A tumorfejlődés stádiumainak jellegzetes molekuláris változásai vastagbél-daganatokban

A tumorfejlődés stádiumainak jellegzetes molekuláris változásai vastagbél-daganatokban Doktori értekezés

Spisák Sándor

Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Molnár Béla, az orvostudományok doktora Programvezető: Prof. Dr. Tulassay Zsolt, egyetemi tanár Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:

Dr. Orosz László egyetemi tanár, DSc. Dr. Kovalszky Ilona egyetemi tanár, DSc. Dr. Patócs Attila, Ph.D.

Opponensek: Dr. Kiss András egyetemi docens, Ph.D. Dr. Ponyi Tamás, egyetemi adjunktus, Ph.D.

Budapest 2011 1

TARTALOMJEGYZÉK 1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ................................................................................................................................ 7 2. BEVEZETÉS .................................................................................................................................................. 12 2.1. A DAGANATOKRÓL ÁLTALÁBAN .......................................................................................................................... 12 2.2. A VASTAGBÉL-DAGANATOK JELLEMZÉSE............................................................................................................... 12 2.2.1. A vastagbélrák klinikai jelentősége ................................................................................................... 12 2.2.2. A vastagbélrákok csoportosítása klinikai szempontok alapján ......................................................... 13 2.2.3. A vastagbélrákok kezelése ................................................................................................................. 13 2.2.4. A vastagbélrákok felismerésének és korai felismerésének lehetőségei ............................................. 13 2.3. A VASTAGBÉL ANATÓMIÁJA ÉS SZÖVETTANA ......................................................................................................... 15 2.3.1. A hámréteg (lamina epithelialis) szövettana ..................................................................................... 16 2.3.2. A kötőszövetes réteg (lamina propria mucosae) szövettana ............................................................. 18 2.4. A VASTAGBÉLRÁK KIALAKULÁSÁNAK MOLEKULÁRIS HÁTTERE .................................................................................... 18 2.4.1. Onkogének és a rendellenes sejtosztódás ......................................................................................... 18 2.4.1.1 A legismertebb onkogén a K-ras ................................................................................................................... 19 2.4.1.2. Erb-B2 (Her-2/neu) ...................................................................................................................................... 19 2.4.1.3. EGFR, molekuláris öngerjesztő folyamat ..................................................................................................... 19

2.4.2. Tumorszuppresszor gének jellemzése a daganat kialakulás során .................................................... 19 2.4.2.1. A p53 fehérje, mint a genom őre ................................................................................................................. 20 2.4.2.2. A DCC gén .................................................................................................................................................... 20 2.4.2.3. Az adenomatous polyposis coli génje .......................................................................................................... 21

2.4.3. Mismatch repair gének és a mikroszatellita instabilitás.................................................................... 22 2.5. A DNS METILÁCIÓ SZEREPE A DAGANAT KIALAKULÁSA ÉS FEJLŐDÉSE SORÁN ............................................................... 22 2.5.1. DNS metiláció vastagbél-daganatokban ........................................................................................... 24 2.6. AZ APOPTÓZIS ZAVARAI .................................................................................................................................... 25 2.7. A VASTAGBÉLRÁK KIALAKULÁSÁNAK FOLYAMATA ÉS MOLEKULÁRIS CSOPORTOSÍTÁSI LEHETŐSÉGEI ................................... 25 2.8. ADENOMA-CARCINOMA ÁTMENET ..................................................................................................................... 26 2.9. COLORECTALIS DAGANATOK MOLEKULÁRIS KLASSZIFIKÁCIÓJÁNAK EDDIGI EREDMÉNYEI.................................................. 27 2.10. COLORECTALIS DAGANATOK MRNS ÉS FEHÉRJE SZINTŰ ÖSSZEFÜGGÉSEI ................................................................... 28 2.10.1. mRNS és fehérje szint közötti összefüggéseket célzó vizsgálatok .................................................... 29 2.11. A KEMOPREVENCIÓ LEHETŐSÉGEI VASTAGBÉL-DAGANATOKBAN ............................................................................. 29 2.12. NAGY ÁTERESZTŐKÉPESSÉGŰ MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI VIZSGÁLATI MÓDSZEREK A RÁKKUTATÁSBAN............................... 31 2.12.1. Microarray technológiák ismertetése .............................................................................................. 32 2.12.2. Oligonukleotid microarray technológia (Affymetrix) ....................................................................... 32 2.12.3. Fehérje szintű vizsgálatok ellenanyag microarray technológiával .................................................. 34 2.12.3.1. Hagyományos fehérjevizsgálati módszerek ............................................................................................... 34 2.12.3.2. A protein chipek története ........................................................................................................................ 36 2.12.3.3. Modern fehérje chiptechnikák .................................................................................................................. 37

2

2.12.3.3.1.Üvegtárgylemez alapú antigén/antitest kötődés kimutatása alapján működő rendszerek ............... 37 2.12.3.3.2. SELDI-MS alapú rendszerek ............................................................................................................... 38 2.12.3.3.3. Gélelektroforézis alapú chip rendszerek ........................................................................................... 38 2.12.3.4. Fehérje analízis technikai problémái ......................................................................................................... 38 2.12.3.4.1. Fehérje bomlékonyság ...................................................................................................................... 38 2.12.3.4.2. Fals kötődés, pozitivitás .................................................................................................................... 39 2.12.3.5. Szöveti microarray technológia (TMA) ...................................................................................................... 39

2.12.4. A microarray eredmények megerősítésére szolgáló módszerek...................................................... 41 2.12.4.1. Valós idejű RT-PCR .................................................................................................................................... 42

2.13. A LÉZER MIKRODISSZEKCIÓ ÉS ALKALMAZÁSÁNAK LEHETŐSÉGE A RÁKKUTATÁSBAN ..................................................... 42 2.13.1. Lézer mikrodisszekció elméleti háttere ............................................................................................ 42 2.14. A VASTAGBÉLRÁK MICROARRAY ALAPÚ DIAGNOSZTIKAI ÉS PROGNOSZTIKAI LEHETŐSÉGEI ............................................. 44 3. CÉLKITŰZÉSEK ............................................................................................................................................. 45 4. BETEGEK ÉS MINTÁK .................................................................................................................................. 46 5. MÓDSZEREK ............................................................................................................................................... 48 5.1. SEBÉSZETI MINTÁK MRNS ÉS FEHÉRJE SZINTŰ VIZSGÁLATAI ..................................................................................... 48 5.1.1. Mintagyűjtés ...................................................................................................................................... 48 5.1.2. Fehérje izolálás .................................................................................................................................. 48 5.1.3. Clontech AB 500 array vizsgálat ........................................................................................................ 48 5.1.4. Szöveti microarray (TMA) megerősítés .............................................................................................. 49 5.1.5. Immunhisztokémia ............................................................................................................................ 49 5.1.6. Affymetrix teljes genom-szintű génexpressziós vizsgálat .................................................................. 50 5.1.7. Affymetrix U113 Plus 2.0 teljes genom chipek statisztikai kiértékelése ............................................ 50 5.1.8. Korreláció meghatározása Affymetrix és protein chip adatok között ............................................... 50 5.2. LÉZER MIKROKIMETSZETT VASTAGBÉLMINTÁK VIZSGÁLATA ...................................................................................... 51 5.2.1. Mintagyűjtés ...................................................................................................................................... 51 5.2.2. Lézeres mikrokimetszés (LCM- Laser Captured Microdissection) ...................................................... 51 5.2.3. Teljes RNS preparátum készítése LCM mintákból .............................................................................. 52 5.2.4. Affymetrix U113 Plus 2.0 teljes genom chipek készítése LCM mintákból .......................................... 52 5.2.4.1. Jelölés, amplifikáció ..................................................................................................................................... 52 5.2.4.2. Hibridizáció .................................................................................................................................................. 53 5.2.4.3. Mosás, festés, szkennelés ............................................................................................................................ 53 5.2.4.4. Adatfeldolgozás, kiértékelés ........................................................................................................................ 53

5.2.5. Microarray adatok megerősítése valós idejű RT-PCR-rel .................................................................. 54 5.3. METILÁCIÓS VIZSGÁLATOK ................................................................................................................................ 54 5.3.1. Mintagyűjtés ...................................................................................................................................... 54 5.3.2. HT-29 sejtkultúra demetilációs modell .............................................................................................. 55 5.3.2.1. Sejttenyésztés .............................................................................................................................................. 55

3

5.3.2.2. 5-aza-2’-dezoxicitidin demetiláló kezelés .................................................................................................... 55 5.3.2.3. Proliferációs assay ....................................................................................................................................... 55 5.3.2.4. Demetiláció okozta génexpressziós változások azonosítása ....................................................................... 55

5.3.3. Lézeres mikrokimetszés a metiláció hámsejtek génexpressziójára gyakorolt hatásának vizsgálatára az adenoma-carcinoma szekvencia kapcsán ............................................................................................... 55 5.3.4. Reverz transzkripció ........................................................................................................................... 55 5.3.5. Elősokszorozás (preamplifikáció) ....................................................................................................... 56 5.3.6. Valós idejű PCR .................................................................................................................................. 56 5.3.7. DNS izolálás ....................................................................................................................................... 56 5.3.8. Biszulfit konverzió .............................................................................................................................. 57 5.3.9. Szekvenáló PCR reakció ..................................................................................................................... 60 5.3.10. Szekvenálás ...................................................................................................................................... 60 5.3.11. A metiláltság meghatározása biszulfit szekvenálás alapján ........................................................... 61 5.3.12. Metilációs standardsor készítés ....................................................................................................... 61 5.3.13. Metiláció-szenzitív nagyfelbontású olvadáspont (MS-HRM) vizsgálat ............................................ 61 5.4. AZ ADENOMA – CARCINOMA ÁTALAKULÁS GÉNJEINEK VIZSGÁLATA ........................................................................... 62 5.4.1. Sejttenyésztés .................................................................................................................................... 62 5.4.2. MTT sejtproliferációs vizsgálat .......................................................................................................... 62 5.4.3 Microarray vizsgálatok ....................................................................................................................... 62 5.4.4. Taqman RT-PCR ................................................................................................................................. 62 5.4.5. HT-29 immuncitokémiai vizsgálat ..................................................................................................... 63 5.4.6. Western blot vizsgálat ....................................................................................................................... 64 6. EREDMÉNYEK ............................................................................................................................................. 65 6.1. BIOMARKEREK AZONOSÍTÁSA VASTAGBÉL-DAGANATOKBAN ..................................................................................... 65 6.1.1. Expressziós változást mutató gének azonosítása vastagbél daganatokban mRNS és fehérje szinteken ...................................................................................................................................................... 65 6.1.1.1. Teljes genom szintű mRNS expressziós profil meghatározása ..................................................................... 65 6.1.1.2. Fehérje biomarkerek azonosítása vastagbél-daganatokban ellenanyag microarray technológiával........... 67 6.1.1.2.1. Normális és Tumoros vastagbél minták (Ép nyálkahártya vs. Dukes B és Dukes D csoportok) elkülönítése fehérje szinten ................................................................................................................................ 67 6.1.1.2.2. Normális és Dukes B csoportok elkülönítése, a korai rák fehérje szintű progressziós markereinek azonosítása .......................................................................................................................................................... 67 6.1.1.2.3. Normális és Dukes D csoportok elkülönítése ...................................................................................... 67 6.1.1.2.4. Progressziós markerek azonosítása ..................................................................................................... 68 6.1.1.3. Ellenanyag microarray eredmények validációja TMA-val ........................................................................... 68 6.1.1.3.1. Normális-tumor összehasonlítás ......................................................................................................... 68 6.1.1.3.2. Normális nyálkahártya-korai daganat összehasonlítás........................................................................ 69 6.1.1.3.3. Normális nyálkahártya-kései daganat összehasonlítás ....................................................................... 70 6.1.1.3.4. A tumor progresszió követése ............................................................................................................. 70

4

6.1.2. mRNS és fehérje szint közötti összefüggések felderítése ................................................................... 70 6.1.2.1. Korreláció mRNS expressziós és ellenanyag array eredmények között ....................................................... 71 6.1.3. Expressziós változást mutató gének azonosítása az adenoma-carcinoma szekvencia előrehaladása során LCM minták felhasználásával .............................................................................................................................. 73 6.1.3.1. Lézer mikrodisszekció technikai hátterének optimalizálása ........................................................................ 73 6.1.3.1.1. RNS izolálás optimalizálása .................................................................................................................. 73 6.1.3.1.2. Amplifikációs technika kiválasztása LCM minták teljes genom expressziós vizsgálatához .................. 74 6.1.3.2 LCM minták teljes genom microarray vizsgálata Affymetrix U133 Plus 2.0 rendszeren ............................... 77 6.1.3.2.1 Az adenoma-carcinoma szekvencia előrehaladtával expressziós változást mutató gének azonosítása77 6.1.3.3. Nyirok follikulusok vizsgálata ....................................................................................................................... 80

6.1.4. A colorectális adenoma-dysplasia-carcinoma szekvencia előrehaladása során csökkenő kifejeződést mutató gének azonosítása LCM mintákon Affymetrix microarray vizsgálattal .......................................... 81 6.2. VASTAGBÉL-DAGANATOK MOLEKULÁRIS FOLYAMATAINAK FUNKCIONÁLIS VIZSGÁLATA .................................................. 83 6.2.1. Metilációs szabályozás alatt álló gének azonosítása a génexpresszió vizsgálata alapján ................ 83 6.2.1.1. HT-29 sejtkultúra microarray vizsgálata ...................................................................................................... 85 6.2.1.2. RT-PCR validációs vizsgálatok ...................................................................................................................... 88 6.2.1.2.1. 5-aza-2’-dezoxicitidin kezelt HT-29 sejtkultúra ................................................................................... 88 6.2.1.2.2. Szöveti minták génexpressziós RT-PCR validálása ............................................................................... 89 6.2.1.3. Fehérje szintű expressziós változások igazolása .......................................................................................... 90 6.2.1.4. CpG sziget predikció .................................................................................................................................... 90 6.2.1.5. Biszulfit-specifikus PCR reakció.................................................................................................................... 91

6.2.2. COX2-gátlás molekuláris mechanizmusának vizsgálata .................................................................... 95 6.2.2.1. Csökkent vagy fokozott működést mutató gének meghatározása ép - adenoma és ép-tumoros állapotok között........................................................................................................................................................................ 95 6.2.2.2. Az adenoma- CRC-specifikus markerek validációja...................................................................................... 95 6.2.2.3. A NS-398 kezelés HT-29 sejtek génexpressziójára gyakorolt hatása ........................................................... 96 6.2.2.4. Adenoma és daganat mRNS expressziós változásainak nyomon követése NS398 kezelés hatására HT-29 sejtkultúrában .......................................................................................................................................................... 97 6.2.2.5. HT-29 immuncitokémiai és Western blot eredmények ............................................................................... 98 6.2.2.6. Szövetspecifikus expresszió meghatározása................................................................................................ 99

7. MEGBESZÉLÉS ........................................................................................................................................... 100 7.1. BIOMARKEREK AZONOSÍTÁSA VASTAGBÉL-DAGANATOKBAN ................................................................................... 100 7.1.1. mRNS és fehérje alapú biomarker szelekció, korrelációs vizsgálatok .............................................. 100 7.1.1.1. Protein chipek eddigi alkalmazásai ............................................................................................................ 101 7.1.1.2. Szöveti microarray megerősítés ................................................................................................................ 101 7.1.1.3. Felhasználási lehetőségek.......................................................................................................................... 102 7.1.1.4. A korai és késői daganatok elkülönítése .................................................................................................... 103 7.1.1.5. Validációs eredmények alátámasztása ...................................................................................................... 103

7.1.2. A colorectalis adenoma-dysplasia-carcinoma szekvencia génjeinek azonosítása LCM mintákon ... 105 7.1.2.1 Hám markerek jellemzése az adenoma-carcinoma szekvencia előrehaladása során LCM mintákon......... 105

5

7.1.2.2. Stroma markerek jellemzése ..................................................................................................................... 108

7.2. VASTAGBÉL-DAGANATOK MOLEKULÁRIS FOLYAMATAINAK FUNKCIONÁLIS VIZSGÁLATA ................................................ 112 7.2.1. A colorectális adenoma-dysplasia-carcinoma szekvencia előrehaladása során csökkenő expressziót mutató gének funkcionális jellemzése ....................................................................................................... 112 7.2.1.1. A metiláció azonosítása ............................................................................................................................. 113

7.2.2. COX2-gátlás molekuláris mechanizmusának vizsgálata .................................................................. 114 7.2.3. Szövetspecifikus expressziós változások vizsgálata az adenoma – carcinoma átalakulás során LCM mintákon.................................................................................................................................................... 116 8. KÖVETKEZTETÉSEK ................................................................................................................................... 119 9. LEGFONTOSABB ÚJ MEGFIGYELÉSEK ÉS MEGÁLLAPÍTÁSOK ...................................................................... 121 10. ÖSSZEFOGLALÁS ..................................................................................................................................... 122 SUMMARY ................................................................................................................................................... 123 11. IRODALOMJEGYZÉK ................................................................................................................................ 124 12. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK ............................................................................................................................ 144 12.1 AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN, NEMZETKÖZI TUDOMÁNYOS FOLYÓIRATBAN MEGJELENT KÖZLEMÉNYEK ............................. 144 12.2. A DOLGOZAT TÉMÁJÁBAN, HAZAI TUDOMÁNYOS FOLYÓIRATBAN MEGJELENT KÖZLEMÉNYEK ...................................... 144 12.3. MÁS TÉMÁBAN, NEMZETKÖZI FOLYÓIRATBAN MEGJELENT KÖZLEMÉNYEK ............................................................... 145 12.4. MÁS TÉMÁBAN, MAGYAR NYELVEN MEGJELENT KÖZLEMÉNYEK ............................................................................ 146 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ............................................................................................................................... 147 13. FÜGGELÉK............................................................................................................................................... 148

6

1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE °C = fok Celsius 2D-ELFO = 2 dimenziós elektroforézis 3’ = a nukleinsav lánc vége, a 3. szén atomhoz foszfor csoport kapcsolódik 5’ = A nukleinsav lánc eleje, az 5. szénatomhoz OH csoport kapcsolódik A = adenin, 6-aminopurin A = average intensity, 1/2 x (log2R + log2G) A260 = abszorbancia, fényelnyelés 260nm-en AB array = ellenanyag microarray ABI = Applied Biosystems, Life Technologies AdoMet = metil-donor, S-adenozil-metionin AMACR = Alpha-methylacyl-CoA racemase APAF1 = Apoptotic protease activating factor 1 APC = adenomatous polyposis coli BAX = Bcl-2-associated X protein BCA = Bicinchoninic Acid protein assay, fehérje koncentrációmérő módszer BIOCONDUCTOR = nyílt forráskódú, "R" környezetben működő bioinformatikai programcsomag bp = bázispár C = citozin, 4-Aminopyrimidin-2(1H)-one CA125 = cancer antigen 125, tumormarker cDNS = komplementer DNS szekvencia, RNS-ről készült DNS molekula CEA = carcino-embrionális antigén CEL = cella fájl, Affymetrix próbák fluoreszcencia intenzitását tárolja CIMP = CpG island methylator phenotype COX2 = cyclooxygenase-2 Cp = crossing point, áttörési pont, detektálási határ CpG = CG dinukleotid CRC = colorectal cancer, vastagbél-daganat CT = cycle treshold, detektálási határ Cy3 = vízoldékony cyanin festék, ~570 nm-en zöld(G) színt emittál Cy5 = vízoldékony cyanin festék, ~ 670nm-en piros(R) színt emittál DAB = diamino-benzidine 7

DAT = az Affymetrix chipek szkennelt képének nyers adatfájlja DCC = deleted in colorectal carcinoma dCT = delta CT, a referencia és a vizsgált gén közötti ciklusszám különbség ddCT = a vizsgált gén két minta közötti ciklusszám különbsége DNMT = DNS-metiltranszferáz család DNS = dezoxiribonukleinsav dNTP = dezoxi-ribonukleotid trifoszfát ECL = Enhanced chemiluminescence EDTA = etilén-diamin-tetraecetsav EGFR = epidermális növekedési faktor receptor ELISA = Enzyme Linked Immunosorbent Assay EMBOSS = European Molecular Biology Open Software Suite ER = ösztrogén receptor Erb-B2 = HER2/neu, Human Epidermal growth factor Receptor 2 FAP = familiáris adenomatous polyposis FC = Fold Change, expressziós változás mértéke FCS = Fetal calf serum, borjú savó FDA = Food and Drug Administration FFPE = formaline fixed paraffine embdedded - formalin fixált paraffinba ágyazott szövet FOBT = fecal occult blood test FPLC = fluide pressure liquide chromatography g = gramm G = guanin, 2-amino-6-oxo-purin g = nehézségi gyorsulás, 9,80665 m/s2 G:C arány = a duplaszálú DNS molekulában a kettős és hármas hidrogénhíd-kötések aránya G1 = a sejtciklus interfázisának DNS szintézis előtti része/szakasza GCRMA = nukleinsavak energetikai viszonyát figyelembe vevő RMA algoritmus GSK = glikogén-szintáz kináz GTP = guanidin-trifoszfát HGP = Humán Genom Projekt HNPCC = herediter nem polyposus coloncarcinoma HPLC = high performance liquid chromatography – magasnyomású folyadék kromatográfia HRP = horse radish peroxidase HT-29 = immortalizált colorectális adenocarcinoma sejtvonal

8

IGF2R = insulin-like growth factor 2 receptor IH = Immunhisztokémia IHC = immunhistochemistry IVT = in vitro transzkripció kb = kilobázis KDa = kilodalton K-ras = Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog LCM = laser capture microdissection – lézer-mikrodisszekció LOH = loss of heterozigosity M = piros (R)/zöld(G) intenzitási hányados, log2R-log2G MA plot = eloszlási ábra microarray adatok fluoreszcencia intenzitására MALDI = Matrix-Assisted Laser Desorption and Ionisation MCA = metilált CpG-szigetek amplifikációja MCTD = Mixed Connective Tissue Disease MECP2 = methyl-CpG binding protein 2 (Rett syndrome) mer = oligonukleotid hosszúság mg = milligramm miRNS = mikro RNS MLH1 = MutL homolog 1, colon cancer, nonpolyposis type 2 (E. coli) MMR = mismatch repair mRNS = messenger RNS, hírvivő ribonukleinsav MS = mass spectrometry - tömegspektrometria MSI = mikroszatellita instabilitás MSI-H = magas mikroszatellita instabilitás MSI-L = alacsony mikroszatellita instabilitás MTT = 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, proliferációs assay MYOD = Myogenic differentiation 1 NC = nitrocellulose NCI-60 = 59 humán tumorból indított sejtvonal NGS = next genetration sequencing, új generációs szekvenálási eljárás NS398 = N-(2-cyclohexyloxy-4-nitrophenyl)-methanesulfonamide NSAID = nem-szteroid gyulladáscsökkentő gyógyszerek ORF = Open Reading Frame, nyitott leolvasási keret p16(INK4A) = Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (melanoma, p16, inhibits CDK4)

9

p53 = tumor protein 53 PAGE = poliakrilamid gél-elektroforézis PAM = Prediction Analysis of Microarrays PBDF = polybrominated dibenzofurans PCR = polimerase chain reaction - polimeráz láncreakció PEN = polietilén PGE2 = Prostaglandin E2 pH = pondus Hidrogenii, hidrogénion-kitevő PI3 = Phosphoinositide-3-kinase, catalytic, alpha polypeptide PMT = photomultiplayer PTEN = phosphatase and tensin homolog PTGDR = Prostaglandin D2 receptor PVDF = Polyvinylidene Fluoride QC = quality control, minőség ellenőrzés R = programnyelv és környezet statisztikai és grafikai műveletekhez R2 = korrelációs koefficiens RCA = Rolling Circle Amplification rcf = relative centrifugal force, (g) RFLP = restrikciós fragmentum hossz-polimorfizmus RIN = RNA integrity number, RNS integritási szám RMA = Robust Multi-Array Average expression measure algoritmus RNA = RNS RN-ase = RN-áz, ribonukleáz RNS = ribonukleinsav rpm = rotation per minute, percenkénti fordulatszám RPMI-1640 = Roswell Park Memorial Institute medium, tápfolyadék RSV = Respiratory syncytial virus RT = reverz transzkripció RT2-PCR = reverz transzkripciót követő valós idejű PCR RT-PCR = real-time PCR, valós idejű PCR SAGE = serial analysis of gene expression SAM = Significance Analysis of Microarrays SAPE = Streptavidin, R-phycoerythrin konjugátum SDS-PAGE = nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gél-elektroforézis

10

SELDI = Surface Enhanced Laser Dessorption and Ionisation SG = SYBR Green I, dupla szálú DNS kötő, interkalálódó asszimetrikus cyanine festék, gerjesztés (λmax = 488 nm), emisszió (λmax = 522 nm) SLE = szisztémás lupus erythematosus SNP = single nucleotide polymorhism, pontmutáció SPIA = single primer isothermal amplification SSCP = single-strand conformational polymorphism T = timin, 5-metil-uracil, pirimidin nukleobázis T7 = Escherichia coli T7 bakteriofág TALPAT = T7 RNA polymerase promoter-attached, adaptor ligation-mediated, and PCR amplification followed by in vitro T7-transcription TaqMan = Taq Polymerase + PacMan TCF = T-sejt faktor TE = 10mM Tris, 1mM EDTA, pH=8 TIMP3 = Metalloproteinase inhibitor 3 TLDA = Taqman Low-Density Array TMA = Tissue microarray – szöveti multiblokk array technika TMT = Tissue microarray technology TNM = tumor, nyirokcsomó, metasztázis TOF = time of flight, repülési idő analizátor TUKEB = Tudományos- és Kutatás Etikai Bizottság TUNEL = Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling, apoptózis assay U = unit, egység U = uracil, Pirimidin-2,4(1H,3H)-dion VEGF = Vascular endothelial growth factor WNT signaling pathway = wingless (Int1) jelátviteli útvonal μl = mikroliter μM = mikro mol

11

2. BEVEZETÉS 2.1. A daganatokról általában A daganatos megbetegedések, – köztük a vastagbél daganatos megbetegedései – napjaink egyik legnagyob népegészségügyi problémáját jelentik. Diagnosztizálása, korai felismerése, gyógyítása és kutatása az orvostudomány egyik központi kérdésévé vált. A szakirodalomban és az exponenciálisan bővülő elektronikus adatbázisokban egyre több információt találhatunk a daganatos betegségek molekuláris jelenségeiről és annak folyamatairól. Az utóbbi tíz évben megjelent nagy áteresztőképességű molekulárisbiológiai módszereknek köszönhetően egyre több információ áll rendelkezésünkre a daganatok kialakulásának, fejlődésének megértéséhez, diagnosztizálásának és talán gyógyításnak eredményesebbé tételéhez. Azonban a daganatok korai diagnosztizálása és a bennük történő molekuláris folyamatok megértése a hatalmas háttértudás ellenére sem tökéletes még. Jelenlegi tudásunk szerint a daganat a genetikai információban bekövetkező és felhalmozódó hibákra vezethető vissza. A betegség során az érintett szervben kóros, idegen szövetszaporulat jön létre a sejtek hibás osztódási folyamatának eredményeként, ezáltal akadályozva a szerv normális működését. A folyamat azonban nem csak lokális zavarokat idéz elő, hiszen a regenerációs rendszer módosítása a tumor növekedésén túlmenően végsősoron a daganat terjedéséhez is hozzájárul, ami a betegség drasztikus végkimenetelét okozza. Ebből adódóan a daganat inkább tekinthető szisztémás problémának, mintsem lokális elváltozásnak. Ezért fontos a rendszerszemléletű, és az egész szervezetre kiterjedő vizsgálatok tervezése és végrehajtása a rákkutatásban.

2.2. A vastagbél-daganatok jellemzése 2.2.1. A vastagbélrák klinikai jelentősége A vastagbél-daganatos megbetegedése sokkal inkább a fejlett, mint a fejlődő országokra jellemző. Világszerte vezető halálozási ok, mind a nőket és mind a férfiakat tekintve, a lakosságban egyre növekvő előfordulási gyakorisággal jellemezhető. A WHO adatai szerint évente több mint 945000 emberben alakul ki vastagbélrák, amely 492000 esetben halállal végződik [1]. Európai viszonylatban Magyarországon egyedülálló arányban növekedett ennek a betegségnek a gyakorisága, amelynek oka ma még nem tisztázott. Magyarországon évente 4200-4400 férfinél és 3700-3900 nőnél diagnosztizálnak vastagbél-daganatot, amellyel párhuzamosan 4700-4800 halálesetet regisztrálnak [2]. Igazolt, hogy a halálozások aránya

12

megfelelően alkalmazott szűrőmódszerekkel csökkenthető lenne. A legfőbb problémát ennek hiánya, és a késői felismerés jelenti [3]. A betegség megjelenése a 40. életévtől kezdődően folyamatosan, kb. 70 éves korig emelkedik.

Daganatos

elváltozás

a

vastagbél

bármelyik

szakaszán

kialakulhat.

Leggyakrabban, az esetek közel felében a rectum és a sigma érintett, míg a fennmaradó 25% 25% a proximális colonfélben valamint a colon transversumban és a descensdensben azonosított tumorok között oszlik meg [4]. 2.2.2. A vastagbélrákok csoportosítása klinikai szempontok alapján A vastagbél-daganatok jelenlegi klinikai beosztása a daganat mélységi terjedési szintjétől függ. A daganatterjedés mérhető szintjei: a hámalap, a muscularis propria, a submucosa, a subserosa, a nyirokcsomók, a csontvelő és a távoli szervek. Több beosztás is kialakult az elmúlt évtizedekben. A legelterjedtebb az Astler-Coller által módosított Dukes-féle kategorizálás, valamint a TNM (tumor, nyirokcsomó, metasztázis) rendszer [2]. 2.2.3. A vastagbélrákok kezelése A magas halálozási ráta fő oka, hogy az éveken át tünetmentesen fejlődő daganat nem, vagy nehezen észrevehető, így a diagnózis felállítására általában már csak előrehaladott állapotban kerül sor. Ekkor a gyógyulási esélyek jelentősen lecsökkennek a korai felismeréshez képest [3, 5]. A már kialakult tumor elsődleges kezeléseként a sebészeti eltávolítás alkalmazható, mely azonban döntően csak a korai stádiumú daganatoknál lehetséges. Előrehaladottabb állapotokban a tumor már érinti vagy át is töri a muscularis mucosa és a serosa rétegeket, és gyakran áttétek figyelhetők meg a környező nyirokcsomókban, súlyosabb esetekben a távoli szervekben is. Ez esetben a daganat további növekedése és terjedésének megakadályozására kemo - és radioterápia használatos. A klinikai adatok alapján a túlélés negatív korrelációban van a daganatos elfajulások azonosításáig eltelt idővel, így a jelenlegi halálozási arányon a daganatok kialakulásának megelőzése mellett a szűrőmódszerek fejlesztésével változtathatunk [2, 3]. 2.2.4. A vastagbélrákok felismerésének és korai felismerésének lehetőségei A daganatok modern molekuláris biológiai alapú módszerekkel történő kutatása során nagy hangsúlyt fektetnek a betegség molekuláris hátterének felderítésére és a korai felismerést célzó módszerek kifejlesztésére. Az emberiség régi vágya, hogy találjon olyan jelzőmolekulákat, vagyis tumormarkereket a vérben, amely alkalmasak lehetnek a daganatos betegségek szűrésére, korai felismerésére. A jelenleg klinikai gyakorlatban leggyakrabban az 13

AFP (hererák, májrák), a CA 125 (petefészek rák), a CA 19-9 (hasnyálmirigy rák, epehólyag rák), a CA 72-4 (gyomor rák, petefészek rák), a CA 15-3 (mellrák), a PSA (prosztata rák), a hCG (here rák, trofoblaszt rák), a NSE (tüdőrák (SCLC), neuroendokrin daganatok), a SCG Squamosus (pikkelyes) felhám rák, valamint a CYFRA 21-1 (tüdő rák, NSCLC) tumormarkerek használatosak [6-10]. Ilyen molekula a vastagbél-daganatok szűrésére használatos carcinoembryonalis antigén a CEA is, amely egy 180 kDa súlyú komplex intracelluláris glikoprotein [11]. A CEA az embrionális fejlődés során, mint sejtfelszíni antigén képződik a hasnyálmirigyben és az emésztőtraktusban ahonnan bekerül a vérkeringésbe. Termelődése felnőtt korban sem áll le teljesen, normális értéke 0-5 ng/ml között változhat. A CEA értéket, több tumortípus is megemelheti [12]. A hasnyálmirigyrákok döntő többségében, a tüdőrákok, a májrákok és a vastag- és végbélrákok kétharmadában, az emlőrákok, myelomák és a méhnyakrákok mintegy felében növekszik meg a szintje [13-15]. Azonban dohányosoknál, idült gyulladásban vagy májbetegségben szenvedőknél is megemelkedhet. Panasz nélkül a tumor-markerek emelkedése önmagukban nem utalnak rosszindulatú megbetegedésre, folyamatában jelentheti a rosszindulatú daganat kiújulását. Az álpozitív eredmények nagy gyakorisága miatt - 250 pozitív lelet mögött csak egy rosszindulatú daganatos betegség rejtőzik, leggyakrabban a hasnyálmirigy, a gyomor-bél traktus adenocarcinomája - mérése a már diagnosztizált betegség esetén a terápia és prognózis megítélésre alkalmas, más diagnosztikus módszerek eredményével összevetve. A vastagbélrákok 2/3-a CEA-termelő, a daganatok többsége esetében tehát a daganatsejtek pusztulásáról, vagy szaporodásáról értékes információt nyújthat, úgy a sebészi, mint a sugárvagy kemoterápiás kezelések sikerét illetően [16]. Carpelan-Holmstorm munkacsoportjának tanulmánya szerint, a CEA vastagbéldaganatok szürésére 90%-os specificitással 43-50%-os szenzitivitással jellemezhető [17]. A CEA, CA 19-9, CA 242, CA 72-4, TPA, TPS markerek együttes vizsgálatával ez az eredmény tovább javítható [18]. Sajnos azonban a vastag- és végbélrákok közel 1/3-a nem CEA-pozitív, ezért ezeknek a követése ilyen módon nem lehetséges. Azonban a kemoterápia alatt emelkedő CEAkoncentráció a hatástalan kezelést bizonyíthatja, amelyet érdemes még a klinikai tünetek megjelenése előtt megváltoztatni [12]. A klinikumban rutin szűrővizsgálatokként a székletből történő kémiai és immunhisztokémiai alapú széklet-vérmeghatározás (FOBT= fecal occult blood test) [19, 20], valamint az alacsony részvételi arányú (compliance-szű) endoszkópos vizsgálatok (recto-sigmoidoscopia és colonoscopia) használatosak [21, 22]. A teljesség kedvéért fontos megjegyezni, hogy a széklet-vértesztek legalább 10ml napi vérmennyiséget igényelnek, ugyanakkor a széklet 14

normális esetben is tartalmazhat vért, valamint a táplálék (vörös húsok, redukáló szerek) hatással lehet a tesztek eredményére, kimenetelére. Ezért nem meglepő, hogy a vér alapú tesztek nagyobb százalákban adnak fals eredményt, és pozitívitás esetén clonoscopia követi azt, ami ezáltal nem csak diagnosztikai, hanem terápiás eljárás is egyben [3]. Ezek a diagnosztikai módszerek alapvetően morfológiai jegyeken alapulnak, melyek által a bélfal makroszkópikus szerkezetéről és a székletben a betegség kapcsán előforduló vér jelenlétéről szerezhetünk információt. Azonban a többlépcsős folyamaton keresztül fejlődő vastagbél daganatokban bekövetkező komplex molekuláris események követése ezekkel a megközelítésekkel nem lehetséges. Így a diagnosztikai áttörést egy olyan egységesített és megbízható, molekuláris markereken alapuló szűrővizsgálat jelentené, amellyel lehetővé válna a még tünetmentes, makroszkópikusan ép bélfallal rendelkező, de sejtjeiben már valamilyen tumor kialakulásához vezető elváltozást hordozó egyének szűrése. Egy ilyen vizsgálattal nem csak nagyobb felbontású képet kaphatunk a beteg pillanatnyi állapotáról, hanem akár személyre szabott kezelést is biztosíthatunk számára, amely a betegség kimenetelét és a túlélés esélyeit alapvetően javíthatja. Jelenleg nincs megbízható és magas compliance-ű vizsgálati módszer a vastagbél tumorok korai felismerésére. Ezért fontos a vastagbél-daganatok modern molekulárisbiológiai módszerekkel történő kutatása egyrészt bio-

és

tumormarkereinek

azonosítása,

másrészt

a

betegség

kialakulásának

és

progressziójának molekuláris alapfolyamatainak felderítése és megértése érdekében.

2.3. A vastagbél anatómiája és szövettana A bélrendszer feladata a táplálék felvétele, az emészthető anyagok felszívása, valamint az emészthetetlen anyagok eltávolítása a szervezetből. A bélrendszer három részből áll: elő-, közép- és utóbélből. Az utóbélnek két szakasza van: a vastagbél és a végbél. A vastagbélben felszívás már nem történik, kivételt képeznek ez alól: a víz, az ásványi sók, és egyes gyógyszerek. Fő feladata a bélsár végleges formájának kialakítása, és a végbélbe történő továbbítása. A vastagbél anatómiailag a következő részekre osztható: vakbél (coecum), felszálló vastagbél (colon ascendens), haránt vastagbél (colon transversum), leszálló vastagbél (colon descendens), szigmabél (colon sigmoideum) [23]. A vastagbél metszeteken a bél 3 rétegre különíthető el (1. kép), ezen belül is a nyálkahártya rétege további részekre osztható:

15

A bél lumene

1. kép A vastagbél szövettani régiói (forrás: Röhlich Pál, Szövettan [23]) 1. tunica mucosa (nyálkahártya, a bél üreg felé eső legkülső réteg) o lamina epithelialis mucosa (hámréteg) o lamina propria mucosae (kötőszövetes réteg) o lamina muscularis mucosae (mirigyek mozgatásáért felelős izomszövet) 2. tunica submucosa (mucosa alatt található kötőszövetes réteg) 3. tunica muscularis (körkörös hosszanti izomréteg a bél perisztaltikus mozgatásáért felelős) 2.3.1. A hámréteg (lamina epithelialis) szövettana A vastagbél nyálkahártya jellegzetes felépítésű, benne csöves mirigyek találhatók, amelyek kesztyűujj-szerűen a lamina propria rétegbe nyomódnak. Ezeket a mirigyeket Liberkühnkriptáknak hívjuk. A vastagbél felszínét, - beleértve a mirigyek felszínét is - hengerhámsejtek és kehelysejtek borítják, valamint a Lieberkühn-kripták alsó részén ezeknél jóval kisebb számban található differenciálatlan sejtek alkotják, amelyek nagy osztódási kapacitásuk révén pótolják a hámréteg elpusztult sejtjeit. A hengerhámsejtek jellemzően magas, keskeny, felülről nézve hatszögletes hasábokat alkotnak, közöttük szoros kapcsolat alakul ki. Az ép hámrétegben az egymás mellett lévő hengerhámsejtek magja egy vonalban (és egy sejtmagsorban) helyezkedik el. A több sejtmagsor a malignus transzformáció jele, ugyanakkor nem szabad megfeledkeznünk a metszeti sík által okozott sejtmagtorlódásról sem. A sejtmag lehet kerek, vagy ovális, ez utóbbi esetben a sejtmag hossztengelye a sejtével azonos. A kehelysejtek nevüket jellegzetes alakjukról kapták, melyek bél lumen felé eső része rutin hematoxilin-eozin festéssel nem vagy 16

alig festődik. Mivel a kehelysejtek nyákot termelnek speciális nyákfetéssel tartalmuk feltüntethető. A nyák feladata a bélsár, illetve a bélfal síkosítása, a bélműködés (passage) elősegítése. Az alapi részen található a sejtmag mely fölötti citoplazmában jelentős mennyiségű durva szemcsés endoplazmatikus retikulum, mitokondrium és jól fejlett Golgiapparátus található. Az endoplazmatikus retikulum és a Golgi- apparátus a fokozott váladéktermeléshez, a mitokondriumok pedig a fokozott energiatermeléshez szükségesek. A mirigyek alapi részén differenciálatlan, alacsony hengerhámsejtek helyezkednek el, melyek nagyrésze erősen proliferál, kisebb részük őssejt tulajdonságokkal rendelkezik. A proliferációval keletkező új sejtek a bél lumene felé vándorolva differenciálódnak, pótolva az elpusztult hám-, és kehelysejteket. Normális körülmények között az osztódó sejtek a kripták alsó egyharmadára korlátozódnak. Érésük során a kripták lumináris felszíne felé vándorolnak, ahol érett, abszorpciós, hám és kehely sejtekké differenciálódnak majd leválnak (2. kép). Normális körülmények között a sejtosztódás, migráció és sejtpusztulás, vagyis a keletkező és nyálkahártyáról leváló és elhaló

2. kép Biopsziás szövetmintában a vastagbél nyálkahártya Ki67 immunfluorezscens festéssel pozitív osztódó sejtjei (rodamin - piros), ill. a sejtmagok DNS fragmentációját jelző TUNEL teszt-el pozitív (fluoreszcein izotiocianát - zöld) apoptotikus sejtjei láthatók. A kripták alapi részén aktív mitotikus, felszíní részén apoptotikus sejtek láthatók. A képen egy ép nyálkahártya, vagyis az osztódó és apoptotikus sejtek egyensúlya látható.

17

sejtek egyensúlyban vannak. Ha ez az egyensúly a sejtosztódás javára felborul, akkor szabad szemmel is látható kitüremkedések, (ún.) polipok képződnek a nyálkahártya felületén [23]. Az ilyen

szövetszaporulatok

malignus

transzformációja

vastagbéldaganatok

kialakulását

okozhatja [24]. 2.3.2. A kötőszövetes réteg (lamina propria mucosae) szövettana A hámréteg (lamina epithelialis) alatt található a lamina propria, amely egy sejtekben gazdag laza rostos kötőszövet. A lamina propriát a lamina muscularis mucosae simaizom rétege zárja el a submucosa rétegétől. A lamina propriába beüremkedő Lieberkühn-krypták kripták körül fibroblasztokból álló hüvely (pericryptalis fibroblaszt régió) látható, amelyek rácsrostokat (III. típusú

kollagénrostokat)

termelnek.

A

lamina

propria

nagy

mennyiségű

gyulladásos/immunsejtet tartalmaz, így (1) a korai nemspecifikus antibakteriális védekezésért felelős szegmentált magvú granulocytákat (2) a fagocitózisra és részben antigén közvetítésre specializálódott makrofágokat, (3) az antigénspecifikus humorális immunválaszért felelős B lymphocytákat (kis, kerek magvú sejtek) és az immunglobulint termelő (4) plazma sejteket (excentrikus magvú sejtek), a sejtes antigénspecifikus immunválaszért felelős T lymphocytákat. A lamina propria nyiroksejtjei diffúzan vagy nyiroktüszőkbe (follikulusok) rendeződve is megfigyelhetők. A nyiroktüszők (lymphoid aggregátumok), ovális alakú képletek,

amelyek

follikuláris

dendritikus

sejtek

hálózatába

ágyazott

aktivált

és

differenciálódó B-lymphocyták halmazaiból, hisztiocitákból (makrofág) és T sejtekből állnak. A lamina propria rétegben kötőszöveti sejtek hálózata fibroblasztok/fibrociták, valamint endothel- és fibroblasztokból módosult simaizomsejtek miofibroblasztok is megtalálhatók [23].

2.4. A vastagbélrák kialakulásának molekuláris háttere Számos gén olyan hibáját, mutációját azonosították már, melyek bizonyítottan szerepet játszanak a vastagbélrák kialakulásában és fejlődésében. Ezeket a géneket három fő csoportba sorolhatjuk: onkogének, tumorszuppresszor gének, valamint a mismatch repair (MMR) gének [25]. 2.4.1. Onkogének és a rendellenes sejtosztódás A proliferációt elősegítő legfontosabb géncsalád a protoonkogének családja, amely tagjainak működése a normális sejtekben is nélkülözhetetlen. Azonban domináns mutációik segítségével kialakulhatnak onkogén formáik, amelyek szabályozatlan sejtosztódást indukálva elősegítik a daganatok kialakulását [26]. 18

2.4.1.1 A legismertebb onkogén a K-ras A K-ras mutációt a 12-es kromoszóma rövid karján találták, és leginkább a 12. a 13. és a 61. kodonokat érintik, melyek a p21 fehérje aberráns működését okozzák. A fehérje GTP-áz aktivitása megváltozik, ezáltal a GTP-t meg tudja ugyan kötni, de nem tud inaktiválódni, ezáltal folyamatos proliferációs szignált biztosítva a korlátlan osztódáshoz [4, 27]. Egy tanulmányban azt vizsgálták, hogy milyen kapcsolat áll fenn a különböző pontmutációk és a vastagbélrák stádiumai között. A vizsgálat során összefüggéseket azonosítottak a vastagbél klinikai stádiumai, valamint a báziscserék típusai között. Azt találták, hogy G  A mutáció főleg Dukes B, G  T mutáció legtöbbször Dukes C, G  C mutáció pedig csak és kizárólag Dukes C tumorban találtak. A G T és G  C átalakulás kapcsolatban van az áttétek megjelenésével, a G  A módosulás azonban nem mutatott ilyen eredményeket [28]. 2.4.1.2. Erb-B2 (Her-2/neu) Az erb-B2 protoonkogén egy membrán-asszociált receptor tirozin kináz, melynek mutációja fokozott aktivitáshoz vezet, ami szintén fokozott sejtproliferációt okoz. A megváltozott hatásmechanizmusú c-Erb-B2 jelenlétét először mellrákban mutatták ki, majd később immunhisztokémiai (IHC) módszerrel a colorectalis daganatokban is sikerült azonosítani fokozott aktivitást [13]. 2.4.1.3. EGFR, molekuláris öngerjesztő folyamat Az EGFR (epidermális növekedési faktor receptor) is egy tirozin kináz aktivitással rendelkező receptor, ami több jelátviteli útvonalban játszik fontos szerepet. Hibás működését azonosították vastagbél-daganatos betegekben [29, 30]. 2.4.2. Tumorszuppresszor gének jellemzése a daganat kialakulás során Azokat a géneket, amelyek a tumorok kialakulása ellen hatnak tumorszuppresszoroknak nevezzük. Ilyen gének pl. az apoptotikus és a proliferáció gátlásában szerepet játszó gének. A szuppresszor gének legfontosabb tulajdonsága az, hogy mindkét alléljának sérülése és funkciójának megszűnése szükséges a szabályozási folyamatok zavarához (recesszív mutáció). Az első génhiba szinte mindig az egyik allél pontmutációja, a másik allél elvesztése többféleképpen is történhet: az allélt tartalmazó kromoszóma szakasz deléciójával; a mutáns allélt hordozó kromoszóma megkettőződésével, ugyanakkor a normális kromoszóma elvesztésével. Ezek a hibák a heterozigótaság elvesztéséhez vezetnek (LOH – loss of heterozigosity). Kimutatásuk restrikciós fragmentumok hosszának polimorfizmusával (RFLP) történhet [4].

19

2.4.2.1. A p53 fehérje, mint a genom őre A p53 fehérje központi szerepet játszik a sejtciklus szabályozásban, a DNS hibák javításában, a replikációban és a programozott sejthalál elindításában. Az örökítőanyag károsodása esetén azonnal leállítja a sejtosztódást azzal, hogy DNS javító mechanizmusokat stimulál, súlyosabb esetben apoptózist indukál [31]. A legtöbbször érintett gén a humán szolid tumorok esetében. A 17p13.1 kromoszóma régióban bekövetkezett mutációja vagy allél vesztése nagy valószínűséggel carcinogenezishez vezet. A sporadikus vastagbéltumorok több mint 75%ában találták ennek a génnek az inaktivációját, és kimutatták, hogy a mutáció kedvezőtlen túlélési esélyekkel párosul [4, 26]. A gén feladata, hogy integrálja a sejtet érő stresszhatásokat és olyan válaszreakciókat indítson, amely (többek között) apoptózist indukálnak. Gyakorlatilag egy olyan transzkripciós faktor, amely a DNS egy speciális szekvenciájához köt és ezzel számos proapoptotikus gén átíródását szabályozza. A programozott sejthalált végrehajtó mechanizmusok komponenseire (APAF-1, kaszpáz-3) az expressziós szintjük növelésével hat. Továbbá olyan túlélő útvonalak működését kapcsolja ki, amelyek az apoptózist hatástalanítják, mint pl. a PI3 kináz/AKT túlélő útvonal. A p53 gén továbbá képes a sejtciklus leállításra, DNS reparációra, öregedés szabályozására, valamint az apoptózisra [31-33]. Funkció vesztését gyakran a DNS-kötő domain missense mutációja vagy sejt-, esetleg virális- fehérjék interakciója eredményezi. Az egészséges sejtekben a p53 rövid fél élet-idővel rendelkezik, ezzel szemben a mutáns változat rezisztens az mdm-2-ubiquitin közvetített proteolízisre, következésképpen a p53 fehérje felhalmozódik a sejtben. Ez a tulajdonság segített abban, hogy a mutálódott p53 gén fehérjéjét indirekt módon, immunhisztokémiás módszerrel kimutassák. A különböző vizsgálatok szerint a p53 gén megváltozást illetve 17p kromoszóma allélvesztését az adenomák 4-26%-ában, adenomás polipok 50%-ban és az adenocarcinomák 50-75%-ban észelték [4, 31]. A fentiek alapján elmondható, hogy a p53 fehérje mutációja következtében kialakuló funkcióvesztés, fontos szerepet játszik az adenoma- carcinoma átmenetben [34]. A diagnosztikában a p53 állapotának a mutáció túlélési aránnyal, valamint kezelési módszerrel való kapcsolatának felmérése elsősorban IHC immunhisztokémiai vagy DNS konformációváltozáson alapuló SSCP (single-strand conformational polymorphism) vizsgálatokkal, valamint szekvenálással történik [2, 35]. 2.4.2.2. A DCC gén 1989-ben azonosítottak egy gént a 18-as kromoszóma hosszú karján, melyet DCC (deleted in colorectal carcinoma) néven kereszteltek el. A DCC gén feladata egy olyan fehérje kódolása, 20

melynek szabályozási szerepe van a sejt-mátrix és sejt-sejt interakciókban, és bebizonyították, hogy szerepe van apoptotikus folyamatok beindításában. Ha bekövetkezik a mutáció, akkor a kromoszómának ez a része inaktívvá válik, kiesik, heterozigótaság vesztés (LOH) következik be, és így a DCC már nem képes ellátni eredeti funkcióját. A hibásan működő sejtekben az apoptózis elmarad, így a génhibákkal terhelt sejtek életben maradhatnak, elősegítve ezzel a tumorok kialakulását. Kutatások során sikerült kimutatni, hogy ennek a génnek a mutációja a vastagbél-daganatok 70%-ában jelen van[13, 26, 28]. 2.4.2.3. Az adenomatous polyposis coli génje Az 5q21 kromoszómán elhelyezkedő APC gén mutációja az első megváltozás, amely az adenoma kialakulása során megjelenik, ezért a szakirodalomban a „gate-keeper” elnevezést kapta. A vastagbélrákos betegek 40-80%-ában figyelték meg az APC gén mutációját vagy az 5q kromoszóma allélvesztését, ami az adenomás betegeknél is hasonló tendenciát mutatott. A gén terméke egy viszonylag nagy 312 KDa méretű fehérje, amely 2843 aminosavból épül fel [34]. A vastagbél homeosztázisában jelentős szerepe van, egyensúlyt tart a sejtosztódás és az apoptózis között. Funkció vesztése esetén ez az egyensúly a sejtproliferáció irányába tolódik el. Egy multifunkcionális fehérje, amely számos alegységből áll, így további fehérjékkel képes kapcsolatba kerülni, mint pl: β-catenin, glikogén-szintáz kináz (GSK) 3β. Alapvető jelentősége a WNT-jelátviteli útvonalban nyilvánul meg [36]. A daganatok kialakulásával kapcsolatban legfontosabb feladata, hogy szabályozni tudja a β-catenin intracelluláris szintjét ami a szignáltranszdukciós folyamatokért és sejtosztódásért felelős fehérje. Az APC komplexet alkot vele és a GSK-3β-val mely így az ubiquitin-proteoszóma útvonalon keresztül a fehérje további lebomlásához vezet. Tehát az APC közvetetten befolyásolja a sejtosztódást azáltal, hogy gátolja a β-catenin fehérjét. Az APC fehérje mutációja esetén a β-catenin felhalmozódik a sejtben. Fontossága abban áll, hogy képes kötődni a transzkripciós faktorok egyik családjához az úgynevezett T-sejt faktorhoz (TCF) és olyan specifikus gének expresszióját indukálja, amelyek a sejtosztódásban kapnak szerepet. A megnövekedett βcatenin –TCF mediált transzkripciót kimutatták olyan tumorokban, melyekben az APC és a βcatenin mutálódott. A sejtosztódás szabályozása mellett az APC génnek szerepe van még a sejtadhézióban, migrációban és a mitózis közben fellépő kromoszóma szétválásban. Öröklött (germline) mutációja felelős a familiáris adenomatous polyposis (FAP) szindróma kialakulásáért. Ez a betegség dominánsan öröklődik, az érintettek vastagbelében több 100 vagy 1000 adenomás polip alakul ki [37, 38].

21

2.4.3. Mismatch repair gének és a mikroszatellita instabilitás A mismatch repair (MMR) gének a genom stabilitásáért felelősek, a replikáció során történt DNS-hibák kijavításába játszanak szerepet. A legfontosabb MMR gének a hMLH1, hMSH2, hMSH3, hPMS1, hPMS2 és a hMSH6. Ezekben a génekben bekövetkező mutáció abnormális szekvencia kialakulását okozza a DNS bizonyos szakaszain, amiket mikroszatellitáknak hívunk. A mikroszatelliták ismétlődő nukleotid bázisok (2-5bp) egy rövid (20-60bp) szekvenciája, melyek véletlenszerűen helyezkednek el a genomban. Ha az MMR génekben mutáció alakul ki, mikroszatellita instabilitásról (MSI) beszélhetünk. Az MSI-t leggyakrabban a herediter nem polyposus coloncarcinoma (HNPCC) esetében mutatták ki, melyet bizonyos MMR gének csírasejtes mutációja kísér. Az MSI tumoroknak két típusát különböztethetjük, meg, az egyiket kis instabilitási gyakoriság (MSI-L) a másikat magas instabilitási gyakoriság (MSI-H) jellemzi attól függően, hogy a markerek hány százaléka mutat instabilitást [26].

2.5. A DNS metiláció szerepe a daganat kialakulása és fejlődése során A tumorprogresszió egy többlépcsős folyamat, amely során a daganatsejtek genetikai és epigenetikai változások akkumulációja során transzformálódnak [24, 26, 39, 40]. Az előzőekben bemutattam azokat a főbb géneket, amelyeknek hibás működése kapcsolatban állhat a vastagbél-daganatok kialakulásával. Azonban léteznek további molekuláris folyamatok és sejtbiológiai események is, amelyek elősegítik a tumorok kialakulását. Ilyen folyamat lehet a DNS metiláció, mint epigenetikai esemény, ami egy olyan DNS-t érintő, öröklődő módosulás, amely során a leggyakrabban a citozin pirimidin gyűrűjének 5-ös pozícióban lévő szén atomjához metil csoport kapcsolódik, de maga a szekvencia változatlan marad. A folyamatot a DNS-metiltranszferáz családba tartozó enzimek (DNMT1, DNMT3a, DNMT3b) katalizálják, ahol metil-donor az S-adenozil-metionin (AdoMet) [41, 42]. A metiláció célpontjai a CpG dinukleotidok, amelyek a genomban elszórtan, illetve egy-egy pozícióban sűrűbben helyezkednek el. Azokat a szekvencia részleteket, amelyekben ezeknek a dinukleotidok aránya legalább 60%, CpG szigeteknek nevezzük [43]. Ezek a 0,5-5 kilobázis hosszúságú szakaszok megtalálhatóak a humán gének körülbelül felében, gyakran a transzkripciós faktorok által felismert 5’ promóter régióiban, ezáltal közvetlenül szerepet játszva a transzkripciós szabályozásában [43, 44], de fellelhetők intergénikus régiókban és intronikus szekvenciákban is. A metil csoport kapcsolódása egyrészt a transzkripciós faktorok bekötődését fizikailag akadályozza, másrészt lehetővé teszi az ún. metil-CpG-kötő domainnel rendelkező fehérjék (pl. MBD1-3, MeCP2) kapcsolódását a metilált DNS-hez, melyek további fehérjék toborzásával szintén gátló hatással lesznek az átírásra [45, 46]. Emellett a különböző 22

fehérjék kapcsolódása miatt a kromatinstruktúra is átrendeződik, a laza szerkezetű eukromatin helyett tömörebb, heterokromatikus struktúrát mutat [47]. A kapcsolódó MeCP2 a benne található transzkripció-represszáló eleme (TRD – Transcription Repression Domain) által komplexet képez a hiszton-deacetilázokkal (HDAC), amely a hisztonok deacetilációja által transzkripciós aktivitás csökkenést eredményez, azonban erre a MeCP2 önmagában is képes. A MeCP2 továbbá szerepet játszik az X kromoszóma inaktivációban, ahol a sejtben található két X kromoszóma közül csak az egyik maradhat aktív [44]. A metilációs szabályzó rendszer alapvető fontosságú a magasabbrendű szervezetekben. Szerepet játszik az egyedfejlődésben, ahol kezdetben minden CpG sziget demetilált, majd az az embriogenezis blastula stádiumában egy intenziv remetiláció alatt, az ún. de novo metilációs folyamattal kialakul az egyes sejtekre illetve szövettípusokra specifikus metilációs mintázat, melynek fenntartásáért az ún. fenntartó metiláció felelős [42]. Normál, fiziológiás állapotban a genomban előforduló CpG szakaszok demetiláltak maradnak, így nem vesznek részt a génműködés szabályzásában. Azok a különálló CpG dinukleotidok, melyek egy gén promóter régiójában lokalizáltak és hordozzák szövetspecifikus metilációs mintázatot demetilálódhatnak, így fokozhatják az adott gén kifejeződését. Ezután az így aktivált gének funkcióitól függően változhat meg az adott sejt sorsa. Amennyiben protoonkogének is felszabadulnak a metilációs gátlás alól, úgy daganatképződést inicializálhatnak [48, 49]. Életünk során, a kor előrehaladtával az ilyen módon megváltozott, aberráns, az eredetitől eltérő szövetspecifikus metilációs mintázat kialakulásának gyakorisága a megfigyelések alapján egyre magasabb [50]. Az ilyen korfüggő metilációs változások alapvetően kétféle módon hatnak: egyrészt az életkor előrehaladtával a teljes genom hipometiláció növekedése és másrészt az ezzel párhuzamosan zajló génspecifikus, lokális hipermetiláció jellemző, mely a mechanizmusok szintjén tehát a fenntartó metiláció csökkenésével, valamint a de novo metiláció túlműködésével magyarázható. A globális hipometiláció genomiális instabilitást eredményez és igazoltan növeli a mutációs rátát is [51], míg a promóter régiókban elhelyezkedő CpG szigetek hipermetilációja meghatározott gének transzkripciós aktivitását eredményezi. A szabályzott géneket mindezek alapján csoportosíthatjuk: azokat, melyek az idő előrehaladtával párhuzamosan hipometilálódnak A-típusú (age-related, pl. ER [52], MYOD [53]) géneknek nevezzük, míg a daganatspecifikus metilációt mutató géneket C-típusú (cancer-related, pl. p16(INK4A) [54], MLH1 [55], TIMP3) csoportba soroljuk.

23

Ezek szerint az idő múlásával bizonyos génjeink egyre nagyobb eséllyel kerülhetnek metilációs csendesítés alá, míg mások felszabadulhatnak a transzkripciós gátlás alól. Az ilyen aberráns metilációs mintázatok kialakulásával egyre jobban ki vagyunk téve a felülexpresszálódó onkogéneknek, illetve a leszabályozódó tumorszupresszorok egyre kevésbé tudják gátolni a sejtosztódást. Így a sejtenként akkumulálódó epigenetikai változások nagy valószínűséggel vezetnek kontrollálatlan, daganatos sejtproliferációhoz. Emiatt a tumorszupresszor gének metilációs szabályozása intenzív kutatási területté vált, az idő során szerepüket számos daganatos megbetegedésben vizsgálták [54, 56]. A környezeti hatások illetve az élvezeti szerek is bizonyítottan aberráns metilációt eredményeznek. Ilyen lehet az alkoholfogyasztás [57, 58], a dohányzás [59], illetve egyéb carcinogének [60, 61]. A fenti jelenségek vastagbéldaganatok vizsgálatai során is igazolódtak, a carcinogenezis progresszív

folyamatával

párhuzamosan

felhalmozódó

genetikai

mutációk

mellett

kimutathatóak az aberráns DNS metilációból fakadó génexpressziós változások is [50, 62-64]. Az A-típusú, korfüggő metiláció a vastagbél nyálkahártyában már ép állapotban is kimutatható [53, 65], míg a C-típusú metiláció kizárólag a tumoros sejtekre jellemző. Ezek alapján csoportosíthatjuk a vastagbéldaganatokat, ahol utóbbiakat CIMP (CpG island methylator phenotype) pozitívoknak tekinthetjük [40, 66, 67]. Mivel a daganatspecifikus metiláció a carcinogenezis korai lépéseiben is jellemzően az érintett, az adott daganattípusra jellemző gének kifejeződésének csökkenéséhez vezet, potenciális biomarkernek tekinthető [58, 68-70]. 2.5.1. DNS metiláció vastagbél-daganatokban A DNS bázisainak hipermetilációja a daganatokban kétféleképpen alakulhat. Beszélhetünk globális hipermetilációról, mely kapcsolatban állhat az MSI-vel, és a CpG-szigetek hipermetilációjáról. A CpG-szigetek a DNS olyan részei, melyekben sok a citozin-guanin dinukleotid szekvencia. Ha ezeken a területeken a metiláció programja megváltozik, a gének nem a szabályozásnak megfelelően íródnak át, vagy egyáltalán nem működnek. Toyota és mtsai által kifejlesztet MCA (metilált CpG-szigetek amplifikációja) technika segítségével jól nyomon követhető a CpG-szigetek metilációja [41]. Ennek a segítségével 33 CpG-szigetet és 6 gént sikerült azonosítani, melyek daganatokban hipermetilálódnak. Kimutatták azt is, hogy a hipermetiláció nem csak a vastagbéldaganatban, hanem az emlő-, prosztata- és húgyhólyagrák kialakulásában is szerepet játszik [71].

24

2.6. Az apoptózis zavarai Az apoptózis, vagy programozott sejthalál elengedhetetlen a szervezet normális működéséhez, ami különböző sejtfolyamatok összehangolt működéséből áll. Minden sejt rendelkezik olyan fehérjékkel, amelyek a sejtmag kondenzációját, majd végül sejthalált okoznak gyulladást okozó reakció nélkül. A bcl-2 protoonkogén által kódolt fehérje stabilizálja a mitokondriális membránokat az apoptotikus folyamatok ellenében, amelyek a membrán potenciál megszűntetésére és a membrán tönkretételére törekednek. Ha ez a fehérje túl nagy mennyiségben termelődik, megvédi a sejteket az apoptózistól, és a tumoros sejtek nem fognak elpusztulni [13, 31].

2.7. A vastagbélrák kialakulásának folyamata és molekuláris csoportosítási lehetőségei A molekuláris patológiai csoportosítás alapja a kromoszómális vagy a mikroszatellita instabilitás, illetve a CpG sziget metilátor fenotípus megléte vagy hiánya. A mikroszatellita instabilitás bizonyos DNS hibajavító enzimek funkciójának (mismatch repair, MMR) károsodása (mutáció vagy metilació) következtében előforduló jelenség, melynek során genom átrendeződés következtében gének, miRNS-ek aktiválódhatnak és inaktiválódhatnak [72-74]. A mutációk számának növelésével tumorszuppresszor gének inaktivációja történhet (IGF2R, BAX) [75-77]. A megváltozott metilációs státusz is fontos szerepet játszik a vastagbélrák kialakulásában és a genomiális instabilitással is összefüggésbe hozható. A daganatos sejtekben levő gének kódoló régiójának 5’ promóter régióiban a hipermetiláció jellemző, ezzel előidézve bizonyos gének, esetleg tumorszuppresszorok (p16, RB1, Ecadherin) inaktivációját. Az adenoma - carcinoma szekvencia során kromoszómális instabilitás, aneuploidia kialakulása figyelhető meg. Első lépésben az APC gén mutációjának következtében a normál epitéliumból diszplasztikusan aberráns kripták, majd kezdeti adenoma alakul ki [24, 34, 78]. Ezt követi a K-Ras gén mutációja, ami átmeneti adenoma kialakulásához vezet. Az átmeneti adenomákból a DCC gén, valamint az MMR gének germline mutációjával kései adenoma alakul ki. A folyamat a p53 gén mutációjával folytatódik, és vezet a carcinoma kialakulásához [79, 80]. A fenti folyamatot a 1. ábra szemlélteti.

25

2.8. Adenoma-carcinoma átmenet Az egyik legfontosabb alapvető fogalom, amely a vastagbélrákkal kapcsolatban felmerül manapság, az adenoma-carcinoma átmenet (1. ábra). Ez a fogalom lépésről-lépésre definiálja, hogy hogyan alakul az egészséges sejt a diszpláziás epitheliumon át a carcinomáig és hogy mindez hogyan áll kapcsolatban az összetett genetikai változásokkal [78].

1. ábra A vastagbél-daganat kialakulásának egyik lehetséges modellje, amely a daganatkialakulást az adenoma-dysplasia-carcinoma átalakulás során mutatja be. (Forrás: Tulassay Z., A Vastagbéldaganatok megelőzése és kezelése [2]) Köztudott, hogy adenomás polipok (adenomák) eltávolítása után a betegek 30-35%-ánál 3-4 éven belül újabb adenomákat találnak, ami szükségessé teszi a további endoszkópos megfigyeléseket. A nyugati országok lakosainak körülbelül 40%-ánál fejlődnek ki adenomák, de csak 3%-nál alakul ki a vastagbélrák. Világos, hogy az adenomák csak egy kis csoportja alakul tovább rosszindulatú daganattá. Sajnos nincs megbízható jellemvonása, tulajdonsága, amellyel előre jelezhetnénk az adenoma átalakulását vagy kiújulását. Az adenoma-carcinoma átalakulás nem direkt módon történik, számos indirekt bizonyítékkal alátámasztható klinikai, patológiai és genetikai tanulmányokkal [24, 34, 81]. 26

Megkülönböztetünk hyperplasticus polipokat és jóindulatú neoplastycus-okat (neoplasy-ákat). A polipok 90%-a hiperpláziás, azaz 1-5mm átmérőjű, különálló, csepp alakú kitüremkedések. Ebben az esetben a sejt megújulási ciklusa szenved zavart, többlet sejt termelés indukálódik (neoplasya). A fejlődés során széles kitüremkedés figyelhető meg a sejtosztódási zónában, de a goblet és abszorpciós sejtekké történő differenciációban nem történik zavar. Ezek a rendkívül közönséges és kicsi sérülések a jellegzetességeik alapján mikroszkóppal is jól azonosíthatóak és diagnosztizálhatóak [4, 82]. A hétköznapokban kialakuló sejtburjánzások csak 10%-a jóindulatú neoplasya, adenoma. Ezek általában minden méretben és alakban előfordulhatnak. Burjánzó külsőjük miatt szokták őket nyélen ülő vagy nyeles polipoknak esetleg szesszilis (szemölcsös vagy villusos) adenomáknak hívni, bár átmeneti variációk szintén előfordulhatnak. Ezeket a sejteket jóindulatúként tartjuk számon és nem invazívak. Ellenben mégis daganatok, de figyelmen kívül hagyva a burjánzó formájukat, sejttanilag a neoplasya jegyeit viselik. Attól függetlenül, hogy nyélen ülő vagy szesszilis típusról beszélünk, mindkét esetben a sejtmegújulási folyamat szenved komoly zavart, a sejtosztódás (mitózis) szabályozatlanul zajlik, ami az adenomás szövetek minden szintjén megfigyelhető. A sejt differenciáció sem teljes, amely a korlátlan sejtosztódással együtt a neoplasya két legfontosabb karaktere [4, 25, 82].

2.9.

Colorectalis

daganatok

molekuláris

klasszifikációjának

eddigi

eredményei Az elmúlt években több száz, vagy ezer sejtalkotó párhuzamos vizsgálatára alkalmas ún. array technikák jelentek meg, először mRNS expresszió, majd SNP és DNS metiláció, és végül fehérje szinten történő változások kimutatására [83, 84]. A teljes genom vizsgálati módszerek lehetőséget adtak újfajta molekuláris expressziós mintázaton alapuló vastagbélrák csoportosítás létrehozására [43, 49, 51, 65, 85, 86]. A mintázatok diagnosztikai alkalmazása is felmerül [85-87] munkacsoportunk korábbi eredményei alapján [85, 88, 89]. Jelentős különbségeket sikerült azonosítani jobb és bal oldali daganatok között, amelyből származó mintázat alapján egyértelműen elkülöníthető a két csoport. Olyan géneket sikerült így azonosítani, mint a RAD52 és UBL1 amelyek, a DNS javító mechanizmusban vesznek részt. Ez az eredmény erősíti azt a megfigyelést, hogy a jobb oldali daganatok esetében gyakoribbak az MSI tumorok. Negyvenöt daganatos mintát megvizsgálva 58 expressziós különbséget mutató gént azonosítottak jobb és bal oldali daganatok között. Azt találták, hogy a Kreatin 8, 19 és 20 valamint a Carbon anhydrase II, IV és VI a bal oldali tumorokban 27

alulreguláltak a míg a teratocarcinoma growth factor és a cyclooxygenase 2 a bal oldali tumorokban felülexpresszáltak [20,[90]. A daganatos progresszió, vagyis a tumor metasztatizáló képességének megítélésére huszonkét tumoros szövetet vizsgált meg Bertucci munkacsoportja. A metasztatizáló és nem metasztatizáló daganatok között 224 génben találtak szignifikáns eltérést [91]. A daganat kialakuláshoz vezető molekuláris elváltozások felderítésére array módszerek alkalmazásával fehérje szinten is van lehetőség [87]. Az elmúlt években a hagyományos MS és 2-D ELFO eljárások mellett a protein chipek (antitesteket tartalmazó array a szöveti lizátumban levő fehérje markerek kimutatására) is elérhetővé váltak. Ez a technológia nem csupán kvalitatív expressziós mintázatokat eredményez, hanem a konkrét fehérje mennyiségének meghatározására is alkalmas lehet. A fehérje chipek további előnye, hogy a két klasszikus proteomikai technológiánál egyszerűbb minta előkészítést igényel. A protein és mRNS expressziós chipek közötti korreláció tekintetében az irodalmi adatok nem egyértelműek, még sejtkultúra vizsgálatok szintjén sem. Élesztőben fehérje és mRNS profilok között nem sikerült egyértelmű összefüggéseket azonosítani [92]. Ennek oka lehet, hogy a transzkripció és a transzláció közötti időbeli eltolódás, mRNS processing, valamint a féléletidő és degradáció befolyásolhatja az eredményeket. Szöveti, humán mintákban ilyen eredmények nem ismertek. Mansilla és munkatársai microarray vizsgálatokkal 168 tumoros minta RNS expressziós profiljának (microarray profiling) vizsgálata során azt találták, hogy az LPACT1 gén az adenocarcinomák 94%-ában a normál mukózához képest fokozott expressziót mutat [93]. Ugyanez a kutatócsoport azt találta, hogy a DHHC9 gén MSI vastagél-daganatokban kétszeres expressziós növekedést mutat [94].

2.10. Colorectalis daganatok mRNS és fehérje szintű összefüggései A daganat kialakuláshoz vezető molekuláris elváltozások felderítése mind mRNS, mind fehérje szinten több módszerrel elvégezhető, azonban az ezek közötti összefüggések nem ismertek. A technológiai platformok közötti átjárhatóság jelentős gátat szab az eredmények összevetésének. Az elmúlt években a hagyományos MS és 2-D ELFO eljárások mellett a protein chipek jelentősége megnőtt [87]. Ez a technológia nem csupán kvalitatív expressziós mintázatokat eredményez, hanem a konkrét fehérje mennyiségének meghatározására is alkalmas lehet. További előnye a fehérje chipeknek, hogy a két klasszikus proteomikai technológiánál egyszerűbb minta előkészítést igényel. Azáltal, hogy lehetőség nyílt array

28

módszerek

alkalmazására

ugyanabból

a

mintából

az

mRNS

és

fehérje

szintek

meghatározására, közelebb juthatunk az összefüggések felderítéséhez [95]. 2.10.1. mRNS és fehérje szint közötti összefüggéseket célzó vizsgálatok Napjainkig igen kevés olyan vizsgálat készült, amely az mRNS és a fehérje közötti összefüggéseket tanulmányozza. Eddigi adatok alapján csak microarray technológia felhasználásával ugyanabból a mintából az RNS és fehérje szint közötti összefüggés feltárására még nem történt meg. Ez különösen tumoros mintákban lehet nagyon fontos kérdés. Néhány adat már rendelkezésünkre áll fehérje szintű MS, bead-array, ELISA vizsgálatokkal párhuzamosan készített transzkriptum profil összehasonlításából. 1200 fehérje és transzkriptum vizsgálatakor 32%-os pozitív korrelációt írtak le [96].

2.11. A kemoprevenció lehetőségei vastagbél-daganatokban A vastagbéldaganat (CRC) az egyik leggyakrabban előforduló rákos megbetegedés, amelyre magas mortalitás jellemző még a sebészeti eltávolítások, a radio- és kemoterápiás kezelések után/ellenére is [97]. Mára már egyértelművé vált, hogy a CRC adenomatózus polipokból fejlődik [34]. Számos tanulmány sugallja a nem-szteroid gyulladáscsökkentő gyógyszerek (NSAID), mint például a szelektív ciklooxigenáz (COX-2) inhibitorok antineoplasztikus hatását [98-100]. A ciklooxigenáz-2 az arachidonsav metabolizmus és a prosztaglandin bioszintézis egyik kulcsenzime, bizonyítottan szerepet játszik a colorectális carcinogenezis folyamatában. Az ép vastagbél nyálkahártyához képest a vastagbél tumorok mintegy 85%ában mutatható ki a COX-2 fokozott működése, amely az adenomák 50%-ára szintén jellemző [101]. A ciklooxigenáz-2 számos tumor-asszociált biológiai útvonalon keresztül aktiválódhat, mint amilyen a például a Wnt- és Ras- jelátviteli útvonalak [102]. Pre-klinikai vizsgálatok szerint a colorectális adenomák szelektív COX-2 gátlásán alapuló kezelése hozzájárulhat a CRC kemoprevenciójához [102]. A legtöbb egészséges szövetre a COX-2 kifejeződésének hiánya jellemző, de mitogének és citokinek hatására szintje hirtelen megemelkedik, amely a prosztaglandinok (pl.: PGE2) akkumulációjához vezet neoplasztikus és gyulladt szövetekben egyaránt [103]. A COX-2 megnövekedett szintje az EGFR- és Tcf/Lef jelátviteli útvonalak aktiválásán keresztül tumor kialakulásához és szétterjedéséhez vezethet. Az apoptózis gátlását, az immunrendszer zavart működését és az angiogenezis fokozódását (vaszkuláris endoteliális növekedési faktor

29

(VEGF) aktivációt), valamint a tumor inváziót a megemelkedett PGE2 szint is eredményezheti [104]. A szelektív COX-2 inhibitorok a vastagbél daganat kialakulásának valószínűségét COX2függő és -független mechanizmusokon keresztül egyaránt csökkentik. A N-(2-cyclohexyloxy4-nitrophenyl)-methanesulfonamide (NS398) egy szelektív COX2 inhibitor, amely tumor ellenes hatását az apoptózis fokozásával [105, 106], és a sejtciklus szabályozásának [107, 108], az érképződés [109, 110] és az áttétképzés [106, 111-116] gátlásával ill. megakadályozásával fejti ki. HCA-7 colon carcinoma sejtekben a NS398 szignifikánsan növekedésgátló hatású szernek bizonyult [108]. Megakadályozza a PGE2 szintézisét és a p27KIP1 expressziójának fokozásán keresztül a sejtciklust G1 fázisban tartja [107]. A NS398függő apoptózis vastagbélrákos sejtekben a citokróm c-függő útvonalon keresztül zajlik le [105]. A NS398 kezelés hatására bekövetkező VEGF szint csökkenés, az ágens érképződés gátló szerepét támasztja alá [109, 110]. Az NS398 rákos sejtek terjedésére és a metasztatikus növekedésre gyakorolt hatása in vitro sejtkultúra modellben [111, 113, 114] és in vivo állatkísérletek [111, 113-115] által egyaránt bizonyított. Terápiás hatását a mátrix-metalloproteáz-2 (MMP2) expresszió csökkentésén [112, 115], az epidermális növekedési faktor receptor (EGFR) transzaktivációjának blokkolásán [114], vagy a HGF-indukálta invazitás gátlásán keresztül fejtheti ki [111, 113].

30

2.12. Nagy áteresztőképességű molekuláris biológiai vizsgálati módszerek a rákkutatásban A daganatok olyan genetikai betegségnek tekinthetők, amelyeknél a kóros fenotípus kialakulása és megléte számos gén megváltozására (gén kaszkád) vezethető vissza. A tumorok molekuláris hátterének komplex elemzéséhez és megismeréséhez sok biológiai paraméter párhuzamos vizsgálatát lehetővé tevő úgynevezett nagy áteresztőképességű módszerekre van szükség. A 90-es évek elején elkezdődött Humán Genom Projekt (HGP) lehetővé tette, hogy széleskörben elterjedjenek különböző microarray rendszerek, melyek alkalmasak több száz vagy ezer sejtalkotó egyidejű vizsgálatára. A cDNS microarray technológia forradalmi áttörést jelentett a génexpressziós vizsgálatokban, a nagydenzitású oligonukleotid microarray-k pedig teljes genom szinten tették lehetővé a transzkriptomikai vizsgálatokat. Napjainkban az újgenerációs szekvenáló rendszerek (NGS) fejlődésével ez a lehetőség még tovább bővült, hiszen segítségével ismeretlen variánsok is azonosíthatók, kvantifikálhatók [117]. Proteomikai oldalról a tömegspektrometriai (MS) eljárások játszanak fontos szerepet a biomarker azonosításban (untargeted proteomics) [87]. A chiptechnológia fejlődésével elérhetővé váltak a protein chipek, amelyek a fenotípus közvetlen vizsgálatát célozzák, valamint elérhetővé váltak a szénhidrát, lipid és aptamer array-k a metabolikus folyamatok felderítéséhez. A következőkben a microarray technológia alapjait, működési elvét és alkalmazási területeit mutatom be, megemlítve a módszer korlátait és hiányosságait is. A genomika területén végzett kutatások ismeretet adnak az egyes betegségekben, gyógyszerkezelésekben vagy biológiai folyamatokban szerepet játszó génekről, melyeknek száma egyre inkább nő a mRNS analizáló technológiák fejlődésével (SAGE, microarray, NGS) [118, 119]. A cDNS microarray-k felhasználhatók génexpressziós szintek változásának mérésére, valamint génexpressziós mintázatokat tartalmazó adatbázisok létrehozására, továbbá különböző fenotípusok, vagy fiziológiai állapotok összehasonlítására alkalmasak. A DNS chipek azonban nem alkalmasak fehérje szinten történő információk kinyerésére, melyek a biológiai kutatások egyik legfontosabb alapját képezik. Tulajdonságaink az örökítő anyagban kódolt fehérjék által nyilvánulnak meg, továbbá minden sejtbeli funkcionális esemény fehérjékhez kötött (tekintsünk el a ribozimektől). A cDNS chipek eredményei leegyszerűsítve felfoghatók úgy, hogy a geno- és fenotípus közötti állapotot tükrözik, mivel mRNS alapú technikáról beszélünk, vagyis a DNS és fehérje közötti lépcsőről. Az mRNS-ről kapott információkból jól lehet következtetni az örökítő anyag tulajdonságaira (mutáció, 31

deléció, transzlokáció, SNP), viszont nem feltétlenül a géntermék minőségére és szintjére, köszönhetően a poszt-transzkripcionális kontrol, valamint a poszt-transzkripcionális modifikáció mechanizmusainak. Mivel a fehérjék kulcsszerepet játszanak az élőlények fenotípusának kialakulásában, így vizsgálatuk különösen fontos jelentőséggel bír az orvosbiologiai kutatásban és a diagnosztikában [87, 120, 121]. 2.12.1. Microarray technológiák ismertetése A microarray-k vagy másnéven nagyteljesítményű biochipek, jelentős fejlődésen mentek keresztül a megjelenésük óta eltelt 20 évben. Nagy áttörést hoztak a molekuláris biológiába, hiszen alkalmazásukkal lehetővé vált a poligénes betegségek molekuláris hátterének átfogó vizsgálata. Már korábban is léteztek olyan array-k, ahol a Southern blot technológia analógia alkalmazásával úgynevezett „dot-blot” és „gridded library” kísérleteket hajtottak végre. Azonban ezek hatalmas membránokon, legtöbbször izotópos jelöléssel készültek. A microarray-k ennél lényegesen nagyobb próbasűrűséggel (100 elem/cm2) rendelkeznek, amit speciális nyomtatótű segítségével tudnak elérni. A nagy jelsűrűség eléréséhez porózus hibridizációs membránok (NC) helyett nem porózus-, vagy szilikon alapú üvegeket használnak. Ezáltal a reakció térfogat jelentősen csökkenthető, a reakciósebesség pedig növelhető. Továbbá lehetőség nyílt fluoreszcens festékek alkalmazására, amelyek a porózus membránok esetében erős aspecifikus hátteret eredményeznek, a microarray-knél kiváló és érzékeny jelfeldolgozást biztosítanak, lehetőséget teremtve a mennyiségi kiértékelésre, sőt két vagy több fluorofór egyidejű alkalmazásával kettő vagy több minta egyidejű összehasonlítása is elérhető [87]. Az array technológia lényege, hogy ismert oligonukleotid szekvenciák vannak elhelyezve ismert pozíciókban, amelyekhez a komplementaritás szabályai szerint a jelölt ismeretlen molekulák kapcsolódnak. Az eredeti ismeretlen molekula mennyisége a kapcsolódás után leolvasott jel intenzitásából visszanyerhető. A mikroszkóp tárgylemez alapú chiprendszereken előre szintetizált komplementer, ún. cDNS molekulákat rögzítenek fel a szilárd hordozó felszínére [122]. 2.12.2. Oligonukleotid microarray technológia (Affymetrix) Ennél a rendszernél nagy jelsűrűség érhető el a speciális, úgynevezett fotolitográfiás technológia által (2. ábra). Ennek lényege, hogy oligonukleotidokat szintetizálnak a szilárd hordozó felszínére fényérzékeny csoportok segítségével. A chipen vizsgálható minden egyes transzkriptum 3’ végétől számított 1000 bázispár hosszúságú szakaszt 11db 25mer

32

2. ábra A Fotolitográfiás szilárdfázisú oligonukleotid szintézis lépései. Az üveg hordozóra (A) fényérzékeny csoportokat (n-BOC, t-BOC) konjugálnak (B). Lézer technológiával előállított, speciális mintázatú, 10x10µm területű réseket tartalmazó maszkot helyeznek a szilárd hordozó fölé, majd megvilágítják (D). A nyitott pozíciókban szabaddá váló reaktív csoportokhoz az első réteg nukleotidjai hozzákötődnek (E). A maszk forgatásával, ill különböző maszkok használatával a többi pozícióba rögzíthetők a megfelelő nukleotidok. További maszkokat felhasználva egymásra építhetők a rétegek. n hosszúságú oligonukleotid lánc felépítéséhez 4n db maszk szükséges. hosszúságú oligonukleotiddal reprezentálnak.

Ez a 11db oligonukleotid a chipfelszínén

véletlenszerű eloszlásban helyezkedik el. A hibridizációt követően a 11 pozícióban mért fluoreszcencia intenzitás eredő értéke adja meg a vizsgált transzkriptum jelenlétének mértékét, amelyet az Affymetrix cég által fejlesztett speciális algoritmus segítségével határoznak meg. A DAT fájlokra illeszkedik az array háló, ami a hibridizációs kontroll pontok segítségével kijelöli a chip felszínén a mérési pontokat (3. ábra). Egy mérési pont 7x7 pixelből áll, amelyet az értékelésbe a külső pixelréteg elhagyása után vonnak be (5x5), ezáltal kiküszöbölve az array háló illesztéséből adódó hibalehetőségeket. Az array háló illesztése nagy térinformatikai kihívást jelent, hiszen amennyiben a chip felszín nem egyenletes, és az 33

1200X1200-as mátrix akár 0,01 fokot torzul, az illesztési hiba lehetősége jelentősen megnövekszik. Az illesztés után kapott nyers adatokat egy cella fájl (CEL) tárolja, amelyben minden vizsgált pozícióhoz hozzárendelik az aktuális fluoreszcencia intenzitást. Ezt a formátumot kezeli a legtöbb chip-adatelemző szoftver.

3. ábra Az Affymetrix teljes genom microarray rendszer felépítése. A chip felszínén elszórtan helyezkedik el az egy gént reprezentáló, egyenként 25mer hosszúságú 11db próba, ami egy értékelési egységet (probeset) alkot. Az ábra jobb felő részén egy probe set látható amit 2x 11 próba – a vizsgált szekvencia tökéletes homológ (PM) és a 13. pozícióban nem komplementer bázist tartalmazó kontroll próba (MM) - fluoreszcencia intenzitása alkot.

2.12.3. Fehérje szintű vizsgálatok ellenanyag microarray technológiával 2.12.3.1. Hagyományos fehérjevizsgálati módszerek Napjainkig a legtöbb proteomikai megközelítés a 2-D PAGE (kétdimenziós poliakrilamid gélelektroforézis) módszert használta, amelynek lényege a fehérje-extraktum vagy sejtlizátum fehérje komponenseinek izoelektromos fókuszálása, majd méret szerint szeparációja. A kapott jellegzetes mintázatok összehasonlításából (beteg vs. normál, kezelt vs. kezeletlen) megállapítható, hogy melyik fehérje hiánya, vagy többlete okozza a kialakult fenotípust [123]. Azonban ez a technika csak viszonylag magas koncentraciójú fehérjékre alkalmazható, mert 34

az alacsony koncentrációjú fehérjék a gélen egyáltalán nem észlelhetők, vagy a nagyobb koncentrációban lévők domináns jelek miatt nem azonosíthatók. A 2-D PAGE előnye, hogy az alkalmazott pH- (pH 3-10) és mérettartományba (40-200 kDa) eső, a módszer érzékenységének megfelelő össszes fehérje vizsgálható. Hátránya, hogy néhány fehérje azonos méret és pH tartományba esik, így az átfedések korlátozzák a módszer pontosságát ill. megbízhatóságát. Ennek tisztázása további vizsgálatokat igényel pl: tömegspektrometria. Ennél egyszerűbb megoldás a Western-blot analízis, amelyben csupán méret szerinti fehérjeszeparálás történik, majd a vizsgálni kívánt fehérje molekulát egy specifikus elsődleges ellenanyaggal reagáltatják. A következő lépésben egy másodlagos ellenanyagot kötnek az elsőre, ami arra specifikus, és valamilyen detektálási lehetőséget nyújt (HRP, izotóp, ECL). Az előhívás után kirajzolódik a vizsgálni kívánt fehérje sávja, a rá jellemző mérettartományban. Azonban a glikoziláció, szulfatáció és a komplexképzés jelentősen megváltoztathatja a molekula méretét. A technika előnye, hogy egyszerűen, és viszonylag olcsón kivitelezhető, szemikvantitatív meghatározásra alkalmas. Hátránya, hogy egy reakcióban egyetlen ismert fehérje vizsgálható, továbbá igen időigényes és nem jól reprodukálható, a párhuzamos eredmények nehezen összevethetők [87, 120]. A kvantitatív fehérje meghatározás legelterjedtebb módszere az ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) [124]. Ez a kompetíción alapuló, színreakciót adó módszer érzékenysége, valamint megbízhatósága miatt igen széles körben alkalmazott módszer a fehérje diagnosztikában. Pontosan meghatározható vele az egyes fehérjék koncentrációja. Talán érdemes még szót ejteni az immunhisztokémiáról, ahol fluoreszcensen vagy indirekten jelölt antitestek segítségével győződhetünk meg az adott fehérje sejtbéli lokalizációjáról, jelenlétéről [125]. Ez a módszer azonban mennyiségi meghatározásra nem alkalmas. Előnye, hogy különböző fluoreszcens festékeket használva egyszerre akár három fehérje elhelyezkedése is vizsgálható. A legújabb módszerek között megemlítendő a tömegspektrometriával (MS) egybekötött SELDI (Surface Enhanced Laser Desorption and Ionisation) és MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption and Ionisation) technológiák, ahol a különböző fehérje frakciókat megfelelő affinitás felülethez rögzítik (affinitás vagy más paraméter alapján), ill. mátrixba ágyazzák, majd lézerrel kilőve a repülési időkből (TOF) valamint a tömegspektrumokból megállapítható a két minta közötti eltérés [126]. Előnye, hogy nagyon nagy érzékenységű rendszer, akár attoés femtomoláris tartományban is mérhetünk. Hátránya, hogy nagyságrendi korlátai vannak, ugyanis csak 4 nagyságrendnyi tartományon belül lévő fehérjéket detektálhatunk vele. A vérben jelenlévő legnagyobb ill. legkisebb koncentrációjú fehérje között mintegy 12 35

nagyságrendbeli különbség van. Továbbá a mintára jellemző spektrumok (biomarkerek) nem adnak egyből pontos információt a konkrét fehérjére. Ennek meghatározásához további bonyolult vizsgálatok szükségesek. Két minta elkülönítése általában spektrumaik különbsége alapján történik, akár 1000 Da-tól 300 kDa tartományban. 2.12.3.2. A protein chipek története A protein chipek a cDNS micro-array technológia analógiájára jöttek létre. Kezdetben ugyan nem chip, hanem ELISA-tálca méretűek voltak [127]. Ez a technika fejlődésével egyre kisebb méretűvé vált. Míg a cDNS chipeknél a reakciót a Southern- vagy Northern-hibridizáció, addig a fehérje chipek esetében a Western-hibridizáció alapján végezzük, néhány módosítással. Itt azonban nem a minta, hanem a próba (ellenanyag, vagy fehérje) van fix pozícióban rögzítve. Ezáltal egy mintából egy reakcióban nem csak egy, hanem akár több száz vagy ezer paramétert (génterméket) vizsgálhatunk, az előre a szilárd hordozó felszínére rögzített „fogó molekulák” számának függvényében. Továbbá, magát a mintát jelöljük, ami lehetőséget ad több minta (általában 2) egyidejű, egy chipen történő vizsgálatához (normál vs. beteg vagy kezelt vs. kezeletlen). Ezáltal egy chipen azonosítható a két minta közötti különbség [128]. Eleinte ELISA tálca vályúiba (plate well) rögzítettek megfelelő antitesteket. Így egyszerre 96 vagy 48 (mivel célszerű 2 párhozamos reakciót végezni) génterméket lehetett egyszerre vizsgálni. Ez azonban pontatlan és időigényes volt a rengeteg pipettázás miatt, továbbá rendkívül nagymennyiségű fehérjekivonatot igényelt. Ezt követően az ELISA tálcát PVDF membrán váltotta fel. Ennek meghatározott pontjaira csöppentették az ellenanyagot, majd rögzítették. Innentől a hibridizáció egy térben zajlott, tehát az előző rendszer pontatlanságai kiküszöbölődtek. Viszont megjelent egy a háttérből adódó probléma: az ellenanyag csöppek közötti terület aspecifikusan magához köthette a nem hibridizálódott fehérjéket. Míg a nukleinsavak esetében a hibridizációs oldat sókoncentrációjának módosítása, vagy a hibridizáció hőmérsékletének emelése megoldást jelent, addig az fehérjek esetében ez nem alkalmazható. Ezt a problémát az aspecifikus reakciók blokkolása, valamint a megfelelő felületkezelés oldotta meg [129]. A jelölést eleinte radioizotóposan végezték. Ez a foszforilálható fehérjék esetében nem okozott különösebb gondot, ám a többi esetben módosításokat kellet végezni. Sejtkultúra esetében alkalmazható volt a jelölt aminosav in vivo beépítése. Az izotópos jelölés hátránya a veszélyes munkafolyamaton túl, hogy egy felszínen csak egyetlen minta vizsgálható. Előnye viszont, hogy nagyon érzékeny, így kevesebb minta is elegendő, valamint kis különbségek is 36

jól detektálhatók. Alkalmazták még ugyan az ECL (enhanced chemiluminescent) technikát, de ez is csak egy minta vizsgálatát tette lehetővé. Az izotópos és az ECL technika detektálása röntgen film vagy PIA (phosphore image analyzer) segítségével történt, amit ezután fotó formájában tároltak és analizáltak. A jelölés tekintetében az igazi áttörést a fluoreszcens festékek alkalmazása hozta. A leginkább használatosak a mono-reaktív Cy3 és Cy5 fluoreszcens festékek, melyek a fehérjék aminocsoportjaival reagálnak [130]. Amellett, hogy alkalmazásuk veszélytelen és pontos méréseket lehet velük végezni, egy chip-felszínen akár több minta is összehasonlítható. Detektálásuk lézer szkenner használatával történik. A lézer egy adott hullámhosszon gerjeszti a festéket, majd az egy rá jellemző hullámhosszon fényt bocsát ki, amit a készülék detektál. Ha két vagy több fluoreszcens festék eltérő hullámhosszt bocsát ki, akkor azok külön-külön detektálhatók. A ma használatos protein-chipek, a szó szoros értelmében computer chip méretűek. Egy cm2en több száz, néhány µm átmérőjű antigén csepp található. Ez nagyban leegyszerűsíti a reakciók kivitelezését, lehetővé téve a gyors és pontos méréseket [131]. 2.12.3.3. Modern fehérje chiptechnikák 2.12.3.3.1.Üvegtárgylemez alapú antigén/antitest kötődés kimutatása alapján működő rendszerek A diagnosztikában használatos fehérje-kimutatási technikák fehérje-fehérje interakción alapulnak, úgy, hogy szilárd felülethez kötött, ismert antitesteket alkalmaznak.

Így

egyidejűleg akár több 100 fehérjét lehet azonosítani, ill. kifejeződésének változását nyomon követni. Ez a rendszer a cDNS microarray-k analógiájaként működik, és kompatibilis is az ehhez szükséges eszközökkel (jelölés, hibridizáció, detektálás). Leggyakrabban szilárd hordozóként különböző felületkezeléssel előkészített üveglemezt használnak, így az illeszthetőség mellett további előnyük a költségkímélés. Chipek előállítása csöppentéssel történik (spot), vagyis az antitesteket megfelelően kis cseppek formájában juttatják a felületre, majd valamilyen kémiai vagy fizikai módon rögzítik a felszínhez. Ez viszont a keresztszennyeződések megnövekedéséhez vezethet (aeroszol), valamint előfordulhat a cseppek bekoncentrálódása az esetleges evaporáció miatt. Ezt úgynevezett Matrix-slide alkalmazásával próbálják kiküszöbölni, viszont ez igen költséges [132]. A protein-chipek előállítása során alapvetően két hordozó felületet különböztetünk meg. Az egyik az üveg, melyet kémiai felületkezelés után speciális oldalláncokkal vonnak be, melyekhez aztán kapcsolódnak majd az antitestek. A gyakorlatban ez egy mikroszkóp tárgylemezt jelent, (25 x 76 mm) ami kompatibilis a legtöbb hibridizáló és leolvasó 37

rendszerrel. A másik megoldást egy speciális membrán rögzítése jelenti hasonló méretű tárgylemezen. A chipek felszínére rögzített fehérjéknek is két fajtáját különböztetjük meg. Lehetséges fehérjéket rögzíteni, amelyekkel jelenlevő testfolyadék antitesteket tudunk detektálni. A másik lehetőség antitestek rögzítése az üveglemez felületére, amelyekkel szöveti lizátumból, sejtkultúra lizátumból, testfolyadékokból tudunk adott fehérje jelenlétére következtetni. Ma a kereskedelmi forgalomban elérhető fehérje chipek maximálisan 500-1000 ellenanyaggal készülnek. Irodalmi adatok azonban ennél sokkal nagyobb (több ezer) antitest és fehérje vizsgálatára alkalmas chipekről is beszámoltak [108, 133, 134]. 2.12.3.3.2. SELDI-MS alapú rendszerek Az első és legismertebb antibody microarray-eket a CIPHERGEN készítette ProteinChip néven. Működését tekintve SELDI elven alapuló diagnosztikai rendszer volt. Bizonyos betegség specifikus fehérjéket rögzítettek (enzim, receptorfehérje) a szilárd hordozón, amelyekhez a hibridizáció alatt kötődött fehérjemolekulákat MS segítségével azonosítottak. Alkalmas továbbá fehérje-fehérje kölcsönhatások vizsgálatára, valamint foszforilációs térképezésre is. A detekciós idő órákra rövidült, szemben a 2D elfo napokig tartó procedúrájával. Nem beszélve a csekély mintamennyiségről (1ml vagy 500 sejt), amivel a rendszer működni képes. A kis mintamennyiség nem csak gyakorlati szempontokból szükséges, hanem gondoljunk csak a korlátozott mennyiségű mintákra (keringő tumorsejtek), továbbá a megelőző állapotok diagnosztikájára, ill. prognosztikájára. Ez a rendszer alkalmas klinikai minták, pl.: biopszia, metszet, lézer mikrodisszektált sejtek, szérum, vizelet vizsgálatára. A kapott biomarker mintázatot automatikus mintázatfelismerő szoftver analizálja, és statisztikailag értékeli, majd korreláltatja az adott betegség genotípusával [135]. 2.12.3.3.3. Gélelektroforézis alapú chip rendszerek A Lab-on-a-Chip technológia, amit a CIBA GEIGY kutatolaboratóriumában fejlesztettek ki a múlt század végén majd elsőként a Caliper Technology Corporation hozta kereskedelmi forgalomba az Agilent céggel közösen 2100 Bioanalyzer néven. A rendszer nukleinsavak, fehérjék és egész sejtek vizsgálatára is alkalmas. A rendszer kapilláris elektroforézis elvén alapszik. A minták fluoreszcens jelölés után kerülnek azonosításra [136]. 2.12.3.4. Fehérje analízis technikai problémái 2.12.3.4.1. Fehérje bomlékonyság A fehérjék bomlékonysága jelentősen megnehezíti pontos mennyiségi meghatározásukat. A fehérjék általában sokkal stabilabban kezelhetők, mint az RNS-ek, azért nagy figyelmet és 38

körültekintést igényel a velük történő munka. A sejt, mint tudjuk dinamikus rendszer. Az életműködéséhez valamint az életben maradásához gyors válaszokra, változtatásokra van szüksége. Ezért ezek az effektor molekulák, – ellentétben a stabilnak tekinthető DNS-sel, ami akár több ezer éves mintákból is kinyerhető [137] – rövid életűek, ennek köszönhetően gyors válaszok adására nyújtanak lehetőséget, bonyolult szabályozási mechanizmusok által. Azt, hogy egy adott fehérje mennyire bomlékony, számtalan dolog befolyásol (mérete, szerkezete, összetétele, funkciója). Ezeknek a paraméterek a stabilitása kapcsán nem csupán az enzimatikus (proteázok által végzett) lebomlást befolyásolják, hanem a térszerkezet módosulásokat is. Ugyanis, ha egy fehérje térszerkezete azon a részen módosul, ahol az ellenanyag specifikusan fölismerné (epitóp), nem jön létre a reakció, vagy fals kötődés következhet be. Ezt a sejtbeli lokalizációhoz képest megváltozott reakciókörülmények is előidézhetik (pH, sókoncentráció, hidrofóbicitás, FFPE). A fehérje intaktsága, tehát nagyon fontos a megbízható reakciók végzése érdekében. Erről SDS-PAGE, vagy még inkább egy kiválasztott (bomlékony) fehérje Western hibridizációjával győződhetünk meg [121]. 2.12.3.4.2. Fals kötődés, pozitivitás További fontos hangsúlyozandó tényező a fals kötődés. A már említett térszerkezet módosuláson túl ennek a legfőbb oka az, hogy a chip felszínén monoklonális ellenanyagokat rögzítenek. Maga az antitest is károsodhat a rögzítés során – ez okozza, hogy léteznek olyan fehérjék, amelyek ezzel a technikával ez idáig nem vizsgálhatók – de még fontosabb az aspecifikus reakciók létrejötte, amelyek végképp pontatlanná teszik a kísérletet. Az erről történő meggyőződés rendkívül fontos, azonban nagyon költséges is. Ugyanis, az összes vizsgált fehérjét egyenként túl kell termeltetni, jelölni, majd egyenként hibridizálni. Ideális esetben az aktuális fehérje, csak a neki megfelelő antitesttel reagál. Amennyiben máshol is kapunk jelet, más epitópra specifikus antitestet kell a chip felszínére rögzíteni [129]. 2.12.3.5. Szöveti microarray technológia (TMA) A szöveti mikroblokk technológia (Tissue Microarray Technology, TMT) vagy rövidebben (Tissue Microarray, TMA) az immunhisztokémia elvén alapszik. Nevét onnan kapta, hogy a tárgylemezre nem egy, hanem több szövet korongot rögzítenek a microarray-eken ismeretes elrendezésben, majd ezt kezelik a megfelelő ellenanyaggal. Így akár több tucat mintán egyszerre vizsgálható egyes fehérjek lokalizációja. Az eddig ismertetett array technológiákkal szemben a különbség az, hogy itt a mintákat rögzítik, és a próba szolubilis. Ezáltal több minta (10-100) egy, vagy fluoreszcens jelölés esetén 2-3 paramétere vizsgálhatóegyidejűleg. A formalinban fixált szöveteket paraffinba ágyazzák (FFPE), majd szövethengereket készítenek 39

belőle. A hengerek átmérője néhány millimétertől 1 cm-ig terjedhet. Ettől függ az, hogy hány minta kerül végül is a tárgylemezre. Itt kompromisszumot kell kötni az egyszerre vizsgálandó mintaszám, valamint a vizsgált metszet területei között. Leggyakrabban a 4x6, 6x10, 8x12, 10x24 elrendezést alkalmazzák (4.ábra) [138, 139].

4. ábra A szöveti mikroblokk technika (TMA) készítésének folyamata. A donor blokkból mintavételi tűvel kivett egyedi, reprezentatív szövethengereket az akceptor blokkba ágyazzák, majd sorozatmetszetet készítenek, amelyek tagjain immunfestést végeznek.A megfestett tárgylemezek digitalizálhatók és virtuális mikroszkóp használatával elemezhetők. A TMA technológia része a virtuális mikroszkópia. A kiértékeléshez a metszeteket nagy felbontású kamera segítségével digitalizálják, majd a digitális tárgylemezeket egy szoftver segítségével elemzik (5. ábra). A szoftver képes alakzat felismerő algoritmusok és objektív kiértékelő rendszerek alkalmazására. A digitalizált tárgylemez előnye, hogy nem változik a minősége, egyszerre több helyen is elérhető, valamint könnyen hozzáférhető és rendszerezhető.

40

5. ábra A TMA kiértékelő rendszer szoftveres felülete. A digitalizált tárgylemez egy virtuális mikroszkóp segítségével tetszés szerint pozicionálható, nagyítható. A reprezentatív szöveti területek (core) kiértékeléséből származó eredmények, a festődés intenzitása alapján (score) a biológiai csoportok jellemezhetők, elkülöníthetők. A folyamat szoftveresen automatizálható. A TMA technológia nagy lehetőséget nyitott az eredmények fehérje szinten tőrténő visszaellenőrzéséhez. Ez a nagy horderejű módszer lehetővé teszi sok minta számos markerrel történő szövet szintű fehérje expressziójának verifikációját, akár független minták bevonásával. A 18q kromoszóma elvesztése fontos szerepet játszik CRC-ben. A folyamat során deletálódó DCC (deleted in colorectal cancer) gén tumor prognosztikai jelentőségét immunohisztokémiával igazolták [140]. TMA alapú immunhisztokémiával igazolták a CycE gén szerepét és fokozott expresszióját colon és más tumorokban [141]. Vastagbéldaganatokban

1315

minta

TMA-n

történő

vizsgálatakor,

klinikai

utánkövetéssel

megállapították, hogy a AMACR gén működése a bal oldali daganatokban fokozottabb [142]. 2.12.4. A microarray eredmények megerősítésére szolgáló módszerek A nagydenzitású chipek hátránya, hogy minimális bizonytalanság esetén is nagy a hibák felhalmozásának lehetősége. Tízezer paraméter vizsgálatánál 1%-os hiba 100 paraméter pontatlan mérését eredményezi. Ezért a chip-méréseket független módszerrel meg kell erősítenünk (validáció). Emiatt a chipvizsgálatokat szűrő módszerként használják. Az expressziós chipek PCR alapú technikákkal, míg a fehérje chipek Western blot, ELISA vagy TMA technikákkal validálhatók. 41

2.12.4.1. Valós idejű RT-PCR Az RT-PCR alapú technikák a microarray vizsgálatok arany sztenderdévé váltak a kísérleti eredmények visszaigazolásában. A kvantitatív valós idejű (real-time) PCR módszerek alkalmazásának célja, hogy egy adott molekuláris eltérést ne csak minőségileg, hanem mennyiségileg is meg lehessen ítélni az abszolút és a relatív kópiaszám meghatározása alapján. Leggyakrabban a SYBR Green interkalálódó festéken valamint a TaqMan próbán alapuló rendszereket alkalmazzák. A génexpresszió mértékének meghatározása az mRNS-ből átírt cDNS-en valós időben, kvantitatív módon történik. Az adat elemzés a Cp (áttörési pont, crossing point) értékek összehasonlításával történik [143], a Cp értékek második derivált módszerének meghatározását követően [144].

2.13.

A

lézer

mikrodisszekció

és

alkalmazásának

lehetősége

a

rákkutatásban 2.13.1. Lézer mikrodisszekció elméleti háttere A sejtspecifikus biológiai információ megismerése egyedülálló távlati lehetőséget nyújt mind a kutatásban, mind a diagnosztikában, mind a terápiás lehetőségek területén. Segítségével megérthetjük a sejtek közötti kommunikációs folyamatokat a tumor mikrokörnyezeteinek sajátos működését. Lehetőség nyílik pontosabb molekuláris klasszifikációra, ezáltal elkülöníthetők és azonosíthatók a patovariánsok, és pontosabbá válik a terápiára adott válaszok előrejelzése. Továbbá olyan távlati lehetőségeket nyújthat, mint az oki terápia, ahol lézer mikrodisszekcióval gyűjtött minták hibás génjeinek meghatározása után a sejtterápia megvalósítható. A ritkasejtes minták, így a tumor mikrokörnyezetének tanulmányozása a mai kutatások középpontjában állnak. Ritka sejtes minták azok a biológiai minták, amelyekből korlátozott számú sejtek vizsgálhatók. A lézer mikrodisszekció alkalmazása lehetővé teszi a szöveti minták néhánytól - pár ezersejtes részleteinek elemzését, biológiailag homogén sejtcsoportok gyűjtésével. A tökéletes megoldás egyetlen sejt vizsgálata lenne, de ennek jelenleg még komoly technikai korlátai vannak.

A

legnagyobb

kihívást

nem

a

sejtek

összegyűjtése

jelenti,

hiszen

a

lézermikrodisszekcióhoz 4 nagy gyártó (PALM (ZEISS), Leica, Arcturus és Cell Robotics) termékei érhetők el a kereskedelmi forgalomban, amelyek felhasználóbarát módon lehetővé teszik a mikrodisszekciót, hanem a sejtalkotók megfelelő módon és minőségben történő kinyerése, valamint ezek kellően érzékeny módszerekkel történő vizsgálata illetve vizsgálatra alkalmassá tétele (jelölés, amplifikáció) [145].

42

6. ábra PALM LCM rendszer felépítése. A lézerforrás, B automatizált tárgyasztal, C gyűjtő felület tartó rendszere, D digitális kezelőfelület, E addhezív gyűjtő felület, F membránnal bevont, festett metszetet tartalmazó tárgylemez, G az objektíven keresztül fókuszált lézer sugár, H kamera, I inverz mikroszkóp.

7. ábra Az LCM folyamata. Felső sor balról jobbra: A vizsgálandó terület kiválasztása és kijelölése, majd a kijelölt terület körbe vágása CUT funkcióval, majd a megmaradt szöveti híd segítségével a kivágott terület fellövése (katapultáció) LPC funkcióval, a kiemelt szövet darab a gyüjtő felületen. Középen: Normális nyálkahártya hámsejtjeinek összegyűjtése. Alsó sor: tumor hámsejtjeinek összegyűjtése. 43

A lézer mikrodisszektor egy lézerfény-generátorral ellátott több alegységből álló inverz mikroszkóp. Optikai rendszere egyidejűleg teszi lehetővé a minta megjelenítését és az alkalmazott lézerfény (folyamatos vagy pulzáló) mintához történő eljuttatását. Az inverz mikroszkóp tárgyasztalát egy precíziós mikromotoros rendszer mozgatja az objektíven áthaladó lézer sugár felett. A tárgyasztalhoz egy mintagyűjtő kar csatlakozik, amely a minta összegyűjtésére alkalmas műanyag kupakokat a metszet fölé helyezi. A rendszer szoftveresen, egy virtuális grafikus felület segítségével vezérelhető. A mikroszkóphoz csatlakoztatott kamerával a monitoron megjelenő szöveti képen a vizsgálni kívánt terület kijelölhető (6.ábra). Üveg lemez esetében a minta 5-10um átmérőjű darabonként katapultálható, vagy fóliával bevont lemez esetében a körbevágás után meghagyott néhány μm-es szöveti hídra egy nagyobb lézer impulzust adva a körbevágott sejtcsoport kiemelhető (7. ábra). A minta lehet natív, pl. sejtkultúra esetében, azonban szöveteknél a morfológiai elkülönítéshez univerzális (cresyl violet, hematoxylin-eozin, metilénkék vagy toluidin kék) és/vagy immunfestés javasolt [145]. Nem közömbös, hogy az elváltozás melyik részéről származó szöveti területet, vagy sejtcsoportot vizsgáljuk. Más a génexpressziós mintázata egy daganatos szövetnek, ha az egész tumoros masszát vizsgáljuk (biopszia vagy sebészi minta) és megint más, ha külön vizsgáljuk az invázió területét vagy a nekrotikus centrum közelében található sejteket, mindemellett szövet-specifikus expressziós mintázatokat (hám, stróma, follikulus) is megkülönböztethetünk. Ezeken a területeken, szinte korlátlan lehetőséget nyújthat a lézer mikrodisszekció [81, 88].

2.14. A vastagbélrák microarray alapú diagnosztikai és prognosztikai lehetőségei Napjainkban a vastagbél-daganatok diagnosztikája szövettani és klinikai paraméterek alapján valósul meg. Új irányvonalat jelent ezen a területen a molekuláris diagnosztika térhódítása. Diagnosztikai szempontból indokolt a Kras mutáció vizsgálata, valamint kombinált és biológiai terápiás eljárások alkalmazásakor az EGFR és VEGF gének kifejeződési szintjének mérése [146, 147]. Az emlődaganatok esetében már létezik a kereskedelmi forgalomban kapható microarray alapú 70 gén kifejeződését vizsgáló Mammaprint [148, 149], valamint 25 gén kifejeződését vizsgáló PCR-array alapú Oncotype DX rendszer [150, 151]. Használatukkal pontosabb a diagnózis és személyre szabott terápia valósítható meg. Hazánkban széleskörű elterjedésének jelenlegi viszonylag magas ára - kb 750000Ft/vizsgálat - szab határt. Kutatócsoportunk eredményei szerint, a vastagbéltumorok stádiumainak elkülönítése megvalósítható a szöveteken végzett microarray kísérletek alapján [89]. Azonban az igazi diagnosztikai áttörést a vérből történő kimutatás és előrejelzés jelentené [88]. 44

3. CÉLKITŰZÉSEK Vizsgálataim célja vastagbél műtéti minták gyűjtése és azok oligonukleotid- és ellenanyag microarray vizsgálatra való alkalmazhatóságának igazolása, diagnosztikus és prognosztikus fehérjemintázatok meghatározása ellenanyag microarray technológiával, az oligonukleotid és ellenanyag microarray rendszerek összevetése, előnyeik, hátrányaik, felhasználhatóságuk és korlátaik vizsgálata, fehérje és mRNS szint közötti összefüggések azonosítása vastagbél-daganatokban, a microarray vizsgálatok eredményeit igazoló (validációs) assay rendszer kifejlesztése és tesztelése fehérje (TMA) és mRNS (RT-PCR) szinten, a génexpressziós eredmények alapján a vastagbélbetegségek patomechanizmusával összefüggő károsodott biológiai útvonalak azonosítása, a vastagbél adenoma – dysplasia - carcinoma szekvencia génexpressziós hátterének kutatása lézer mikrodisszektált mintákon: olyan gének meghatározása, amelyek megváltozott expressziója indikátora lehet a colorectális carcinogenezisnek hám és stróma régiókban, metilációs szabályozás alatt álló gének azonosítása a génexpresszió vizsgálata alapján, majd az azonosított gének metilációs szabályozásának igazolása cox2 inhibitor és 5’ aza deoxycitidin terápiás ágensek hatásmechanizmusának vizsgálata.

45

4. BETEGEK ÉS MINTÁK Kutatásaimat fagyasztott vastagbél sebészeti mintákon és biopsziákon, valamint az ezekből készült fagyasztott metszeteken és az ezekkel párhuzamosan patológiai feldolgozásra kerülő FFPE mintákon végeztem. A következőkben összefoglalom a felhasznált minták legfontosabb jellemzőit. Az ellenanyag microarray vizsgálatok, valamint a teljes genom microarray vizsgálatok egy része sebészeti minták homogenizálását követő sejtalkotók kinyerése után történt (1. táblázat) 1. táblázat Ellenanyag és teljes genom microarray vizsgálathoz felhasznált sebészeti minták

Azonosító Kor Nem

Diagnózis

Szövettan

Dukes

Áttét

beosztás 5

80

N

Tu. Recti

B

jól differenciált adenocarcinoma

-

8

58

N

Tu. Sigmatis

D

mérsékelten differenciált adenocarcinoma

máj

11

66

F

Tu. Sigmatis

B

mérsékelten differenciált adenocarcinoma

-

12

56

N

Tu. Sigmatis

D

mérsékelten differenciált adenocarcinoma

-

13

69

F

Tu. Sigmatis

D

rosszul differenciált adenocarcinoma

máj, tüdő

15

72

F

Tu. Recti

D

rosszul differenciált adenocarcinoma

máj, tüdő, agy

16

82

F

Tu. Recti

B

mérsékelten differenciált adenocarcinoma

máj

18

55

F

Tu. Recti

B

jól differenciált adenocarcinoma

-

20

62

F

Tu. Recti

B

mérsékelten differenciált adenocarcinoma

-

22

64

N

Tu. Sigmatis

B

jól differenciált adenocarcinoma

-

31

52

F

Tu. Recti

B

jól differenciált adenocarcinoma

-

32

59

N

Tu. Recti

B

mérsékelten differenciált adenocarcinoma

-

33

70

N

Tu. Recti

D

mérsékelten differenciált adenocarcinoma

máj

39

62

F

Tu. Sigmatis

D

rosszul differenciált adenocarcinoma

máj

45

59

F

Tu. Sigmatis

B

jól differenciált adenocarcinoma

-

46

83

F

Tu. Recti

B

mérsékelten differenciált adenocarcinoma

-

A lézer mikrodisszekciót 6 beteg makroszkóposan ép, polipot tartalmazó, valamint daganatos területéről származó metszetek 3 szövettani régióján (hám, stróma, nyirok follikulus) végeztem, összesen 42 minta felhasználásával (2. táblázat).

46

2. táblázat A lézer mikrodisszekcióhoz felhasznált minták bemutatása Betegcsoport

hám

Eset

stróma

Peyer

Affymetrix U133 Plus 2.0

plakk

microarray

Egészséges/ép nyálkahártya

6

6

6

3

15

Adenoma

6

6

6

3

15

CRC

6

6

6

0

12

18

18

18

6

42

összesen

Az adenoma – dysplasia – carcinoma szekvencia során megváltozó működésű gének megfigyelése biopsziás minták teljes genom microarray vizsgálatával történt.

A

megfigyelések ellenőrzése TaqMan RT-PCR és TMA segítségével valósult meg. Az RT-PCR vizsgálathoz nem minden mintából maradt megfelelő minőségű és mennyiségű RNS, viszont a TMA vizsgálat független minták bevonásával készült (3. táblázat). 3. táblázat A felhasznált biopsziás minták áttekintése Betegcsoport

Eset

Affymetrix U133 Plus 2.0 microarray

TaqMan RT-PCR

TMA

Egészséges/ép nyálkahártya

11

11

5

62

Adenoma dysplasia nélkül

9

9

6

89

Dysplasticus adenoma

11

11

4

57

Dukes A, B CRC

11

11

6

37

Dukes C, D CRC

11

11

6

44

53

53

27

289

összesen

A sejtkultúra microarray vizsgálatok esetében a kezelést 2 hatóanyag felhasználásával végeztem, kontrollként pedig a hatóanyagok oldószereit használtam. Minden mérés 3 biológiai replikátumban készült, így összesen (2 x 2 x 3) 12 array felhasználásával.

47

5. MÓDSZEREK 5.1. Sebészeti minták mRNS és fehérje szintű vizsgálatai 5.1.1. Mintagyűjtés A vizsgálatokat 16 CRC-s (10 Dukes B és 6 Dukes D stádiumú beteg, 1. táblázat) beteg sebészeti úton eltávolított mintáin végeztem. A rezekció után legfeljebb 10 perccel a párhuzamosan az ép, rezekciós véghez közeli nyálkahártyából, valamint a beteg területről vett szövetből vett 500mg mintát helyeztem folyékony nitrogénbe. A mintákat ezt követően -80 Co-on tároltam. Az egészséges és a beteg szövetből paraffinba ágyazott, formalin fixált (FFPE) minták is készültek, melyek alapján a patológiai diagnózis, valamint az immunhisztokémiai festések és a TMA-k készültek. A mintagyűjtést a TUKEB: 2005/037 számú engedélye alapján végeztem. 5.1.2. Fehérje izolálás A fagyasztott mintákat lízis pufferben (Clontech) homogenizáltam, majd jégen minden gramm kiindulási szövethez egy gramm aluminát (Sigma-Aldrich) adtam. Erőteljes keverést (vortex) követően 10 percen keresztül 25000g-vel centrifugáltam. A felülúszót, ami a nyers fehérje preparátumot (crude extract) tartalmazza, 100 ul-es egységekben -80 Co-on tároltam a felhasználásig. 5.1.3. Clontech AB 500 array vizsgálat A nyers fehérje preparátumok koncentrációját BCA módszerrel határoztam meg, majd 1mg/ml koncentrációjú munka oldatokat készítettem a tumoros és ép mintákból egyaránt. A jelöléshez monoreaktív Cy3 és Cy5 festékeket (Amersham (GE Helthcare)) használtam a gyártó előírása szerint. A jelölést dye swap (kereszt jelölés) módszerrel végeztem, ahol az „A” reakcióban a tumoros mintát pirossal (Cy5), a normált zölddel (Cy3) jelölik, majd ugyanezeket a mintákat a párhuzamos „B” reakcióban színcserével jelölik. A jelölt fehérje tisztítását, és a nem kötődött festékek eltávolítását CD10-es oszlopon (Amersham (GE Helthcare)) végeztem. A jelölt és tisztított fehérjék koncentrációját ismételten meghatároztam BCA módszerrel, majd ekvivalens mennyiségben összekevertük (100-100 ug), és 30-30 ug-ot felhasználva elkészítettük a hibridizációs koktélt. Ezt Clontech AB500 array-re (Clontech) hibridizáltam az alkalmazott kit leírása szerint. A hibridizáció után a nem kötődött

48

molekulákat abszolút etanollal történő mosással távolítottam el, majd száradásig centrifugáltam. A száraz lemezeket szkennelésig sötét helyen tároltam. A lemezeket Axon 4000B típusú szkennerrel (Axon Instruments, USA) digitalizáltam 532 és 635 nm-en. A gyártó által javasolt 33%-os lézererő, valamint 560 és 670 PMT erősítés, valamint 20um/pixel felbontás mellett. Az adatok értékelése GenePix 4.1 (Axon Instruments) szoftverrel készült. Az array háló (Lot: 5010317) illesztése után meghatároztam a fluoreszcencia intenzitásokat, valamint a háttér intenzitásokat mindkét csatornán. Ezt követően lokális háttér korrekciót végeztem. Az adatokat gpr és csv formátumban exportáltam. Az elemzést R környezetben végeztem RMA és normexp háttérkorrekciós és quantile normalizációs metódus alkalmazásával. Az expressziós különbséget mutató gének azonosítása a normalizált M értékek alapján történt: M = log2(R/G), vagyis M a piros (R) és a zöld (G) csatornán mért fluoreszcencia intenzitások kettesalapú logaritmusainak különbsége. A szignifikáns eltérést mutató határ fehérje markerek esetén M = ± 0,5 értéknél van [152], vagyis 30%-nál nagyobb változás esetén mondható ki megbízható eltérés. 5.1.4. Szöveti microarray (TMA) megerősítés A fehérje chip eredményeit TMA technológiával igazoltam független minták bevonásával. A validációba 15 egészséges területről származó minta mellett 36 különböző lokalizációjú, differenciáltságú mintát is bevontam. A szöveti microarray 2mm-es mintákat tartalmazott 24es blokkokban. A TMA blokkokból 5 um-es sorozatmetszeteket készítettem, majd a következő immunhisztokémiai festéseket végeztük el: APC, Caveolin, CBP, cyclinA, ERK, HSP60, Cox2, EGFR, C-myc, Cald, Top1, DARPP32, MRE11A, AndrogenR, EPS8. A megfestett sorozatmetszeteket Mirax Desk rendszerrel digitalizáltam (3DHistech kft, Budapest) majd TMA virtuális mikroszkóppal értékeltük ki (Mirax Viewer, 3DHistech kft, Budapest). 5.1.5. Immunhisztokémia A deparaffinálást követően 20 perces hőindukciós antigén feltárást végeztem citrát pufferben. A kötődött ellenanyagokat standard indirekt immunoperixidáz reakcióval vizualizáltam, kromogénként Diaminobenzidint (DAB) használtam (Dako). Az immunhisztokémiai festésekhez Abgene, Dako ellenanyagokat használtam, a gyártó utasításai alapján.

49

5.1.6. Affymetrix teljes genom-szintű génexpressziós vizsgálat Az RNA laterben konzervált és fagyasztott szövetdarabokat homogenizálás után Qiagen RNeasy Mini kittel izoláltam a gyártó utasításai alapján. A kivont teljes RNS mennyiségét abszorbancia (A260) méréssel határoztam meg, minőségét Agilent Bioanalyzer Pico 6000 Chip kit segítségével ellenőriztük. 5µg teljes RNS-ből biotinnal jelölt cRNS próbákat szintetizáltattam az Affymetrix protokoll alapján, GeneChip cDNS szintézis reagensek, minta tisztító kit és IVT (in vitro transzkripció) Labeling Kit (Affymetrix, Santa Clara, Kalifornia, felhasználásával

USA)

(https://www.affymetrix.com/support/downloads/manuals/expression_s2_manual.pdf

–

1.

version). Mintánként 10µg fragmentált cRNS-t hibridizáltam HGU133 Plus2.0 microarray-re (Affymetrix) 16 óráig 45ºC-on. A chipeket Fluidics Station 450 berendezéssel mostam, és ellenanyag sokszorozó festési eljárással a használati útmutatónak megfelelően festettem (EukGE_Ws_2v5 mosási protokoll és 10μg/ml sztreptavidin-fikoeritrin (Molecular Probes)). A fluoreszcens jeleket GeneChip 3000 leolvasóval azonosítottam 570 nm-en. 5.1.7. Affymetrix U113 Plus 2.0 teljes genom chipek statisztikai kiértékelése A minőségi elemzést a Tumour Analysis Best Practices Working Group ajánlásai alapján végeztem [153]. A leolvasott arrayképeket műterméket keresve átvizsgáltam, és megállapítottam a jelsűrűséget (present %-ot) (>25%) és az RNS lebomlás (degradáció) mértékét. Valamennyi mintából készült microarray megfelelt a minőségi követelményeknek. Az előfeldolgozást GCRMA metodikával végeztem. A szignifikáns eltérést mutató géneket lineáris modellt és bayesian megközelítést alkalmazva határoztam meg [154]. 5.1.8. Korreláció meghatározása Affymetrix és protein chip adatok között Hat Dukes D beteg tumoros és makroszkóposan ép mintájából párhuzamosan izoláltam mRNS-t és fehérjét, amelyekből Affymetrix U133 plus 2.0 teljes genom chipet és Clontech 500 AB array-t készítettem. Az AB array targetjeiként szereplő fehérjék Swissprot azonosítói alapján 481 génhez sikerült Affymetrix azonosítót rendeltem a Netaffx adatbázis segítségével. Minden fehérjéhez egy Affymetrix azonosítót rendeltem, több azonosító esetén a 3’ végen lokalizálódó próba szettet preferáltam. Az elemzést követően a két szinten mért expressziós változásokat (M érték) koordináta rendszerben ábrázoltam, majd korrelációs analízist folytattam. A legjobban korreláló értékpárok kiválogatásához az értékpárok nullától való távolságát, valamint hányadosaik nagyságát vettem alapul.

50

5.2. Lézer mikrokimetszett vastagbélminták vizsgálata 5.2.1. Mintagyűjtés A kísérletek kardinális pontja a jó minőségű és jól dokumentált sebészeti úton eltávolított makroszkóposan ép és tumoros szövetminták gyűjtése. A szövetdarabokat a kivételt követő tíz percen belül folyékony nitrogénbe helyeztem, majd -80C-on tároltam felhasználásig. A rezekátumokról fényképet készítettem és a szövettani leírásokat kigyűjtöttem. A tumorokat a szövettani leletek és klinikai vélemények alapján csoportosítottam. A mintagyűjtést TUKEB: 2005/037 számú engedély alapján végeztem. Munkám során 6 colorectális adenocarcinomát vizsgáltam meg, amelyek a vastagbél baloldalán lokalizálódtak (sigma, rectum) és DUKES B stádiumú, közepesen differenciált adenocarcinomák voltak, továbbá a tumor mellett egy polypoid képletet is tartalmaztak (1. fénykép). Ezekből a szövetekből 6μm-es metszeteket készítettem, majd LCM segítségével elkülönítettem az epiteliális és a strómális régiókat (7. ábra). A metszeteket felhasználásig -80°C-on tároltam.

1. fénykép Műtéti preparátumok előkészítése a fagyasztott metszet készítéséhez. 5.2.2. Lézeres mikrokimetszés (LCM- Laser Captured Microdissection) A szövetekből kriosztátban -20 oC-on fagyasztva 6 μm vastagságú metszeteket készítettem, amelyek az LCM-hez használt, speciális membrán (1 μm PEN) bevonatú tárgylemezre (Membrane Slide 1.0 PEN, Carl Zeiss, Jéna, Németország) kerültek. A metszeteket -80 °C-on tartottam, majd felhasználáskor etanolos hígítási sorban való fixálás után Cresyl Violet acetát alkoholban oldódó festékkel festettem. A minták teljes víztelenítése különösen fontos, ha később belőlük RNS-t izolálunk, mivel alkoholos festési protokollal igazoltan csökkenthető a

51

lézeres mikrokimetszés folyamata során fellépő RN-áz enzimek aktivitásból fakadó RNS lebomlás [81]. A lézeres kimetszéshez PALM Microbeam rendszert (PALM, Bernried) használtam. Munkám során átlagosan 5000 sejtet gyűjtöttem mintánként, melyből 5 biológiai replikátumot készítettem. 5.2.3. Teljes RNS preparátum készítése LCM mintákból A fagyasztott metszeteket felhasználás előtt etanol hígítási sorban fixáltam, majd Cresyl Violet acetate alkoholban is jól oldódó festékkel festettem. Ezt követően egy órán keresztül szobahőn szárítottam. A metszetekről lézeres mikrokimetszéssel (LCM) mikrocső kupakok (PALM adhesive cap) felhasználásával összegyűjtöttem a különböző szövettani régiókat, amelyekből Qiagen RNeasy Micro kit segítségével teljes RNS preparátumot készítettem. Az RNS koncentrációját és minőségét Agilent Bioanalyzer, automatizált kapilláris elektroforézis rendszeren ellenőriztem RNA6000 Pico Chip kit felhasználásával. A minták minőségét az RNS integritási számmal (RIN) jellemeztem, ami a 18S és a 28S riboszomális fragmentumok arányából, valamint az alapvonal által megmutatja, hogy a vizsgált minta milyen minőségű (ép vagy lebomlott) RNS-t tartalmaz. Ugyanis az RNS molekulák nagyon hamar képesek lebomlani, ami a kísérletet negatív irányba befolyásolják. Ezért az egytől tízig terjedő skálán a 7-nél nagyobb RIN értékkel rendelkező mintákat vontam be a kísérletbe. A továbbiakban a microarray vizsgálatokhoz a teljes izolátumot, kb 5-50 ng totál RNS-t használtam fel. 5.2.4. Affymetrix U113 Plus 2.0 teljes genom chipek készítése LCM mintákból 5.2.4.1. Jelölés, amplifikáció Mivel a kiindulási anyag igen kevés totál RNS-t tartalmaz, és ennek több mint 90%-a riboszomális RNS, ezért a kiindulási mintát (mRNS) sokszorozni kell, hogy a chipen történő hibridizáció után megfelelő erősségű jelet adjon. Ahhoz pedig, hogy ezeket a jeleket detektálni tudjuk, a vizsgált nukleinsav komponenseket meg kell jelölnünk. A jelölés az amplifikációval egy lépésben történik úgy, hogy biotinilált nukleotidok kerülnek beépítésre. Ehhez a két körös IVT (in vitro transzkripció) módszert használtam. Első lépésben (első kör) egy cDNS-t szintetizálunk, egy olyan poly dT oligonukleotid segítségével, ami az 5’ végén egy T7 bakteriofág promóter szekvenciát tartalmaz. A reakcióban az oligo dT a mRNS molekula poly A farkához hibridizál, és innen indul a reverz transzkripció. Így egy olyan duplaszálú hibrid molekulát kapunk, ami tartalmazza az eredeti géntermék (mRNS) szekvenciáját, valamint az újonnan szintetizált komplementer (cDNS) szekvenciát. Ezt követően az eredeti templátot (mRNS) RNaseH enzim segítségével eltávolítjuk, majd DNS 52

polimeráz segítségével duplaszálú cDNS molekulává egészítjük ki. Erről a molekuláról pedig végrehajtjuk az amplifikációt, melynek lényege, hogy T7 RNS polimeráz segítségével a cDNS molekulába épített T7 promóter szakaszról IVT-t hajtunk végre. Így az első kör végére a teljes mRNS állomány torzítatlan sokszorosított (10000x) komplementer (cRNS) szekvenciáit kapjuk. A második körben (miután kizártuk a nem polyA farokkal rendelkező komponenseket: tRNS, rRNS, miRNS esetleg genomiális DNS szennyeződés stb.) random hexamerek segítségével újabb cDNS-t készítünk a cRNS-ekről. Majd ezt ismételten 2 szálú DNS-re egészítjük ki T7 oligo dT és DNS polimeráz segítségével. Erről következik a második IVT (második kör), melynek során beépítésre kerülnek a biotinilált nukleotidok. Így az eredeti molekulával (mRNS) komplementer biotinilált RNS molekulát kapunk (jelölt cRNS). 5.2.4.2. Hibridizáció A jelölt cRNS molekulákat tömény sóoldatban magas hőfokon fragmentáljuk, majd 16 órán keresztül, 60 rpm-en, 45

O

C fokon chipre hibridizáljuk, ahol a jelölt molekulák

hozzákapcsolódnak az előre chip felszínre rögzített, ismert pozícióban lévő komplementer molekulákhoz. 5.2.4.3. Mosás, festés, szkennelés A hibridizációt követően eltávolítjuk a nem kötődött, valamint a rosszul kötődött jelölt komponenseket (cRNS). Ehhez különböző sókoncentrációjú és hőmérsékletű puffereket használunk.

Ezt követi a festés, ahol a módosított nukleotidokhoz fluoreszcens festéket

kapcsolunk. Mivel egységnyi nukleinsavhoz egységnyi festék képes kötődni (ugyanolyan G:C arány mellett), így a fluoreszcencia intenzitásból következtethetünk a nukleinsav koncentrációra, vagyis a génexpresszió mértékére. A fluoreszcens jelölés három lépcsőben történik, automatizált körülmények között, melynek lényege a következő: A biotinhoz először egy streptavidin-phicoerythrin (SAPE) konjugátum kapcsolódik. A második lépésben egy SAPE specifikus biotinilált antitesttel végzünk immunreakciót, majd a harmadik lépésben ehhez az ellenanyaghoz ismét egy SAPE molekulát kapcsolunk. Ezzel egy fordított piramis keletkezik a chip felszínen, ami jelerősítésre szolgál. Ezt követi a chip leolvasása. A chip felszínét egy lézer gerjeszti 570 nm-en, és az emittált fluoreszcens jelet 1um-es felbontással a számítógép detektálja, majd kép formátumban tárolja. Ebből a szoftver egy cella fájlt (CEL) generál. 5.2.4.4. Adatfeldolgozás, kiértékelés Az egyes cellákban (egy cella reprezentál egy gén egy bizonyos szakaszát, egy probe-ot ami 25mer hosszúságú oligo nukleotid) mért fluoreszcencia intenzitásokat egy úgynevezett CEL 53

fájl tárolja. A nyers fluoreszcencia intenzitásokból többféle módon állapítható meg a génexpressziós különbség. Ehhez a legjobb platform a BIOCONDUCTOR programcsomag, ami R környezetet használ. Számos csomag és függvény áll rendelkezésre a chip adatok kiértékelésére. Első feladat a minőség ellenőrzés (QC, quality control), melynek elvégzésével információt kapunk a hibridizált chipek minőségéről. Több eljárás is létezik erre, miszerint a jelenléti százalék (present call), ami megmutatja, hogy a gének hány százaléka expresszált a sejtben, vagyis az adott chipen hány transzkriptum adott jelet. Ez általában 25 és 45% közötti érték. Ha ettől lényegesen eltér az érték, amplifikációs vagy hibridizációs hiba lépett fel, vagy pedig a minta nem volt megfelelő minőségű. Azonban ha 7 feletti RIN értékű RNS-ből indulunk ki, ez a gyakorlatban nem fordul elő. További eszköz az RNA digestion plot, ami meredekségével megmutatja a kiindulási minta minőségét. További információt ad a fluoreszcencia intenzitás eloszlása a hibridizációról. Második feladat az előfeldolgozás (preprocessing), ami három lépésből áll: háttér korrekció, normalizáció és összegzés. Az első lépésben történik a háttérkorrekció, ahol kivonjuk a cellák körüli fluoreszcencia intenzitást a cellákban mért értékekből. Ezt követően normalizáljuk a mintákat, ami azt jelenti, hogy közös szintre hozzuk az egyszerre vizsgált és elemzett chipek fluoreszcencia intenzitás tartományát és eloszlását. Megkülönböztetünk chipen belüli és chipek közötti normalizációkat. A normalizált értékeket leggyakrabban log2 transzformáció után származtatjuk. A normalizációt az összegzés követi, ahol az egy génhez tartozó fluoreszcencia intenzitásokból egy értéket képezünk, ugyanis egy gén több ponton van reprezentálva a chipeken. Vagyis a probe-okból probe set szintű információt képzünk. Az élőfeldolgozott adatokból készül a különböző szinten expresszálódó gének kiválogatása (differential expression, feature szelekció), vagyis az a génlista, ami tartalmazza a csoportok közötti szignifikánsan expressziós különbséget mutató gének listáját. Ezeket a géneket RT-PCR-rel validáljuk, független minta szetten is, majd genetikai útvonalakba illesztjük őket. 5.2.5. Microarray adatok megerősítése valós idejű RT-PCR-rel A microarray adatok megerősítése saját tervezésű SYBR Green és kereskedelmi forgalomban kapható (Applied Biosystems) TaqMan rendszerű RT-PCR módszerekkel történt.

5.3. Metilációs vizsgálatok 5.3.1. Mintagyűjtés A sebészetileg eltávolított szövetmintákat a 5.2.1. fejezetben leírtak szerint gyűjtöttem.

54

5.3.2. HT-29 sejtkultúra demetilációs modell 5.3.2.1. Sejttenyésztés Sejttenyészetenként 1,5 millió HT-29 colon adenocarcinoma sejtet növesztettem 10 %-os FCS tartalmú (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) RPMI-1640 médiumban 37°C-on, 5%-os CO2 koncentráció mellett. 5.3.2.2. 5-aza-2’-dezoxicitidin demetiláló kezelés A demetilációs kezelést FCS-mentes médiumban 10 μM 5-aza-2’-dezoxicitidin (SigmaAldrich) ágenssel végeztem 72 órán keresztül. Kontroll vizsgálatokban a tenyészethez az 5aza-2’-dezoxicitidin oldószerét, ecetsavat adtam. 5.3.2.3. Proliferációs assay A demetiláló ágenst négy különböző (1μM, 5μM, 10μM, 20μM) koncentrációban alkalmaztam a HT-29 sejtek kezelésekor. Ezeknek a sejtek viabilitására és osztódására gyakorolt hatását az 5.4.2. fejezetben leírtak szerint vizsgáltam. 5.3.2.4. Demetiláció okozta génexpressziós változások azonosítása A metilációs gátlás alatt álló gének kezelés hatására történő kifejeződését Affymetrix U133 Plus 2.0 teljes genom microarray kísérlettel vizsgáltam. A kezelt és kezeletlen (ecetsavas kontroll) sejtekből teljes RNS preparátumot készítettem RNeasy Mini Kittel (Qiagen), amelynek épségét Agilent BioAnalyzer készülékkel ellenőriztem. A templát RNS-ként 2,5 ± 0,5 µg-ot használtam, majd egykörös IVT sokszorozó és jelölő reakciót végeztem, amely után a hibridizáció, a mosás, a festés és a leolvasás a szöveti mintákon végzett módszerrel megegyező módon történtek (5.1.6. fejezet). 5.3.3. Lézeres mikrokimetszés a metiláció hámsejtek génexpressziójára gyakorolt hatásának vizsgálatára az adenoma-carcinoma szekvencia kapcsán A 5.2.1. – 5.2.3. fejezetben leírtak alapján 5 adenoma és 5 ép-tumor mintapárt gyűjtöttem. A microarray

vizsgálatoknál

alkalmazott

módszerekkel

megegyezően

a

szövetekből

metszetkészítést, lézer mikrodisszekciót, majd RNS izolálást és minőségellenőrzést végeztem. A mintákat az RNS minőség ellenőrzés eredményei alapján RIN>6 érték felett vontam be a kísérletbe. 5.3.4. Reverz transzkripció A 15 μl végtérfogatú reakcióban MultiScribe Reverse Transcriptase enzimet (50U/μl), RNase Inhibitort (20U/μl), 10x RT puffert és 100 μM dNTP-t (Applied Biosystems, Foster City, 55

Kalifornia) adtam a mintákhoz. Az átíráshoz saját tervezésű génspecifikus primereket használtam 200 nM-os végkoncentrációban. Az enzimek hozzáadása előtt a mintákat 5 percig 65 °C-on denaturáltam, majd 4 °C-ra helyezve adtam a reakciókhoz a reverz transzkriptázt és az RNáz inhibitort, majd a mintákat 42 °C-on 30 percig inkubáltam és 85 °C-on 5 percig inaktiváltam. 5.3.5. Elősokszorozás (preamplifikáció) A lézerrel kimetszett minták korlátozott anyagmennyisége miatt a polimeráz láncreakció előtt szükséges volt elősokszorozó (preamplifikáció) lépést végeztem az átírt cDNS-en. Ez azt jelenti, hogy a mérés előtt egy olyan PCR reakciót végzünk, ahol a sokszorozást 10-12 cikluson keresztül folytatjuk, anélkül, hogy a vizsgált gének közötti expressziós különbség megváltozna. Egy 50 μl-es végtérfogatú reakcióban 5 μl templát cDNS-hez 25 μl LightCycler Probes Master-t (2x PCR reakció mix) (Roche, Basel, Svájc), 17 μl LightCycler molekuláris biológiailag tiszta vizet és 3 μl génspecifikus egyenként 200 nM végkoncentrációjú primer keveréket adtam. Negatív kontroll reakciókat is végeztem, amelyekbe a templát helyett molekuláris biológiailag tiszta víz került. A hőciklus a következőképpen zajlott: 94°C 5 perc, 12 ciklusban: 94°C 15 s, 60°C 15 s, 72°C 15 s, majd 2 perces 72°C-os végső extenzió. 5.3.6. Valós idejű PCR Az elő sokszorozott mintákat LightCycler 480 típusú Real-time PCR készüléken (Roche) 384 reakciós rendszerben SYBR Green assay-vel vizsgáltam. A reakciókat 10 μl végtérfogatban végeztem, 2x LightCycler Probes Master mix (Roche) felhasználásával a gyártói utasításoknak megfelelően. A 384 lyukú tálcák (multiwell plate) összemérése pipettázó automata segítségével (Eppendorf epMotion 5070, Eppendorf, Hamburg, Németország) történt. Minden reakcióból génenként 3 párhuzamos mérés, valamint az elő sokszorozott negatív kontroll reakciók mérése történt. A PCR reakcióban a következő hőciklust használtam: 95°C 5 perc, 45 ciklusban ismételve 95°C 10 s, 60°C 10 s, 72°C 10 s, 65°C 1 perc után folyamatos felmelegítés 97°C-ra, s végül 40°C 30 s. A hőciklus végén végrehajtott olvadási

görbe

(melting

curve)

vizsgálattal

ellenőriztem

a

képződött

termékek

specifikusságát. 5.3.7. DNS izolálás A biszulfit szekvenálás során egyrészt HT-29 colon adenocarcinoma sejtekből, másrészt sebészetileg eltávolított ép és tumoros vastagbélminták hámrétegéből izolált DNS-t vizsgáltam. A DNS izolálás mindkét esetben a High Pure PCR Template Preparation Kit 56

(Roche) használatával történt. A HT-29 tenyészet esetén a 104-106 sejtet kétszer steril PBS-sel mostam, majd az „Isolation of Nucleic Acids from Mammalian Whole Blood, Buffy Coat, or Cultured Cells” gyártói protokoll szerint végeztem az izolálást. A klinikai minták esetében a szövet darabokat 200μl 2%-os SDS oldatba helyeztem és Polytron (PT1600 E típusú) homogenizátor (Kinematica, Svájc) segítségével homogenizáltam. A szuszpenzióhoz 100μl proteináz K enzimet adtam, majd 60°C-on O/N inkubáltam. Tíz perces RNáz A kezelés (4μl 100mg/ml,7000U/ml, Qiagen) után az izoláló kit „Isolation of Nucleic Acids from Mammalian Tissue” gyártói utasításai szerint. Az eluálást mindkét esetben két lépésben, 2 x 100μl TE pufferrel végeztem, majd az izolátumok koncentrációját NanoDrop készüléken mértem. 5.3.8. Biszulfit konverzió A metiláció közvetett kimutatásának egyik legelterjedtebb formája a biszulfit átalakítás 8. ábra. A reakció során az 5. szénatomon metil csoportot tartalmazó citozinek nem változnak, míg a nem metilált citozin nukleotidok a nátrium-biszulfit hatására uracillá alakulnak. Hidrolítikus deamináció

Szulfonálás

Citozin

Citozin-szulfonát

Alkálideszulfonálás

Uracil-szulfonát

Uracil

8. ábra A biszulfit konverzió folyamata. Savas körülmények között, nátrium-biszulfit jelenlétében közt a metil csoporttal nem rendelkező citozin nukleotidok nukleofil támadást szenvednek, amely következtében uracillá alakulnak. Az 5-metilcitozin megakadályozza az aminocsoport deaminációját, ezért a molekula változatlan marad. A kép forrása: http://www.grailmaster.com/genetics/protocols.shtml-Dateien/schumachersguide1.pdf/ Így a metilálatlan citozin pozíciójában egy pontmutáció keletkezik, amely hagyományos molekulárisbiológiai módszerekkel tovább vizsgálható (9. ábra).

57

9. ábra A biszulfit konvertált DNS módosult szekvenciáját PCR reakcióval sokszorozhatjuk. A metilált - nem metilált citozinek C vagy U bázis formájában jelennek meg, ezért a bázis csere kimutatására alkalmas molekuláris biológiai módszerekkel vizsgálható. A kép forrása: Applied Biosystems, Methylation Analysis Using FFPE Samples catalog. A DNS minták biszulfit konverzióját EpiTect Bisufite kit (Qiagen) használatával végeztem a gyártói utasításoknak megfelelően. Mintánként 20μl 100ng/μl DNS oldathoz 85μl Bisulfite Mixet és 35μl DNA Protect Buffert mértem, majd a 4. táblázat hőciklusa alapján inkubáltam. 4. táblázat A biszulfit konverzió hőprogramja Denaturáció

95°C

5 perc

Inkubáció

60°C

25 perc

Denaturáció

95°C

5 perc

Inkubáció

60°C

85 perc

Denaturáció

95°C

5 perc

Inkubáció

60°C

175 perc

20°C

∞

A konvertált terméket EpiTect oszlopon köthetjük meg, majd mosási és deszulfonálási lépés után a módosított és tisztított terméket 40 μl EB pufferben eluálhatjuk. A mintákat korábbi tapasztalataim szerint érdemes aliquotokban tárolni, így elkerülhető a többszöri olvasztásfagyasztásból adódó mintakárosodás.

58

5. táblázat A PTGDR CpG szigeteinek kimutatásához tervezett oligonukleotidok regio1_F regio1_R regio2_F regio2_R regio3_F regio3_R reg1_F reg1_R reg2_F reg2_R reg3_F PTGDR_F PTGDR_R

GAGTTTTTGGTTATTTTAGTTTAAATATTA CAACAACCCCAAAACCAACAAATTA ATTATTTTTGTGGAAAAAGGTAATT CCCTAAAAAAAACCAACACTCCAATAC TGGTTTTTTTTAGGGTATTTTTTTT CCAACAACAAAAAATAATCCAACTCCTC ATTGGTGTTGGGTGTTTGGAA AACCCCAAAACCAACAAATTAC GTAATTTGTTGGTTTTGGGGTT AACACAAAATACCCCAACACC GGTGTTGGGGTATTTTGTGTT CACAAACCACTTCCCTGAAATCTG CCTGTTGCCAAGGAGAAACTAAG

A kiválasztott primer párokat (5. táblázat) a BiSearch programmal (http://bisearch.enzim.hu), a „Primer search, ePCR” felületen ellenőriztem. A program primer páronként egy terméket jósolt, a várt lokalizációban. A primerek tesztelését gradiens PCR módszerrel végeztem. Ehhez 50 μl végtérfogatú reakcióban 25 μl LC480 Probes Master mixet (Roche), 1-1μl forward illetve reverz primert (10 μM), 10ng összmennyiségű biszulfit konvertált terméket, valamint kiegészítésként PCR tiszta vizet mértem össze. A genomiális DNS-re tervezett reakció esetén a minta 20ng összemennyiségű konvertálatlan DNS volt, és az extenzió minden ciklusban 2 percig tartott. Az optimalizáláshoz minden primer párral 12 reakció gradiens PCR-t végeztem 55-75°C annelációs hőmérséklet között (6. táblázat). 6. táblázat Az optimális annelációs hőmérséklet meghatározásához szükséges hőciklus Denaturáció

94°C

5 perc

Denaturáció

94°C

20 sec

Anneláció

55-75°C 20 sec

Extenzió

72°C

Extenzió Hold

72°C

35x ciklus 1 perc

1 perc 4°C

Az amplifikált termékeket 2%-os agaróz gélen elválasztva minden primer pár esetén megállapítottam az ideális annelációs hőmérsékletet (7. táblázat).

59

7. táblázat A PTGDR gén CpG szigeteinek sokszorozásához használt annelációs hőmérsékletek Regio1

50°C

Regio2

50°C

Regio3

55°C

Reg1

62°C

Reg2

62°C

Reg3

62°C

PTGDR2kb

50°C

Ezután az összes biszulfit-specifikus PCR reakciót a gradiens PCR-nél használt protokollal megegyezően végeztem az adott primer párnak megfelelő annelálási hőmérséklettel. A termékeket 2 térfogatnyi abszolút etanollal kicsaptam, majd -20°C-on minimum 1 órán keresztül inkubáltam. Ezután a tisztított mintákat 40 μl PCR-tiszta vízben oldottam fel. 5.3.9. Szekvenáló PCR reakció A szekvenáló PCR reakciót a BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kittel végeztem. 5 μl végtérfogatban 1μl BigDye Ready Reaction mixet, 1μl (2,5x) BigDye Sequencing puffert, 1μl primert (10μM) valamint 2μl tisztított PCR terméket mértem össze. Egy mintához két reakció tartozott, egyet a forward, egyet pedig az reverz primerrel végeztem a 8. táblázat hőciklusa alapján. 8. táblázat A szekvenáló reakció hőciklusa Denaturáció

98°C

5 perc

Denaturáció

96°C

Anneláció

55°C

30 sec 1525x sec ciklus

Extenzió

60°C

4 perc

4°C

∞

5.3.10. Szekvenálás A tisztított minták kapilláris gélelektroforézise ABI PRISM 310 Genetic Analyser készülékkel történt. A futási időt a várt termékhossz szerint lett kiválasztva, ez mind a három primer pár esetén kb. 500 bp-t jelentett, így egy minta vizsgálata 60 percig tartott. A szekvenciákat a BioEdit program segítségével nyertem ki, majd a kromatogramokat is ezen a felületen ellenőriztem. 60

5.3.11. A metiláltság meghatározása biszulfit szekvenálás alapján A metilált és nem metilált CpG szigeteket egyaránt tartalmazó mintában a metilált citozinok C-ként, míg a nem metiláltak T-ként szerepelnek a szekvenogramon, amely így az adott pozícióban kettős csúcsot eredményez. A CG dinukleotidok esetén a C és T csúcsmagasságok relatív arányának [C/(C+T)] meghatározásával, meghatározható az adott pozíció metilációs %-a. (10. ábra).

T

C

→ Metiláltság %

= [C/(C+T)]

10. ábra: A heterogén metilációs mintázattal rendelkező minták szekvenogramjaiban a CpG pozíciókban, két G (fekete) csúcs közt jelentkező C (kék) és T (piros) kettős csúcsok, valamint a metiláltság százalékának megállapítására alkalmas képlet 5.3.12. Metilációs standardsor készítés Az általam vizsgált minták metilációs százalékát mesterségesen előállított metilált és nem metilált DNS minták eltérő arányú keverékével (0%, 25%, 50%, 75%, 100% metilált) felállított standard sor segítségével becsültem meg. A 100%-ban metilált PCR termék előállításához SssI. metil transzferázt (New England Biolabs, Beverly, MA) használtam a gyártó utasításai alapján. Két mikrogramm PCR terméket 160 μM végkoncentrációjú Sadenosylmethionine (SAM) metildonorral 2 óráig inkubáltam 37°C-on. A hígítási sor tagjait a 0%- os és a 100%-ban metilált termékek megfelelő arányából állítottam elő. 5.3.13. Metiláció-szenzitív nagyfelbontású olvadáspont (MS-HRM) vizsgálat A nagyfelbontású olvadáspont analízis a folyamatosan emelkedő hőmérséklet hatására megolvadó duplaszálú DNS disszociációs tulajdonságait vizsgálja nagymértékű telítésre képes interkalálódó festék (pl.: Syto9, ResoLight, stb.) felhasználásával. A metilált és a nem metilált DNS minták szekvenciája a biszulfit kezelést követően megváltozik, a nem metilált szekvenciákban a citozinok uracillá konvertálódnak és a PCR termékben A-T bázispárként jelentkeznek. Ebből kifolyólag a biszulfit-specifikus PCR során keletkező amplikonok eltérő olvadási kinetikát mutatnak, mivel a nem metilált szekvenciák a metiláltakhoz képest alacsonyabb GC tartalmuk révén alacsonyabb olvadási hőmérséklettel rendelkeznek. A reakció során a 10μl biszulfit specifikus PCR termék és 0,5μl ResoLight (20x) (Roche) festék 61

elegyét a 9. táblázatban feltüntetett hőprogram szerint inkubáltam Roche 480 LightCycler készülékben. 9. táblázat A HRM vizsgálat hőprogramja 95°C

1 perc

40°C

1 perc

60°C

1 sec

95°C

+0,03 °C/sec folyamatos detektálás (20 detektálás/°C)

40°C

30 sec

5.4. Az adenoma – carcinoma átalakulás génjeinek vizsgálata 5.4.1. Sejttenyésztés Hatlyukú plate-ben well-enként 300.000 HT-29 colon adenocarcinoma sejtet 10% FCS és gentamycin tartalmú RPMI-1640 médiumban (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 37oC-on, 5% CO2 tartalom mellett egy napig növesztettem. A kezeléseket szérum-mentes tápfolyadékban végeztem. 5.4.2. MTT sejtproliferációs vizsgálat 96-lyukú platekben well-enként 5000 HT-29 sejt raktam, majd 100 ml 10% FCS tartalmú RPMI-1640 médiumban 24 órán keresztül növesztettem. A tápfolyadékot lecserélve, szérummentes médiumban 10, 25 és 100mM NS398 (Sigma-Aldrich, DMSO-ban oldott) kezelést

végeztem

48

és

72

órán

keresztül.

Ezután

0.5

mg/ml

MTT-t

(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, Sigma-Aldrich) adtam minden wellhez, majd a plate-eket 4 órán keresztül 37oC-on inkubáltam. A médium óvatos eltávolítása után a kék formazán, amelyet MTT-ből a sejt mitokondriális dehidrogenáz enzim rendszere állít elő, DMSO-ban lett feloldva. Az abszorbancia mérését Multiskan MS ELISA plate reader (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) készülékkel 570 nm-en végeztem. 5.4.3 Microarray vizsgálatok A génexpressziós méréseket a 6.1.6 és a 6.3.2.4. fejezetben leírtak szerint végeztem. 5.4.4. Taqman RT-PCR Tizenkét kiválasztott gén (ABCA8 (Hs00200350_m1), TRPM6 (Hs00214306_m1), VWF (Hs00169795_m1),

IL8

(Hs00174103_m1), 62

LCN2

(Hs00194353_m1),CXCL1

(Hs00236937_m1), COL4A1 (Hs00266237_m1), MCAM (Hs00174838_m1), IL1RN (Hs00277299_m1), CXCL2 (Hs00236966_m1), DUOX2 (Hs00204187_m1) és SPP1 (Hs00167093_m1), referencia 18S rRNS (Hs99999901_s1)) expresszióját TaqMan valós idejű PCR módszerrel, Applied Biosystems MicroFluidic Kártyarendszeren (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) határoztam meg. A reakciókhoz mintánként 400 ng teljes RNS-ből kiindulva a Taqman Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) használatával cDNS-t szintentizáltam, az így keletkező termék minőségét pedig CK20 és PBGD valós-idejű PCR reakciókban ellenőriztem (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Switzerland). A mintákat Taqman Low-Density Array rendszeren vizsgáltam Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) alkalmazásával. A mérések az ABI PRISM 7900HT készülékben, a gyártói utasításoknak megfelelően történtek. Első lépésként az enzim aktivációjához a reakciókat 10 percig 95°C-on inkubáltam, majd ezt követte a 40 ciklusos (denaturáció: 95°C 15s, anneláció és extenzió: 60°C 1 perc) amplifikációs reakció. Az adatelemzés a korábban leírt módon (Galamb et al, 2008a), SDS 2.2 szoftver használatával történt. A delta Ct értékeket (amelyek a riboszomális 18S RNS expresszióhoz normalizált expressziót jelentik) a szövettani csoportoknak megfelelően csoportosítottam, majd Student t-tesztet végeztem az expressziós értékek csoportok közötti összehasonlítására. 5.4.5. HT-29 immuncitokémiai vizsgálat Az immuncitokémiai vizsgálatokhoz lemezenként 40.000 HT-29 sejtet citocentrifugáltam, a metszeteket 5 perces acetonos fixálás után szobahőmérsékleten 30 percen keresztül szárítottam, majd a festési lépésig -20°C-on tároltam. A HT29 sejtek immunjelölése antiCOX2 ellenanyag és Novolink Polymer Detection System (Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle upon Tyne, UK) használatával történt. Az endogén peroxidázok blokkolása 30 percen keresztül 0,5% hidrogén-peroxidos (metanolban) oldatban történt. A metszeteket 5 percig Protein Block reagenssel (Novocastra Laboratories Ltd.) inkubáltam a nem specifikus kötődések elkerülése érdekében. A metszeteket 2x5 percig tartó Tris pufferes mosás után nyúl monoklonális anti-humán COX2 IgG ellenanyaggal (1:100, clone SP21, Thermo Fisher Scientific) egy órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáltam. Kromogén szubsztrátként DAB-ot használtam, majd haematoxylin-eozin festést végeztem. Az immunfestett tárgylemezeket MIRAX DESK készülékkel (3DHistech kft, Budapest) digitalizáltam, majd a MIRAX Viewer version 1.11.43.0 és HistoQuant szoftver (3DHistech kft, Budapest) segítségével elemeztem. Az összes és a COX-2 pozitív sejt (kb. 1000) leszámolása 32x

63

nagyítás mellett történt. A kontroll illetve az NS398-kezelt sejtek esetében tapasztalt COX2pozitív/összes sejt arányában jelentkező eltérések meghatározásához t-tesztet használtam. 5.4.6. Western blot vizsgálat HT-29 colon adenocarcinoma sejteket 10% FCS tartalmú RPMI-1640 médiumban 24 órán keresztül tenyésztettem, majd szérummentes médiumban 10, 25 és 100mM-os NS398 (SigmaAldrich, 0,1% DMSO-ban oldott) kezelést végeztem 72 és 96 órán keresztül. Kontrollként vivőanyaggal (0,1% DMSO) végzett kezelést alkalmaztam. Proteáz és foszfatáz inhibitorok jelenlétében 1,5x106 kezelt sejtből Triton X-100 tartalmú lízis pufferrel szolubilis fehérje frakciókat készítettem [155]. A fehérje minták koncentrációját BCA (Pierce) módszerrel határoztam meg. A denaturált fehérjemintákat (25 mg) ezután 10%-os SDS-PAGE-n elválasztottam, majd elektroblott technikával PVDF (Biorad) membránra juttattam. Az immunreakcióhoz nyúl anti-humán poliklonális COX2 ellenanyag használtam (RB-9072, 1 mg/ml, Thermo Fisher Scientific) Tátrai et al, 2006 szerint [156]. A vizualizáláshoz ECL technikát alkalmaztam (Dako, Glostrup, Denmark) az adatok értékelése Kodak Image Station 4000MM készülékkel és a hozzátartozó Molecular Imaging Software version 4.0 (Carestream Health Inc., Rochester, NY, USA) alkalmazásával történt.

64

6. EREDMÉNYEK Ebben a fejezetben ismertetem a BIOMARKER kutatással és validációval (6.1. fejezet), valamint a vastagbél-daganatok molekuláris folyamatainak FUNKCIONÁLIS elemzésével (6.2. fejezet) foglalkozó kutatásaim eredményeit. Röviden összefoglalva: mRNS és fehérje alapú biomarker azonosítását végeztem vastagbél-daganatokban oligonukleotid és ellenanyag microarray technológiával. A kapott eredményeket validáltam, majd összefüggéseket kerestem az mRNS és fehérje szintek között. Lézer mikrodisszektált minták bevonásával meghatároztam

a

vizsgált

biomarkerek

szövetspecifikus

expresszióját.

A

lézer

mikrodisszektált minták felhasználásával meghatároztam az adenoma-carcinoma szekvencia előrehaladása során csökkenő expressziót mutató gének listáját, amelyből meghatároztam a metilációs szabályozással összefüggésbe hozható gének csoportját. Szintén az adenomacarcinoma szekvencia vizsgálatával azonosítottam azokat a géneket, amelyek expressziója a szelektív COX2 inhibitor kezeléssel reverzibilisen visszafordítható.

6.1. Biomarkerek azonosítása vastagbél-daganatokban 6.1.1. Expressziós változást mutató gének azonosítása vastagbél daganatokban mRNS és fehérje szinteken 6.1.1.1. Teljes genom szintű mRNS expressziós profil meghatározása A génexpressziós mintázat meghatározásához 6 Dukes D tumor és ép nyálkahártya mintából készült chip eredményeket használtam fel. A génszelekcióhoz SAM (Significance Analysis of Microarrays) módszert használtam. Kiválasztottam a top500 gént, tehát azoknak a géneknek a listáját, amelyek változása leginkább jellemző az ép vs. tumor átalakulásra, vagyis amelyek expressziója leginkább eltér a két mintacsoport között. A szelekcióhoz a FoldChange (LogFC) és módosított p értékeket használtam, vagyis azokat a változásokat vettem figyelembe, amelyek legalább 2x-es növekedést, vagy felére történő csökkenést mutattak tumorokban, p < 0,05 mellett. Összesen 199 csökkenő és 301 növekvő expressziójú gént azonosítottam (11. ábra), majd sejtfunkció alapján csoportosítottam. Ezt követően a listát leszűkítettem a 111 „élenjáró” változást mutató génre. A kiválogatás eredményét a 12. ábra szemlélteti. A meghatározott génekről itt is elmondható, hogy a tumorban több olyan található, amelynek expressziója fokozódott, mint amelyeknek csökkent.

65

n

n

n

n

n

n

t

t

t

t

t

t

217884_at 214662_at 209317_at 33307_at 208926_at 225903_at 201870_at 218282_at 209610_s_at 207173_x_at 225520_at 201340_s_at 201341_at 225842_at 218151_x_at 228762_at 209589_s_at 225016_at 204600_at 203119_at 217754_at 202715_at 201797_s_at 221649_s_at 200924_s_at 202357_s_at 201416_at 225150_s_at 208711_s_at 201418_s_at 225802_at 204087_s_at 228754_at 206994_at 218084_x_at 224252_s_at 213524_s_at 204051_s_at 211732_x_at 216092_s_at 203417_at 212657_s_at 205894_at 204044_at 221577_x_at 218704_at 205890_s_at 236471_at 204702_s_at 222549_at 209309_at 203961_at 206754_s_at 206286_s_at 212118_at 212059_s_at 200054_at 219105_x_at 218950_at 206855_s_at 225991_at 223056_s_at 218399_s_at 218278_at 218305_at 212810_s_at 241937_s_at 221810_at 223454_at 204588_s_at 202834_at 209396_s_at 1553959_a_at 234985_at 202925_s_at 212563_at 218412_s_at 222757_s_at 209588_at 220789_s_at 222696_at 231779_at 205264_at 204103_at 218574_s_at 214095_at 204027_s_at 230398_at 218565_at 221575_at 231843_at 225699_at 203052_at 226017_at 209784_s_at 205479_s_at 201195_s_at 209395_at 213577_at 227475_at 218145_at 205983_at 229215_at 225681_at 227140_at 213668_s_at 201261_x_at 1553970_s_at 205910_s_at 238021_s_at 206224_at 201791_s_at 232201_at 226132_s_at 204717_s_at 202580_x_at 219888_at 225777_at 209626_s_at 41037_at 204169_at 218670_at 212858_at 229758_at 235501_at 219249_s_at 218507_at 217428_s_at 218872_at 211603_s_at 238898_at 227829_at 232151_at 223055_s_at 227804_at 204924_at 205865_at 218590_at 218907_s_at 218500_at 205937_at 226552_at 209516_at 228171_s_at 203854_at 215695_s_at 236565_s_at 210132_at 204281_at 212194_s_at 59697_at 227614_at 231914_at 235099_at 209627_s_at 219874_at 229538_s_at 225806_at 212686_at 228303_at 205499_at 219956_at 219911_s_at 210319_x_at 231849_at 212942_s_at 204268_at 229667_s_at 206755_at 227194_at 226695_at 218051_s_at 204595_s_at 205114_s_at 229802_at 236179_at 210511_s_at 37892_at 204320_at 204052_s_at 205713_s_at 1552767_a_at 211470_s_at 207457_s_at 226064_s_at 224327_s_at 240045_at 202924_s_at 203256_at 238755_at 241031_at 230030_at 210163_at 210164_at 231311_at 1555310_a_at 206558_at 209955_s_at 205342_s_at 230493_at 205220_at 1554576_a_at 239433_at 214708_at 210445_at 202286_s_at 235474_at 244825_at 228262_at 203878_s_at 214511_x_at 216950_s_at 214927_at 205941_s_at 1555705_a_at 219773_at 228260_at 218944_at 224614_at 226726_at 33494_at 205530_at 213407_at 53991_at 227703_s_at 237515_at 227193_at 209442_x_at 226844_at 233587_s_at 212289_at 204491_at 204635_at 223126_s_at 203542_s_at 231925_at 241412_at 219230_at 218730_s_at 218510_x_at 204529_s_at 207977_s_at 205111_s_at 229893_at 228469_at 227176_at 226489_at 205112_at 225941_at 225939_at 241703_at 239272_at 228962_at 228885_at 218717_s_at 235849_at 219691_at 221218_s_at 219195_at 230645_at 204931_at 206710_s_at 211549_s_at 231899_at 230788_at 223449_at 222571_at 219909_at 228504_at 1553808_a_at 229839_at 203000_at 203001_s_at 206377_at 210198_s_at 206898_at 229288_at 209686_at 209169_at 220794_at 1552365_at 230830_at 206100_at 238750_at 228195_at 210739_x_at 220723_s_at 220645_at 220812_s_at 220310_at 224240_s_at 228232_s_at 213921_at 229254_at 230269_at 226492_at 215657_at 224009_x_at 223952_x_at 206784_at 204818_at 219669_at 207502_at 203908_at 207392_x_at 229070_at 223597_at 205185_at 214601_at 211494_s_at 223754_at 206149_at 206664_at 206422_at 207080_s_at 214598_at 205464_at 217110_s_at 221091_at 219132_at 213094_at 209866_s_at 235850_at 205051_s_at 230319_at 231580_at 229831_at 219728_at 242301_at 235171_at 220276_at 238533_at 235004_at 227198_at 205697_at 227705_at 228547_at 237802_at 213714_at 223942_x_at 221164_x_at 1554522_at 235976_at 232176_at 207432_at 204895_x_at 211253_x_at 215563_s_at 215321_at 1552695_a_at 1559977_a_at 232481_s_at 1552834_at 203759_at 212286_at 227231_at 227230_s_at 229369_at 220421_at 228706_s_at 205927_s_at 207504_at 205290_s_at 224027_at 220180_at 1552367_a_at 239273_s_at 208399_s_at 227048_at 215118_s_at 226208_at 218364_at 227539_at 202969_at 212573_at 226399_at 231851_at 223125_s_at 223058_at 202242_at 235496_at 224480_s_at 205042_at 212814_at 205259_at 242317_at 203913_s_at 203914_x_at 211548_s_at 203373_at 204036_at 226333_at 204037_at 211671_s_at 206637_at 212681_at 203638_s_at 203543_s_at 205593_s_at 218326_s_at 227682_at 213106_at 228961_at 235146_at 224989_at 218024_at 225475_at 219093_at 219156_at 222722_at 228507_at 225056_at 211538_s_at 225283_at 209170_s_at 204719_at 209167_at 206577_at 207245_at 220834_at 214142_at 220026_at 206209_s_at 210107_at 209301_at 205950_s_at 207003_at 219508_at 223551_at 219799_s_at 206208_at 204673_at 217109_at 203240_at 217546_at 217941_s_at 202364_at 226177_at 212594_at 200732_s_at 227052_at 204897_at 206385_s_at 212510_at 218532_s_at 202130_at 212741_at 214433_s_at 221841_s_at 212859_x_at 224959_at 221004_s_at 226147_s_at 205097_at 224963_at 219014_at 206199_at 208383_s_at 206143_at 208795_s_at 206656_s_at 222258_s_at 201391_at 201111_at 206918_s_at 210766_s_at 201558_at 214096_s_at 227558_at 200832_s_at 208540_x_at 206976_s_at 224903_at 201326_at 225541_at 224714_at 209122_at 202295_s_at 201587_s_at 219192_at 202185_at 221514_at 205194_at 226032_at 216212_s_at 200629_at 212898_at 225060_at 227378_x_at 58696_at 203124_s_at 214427_at 203510_at 225799_at 212070_at 209875_s_at 221923_s_at 208693_s_at 200837_at 214022_s_at 201601_x_at 201417_at 201315_x_at 200660_at 214039_s_at 201666_at 201506_at 202228_s_at 200845_s_at 207761_s_at

11. ábra A „top” 500 – legnagyobb eltérést mutató - gén kiválasztása normális vastagbélnyálkahártya és Dukes D tumoros minták esetében SAM módszerrel. n=ép nyálkahártya szövet (világoskék), t=tumor (sötétkék).

n

n

n

n

n

n

t

t

t

t

t

t

203000_at 203001_s_at 206377_at 228885_at 210198_s_at 239272_at 230645_at 231899_at 228195_at 226492_at 230269_at 213921_at 229254_at 1552695_a_at 232176_at 239273_s_at 232481_s_at 230319_at 205697_at 231580_at 229831_at 211494_s_at 223754_at 207504_at 228469_at 229893_at 209442_x_at 233587_s_at 231925_at 206637_at 202242_at 227176_at 205042_at 212814_at 205259_at 224009_x_at 223952_x_at 207080_s_at 207502_at 203908_at 207392_x_at 229070_at 218574_s_at 214095_at 204281_at 231914_at 204169_at 218670_at 219874_at 218507_at 225806_at 41037_at 228303_at 205499_at 1553959_a_at 234985_at 218412_s_at 212563_at 204051_s_at 209395_at 204320_at 204052_s_at 236471_at 204702_s_at 209309_at 205983_at 207457_s_at 226064_s_at 224327_s_at 240045_at 202924_s_at 203256_at 238755_at 212942_s_at 203854_at 232201_at 211603_s_at 227829_at 206558_at 225802_at 204087_s_at 228754_at 218084_x_at 224252_s_at 225520_at 209317_at 210766_s_at 214096_s_at 209875_s_at 229215_at 225681_at 227475_at 201666_at 214022_s_at 202364_at 207245_at 220834_at 214142_at 220026_at 206209_s_at 205950_s_at 209301_at 207003_at 219799_s_at 206208_at 204673_at 217109_at 203240_at 217546_at 206143_at 206199_at

12. ábra A top500 gén leszűkítése a 111 legnagyobb kifejeződés beli változást mutató génekre, tumor és ép nyálkahártya között SAM módszerrel.

66

6.1.1.2. Fehérje biomarkerek azonosítása vastagbél-daganatokban ellenanyag microarray technológiával 6.1.1.2.1. Normális és Tumoros vastagbél minták (Ép nyálkahártya vs. Dukes B és Dukes D csoportok) elkülönítése fehérje szinten A

tumoros

csoportokat

összevontan

az

ép

nyálkahártyához

hasonlítottam,

majd

meghatároztam az eltérően expresszáló fehérjék listáját. A két csoport között 67 szignifikánsan változó gént került azonosításra fehérje szinten. Ezeket a géntermékeket a funkcionális csoportosítás alapján apoptózis (5), sejtciklus szabályozás (7), transzkripció szabályozás (4), DNS replikáció (6) és molekuláris transzport, sejtadhézió (45) sejtfunkció területére soroltam be. Az expressziós különbségeket mutató gének közül a 10-10 leginkább növekedést és csökkenést mutató fehérjét sejtfunkció szerinti csoportosítását a függelék 1.táblázat szemlélteti. 6.1.1.2.2. Normális és Dukes B csoportok elkülönítése, a korai rák fehérje szintű progressziós markereinek azonosítása Dukes B csoportban 22 expressziós különbséget mutató gént találtam, amelyek szignifikáns változást mutattak fehérje szinten a makroszkóposan ép mucosához viszonyítva (függelék 2. táblázat). Ebből 9 alul- valamint 13 felülexpresszált az egészséges szövethez képest. Ezeket az ubiquitin ciklus (1), jelátvitel (8), rekombináció (1), vírus köpenyfehérje termelődés (1), sejtproliferáció (1), sejtosztódás (mitosis) (3), oxidoreduktáz (1), transzkripciós faktor (1), ismeretlen (1), DNS topológia (1), sejtmozgás (1), transzport (1) sejtfunkcióba tudtam besorolni. Néhány mintában sikerült HPV-16 vírus jelenlétét kimutatnom, de mivel ez nem volt minden mintában bizonyítható, így ennek a fehérjének a vizsgálatával a továbbiakban nem foglalkoztam. 6.1.1.2.3. Normális és Dukes D csoportok elkülönítése Dukes D csoportban 25 expressziós különbséget mutató gént találtam fehérje szinten. Ebből 13 alul, 12 felülexpresszált az egészséges szövethez képest. Ezekből az ubiquitin ciklus (1), jelátvitel (7), vírus köpenyfehérje termelődés (1), DNS javítás (3), RNS kötés (1), sejt proliferáció (3), transzláció szabályozása (1), ubiquitinyláció (1), transzkripciós faktor (1), sejtdifferenciáció (2), sejt ciklus (1), transzport (2) és a mitózis (1) sejtfunkciókat érintették. Az azonosított gének expressziós változását és sejtfunkcióját a függelék 3. táblázat szemlélteti.

67

6.1.1.2.4. Progressziós markerek azonosítása A progressziós markerek azonosítására két stratégiát állítottam fel. Az egyikben a Dukes B és Dukes D mintákból származó eredményeket közvetlenül hasonlítottam össze egy elemzésben, a másikban a külön-külön készült elemzések során kapott adatokat vetettem össze, visszakeresve azt, hogy az egyik stádiumban változást mutató gén hogyan változott a másik stádiumban. Az első megközelítéssel a korai és késői csoportok elkülönítése során 58 szignifikáns gént azonosítottam, ebből 11 mutatott jelentősebb expressziós eltérést a két csoport között (függelék 4. táblázat). A második megközelítéssel a DUKES D csoportban csökkent működést mutató géneket három alcsoportra sikerült osztani aszerint, hogy miként viselkedtek a korai daganatokban. Az első csoportba 8 gén tartozik (HPV-16, NEDD4, MRE11A, UBE2E1, EPHA4, KHDRBS1, SQSTM1, PPP1R1B), amelyek már szintén alulexpressziót mutattak DUKES B csoportban. A második csoportba azok a gének tartoznak (EIF4E, HSP90AA1, AR, LCP2) amelyek még nem mutattak látványos csökkenést korai daganatokban, de már lecsökkent az expressziójuk. A harmadik csoportba az ATP1B2 tartozik, aminek korai daganatban még enyhén emelkedett volt az expressziója. A DUKES D-ben felülexpresszált géneket szintén három csoportba lehetett sorolni. Az első csoportba azok a gének tartoznak (EGFR, NUMA1), amelyek már korai daganatokban is felülexpresszáltak. A második csoportba azokat a géneket soroltam (CAV1, TOP2B, EPS8, NPAT, STXBP1, SEMA4D), amelyek expressziós szintje korai daganatokban megkezdte a növekedést a saját normálhoz képest. A harmadik csoport tagjai, ellentétes változást mutatnak korai daganatokban (GAP43, NCF2, POLE) A Dukes B csoportban alulexpresszált gének Dukes D csoportban szintén alulexpresszáltak, a BCAT1 kivételével, ami szintén csökkent expressziót mutatott, de kisebb mértékben. A felülexpresszál gének közül 9 konzekvensen DUKES D csoportban is felülexpresszált. Négy gén (HSPD1, TOP1, PMF1, HSF4) ugyan nem mutatott DUKES D stádiumban felülexpressziót, de a protein szint növekedett. 6.1.1.3. Ellenanyag microarray eredmények validációja TMA-val 6.1.1.3.1. Normális-tumor összehasonlítás Normális és tumoros minták között a TOP1, CCNA1 és a HSP60 géntermékek fokozódását, míg az APC fehérje csökkenését sikerült TMA-val visszaigazolnom (13. ábra). A c-myc esetében ugyan szignifikáns (p=0,019) de nagyon kismértékű csökkenést (M=-0,16) tapasztaltam a protein chipen. Immunohisztokémiával jelentős mértékű csökkenést sikerült

68

igazolnom. Az AR esetében protein chip alapján csökkenést tapasztaltam, de az immunhisztokémia növekedést igazol a tumoros mintákban.

13. ábra A TMA validáció eredménye. Fentről lefelé az APC, a CYCA1, a TOP1 és az EGFR 4 kiválasztott fehérje immunfestése ép, adenoma, korai és előrehaladott tumoros mintákon. Az első oszlopban az ép nyálkahártya, a második oszlopban adenoma (kivétel az EGFR, mert a 2. kép is az ép nyálkahártya festődését mutatja) a harmadik oszlopban a korai rák (Dukes B) a negyedik oszlopban az előrehaladott daganatok (Dukes D) immunfestését láthatjuk. Az ötödik oszlop asszociációs térképen (assotiation plot) szemlélteti a változások tendenciáját, több ugyanabba a szövettani csoportba tartozó minta, várható értékhez képest történő festődése alapján. E szerint az APC kifejeződése a tumorprogresszió során fokozatosan csökken, a CYCA és a TOP1 fokozatosan növekszik, az EGFR eleinte növekszik, majd a Dukes D tumorok esetében mérséklődik [30]. Részletes szemléltetés a függelék 2. ábrán.

6.1.1.3.2. Normális nyálkahártya-korai daganat összehasonlítás A normál nyálkahártya és korai daganat csoportok között AB array vizsgálatok alapján expressziós különbséget mutató génekből (függelék 2. táblázat) 6 génterméket választottam 69

ki TMA megerősítő vizsgálathoz. Az immunhisztokémia alapján a TOP1, HSP60 és a CYCA1 array adatai kaptak megerősítést, melyek szerint a két csoport között szignifikánsan növekedett ezeknek a fehérjéknek a mennyisége. A NUMA1 esetében nem sikerült kimutatni egyértelműen a tumorokban történő expresszió növekedését. A caldesmon expresszió korrelációt mutatott a protein chip eredményekkel. Ez azonban morfológiailag csak a stromális sejtekből származott. Az EGFR a korai stádiumú daganatokban expressziós növekedést mutat az AB array adatok alapján, amit immunohisztokémiával sikerült megerősíteni. Azonban a daganatfejlődés előrehaladásával az expresszió mértéke csökken. Az array adatok alapján ép nyálkahártya és Dukes D stádiumú minták között az EGFR expresszió nem változik szignifikánsan, amit ugyanezen a csoporton végzett immunhisztokémia is igazolt. 6.1.1.3.3. Normális nyálkahártya-kései daganat összehasonlítás Normál és kései daganat relációban a TOP1, AR, EPS8, CAV1, DARPP32 és a NUMA1 fehérjék lettek TMA-val megerősítve. TMA-val egyértelmű fehérjeszintű expresszió fokozódást sikerült igazolnom a TOP1 esetében. Az AR esetében növekedett expressziót sikerült kimutatnom, ellentétben a protein chip adataival. Az EPS8, CAV1, DARPP32 és a NUMA1 esetében az immunhisztokémia során nem tapasztaltam jelentős expressziós változást fehérje szinten a normál és a késői daganatos minták között. 6.1.1.3.4. A tumor progresszió követése A daganat progressziója során talált markerek közül 3 (CBP (EIF4), ERK (MAPK12), c-myc) valamint 5 nem jelentős vagy szignifikáns változást mutató, irodalmilag megerősített fehérje GSTP, IGFR, TGFB, CALD, COX2) került TMA validációra. Az ERK fehérje esetében felülexpressziót, míg a c-myc esetében az expresszió csökkenését tapasztaltam TMA-val. CBP esetében sikerült a csökkenő tendenciát kimutatnom az előrehaladott daganatokban a korai daganatokhoz képest fehérje szinten. Ugyanezt az eredményt kaptam az EGFR esetében is. A validáció eredményét a 13. ábra szemlélteti. 6.1.2. mRNS és fehérje szint közötti összefüggések felderítése A diagnosztikában jelenleg a fehérje alapú biomarkerek a legelterjedtebbek. Azonban új fehérje szintű markerek azonosítása nem egyszerű feladat. A leggyakrabban alkalmazott szűrő módszerek fejlesztéséhez tömegspektrometriás megközelítést használnak, majd a kiválasztott markerekre immun- vagy PCR eljáráson alapuló assay-ket készítenek [87, 157]. A másik lehetséges megközelítés, hogy mRNS szint változásán keresztül markereket szelektálunk, 70

majd fehérje szinten vizsgáljuk őket tovább [121]. Ezzel a megközelítéssel hasznos ínformációk nyerhetők a sejtben lejátszódó szabályozási folyamatokról is. Munkám kísérleti elrendezését a 14. ábra szemlélteti.

14. ábra Fehérje szintű információk mérése (ellenanyag microarray (AB)), majd visszaigazolása (TMA) korai daganatok esetében (A), továbbá összehasonlítása az mRNS szinttel (B), kései daganatok esetében microarray technikák (oligo, ellenanyag, TMA) felhasználásával, ugyanabból a mintából származó mRNS és fehérje preparátumokból.

6.1.2.1. Korreláció mRNS expressziós és ellenanyag array eredmények között A vizsgált 500 fehérjéből 465 (93%) nem mutatott jelentős mértékű expressziós változást fehérje szinten. Ugyanerre az 500 génre készített lista (subset) teljes genom array vizsgálatokból származó eredménye alapján ezek a gének szintén nem mutattak jelentős változást normál és Dukes D csoportok között mRNS szinten, tehát a két platform konzekvensen ugyanazt az eredményt mérte. Az mRNS és a fehérje szint közötti összefüggéseket a 15. ábra szemlélteti.

Látható, hogy mRNS szinten sokkal nagyobb

ingadozások mérhetők, míg a fehérje szint sokkal kiegyenlítettebb, a 15. ábra első része alapján. Pozitív korrelációt 143 transzkriptum és géntermék esetében sikerült kimutatnom 71

(R2> 0,8), mely csoportba főként transzport fehérjék tartoznak. Módszerünkkel 95 ellentétesen változó gént is azonosítottam (R2> 0,9), amelyek főként a sejtfolyamatok szabályozásában érintett génekre jellemzőek. Ezt követően olyan subsetet készítettem, ahol a vizsgált sejtalkotók mindkét platformon jelentős és szignifikáns változást mutattak.

15. ábra Az mRNS és fehérje szintek közötti összefüggések ábrázolása. A transzport fehérjékre pozitív, míg a sejtfolyamatok szabályozásában résztvevő fehérjék kifejeződési szintje negatív korrelációt mutat a tumoros sejtek mRNS tartalmával.

Vizsgálatom során 12 olyan gént azonosítottam, amelyek jelentős és szignifikáns eltérést mutattak mindkét platformon az egészséges és a tumoros minták között (16. ábra). Ez a 12 értékpár a normál Dukes D minták összehasonlításából származik, és az expressziós változásuk abszolút értékben vett értéke mindkét platformon M nagyobb, mint 0,5. Ennek a kritériumnak 12 fehérje felelt meg a normál – Dukes D relációban. A vizsgált gének három csoportba sorolhatók. Az első csoportba azok a gének tartoznak, amelyeknél az mRNS szint csökkenését a fehérje szint csökkenése követte (EIF4E, AR, UBE2E1, EPHA4). Ezek a fehérjék a transzláció inicializálásában, transzkripció és sejtek közötti kommunikáció, poszttranszlációs modifikációban és a jelátviletben vesznek részt. A második csoportba azok a gének tartoznak, ahol az mRNS szint növekedését a fehérje szint növekedése követte (NCF2, TOP2B, SEMA4D, NUMA1). Ezek a fehérjék a sejtes védelmi válaszban, a DNS topológiai változásokban, az immunválaszban és sejdifferenciációban, valamint a mitózisban játszanak szerepet. A harmadik csoportban az mRNS és a fehérje szint ellentétesen változott (GLUL, GAP43, LCP2, PPP1R1B). Ezek a fehérjék metabolikus folyamatokban, sejtnövekedésben, citokin szekrécióban és negatív szignáltranszdukciós regulátorként látják el funkcióikat (16. ábra).

72

16. ábra Azonos és ellentétes irányba változó mRNS és fehérje szintek bemutatása microarray adatok alapján. 6.1.3. Expressziós változást mutató gének azonosítása az adenoma-carcinoma szekvencia előrehaladása során LCM minták felhasználásával 6.1.3.1. Lézer mikrodisszekció technikai hátterének optimalizálása Laboratóriumunkban már jól bejáratott módon működött a biopsziás minták teljes genom szintű microarray vizsgálata, azonban mikroszkópos lézertechnikával vett minták (Laser Capture Microdissection, LCM) vizsgálata ez idáig még nem folyt. Ez a szakirodalomban is igen nagy kihívást jelentett, ezért feladatom volt az LCM minták vizsgálatához szükséges vizsgálati rendszer kidolgozása, így a megfelelő minőséget adó RNS izolálási technika kidolgozása, valamint a legjobb eredményt adó amplifikációs eljárás megtalálása. 6.1.3.1.1. RNS izolálás optimalizálása Első lépésben az RNS izolálási technikát optimalizáltam. A fagyasztott metszetből történő chip-készítéshez alkalmas RNS izolálás nagy kihívást jelent egy olyan szövetből, mint amilyen a colon, mind minőségi és mennyiségi szempontból. Minőségi szempontból egyrészt az operáció során akár több óra is eltelhet a rezekcióig (a daganat lokalizációjától, az operáció körölményeitől és a tumor jellegéből adódóan), amíg az eltávolítás alatt lévő terület vérellátás nélkül marad. Másrészt egy olyan szövet, ami funkciójából adódóan magas sejten kívüli nukleáz aktivitással rendelkezik, megnehezíti a jó minőségű RNS izolálását. Harmadrészt a metszetkészítés és a fixálás igényel jól működő protokollt. Továbbá az LCM amit, szobahőn végzünk és akár több óráig is eltart (2-10), jelenti a legnagyobb próbatételt. Sikerült egy olyan fixálási és RNS izolálási protokollt optimalizálnom, amellyel elegendő és jó minőségű RNS 73

nyerhető ki teljes genom szintű microarray vizsgálathoz, akár néhány ezer sejtből is. (17. ábra) A protokoll részletes leírása az anyagok és módszerek fejezetben olvasható. A módszer segítségével méréseim szerint 10-100ng teljes RNS nyerhető.

17. ábra Az RNS izolálás optimalizálása. A hagyományos módon történő RNS izolálási megközelítésekkel izolált teljes RNS elektroferogrammja értékelhetetlen (A). Ezek a preparátumok mind minőségben, mind koncentrációban alkalmatlanok chip készítéshez. A virtuális ELFO képen, valamint az elektroferogrammon súlyosan degradálódott RNS képe látszik. (B)

Az optimalizált RNS izolálási folyamat eredménye. Az elektroferogrammon

látható, hogy intaktak maradnak a riboszomális fragmentumok, RIN>7 minőségű RNS preparátumok készíthetők. 6.1.3.1.2. Amplifikációs technika kiválasztása LCM minták teljes genom expressziós vizsgálatához Azonban ahhoz, hogy ekkora mintamennyiségű RNS-t microarray technikával vizsgálni lehessen, a jelölésen túl sokszorozni (amplifikáció) kell a minták mRNS tartalmát. Ehhez három módszert próbáltam ki (i. TALPAT (T7 RNA polymerase promoter-attached, adaptor ligation-mediated, and PCR amplification followed by in vitro T7-transcription [158]), ii. SPIA (Single Primer

Isothermal

Amplification

[159]), 2 körös

IVT (in vitro

transcription)[160]), melyek sematikus működését a (függelék 1.ábra) szemlélteti. Vizsgálataim alapján a két körös IVT (függelék 1.ábra „A” panel) bizonyult a 74

legmegbízhatóbb és konzekvens amplifikációs eljárásnak, ezért expressziós méréseimhez az LCM mintákat ezzel a megközelítéssel sokszoroztam és jelöltem. Mint sejteni lehetett, beigazolódott, hogy a TALPAT esetében végrehajtott PCR reakció végzésekor az amplifikáció telítésbe megy, így a gének közötti expressziós különbségek elmosódnak. Valamint ez a módszer nem alkalmas a kis mértékben kifejeződő (kis kópiaszámú) gének kimutatására. A legjobb reakciók is csupán 10 present %-ot (azoknak a géneknek az aránya, amelyeket detektálni tudunk a kísérlet során) adtak az Affymetrix U133 Plus2.0 típusú expressziós chipeken, a várható 25-40% helyett (általában egy szövet típusban a gének egyharmada aktív). Továbbá a módszer rossz reprodukálhatósága következtében 2 minta között csupán 50% volt az átfedés az azonosított gének tekintetében. A hibridizációt Affymetrix X3P típusú microarray-n is elkészítattem. Ez az array rendszer szintén teljes genom szintű transzkriptum analízisre alkalmas, azonban a probe set-ek a transzkriptumok 3’ végéhez közel helyezkednek el, és mindössze pár 100 bázisnyi régiót fednek le. Ezzel olyan minták vizsgálatára is alkalmas, mint pl az FFPE (formalin fixált paraffinba ágyazott) szövetek, ahol bomlott a kiindulási RNS, vagy az amplifikált minták, ahol az amplifikáció miatt a transzkriptumok 3’ vége felülreprezentáltabb. Azonban ez a kísérlet sem hozott jelentősebb minőségi javulást, tehát a TALPAT módszer csak a transzkriptumok egy részének sokszorozására alkalmas, nem jól reprodukálható módon (18. ábra). M 1 2 3 4

18. ábra A PCR-t követő mintaellenőrzés tisztítás előtt és után az „A” ill. „B” mintákból, valamint a chipelemzés statisztikai paraméterei. 75

A SPIA technológia esetében a minta sokszorozása során merült fel probléma, mivel a jelölt minták egy bizonyos mérettartományában minden esetben nem várt fragmentumokat tartalmaztak 2,5-3kb és 4kb mérettartományban. Ahogy azt a 19. ábra szemlélteti, hogy a (zöld nyíllal) jelzett 28S riboszómális fragmentum (4kb) megjelenik az amplifikált mintákban, valamint az RNS izolálásnál a magasabb kihozatal érdekében használt carrier RNS molekulák (2,5-3kb-nál piros nyíllal jelölve) is sokszorozódnak. Ha ezek a molekulák a hibridizációs oldatba kerülnek, aspecifikus kötődésükkel rontják a hibridizáció minőségét, ezáltal a chipek kiértékelhetőségét. Az nagy mennyiségben jelenlevő RNS molekulák, mint pl a 18S és 28S riboszomális fragmentumok, valamint a teljes vérből izolált RNS-ben a globin gének szubtrakció vagy redukció révén nem kerülnek vizsgálatra, mivel zavarják vagy elfedik a kis kópiaszámban jelenlevő molekulák chipen történő kimutatását. Ezért a továbbiakban a SPIA technikát nem használtam LCM minták esetében.

19. ábra A SPIA amplifikációs technika alkalmazása. A piros elektroferogramm egy teljes RNS preparátumot jelenít meg, a kék elektroferogrammon az amplifikált minta méret szerinti eloszlása látható. A piros és a zöld nyilakkal jelzett fragmentumok a nem kívánt mérettartományban felszaporodott fragmentumokat jelölik. A helyes eloszlás egy szabályos haranggörbe lenne 1-5kb (30-60s) között.

76

6.1.3.2 LCM minták teljes genom microarray vizsgálata Affymetrix U133 Plus 2.0 rendszeren 6.1.3.2.1 Az adenoma-carcinoma szekvencia előrehaladtával expressziós változást mutató gének azonosítása Munkám során 42 chipet készítettem, hat tumoros beteg hat különböző szövettani régiójának felhasználásával, amelyben (6 ép nyálkahártya, 6 polip, 6 daganat, hám és stróma régiója, valamint 3 ép és 3 adenoma nyirok follikulus régiója), melyekből 5000 - 10000 sejtet gyűjtöttem össze lézer mikrodisszekcióval. Azt tapasztaltam, hogy a hám viszonylag könnyen kezelhető, elegendő akár 5000 sejt kiemelése is, míg a stroma esetében feltétlenül szükséges volt a 10.000 sejt összegyűjtése. Ez a stróma magas kollagén tartalmával, valamint a sejtek eltérő morfológiájával, ezáltal kevesebb mRNS tartalmával magyarázható. További tapasztalatom, hogy a tumorok hám és stróma régiójából is jobb minőségű RNS nyerhető, mint az ép nyálkahártyából. Elemzéseim során meghatároztam azt a top100 gént, amely expressziója legnagyobb és legbiztosabb mértékben változik a tumor kialakulása során a hámban majd a stróma régióban. A méréssel 54763 próbával 47400 transzkriptum, ezáltal 38500 gén vizsgálható. A vizsgált gének expressziójának változását a hám esetében a 20. ábra (függelék 5. táblázat) és stróma esetében az 21. ábra (függelék 6. táblázat) hőmérsékleti térképei szemléltetik. Az expressziós változást mutató géneket 17 sejtfunkcióba soroltam be, amely szerinti csoportosítást a 22. ábra jeleníti meg.

77

n

n

n

n

n

n

a

a

a

a

a

a

t

t

t

t

t

t

234985_at 235694_at 205472_s_at 203367_at 225806_at 209784_s_at 216565_x_at 208926_at 202925_s_at 219911_s_at 204849_at 32137_at 201462_at 224791_at 226017_at 228656_at 200868_s_at 211318_s_at 223038_s_at 212312_at 218507_at 228073_at 225313_at 242214_at 230060_at 224189_x_at 233819_s_at 47069_at 210010_s_at 201927_s_at 238477_at 204862_s_at 230000_at 232151_at 1566766_a_at 226064_s_at 236565_s_at 218963_s_at 205983_at 218145_at 227037_at 234942_s_at 201802_at 201042_at 206696_at 221164_x_at 204895_x_at 206100_at 227955_s_at 235706_at 239545_at 203542_s_at 1558324_a_at 237086_at 206502_s_at 211494_s_at 208814_at 223281_s_at 222875_at 226320_at 241937_s_at 221734_at 1558080_s_at 213235_at 231793_s_at 211375_s_at 216088_s_at 202329_at 217796_s_at 227475_at 228754_at 212942_s_at 238021_s_at 217109_at 228241_at 204673_at 206262_at 205403_at 228969_at 223969_s_at 1553828_at 223597_at 214142_at 203908_at 206664_at 242601_at 220645_at 229369_at 239673_at 217110_s_at 237654_at 230660_at 225275_at 215894_at 204697_s_at AFFX-r2-Ec-bioC-5_at AFFX-BioC-3_at AFFX-BioC-5_at 203240_at 210107_at

20. ábra LCM PAM top100gén kiválasztása hámon. t=tumor, a=adenoma, n=ép hám.

t

t

t

t

t

t

n

n

n

n

n

n

a

a

a

a

a

a

231993_at 205206_at 202311_s_at 222288_at 230147_at 213943_at 221898_at 214807_at 202619_s_at 205529_s_at 210302_s_at 227475_at 229450_at 231807_at 228141_at 203817_at 226517_at 213869_x_at 201069_at 221942_s_at 226695_at 203325_s_at 221730_at 214352_s_at 218008_at 212718_at 212345_s_at 204373_s_at 218309_at 209043_at 213812_s_at 220952_s_at 1553703_at 223006_s_at 201393_s_at 212417_at 204131_s_at 209210_s_at 213905_x_at 226237_at 219087_at 227140_at 212354_at 203083_at 37892_at 204320_at 223122_s_at 229802_at 212353_at 229530_at 227235_at 211959_at 225664_at 225681_at 238617_at 226777_at 231766_s_at 212372_at 202291_s_at 238623_at 226311_at 204457_s_at 208850_s_at 203699_s_at 210511_s_at 214927_at 212344_at 204051_s_at 209955_s_at 226769_at 226930_at 204052_s_at 213909_at 205422_s_at 213068_at 204533_at 228218_at 236297_at 223475_at 205648_at 205941_s_at 209324_s_at 203854_at 209695_at 219454_at 205303_at 204114_at 228776_at 219935_at 229242_at 230493_at 202016_at 212504_at 227258_at 205950_s_at 207245_at 214142_at 204719_at 220834_at 210107_at

21. ábra LCM PAM top100 gén ábrázolása. strómában t=tumor, a=adenoma, n=ép stróma.

78

22. ábra Az adenoma-carcinoma szekvencia előrehaladása során génexpressziós változást mutató top100 gén funkció szerinti csoportosítása hám és stróma mintákban. A top100 gén vizsgálatából kiderült, hogy a gének közel negyedének (22 hám, 23 stróma) még nem ismert a genetikai útvonalakban betöltött szerepe. Az apoptózis (2,3) a proteolízis (3,3) a sejtvándorlás (2,2) és az ubiquitiniláció (1,1) mind a hámban és mind a strómában jellemző folyamatok. A hámban azonban nem szerepel csontosodás és csontfejlődésért felelős gének működésének változása (0,7), míg strómára jellemző endocitózis helyett exocitózis (1,1), immunválasz helyett stressz válasz (2,2) génjei azonosíthatók. Ezzel szemben a hámban élénkebbnek mutatkozott a transzportfolyamatok (9,6) transzkripció szabályozása (20,6) a metabolizmus, (10,3) és a sejtosztódás (5,2) génjeinek változása, melyek a proliferációt alátámasztó fokozott osztódásra és anyagcserére utalnak. Az érképződés (1,5), a jelátvitel mechanizmusok fokozódása (9,15) és az oxidációs-redukciós folyamatok megváltozása (0,2) a strómára jellemzőek. A többi sejtfolyamat, mint pl. a morfogenezis (5,7) a sejtadhézió (7,9) és a sejtvándorlás (2,2), közel azonos mértékűnek tekinthetők mindkét régióban. A kiválasztott 100-100 gén klaszter-analízise és molekuláris mintázata alapján elmondható, hogy mind a hám, mind a stróma régiókban az ép és adenoma állapot jobban hasonlít egymáshoz, mint az adenoma és a tumor állapot.

79

Munkám további részében ugyanebből a minta összeállításból származó adatsoron meghatároztam az 1000 legjobban változó transzkriptumot az adenoma-carcinoma átalakulás során. 6.1.3.3. Nyirok follikulusok vizsgálata A Peyer-plakkok szerep még nem teljesen tisztázott a vastagbél regenerációs és a tumor progressziós folyamatok során. Azonban irodalmi adatok alátámasztják, hogy ebben a régióban aktív sejtvándorlási és differenciációs folyamatok játszódnak le. Munkám során 75 olyan gént azonosítottam, amelyek kifejeződése megváltozik az adenomák kialakulásakor (23. ábra, függelék 7. táblázat).

23. ábra. A Peyer-plakkok génexpressziós vizsgálata során azonosított 75 expressziós különbséget mutató gén hőmérsékleti térképe. A génlistát a függelék 7. táblázat tartalmazza.

80

Ötvennégy csökkenő expressziót mutató gént azonosítottam, amelyek az apoptózis (3), érképződés (1), immunválasz (3), jelátvitel (2), kromatin újraszerveződés, (1) metabolizmus, (3) metiláció, (1) monocita kemotaxis, (1) aktin képződés, (1) sejtadhézió, (2) sejt differenciáció, (1) sejtfelszíni receptor, (1) sejtosztódás, (1) transzkripció szabályozás, (6) transzláció szabályozás, (3) transzport, (4) ubikvitiniláció (1) sejtfolyamatokban játszanak szerepet, további 19 transzkriptum funkciójáról jelenleg nincsen ismeretünk. Huszonegy fokozódó működésű gént azonosítottam, amelyek a katabolizmus,

(1) endocitózis, (1)

foszforiláció, (1) glikoziláció, (1) immunválasz, (2) jelátvitel, (1) metabolizmus, (2) proteolízis, (1) RNS modifikáció, (1) transzkripció, szabályozás, (2) transzport, (2) folyamatokat érintik. Hat azonosított transzkriptum funkciója ismeretlen. 6.1.4. A colorectális adenoma-dysplasia-carcinoma szekvencia előrehaladása során csökkenő kifejeződést mutató gének azonosítása LCM mintákon Affymetrix microarray vizsgálattal A tumorkialakulás hátterének kutatásakor nem csak a változást mutató gének megtalálása érdekes feladat. Célravezető lehet olyan géneket keresni, amelyek a betegség kialakulása során folyamatos (monoton) egyirányba történő változást mutatnak. Ezért olyan géneket próbáltam

keresni,

amelyek

a

vastagbél

daganat

adenoma-carcinoma

szekvencia

előrehaladása során csökkenő kifejeződést mutatnak. PAM (Prediction Analysis of Microarrays) megközelítéssel 110 olyan gént azonosítottam, amelyek kifejeződése az egészséges bélhámsejtekben intenzív, adenoma hámsejtjeiben csökkenni kezd, majd a tumoros hámsejtekben még jobban mérséklődik vagy megszűnik. Ezeket a géneket és kifejeződési szintjeiket a 24. ábra szemlélteti. A jelenség hátterében genetikai és epigenetikai események húzódhatnak meg. Kromoszóma régiók elvesztése, a génben bekövetkezett mutáció okozhatja a génműködés csökkenését. Azonban a szabályozás útján is megtörténhet mindez. A gént szabályozó transzkripciós faktorok alacsonyabb szintű kifejeződése, vagy a gének szabályozó régiójának mutációja, továbbá epigenetikai hatások, mint a DNS metiláció és a mikroRNS szabályozás okozhatja szintén a gének alacsonyabb szintű működését.

A 110 gén között a olyan molekulákat

találtam, mint a RASSF6 és a CDKN2 amelyk bizonyítottan csökkent működésű transzkripciós faktorok. Olyan molekulákat is azonosítottam, amelyek funkciója, valamint vastagbél-daganatok kialakulásában betöltött szerepe ismertelen. Ilyen pl. a GCG, NMES1 és az LRMP. A gének csökkenő kifejeződésének egyik lehetséges okát a következő fejezetben (6.5 fejezet) vizsgáltam. 81

40 0

Count

80

Color Key and Histogram

-2

-1

0

1

2

3

Row Z-Score

N

N

N

N

N

N

A

A

A

A

A

A

T

T

T

T

T

T

SLC4A4 VSIG2 230269_at MUC4.. FAM46C KCTD12 HSD11B2 241681_at LOC220729 PLA2G10 CES3 ISX MUC4. ADH1C MUC2 IL1R2 AGR2. CA2 ZG16 CA1 B3GNT7 SPON1 CHGA GCG SIPA1L2 SLC22A23 PDCD4. RAB27A CAPN5 RAB27A. NUCB2 ABP1 229147_at ERN2 MFSD4 PADI2 231925_at GNE TSPAN1 FAS OXCT1 SIAE MAOA ITM2C FAM3D C15orf48 PDCD4 AGR2 PIGR CHST5. EFNA5 RHBDL2 CHST5 MUC4 232889_at SIDT1 228642_at NR3C1 MUC5B IL1R2. RARRES1 MT1M 234563_at 244282_at MMP28 MYO1A CDKN2B C2orf88 HSD17B2. 1559910_at UGP2 SLC13A2 MCTP2 CCL28 1563792_at FAS. C1orf21 MTUS1 ALDH6A1 RASSF6 TNFRSF11A HOXA5 SLC9A2 CPM. CPM HSPA2 PROM2 PPP1R9A SPINK5 LGALS2 PKIB CHP2 PTGDR CPM.. POU2F3 ITM2A 242874_at 236610_at ANO5 FAM161B 243278_at 235201_at LRMP PTGS2 COX5A 1556395_at PEG10 234877_x_at CHRNA2 PTGER2

24. ábra Ép – adenoma és tumoros hámban azonosított 110 szekvenciálisan csökkenő expressziót mutató gén hőmérsékleti térképe. Látható, hogy az ép hámra jellemző magas expresszió az adenoma kialakulásakor mérséklődik, majd a tumorban megszűnik.

82

6.2.

Vastagbél-daganatok

molekuláris

folyamatainak

funkcionális

vizsgálata 6.2.1. Metilációs szabályozás alatt álló gének azonosítása a génexpresszió vizsgálata alapján Feltételezésem

szerint

a

tumorfejlődés

során

megváltozó

metilációs

mintázat

nyomonkövethető a génexpressziós változások vizsgálatával. Ha egy gén promóter régiójában található CpG sziget metilálódik, a szóban forgó gén kifejeződése csökken, vagy megszűnik. Ha azonban egy metilálódott szabályozó régió demetilálódik, akkor a gén újra működni kezd [161]. Ezt a folyamatot a 25. ábra szemlélteti.

25. ábra A DNS metiláció és a demetiláció transzkripcióra gyakorolt hatása. A nem metilált DNS molekulán zavartalan a gén átíródása. A szabályozó régióban bekövetkezett DNS metiláció azonban fizikailag meggátolja ezt a folyamatot. A metil csoportok eltávolítása gén zavartalan működését eredményezi. A génműködés vizsgálatával tehát nyomonkövethető a metiláció hatása. Feltételezésem szerint, ha klinikai mintából az adenoma-carcinoma szekvencia előrehaladása során azonosítjuk a csökkenő kifejeződést mutató géneket (25. ábra) majd összevetjük egy tumoros sejtkultúra modell demetilációs eredményével, akkor megkaphatjuk a metilációs szabályozás alatt álló gének listáját. Ennek igazolására egy LCM szöveti mintákból álló és egy demetilációs sejtkultúra modell miroarray vizsgálatát terveztem. A kísérleti elrendezést és stratégiát a 26. ábra szemlélteti. 83

26. ábra. A tumorfejlődéshez köthető, metiláció által szabályozott transzkriptumok azonosítása

a

génexpresszió

vizsgálata

alapján.

A

lézermikrokimetszett

mintákon

tumorprogresszió során azonosított, csökkenő működést mutató génlistát (110), a HT-29 sejtkultúrán végrehajtott demetilációs kezelés hatására fokozódó kifejeződést mutató génekkel (71) vetettem össze. A lista közös elemein (17) RT-PCR megerősítést végeztem, majd szabályozó régiójukban CpG sziget predikciót végeztem. A PTGDR gént tovább vizsgálva, promóter régióján biszulfit szekvenálást és HRM analízist végeztem, valamint a fehérje kifejeződését immunhisztokémiával ellenőriztem. A kísérleti megközelítés azon alapul, hogy a szövetekben az adenoma-carcinoma szekvencia előrehaladtával csökkenő működést mutató gének bizonyos része metiláció által szabályozott. Ennek felderítésére egy lehetséges megközelítés, ha egy tumoros sejtvonal demetilációs kezelését követően megkeressük a fokozódó működésű géneket. A két megközelítés során meghatározott génlista összevetésével azonosíthatjuk a metiláció által szabályozott géneket. Az expressziós változás független mintákon történő tesztelését követően, az érintett gének promóter régiójának in silico vizsgálata alapján a metilálódott/demetilálódott régiókat biszulfit szekvenálással elemezzük [88]. 84

6.2.1.1. HT-29 sejtkultúra microarray vizsgálata HT-29 colorectális adenocarcinoma sejtvonalat kezeltem 5-aza-2’-dezoxicitidin demetilációs ágenssel. A kezelés hatására 71 olyan gént azonosítottam, amelyek expressziója legalább kétszeresére növekedtek p<0,01 valószínűség mellett a demetiláció során. Ezek a gének az apoptózis (5), jelátviteli folyamatok (7), transzport folyamatok (3), csontfejlődés (4), immunválasz (6), gyulladás-válasz (9), transzkripció szabályozása (6), sejt proliferáció (5), sejt-sejt közötti kommunikáció (6), motilitás (4) és egyéb vagy nem ismert (16) sejtfunkciókat érintik. A két lista 17 közös elemét RT-PCR technikával tovább vizsgáltam, igazolva ezzel a chip adatok helytállóságát. A 17 vizsgált transzkriptum jellemzőinek bemutatását (annotáció) a 10. táblázat szemlélteti. Az RT-PCR megerősítéshez használt oligonukleotid szekvenciákat a függelék 8. táblázatában mutatom be. 10. táblázat Tizenhét kiválasztott transzkriptum sejtfunkció szerinti csoportosítása

Affymetrix azonosító

Génszimbólum Gén név

Sejtfunkció

1556395_at

---

---

---

229147_at

---

---

---

234877_x_at

---

---

---

223484_at

C15orf48

chromosome 15 open reading frame 48

---

236313_at

CDKN2B

cyclin-dependent kinase inhibitor 2B (p15, sejtciklus szabályozása inhibits CDK4)

217451_at

COX5A

242608_x_at

FAM161B

206422_at

oxidáció – redukció

GCG

cytochrome c oxidase subunit Va Family with sequence similarity 161, member B glucagon

204674_at

LRMP

lymphoid-restricted membrane protein

vezikuláris transzport

212092_at

PEG10

paternally expressed 10

apoptózis

226147_s_at

PIGR

polymeric immunoglobulin receptor

transzkripció szabályozás

207109_at

POU2F3

POU class 2 homeobox 3

transzkripció szabályozás

215894_at

PTGDR

jelátvitel

206631_at

PTGER2

prostaglandin D2 receptor (DP) prostaglandin E receptor 2 (subtype EP2), 53kDa prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (prostaglandin G/H synthase and cyclooxygenase) Ras association (RalGDS/AF-6) domain family member 6

1554997_a_at PTGS2 235638_at

RASSF6

--jelátvitel

jelátvitel prostaglandin bioszintézis, gyulladás válasz jelátvitel

A 10. táblázatban foglaltak alapján látható, hogy a 1556395_at, 229147_at, 234877_x_at és a 223484_at azonosítójú próbák által vizsgált transzkriptumokhoz jelenleg nem rendelhető 85

funkció. A továbbiakban ezeknek a transzkriptumoknak a funkcionális vizsgálata és tumorfejlődésben betöltött szerepüknek azonosítása érdekes kutatási téma lehet. A többi transzkriptum már funkcionálisan jól jellemzett. A GCG, CDKN2B, NMES1 és az LRMP tumorfejlődésben betöltött szerepe már bizonyított [162-166]. A RASSF6 szintén jellemzett tumorszuppresszor gén [167], amelynek transzkriptumait több különböző próba is méri a chipen, amelyből kettő mind a két (110;71) halmazban szerepelt. A 10. táblázatban csak az egyik (235638_at) azonosítót tüntettem fel, mivel a validáció során a transzkriptumnak ezt a részét vizsgáltm. Annak igazolására, hogy a metiláció melyik lépcsőben a legaktívabb, a lézerrel kimetszett mintákból származó expressziós változásokat (27. ábra bal oldali hőmérsékleti térképek) visszakerestem a sejtkultúra modell chip eredményein (27. ábra jobb oldali hőmérsékleti térképek). SAM analízis segítségével meghatároztam a TOP 100 csökkent működésű gént épadenoma (A), adenoma-tumor (B) és ép-tumor (C) összehasonlítások során. Ezeket a géneket visszakerestem a sejtkultúra chip eredményein, és meghatároztam azokat, amelyek működése sejtkultúrában az 5-aza-2’-dezoxicitidin demetilációs ágenssel történő kezelés hatására növekedett. Az elemzés eredményét a 27. A, B és C ábra szemlélteti. Kiderült, hogy az épadenoma összehasonlításban tapasztalt csökkenő kifejeződés nem egyértelműen a metiláció hatására alakul ki, hiszen a 100 kiválogatott génből a modellben mindössze 12 működése növekedett az 5-aza-2’-dezoxicitidin kezelés hatására. A metiláció által történő szabályozás a legnagyobb arányban, 55%-ban az ép és tumoros mintákból származó gének esetében igazolódott. Adenoma és tumor között 100 csökkent működésű transzkriptumból 32 esetében sikerült növekedést kimutatnom a modellben, ezzel igazolva ezek metilácóval történő szabályozását vastagbél-daganatokban.

86

LCM minták

T

AD

T

N

HT-29

CTRL

CTRL

5-AZA

5-AZA

27. ábra Metiláció által szabályozott gének azonosítása ép-adenoma (A), adenoma-tumor (B) és ép-tumor (C) összehasonlítások során LCM mintákon (bal panel). A 100 leginkább csökkent kifejeződést mutató transzkriptum (zöld területek, baloldal) HT-29 demetilációs kezelésre történő változása HT-29 sejtkultúra modellben (jobb panel). A jobboldali piros területek alapján látható, hogy az adenoma-tumor átalakulás során a gének fele inaktiválódik metilációs szabályozással. Az ép-adenoma átalakuláskor csupán néhány ilyen azonosítható. 87

6.2.1.2. RT-PCR validációs vizsgálatok 6.2.1.2.1. 5-aza-2’-dezoxicitidin kezelt HT-29 sejtkultúra A demetilációs kezelés hatásának vizsgálatához 4 különböző koncentrációban (1, 5, 10 és 20 μM) kezeltem HT-29 sejteket, majd ezeken vizsgáltam a 17 kiválasztott gén kifejeződését ecetsavval (oldószer) kezel kontrollhoz képest. A vizsgálat eredményeképpen kapott Ct értékekből dCt értékeket számoltam a GAPDH háztartási gén alapján, majd az ecetsavas kontrollhoz viszonyítva meghatároztam a ddCT értékeket, amelyeknek kettesalapú logaritmusa, tehát az expressziót kifejező értékek az 28. ábrán láthatók. A demetilációs ágenssel történő kezelés hatására bár koncentrációfüggés nélkül, de egyértelműen a vizsgált gének kifejeződése növekedett. Az azonosítókhoz tartozó géneket és jellemzésüket a 10. táblázat szemlélteti. 350 300 250 200 150 70 100 6070 60

50

50

40 0

24 26 0 23 8_x _a 48 t 7 20 7_x _a 78 t 15 68_ x_ 54 a 99 t 7 15 _a_ 56 a 39 t 5 20 _ 46 at 74 _ 20 64 at 22 20 _ 71 at 09 21 _ 20 at 92 22 _a 3 t 22 4 84 _a 61 t 47 _ 22 s_ a t 91 4 23 7_a 56 t 3 23 8_a 63 t 1 21 3_a 74 t 5 21 1_a t 58 9 20 4_a 66 t 31 _a t

40

30

30

2020

1 1μM μMAza Aza 5 5μM μMAza Aza 10 μM Aza Aza 1 10 μMμM Aza 5 20 μM Aza 20 μM Aza μM Aza 10 μM Aza 20 μM Aza

1010

R

24 26 F0 23 A8M_x 2348 1_ a 47 61t 20 8777_x B 207 _ 8 _xat 15 78668_ _ a 54 8x__ t 99 x_at 7 a 15 P_Ta_ t 1556 Gat 5639 S2 20 395_a 46 5_t 7 a 20 L4R_a t 64 Mt 2 P 20 2G_a 71 C t P0 G 21 O9U_a 20 2Ft 9 3 22 PE2_a 34 G 1t 22 C184 0 61 5o_a 47 rf t _ 48 22 Ps_ a 2921 IGt 94 R 23 174_a 56 7 _t R3 a 23 AS8_a t 63 SFt C1 6 21 D K3_a 74 N 2t 5 B 21 C1_a 58 O t P9 X5 20 T4G_a 66 Dt P31 R TG_a Et

0 0

28. ábra. A demetiláció génexpresszióra gyakorolt hatása HT-29 sejtkultúra kísérletben, különböző koncentrációjú (1 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM) demetilációs ágenssel történő kezelés hatására. Látható, hogy nem teljesen koncentrációfüggő módon, de a kezelés konzekvensen megnöveli a vizsgált gének expresszióját.

88

6.2.1.2.2. Szöveti minták génexpressziós RT-PCR validálása Az ép, az adenoma és a tumoros szövetekben a géncsoportot RT-PCR módszerrel vizsgáltam, a kapott Ct értékekből dCt értékeket GAPDH háztartási gén alapján határoztam meg, majd összehasonlítást végeztem az ép-adenoma, az ép-tumor illetve az adenoma-tumor mintacsoportok között. Az ábrákon az összehasonlításoknak megfelelően meghatározott ddCt értékek láthatóak a kettő hatványára emelve, ahol minden diagram első oszlopa a 100%-ot jelzi. Az összehasonlításokban két állapot között egy adott gén kifejeződését abban az esetben tekintettem csökkenőnek, ha a kettő hatványára emelt ddCt értéke 0,6-nál alacsonyabb volt illetve változatlannak, ha 0,6-1,2 közé esett. Az ép-adenoma összehasonlítás eredményei alapján 15 gén kifejeződése csökkent, ezek többsége legalább felére esett. Az ép-tumor összehasonlítás eredmények alapján 11 gén működése mérséklődött a két állapot között. Az adenoma-tumor összehasonlítás esetében 6 olyan gént azonosítottam, amelyek kifejeződése tovább csökken a malignizálódás során (29. ábra).

29. ábra Az RT-PCR megerősítő kísérlet eredménye, az ép-adenoma (fent), és az ép-tumor (lent) csoportok között csökkenő expressziót mutató 15 és 11 transzkriptum esetében.

89

6.2.1.3. Fehérje szintű expressziós változások igazolása Egy kiválasztott génen, a PTGDR génen további vizsgálatokat végeztem. Azért erre a génre esett a választásom, mert expressziójának csökkenését biopsziás mintákon is igazoltam, továbbá 5’ szabályozó régiójában 3 CpG szigetet azonosítottam. A PTGDR gén metiláció által történő szabályozásának bizonyításához biszulft szekvenálást terveztem. Mindezek előtt megvizsgáltam, hogy fehérje szinten is érvényes-e az adenoma – carcinoma szekvencia előrehaladásával járó fehérje expresszió csökkenés. Vizsgálataim szerint, a PTGDR expressziója csökken a tumor progressziója során (30. ábra).

30. ábra. PTGDR immunhisztokémia ép (A), adenoma (B) és tumoros (C) vastagbél metszeteken. Látható, hogy az ép nyálkahártya hámsejtjeinek citoplazmája erős pozitivitást mutat, ami adenomában csökkenni kezd, és a tumor hámsejtekben tovább mérséklődik.

6.2.1.4. CpG sziget predikció Az interneten elérhető számos olyan szoftver, aminek segítségével egy ismert szekvenciában megjósolhatjuk a CpG szigetek előfordulását. Ilyen az EMBL honlapján elérhető cpgplot nevű EMBOSS alkalmazás (http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/index.html) is, amelyet a PTGDR gén promóter szakaszának elemzéséhez használtam. Az algoritmus a szekvenciában a tapasztalt CG dinukleotid mintázatot (=a szekvenciában található olyan citozinok száma, melyet guanin követ) hasonlítja össze a várttal (=[citozinok száma*guaninok száma/szekvenciahossz]). Az alapbeállítás szerint azokon a szakaszokon, ahol a G+C tartalom meghaladja az 50%-ot és a tapasztalt/várt arány a 0.6-os értéket, ott az algoritmus CpG szigetet jósol. A program az output file-ban grafikusan megadja a tapasztalt/várt arányt, a CG százalékos arányát, valamint a jósolt CpG szigeteket. A PTGDR génhez (chr.14: 52734431-52743442) képest upstream 2000, 5000 és 10000bp szekvencia régiókat vizsgáltam. A cpgplot program 3 CpG szigetet prediktált a transzkripciós startpont előtti 2000 bp-os régióban (31. ábra, 11. táblázat).

90

31. ábra A CpG sziget predikció eredménye. A PTGDR gén esetében 3 CpG szigetet határoztam meg upstream 2000 bázison belül. 11. táblázat A cpgplot program által meghatározott három CpG szigetet tulajdonságai CpG sziget

Hosszúság (bp)

Pozíció

Elhelyezkedés a kromoszómán

1 2 3

427 259 204

(104..530) (550..808) (1059..1262)

chr.14: 52733964-52734390 chr.14: 52734410-52734668 chr.14: 52734919-52735122

6.2.1.5. Biszulfit-specifikus PCR reakció A reakcióban templátként a biszulfit konverzió termékét amplifikáljuk. Ehhez olyan primereket terveztem, mely a konverzió utáni szekvenciára specifikusak. Az interneten elérhető programok közül a MethPrimer (www.urogene.org/methprimer/index1.html) használtam, segítségével a PTGDR gén upstream régiójában prediktált CpG szigeteket lefedő régióra három primer párt terveztem az alábbi konstrukció szerint (32. ábra).

91

Chr.14 q22

PTGDR (9 Kb)

exon1

Gén

CpG szigetek Vizsgált Régiók 1 Vizsgált Régiók 2

426 bp

486 bp

600 bp

Vizsgált Régiók 3

259 bp

508 bp

204 bp

218 bp

375 bp

412 bp

2031 bp

32. ábra A PTGDR gén promóter régiójában található CpG szigetek vizsgálata. A 3 CpG sziget szekvenálásának terve. A primerek tervezésekor figyelembe kell vennünk, hogy a templát kétszálú DNS szekvenciája a biszulfit konverzió után már nem komplementer, így a biszulfit-specifikus PCR reakció során a primereket az egyik (általában a sense) szálra tervezzük. Nem ajánlott, hogy a primeren belül CpG dinukleotid forduljon elő, hiszen ennek metiláltsága befolyásolhatja a reakciót. Amennyiben ez mégis elkerülhetetlen, úgy degenerált nukleotidok használata javasolt: a forward primer esetében a C és T helyett „Y”, míg a reverz szálon G és A helyett „R”. Ezen kívül előnyös, ha a primer minél több „nem CpG szigetben előforduló” citozint tartalmaz, mert így specifikusabb a biszulfit konvertált DNS-re 33. ábra. A kontroll kísérlethez a 3 CpG szigetet átfogó 2kb méretű genomiális DNS-t felszaporító primer párt terveztem.

33. ábra CpG sziget predikció. A MethPrimer

program

által

adott

output file: az első CpG sziget szekvenciájára ajánlott primerpárok.

92

A biszulfit szekvenálással kapott eredményeim szerint a PTGDR gén promóter régiójának CpG szigetei az ép nyálkahártya sejtjeiben alig, a tumoros hámban részlegesen, míg HT-29 adenocarcinoma sejtvonalban erőteljesen metilált. A jelenséget a továbbiakban a 24 CpG dinukleotid ismétlődést tartalmazó regio2 34. ábrán történő elemzésével mutatom be. 2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

HT29

T2

N2

1

34. ábra A PTGDR regio2 forward irányból történő biszulfit szekvenálása. Az ép nyálkahártyából származó mintában (N2) a timin csúcsok (piros) magas értéket mutatnak, jelezve a nem metilált citozinok biszulfit konverzióját. A tumoros mintában (T2) magasabb citozin értékeket találtam, különösen a 2, 8, 9, 14, 15 és 23-as pozícióban. A HT-29 minta szekvenálása során csak nem konvertálódott citozineket találtam, ami erőteljes metilációra utal.

A csúcsok relatív arányából származó értékeket intenzitási térképen ábrázolhatjuk, amelyek lehetővé teszik a különböző minták metiláltsági fokának összehasonlítását. Mivel a konverzió nem 100%-ban működik, ezért annak hatásfokával korrigálni kell (10. ábra). Az összevethetőség szempontjából az eredményeket a standard sor adatai alapján számolt egyenes egyenletével korrigáltam, majd az így kapott metiláltsági százalékokat grafikusan ábrázoltam (35. ábra).

93

A CpG dinukleotidok metiláltsága 0% 0%

50% 50%

100% 100%

HT-29 HT-29 T1 T1 T2 T2 N1 N1 N2 N2

CpGpozíciók positions CpG positions

35. ábra Tumoros és ép minták metilációs %-ának ábrázolása Mivel a biszulfit szekvenálás nagyon idő- és költség igényes művelet, ennek kiváltására egy olcsóbb, és nagyobb áteresztő képességű módszert állítottam be. A biszulfit konverzió utáni HRM analízis lehetőséget ad a metiláltsági százalék becslésére, ezáltal a különböző metiláltsági fokú termékek, (csoportok) elkülönítésére. A következőkben egy mesterséges standard sor (0%, 25%, 50%, 75%, 100%), valamint 2 ép nyálkahártya és 2 tumoros minta olvadáspont különbség vizsgálatát mutatom be (36. ábra).

100%

75%

50% T1

T2

25%

N2 N1 0%

36. ábra. A regio2 HRM analízise. A standard sor (kék) alapján jól elkülöníthetők az alig metilált ép nyálkahártya (zöld) és a 10-20%-ban tumoros (piros) minták. Eredményeimet összefoglalva mind szekvenálással, mind HRM analízissel megállapítható, hogy a PTGDR promóter régiójának általam prediktált 2 számú CpG szigete nagyobb százalékban metilált a tumoros mintákban, mint az ép nyálkahártyában.

94

6.2.2. COX2-gátlás molekuláris mechanizmusának vizsgálata 6.2.2.1. Csökkent vagy fokozott működést mutató gének meghatározása ép - adenoma és ép-tumoros állapotok között PAM módszer használatával olyan géneket kerestem, amelyek kifejeződése a betegség megjelenésével konzekvensen megváltozik, így ezek segítségével az ép - adenoma, valamint az ép-tumoros állapotok az expressziós mintázat alapján elkülöníthetők. Az ép-adenoma állapot közt 20 olyan elkülönítő markert azonosítottam, amelyek közt szerepel a fokozott működést mutató cadherin 3, KIAA1199, forkhead box Q1 és a csökkent működésű carbonic anhydrase 7, glucagon, somatostatin, Spi-B transzkripciós faktor, claudin 8, bestrophin 4 és a YY peptid. A vizsgálatok azt mutatják, hogy ez az elkülönítő adatsor 100%-os szenzitivitással 100%-os specificitással rendelkezik. Függelék 9. táblázat. Az ép és vastagbél-daganatos betegekből származó biopsziák 38 génnel különíthetők el, 90.91% szenzitivitás 100% specificitás mellett Függelék 9. táblázat. 6.2.2.2. Az adenoma- CRC-specifikus markerek validációja A 12 vizsgált gén közül mind azonos expressziós tendenciát mutatott a microarray vizsgálatoknál tapasztalt eredményekkel. Közülük 9 esetében korrelált az Affymetrix microarray eredményekkel p<0,05 szignifikancia szint mellett. A kiválasztott gének expressziós változásait a 12. táblázat foglalja össze. 12. táblázat A TaqMan validáció eredménye. A chipen mért változás (FC) és az RT-PCR-rel lmeghatározott expressziós változások összehasonlítása biopsziás mintákon. RT–PCR 2(-DDCT)

P érték

0,078

0,1

0,00061

0,086

0,04

0,00006

CRC vs. ép

3,61

12,21

0,55142

202859_x_at

CRC vs. ép

20,2

148,06

0,00283

212531_at

CRC vs. ép

7,97

28,44

0,00051

Chemokine (C-X-C motif) ligand 1 Collagen, type IV, a1

204470_at

CRC vs. ép

13,1

14,32

0,0114

211980_at

CRC vs. ép

5,21

10,41

0,02831

Melanoma cell adhesion molecule Interleukin 1 receptor antagonist Chemokine (C-X-C motif) ligand 2 Dual oxidase 2

209087_x_at

CRC vs. ép

2,92

6,87

0,05209

212657_s_at

CRC vs. ép

11,99

25,28

0,00714

209774_x_at

CRC vs. ép

9,2

13

0,00204

219727_at

CRC vs. ép

9,7

30,06

0,00363

Secreted phosphoprotein 1 (osteopontin)

209875_s_at

CRC vs. ép

8,92

12,55

0,07492

Taqman azonosító

Gén szimbólum

Génnév

Affymetrix azonosító

Összehasonlított csoportok

Hs00200350_m1

(ABC1)

204719_at

Adenoma vs. ép

Hs00214306_m1

TRPM6

240389_at

Adenoma vs. ép

Hs00169795_m1

VWF

ATP-binding cassette, subfamily A (ABC1), member 8 Transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 6 von Willebrand factor

202112_at

Hs00174103_m1

IL8

Interleukin 8

Hs00194353_m1

LCN2

Lipocalin 2

Hs00236937_m1

CXCL1

Hs00266237_m1

COL4A1

Hs00174838_m1

MCAM

Hs00277299_m1

IL1RN

Hs00236966_m1

CXCL2

Hs00204187_m1

DUOX2

Hs00167093_m1

SPP1

95

Chip (FC)

6.2.2.3. A NS-398 kezelés HT-29 sejtek génexpressziójára gyakorolt hatása SAM analízissel 1925 olyan gént azonosítottam P<0,05 szignifikancia szint mellett, amelyek az NS398 kezelt csoportban a kontroll csoporthoz képest eltérő mértékben expresszálódik 37. ábra. A további leválogatás (feature selection) kritériuma az expressziós változás kettes alapú logaritmusának (log fold change (logFC)) értéke volt. Az eltérő mértékben expresszálódó gének között 1156 esetben tapasztaltam legalább kétszeres növekedést logFC>1 érték mellett, míg 769 gén esetében legalább felére csökkent (a logFC értéke 1-nél kisebbnek adódott) az expresszió a kezelés hatására.

37. ábra (A) az 1925 expressziós változást mutató gének csoportosítása és sejt funkció szerinti megoszlása. (B) 769 alulexpresszált és a (C) 1156 felülexpresszált gén sejt funkció szerinti csoportosítása. A sejt proliferációban és sejtciklus szabályzásában (mint például a fokozott működést mutató CDKN3, BTG2, TGFB1, CNOT8, KAT2B, RARRES3 CDKN2C, RARRES1, MAGED1, PPAP2A, MXD4, TENC1, SESN1, és a csökkent működésű CDCA4, VEGFA), az intracelluláris szignál transzdukcióban, a transzkripció szabályzásában, a metabolikus és transzport folyamatokban és apoptózisban (fokozott működésű CDKN2C, BIK, CASP6, TIA, DAPK3 és gátolt ANXA1, CEBPB, CBX4) szerepet játszó gének expressziója az NS398 96

kezelés hatására a döntően megváltozott. Emellett számos eltérő mértékben expresszálódó transzkriptumnak funkciója még ismeretlen. A gének funkció szerinti osztályzását az 37. ábra foglalja össze. A megállapított mRNS expressziós értékekkel korrelációban az MTT vizsgálatokban szignifikáns koncentrációfüggő sejtproliferáció gátlás volt mérhető, amit az NS398 COX2 inhibitor kezelés alkalmazott koncentrációjának meghatározására végeztem. Ez alapján elmondható, hogy 100 μM koncentrációban az NS398 jelentősen megváltoztatja a sejtek molekuláris folyamatait, a sejtosztódás gátlásán és az apoptózis fokozásán keresztül befolyásolva növekedési erélyüket. Az ép vs. adenoma csoportból 20, az ép vs. tumor csoportból 38 gént vizsgáltam (függelék 9. táblázat). 6.2.2.4. Adenoma és daganat mRNS expressziós változásainak nyomon követése NS398 kezelés hatására HT-29 sejtkultúrában A vizsgált 20 gén közül a HT-29 colon adenocarcinoma sejtekben a NS398 COX2 inhibitor kezelés hatására 17 gén expressziójában ellenkező irányú változás mutatkozott. Ebből 14 esetében (köztük a növekedett működést mutató somatostatin, claudin 8, YY peptid, és a gátolt cadherin 3, IAA1199) P<0,05 szignifikancia szint mellett 38. ábra.

38. ábra A 20 ép vs. adenoma biopsziás minta összehasonlításából származó transzkriptum működése biopsziás és HT-29 sejtkultura mintákon. A baloldalon a biopsziás mintákon azonosított 20 mRNS kifejeződését mutatom be. Ezeket a transzkriptumokat NS398 HT-29 sejtvonalon megvizsgálva azt tapasztaltam, hogy a kezelésnek köszönhetően a mRNS-ek kifejeződése ellentétesen változik normális-adenoma átalakuláshoz képest (jobb oldal).

97

A 38 CRC-marker közül (mint például a carbonic anhydrase 7, interleukin 8, melanoma sejtadhéziós molekula) 12 olyan gént azonosítottam, amelyek működését az NS398 kezelés ellenkező irányba változtatta 39. ábra.

39. ábra A 38 ép vs. tumor biopsziás minták összehasonlításából származó transzkriptum kifejeződése biopsziás és HT29 sejtkultura mintákon. A baloldalon a biopsziás mintákon azonosított 38 mRNS kifejeződését mutatom be. Ezeket a transzkriptumokat NS398 HT-29 sejtkultvonalon megvizsgálva azt tapasztaltam, hogy a kezelésnek köszönhetően a mRNS-ek kifejeződése ellentétesen változik (visszafordul) ép-tumor átalakuláshoz képest (jobb oldal).

6.2.2.5. HT-29 immuncitokémiai és Western blot eredmények A molekuláris hatásmechanizmus szempontjából nagy jelentőséggel bír a hatóanyag célmolekulára gyakorolt hatásának vizsgálata. Fontos meghatározni, hogy a gátlás enzim szinten funkcióvesztéssel történik, pl. a célfehérjéhez történő specifikus vagy aspecifikus kapcsolódással, vagy valamilyen szabályozási folyamaton keresztül, a fehérje képződését, ezáltal aktivitásának csökkenését okozza. A NS398 kezelés során a COX2 fehérje kifejeződésének koncentráció függő gátlását vizsgáltam. A kontroll mintákban a COX2-pozitív/összes sejt aránya 80,5% volt, míg a 10 μM kezelés hatására 77,0%-ra, a 25 μM NS398 kezelésre 61,2%-ra esett vissza. A NS398 dózisának további emelése (100 μM) a pozitív sejtek arányában (53,1%) szignifikáns esést eredményezett.

A

COX2-pozitív

sejtek

esetében

erős

granuláris

citoplazmatikus immunfestés volt tapasztalható (40. A és B ábra).

98

és/vagy

diffúz

40. ábra NS398 kezelés hatása HT-29 sejtekben a COX2 fehérje kifejeződésére. A kezeletlen sejtek (A) döntő többsége COX2 pozitív, míg a 100mM-os kezelés jelentősen lecsökkenti a fehérjét termelő sejtek számát. A Western blot eredmények az immuncitokémia vizsgálatokban tapasztaltakkal egyeznek (41. ábra). A COX2 fehérje kifejeződésben jelentős csökkenés volt tapasztalható a 96 órán át tartó 50 és 100 μM koncentrációban alkalmazott NS398 kezelés hatására.

41. ábra Az NS398 kezelés hatása a COX2 kifejeződésre. A 96 órás kezelés 2 nagyobb koncentrációja közel felére csökkentette a termelődő COX2 fehérje mennyiségét. Fehérje szintű vizsgálataim alapján megállapítható, hogy az NS398 kezelés a COX2 fehérje képződésének gátlásán keresztül fejti ki hatását. 6.2.2.6. Szövetspecifikus expresszió meghatározása Annak meghatározására, hogy ezek a módosulások melyik szövettani régió sejtjeiben jönnek létre, lézer mikrodisszektált mintákat használtam fel ép, adenoma daganat stróma és hám régiójából. Ennek alapján elmondható, hogy a jelek döntő többsége a hámból származik. A lézer mikrodisszektált mintákban az adenoma asszociált génexpressziós változások 65%-a a hámsejtekből származott, míg a CRC markerek 53%-a volt hámsejt eredetű. 99

7. MEGBESZÉLÉS 7.1. Biomarkerek azonosítása vastagbél-daganatokban 7.1.1. mRNS és fehérje alapú biomarker szelekció, korrelációs vizsgálatok A bioekvivalencia vizsgálatok fontos szerepet töltenek be mind a biomarker kutatásban, mind a molekuláris sejtfolyamatok megértését segítő funkcionális kutatásokban. A humán genomban 23.000 fehérjekódoló gént feltételeznek, pontos szám még mindig nem ismert, melyekről megközelítőleg 50-60.000 transzkriptum szintetizálódhat, köszönhetően az érési változatoknak (alternativ splicing). Fehérje szinten 2-300.000 molekulát különböztethetünk meg. Mivel a teljes proteóm jelenleg nem definiált célpontok mérésén és azonosításán alapuló megközelítéssel (untargeted) vizsgálható (MS és 2DE), ezért kézenfekvő megoldásnak tűnik a transzkriptomikai oldalról történő megközelítés, ahol jelenleg megvannak a technikai feltételei a teljes genom szinten történő vizsgálatoknak. A probléma az, hogy nem rendelkezünk teljes ismerettel az mRNS szintről kapott információ fehérje szintre történő átültetésére. Ez a lépcső számos olyan folyamatot rejt magában, mint pl. a transzkripció utáni események (géncsendesítés, splicing), a transzláció szabályozása, valamint a transzláció utáni események (glikoziláció, foszforiláció, dimerizáció, komplex képzés) amelyek egyedi kombinációja génenként eltérő konverziós hatásfokot eredményezhet. Továbbá a mennyiségi információk változását fehérje szinten az aktivitás változása nem minden esetben követi. Ebben a jelenségben szerepet játszhat a DNS-ben bekövetkezett mutáció, amelyik a képződő fehérje mennyiségére nincsen hatással, viszont az aktivitására igen. Az, hogy a vizsgált mRNS szint változását a fehérje hogyan követi, valamint ez hogyan mutatható ki, sok paraméter befolyásolja. Biológiai oldalról a sejtekben, térben és időben elkülönülő folyamatok éppúgy hatással vannak az mRNS és fehérje szint közötti összefüggésekre, mind a térszerszerkezet, a funkció és a szabályozás. Vagyis az mRNS a sejtben milyen gyorsan indukálódik, mennyire stabil, mikor képződik róla fehérje, milyen mennyiségben és az meddig van jelen a sejtben. Ilyen megfontolásból minden génre egyedi összefüggések állapíthatók meg. Azonban mint eredményeimből is kiderül, a hasonló funkciójú és szabályozású molekulapárok együttesen vizsgálhatók és expressziós változásuk szintjének változására összefüggések állapíthatók meg. További befolyásoló tényező a szövet homogenitása. Mivel itt nem lézer mikrodisszektált mintákból készült a kísérlet, a tumor- és más- sejtek aránya az egyes szöveti régiókban jelentősen befolyásolhatja a mérési eredményeket. A megoldás olyan vizsgálati rendszerek 100

fejlesztése lehet, ahol ugyanazon szövetdarabból folyik a DNS, RNS és fehérje preparátumok készítése. Technikai oldalról a platformok közötti különbség, vagyis a méréstechnikai háttér okozhat különbséget. Más elven működik az mRNS chip és más elven a protein. Továbbá az sem mindegy, hogy a technológiával a molekula melyik részét mérjük. Különösen igaz ez az mRNS-re, ahol a 3’ végtől való távolodás tendenciózus jelintenzitás csökkenést mutat a technológiából adódóan. A méréseket az is befolyásolja, hogy az alkalmazott módszerek csak szemikvantitatív módon alkalmasak a mennyiségi meghatározásra. 7.1.1.1. Protein chipek eddigi alkalmazásai A protein chipeket leginkább szignáltranszdukcióban szerepet játszó molekulák expressziós változásának mérésére és a fehérjék aktivációs állapotának (foszforiláció) vizsgálatára használták. A technológia fejlődésével azonban egyre inkább előtérbe kerül az expressziós profilok meghatározása is. RPA (reversephase array) segítségével lézer mikrodisszektált mintákon 29 szignáltranszdukcióban résztvevő gén foszfoproteomikai profilja alapján sikerült elkülöníteni a primer tumor mintákat a metasztázisoktól [168]. Fontos megjegyezni, hogy korábbi AB array-vel végzett tanulmányok alapján szintén kevés gén mutatott kétszeresére növekedett vagy felére csökkent expressziót fehérje szinten. Ezért az expresszió változásának mértéke helyett célszerűbb a csoporton belüli varianciát figyelembe venni, amit a p értékkel jellemeznek az elemzések során. Más tapasztalatok is azt mutatják, hogy a 0,5 - 0,7-es M értékek elfogadható fehérje szintű változásokat jelentenek, vagyis a fehérje expresszió 140%ra történő növekedése és 70%-ra történő csökkenése jelentős változásnak tekinthető [152]. 7.1.1.2. Szöveti microarray megerősítés A CCNE1 és CCND1 génekről leírták, hogy vastagbél-daganatokban emelkedett expressziót mutatnak, sőt a CCND1 emelkedett szintje a betegek plazmájából is kimutatható. Ezzel a megfigyeléssel az Ab/ellenanyag array eredménye egybecseng, miszerint a tumorokban a fehérje családba tartozó CCNA1 felülexpresszál. Ezt TMA-val is sikerült igazolnom. Az MRE11A gén egy olyan sejtmagi fehérjét kódol, amelynek a RAD50 és NBS1 fehérjékkel alkotott komplexei a homológ rekombinációban, valamint a telomer régiók fenntartásában, továbbá a duplaszálú DNS töréseinek kijavításában vesznek részt, tehát a MMR gének közé sorolható [169]. Ellenanyag (AB) array-n végzett megfigyeléseim egybecsengenek Giannini és munkatársai eredményeivel [106], miszerint a MRE11 gén a vastagbéldaganatokban csökkent expressziót mutat, feltehetően a génben bekövetkezett mutáció következtében képződő trunkált fehérje miatt. Azonban ezt a megfigyelést immunhisztokémiával nem 101

sikerült megerősítenem, miszerint ennek a fehérjének az expressziója nem változik sem korai, sem késői stádiumú daganatokban. Microarray felhasználásával azt találták, hogy az oszteopontin szintje adenomákban megemelkedik, míg tumorban 15x-ös, metasztázisokban pedig 27-szeres expressziós növekedést mutat [170, 171]. A caldesmon 1 ugyan alacsonyszinten expresszálódik a colorectalis adenocarcinomákban (GeneAtlas), de kimutatták, hogy ennek az aktin-kötő fehérjének fontos szerepe van a sejtek invazivitásában [172]. A caldesmon 1 ektopikus expressziója gátolja az ECM degradációt, valamint csökkenti a podosome-ákat és az invadopodiát. Tehát a caldesmon 1 és a vele kölcsönhatásban álló fehérjék vizsgálata fontos lehet a tumorprogresszió megítélése szempontjából. A caldesmon esete a microarray rendszerek egy speciális hibalehetőségére hívja fel a figyelmet, mégpedig a szövet specifikus expresszió mértékének mérésére, valamint a minta homogenitására. Azon túlmenően, hogy a caldesmon nem a hámban expresszálódik, hanem a sima izmokban és a strómában is jelen van, leginkább a kriptákat körülölelő sejtrétegekben jellemző. Az AB array-n mért M=-0,39 azt sugallja, hogy ez a fehérje a tumorokban csökkent

expresszióval működik.

Az

immunohisztokémiai

vizsgálatok

eredményei alapján pedig egyértelműen látszik, hogy a tumorok bizonyos strómális sejtcsoportjaiban sokkal kifejezettebben működik. Az ellentétes expressziós érték oka lehet, hogy a tumor strómális részeiben erősebben fejeződik ki, de ezek a régiók fajlagosan ritkábbak. Valamint az is elképzelhető, hogy a mintavétel során az ép nyálkahártya simaizommal kontaminálódott. Ezért nagyon fontos visszaellenőrizni a marker lokalizációját és szövet specifikus expresszióját. 7.1.1.3. Felhasználási lehetőségek Eddigi eredmények azt mutatják, hogy a betegség során megjelenő mRNS expressziós különbségek visszaigazolhatók fehérje szinten is. Azonban a visszaigazolódás mértéke jelentősen függ a vizsgált génektől (funkció, szerkezet) és az alkalmazott módszerektől. Immunhisztokémiával sikeresen validáltak teljes genom microarray módszerrel kiválasztott CRC specifikus markereket, mint pl.: az oszteopontin, oszteonektin [88, 89]. Arra is sikerült fényt deríteni, hogy a fehérje szinten mért változások irányukban megegyezhetnek, de mértékükben eltérhetnek az mRNS-hez képest. A VEGF mRNS és fehérje szintű expressziójának tanulmányozásakor vese tumorokban (RCC) fokozott VEGF expressziót mutattak ki, azonban egyértelmű összefüggést nem sikerült azonosítani az mRNS és a fehérje szint között. Mint az eredményekből kiderült, ennek legfőbb oka az alkalmazott vizsgálati módszerek lehetnek [173]. Haemapoetikus őssejtekben 1200 fehérje MS vizsgálatakor a 102

vizsgált fehérjék 32%-a korrelált az mRNS-ekkel, bizonyítva ezzel a differenciáció során lezajlódó poszttranszkripcionális módosulások szerepét [96]. 7.1.1.4. A korai és késői daganatok elkülönítése Vizsgálataim a cluster- és a TMA alapján készült asszociációs plotok elemzése alapján azt mutatják, hogy a két klinikai csoport (Dukes B és Dukes D) között nincs jelentős molekuláris eltérés a vizsgált 500 fehérje paraméter tekintetében. Felmerülhet egy molekuláris szempontból történő csoportosítás szükségessége és lehetősége a klinikai szempontok figyelembevétele helyett. A tumor progressziója során azonban bizonyos fehérjék folyamatos emelkedést (Top1, HSP60) és csökkenést (APC) mutatnak. Az EGFR szintén stádiumfüggő expressziót mutatott, ugyanis a tumor növekedési szakaszában igen erőteljesen fejeződött ki, ami a metasztatizáló képesség megjelenésekor látványosan lecsökkent. 7.1.1.5. Validációs eredmények alátámasztása Korábbi eredményeinkkel egybecsengenek azok az irodalmi megfigyelések, melyek szerint egyetlen marker nem alkalmas a CRC betegségcsoportok elkülönítésére. Ezért olyan marker kombináció azonosítását terveztem, melyek alkalmasak lehetnek elkülönítésre [30, 95]. (42. ábra).

42. ábra Egészséges és tumoros vastagbélminták elkülönítése 6 fehérje alapú biomarker (CycA, Ar, Top1, TGFB, Hsp60, ERK) használatával, azok TMA mérésekből származó intenzitási értékei alapján. 103

A marker szet-ek diszkrimináló erejének tesztelését független minták bevonásával végrehajtott TMA rendszeren végeztem. A score értékek alapján végzett cluster analízis által meghatároztam egy hat markerből álló kombinációt (CycA, Ar, Top1, TGFB, Hsp60, ERK), amellyel egyértelműen elkülöníthetők a tumoros és ép csoportok (42. ábra).

43. ábra Diszkriminancia analízis a vizsgált markerek elkülönítő erejének tesztelésére. A hat kiválasztott marker „dimenzió redukciójával” az ép és tumoros csoportok nagy biztonsággal elkülöníthetők. Csoportok: 1=ép, 2=Dukes B, 3=Dukes D. A hat fehérje szöveteken történő együttes vizsgálatával a korai és késői daganatok elkülönítése az egészséges vastagbél szövettől 90.9%-os és 100%-os biztonsággal lehetséges, továbbá a korai és az előrehaladott tumorok az esetek 96%-ában elkülöníteníthetők egymástól (43. ábra).

104

7.1.2.

A

colorectalis

adenoma-dysplasia-carcinoma

szekvencia

génjeinek

azonosítása LCM mintákon Vizsgálatom során a talált gének jelentős része még nem jellemzett vastagbél-daganatokban, szövetspecifikus expresziójukról pedig nagyon keveset tudunk. Lézer mikrodisszekciós publikált adatok hiányában eredményeimet más munkacsoportok sejtkultúrákon vagy szöveten végzett kísérleteivel vetettem össze. 7.1.2.1 Hám markerek jellemzése az adenoma-carcinoma szekvencia előrehaladása során LCM mintákon Méréseim szerint a MUC4 gén csökkenő expressziót mutatott az adenoma carcinoma szekvencia előrehaladtával a hámban. Biemer-Huttmann, A. E. munkacsoportja szerint a MUC4 gén a vizsgált hiperplasztikus vastagbél polipok felében csökkent expresszió volt tapasztalható, míg a minták másik felében az ép állapothoz közeli értéket mutatott. A gén kifejeződése az immunhisztokémiai vizsgálatok alapján az elemzett fogazott adenomák mindegyikében teljesen lecsökkent [174]. Prosztatarákban is jelentősen lecsökken a MUC4 gén kifejeződése, amelyet RT-PCR, immunoblot technikával igazoltak [175-178]. Számos vizsgálat bizonyította a MUC4 gén daganatfejlődésben és metasztázis szabályzásában betöltött szerepét. Ektopikusan kifejezett MUC4 hatására (pl. NIHT3 fibroblaszt sejtek esetén) a sejtek növekedése fokozódik, kolónia formáló képessége és motilitása megnő, továbbá nude egerekbe subcutan injektálva tumorképződést indukál [179]. Az interlektin kifejeződése MPM (malignus pleurális mesothelioma) betegekben RT-PCR, IHC, Western-blot technikákkal végzett vizsgálatok eredményei szerint akár 139-szeresére is megnövekszik [180]. A lektinek a veleszületett immunrendszer tagjai, feladatuk a bakteriális sejtfal komponenseinek felismerése. Affymetrix microarray vizsgálatok Taqman validációját követően elmondható, hogy a rendszeresen dohányzók légúti epitéliumát nem dohányzó emberekével összehasonlítva az interlektin gén kifejeződésében jelentős csökkenés tapasztalható [181]. A MUC2 gén 126 CRC-s beteg vizsgálata alapján a daganatokban csökkent mértékben fejeződik ki. Expressziós szintje összefüggést mutatott a nyirokcsomó metasztázis mértékével és az Dukes szerinti stádium besoroltsággal, tehát a tumorprogresszióval [107]. A cink-ujj (zinc-finger) motívum transzkripciós faktorok családjába tartozó Krüppel-like faktorok (KLF) szerepet játszanak a növekedés, a proliferáció, az apoptózis és az angiogenezis szabályozásában. A rákos megbetegedésekhez több KLF is köthető. A vastagbéldaganatok esetén ilyen a KLF9, amely RT-PCR technikával 50 vizsgált tumor 86%105

ában alacsonyabb kifejeződést mutatott az ép mucosához hasonlítva p<0,0001 érték mellett. A KLF kifejeződés Western blot alapján a tumoros minták 65%-ban csökkent, illetve megszűnt. TMA vizsgálatok alapján az ép minták 81%-ban volt jelen a KLF9 fehérje, ezzel szemben a tumoros szövetek mindössze 9%-ban volt kimutatható [67]. Az MACC1 (metastasis associated in colon cancer 1) gén jelentős fokozódását tapasztaltam a tumoros hámsejtekben, ami egybecseng Boardman et.al eredményével, mely szerint a hepatocita növekedési faktor (HGF)/HGF receptor (MET) szignalizációs útvonal a vastagbél daganatok malignus transzormációjával és metasztázisával hozható összefüggésbe [182]. A MACC1 egy olyan újonnan felfedezett gén, amely képes szabályozni az említett szignalizációs kaszkádot. További vizsgálatok alapján a gén fokozott működése szignifikánsan korrelál a vastagbéldaganatok progressziójával és mind a malignus transzformáció, mind a metasztázis kialakulásának esélyével II és III stádiumú betegekben [182]. Ezen kívül egyéb vizsgálatok is igazolják a MACC1 metasztatizáló hatását. A MACC1 gén kifejeződése tumoros szövetekben a metasztázis kialakulás és az áttétek kialakulása nélküli túlélési idő szempontjából önálló prognosztikus faktorként használható. A HGF receptorát kifejező gén a MACC1 transzkripcionális targetje. A gén képes proliferációt, inváziót és HGF-indukálta szóródást előidézni vastagbéldaganatos sejtvonalakban, valamint tumornövekedést okozni egér modellekben [183]. A BCL2 családba tartozó gének 30 elsődleges colorectális carcinomában és 24 adenomatózus polipban immunfestéssel vizsgálva az egészséges állapothoz képest az adenomák 60%-ban és az adenomatózus polipok 50%-ban mutattak növekedést (p=0,0001 érték mellett). Öt tumoros és tumorhoz közel eső szomszédos ép szövet immunoblot vizsgálataiban szintén emelkedett kifejeződés volt tapasztalható az anti-apoptotikus

Bcl-XL fehérje esetén, míg a Bcl-2

esetében csak kevés százalékban volt jellemző[184]. Gyomorrákos biopsziákban Kondo és munkatársai a bcl-XL és bcl-2 mRNS szinteket PCR és immunblot módszerekkel vizsgálva a bcl-xl gén fokozott működését azonosították mind RNS, mind fehérjeszinten. A Bcl-xl és a Bcl-2 gén egyaránt képes az apoptózist, a sejtciklust és a sejtciklusba való belépést szabályozni [185]. CRC-s szövetekben génkópiaszám többlet miatt a C20orf24, AURKA, RNPC1, TH1L, ADRM1, C20orf20 and TCFL5 gének szignifikánsan overexpresszálódnak az adenomás állapothoz képest. A meghatározott géncsoport fontos szerepet tölthet be a kromoszóma instabilitással összefüggésbe hozott adenoma-carcinoma progresszióban [186]. Huszonhét egészséges és 258 adenocarcinomás vastagbélszövetet összehasonlítva a mikroszatellita instabil (MSI) tumorok 78%-ban emelkedett a Keratin23 kifejeződése, míg 106

mikroszatellita stabil (MSS) daganatokban ez nem volt tapasztalható. Immunhisztokémiai vizsgálatok során az MSI tumorok keratin23 negatívak, míg az MSS daganatok és az ebből kialakult metasztázisok erősen keratin23 pozitívak voltak. A gén kifejeződésében lévő különbségek alapján a keratin23 egy újabb elkülönítő marker lehet a két daganattípus közt [94]. A dipeptidáz-1 gén (DPEP1) cDNS microarray vizsgálatok alapján a kontrollhoz képes akár kétszeresére is megnövekedett expressziót mutathat vastagbél-daganatokban [187]. PSMA7 proteaszóma alegységet kódoló gén a 20. kromoszómán helyezkedik el és megemelkedett kifejeződése a CRC-vel és a májban kialakult metasztázisokkal függ össze. Jól ismert, hogy a gén hibás aktivációja képes befolyásolni a vastagbélben fejlődő rákos sejtek metasztatizáló képességét [115]. Amennyiben a PSMA7 gént RKO vastagbélrákos sejtekben RNS interferencia segítségével lecsendesítik, úgy a letapadás-független sejtnövekedés, az invázió illetve a migráció is gátlás alá kerül. Ezenfelül, a PSMA7 depléció során a RKO sejtek in vivo tumorigenitása csökken [115]. A PSMA7 gén RT-PCR vizsgálatok eredményei alapján a daganatos szövetekben 37%-ban felülexpresszált, míg az egészséges mintákban nem fejeződött ki. A gén magas szintje jól korrelált a májáttétek kialakulásával (p=0,028), valamint a vizsgált egyének túlélési idejével [116]. A humán Drosophila tribble homológok egyike, a TRIB3 gén bizonyos fehérjéket képes ubiquitin ligáláson keresztül degradálni, ezzel fontos sejtciklus szabályozó szerepet tölt be. Húsz rákos sejtvonalat (nyelőcsőrákos: TE-8, TE-10, gyomorrákos: MKN45, hasnyálmirigy rákos: MIAPaCa-2, PANC-1, PSN-1, májrákos: HuH-7, HepG2, Hep3B, HLE, HLF, PLC, HuCCT-1, vastagbélrákos: Caco2, DLD-1, LoVo, HCT116, HT-29, KM12SM és SW480) megvizsgálva azt volt tapasztalható, hogy a sejtvonalak 90,9%-ában kifejeződik a gén, amelynek RNS interferenciával való csendesítése a sejtek növekedésének csökkenését eredményezte. 202 CRC-s betegekből eltávolított tumorok vizsgálata során a TRIB3 gén megemelkedett expressziója tapasztalható az egészséges mintákkal összehasonlítva [188]. A TRIB3 gén az Akt és az S6 kinázok negatív regulátora, emellett kapcsolatban áll a sejtciklus szabályzó CtIP (CtBP interacting protein) fehérjével, amellyel a HeLa sejtek sejtmagjában pontszerű struktúrákban kolokalizál. A gén esetében számos daganatos szövetben emelkedett expresszió tapasztalható [105]. Resistin-like molucule-beta, azaz a RELM béta gén egy intesztinális kehelysejt-specifikus fehérje, amely a min egér intesztinális tumoraiban és vastagbél-daganatos sejtkultúrákban egyaránt megnövekedett expressziót mutat. 80 CRC-s beteg 65%-ban jelen volt a RELM beta 107

fehérje, többnyire a vastagbél mucosa rétegében, a citoplazmában. A kifejeződés mértéke korrelált a szövettani stádiummal és a nyirokcsomókban jelentkező metasztázis mértékével is, de a korral, nemmel, tumor lokalizációval és mérettel, Dukes stádiummal és májban jelentkező áttétek számával nem. A RELM beta kifejeződése szorosan korrelált a CDX-2 transzkripciós faktor expressziójával (p<0,01) [63]. A RELM beta kifejeződése RT-PCR vizsgálatok, és immunhisztokémiai eredmények alapján gyomor metaplasya esetén jellemzően fokozott kifejeződést mutat, míg az egészséges mucosaban jelenléte nem tapasztalható [63]. 7.1.2.2. Stroma markerek jellemzése A karbonsav-anhidráz 1 a szén-dioxid reverzibilis hidratációját végzi, fontos szerepe van a CO2 celluláris diffúziójában, az ion transzportban és a pH szabályozásában is. A CA1 gén két promóterrel rendelkezik. Felnőtt vastagbél epitéliumban a proximális promóter magas szintű kifejeződést mutat, míg a disztális eritroid promóter működése gátolt. RNS in situ hibridizációs vizsgálatok alapján a CA1 mRNS szintje a vastagbél kriptáinak lumináris felszín felé haladva növekszik. Kifejeződése a differenciálódó sejtjeiben magas, ugyanakkor a lumináris felszínen alacsony. A kripták alapi részén nem mutatható ki a CA1 gén kifejeződése. A gén kifejeződését valószínűleg különböző transzkripciós és/vagy mRNS stabilitás határozza meg. Ezzel ellentétben a CA1 fehérje többnyire a lumináris felszínhez közel jellemző, így feltételezhető, hogy a gén expressziója poszttranszkripcionális szabályzás alatt is áll. Vastagbél tumoros szövetben és FAP adenomákban a CA1 gén jellemzően csökkent működésű, amelynek következményeképpen a differenciált hámsejtek száma lecsökken [189]. A karbonsav anhidráz enzimek fontos szerepet töltenek be a különböző daganatos megbetegedések kialakulása során. Néhány izoenzim pH szabályzó a tumorokban, így működésük a rákos sejtek tulajdonságait nagyban meghatározzák. Immunhisztokémiai vizsgálatok alapján a CA1, CA2 és CA 13 gének kifejeződésében egyaránt jelentős csökkenés tapasztalható a neoplasztikus és az egészséges vastagbélszövetet összehasonlítva. Ezt az expressziós változást okozhatja egy általános transzkripciós faktor hiánya vagy a fent említett három 8. kromoszómán közel elhelyezkedő, potenciális tumorszuppresszor gén együttes elvesztése [190]. A hZG16 (Zymogen granule protein 16) egy Jacalin domaint tartalmazó humán szekretált fehérje. A különböző ortológok evolúciós vizsgálata alapján a ZG16 egy konzervált gén, melyre tisztító szelekció hat. Az RT-PCR, Northern blot és immunhisztokémiai vizsgálatok 108

alapján a hZG16 expressziós szintje hepatocelluláris carcinomában (HCC) jelentősen lecsökken [112]. OTSCC (oral tongue squamous cell carcinoma) minták (53) és 22 egészséges szövet teljes genomszintű vizsgálata alapján az ABCA8 tumoros állapotban csökkenő expressziót mutat [191]. Az activin (INHBA) gén kifejeződése 46 nyelőcsőből származó mintában (9 Barrett metaplázia, 7 BM/low grade diszplázia, 8 low grade diszplázia, 7 high grade diszplázia, 15 nyelőcső

carcinoma)

oligonukleotid

microarray

és

RT-PCR

vizsgálatai

alapján

megállapítható, hogy a Barrett metapláziához képest a nyelőcső carcinomában akár 5,7-szeres génexpressziós növekedés tapasztalható [192]. Kilencven szövet (79 nyelőcső carcinoma, 8 diszplázia és 3 Barrett metaplázia) immunhisztokémiai vizsgálata alapján az INHBA fehérjeszintű kifejeződése a nyelőcső carcinomában a legnagyobb (69,9%), a diszpláziás szövetekben és a Barrett metapláziás mintákban ennél alacsonyabb (37,5% és 33,3%). INHBA-célzott knock down OE-33 nyelőcső carcinoma sejtekben a kezeletlen kontroll csoporthoz képest csökkenő proliferáció tapasztalható. Demetiláló ágenssel kezelt sejtekben az INHBA mRNS és fehérjeszintű kifejeződése egyaránt megnövekedett. Ezek alapján a gén epigenetikai szabályzás alatt állhat és hatással van a proliferáció mértékére [192]. 96 tüdőminta (86 tüdő adenocarcinoma és 10 egészséges tüdőszövet) oligonukleotid microarray vizsgálata alapján az INHBA expressziója a tumorban átlagosan 3,1-szeresére emelkedett az egészséges mintához hasonlítva, amely együtt járt a megbetegedés rosszabb prognózisával. 187 tüdőminta (164 adenocarcinoma, 6 bronchioalveoláris carcinoma és 17 egészséges tüdő) és egészséges tüdőminták immunhisztokémiai vizsgálatának eredménye megerősítette az inhibin beta a magasabb fehérjeszintű megjelenését adenocarcinomában (78,7%) és a bronchioalveoláris carcinomákban (66,7%) egyaránt. H460 sejtekben az INHBA gént célzott csendesítése a proliferáció csökkenéséhez, míg a 5-aza és trichostatin A kezelés az INHBA gén fokozott működéséhez vezetett [193]. 8 fej-nyakrákos (HNSCC) sejtvonal komparatív genom hibridizációs és oligonukleotid microarray vizsgálata alapján az INHBA gén erősen megnövekedett expressziót mutatott. Klinikai mintákban az INHBA kifejeződése szignifikánsan magasabb volt az egészséges mintákban tapasztalt értékeknél, amely a páciensek rövidebb betegség mentes túlélési idejével korrelált [194]. A XI. kollagén alfa-1 láncát kódoló gén (COL11A1) egészséges vastagbél-szövetben nem expresszálódik, de a legtöbb sporadikus vastagbél-daganat stromális fibroblaszt sejtjeiben 109

igen. Az APC gén csíravonalbeli mutációja a vastagbélben megjelenő polipok mellett stromális fibroblaszt sejtek miatti tünetekkel is jár, amely a COL11A1 gén kifejeződésével lehet összefüggésben. A legtöbb CRC a konstitutívan aktivált Wnt útvonal miatt alakul ki, leggyakrabban az APC gén inaktiválása vagy a beta-catenin aktiválása következtében. FAP betegekből és sporadikus vastagbél-daganatok vizsgálata alapján a COL11A1 gén mind a FAP, mind a sporadikus vastagbél-daganatok esetében az APC/beta-catenin útvonallal áll kapcsolatban [195]. Az intesztinális extrecelluláris mátrix nagy részét alkotó kollagén számos biológiai folyamat tagja, ilyen például a sejtalak kialakítása, a proliferáció, a migráció, a differenciáció, az apoptózis és a carcinogenezis is. RT-PCR vizsgálatok eredménye szerint a COL11A1 gén egészséges mintákban nem, de a tumoros szövetekben (79%) expresszálódott. Az eredmények szerint a COL11A1 stromális kifejeződése összefüggésben állhat a vastagbél-daganatok malignizálódásával [196]. A WNT-2 gén több malignus szövetben felülexpresszálódik. 120 vastagbél daganat immunhisztokémiai vizsgálata alapján a sejtmembránban és a citoplazmában lokalizálódott és 61,7%-ban overexpresszálódott. Ez a növekedés azonban nem függött össze szignifikánsan sem a tumor lokalizációjával, klinikai stádiumával sem az 5 éves túléléssel. Az eredmények alapján a WNT-2 fehérje vastagbéldaganatok kialakulásának egy korai fázisában játszhat szerepet [197]. RT-PCR és direkt szekvenálás alapján a Wnt-2 gén a tumoros vastagbél szövetekben jelentősen overexpresszálódik az egészséges mintákhoz képest. Ez a gén az emésztőrendszer egyéb kórképeiben, mint például a gyomor illetve nyelőcső carcinomákban valamint stenosis és pseudo-tumor-asszociált diverticulitisben. A WNT-2 gén a vastagbél polipokban a tumor-stroma interakció következtében gyakran felülszabályozódik, az elsődleges vastagbél-daganatban és a máj metasztázisban is [198]. A Wnt-2 gén 5’ régiójában megtalálható az ösztrogén receptor, a GATA-1, az AP-2, a TCF1, a BHLH, a MBF-1, a p53 és a HNF-5 kötőhelye is. A gén MCF-7 sejtekben beta-ösztradiol hatására overexpresszálódik, amelynek következményeként a WNT-beta katenin útvonal aktiválódik és carcinogenezishez vezet [199]. A gyulladásos folyamatok során az egyik legnagyobb komplikációt jelentő tényező a fibrózis kialakulása, mint ahogy az a Crohn-betegség és a colitis ulcerosa esetében is ismert. Egy vizsgálat során trinitrobenzén szulfonsav-indukált colitis modellben a COL1A1 profibrinogén extracelluláris mátrix gén fokozott működése volt tapasztalható. Colitis ulcerosa-ban

110

szenvedő betegek gyulladt vastagbél mucosa-jában a COL1A1 gén kifejeződése megemelkedik [105]. Az adenovírusok gén- és onkolitikus terápiás alkalmazása fejlődik, leggyakrabban a p53 gén a bejuttatott tumorszuppresszor. A terápia alkalmazása nem mindig sikeres, ugyanis az adenovirálisan bejuttatott p53 ellen rezisztencia alakulhat ki, többek közt a tumoros szövetekben gyakran túlexpresszálódó LRRC15 tumor antigén hatására. Bár az LRRC15 önmagában nem gátolja a p53 funkcióit, de a sejtfelszínen lévő coxsackie-vírus adenovírus receptormintázat megváltoztatásával lecsökkenti a sejtbe jutott adenovirális p53 mennyiségét [200]. Duktális carcinoma és invazív duktális carcinoma minták microarray vizsgálata alapján az LRRC15 gén részt vehet a mellrák inváziójában [201]. 8 daganatos és 8 egészséges vastagbél szövet vizsgálata alapján a tumor mikrokörnyezetében a CXCL10 megnövekedett expressziója az NK sejtek felhalmozódásához vezet [202]. A Forkhead box Q1 (FOXQ1) gén a forkhead transzkripciós család tagja, a gyomorsav szekrécióban és egerekben a mucin gén expressziójában vesz részt. A gén kifejeződési szintje CRC-ben akár 28-szoros növekedést mutathat. Egy kromatin immunprecipitációs vizsgálat szerint a FOXQ1 egyik célpont génje a p21, amelynek kifejeződése a FOXQ1 gén RNS interferenciával való csendesítése után lecsökkent. A FOXQ1 gént stabilan overexpresszáló H1299 sejtekben magasabb p21 szint, megemelkedett tumorigenitás és gyorsabb tumor növekedés tapasztalható. Mindemellett a p21 kiütött H1299/FOXQ1 sejtekben felgyorsul a tumor növekedés, így a FOXQ1 gén hatása a p21 géntől függetlenül történhet. Egy H1299/EGFP és H1299/FOXQ1 sejtek microarray vizsgálat eredményei szerint a FOXQ1 fokozott kifejeződése miatt a tumor növekedésében szerepet játszó gének (pl.: VEGFA, WNT3A, RSPO2, és BCL11A) túltermelődnek. TUNEL festés során a FOXQ1-mediálta angiogenetikus és antiapoptotikus hatások láthatóak in vivo. Összefoglalva a FOXQ1 fokozott működése vastagbélrákos szövetben, a tumorigenitás és a tumornövekedés irányába hat [203]. Az orrgarattumoros és egészséges orrgarat biopsziák RT-PCR módszerrel való vizsgálata alapján a KCNJ8 gén a daganatos szövetben túlexpresszálódik [112]. Egészséges és daganatos vastagbélszövetek microarray vizsgálata alapján a THY-1 gén megemelkedett expressziója a daganatos betegek vérszegénységének mértékével mutatott összefüggést [204]. A prosztata stroma meghatározza az epiteliális differenciációt és fejlődést, valamint a prosztatarák kialakulásában is potenciálisan részt vesz. A daganat-asszociált stromára a CD90/THY1 megemelkedett kifejeződése jellemző [205]. 111

7.2.

Vastagbél-daganatok

molekuláris

folyamatainak

funkcionális

vizsgálata 7.2.1. A colorectális adenoma-dysplasia-carcinoma szekvencia előrehaladása során csökkenő expressziót mutató gének funkcionális jellemzése Vizsgálataim során olyan géncsoportot tanulmányoztam, amelynek tagjai vastagbéldaganatokban előzetes microarray adataink alapján csökkenő mértékben fejeződnek ki az adenoma-carcinoma szekvencia előrehaladtával, majd ugyanezek a gének a sejtkultúra modell vizsgálatban demetilációs kezelés hatására aktiválódtak. Ezeknek a géneknek lézerrel kimetszett mintákban és a HT-29 colon adenocarcinoma sejtekben tapasztalt működésbeli változásai eredményeink szerint metilációs szabályozással függnek össze. A kezelt HT-29 sejtkultúrában a DNS metiltranszferázok gátlószerének, az 5-aza-2’dezoxicitidin demetiláló ágens koncentrációjának függvényében génenként eltérő mértékben, de egyértelműen a génkifejeződés növekedett, bár nem koncentrációfüggő módon (26. ábra). Ez azt jelenti, hogy a vizsgált géneket metiláció szabályozza. Optimális hatóanyag koncentráció azonban nem állapítható meg a tökéletes demetilációhoz. Ennek oka lehet pl a sejtek 5-aza-2’-dezoxicitidin demetilációs ágenssel szemben való érzékenysége, vagy az egyes gének más-más módon történő reakciója. Ez alól csak a CDKN2B kivétel, ahol egy alternatív szabályozási folyamat (pl. a gént csendesítő metilációs gátlás alól felszabaduló miRNS) létezését feltételezhetjük. Mivel a demetilációs kezelés hatására ennek a génnek az aktivitása csökkent, a szabályozása nem hozható összefüggésbe közvetlenül a metilációval. A demetilációs kezelés hatására azonban olyan miRNS jelenhet meg, amelyik a CDKN2B transzkriptumát képes RNS interferenciával elcsendesíti. A CDKN2B esetében a csendesítés miatt adenomában az eredeti szint negyedére (26%) míg tumorban közel tizedére (15%) csökkentette a gén működését. A szöveti minták eredményei arra utalnak, hogy az általam vizsgált 17 gén közül az épadenoma összehasonlításban 15, míg az ép-tumor összehasonlításban 11 gén esetében tapasztaltam csökkent a kifejeződés. Az adenoma-tumor állapot közt 4 gén esetében mutattam ki jelentős mértékű csökkenést (27. ábra). Ez az eredmény arra utal, hogy a metiláció már az adenoma kialakulása során csendesíti a vizsgált gének működését, és ez a folyamat a tumor előrehaladása során erősebbé válik. Előzetes feltevéseink szerint a géncsoportban sikeresen validáltam olyan tumorszupresszort, mint a RASSF6, amely fontos szerepet játszik a normális sejtfejlődés, illetve az apoptózis mediálásában [167, 206]. Eredményeink az irodalmi adatokkal megegyeznek, ugyanis ez a 112

gén igazoltan epigenetikus szabályzású, daganatképződés során CpG-sziget hipermetiláció miatt működése megszűnik. Tapasztalataim szerint az RASSF6 mind adenomában (58%), mind tumorban (26%) csökkent aktivitású. A méhnyakrákban jellemzően aberráns DNS metilációjú POU2F3 gén vizsgálatainkban szintén csökkent (75%, 35%) [164]. Az interferon-gamma (IFN-γ) által serkentett PIGR gén terméke a gyulladásos folyamatokban játszik szerepet, fő feladata a polimer IgA-k transzcitózissal való kiürítése. Irodalmi adatok szerint HT-29 sejtekben aktivitása jelentősen megnő [207]. 7.2.1.1. A metiláció azonosítása A metiláció egyik legelterjedtebb kimutatási reakciója a báziscserét okozó biszulfit konverzió. Azonban, mint azt az eredményekből is láthatjuk, a módszer nem tökéletes. A konverziós procedúra során a DNS molekula összetörhet, így annak egy része tovább nem vizsgálható. Ehhez hozzá adódik a biszulfit konverzió hatásfoka, ami a méréseim szerint kalibrációs sor alkalmazásával jól becsülhető. Az egyik legnagyobb problémát a primer tapadási helyének nem tökéletes konverziója okozza. Ugyanis ha ez a molekula részlet nem tökéletesen konvertálódik, a közbezárt szekvenciapopuláció csak bizonyos hányadát tudjuk tovább vizsgálni. Ebben a szelektált populációban az eredetitől eltérő metilációs arányt mérhetünk. A másik kritikus pont a szöveti minták heterogenitása. A különböző szövettípusokra más-más metilációs mintázat jellemző. Ezek együttes vizsgálata megnehezíti a szövetek metilációs vizsgálatát, mivel az alkotó sejttípusok metilációs mintázata eltérő lehet. Továbbá a tumorok egyes mikrokörnyezetében is találkozhatunk más-más metilációs mintázattal. Ehhez megoldást a lézeres mikrokimetszés jelenthet, azonban ennek technikai feltétele még nem biztosított. A biszulfit konverzió relatíve sok kiindulási genomiális DNS-t igényel, ami LCM mintákból nehezen megoldható. Megoldás lehet olyan precíziós, szenzitív biszulfit konverziós és visszaizoláló rendszerek fejlesztése, amelyek relatíve kis mennyiségű kiindulási mintából is hatékonyan, nagy pontossággal és jól reprodukálható módon működnek. Az ellenanyag és MBP alapú metilációs vizsgálatok csak a metilált szakaszok kimutatására alkalmasak, a pontos metilációs pozíciók nem állapíthatók meg, továbbá nehéz különbséget tenni a gyengén és erősen részlegesen metilált, valamint a teljesen metilált szekvenciák között. Az általam vizsgált microarray Affymetrix azonosítók közt adódott olyan, amelyhez annotált gén, így funkció sem rendelhető. A nagy áteresztő képességű microarray szűréssel és az azt kiegészítő, demetilációs kezeléssel sikeresen válogattam ki olyan géneket, amelyek aberráns DNS metiláció miatt a vastagbél-daganat előrehaladásával egyértelműen 113

összefüggésbe hozhatóak. Az ilyen daganatspecifikus, C-típusú (cancer-related) metilációt mutató gének a jövőben a diagnosztika és terápia szempontjából egyaránt hasznos biomarkerek lehetnek. A chip adatokkal és a validációs eredményekkel külön-külön is igazolható, hogy bizonyos gének metilálódása már az adenoma kialakulásakor megfigyelhető, viszont az adenoma-tumor átalakuláskor több gén szabályozása valósul meg a metiláció révén. A gyakorlatban ennek azért lehet fontos szerepe, mert a betegség korai felismerését követően lehetőség nyílhat specifikus demetilációs kezelésekre, vagy célzott génaktivációs módszerek alkalmazására. 7.2.2. COX2-gátlás molekuláris mechanizmusának vizsgálata A COX2 inhibitorokról ismert tény, hogy familiáris adenomatózus polyposis (FAP) betegek kezelésében alkalmazva a colorectális polipok száma jelentősen csökkenthető [208, 209]. A szelektív COX2 inhibitorok szintén hatékonyan megelőzhetik a sporadikus adenomatózus polipok (adenomák) kialakulását azáltal, hogy használatukkal a colorectális adenomák polypectomia utáni 3 éven belüli megjelenése nagymértékben visszaszorítható [210]. Mindemellett használatukat a fellépő kardiovaszkuláris mellékhatások nehezítik meg [211, 212]. A vastagbél-daganatos betegek szelektív COX2 inhibitorokkal való kezelése kevésbé lehet eredményes, mivel a megnövekedett COX2 expresszió a vastagbél-daganatok kialakulásának már korai fázisában is jellemző [101, 213], de a jelenség mögött álló pontos molekuláris biológiai okok egyelőre még nem tisztázottak. A nagy áteresztőképességű szűrőmódszerek, mint például az mRNS expressziós microarray vizsgálatok használatával a szelektív COX2 inhibitorok COX2 mellett előforduló más molekuláris target molekulái kerültek azonosításra annak érdekében, hogy a prosztatarákban [214, 215] és vastagbél-daganatban [216] kifejtett rákellenes hatásmechanizmusát jobban megértsük. Vizsgálataimban

a

NS398

szelektív

COX2

inhibitor

adenoma-és

CRC-asszociált

génexpressziós profilokra gyakorolt hatását elemeztem HT-29 sejtvonalon teljes genom szintű HGU133 Plus 2.0 microarray rendszeren. Emellett a NS398 teljes génexpresszióra gyakorolt módosító hatását is vizsgáltam abból a célból, hogy a tumor különböző szövettani régióiban (hám, stroma) az inhibitor által befolyásolt egyéb target molekulákat és genetikai útvonalaikat felderítsem. Eredményeim alapján az NS398 visszafordítólag hat a colorectalis adenomacarcinoma szekvenciával párhuzamosan változó gének kifejeződésére. A NS398 az adenomában

jelentkező

expressziós

különbségek

visszafordításában

hatékonyabbnak

bizonyult, mint a carcinoma állapotban, ezzel rámutatva, hogy a vastagbél-daganat 114

kialakulásának korai fázisában alkalmazva hasznos kemopreventív szer lehet. Biopsziás mintákon

vastagbél-daganat

és

adenoma-specifikus

génexpressziós

mintázatokat

azonosítottam, amely molekuláris alapú diagnosztikus osztályozásra is alkalmasak lehetnek. Bár a colorectális adenoma és adenocarcinoma hám eredetű elváltozásnak tekintendő, a tumor mikrokörnyezetének, ezáltal a rákos és stroma sejtek, valamint a bevándorló őssejtek és limfociták interakciójának a tumor fejlődésében és progressziójában kritikus szerepe van. Emiatt a biopsziákon mért mRNS expresszióban tapasztalt változások – amelyek hám és strómasejteket egyaránt tartalmazó biopsziás mintákból lettek meghatározva – szövettani eredete (sejttípusra történő visszavetítése) lézer mikordisszektált minták felhasználásával került azonosításra. A kapott microarray eredmények a korábban publikált adatokat megerősítik, miszerint a szelektív COX2 inhibitorok rákellenes hatása az anti-proliferatív és pro-apoptotikus tulajdonságukban rejlik [102, 105-108, 113, 214, 216, 217]. A NS398 sejtproliferációt gátló hatását tapasztaltam microarray méréseim alapján. A kezelés hatására megváltozó sejtfolyamatok a sejtciklus G1 fázisban való megrekedését okozták, ahogy az már az irodalomban szerepel [107]. Ez a hatás nem csak a p27KIP1 által jöhet létre [107], hanem a p18-INK4C (CDKN2C) és CIP2 (CDKN3) fokozott működésén keresztül is. Vizsgálatom során utóbbiak a NS398 kezelés hatására akár 4,5-szeres felülexpressziót mutattak. A p53 által indukálható BTG2 (amely HT-29 sejtekben NS398 hatására 4,6szorosára növekedett) szintén részt vesz az NS398 anti-proliferatív aktivitásában a cyclin D1 szint csökkentésével, a sejtciklus G1-S fázisok közti átmenet gátlásán keresztül [217]. Az MTT proliferációs tesztek eredményei szintén a NS398 sejtproliferációra gyakorolt gátló hatását erősítik meg. A COX2 NS398 általi gátlása a rákos sejtekben arachidonsav felhalmozódáshoz vezet, így apoptózist indukál. A nem-szteroid gyulladáscsökkentő gyógyszerek (NSAID) által kiváltott sejthalál, viszont a COX2-től független úton is végbemehet. Vizsgálatomban a NS398 kezelés hatására az apoptózis külünböző fázisaiban számos pro-apoptotikus gén expressziója megnövekedett, így például a TRAIL halál ligandum (TNFSF10), a SIVA1 halálreceptor a CD-27 indukálta útvonalban és egyéb molekulák, amelyek az apoptózis végrehajtó fázisában játszanak szerepet (pl. APAF1 apoptoszóma protein és CASP6 effektor kaszpáz). Az apoptózis során morfológiai változásokat indukáló Death-associated kinase-3 (DAPK3) a NS398 kezelés hatására HT29 sejtekben túltermelődik. Li és munkatársai eredményeivel összhangban, a vastagbélrákos sejtekben az NS398-függő apoptózis a citokróm-c-függő útvonalon történt [105]. Eredményeim szerint a p53-függő útvonal a citokróm-c útvonalon 115

keresztül szintén apoptotikus folyamatokat serkenthet. A tumor protein p53-indukálható nuclear protein-1 és a tumor protein p53-indukálható nuclear protein-3 pro-apoptotikus faktorok p53-függő apoptózist indukálnak. A p73 fehérje, amely a p53-szabályozott gének transzaktiválásával képes a sejtciklust felfüggeszteni és apoptózist kiváltani, NS398 szelektív COX2 inhibitor kezelés hatására szintén túltermelődik. Egy randomizált kontrollal rendelkező, fázis II klinikai vizsgálat eredményei szerint prosztatarákban a Celecoxib hatására szintén a p73 tumorszuppresszor gén fokozott működése tapasztalható [214]. Bár az angiogenezisben szerepet játszó gének közül csak kevés esetében látszott szignifikáns mRNS expressziós változás, az irodalmi adatokkal megegyezően [109, 110], a VEGF, az egyik legfontosabb angiogén faktor a többi mellett (pl.: PTEN, IL8) csökkent működést mutatott a kezelés hatására. 7.2.3. Szövetspecifikus expressziós változások vizsgálata az adenoma – carcinoma átalakulás során LCM mintákon A HT-29 colon adenocarcinoma sejtvonal a fent említett markerek hámsejtekben történő vizsgálatára került kiválasztásra. Azonban nem elhanyagolható, hogy a COX2 döntően az adenomatózus vagy tumoros hámrétegben expresszálódik, emellett számos tanulmány számol be a COX2 stromális kifejeződéséről is [218, 219]. Ebből kifolyólag érdemes megvizsgálni a tumorsejtek környezetében található sejtcsoportokban bekövetkező expressziós változásokat. Ehhez ép egészséges, adenoma és tumor lézer mikrodisszektált mintákat használtam a hám és stróma régióból egyaránt. Az adenoma kialakulásakor megjelenő génműködés-beli eltéréseket megvizsgálva 20 gén esetében azt tapasztaltam, hogy a 4 felülexpresszálódó gén (FOXQ1, KIAA1199, CDH3, TRIM29) mind a hámban, mind a strómában kifejeződik, bár mérési eredményeim alapján a hám erőteljesebben fejezi ki ezeket a géneket, mint a mikrodisszektált adenoma stroma sejtek. A tumor hám és stróma sejtekben ez a jelenség még markánsabbá válik (44. ábra). Az ábra azt szemlélteti, hogy a biopsziás mintákon adenoma vs. ép, valamint tumor vs. ép csoportok között azonosított expressziós változást mutató gének hogyan viselkednek HT-29 sejtkultúrában 100 μM-os NS398 kezelés hatására, majd ugyanezek a gének milyen szövetspecifikus expressziós változást mutatnak hám és stroma régiókban az egészséges sejtekhez viszonyítva. A HAPLN1 és a TRPM6 egy-egy variánsának (240389_at, 237530_at) valamint két ismeretlen

funkciójú

transzkriptum

(240157_at

és

237530_at)

expressziójának

szövetspecifikus lokalizációja a lézer mikrodisszekció chip adatainak segítségével nem volt 116

44. ábra Az ép-adenoma (A) és az ép-tumor (B) átalakulás során expressziós különbséget mutató gének hőmérsékleti térképe, biopszia, sejtkultúra LCM hám és LCM stroma mintákon. A szövetekben (AD=adenoma, N=ép nyálkahártya, CRC=vastagbél-daganat) megváltozott működést mutató géneket az NS398 kezelés képes befolyásolni HT-29 sejtkultúrában a kezeletlenhez (CTRL) képest. A gének LCM minták hám és strómális régiójában vizsgálva megállapítható a szövetspecifikus expresszió. A génlisták sejtfunkció szerinti csoportosítását a függelék 9. táblázat szemlélteti. 117

egyértelműen megállapítható. A TRPM6, CLDN8, SST, CA7, PYY, GCG, SPIB, TMEM72 és a BEST4 erőteljes hám expressziót mutat. A HAPLN1, ABCA8, STMN2 kizárólagos stróma expressziót mutat, míg a HAPLN1, TRPM6 és CLDN8 a hámban és a strómában is egyaránt megjelenik. Így tehát a vizsgált gének 65%-át a hámsejtek expresszálják, míg 20%uknak eredete nem határozható meg egyértelműen, 15%-uk csak a strómában expresszálódik. A vizsgált gének 35%-a mind a hámban, mind a strómában expresszálódik. A tumorokra jellemző génelváltozásokat vizsgálva 38 kiválasztott gén esetében melyből 6 alulexpresszált, a következőket találtam. Az a 6 gén, amelynek expressziója a tumor kialakulása során csökken, ép és adenoma hámban expresszálódnak, kivéve az AMPD1 transzkriptumot, ami erőteljes strómális kifejeződést mutat az ép nyálkahártyában. A 32 felülexpresszálódó génből 2 kivételével (IL8 és IL1B) az összes működik a tumorok strómájában. A 32 gén 72%-a jelenik meg a tumoros hámsejtekben. Az IL1RN, IL8, MCAM, MMP3, IL1B, CDH5, S100A8, COL1A2, VWF tumoros hámsejtekben nem expresszálódtak. Érdekes megfigyelés, hogy az IL8 és IL1B molekulák expressziója nem volt mérhető a lézer mikrodisszektált sejtekből. Ennek oka a nagyon alacsony átlagosan 10 alatti kópia/sejt vagy az ektopikus expresszió lehet. Összefoglalva, munkám során a NS398 szelektív COX2 inhibitor kezelés vastagbél adenomaés vastagbél-daganat jellemző génexpressziós változására gyakorolt hatását teljes genom microarray rendszeren elemeztem. Meghatároztam az adenomára és a vastagbél-daganatokra jellemző elkülönítő diagnosztikus mintázatokat, majd ezeknek a géneknek változását vizsgáltam HT-29 colon adenocarcinoma sejtvonalon NS398 szelektív COX2 inhibitor kezelés hatására. A COX2 fehérje kifejeződés koncentrációfüggő gátlása a colorectális épadenoma közti génexpressziós mintázat fordított változásaihoz erősebben kapcsolódott, mint az ép-carcinoma összehasonlítás esetében, ezzel molekuláris alapon alátámasztva a korai időpontban felismert neoplasztikus elváltozások kezelésének sikerességét. Eredményeim molekuláris magyarázatot adhatnak a szelektív COX2 inhibitorok rákmegelőző adenoma állapotokban CRC kemoprevenciós hatékonyságára. A kapott adatokkal ezen felül betekintést nyerhetünk a szelektív COX2 inhibitorok teljes molekuláris hátterébe, a p18INK4C, CIP2 ciklin-dependens kináz inhibitorok és a p53-indukált BTG2 gén NS398-függő proliferációgátlásában

és

TRAIL

valamint

p53-közvetítette

apoptotikus

útvonalak

működéséről. A

NS398

az

adenomában

jelentkező

expressziós

különbségek

visszafordításában

hatékonyabbnak bizonyult, mint a carcinoma állapotban, ezzel rámutatva, hogy a vastagbéldaganat kialakulásának korai fázisában alkalmazva hasznos kemopreventív szer lehet. 118

8. KÖVETKEZTETÉSEK Molekuláris biológiai eszközökkel folytatott vizsgálataim alapján a vastagbél tumorok sokkal inkább tekinthetők szisztémás mintsem lokális elváltozásoknak. A tumor kialakulása majd fejlődése során hatást gyakorol a környező sejtekre, szervekre, szervrendszerekre. Az, hogy ez a kommunikáció/jelátvitel hogyan és miként valósul meg, még nem megértett folyamat, azonban példák sorozata mutatja ennek a kommunikációnak fontos szerepét. A vér alakos elemeinek génexpressziós mintázata megváltozik a tumorprogresszió során [88]. Hangsúlyozandó, hogy ez a változás nem a vérben keringő tumorsejtekből származik, hanem a tumor által kibocsátott faktorok, magukat a vérben található sejteket késztetik más működésre. A kibocsátott faktorok lehetnek fehérjék, de nukleinsavak és vezikulumok is. Bizonyított, hogy a tumorprogresszióval párhuzamosan a plazma szabad DNS tartalma akár egy nagyságrenddel megnő koncentrációját tekintve. Összetételének változásáról, vagyis, hogy a genom melyik része milyen mértékben van jelen, és ez hogyan változik a tumorprogresszióval, valamint a jelenlévő DNS fragmentumok metiláltsága milyen arányú és hogyan változik, még nincsen információnk. Az is bizonyított, hogy a tumoros sejtek RNS, leginkább szabályozó miRNS molekulákat tartalmazó exoszómákat bocsátanak ki magukból, melyek száma szintén növekszik a tumorprogresszió során. Ezek a csomagok képesek célbajuttatni a bennük található miRNS-eket és távoli sejtekben kifejteni csendesítő hatásukat [220-225]. Magán a tumoron belül más folyamatok játszódnak le a hámrétegben, mint a stroma régiókban. Az is látható, hogy a nyirok follikulusok miként reagálnak ezekre a változásokra. Lézer mikrodisszekcióval megállapítható az egészséges és kóros sejtcsoportok expressziós változása a tumorprogresszió során [161]. Nagy denzitású oligonukleotid microarray technológiával és a későbbiekben NGS alapú transzkriptum szekvenálással olyan mRNS molekulák azonosíthatók, amelyek diagnosztikus értékkel rendelkeznek. Az automatizált molekuláris diagnosztizáláson túlmenően nem csak a szövettani besorolást elősegítő molekuláris patológiai csoportosításra nyílik lehetőség, hanem a terápiás válaszok előrejelzésére és az egyénre szabott terápiás lehetőségek megvalósítására is. Az ellenanyag microarray technológia, mint potenciális nagy áteresztőképességű módszer (high througput) alkalmas lehet fehérje szintű biomarkerek és diagnosztikus mintázatok azonosítására. A markerkombinációk azonosítása és a napi gyakorlatban történő felhasználása igen fontos feladat, ahol az ellenanyag microarray jelentős előrelépést jelenthet. A technológia érzékenységéből adódóan alkalmas lehet az egyes stádiumokban történő változások screenelésére és nyomon követésére. Eredményeim alapján elmondható, hogy fehérje szinten történő eseményeket előre jelezhetünk mRNS expressziós vizsgálatok alapján. Különösen 119

azoknál a fehérjéknél lehet ez nagyon fontos, amelyek koncentrációja a sejtben gyors ingadozást mutat. Azonban ezeket az eredményeket körültekintően kell kezelnünk, a még nem teljesen ismert biológiai folyamatok miatt, mint pl: a stabilitás, féléletidő, RNS processing és annak

szabályozása,

valamint

a

poszttranszlációs

módosulások.

Mindezek

figyelembevételével egy a proteinchipek alkalmazásával egy új lehetőség nyílik meg a daganat és a biomarker kutatás területén [30, 87, 95, 120, 121]. A chip-technológia fejlődésével lehetővé vált, hogy kis sejtes mintákból is megfelelően értékelhető teljes genom expressziós microarray-k készüljenek. Ez nagy szerepet játszik a genetikai hátterű betegségek megértésében. A technológia LCM-val kombinálva lehetővé teszi különböző szövettani régiók genom szintű expressziójának tanulmányozását. Ezáltal azonosítható, hogy milyen folyamatok mely szövettani régiókra jellemzők. A diagnosztikában szintén fontos szerepet kaphatnak ezek a „tiszta” feldúsított sejtpopulációból származó eredmények, expressziós mintázatok. A jelenlegi határ a néhány ezersejtes tartomány. Ez már elég kicsiny mikrokörnyezet ahhoz, hogy egy szöveti régió pillanatnyi expressziós állapotáról pontos képet kapjunk. Azonban az igazi áttörést az jelentené, ha egyetlen sejt genom szintű expressziója is tanulmányozhatóvá válna. Ennek jelenleg technikai korlátját az izolálási és amplifikációs lépések jelentik, amelynek megoldását a kutatók az új generációs szekvenálási eljárások alkalmazásától várják [161]. A génexpresszió vizsgálata alapján lehetőség nyílik olyan epigenetikai események felderítésére, mint amilyen a DNS metiláció. A DNS metiláció mértéke biszulfit szekvenálással és HRM analízissel megállapítható az ép és tumoros szövetekből egyaránt. Sejtkultúrából közel 100%-ban metilált régiók azonosíthatók, míg tumoros szövetből nem ennyire markáns, de határozott 20-25% körüli metiláltság mutatható ki. Ennek oka, hogy a szövet tumor/ép sejtaránya nem ismert, továbbá ahám és stroma sejtek más mértékben metilálódhatnak. Ennek kiderítése további feladatot jelent, mivel a lézermikrodisszektált minták mennyiségi korlátok miatt jelenleg nem alkalmasak biszulfit szekvenálással való vizsgálatra. Az adenoma-carcinoma-dysplasia szekvencia előrehaladása során biopsziás mintákból azonosíthatók a folyamat során megváltozó expresssziót mutató gének listája. Ezek között olyanok is azonosíthatók, amelyek az adenoma átalakulás során visszafordíthatók, vagyis expressziójuk az egészséges szintre módosítható. Diagnosztikai szempontból fontos feladat további gének azonosítása amelyek expressziója megváltozik az adenoma-carcinoma átalakulás során, valamint terápiás szempontból fontos lehet új hatóanyagok kifejlesztése és tesztelése. Tehát létezik egy olyan pont a tumorfejlődés során, ahol megfelelő beavatkozással leállítható a kóros sejtosztódás. Ilyen hatóanyag az NS398, amelyik vizsgálataim szerint adenoma állapotból 20 gént képes „visszafordítani” az egészséges szintre [81].

120

9. LEGFONTOSABB ÚJ MEGFIGYELÉSEK ÉS MEGÁLLAPÍTÁSOK a lézer mikrodisszektált szövettani régióinak génexpressziós mintázata nagy biztonsággal meghatározható, vizsgálható és összehasonlítható teljes genom oligonukleotid microarray vizsgálatokkal akár már 5000 sejtes

mintamennyiségből

és.

Az

Affymetrix

oligonukleotid

microarray minőségi

kritériumoknak messzemenően megfelelnek, standardizáltnak és jól reprodukálhatónak bizonyult alkalmazásuk. a vastagbél-daganatok fejlődése során fehérje szintű diagnosztikus és prognosztikus fehérjemintázatok határozhatók meg ellenanyag microarray technológiával, amelyek elkülönítő ereje TMA technolgiával is igazolható. az oligonukleotid és ellenanyag microarray mérések eredményei alapján fehérje és mRNS szint közötti összefüggések határozhatók meg vastagbél-daganatokban, amelyek más technológiákkal (RT-PCR, TMA) igazolhatók. a microarray vizsgálatok eredményei visszaigazolhatók más technológiákkal fehérje (TMA) és mRNS (RT-PCR) szinten, aminek a molekuláris diagnosztikában jelentős szerepe lehet, a génexpressziós eredmények alapján a vastagbélbetegségek patomechanizmusával összefüggő károsodott biológiai útvonalak azonosíthatók, lézer mikrodisszektált mintákon a vastagbél adenoma – dysplasia - carcinoma szekvencia génexpressziós háttváltozása azonosítható,

amelyek

megváltozott

expressziója

indikátora

lehet

a

colorectális

carcinogenezisnek hám és stróma régiókban, a génexpresszió vizsgálata alapján metilációs szabályozás alatt álló gének azonosíthatók (pl.: PTGDR) az adenoma carcinoma szekvencia előrehaladása során sejtkultúra modell és klinikai LCM minták használatával, szelektív cox2 inhibitor (NS398) hatására az adenoma-carcinom átmenetben szerepet játszó gének működése megfordítható, amely megfigyelés nagy jelentőséggel bírhat a klinikai preventatív kezelések területén.

121

10. ÖSSZEFOGLALÁS Az utóbbi tíz évben megjelent nagy-áteresztőképességű molekuláris biológiai módszereknek köszönhetően egyre több információ áll rendelkezésünkre a tumorok molekuláris folyamatairól, azonban a daganatok korai diagnosztikája, terápiája, követése napjainkban sem teljesen megoldott. A vastagbéldaganatok gyakori előfordulása és máig sem teljesen ismert molekuláris biológiai és patogenetikai háttere szükségessé teszi az ezek felderítését végző rendszerszemléletű kutatásokat. PhD dolgozatomban a vastagbéldaganatok kialakulásának és progressziójának mRNS és fehérje szintű biomarkereit azonosítottam és validáltam. Munkám során génexpressziós változások alapján metilációval szabályozott géneket azonosítottam, majd egy kemopreventív ágens

tumorsejtekre

gyakorolt

hatását

vizsgáltam.

Megállapítottam,

hogy

a

lézermikrodisszektált (LCM) minták alkalmasak teljes genom microarray vizsgálathoz. Azonosítottam az adenoma-carcinoma szekvencia előrehaladása során változó működésű géneket (LCM) mintákon. Megállapítottam, hogy a biopsziás és sebészeti minták biomarkerei milyen szövet-specifikus expressziót mutatnak LCM mintákat felhasználva. Kimutattam, hogy a metiláció által szabályozott gének azonosíthatók a génexpresszió vizsgálatával. Azonosítottam a PTGDR gén metilációs lókuszait, mRNS- és fehérjeszintű expressziójának csökkenését is igazoltam. Megállapítottam, hogy melyek azok a vastagbél-daganatok fejlődése során fellépő sejtfolyamatok, amelyeket a szelektív COX2 inhibitorral történő kezeléssel visszafordíthatók.

122

SUMMARY In the last decade, high-throughput molecular biological methods provide more and more information about the molecular processes of tumors, but there are still many questions regarding the early diagnosis, therapy and follow-up of cancers. The high incidence and not fully understood molecular and pathological background of CRC, necessitate the systemic research of this field. In my PhD thesis I identified and validated biomarkers of CRC development and progression at mRNA and protein levels. I have determined methylaton regulated genes based on altered gene expression, and then I have analyzed the effect of a chemopreventive agent in cell culture modell. I have established that the laser microdissected (LCM) samples are suitable for whole genomic microarray analysis. I have identified genes with altering expression during the colorectal adenoma-carcinoma sequence progression using LCM samples. Using LCM samples, I have determined tissue specific expression of biomarkers from biopsy and surgical studies. I have demonstrated that the methylation regulated genes could be determined by the examination of gene expression. I have identified the methylation loci of the PTGDR gene and its decreasing expression at mRNA and protein level was also proved. I have assessed molecular processes in CRC carcinogenesis which can be reversed by selective COX2 inhibitor treatment.

123

11. IRODALOMJEGYZÉK 1.

Weitz J, Koch M, Debus J, Hohler T, Galle PR és Buchler MW. Colorectal cancer. Lancet, 2005. 365(9454): p. 153-65.

2.

Tulassay Z, könyv. A vastagbélrák megelőzése és kezelése. 2004, Springer kiadó: Budapest. 20-278.

3.

Baffy G, Tárnoki DL, Tárnoki AD és Baffy N. Colorectalis rákszűrés: az amerikai tapasztalatok tanulságai. Magyar Radiológia, 2009. 83(3): p. 164–173.

4.

Kopper L, könyv. Onkológia. 2002, Medicina kiadó: Budapest.

5.

Herraiz M és Munoz-Navas M. Recognition and management of hereditary colorectal cancer syndromes. Rev Esp Enferm Dig, 2009. 101(2): p. 125-32.

6.

Gebo KA, Chander G, Jenckes MW, Ghanem KG, Herlong HF, Torbenson MS, ElKamary SS és Bass EB. Screening tests for hepatocellular carcinoma in patients with chronic hepatitis C: a systematic review. Hepatology, 2002. 36(5 Suppl 1): p. S84-92.

7.

Gunczler P, Ogris E, Maca S és Danmayr E. [Tumor markers in breast cancer: on the diagnostic value of serum determinations in clinical freedom from tumor and manifest disease]. Onkologie, 1989. 12(5): p. 209-14.

8.

Najemnik C, Mohn-Staudner A, Vetter H, Kokron O, Baumgartner G, Scheiner W, Zwick H, Koderhold G, Alth G és Dudczak R. Evaluation of Cyfra 21-1 as a marker for lung cancer. Wien Klin Wochenschr, 1996. 108(15): p. 467-72.

9.

Shabana A és Onsrud M. Tissue polypeptide-specific antigen and CA 125 as serum tumor markers in ovarian carcinoma. Tumour Biol, 1994. 15(6): p. 361-7.

10.

Bottger T, Hassdenteufel A, Boddin J, Kuchle R, Junginger T és Prellwitz W. [Value of the CA 19-9 tumor marker in differential diagnosis of space-occupying lesions in the head of the pancreas]. Chirurg, 1996. 67(10): p. 1007-11.

11.

Accolla RS, Carrel S és Mach JP. Monoclonal antibodies specific for carcinoembryonic antigen and produced by two hybrid cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A, 1980. 77(1): p. 563-6.

12.

Beczassy E, Otto S és Vamosi Nagy I. [Role of tumour markers in monitoring and follow-up of colorectal cancer patients]. Magy Onkol, 2004. 48(1): p. 57-61.

13.

Kahlenberg MS, Sullivan JM, Witmer DD és Petrelli NJ. Molecular prognostics in colorectal cancer. Surg Oncol, 2003. 12(3): p. 173-86.

124

14.

Nicolini A, Caciagli M, Zampieri F, Ciampalini G, Carpi A, Spisni R és Colizzi C. Usefulness of CEA, TPA, GICA, CA 72.4, and CA 195 in the Diagnosis of primary colorectal cancer and at its relapse. Cancer Detect Prev, 1995. 19(2): p. 183-95.

15.

Reiter W, Stieber P, Reuter C, Nagel D, Lau-Werner U és Lamerz R. Multivariate analysis of the prognostic value of CEA and CA 19-9 serum levels in colorectal cancer. Anticancer Res, 2000. 20(6D): p. 5195-8.

16.

Arnaud JP, Koehl C és Adloff M. Carcinoembryonic antigen (CEA) in diagnosis and prognosis of colorectal carcinoma. Dis Colon Rectum, 1980. 23(3): p. 141-4.

17.

Carpelan-Holmstrom M, Haglund C, Kuusela P, Jarvinen H és Roberts PJ. Preoperative serum levels of CEA and CA 242 in colorectal cancer. Br J Cancer, 1995. 71(4): p. 868-72.

18.

Duffy MJ, van Dalen A, Haglund C, Hansson L, Klapdor R, Lamerz R, Nilsson O, Sturgeon C és Topolcan O. Clinical utility of biochemical markers in colorectal cancer: European Group on Tumour Markers (EGTM) guidelines. Eur J Cancer, 2003. 39(6): p. 718-27.

19.

Hewitson P, Glasziou P, Irwig L, Towler B és Watson E. Screening for colorectal cancer using the faecal occult blood test, Hemoccult. Cochrane Database Syst Rev, 2007(1): p. CD001216.

20.

Sanford KW és McPherson RA. Fecal occult blood testing. Clin Lab Med, 2009. 29(3): p. 523-41.

21.

McCarthy BD és Moskowitz MA. Screening flexible sigmoidoscopy: patient attitudes and compliance. J Gen Intern Med, 1993. 8(3): p. 120-5.

22.

Lisi D, Hassan C és Crespi M. Participation to colorectal cancer screening with FOBT and colonoscopy: An Italian, multicentre, randomized population study. Dig Liver Dis, 2009.

23.

Röchlich P, könyv. Szövettan. 2006, Semmelweis kiadó: Budapest. 237-298.

24.

Vogelstein B, Fearon ER, Hamilton SR, Kern SE, Preisinger AC, Leppert M, Nakamura Y, White R, Smits AM és Bos JL. Genetic alterations during colorectaltumor development. N Engl J Med, 1988. 319(9): p. 525-32.

25.

Rustig AK, könyv. Gastrointestinal Cancers. 1995, Lippincott-Raven kiadó: New York. 353-478.

26.

Calvert PM és Frucht H. The genetics of colorectal cancer. Ann Intern Med, 2002. 137(7): p. 603-12.

125

27.

McDermott U, Longley DB és Johnston PG. Molecular and biochemical markers in colorectal cancer. Ann Oncol, 2002. 13 Suppl 4: p. 235-45.

28.

Anwar S, Frayling IM, Scott NA és Carlson GL. Systematic review of genetic influences on the prognosis of colorectal cancer. Br J Surg, 2004. 91(10): p. 1275-91.

29.

Alliot C. Relevance of EGFR expression in colorectal cancer. Ann Oncol, 2005. 16(9): p. 1557-8; author reply 1558-9.

30.

Spisak S, Galamb B, Wichmann B, Sipos F, Galamb O, Solymosi N, Nemes B, Tulassay Z és Molnar B. [Tissue microarray (TMA) validated progression markers in colorectal cancer using antibody microarrays]. Orv Hetil, 2009. 150(34): p. 1607-13.

31.

Kopper L, könyv. Apoptózis. 2002, Medicina kiadó: Budapest. 15-206.

32.

Watson AJ. Apoptosis and colorectal cancer. Gut, 2004. 53(11): p. 1701-9.

33.

Watson AJ. An overview of apoptosis and the prevention of colorectal cancer. Crit Rev Oncol Hematol, 2006. 57(2): p. 107-21.

34.

Leslie A, Carey FA, Pratt NR és Steele RJ. The colorectal adenoma-carcinoma sequence. Br J Surg, 2002. 89(7): p. 845-60.

35.

Szoke. Polymorphisms of the ApoE, HSD3B1, IL-1β and p53 genes are associated with the development of early uremic complications in diabetic patients: Results of a DNA resequencing array study. International Journal of Molecular Medicine, 1998.

36.

Molatore S és Ranzani GN. Genetics of colorectal polyps. Tech Coloproctol, 2004. 8 Suppl 2: p. s240-2.

37.

Fodde R. The APC gene in colorectal cancer. Eur J Cancer, 2002. 38(7): p. 867-71.

38.

Kinzler KW és Vogelstein B. Lessons from hereditary colorectal cancer. Cell, 1996. 87(2): p. 159-70.

39.

Grady WM. Genomic instability and colon cancer. Cancer Metastasis Rev, 2004. 23(1-2): p. 11-27.

40.

Boland CR, Shin SK és Goel A. Promoter methylation in the genesis of gastrointestinal cancer. Yonsei Med J, 2009. 50(3): p. 309-21.

41.

Siedlecki P és Zielenkiewicz P. Mammalian DNA methyltransferases. Acta Biochim Pol, 2006. 53(2): p. 245-56.

42.

Okano M, Bell DW, Haber DA és Li E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell, 1999. 99(3): p. 247-57.

43.

Eden S és Cedar H. Role of DNA methylation in the regulation of transcription. Curr Opin Genet Dev, 1994. 4(2): p. 255-9. 126

44.

Li E. Chromatin modification and epigenetic reprogramming in mammalian development. Nat Rev Genet, 2002. 3(9): p. 662-73.

45.

Hung MS és Shen CK. Eukaryotic methyl-CpG-binding domain proteins and chromatin modification. Eukaryot Cell, 2003. 2(5): p. 841-6.

46.

Jones PL, Veenstra GJ, Wade PA, Vermaak D, Kass SU, Landsberger N, Strouboulis J és Wolffe AP. Methylated DNA and MeCP2 recruit histone deacetylase to repress transcription. Nat Genet, 1998. 19(2): p. 187-91.

47.

Kondo Y. Epigenetic cross-talk between DNA methylation and histone modifications in human cancers. Yonsei Med J, 2009. 50(4): p. 455-63.

48.

Baylin SB és Herman JG. DNA hypermethylation in tumorigenesis: epigenetics joins genetics. Trends Genet, 2000. 16(4): p. 168-74.

49.

Baylin SB, Herman JG, Graff JR, Vertino PM és Issa JP. Alterations in DNA methylation: a fundamental aspect of neoplasia. Adv Cancer Res, 1998. 72: p. 141-96.

50.

Ahuja N és Issa JP. Aging, methylation and cancer. Histol Histopathol, 2000. 15(3): p. 835-42.

51.

Chen RZ, Pettersson U, Beard C, Jackson-Grusby L és Jaenisch R. DNA hypomethylation leads to elevated mutation rates. Nature, 1998. 395(6697): p. 89-93.

52.

Issa JP, Ottaviano YL, Celano P, Hamilton SR, Davidson NE és Baylin SB. Methylation of the oestrogen receptor CpG island links ageing and neoplasia in human colon. Nat Genet, 1994. 7(4): p. 536-40.

53.

Ahuja N, Li Q, Mohan AL, Baylin SB és Issa JP. Aging and DNA methylation in colorectal mucosa and cancer. Cancer Res, 1998. 58(23): p. 5489-94.

54.

Herman JG, Merlo A, Mao L, Lapidus RG, Issa JP, Davidson NE, Sidransky D és Baylin SB. Inactivation of the CDKN2/p16/MTS1 gene is frequently associated with aberrant DNA methylation in all common human cancers. Cancer Res, 1995. 55(20): p. 4525-30.

55.

Kane MF, Loda M, Gaida GM, Lipman J, Mishra R, Goldman H, Jessup JM és Kolodner R. Methylation of the hMLH1 promoter correlates with lack of expression of hMLH1 in sporadic colon tumors and mismatch repair-defective human tumor cell lines. Cancer Res, 1997. 57(5): p. 808-11.

56.

Auerkari EI. Methylation of tumor suppressor genes p16(INK4a), p27(Kip1) and Ecadherin in carcinogenesis. Oral Oncol, 2006. 42(1): p. 5-13.

127

57.

Bonsch D, Lenz B, Reulbach U, Kornhuber J és Bleich S. Homocysteine associated genomic DNA hypermethylation in patients with chronic alcoholism. J Neural Transm, 2004. 111(12): p. 1611-6.

58.

Kurkjian C, Kummar S és Murgo AJ. DNA methylation: its role in cancer development and therapy. Curr Probl Cancer, 2008. 32(5): p. 187-235.

59.

Enokida H, Shiina H, Urakami S, Terashima M, Ogishima T, Li LC, Kawahara M, Nakagawa M, Kane CJ, Carroll PR, Igawa M és Dahiya R. Smoking influences aberrant CpG hypermethylation of multiple genes in human prostate carcinoma. Cancer, 2006. 106(1): p. 79-86.

60.

Salnikow K és Zhitkovich A. Genetic and epigenetic mechanisms in metal carcinogenesis and cocarcinogenesis: nickel, arsenic, and chromium. Chem Res Toxicol, 2008. 21(1): p. 28-44.

61.

Takeshima M, Saitoh M, Kusano K, Nagayasu H, Kurashige Y, Malsantha M, Arakawa T, Takuma T, Chiba I, Kaku T, Shibata T és Abiko Y. High frequency of hypermethylation of p14, p15 and p16 in oral pre-cancerous lesions associated with betel-quid chewing in Sri Lanka. J Oral Pathol Med, 2008. 37(8): p. 475-9.

62.

Grady WM. Epigenetic events in the colorectum and in colon cancer. Biochem Soc Trans, 2005. 33(Pt 4): p. 684-8.

63.

Takahashi T, Shigematsu H, Shivapurkar N, Reddy J, Zheng Y, Feng Z, Suzuki M, Nomura M, Augustus M, Yin J, Meltzer SJ és Gazdar AF. Aberrant promoter methylation of multiple genes during multistep pathogenesis of colorectal cancers. Int J Cancer, 2006. 118(4): p. 924-31.

64.

Wettergren Y, Odin E, Nilsson S, Carlsson G és Gustavsson B. p16INK4a gene promoter hypermethylation in mucosa as a prognostic factor for patients with colorectal cancer. Mol Med, 2008. 14(7-8): p. 412-21.

65.

Jones PA és Laird PW. Cancer epigenetics comes of age. Nat Genet, 1999. 21(2): p. 163-7.

66.

Toyota M, Ahuja N, Ohe-Toyota M, Herman JG, Baylin SB és Issa JP. CpG island methylator phenotype in colorectal cancer. Proc Natl Acad Sci U S A, 1999. 96(15): p. 8681-6.

67.

Lee S, Cho NY, Yoo EJ, Kim JH és Kang GH. CpG island methylator phenotype in colorectal cancers: comparison of the new and classic CpG island methylator phenotype marker panels. Arch Pathol Lab Med, 2008. 132(10): p. 1657-65.

128

68.

Grutzmann R, Molnar B, Pilarsky C, Habermann JK, Schlag PM, Saeger HD, Miehlke S, Stolz T, Model F, Roblick UJ, Bruch HP, Koch R, Liebenberg V, Devos T, Song X, Day RH, Sledziewski AZ és Lofton-Day C. Sensitive detection of colorectal cancer in peripheral blood by septin 9 DNA methylation assay. PLoS One, 2008. 3(11): p. e3759.

69.

Jubb AM, Quirke P és Oates AJ. DNA methylation, a biomarker for colorectal cancer: implications for screening and pathological utility. Ann N Y Acad Sci, 2003. 983: p. 251-67.

70.

Miyamoto K és Ushijima T. Diagnostic and therapeutic applications of epigenetics. Jpn J Clin Oncol, 2005. 35(6): p. 293-301.

71.

Toyota M, Ho C, Ahuja N, Jair KW, Li Q, Ohe-Toyota M, Baylin SB és Issa JP. Identification of differentially methylated sequences in colorectal cancer by methylated CpG island amplification. Cancer Res, 1999. 59(10): p. 2307-12.

72.

Garzon R, Fabbri M, Cimmino A, Calin GA és Croce CM. MicroRNA expression and function in cancer. Trends Mol Med, 2006. 12(12): p. 580-7.

73.

Calin GA és Croce CM. MicroRNAs and chromosomal abnormalities in cancer cells. Oncogene, 2006. 25(46): p. 6202-10.

74.

Calin GA és Croce CM. MicroRNA signatures in human cancers. Nat Rev Cancer, 2006. 6(11): p. 857-66.

75.

Markowitz SD és Roberts AB. Tumor suppressor activity of the TGF-beta pathway in human cancers. Cytokine Growth Factor Rev, 1996. 7(1): p. 93-102.

76.

Rampino N, Yamamoto H, Ionov Y, Li Y, Sawai H, Reed JC és Perucho M. Somatic frameshift mutations in the BAX gene in colon cancers of the microsatellite mutator phenotype. Science, 1997. 275(5302): p. 967-9.

77.

Souza RF, Appel R, Yin J, Wang S, Smolinski KN, Abraham JM, Zou TT, Shi YQ, Lei J, Cottrell J, Cymes K, Biden K, Simms L, Leggett B, Lynch PM, Frazier M, Powell SM, Harpaz N, Sugimura H, Young J és Meltzer SJ. Microsatellite instability in the insulin-like growth factor II receptor gene in gastrointestinal tumours. Nat Genet, 1996. 14(3): p. 255-7.

78.

Fearon ER és Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell, 1990. 61(5): p. 759-67.

79.

Jass JR, Biden KG, Cummings MC, Simms LA, Walsh M, Schoch E, Meltzer SJ, Wright C, Searle J, Young J és Leggett BA. Characterisation of a subtype of

129

colorectal cancer combining features of the suppressor and mild mutator pathways. J Clin Pathol, 1999. 52(6): p. 455-60. 80.

Caron de Fromentel C és Soussi T. TP53 tumor suppressor gene: a model for investigating human mutagenesis. Genes Chromosomes Cancer, 1992. 4(1): p. 1-15.

81.

Galamb O, Spisak S, Sipos F, Toth K, Solymosi N, Wichmann B, Krenacs T, Valcz G, Tulassay Z és Molnar B. Reversal of gene expression changes in the colorectal normal-adenoma pathway by NS398 selective COX2 inhibitor. Br J Cancer, 2010. 102(4): p. 765-73.

82.

Fenoglio CM és Lane N. The anatomical precursor of colorectal carcinoma. Cancer, 1974. 34(3): p. suppl:819-23.

83.

Zhang D, Wang Y, Bai Y, Ge Q, Qiao Y, Luo J, Jia C és Lu Z. A novel method to quantify local CpG methylation density by regional methylation elongation assay on microarray. BMC Genomics, 2008. 9: p. 59.

84.

Haab BB. Antibody arrays in cancer research. Mol Cell Proteomics, 2005. 4(4): p. 377-83.

85.

Galamb O, Sipos F, Dinya E, Spisak S, Tulassay Z és Molnar B. mRNA expression, functional profiling and multivariate classification of colon biopsy specimen by cDNA overall glass microarray. World J Gastroenterol, 2006. 12(43): p. 6998-7006.

86.

Galamb O, Sipos F, Molnar B, Szoke D, Spisak S és Tulassay Z. Evaluation of malignant and benign gastric biopsy specimens by mRNA expression profile and multivariate statistical methods. Cytometry B Clin Cytom, 2007. 72(5): p. 299-309.

87.

Spisak S, Tulassay Z, Molnar B és Guttman A. Protein microchips in biomedicine and biomarker discovery. Electrophoresis, 2007. 28(23): p. 4261-73.

88.

Galamb O, Sipos F, Solymosi N, Spisak S, Krenacs T, Toth K, Tulassay Z és Molnar B. Diagnostic mRNA expression patterns of inflamed, benign, and malignant colorectal biopsy specimen and their correlation with peripheral blood results. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2008. 17(10): p. 2835-45.

89.

Galamb O, Sipos F, Spisak S, Galamb B, Krenacs T, Valcz G, Tulassay Z és Molnar B. Potential biomarkers of colorectal adenoma-dysplasia-carcinoma progression: mRNA expression profiling and in situ protein detection on TMAs reveal 15 sequentially upregulated and 2 downregulated genes. Cell Oncol, 2009. 31(1): p. 1929.

130

90.

Birkenkamp-Demtroder K, Olesen SH, Sorensen FB, Laurberg S, Laiho P, Aaltonen LA és Orntoft TF. Differential gene expression in colon cancer of the caecum versus the sigmoid and rectosigmoid. Gut, 2005. 54(3): p. 374-84.

91.

Bertucci F, Salas S, Eysteries S, Nasser V, Finetti P, Ginestier C, Charafe-Jauffret E, Loriod B, Bachelart L, Montfort J, Victorero G, Viret F, Ollendorff V, Fert V, Giovaninni M, Delpero JR, Nguyen C, Viens P, Monges G, Birnbaum D és Houlgatte R. Gene expression profiling of colon cancer by DNA microarrays and correlation with histoclinical parameters. Oncogene, 2004. 23(7): p. 1377-91.

92.

Gygi SP, Rochon Y, Franza BR és Aebersold R. Correlation between protein and mRNA abundance in yeast. Mol Cell Biol, 1999. 19(3): p. 1720-30.

93.

Mansilla F, da Costa KA, Wang S, Kruhoffer M, Lewin TM, Orntoft TF, Coleman RA és Birkenkamp-Demtroder K. Lysophosphatidylcholine acyltransferase 1 (LPCAT1) overexpression in human colorectal cancer. J Mol Med, 2009. 87(1): p. 85-97.

94.

Mansilla F, Birkenkamp-Demtroder K, Kruhoffer M, Sorensen FB, Andersen CL, Laiho P, Aaltonen LA, Verspaget HW és Orntoft TF. Differential expression of DHHC9 in microsatellite stable and instable human colorectal cancer subgroups. Br J Cancer, 2007. 96(12): p. 1896-903.

95.

Spisak S, Galamb B, Sipos F, Galamb O, Wichmann B, Solymosi N, Nemes B, Molnar J, Tulassay Z és Molnar B. Applicability of antibody and mRNA expression microarrays for identifying diagnostic and progression markers of early and late stage colorectal cancer. Dis Markers, 2010. 28(1): p. 1-14.

96.

Spooncer E, Brouard N, Nilsson SK, Williams B, Liu MC, Unwin RD, Blinco D, Jaworska E, Simmons PJ és Whetton AD. Developmental fate determination and marker discovery in hematopoietic stem cell biology using proteomic fingerprinting. Mol Cell Proteomics, 2008. 7(3): p. 573-81.

97.

Suttie SA, Shaikh I, Mullen R, Amin AI, Daniel T és Yalamarthi S. Outcome of right and left sided colonic and rectal cancer following surgical resection. Colorectal Dis, 2011.

98.

Giercksky KE. COX-2 inhibition and prevention of cancer. Best Pract Res Clin Gastroenterol, 2001. 15(5): p. 821-33.

99.

Cho SJ, Kim N, Kim JS, Jung HC és Song IS. The anti-cancer effect of COX-2 inhibitors on gastric cancer cells. Dig Dis Sci, 2007. 52(7): p. 1713-21.

131

100.

Saini MK, Sharma P, Kaur J és Sanyal SN. The cyclooxygenase-2 inhibitor etoricoxib is a potent chemopreventive agent of colon carcinogenesis in the rat model. J Environ Pathol Toxicol Oncol, 2009. 28(1): p. 39-46.

101.

Eberhart CE, Coffey RJ, Radhika A, Giardiello FM, Ferrenbach S és DuBois RN. Upregulation of cyclooxygenase 2 gene expression in human colorectal adenomas and adenocarcinomas. Gastroenterology, 1994. 107(4): p. 1183-8.

102.

Brown JR és DuBois RN. COX-2: a molecular target for colorectal cancer prevention. J Clin Oncol, 2005. 23(12): p. 2840-55.

103.

Eisinger AL, Prescott SM, Jones DA és Stafforini DM. The role of cyclooxygenase-2 and prostaglandins in colon cancer. Prostaglandins Other Lipid Mediat, 2007. 82(14): p. 147-54.

104.

Grosch S, Maier TJ, Schiffmann S és Geisslinger G. Cyclooxygenase-2 (COX-2)independent anticarcinogenic effects of selective COX-2 inhibitors. J Natl Cancer Inst, 2006. 98(11): p. 736-47.

105.

Li M, Wu X és Xu XC. Induction of apoptosis in colon cancer cells by cyclooxygenase-2 inhibitor NS398 through a cytochrome c-dependent pathway. Clin Cancer Res, 2001. 7(4): p. 1010-6.

106.

Nishikawa M, Stapleton PP, Freeman TA, Gaughan JP, Matsuda T és Daly JM. NS398 inhibits tumor growth and liver metastasis of colon cancer through induction of apoptosis and suppression of the plasminogen activation system in a mouse model. J Am Coll Surg, 2004. 199(3): p. 428-35.

107.

Hung WC, Chang HC, Pan MR, Lee TH és Chuang LY. Induction of p27(KIP1) as a mechanism underlying NS398-induced growth inhibition in human lung cancer cells. Mol Pharmacol, 2000. 58(6): p. 1398-403.

108.

Zhang Z és DuBois RN. Detection of differentially expressed genes in human colon carcinoma cells treated with a selective COX-2 inhibitor. Oncogene, 2001. 20(33): p. 4450-6.

109.

Abdelrahim M és Safe S. Cyclooxygenase-2 inhibitors decrease vascular endothelial growth factor expression in colon cancer cells by enhanced degradation of Sp1 and Sp4 proteins. Mol Pharmacol, 2005. 68(2): p. 317-29.

110.

Huang SP, Wu MS, Shun CT, Wang HP, Hsieh CY, Kuo ML és Lin JT. Cyclooxygenase-2 increases hypoxia-inducible factor-1 and vascular endothelial growth factor to promote angiogenesis in gastric carcinoma. J Biomed Sci, 2005. 12(1): p. 229-41. 132

111.

Abiru S, Nakao K, Ichikawa T, Migita K, Shigeno M, Sakamoto M, Ishikawa H, Hamasaki K, Nakata K és Eguchi K. Aspirin and NS-398 inhibit hepatocyte growth factor-induced invasiveness of human hepatoma cells. Hepatology, 2002. 35(5): p. 1117-24.

112.

Yao M, Lam EC, Kelly CR, Zhou W és Wolfe MM. Cyclooxygenase-2 selective inhibition with NS-398 suppresses proliferation and invasiveness and delays liver metastasis in colorectal cancer. Br J Cancer, 2004. 90(3): p. 712-9.

113.

Chen JH, Wu CW, Kao HL, Chang HM, Li AF, Liu TY és Chi CW. Effects of COX-2 inhibitor on growth of human gastric cancer cells and its relation to hepatocyte growth factor. Cancer Lett, 2006. 239(2): p. 263-70.

114.

Banu N, Buda A, Chell S, Elder D, Moorghen M, Paraskeva C, Qualtrough D és Pignatelli M. Inhibition of COX-2 with NS-398 decreases colon cancer cell motility through blocking epidermal growth factor receptor transactivation: possibilities for combination therapy. Cell Prolif, 2007. 40(5): p. 768-79.

115.

Leung E, McArthur D, Morris A és Williams N. Cyclooxygenase-2 inhibition prevents migration of colorectal cancer cells to extracellular matrix by down-regulation of matrix metalloproteinase-2 expression. Dis Colon Rectum, 2008. 51(3): p. 342-7.

116.

McArthur DR, Leung E, Morris A és Williams N. COX-2 expression is unexpectedly high in viable colorectal mucosal cells: is there life for chemoprophylaxis after VICTOR? Colorectal Dis, 2009. 11(7): p. 775-82.

117.

Hert DG, Fredlake CP és Barron AE. Advantages and limitations of next-generation sequencing technologies: a comparison of electrophoresis and non-electrophoresis methods. Electrophoresis, 2008. 29(23): p. 4618-26.

118.

Fodor SP, Rava RP, Huang XC, Pease AC, Holmes CP és Adams CL. Multiplexed biochemical assays with biological chips. Nature, 1993. 364(6437): p. 555-6.

119.

Zhang L, Zhou W, Velculescu VE, Kern SE, Hruban RH, Hamilton SR, Vogelstein B és Kinzler KW. Gene expression profiles in normal and cancer cells. Science, 1997. 276(5316): p. 1268-72.

120.

Spisak S és Guttman A. Biomedical applications of protein microarrays. Curr Med Chem, 2009. 16(22): p. 2806-15.

121.

Spisak S, Molnar B, Galamb O, Sipos F és Tulassay Z. [Theoretical foundations of protein chips and their possible use in medical research and diagnostics]. Orv Hetil, 2007. 148(32): p. 1511-20.

133

122.

Galamb O, Molnar B és Tulassay Z. [DNA chips for gene expression analysis and their application in diagnostics]. Orv Hetil, 2003. 144(1): p. 21-7.

123.

Kaltschmidt E és Wittmann HG. Ribosomal proteins. VII. Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis for fingerprinting of ribosomal proteins. Anal Biochem, 1970. 36(2): p. 401-12.

124.

Engvall E és Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry, 1971. 8(9): p. 871-4.

125.

Campbell GT és Bhatnagar AS. Simultaneous visualization by light microscopy of two pituitary hormones in a single tissue section using a combination of indirect immunohistochemical methods. J Histochem Cytochem, 1976. 24(2): p. 448-52.

126.

Hillenkamp F, Karas M, Beavis RC és Chait BT. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. Anal Chem, 1991. 63(24): p. 1193A-1203A.

127.

Wiese R, Belosludtsev Y, Powdrill T, Thompson P és Hogan M. Simultaneous multianalyte ELISA performed on a microarray platform. Clin Chem, 2001. 47(8): p. 1451-7.

128.

Huang RP, Huang R, Fan Y és Lin Y. Simultaneous detection of multiple cytokines from conditioned media and patient's sera by an antibody-based protein array system. Anal Biochem, 2001. 294(1): p. 55-62.

129.

Kusnezow W és Hoheisel JD. Solid supports for microarray immunoassays. J Mol Recognit, 2003. 16(4): p. 165-76.

130.

Southwick PL, Ernst LA, Tauriello EW, Parker SR, Mujumdar RB, Mujumdar SR, Clever

HA

és

Waggoner

AS.

Cyanine

dye

labeling

reagents--

carboxymethylindocyanine succinimidyl esters. Cytometry, 1990. 11(3): p. 418-30. 131.

Haab BB, Dunham MJ és Brown PO. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in complex solutions. Genome Biol, 2001. 2(2): p. 0004.

132.

Zhu H és Snyder M. Protein arrays and microarrays. Curr Opin Chem Biol, 2001. 5(1): p. 40-5.

133.

MacBeath G. Protein microarrays and proteomics. Nat Genet, 2002. 32 Suppl: p. 52632.

134.

Zhang Z, Bast RC, Jr., Yu Y, Li J, Sokoll LJ, Rai AJ, Rosenzweig JM, Cameron B, Wang YY, Meng XY, Berchuck A, Van Haaften-Day C, Hacker NF, de Bruijn HW, van der Zee AG, Jacobs IJ, Fung ET és Chan DW. Three biomarkers identified from 134

serum proteomic analysis for the detection of early stage ovarian cancer. Cancer Res, 2004. 64(16): p. 5882-90. 135.

Chapman K. The ProteinChip Biomarker System from Ciphergen Biosystems: a novel proteomics platform for rapid biomarker discovery and validation. Biochem Soc Trans, 2002. 30(2): p. 82-7.

136.

Vasilyeva E, Woodard J, Taylor FR, Kretschmer M, Fajardo H, Lyubarskaya Y, Kobayashi K, Dingley A és Mhatre R. Development of a chip-based capillary gel electrophoresis method for quantification of a half-antibody in immunoglobulin G4 samples. Electrophoresis, 2004. 25(21-22): p. 3890-6.

137.

Aufderheide AC, Salo W, Madden M, Streitz J, Buikstra J, Guhl F, Arriaza B, Renier C, Wittmers LE, Jr., Fornaciari G és Allison M. A 9,000-year record of Chagas' disease. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101(7): p. 2034-9.

138.

Kononen J, Bubendorf L, Kallioniemi A, Barlund M, Schraml P, Leighton S, Torhorst J, Mihatsch MJ, Sauter G és Kallioniemi OP. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med, 1998. 4(7): p. 844-7.

139.

Simon R és Sauter G. Tissue microarrays for miniaturized high-throughput molecular profiling of tumors. Exp Hematol, 2002. 30(12): p. 1365-72.

140.

Shibata D, Reale MA, Lavin P, Silverman M, Fearon ER, Steele G, Jr., Jessup JM, Loda M és Summerhayes IC. The DCC protein and prognosis in colorectal cancer. N Engl J Med, 1996. 335(23): p. 1727-32.

141.

Schraml P, Bucher C, Bissig H, Nocito A, Haas P, Wilber K, Seelig S, Kononen J, Mihatsch MJ, Dirnhofer S és Sauter G. Cyclin E overexpression and amplification in human tumours. J Pathol, 2003. 200(3): p. 375-82.

142.

Marx A, Simon P, Simon R, Mirlacher M, Izbicki JR, Yekebas E, Kaifi JT, Terracciano L és Sauter G. AMACR expression in colorectal cancer is associated with left-sided tumor localization. Virchows Arch, 2008. 453(3): p. 243-8.

143.

Pfaffl MW, Horgan GW és Dempfle L. Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in realtime PCR. Nucleic Acids Res, 2002. 30(9): p. e36.

144.

Shain EB és Clemens JM. A new method for robust quantitative and qualitative analysis of real-time PCR. Nucleic Acids Res, 2008. 36(14): p. e91.

145.

Murray GI, könyv. Laser Capture Microdissection. 2005, Humana Press kiadó: Totowa, New Jersey. 127-308.

135

146.

Timar J, Hegedus B és Raso E. KRAS Mutation Testing of Colorectal Cancer for AntiEGFR Therapy: Dogmas versus Evidence. Curr Cancer Drug Targets, 2010.

147.

Lievre A, Bachet JB, Le Corre D, Boige V, Landi B, Emile JF, Cote JF, Tomasic G, Penna C, Ducreux M, Rougier P, Penault-Llorca F és Laurent-Puig P. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res, 2006. 66(8): p. 3992-5.

148.

Kim C és Paik S. Gene-expression-based prognostic assays for breast cancer. Nat Rev Clin Oncol, 2010. 7(6): p. 340-7.

149.

Oakman C, Santarpia L és Di Leo A. Breast cancer assessment tools and optimizing adjuvant therapy. Nat Rev Clin Oncol, 2010.

150.

Kelly CM, Krishnamurthy S, Bianchini G, Litton JK, Gonzalez-Angulo AM, Hortobagyi GN és Pusztai L. Utility of oncotype DX risk estimates in clinically intermediate risk hormone receptor-positive, HER2-normal, grade II, lymph nodenegative breast cancers. Cancer, 2010. 116(22): p. 5161-7.

151.

Webber EM, Lin JS és Evelyn PW. Oncotype DX tumor gene expression profiling in stage II colon cancer. Application: prognostic, risk prediction. PLoS Curr, 2010. 2.

152.

Madoz-Gurpide J, Canamero M, Sanchez L, Solano J, Alfonso P és Casal JI. A proteomics analysis of cell signaling alterations in colorectal cancer. Mol Cell Proteomics, 2007. 6(12): p. 2150-64.

153.

Tumor_analysis_best_practices_working_group. Expression profilingbest practices for data generation and interpretation in clinical trials. Nat Rev Genet, 2004. 5: p. 229–237.

154.

Gentleman R, könyv. Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. 2005, Springer: New York. 3-292.

155.

Alpert E, Gruzman A, Lardi-Studler B, Cohen G, Reich R és Sasson S. Cyclooxygenase-2 (PTGS2) inhibitors augment the rate of hexose transport in L6 myotubes in an insulin- and AMPKalpha-independent manner. Diabetologia, 2006. 49(3): p. 562-70.

156.

Tatrai P, Dudas J, Batmunkh E, Mathe M, Zalatnai A, Schaff Z, Ramadori G és Kovalszky I. Agrin, a novel basement membrane component in human and rat liver, accumulates in cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Lab Invest, 2006. 86(11): p. 1149-60.

136

157.

Jeong HC, Kim GI, Cho SH, Lee KH, Ko JJ, Yang JH és Chung KH. Proteomic Analysis of Human Small Cell Lung Cancer Tissues: Up-regulation of Coactosin-Like Protein-1. J Proteome Res, 2011.

158.

Aoyagi K, Tatsuta T, Nishigaki M, Akimoto S, Tanabe C, Omoto Y, Hayashi S, Sakamoto H, Sakamoto M, Yoshida T, Terada M és Sasaki H. A faithful method for PCR-mediated global mRNA amplification and its integration into microarray analysis on laser-captured cells. Biochem Biophys Res Commun, 2003. 300(4): p. 915-20.

159.

Kurn N, Chen P, Heath JD, Kopf-Sill A, Stephens KM és Wang S. Novel isothermal, linear nucleic acid amplification systems for highly multiplexed applications. Clin Chem, 2005. 51(10): p. 1973-81.

160.

Park JY, Kim SY, Lee JH, Song J, Noh JH, Lee SH, Park WS, Yoo NJ, Lee JY és Nam SW. Application of amplified RNA and evaluation of cRNA targets for spottedoligonucleotide microarray. Biochem Biophys Res Commun, 2004. 325(4): p. 134652.

161.

Spisak S, Kalmar A, Galamb O, Sipos F, Wichmann B, Molnar B és Tulassay Z. [Identification of methylation related genes from laser capture microdissected colon samples during investigation of adenoma-carcinoma sequence]. Orv Hetil, 2010. 151(20): p. 805-14.

162.

Suzuki H, Zhou X, Yin J, Lei J, Jiang HY, Suzuki Y, Chan T, Hannon GJ, Mergner WJ, Abraham JM és et al. Intragenic mutations of CDKN2B and CDKN2A in primary human esophageal cancers. Hum Mol Genet, 1995. 4(10): p. 1883-7.

163.

Wu CC, Shyu RY, Chou JM, Jao SW, Chao PC, Kang JC, Wu ST, Huang SL és Jiang SY. RARRES1 expression is significantly related to tumour differentiation and staging in colorectal adenocarcinoma. Eur J Cancer, 2006. 42(4): p. 557-65.

164.

Zhang Z, Huettner PC, Nguyen L, Bidder M, Funk MC, Li J és Rader JS. Aberrant promoter methylation and silencing of the POU2F3 gene in cervical cancer. Oncogene, 2006. 25(39): p. 5436-45.

165.

Zhou J, Wang H, Lu A, Hu G, Luo A, Ding F, Zhang J, Wang X, Wu M és Liu Z. A novel gene, NMES1, downregulated in human esophageal squamous cell carcinoma. Int J Cancer, 2002. 101(4): p. 311-6.

166.

Drucker DJ. Glucagon-like peptides: regulators of cell proliferation, differentiation, and apoptosis. Mol Endocrinol, 2003. 17(2): p. 161-71.

137

167.

Allen NP, Donninger H, Vos MD, Eckfeld K, Hesson L, Gordon L, Birrer MJ, Latif F és Clark GJ. RASSF6 is a novel member of the RASSF family of tumor suppressors. Oncogene, 2007. 26(42): p. 6203-11.

168.

Belluco C, Mammano E, Petricoin E, Prevedello L, Calvert V, Liotta L, Nitti D és Lise M. Kinase substrate protein microarray analysis of human colon cancer and hepatic metastasis. Clin Chim Acta, 2005. 357(2): p. 180-3.

169.

Habraken

Y,

Jolois

O

és

Piette

J.

Differential

involvement

of

the

hMRE11/hRAD50/NBS1 complex, BRCA1 and MLH1 in NF-kappaB activation by camptothecin and X-ray. Oncogene, 2003. 22(38): p. 6090-9. 170.

Giannini G, Rinaldi C, Ristori E, Ambrosini MI, Cerignoli F, Viel A, Bidoli E, Berni S, D'Amati G, Scambia G, Frati L, Screpanti I és Gulino A. Mutations of an intronic repeat induce impaired MRE11 expression in primary human cancer with microsatellite instability. Oncogene, 2004. 23(15): p. 2640-7.

171.

Giannini G, Ristori E, Cerignoli F, Rinaldi C, Zani M, Viel A, Ottini L, Crescenzi M, Martinotti S, Bignami M, Frati L, Screpanti I és Gulino A. Human MRE11 is inactivated in mismatch repair-deficient cancers. EMBO Rep, 2002. 3(3): p. 248-54.

172.

Yoshio T, Morita T, Kimura Y, Tsujii M, Hayashi N és Sobue K. Caldesmon suppresses cancer cell invasion by regulating podosome/invadopodium formation. FEBS Lett, 2007. 581(20): p. 3777-82.

173.

Weinzierl AO, Maurer D, Altenberend F, Schneiderhan-Marra N, Klingel K, Schoor O, Wernet D, Joos T, Rammensee HG és Stevanovic S. A cryptic vascular endothelial growth factor T-cell epitope: identification and characterization by mass spectrometry and T-cell assays. Cancer Res, 2008. 68(7): p. 2447-54.

174.

Biemer-Huttmann AE, Walsh MD, McGuckin MA, Ajioka Y, Watanabe H, Leggett BA és Jass JR. Immunohistochemical staining patterns of MUC1, MUC2, MUC4, and MUC5AC mucins in hyperplastic polyps, serrated adenomas, and traditional adenomas of the colorectum. J Histochem Cytochem, 1999. 47(8): p. 1039-48.

175.

Singh AP, Chaturvedi P és Batra SK. Emerging roles of MUC4 in cancer: a novel target for diagnosis and therapy. Cancer Res, 2007. 67(2): p. 433-6.

176.

Singh AP, Chauhan SC, Bafna S, Johansson SL, Smith LM, Moniaux N, Lin MF és Batra SK. Aberrant expression of transmembrane mucins, MUC1 and MUC4, in human prostate carcinomas. Prostate, 2006. 66(4): p. 421-9.

138

177.

Singh AP, Moniaux N, Chauhan SC, Meza JL és Batra SK. Inhibition of MUC4 expression suppresses pancreatic tumor cell growth and metastasis. Cancer Res, 2004. 64(2): p. 622-30.

178.

Chaturvedi P, Singh AP, Moniaux N, Senapati S, Chakraborty S, Meza JL és Batra SK. MUC4 mucin potentiates pancreatic tumor cell proliferation, survival, and invasive properties and interferes with its interaction to extracellular matrix proteins. Mol Cancer Res, 2007. 5(4): p. 309-20.

179.

Bafna S, Singh AP, Moniaux N, Eudy JD, Meza JL és Batra SK. MUC4, a multifunctional transmembrane glycoprotein, induces oncogenic transformation of NIH3T3 mouse fibroblast cells. Cancer Res, 2008. 68(22): p. 9231-8.

180.

Wali A, Morin PJ, Hough CD, Lonardo F, Seya T, Carbone M és Pass HI. Identification of intelectin overexpression in malignant pleural mesothelioma by serial analysis of gene expression (SAGE). Lung Cancer, 2005. 48(1): p. 19-29.

181.

Carolan BJ, Harvey BG, De BP, Vanni H és Crystal RG. Decreased expression of intelectin 1 in the human airway epithelium of smokers compared to nonsmokers. J Immunol, 2008. 181(8): p. 5760-7.

182.

Boardman LA. Overexpression of MACC1 leads to downstream activation of HGF/MET and potentiates metastasis and recurrence of colorectal cancer. Genome Med, 2009. 1(4): p. 36.

183.

Stein U, Walther W, Arlt F, Schwabe H, Smith J, Fichtner I, Birchmeier W és Schlag PM. MACC1, a newly identified key regulator of HGF-MET signaling, predicts colon cancer metastasis. Nat Med, 2009. 15(1): p. 59-67.

184.

Krajewska M, Moss SF, Krajewski S, Song K, Holt PR és Reed JC. Elevated expression of Bcl-X and reduced Bak in primary colorectal adenocarcinomas. Cancer Res, 1996. 56(10): p. 2422-7.

185.

Kondo S, Shinomura Y, Kanayama S, Higashimoto Y, Miyagawa JI, Minami T, Kiyohara T, Zushi S, Kitamura S, Isozaki K és Matsuzawa Y. Over-expression of bclxL gene in human gastric adenomas and carcinomas. Int J Cancer, 1996. 68(6): p. 727-30.

186.

Carvalho B, Postma C, Mongera S, Hopmans E, Diskin S, van de Wiel MA, van Criekinge W, Thas O, Matthai A, Cuesta MA, Terhaar Sive Droste JS, Craanen M, Schrock E, Ylstra B és Meijer GA. Multiple putative oncogenes at the chromosome 20q amplicon contribute to colorectal adenoma to carcinoma progression. Gut, 2009. 58(1): p. 79-89. 139

187.

McIver CM, Lloyd JM, Hewett PJ és Hardingham JE. Dipeptidase 1: a candidate tumor-specific molecular marker in colorectal carcinoma. Cancer Lett, 2004. 209(1): p. 67-74.

188.

Miyoshi N, Ishii H, Mimori K, Takatsuno Y, Kim H, Hirose H, Sekimoto M, Doki Y és Mori M. Abnormal expression of TRIB3 in colorectal cancer: a novel marker for prognosis. Br J Cancer, 2009. 101(10): p. 1664-70.

189.

Sowden J, Leigh S, Talbot I, Delhanty J és Edwards Y. Expression from the proximal promoter of the carbonic anhydrase 1 gene as a marker for differentiation in colon epithelia. Differentiation, 1993. 53(2): p. 67-74.

190.

Kummola L, Hamalainen JM, Kivela J, Kivela AJ, Saarnio J, Karttunen T és Parkkila S. Expression of a novel carbonic anhydrase, CA XIII, in normal and neoplastic colorectal mucosa. BMC Cancer, 2005. 5: p. 41.

191.

Ye H, Yu T, Temam S, Ziober BL, Wang J, Schwartz JL, Mao L, Wong DT és Zhou X. Transcriptomic dissection of tongue squamous cell carcinoma. BMC Genomics, 2008. 9: p. 69.

192.

Seder CW, Hartojo W, Lin L, Silvers AL, Wang Z, Thomas DG, Giordano TJ, Chen G, Chang AC, Orringer MB és Beer DG. INHBA overexpression promotes cell proliferation and may be epigenetically regulated in esophageal adenocarcinoma. J Thorac Oncol, 2009. 4(4): p. 455-62.

193.

Seder CW, Hartojo W, Lin L, Silvers AL, Wang Z, Thomas DG, Giordano TJ, Chen G, Chang AC, Orringer MB és Beer DG. Upregulated INHBA expression may promote cell proliferation and is associated with poor survival in lung adenocarcinoma. Neoplasia, 2009. 11(4): p. 388-96.

194.

Shimizu S, Seki N, Sugimoto T, Horiguchi S, Tanzawa H, Hanazawa T és Okamoto Y. Identification of molecular targets in head and neck squamous cell carcinomas based on genome-wide gene expression profiling. Oncol Rep, 2007. 18(6): p. 1489-97.

195.

Fischer H, Salahshor S, Stenling R, Bjork J, Lindmark G, Iselius L, Rubio C és Lindblom A. COL11A1 in FAP polyps and in sporadic colorectal tumors. BMC Cancer, 2001. 1: p. 17.

196.

Fischer H, Stenling R, Rubio C és Lindblom A. Colorectal carcinogenesis is associated with stromal expression of COL11A1 and COL5A2. Carcinogenesis, 2001. 22(6): p. 875-8.

197.

Park JK, Song JH, He TC, Nam SW, Lee JY és Park WS. Overexpression of Wnt-2 in colorectal cancers. Neoplasma, 2009. 56(2): p. 119-23. 140

198.

Vider BZ, Zimber A, Chastre E, Prevot S, Gespach C, Estlein D, Wolloch Y, Tronick SR, Gazit A és Yaniv A. Evidence for the involvement of the Wnt 2 gene in human colorectal cancer. Oncogene, 1996. 12(1): p. 153-8.

199.

Katoh M. WNT2 and human gastrointestinal cancer (review). Int J Mol Med, 2003. 12(5): p. 811-6.

200.

O'Prey J, Wilkinson S és Ryan KM. Tumor antigen LRRC15 impedes adenoviral infection: implications for virus-based cancer therapy. J Virol, 2008. 82(12): p. 59339.

201.

Schuetz CS, Bonin M, Clare SE, Nieselt K, Sotlar K, Walter M, Fehm T, Solomayer E, Riess O, Wallwiener D, Kurek R és Neubauer HJ. Progression-specific genes identified by expression profiling of matched ductal carcinomas in situ and invasive breast tumors, combining laser capture microdissection and oligonucleotide microarray analysis. Cancer Res, 2006. 66(10): p. 5278-86.

202.

Erreni M, Bianchi P, Laghi L, Mirolo M, Fabbri M, Locati M, Mantovani A és Allavena P. Expression of chemokines and chemokine receptors in human colon cancer. Methods Enzymol, 2009. 460: p. 105-21.

203.

Kaneda H, Arao T, Tanaka K, Tamura D, Aomatsu K, Kudo K, Sakai K, De Velasco MA, Matsumoto K, Fujita Y, Yamada Y, Tsurutani J, Okamoto I, Nakagawa K és Nishio K. FOXQ1 is overexpressed in colorectal cancer and enhances tumorigenicity and tumor growth. Cancer Res, 2010. 70(5): p. 2053-63.

204.

Chiu ST, Hsieh FJ, Chen SW, Chen CL, Shu HF és Li H. Clinicopathologic correlation of up-regulated genes identified using cDNA microarray and real-time reverse transcription-PCR in human colorectal cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2005. 14(2): p. 437-43.

205.

Pascal LE, Goo YA, Vencio RZ, Page LS, Chambers AA, Liebeskind ES, Takayama TK, True LD és Liu AY. Gene expression down-regulation in CD90+ prostate tumorassociated stromal cells involves potential organ-specific genes. BMC Cancer, 2009. 9: p. 317.

206.

Le Frere-Belda MA, Cappellen D, Daher A, Gil-Diez-de-Medina S, Besse F, Abbou CC, Thiery JP, Zafrani ES, Chopin DK és Radvanyi F. p15(INK4b) in bladder carcinomas: decreased expression in superficial tumours. Br J Cancer, 2001. 85(10): p. 1515-21.

141

207.

Piskurich JF, Youngman KR, Phillips KM, Hempen PM, Blanchard MH, France JA és Kaetzel CS. Transcriptional regulation of the human polymeric immunoglobulin receptor gene by interferon-gamma. Mol Immunol, 1997. 34(1): p. 75-91.

208.

Steinbach G, Lynch PM, Phillips RK, Wallace MH, Hawk E, Gordon GB, Wakabayashi N, Saunders B, Shen Y, Fujimura T, Su LK és Levin B. The effect of celecoxib, a cyclooxygenase-2 inhibitor, in familial adenomatous polyposis. N Engl J Med, 2000. 342(26): p. 1946-52.

209.

Higuchi T, Iwama T, Yoshinaga K, Toyooka M, Taketo MM és Sugihara K. A randomized, double-blind, placebo-controlled trial of the effects of rofecoxib, a selective cyclooxygenase-2 inhibitor, on rectal polyps in familial adenomatous polyposis patients. Clin Cancer Res, 2003. 9(13): p. 4756-60.

210.

Arber N, Eagle CJ, Spicak J, Racz I, Dite P, Hajer J, Zavoral M, Lechuga MJ, Gerletti P, Tang J, Rosenstein RB, Macdonald K, Bhadra P, Fowler R, Wittes J, Zauber AG, Solomon SD és Levin B. Celecoxib for the prevention of colorectal adenomatous polyps. N Engl J Med, 2006. 355(9): p. 885-95.

211.

Bertagnolli MM, Eagle CJ, Zauber AG, Redston M, Solomon SD, Kim K, Tang J, Rosenstein RB, Wittes J, Corle D, Hess TM, Woloj GM, Boisserie F, Anderson WF, Viner JL, Bagheri D, Burn J, Chung DC, Dewar T, Foley TR, Hoffman N, Macrae F, Pruitt RE, Saltzman JR, Salzberg B, Sylwestrowicz T, Gordon GB és Hawk ET. Celecoxib for the prevention of sporadic colorectal adenomas. N Engl J Med, 2006. 355(9): p. 873-84.

212.

Baron JA, Sandler RS, Bresalier RS, Quan H, Riddell R, Lanas A, Bolognese JA, Oxenius B, Horgan K, Loftus S és Morton DG. A randomized trial of rofecoxib for the chemoprevention of colorectal adenomas. Gastroenterology, 2006. 131(6): p. 1674-82.

213.

Yona D és Arber N. Coxibs and cancer prevention. J Cardiovasc Pharmacol, 2006. 47 Suppl 1: p. S76-81.

214.

Sooriakumaran P, Macanas-Pirard P, Bucca G, Henderson A, Langley SE, Laing RW, Smith CP, Laing EE és Coley HM. A gene expression profiling approach assessing celecoxib in a randomized controlled trial in prostate cancer. Cancer Genomics Proteomics, 2009. 6(2): p. 93-9.

215.

John-Aryankalayil M, Palayoor ST, Cerna D, Falduto MT, Magnuson SR és Coleman CN. NS-398, ibuprofen, and cyclooxygenase-2 RNA interference produce significantly different gene expression profiles in prostate cancer cells. Mol Cancer Ther, 2009. 8(1): p. 261-73. 142

216.

Zagani R, Hamzaoui N, Cacheux W, de Reynies A, Terris B, Chaussade S, Romagnolo B, Perret C és Lamarque D. Cyclooxygenase-2 inhibitors down-regulate osteopontin

and

Nr4A2-new

therapeutic

targets

for

colorectal

cancers.

Gastroenterology, 2009. 137(4): p. 1358-66 e1-3. 217.

Guardavaccaro D, Corrente G, Covone F, Micheli L, D'Agnano I, Starace G, Caruso M és Tirone F. Arrest of G(1)-S progression by the p53-inducible gene PC3 is Rb dependent and relies on the inhibition of cyclin D1 transcription. Mol Cell Biol, 2000. 20(5): p. 1797-815.

218.

Soumaoro LT, Uetake H, Higuchi T, Takagi Y, Enomoto M és Sugihara K. Cyclooxygenase-2 expression: a significant prognostic indicator for patients with colorectal cancer. Clin Cancer Res, 2004. 10(24): p. 8465-71.

219.

Nakagawa H, Liyanarachchi S, Davuluri RV, Auer H, Martin EW, Jr., de la Chapelle A és Frankel WL. Role of cancer-associated stromal fibroblasts in metastatic colon cancer to the liver and their expression profiles. Oncogene, 2004. 23(44): p. 7366-77.

220.

Zomer A, Vendrig T, Hopmans ES, van Eijndhoven M, Middeldorp JM és Pegtel DM. Exosomes: Fit to deliver small RNA. Communicative & integrative biology, 2010. 3(5): p. 447-50.

221.

Akao Y, Iio A, Itoh T, Noguchi S, Itoh Y, Ohtsuki Y és Naoe T. Microvesiclemediated RNA molecule delivery system using monocytes/macrophages. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy, 2011. 19(2): p. 395-9.

222.

Corcoran C, Friel AM, Duffy MJ, Crown J és O'Driscoll L. Intracellular and extracellular microRNAs in breast cancer. Clinical chemistry, 2011. 57(1): p. 18-32.

223.

Kogure T, Lin WL, Yan IK, Braconi C és Patel T. Intercellular nanovesicle-mediated microRNA transfer: A mechanism of environmental modulation of hepatocellular cancer cell growth. Hepatology, 2011.

224.

Ng EK, Chong WW, Jin H, Lam EK, Shin VY, Yu J, Poon TC, Ng SS és Sung JJ. Differential expression of microRNAs in plasma of patients with colorectal cancer: a potential marker for colorectal cancer screening. Gut, 2009. 58(10): p. 1375-81.

225.

Turchinovich A, Weiz L, Langheinz A és Burwinkel B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic acids research, 2011.

143

12. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK 12.1 Az értekezés témájában, nemzetközi tudományos folyóiratban megjelent közlemények 1. Galamb O, Spisák S, Sipos F, Tóth K, Solymosi N, Wichmann B, Krenács T, Valcz G, Tulassay Z, Molnár B. Reversal of gene expression changes in the colorectal normaladenoma pathway by NS398 selective COX2 inhibitor. Br J Cancer. 2010;102(4):765-73. IF: 4,831 2. Spisák S, Galamb B, Sipos F, Galamb O, Wichmann B, Solymosi N, Nemes B, Molnár J, Tulassay Z, Molnár B. Applicability of antibody and mRNA expression microarrays for idetifing diagnostic and progression markers of early and late stage colorectal cancer. Dis Markers, 2010;28(1):1-14. IF: 1,723 3. Spisák S, Guttman A. Biomedical applications of protein microarrays. Curr Med Chem. 2009;16(22):2806-15. IF: 4,708 4. Galamb O, Sipos F, Spisák S, Galamb B, Krenács T, Valcz G, Tulassay Z, Molnár B. Potential biomarkers of colorectal adenoma-dysplasia-carcinoma progression: mRNA expression profiling and in situ protein detection on TMAs reveal 15 sequentially upregulated and 2 downregulated genes. Cell Oncol. 2009;31(1):19-29. IF: 4,169 5. Galamb O, Sipos F, Solymosi N, Spisák S, Krenács T, Tóth K, Tulassay Z, Molnár B. Diagnostic mRNA expression patterns of inflamed, benign and malignant colorectal biopsy specimen and their correlation with peripheral blood results. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2008;17(10):2835-45. IF: 4,770 6. Spisak S, Tulassay Z, Molnar B, Guttman A. Protein microchips in biomedicine and biomarker discovery. Electrophoresis. 2007 ;28(23):4261-73. IF: 3,609 7. Sipos F, Muzes G, Galamb O, Spisak S, Krenács T, Toth K, Tulassay Z, Molnar B. The possible role of isolated lymphoid follicles in colonic mucosal repair. Pathol Oncol Res. 2010;16(1):11-8. IF: 1,483

12.2. A dolgozat témájában, hazai tudományos folyóiratban megjelent közlemények 1. Spisák S, Kalmár A, Galamb O, Sipos F, Wichmann B, Molnár B, Tulassay Z. Identification of methylation related genes from laser capture microdissected colon

144

samples

during

investigation

of

adenoma-carcinoma

sequence

Orv Hetil.

2010;151(20):805-14. 2. Spisák S, Galamb B, Wichmann B, Sipos F, Galamb O, Solymosi N, Nemes B, Tulassay Z, Molnár B. Orv Hetil. Tissue microarray (TMA) validated progression markers in colorectal cancer using antibody microarrays. 2009;150(34):1607-13. 3. Spisák S, Molnár B, Galamb O, Sipos F, Tulassay Z. Fehérje chipek elméleti alapjai és alkalmazási lehetőségük az orvosi diagnosztikában és kutatásban. Orv Hetil. 2007; 148(32):1511-20.

12.3. Más témában, nemzetközi folyóiratban megjelent közlemények 1. Tóth K, Galamb O, Spisák S, Wichmann B, Sipos F, Valcz G, Leiszter K, Molnár B, Tulassay Z. The influence of methylated septin 9 gene on RNA and protein level in colorectal cancer. Pathol Oncol Res. 2011 (nyomtatásban). IF: 1,483 (2010) 2. Szoke D, Molnar B, Solymosi N, Racz K, Gergics P, Blasko B, Vasarhelyi B, Vannay A, Mandy Y, Klausz G, Gyulai Z, Galamb O, Spisak S, Hutkai B, Somogyi A, Berta K, Szabo A, Tulassay T, Tulassay Z. Polymorphisms of the ApoE, HSD3B1, IL-1beta and p53 genes are associated with the development of early uremic complications in diabetic patients: Results of a DNA resequencing array study. Int J Mol Med. 2009;23(2):217-27. IF: 1,980 3. Galamb O, Győrffy B, Sipos F, Spisák S, Németh AM, Miheller P, Tulassay Z, Dinya E, Molnár B. Inflammation, adenoma and cancer: objective classification of colon biopsy specimens with gene expression signature. Dis Markers. 2008;25(1):1-16. IF: 2,303 4. Galamb O, Győrffy B, Sipos F, Dinya E, Krenács T, Berczi L, Szőke D, Spisák S, Solymosi N, Németh AM, Juhász M, Molnár B, Tulassay Z. Helicobacter pylori and antrum erosion specific gene expression patterns: the discriminative role of CXCL13 and VCAM1 transcripts. Helicobacter. 2008;13(2):112-26. IF: 2,470 5. Galamb O, Sipos F, Molnár B, Szőke D, Spisák S, Tulassay Z. Evaluation of malignant and benign gastric biopsy specimens by mRNA expression profile and multivariate statistical methods. Cytometry B Clin Cytom. 2007 Sep;72(5):299-309. IF: 2,307 6. Galamb O, Sipos F, Dinya E, Spisák S, Tulassay Z, Molnár B. mRNA expression, functional profiling and multivariate classification of colon biopsy specimen by cDNA overall glass microarray. World J Gastroenterol. 2006;12(43):6998-7006.

145

12.4. Más témában, magyar nyelven megjelent közlemények 1. Valcz G, Sipos F, Krenács T, Spisák S, Tóth K, Molnár B, Tulassay Z. Az őssejtek jellemzése, mozgása és terápiás lehetőségei a humán vastagbélben. Magy. Belorv. Arch. 2009;4:272-278. 2. Leiszter K, Galamb O, Sipos F, Spisák S, Tóth K, Valcz G, Kalmár A, Műzes G, Molnár J, Molnár B, Tulassay Z. Az öregedés jelei az emésztőrendszerben. Magy Belorv Arch. 2010;63:19-24. 3. Tóth K, Galamb O, Spisák S, Wichmann B, Sipos F, Leiszter K, Molnár J, Molnár B, Tulassay Z. Free circulating DNA based colorectal cancer screening from peripheral blood: the possibility of the methylated septin 9 gene marker Orv Hetil. 2009;150(21):969-77. 4. Galamb O, Sipos F, Dinya E, Spisák S, Somorácz A, Molnár B, Tulassay Z. Vastagbélbiopszia funkcionális mRNS-expressziós vizsgálata és osztályozása általános cDNS microarray technikával. Orv Hetil. 2008;149(5):219-32. 5. Galamb O, Győrffy B, Sipos F, Spisák S, Németh AM, Miheller P, Dinya E, Molnár B, Tulassay Z. Vastagbél-adenoma, vastagbélrák és IBD-specifikus génexpressziós mintázatok meghatározása teljes genomszintű oligonukleotid microarray-rendszerrel. Orv Hetil. 2007;148(44):2067-79. Markusovszky díj 2008 6. Tóth K, Galamb O, Hevér-Pálfy T, Solymosi N, Miheller P, Müllner K, Spisák S, Sipos F, Molnár B, Tulassay Z. Vastagbél betegségben szenvedők perifériás vérének mRNS expressziós vizsgálata. Magy Belorv Arch. 2007; 60:531–539. 7. Szoke D, Sipos F, Spisak S, Molnar B, Tulassay Z. A p53 gén és fehérje 2005-ben: új eredmények, ígéretes lehetőségek. Orv Hetil, 2005;l46(30):1587-94.

146

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönetet szeretnék mondani mindazoknak, akik segítették PhD munkám elkészítését: - programvezetőmnek, Prof. Dr. Tulassay Zsolt egyetemi tanárnak, és témavezetőmnek, Dr. Molnár Béla tudományos főmunkatársnak, hogy lehetővé tették és támogatták PhD munkám elkészítését a Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinikáján; - Udvardyné Dr. Galamb Orsolya szakmai támogatásáért és barátságáért; - Dr. Mihály Emese és Dr. Igaz Péter házi opponenseimnek PhD dolgozatom alapos áttekintéséért; - Dr. Krenács Tibornak szakmai és a szöveti microarray vizsgálatokban nyújtott elengedhetetlen segítségéért; - Dr. Berczi Lajos egyetemi adjunktusnak a személyes konzultációk során nyújtott értékes és hasznos tanácsaiért; - Dr. Solymosi Norbertnek a bioinformatikai elemzések professzionális kivitelezéséért; - Csorba Gézáné Marica szakasszisztensnek a gyakorlati munkámban nyújtott segítségéért; - a Sejtanalitika Laboratórium összes dolgozójának támogatásukért; Végül, de nem utolsósorban köszönöm Családomnak, hogy mindenben mellettem álltak és állnak.

147

13. FÜGGELÉK

148

1. ábra Amplifikációs reakciók működési elve, technikai lépései A két körös IVT folyamata B TALPAT (T7 in vitro transzkripció majd Adapter ligálást követő PCR reakcióval történő Amplifikálás, majd ismételt T7 IVT) reakció sémája C SPIA (Single Primer Isothermal Amplification) reakció sémája. 149

2. ábra Az APC (A), CYCA1 (B), TOP1 (C) és EGFR (D) fehérjék változása az ép (N) szövetekhez képest a tumorokban (T). Az APC esetében tumorokban csökkenés figyelhető meg, az ép szövetekben domináló 3-as közepesen erős festődés helyett tumorokban a 0 nagyon gyenge erősségű festődés jellemző. A CYCA1 és a TOP1 esetében tumorokban a 2 valamint 3 erős festődés dominál, ami fokozódó kifejeződésre utal. Az EGFR tumorokban heterogén változást mutat. Korai stádiumokban erősebb festődés a jellemző, amely a tumorok fejlődése során mérséklődik. 150

1. TÁBLÁZAT 20 SZIGNIFIKÁNS (10 LEFELÉ ÉS 10 FELFELÉ) VÁLTOZÁST MUTATÓ FEHÉRJE A DAGANATOS ÉS ÉP TERÜLETEK KÖZÖTT, SEJTFUNKCIÓ SZERINT CSOPOROTOSÍTVA, M ÉRTÉK ÉS MÓDOSÍTOTT P ÉRTÉK MEGADÁSÁVAL Génnév

SwissProt

Sejtfunkció

M érték

p érték

ubiquitin-conjugating enzyme E2E 1 (UBC4/5 homolog, yeast)

P51965

protein degradation

-1,319

0,002

sequestosome 1

Q13501

cell differentiation

-1,044

0,005

KH domain containing, RNA binding, signal transduction associated 1 branched chain aminotransferase 1, cytosolic

Q07666 P54687

cell proliferation cell proliferation

-0,733 -0,719

0,008 0,008

protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 1B (dopamine and cAMP regulated phosphoprotein, DARPP-32) syntaxin 8

Q9NNW1 Q9UNK0

signal transduction transport

-0,616 -0,541

0,035 0,029

plectin 1, intermediate filament binding protein 500kDa nitric oxide synthase 1 (neuronal)

Q15149 P29475

cyoscheletal anchoring cell-cell signaling

-0,478 -0,408

0,005 0,025

adenomatosis polyposis coli caldesmon 1 proteasome (prosome, macropain) activator subunit 3 (PA28 gamma; Ki) serine/threonine kinase 24 (STE20 homolog, yeast)

P25054 Q05682

signal transduction muscle contraction

-0,397 -0,392

0,026 0,022

Q12920 Q9Y6E0

immun response signal transduction

0,389 0,431

0,033 0,003

topoisomerase (DNA) I thioredoxin-like, 32kDa

P11387 O43396

DNA topological change apoptosis

0,435 0,474

0,008 0,001

guanine nucleotide binding protein (G protein), beta polypeptide 1 F11 receptor

P04901 Q9Y624

signal transduction inflamatory response

0,478 0,529

0,004 0,005

cyclin A1 nuclear mitotic apparatus protein 1 CDC-like kinase 1

P20248 Q14980

cell cycle cell cycle

0,543 0,571

0,002 0,004

P21127 P10809

cell proliferation protein folding

0,578 0,635

0,003 0,004

heat shock 60kDa protein 1 (chaperonin)

151

2. TÁBLÁZAT KORAI STÁDIUMÚ DAGANATOS ÉS ÉP MINTÁK KÖZÖTT KAPOTT SZIGNIFIKÁNS ELTÉRÉST MUTATÓ GÉNEK Génnév

Funkció

SwissProt

M érték

1

ubiquitin-conjugating enzyme E2E 1 (UBC4/5 homolog, yeast)

Ubiquitin cycle, Ubiquitin-dependent protein catabolism

P51965

-1,8659954

2

sequestosome 1

Response to stress, Ubiquitin binding, Endosome transport, Intracellular signaling cascade

Q13501

-1,728748

3

MRE11 meiotic recombination 11 homolog A (S. cerevisiae)

Meiotic recombination, Meiosis, Double-strand break repair via nonhomologous end-joining

P49959

-1,5668813

4

HPV-16 L1

Viral envelopement protein

P03101

-1,1709425

5

protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 1B (dopamine and cAMP regulated phosphoprotein, DARPP-32)

Signal transduction, Protein phosphatase inhibitor activity, protein kinase inhibitor activity

Q9NNW1

-1,1278703

6

KH domain containing, RNA binding, signal transduction associated 1

RNA binding, signal transduction

Q07666

-0,9981032

7

branched chain aminotransferase 1, cytosolic

Cell proloferation

P54687

-0,7593773

8

EphA4

RNA binding, signal transduction

P54764

-0,6200302

9

neural precursor cell expressed, developmentally down-regulated 4

Structural molecule activity, Nuclear organization and biogenesis, Mitotic anaphase

P46934

-0,6180871

10

prenylcysteine lyase

Oxidoreductase activity, Lyase activity

Q9UHG3

0,5012577

11

thioredoxin-like, 32kDa

Electron transporter activity, Thiol-disulfide exchange intermediate activity, Apoptosis, Signal transduction

O43396

0,514952

12

casein kinase 2, beta polypeptide

Wnt receptor signaling pathway, Protein serine/threonine kinase activity

P13862

0,5329179

13

heat shock transcription factor 4

Transcription corepressor activity, Transcription factor activity, Response to unfolded protein, Transcription, Protein folding

Q9ULV5

0,5340181

14

nuclear mitotic apparatus protein 1

Mitosis

Q14980

0,5457712

15

polyamine-modulated factor 1

-

Q9UBQ3

0,5510122

16

cyclin A1

Mitosis, Regulation of cyclin dependent protein kinase activity

P20248

0,5577533

17

epidermal growth factor receptor (erythroblastic leukemia viral (v-erb-b) oncogene homolog, avian)

Epidermal growth factor receptor signaling pathway, Negative regulation of cell cycle, ATP binding, Transferase activity

P00533

0,5640857

18

CDC-like kinase 1

Cell cycle

P21127

0,5747314

19

topoisomerase (DNA) I

DNA topological change, DNA unwinding

P11387

0,5770331

20

guanine nucleotide binding protein (G protein), beta polypeptide 1

Signal transducer activity, G-protein coupled receptor protein signaling pathway

P04901

0,6049769

21

F11 receptor

Cell motility, Inflammatory response

Q9Y624

0,6984979

22

heat shock 60kDa protein 1 (chaperonin)

Unfolded protein binding, Mitochondrial matrix protein import

P10809

0,776671

152

3. TÁBLÁZAT KÉSŐI STÁDIUMÚ DAGANATOS ÉS ÉP MINTÁK KÖZÖTT KAPOTT SZIGNIFIKÁNS ELTÉRÉST MUTATÓ GÉNEK Génnév

Funkció

SwissProt

1

ubiquitin-conjugating enzyme E2E 1 (UBC4/5 homolog, yeast) (UBE2E1)

Ubiquitin cycle, Ubiquitin-dependent protein catabolism

P51965

-1,3655365

2

sequestosome 1 ()

Response to stress, Ubiquitin binding, Endosome transport, Intracellular signaling cascade

Q13501

-1,2216673

3

HPV-16 L1

P03101

-1,1267989

4

MRE11 meiotic recombination 11 homolog A (S. cerevisiae)

Meiotic recombination, Meiosis, Double-strand break repair via nonhomologous end-joining

P49959

-1,0716098

5

protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 1B (dopamine and cAMP regulated phosphoprotein) (DARPP-32)

Signal transduction, Protein phosphatase inhibitor activity, protein kinase inhibitor activity

Q9NNW1

-0,9386422

6

KH domain containing, RNA binding, signal transduction associated 1

RNA binding, signal transduction

Q07666

-0,8630941

7

heat shock 90kDa protein 1, alpha

P07900

-0,8473879

8

eukaryotic translation initiation factor 4E

RNA cap binding, Regulation of translation

P06730

-0,7378523

9

androgen receptor

Steroid binding, Cell proliferation, Regulation of transcription, Protein dimerization activity

P10275

-0,7205401

10

neural precursor cell expressed, developmentally down-regulated 4 (NEDD4)

protein degradation; protein ubiquitinylation.

P46934

-0,6205902

11

EphA4

RNA binding, signal transduction

P54764

-0,5975661

12

lymphocyte cytosolic protein 2 (SH2 domain containing leukocyte protein of 76kDa)

Q13094

-0,5729652

13

ATPase, Na+/K+ transporting, beta 2 polypeptide

P14415

-0,5413946

14

epidermal growth factor receptor pathway substrate 8

SH3/SH2 adaptor activity, Cell proliferation, EGFR signaling pathway, Signal transduction, SH3/SH2 adaptor activity

Q12929

0,5035487

15

growth associated protein 43

Cell differentiation, Regulation of cell growth, Neurogenesis, Calmodulin binding

P17677

0,5042365

16

nuclear protein, ataxia-telangiectasia locus

Q13632

0,5087894

17

epidermal growth factor receptor (erythroblastic leukemia viral (v-erb-b) oncogene homolog, avian)

P00533

0,5192014

18

DNA topoisomerase 1

Q

0,5367019

19

Rho GTPase activating protein 1

SH3/SH2 adaptor activity, GTP binding, Rho protein signal transduction, Cytoskeleton organization and biogenesis, Signal transduction

Q07960

0,5396524

20

syntaxin binding protein 1

Vesicle-mediated transport, Vesicle docking during exocytosis

Q64320

0,5473203

21

caveolin 1

Scaffolding protein, molecular transporting

P51636

0,5955298

22

sema domain, immunoglobulin domain (Ig), transmembrane domain (TM) and short cytoplasmic domain, (semaphorin) 4D

Receptor activity, Neurogenesis, Anti-apoptosis, Cell differentiation, Immune response

Q92854

0,5980394

23

nuclear mitotic apparatus protein 1

may be a structural component of the nucleus

Q14980

0,6672197

24

polymerase (DNA directed), epsilon

DNA binding, Nucleotide binding, DNA repair

Q07864

0,6765401

25

neutrophil cytosolic factor 2 (65kDa, chronic granulomatous disease, autosomal 2)

P19878

0,7448919

Epidermal growth factor receptor signaling pathway, Negative regulation of cell cycle, ATP binding, Transferase activity

153

M érték

4. TÁBLÁZAT A DAGANATOS PROGRESSZIÓ SORÁN SZIGNIFIKÁNS EXPRESSZIÓS ELTÉRÉST MUTATÓ SZELEKTÁLT GÉNEK

Fehérje neve

Funkció

SwissProt

M érték

ubiquitin-conjugating enzyme E2E 1 (UBC4/5 homolog, yeast)

cell proliferation

P51965

-1,314214341

sequestosome 1

signal transduction

Q13501

-1,043584071

HPV-16 L1

transport

P03101

-0,77024562

KH domain containing, RNA binding, signal transduction associated 1

cyoscheletal anchoring

Q07666

-0,733015297

branched chain aminotransferase 1, cytosolic

cell-cell signaling

P54687

-0,718986189

protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 1B (dopamine and cAMP regulated phosphoprotein, DARPP-32)

signal transduction

Q9NNW1

-0,616086234

syntaxin 8

muscle contraction

Q9UNK0

-0,541441325

F11 receptor

immun response

Q9Y624

0,528651479

cyclin A1

cell cycle

P20248

0,542708779

nuclear mitotic apparatus protein 1

DNA topological change

Q14980

0,571409175

CDC-like kinase 1

signal transduction

P21127

0,577723106

heat shock 60kDa protein 1 (chaperonin)

protein folding

P10809

0,634592412

5. TÁBLÁZAT A 20. ÁBRA SZERINT, A HÁM SEJTEKBEN AZONOSÍTOTT 100 LEGNAGYOBB EXPRESSZIÓS VÁLTOZÁST MUTATÓ GÉN LISTÁJA A TUMORPROGRESSZIÓ SORÁN ÉP-ADENOMA, ÉP-TUMOR és ADENOMATUMOR ÖSSZEHASONLÍTÁSOKBAN Génszimbólum

LDLRAD3

Génnév

low density lipoprotein receptor class A

Probe Set

Expressziós

Expressziós

Expressziós

azonosító

különbség

különbség

különbség

(N-A)

(N-T)

(A-T)

234985_at

1,0011

11,5172

11,5042

204849_at

0,6224

18,6743

30,0037

domain containing 3 TCFL5

transcription factor-like 5 (basic helixloop-helix)

DACH1

dachshund homolog 1 (Drosophila)

205472_s_at

1,1002

12,0261

10,9311

DUSP14

dual specificity phosphatase 14

203367_at

1,4720

9,1607

6,2234

JUB

jub, ajuba homolog (Xenopus laevis)

225806_at

1,2809

16,0811

12,5549

JAG2

jagged 2

32137_at

0,5152

8,8820

17,2401

---

---

216565_x_at

0,9655

5,9993

6,2139

154

NEU1

sialidase 1 (lysosomal sialidase)

208926_at

1,6358

10,4583

6,3935

PLAGL2

pleiomorphic adenoma gene-like 2

202925_s_at

1,0666

9,2323

8,6558

SLCO4A1

solute carrier organic anion transporter

219911_s_at

0,7965

19,3839

24,3356

235694_at

0,7486

5,8440

7,8064

family, member 4A1 TCFL5

transcription factor-like 5 (basic helixloop-helix)

JAG2

jagged 2

209784_s_at

0,9309

6,5628

7,0499

SCRN1

secernin 1

201462_at

0,9341

15,8630

16,9817

ASAP1

ArfGAP with SH3 domain, ankyrin repeat

224791_at

0,8515

9,1815

10,7830

226017_at

0,4908

5,7503

11,7168

and PH domain 1 CMTM7

CKLF-like

MARVEL

transmembrane

domain containing 7 PROX1

prospero homeobox 1

228656_at

0,6382

11,2340

17,6038

RNF114

ring finger protein 114

200868_s_at

0,4169

7,6409

18,3259

RAE1

RAE1 RNA export 1 homolog (S. pombe)

211318_s_at

0,7993

11,8364

14,8077

FAM60A

family

223038_s_at

0,1838

3,8615

21,0146

with

sequence

similarity

60,

member A BCL2L1

BCL2-like 1

212312_at

0,3124

4,4129

14,1248

C7orf68

chromosome 7 open reading frame 68

218507_at

0,3371

11,2265

33,3018

NANP

N-acetylneuraminic acid phosphatase

228073_at

0,4218

6,5280

15,4770

C20orf177

chromosome 20 open reading frame 177

225313_at

0,8357

6,4656

7,7364

RPS27A

ribosomal protein S27a

242214_at

0,0971

1,1078

11,4114

CDCA7

cell division cycle associated 7

230060_at

0,1343

1,2385

9,2251

EHF

ets homologous factor

224189_x_at

0,0425

0,4302

10,1122

RNF160

ring finger protein 160

233819_s_at

0,0746

0,4317

5,7877

PRR5

proline rich 5 (renal)

47069_at

0,0755

1,6695

22,1195

SLC25A1

solute carrier family 25 (mitochondrial

210010_s_at

0,1397

1,3932

9,9720

carrier; citrate transporter), member 1 PKP4

plakophilin 4

201927_s_at

0,0750

1,2536

16,7200

KIF1C

kinesin family member 1C

238477_at

0,0762

0,3797

4,9803

NME3

non-metastatic cells 3, protein expressed in

204862_s_at

0,1239

0,5534

4,4660

RNF213

ring finger protein 213

230000_at

0,1116

1,1241

10,0720

MACC1

metastasis associated in colon cancer 1

1566766_a_at

1,1149

11,0845

9,9419

MACC1

metastasis associated in colon cancer 1

232151_at

1,1263

8,7605

7,7779

DGAT2

diacylglycerol O-acyltransferase homolog

226064_s_at

1,0981

7,2026

6,5594

236565_s_at

1,0070

11,8901

11,8072

2 (mouse) LARP6

La

ribonucleoprotein

domain

family,

member 6 KRT23

keratin 23 (histone deacetylase inducible)

218963_s_at

1,1559

42,2087

36,5165

DPEP1

dipeptidase 1 (renal)

205983_at

1,4509

31,2876

21,5647

TRIB3

tribbles homolog 3 (Drosophila)

218145_at

1,3543

46,1252

34,0595

PLD6

phospholipase D family, member 6

227037_at

0,9769

5,3505

5,4772

DNTTIP1

deoxynucleotidyltransferase,

234942_s_at

0,8117

6,5004

8,0080

201802_at

1,0038

6,9806

6,9545

terminal,

interacting protein 1 SLC29A1

solute

carrier

family 29

(nucleoside

transporters), member 1

155

TGM2

transglutaminase

2

(C

polypeptide,

201042_at

0,9683

10,0794

10,4095

protein-glutamine-gammaglutamyltransferase) GPR143

G protein-coupled receptor 143

206696_at

1,1924

12,1823

10,2162

CHST5

carbohydrate (N-acetylglucosamine 6-O)

221164_x_at

0,1015

0,0360

0,3549

sulfotransferase 5 MUC4

mucin 4, cell surface associated

204895_x_at

0,1551

0,0420

0,2706

CPM

carboxypeptidase M

206100_at

0,1211

0,0830

0,6852

EFNA5

ephrin-A5

227955_s_at

0,1162

0,0557

0,4800

CPM

carboxypeptidase M

235706_at

0,1791

0,0568

0,3169

---

---

239545_at

0,1129

0,0897

0,7945

KLF9

Kruppel-like factor 9

203542_s_at

0,0972

0,0795

0,8177

TMEM72

transmembrane protein 72

1558324_a_at

0,1026

0,0892

0,8691

FOXA1

Forkhead box A1

237086_at

0,1529

0,1138

0,7446

INSM1

insulinoma-associated 1

206502_s_at

0,0831

0,0696

0,8379

SLC4A4

solute carrier family 4, sodium bicarbonate

203908_at

0,1580

0,0043

0,0270

cotransporter, member 4 HSPA4

Heat shock 70kDa protein 4

208814_at

0,0753

1,3075

17,3713

COX15

COX15 homolog, cytochrome c oxidase

223281_s_at

0,0510

0,8575

16,8159

222875_at

0,0757

1,8557

24,5008

assembly protein (yeast) DHX33

DEAH

(Asp-Glu-Ala-His)

box

polypeptide 33 THOC4

THO complex 4

226320_at

0,0452

0,9457

20,9001

WDR4

WD repeat domain 4

241937_s_at

0,0507

1,6918

33,3560

PRRC1

proline-rich coiled-coil 1

221734_at

0,0626

0,6541

10,4433

DNAJC3

DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily C,

1558080_s_at

0,0453

0,9356

20,6548

member 3 C16orf88

chromosome 16 open reading frame 88

213235_at

0,1564

0,7349

4,6997

CAMK2D

calcium/calmodulin-dependent

protein

231793_s_at

0,0553

0,1512

2,7340

interleukin enhancer binding factor 3,

211375_s_at

0,1027

1,7416

16,9616

216088_s_at

0,1465

4,1742

28,4880

kinase II delta ILF3

90kDa PSMA7

proteasome (prosome, macropain) subunit, alpha type, 7

CSK

c-src tyrosine kinase

202329_at

0,1907

0,9858

5,1682

NPLOC4

nuclear protein localization 4 homolog (S.

217796_s_at

0,2291

1,4869

6,4906

cerevisiae) FOXQ1

forkhead box Q1

227475_at

22,6732

322,6377

14,2299

SLC6A6

solute carrier family 6 (neurotransmitter

228754_at

6,7593

72,0925

10,6656

212942_s_at

28,0710

77,1770

2,7494

238021_s_at

13,5699

27,7631

2,0459

transporter, taurine), member 6 KIAA1199

KIAA1199

CRNDE

colorectal

neoplasia

differentially

expressed (non-protein coding) MUC4

mucin 4, cell surface associated

217109_at

0,4756

0,0049

0,0103

AGR3

anterior gradient homolog 3 (Xenopus

228241_at

1,1031

0,0093

0,0085

laevis)

156

MUC2

mucin 2, oligomeric mucus/gel-forming

204673_at

0,4097

0,0046

0,0113

---

---

AFFX-BioC-

0,3661

0,0060

0,0163

3_at IL1R2

interleukin 1 receptor, type II

205403_at

0,2143

0,0056

0,0261

AGR2

anterior gradient homolog 2 (Xenopus

228969_at

0,4177

0,0228

0,0547

223969_s_at

5,1482

0,0266

0,0052

1553828_at

2,1744

0,0198

0,0091

laevis) RETNLB

resistin like beta

FAM55A

family

with

sequence

similarity

55,

member A ITLN1

intelectin 1 (galactofuranose binding)

223597_at

1,3222

0,0027

0,0021

ZG16

zymogen granule protein 16 homolog (rat)

214142_at

0,1714

0,0019

0,0113

SLC4A4

solute carrier family 4, sodium bicarbonate

211494_s_at

0,0803

0,0784

0,9762

206664_at

1,5803

0,0160

0,0101

cotransporter, member 4 SI

sucrase-isomaltase (alpha-glucosidase)

HEPACAM2

HEPACAM family member 2

FAM55D

family

with

sequence

242601_at

0,9347

0,0172

0,0184

55,

220645_at

1,6772

0,0177

0,0105

domain

229369_at

0,2668

0,0091

0,0341

similarity

member D VSIG2

V-set

and

immunoglobulin

containing 2 ---

---

239673_at

0,5848

0,0261

0,0446

MUC4

mucin 4, cell surface associated

217110_s_at

0,2565

0,0138

0,0537

C14orf50

chromosome 14 open reading frame 50

237654_at

2,2819

0,1112

0,0487

SERTAD4

SERTA domain containing 4

230660_at

0,7258

0,0738

0,1017

EDIL3

EGF-like repeats and discoidin I-like

225275_at

0,0197

0,0129

0,6521

domains 3 PTGDR

prostaglandin D2 receptor (DP)

215894_at

0,0363

0,0104

0,2862

CHGA

chromogranin A (parathyroid secretory

204697_s_at

0,0582

0,0097

0,1660

206262_at

16,2080

0,2519

0,0155

AFFX-BioC-

15,5002

0,2750

0,0177

19,0391

0,2771

0,0146

protein 1) ADH1C

alcohol dehydrogenase 1C

(class

I),

gamma polypeptide ---

---

5_at ---

---

AFFX-r2-EcbioC-5_at

FCGBP

Fc fragment of IgG binding protein

203240_at

1,5494

0,0044

0,0028

CLCA1

chloride channel accessory 1

210107_at

2,1151

0,0006

0,0003

157

6.

TÁBLÁZAT

A

21.

ÁBRA

SZERINT,

A

STROMA

SEJTEKBEN

AZONOSÍTOTT 100 LEGNAGYOBB EXPRESSZIÓS VÁLTOZÁST MUTATÓ GÉN LISTÁJA A TUMORPROGRESSZIÓ SORÁN ÉP-ADENOMA, ÉPTUMOR és ADENOMA-TUMOR ÖSSZEHASONLÍTÁSOKBAN Génszimbólum

Génnév

Expressziós

Expressziós

Expressziós

különbség

különbség

különbség

(N-A)

(N-T)

(A-T)

205422_s_at

1,198

24,221

20,226

Probe

Set

azonosító

ITGBL1

integrin, beta-like 1 (with EGF-like repeat domains)

KAL1

Kallmann syndrome 1 sequence

205206_at

0,922

30,990

33,616

COL1A1

collagen, type I, alpha 1

202311_s_at

1,054

18,851

17,893

---

---

222288_at

0,894

16,264

18,192

F2RL2

coagulation factor II (thrombin) receptor-like

230147_at

1,402

29,076

20,739

2 TWIST1

twist homolog 1 (Drosophila)

213943_at

0,770

26,147

33,959

PDPN

podoplanin

221898_at

0,899

35,866

39,901

---

---

PLOD2

procollagen-lysine,

2-oxoglutarate

214807_at

0,642

9,969

15,519

5-

202619_s_at

0,671

9,044

13,487

1;

205529_s_at

0,432

8,416

19,486

dioxygenase 2 RUNX1T1

runt-related

transcription

factor

translocated to, 1 (cyclin D-related) MAB21L2

mab-21-like 2 (C. elegans)

210302_s_at

0,574

15,631

27,209

FOXQ1

forkhead box Q1

227475_at

1,368

31,105

22,731

IFIT3

interferon-induced

229450_at

0,663

11,453

17,261

protein

with

tetratricopeptide repeats 3 KIAA1217

KIAA1217

231807_at

0,736

15,208

20,652

GPX8

glutathione peroxidase 8 (putative)

228141_at

0,483

12,303

25,495

GUCY1B3

guanylate cyclase 1, soluble, beta 3

203817_at

1,211

17,183

14,185

BCAT1

branched chain amino-acid transaminase 1,

226517_at

0,648

35,658

55,065

cytosolic THY1

Thy-1 cell surface antigen

208850_s_at

0,561

22,928

40,849

MMP2

matrix metallopeptidase 2

201069_at

0,490

38,852

79,349

GUCY1A3

guanylate cyclase 1, soluble, alpha 3

221942_s_at

1,175

58,329

49,644

PRRX1

paired related homeobox 1

226695_at

0,770

53,071

68,910

COL5A1

collagen, type V, alpha 1

203325_s_at

0,535

14,494

27,105

COL5A2

collagen, type V, alpha 2

221730_at

0,204

21,333

104,424

KRAS

v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene

214352_s_at

0,042

1,365

32,580

homolog C7orf42

chromosome 7 open reading frame 42

218008_at

0,078

1,857

23,853

CREB3L2

cAMP responsive element binding protein 3-

212345_s_at

0,043

1,044

24,263

212718_at

0,065

1,798

27,478

like 2 PAPOLA

poly(A) polymerase alpha

158

CEP350

centrosomal protein 350kDa

204373_s_at

0,060

1,261

21,130

CAMK2N1

calcium/calmodulin-dependent

protein

218309_at

0,052

0,878

16,816

5'-phosphosulfate

209043_at

0,138

3,433

24,898

protein

213812_s_at

0,111

2,973

26,767

pleckstrin homology domain containing,

220952_s_at

0,077

1,524

19,897

kinase II inhibitor 1 PAPSS1

3'-phosphoadenosine synthase 1

CAMKK2

calcium/calmodulin-dependent kinase kinase 2, beta

PLEKHA5

family A member 5 ZNF791

zinc finger protein 791

1553703_at

0,045

1,358

30,064

C9orf5

chromosome 9 open reading frame 5

223006_s_at

0,103

3,453

33,517

IGF2R

insulin-like growth factor 2 receptor

201393_s_at

0,090

4,577

50,963

SCAMP1

secretory carrier membrane protein 1

212417_at

0,099

1,965

19,813

FOXO3

forkhead box O3

204131_s_at

0,074

1,076

14,617

FERMT2

fermitin family homolog 2 (Drosophila)

209210_s_at

0,054

5,923

110,474

BGN

biglycan

213905_x_at

0,593

88,196

148,782

---

---

226237_at

0,694

220,043

317,025

ASPN

asporin

219087_at

0,519

125,304

241,318

---

---

227140_at

2,136

367,652

172,112

SULF1

sulfatase 1

212344_at

1,348

22,090

16,390

THBS2

thrombospondin 2

203083_at

1,095

869,639

794,142

COL11A1

collagen, type XI, alpha 1

204320_at

1,256

332,465

264,787

COL11A1

collagen, type XI, alpha 1

37892_at

1,034

634,323

613,702

SFRP2

secreted frizzled-related protein 2

223122_s_at

1,018

179,096

175,858

---

---

229802_at

1,058

101,851

96,272

SULF1

sulfatase 1

212353_at

1,272

100,723

79,186

GUCY1A3

guanylate cyclase 1, soluble, alpha 3

227235_at

0,854

43,016

50,387

GUCY1A3

guanylate cyclase 1, soluble, alpha 3

229530_at

1,929

50,480

26,170

IGFBP5

insulin-like growth factor binding protein 5

211959_at

0,754

36,215

48,011

COL12A1

collagen, type XII, alpha 1

225664_at

1,442

79,300

54,977

CTHRC1

collagen triple helix repeat containing 1

225681_at

0,153

94,897

622,168

---

---

238617_at

1,108

20,203

18,230

---

---

226777_at

1,114

30,738

27,586

COL12A1

collagen, type XII, alpha 1

231766_s_at

1,190

27,070

22,753

MYH10

myosin, heavy chain 10, non-muscle

212372_at

0,903

28,701

31,769

MGP

matrix Gla protein

202291_s_at

1,068

20,045

18,776

---

---

238623_at

1,168

20,668

17,700

---

---

226311_at

1,570

22,581

14,384

GAS1

growth arrest-specific 1

204457_s_at

1,204

22,373

18,576

THY1

Thy-1 cell surface antigen

213869_x_at

0,954

43,353

45,455

DIO2

deiodinase, iodothyronine, type II

203699_s_at

0,720

28,094

39,045

INHBA

inhibin, beta A

210511_s_at

1,223

95,704

78,273

ITGBL1

integrin, beta-like 1 (with EGF-like repeat

214927_at

1,333

32,514

24,398

212354_at

1,826

166,578

91,245

domains) SULF1

sulfatase 1

159

SFRP4

secreted frizzled-related protein 4

204051_s_at

0,955

29,382

30,778

FAP

fibroblast activation protein, alpha

209955_s_at

0,920

16,581

18,020

FIBIN

fin bud initiation factor homolog (zebrafish)

226769_at

1,063

33,576

31,580

FNDC1

fibronectin type III domain containing 1

226930_at

1,022

50,309

49,245

SFRP4

secreted frizzled-related protein 4

204052_s_at

0,971

59,989

61,766

LRRC15

leucine rich repeat containing 15

213909_at

1,449

20,778

14,337

ITGBL1

Integrin, beta-like 1 (with EGF-like repeat

231993_at

1,221

39,575

32,412

domains) DPT

dermatopontin

213068_at

0,904

24,870

27,514

CXCL10

chemokine (C-X-C motif) ligand 10

204533_at

1,153

32,291

28,000

LSAMP

limbic system-associated membrane protein

228218_at

1,029

9,635

9,367

---

---

236297_at

0,926

9,274

10,010

CRISPLD1

cysteine-rich secretory protein LCCL domain

223475_at

1,273

17,525

13,765

205648_at

1,866

11,350

6,083

containing 1 WNT2

wingless-type MMTV integration site family member 2

COL10A1

collagen, type X, alpha 1

205941_s_at

0,962

10,329

10,739

RGS16

regulator of G-protein signaling 16

209324_s_at

1,006

13,929

13,841

CFI

complement factor I

203854_at

0,875

12,893

14,734

PTP4A3

protein tyrosine phosphatase type IVA,

209695_at

0,853

16,333

19,146

219454_at

1,191

19,285

16,196

205303_at

1,024

11,459

11,187

member 3 EGFL6

EGF-like-domain, multiple 6

KCNJ8

potassium

inwardly-rectifying

channel,

subfamily J, member 8 NID2

nidogen 2 (osteonidogen)

204114_at

0,898

19,302

21,496

GJC1

gap junction protein, gamma 1, 45kDa

228776_at

0,938

14,657

15,630

ADAMTS5

ADAM

219935_at

0,910

15,234

16,744

229242_at

1,215

7,475

6,155

metallopeptidase

with

thrombospondin type 1 motif, 5 ---

---

SHISA2

shisa homolog 2 (Xenopus laevis)

MEST

mesoderm

230493_at

1,855

16,652

8,977

homolog

202016_at

0,777

9,800

12,608

DIP2 disco-interacting protein 2 homolog C

212504_at

0,518

4,065

7,843

specific

transcript

(mouse) DIP2C

(Drosophila) C10orf46

chromosome 10 open reading frame 46

227258_at

3,615

0,750

0,207

CA1

carbonic anhydrase I

205950_s_at

0,050

0,011

0,224

UGT2B17

UDP

207245_at

0,044

0,015

0,339

glucuronosyltransferase

2

family,

polypeptide B17 ZG16

zymogen granule protein 16 homolog (rat)

214142_at

0,053

0,008

0,154

ABCA8

ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1),

204719_at

0,013

0,007

0,517

220834_at

0,022

0,011

0,529

210107_at

1,612

0,012

0,008

member 8 MS4A12

membrane-spanning 4-domains, subfamily A, member 12

CLCA1

chloride channel accessory 1

160

7. TÁBLÁZAT A PEYER PLAKKOKBAN AZONOSÍTOTT ALUL ÉS FELÜLEXPRESSZÁLT GÉNEK LISTÁJA ÉS FUNKCIONÁLIS JELLEMZÉSE ÉP VS ADENOMA LCM MINTÁKBÓL, A 22. ÁBRA SZERINT Génszimbólum

Génnév

Probe Set

Expressziós

azonosító

különbség (N-A)

RGS10

regulator of G-protein signaling 10

204316_at

0,6544

FILIP1L

filamin A interacting protein 1-like

1554966_a_at

0,6222

RPS24

Ribosomal protein S24

1555878_at

0,4867

---

---

234997_x_at

0,4796

CCL2

chemokine (C-C motif) ligand 2

216598_s_at

0,5294

TGFBI

transforming growth factor, beta-induced, 68kDa

201506_at

0,3928

SLC26A2

solute carrier family 26 (sulfate transporter), member 2

224959_at

0,3370

MTIF2

mitochondrial translational initiation factor 2

203095_at

0,2832

---

---

241893_at

0,2133

ARPC5L

actin related protein 2/3 complex, subunit 5-like

226914_at

0,2277

SP110

SP110 nuclear body protein

209762_x_at

0,2111

DDIT4

DNA-damage-inducible transcript 4

202887_s_at

0,2494

MBP

myelin basic protein

210136_at

0,5397

FTSJ3

FtsJ homolog 3 (E. coli)

218103_at

0,5558

SLC2A3

solute carrier family 2 (facilitated glucose transporter), member 3

202499_s_at

0,4467

CSTB

cystatin B (stefin B)

201201_at

0,4336

NNMT

nicotinamide N-methyltransferase

202237_at

0,4570

TMEM176A

transmembrane protein 176A

218345_at

0,4160

GBP1

guanylate binding protein 1, interferon-inducible, 67kDa

202269_x_at

0,2479

GBP1

guanylate binding protein 1, interferon-inducible, 67kDa

231577_s_at

0,2670

CXCL9

chemokine (C-X-C motif) ligand 9

203915_at

0,2520

---

---

243030_at

0,4462

CCDC84

coiled-coil domain containing 84

227208_at

0,3453

RAB31

RAB31, member RAS oncogene family

217762_s_at

0,4162

TIMP2

TIMP metallopeptidase inhibitor 2

231579_s_at

0,3941

IFNGR2

interferon gamma receptor 2 (interferon gamma transducer 1)

201642_at

0,4217

FILIP1L

filamin A interacting protein 1-like

204135_at

0,4064

USP12

ubiquitin specific peptidase 12

213327_s_at

0,4775

---

---

1557632_at

0,3939

DUSP6

dual specificity phosphatase 6

208892_s_at

0,3346

RGS1

regulator of G-protein signaling 1

202988_s_at

0,4663

---

---

234989_at

0,1620

GLIPR1

GLI pathogenesis-related 1

214085_x_at

0,2689

EPHB4

EPH receptor B4

216680_s_at

1,7526

FOLR2

folate receptor 2 (fetal)

204829_s_at

1,5306

LPGAT1

lysophosphatidylglycerol acyltransferase 1

227476_at

0,5923

FAM120C

family with sequence similarity 120C

229512_at

0,6632

161

ARF4

ADP-ribosylation factor 4

201096_s_at

0,4640

FAM63A

family with sequence similarity 63, member A

226062_x_at

0,7323

SMARCA5

SWI/SNF actin dependent regulator of chromatin, subfamily a, member 5

202303_x_at

0,3719

AKT3

v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 3 (protein kinase B, gamma)

212607_at

0,3363

WDFY1

WD repeat and FYVE domain containing 1

224800_at

0,4176

---

---

242471_at

0,2617

CHURC1

churchill domain containing 1

226736_at

0,2727

ZNF22

zinc finger protein 22 (KOX 15)

218006_s_at

0,5535

PFKP

phosphofructokinase, platelet

201037_at

0,5072

CD84

CD84 molecule

205988_at

0,3572

MAFF

v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog F (avian)

36711_at

0,4520

---

---

244357_at

0,3533

KLF4

Kruppel-like factor 4 (gut)

221841_s_at

0,3990

UGT2B17

UDP glucuronosyltransferase 2 family, polypeptide B17

207245_at

0,2613

CTU2

Cytosolic thiouridylase subunit 2 homolog (S. pombe)

1561500_at

1,5076

NOD2

nucleotide-binding oligomerization domain containing 2

220066_at

1,6893

SERGEF

secretion regulating guanine nucleotide exchange factor

220482_s_at

1,9962

CTNS

cystinosis, nephropathic

36566_at

1,4216

EPS15L1

epidermal growth factor receptor pathway substrate 15-like 1

231926_at

1,5992

ZNF506

zinc finger protein 506

221626_at

1,5225

LOC100130700

similar to hCG2038355

237730_at

1,3426

TMEM150A

transmembrane protein 150A

226239_at

1,3605

CD7

CD7 molecule

214049_x_at

1,4198

---

---

240571_at

2,2578

SCRN2

secernin 2

225513_at

1,5977

TRPM3

transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 3

233022_at

1,3852

PGAP3

post-GPI attachment to proteins 3

221811_at

1,8491

LOC401431

hypothetical LOC401431

229094_at

1,7090

MGAT3

mannosyl (beta-1,4-)-glycoprotein beta-1,4-N-acetylglucosaminyltransferase

209764_at

1,5117

C1orf86

chromosome 1 open reading frame 86

236499_at

1,8778

TEF

thyrotrophic embryonic factor

225840_at

2,6659

DKFZp761P0212

hypothetical protein DKFZp761P0212

234846_at

1,8806

BAT2L2

HLA-B associated transcript 2-like 2

214055_x_at

0,3853

COL3A1

collagen, type III, alpha 1

215076_s_at

0,2492

NCOA7

nuclear receptor coactivator 7

225344_at

0,2633

TSC22D3

TSC22 domain family, member 3

208763_s_at

0,2886

TOX4

TOX high mobility group box family member 4

201684_s_at

1,5012

EIF5B

eukaryotic translation initiation factor 5B

201024_x_at

0,5132

162

8. TÁBLÁZAT A GÉNEXPRESSZIÓS VIZSGÁLATOKHOZ HASZNÁLT OLIGONUKLEOTID SZEKVENCIÁK

Affy_ID

Génszimbólum

Forward primer szekvencia 5’-3’

Reverz primer szekvencia 5’-3’

242608_x_at

FAM161B

GAGCAAGACCCCATCTCAAA

CAATCATCCTGTCTCCACAGC

234877_x_at

*

GTCCCACGCCTGACAGTAAT

GATTCTCCGGCTCCAACTCT

207868_x_at

* (CHRNA2)

TACAGGTGGCTGGGCTATTC

GGAGAGGAATGACGTCAAGG

1554997_a_at

PTGS2

AGCCATTTTGCTAAGAGACACA

GGCAGAGTCCAAAGAAAGTGA

1556395_at

*

AATGGTTTACCAGCTGTTCACTT

ACTCTGCTCTTTCCCCAACA

204674_at

LRMP

TGTTTGCAGCTTTGATGAGC

TGAGTCCTCTTGCTGTGTGG

206422_at

GCG

TCCGATCTGACATATCTGCATT

CACCACTGTGGCTACCAGTTC

207109_at

POU2F3

GGCTGGGAATCTTTGTTGAC

TCTCTACAAACTGGCCCACA

212092_at

PEG10

TTCACCAACGACAAGAACGA

CCAAATGTGGATCAGGGACT

223484_at

C15orf48

TGCAGCAATAACTGCACTGTC

GCTTTGTAAATTTTAAGAAAAACATTC

226147_s_at

PIGR

TGTTTGATGGTGCCAGAGAG

AGCAAGTGCCAGCTTGTAGG

229147_at

*

TGCAAGAATATAAACTTGTCACAGAA

CAATGAAATATTTGGACCACCT

235638_at

RASSF6

TGGAATTATATGCAACATTCTTTC

GCTTATGAGGAATGCAAATGG

236313_at

CDKN2B

TTTGAAGGATACATGCAAAACA

CCACAATGGAGCTAGAAGCA

217451_at

COX5

AACAGTCACCTGGAAATACTGATG

GTTCGAACTCATTTCCCTTTT

215894_at

PTGDR

TTCAGATCTCCAGTATTTCGGATA

CACCGGCTCCTGTACCTAAG

206631_at

PTGER

TGATATTGGGGCCATGAGTAA

TCAAACCATGTTCCCCTAAA

163

9. TÁBLÁZAT BIOPSZIÁS MINTÁKON AZONOSÍTOTT 20 ADENOMA ÉS 38 TUMOR ASSZOCIÁLT GÉN FUNKCIONÁLIS JELLEMZÉSE Affymetrix ID Gene symbol Adenoma vs normal KIAA1199 212942_s_at FOXQ1 227475_at CA7 207504_at ABCA8 204719_at BEST4 1552296_at — 240157_at SPIB 205861_at PYY 207080_s_at — 237530_at HAPLN1 230204_at TRPM6 240389_at

Gene name

Function

KIAA1199 Forkhead box Q1 Carbonic anhydrase VII ATP-binding cassette, subfamily A (ABC1), member 8 Bestrophin 4 Ion transport — Spi-B transcription factor Peptide YY — Hyaluronan and proteoglycan link protein 1 Transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 6

Sensory perception of sound Transcription, regulation of transcription One-carbon compound metabolic process Transport Ion transport — Transcription, regulation of transcription Cell motility, cytoskeleton organisation and biogenesis, cell proliferation — Cell adhesion Protein amino acid phosphorylation, calcium ion transport

1558324_a_at 214598_at 203256_at 205523_at 206422_at 213921_at 224412_s_at

TMEM72 CLDN8 CDH3 HAPLN1 GCG SST TRPM6

Transmembrane protein 72 Claudin 8 Cadherin 3, type 1, P-cadherin Hyaluronan and proteoglycan link protein 1 Glucagon Somatostatin Transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 6

— Calcium-independent cell – cell adhesion Transcription, regulation of transcription Cell adhesion Signal transduction, feeding behavior, cell proliferation Cell surface receptor linked signal transduction Protein aminoacid phosphorylation, calcium ion transport

203000_at 202504_at

STMN2 TRIM29

Stathmin-like 2 Tripartite motif-containing 29

Intracellular signalling cascade, neuron differentiation Transcription from RNA polymerase II promoter

164

CRC vs normal 202112_at 202859_x_at 209395_at 202917_s_at 218468_s_at 212531_at 204470_at 211981_at 213338_at 211980_at 209752_at 211959_at 225681_at 218469_at 209087_x_at 207504_at 205067_at 212657_s_at 225664_at 202311_s_at 209774_x_at 225842_at 219727_at 211506_s_at 209875_s_at

VWF IL8 CHI3L1 S100A8 GREM1 LCN2 CXCL1 COL4A1 TMEM158 COL4A1 REG1A IGFBP5 CTHRC1 GREM1 MCAM CA7 IL1B IL1RN COL12A1 COL1A1 CXCL2 PHLDA1 DUOX2 IL8 SPP1

von Willebrand factor Interleukin 8 Chitinase 3-like 1 S100 calcium binding protein A8 Gremlin 1, cysteine knot superfamily, homolog Lipocalin 2 Chemokine (C-X-C motif) ligand 1 Collagen, type IV, a1 Transmembrane protein 158 Collagen, type IV, a1 Regenerating islet-derived 1a Insulin-like growth factor binding protein 5 Collagen triple helix repeat containing 1 Gremlin 1, cysteine knot superfamily, homolog Melanoma cell adhesion molecule Carbonic anhydrase VII Interleukin 1, b Interleukin 1 receptor antagonist Collagen, type XII, a1 Collagen, type I, a1 Chemokine (C-X-C motif) ligand 2 Pleckstrin homology-like domain, family A, member 1 Dual oxidase 2 Interleukin 8 Secreted phosphoprotein 1 (osteopontin)

165

Cell adhesion, blood coagulation, hemostasis Angiogenesis, cell motility, chemotaxis Carbohydrate metabolic process, chitin catabolic process, transport Inflammatory response Multicellular organismal development, nervous system development Transport Chemotaxis, inflammatory response, cell proliferation Phosphate transport — Phosphate transport Positive regulation of cell proliferation Regulation of cell growth, signal transduction Phosphate transport Multicellular organismal development, nervous system development Cell adhesion, anatomical structure morphogenesis One-carbon compound metabolic process Angiogenesis, fever, apoptosis, inflammatory response Inflammatory response, immune response Skeletal development, phosphate transport, cell adhesion Skeletal development, ossification, phosphate transport Chemotaxis, inflammatory response Apoptosis, FasL biosynthetic process Electron transport, response to oxidative stress Angiogenesis, cell motility, chemotaxis, inflammatory response Ossification, cell adhesion, negative regulation of bone mineralisation

205828_at 211340_s_at 1552296_at 204677_at 202404_s_at 240157_at 39402_at 206121_at 201438_at 201195_s_at 1558324_a_at 210869_s_at 220724_at

MMP3 MCAM BEST4 CDH5 COL1A2 — IL1B AMPD1 COL6A3 SLC7A5 TMEM72 MCAM FLJ21511

Matrix metallopeptidase 3 Melanoma cell adhesion molecule Bestrophin 4 Cadherin 5, type 2, VE-cadherin Collagen, type I, a2 — Interleukin 1, b Adenosine monophosphate deaminase 1 Collagen, type VI, a3 Solute carrier family 7, member 5 Transmembrane protein 72 Melanoma cell adhesion molecule Hypothetical protein FLJ21511

Proteolysis, metabolic process Cell adhesion, anatomical structure morphogenesis Ion transport Cell adhesion Skeletal development, phosphate transport — Angiogenesis, fever, apoptosis, inflammatory response Nucleotide metabolic process Phosphate transport, cell adhesion, muscle development Amino acid metabolic process, transport — Cell adhesion, anatomical structure morphogenesis —

166

167