Génmutációk és polimorfizmusok vizsgálata mellékvese daganatokban
Doktori (PhD) dolgozat
Dr. Patócs Attila
Témavezeto: Dr. Rácz Károly
Semmelweis Egyetem ÁOK II. sz. Belgyógyászati Klinika 2004.
1
TARTALOMJEGYZÉK
Oldal
RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK
5
I. BEVEZETÉS
6
II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS
8
II.1.
Mellékvesekéreg daganatok hátterében álló genetikai rendellenességek
8
II.2.
A véletlenszeruen felfedezett mellékvesekéreg daganatok kóros szteroid termelése és a pathogenesis kapcsolata
10
II.2.1. Veleszületett mellékvesekéreg hyperplasia (congenitalis adrenalis hyperplasia, CAH) és a mellékvesekéreg daganatok kapcsolata
II.3.
II.4.
11
II.2.2. A 21-hidroxiláz defektus klinikai megjelenése és genetikai háttere
12
Mellékvesevelo daganatok hátterében álló örökletes szindrómák
15
II.3.1. Multiplex endokrin neoplasia
15
II.3.2. MEN 2 tumorok klinikai jellegzetességei
16
II.3.3. A MEN 2 szindróma genetikai háttere - RET protoonkogén
18
II.3.4. Genotípus-fenotípus összefüggések MEN 2 szindrómában
22
II.3.5. vonHippel-Lindau (VHL) szindróma
24
II.3.6. 1-es típusú neurofibromatosis
24
Sporadikus phaechromocytomák hátterében álló genetikai rendellenességek
25
III. CÉLKITUZÉSEK
26
IV. BETEGEK ÉS MÓDSZEREK
28
IV.1. Betegek, vér- és szövetminták
28
IV.2. Hormonvizsgálatok
28
2
IV.3. Molekuláris biológiai vizsgálatok
29
IV.3.1. CYP21B mutációk vizsgálata allél-specifikus PCR módszerrel 29 IV.3.2. CYP17 mutáció és polimorfizmus vizsgálat DNS szekvenálással
31
IV.3.3. RET protoonkogén vizsgálata SSCP-vel és direkt DNS szekvenálással
32
IV.3.4. vhl vizsgálata direkt DNS szekvenálással
34
IV.4. Szöveti catecholamin tartalom vizsgálata HPLC-vel
35
IV.5. Statisztikai módszerek
35
V. VIZSGÁLATOK EREDMÉNYEI
V.1.
36
CYP21B mutációk hormonálisan inaktív, véletlenszeruen felfedezett egyoldali és kétoldali mellékvesekéreg adenomás betegekben
V.2.
CYP17 gén mutáció és polimorfizmusok hormonálisan inaktív kétoldali mellékvesekéreg daganatos betegben
V.3.
36
37
RET protoonkogén mutációk és polimorfizmusok MEN 2 szindrómában
39
V.3.1. RET mutációk spektruma MEN 2 szindrómás betegekben
39
V.3.2. Val804Leu mutáció és Ser836Ser polimorfizmus ko-szegregáció FMTC-ben
43
V.3.3. RET protoonkogén egyéb polimorfizmusai
45
V. 4. Örökletes és sporadikus phaeochromocytomák relatív gyakorisága, klinikai és biokémiai sajátosságai
46
VI.
MEGBESZÉLÉS
51
VII.
KÖVETKEZTETÉSEK
61
3
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
64
IRODALOMJEGYZÉK
65
MAGYAR NYELU ÖSSZEFOGLALÓ
80
ANGOL NYELU ÖSSZEFOGLALÓ
81
AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉBEN KÉSZÜLT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉK
82
4
Rövídítésjegyzék: 17-OHP:
17-hidroxi-progeszteron
ACTH:
adrenocorticotrop hormon
BLAST: CAH:
Basic Local Alignment Search Tools (szekvencia keresésre használatos számítógépes szoftver) veleszületett (congenitalis) mellékvesekéreg hyperplasia
cAMP:
ciklikus adenozin-monofoszfát
CDK:
ciklin függo kináz
CKI:
ciklin függo kináz inhibitor
CYP17:
humán szteroid 17? -hidroxiláz /17, 20-liáz
CYP21A:
humán szteroid 21-hidroxiláz (P450c21) pseudogén
CYP21B:
humán szteroid 21-hidroxiláz (P450c21) valódi gén
CT:
computertomográphia
FMTC:
familiáris medulláris pajzsmirigy carcinoma
Gi2:
G-fehérjét gátló 2-es típusú fehérje
MEN 1:
Multiplex endokrin neoplázia 1-es típus
MEN 2:
Multiplex endokrin neoplázia 2-es típus
MRI:
mágneses rezonancia vizsgálat
mRNS:
messenger ribonuklein sav
NC:
nem klasszikus (non-classical)
NCBI:
National Center for Biotechnology Instituit
Nf1:
neurofibromatózis 1-es típusa
PCR:
polimeráz láncreakció
p53:
foszfoprotein 53 kDa
RET:
rearranged during transfection gén
RB:
retinoblasztóma gén
SSCP:
single strand conformational polymophism
SV:
egyszeru virilizáló (simple virilizing)
SW:
sóveszto (salt wasting)
Taq:
thermophilus aquaticus (DNS polimeráz)
5
UH:
ultrahangos vizsgálat
VHL:
von Hippel-Lindau szindróma
6
I. BEVEZETÉS
A hasüregi képalkotó vizsgálatok elterjedésével jelentosen megnövekedett a mellékvesében kimutatott elváltozások száma (1-3). Irodalmi adatok alapján a hasi computer tomográfiás (CT) vizsgálatok során 2-4 %-ban (4-6), kórbonctani vizsgálat során ennél is gyakrabban (79) mutatható ki mellékvese daganat. Az esetek többségében az elváltozás csak az egyik mellékvesét érinti, de az esetek 10-18 %-ában az elváltozás kétoldali (10, 11). Ezek a daganatok komoly diagnosztikai és terápiás problémát jelentenek, ugyanis a jelenleg rendelkezésünkre álló klinikai és hisztopatológiai módszerek a daganatok természetének megismerésében az esetek egy részében korlátozott értékunek bizonyultak.
A mellékvese daganatok többsége mellékvesekéreg eredetu, ritkábban azonban a mellékvesevelobol is kiindulhatnak, illetve lehetnek nem mellékvese eredetuek is. A kéregbol kiinduló daganatok nagy része a hagyományos klinikai módszerekkel hormonálisan inaktív adenomának bizonyul (1, 4, 9), de az esetek 12-18 %-ában klinikai jelentoséggel bíró hormontúltermelés igazolható (szubklinikai Cushing szindróma, Cushing szindróma, Connszindróma, ritkán hyperandrogenismus) (12, 13). Számos tanulmány alapján bizonyosnak tartható, hogy a hormontúltermelés hiánya ellenére az adenomák többségében a szteroid termelés kóros, sot a hypothalamus-hypophysis-mellékvese tengely szabályozása is károsodott (14-16). Egyik leggyakoribb szteroid-termelési zavarként tartják számon, hogy véletlenszeruen felfedezett mellékvesekéreg daganatos betegek többségében exogén ACTH adásával a normálist meghaladó plasma 17-hidroxiprogeszteron (17-OHP) válasz váltható ki (14, 16-20). Erre a megfigyelésre alapozva feltételezték, hogy a szteroid bioszintézisben szerepet játszó 21-hidroxiláz enzim részleges defektusa szerepet játszhat a hormonálisan inaktív mellékvese daganatok pathomechanismusában. Ezt a hypothesist támasztotta alá Jaresch és mts. megfigyelése is, mely szerint a veleszületett 21-hidroxiláz defektusos betegek 45-78 %-ában CT vizsgálattal mellékvesekéreg daganat mutatható ki (21). A hypothesist támogató indirekt klinikai megfigyelések ellenére a 21-hidroxiláz enzim (vagy egyéb szteroid bioszintézis enzimek) örökletes defektusainak (22-26) lehetséges oki szerepe a hormonálisan
7
inaktív mellékvese adenomák kialakulásában nem tekintheto bizonyítottnak, ugyanis a szteroid bioszintézis enzimeket kódoló gének mutációi szomatikus vagy csírasejtes elofordulása és az enzimdefektusokra jellemzo laboratóriumi eltéréseknek az összefüggéseit hormonálisan inaktív mellékvese adenomás betegekben mindezidáig nem vizsgálták.
Klinikai következményei miatt a mellékvese daganatok közül kiemelt jelentoséguek a mellékvese veloállományból kiinduló phaeochromocytomák. Néhány külföldi centrum szelektált betegcsoportjain végzett újabb vizsgálatok szerint a phaeochromocytomák jelentos része (25-30 %-a) örökletes szindróma részeként alakul ki (MEN 2 szindróma, vonHippelLindau
szindróma,
neurofibromatosis,
familiáris
phaeocromocytoma-paraganglioma
szindróma). A phaeochromocytomával társuló örökletes szindrómák hátterében álló gén mutációk (27-30) egyre pontosabb megismerése új lehetoséget nyitott ezeknek az örökletes betegségeknek a korai felismerésére. Jelenleg azonban az örökletes génmutációk és a betegségek klinikai megjelenése közötti kapcsolat, a genotípus és klinikai fenotípus közötti összefüggések még nem mindenben tisztázottak. A kutatások felvetették annak a lehetoségét is, hogy az örökletes szindrómákat okozó géndefektusok látszólag sporadikus esetekben is szerepet játszhatnak a phaeochromocytomák kialakulásában (27, 30). Jelenleg azonban nem tisztázott még az a kérdés, hogy az örökletes phaeochromocytomák szelektált betegcsoportokban észlelt nagy gyakoriságával kapcsolatos megfigyelések megerosíthetok-e nem szelektált betegcsoportokban is. Ezekhez kapcsolódó további kérdés, hogy az örökletes és sporadikus phaeochromocytomák klinikai, laboratóriumi és patológiai paramétereiben, illetve a daganatok catecholamin termelésében néhány vizsgálatban kimutatott különbségek segíthetik-e nem szelektált phaeochromocytomás betegekben az örökletes és sporadikus esetek elkülönítését.
Munkámban a mellékvese daganatok, különös tekintettel a hormonálisan inaktív kéreg adenomák és phaeochromocytomák pathomechanismusában jelentosnek tuno genetikai eltéréseket a klinikai és biokémiai paraméterekkel összevetve vizsgáltam, figyelmet fordítva a lehetséges összefüggések megismerésére. II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS
8
II.1.
Mellékvesekéreg daganatok hátterében álló genetikai rendellenességek
A jelenlegi hypothesis szerint a mellékvesekéreg daganatainak kialakulása az esetek jelentos részében egy több lépcsos folyamat következménye, melynek modulálásában számos genetikai rendellenesség játszik szerepet (1, 26). A kéreg daganatok társulhatnak familiáris megbetegedésekhez (1). Több olyan monogénes öröklodo kórkép ismert, melyben a jó- vagy rosszindulatú mellékvesekéreg tumor a klinikai kép részjelensége. A Beckwith-Widemann szindróma jellemzoi a Wilms tumor, a hepatoblastoma, a rhabdomyosarcoma és a mellékvesekéreg daganat együttes elofordulása (31, 32), Li-Fraumeni szindrómában emlotumor, különbözo típusú leukémiák, lágy-szövet sarcoma, gliomák és mellékvesekéreg tumorok fordulnak elo (33). Multiplex endokrin neoplasia I-es típusában mellékpajzsmirigy adenomák, hipofízis adenoma és a hasnyálmirigy endokrin daganatok alakulnak ki (34, 35). A Carney komplexet a szív-, bor- és emlo myxomája, foltos borpigmentáció, mellékvesekéreg daganat (Cushing-szindrómát okozó mellékvesekéreg-daganat, mellékvesekéreg-carcinoma valamint primer pigmentált nodularis mellékvesekéreg-hyperplasia), here daganat (Sertoli- és Leydig sejt daganat), hypophysis-daganat (akromegália), valamint a perifériás idegek schwannomája jellemzi (36). McCune-Albright szindrómában mellékvesekéreg daganatok, illetve primer pigmentált bilateralis mellékvesekéreg hyperplasia, a hosszú csöves csontok fibrosus dysplasiája, pubertas praecox, café-au-lait foltok, hyperthyreosis és akromegália fordulhat elo (37).
A familiáris esetek mellett a mellékvesekéreg daganatok legnagyobb része sporadikus elofordulású. Ezek genetikai háttere nagyrészt tisztázatlan, kialakulásukban onkogének és tumor-szuppresszor gének szerepét feltételezik. A p53 tumor szuppresszor gén kóroki jelentosége sporadikus mellékvesekéreg tumorokban is felmerült. A szakirodalomban a p53 gén szerepét számos tumorban igazolták, de a mellékvesekéreg daganatokra vonatkozóan csekély számú vizsgálat áll rendelkezésre és az eredmények sem egyértelmuek. Jóindulatú mellékvesekéreg daganatokban ritkán, malignus tumorokban gyakran mutatható ki p53 gén mutáció (38-44). Sporadikus mellékvesekéreg carcinomák egy részében a p53 mRNS és a p53 fehérje magasabb koncentrációban fordul elo, mint ép mellékvesekéreg szövetben. A p53
9
mRNS expresszió és az apoptosis markereként számon tartott humán transzglutamináz gén expressziója között mind a hormontermelo mind a hormonálisan inaktív jóindulatú mellékvesekéreg daganatokban szignifikáns összefüggés áll fenn (45-47).
Több tanulmány vizsgálta azt a kérdést, hogy a növekedési hormont termelo hypophysis adenómákhoz és pajzsmirigy adenómákhoz hasonlóan a cAMP termelodést stimuláló Gfehérje a-alegység aktiváló mutációi szerepet játszanak-e a mellékvese daganatok patomechanizmusában. Az eddig megjelent közlemények alapján mellékvesekéreg tumorokban a G-fehérjét érinto mutációk csak közvetett szerepet játszanak, eddig mindössze néhány mellékvesekéreg tumorban sikerült igazolni gátló G-fehérje (Gi2) mutációt. Más vizsgálatok súlyos lefolyású carcinomák mintegy 50 %-ában az ACTH receptor gén heterozigótaság vesztését detektálták. Northern-blot vizsgálattal ezekben a tumorokban az ACTH receptor mRNS-ének csökkent mennyiségét mutatták ki. Mindezek a vizsgálatok azt sugallják, hogy az ACTH receptor allél-vesztése tumoros folyamatot indíthat el (26, 48). A 11p15 locuson található IGF-II génen kívül a 11p15 locuson még számos, a sejtnövekedéssel kapcsolatos gén található (H19, p57KIP2, KvLQT1, TSSC3, TSSC5). A p57KIP2 egy ciklin függo kináz (CDK) inhibitort (CKI) kódol a CIP/KIP családból. Ezeknek a géneknek a szerepét leggyakrabban mellékvesekéreg carcinomákban igazolták (49-51). A ras fehérjéknek a jelátviteli rendszerben, a sejtnövekedésben, a hormonszintézisben és szekrécióban van szerepük. A ras géncsaládba három különbözo ras gén tartozik: H-ras, K-ras és N-ras. Számos tumor pathogenesisében igazolták a Ras onkogének szerepét (pajzsmirigy follikularis carcinoma, myeloid leukémia). Lin és mts. aldoszteron-termelo adenomák 46 %-ában találtak K-ras gén mutációt, illetve funkcionális mellékvese tumorok 37,5 %-ában mutattak ki fokozott K-ras mRNS expressziót (52).
10
II.2.
Véletlenszeruen felfedezett mellékvesekéreg daganatok kóros szteroid termelése és a pathogenesis kapcsolata
A mellékvesekéreg daganatok dönto többsége nem jár hormontúltermelés tüneteivel. Többségüket más okból végzett hasi képalkotó vizsgálatok során fedezik fel, ezért az irodalomban a véletlenszeruen (incidentálisan) felfedezett mellékvesekéreg daganat (incidentaloma) elnevezés terjedt el (2-7).
A véletlenszeruen felfedezett mellékvese daganatok legnagyobb hányadát alkotó kéregadenomák eseteiben a klasszikus szteroid-hormon túltermelés tünetei általában hiányoznak, de részletes endokrinológiai vizsgálatokkal kóros szteroid-termelés, a szteroid-bioszintézis útvonalának részleges zavara mutatható ki (12, 13, 15-20, 53). Ritkán a plasma hormonszintek már alaphelyzetben is kórosak lehetnek, azonban többségükben a szteorid bioszintézis zavar csak dinamikus endokrin tesztekkel (pl. dexamethason szuppresszió, ACTH terheléses teszt) igazolható (13, 15-20, 53). Feltételezik, hogy összefügés áll fenn a daganat pathogenesise és a kóros szteroid-termelés között, amit az alábbi indirekt klinikai megfigyelések támasztanak alá: -
centrális (hypophysis eredetu) Cushing-kórban a tartós ACTH túltermelés macronodularis mellékvesekéreg hyperplasiát okoz. Veleszületett mellékvesekéreg hyperplasias betegekben szintén gyakran alakul ki macronodularis hyperplasia, illetve egy- vagy kétoldali mellékvese daganat (21, 54).
-
véletlenszeruen felfedezett mellékvesekéreg daganatos betegek 25-71 %-ában az ACTH-stimulált plasma 17-OHP koncentráció kórosan magas (14, 16-20), illetve veleszületett mellékvesekéreg hyperplasiás (congenitalis adrenalis hyperplasia, CAH) betegek 45-78 %-ában igazoltak CT vizsgálattal mellékvesekéreg daganatot (21). A CAH leggyakoribb oka a szteroid 21-hidroxiláz enzim csökkent muködése. A 21hidroxiláz (P450c21) a szteroid bioszintézis egyik kulcsenzime, szubsztrátja a 17hidroxiprogeszteron és a progeszteron. Az enzim megfelelo muködése mind a kortizol, mind az aldoszteron szintéziséhez nélkülözhetetlen (55, 56).
II.2.1. Veleszületett mellékvesekéreg hyperplasia (congenitalis adrenalis
11
hyperplasia, CAH) és a mellékvesekéreg daganatok kapcsolata
A veleszületett mellékvesekéreg hyperplasia hátterében a szteroid bioszintézisben résztvevo enzimek csökkent muködése áll. A leggyakoribb ok a szteroid 21-hidroxiláz enzim defektusa, de a 11? -hidroxiláz, 3? -hidroxiszteroid-dehidrogenáz és a 17? -hidroxiláz enzimek, továbbá egy transzport fehérje, a ”steroidogenesis acut regulatory protein” (StAR) csökkent muködése is CAH-al jár (ún. „lipoid” CAH). Az enzim defektusok következtében a kortizol elválasztás csökkent, ezért a hypophysisben fokozódik az ACTH elválasztás, ami az enzim-blokk elotti eloanyagok felszaporodását eredményezi. (14, 23, 57, 59, 60, 143)
A CAH leggyakoribb formáját képezo 21-hidroxiláz defektusban a magas ACTH koncentráció miatt a mellékvesekéreg szteroid-termelése az androgén bioszintézis irányába tolódik el (58). A hormonálisan inaktív mellékvesekéreg daganatok kialakulásában a fokozott ACTH stimulációt fontos patogenetikai faktornak tartják. Ebbol a szempontból kiemelkedo fontosságúnak tartható az a megfigyelés, hogy az ACTH-stimulált plasma 17-OHP értékek véletlenszeruen felfedezett mellékvesekéreg adenomás betegek 25-71 %-ában meghaladják a normális értéket (14, 16-20). Miután a normális plasma 17-OHP szint mellett észlelt túlzottan magas ACTH-stimulált 17-OHP válasz részleges 21-hidroxiláz defektust valószínusít, a hormonálisan inaktív mellékvesekéreg adenomás betegek jelentos százalékában észlelt plasma 17-OHP eltérést részleges 21-hidroxiláz defektus indirekt bizonyítékaként értékelték. A veleszületett mellékvese hyperplasiában szenvedo betegekben nagy gyakorisággal észlelt mellékvese daganatokon kívül (21) ezt a feltételezést támasztják alá azok a klinikai tapasztalatok is, hogy véletlenszeruen felfedezett mellékvese daganatos betegek kis százalékában korábban fel nem ismert valódi CAH esetek fordulhatnak elo (61-63). A hypothesist támogató indirekt klinikai megfigyelések ellenére a 21-hidroxiláz enzim örökletes defektusainak (22-25) lehetséges oki szerepe a hormonálisan inaktív mellékvese adenomák kialakulásában nem tekintheto bizonyítottnak, ugyanis a szteroid bioszintézisben szerepet játszó enzimeket kódoló gének mutációi szomatikus vagy csírasejtes elofordulásának és az enzimdefektusokra jellemzo laboratóriumi eltéréseknek az összefüggéseit hormonálisan inaktív mellékvese adenomás betegekben mindezidáig nem vizsgálták.
12
A szteroid 11? -hidroxiláz enzim csökkent muködése szintén veleszületett mellékvesekéreg hyperplasiat okoz. Reincke 1997-ben megjelent tanulmányában a 11? -hidroxiláz enzim csökkent aktivitását igazolták véletlenszeruen felfedezett, hormonálisan inaktív mellékvese daganatokban (57).
II.2.2. A 21-hidroxiláz defektus klinikai megjelenése, genetikai háttere Az enzimdefektus klinikai megjelenése az enzimaktivitás károsodásának mértékével áll összefüggésben. Klinikailag legsúlyosabb az ún. sóveszto (salt wasting, SW) forma, kevésbé súlyos az ún. egyszeru virilizáló forma (simple virilizing, SV), míg a legenyhébb klinikai képpel az ún. késon manifesztálódó (late onset, LO) vagy nem klasszikus típus jár. A 21-hidroxiláz defektus a leggyakoribb autoszom recesszív módon öröklodo kórkép. A klasszikus esetek gyakorisága a kaukázusi népességben 1:15000 (60), a nem klasszikus, ún. késon manifesztálódó (late onset) formák gyakorisága egyes irodalmi adatok szerint kb 1:100 (54). A különbözo klinikai megjelenési formák különbözo életkorokban manifesztálódnak: a sóveszto
illetve
virilizáló
formák
csecsemo-
és
újszülöttkorban,
míg
a
késon
manifesztálódó/nem klasszikus típus serdülokorban, de tünetmentes maradhat akár az élet végéig is. A diagnózist a plasma 17-OHP emelkedett koncentrációja támasztja alá, de a 21hidroxiláz enzimet kódoló gén rendellenességeit molekuláris biológiai vizsgálatokkal is igazolni lehet (56).
A 21-hidroxiláz gén (CYP21B) a 6-os kromoszóma rövid karján (6p21.3), a HLA class III régióban található. A gén elhelyezkedése bonyolult: egy pszeudogénnel (CYP21A) és a komplement C4A és C4B-vel közösen, ezekkel felváltva alkot egységet (1. ábra) (64, 65). A pszeudogén a normális génnel nagyfokú homológiát mutat (98 %), ami magyarázhatja a nagyfokú (95%-os) génátrendezodést, melynek során a pszeudogénrol kóros szekvenciák kerülnek át a valódi génre. A mutációk 95 %-a pszeudogén eredetu, míg a fennmaradó 5 % populáció szintu polimorfizmus/variáns.
13
1. ábra A 6-os kromoszóma szerkezete, a szteroid 21-hidroxiláz ezimet kódoló CYP21B gén és pszeudogén elhelyezkedése és a CYP21B gén szerkezete. A CYP21B gén 10 exonból és 9 intronból áll, mérete 3 kb. A valódi gén és a pszeudogén közötti különbségek közül kiemelkedo fontosságú egy 8 bázispárnyi deléció. Ennek a deléciónak a hatására a pszeudogén szekvenciájában kereteltolódás (frameshift) jön létre, így nem képzodik muködoképes, aktív enzim. Módszertani szempontból a CYP21B gén vizsgálata a pszeudogén jelenléte miatt nehéz, mivel a mutációk környezetében a szekvenciák mind a valódi génen, mind a pszeudogénen azonosak. Enzimaktivitás csökkenést és ez által betegséget csak a valódi CYP21 gén mutációk okoznak (54, 60, 140).
Az enzimdefektus mértékét a CYP21B gén különbözo rendellenességei (mutációk, deléciók) határozzák meg. Egyes mutációk esetén nagyon szoros genotípus-fenotípus összefüggést mutattak ki, míg más mutációk esetén ez az összefüggés nem egyértelmu (55, 56, 66-75).
Az enzimdefektus klinikailag legsúlyossabb formáját képezo, ún. sóveszto típussal járó CYP21B eltérésekre jellemzo, hogy beteg egyénekben ezek homozigóta (hemizigóta) gén deléciók vagy mutációk és/vagy compound heterozigóta génmutációk formájában vannak jelen
14
(66, 76). Egyes CYP21B mutációk (pl. Val281Leu, Ile172Asn) homozigóta formában is klinikailag enyhe tünetekkel járnak, ezek okozzák az ún. late onset (késon manifesztálódó) vagy nem klasszikus klinikai fenotípust (60, 66, 67). A 21-hidroxiláz enzim defektus harmadik klinikai típusa, az ún. egyszeru virilizáló forma hátterében álló CYP21B eltérések és a fenotípus összefüggései jól körülhatároltak (56, 77).
Az 1. táblázatban a CYP21B 9 leggyakoribb mutációjának relatív gyakoriságát mutatom be a klinikai fenotípus fügvényében, az irodalmi adatok elemzése alapján. A táblázatban a 21hidroxiláz defektusos gyermekek hazai szurésével kapcsolatban közölt eredményeket is feltuntettem.
Egyszeru Sóveszto (SW)
Nem klasszikus/késon
virilizáló
Szerzok
SW és SV
(SV) Del8b
ClusterE6
Q318X
I172N
R356W
p
Wedell et al. 1994 (76) (n=186) Rumsby et al., 1998 (66) (n=30, NC; n=95CL) Levo et al., 1997 (78) (n=102) Ezquieta et al. 1995 (79) (n=76) Mornet et al., 1991 (80) (n=182) Speiser et al., 1992 (72) (n=158) Bachega et al., 1998 (81) (n=228) Carrera et al., 199 (82) (n=146) Ferenczi et al. 1999 (75) (n=310)
manifesztálódó (NC)
I2splic
P30L
V281L
P453S
e
1,2
1,1
3,2
20,8
4,3
30,5
1,6
7
0,5
25
-
-
15
-
34
10
45
-
-
-
2
29,4
1
11,8
-
2,9
-
4
0
4
1,3
4
25
2,6
18,4
-
7
11
-
4
-
20
-
15
-
10
6,3
5,7
15,8
7,6
26
2,5
8,9
-
1,3
0,9
5,7
14
7
20,6
2,2
18
1,3
1,4
0
10,3
9,6
0,7
29,4
8,2
15,8
-
9
-
3,2
10
0,6
30,5
-
5,1
-
15
1. táblázat CYP21B mutációk relatív gyakorisága a klinikai fenotípus függvényében, az irodalmi adatok alapján.
16
II.3. Mellékvesevelo daganatok hátterében álló örökletes szindrómák
II.3.1. Multiplex endokrin neoplasia Több szervet érinto daganatos betegségek, melyeknek a klinikai megjelenés alapján két fo csoportja ismert (1-es és 2-es típus). A két kórkép egymástól mind a klinikai megjelenésben, mind a genetikai háttérben elkülönül. Az 1-es típusú multiplex endokrin neoplasiát (83) a mellékvesekéreg daganataival foglalkozó részben ismertettem. Mellékvesevelo daganatok 2-es típusú multiplex endokrin neoplasiában fordulnak elo (27, 84-88).
Multiplex endokrin neoplasia 2-es típus (MEN 2) A betegséget 1961-ben Sipple írta le, mint egy inkomplett penetranciájú autoszom domináns módon öröklodo tumor szindrómát. A betegség penetranciája életkor függo, a klinikai megjelenési formák változatosak. A betegség összetevoi a pajzsmirigy C sejtjeibol kiinduló carcinoma (medulláris pajzsmirigy carcinoma, MTC), a mellékvese velo daganat (phaeochromcytoma), valamint a mellékpajzsmirigy hyperplasia illetve adenoma. A három összetevo különbözo életkorban jelenhet meg. A genetikai háttér ismeretében genotípusfenotípus összefüggéseket írtak le (86, 89-93). A MEN 2 szindróma három altípusra osztható: MEN 2A-ban a három elváltozás különbözo kombinációkban fordul elo, a MEN 2B-ben a mellékpajzsmirigyek nem érintettek, de az MTC és phaeochromocytoma mellett jellegzetes testalkat, marfanoid habitus, csontrendszeri rendellenességek, nyálkahártya neuromák, cornea idegek megvastagodása és pubertás tarda figyelheto meg. A MEN 2 szindróma harmadik alcsoportját az MTC önállóan megjeleno formája, az ún. familiáris medulláris pajzsmirigy carcinoma (FMTC) képezi. Ebben az alcsoportban semmilyen más MEN 2-re jellemzo elváltozás nem mutatható ki (83). Mindhárom csoport genetikai hátterét ugyanannak a génnek (RET protoonkogén) különbözo eltérései okozzák (84, 88-92). Napjainkban a RET gén molekuláris biológiai vizsgálatával egyre több genotípus-fenotípus összefüggés válik ismertté, és úgy tunik, hogy az FMTC önálló entitás, nagyon pontos genetikai háttérrel (89, 92-94).
Irodalmi adatok alapján a MEN 2 tumorok közül elso manifesztációként az esetek 40 %ában az MTC, kb. negyedében a phaeochromocytoma, 30 %-ában a ketto együtt jelentkezik.
17
A különbözo tumorok megjelenése egy családon belül is nagyon változatos lehet, elofordulhat, hogy a mutáns gént hordozóban a betegség még 80 éves korban sem alakult ki. Általánosságban elmondható, hogy a MEN 2 szindrómához társuló MTC jelenik meg a legfiatalabb életkorban, általában 30-40 éves korban, de a biokémiai vizsgálatok (szérum calcitonin) már korábban pozitívak lehetnek. MEN 2B-ben az MTC még korábban, nem ritkán az elso életévben manifesztálódik (88, 90).
MEN 2 szindrómában a phaeochromocytoma általában fiatalabb korban jelentkezik, gyakran kétoldali és klinikai megjelenésük enyhébb, mint a sporadikusan eloforduló phaeochromocytomáké. Egyes vizsgálatok szerint a genetikai diagnózis ismeretében végzett rendszeres ellenorzéssel a betegek egy részében a phaeochromocytoma a klinikai tünetek jelentkezése elott diagnosztizálható (95, 96).
A MEN 2 szindróma potenciálisan letális betegség, halálhoz leggyakrabban a medulláris pajzsmirigy carcinoma vezet. A genetikai szurovizsgálat jelentoségét alátámasztja az a megfigyelés, hogy ha a betegnek a diagnózis megállapításakor már manifeszt tünetei vannak, akkor a MEN 2-vel összefüggo mortalitás 35 %-os, ha a diagnóziskor klinikai tünet még nincs, de a laboratóriumi tesztek már pozitívak akkor 10 %-os, míg a genetikai vizsgálat birtokában elvégzett preventív thyreoidectomia esetén a MEN 2-vel összefüggo mortalitás gyakorlatilag 0 %-ra csökken (95-97).
II.3.2. MEN 2 tumorok klinikai jellegzetességei
Medullaris pajzsmirigy carcinoma (MTC) A pajzsmirigy C sejtjeibol kiinduló carcinoma, az összes rosszindulatú pajzsmirigy tumor 35 %-át alkotja. Az összes medulláris pajzsmirigy carcinoma mintegy 20 %-a társul MEN 2 szindrómához. Általában fájdalommentes féloldali göbként jelentkezik, de az esetek felében ilyenkor már nyaki nyirokcsomó illetve távoli áttéttel rendelkezik. A nyirokcsomókon kívül áttétet leggyakrabban a tüdobe, csontokba és májba ad. Invazív terjedésre utalhat a rekedtség (nervus recurrens bénulás miatt), a nyelés nehezítettsége és a nyaki fádalom. A laboratóriumi
18
diagnosztika során a szérum calcitonin szint jelent segítséget. Ez a paraméter már a C-sejt hyperplasiat is megbizhatóan jelzi, de aspecifikusan emelkedett serum calcitonin szint is elofordulhat. MTC-s betegekben a szérum calcitonin koncentrációk a normális értékek 201000-szeresére
emelkedhetnek.
Kisebb
mértéku
emelkedés
tüdobetegségekben,
hasnyálmirigy, valamint gyomor-bélrendszeri tumorokban, veseelégtelenségben fordul elo. Régebbi idokben az MTC laboratóriumi diagnosztikája során a szérum calcitonin stimulációs tesztet alkalmazták különbözo farmakonokkal, melyek közül a pentagasztrin stimulációs teszt terjedt el. A teszt elvégzése a beteg számára megterhelo, a napi klinikai gyakorlatban ma már ritkán alkalmazzák. Napjainkban a stimulációs tesztet a genetikai vizsgálattal pozitív egyénekben a C-sejt hyperplasia korai kimutatására, illetve pajzsmirigy mutéten átesett betegben a recidíva bizonyítására alkalmazzák. Az MTC diagnosztikájában a vékonytu aspirációs citológiai vizsgálat alapveto jelentoségu. A képalkotó módszerek közül a CT, MRI és UH vizsgálat a daganat lokalizálására, illetve nyirokcsomó érintettség igazolására alkalmas.
Phaeochromocytoma A mellékvesevelo chromaffin-sejtjeinek daganata, melynek gyakorisága a hypertoniás betegek között 1 %-os. Az összes mellékvese daganat mintegy 8-10 %-át képezi. A klinikai tünetek általában jellegzetesek és specifikusak, de néha tünetmentes esetek is elofordulhatnak. Jellegzetes klinikai tünetei a fejfájás, izzadás, palpitáció, remegés, szédülés, szorongás és idegesség. A betegek jelentos részében magas vérnyomás igazolható, ami lehet állandó vagy rohamokban jelentkezo. Jellemzo a vérnyomás nagyfokú ingadozása, valamint az, hogy a szokványos antihypertenzív kezeléssel a magasvérnyomás nehezen befolyásolható. A tüneteket a daganat catecholamin elválasztása és ezek hatásai okozzák. A plasma emelkedett catecholamin tartalma vasoconstrictiót és plazmatérfogat csökkenést okoz. A betegség szövodményeit egyrészt a hypertonia okozza, de a daganat malignus elfajulása is járhat súlyos komplikácókkal. A hypertonia szív- és érrendszeri szövodményekkel (agyi ischaemia, myocardialis infarctus, vérzés) és akár hirtelen halállal is járhat. A phaeochomocytomák mintegy 10 %-a rosszindulatú és szintén 10 %-a kétoldali. A MEN 2 szindrómához társuló phaeochromocytómákra jellemzo, hogy fiatalabb életkorban jelentkeznek, szurovizsgálattal még a manifeszt klinikai tünetek megjelenése elott kiszurhetok, ritkán malignusak (az esetek
19
kevesebb, mint 10 %-ában), ritkán fordulnak elo a mellékvesén kívül, de gyakran kétoldaliak és a mutét után gyakrabban újulnak ki (28, 98, 99). A phaeochromocytoma kezelése minden esetben a daganat mutéttel történo eltávolítása, elozetes alfa-adrenerg receptor blokkoló kezelés után.
Hyperparathyreosis A klinikai tünetek néha szegényesek, tünetmentes hypercalcaemia is elofordulhat. Fáradtság, gyengeség, polyuria, polydipsia, hányinger, hányás, exsiccosis, vesekövesség, osteitis fibrosa cystica, súlyos esetben idegrendszeri tünetek alakulnak ki. A MEN 2B szindrómához társuló hyperparathyreosis súlyosabb és agresszívebb lefolyású, mint a MEN 2A szindrómával összefüggo hyperparathyreosis (90).
II.3.3. A MEN 2 szindróma genetikai háttere - RET protoonkogén A MEN 2 szindróma autoszom domináns módon öröklodo kórkép, melynek kialakulásáért a RET protoonkogén csírasejtes mutációi felelosek. A RET protoonkogént Takahashi és mts. fedezték fel egy transzfekciós kísérlet kapcsán 1985-ben (100, 101). A transzfekció alatt azonosítottak egy egyszálú DNS-t, ami a transzfekció során rekombinálódott. A DNS-en két különbözo génszekvenciát mutattak ki, melyeket RFP-nek (RET-fused) és RET-nek (rearranged during transfection) neveztek el. A gén lokalizációját a 10q11.2 lókuszon 1994ben Mulligan és Gardner munkacsoportjai tisztázták (91). A RET gén 55 kb nagyságú és 22 exonból áll. A fehérje egy receptor tirozin kináz TGF? szupercsaládba tartozó transzmembrán fehérje, melynek molekulasúlya a glikoziláltságtól függoen 150 illetve 170 kD (102).
Az extracellularis rész tartalmazza a cadherin-köto doméneket, melynek a jel-átvitelben van jelentosége, valamint az ún. ciszteinben gazdag régiót, melynek a receptor dimerizációban van szerepe (2. ábra).
20
2. ábra A RET receptor szerkezete
A RET fehérje fiziológiás funkciója az idegdúc eredetu sejtek fejlodésének és ezek migrációjának a szabályozása. A RET fehérje expresszióját igazolták az idegdúc eredetu sejtekben, a pajzsmirigy C sejtekben, a mellékveseveloben, a paraszimpatikus és szimpatikus ganglionokban, a bél- és az urogenitális rendszer ganglionjaiban és kimutatták jelenlétét a mellékpajzsmirigy sejtekben is. Kimutatták, hogy a RET protoonkogén kiütése vese agenesist és a gyomor-bél rendszer beidegzésének károsodását, valamint Hirschprung betegséget okoz (103-105).
A RET receptor ismert ligandjai a következoek: gliasejt eredetu növekedési faktor (GDNF), neurturin (NTN), artemin és persephin (106, 107). A GDNF egy neurotroph anyag; a középagy dopaminerg neuronjainak fennmaradásában, az autonom idegsejtek, kisagyi Purkinje sejtek, motoneuronok túlélésében játszik szerepet. A GDNF a jelátvitelt a RET aktiválásán keresztül indítja be (108). A RET fehérje a sejtmembránon több fehérjével, koreceptorral együtt egy komplexet képez. Ma négy koreceptort ismerünk: GFR? 1, GFR? 2, GFR? 3 és GFR? 4. A koreceptorok a ligandkötésért, a RET pedig a jelátvitelért felelos. A ligandok dimerizálódáson keresztül a receptort aktiválják, majd a RET fehérje intracelluláris részén lévo tirozin foszforilálódik, ami különbözo összeköto fehérjéket indukál (Shc és Grb2).
21
Ezek az összeköto fehérjék a RET molekulával együtt az Sos, Ras és Raf-1 molekulákat aktiválják, melyek a mitogén aktivált protein kináz (MAPK) utat indítják el. Irodalmi adatok alapján a RET a c-Jun (JNK), foszfolipáz C és foszfatidylinozitol 3-kinázokon keresztül is hathat (3. ábra) (110, 111).
3. ábra A RET receptor jelátviteli útja.
RET protoonkogén mutációk A RET gén mutációkat két nagy csoportba osztjuk; az elso csoportba tartozók a RET inaktiválódását okozzák és a Hirschprung betegség pathogenesisében játszanak szerepet, míg a második csoportba tartozók a RET ligand nélküli aktiválódását váltják ki. Az utóbbi csoportba sorolt ún. aktiváló mutációk játszanak szerepet a MEN 2 tumorok pathogenesisében.
RET protoonkogén inaktiváló mutációk A mutációk a Hirschprung betegség pathogenesisében játszanak szerepet. A Hirschprung betegség vagy veleszületett colon aganglionosis gyakorisága 1:5000. A betegség autoszom
22
domináns, autoszom recesszív, vagy poligénes úton öröklodik. Az érintettekben a gastrointestinális rendszer autonom beidegzésének zavara, vagy teljes hiánya igazolható (144). A betegség genetikai háttere komplex, legalább öt génrol mutatták ki, hogy szerepe van a kórkép kialakulásában (GDNF, RET, NTN, endothelin-? és endothelin-? receptor) (108110). A RET/GDNF rendszer mutációt igazolták congeniális hypoventilatioban, valamint ismeretesek olyan családok, amelyekben MEN 2A és Hirschprung betegség egyidejuleg van jelen (93).
RET protoonkogén aktiváló mutációk Az extracelluláris ciszteinben gazdag régió mutációi a RET receptor aktivációját okozzák. A 634-es kodon mutációk a RET ligand nélküli homodimerizációját és következményes tirozin kináz aktiválódását eredményezik. A ciszteinben gazdag régiót érinto mutációk ezt a hatást a páratlan ciszteinek között kialakuló diszulfid hidakon keresztül váltják ki.
A tirozinkináz doméneket érinto mutációk két úton okozhatnak receptor aktiválódást. Elso lépésben a RET autofoszforilációja lép fel, ami egy aktív monomert eredményez, majd dimér jöhet létre a normális vagy mutáns receptorral, de mindkét esetben a receptor-dimér hyperreaktív állapotba kerül (4. ábra).
4. ábra Receptor dimerizáció normális RET, valamint RET 634-es és 918-as kodon mutációk esetén.
23
II.3.4. Genotípus -fenotípus összefüggések MEN 2 szindrómában Irodalmi adatok alapján az összes MEN 2 szindrómás beteg 90-95 %-ában mutatható ki RET mutáció (111, 112). A mutációk predilekciós helyeinek vizsgálata helyett a RET gén MEN 2 szindrómát okozó exonjának nukleotid szekvencia analízisével azonban a MEN 2 szindrómás esetek akár 98-100 %-ában igazolható mutáció (27). A ciszteinben gazdag régióban (10-es és 11-es exonok) eloforduló aktiváló mutációk a MEN 2A és az FMTC kb. 95%-áért felelosek. A 2. táblázatban aláhúzással jelöltem meg a 634-es kodont, melynek mutációi okozzák az irodalmi adatok szerint a MEN 2 szindrómás esetek mintegy 80-90 %-át (84, 86, 88, 91, 96).
A 10-es exon mutációk (609, 611, 618, 620 kodonok) elsosorban inkomplett MEN 2A szindrómával járnak együtt. MTC minden esetben, phaeochromocytoma ritkán (609-es kodon mutáció esetén az irodalomi adatok szerint egyáltalán nem) míg hyperparathyreosis gyakran kialakul. A 618-as és 620-as kodonok mutációit igazolták MEN 2A és Hirschprung betegség együttes elofordulásakor (93).
A 11-es exonon a 634-es kodon mutációk többsége MEN 2A szindrómával társul (az 1994 évi V. International MEN Wokshop felmérése alapján, ami 361 MEN 2A szindrómás család adatait tartalmazta, a 634-es kodon mutáció az esetek 87,1 %-ában fordult elo). A 634-es kodon mutációk azonban nem ritkán (az esetek 30 %-ában) FMTC-ben szenvedo betegekben is elofordulhatnak (92). A 634-es kodon mutációját mutatták ki MEN2A szindróma és cutan lichen amyloidosis együttes elofordulásakor is (93).
A 13-as és 14-es exonok mutációi gyakran társulnak FMTC-val. A 13-as exon 790-es kodon és a 14-es exon 804-es kodon mutációi esetén komplett MEN 2A szindróma kifejlodésérol is beszámoltak (89, 91, 92, 113). Összeségében megállapítható, hogy a 13-as és 14-es exonok mutációi viszonylag ritkák, az összes MEN 2 szindrómás beteg mindössze 12 %-áért felelosek és klinikailag enyhébb fenotípus kifejlodését okozzák.
24
MEN 2B szindrómás betegek 94-95 %–ában igazoltak RET mutációt, ami leggyakrabban (az esetek több, mint 95 %-ában) a 16-os exonon a 918-as kodont érintette. Ritkán a 16-os exon 922-es kodon és a 15-ös exon 883-as kodon mutációi is társulhatnak MEN 2B szindrómával (29, 88, 90). Klinikai megfigyelések szerint ezek a mutációk súlyosabb, agresszívebb tumorok kialakulását eredményezik.
Sporadikus elofordulású MTC esetek 15-25 %-ban igazoltak szomatikus RET mutációt (918-as, 768-as és 883-as kodonok) (88-90, 114).
A 2. táblázatban a legfontosabb genotípus-fenotípus összefüggéseket, illetve a RET mutációk relatív gyakoriságát foglaltam össze.
2. táblázat Genotípus-fenotípus összefüggések MEN 2A, MEN 2B szindrómában és FMTCben, valamint a RET mutációk relatív gyakorisága (84, 86, 88-90, 92, 93, 95, 97, 98, 113117, 118-120)
25
II.3.5. vonHippel-Lindau (VHL) szindróma A betegség szintén egy több szervet érinto, autoszom dominánsan öröklodo familiáris szindróma. A kórképet veserák, retina és cerebellaris hemangioblastomák endolymphatikus tumorok, phaeochromocytomák, vese, hasnyálmirigy és mellékhere cysták együttes elofordulása jellemzi (121). A phaeochromocytoma megjelenése alapján a kórképnek két típusát különböztetjük meg: az 1-es típusban nem fordul elo phaeochromocytoma, míg a 2-es típusban a phaeochromocytoma a kórkép manifesztációi közé tartozik. Irodalmi adatok alapján az összes VHL szindrómás beteg 10-20 %-ában alakul ki phaeochromocytoma, de a mutáció típusától függoen a családok között a phaeochromocytoma megjelenésében és természetében nagy különbségek fordulhatnak elo (122). A betegség elofordulásának gyakorisága 1:36000. A phaeochromocytoma az esetek kb. felében kétoldali (121, 123).
A betegség kialakulásáért a vhl génmutációi a felelosek. A vhl gén egy tumor szuppresszor gén, a 3p25 kromoszóma locuson helyezkedik el. A vhl gén terméke a vhl fehérje, ami az RNS polimeráz II-t szabályozó elongin B és C-vel egy stabil komplexet képez. Ez a heterotrimer
komplex
tumorszupresszor
hatású.
A
vhl
gént
károsító
mutációk
megakadályozzák a komplex kialakulását, így a tumor-gátló hatás nem érvényesül (111, 112).
II.3.6. 1-es típus ú neurofibromatosis Az 1-es típusú neurofibromatosis I-es típusa szintén egy autoszom domináns módon öröklodo, familiaris szindróma. A kórkép a borön látható jellegzetes café au lait foltok és neurofibrómák alapján ismerheto fel. Elofordulása 1:3-4000. Phaeochromocytoma ritkán fordul elo (az esetek mintegy 1 %-ában) és megjelenése az idosebb életkorban várható. A betegséget okozó nf1 tumorszupresszor gén a 17-es kromószóma rövid karján található (17q11.2). A nf1 gén terméke a neurofibromin, amely a ras/GTP-áz aktiváló fehérjéhez hasonló muködésu. A neurofibrominnek a ras rendszer jelátvitelében van szerepe: a GDP kötohelyet kikapcsolja, és, ezáltal gátolja a jelátvitelt. A neurofibromin funkció károsodása esetén a p21 ras aktiválódásán keresztül aktiválódnak a MAPK-ok (124). II.4. Sporadikus phaechromocytomák hátterében álló genetikai rendellenességek
26
Az irodalmi adatok többsége szerint az összes phaeochromocytomák kb. 90 %-a sporadikus és csak mintegy 10 %-a herediter megjelenésu (125, 126). Néhány endokrin centrum szelektált betegcsoportjában azonban az újabb molekuláris biológiai vizsgálatok szélesebbköru alkalmazásával az örökletes esetek gyakoriságát 25-30 %-osnak találták (27). Néhány vizsgálatban az örökletes formákat okozó géndefektusok elofordulását sporadikus phaeochromocytomákban is vizsgálták, így elemezték a MEN 2 szindrómát okozó RET protoonkogén, a von Hippel-Lindau szindróma hátterében álló vhl gén, valamint a neurofibromatois I-es típusát eredményezo nfI gének lehetséges patogenetikai szerepét. Sporadikus phaeochromocytomás betegekben a vhl gén mutációit az esetek 10-15 %-ában mutatták ki (122, 123, 127), RET mutációt ennél ritkábban, az esetek 3-10 %-ában találtak, és ezek leggyakrabban a 918-as kodonban fordultak elo (86, 94-96, 121), míg nfI génhibát elvétve észleltek (128, 129). Génexpressziós vizsgálatokkal Gutmann és mts. 20 sporadikus phaeochromocytoma eset közül 7 esetbe talált csökkent vagy hiányzó nfI expressziót (124).
Más vizsgálatok sporadikus phaeochromocytomákban az 1p, 3p és 17p kromoszómán, illetve a 13-as és 17-es kromoszómán, a retinoblasztoma (RB1) és p53 tumor szupresszor gének lokalizációjának megfelelo locusokon mutattak ki allélvesztést. Ez utóbbi eltérést viszonylag
gyakrabban
phaeochromocytomákban
igazolták (43).
sporadikus,
Sporadikus
malignus
illetve
phaeochromocytomákban
mint
multiplex lokális
növekedési faktor az IGFII lehetséges patogenetikai szerepe is felmerült.
Legújabb eredmények alapján a szukcinil-dehidrogenáz (SDH, mitokondriális komplex complex II) alegységei közül a SDHD, SDHB és SDHC géneknek van szerepe a familiáris paragangliomák kialakulásában (130-132), és a SDHD és SDHB gének mutációit igazolták herediter és sporadikus phaeochromocytomákban is (27, 132-135).
27
III. CÉLKITUZÉSEK
Munkámban a mellékvese daganatok különbözo klinikai típusaiban azoknak a genetikai eltéréseknek a tanulmányozását tuztem ki célul, amelyeknek jelentosége lehet a daganatok pathomechanizmusában, a daganatokhoz társuló endokrin szindrómák manifesztációjában, illetve amelyek magyarázatul szolgálhatnak a klinikai fenotípus variabilitására. Munkámat a Semmelweis Egyetem ÁOK II. sz. Belgyógyászati Klinikán kivizsgált és mellékvese daganat miatt kezelt betegek klinikai, hormonlaboratóriumi és szövettani leleteinek feldolgozására, illetve a betegekbol nyert vér DNS és a mutéttel eltávolított daganat szövet DNS mintákban elvégzett molekuláris biológiai vizsgálatokra alapoztam. Vizsgálataimban az alábbi konkrét kérdéscsoportokra kívántam választ kapni:
1.
A mellékvese daganatok leggyakoribb klinikai típusát képezo hormonálisan inaktív, véletlenszeruen
felfedezett
mellékvesekéreg
adenomákban
indirekt
klinikai
bizonyítékok alapján feltételezett 21-hidroxiláz enzim gén defektus jelenléte bizonyítható-e a CYP21B leggyakoribb mutációinak direkt meghatározásával? A CYP21B mutációk, amennyiben kimutathatók, szomatikus vagy csírasejtes mutációknak felelnek-e meg? Az egy- és kétoldali hormonálisan inaktív kéregadenomák lehetségesen eltéro pathomechanizmusa miatt tanulmányozni kívántam, hogy különbözik-e a CYP21B mutációk spektruma és/vagy gyakorisága az egy- és kétoldali adenomás esetekben.
2.
Hormonálisan inaktív, véletlenszeruen felfedezett mellékvesekéreg adenomás betegekben elofordulnak-e a CYP21B mutációin kívül más szteroid bioszintézis enzim gén, mint pl. CYP17 mutációk? Hormonálisan inaktív mellékvesekéreg adenomás beteg perifériás vér DNS mintájában a CYP17 szekvencia-analízisével bizonyítható-e a korábbi vizsgálatainkban a CYP17 génen in silico módszerrel felfedezett új (hypotheticus) szekvencia-variánsok természetes elofordulása?
28
3.
A phaeochromocytomával járó örökletes szindromák egyik leggyakoribb oka, a MEN 2 szindrómát okozó RET gén mutációk kimutatására kidolgozott módszer segítségével tanulmányozni kívántam, hogy a pontos genotípus és a részletes klinikai vizsgálatokra alapozott fenotípus meghatározásával nyerhetok-e új klinikai ismeretek? A munka részeként annak a kérdésnek a vizsgálata, hogy egy bizonyos betegség-okozó mutációként számontartott RET mutáció és az általános populációban is eloforduló Ser836Ser szekvencia polimorfizmus (melyet alacsony penetranciájú RET mutációnak is tekintenek) családon belüli ko-szegregációja befolyásolja-e a klinikai fenotípust. A munka további részeként a RET gén MEN 2 szindrómát okozó exonjainak szekvencia-analízisével bizonyítékot kívántam nyerni arra, hogy a vizsgált betegek perifériás vér DNS mintáiban kimutatható-e a korábbi in silico vizsgálatainkkal felfedezett új (hypotheticus) RET szekvencia-variánsok természetes elofordulása.
4.
A II. Belklinikán 1995 és 2003 között vizsgált összes phaeochromocytomás betegben a RET gén mutációk következményeként kialakuló MEN 2 szindróma, a vhl gén mutációk eredményeként kifejlodo vonHippel-Lindau szindróma és az 1-es típusú neurofibromatosis elofordulásának szisztematikus vizsgálatával pontos választ kívántam nyerni arra a kérdésre, hogy néhány külföldi centrum szelektált beteganyagában az örökletes phaeochromocytomák újabban észlelt nagy (25-30%os) gyakoriságával kapcsolatos megfigyelések megerosíthetok-e nem szelektált phaeochromocytomás betegcsoportban? A munka részeként fel kívántam mérni, hogy a klinikai, laboratóriumi és pathológiai paraméterek, illetve a daganatok catecholamin tartalmának elemzése segítséget nyújthat-e a phaeochromocytomák örökletes és sporadikus eseteinek elkülönítésében.
29
IV. BETEGEK ÉS MÓDSZEREK
IV.1. Betegek, vér- és szövetminták Munkámban a Semmelweis Egyetem ÁOK II. sz. Belgyógyászati Klinikán vizsgált mellékvese daganatos betegek klinikai, hormonális, és szövettani adatait dolgoztam fel. A molekuláris biológiai vizsgálatokhoz perifériás vérbol és mellékvese daganatok mutét során eltávolított szövetmintáiból izolált DNS-t használtam. A betegeket a kezelo orvosuk tájékoztatta a vizsgálatokról, beleegyezo nyilatkozatot írtak alá. A daganatszövet-mintákat a daganat mutéti eltávolítása után azonnal folyékony nitrogénben gyorsfagyasztottam és a felhasználásig -80 C0-on tároltam. A perifériás vér és szövetmintákból a DNS-t a kereskedelemben forgalmazott kit-ek segítségével izoláltam (DNA Isolation Kit for Mammalian Blood, Boehringer Mannheim, Németország, illetve Qiamp DNA Blood Kit, Qiagen, USA). A DNS-t a felhasználásig -80 C0-on tároltam.
A mellékvese daganatos betegek klinikai, hormon és szövettani vizsgálati eredményeinek értékelése alapján a betegeket klinikai csoportokba soroltam (hormonálisan inaktív mellékvesekéreg adenoma, aldoszteron-termelo adenoma, phaeochromocytoma, Cushing szindrómát okozó mellékvesekéreg adenoma, daganat-áttét, ganglioneuroma, mellékvesekéreg carcinoma, egyéb).
IV.2. Hormonvizsgálatok
Plasma kortikoszteroidok A hormonálisan inaktív, véletlenszeruen felfedezett mellékvesekéreg daganatos betegek plasmájából a következo kortikoszteroid koncentrációkat határoztuk meg: aldoszteron, kortizol,
18-hidroxi-kortikoszteron,
kortikoszteron,
dezoxikortikoszteron,
dehidroepiandroszteron-szulfát és 17-OHP. A kortikoszteroid koncentrációkat a Semmelweis Egyetem ÁOK II. sz. Belgyógyászati Klinika Endokrin Laboratóriumában kifejlesztett, nagy specificitású radioimmunassay módszerekkel határoztuk meg (136-138).
30
Vizelet VMA és szöveti catecholaminok Mellékvese daganatos betegek 24 h-ás gyujtött vizelet mintáiban meghatároztuk a vanilmandulasav (VMA) mennyiségét. Mutéttel eltávolított, catecholamin-termelo daganatokból származó
mintákban
nagy
nyomású
folyadékkromatográfia
(HPLC)
segítségével
meghatároztam a szöveti adrenalin, noradrenalin és dopamin koncentrációkat.
IV.3. Molekuláris biológiai vizsgálatok
IV.3.1. CYP21B mutációk vizsgálata allél-specifikus PCR módszerrel A CYP21B elemzését Wedell és mts. által kidolgozott allél-specifikus PCR módszerrel végeztem (77). A módszert Magyarországon elsoként a Semmelweis Egyetem ÁOK Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Patobiokémiai Intézetében Dr. Sasvári Mária professzor asszony és munkacsoportja vezette be és ezt a módszert, alkalmazzák a II. sz. Gyermekklinikán Dr Sólyom János professzor úr vezetésével a veleszületett 21-hidroxiláz defektus hátterében álló CYP21B mutációk komplex magyarországi szurése során (75). A CYP21B vizsgálatokat nehezíti, hogy a gén egy inaktív pszeudogénnel (CYP21A) közös egységet alkot. Ezért a CYP21B szelektív amplifikálása során elso lépésben a CYP21A pszeudogénben jelenlevo 8 bázispárnyi deléciót átfedo két belso primer (CYP55, CYP48) és két külso primer (CYP12, CYP1) segítségével egy ún. nagy fragmenst és egy kis fragmenst készítettem (2080 bázispár, illetve 1129 bázispár). Ezek a szakaszok tartalmazzák a CYP21B gén specifikus mutációit, melyek közül a következoek a leggyakoribbak: 2-es intron splice, Pro30Leu, Ile172Asn, 6-os exon cluster, Val281Leu, Leu307insT, Gln318Stop és Arg356Trp.
A nagy illetve kis fragmens amplifikálásához a következo PCR protokollt használtam: 96 C0 3 perc, majd 30 ciklusban 96 C0 1 perc, 54 C0 30 másodperc, 72 C0 3 perc és végül 72 C0 3 perc. A reakcióelegy összetétele: 1,5 mM Mg2Cl, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, 0,2 mM deoxinukleotid trifoszfát, 1U Taq polimeráz (Pharmacia Biotech, Uppsala, Svédország), 0,5 ? M oligonukleotid primerek (Invitrogene Life Technologies, Glasgow, Anglia) és 5 %
31
glicerin. Templátként a betegek perifériás vérébol illetve tumorszövetbol izolált 150 ng DNS-t használtam.
Az elso PCR-t követoen egy második PCR során a mutációk jelenlétét allél-specifikus primerekkel vizsgáltam (4. ábra). Minden mutáció kimutatására két PCR reakciót végeztem; az egyiket a vad típusú, míg a másikat a mutáns szekvenciákra specifikus primerekkel (3. táblázat).
Primerek
Szekvencia 5’-3’
CYP21B génmutációk
CYP55
CCTGTCCTTGGGAGACTACT
Nagy fragmens
CYP12
ACTGTGTTTACAGGGGGGAG
Nagy fragmens
CYP1
TTCAGGCGATTCAGGAAGGC
Kis fragmens
CYP48
CAGAGCAGGGAGTAGTCTC
Kis fragmens
CYP92D CYP92E CYP659G CYP659H CYP659I CYP 1004D CYP 1004H CYP 1388D CYP 1388E CYP 1688G CYP 1688F CYP 1999F CYP 1999E CYP 2113D CYP 2113C
GAG CCT CCA CCT CCC GGAG CCT CCA CCT CCT ACC CTC CAG CCC CCA G ACC CTC CAG CCC CCA A ACC CTC CAG CCC CCA C CCG AAG GTG AGG TAA CAG A CG AAG GTG AGG TAA CAG T GCC TCA GCT GCA TCT CCA GCC TCA GCT GCT TCT CCT ACT GCA GCC ATG TGC AC C ACT GCA GCC ATG TGC AA TGG TCT AGC TCC TCC TG TGG TCT AGC TCC TCC TA G GGC ACA ACG GGC CG AAG GGC ACA ACG GGC CA
Pro30 vad Pro30Leu mutáns I2splice mutáns I2splice vad I2splice vad Ile172 vad Ile172Asn mutáns Val238 vad Val238Glu mutáns Val281 vad Val281Leu mutáns Gln318 vad Gln318stop mutáns Arg356 vad Arg356Trp mutáns
3. táblázat A CYP21B mutációk vizsgálatához használt primerek szekvenciája
A második PCR reakció protokollja a következo volt: 96 C0 3 perc, majd 30 ciklusban 96 C0 1 perc, 56 C0 30 másodperc, 72 C0 3 perc és végül 72 C0 3 perc. A reakció összetétele: 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, 0,2 mM deoxinukleotid trifoszfát, 1U Taq polimeráz (Pharmacia Biotech), 0,15 és 0,5 ? M oligonukleotid primer (Invitrogene Life
32
Technologies) és 5 % glicerin. A második PCR reakcióhoz az elso PCR reakció termékébol 1 ? l-t használtam.
A PCR termékeket 1 %-os agaróz gélben kromatográfiát követoen Polaroid illetve Olympus Camedia 3020 típusú digitális kamerával és UVP-Doc-It szoftverrel (Ultra-Violet Products Ltd, Cambride, UK) dokumentáltam.
4. ábra CYP21B mutációk vizsgálatára alkalmazott allél-specfikus primerek tapadása és a PCR-termékek mérete.
IV.3.2 CYP17 mutáció és polimorfizmus vizsgálat DNS szekvenálással A 8 exonból álló CYP17 (szteroid 17? -hidroxiláz/17,20-liáz gén) mérete lehetové tette, hogy a teljes gén PCR-amplifikálását 5 szakaszban (A-E) végezzem el (139, 140, 143). A PCR reakciókhoz használt oligonukleotid primereket a 4. táblázat tartalmazza. A PCR reakcióhoz 100 ng DNS-t használtam. A PCR reakció összetétele 50 ? l végtérfogatban a következo volt: 2 ? M/l oligonukleotid primer (Invitrogene Life Technologies), 10 mM/L TrisHCl, 2,5 mM/L MgCl2, 50 mmol/L KCl, 0.2 mM/L dezoxinucleotid triphosphat, 1 U Taq polimeráz (Pharmacia Biotech) és 5 % glycerin. A PCR reakció 95 C0-on 5 percig tartó denaturációval kezdodött, amit 30 ciklus egyenként 1 perc 95 C0, 57 C0 és 72 C0 következett, végül a program egy 72 C0-on 10 perces extenzióval zárult. A PCR termékeket
33
2% agaróz gélen választottuk el és High Pure PCR Product kit-el (Roche Diagnostics) tisztítottam.
1-es exon
17-AF 5’-TCA AGG TGA AGA TCA GGG TA-3’ 17-AR 5’-GTC TGA AGA CC TGA ACC AAT CCC A-3’ 2-es + 3-as exon 17-BF 5’-GTG GAT GGG TGT GAG ATT CCT ACA-3’ 17-BR 5’-CAA TGT CAG GGT CTA CTA GAA CCT-3’ 4-es exon 17-CF 5’-TGC TGA TTC ATT TCC A CCC T-3’ 17-CR 5’-TGA TTC CTT TTA GCC TAA CTC ATA T-3’ 5-ös + 6-os exon 17-DF 5’-TGG GGC TCC TTC CTT ATT AAT GT-3’ 17-DR 5’-GTG AAT GCA TCA TGG GGC TAG AT-3’ 7-es + 8-as exon 17-EF 5’-TAC GAA GTC CCA GAC CCA CTT TTC CT-3’ 17-ER 5’-GAA AGA ATG AGT GAG CAA ATG AAT A-3’ 4. táblázat CYP17 PCR-amplifikálásához használt primerek szekvenciája (143).
A PCR-termékeket Big Dye Terminator Cycle-Sequencing kit-el (Applied Biosystems) és ABI 310 automata szekvenálóval (Genetic Analyser, Applied Biosystems) szekvenáltuk.
IV.3.2 A RET protoonkogén vizsgálata SSCP-vel és direkt DNS szekvenálással Single strand polymorphism analízissel (SSCP) a RET protoonkogénen eloforduló rendellenességek szurovizsgálatszeru kimutatása lehetséges. Irodalmi adatok szerint a módszer a génszakaszok gyors vizsgálatára, valamint ismert mutációk esetén a családtagok szurésére alkalmas, bár egyes mutációk esetén ál-negatív eredményeket is leírtak.
Az SSCP vizsgálatot vertikális gél-elektroforézis készülékben (Hoefer Instruments, CA, USA) 12 % polyacrylamidot és 0,8 % bisacrylamidot tartalmazó gélen végeztem. A vizsgált exonoknak megfeleloen a PCR termékek elválasztására különbözo homérsékletet és idotartamot alkalmaztam (a 11 exon esetében 45 C0 és 4,5 óra, a 14-es exon esetében szobahomérsékleten és 12 óra, míg a 10-es exon esetében 4 C0 és 12 óra, 200 V). A PCR termékeket formamid/50 ? mol/l EDTA oldattal denaturáltam, és jégen hutöttem (44). A PCR amplifikáláshoz használt primerek nukleotid szekvenciáját az 5. táblázat tartalmazza. 10-es exon
RET10F: 5’-GCAGCATTGTTGGGGGACA-3’
34
RET10R: 5’-GTCCCGGCCACCCACT-3’ 11-es exon RET11F: 5’-CATGAGGCAGAGCATACGCA-3’ RET11R.5’-GACAGCAGCACCGAGACGAT-3’ 13-as exon RET13F: 5’-AACTTGGGCAAGGCGATGC-3’ RET13R: 5’-AGAACAGGGCTGTATGGAGC-3’ 14-es exon RET14F: 5’-AAGACCCAAGCTGCCTGAC-3’ RET14R: 5’-GCTGGGTGCAGAGCCATAT-3’ 15-ös exon RET15F: 5’-GTGACCGCTGCTGCTGCCATGG-3’ RET15R: 5’-CACCTGGCTCCTCTTCACGTAG-3’ 16-os exon RET16F: 5’-AGGGATAGGGCCTGGCCTTC-3’ RET16R: 5’-TAACCTCCACCCCAAGAGAG-3’ (44) 5. táblázat A RET protoonkogén PCR-amplifikálásához használt primerek nukleotid szekvenciája (94). A PCR reakcióhoz 100 ng DNS-t használtam. A PCR reakció összetétele 25 ? l végtérfogatban a következo volt: 1 ? M/l oligonukleotid primerek (Invitrogene Life Technologies), 10 mM/L Tris-HCl, 2,5 mM/L MgCl2, 50 mM/L KCl, 0.2 mM/L dezoxinucleotid triphosphat, 1 U Taq polimeráz (Pharmacia Biotech) és 5 % glycerin. A PCR reakció 95 C0-on 5 percig tartó denaturációval kezdodött, amit 30 ciklus egyenként 1 perc 65 C0, 72 C0 és 95 C0 következett, végül a program egy 72 C0-on 10 perces extenzióval zárult. A PCR termékeket 2% agaróz gélen választottam el és High Pure PCR Product kit-el (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) tisztítottam.
A PCR-termékeket Big Dye Terminator Cycle-Sequencing kit-el (Applied Biosystems, Foster City, CA) és ABI 310 automata szekvenálóval (Genetic Analyser, Applied Biosystems) szekvenáltuk. A szekvenálást 2002-tol a laboratóriumunkban üzembe helyezett Li-Cor IR2 automata gél szekvenáló készülékkel végeztem, ami a festékkel jelölt univerzális primer alacsonyabb költsége miatt külön elonnyel járt. Ettol az idotol kezdve a szekvenáláshoz használt PCR termékeket egy M13-as véggel kiegészített primerekkel készítettem (6. táblázat), míg a PCR program és reakcióelegy összetétele nem változott.
35
10-es exon 10F-sz: CAC gAC gTT gTA AAA CgA C- gCA gCA TTg TTg ggg gAC A 10R-sz: ggA TAA CAA TTT CAC ACA gg- gTC CCg gCC gCC ACC CAC T 11-es exon 11F-sz: CAC gAC gTT gTA AAA CgA C-CAT gAg gCA gAg CAT ACg CA 11R-sz: ggA TAA CAA TTT CAC ACA gg-gAC AgC AgC ACC gAg ACg AT 14-es exon 14F-sz: CAC gAC gTT gTA AAA CgA C- AAg ACC CAA gCT gCC TgA C 14R-sz: ggA TAA CAA TTT CAC ACA gg- gCT ggg TgC AgA gCC ATA T
6. táblázat A RET protoonkogén szekvenálásához használt, M13-as véggel kiegészített primerek szekvenciája (115). A szekvenáló primerekkel eloállított PCR terméket 3 %-os agaróz gélben a kromatográfiát követoen Gel-extraction kit-tel (Viogene-Biotech Corporation, Tonhua, Taiwan) tisztítottam. A szekvenálási reakciókat Cycle-sequencing kit with 7-deaza (Pharmacia Biotech, Uppsala, Svédország) segítségével végeztem az alkalmazási leírás szerint. A szekvenálást automata LiCOR IR2 (Li-COR, Inc, Lincoln, USA) DNS-analizálóval végeztem (115).
IV.3.3. A vhl gén vizsgálata direkt DNS szekvenálással A vhl gén amplifikálására a PCR reakció összetétele 25 ? l végtérfogatban a következo volt: 0,5 ? M/l primer (Invitrogene Life Technologies, 10 mM/l Tris-HCl, 2,5 mM/l MgCl2, 50 mM/l KCl, 0,2 mM/l deoxinucleotid trifoszfát, 0,5 U Taq polimeráz (Pharmacia Biotech) és 5 % glycerin. A PCR reakcióhoz használt oligonukleotid primerek szekvenciáját a 7. táblázat tartalmazza.
1-es exon VHL1F 5’-CACGACGTTGTAAAACGAC CGA AGA CTA CGG AGG TCG AC3’ VHL1R 5’-GGC TTC AGA CCG TGC TAT CG- 3’ 2-es exon VHL2F 5’-CACGACGTTGTAAAACGAC ATT ACA GGT GTG GGC CAC CG-3’ VHL2R 5’-GCC TGA CAT CAG GCA AAA ATT GAG-3’ 3-as exon VHL3F 5’-CACGACGTTGTAAAACGAC CCT TGT ACT GAG ACC CTA G-3’ VHL3R 5’-GCT GAG ATG AAA CAG TGT A-3’
7. táblázat A vhl gén szekvenálásához használt, M13-as véggel kiegészített primerek szekvenciája (127). A PCR reakciót MJ Research PTC 100 ThermoCycler-ben végeztük a következõ programmal: 5 perc denaturáció 95 C0 -on, amit 30 ciklus egyenként 1 perc 60 C0, 72 C0 és 95 C0 követett, végül a program egy 10 perces 72 C0 -os extenzióval zárult. A PCR
36
termékeket 2 % agaróz gélen választottam el, majd High Pure PCR Product kit-el (Roche Diagnostics) tisztítottam. A PCR-termékeket Cycle-sequencing with 7-deaza kit segítségével (Pharmacia Biotech) automata LiCOR IR2 DNS analizáló készülékkel (Li-COR, Inc.) szekvenáltam.
IV.3.4. Szöveti catecholamin tartalom vizsgálata HPLC-vel A phaeochromocytoma szövetek catecholamin tartalmát reverz fázisú magas nyomású folyadék kromatográfiával (HPLC) határoztam meg. A vizsgálathoz gyorsfagyasztott és -80 C0-on tárolt szövetmintákat használtam. 100 mg daganatszövetet 2 ml 0.5 M ecetsav oldatban homogenizáltam, majd a homogenizátumot 10 percig 10000 g-n centrifugáltam. A felülúszóhoz 1/10 térfogat 1 M perklórsavat adtam. A perklórsavval precipitált fehérjét ismételt centrifugálással távolítottam el (4 C0-on, 10 percig, 15600 g), majd a felülúszó folyadék pHját 5-7 közé állítottam be. A phaeochromocytomák igen magas catecholamin tartalma miatt a tisztított mintákat az analízis elott hígítottam, a vizsgálatok szerint a 100-szoros hígítás volt optimális. Hígítás után a mintákból 20 ? l-t injektáltam a HPLC rendszerbe. A HPLC készülék a következo egységekbol állt: Bio-Rad Model 1350 Soft-star pumpa, Model 1640 elektrokémiai detektor (Bio-Rad Laboratories, München, Németország). Az elválasztáshoz használt oszlopot és az elotét-oszlopot 40 Co homérsékleten tartottam. Az elektrokémiai detektor beállítása a következo volt: potenciál 550 mV, érzékenység: 10 nA/V, válasz-ido 5 másodperc (Ag/AgCl), áramlási sebesség: 1,4 ml/perc. A HPLC analízishez belso standardként dihidroxibenzilamint (DHB) használtam. A vizsgált minták catecholamin tartalmát az ismert koncentrációjú catecholamin és DHB standardok egymáshoz viszonyított arányából számítottam ki (141, 142).
IV.5. Statisztikai módszerek A laboratóriumi adatok feldolgozásában az SPSS szoftver csomagját használtam. A hormon mérések feldolgozásában parametrikus (Student t-teszt), nem-parametrikus módszereket (Mann-Whitney u-teszt, illetve Kruskal-Wallis teszt), a korrelációszámításhoz a Spearman és Pearson-teszteket alkalmaztam.
37
V. VIZSGÁLATOK EREDMÉNYEI
V.1.
CYP21B mutációk hormonálisan inaktív, véletlenszeruen felfedezett egyoldali és kétoldali mellékvesekéreg adenomás betegekben
A CYP21B gén 8 leggyakoribb mutációjának elofordulását 19 kétoldali mellékvesekéreg daganatos beteg perifériás vérébol izolált DNS mintáiban, valamint 31 mutéttel kezelt egyoldali mellékvesekéreg daganatos beteg perifériás vérébol és daganatszövetébol izolált DNS mintáiban vizsgáltam. A mutáció vizsgálat eredményeit a 21-hidroxiláz defektus klinikai diagnosztikájában rutinszeruen alkalmazott hormonmeghatározások (alap és ACTH-stimulált plasma 17-OHP koncentrációk) eredményeivel összevetve értékeltem.
A kétoldali mellékvesekéreg adenomás 19 beteg közül egy betegben homozigóta és két betegben heterozigóta Val281Leu mutációt, míg egy betegben heterozigóta Arg356Trp mutációt találtam. Az egyoldali mellékvese daganatos 31 beteg között 5 betegben találtam CYP21B mutációt heterozigóta formában (három betegben Ile172Asn és két betegben Val281Leu mutáció). Az egyoldali mellékvesekéreg daganatos betegek perifériás vér és daganatszövet DNS mintáinak analízise azonos eredményt adott. Ezeknek a vizsgálatoknak az eredménye alapján a heterozigóta és homozigóta CYP21B mutációk a kétoldali mellékvesekéreg adenomás betegek 21.1 %-ában, míg az egyoldali mellékvesekéreg adenómás betegek 16,1 %-ában fordulnak elo.
Kétoldali mellékvesekéreg adenomás betegekben az ACTH-stimulált plazma 17-OHP koncentráció meghaladta az egyoldali adenomás betegekben mért plazma koncentrációkat (1770? 1459 ng/dl vs. 1287? 731 ng/dl) (5. ábra), de a különbség nem volt szignifikáns. A homozigóta Val281Leu mutációt hordozó betegben igen magas ACTH-stimulált plazma 17OHP értéket találtam. Említésre méltó azonban, hogy egy másik kétoldali mellékvesekéreg adenomás betegben, akinél az ACTH-stimulált plasma 17-OHP koncentráció az összes beteg közül a legmagasabb volt, a vizsgált 8 leggyakoribb CYP21B mutáció egyikét sem lehetett kimutatni. Említésre érdemes az a megfigyelés is, hogy a CYP21B mutációt hordozó 5
38
egyoldali mellékvesekéreg adenomás beteg közül mindössze két betegben lehetett a normálist meghaladó ACTH-stimulált plazma 17-OHP koncentrációt bizonyítani.
5. ábra Egyoldali és kétoldali mellékvesekéreg adenomás betegek ACTH-stimulált plazma 17-OHP értékei és a CYP21B gén mutáció-analízisének eredményei.
V.2.
CYP17 gén mutáció és polimorfizmusok kétoldali mellékvesekéreg daganatos betegben
A II. Belklinikán 1995 és 2003 között vizsgált kétoldali mellékvese daganatos betegek hormon-adatainak elemzésekor egy betegben igen magas (a normálist több mint tízszeresen meghaladó) plazma kortikoszteron szint derült ki. A betegnél a klinikai tünetek (primer amenorrhoea, hypogonadismus, hypertonia és hypokalaemia), valamint a részletes
39
hormonvizsgálatok veleszületett 17-hidroxiláz defektust valószínusítettek. A beteg perifériás vérébol izolált DNS mintában a CYP17 szekvencia-analízise egy új, az irodalomban eddig még nem közölt mutációt igazolt (Arg440Cys). A betegség-okozó mutáció azonosítását követoen a CYP17 gén szekvencia vizsgálatot kiterjesztettem a gén összes exonjára. Ezekkel a vizsgálatokkal arra a kérdésre kívántam választ kapni, hogy bizonyítható-e a korábbi in silico vizsgálatainkban a CYP17 kódoló régiójában felfedezett új polimorfizmusok természetes elofordulása.
A beteg perifériás vérébol izolált DNS mintában a CYP17 gén összes exonjának szekvenálása során az 1-es exonon három, korábban már leírt polimorfizmust azonosítottam: TGG22TGC ?Trp22Cys? és CAT-CAC ?His46His? homozigóta formában és TCG65TCC ?Ser65Ser? heterozigóta formában (6. ábra).
6. ábra Kétoldali mellékvese daganatos beteg perifériás vér DNS mintájában a CYP17 1-es exonján homozigóta TGG22TGC (Trp22Cys) és CAT-CAC (His46His) valamint heterozigóta Ser65Ser (TCG65TCC) polimorfizmus A CYP17 további exonjainak vizsgálatakor az in silico kutatásokkal felfedezett új génpolimorfizmusok közül két, aminosav-cserével nem járó polimorfizmus (GAC192GAT és GAC283GAT, mindketto homozigóta formában) jelenlétét igazoltam (7. ábra). Bár a két új polimorfizmus populáció-szintu gyakorisága és potenciális jelentosége jelenleg még nem ismert,
40
perifériás vér DNS mintában való jelenlétük egyértelmuen igazolja ezek természetes elofordulását.
7. ábra Kétoldali mellékvese daganatos beteg perifériás vér DNS mintájában a CYP17 két új polimorfizmusa (GAC192GAT és GAC283GAT, mindketto homozigóta formában)
V.3.
RET protoonkogén mutációk és polimorfizmusok MEN 2 szindrómában
V.3.1. RET mutációk spektruma MEN 2 szindrómás betegekben A RET protoonkogén mutációk szurését SSCP módszerrel, a mutációs ”hot spot”-ot képezo 11-es exon vizsgálatával kezdtem. A RET mutációk vizsgálatát munkacsoportunkon kívül Magyarországon dr. Ésik Olga professzor asszonnyal való szoros együttmuködésben dr. Váradi András professzor úr laboratóriumában, az MTA Enzimológiai Intézetében végzik. Laboratóriumunkban összesen 86 betegben végeztem SSCP módszerrel RET protoonkogén 11-es exon mutáció szurést (5 MEN 2A szindrómás családban 30 egyén, 1 FMTC-s családban 9 egyén, 19 sporadikus MTC-ben szenvedo beteg és 28 sporadikus phaeochromocytomás beteg). Az eredményeket a 8. táblázat tartalmazza. A módszerrel 4 MEN 2A szindrómás család 12 tagjában és az FMTC-s család 4 tagjában lehetett a 11-es exonon mutáció jelenlétét valószínusíteni, amit ezt követoen a 11-es exon direkt szekvenálásával minden esetben bizonyítani tudtam (TGC634TTC, TGC634TAC és TGC634CGC mutációk). Az ötödik MEN 2A család tagjaiban az SSCP vizsgálat álnegatív eredményt adott (8. ábra)? ebben a családban a betegség-okozó mutációt (TGC634AGC) a 11-es exon direkt szekvenálásával azonosítottam. Sporadikus MTC-ben és sporadikus
41
phaeochromocytomában szenvedo betegekben SSCP vizsgálattal nem lehetett a 11-es exonon mutáció jelenlétét bizonyítani.
MEN2A
FMTC
MTC
Sporadikus
phaeochromoc. Pozitív
12
4
0
0
Negatív
18
5
19
28
Összesen
30 (5 család) 9 (1 család)
19
28
8. táblázat SSCP vizsgálattal a RET protoonkogén 11-es exon mutációra szurt egyének, illetve a pozitív és negatív esetek száma
8. ábra: RET gén 11-es exon mutáció szurés SSCP vizsgálattal. Az 1. minta egészséges kontroll, a 2-5 minták mutációt hordozó egyének kromatográ-fiás képét mutatja be. Az SSCP vizsgálatot követoen szekvenálással a 2. és 4. mintákban TGC634TTC, a 3. mintában TGC634CGC, az 5. mintában TGC634AGC mutáció igazolódott.
1.
2.
3.
4.
5.
A RET protoonkogén 11-es exon TGC634AGC mutáció esetén álnegatív eredménnyel járó SSCP vizsgálattól eltekintve a 11-es exon egyéb mutációi kapcsán az SSCP módszerrel nyert eredmények összhangban álltak a szekvenálással nyert adatokkal (negatív SSCP vizsgálat esetén direkt szekvenálással nem fordult elo mutáció vagy TGC634AGC mutációt találtam, míg pozitív SSCP vizsgálat esetén direkt szekvenálással minden esetben azonosítani lehetett a mutációt).
A RET protoonkogén 10, 11, 13, 14, 15 és 16-os exonok mutáció-analízisét 10 MEN 2 szindrómás (7 MEN 2A és 3 FMTC) család 72 tagján végeztem el. A mutációk vizsgálatára az exonok PCR-amplifikálását követoen direkt szekvenálást alkalmaztam. A módszer az
42
SSCP-vel álnegatív esetek pontos azonosításán kívül lehetové tette a mutációkon kívül egyéb gén-variánsok (polimorfizmusok) detektálását, melyeket a további vizsgálatokban részletesen elemeztem (lásd késobb). A RET protoonkogén 10, 11, 13, 14, 15 és 16-os exonok mutáció analízisének eredményét a 9. táblázatban foglaltam össze. Vizsgált exon 10-es exon
Mutáció
Esetszám
TGC609TCC
4 eset pozitív 3 eset negatív 3 eset pozitív
TGC609TAC 11-es exon
TGC634TTC TGC634TAC TGC634TAC TGC634CGC TGC634AGC TGC634TTC
13-as exon 14-es exon
nincs GTG804TTG
Klinikai manifesztáció MEN2A
Család sorszáma 1
MEN2A
2
6 eset pozitív 14 eset negatív 2 eset pozitív 1 eset negatív 3 eset pozitív 1 eset pozitív 3 eset pozitív 4 eset pozitív 5 eset negatív
MEN2A
3
MEN2A
4
MEN2A MEN2A MEN2A FMTC
5 6 7 8
15 eset pozitív 6 eset negatív 2 eset pozitív
FMTC
9
GTG804ATG FMTC 10 15-ös exon nincs 16-os exon nincs 9. táblázat RET protoonkogén mutáció analízis eredménye 10 MEN 2 szindrómás családban A nemzetközi irodalmi adatokkal összhangban a vizsgált 10 család közül a leggyakoribb mutációs hely a 11-es exon 634-es kodonja volt (6 család). A szekvenálással azonosított mutációk közül a TGC634TTC (Cys634Phe) mutációt, melyet két családban észleltem, a nemzetközi irodalomban ritka mutációként tartják számon. A TGC634TTC mutáció az egyik családban MEN 2A szindrómával, míg a másikban FMTC-vel társult. Az irodalmi adatok szerint leggyakoribb TGC634TAC (Cys634Tyr) mutációt két MEN 2A szindrómás családban mutattam ki, míg 1-1 családban TGC634CGC (Cys634Arg) illetve TGC634AGC (Cys634Ser) mutációt találtam.
43
A 10-es exon 609-es kodonon két MEN 2A szindrómás családban két különbözo mutációt igazoltam (TGC609TAC és TGC609TCC). A 10-es exon TGC609TCC (Cys609Ser) mutációt hordozó családtag DNS mintájának szekvenálásával nyert eredményt a 9. ábra szemlélteti
9. ábra RET protoonkogén 10-es exon TGC609TCC (Cys609Ser) heterozigóta mutáció MEN 2A szindrómás betegben
A 10-es exon TGC609TCC (Cys609Ser) mutáció elofordulását a vizsgált MEN 2A szindrómás családban a betegség klinikai manifesztációi különösen érdekessé tették, ezért indokoltnak tartom ennek rövid ismertetését. A családfát a 10. ábra illusztrálja. Az index egyén (II.1) egy 48 éves férfi, akinél phaeochromocytoma miatt végeztek mellékvese mutétet, majd a magas szérum calcitonin szint (780 pg/ml, normális érték: <11.5 pg/ml) miatt történt vizsgálatok medulláris pajzsmirigy carcinomát igazoltak, és totális thyreoidectomiát végeztek. A családi anamnézis során derült fény arra, hogy a proband édesanyja (I.1) 20 évvel korábban, 50 éves korban phaeocromocytoma miatt mellékvese mutéten és medulláris pajzsmirigy carcinoma miatt pajzsmirigy mutéten esett át, majd metasztatizáló daganatos betegségben elhunyt. A RET gén analízise során a probandban (II.1) és a proband egyik fiában (III.3) azonosítottam a TGC609TCC mutáció jelenlétét, míg a proband másik két fiában (III.1 és III.2) nem találtam mutációt. A mutáció-analízis eredménye alapján a mutációt hordozó fiúban preventív totális thyreoidectomia történt. A proband két testvére közül az egyik testvérben (II. 3) 42 éves korban phaeochromocytoma és medulláris pajzsmirigy carcinoma igazolódott, és a mutáció vizsgálattal is pozitív eredményt kaptam (a vizsgálatokat követoen a betegnél féloldali adrenalectomiát és totális thyreoidectomiát végeztek). A mutáció jelenlétét a proband 42 éves testvérének 21 éves gyermekében (III.4) is kimutattam, és a vizsgálat eredménye alapján preventív totális thyreoidectomiára került sor. A proband másik, 47 éves testvérében a mutáció analízis eredménye negatív volt. A családfát a TGC609TCC
44
mutációhoz 3 családtagban társuló phaeochromocytoma teszi különösen érdekessé, ugyanis a nemzetközi irodalomban közzétett megfigyelések szerint a 609-es kodon mutáció nem társult phaeochromocytomával. A család 3 tagjában manifesztálódó phaeochromocytomát a TGC609TCC mutáció új klinikai fenotípusaként publikáltuk.
10. ábra RET protoonkogén 10-es exon TGC609TCC (Cys609Ser) mutáció elofordulása egy családban
V.3.2. Val804Leu mutáció és Ser836Ser polimorfizmus ko-szegregáció FMTC-ben A RET protoonkogén 10, 11, 13, 14, 15 és 16-os exonok szekvencia-vizsgálata során a betegség-okozó mutációk azonosításán kívül külön figyelmet fordítottam azoknak a polimorfizmusoknak az elemzésére, amelyek jelenléte feltételezések szerint módosíthatja a betetgség klinikai manifesztációját vagy lefolyását. Különösen érdekesnek tunt a medulláris pajzsmirigy carcinomás esetekben alacsony penetranciájú gén-variánsként számontartott AGC836AGT (Ser836Ser) polimorfizmus jelenlétének vizsgálata, ugyanis irodalmi adatok szerint ennek a polimorfizmusnak az allél-gyakorisága sporadikus medulláris pajzsmirigy carcinomás betegekben szignifikánsan nagyobb, mint az általános népességben.
Munkám során egy olyan 4 generációból és 80 tagból álló FMTC-s család vizsgálatát végeztem el, ahol a 14-es exon vizsgálatakor egy ismert betegség-okozó (GTG804TTG,
45
Val804Leu) mutáció és az AGC836AGT (Ser836Ser) polimorfizmus egyuttes elofordulását mutattam ki. Miután az elso generációban a mutáció és polimorfizmus különbözo allélokon helyezkedett el, a nagyszámú családtag vizsgálata lehetové tette a mutáció és polimorfizmus klinikai fenotípusra gyakorolt hatásainak részletes elemzését. A család GTG804TTG mutációt és AGC836AGT polimorfizmust hordozó egyik tagjának DNS mintájában a RET protoonkogén 14-es exon szekvenálás eredményét a 11. ábra szemlélteti, míg a családfát a 12. ábra mutatja be.
11. ábra RET 14-es exon mutáció analízis egy FMTC-s család tagjában. Bal oldal: heterozigóta GTG804TTG (Val804Leu) mutá-ció. Jobb oldal: heterozigóta AGC836AGT (Ser836Ser) poli-morfizmus.
A négy generációból álló család összesen 4 tagjában fordult elo szövettani vizsgálattal igazolt medulláris pajzsmirigy carcinoma, valamennyi beteg a második generációba tartozott. A betegekben a phaeochromocytoma és hyperparathyreosis jelenlétét klinikai, endokrinológiai, radiológiai és laboratóriumi vizsgálatokkal ki lehetett zárni. A medulláris pajzsmirigy carcinomás családtagok közül egy családtagban nem történt genetikai vizsgálat (külföldön él), a többi családtagban a vizsgálatok Val804Leu mutáció jelenlétét igazolták. A család második generációjában a medulláris pajzsmirigy carcinomás családtagokon kívül még további 2 családtagban igazolódott Val804Leu mutáció, míg a második generáció 5 tagjában lehetett Ser836Ser polimorfizmust detektálni. A család elso generációjába tartozó legidosebb tagjának DNS mintáiban mind a Val804Leu mutáció, mind a Ser836Ser polimorfizmus jelen volt, azonban medulláris pajzsmirigy carcinomát nem lehetett kimutatni. A harmadik generáció tagjainak vizsgálata során összesen 7 esetben igazoltam Val804Leu mutációt és 2 esetben Ser836Ser polimorfizmust. A negyedik generációba tartozó 2 kisgyermek mind a Val804 mutációt, mind a Ser836Ser polimorfizmust hordozta (12. ábra).
46
A klinikai tünetek elemzésével megállapítottam, hogy a betegekben az FMTC kórlefolyása a 14-es exon mutációk esetében megfigyelt viszonylag enyhe formának felelt meg (89, 93) és a család egyetlen medulláris pajzsmirigy carcinomás tagjában sem fordult elo a betegséggel összefüggo halál. A genotípus és klinikai fenotípus összevetése alapján a Val804Leu mutáció és Ser836Ser polimorfizmus ko-szegregációja nem súlyosbította a klinikai tüneteket vagy a kórlefolyást, sot együttes elofordulásuk ellenére a család legidosebb, 80 éves kor feletti tagjában nem lehetett medulláris pajzsmirigy carcinomát kimutatni.
12. ábra FMTC-s családban a RET protoonkogén Val804Leu mutáció és Ser836Ser polimorfizmus ko-szegregációja
V.3.3. RET protoonkogén egyéb polimorfizmusai MEN 2 szindrómás betegek DNS mintáiban a RET protoonkogén exonok nukleotid szekvencia analízisével a Ser836Ser polimorfizmuson kívül egyéb gén- polimorfizmusokat is azonosítottam. A 13-as exonon egy korábban már leírt, aminosav cserével nem járó
47
CTT769CTG (Leu769Leu) polimorfizmus jelenlétét detektáltam mind heterozigóta (13. ábra), mind homozigóta formában. Külön kiemelést érdemel, hogy a korábbi in silico vizsgálatainkban felfedezett új RET protoonkogén polimorfizmusok közül a TCC904TCG (Ser904Ser) polimorfizmus jelenlétét mutattam ki egy sporadikus phaeochromocytomában szenvedo beteg perifériás vér DNS mintájában (13. ábra), bizonyítva az in silico kutatásokkal felismert TCC904TCG polimorfizmus természetes elofordulását.
13. ábra RET protoonkogén heterozigóta CTT769CTG (Leu769Leu) polimorfizmus FMTC-ben és heterozigóta TCC904TCG (Ser904Ser) polimorfizmus sporadikus phaeochromocytomában.
V. 4. Örökletes és sporadikus phaeochromocytomák relatív gyakorisága, klinikai és biokémiai sajátosságai Az örökletes és sporadikus phaeochromocytomák relatív gyakoriságának, valamint klinikai és biokémiai sajátosságainak meghatározását a Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinikán 1995 - 2003 között vizsgált összes phaeocromocytomás beteg adataira alapoztam. Ez ido alatt a Klinikán 609 mellékvese daganatos beteget vizsgáltak (10. táblázat), akik közül 41 betegben (6.7 %) igazoltak phaeochromocytomát.
Daganat típusa Hormonálisan inaktív mellékvesekéreg adenoma Primér aldoszteronizmus (adenoma) Phaeochromocytoma Cushing szindróma Daganat-metastasis
48
Szám 458 43 41 23 9
% 75.2 7.1 6.7 3.8 1.5
Betegek Férfi/No 163/295 19/24 11/30 7/16 6/3
Ganglioneuroma 8 1.3 3/5 Mellékvesekéreg carcinoma 8 1.5 2/6 Egyéb (myelolipoma, angiomyolipoma, cysta) 19 3.1 12/7 Összesen 609 100 223/386 10. táblázat: A Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinikán 1995-2003 között mellékvese daganat miatt vizsgált betegek száma, százalékos elofordulása és nemi megoszlása a daganat klinikai típusa szerinti osztályozás alapján Vizsgálataimban a 41 phaechromocytomás beteg közül az örökletes és sporadikus formák elkülönítését a klinikai adatok mellett a RET protoonkogén 10, 11 és 14-es exonok, valamint a vhl gén 1, 2 és 3-as exonok mutáció analízisének eredményére alapoztam.
Beteg szám MEN 2A
Család szám
Életkor Klinikai manifesztáció (év)
1.
I
48
2.
I
42
3.
II
63
4.
II
63
5.
II
33
6.
III
45
7.
IV
52
Gén mutáció (aminosav-csere)
Pheo, MTC
RET TGC609TCC (Cys609Ser) Pheo, MTC RET TGC609TCC (Cys609Ser) Pheo, MTC RET TGC634TTC (Cys634Phe) Pheo (kétoldali) RET TGC634TTC mellékpajzsmirigy adenoma (Cys634Phe) Pheo, mellékpazsm adenoma RET TGC634TTC (Cys634Phe) Pheo (kétoldali), MTC, RET TGC634TAC mellékpajzsmirigy adenoma (Cys634Tyr) Pheo (kétoldali), MTC RET TGC634CGC (Cys634Arg)
vonHippel-Lindau szindróma 8.
V
20
9.
VI
34
Pheo, kisagyi hemangioVHL CGG167CAG blastoma, retina angioma (Arg 167Gly) Pheo, vese carcinoma, VHL AGT80ATT pancreas carcinoma (Ser80Ile)
Neurofibromatosis 1-es típus 10.
VII
58
11.
VIII
58
12.
IX.
58
Pheo, café au lait foltok, bor neurofibromák Pheo, café au lait foltok, bor neurofibromák Pheo, café au lait foltok,
49
N.D. N.D. N.D.
bor neurofibromák Pheo, café au lait foltok, N.D. bor neurofibromák Pheo: phaeochromocytoma, MTC: medulláris pajzsmirigy carcinoma, N.D.: nem vizsgált 13.
X.
58
11. táblázat: Örökletes phaeochromocytomákhoz társuló tünetek és a genetikai vizsgálatok eredeménye A
41
phaeochromocytomás
beteg
közül
13
esetben
lehetett
örökletes
phaeochromocytomát igazolni (7 esetben RET mutáció vizsgálattal igazolt MEN 2A szindróma, 2 esetben vhl mutáció analízissel bizonyított vonHippel-Lindau szindróma és 4 esetben a klinikai kép alapján igazolt 1-es típusú neurofibramotosis (11. táblázat). Az örökletes phaeochromocytomás esetek az összes phaeochromocytomás beteg 28 %-át tették ki, ami megegyezik az újabb felmérések adataival (27), de jelentosen eltér a régebbi, kb 10 %-os gyakoriságot jelzo vizsgálatok eredményétol (87, 116, 117, 125, 126).
Az örökletes és sporadikus phaeochromocytomák patológiai jellegzetességeit a 12. táblázatban foglaltam össze. Az örökletes phaeochromocytomák mérete a sporadikus esetekhez képest kissé nagyobb volt, de a különbség nem volt szignifikáns. Az örökletes esetek között gyakoribb volt a kétoldali elváltozás, míg malignitás csak sporadikus phaeochromocytoma esetén fordult elo.
Örökletes Sporadikus phaeochromocytoma phaeochromocytoma (n = 13) (n = 28) Daganat átméro (cm) 4.5 ? 1.5 3.8 ? 1.3 Egyoldali 10 27 Kétoldali 3 1 Benignus 13 25 Malignus 0 3 12. táblázat Örökletes és sporadikus phaeochromocytomák patológiai jellemzoi
Az örökletes és sporadikus esetekben észlelt klinikai tünetek elemzése nem mutatott ki feltuno különbséget a legtöbb vizsgált klinikai tünet százalékos gyakoriságában. Mind az örökletes, mind a sporadikus phaeochromocytomás betegek vezeto tünete a palpitáció és a
50
fejfájás volt (13. táblázat). Örökletes phaeochromocytomában szenvedo betegekben kissé gyakrabban fordult elo izzadás, gyengeség és szédülés, bár a különbség nem volt szignifikáns.
Örökletes phaeochromocytoma (n = 13) Palpitáció 62 % Fejfájás 55 % Izzadás 54 % Gyengeség 46 % Remegés 23 % Mellkasi fájdalom 8% Hányinger 8% Kipirulás 8% Szédülés 15 % Székrekedés 8% Az adatok a tünetek %-os gyakoriságát jelentik.
Sporadikus phaeochromocytoma (n = 28) 54 % 46 % 29 % 25 % 18 % 11 % 11 % 11 % 7% 7%
13. táblázat Örökletes és sporadikus phaeochromocytomás betegekben a klinikai tünetek százalékos gyakorisága Sporadikus phaeochromocytomás betegekben a mutét elotti legmagasabb szisztolés vérnyomás szignifikánsan magasabb volt, mint az örökletes phaeochromocytomás betegekben mért értékek. Mindkét csoportra jellemzo volt a magasabb pulzus-szám és emelkedett éhgyomri szérum glukóz érték. A phaeochromocytoma mutéti eltávolítása után mindkét csoportban normálissá vált a szisztolés és diasztolés vérnyomás, pulzus-szám valamint az éhgyomri szérum glukóz koncentráció (14. táblázat). A vizelet catecholamin metabolit ürítés a mutét elott nem különbözött a két csoportban és a mutét után mindkét csoportban normális volt.
Vérnyomás szisztolés (mmHg) diasztolés (mmHg)
Örökletes phaeochromocytoma (n = 13) Mutét elott Mutét után
Sporadikus phaeochromocytoma (n = 28) Mutét elott Mutét után
174 ? 26 117 ? 20
213 ? 30* 123 ? 15
124 ? 5+ 80 ? 4+
51
132 ? 11+ 81 ? 4+
Szívfrekvencia (percenként) 92 ? 7 79 ? 7+ 90 ? 10 81 ? 7+ Szérum glukóz (mmol/l) 6.4 ? 1.1 4.8 ? 0.3+ 7.0 ? 1.8 5.1 ? 0.5+ Az adatokat átlag ? SD értékekben fejeztem ki. *p? 0.05 vs mutét elotti érték örökletes phaeochromocytomában? +p? 0.05 vs ugyanabban a csoportban a mutét elotti érték. 14. táblázat Örökletes és sporadikus phaeochromocytomás betegekben a mellékvese mutét elott és után mért maximum szisztolés és diasztolés vérnyomás, pulzus-szám és éhgyomri szérum glukóz értékek.
A mutéttel eltávolított phaeochromocytoma szövetekben a noradrenalin és adrenalin koncentrációkat a 14. ábra mutatja be.
14. ábra Sporadikus (n = 8) és örökletes phaeochromocytomában szenvedo betegek mutéttel eltávolított daganat-szövet mintáiban (n = 8) az adrenalin és noradrenalin koncentrációja.
Mind az örökletes, mind a sporadikus phaeochromocytomában szenvedo betegek daganat-szövet mintáiban a noradrenalin és adrenalin koncentráció nagyfokú egyedi variablilitást mutatott (noradrenalin: 0.14-12.2 mg/g szövet, adrenalin: 0.05-15.5 mg/g szövet). Mindkét csoportban elofordult túlnyomó részben noradrenalint és túlnyomó részt adrenalint termelo daganat. A szövetek dopamin-tartalma a detektálhatóság szintje alatt volt. A klinikai
52
tünetek, a laboratóriumi paraméterek és a daganat-szövetek catecholamin-tartalma között nem sikerült egyértelmu összefüggést megállapítani.
53
VI. MEGBESZÉLÉS A hormonálisan inaktív mellékvesekéreg adenomák pathogenesisében a 21-hidroxiláz enzim csökkent muködésének lehetséges oki szerepével kapcsolatos korábbi hypothesis indirekt klinikai megfigyeléseken alapul. A hypothesist támogató indirekt klinikai megfigyelések ellenére a 21-hidroxiláz enzim örökletes defektusainak (22-25) lehetséges oki szerepét a hormonálisan inaktív mellékvese adenomák kialakulásában nem lehetett bizonyítottnak tekinteni, ugyanis a szteroid bioszintézis enzimeket kódoló gének mutációi szomatikus vagy csírasejtes elofordulásának és az enzimdefektusra jellemzo laboratóriumi eltéréseknek az összefüggéseit hormonálisan inaktív mellékvese adenomás betegekben mindezidáig nem vizsgálták. A nemzetközi irodalomban mindössze két tanulmányban vizsgálták a CYP21B mutációk gyakoriságát hormonálisan inaktív egyoldali mellékvese daganatos betegek perifériás vér és daganat szövet DNS mintáiban (22, 24). Ezeknek a korábbi vizsgálatoknak az eredményei arra utaltak, hogy homozigóta vagy heterozigóta CYP21B mutációk a DNS mintákban nem fordulnak elo. Mindkét vizsgálatban azonban kisszámú (2 illetve 6) esetet vizsgáltak, és nem közöltek adatokat azzal kapcsolatban, hogy vajon a vizsgált betegekben a CYP21B defektusra jellemzo hormonális eltérések jelen voltak-e (24, 22). A kisszámú egyoldali, hormonálisan inaktív mellékvesekéreg adenomás betegen kívül kétoldali mellékvesekéreg adenomás betegekben a CYP21B mutációk elofordulását korábban még nem vizsgálták.
Munkámban 31 egyoldali mellékvesekéreg adenomás beteg perifériás vér DNS és 19 kétoldali mellékvesekéreg adenomás beteg perifériás vér és daganat szövet DNS mintáiban vizsgáltam a CYP21B nyolc leggyakoribb mutációjának elofordulását és ezek összefüggéseit a 21-hidroxiláz defektus hormonális markereként számontartott alap és ACTH-stimulált plazma 17-OHP koncentrációkkal. A mutációk vizsgálatára allél-specifikus PCR módszert alkalmaztam. Ennek a módszernek az alkalmazhatóságát a CYP21B defektusok pontos detektálására külföldi és hazai munkacsoportok vizsgálatai is bizonyították (71, 72, 75-77). A módszert Magyarországon elsoként a Semmelweis Egyetem ÁOK Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Patobiokémiai Intézetében Dr. Sasvári Mária professzor asszony munkacsoportja vezette be, és ezt a módszert alkalmazzák a II. sz. Gyermekklinikán Dr
54
Sólyom János professzor úr vezetésével a veleszületett 21-hidroxiláz defektus hátterében álló CYP21B mutációk komplex magyarországi szurése során (75). A módszer elonye, hogy alkalmas a homozigóta és heterozigóta mutációk kimutatására és elkülönítésére (bár a vizsgálattal a heterozigóta deléciók nem detektálhatók). A hormonkoncentrációkat specifikus radioimmunassay-vel határoztuk meg.
Az egy- és kétoldali mellékvesekéreg adenomás betegekben mért alap és ACTH-stimulált plazma 17-OHP koncentrációk a korábbi nagyszámú klinikai megfigyeléssel megegyezoen arra utaltak, hogy bár az alap plazma 17-OHP szintek mindkét betegcsoportban a normális tartományban voltak, az ACTH-stimulált plazma 17-OHP koncentráció a betegek jelentos százalékában (a 31 egyoldali adenomás beteg 61 %-ában és a 19 kétoldali adenomás beteg 74 %-ában) meghaladta a normális felso határának tartott 1000 ng/dl értéket. A laboratóriumban alkalmazott allél-specifikus PCR módszerrel egy kétoldali adenomás beteg perifériás vér DNS mintájában mutattam ki a CYP21B génen homozigóta Val281Leu mutációt. A homozigóta Val281Leu mutáció az irodalmi adatok szerint az enzimaktivitás részleges csökkenésével jár, ami megfelelt a betegnél észlelt hormonszint eltéréseknek (normális alap 17-OHP szint mellett nagyfokban emelkedett ACTH-stimulált 17-OHP koncentráció). Mindezek alapján megállapítható, hogy a VAL281Leu mutációt hordozó, kétoldali mellékvesekéreg adenomás beteg korábban nem felismert CAH-ban szenved. A homozigóta VAL281Leu mutáción kívül a kétoldali adenomás betegek közül további három esetben igazoltam a perifériás vér DNS mintákban heterozigóta CYP21B gén-mutációt (két esetben heterozigóta Val281Leu és egy esetben heterozigóta Arg356Trp). A CYP21B mutációt heterozigóta formában hordozó betegekben az ACTH-stimulált plazma 17-OHP koncentrációk szintén meghaladták a normális értékeket, de a homozigóta mutációval rendelkezo betegben mért értékhez képest alacsonyabbak voltak.
A 31 egyoldali mellékvesekéreg adenomás beteg perifériás vér és daganat szövet DNS mintáiban homozigóta CYP21B mutáció nem fordult elo, de 5 beteg DNS mintájában találtam heterozigóta mutációt (két esetben heterozigóta Val281Leu és három esetben heterozigóta Ile356Asn). A mutáció-analízis eredményét a hormonvizsgálatok eredményével összevetve
55
megállapítottam, hogy az 5 mutációt hordozó beteg közül 3 betegben az ACTH-stimulált plasma 17-OHP koncentráció a normális tartományban volt. Utóbbi alátámasztja azt a megfigyelést, hogy a klinikai gyakorlatban szélesköruen használt ACTH-stimulációs teszt nem minden esetben alkalmas a heterozigóta CYP21B mutációt hordozó állapot detektálására. (66). Más tanulmányok is utalnak arra, hogy a homozigóta illetve heterozigóta CYP21B mutációt hordozókban mérheto ACTH-stimulált plazma 17-OHP koncentráció és a klinikai megjelenés heterogén kapcsolatot mutat (69, 70).
Összefoglalva, vizsgálataim eredményei alapján a CYP21B mutációk hormonálisan inaktív egyoldali mellékvesekéreg adenomás betegek 16.1 %-ában, míg kétoldali mellékvesekéreg adenomás betegek 21.1 %-ában fordulnak elo. Munkám eredményeinek publikálása után egy külföldi munkacsoport hormonálisan inaktív egyoldali mellékvesekéreg adenomás betegekben a CYP21B mutációk 16 %-os gyakoriságát közölte (145) Saját vizsgálataimban egyoldali mellékvese adenomás betegekben a perifériás vér és daganatszövet DNS minták vizsgálatának azonos eredményei alapján a CYP21B mutációk csírasejtes és nem szomatikus mutációknak felelnek meg. Vizsgálataimban a betegek DNS mintáiban kimutatott CYP21B mutációk gyakorisága lényegesen meghaladta a kaukázusi népességre vonatkozóan az irodalomban közölt adatokat (73, 75), ami felveti lehetséges oki szerepüket a hormonálisan inaktív egy- és kétoldali mellékvesekéreg daganatok egy részének pathomechanizmusában. Eredményeim alapján feltételezheto, hogy az egy- és kétoldali mellékvesekéreg adenomás betegek 16.1 illetve 21.1 %-ában a CYP21B mutációk jelenléte a 21-hidroxiláz enzim aktivitás részleges csökkenésén és következményes ACTH túltermelésen keresztül oki tényezoként vehet részt ezeknek az adenomáknak a pathomechanismusában. A CYP21B mutációk és az ACTHstimulált 17-OHP koncentráció közötti szoros kapcsolat hiánya, különösen egyoldali mellékvesekéreg adenomás betegekben azonban arra utalhat, hogy a mutációk az ACTHstimulációtól független hatással (21) is szerepet játszhatnak a hormonálisan inaktív mellékvesekéreg adenomák kialakulásában.
Irodalmi
adatok
szerint
a
hormonálisan
inaktív
mellékvesekéreg
adenomák
pathomechanismusában a 21-hidroxiláz enzimen kívül a 17-hidroxiláz enzim zavara is felmerült
56
(139). A II. Belklinikán 1995 és 2003 között vizsgált kétoldali mellékvese daganatos betegek hormon-adatainak elemzésekor egy betegben igen magas plazma kortikoszteron szintre derült fény és ezt követoen az endokrinológiai vizsgálatok 17-hidroxiláz defektust valószínusítettek. A beteg perifériás vér DNS mintájában a CYP17 szekvencia-analízise egy új, az irodalomban eddig nem közölt mutációt igazolt (Arg440Cys). A DNS mintában a CYP17 összes exonjának szekvencia-analízise lehetoséget adott arra, hogy a betegség-okozó mutáció azonosításán kívül vizsgáljam azoknak az új CYP17 polimorfizmusoknak a lehetséges jelenlétét, melyeket korábbi in silico vizsgálatainkkal mutattunk ki, de beteg-populációban való elofordulásukat korábban még nem vizsgálták. A CYP17 összes exonjának szekvenálása során öt különbözo polimorfizmust
azonosítottam
(homozigóta
TGG22TGC
?Trp22Cys?,
homozigóta
CAT46CAC ?His46His?, heterozigóta TCG65TCC ?Ser65Ser?, homozigóta GAC192GAT ?Asp192Asp? és homozigóta GAC283GAT ?Ser283Ser?). Az utóbbi két, aminosav-cserével nem járó polimorfizmus az in silico kutatásainkkal felfedezett új gén-variánsnak felelt meg, bizonyítva az in silico módszer alkalmasságát a CYP17 új variánsainak felderítésében. További vizsgálatok szükségesek azonban ezen új polimorfizmusok lehetséges jelentoségének tisztázásához.
Vizsgálataim második fo témakörének középpontjában a mellékvese velo-állományból kiinduló phaeochromocytoma genetikai hátterének kutatása állt. A MEN 2 szindrómát okozó RET protoonkogén mutációk szurését SSCP módszerrel, a mutációs ”hot spot”-ot képezo 11-es exon vizsgálatával kezdtem. Ezeket a vizsgálatokat 86 betegben végeztem el (5 MEN 2A szindrómás családban 30 egyén, 1 FMTC-s családban 9 egyén, 19 sporadikus MTC-ben szenvedo beteg és 28 sporadikus phaeochromocytomás beteg). A módszerrel a MEN 2A szindrómás családok közül 4 család 12 tagjában és az FMTC-s család 4 tagjában lehetett a 11-es exonon mutáció jelenlétét valószínusíteni, míg sporadikus MTC-ben és sporadikus phaeochromocytomában szenvedo betegekben a vizsgálat nem utalt mutációra. Az SSCP vizsgálattal pozitív esetekben a RET 11-es exon mutáció jelenlétét direkt szekvenálásával minden esetben bizonyítani tudtam. Ezekben a családokban a 634-es kodonon 3 különbözo mutációt igazoltam (TGC634TTC, TGC634TAC és TGC634CGC). A 11-es exon SSCP vizsgálatával negatívnak bizonyuló MEN 2A család tagjaiban direkt szekvenálással a 634-es
57
kodonon az elozoektol eltéro mutációt detektáltam (TGC634AGC). A TGC634AGC mutáció esetén a két módszer ellentmondó eredménye miatt az összes SSCP-vel vizsgált esetben szekvenálást végeztem. Megállapítottam, hogy a TGC634AGC mutáció esetén álnegatív eredménnyel járó SSCP vizsgálattól eltekintve a 11-es exon egyéb mutációi kapcsán az SSCP vizsgálattal nyert eredmények megegyeznek a szekvenálással nyert eredményekkel (negatív SSCP vizsgálatot követoen direkt szekvenálással nem fordult elo mutáció, vagy TGC634AGC mutációt találtam, míg pozitív SSCP vizsgálat esetén direkt szekvenálással minden esetben azonosítani lehetett a mutációt). A RET 11-es exon mutációk vizsgálatára az SSCP módszer korlátozott szenzitivitását mások megfigyelései is alátámasztják (94). Megállapítható azonban, hogy elonyei miatt (gyors, technikailag egyszeru és költségkimélo) az SSCP módszer sikeresen alkalmazható a 11-es exon 634-es kodon mutációk többségének szurésére.
A MEN 2 szindrómát okozó RET protoonkogén mutációk teljes spektrumának vizsgálatára 10 MEN 2 szindrómás család (7 MEN 2A és 3 FMTC) 72 tagjánának perifériás vér DNS mintáin végeztem el a 10, 11, 13, 14, 15 és 16-os exonok szekvenálását. A módszer az SSCP-vel álnegatív esetek pontos azonosításán kívül lehetové tette a mutációkon túl egyéb gén-variánsok (polimorfizmusok) detektálását, melyeket további vizsgálataimban részletesen elemeztem. A nemzetközi irodalmi adatokkal összhangban a vizsgált 10 család közül a leggyakoribb mutációs hely a 11-es exon 634-es kodonja volt (6 család). Az irodalmi adatok szerint leggyakoribb TGC634TAC (Cys634Tyr) mutációt két MEN 2A szindrómás családban mutattam ki. Szintén két családban fordult elo a nemzetközi irodalomban ritka mutációként számontartott TGC634TTC (Cys634Phe) mutáció, míg 1-1 családban TGC634CGC (Cys634Arg) illetve TGC634AGC (Cys634Ser) mutációt találtam. A 10-es exon 609-es kodonon két MEN 2A szindrómás családban két különbözo mutációt igazoltam (TGC609TAC és TGC609TCC).
Vizsgálataim idopontjában a RET 10-es exon 609-es kodont olyan mutációs helyként tartották számon a nemzetközi irodalomban, amelyhez nem társul phaeochromocytoma (99). Ezért jelentosnek tartom azt a megfigyelésemet, hogy az egyik általunk vizsgált MEN 2
58
szindrómás családban a 10-es exon 609-es kodon mutációhoz (TGC609TCC) a család három
mutáció-hordozó tagjában phaeochromocytoma társult. Esetünket a RET
protoonkogén 10-es exon 609-es kodon mutáció új klinikai fenotípusaként közöltük. A megfigyelés közvetlen klinikai jelentoséggel bír, ugyanis a család három mutáció-hordozó tagjában a phaeochromocytoma kialakulása egyértelmuen bizonyítja, hogy a 10-es exon 609es kodon mutációt hordozó egyénekben is indokolt a phaeochromocytoma irányában történo szurés.
A vizsgált MEN 2 szindrómás családokban a RET protoonkogén exonok szekvenálása során a betegség-okozó mutációk azonosításán kívül külön figyelmet fordítottam azoknak a polimorfizmusoknak az elemzésére, amelyek jelenléte feltételezések szerint módosíthatja a betegség klinikai manifesztációját vagy lefolyását. Különösen érdekesnek tunt a medulláris pajzsmirigy carcinomás esetekben alacsony penetranciájú gén-variánsként számontartott AGC836AGT (Ser836Ser) polimorfizmus vizsgálata, ugyanis irodalmi adatok szerint ennek a polimorphismusnak az allél-gyakorisága sporadikus medulláris pajzsmirigy carcinomás betegekben szignifikánsan nagyobb, mint az általános népességben (114, 146). Egy korábbi tanulmány eredményei alapján feltétezik, hogy az aminosav cserével nem járó Ser836Ser polimorfizmus jelenléte a 15-ös exontól kezdodoen instabil szekvenciát eredményez, ami elosegíti az instabil szekvenciájú exonokon szomatikus mutációk kialakulását (114). Egy 4 generációból és 80 tagból álló FMTC-s család DNS mintáinak vizsgálatakor a 14-es exonon egy ismert betegség-okozó mutáció (GTG804TTG, Val804Leu) és az AGC836AGT (Ser836Ser) polimorfizmus együttes elofordulását mutattam ki. A családban a mutáció és polimorfizmus szegregációjával bizonyítottam, hogy a két gén-variáns különbözo allélokon helyezkedik el. A nagyszámú családtagban a mutáció és polimorfizmus klinikai fenotípusra gyakorolt hatásainak részletes elemzésével megállapítottam, hogy a család medulláris pajzsmirigy carcinomás tagjaiban a Val804Leu mutáció az irodalomban közölt (89, 91-93) esetekhez hasonlóan viszonylag enyhe klinikai fenotípussal járt, a betegség viszonylag késon jelent meg, és a család egyetlen medulláris pajzsmirigy carcinomás tagjában sem fordult elo a betegséggel összefüggo halál. A genotípus és klinikai fenotípus összevetése alapján megállapítottam, hogy Val804Leu mutáció nélkül a Ser836Ser polimorfizmus nem társult
59
medulláris pajzsmirigy carcinomával, a Val804Leu mutáció és Ser836Ser polimorfizmus együttes elofordulása nem súlyosbította a klinikai tüneteket vagy a kórlefolyást, sot együttes elofordulásuk esetén a család több tagjában nem lehetett medulláris pajzsmirigy carcinomát kimutatni. Eredményeim nem támasztják alá azt a hypothesist, hogy a sporadikus medulláris pajzsmirigy carcinomákhoz hasonlóan a Ser836Ser polimorfizmusnak szerepe van az FMTC pathomechanizmusában.
MEN 2 szindrómás betegek DNS mintáiban a RET protoonkogén exonok szekvencia analízise során a Ser836Ser polimorfizmuson kívül egyéb polimorfizmusok jelenlétét is kimutattam. Ezek közül a 13-as exonon egy korábban már leírt, aminosav cserével nem járó CTT769CTG (Leu769Leu) polimorfizmust mind heterozigóta, mind homozigóta formában azonosítottam. Ennél fontosabbnak tartom, hogy a korábbi in silico vizsgálatainkban felfedezett új RET protoonkogén polimorfizmusok közül a TCC904TCG (Ser904Ser) polimorfizmus jelenlétét igazoltam egy sporadikus phaeochromocytomában szenvedo beteg DNS mintájában, bizonyítva az in silico kutatásokkal felismert polimorfizmus természetes elofordulását. További vizsgálatok szükségesek azonban az új polimorfizmus lehetséges jelentoségének tisztázásához.
Munkám harmadik témakörében a phaeochromocytoma familiáris formáinak komplex vizsgálatát tüztem ki célul. A Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinikán 1995-2003 között vizsgált összes phaeochromocytomás betegben a RET mutációk következményeként kialakuló MEN 2 szindróma, a vhl gén mutációk eredményeként kifejlodo vonHippel-Lindau szindróma és az 1-es típusú neurofibromatosus elofordulásának szisztematikus vizsgálatával választ kerestem arra a kérdésre, hogy néhány külföldi centrum szelektált beteganyagában az örökletes phaeochromocytomák újabban észlelt nagy (25-30%-os) gyakoriságával kapcsolatos megfigyelések (27) megerosíthetok-e nem szelektált betegcsoportban is. Ezen kívül fel kívántam mérni, hogy a klinikai, laboratóriumi és pathológiai paraméterek, illetve a daganatok catecholamin tartalmának elemzése segítséget nyújthat-e a phaochromocytomák örökletes és sporadikus eseteinek elkülönítésében.
60
A vizsgált idoszakban a Klinikán összesen 609 mellékvese daganatos beteget vizsgáltak, akik közül a klinikai vizsgálatok és a hisztológiai lelet 41 betegben igazolt phaeochromocytomát. A phaechromocytoma örökletes és sporadikus formáinak elkülönítését a klinikai adatok mellett a RET protoonkogén 10, 11 és 14-es exonok, valamint a vhl gén 1, 2 és 3-as exonok mutáció analízisének eredményére alapoztam. Megállapítottam, hogy a vizsgált 41 phaeochromocytomás beteg közül 13 betegben örökletes (7 esetben RET mutáció vizsgálattal igazolt MEN 2A szindróma, 2 esetben vhl mutáció analízissel bizonyított von Hippel-Lindau szindróma és 4 esetben a klinikai kép alapján igazolt 1-es típusú neurofibramotosis), míg 28 betegben sporadikus phaeochromocytoma fordult elo. Az örökletes phaeochromocytomás esetek az összes phaeochromocytomás eset 28 %-át tették ki, ami megegyezik az újabb felmérések adataival (27), de jelentosen eltér a régebbi, kb 10 %-os gyakoriságot jelzo vizsgálatok eredményétol (87, 116, 117, 125, 126). Az irodalmi adatokkal összhangban (27, 98) az örökletes esetek között gyakoribb volt a kétoldali elváltozás, míg malignitás csak sporadikus phaeochromocytoma esetén fordult elo. Legújabb irodalmi adatok szerint kétoldali phaeochromocytomás betegek 84 %-ában igazolható örökletes szindróma (27), míg saját vizsgálatomban a 4 kétoldali phaeochromocytomás beteg közül 3 betegben (75 %) igazoltam örökletes phaeochromocytomát. Nem zárható ki azonban annak a lehetosége, hogy az egyetlen saját kétoldali phaeochromocytomás esetünkben, akiben sem RET sem vhl mutációt nem tudtam igazolni, a betegség hátterében az SDHD vagy SDHB gének
mutációi
állnak.
Utóbbi
gének
mutációit
újabban
látszólag
sporadikus
phaeochromocytomás betegekben is kimutatták (27, 132-135).
Megállapítottam, hogy az örökletes phaeochromocytomák mérete a sporadikus esetekhez képest nagyobb volt, bár a különbség nem volt szignifikáns. A kisebb daganat méret ellenére a sporadikus phaeochromocytomás betegekben a mutét elotti maximum szisztolés vérnyomás szignifikánsan magasabb volt, mint az örökletes phaeochromocytomás betegekben mért értékek, de a diasztolés vérnyomás értékekben a két csoport között nem volt különbség. Az összes örökletes és sporadikus esetünkben hypertonia (paroxizmális vagy állandó) fordult elo, ami ellentétben áll néhány korábbi irodalmi megfigyeléssel, melyek MEN2 szindrómához (98) és vonHippel-Lindau szindrómához (99) társuló phaeochromocytomás esetekben a hypertonia
61
viszonylag ritka elofordulásáról számoltak be. Valószínunek tartom, hogy a korábban közölt és a saját eredmények közötti eltérést az örökletes phaeochromocytomás betegek eltéro szelektálása okozhatta. A MEN 2 és vonHippel-Lindau szindróma diagnózisának megállapítása esetén a RET és vhl mutációt hordozó családtagokban a rendszeres klinikai szurovizsgálatokkal a phaeochromocytomát rendszerint korán, viszonylag tünetszegény stádiumban diagnosztizálják (98, 99), míg saját vizsgálatomban a MEN 2 szindróma, vonHippel-Lindau
szindróma
és
1-es
típusú
neurofibromatosis
diagnózisát
a
phaeochromocytoma felismerésekor vagy azt követoen állapítottuk meg. Saját vizsgálatomban az örökletes és sporadikus phaeochromocytomás betegek életkora, prezentációs tünete, pulzusszáma, éhgyomri vércukor értéke és vizelet catecholamin metabolit ürítése között sem találtam szignifikáns különbséget. A klinikai tünetek elemzése sem mutatott ki feltuno eltérést a két csoport között. Mind az örökletes, mind a sporadikus phaeochromocytomás betegek vezeto tünete a palpitáció és a fejfájás volt. Örökletes phaeochromocytomában szenvedo betegekben kissé gyakrabban fordult elo izzadás, gyengeség és szédülés, de a különbség nem volt szignifikáns.
Korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a catecholamin-termelo szövetek catecholamintartalma a hormon-aktivitást tükrözheti (98, 99), ezért örökletes és sporadikus daganat-szövet mintákban HPLC módszerrel meghatároztam a noradrenalin és adrenalin koncentrációt (a módszerrel a daganat-szövetek dopamin tartalma a detektálási limit alatt volt). Mind az örökletes, mind a sporadikus phaeochromocytoma szövetmintákban a noradrenalin és adrenalin koncentráció nagyfokú egyedi variablilitást mutatott. Mindkét csoportban elofordult túlnyomó részben noradrenalint termelo és túlnyomó részben adrenalint termelo daganat. A klinikai tünetek, a laboratóriumi paraméterek és a daganat-szövetek catecholamin-tartalma között nem sikerült egyértelmu összefüggést megállapítani. Ennek hiánya azt jelezheti, hogy a phaeochromocytoma szövet hormon-szekréciós jellegzetességeit a szöveti catecholamin koncentráción kívül egyéb mechanismusok határozhatják meg.
62
VII. KÖVETKEZTETÉSEK
1. A mellékvese daganatok leggyakoribb klinikai típusát képezo hormonálisan inaktív, véletlenszeruen százalékának mutációinak -
felfedezett
mellékvesekéreg
pathomechanismusában
a
adenomák
CYP21B
nem
elhanyagolható
veleszületett
(csírasejtes)
a 21-hidroxiláz enzim aktivitás részleges csökkenésén és
következményes ACTH túltermelésen keresztül - oki szerepe lehet. Az egy- és kétoldali adenomás esetekben a CYP21B leggyakoribb mutációinak gyakorisága és spektruma különbözo. A 21-hidroxiláz enzim defektus klinikai markereként tekintett hormonális eltérések és a CYP21B mutációk elofordulása között nem minden esetben állapítható meg szoros kapcsolat, ezért feltételezheto, hogy a CYP21B mutációk az ACTH-stimulációtól független hatással is szerepet játszhatnak a hormonálisan inaktív mellékvesekéreg adenomák kialakulásában.
2. A mellékvese daganatok hátterében a CYP21B mutációin kívül igen ritkán (609 közül egy esetben) CYP17 mutáció igazolható. Egy kétoldali mellékvesekéreg adenomában szenvedo beteg perifériás vér DNS mintájában a CYP17 nukleotid-szekvencia vizsgálatával igazolt Arg440Cys mutáció az irodalomban eddig nem közölt, új betegség-okozó mutációnak felel meg. A beteg DNS mintájában a CYP17 összes exonjának szekvencia analízise három korábban ismert polimorfizmuson kívül két új polimorfizmus jelenlétét is igazolta: GAC192GAT ?Asp192Asp? és GAC283GAT ?Ser283Ser?), amelyeket korábbi in silico vizsgálatainkban új hypotheticus szekvencia-variánsként írtunk le. Eredményeink igazolják az in silico vizsgálatok alkalmasságát a CYP17 új variánsainak kutatásában.
3. A phaeochromocytomával járó örökletes szindrómák egyik leggyakoribb oka, a MEN 2 szindrómát okozó RET gén mutációk kimutatására alkalmazott módszerek közül az SSCP vizsgálat a 11-es exon 634-es kodon TGC? AGC mutációja esetén álnegatív eredményt ad. A nemzetközi irodalomban közzétett állásponttal ellenkezoen vizsgálatainkkal bizonyítottuk, hogy a 10-es exon 609-es kodon mutációhoz
63
phaeochromocytoma társulhat. Megfigyelésünk közvetlen klinikai jelentoséggel bír, mert egyértelmuvé teszi, hogy a 10-es exon 609-es kodon mutációt hordozó egyénekben indokolt a phaeochromocytoma irányában történo szurés. A sporadikus medulláris pajzsmirigy carcinomás esetekben alacsony penetranciájú RET variánsként számontartott AGC836AGT (Ser836Ser) polimorfizmusnak és az FMTC-t okozó RET mutációként ismert GTG804TTG (Val804Ser) mutációnak ko-szegregációja egy 4 generációból álló, 80 tagú FMTC-s családban nem befolyásolta a Val804Ser mutáció esetén várható viszonylag enyhe klinikai fenotípust. Eredményeim ezért nem támasztják alá azt a hypothesist, hogy a sporadikus medulláris pajzsmirigy carcinomákhoz hasonlóan a Ser836Ser polimorfizmusnak szerepe van az FMTC pathomechanismusában. A korábbi in silico vizsgálatainkban felfedezett új RET protoonkogén polimorfizmusok közül a TCC904TCG (Ser904Ser) polimorfizmus jelenlétét igazoltam egy sporadikus phaeochromocytomában szenvedo beteg DNS mintájában, bizonyítva az in silico kutatásokkal leírt új hypotheticus polimorfizmus természetes elofordulását és az in silico vizsgálatok alkalmasságát a RET új variánsainak kutatásában.
4. A II. Belklinikán 1995 és 2003 között vizsgált összes phaeochromocytomás betegben a RET gén mutációk következményeként kialakuló MEN 2 szindróma, a vhl gén mutációk eredményeként kifejlodo vonHippel-Lindau szindróma és az 1-es típusú neurofibromatosus elofordulásának szisztematikus vizsgálatával megállapítottam, hogy az
örökletes
szindrómákhoz
társuló
phaeochromocytoma
az
összes
phaeochromocytoma eset 28 %-át teszi ki (41 esetbol 13). Nem szelektált betegcsoportban nyert eredményeim megerosítik néhány külföldi centrum szelektált beteganyagában az örökletes phaeochromocytomák nagy gyakoriságával kapcsolatos megfigyeléseket. Az irodalmi adatokkal összhangban az örökletes esetek között gyakoribbnak találtam a kétoldali elváltozást, míg malignitás csak sporadikus phaeochromocytoma
esetén
fordult
elo.
Sporadikus
phaeochromocytomás
betegekben a legmagasabb szisztolés vérnyomás szignifikánsan magasabb volt, mint az örökletes phaeochomocytomás betegekben mért érték, azonban egyéb klinikai és
64
laboratóriumi paraméterekben nem találtam szignifikáns különbséget az örökletes és sporadikus esetek között (életkor, prezentációs tünet, pulzusszám, éhgyomri vércukor érték, vizelet catecholamin metabolit ürítés, daganatszövet catecholamin koncentráció). Eredményeim alapján ezek a klinikai és laboratóriumi paraméterek nem nyújtanak lényeges támpontot a phaeochromocytoma örökletes és sporadikus formáinak elkülönítésében.
65
KÖSZÖNETNYLVÁNÍTÁS
Munkámhoz nyújtott segítségükért szeretnék köszönetet mondani:
?
Dr. Tulassay Zsolt professzor Úrnak, a Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinika igazgatójának, aki lehetové tetté, hogy munkámat a II. sz. Belgyógyászati Klinikán végezhessem.
?
Dr. Rácz Károly professzor Úrnak, témavezetomnek, akitol munkámhoz minden segítséget, tanácsot megkaptam.
?
Dr. Rosivall László professzor Úrnak, programvezetomnek, aki biztosította számomra a lehetoséget, hogy PhD hallgatóként kutatómunkámat végezhessem.
? Dr. Tóth Miklós, egyetemi adjunktus Úrnak, a betegek klinikai, laboratóriumi és genetikai vizsgálati eredményeinek feldolgozásában nyújtott segítségért. ?
Krauszné Vaczula Mária aszisztensnonek, a molekuláris biológiai vizsgálatokban nyújtott segítségéért.
? Dr. Kovács Gábornak, Cech Gábornak és Nyíro Gábornak, akik az Eötvös Lóránd Tudományegyetem Mikrobiológiai Tanszékének munkatársai a DNS szekvenálásban nyújtott segítségért.
? Dr. Varga Ibolyának és a Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinika Endokrinológiai és Izotóp Laboratóriumában dolgozó asszisztenseknek.
? Laboratóriumunkban dolgozó TDK és PhD hallgatóknak. Feleségemnek és családomnak a türelmükért.
66
VIII. IRODALOMJEGYZÉK 1.
Latronico A C, Chrousos G P: Adrenocortical Tumors. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1997; 82:1317-1324
2.
Kloos RT, Gross MD, Francis IR, Korobkin M, Shapiro B. Incidentally dicovered adrenal masses. Endocrine Reviews 1995? 16:460-483.
3.
Ross NS, Aron DC. Hormonal evaluation of the patient with an incidentally discovered adrenal mass. New England Journal of Medicine 1990? 323:1401-1405.
4.
Copeland PM. The incidentally discovered adrenal mass. Annals of Internal Medicine 1993? 98:940-945.
5.
Glazer HS, Weyman PJ, Sagel SS, Levitt RG, McClennan BL. Nonfunctioning adrenal masses: incidental discovery on computed tomography. American Journal of Roentgenology 1982? 139:81-85.
6.
Peppercorn PD, Grossman AB. Rezneck RH. Imaging of incidentally discovered adrenal masses. Clinical Endocrinology 1966? 48:379-388.
7.
Griffing G. Editorial: A-I-D-S: The new endocrine epidemic. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1994? 79:1530-1531.
8.
Hedeland H, Östberg G, Hökfelt B. On the prevalence of adrenocortical adenomas in an autopsy material in relation to hypertension and diabetes. Acta Medica Scandinavica 1968? 184:211-214.
9.
Russel R, Masi A, Richter E. Adrenal cortical adenomas and hypertension. A clinical pathologic analysis of 690 cases with matched controls and a review of the literature. Medicine 1972? 51:211-215.
10.
Kasperlik-Zaluska AA, Roslonowska E, Slowinska-Srzednicka J, Migdalska B, Jeske W, Makowska A és mtsai. Incidentally discovered adrenal mass (incidentaloma): investigation and management of 208 patients. Clinical Endocrinology 1997? 46:29-37.
11.
Mantero F, Terzolo M, Arnaldi G, Osella G, Masini AM, Ali A és mtsai. A survey on adrenal incidentaloma in Italy. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 2000? 85:637-644.
67
12.
Gláz E, Rácz K, Varga I, Kiss R, Tóth M, Füto L. Mineralocorticoid production of adrenal cortical adenomas. Journal of Steroid Biochemistry 1993? 45:57-84.
13.
Reincke M, Nieke J, Krestin GP, Saeger W, Allolio B, Winkelman W. Preclinical Cushing’s syndrome in adrenal ”incidentalomas”. Comparison with adrenal Cushing’s syndrome. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1992? 75:826-832.
14.
Tóth M, Rácz K, Adleff V, Varga I, Futo L, Jakab Cs és mtsai.: Comparative analysis of plasma 17-hydroxyprogesterone and cortisol responses to ACTH in patients with variuos adrenal tumors before and after adrenalectomy Journal of Endocrinological Investigation 2000? 23:287-294
15.
Osella G, Terzolo M, Borretta G, Magra G, Piovesan AA. Endocrine evaluation of incidentally discovered adrenal masses (incidentalomas). Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1994? 79:1532-1539.
16.
Bernini GP, Brogi G, Vivaldi MS, Argenio GF, Sgro M, Moretti A és mtsai. 17hydroxyprogesterone response to ACTH in bilateral and monolateral adrenal incidentalomas. Journal of Endocrinological Investigation 1996? 19:745-752.
17.
Del Monte P, Bernasconi D, Bertolazzi L, Meozzi M, Badaracco B, Torne R. és mtsai. Increased 17? -hydroxyprogesterone response to ACTH in silent adrenal adenoma: cause or effect? Clinical Endocrinology 1995? 42:273-277.
18.
Seppel T, Schlghecke R. Augmented 17-alpha-hydroxyprogesterone response to ACTH stimulation as evidence of decreased 21-hydroxylase activity in patients with incidentally discovered adrenal tumours (‘incidentalomas’). Clinical Endocrinology 1994? 41:445-451.
19.
Terzolo M, Osella G, Ali A, Borretta G, Magro G-P, Termine A. és mtsai. Different patterns of steroid secretion in patients with adrenal incidentalomas. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1996? 81:740-744.
20.
Turton DB, O’Brian JT, Shakin KMM. Incidental adrenal nodules: Association with exaggerated 17-hydroxyprogesterone response to adrenocorticotropic hormone. Journal of Endocrinological Investigation 1992? 15:789-796.
68
21.
Jaresch S, Kornely E, Kley H-K, Schlaghecke R. Adrenal incidentalomas and patients with homozygous or heterozygous congenital adrenal hyperplasia Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1992? 74: 685-689
22.
Beuschlein F, Schulze E, Mora P, Gensheimer H-P, Maser-Gluth C, Allolio B és mtsa. Steroid 21-hydroxylase mutations and 21-hydroxylase messenger ribonucleic acid expression in human adrenocortical tumors Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1998? 83:2585-2588
23.
Ambrosi B, Dall’Asta C, Barbetta L and Libé R. Activities of 21-hydroxylase, 17? hydroxylase and 17,20-lyase European Journal of Endocrinology 2000? 142:411-412
24.
Kjellman M, Holst M, Backdahl M, Larsson C, Farnebo L-O, Wedell A. No overrepresentation of congenital adrenal hyperplasia in patients with adrenocortical tumours. Clinical Endocrinology 1999? 50:343-346.
25.
Rácz K, Pinet F, Marton T, Szende B, Gláz E., Corvol P. Expression of steroidogenic enzyme messenger ribonucleic acids and corticosteroid production in aldosteroneproducing and ”nonfunctioning” adrenal adenomas. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1993? 77:677-682.
26.
Reincke M: Mutations in adrenocortical tumors Horm Metabolism Research 1998; 30:447-455
27.
Neumann HPH, Bausch B, McWhinney SR, Bender BU, Gimm O, Franke G et al. Germ-line mutations in nonsyndromic pheochromocytoma. N Engl J Med 2002? 346:1459-1466.
28.
Koch CA, Vortmeyer AO, Zhuang Z, Brouwers FM, Pacak K. New insights into the genetics of familial chromaffin cell tumors, Ann N Y Acad Sci 2002? 970:11-28.
29.
Januszevicz A, Neumann HPA, Lon I, Szmigielski C, Symonides B, Kabat M et al. Incidence and clinical relevance of RET proto-oncogene germline mutations in pheochromocytoma patients. J Hypertension 2000? 18:1019-1023.
30.
Lindor NM, Honchel R, Khosla S, Thibodeau SN: Mutations in the RET protooncogene in sporadic pheochromocytomas.J. of Clinical Endocrinology. & Metabolism 1995; 80:627-629
69
31.
Wiedemann HR.: Complex malformatif familial avec hernie ombilicale at macroglossieun syndrome nouveau? J Genet Hum 1964; 13:223-32
32.
Beekwith JB.: Macroglossia, omphalocele, adrenal cytomegaly, gigantism and hyperplastic visceromegalie. Birth Defects 1969; 5:188-96
33.
Li FP, Fraumeni JF: Soft-tissue sarcomas, breast cancer, and other neoplasms: A familial syndrome? Ann Int Med 1969; 71:747-52
34.
Heppner C, Reincke M, Agarwal S, Mora P, Allolio B, Burns AL, Spiegel AM and Marx S J: MEN1 gene analysis in sporadic adrenocortical neoplasms J. of Clinical Endocrinology. & Metabolism 1999; 84:216-19
35.
Karges W, Jostarndt, K, Maier S. et al. Multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN1) gene mutations in a subset of patients with sporadic and familial primary hyperparathyroidism target the coding sequence but spare the promoter region. J. Endocrinol. 2000, 166: 1-9.
36.
Stratakis C A, Carney J A, Lin JP, Papanicolau D A, Karl M et al: Carney Complex, a Familial Multiple Neoplasia and Lentiginosis Syndrome, Journal of Clinical Investigation 1996 97 (3): 699-705
37.
Weinstein LS, Shenker A, Gejman PV, Merino MJ, Friedman E, Spiegel AM: Activating mutations of the stimulatory G protein in the McCune-Albright syndrome. N Engl J Med 1991; 325:1688-1695
38.
Reincke M, Karl M, Travis W et al.: p53 mutations in human adrenocortical neoplasms: Immunhistochemical and molecular studies. J. of Clinical Endocrinology. & Metabolism 1994; 78:790-4
39.
Gicquel C, Baudin E, Lebouc Y, & Schlumberger M: Adrenocortical carcinoma Annals of Oncology 1997; 8:423-27
40.
Yano T, Linehan M, Anglard P, Lerman MI, Daniel LN, Stein CA, Robertson N, LaRocca R, Zbar B: Genetic changes in human adrenocortical carcinoma. J Natl Cancer Inst 1989; 81:518-23
41.
Gicquel C, Raffin-Sanson ML, Gaston V, Bertagna X, Plouin PF, Schlumberger M, Louvel A, Luton JP, Le Bouc Y: Structural and functional abnormalities at 11p15 are associated with the malignant phenotype in sporadic adrenocortical tumors: Study on a
70
series of 82 tumors tumors J. of Clinical Endocrinology. & Metabolism 1997; 82:2559-65 42.
Ohgaki K, Kleihues P, Heitz PU: p53 mutations in sporadic adrenocortical tumors. Int J Cancer 1993; 54:408-10
43.
Lin SR, Lee YJ, Tsai JH: Mutations of the p53 gene in human functional neoplasms tumors J. of Clinical Endocrinology. & Metabolism 1994; 78:483-91
44.
Levine AJ, Momand J, Finlay CA: The p53 tumour suppressor gene. Nature 1991; 351:453-6
45.
Rácz K, Adleff V, Bezzegh A, Tóth M, Varga I, Szende B, Moldvay J, Szegedi Z, Gláz E: p53 gén expresszió humán mellékvesekéreg daganatokban. Magyar Belorvosi Archivum, 1997; 50:159-162
46.
Adleff V, Rácz K, Tóth M, Varga I, Bezzegh A, Gláz E: P53 protein and its messenger ribonucleic acid in human adrenal tumors J Endocrinol Invest 1998; 21:753-757
47.
Helmberg, Twin genes and endocrine disease: CYP21 and CYP11B genes. Acta Endocrinol.1993; 129(1): 97-108.
48.
Beuschlein F, Fassnacht M, Klink A, Allolio B and Reincke M: ACTH-receptor expression, regulation and role in adrenocortical tumor formation European J of Endocrinology 2001; 144:199-206
49.
Gicquel C, Xavier B, Schneid H, Francillard-Leblond M, Luton J-P, Girard F, Le Bouc Y.: Rearrangement at the 11p15 locus and overexpression of IGFII gene in sporadic adrenocortical tumors J. of Clinical Endocrinology. & Metabolism 1994; 78:1444-53
50.
Liu J, Kahri AI, Heikkila P, Voutalainen R: Ribonucleic acid expression of the clustered imprinted genes, p57KIP2, IGF-II and H19, in adrenal tumors and cultered adrenal cells. tumors J. of Clinical Endocrinology. & Metabolism 1994; 78:1766-71
51.
Bourcigaux N, Gaston V, Logie A, Bertagna X, Le Bouc Y, and Gicquel C: High expression of cyclin E and G1 CDK and loss of function of p57KIP2, are involved in proliferation of malignant sporadic adrenocortical tumors J. of Clinical Endocrinology. & Metabolism 2000; 85:322-330
71
52.
Lin S-R, Tsai JH, Yang YC, Lee SC: Mutations of K-ras oncogene in human adrenal tumours in Taiwan British J. of Cancer 1998; 77:1060-1065
53.
Hensen J, Buhl M, Bahr V ? Oelker W. Endocrine activity of the ’silent’ adrenocortical adenoma is uncovered by response to corticotropin-releasing hormone. Klinische Wochenschrift 1990; 68:608-614.
54.
New M I: 21-hydroxylase deficiency congenital hyperplasia Steroid Biochem. Molec. Biol 1994, 48: 15-22
55.
Miller WL. Genetics, diagnosis, and management of 21-hydroxylase deficiency. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1994 78 241-246.
56.
New MI ? Speiser PW. Genetics of adrenal steroid 21-hydroxylase deficiency. Endocrine Reviews 1986; 7:331-349.
57.
Reincke M, Peter M, Sippel W G, Allolio B: Impairment of 11? -hydroxylase but not 21-hydroxylase in adrenal ‘incidentalomas’ Eur. J. Endocrinology 1997, 136: 196200
58.
Morel Y, Murena M, Nicolino M, Forest MG: Molecular genetics of the congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency. in: Cellular and molecular biology of the adrenal cortex. J.M. Saez, A.C. Brownie, A. Capponi, E.M. Chambaz, F. Mantero (Eds.), Colloque INSERM, John Libbey Eurotext Ltd. 1992, 222:123136.
59.
Mancini T, Kola B, Mantero F: Functional and nonfunctional adrenocortical tumors demonstrate a high responsiveness to low dose adrenocorticotropin J Clin Endocr Metab 2003; 88 (5): 1994-1998.
60.
White PC ? New MI. Genetic basis of endocrine disease 2: Congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1992; 74:6-11.
61.
Abo K, Sumino K, Nishio H, Hozumi T, Ishida Y, Fujieda T et al. 21-hydroxylase deficiency presenting as massive bilateral adrenal masses in the seventh decade. Endocrine Journal 1999; 46:817-823.
72
62.
Mokshagundam S ? Surks MI. Congenital adrenal hyperplasia diagnosed in a man during workup for bilateral adrenal masses. Archives of Internal Medicine 1993; 153:1389-1391.
63.
Ravichandran R, Lafferty F, McGinnis MJ ? Taylor HC. Congenital adrenal hyperplasia presenting as massive adrenal incidentalomas in the sixth decade of life: report of two patients with 21-hydroxylase deficiency. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1996; 81:1776-1779.
64.
Higashi Y, Yoshioka H, Yamane M, Gotoh O., Fujii-Kuriyama Y.: Complete nucleotide sequences of two steroid 21-hydroxylase genes tandemly arranged in human chromosome: a pseudogene and a genuine gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986; 83(9):2841-2845.
65.
Higashi YA, Tanae H.I, Hiromasa T, Fujii-Kuriyama Y.: Aberrant splicing and missense mutations cause steroid 21-hydroxylase [p450 (c21)] deficiency in humans: possible gene conversation products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (20) 1988; 85:7486-7490.
66.
Rumsby G, Avey CJ, Conway GS ? Honour JW. Genotype-phenotype analysis in late onset 21-hydroxylase deficiency in comparison to the classical forms. Clinical Endocrinology 1998 48 707-711.
67.
Witchel SF ? Lee PA. Identification of heterozygotic carriers of 21-hydroxylase deficiency - sensitivity of ACTH stimulation test. American Journal of Medical Genetics 1998; 76:337-342.
68.
Bormann M, Kochhan L, Knorr D, Bidlingmaier F ? Olek K. Clinical heterogeneity of 21-hydroxylase deficiency of sibs with identical 21-hydroxylase genes. Acta Endocrinologica 1992; 126:7-9.
69.
Witchel SF, Lee PA, Suda-Hartman M ? Hoffmann EP. Hyperandrogenism and manifesting heterozygotes for 21-hydroxylase deficiency. Biochemical and Molecular Medicine 1997; 62:151-158.
70.
Dumic M, Brkljacic L ? Speiser PW. An update on the frequency of nonclassic deficiency
of
adrenal
21-hydroxylase in the Yugoslav population. Acta
Endocrinologica 1990 122 703-710.
73
71.
Sherman SL, Aston CE, Morton NE, Speiser PW ? New MI. A segregation and linkage study of classical and nonclassical 21-hydroxylase deficiency. American Journal of Human Genetics 1988; 42:830-838.
72.
Speiser PW, New MI, Tannin GM, Pickering D, Yang SY ? White PC. Genotype of Yupik Eskimos with congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency. Human Genetics 1992 88 647-648.
73.
Speiser PW, Dupont B, Rubinstein P, Piazza A, Kastelan A ? New MI. High frequency of nonclassical steroid 21-hydroxylase deficiency. American Journal of Human Genetics 1985 37 650-667.
74.
Fitness J, Dixit N, Webster D, Torresani T, Pergolizzi R, Speiser PW et al. Genotyping of CYP21, linked chromosome 6p markers, and a sex-specific gene in neonatal screening for congenital adrenal hyperplasia. J Clin Endocrinol Metab 1999 84 960-966.
75.
Ferenczi A, Garami M, Kiss E, Pék M, Sasvári-Székely M, Barta C et al. Screening for mutations of 21-hydroxylase gene in Hungarian patients with congenital adrenal hyperplasia. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1999 84 2369-2372.
76.
Wedell A, Thilén A, Stengler B, Ritzén E ? Luthman H. Mutational spectrum of the steroid 21-hydroxylase gene in Sweden: implication for genetic diagnosis and association with disease manifestation. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1994 78 1145-1152.
77.
Wedell A ? Luthman H. Steroid 21-hydroxylase deficiency: two additional mutations in salt-wasting disease and rapid screening of disease-causing mutations. Human Molecular Genetics 1993; 2: 499-504.
78.
Levo A, Partanen J: Mutation-haplotype analysis of steroid 21-hydroxylase (CYP21) deficiency in Finland. Implication for the population history of defective alleles. Human Genetics 1997; 99:488-497
79.
Ezquieta B, Oliver A, Gracia R, Gancedo PG: Analysis of steroid 21-hydroxylase gene mutations in the Spanish population Human Genetics 1995; 96:198-204
74
80.
Mornet E, Crété P, Kuttenn F, Rauw D, Boué J, White PC, Boué A: Distribution of deletions and seven point mutations on CYP21B genes in three clinical forms of steroid 21-hydroxylase deficiency. Am J Hum Genet 1991:48:79-88
81.
Bachega Tania ASS, Bilerbeck AE, Madureira G, Marcondes JAM, Longui CA, Leite MV, et al: Molecular Genotyping in Brazilian Patients with the Classical and Nonclassical Forms of 21-hydroxylase Deficiency. Journal of Clinical Endocr. And Metab. 1998; 83: 4416-4419
82.
Carrera P, Bordone L, Bunelli VL, Forest MG, Chiumello G, Ferrari M: Distribution of point mutations and correlation with phenotype in 73 Italian patinets presenting with 21-hydroxylase deficiency. Paper Presented at the Symposium on Adrenal Hyperplasia, Baltimore, Maryland June11-13
83.
Sizemore GW: Multiple endocrine neoplasia. In: Becker K.I. (Ed.) Principles of endocrinology and metabolism. J.B. Lippincott Company, Philadelphia, 1995, p. 1555-1563.
84.
Mulligan LM, Kwok JBJ, Healey CS, Elsdon Mj, Eng C, Gardner E, et al.: Germ-line mutations of the Ret proto-oncogene in multiple endocrine neoplasia type 2A. Nature 1993; 2: 851-6
85.
Rodien P, Jeunemaitre X, Dumont C et al.: Genetic alterations of the RET protooncogene in familial and sporadic pheochromocytomas. Hormone research 1997; 47(4-6):263-8
86.
Mulligan LM, Ponder BAJ. Genetic basis of endocrine disease: multiple endocrine neoplasia type 2. J Clin Endocrinol Metab 1995? 80:1989-1995.
87.
Medeiros LJ, Wolf BC, Balogh K, Federman M. Adrenal pheochromocytoma: a clinicopathologic review of 60 cases. Hum Pathol 1985? 16:580-589
88.
Eng C, Clayton D, Schuffenecker I et al: The relationship between specific RET proto-oncogene mutations and disease genotype in multiple endocrine type 2. Intenational RET mutation consortium analysis. JAMA 1996, 276:1575-1579
89.
Bolino A, Schuffenecker I, Luo Y, Seri M, Silengo M, et al.: RET mutations in exon 13 and 14 of FMTC patients. Oncogene 1995; 10: 2415-2419
75
90.
Hofstra RM, Landsvater RM, Ceccherini I, Stulp RP, Stelwagen T, Luo Y, et al.: A mutation in the RET proto-oncogene associated with multiple endocrine neoplasia type 2B and sporadic medullary thyroid carcinoma. Nature 1994; 367: 375-83
91.
Mulligan LM, Eng C, Healay CS, et al.: Specific mutations of the RET protooncogene are related to disease phenotype in MEN 2A and FMTC. Nature Genetics 1994; 6:70-74
92.
Mulligan LM, Marsh DJ, Robinson BG, Schuffenecker I, et al.: Genotype-phenotype correlation in multiple endocrine neoplasia type 2: report of the International RET Mutation Consortium. J. of Internal Medcine 1995; 238:343-346
93.
Cote GJ, Wohllk N, Evans D, Goepfert H, Gagel RF: RET Proto-oncogen Mutations in Multiple Endocrine Neoplasia Type 2 and Medullary Thyroid Carcinoma. Baliere’s Clinical Endocrinology and Metabolism 1995; 9:609-630
94.
Berndt I, Reuter M, Saller B, Frank-Raue P, Groth P, Gru? endorf M et al. A new hot spot for mutations in the ret protooncogene causing familial medullary thyroid carcinoma and multiple endocrine neoplasia type 2A. J Clin Endocrinol Metab 1998? 83:770-774.
95.
Uchino S, Noguchi S, Adachi MT, Sato M, Mukakami N, Yamashita H et al. Presymptomatic detection and treatment of gene carriers of multiple endocrine neoplasia families for germ-line mutations of the ret gene. Cancer Detect Prev 1996? 20 (Suppl):S5.
96.
Brandi ML, Gagel RF, Angeli A, Bilezikian JP, Beck-Peccoz P, Bordi C et al. Guidelines for diagnosis and therapy of MEN type I and type 2. J Clin Endocrinol Metab 2001? 86:5658-5671.
97.
Cornelis JM, Lips, Rudy M Landsvater, Jo WM Höppener et al.: Clinical screening as compared with DNA Analysis in Families with Multiple Endocrine Neoplasia Type 2A. The New England Journal of Medicine 1994:828-835
98.
Pomares FJ, Canas R, Rodriguez JM, Hernandez AM, Parilla P, Tebar FJ. Differences between sporadic and multiple endocrine neoplasia type 2A pheochromocytoma. Clin Endocrinol 1998? 48:195-200.
76
99.
Eisenhofer G, McClellan MW, Huynh T-T, Li S-T, Bornstein SR, Vortmeyer A et al. Pheochromocytomas in von Hippel-Lindau syndrome and multiple endocrine neoplasia type 2 display distinct biochemical and clinical phenotypes. J Clin Endocrinol Metab 2001? 86:1999-2008.
100.
Takahashi M, Cooper G.M: Ret transforming gene encodes a fusion protein homologous to tyrosine kinases. Mol. Cell. Biol. 1987, 7: 1378-1385.
101.
Takahashi M, Buma Y, Iwamoto T, Inaguma Y, Ikeda H, Hiai H. Cloning and expression of the RET-protooncogene encoding a tyrosine kinase with potential transmembrane domains. Oncogene 1988, 3: 571-578.
102.
Capes-Davis A., Robinson BG: Return of the native: deducing the normal function of the RET proto-oncogene. Curr. Opin. Endocrinol. Diab. 1999, 6: 61-69.
103.
Vega QC, Worby CA, Lechner MS et al: Glial Cell Line Drived Neurotrophic Factor Activates the Receptor Tyrosin Kinase RET and Promotes Kidney Morphogenesis. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:10657-10661
104.
Sanchez MP, Silos SI, Frsen J, He B, Lira SA, Barbacid M: Renal agenesis and the absence of Enteric Neurons in Mice Lacking GDNF. Nature 1996;382:70-73
105.
Pichel JG, Shen L, Sheng HZ, Granholm AC et al.: Defects in Enteric Innervation and Kidney Development in Mice Lacking GDNF. Nature 1996;382:73-76
106.
Durbec PL, Marcos GCV, Illkenny C et al: Signalling Through the RET receptor Tyrosin Kinase. Nature 1996; 381:789-793
107.
Reedon DJ, Tansey MG, Baloh RH et al.: Neurturin Shares Receptors and Signal Transduction Pathways with GDNF in Sympathic Neurons. Proc Natl Acad Sci USA 1997;94:7018-7023
108.
Moore MW, Klein RD, Farinas I et al.: Renal and Neuronal Abnormalities in Mice Lacking GDNF. Nature 1996; 382:76-79
109.
Edery P, Lyonnet S, Mulligan LM. et al. Mutations of the RET proto-oncogene in Hirschprung's disease. Nature 1994, 367: 378-380.
110.
Borrego S, Sáez ME, Ruiz A et al.. Specific polymorphisms in the RET protooncogene are over-represented in patients with Hirschprung disease and may represent loci modifying phenotypic expression. J. Med. Genet. 1999, 36:771-774
77
111.
Kondo K, Kaelin WG: The von Hippel-Lindau tumor suppressor gene Experimental Cell Research, 2001; 264: 117-25
112.
Eng C, Crossey P, Mulligan LM, Healey C, Houghton C, Prowse A, Chew S, Dahia P, O’Riordan, Jeffrey LH, Toledo S, Smith D, Maher E, Ponder B: Mutations in the RET protoocogene and the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene in sporadic and syndromic phaeochromocytomas J of Medical Genetics 1995; 32:934937
113.
Nilsson O, Tisell LE, Jansson S, Ahlman H, Gimm O, Eng C.: Adrenal and extraadrenal pheochromocytomas in a family with germline RET V804L mutation. JAMA 1999; 1587-8
114.
Gimm O, Neuberg DS, Marsh DJ et al. Over-representation of germline RET sequence variant in patients with sporadic medullary thyroid carcinoma and somatic RET codon 918 mutation. Oncogene 1999, 18: 1369-1370.
115.
Patócs A, Valkusz Zs, Igaz P, Balogh K, Tóth M, Varga I et al. Segregation of the V804L mutation and S836S polymorphism of exon 14 of the RET gene in an extended kindred with familial medullary thyroid cancer. Clin Genet 2003? 63:219223.
116.
Luton JP, Martinez M, Coste J Bertherat J. Outcome of patients with adrenal incidentaloma selected for surgery: an analysis of 88 cases investigated in a single clinical center. Eur J Endocrinol 2000? 143:111-117.
117.
Mannelli M, Ianni L, Cilotti A, Conti A. Pheochromocytoma in Italy: a multicentric retrospective study. Eur J Endocrinol 1999? 141:619-624.
118.
Gagel RF, Cote G: The Ret signaling system and its role in hereditary medullary thyroid carcinoma. In: Econs M.J. (Ed.) The genetics of osteoporosis and metabolic bone disease. Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2001, p. 295-308.
119.
Libroia A, Verga, U, Vecchi G. et al. Seventeen-year-long-follow-up of a family affected by type 2A multiple endocrine neoplasia (MEN2A). J Endocrinol Invest 1998, 21: 87-92.
120.
Pacini F, Elisei R, Romei C, Pinchera A: RET proto-oncogene mutation in thyroid carcinomas: clinical relevance. J. Endocrinol. Invest. 2000, 23: 328-338.
78
121.
Latif F, Tory K, Gnarra J, Yao M, Duh FM, Orcutt ML et al. Identification of the von Hippel-Lindau disease tumor suppressor gene. Science 1993? 260:1317-1320.
122.
Hes FJ, Höppener JWM, Lips CJM. Pheochromocytoma in von Hippel-Lindau disease. J Clin Endocrinol Metab 2003? 88:969-974.
123.
Chen F, Kishida T, Yao M, Hustad T, Glavac D, Dean M et al. Germline mutations in the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene: correlations with phenotype. Hum Mutat 1995? 5:66-75.
124.
Gutmann DH: Loss of neurofibromatosis type 1 (NF1) gene expression in pheochromocytomas from patients without NF1 Genes, chromosomes & Cancer, 1995; 13:104-9
125.
Levine C, Skimming J, Levine E.
Familial pheochromocytomas with unusual
associations. J Pediatr Surg 1992? 27:447-451. 126.
Manger WM, Gifford RW Jr. Pheochromocytoma: a clinical overview. in: Laragh JH. Brenner BM. eds. Hypertension: pathophysiology, diagnosis, and management. 2nd ed. New York: Raven Press, 1995: 2225-2244.
127.
Crossey PA, Richards FM, Foster K, Green JS, Prowse A, Latif F et al. Identification of intragenic mutations in the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene and correlation with disease phenotype. Hum Mol Genet 1994? 3:1303-1308.
128.
Riccardi VM. Von Recklinghausen neurofibromatosis. N Engl J Med 1991? 305:1617-1627.
129.
Kalff V, Shapiro B, Lloyd R, Sisson JC, Holland K, Nakajo M et al. The spectrum of pheochromocytoma in hypertensive patients with neurofibromatosis. Arch Intern Med 1982? 142:2092-2098.
130.
Baysal BE, Ferrell RE, Willett-Brozick JE, Lawrence EC, Myssiorek D, Bosch A et al. Mutations in SDHD, a mitochondrial complex gene, in hereditary paraganglioma. Science 2000? 287:848-851.
131.
Niemann S, Muller U. Mutations in SDHC cause autosomal dominant paraganglioma type 3. Nat Genet 2000? 26:268-270.
79
132.
Astuti D, Latif F, Dallol A, Dahia PL, Douglas F, George E et al. Gene mutations in the succinate dehydrogenase subunit SDHB cause susceptibility to familial pheochromocytoma and to familial paragangioma. Am J Hum Genet 2001? 69:49-54.
133.
Gimm O, Armanios M, Dziema H, Neumann HP, Eng C. Somatic and occult germline mutations
in
SDHD,
a
mitochondrial
complex
II
gene,
in
nonfamilial
pheochromocytoma, Cancer Res 2000? 60:6822-6825 134.
Benn DE, Croxson MS, Tucker K, Bambach CP, Richardson AL, Delbridge L et al. Novel succinate dehydrogenase subunit B (SDHB) mutations in familial phaeochromocytomas and paragangliomas, but an absence of somatic SDHB mutations in sporadic phaeochromocytomas. Oncogene, 2003? 22:1358-1364.
135.
Cascon A, Ruiz-Llorente S, Cebrian A, Telleria D, Rivero JC, Benitez J et al. Mutational analysis of complex II genes (SDHB, SDHC and SDHD) in Spanish patients with pheochromocytoma and/or paraganglioma. Cancer Detect Prev 2002? (Suppl) S66.
136.
Vecsei P: Glucocorticoids: cortisol, cortisone, corticosterone, compound S and their metabolites. In: Methods of Hormone Radioimmunoassay, pp 767-796. Eds BM Jaffe ? HR Behrman. New York: Academic Press, 1979.
137.
Vecsei P, Onyechi J, Hornung J, Dietz R, Mast G ? Hobler H: Use of corticosteroid antibodies for the study of corticosteroid biosynthesis in vitro. Journal of Steroid Biochemistry 1975 6 383-387.
138.
Varga I, Jakab Cs, Szücs N, Patócs A, Tóth M, Kiss R, Gláz E, Rácz K: Plasma and salivary 6? -hydroxycortisol measurements for assassing adrenocortical activity in patients with adrenocortical adenomas, Hormone Metab Research 2003;35:421-426
139.
Matteson KJ, Picado-Leonard J, Chung BC, Mohandas TK, Miller WL: Assignment of the gene for adrenal p450c17 (steroid 17 alpha-hydroxylase/17,20 lyase) to human chromosome 10. J. Clin. Endocrinol. Metab. 63 (3) (1986) 789-791.
140.
Picado-Leonard J, Miller WL: Cloning and sequence of the human gene for p450c17 (steroid 17 alpha-hydroxylase/17,20 lyase): similarity with the gene for p450c21. DNA 6 (5) (1987) 439-448.
80
141.
Elchisak MA, Carlson JA. Assay of free and conjugated catecholamines by highperformance liquid chromatography with electrochemical detection. J Chromatogr 1982? 233:79-88.
142.
Hjemdahl P, Daleskog M, Kahan T. Determination of plasma catecholamines by high performance liquid chromatography with electrochemical detection: comparison with a radioenzymatic method. Life Sci 1979? 25:131-138.
143.
Liovic M, Prezelj J, Kocijancic A, Majdic G, Komel R. CYP17 gene analysis in hyperandrogenised women with and without exaggerated 17-hydroxyprogesterone response to ovarian stimulation. J. Endocrinol. Invest. 20 (1997) 189-193.
144.
Munnes M., Fanaei S., Schmitz B., Muiznieks I., Holschneider A.M., Doerfler W. Familial form of Hirschprung disease: nucleotide sequence studies reveal point mutation in the RET proto-oncogene in two of six families but not in other candidate genes. Am. J. Med. Genet. 2000, 94: 19-27.
145.
Baumgartner-Parzer S.M., Pauschenwein S., Waldhausl W. et al. Increased prevalence of heterozygous 21-OH germline mutations in patients with adrenal incidentalomas. Clinical Endocrinology 2002, 56: 811-816.
146.
Ruiz A, Antinolo G, Fernandez RM, Eng C, Marcos I, Borrego S: Germline sequence varinat S836S of the RET proto-oncogene is associated with low level predisposition to sporadic medullary thyroid carcinoma in the Spanish population. Clin Endocrinol 2001: 55:399-402
81
ÖSSZEFOGLALÁS Munkámban, a mellékvese daganatok, különös tekintettel a hormonálisan inaktív kéreg adenomák és phaeochromocytomák pathomechanismusában jelentosnek tuno genetikai eltéréseket a klinikai és biokémiai paraméterekkel összevetve vizsgáltam, figyelemet fordítva a lehetséges összefüggések megismerésére. Allél-specifikus PCR módszerrel kimutattam, hogy a CYP21B mutációk hormonálisan inaktív egyoldali mellékvesekéreg adenomás betegek 16.1 %-ában, míg kétoldali adenomás betegek 21.1 %-ában fordulnak elo. Eredményeim alapján feltételezheto, hogy ezekben a betegekben a CYP21B mutációk jelenléte a 21-hidroxiláz aktivitás részleges csökkenésén és következményes ACTH túltermelésen keresztül oki tényezo lehet az adenomák kialakulásában. A CYP21B mutációk és az ACTH-stimulált 17-OHP koncentráció közötti szoros kapcsolat hiánya azonban arra utalt, hogy a mutációknak az ACTH-stimulációtól független hatása is lehet. Egy kétoldali kéreg adenomás betegben a CYP17 összes exonjának szekvencia-analízisével egy új, eddig nem közölt betegség-okozó mutáció (Arg440Cys), valamint 5 különbözo polimorfizmus jelenlétét igazoltam? utóbbiak közül két polimorfizmus (Asp192Asp és Ser283Ser) a korábbi in silico kutatásainkkal felfedezett új gén-variánsnak felelt meg, bizonyítva a módszer alkalmasságát a CYP17 új variánsainak kutatásában. A MEN 2 szindrómát okozó RET protoonkogén mutációk teljes spektrumának vizsgálata során a 609-es kodon mutáció phaeochromocytomával (is) járó eseteit azono-sítottam, amelyeket a MEN 2A szindróma új klinikai fenotípusaként közöltük. Egy 80 tagból álló FMTC-s családban egy ismert betegség-okozó RET mutáció (Val804Leu) és a sporadikus esetekben feltételezett szereppel bíró RET variáns (Ser836Ser) ko-szegre-gációjának elemzésével megállapítottam, hogy a Ser836Ser polimorfizmus nem módo-sítja az FMTC kórlefolyását. Nem szelektált phaeochromocytomás betegek csoportjában a RET gén mutációk miatt kialakuló MEN 2 szindróma, a vhl gén mutációkkal össze-függo vonHippelLindau szindróma és az 1-es típusú neurofibromatosus elofordu-lásának szisztematikus vizsgálatával megállapítottam, hogy az örökletes szindrómákhoz társuló phaeochromocytoma az összes phaeochromocytoma eset 28 %-át teszi ki. Megállapítottam, hogy a klinikai és laboratóriumi paraméterek nem nyújtanak lényeges támpontot a phaochromocytoma örökletes és sporadikus formáinak elkülönítésében.
82
SUMMARY The aim of this study was to examine genetic abnormalities thought to be potentially important in the pathomechanism of hormonally inactive adrenocortical adenomas and pheochromocytomas, and to compare the results with clinical and biochemical parameters present in patients with these adrenal tumors. Using an allele-specific PCR method we showed that 16.1 % of unilateral and 21.1 % of bilateral hormonally inactive adrenocortical adenomas had mutations of the CYP21B gene. Based on these data we presumed that the presence of CYP21B mutations in these patients may result in a partially decreased activity of the 21-hydroxylase enzyme and that a subsequent overproduction of ACTH may, therefore, play a causal role in the development of these tumors. However, the lack of close relationship between the presence of CYP21B mutations and ACTH-stimulated plasma 17-OHP concentrations in several patients indicated that the role of CYP21B mutations on tumor formation may involve mechanisms independent of ACTH-induced changes in 17-OHP secretion. Sequencing of all exons of CYP17 in germline DNA of a patient with bilateral adrenal adenomas revealed a previously undescribed disease-causing mutation of the CYP17 gene (Arg440Cys) and 5 different CYP17 polymorphisms, of which two polymorphisms (Asp192Asp és Ser283Ser) were described by our in silico approach. This confirms the usefulness of this approach to search for novel CYP17 variants. In the course of our studies on mutation screening of the RET gene, patients with pheochromocytomas having mutations at codon 609 have been identified and described as a new MEN 2A phenotype associated with this mutation. Our studies on a large kindred with FMTC consisting 80 members indicated that co-segregation of a known disease-causing RET mutation (Val804Leu) and a RET polymorphism presumably involved in the pathomechanism of sporadic medullary thyroid cancer (Ser836Ser) failed to have an impact on the clinical course of FMTC. Our extended mutational screening studies for MEN 2 syndrome and vonHippel-Lindau syndrome, together with clinical screening for type 1 neurofibromatosis indicated that the prevalence of hereditary cases in non-selected patients with pheochromocytomas is as high as 28 %. We showed that clinical and laboratory parameters
83
do not offer a great help to differentiate between patients with sporadic and hereditary pheochromocytomas.
84
SAJÁT KÖZLEMÉNYEK LISTÁJA A DOLGOZAT ANYAGÁT KÉPEZÓ KÖZLEMÉNYEK Külföldi folyóiratokban megjelent eredeti közlemények: 1.
Rácz K, Tóth M, Patócs A, Gláz E: Incidentally discovered adrenal masses Polskie Towarzystwo Endokrynolodiczne (2000); Supl 1:85-88)
2.
Patócs A, Tóth M, Barta Cs, Sasvári-Székely M, Varga I, Szücs N, Jakab C, Kiss R, Gláz E and Rácz K : Hormonal evaluation and mutation screening for steroid 21hydroxylase deficiency in patients with unilateral and bilateral adrenal incidentalomas European Journal of Endocrinology (2002), 147(3):349-355) IF: 2,56
3.
Igaz P, Patócs A, Rácz K, Klein I, Váradi A and Ésik O: Occurrence of pheochromocytoma in a MEN2A family with codon 609 mutation of RET protooncogene (Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism (2002) 87(6): 2994, IF: 5,199 (Letter)
4.
Patócs A, Valkusz Zs, Igaz P, Balogh K, Tóth M, Varga I, Rácz K: Segregation of the V804L mutation and S836S polymorphism of exon 14 of the RET gene in the extended kindred with familial medullary thyroid cancer Clinical Genetics (2003): 63: 219-223 IF: 2.237
5.
Patócs A, Karádi E, Tóth M, Varga I, Szücs N, Balogh K, Majnik J, Gláz E, Rácz K: Clinical and biochemical features of sporadic and hereditary pheochromocytomas: an analysis of 41 cases investigated in a single endocrine center European Journal of Cancer Prevention, (2004): 13(5):, közlésre elfogadva, IF: 1,685
Hazai folyóiratokban megjelent közlemények és eloadások 6.
Patócs A, Tóth M, Varga I, Jakab Cs, Gláz E, Adleff V, Kiss R, Szücs N, Futo L, Rácz K: Hormonálisan inaktív mellékvesekéreg adenómák genetikai és biokémiai jellegzetességeinek vizsgálata (MEAT, 2000 Lillafüred, Orvosi Hetilap, Suppl. I: 1263, 2000)
7.
Majnik J, Patócs A, Igaz P, Tóth M, Rácz K: MEN 2A szindrómás betegek vizsgálatával szerzett tapasztalatok a II sz. Belklinikán (MEAT, 2000 Lillafüred, Orvosi Hetilap, Suppl. I: 1259, 2000)
85
8.
Patócs A, Rácz K, Tóth M, Kovács G: Ret protoonkogén mutációk kimutatása különbözo molekuláris biológiai módszerekkel MEN2A szindrómás betegekben (2000) (II. Magyar Sejtanalitikai Konferencia, Budapest)
9.
Patócs A, Rácz K, Tóth M: Genetic screening of Ret protooncogen in Hungarian patients with MEN2A (2000) International Congress of Endocrinology, Sydney
10.
Patócs A., Rácz K: Phaeochromocytoma Hippocrates, (2001) III/6: 354-356
11.
Patócs A., Tóth M., Varga I., Balogh K., Szücs N., Jakab Cs., Gláz E., Rácz K.: CYP21 gén mutációk hormonálisan inaktív mellékvesekéreg daganatokban. MEAT, 2002, Gyula (Orvosi Hetilap, (2002) 143: 18 Suppl. 1: 991- absztrakt
12.
Patócs A, Valkusz Zs, Igaz P, Balogh K, Tóth M, Majnik J, Varga I, Rácz K: RET protoonkogén V804L mutáció és S836Spolimorfizmus familiáris medulláris pajzsmirigy-carcinomában. A Magyar Belgyógyász Társaság XXXIX. Nagygyulése, 2002. (Magyar Belorvosi Archivum Supplementum 3/2002)
13.
Patócs A, Valkusz Zs, Balogh K, Nyíro G, Tóth M, Igaz P, Varga I, Rácz K: Coexistence of V804L mutation and S836S polymorphism of exon 14 of the RET gene in an extended kindred with familial medullary thyroid cancer (2003) The 6th European Congress of Endocrinology, Lyon
14.
Patócs A, Karádi É, Balogh K, Majnik J, Tóth M, Szücs N, Varga I, Kiss R, Gláz E, Rácz K: Sporadikus és örökletes phaeochromocytomák gyakorisága egy endokrin centrumban vizsgált mellékvese daganatos betegekben (2004) (MEAT, Szolnok) (Orvosi Hetilap 145; 20 Suppl 3:1100, 2004)
86
KÜLFÖLDI FOLYÓIRATOKBAN MEGJELENT, A TÉMÁHOZ SZOROSAN NEM KAPCSOLÓDÓ EREDETI KÖZLEMÉNYEK
15.
Szücs N, Varga I, Jakab C, Patócs A, Gláz E, Tóth M, Kiss R, and Rácz K: Leptin inhibits cortisol and corticosterone secretion in pathologic human adrenocortical cells Pituitary (2001) 4: 71-77
16.
Igaz P, Patócs A and Rácz K: Novel sequence variants of the genes associated with the multiple endocrine neoplasia syndromes 1 and 2. Analysis by an „in silico approach” Journal of Endocrinological Investigation, (2002) 25:609-613) IF: 1,476
17.
Igaz P, Pap E, Patócs A, Falus A, Tulassay Z and Rácz K: Genomics of steroid hormones: In silico analysis of nucleotide sequence variants (polymorphisms) of the enzymes involved in the biosynthesis and metabolism of steroid hormones Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology (2002) 82: 359-367, IF: 2,637
18. Toth M, Ujhelyi R, Tulassay Z, Szathmari M, Patocs A, Miheller P: Decreased bone mineral density and alterations of bone metabolism in heterozygotes for cystic fibrosis Gastroenterology (2002) 122 (4): W1009 Suppl 1-absztrakt 19.
Varga I, Jakab Cs, Szucs N, Patócs A, Tóth M, Kiss R, Gláz E, Rácz K: Plasma and salivary 6beta-hydroxycortisol measurments for assessing adrenocortical activity in patients with adrenocortical adenomas Hormon Metabolic Reearch (2003) 35:421-426, IF: 1,608
20.
Szücs N, Varga I, Patócs A, Tóth M, Gláz E, Rácz K: Secretion of 6? hydroxycortisol in human adrenals and adrenocortical adenomas Steroids (2003) 68: 477-482 IF: 2.524
21.
Szücs N, Varga I, Patócs A, Tóth M, Gláz E, Rácz K: Plasma 6beta-hydroxycortisol measurments for assessing altered hepatic drug metabolizing enzyme activity Acta Physiologica Hungariaea (2003), 90 (3): 217-233, IF: 0,112
22.
Tóth M, Speer G, Patócs A, Salamon D, Lakatos P, Rácz K, Tulassay Zs: Familiáris hypocalciuriás hypercalcaemia Orvosi Hetilap (2003) 144: 41: 2029-31
23.
Speer G, Tóth M, Niller HH, Salomon D, Takács K, Miheller P, Patócs A, Nagy Z, Bajnok É, Nyíri P, Varga I, Lakatos P: Calcium metabolism and endocrine functions in a family with familial hypocalciuric hypercalcemia Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes, (2003) 111: 486-490, IF:1,438
87
24.
Balogh K, Patócs A, Majnik J, Varga F, Illyés Gy, Hunyady L, Racz K: Unusual presentation of multiple mutation of the MEN1 gene, Journal of Human Genetics (2004) közlésre elfogadva IF: 1,971
25.
Majnik J, Szücs N, Patócs A, Tóth M, Balogh K, Varga I, Gláz E and K. Rácz K: Effect of single doses of dexamethasone and adrenocorticotrop hormone on serum bone markers in healthy subjects and in patients with adrenal incidentalomas and Cushing’s syndrome. Journal of Endocrinological Investigation (2004) közlésre elfogadva, IF: 1,476
A TÉMÁHOZ SZOROSAN NEM KAPCSOLÓDÓ ELOADÁSOK 26.
Patócs A, Tóth M, Rácz K, Czirják S, Gláz E, Scücs N, Jakab Cs: Invasive corticotroph pituitary macroadenoma in a patient with mild clinical manifestation of Cushing’s disease (Semmelweis Symposium, 1999)
27.
Patócs A, Tóth M, Rácz K, Varga I, Kocsis I: Vizelet catecholamin meghatározás HPLC módszerrel essentiális hypertóniás betegekben (MLDT 49. nagygyulés Siófok, 1999, Klinikai és Kísérletes Laboratóriumi Medicina, 1999, 3:128)
28.
Varga I, Rácz K, Tóth M, Futo L, Kiss R, Pusztai P, Jakab Cs, Patócs A, Szücs N, Gláz E: Emelkedett nyál 6? -hydroxycortisol koncentráció nem-hyperfunkciós mellékvesekéreg adenómás betegekben (MLDT 49. nagygyulés Siófok, 1999, Klinikai és Kísérletes Laboratóriumi Medicina, 1999, 3:127)
29.
Csiffáry B, Oláh M, Patócs A, Varga I, Tóth M, Jakab Cs, Gláz E, Kiss R, Rácz K: Nem-klasszikus 21-hidroxiláz defektusos betegek klinikai-, hormon-, és genetikai vizsgálatainak eredményei (MEAT, 2000 Lillafüred, Orvosi Hetilap, Suppl. I: 1243, 2000)
30.
Igaz P., Patócs A., Rácz K.: Szekvenciavariánsok a multiplex endokrin neoplásia 1-es és 2-es típusáért felelos gének esetében: in silico eredmények Orvosi Hetilap (2002) 143: 18 Suppl. 1: 982-absztrakt
31.
Rácz K, Tóth M, Jakab C, Patócs A és Kiss R: Acromegalia: a feltuno, mégis késon felismert betegség Orvosi Hetilap (2002) 143 (19, Suppl.2:1052-1057
32.
Tóth M, Jakab C, Patócs A, Varga I, Füto L, Horányi J, Kiss R, Gláz E, Rácz K, Tulassay Z: Bone mineral density of patients with non-hyperfunctioning adrenal adenomas (International Congress of Endocrinology, Sydney 2000)
33.
Tóth M, Patócs A, Miheller P, Jakab C, Horányi J, Kiss R, Gláz E, Rácz K: Endocrin investigations and bone mineral density measurements of patients with non
88
hyperfunctioning adrenal adenomas (5th European Congress of Endocrinology, Torino, 2001) 34.
Varga I, Szücs N, Tóth M, Jakab C, Patócs A, Kiss R, Gláz E, Rácz K: Leptin inhibits cortisol and corticosterone secretion in pathologic human adrenocortical cells (5th European Congress of Endocrinology, Torino 2001)
35.
Balogh K., Rácz K., Patócs A., Hunyady L., Valkusz Zs.: Új lehetosége a hazai MEN 1 szindrómás betegek genetikai szurésére MEAT, Gyula (Orvosi Hetilap, 143: 18 Suppl. 1: 973, 2002)
36.
Igaz P., Patócs A., Rácz K.: Szekvenciavariánsok a multiplex endokrin neoplásia 1-es és 2-es típusáért felelos gének esetében: in silico eredmények MEAT, Gyula (Orvosi Hetilap, 143: 18 Suppl. 1: 982, 2002)
37.
Tóth M., Speer G., Patócs A., Lakatos P., Miheller P., Takács I., Rácz K., Tulassay Zs.: Familiáris hypocalciuriás hypercalcaemia- új calcium-sensor gén mutáció MEAT, Gyula (Orvosi Hetilap, 143: 18 Suppl. 1: 997, 2002)
38.
Jakab Cs., Tóth M., Varga I., Szabó P., Szücs N., Patócs A., Kiss R., Rácz K., Gláz E.: A macroprolactin meghatározás klinikai jelentosége hyperprolactinaemiában MEAT, Gyula (Orvosi Hetilap, 143: 18 Suppl. 1: 91, 2002)
39.
Csákváry V., Tóth M., Horváth K., Patócs A., Toldy E., Oroszlán Gy.: Familiáris hypocalciuriás hypercalcaemia – laboratóriumi és radiológiai leletek újszülött és gyermekkorban. MEAT, Gyula (Orvosi Hetilap, 143: 18 Suppl. 1: 975, 2002)
40.
Majnik J., Oláh M., Patócs A., Bezzegh A., Szücs N., Tóth M., Jakab Cs., Rácz K.: A csontanyagcserét jellemzo szérum-markerek kortikoszteroid érzékenysége. MEAT, Gyula (Orvosi Hetilap, 143: 18 Suppl. 1: 988, 2002)
41.
Patócs Attila, Tóth Miklós, Miheller Pál, Szabó Péter, Pregun István, Tulassay Zsolt: 13171 DEXA-vizsgálat adatainak elemzése (Ca-és Csont, 5:1:24, 2002)
42.
Varga I., Rácz K., Tóth M., Patócs A., Futo L., Kiss R., Jakab Cs., Szücs N., Szabó P., Gláz E.: Az interleukin-1? glucocorticoid és mineralocorticoid bioszintézist serkento hatása izolált humán mellékvesekéreg sejtrendszerekben. MEAT, Gyula (Orvosi Hetilap, 143: 18 Suppl. 1: 998, 2002)
43.
Majnik J, Szücs N, Patócs A, Tóth M, Rácz K: A csontmarkerek szérumkoncentrációinak változása endogén és exogén glukokortikoid stimulusokra. A Magyar Belgyógyász Társaság XXXIX. Nagygyulése, 2002. (Magyar Belorvosi Archivum Supplementum 3/2002)
89
44.
Majnik J, Balogh K, Patócs A, Rácz K: Glukokortikoid receptor génvariánsok vizsgálata kétoldali mellékvesedaganatos betegekben. (2003) SE PhD Tudományos Napok
45.
Balogh K, Majnik J, Patócs A, Rácz K, Hunyady L. MEN1 szindrómás betegek és családtagjaik genetikai szurése. (2003) SE PhD Tudományos Napok
46.
Majnik J, Patócs A, Balogh K, Rácz K: Glucocrticoid receptor gene variants in patients with bilateral adrenal incidentalomas. (2003) The 6th European Congress of Endocrinology, Lyon.
47.
Balogh K, Patócs A, Majnik J, Rácz K, Hunyady L: Mutation analysis in patients with multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN1) with temporal temperature gradient gel electrophoresis (TTGE) and DNA sequencing. (2003) The 6th European Congress of Endocrinology, Lyon.
48.
Balogh K, Majnik J, Patócs A, Rácz K, Hunyady L: MEN1 szindrómás betegek és családtagjainak genetikai szurése (2004) SE PhD Tudományos Napok
49.
Balogh K, Majnik J, Patócs A, Valkusz Zs, Rácz K, Hunyady L: MEN1 szindrómás betegek és családtagjainak genetikai szurése. (2004) (MEAT, Szolnok) (Orvosi Hetilap 145; 20 Suppl 3:1085, 2004)
50.
Csákváry V, Tóth M, Patócs A, Oroszlán Gy, Rácz K: De Novo heterozygota Ca2+-érzékelo receptor gén mutáció (R551K) okozta újszülöttkori súlyos primer hyperparathyerosis (2004) (MEAT, Szolnok) (Orvosi Hetilap 145; 20 Suppl 3: 1087, 2004)
51.
Majnik J, Balogh K, Patócs A, Rácz K: Mellékvese incidentalómák és a glukokortikoid receptor gén Asn363ser polimorfizmusának összefüggései (2004) (MEAT, Szolnok) (Orvosi Hetilap 145; 20 Suppl 3: 1096, 2004)
52.
Mondok Á, Rácz K, Gláz E, Varga I, Szucs N, Patócs A, Czokoly A: A 11 bétahidroxiszteroid dehidrogenáz aktivitásának vizsgálata akromegáliában (2004) (MEAT, Szolnok) (Orvosi Hetilap 145; 20 Suppl 3: 1098, 2004)
53.
Varga I, Mondok Á, Rácz K, Tóth M, Kiss R, Patócs A, Szücs N, Jakab Csilla, Gláz E: Plazma kortizol és kortizon koncentrációk változása a hypophysismellékvesekéreg betegségeiben alkalmazott funkcionális tesztek során. (2004) (MEAT, Szolnok) (Orvosi Hetilap 145; 20 Suppl 3: 1109, 2004)
54.
Gyorffy András, Virág Tibor, Szabó András, Tulassay Tivadar, Patócs Attila, Molnár Béla, Tulassay Zsolt: Development of a new electrochemical chip technology for gastrointestinal biopsy specimen cDNA analysis (2004) SE PhD Tudományos Napok
90
55.
Szoke Dominika, Patócs Attila, Molnár Béla, Tulassay Zsolt: P53 sequence determination in gastric biopsy specimens by chip and conventional sequencing technology (2004) SE PhD Tudományos Napok
56.
Tóth Géza, Futo László, Lipkovics Judit, Horvát Gyula, Horváth Györgyi, Balogh Katalin, Patócs Attila, Rácz Károly: Multiples endokrin neoplasia 1-es típusa – esetismertetés (2004) MEAT, Szolnok (Orvosi Hetilap 145; 20 Suppl 3: 1106, 2004)
91
