1.9 log egységnyi emelkedést mutatott, de a pálcika válasz hiányzott. A színlátása kismértékben érintett volt. Az ERG alátámasztotta a retinitis pigmentosa diagnózisát. A beteg 6 évvel fiatalabb nővérének (II:3) vizsgálata során a látóélesség normális volt, a biomikroszkópia ép fundust írt le, a retinitis pigmentosa jeleit nem észlelték. A látótér és a színlátás ép volt. Az ERG vizsgálat során bebizonyosodott, hogy a nőbeteg teljes nyctalopiában szenvedett, a megtartott csap válasz mellett a pálcika válasz teljes mértékben hiányzott. További 3 családtag vizsgálata történt meg (III:2, III:4, III:7), mindannyian farkasvakságra panaszkodtak. A III:2 beteg fénytörési hibája –8.50 és –7.00 D (SE) volt jobb és baloldalon, a III:4 beteg refrakciós hibája -2.00 Dsph, a III:7 beteg refrakciós hibája -3.5 Dsph volt mindkét szemen. A funduson kóros retina degenerációra utaló jelek nem voltak megfigyelhetők, és mindhármuk látótere, színlátása ép volt. A sötét adaptáció során a pálcika adaptáció hiányát figyelték meg. Az ERG vizsgálat során hiányzó pálcika választ és szubnormális csapválaszt regisztráltak.
65
A molekuláris genetikai vizsgálatok eredményei A kapcsoltsági analízis eredménye A mikroszatellita markerek variánsainak vizsgálatával 3. Táblázatban összefoglalt vizsgálandó gének közül minden esetben egyértelműen kizárható volt a kapcsoltság, a GNAT1 gén kivételével, ahol több beteg családtag homozigóta genotípusú volt a D3S1289 marker egy variánsára. A markerekkel kapcsoltságot nem mutató gének kétpontos linkage analízise során számolt LOD érték Θ = 0.00-nál -5 körüli érték volt. A D3S1289 marker gyenge kapcsoltságot mutatott, Zmax=1.81; θ = 0.00 rekombinációs gyakoriságnál (9.Táblázat), ezért elvégeztük a GNAT1 gén fehérjekódoló régiójának mutációanalízisét. 9. Táblázat A D3S1289 marker kétpontos kapcsoltsági analízisének eredménye Rekombinációs gyakoriság (Θ)
0.00
0.01
0.05
0.1
0.2
0.3
0.4
LOD érték (Zmax)
1.81
1.77
1.63
1.44
1.04
0.62
0.24
A GNAT1 gén mutációanalízise A GNAT1 gén minden exonjára sikerült optimalizálnunk a PCR-t. A gén kétirányú, direkt szekvenálása során a II:2 és II:3 családtagokban sikerült azonosítanunk egy heterozigóta misszenz mutációt a 200. kodonban, amely glutamin/glutaminsav aminosavcseréhez vezet a fehérje szekvenciájában (21/B Ábra).
21. Ábra. Az elektroferogramon látható a vad típusú allél (A), és a heterozigóta misszenz mutációt hordozó allél (B) szekvenciája a kódolt aminosavakkal.
66
A mutáció verifikálása TseI restrikciós enzimhasítással A C/G tranzíció a Tse I enzim restrikciós helyének elvesztéséhez vezetett. A II:2 és II:3 családtagokban talált Gln200Glu mutációt a Tse I enzimes emésztéssel verifikáltuk. A család többi tagjának 6. exonját szintén Tse I restrikciós enzimes hasítással vizsgáltuk meg. A normál allél kettő Tse I restrikciós hasítóhellyel rendelkezik, így 3 fragment keletkezik a hasítás során: egy 111, 128 és egy 155 bp hosszú fragment (22. Ábra, 4. oszlop). Egy további 283 bp hosszú fragment keletkezik a heterozigóta mutációt hordozó betegekben (22. Ábra, 2. és 3. oszlop), mivel a vad típusú allélt 2 helyen hasítja, a mutáns allélt 1 helyen hasítja az enzim.
22. Ábra. A Gln200Glu mutáció verifikálása Tse I restrikciós enzimes hasítással. Az M jelű oszlopban DNS-létra (50-bp), az 1. oszlopban emésztetlen kontroll PCR termék, a 2. oszlopban a II:2, a 3. oszlopban a II:3 családtag mintái, a 4. oszlopban a II:7 családtag mintája látható. A talált Gln200Glu mutáció szegregált a családban, csak a farkasvakságban szenvedő családtagokban volt jelen. A koszegregációs maximális LOD érték Zmax=3,01 (Θ = 0,00) volt komplett penetranciát és a mutáns allél 0.0001 előfordulási frekvenciáját feltételezve. A Gln200Glu mutáció egyetlen allélon sem fordult elő 104 normál kontroll kromoszóma vizsgálata során.
67
A mutáció funkcionális hatása A talált Gln200Glu (Q200E) mutáció a G-fehérje α-alegységének Switch2 doménjében (fehérjekötőhely) található, amely az inaktiválódáshoz szükséges intrinsic GTPáz aktivitásért felelős illetve az inaktivációban további szerepet játszó két fehérje - a Gproteint szabályozó RGS9-1 és a foszfodiészteráz gamma alegysége - kötődési helye. A mutáns fehérje háromdimenziós modelljének elkészítéséhez Slep és munkatársai által alkotott röntgen krisztallográfiás kiméra modell adott alapot, melyet a G-proteinα/RGS9/foszfodiészteráz-γ heterotrimer komplex tanulmányozásához hoztak létre (23. Ábra) [3].
23. Ábra. Az A, ábrán a transzducin/Gai kiméra katalitikus centrumának szerkezete látható. A tranzíciós állapottal analóg GDP-AlF4- molekula, mely közeli kapcsolatot teremt a katalitikus Gln200 (Q200) aminosavval, biztosítja a valósághű modellezést; az AlF4- utánozza a γ-foszfát csoport planáris konformációját a hidrolízis során, amelyet a Gln200 amid-csoportjával való kölcsönhatása stabilizál (nyíl). A B, ábrán a homológ mutáns transzducin/Gai modellen a Glu200 (E200) aminosav (nyíl) látható. Jelölés: kék: nitrogén, piros: oxigén, sárga: foszfát. A GDP.AlF4komplex-szel asszociált AlF4- és Mg2+ ionok különböző árnyalatú szürkével vannak jelölve.
68
A Glu200 aminosav kimozdul a katalitikus centrumból, melynek legvalószínűbb oka az elektrosztatikus taszítás. A Glu200 aminosavat a Ser202 aminosavval alkotott addicionális H-kötés stabilizálja új helyzetében. A további feltételezett változások az Arg174 oldalláncának kisfokú elferdülése és a Thr177 hidroxil-csoportjának rotációja.
69
A
refraktív
beavatkozásokat
követő
corneális
sebgyógyulás
vizsgálatának eredményei A klinikai vizsgálatok eredményei A biomikroszkópos vizsgálat eredménye
A betegek szubjektív panaszait kérdőíven kikérdezve megállapítottuk, hogy minden perzisztáló corneális homállyal rendelkező beteg káprázási tünetekre és homályosságra panaszkodott, illetve 2 beteg myopiás regressziót tapasztalt. Biomikroszkópos vizsgálattal a betegek cornea epitheliuma a PRK után 1 évvel nem mutatott kóros elváltozást, de a stroma érintettsége minden PRK-kezelt szemen látható volt. A legsúlyosabb fokú haze 3 hónappal a kezelés után Hanna szerint 3.0 fokozatú volt egy fiatal férfibetegnél, aki káprázási tünetekre és a látásminőség kifejezett romlására panaszkodott. Egy évvel a kezelés után a legsúlyosabb fokozatú homály a Hanna-féle beosztás szerint 2 fokú volt (24. Ábra), amely két magas fokban myopiás páciens esetében fordult elő. Réslámpás vizsgálattal az anterior stroma érintettségének mélysége nehezen volt megítélhető. Nem találtunk corneális eltérést a nem kezelt kontroll szemeken. A PRK-kezelt kontroll szemeken egy vékony vonal jelezte a fotoablációs kezelés felszínét. Az átlagos fotoablációs mélység 88.94 ± 18.64 µm (átlag ± szórás, tartomány: 56-130 µm), az átlagos fénytörési hiba -8.5±2.3 dioptria volt (átlag ± szórás, tartomány: 4.75-14.0 dioptria). Az átlagos preoperatív szaruhártyavastagság 539.0 ± 23.13 µm volt, amely a lézerkezelés során 463.18 ± 16.44 µm-re csökkent.
24. Ábra A PRK után 1 évvel Hanna szerint 1.5 fokozatú corneális subepitheliális homály volt megfigyelhető egy férfibeteg szemén
70
Az in vivo konfokális mikroszkópiával végzett vizsgálatok eredményei Konfokális mikroszkópiával nem találtunk epitheliumot érintő változást sem a perzisztáló haze-zel gyógyuló, sem a PRK kezelt és nem kezelt kontroll szemeken. A nem kezelt, egészséges szemekkel (25/A Ábra) összehasonlítva a PRK-kezelt szemeken a fotoablációs területen a Bowman réteg hiányát, valamint hiperreflektív sejteket és inhomogén, reflektív depozitumok jelenlétét figyeltünk meg a subepitheliális extracelluláris mátrixban (25/B-C Ábra) A PRK-kezelt szemeken az epithelium-stroma határfelülete alatt egy fényes visszatükröződés jelezte a fotoablációs felszínt. A kóros homályképződést mutató corneában az extracelluláris mátrixban fibrózisszerű hyperreflektivitás, a keratocyták világos sejtmagjai és egyenetlen sejteloszlás volt megfigyelhető (25/D Ábra). A depozitumok apró pontszerű vagy granuláris megjelenésűek voltak, előfordulásuk a subepiteliális területtől az elülső stroma hátsó régiójáig közel egyenletes volt.
25. Ábra In vivo konfokális mikroszkópia nem kezelt kontroll szemen (A), normális sebgyógyulást mutató PRK-kezelt szemen (B), kisfokú subepitheliális corneális homállyal gyógyuló PRK-kezelt szemen (C), és kifejezett subepiteliális corneális homállyal gyógyuló PRK-kezelt szemen (D). A felvételek a stroma elülső 50 µm-es mélységében készültek.
71
Az elülső stroma teljes vastagságában érintett volt azon betegek szemeiben, akiknél az ablációs mélység meghaladta a 100 µm-t. A lézió a 6.0 mm-es kezelési zónának megfelelően
a
szaruhártya
centrumát érintette
minden
esetben,
a
periféria
transzparenciája megtartott volt. A subbasalis idegek szintén jól láthatóak voltak. A legkifejezettebb kóros sebgyógyulási választ a 7. és a 9. jelű betegek esetében tapasztaltuk, akiknél Hanna szerint 2. fokozatú homály alakult ki. A keratocyták inaktivált állapotban maradtak a közép és a posterior stromában. A Descemet-réteg és az endothelium nem mutatott kóros elváltozást. Az átlagos endotheliális sejtdenzitás 2214.96±223.7 sejt/mm2 (átlag±SD, tartomány: 1620-2765 sejt/mm2) és az átlagos variációs koefficiens 0.34±0.057 (átlag±SD) volt. Az endotheliális sejtdenzitás tekintetében nem találtunk szignifikáns eltérést (p>0.05) a PRK-kezelt perzisztáló subepiteliális homállyal gyógyuló corneák és az egészséges kontroll corneák összehasonlításakor (26/A-B Ábra). A PRK-kezelt normál sebgyógyulású kontroll szemek esetén enyhe elülső stromát érintő elváltozásokat figyeltünk meg (25/B Ábra), az endotheliális sejtdenzitás és a sejtek morfológiája nem mutatott különbséget az egészséges kontroll szemekhez viszonyítva.
26. Ábra A PRK-kezelt perzisztáló homállyal gyógyuló corneák (A) és az egészséges kontroll corneák (B) összehasonlításakor nem látható eltérés az endothelsejtek morfológiájában és sejtdenzitásában.
72
A molekuláris genetikai vizsgálatok eredményei A lumikán gén mutációanalízise A lumikán gén mutációanalízise során sikerült optimalizálni a PCR reakciókat minden vizsgálandó génfragment esetében. A direkt szekvenálás során nem találtunk csírasejt eredetű genetikai eltérést a kóros sebgyógyulást mutató betegek körében a gén 5’-át nem íródó régiójában, az exon-intron junkciókban és a fehérjekódoló szakaszán, mely a 2. és 3. exonban helyezkedik el.
A keratokán gén mutációanalízise A keratokán gén mutációanalízise során meghatároztuk minden vizsgálandó génszakaszra nézve az optimális PCR körülményeket és kidolgoztuk a hőmérséklet grádiens gélelektroforézis (TGGE) módszerét. Találtunk egy intronikus heterozigóta nukleotideltérést (G/T) a mutációs előszűrő módszerrel (TGGE) (27/A Ábra), amelyet direkt szekvenálással verifikáltunk (27/B Ábra). A gén 5’-szakaszán, az exon-intron határokon és a fehérjekódoló régiókban (2. és 3. exon), nem sikerült betegséget okozó csírasejtes mutációt azonosítani.
27. Ábra Az ezüstözött poliakrilamid gélen az 1. és 3-9. sorokban homoduplexek figyelhetők meg. A 2. sorban látható a különböző vándorlási sebességű homo- és heteroduplexek eltérő mintázata (A), amely DNS minta szekvenálása során megtaláltuk a G/T heterozigóta nukleotideltérést (B).
73
A glükokortikoid receptor funkcionális polimorfizmusai vizsgálatának eredménye A klinikai vizsgálatok leíró statisztikai eredményei A PRK kezelést követő szteroidterápia időtartamának mediánja 7.3 hónap (tartomány: 2.8-30.0 hónap, 1. kvartilis / 3. kvartilis: 5.8 / 9.2 hónap). A fluorometolon 0.1% kezelésről való áttérés prednizolon acetát 0.5% terápiára a betegek 37%-ában vált szükségessé. A fluorometolon 0.1% terápia hosszának mediánja 3.0 hónap (1. kvartilis/ 3. kvartilis: 1.3 / 6.0 hónap). A photoablációa mélység mediánja 84 µm (tartomány: 13118 µm, 1. kvartilis/ 3. kvartilis: 60 µm / 99 µm).
A molekuláris genetikai vizsgálatok eredményei A glükokortikoid receptor gén polimorfizmusainak vizsgálata során nyert genotipizálási eredmények a 10. Táblázatban szerepelnek. A vizsgálatunkban talált allélfrekvenciák mindhárom polimorfizmus esetében megegyeztek az irodalomban leírt kaukázusi népességben talált allélfrekvenciákkal. Szintén az irodalommal egybehangzó eredményt kaptunk az N363S és az ER22/23EK SNP homozigóta előfordulása tekintetében: a homozigóta polimorf allélhordozókat sem az N363S variáns, sem az ER22/23EK szekvenciavariáns esetében nem találtunk a vizsgált betegpopulációban. 10. Táblázat A genotipizálás eredménye és az egyes polimorf allélok frekvenciája. Polimorfizmus
Genotípus
Betegek száma
Allél
Allél frekvencia
N363S
WT: AA
94
A
96.1 % (196/204)
P: AG
8
G
3.9 % (8/204)
P: GG
0
WT: CC
49
C
71.1 % (145/204)
P: GC
47
G
28.9 % (59/204)
P: GG
6
WT: GG
99
G
98,5 % (201/204)
P: GA
3
A
1.5 % (3/204)
P: AA
0
Bcl I
ER22/23EK
74
Az A1 és A2 vizsgálatok eredményei Az
A1
vizsgálatban
a
szteroid
kezelés
során
mért
átlagos
legmagasabb
szemnyomásérték 18.0 Hgmm (tartomány: 11-36 Hgmm, 1. kvartilis/medián/3. kvartilis: 16 Hgmm/17 Hgmm/19 Hgmm), az A2 vizsgálatban a szteroid kezelés során mért átlagos legmagasabb szemnyomásérték 24.8 Hgmm (tartomány: 14-44 Hgmm, 1. kvartilis/medián/3. kvartilis: 19 Hgmm/23 Hgmm/30 Hgmm). A következő változók szerepeltek a modellben az előrehaladó lépésenkénti szelekció során: •
N363S polimorfizmus
•
Bcl I polimorfizmus
•
ER22/23EK polimorfizmus
•
fotoablációs mélység
•
szteroidterápia megkezdése előtti IOP.
Az előrehaladó lépésenkénti szelekciós folyamat eredményeképpen egyetlen prediktor sem került a modellbe, nem találtunk szignifikáns prediktor tényezőket a követési periódusban mért legmagasabb szemnyomásérték tekintetében. Így nem igazolódott, hogy a három vizsgált funkcionális polimorfizmusnak vagy a vizsgált klinikai tényezőknek hatása lett volna a maximális szemnyomásértékre az A1 és A2 vizsgálati csoportokban (11. Táblázat).
A B vizsgálat eredménye A B vizsgálatban a követési idő a prednizolon acetát (0.5%) első adásának időpontjával kezdődött. A betegek legtöbbje ezt megelőzően fluorometolon 0.1% kezelést kapott különböző ideig. Az átlagos legmagasabb szemnyomásérték a prednizolon acetát 0.5% kezelés során 26.6 Hgmm (tartomány: 14-44 Hgmm, 1. kvartilis/medián/3. kvartilis: 22 Hgmm/24 Hgmm/34 Hgmm) volt. A következő változókat foglalta magában az előrehaladó lépésenkénti változó szelekciós modell: •
N363S polimorfizmus
•
Bcl I polimorfizmus
•
ER22/23EK polimorfizmus
•
a fluorometolon 0.1% terápia időtartama a prednizolon acetát 0.5% kezelést megelőzően
75
•
a fotoablációs mélység
•
a szteroid kezelés előtti IOP.
A változók szelekcióját követően csak az N363S polimorfizmus maradt a modellben, koefficiense 9.1 Hgmm (SE=4.1 Hgmm), p=0.03, konfidencia intervalluma 95% (1.0 Hgmm; 17.3 Hgmm). Így szignifikáns összefüggést találtunk az N363S heterozigóta genotípus és a prednizolon acetát kezelés során mért megemelkedett szemnyomásérték között. A részletes eredményeket minden génvariánsra vonatkozóan a 11. Táblázatban foglaltuk össze. A többi változónak nem volt szignifikáns hatása. 11. Táblázat Az N363S, Bcl I és ER22/23EK polimorfizmusok különböző alléljeit hordozó betegek legmagasabb szemnyomásértékei a szteroid kezelés során. A szteroid kezelés alatt mért maximális IOP SNP
N363S Bcl I ER22/23EK
Genotípus
/Hgmm, átlag±SD/ A1 vizsgálat
A2 vizsgálat
B vizsgálat
WT: AA
18.2±4.3 (n=124)
24.4±8.1 (n=37)
23.4*±7.9 (n=70)
P: AG
16.0±1.2 (n=8)
27.7±6.2 (n=5)
31.0*±7.8 (n=6)
WT: CC
18.4±4.3 (n=64)
26.7±8.4 (n=23)
25.0±8.9 (n=26)
P: CG, GG
17.7±4.1 (n=68)
22.5±6.8 (n=19)
23.4±7.3 (n=40)
WT: GG
18.0±4.3 (n=131)
24.5±8.0 (n=39)
24.0±8.2 (n=72)
P: GA, AA
19.0 (n=1)
27.8±6.0 (n=3)
26.3±4.9 (n=4)
*: szignifikáns különbség, p=0.03, ∆ maxIOP=7.6 Hgmm (95% CI: 1.0 Hgmm; 17.3 Hgmm) Az N363S polimorfizmus G allélját hordozó betegek esetében szignifikánsan magasabb maximális IOP-t mértünk a prednizolon acetát kezelés során. Az egyéb faktorok, mint a Bcl I és ER22/23EK polimorfizmusok frekvenciája, a fotoablációs mélység, a kezdeti szemnyomásérték, sem az A1 és A2, sem a B vizsgálati csoportban nem mutattak szignifikáns eltérést.
76
Megbeszélés Az autoszomális domináns stacioner nyctalopia vizsgálati eredményeinek megbeszélése Vizsgálatunkban
a
3
generációs
dán
családban
autoszomális
domináns
öröklődésmenetet mutató farkasvakság és az egyik családtagban talált retinitis pigmentosa genetikai hátterét kutattuk mikroszatellita markerek segítségével. A jelölt GNAT1 gén mutációanalízise során talált heterozigóta misszenz mutáció nagy valószínűséggel adCSNB-t okoz a vizsgált családban. A Gln200Glu aminosavcsere a Gfehérje α-alegységének Switch2 doménjében (fehérjekötőhely) található, amely az inaktiválódáshoz szükséges intrinsic GTPáz aktivitásért felelős illetve az inaktivációban további szerepet játszó két fehérje - a G-proteint szabályozó RGS9-1 és a foszfodiészteráz gamma alegysége - kötődési helye (28. Ábra). Feltételezésünk a korábban ismertetett vizsgálatok eredményein alapul, mivel a Gproteinek α-alegysége kifejezetten konzervált elsődleges szerkezettel rendelkezik és közös a GTP-kötő és hidrolizáló mechanizmusuk, így a mutációk, melyek ezeket a evolucionálisan konzervált régiókat érintik, gátolják a GTPáz aktivitást és konstitutív jeleket generálnak a szignáltranszdukció során [108-110]
28. Ábra. A transzducin fehérje szerkezete és a mutáció helye (piros nyíllal jelölve) [111]
77
A konzervált glutamin aminosav szubsztitúciója a konformációszenzitív Switch2 doménben nem hat ki az α-transzducin aktivációjára, vagyis az aktivált rodopszin hatására megtörténik a GDP/GTP kicserélődés és a foszfodiészteráz gátló γalegységéhez való kötődés, amely a foszfodiészteráz effektor αβ-alegységeinek aktiválódásához vezet. Az α-transzducin Arg174 és a Glu200 aminosavjai alkotják a GTP hidrolízis katalitikus centrumát. A mutáns glutamát (Gln200) aminosav azonban kimozdul a katalitikus centrumból, melynek legvalószínűbb oka az elektrosztatikus taszítás. Ez a konformációváltozás magyarázhatja a GTPáz deficienciát és a mutáns transzducin
konstitutív
aktivációját,
mivel
a
konzervált
Glu200
aminosav
szubsztitúciója megváltoztatja az RGS9-1 protein kötőhelyét, az α-transzducin intrinsic GTPáz aktivitását és a foszfodiészteráz γ-alegységének akcelerációs mechanizmusát [3, 110-112]. Srinivasan és munkacsoportja korábban elkészítette a mutáns α-transzducin in vitro modelljét, amelyben a Glu200 aminosavat leucinra cserélték. A megváltozott αtranszducin GTPáz aktivitása csökkent, így konstitutívan aktiválta az effektor foszfodiészterázt [113]. Bizonyos emlős G-protein α-génekben a Glu200Leu mutáció abnormális sejtnövekedéshez és tumor kialakulásához vezethet [108]. Az Ia típusú pszeudohipoparatiroidizmusban megtalálták a GSα alegység második mutációját, Arg201Cys, egy analóg régióban, amely szintén a GTP hidrolízis gátlásához és a cAMP akkumuláció
receptor-független
stimulációjához
vezetett
[114].
Artemyev
munkacsoportja létrehozott egy Glu200Leu mutáns egérmodellt, melyben a pálcika specifikus α-transzducin GTPáz aktivitása szignifikánsan csökkent. A foszfodiészteráz katalitikus α- és β-alegységei nagymértékben downregulálódtak, azonban a gátló γ-PDE alegység szintje nem változott a Glu200Leu mutációt hordozó egerekben. Az ERG vizsgálatok a pálcika válaszok hiányát írták le, és megfigyelték, hogy a Glu200Leu mutáns egerek kifejezetten inszenzitívek voltak a fényre [115]. Hely-specifikus mutagenezis során a human rasH génben pontmutációkat hoztak létre a Gln200 aminosavnak megfelelő Gln-61 pozícióban 17 különböző reziduumot felhasználva. Minden mutáns protein GTP-hidrolizáló aktivitása 1/8-a volt a normál protein aktivitásának. Ez a modell is bizonyítja a Gln200 Switch2 doménben betöltött jelentős, konformációt meghatározó és a GTPáz aktivitásban betöltött kulcsszerepét [116].
78
Ellentétben a korábban leírt Nougaret-mutációval, amit a GNAT1 Gly38Asp aminosavcseréje okoz és a pálcika-specifikus α-transzducin effektor funkciójának elvesztéséhez vezet, az általunk talált Gln200Glu mutáció következménye feltehetően azonos a Glu200Leu mutáció következményével, azaz a pálcika-specifikus αtranszducin konstitutív aktivációjához és az effektor foszfodiészteráz folyamatos működéséhez vezet a fototanszdukció során, mivel csökkenti a mutáns pálcikaspecifikus
α-transzducin
GTPáz
aktivitását.
Elkészítettük
a
mutáns
fehérje
háromdimenziós modelljét, amely alátámasztotta a feltevésünket és megmutatta, hogy a mutáns fehérjedomén megváltozása a GTPáz aktivitásért felelős katalitikus centrumot változtatja meg (23. Ábra). A konstitutív aktiváció mechanizmusa előfordulhat mind a retina degenerációban, mind a stacioner farkasvakságban. Ezért különösen érdekes kérdés, hogy az egyik esetben miért figyelhető meg a fotoreceptorok degenerációja vagy apoptosisa, míg a másik esetben nem fordul elő, vagy csak enyhe/késői manifesztációjú formában. Lem és Fain hipotézise szerint a konstitutívan aktív mutációk abban az esetben vezetnek súlyos retina degenerációhoz, ha a fotoreceptorok nem képesek regenerálni a rodopszint és a jelátvitel állandó. Ez az állapot az intracelluláris Ca2+ szint csökkenéséhez vezet, és apoptosist vált ki. Azokban az esetekben, ahol a fototranszdukció részben vagy átmenetileg befejeződik/felfüggesztődik, a fotoreceptorok regenerálják a rodopszint és a kation csatornák nyitása révén a Ca2+ koncentráció emelkedik. Így nem következik be apoptosis, és nem látható degeneráció vagy csak enyhe/késői manifesztációjú formában [5]. A fototranszdukció terminációjához időben szükségesek az inaktivációs lépések. A rodopszin-kináz, arrestin és a 11-cisz retinal katalizálja a rodopszin molekula kiindulási állapotba való visszatérését. Az aktivált α-transzducin inaktiválása a transzducin intrinsic GTPáz aktivitása révén és az e hatást segítő RGS9-1 fehérje és a γ-PDE koordinált együttműködése révén valósul meg. Az aktivált effektor αβ-PDE alegysége a γ-PDE alegység visszakötődésével inaktiválódik.
79
A RHO gén konstitutívan aktív mutációja, a Lys296Glu, permanensen gátolja a fototranszdukció inaktivációs mechanizmusát, mely a fotoreceptorok degenerációjához és klinikailag autoszomális domináns retinitis pigmentosához vezet. A Thr94Ile és Ala292Glu mutációkat hordozó, konstitutívan aktív mutáns opszinok autoszomális domináns stacioner farkasvakságot okoznak, mivel a 11-cisz retinal normálisan katalizálja a rodopszin alapállapotba való visszatérését, a fototranszdukciós kaszkád átmenetileg terminálódhat, a fotoreceptorok szintén visszatérnek a kiindulási állapotukba [5]. A foszfodiészteráz enzim β-alegységében talált konstitutívan aktiváló His258Asn mutáció gátolhatja a gátló γ-PDE alegység kötődését az αβ-PDE alegységekhez, azonban a γ-PDE alegység képes gátolni a vad típusú αβ-PDE alegységeket, így részben inaktiválódhat és terminálódhat a fototranszdukciós kaszkád, ami klinikailag farkasvakságban nyilvánul meg. A szürkületben való látáscsökkenés foka és súlyossága a mutáns protein szintjétől függhet. A Nougaret-típusú mutáns α-transzducin esetében a hiányzó downstream effektor funkció cGMP akkumulációhoz vezet, de nem jár retina degenerációval. A GNAT1 gén Gln200Glu mutációja nem befolyásolja a fototranszdukciós kaszkád rodopszin kináz, arresztin és 11-cisz retinal által mediált inaktivációs mechanizmusokat, viszont az αtranszducin helyreállása és a kation csatornák újranyitásának mechanizmusa tisztázatlan. Feltehetően a vad típusú α-transzducin alegység hatására egyes kation csatornák újra megnyílnak és az intracelluláris Ca2+ szint relatív csökkenést mutat. Ez a relatív Ca2+ szint csökkenés azonban nem elegendő az apoptosis kiváltásához, így a pálcika fotoreceptorok nem degenerálódnak, hanem a mutáns α-transzducin által konstitutívan aktivált fototranszdukció révén deszenzitizálódnak és farkasvakság alakul ki. A vizsgált dán családban a retinitis pigmentosában és farkasvakságban szenvedő férfibeteg (II:2) elméletileg hordozhatna compound heterozigóta mutaciókat a GNAT1 génben, azonban a teljes kódoló régió kétirányú szekvenálása nem mutatott más aminosavcserét a Gln200Glu mutáción kívül. A kapcsoltsági analízis kizárta az autoszomális domináns retinitis pigmentosában eddig ismert gének érintettségét, ezért feltételezzük, hogy a retina degeneráció hátterében más gén mutációja állhat a retinitis pigmentosa és a farkasvakság együttes előfordulása véletlenszerű.
80
A PRK kezelést követő corneális sebgyógyulás vizsgálati eredményeinek megbeszélése A corneális homály hátterében többféle eredetet feltételeznek: egyes szerzők szerint a károsodott kollagénszerkezet [41-43], mások szerint a metabolikusan aktív keratocyták [38, 39] illetve az extracelluláris mátrixdepozitumok [29, 40] okozhatják. A homály kialakulása és súlyossági foka függhet a fotoablációs mélységtől, valamint számos posztoperatív környezeti faktortól, többek között az UV-B sugárzástól [28, 38, 44]. A posztoperatív időszak alatt a PRK-val kezelt betegeink kerülték az UV-B hatást (szolárium, napozás) és védőszemüveget viseltek, ezért a környezeti UV-B sugárzás nem játszhatott jelentős szerepet a homály kialakulásában. Feltételezésünk szerint a vizsgált betegcsoportban genetikai prediszpozíció állhatott a kóros corneális sebgyógyulási válasz hátterében. Megfigyelésünket alátámasztotta, hogy a 10 kóros perzisztáló homállyal rendelkező beteg között egy testvérpár van, illetve, hogy minden bilaterális PRK-val kezelt beteg esetében mindkét oldalon kialakult a corneális subepitheliális haze és közel azonos klinikai súlyosságú volt mindkét szemen. A cornea átlátszóságának elvesztése hátterében endothelium diszfunkció is állhat. Ennek kizárása céljából in vivo konfokális mikroszkópiás vizsgálatokat végeztünk. Az in vivo konfokális mikroszkópia valós idejű noninvazív módszer, mely lehetővé teszi az élő corneaszövet optikai szeletelését. Tanulmányunkban a PRK-kezelés uán az epithelium teljes regenerálódását figyeltük meg. Minden fotoablált cornea elülső stromájában fokozott reflektivitás volt megfigyelhető, feltételezve, hogy a corneális subepiteliális haze-t a dezorganizált kollagénstruktúra és az extracelluláris mátrixot termelő aktivált keratocyták celluláris hyperreflektivitása okozta. A keratocyták metabolikus aktivitása mutatta, hogy a sebgyógyulási folyamat évekkel a PRK kezelés után is aktív maradt, és a cornea stroma celluláris és fibrilláris regenerációja befejezetlen volt. Az endothelium intakt volt és nem befolyásolta a cornea transzparenciáját. Összefoglalva, az in vivo konfokális mikroszkópiával bizonyítottuk, hogy a perzisztáló homállyal gyógyuló cornea kóros elváltozásai a stromára korlátozódtak. Vizsgálatunk egybehangzó eredményeket írt le a korábbi irodalmi eredményekkel [39, 117]. A lumikán-deficiens egerek corneájában szintén hasonló
81
diffúz fényvisszaverődést találtak fókuszáló konfokális mikroszkópiával [118]. Feltételezhető továbbá, hogy a subepitheliális homályképződésben a hámsejtek és a stromasejtek megváltozott kölcsönhatása és a neurális diszfunkció szintén szerepet játszhat [119]. Korábbi közlemények leírták, hogy a 193 nm excimer lézer nem rendelkezik citotoxikus és mutagén hatással humán corneális fibroblaszt sejtvonalakon [120, 121], ami alapján kizárható szomatikus mutációk keletkezése az excimer lézerkezelés során. A csírasejtes mutációk jelenléte a különböző cornea-specifikus génekben azonban nem zárható ki. A lumikán és a keratokán bizonyítottan nélkülözhetetlen a zavartalan kollagén fibrillogenezisben, a rostok átmérőjének, méretének, szabályos elrendeződésének elősegítésében és segítik a sejtek migrációját. Target génként szerepelnek a TGF-β2 in vivo szignálizációs folyamataiban [122]. Egérmodellben bizonyították, hogy a lumikán fehérje hiányában a cornea elveszti átlátszóságát. Egy másik kísérlet során a lumikán gén cisztein-gazdag doménjét transzfektálták egér corneális stroma sejttenyészetbe, majd hely-specifikus mutagenezist hoztak létre. Az ultrastrukturális vizsgálatok eltérő többrétegű stromális hálózatot mutattak a mutáns sejtvonal esetén ex vivo, mint a vad típusú sejtvonal esetében: a mutáns sejtvonal megváltozott kollagénrost szerkezetű és elrendeződésű mátrixot hozott létre [123]. A többi keratán-szulfát proteoglikán szerepét további génkiütött egérmodelleken tanulmányozták. A keratokán génhiányos állatokban a cornea stroma elvékonyodását, szűkebb cornea-iris zugot figyeltek meg. A biglikán génhiányos egérmodellben osteoporosis-szerű fenotípus alakult ki. A dekoringénhiányos egerekben a bőr elvékonyodott. A fibromodulin-génhiányos állatoknál abnormális inak alakultak ki a cornea megtartott transzparenciája mellett [58]. A lumikán-fibromodulin-génhiányos állatokban a sclerális és okuláris eltérések számos fenotípusos hasonlóságot mutattak a magas fokú rövidlátással, a sclera elvékonyodása és csökkent ellenállóképessége következtében megnövekedett a bulbus tengelyhossza [58, 59]. Ennek ellenére nem sikerült polimorfizmusok vagy mutációk jelenlétét bizonyítani két magas fokú myopiás családban végzett vizsgálatban [124]. Összefoglalva, a lumikán, keratokán, dekorin, biglikán vagy fibromodulin génhiányos állatokban kötőszöveti elváltozásokat írtak le, viszont csak a lumikán-hiányos egerekben alakult ki corneális opacitás [125]. A knockout egérmodellek segítettek feltárni a corneális proteoglikánok fontos szerepét a cornea fejlődésében és a corneális
82
sebgyógyulás folyamatában, azonban az állatkísérletes eredmények sok esetben nagy különbséget mutathatnak a humán anyagon történő megfigyelések eredményeivel. A lumikán és keratokán fehérjéknek kiemelt szerepük feltételezhető az excimer lézerrel kezelt szaruhártyák sebgyógyulásában is, ezért kutatómunkánk során a két corneaspecifikus jelölt gén mutációanalízisét végeztük el. In vivo vizsgálatok és corneális mRNS gyűjtése a PRK-val kezelt betegeknél nem kivitelezhető, ezért genomiális DNS-t vizsgáltunk a csírasejtes mutációk vizsgálatára. Vizsgálatunk során nem sikerült csírasejtes mutációt azonosítani a lumikán génben a PRK-val
kezelt
kóros
corneális
subepitheliális
homályképződést
mutató
betegcsoportunkban. A keratokán génben azonosított heterozigóta nukleotideltérés egy ismert egy pontot érintő polimorfizmus, mely feltehetően nem bír releváns hatással a PRK után kialakuló kóros corneális homályképződésre. Más csírasejtes mutációt nem sikerült azonosítani a keratokán génben. Lehetséges azonban, hogy a lumikán és a keratokán gének, vagy más transzkripciós faktorok, citokinek és növekedési faktorok mRNS szintű expressziós változásainak van szerepe a corneális haze képződésében. Bár korábbi tanulmányokban leírták, hogy a lumikán gén hibája vagy teljes hiánya az általunk megfigyelt fenotípusos elváltozást hozta létre, eredményeink szerint a PRK után más tényezők játszanak szerepet a corneális haze kialakulásában. A betegek sebgyógyulási válaszában nagyfokú variabilitás figyelhető meg, azonban egyelőre nem áll rendelkezésünkre módszer annak előrejelzésére, hogy kinél alakul ki kóros sebgyógyulási reakció és perzisztáló cornea homály a PRK kezelés után. A betegséget okozó gének keresését nagymértékben megnehezíti, hogy a legtöbb betegség klinikailag heterogén és bizonyos genetikai faktorok nem egyedül határozzák meg a betegségre való hajlamot, hanem több más genetikai és környezeti tényezővel együttesen. A lumikán és keratokán expressziós változásainak szerepe nem zárható ki, mint egy lehetséges tényező a corneális stromában lejátszódó változásokban a PRK-t követően. A keratocyták génexpressziós mintázata változik a növekedési faktorok, citokinek és környezeti hatások következtében is. A jövőben a cornea összetett élettani folyamatainak megismerésével és a további cornea-specifikus gének genetikai variánsainak, mutációinak feltérképezésével közelebb kerülhetünk a még felderítetlen folyamatok tisztázásához.
83
A
glükokortikoid
receptor
polimorfizmusai
vizsgálati
eredményeinek megbeszélése A glükokortikoid hormonok a klinikai gyakorlatban széles körben alkalmazott gyógyszerek, közismert, hogy bizonyos betegeknél az alacsony dózisú szteroidok is képesek mellékhatások kiváltására, míg másoknál a magas dózis sem okoz mellékhatásokat. A szemészetben már az 1960-as években leírták a szteroid-indukált okuláris hipertenzió jelenségét egészséges normál szemnyomású egyéneken és glaukómás betegeken egyaránt. A szteroidhatásra adott válaszok különbözőségét genetikai okokkal magyarázták [65, 66, 69]. A glükokortikoidok hatása a glükokortikoid receptorokon keresztül jön létre. A glükokortikoid receptor nagy mennyiségben expresszálódik a szem trabekuláris hálózatában. A glükokortikoidok, mint a fluorometolon és a prednizolon acetát, gátolják a sebgyógyulást és csökkentik a corneális ödémát. E tulajdonságaik miatt alkalmazzák a fluorometolon és a prednizolon acetát szemcseppeket az excimer lézeres refraktív beavatkozásokat követő posztoperatív időszakban. A glükokortikoidok a trabekuláris hálózat extracelluláris mátrixának átépülése következtében csökkentik a csarnokvíz elvezetését, ezáltal emelik a szemnyomást [104]. A fluorometolon és a prednizolon acetát eltérő hatáserősségű szteroidok, a fluorometolon kisebb mértékben emeli a szemnyomást, míg a dexametazon és prednizolon acetát nagyobb mértékben okoznak szemnyomásemelkedést. Klinikai megfigyelések alátámasztják ezeket az adatokat: egy vizsgálatban a fluorometolon (0.1%) 6.1±1.4 Hgmm (középérték±SD) IOP emelkedést, a prednizolon acetát (1.0%) 10.0±1.7 Hgmm (középérték±SD) IOP emelkedést okozott [126, 127]. További klinikai tanulmányokban a 6 hetes fluorometolon (0.5%) kezelés szintén kisebb IOP emelkedést okozott, mint a 6 hetes dexametazon (0.1%) kezelés; a prednizolonnal kezelt csoportban az átlagos IOP növekedés szintén szignifikáns volt (18.1 Hgmm-ről 27.1 Hgmm-re) [128, 129].
84
A GR polimorfizmusok funkcionális hatásait, a receptor működésében okozott változásokat és a különböző klinikai manifesztációjú kórképek megjelenését, korábbi vizsgálatok
igazolták.
A
legtöbb
mutációt
a
glükokortikoid
szindrómával
összefüggésben írták le. A korábbi irodalmi adatok szerint az N363S variáns és a Bcl I polimorfizmus növeli a glükokortikoid iránti érzékenységet; az ER22/23EK pedig a relatív glükokortikoid rezisztenciával van összefüggésben. Vizsgálatunkban a fluorometolon és a prednizolon acetát kezelést követő szteroidindukált okuláris hipertenzió előfordulását tanulmányoztuk a PRK-val kezelt betegcsoportban. Analizáltuk a különböző genotípusok és a szteroid-indukált okuláris hipertenzió összefüggését, és eredményeink szerint az N363S polimorfizmust hordozók csoportjában szignifikánsan magasabb IOP értékek fordultak elő a prednizolon acetát kezelés alatt. A szemnyomást azonban számos tényező befolyásolja. Feltehetően a haplotípus és a környezeti tényezők kölcsönhatása együttesen gyakorol rá jelentős hatást, következésképpen a vad típusú egyének csoportjában szintén kialakulhat klinikailag
szignifikáns,
lokális
szemnyomáscsökkentő
kezelést
igénylő
szemnyomásemelkedés.
A fotoabláció Goldmann applanációs tonometriát befolyásoló hatása Az excimer lézeres fotoabláció megváltoztatja a cornea vastagságát és rigiditását, ezért befolyásolhatja a Goldmann applanációs tonometriával történő szemnyomásmérést. Azonban a refraktív sebészeti beavatkozásokat követő Goldmann-féle applanációs tonometria pontosságáról, a méréseket pontosító korrekciós faktorokról publikált eredmények és azok klinikai relevanciája nem egyértelmű [63, 130-133]. Az általunk alkalmazott regressziós modellben a fotoabláció nem volt szignifikáns változó, azonban annak kizárása céljából, hogy esetlegesen zavaró tényezőként szerepet játszik, összehasonlítottuk a fotoablációs mélységet az N363N vad típusú és N363S heterozigóta csoportban. A fotoablációs mélység középértéke mindkét csoportban közel azonos volt, az N363N vad típusú csoportban 84.3 (SD = 23.5); az N363S heterozigóta csoportban 85.2 (SD = 27.1), p>0,05.
85
Normál/magasabb szemnyomás vs szemnyomásváltozás A klinikai gyakorlatban a magas szemnyomás diagnózisát 21 Hgmm feletti értéknél alkalmazzuk. Vizsgálatunkban nem a normál szemnyomás felső határát meghaladó IOP értékeket vagy a szemnyomásértékek változását (∆IOP) vettük figyelembe, hanem a mért szemnyomásértékeket hasonlítottuk össze a genetikai és egyéb faktorokkal; így a módszer finomabb összefüggések megfigyelését tette lehetővé. A glükokortikoidok által kiváltott válasz heterogenitásának terápiás konzekvenciái lehetnek,
nemcsak a szemészetben,
hanem a belgyógyászati, reumatológiai,
transzplantációs szteroidkezelések során. Jósolhatóvá válhat, hogy a mellékhatások elkerülése céljából egy adott beteg számára melyik a megfelelő típusú gyógyszer, magas vagy alacsony hatékonyságú szteroidot alkalmazzunk-e, milyen dózisban, illetve a szemészeti esetekben milyen szemnyomáscsökkentő kiválasztásával kombináljuk az egyénreszabott kezelést. A kóros sebgyógyulásra és a szekunder szemnyomás emelkedésre való hajlam pontosabb megismerése segíthetne a rizikócsoportok preoperatív kiszűrésében, ezáltal lehetővé válna a posztoperatív szövődmények elkerülése és az excimer lézeres kezelések biztonságosságának növelése.
86
Következtetések 1. a, Az ismert autoszomális domináns retinitis pigmentosa és autoszomális domináns kongenitális stacioner farkasvakságot okozó gének közül kapcsoltsági analízissel kiválasztottuk a jelölt GNAT1 gént. Az általunk tervezett primerekkel optimalizáltuk a mutációanalízis módszerét, mely során sikerült azonosítani az új Gln200Glu heterozigóta misszenz mutációt a pálcika-specifikus G-protein alfa-alegységének génjében a vizsgált dán családban. b, Az elkészített mutáns fehérjemodell alapján feltételezzük, hogy a Gln200Glu mutáció a GTP hidrolízisért felelős katalitikus centrum konformációs változását okozza, ezáltal csökkenti az α-transzducin GTPáz aktivitását és konstitutív aktivációhoz vezet a fototranszdukciós kaszkádban.
2.1. a, Elsőként vizsgáltuk humán betegcsoportban a lumikán gén mutációit az általunk kidolgozott metodikával. A lumikán gén csírasejtes mutációinak jelenléte a kóros corneális homályt mutató, PRK-val kezelt betegcsoportban nem igazolódott, ezért nagy valószínűséggel nem játszanak szerepet a PRK-t követő kóros corneális subepitheliális homály kialakulásában. b, Kidolgoztuk az optimális PCR és heteroduplex analízisen alapuló mutációs előszűrő módszert a keratokán gén vizsgálatára. Az elvégzett mutációanalízis alapján a keratokán gén csírasejtes mutációinak szerepe a kóros corneális homály kialakulásában nem igazolódott a vizsgált betegcsoportban.
2.2
a, Elsőként vizsgáltuk a GR N363S, Bcl I és ER22/23EK polimorfizmusainak előfordulását szemészeti betegcsoportban. A általunk vizsgált PRK-val kezelt betegcsoportban
a
polimorfizmusok
allélfrekvenciája
megegyezett
az
irodalomban leírt adatokkal. A kaukázusi népesség adataihoz hasonlóan S363S homozigóta polimorf allél szintén nem fordult elő a vizsgált betegcsoportban.
87
b,
Elsőként
vizsgáltuk
a
glükokortikoid
receptor
gén
funkcionális
polimorfizmusa - N363S, Bcl I, ER22/23EK - és a szteroid-indukált szekunder szemnyomásemelkedés asszociációját. Nem találtunk szignifikáns összefüggést az N363S, Bcl I és ER22/23EK génvariánsok és a szteroid-indukált okuláris hipertenzió előfordulása között PRK után fluorometolonnal (0.1%) kezelt betegcsoportban. c, Elsőként írtuk le a glükokortikoid receptor N363S polimorfizmusa és a szteroid-indukált
okuláris
hipertenzió
előfordulása
közötti
szignifikáns
összefüggést PRK után prednizolon acetáttal (0.5%) kezelt betegcsoportban. A Bcl I és ER22/23EK génvariánsok és a szteroid-indukált okuláris hipertenzió előfordulása között nem találtunk asszociációt PRK után prednizolon acetáttal (0.5%) kezelt betegcsoportban.
88
Összefoglaló A Ph.D. értekezésem célja azon génmutációk és polimorfizmusok vizsgálata volt, melyek feltételezhetően fontos szerepet játszanak az autoszomális domináns öröklődésű veleszületett stacioner farkasvakság (adCSNB), és a fotorefraktív keratektomiával kezelt betegcsoportban elforduló két multifaktoriális kórkép patomechanizmusában. Kutatómunkánkban a GNAT1 gén mutációanalízise során azonosítottunk egy új heterozigóta C/G tranzíciót (c.598C>G) a transzducin α-alegység génjének 6. exonjában, amely a p.Gln200Glu szubsztitúcióhoz vezet a konzervált Switch 2 fehérjedoménben.
A
háromdimenziós
számítógépes
modellezés
arra
enged
következtetni, hogy a mutáns fehérje csökkent GTPáz aktivitást eredményez, amely konstitutív aktivációhoz vezet a fototranszdukciós kaszkádban és adCSNB-t okoz. (Szabó és mtsai, Hum Mutat 2007, 28(7):741-2.) A fotorefraktív keratektomiával kezelt betegcsoportban, először a kóros corneális subepitheliális homályképződés genetikai hátterét tanulmányoztuk. Ez a klinikai kép hasonlít a lumikán-null egérmodellben leírt fenotípushoz, ezért elvégeztük a lumikán és keratokán gének mutációanalízisét. Nem találtunk bizonyítékot arra, hogy a lumikán és keratokán gének csírasejtes mutációi szerepet játszanak a subepitheliális corneális homály kialakulásában. Eredményeink szerint a kóros corneális homályképződés patomechanizmusa PRK kezelt humán betegcsoportban eltér a lumikán deficiens knockout egérmodellben leírt patomechanizmustól. (Szabó és mtsai, Mol Vis 2006, 12:597-605.) A fotorefraktív keratektomiával kezelt betegcsoportban, egy további tanulmányban a szteroid-indukált okuláris hipertenzió és a glükokortikoid receptor (GR) funkcionális polimorfizmusainak összefüggését vizsgáltuk. Az egészséges populációban tapasztalt, szteroidra adott válasz különbözőségét a GR genetikai variánsai befolyásolhatják, ezért megvizsgáltuk, hogy az N363S, ER22/23EK, és Bcl I variánsok szerepet játszanak-e védő vagy rizikófaktorként az exogén szteroidkezelés során a szteroid-indukált okuláris hipertenzió kialakulásában. Prednizolon acetáttal kezelt betegcsoportban szignifikáns összefüggést találtunk az N363S heterozigóta státusz és a szteroid-indukált okuláris hipertenzió között. Az N363S polimorfizmus genotipizálása és a szteroid responder rizikócsoportok felismerése egyéni kezelést tenne lehetővé a szteroid-indukált okuláris hipertenzió megelőzése céljából. (Szabó és mtsai, Mol Vis 2007, 13:659-666.)
89
Summary Study of mutations and polymorphisms in ocular diseases The aim of my Ph.D. thesis was to examine genetic mutations and polymorphisms thought to be potentially important in the mechanism of the autosomal dominant congenital stationary night blindness (adCSNB), and in two multifactorial disorders of patients treated with photorefractive keratectomy. In the course of our study on mutational analysis of GNAT1 gene we identified a novel heterozygous C to G alteration (c.598C>G) in exon 6 of transducin α-subunit gene that should result in the p.Gln200Glu substitution in the highly conserved Switch 2 region of α-transducin. The three dimensional computer modeling of transducin suggests that the mutant protein exhibits impaired GTPase activity, thereby leading to constitutive activation of phototransduction and causing adCSNB. (Szabo et al., Hum Mutat 2007, 28(7):741-2.) In patients treated with photorefractive keratectomy, first a genetic study of severe subepithelial corneal haze was performed. Since this clinical condition resembles the lumican-null mouse phenotype, mutation analysis of lumican and keratocan genes was carried out. There was no evidence that germline mutation of lumican and keratocan genes participate in the aetiology of subepithelial corneal haze. Our findings suggest that the mechanisms of the development of severe corneal opacity are different in humans after PRK compared to the lumican-deficient knockout mouse model. (Szabo et al., Mol Vis 2006, 12:597-605.) In patients treated with photorefractive keratectomy, a further association study of steroid-induced ocular hypertension and functional polymorphisms of glucocorticoid receptor was carried out. Since variation in responsiveness to glucocorticoids observed in healthy population is influenced by genetic polymorphisms of the glucocorticoid receptor gene, we investigated whether variants N363S, ER22/23EK, and Bcl I may contribute to steroid-induced ocular hypertension. In cases where prednisolone acetate was administered, we found a significant correlation between N363S heterozygosity and steroid-induced ocular hypertension. Genotyping of N363S polymorphism and identifying high risk steroid responders may allow an individual therapy to avoid steroid-induced ocular hypertension. (Szabo et al., Mol Vis 2007, 13:659-666.)
90
Irodalomjegyzék 1.
Dryja TP. (2000) Molecular genetics of Oguchi disease, fundus albipunctatus, and other forms of stationary night blindness: LVII Edward Jackson Memorial Lecture. Am J Ophthalmol, 130: 547-63.
2.
Slepak VZ, Artemyev NO, Zhu Y, Dumke CL, Sabacan L, Sondek J, Hamm HE, Bownds MD, Arshavsky VY. (1995) An effector site that stimulates Gprotein GTPase in photoreceptors. J Biol Chem, 270: 14319-24.
3.
Slep KC, Kercher MA, He W, Cowan CW, Wensel TG, Sigler PB. (2001) Structural determinants for regulation of phosphodiesterase by a G protein at 2.0 A. Nature, 409: 1071-7.
4.
Cowan CW, He W, Wensel TG. (2001) RGS proteins: lessons from the RGS9 subfamily. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 65: 341-59.
5.
van Rossum EF, Voorhoeve PG, te Velde SJ, Koper JW, Delemarre-van de Waal HA, Kemper HC, Lamberts SW. (2004) The ER22/23EK polymorphism in the glucocorticoid receptor gene is associated with a beneficial body composition and muscle strength in young adults. J Clin Endocrinol Metab, 89: 4004-9.
6.
Zeitz C, Minotti R, Feil S, Matyas G, Cremers FP, Hoyng CB, Berger W. (2005) Novel mutations in CACNA1F and NYX in Dutch families with X-linked congenital stationary night blindness. Mol Vis, 11: 179-83.
7.
Dryja TP, Berson EL, Rao VR, Oprian DD. (1993) Heterozygous missense mutation in the rhodopsin gene as a cause of congenital stationary night blindness. Nat Genet, 4: 280-3.
8.
Sieving PA, Richards JE, Naarendorp F, Bingham EL, Scott K, Alpern M. (1995) Dark-light: model for night blindness from the human rhodopsin Gly-90->Asp mutation. Proc Natl Acad Sci U S A, 92: 880-4.
9.
al-Jandal N, Farrar GJ, Kiang AS, Humphries MM, Bannon N, Findlay JB, Humphries P, Kenna PF. (1999) A novel mutation within the rhodopsin gene (Thr-94-Ile) causing autosomal dominant congenital stationary night blindness. Hum Mutat, 13: 75-81.
91
10.
Dryja TP, Hahn LB, Reboul T, Arnaud B. (1996) Missense mutation in the gene encoding the alpha subunit of rod transducin in the Nougaret form of congenital stationary night blindness. Nat Genet, 13: 358-60.
11.
Gal A, Orth U, Baehr W, Schwinger E, Rosenberg T. (1994) Heterozygous missense mutation in the rod cGMP phosphodiesterase beta-subunit gene in autosomal dominant stationary night blindness. Nat Genet, 7: 64-8.
12.
Fuchs S, Nakazawa M, Maw M, Tamai M, Oguchi Y, Gal A. (1995) A homozygous 1-base pair deletion in the arrestin gene is a frequent cause of Oguchi disease in Japanese. Nat Genet, 10: 360-2.
13.
Yamamoto S, Sippel KC, Berson EL, Dryja TP. (1997) Defects in the rhodopsin kinase gene in the Oguchi form of stationary night blindness. Nat Genet, 15: 175-8.
14.
Zeitz C, van Genderen M, Neidhardt J, Luhmann UF, Hoeben F, Forster U, Wycisk K, Matyas G, Hoyng CB, Riemslag F, Meire F, Cremers FP, Berger W. (2005) Mutations in GRM6 cause autosomal recessive congenital stationary night blindness with a distinctive scotopic 15-Hz flicker electroretinogram. Invest Ophthalmol Vis Sci, 46: 4328-35.
15.
Alitalo T, Kruse TA, Forsius H, Eriksson AW, de la Chapelle A. (1991) Localization of the Aland Island eye disease locus to the pericentromeric region of the X chromosome by linkage analysis. Am J Hum Genet, 48: 31-8.
16.
Bech-Hansen NT, Naylor MJ, Maybaum TA, Sparkes RL, Koop B, Birch DG, Bergen AA, Prinsen CF, Polomeno RC, Gal A, Drack AV, Musarella MA, Jacobson SG, Young RS, Weleber RG. (2000) Mutations in NYX, encoding the leucine-rich proteoglycan nyctalopin, cause X-linked complete congenital stationary night blindness. Nat Genet, 26: 319-23.
17.
Bech-Hansen NT, Boycott KM, Gratton KJ, Ross DA, Field LL, Pearce WG. (1998) Localization of a gene for incomplete X-linked congenital stationary night blindness to the interval between DXS6849 and DXS8023 in Xp11.23. Hum Genet, 103: 124-30.
18.
Boycott KM, Maybaum TA, Naylor MJ, Weleber RG, Robitaille J, Miyake Y, Bergen AA, Pierpont ME, Pearce WG, Bech-Hansen NT. (2001) A summary of 20 CACNA1F mutations identified in 36 families with incomplete X-linked
92
congenital stationary night blindness, and characterization of splice variants. Hum Genet, 108: 91-7. 19.
Cunier F. (1838) Histiore d'une héméralopie héréditaire depuis deux siècles dans une famille de la commune de Vendémian, près Montpellier. Ann Soc Médicin de Gand: 383-95.
20.
Nettleship E. (1907) A history of congenital stationary nightblindness in nine consecutive generations. Trans Ophthalmol Soc UK 27: 269-93.
21.
Rosenberg T, Haim M, Piczenik Y, Simonsen SE. (1991) Autosomal dominant stationary night-blindness. A large family rediscovered. Acta Ophthalmol (Copenh), 69: 694-702.
22.
Rao VR, Cohen GB, Oprian DD. (1994) Rhodopsin mutation G90D and a molecular mechanism for congenital night blindness. Nature, 367: 639-42.
23.
Cohen GB, Oprian DD, Robinson PR. (1992) Mechanism of activation and inactivation of opsin: role of Glu113 and Lys296. Biochemistry, 31: 12592-601.
24.
Robinson PR, Cohen GB, Zhukovsky EA, Oprian DD. (1992) Constitutively active mutants of rhodopsin. Neuron, 9: 719-25.
25.
Fingert JH, Clark AF, Craig JE, Alward WL, Snibson GR, McLaughlin M, Tuttle L, Mackey DA, Sheffield VC, Stone EM. (2001) Evaluation of the myocilin (MYOC) glaucoma gene in monkey and human steroid-induced ocular hypertension. Invest Ophthalmol Vis Sci, 42: 145-52.
26.
Gal A, Xu S, Piczenik Y, Eiberg H, Duvigneau C, Schwinger E, Rosenberg T. (1994) Gene for autosomal dominant congenital stationary night blindness maps to the same region as the gene for the beta-subunit of the rod photoreceptor cGMP phosphodiesterase (PDEB) in chromosome 4p16.3. Hum Mol Genet, 3: 323-5.
27.
Bleckmann H, Schnoy N, Kresse H. (2002) Electron microscopic and immunohistochemical examination of scarred human cornea re-treated by excimer laser. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 240: 271-8.
28.
Nagy ZZ, Hiscott P, Seitz B, Schlotzer-Schrehardt U, Suveges I, Naumann GO. (1997) Clinical and morphological response to UV-B irradiation after excimer laser photorefractive keratectomy. Surv Ophthalmol, 42 Suppl 1: S64-76.
93
29.
Fitzsimmons TD, Fagerholm P, Tengroth B. (1993) Steroid treatment of myopic regression: acute refractive and topographic changes in excimer photorefractive keratectomy patients. Cornea, 12: 358-61.
30.
Strom TM, Nyakatura G, Apfelstedt-Sylla E, Hellebrand H, Lorenz B, Weber BH, Wutz K, Gutwillinger N, Ruther K, Drescher B, Sauer C, Zrenner E, Meitinger T, Rosenthal A, Meindl A. (1998) An L-type calcium-channel gene mutated in incomplete X-linked congenital stationary night blindness. Nat Genet, 19: 260-3.
31.
Füst Á, Ratkay I, Süveges I, Bor Z, Nagy ZZ. (1994) Excimer lézer kezelés hatása a nyúl corneájára - elektronmikroszkópos tanulmány. Szemészet 131: 8588.
32.
Fust A, Veres A, Kiszel P, Nagy ZZ, Cervenak L, Csakany B, Maka E, Suveges I, Grus FH. (2003) Changes in tear protein pattern after photorefractive keratectomy. Eur J Ophthalmol, 13: 525-31.
33.
Wilson SE. (2002) Analysis of the keratocyte apoptosis, keratocyte proliferation, and myofibroblast transformation responses after photorefractive keratectomy and laser in situ keratomileusis. Trans Am Ophthalmol Soc, 100: 411-33.
34.
Wilson SE. (2000) Role of apoptosis in wound healing in the cornea. Cornea, 19: S7-12.
35.
Resch M, Szentmary N, Nagy ZZ, Czumbel N. (2004) [Comparison of results of photorefractive keratectomy and laser in situ keratomileusis in the treatment of hyperopia using a flying spot eximer laser]. Orv Hetil, 145: 573-8.
36.
Nawata H, Tanaka S, Tanaka S, Takayanagi R, Sakai Y, Yanase T, Ikuyama S, Haji M. (1995) Aromatase in bone cell: association with osteoporosis in postmenopausal women. J Steroid Biochem Mol Biol, 53: 165-74.
37.
Weleber RG, Pillers DA, Powell BR, Hanna CE, Magenis RE, Buist NR. (1989) Aland Island eye disease (Forsius-Eriksson syndrome) associated with contiguous deletion syndrome at Xp21. Similarity to incomplete congenital stationary night blindness. Arch Ophthalmol, 107: 1170-9.
38.
Moller-Pedersen T. (2003) On the structural origin of refractive instability and corneal haze after excimer laser keratectomy for myopia. Acta Ophthalmol Scand Suppl: 1-20.
94
39.
Moller-Pedersen T, Cavanagh HD, Petroll WM, Jester JV. (2000) Stromal wound healing explains refractive instability and haze development after photorefractive
keratectomy:
a
1-year
confocal
microscopic
study.
Ophthalmology, 107: 1235-45. 40.
Zieske JD. (2001) Extracellular matrix and wound healing. Curr Opin Ophthalmol, 12: 237-41.
41.
Rada JA, Cornuet PK, Hassell JR. (1993) Regulation of corneal collagen fibrillogenesis in vitro by corneal proteoglycan (lumican and decorin) core proteins. Exp Eye Res, 56: 635-48.
42.
Saika S, Shiraishi A, Liu CY, Funderburgh JL, Kao CW, Converse RL, Kao WW. (2000) Role of lumican in the corneal epithelium during wound healing. J Biol Chem, 275: 2607-12.
43.
Kurpakus Wheater M, Kernacki KA, Hazlett LD. (1999) Corneal cell proteins and ocular surface pathology. Biotech Histochem, 74: 146-59.
44.
Nagy ZZ, Hiscott P, Seitz B, Shlotzer-Schrehardt U, Simon M, Jr., Suveges I, Naumann GO. (1997) Ultraviolet-B enhances corneal stromal response to 193nm excimer laser treatment. Ophthalmology, 104: 375-80.
45.
Ying S, Shiraishi A, Kao CW, Converse RL, Funderburgh JL, Swiergiel J, Roth MR, Conrad GW, Kao WW. (1997) Characterization and expression of the mouse lumican gene. J Biol Chem, 272: 30306-13.
46.
Funderburgh JL, Hevelone ND, Roth MR, Funderburgh ML, Rodrigues MR, Nirankari VS, Conrad GW. (1998) Decorin and biglycan of normal and pathologic human corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci, 39: 1957-64.
47.
Chakravarti S, Magnuson T, Lass JH, Jepsen KJ, LaMantia C, Carroll H. (1998) Lumican regulates collagen fibril assembly: skin fragility and corneal opacity in the absence of lumican. J Cell Biol, 141: 1277-86.
48.
Funderburgh JL, Funderburgh ML, Mann MM, Conrad GW. (1991) Arterial lumican. Properties of a corneal-type keratan sulfate proteoglycan from bovine aorta. J Biol Chem, 266: 24773-7.
49.
Grover J, Chen XN, Korenberg JR, Roughley PJ. (1995) The human lumican gene. Organization, chromosomal location, and expression in articular cartilage. J Biol Chem, 270: 21942-9.
95
50.
Chakravarti S, Stallings RL, SundarRaj N, Cornuet PK, Hassell JR. (1995) Primary structure of human lumican (keratan sulfate proteoglycan) and localization of the gene (LUM) to chromosome 12q21.3-q22. Genomics, 27: 481-8.
51.
Cornuet PK, Blochberger TC, Hassell JR. (1994) Molecular polymorphism of lumican during corneal development. Invest Ophthalmol Vis Sci, 35: 870-7.
52.
Corpuz LM, Funderburgh JL, Funderburgh ML, Bottomley GS, Prakash S, Conrad GW. (1996) Molecular cloning and tissue distribution of keratocan. Bovine corneal keratan sulfate proteoglycan 37A. J Biol Chem, 271: 9759-63.
53.
Tasheva ES, Funderburgh JL, Funderburgh ML, Corpuz LM, Conrad GW. (1999) Structure and sequence of the gene encoding human keratocan. DNA Seq, 10: 67-74.
54.
Pellegata NS, Dieguez-Lucena JL, Joensuu T, Lau S, Montgomery KT, Krahe R, Kivela T, Kucherlapati R, Forsius H, de la Chapelle A. (2000) Mutations in KERA, encoding keratocan, cause cornea plana. Nat Genet, 25: 91-5.
55.
Lehmann OJ, El-ashry MF, Ebenezer ND, Ocaka L, Francis PJ, Wilkie SE, Patel RJ, Ficker L, Jordan T, Khaw PT, Bhattacharya SS. (2001) A novel keratocan mutation causing autosomal recessive cornea plana. Invest Ophthalmol Vis Sci, 42: 3118-22.
56.
Sipila K, Aula P. (2002) Database for the mutations of the Finnish disease heritage. Hum Mutat, 19: 16-22.
57.
Saika S, Ohnishi Y, Ooshima A, Liu CY, Kao WW. (2002) Epithelial repair: roles of extracellular matrix. Cornea, 21: S23-9.
58.
Chakravarti S. (2002) Functions of lumican and fibromodulin: lessons from knockout mice. Glycoconj J, 19: 287-93.
59.
Chakravarti S, Paul J, Roberts L, Chervoneva I, Oldberg A, Birk DE. (2003) Ocular and scleral alterations in gene-targeted lumican-fibromodulin double-null mice. Invest Ophthalmol Vis Sci, 44: 2422-32.
60.
Chakravarti S, Petroll WM, Hassell JR, Jester JV, Lass JH, Paul J, Birk DE. (2000) Corneal opacity in lumican-null mice: defects in collagen fibril structure and packing in the posterior stroma. Invest Ophthalmol Vis Sci, 41: 3365-73.
96
61.
Liu CY, Birk DE, Hassell JR, Kane B, Kao WW. (2003) Keratocan-deficient mice display alterations in corneal structure. J Biol Chem, 278: 21672-7.
62.
Sher NA, Chen V, Bowers RA, Frantz JM, Brown DC, Eiferman R, Lane SS, Parker P, Ostrov C, Doughman D, et al. (1991) The use of the 193-nm excimer laser for myopic photorefractive keratectomy in sighted eyes. A multicenter study. Arch Ophthalmol, 109: 1525-30.
63.
Nagy ZZ, Szabo A, Krueger RR, Suveges I. (2001) Treatment of intraocular pressure elevation after photorefractive keratectomy. J Cataract Refract Surg, 27: 1018-24.
64.
Gartry DS, Muir MG, Lohmann CP, Marshall J. (1992) The effect of topical corticosteroids on refractive outcome and corneal haze after photorefractive keratectomy. A prospective, randomized, double-blind trial. Arch Ophthalmol, 110: 944-52.
65.
Armaly MF. (1967) The genetic determination of ocular pressure in the normal eye. Arch Ophthalmol, 78: 187-92.
66.
Armaly MF. (1967) Genetic determination of cup/disc ratio of the optic nerve. Arch Ophthalmol, 78: 5-43.
67.
Armaly MF. (1967) Inheritance of dexamethasone hypertension and glaucoma. Arch Ophthalmol, 77: 747-51.
68.
Clark AF, Wilson K, de Kater AW, Allingham RR, McCartney MD. (1995) Dexamethasone-induced ocular hypertension in perfusion-cultured human eyes. Invest Ophthalmol Vis Sci, 36: 478-89.
69.
Armaly MF. (1963) Effect of Corticosteroids on Intraocular Pressure and Fluid Dynamics. Ii. the Effect of Dexamethasone in the Glaucomatous Eye. Arch Ophthalmol, 70: 492-9.
70.
Bhattacherjee P, Paterson CA, Spellman JM, Graff G, Yanni JM. (1999) Pharmacological validation of a feline model of steroid-induced ocular hypertension. Arch Ophthalmol, 117: 361-4.
71.
Shepard AR, Jacobson N, Fingert JH, Stone EM, Sheffield VC, Clark AF. (2001) Delayed secondary glucocorticoid responsiveness of MYOC in human trabecular meshwork cells. Invest Ophthalmol Vis Sci, 42: 3173-81.
97
72.
Wilson K, McCartney MD, Miggans ST, Clark AF. (1993) Dexamethasone induced ultrastructural changes in cultured human trabecular meshwork cells. Curr Eye Res, 12: 783-93.
73.
Stokes J, Noble J, Brett L, Phillips C, Seckl JR, O'Brien C, Andrew R. (2000) Distribution of glucocorticoid and mineralocorticoid receptors and 11betahydroxysteroid dehydrogenases in human and rat ocular tissues. Invest Ophthalmol Vis Sci, 41: 1629-38.
74.
Gupta V, Wagner BJ. (2003) Expression of the functional glucocorticoid receptor in mouse and human lens epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci, 44: 2041-6.
75.
Wilson SE, Lloyd SA, He YG. (1994) Glucocorticoid receptor and interleukin-1 receptor messenger RNA expression in corneal cells. Cornea, 13: 4-8.
76.
Yudt MR, Cidlowski JA. (2002) The glucocorticoid receptor: coding a diversity of proteins and responses through a single gene. Mol Endocrinol, 16: 1719-26.
77.
Giguere V, Hollenberg SM, Rosenfeld MG, Evans RM. (1986) Functional domains of the human glucocorticoid receptor. Cell, 46: 645-52.
78.
Reichardt HM, Tuckermann JP, Gottlicher M, Vujic M, Weih F, Angel P, Herrlich P, Schutz G. (2001) Repression of inflammatory responses in the absence of DNA binding by the glucocorticoid receptor. Embo J, 20: 7168-73.
79.
Buttgereit F, Brand MD, Burmester GR. (1999) Equivalent doses and relative drug potencies for non-genomic glucocorticoid effects: a novel glucocorticoid hierarchy. Biochem Pharmacol, 58: 363-8.
80.
Schacke H, Schottelius A, Docke WD, Strehlke P, Jaroch S, Schmees N, Rehwinkel H, Hennekes H, Asadullah K. (2004) Dissociation of transactivation from transrepression by a selective glucocorticoid receptor agonist leads to separation of therapeutic effects from side effects. Proc Natl Acad Sci U S A, 101: 227-32.
81.
Chrousos GP, Kino T. (2005) Intracellular glucocorticoid signaling: a formerly simple system turns stochastic. Sci STKE, 2005: pe48.
82.
Wikstrom AC. (2003) Glucocorticoid action and novel mechanisms of steroid resistance: role of glucocorticoid receptor-interacting proteins for glucocorticoid responsiveness. J Endocrinol, 178: 331-7.
98
83.
DeRijk RH, Schaaf M, de Kloet ER. (2002) Glucocorticoid receptor variants: clinical implications. J Steroid Biochem Mol Biol, 81: 103-22.
84.
Leung DY, Hamid Q, Vottero A, Szefler SJ, Surs W, Minshall E, Chrousos GP, Klemm DJ. (1997) Association of glucocorticoid insensitivity with increased expression of glucocorticoid receptor beta. J Exp Med, 186: 1567-74.
85.
Fleury I, Beaulieu P, Primeau M, Labuda D, Sinnett D, Krajinovic M. (2003) Characterization of the BclI polymorphism in the glucocorticoid receptor gene. Clin Chem, 49: 1528-31.
86.
Di Blasio AM, van Rossum EF, Maestrini S, Berselli ME, Tagliaferri M, Podesta F, Koper JW, Liuzzi A, Lamberts SW. (2003) The relation between two polymorphisms in the glucocorticoid receptor gene and body mass index, blood pressure and cholesterol in obese patients. Clin Endocrinol (Oxf), 59: 68-74.
87.
Koper JW, Stolk RP, de Lange P, Huizenga NA, Molijn GJ, Pols HA, Grobbee DE, Karl M, de Jong FH, Brinkmann AO, Lamberts SW. (1997) Lack of association between five polymorphisms in the human glucocorticoid receptor gene and glucocorticoid resistance. Hum Genet, 99: 663-8.
88.
Huizenga NA, Koper JW, De Lange P, Pols HA, Stolk RP, Burger H, Grobbee DE, Brinkmann AO, De Jong FH, Lamberts SW. (1998) A polymorphism in the glucocorticoid receptor gene may be associated with and increased sensitivity to glucocorticoids in vivo. J Clin Endocrinol Metab, 83: 144-51.
89.
van Rossum EF, Roks PH, de Jong FH, Brinkmann AO, Pols HA, Koper JW, Lamberts SW. (2004) Characterization of a promoter polymorphism in the glucocorticoid receptor gene and its relationship to three other polymorphisms. Clin Endocrinol (Oxf), 61: 573-81.
90.
van Rossum EF, Koper JW, van den Beld AW, Uitterlinden AG, Arp P, Ester W, Janssen JA, Brinkmann AO, de Jong FH, Grobbee DE, Pols HA, Lamberts SW. (2003) Identification of the BclI polymorphism in the glucocorticoid receptor gene: association with sensitivity to glucocorticoids in vivo and body mass index. Clin Endocrinol (Oxf), 59: 585-92.
91.
Wust S, Van Rossum EF, Federenko IS, Koper JW, Kumsta R, Hellhammer DH. (2004) Common polymorphisms in the glucocorticoid receptor gene are
99
associated with adrenocortical responses to psychosocial stress. J Clin Endocrinol Metab, 89: 565-73. 92.
Russcher H, Smit P, van den Akker EL, van Rossum EF, Brinkmann AO, de Jong FH, Lamberts SW, Koper JW. (2005) Two polymorphisms in the glucocorticoid receptor gene directly affect glucocorticoid-regulated gene expression. J Clin Endocrinol Metab, 90: 5804-10.
93.
Panarelli M, Holloway CD, Fraser R, Connell JM, Ingram MC, Anderson NH, Kenyon
CJ.
(1998)
Glucocorticoid
receptor
polymorphism,
skin
vasoconstriction, and other metabolic intermediate phenotypes in normal human subjects. J Clin Endocrinol Metab, 83: 1846-52. 94.
Koyano S, Saito Y, Sai K, Kurose K, Ozawa S, Nakajima T, Matsumoto K, Saito H, Shirao K, Yoshida T, Minami H, Ohtsu A, Saijo N, Sawada J. (2005) Novel genetic polymorphisms in the NR3C1 (glucocorticoid receptor) gene in a Japanese population. Drug Metab Pharmacokinet, 20: 79-84.
95.
Lin RC, Wang XL, Morris BJ. (2003) Association of coronary artery disease with glucocorticoid receptor N363S variant. Hypertension, 41: 404-7.
96.
Dobson MG, Redfern CP, Unwin N, Weaver JU. (2001) The N363S polymorphism of the glucocorticoid receptor: potential contribution to central obesity in men and lack of association with other risk factors for coronary heart disease and diabetes mellitus. J Clin Endocrinol Metab, 86: 2270-4.
97.
van Rossum EF, Lamberts SW. (2004) Polymorphisms in the glucocorticoid receptor gene and their associations with metabolic parameters and body composition. Recent Prog Horm Res, 59: 333-57.
98.
Watt GC, Harrap SB, Foy CJ, Holton DW, Edwards HV, Davidson HR, Connor JM, Lever AF, Fraser R. (1992) Abnormalities of glucocorticoid metabolism and the renin-angiotensin system: a four-corners approach to the identification of genetic determinants of blood pressure. J Hypertens, 10: 473-82.
99.
Tremblay A, Bouchard L, Bouchard C, Despres JP, Drapeau V, Perusse L. (2003) Long-term adiposity changes are related to a glucocorticoid receptor polymorphism in young females. J Clin Endocrinol Metab, 88: 3141-5.
100.
van Rossum EF, Koper JW, Huizenga NA, Uitterlinden AG, Janssen JA, Brinkmann AO, Grobbee DE, de Jong FH, van Duyn CM, Pols HA, Lamberts
100
SW. (2002) A polymorphism in the glucocorticoid receptor gene, which decreases sensitivity to glucocorticoids in vivo, is associated with low insulin and cholesterol levels. Diabetes, 51: 3128-34. 101.
van Rossum EF, Feelders RA, van den Beld AW, Uitterlinden AG, Janssen JA, Ester W, Brinkmann AO, Grobbee DE, de Jong FH, Pols HA, Koper JW, Lamberts SW. (2004) Association of the ER22/23EK polymorphism in the glucocorticoid receptor gene with survival and C-reactive protein levels in elderly men. Am J Med, 117: 158-62.
102.
Ott J. (1974) Estimation of the recombination fraction in human pedigrees: efficient computation of the likelihood for human linkage studies. Am J Hum Genet, 26: 588-97.
103.
Lathrop GM, Lalouel JM, Julier C, Ott J. (1984) Strategies for multilocus linkage analysis in humans. Proc Natl Acad Sci U S A, 81: 3443-6.
104.
Ziai N, Ory SJ, Khan AR, Brubaker RF. (1994) Beta-human chorionic gonadotropin, progesterone, and aqueous dynamics during pregnancy. Arch Ophthalmol, 112: 801-6.
105.
Steger G. (1994) Thermal denaturation of double-stranded nucleic acids: prediction of temperatures critical for gradient gel electrophoresis and polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res, 22: 2760-8.
106.
Majnik J, Patocs A, Balogh K, Toth M, Racz K. (2004) A rapid and simple method for detection of Asn363Ser polymorphism of the human glucocorticoid receptor gene. J Steroid Biochem Mol Biol, 92: 465-8.
107.
Gergics P, Patocs A, Majnik J, Balogh K, Szappanos A, Toth M, Racz K. (2006) Detection of the Bcl I polymorphism of the glucocorticoid receptor gene by single-tube allele-specific polymerase chain reaction. J Steroid Biochem Mol Biol, 100: 161-6.
108.
Landis CA, Masters SB, Spada A, Pace AM, Bourne HR, Vallar L. (1989) GTPase inhibiting mutations activate the alpha chain of Gs and stimulate adenylyl cyclase in human pituitary tumours. Nature, 340: 692-6.
109.
Bourne HR, Landis CA, Masters SB. (1989) Hydrolysis of GTP by the alphachain of Gs and other GTP binding proteins. Proteins, 6: 222-30.
101
110.
Natochin M, Granovsky AE, Artemyev NO. (1998) Identification of effector residues on photoreceptor G protein, transducin. J Biol Chem, 273: 21808-15.
111.
Skiba NP, Bae H, Hamm HE. (1996) Mapping of effector binding sites of transducin alpha-subunit using G alpha t/G alpha i1 chimeras. J Biol Chem, 271: 413-24.
112.
Natochin M, Artemyev NO. (2003) A point mutation uncouples transducinalpha from the photoreceptor RGS and effector proteins. J Neurochem, 87: 1262-71.
113.
Srinivasan J GR, Hadwiger JA. (1999) Activated G alpha-subunits can inhibit multiple signal transduction pathways during Dictyostelium development. Developmental Biology, 215: 443-452.
114.
Farfel Z, Iiri T, Shapira H, Roitman A, Mouallem M, Bourne HR. (1996) Pseudohypoparathyroidism, a novel mutation in the betagamma-contact region of Gsalpha impairs receptor stimulation. J Biol Chem, 271: 19653-5.
115.
Kerov V, Chen D, Moussaif M, Chen YJ, Chen CK, Artemyev NO. (2005) Transducin activation state controls its light-dependent translocation in rod photoreceptors. J Biol Chem, 280: 41069-76.
116.
Majumdar S, Ramachandran S, Cerione RA. (2006) New insights into the role of conserved, essential residues in the GTP binding/GTP hydrolytic cycle of large G proteins. J Biol Chem, 281: 9219-26.
117.
Bohnke M, Thaer A, Schipper I. (1998) Confocal microscopy reveals persisting stromal changes after myopic photorefractive keratectomy in zero haze corneas. Br J Ophthalmol, 82: 1393-400.
118.
Song J, Lee YG, Houston J, Petroll WM, Chakravarti S, Cavanagh HD, Jester JV. (2003) Neonatal corneal stromal development in the normal and lumicandeficient mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci, 44: 548-57.
119.
Moilanen JA, Vesaluoma MH, Muller LJ, Tervo TM. (2003) Long-term corneal morphology after PRK by in vivo confocal microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci, 44: 1064-9.
120.
Siegel IM, Greenstein VC, Seiple WH, Carr RE. (1987) Cone function in congenital nyctalopia. Doc Ophthalmol, 65: 307-18.
102
121.
Trentacoste J, Thompson K, Parrish RK, 2nd, Hajek A, Berman MR, Ganjei P. (1987) Mutagenic potential of a 193-nm excimer laser on fibroblasts in tissue culture. Ophthalmology, 94: 125-9.
122.
Missiaen L, Callewaert G, Parys JB, Wuytack F, Raeymaekers L, Droogmans G, Nilius B, Eggermont J, De Smedt H. (2000) [Intracellular calcium: physiology and physiopathology]. Verh K Acad Geneeskd Belg, 62: 471-99.
123.
Carlson EC, Mamiya K, Liu CY, Gendron RL, Birk DE, Funderburgh JL, Kao WW. (2003) Role of Cys41 in the N-terminal domain of lumican in ex vivo collagen fibrillogenesis by cultured corneal stromal cells. Biochem J, 369: 4618.
124.
Paluru PC, Scavello GS, Ganter WR, Young TL. (2004) Exclusion of lumican and fibromodulin as candidate genes in MYP3 linked high grade myopia. Mol Vis, 10: 917-22.
125.
Kao WW, Liu CY. (2002) Roles of lumican and keratocan on corneal transparency. Glycoconj J, 19: 275-85.
126.
Cantrill HL, Palmberg PF, Zink HA, Waltman SR, Podos SM, Becker B. (1975) Comparison of in vitro potency of corticosteroids with ability to raise intraocular pressure. Am J Ophthalmol, 79: 1012-7.
127.
Cantrill HL, Waltman SR, Palmberg PF, Zink HA, Becker B. (1975) In vitro determination of relative corticosteroid potency. J Clin Endocrinol Metab, 40: 1073-7.
128.
Foster CS, Alter G, DeBarge LR, Raizman MB, Crabb JL, Santos CI, Feiler LS, Friedlaender MH. (1996) Efficacy and safety of rimexolone 1% ophthalmic suspension vs 1% prednisolone acetate in the treatment of uveitis. Am J Ophthalmol, 122: 171-82.
129.
Leibowitz HM, Bartlett JD, Rich R, McQuirter H, Stewart R, Assil K. (1996) Intraocular pressure-raising potential of 1.0% rimexolone in patients responding to corticosteroids. Arch Ophthalmol, 114: 933-7.
130.
Resch M, O. Ispán, and E. Kelemen. (2002) Intraoperatív és posztoperatív pachymetria LASIK-mutétek kapcsán. Szemészet, 139: 105-108.
103
131.
Munger R, Hodge WG, Mintsioulis G, Agapitos PJ, Jackson WB, Damji KF. (1998) Correction of intraocular pressure for changes in central corneal thickness following photorefractive keratectomy. Can J Ophthalmol, 33: 159-65.
132.
Nagy ZZ, Resch M, Suveges I. (2004) Ultrasound evaluation of flap thickness, ablation depth, and corneal edema after laser in situ keratomileusis. J Refract Surg, 20: 279-81.
133.
Barcsay G. (2004) A szemgolyó ultrahangos és optikai morfometriája, a paraméterek szórásának hatása a mérések pontosságára. Doktori értekezés
104
Saját közlemények jegyzéke Az értekezés témájához kapcsolódó közlemények 1. Szabó V, Balogh K, Süveges I, Rácz K, Hunyady L, Nagy Z Z: The role of lumican and keratocan genes in persistent corneal subepithelial haze following excimer laser photorefractive keratectomy, Molecular Vision 2006, 12:597-605.
IF: 2,239 2. Szabó V, Borgulya G, Filkorn T, Majnik J, Bányász I, Nagy Z Z: The variant N363S of glucocorticoid receptor in steroid-induced ocular hypertension in Hungarian patients treated with photorefractive keratectomy, Molecular Vision 2007, 13:659-666.
IF: 2,239 3. Szabó V, Kreienkamp HJ, Rosenberg T, Gal A.: p.Gln200Glu, a putative constitutively active mutant of rod α-transducin in autosomal dominant congenital stationary night blindness, Human Mutation 2007, 28(7):741-2. IF: 7,923 4. Szabó V, Balogh K, Resch M, Hunyady L, Nagy Z Z: A proteoglikánok szerepe a corneális sebgyógyulásban - A lumikán és a keratokán gének mutációanalízise, Szemészet 2006, 143:207-211. 5. Majnik J, Patócs A, Balogh K, Luczay A, Török D, Szabó V, Borgulya G, Gergics P, Szappanos Á, Bertalan R, Belema B, Tőke J, Sereg M, Nagy Z Z, Sólyom J, Tóth M, Gláz E, Rácz K, Németh J, Fekete G, Tulassay Z: A glükokortikoidreceptor
gén
szekvenciavariánsai
és
jelentőségük
a
glükokortikoidok iránti érzékenység meghatározásában, Orv Hetil 2006; 147: 2107-2115.
105
6. Nagy ZZ, Szabó V, Süveges I: Refraktív sebészet a XXI. században. Lege Artis Medicinae 2004, 14 (6):425-432. 7. Nagy ZZ, Visontai Z, Szabó V, Németh J, Süveges I: A preoperatív szaruhártyavastagság és a posztoperatív regresszió összefüggése fotorefraktív keratectomiát követően, Szemészet 2003, 140 (4): 255-258. 8. Nagy ZZ, Visontai Z, Szabó V, Süveges I: Phacoemulsificatióval kombinált hátsó csarnoki lencse beültetése nagyfokú myopiában, Szemészet 2003, 140 (3):155-161. 9. Nagy ZZ, Szabó V, Takács Á, Süveges I: A kis sugárátmérőjű, nagyfrekvenciás repülőpont-technikás excimer lézerkezelés eredményei myopiás szemekben. Orv Hetil 2005; 146:253-257.
Egyéb közlemények 1. Csák K, Szabó V, Szabó A, Vannay A: Pathogenesis and genetic basis for retinopathy of prematurity. Frontiers in Bioscience 2006, 11:908-20. IF: 2,623 2. Hargitai B, Szabó V, Cziniel M, Hajdu J, Papp Z, Szende B, Sergi C: Human brain of preterm infants after hypoxic-ischemic injuries: No evidence of a substantial role for apoptosis by using a fine tuned ultrasound-guided neuropathological analysis, Brain and Development (Japanese) 2004, 26 (1):3036. IF: 1,382 3. Hargitai B, Szabó V, Hajdu J, Harmath A, Pataki M, Farid P, Papp Z, Szende B: Apoptosis in various organs of preterm infants: Histopathologic study of lung, kidney, liver and brain of ventilated infants, Pediatric Research 2001, 50:110114. IF: 3,28
106
Az értekezés témájához kapcsolódó előadások, poszterek 1. Szabó V, Balogh K, Rácz K, Hunyady L, Nagy Z Z, Süveges I: A kóros corneális subepitheliális homályképződés és a lumican gén kapcsolatának vizsgálata, Magyar Szemorvostársaság Ülése, Budapest, 2004. 2. Szabó V, Balogh K, Rácz K, Hunyady L, Nagy Z Z: A kóros corneális subepitheliális homályképződés és a lumican gén kapcsolatának vizsgálata, Legjobb Fiatal előadó I. díj, Magyar Műlencse Implantációs és Refraktív Sebészeti Társaság XV. Kongresszusa, Keszthely, 2004. 3. Szabó V, Balogh K, Rácz K, Hunyady L, Nagy Z Z, Süveges I: A kóros corneális sebgyógyulás genetikai hátterének tanulmányozása, Semmelweis Egyetem, PhD Tudományos Napok, Budapest, 2004. 4. Szabó V, Balogh K, Rácz K, Hunyady L, Nagy Z Z: Szerepet játszik-e a lumican gén a kóros corneális subepitheliális haze fotorefraktív keratectomia utáni kialakulásában? – A lumican gén mutációanalízise, Operatív Szekció I. Díj, Korányi Frigyes Szakkollégium, IX. Tudományos Fórum, Budapest, 2004. 5. Szabó V, Nagy Z Z, Resch M, Süveges I: A cornea sebgyógyulása excimer lézerkezelések után, 100 éves a Magyar Szemorvostársaság Jubileumi Kongresszus, Magyar Tudományos Akadémia, Budapest, 2004. 6. Szabó V: Újdonságok a szemészeti genetikából, MSD Szemhétvége, Továbbképzés szakorvosok számára, Tapolca, 2004. 7. Szabó V, Balogh K, Hunyady L, Nagy Z Z: A study of the genetic background of corneal subepithelial haze following refractive surgery, European Association for Vision and Eye Research, Vilamoura, Portugália, Ophthalmic Research 36:(S1), No.1131, 2004 8. Szabó V, Balogh K, Süveges I, Rácz K, Hunyady L, Nagy Z Z: A study of the genetic background of the corneal wound healing related to refractive surgery, (Poszter) IV. Magyar Sejtanalitikai Konferencia, Budapest, 2004. 9. Szabó V, Borgulya G, Majnik J, Rácz K, Nagy Z Z: A glükokortikoid receptor gén polimorfizmusainak vizsgálata PRK után steroiddal kezelt betegcsoportban – előtanulmány, Magyar Műlencse Implantációs és Refraktív Sebészeti Társaság XVI. Kongresszusa, Keszthely, 2005.
107
10. Szabó V: A glükokortikoid receptor gén polimorfizmusainak vizsgálata, Semmelweis Egyetem, PhD Tudományos Napok, Budapest, 2005. 11. Szabó V, Borgulya G, Majnik J, Rácz K, Nagy ZZ: Glucocorticoid receptor gene polymorphisms and steroid-induced ocular hypertension in patients treated with photorefractive keratectomy, SOE-DOG, Berlin, 2005. 12. Szabó V: A sebgyógyulás genetikája, kurzuselőadás, Magyar Műlencse Implantációs és Refraktív Sebészeti Társaság Kongresszusa, Keszthely, 2007. 13. Gál A, Szabó V, Kreienkamp H-J, Rosenberg T: p.Gln200Glu, a Putative Constitutively Active Mutant of Rod Alpha-Transducin in Autosomal Dominant Congenital Stationary Night Blindness, ARVO, Fort Lauderdale, USA, 2007.
Egyéb előadások, poszterek 1. Vámos R, Hargitai J, Varsányi B, Lesch B, Szabó V, Farkas A: Research on inherited retinal diseases at the University Eye Clinic Budapest, (Poszter) ProRetina Research-Colloquium, Potsdam, Németország, 2006. 2. Lesch B, Szabó V, Vámos R, Somfai GM, Hargitai J, Varsányi B, Farkas A: Optical coherence tomography and electroretinography findings in the cases of 4 Hungarian x-linked juvenile retinoschisis families,(Poszter) DOG+SOE, Berlin, Németország, 2005. 3. Nagy Z Z, Szabó V, Süveges I: Wavefront analysis of spherical and spherical astigmatic hyperopia with the MEL 80 excimer laser, (Poszter) European Association for Vision and Eye Research, Vilamoura, Portugália, 2004. 5. Nagy Z Z, Szabó V, Szentmáry N, Resch M: Comparison of hyperopic refractive treatments with different types of excimer lasers and different surgical techniques. (Poszter) AAO-SOE, New Orleans, USA, 2004. 6. Nagy Z Z, Visontai Z, Szabó V, Süveges I: Phacoemulsificatioval kombinált hátsócsarnoklencse
beültetés
nagyfokú
myopiában,
Magyar
Műlencse
Implantációs és Refraktív Sebészeti Társaság XV. Kongresszusa, Keszthely, 2004. 7. Nagy Z Z, Szabó V, Resch M, Süveges I: A kis sugárátmérőjű, nagy frekvenciás,
repülő ponttechnikás
108
laser készülék eredményei myopiás
szemekben, Magyar Műlencse Implantációs és Refraktív Sebészeti Társaság XV. Kongresszusa, Keszthely, 2004. 8. Szabó V, Sényi K, Süveges I, Tóth J: Diagnosis of ocular Chlamydia trachomatis infection in newborns and children. Best Presentation Award, (Poszter) 29th Annual Meeting of the European Paediatric Ophthalmological Society, Regensburg, Németország, 2003. 9. Maka E, Sényi K, Tóth J, Szabó V, Süveges I: Retinoblastoma in the last 5 years, (Poszter) VI. Paediatric Ophthalmology Symposium, Pozsony, Szlovákia, 2003. 10. Nagy Z Z, Visontai Z, Szabó V, Németh J, Süveges I: A preoperatív szaruhártya vastagság és a posztoperatív regresszió összefüggése fotorefraktív keratektomiát követően, Magyar Szemorvostársasági Kongresszus, Budapest, 2003. 11. Szabó V: A Chlamydia trachomatis okozta conjunctivitis felismerése és előfordulása, Semmelweis Egyetem Tudományos Diákköri Konferencia, Budapest, 2002. 12. Szabó V: A retinoblastoma incidenciájának alakulása Magyarországon 1975 és 1999 között, Semmelweis Egyetem Tudományos Diákköri Konferencia, Budapest, 2002. 13. Popper M, Quadrado M J, Nagy Z Z, Szabó V, Süveges I, Van Best J: A szaruhártya
különböző
rétegeiben
történő
sejtszámolás
konfokális
mikroszkóppal diabeteses és egészséges szemeken, Semmelweis Egyetem Ph.D. Tudományos Napok, 2002. 14. Szabó V: Apoptosis in situ detektálása koraszülöttek központi idegrendszerében és tüdejében, Semmelweis Egyetem Tudományos Diákköri Konferencia, Rektori dicséret, 2000. 15. Hargitai B, Degrell P, Szabó V, Szende B: Apoptosis in various organs of preterm infants, Pediatric and Developmental Pathology, 3 (4):396, 2000. 16. Hargitai B, Szabó V, Szende B: Apoptosis in various organs in preterm infants, Paediatric Pathology Society 29th Annual Meeting, Belfast, Észak-Írország, 1999. 17. Hargitai B, Degrell P, Szabó V, Szende B: Az apoptosis vizsgálata koraszülött újszülöttek szervében, Országos Pathológus Találkozó, Sopron, 1999.
109
Köszönetnyilvánítás Munkámhoz nyújtott segítségükért és támogatásukért szeretnék köszönetet mondani: Dr. Süveges Ildikó Professzornőnek, a Doktori Iskola Szemészeti Program vezetőjének Dr. Németh János Professzor Úrnak, a Szemészeti Klinika igazgatójának Dr. Nagy Zoltán Zsolt, egyetemi docens Úrnak, témavezetőmnek Dr. Gál András Professzor Úrnak, hamburgi témavezetőmnek Dr. Hunyady László Professzor Úrnak, a II.sz. Élettani Intézet vezetőjének Dr. Rácz Károly Professzor Úrnak, a II.sz. Belklinika Molekuláris Endokrinológiai Laboratórium vezetőjének Dr. Balogh Katalinnak, Dr. Borgulya Gábornak, Dr. Hans-Jürgen Kreienkampnak, Dr. Thomas Rosenbergnek, Dr. Majnik Juditnak, Dr. Bányász Ilonának, Dr. Resch Miklósnak és Dr. Filkorn Tamásnak, szerzőtársaimnak Dr. Vannay Ádámnak, Dr. Patócs Attilának, hasznos tanácsaikért és ötleteikért Dr. Tóth Jeannettenek, korábbi szemészeti TDK témavezetőmnek Burlovicsné Fekete Judit és Morcz Kata asszisztensnőknek a mintagyűjtésben nyújtott segítségükért A Szemészeti Klinika és a hamburgi Humángenetikai Intézet minden dolgozójának, akik segítették munkámat. Férjemnek és családomnak a türelmükért és támogatásukért. A Semmelweis Egyetem Tömő utcai Szemészeti Klinikáján végzett kutatás és a közlemények az OTKA T 037452 és az ETT 611/2003 pályázatok támogatásával készültek. A Hamburg-Eppendorf Egyetem Humángenetikai Intézetében töltött tanulmányút, kutatás és az eredményeket tartalmazó közlemény publikálása a Magyar Ösztöndíj Bizottság és a Deutsche Akademische Austausch Dienst (DAAD) ösztöndíja révén valósult meg.
110
