Gén-polimorfizmusok szerepe és jelentősége az atherosclerosis kialakulásában. Doktori értekezés. Dr. Szabó Gábor Viktor

Gén-polimorfizmusok szerepe és jelentősége az atherosclerosis kialakulásában Doktori értekezés Dr. Szabó Gábor Viktor

Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola

Témavezető:

Dr. Acsády György D.Sc. egyetemi tanár

Szigorlati Bizottság elnöke: Dr. Ondrejka Pál Ph.D. egyetemi tanár Szigorlati Bizottság tagjai:

Dr. Jámbor Gyula Ph.D. főorvos Dr. Járai Zoltán Ph.D. egyetemi docens

Hivatalos bírálók:

Dr. Gyurkovics Endre Ph.D. főorvos Dr. Karabélyos Csaba Ph.D. egyetemi vendégoktató

Budapest, 2011

Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék

02

Rövidítések jegyzéke

04

1.

Bevezetés

06

1.1.

Elméleti áttekintés

07

1.2.

Az atherosclerosis jellemzése, klinikuma

09

1.3.

Az atherosclerosis kórélettana

10

1.4.

Az atherosclerosis kialakulásának elméletei

11

1.4.1. Endothelialis dysfunctio

11

1.4.2. Anyagcserezavarok

13

1.4.3. Gyulladásos válasz

15

1.5.

20

A diabetes

1.5.1. A diabetes jellemzése

20

1.5.2. A diabetes érszövődményeinek kialakulása

21

1.5.3. Metabolikus szindróma elmélet

22

1.5.4. Patofiziológiai változások diabetes mellitusban

24

1.5.5. A hyperglycaemia által okozott akut, reverzibilis változások

25

1.5.6. A hyperglycaemia által okozott kumulativ, irreverzibilis változások

27

1.6.

Az artériás érbetegségek klinikuma diabetesben

28

1.6.1. Microvascularis szövődmények

28

1.6.2. Macrovascularis szövődmények

29

Molekuláris vizsgáló módszerek

30

1.7.1. Általános genetikai vizsgáló módszerek

32

1.7.

1.7.2. Molekuláris genetikai vizsgálómódszerek az atherosclerosis diagnosztikájában

34

1.7.3. Az atherosclerosis genetikai háttere

35

1.7.3.1.

Monogénes atherosclerosis

35

1.7.3.2.

Poligénes (multifaktoriális) atherosclerosis

35

1.7.4. Génpolimorfizmus vizsgálatok atherosclerosisos, diabeteses betegeken és állatkísérletekben

37

2

2.

Célkitűzések

41

3.

Módszerek

45

3.1.

Vizsgálati csoportok

46

3.2.

Génpolimorfizmus vizsgálatok

51

3.2.1. Endothelialis nitrogénoxid szintetáz és methylentetrahidrofolátreduktáz vizsgálat

51

3.2.2. Tumornecrosis factor-α vizsgálat

54

4.

Eredmények

4.1.

eNOS Glu298Asp (GT) polimorfizmus vizsgálata atherosclerosisos

4.2. 4.3.

54

diabeteses és atherosclerosisos nem diabeteses betegeken

54

MTHFR C677T polimorfizmus vizsgálata atherosclerosisos diabeteses és atherosclerosisos nem diabeteses betegeken

59

TNF-α vizsgálatok atherosclerosisos diabeteses és atherosclerosisos nem diabeteses betegeken

62

5.

Megbeszélés

64

5.1.

Endothelialis nitrogénoxid szintetáz

64

5.2.

Methylentetrahidrofolátreduktáz

66

5.3.

Tumornecrosis factor-α

68

6.

Következtetések

71

7.

Összefoglalás

74

8.

Irodalomjegyzék

76

9.

Saját publikációk jegyzéke

88

10.

Köszönetnyilvánítás

90

3

Rövidítések jegyzéke

5-LO

5-lipoxigenase

ADH

Alcohol dehydrogenase

AGE

Advanced glycolysation end-product

ARH

Autosomalis recessive hypercholesterinaemia

ASO

Atherosclerosis obliterans

AT-II

Angiotensin-II

BMI

Body mass index

CAD

Coronary artery disease

CETP

Cholesterin ester transfer protein

CRP

C-reactive protein

DSA

Digitalis substractios angiographia

ECs

Endothelial cells

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

eNOS

Endothelial nitric oxide synthase

FRET

Fluorescence energy transfer

GM-CSF

Granulocyta-macrophag colony-stimulating factor

HDL

High density lipoprotein

HLA

Human leukocyta antigene

HSP

Heat-shock-protein

ICAM

Intercellular adhesion molecule

IDDM

Insulin dependent diabetes mellitus

IGT

Increased glucose tolerance

IL-1

Interleukin-1

ISAD

Inflammatory Sclerosing Arterial Disease

ISZB

Ischaemias szívbetegség

LDL

Low density lipoprotein

LPa

Lipoprotein a

LPL

Lipoprotein lipase

LTA

Lymphotoxin-A

4

Rövidítések jegyzéke

MCP-1

Monocyta chemotactic protein-1

M-CSF

Macrophag colony-stimulating factor

MDCs

Metalloproteinase-like-disintegrin-like-cystein-rich-protein

MI, AMI

Myocardialis infarctus

MTHFR

Methylentetrahydrofolate reductase

NIDDM

Non-insulin dependent diabetes mellitus

NO

Nitric oxide

OR

Odds ratio, esélyhányados

PAI-1

Plasminogen activator inhibitor-1

PCR

Polymerase chain reaction

PDGF

Platelet derived growth factor

PKC

Proteinkinase C

PON

Paraoxonase

PPAR-α

Peroxisome proliferator-activated receptor- α

PTA

Percutan transluminalis angioplastica

PTCA

Percutan transluminalis coronaria-angioplastica

SNP

Single nucleotide polymorphism

TG

Triglicerid

TGF-β

Transforming-growth-factor-β

TIA

Transiens ischaemias attack

TLR

Toll like receptor

TNF-α

Tumor-necrosis-factor- α

TXA-2

Thromboxan A-2

VCAM-1

Vascular cell adhesion molecule-1

VEGF

Vascular endothelial growth factor

VLDL

Very low density lipoprotein

5

1. Bevezetés A szervezet a környezetből különböző anyagokat vesz fel és környezetébe különböző anyagokat ad le. Az anyagcsere azoknak a szervezetben lejátszódó folyamatoknak az összessége, melyek keretében az anyagok felvétele, felhasználása és eltávolítása végbemegy. Ennek részei a fehérje-, szénhidrát-, zsír-, ásványianyag- és folyadék-anyagcsere, s e rendszerek kifogástalan működése életfenntartásunk alapeleme. Működészavaruk lehet veleszületett vagy szerzett betegség, ez utóbbi megnyilvánulhat nem sokkal a születést követően, vagy csak később, az évek előrehaladtával. A klinikai tünetek súlyosságát befolyásolhatja, mennyire fontos vagy kevésbé fontos rendszer érintett, domináns vagy recesszív, homo- vagy heterozigóta a változás, adott környezeti tényezők mennyire segítik, vagy nehezítik a kórkép megjelenését. Időben történő felismerése fontos, sok elváltozás korán elkezdett gyógyszeres kezeléssel megelőzhető, a kórkép súlyossága csökkenthető, az életminőség javítható és az élettatartam növelhető. Az

anyagcsere

betegségei

közül

a

diabetes

történetét

kutatták

a

legrészletesebben. Időszámítás előtt a II. században keletkezett Ebers papiruszok már említést tesznek róla, de részletes leírását a görögök adták: a „diabetes” elnevezés Demetrios-tól származik, a megnövekedett vizeletmennyiségre utal. Paracelsus nevezte először anyagcsere-betegségnek. A XVII. században Willis adta hozzá az elnevezéshez a „mellitus” latin szót, mely a vizelet magas cukor tartalmára utal (mézédes). A XIX. században először Langerhans írta le a hasnyálmirigy szigeteit. 1923-ban Banting, Best és MacLoad azonosították az inzulint és az első sikeres kezelés után orvosi Nobel-díjat kaptak. Az érgyógyászat sokáig kimerült a sérült erek lekötésében, az érbetegség fogalma sokáig ismeretlen volt. Az első klinikai tünetcsoport leírója Charcot volt a XIX. század közepén, majd sorra születtek a tudományos munkák, egyre több érbetegség klinikumát ismertették (Raynaud, Winiwarter, Buerger). A belgyógyászati angiologia első hazai művelője Bugár Mészáros Károly volt, a XX. század elején (Acsády és mtsa. 2001). Az érsebészet területén Magyarországon Balassa nevéhez fűződik az első aneurysma műtét a XIX. század közepéről. Az első sikeres érvarrat Carell nevéhez fűződik a XX. század elején, aki ezért utóbb orvosi Nobel-díjat kapott. Az

6

atherosclerosis pontos patomechanizmusa viszont rendkívül összetett és multifaktoriális okai miatt csak napjainkban kezd tisztázódni. Kialakulásának részletes ismerete segíti a betegség eredményes, oki kezelését. Jelen tanulmány célja az anyagcsere betegségek okának vizsgálata, genetikai hátterének felderítése, az okok ismeretében az esetleges populációs szűrés lehetősége és a kezelésben az újabb terápiás célpontok biztosítása.

1.1. Elméleti áttekintés Összefoglalóan lipideknek, lipoidoknak nevezzük az anyagok azon heterogén csoportját, melyekre jellemző, hogy zsíroldó szerekben oldódnak. Ezen vegyületek egyrészt a sejt membránrendszerének alkotói, másrészt a szervezet legfőbb energiaszolgáltatói és raktárai. Egy részüknek vitamin és hormonfunkciója is van. A táplálékkal a szervezetbe jutó zsírok zsírsavvá és glicerinné bomlanak, a vékonybél nyálkahártyáján felszívódva a trigliceridek cholesterinnel és foszfatidokkal együtt, mint chylomicronok kerülnek a nyirokkeringésbe. A zsírtranszport fehérjékhez kapcsolódva történik. Méretük alapján megkülönböztetünk igen kis fajsúlyú lipoproteineket (VLDL), kis fajsúlyú (LDL) és nagy fajsúlyú (HDL) lipoproteineket (Meskó és mtsai., 1999). A chylomicronokat a lipoprotein lipáz bontja, maradékát a máj metabolizálja. Javarészt a májban szintetizálódik a cholesterin is. Utóbbi az epével választódik ki. A magas triglicerid vagy cholesterin szint oka a csökkent elimináció és/vagy fokozott szintézis lehet. A zsírok kóros felszaporodását hyperlipoproteinaemia néven említjük. A szekunder

változatok

más

betegségek

következményei,

míg

primer

esetben

anyagcserezavar áll a háttérben. A kóros felszaporodás következménye a magas vérzsírszint, melyből főleg az LDL emelkedése káros, megbontva a sejtszintű egyensúlyt, s melynek lerakódása kapcsán egyenes út vezet az atherosclerosis kialakulásához. A zsírtartalom növekedés a testsúly növekedésével is jár, és az elhízás az energia felvétel és leadás egyensúlyának felbomlását jelenti, s annak oka a fenti anyagcserezavarokon túl pszichés, idegi, endokrin, genetikai, életmódbeli lehet. Az obesitas fokozott kockázati tényezőt jelent, a letalitás és morbiditás az obes emberek

7

között jóval magasabb, mint az átlag populációban, és szignifikánsan magasabb náluk a cerebrovascularis betegségek aránya is. Szénhidrát anyagcsere zavara esetén, ha az egyensúly úgy bomlik fel, hogy a vércukorszint emelkedik, az inzulinhatás csökken, akkor diabetes mellitusról (DM) beszélünk. Ez leggyakrabban örökletes formában jelenik meg. Oka az inzulin viszonylagos vagy abszolút hiánya, illetve az inzulin hatásának elmaradása vagy csökkenése. Kialakulásban veleszületett vagy szerzett tényezők játszanak szerepet. Szövődménye az érrendszer progresszíven kialakuló betegsége, mint az atherosclerosis és az angiopathia. Utóbbi elsősorban a retina és a vese ereit érinti. Gyakorisága egyre nő, Európában már a lakosság 1,5-2,5 %-át érinti. A kor előrehaladtával egyre sűrűbben fordul elő. A diabetes mellitus Magyarországon 150.000-250.000 embert érint. Vizsgálata, meghatározása a vércukor értékek mérésével történik. Az új módszertani levelek alapján a betegség megléte kimondható >7 mmol/l éhomi vércukor érték esetén. Mivel a kórkép komplex anyagcserezavarként értékelhető, jobb jellemzésére bevezették a metabolikus szindróma fogalmát. Ennek részei a glukózintolerancia vagy inzulinrezisztencia, a hypertonia, a dyslipidaemia és az obesitas. Három különböző DM stádium állapítható meg: Inzulint nem igénylő periódus: diéta vagy tablettás kezelés elegendő Inzulin szükséges a megfelelő anyagcsere-egyensúlyhoz de nem a túléléshez: van még endogén inzulin termelés, de nem elegendő, exogén inzulin bevitel is szükséges (ezen két csoport felel meg a korábbi besorolás szerinti nem inzulin dependens diabetes mellitusnak (NIDDM) Inzulin szükséges az életben maradáshoz: ez felel meg a régebbi besorolás szerinti inzulin dependens diabetes mellitusnak (IDDM) A magas vércukorszint következményeként létrejön az érrendszer betegsége, amelynek súlyossága a betegség tartamától és a vércukorszinttől jelentősen függ. Népbetegség lévén szűrése, korai felismerése, időben elkezdett kezelése alapvető fontosságú. A kezelésben a szupportív és szubsztitúciós kezelés mellett felmerült a betegséget kiváltó okok és genetikai tényezők tisztázása, az esetleges célzott oki terápia kialakításának szükségessége.

8

1.2. Az atherosclerosis jellemzése, klinikuma Az arteriosclerosis (Lobstein, 1833) az artériák falának megvastagodásával járó folyamat, függetlenül attól, hogy az elváltozás milyen patomechanizmus szerint jött létre. Az atherosclerosis (Marchand, 1904) az arteriosclerosis egyik formája, melynek jellemzője a nagy, elasztikus típusú artériák és a közepes elastomuscularis artériák jellegzetes intima-elváltozása. Az atherosclerosis progresszív betegség, melyet az érfalba történő lipid és fibrózus elemek lerakódása jellemez (Sanz et al., 2008). Régóta ismert, hogy az atherosclerosis egyes családokban halmozottan fordul elő, ami arra utal, hogy öröklődő betegségről van szó (Jerrard-Dunne et al., 2003). Az elmúlt évtizedek kutatásai ki is mutattak olyan genetikai mutációkat, amelyek következtében súlyos atherosclerosis alakul ki. A vizsgálatok során azonban az is kiderült, hogy ezek a mutációk csak az esetek töredékét képesek magyarázni és a betegek túlnyomó részében az atherosclerosis kialakulása mögött jóval összetettebb folyamatok állnak. A néhány monogénes módon öröklődő típusától eltekintve az atherosclerosis multifaktoriális betegség. A multifaktoriális betegségekre az jellemző, hogy kialakulásukban mind genetikai, mind környezeti tényezők szerepet játszhatnak (Boerwinkle et al., 1996). Általában azt lehet mondani, hogy genetikailag hajlamos emberekben megfelelő környezeti faktorok hatására alakul ki a betegség. Ma már tudjuk, hogy a gyakori betegségek túlnyomó része (valószínűleg az összes) multifaktoriális, de az atherosclerosis összetettségében, a betegségre hajlamosító gének, környezeti faktorok számában kiemelkedik közülük. A helyzetet az is bonyolítja, hogy több olyan betegség is hajlamosít atherosclerosis kialakulására, amelyek maguk is bonyolult multifaktoriális betegségek. Így például a szintén genetikai hátterű magas vérnyomás, az obesitas, vagy a diabetes mellitus betegségek egyik gyakori szövődménye az atherosclerosis. Kialakulása több szakaszos: (a) a korai laesiokban a subendothelialis régióban cholesterin akkumulálódik, részben makrofágokban - ezek mint habos sejtek (ún. fatty streak) jelennek meg, (b) később plakk-képződés indul meg, eleinte mint fibrosus sapka, majd (c) a komplikált laesio szakaszában atheromatosus fekélyek, ereket elzáró plakkok alakulnak ki (Szollár, 2005).

9

1.3. Az atherosclerosis kórélettana Az atheroscleroticus betegségek túlnyomó része multifaktoriális, így ezek gazdasági, népegészségügyi jelentősége meghaladja a ritka monogénes kórképekét. Egyes becslések szerint az atherosclerosis kialakulásában legalább 400 kockázati tényező szerepel, újabb becslések alapján a patomechanizmusában szereplő gének, genetikai variációk száma elérheti az 1000-et is. Az atherosclerosis kialakulását sematikus módon az 1-es kép szemlélteti. A betegség kialakulását hajlamosító tényezők befolyásolják. Ezeket két csoportra oszthatjuk: befolyásolható és nem befolyásolható tényezőkre (Genest et Cohn., 1995, Lusis, 2000). Az előbbi csoportba tartozik a hypercholesterinaemia,

hypertonia,

hypertrigliceridaemia,

elhízás,

dohányzás,

másodlagos

hyperuricaemia,

diabetes

fogamzásgátlók

mellitus, szedése,

mozgásszegény életmód (Kannel et al., 1987). A nem befolyásolható tényezők közt említhetjük az életkort (férfiaknál 45, nőknél 55 év felett), a nemet (férfiak háromszoros kockázattal), a családi halmozódást, a veleszületett anyagcsere- zavarokat (kóros homocystein anyagcsere), gyulladásos folyamatokat, oxidativ stresszt, glycatios termékek felszaporodását (Meskó és Szollár 1999, Stenvinkel, 2001).

Normal

Fatty Streak k

Fibrózus plakk

Szűkületet okozó p la k k

Plakk ruptura/ fissura thrombosis

Instabil angina pectoris Myocardialis infarctus

Hirtelen szívhalál l Stroke

Klinikailag csendes szakasz

Terhelésre fellépő angina, claudicatio

Kritikus alsó végtagi ischaemia

Életkor előrehaladása

1. kép: Az atheroscleroticus plakk kialakulásának sémás mechanizmusa és következményei

10

A korábbi atherosclerosis kialakulási elméletek mára jelentősen változtak (Mullenix et al., 2005). Mai szemlélet szerint az endothel működési vagy strukturális hibája kapcsán kialakuló érfali sérülésre, metabolikus zavarra történő válasz egy gyulladásos mechanizmust indít el, sejtszintű és molekuláris válaszreakciókkal (Ross, 1999). Ha ez az idült gyulladás nem csökken vagy súlyosbodik, összetett, maradandó és nem visszafordítható változásokat eredményez. Az elmúlt évtizedben derült ki, hogy az atherosclerosis egyik legfontosabb tényezője a gyulladás. Míg korábban a legtöbb klinikus úgy tekintette az atheromát, mint egy egyszerű laesiot, az újabb eredmények azt mutatják, hogy az atherogenesis folyamatához nagymértékben hozzájárul a lokális gyulladás és az immunválasz aktív folyamata. A gyulladás központi szerepét a betegségben számos állatmodell, a klinikai kép és a laboratóriumi eredmények bizonyítják. Így például az általános gyulladást jelző szérum CRP enyhén emelkedett szintje (Lombardo et al., 2004), kiegészítve a LDLC/HDL-C hányados magas értékével jelenti a legnagyobb rizikófaktort CAD és MI kialakulására (Lusis, 2000). Specifikusabb és érzékenyebb marker lehet a High-Sensity C-Reactive Protein, mely már diagnosztikus értékkel is bír stroke és infarctus esetén (Ridker, 2001). Főleg az elmúlt 5 évben igen sok olyan, a gyulladásos folyamatokban szereplő gént írtak le, amely szerepet játszhat az atherosclerosisban. 1.4. Az atherosclerosis kialakulásának elméletei

1.4.1. Endothelialis dysfunctio Az endothelium károsodása lehet mechanikai eredetű. Ismert, hogy az érszűkület kialakulásának vannak az érpályán belül predilectios helyei, ezek az oszlások és az ívek. Itt vélhetően a nagyobb nyíróerő („shear stress”), az áramlási viszonyok változása okozza az endothel sejt (ECs) sérülését (Libby, 2002, Cattaruzza et al., 2004). Ezeken a helyeken speciális molekulák képződnek az endotheliumon, amelyek a monocyták és Tsejtek migrációjáért és kumulálódásáért felelősek. Ilyen molekulák a szelektinek, számos intercellularis és vascularis típusú adhéziós molekula, amelyek receptorként szolgálnak a monocyták és T-sejtek integrinjei és glycokonjugátjai számára (Shibuya, 2006). A monocyták és T-lymphocyták transvascularis migrációját szabályozó

11

molekulák (pl. a thrombocyta-endothel adhéziós molekula), összehangoltan működnek kemotaktikus anyagokkal, amelyeket az endothel, a simaizom és a monocyták termelnek, és amelyek mintegy "behívják" a monocytákat és a T-sejteket az artériába (Murtagh et al., 2004). A károsodás további okai közt említhetjük a dohányzásból származó szabadgyökök romboló hatását, genetikai eltéréseket, emelkedett plazma homocystein szintet, Herpes vírus vagy Chlamydia fertőzést (Stenvinkel, 2001). A hypertonia egyértelmű, régóta igazolt kockázati faktor. A hypertensios betegnek gyakran magas a plazma angiotenzin II (AT-II) szintje, amely a reninangiotenzin rendszer legfontosabb terméke: egy potens vasoconstrictor ágens. Az AT-II hozzájárul az atherosclerosishoz azáltal is, hogy elősegíti a simaizom növekedését. Az AT-II specifikus receptorokon kötődik a simaizom felszínén, majd aktiválja a foszfolipáz C-t, ami az intracellularis Ca++-koncentráció emelésével kontrakciót eredményez.

Ezen

túlmenően

növeli

egyes

proteinek

szintézisét,

simaizom

hypertrophiát idézve elő. Az angiotenzin II növeli a simaizom lipoxigenáz aktivitását is, ami gyulladásnövelő hatású és elősegíti az LDL oxidációját (Lusis, 2000). A hypertensionak önmagában is vannak gyulladásfokozó hatásai: serkenti a hidrogén peroxid, a szuperoxid anion és a hydroxyl-gyök képződését a plazmában. Ezek az anyagok redukálják a nitrogén-monoxid (NO) képződését az endothelben, növelve így a leukocyták kötődését, és ezzel a perifériás ellenállást (Davignon et Ganz., 2004). Látható, hogy a hypertensio és a hypercholesterinaemia hatásait egyaránt szabadgyökök mediálják. Szoros összefüggést találtak a magas CRP szint és az endothelialis dysfunctio közt is (Blanke et Ridker, 2001, Ablij et Meinders, 2002) és ugyancsak több tanulmány szól a tumor necrosis factor (TNF)-α kulcs-mediátor szerepéről az endothel működési zavarai kiváltásában (Ridker et al., 2000, Stenvinkel, 2001). A fent leírt artéria fal laesio mint kezdőpont szerepel, elindul az artéria fal szerkezetének átalakulása, u.n. „remodelling” (Geisler et al., 2004). Ez a megváltozott szerkezetű érfal beindítja a szervezet védekező mechanizmusát, azaz anyagcsere folyamatok, gyulladásos válasz és immunreakciók indulnak (Medzhitov, 2008). Ha a szervezetnek sikerül visszaállítani az eredeti állapotot, az érfal gyógyul, ha nem, elkezdődik az atherosclerosis nemgyógyítható folyamata.

12

1.4.2. Anyagcserezavarok Az atherosclerosis folyamatában ismert a kóros lipoprotein anyagcsere patogenetikai szerepe, amelyben három fő folyamat játszik szerepet (Meskó és mtsai, 1999, Szollár, 2005): - Plazmalipidek, illetve lipoproteinek fokozott beáramlása a vérből az érfalba, - Fokozott lipid (cholesterin) felszaporodás az érfal sejtjeiben, illetve a sejtközötti állományban, - Lipidek csökkent kiáramlása (transzportja) az érfalból. Az adott sejt cholesterin-, illetve cholesterin-észter tartalma a felvétel-leadás egyensúlyának függvénye. A sejt általában az LDL receptoron át veszi fel a cholesterint, ilyenkor a saját cholesterin szintézise gátlás alá kerül, egyidejűleg csökken az LDL receptor szintézise is. A szokásos receptor mellett létezik egy ún. scavanger („utcaseprő”) receptoron át történő felvétel is, melyre jellemző, hogy az így bekerülő cholesterin sem az endogén cholesterin szintézist, sem a receptor expressziót nem gátolja, így a többlet cholesterin – ha egyidejűleg elégtelen a cholesterin-elszállítás – a sejtben észtereződik és tárolódik. Ez az egyik fő oka a habossejt-képződésnek („foam cell”) (Libby, 2002). A szokványos LDL receptorról a scavanger receptor felé történő eltolódás oka a magas LDL vérszint és a nagyobb mértékben keletkező kóros, atherogen lipoproteinek jelenléte (pl. béta VLDL). A HDL cholesterin vérszintje fordítottan arányos a kockázattal, ennek angioprotektív szerepe a reverz cholesterin-transzporttal magyarázható (Lusis 2000, Ma K. et al., 2003, Szollár, 2005). A HDL a lipoprotein oxidációt szintén gátolja (Paoletti et al. 2004). Ezzel szemben az LDL az egyik leginkább atherogen részecske, - főleg az oxidált LDL -, mellette a lipoprotein a (LPa) és a chylomicron remnantok szerepe emelhető ki. Eredetüket tekintve megkülönböztetünk primer hyperlipoproteinaemiakat (familiaris) és kevert típusú hyperlipoproteinaemiakat. Újabban ezeket metabolicus (X) szindróma néven foglalják össze, melynek összetevői az inzulin rezisztencia, hyperinsulinaemia, hypertrigliceridaemia, „small LDL” (alacsony HDL szint), android obesitas, hypertonia, IGT, hyperuricaemia.

13

Ha az LDL-partikulák csapdába esnek, lerakódnak a subendothelialis mátrixban, rohamos oxidálódásuk indul meg, majd makrofágok kebelezik be őket scavanger receptoraik (pl. CD-36, SR-A) segítségével. Az oxidált LDL az egyik legerősebb trigger a további folyamatokhoz (Libby et al., 2002, Maxfield et Tabas, 2005). Az LDL bekebelezése lipid peroxidok képződéséhez vezet, és elősegíti a cholesterin észterek raktározását, habos sejteket (foam cells) alakítva ki. Az, hogy az LDL-ek közül mennyi és melyek módosultak, nagyon változó lehet. Ha egyszer már módosultak, és felveszik őket a makrofágok, akkor aktiválják a habos sejteket. A gyulladásos válaszban a makrofágok elsődleges szerepe a módosult LDL eltávolítása, ezáltal megkímélve az endotheliumot és a simaizmot a károsodástól. Ez normális védekező folyamat, azaz a szervezet megpróbál megszabadulni a kóros ágenstől. Az antioxidánsok, mint pl. az E vitamin, eliminálhatják a szabadgyököket, meggátolva az LDL gyökökkel képzett formációinak létrejöttét. A sérülésen túl, a módosult LDL kemotaktikus hatással van más monocytákra, továbbá serkenti a makrofág-stimuláló faktort expresszáló gént, illetve a monocyta-kemotaktikus protein felszabadulását, így kiterjesztheti a gyulladásos választ, stimulálva a monocyta-eredetű makrofágok szaporodását, és az újabb monocyták behatolását az érfalba. Magának a gyulladásos válasznak jelentős hatása lehet a lipoproteinek artériafalon belüli mozgására. A gyulladásos mediátorok, mint a TNF-α vagy a makrofág kolóniastimuláló faktor serkentik az LDL endotheliumhoz és simaizomhoz való kötődését, valamint az LDL-receptor génjének transzkripcióját. In vitro, a scavanger-receptorokhoz történt kötődése után az LDL egy sor intracellularis eseményt indít el, úgy, mint az urokináz és egyes gyulladásos enzimek, mint pl. az IL-1, indukcióját (Willerson et Ridker, 2004). Ezen lipidek jelenléte révén a gyulladás és a lipoproteinek további modifikációja megmarad, fenntartva az állandó gyulladást az artériában. Az oxidált LDL jelen van a humán atheroscleroticus elváltozásokban (Ross, 1999). Hypercholestherinaemiával élő állatokban az antioxidánsok csökkenteni tudják a károsodások nagyságát, emlősökben pedig redukálják a "fatty streak" számát, kiterjedését. Az utóbbi idők kutatásai igazolják az antioxidánsok gyulladáscsökkentő hatását, vélhetően a monocyták adhéziós molekulái up-regulációjának megelőzésével. „Ex vivo”, a plazma E vitamin koncentrációjával arányosan, az antioxidánsok növelik a

14

humán LDL oxidációval szembeni rezisztenciáját. Az E vitamin bevitel fordított arányt mutat a myocardialis infarctus incidenciájával, továbbá az E vitamin adagolása klinikai előkísérletekben - csökkentette a heveny coronaria események előfordulását. Másfelől, egyéb antioxidánsoknak, pl. béta-karotinnak, semmilyen hatása nincsen ezen folyamatokra. A magas plazma homocystein szintet kezdettől összefüggésbe hozták az atherosclerosissal (Selhub et al., 1995, Mazza et al., 2000). A homocystein metabolizmusát

végző

methylentetrahydrofolat

enzimeket

(mint

reduktáz) kódoló

pl.

a

vagy a

cystation-β-reduktáz,

génre nézve

homozigóta

elhunytak

boncolásakor kifejezett atherosclerosis igazolódott (Ross, 1999). Ezekben a betegekben már sokszor gyermekkorban manifesztálódik az érelmeszesedés, és gyakran 20 éves koruk körül kapják az első infarctust. A homocystein önmaga toxikus az endothelre nézve és prothromboticus hatású is, valamint növeli a kollagén szintézisét és gátolja az angioprotektív NO hatását. A fólsavval való kezelés normalizálhatja a szérum homocystein szintet és folyamatban vannak vizsgálatok annak kiderítésére, hogy a megfelelő fólsav szint megóv-e az atherosclerosistól, vagy legalább elindítja-e annak visszafejlődését. 1.4.3. Gyulladásos válasz Az endothelialis sérülés, dysfunctio kapcsán jelentkező válasz (response-toinjury) maga a gyulladásos reakció (Ross, 1999). Az endothelialis sejtek elkezdik termelni felületaktív adhéziós molekuláikat, hogy megkössék a különböző leukocytákat (Libby, 2002). Így a vascular cell adhesion molekula (VCAM-1) hatására a monocyták és T-lymphocyták megkötődnek. Az ér-simaizomsejtek (arterial smooth muscle cells, SMCs) proteoglycanokat termelnek, melyek kötik és raktározzák a lipoprotein partikulumokat. Szelektinek hatására a „rolling” effektus után a megtapadó leukocyta migrációval be is jut az intimába (Lusis, 2000). Az endothel sejtekből és a macrofágokból VEGF expresszálódik, mely segíti a macrofágok működését, fokozza a gyulladásos mechanizmust, tyrosine kinase aktivitásán keresztül az atherosclerosis progresszióját, valamint a tumor-regulációt (Shibuya, 2006, Kéri és mtsai, 2006, Hegymegi-Barakonyi és mtsai, 2009). A kemokinek hatására bejutó makrofágok

15

kumulálódnak, kialakul a lipoprotein egységeket is magába záró zsíros plakk (fatty streak). A monocyták és T-sejtek felszíni receptorait átalakítják, mucin-szerű szelektin kötő régiók aktiválódnak, így próbálják a gyulladásos folyamatot csak a sérülés területére lokalizálni. A változások a permeabilitást fokozzák, így egyre több lipoprotein és más plazma összetevő jut be az érfalba. Mindez az LDL oxigenizációjához vezet, mely ismételten makrofág stimuláló hatással rendelkezik. Megindul a simaizom sejt vándorlás, a simaizomsejtek a növekvő PDGF szint hatására proliferálnak és módosulnak, fibroblaszt-szerűvé válnak, nagy mennyiségű kötőszöveti állományt termelnek, maguk is scavanger receptort expresszálnak a felszínükön: a fibrózus plakk képződés fokozódik (Raines, 2004). A folyamat sematikus ábrája a 2. képen látható.

2. kép: Az endothel sérülés és külső károsító hatások következménye az érfalban citokin aktiváció és az immunválasz mechanizmusa (DeGraba TJ. Stroke 2004; 35, 2713)

A simaizomsejtek proliferációjában szerepet játszhat egy szignáltranszdukciós út is, melynél a sérülés helyén felszabaduló katecholaminok indukálják az EGFR

16

termelést.

Az α1-adenoreceptor által medialt EGFR transzaktiváció hatására

adventiciális fibroblast és simaizom proliferáció kezdődik, elindul az artéria fal remodellingje (Zhang et al., 2004, Hegymegi-Barakonyi és mtsai, 2009). Egy nemrégiben felfedezett molekula-osztály, a disintegrinek vagy, ahogy még nevezik őket, mátrix-metalloproteináz-szerű disintegrin-szerű, cystein-gazdag proteinek (MDCs) jelenlétét detektálták az endothelben, simaizomban, makrofágokban (Ross, 1999).

Ezek

a

transzmembrán

fehérjék,

amelyek

úgy

tűnik,

a

sejt-sejt

kölcsönhatásokban működnek közre (Shah, 1998), az extracellularis szakaszukon tartalmaznak egy metalloproteináz szekvenciát, amely képessé teszi őket arra, hogy olyan molekulákat aktiváljanak, mint a TNF-α (Geisler et al., 2004). Ezek a molekulák nem lelhetők fel a normál artériákban, de egyikük, a MDC15, jelen van az atheroscleroticus elváltozásokban. Segítségével egyes adhéziós molekulák, mint az Lszelektin, leválaszthatóak a leukocyták felszínéről, ami felveti annak lehetőségét, hogy idült gyulladás eseteiben mérhető legyen a „lehullott” adhéziós proteinek, mint állandósult immunválasz markerek plazmaszintje. A disintegrinek ebben a leválasztási procedúrában vesznek részt. Ha bekövetkezik a molekulák leválása, ez a különféle gyulladásos válaszokban detektálható. A lehullott proteinek emelkedett plazmatitere utalhat fokozott kockázatra, kialakult atherosclerosisra, vagy egyéb gyulladásra. A monocyták szerepe az atherosclerosis minden fázisában tetten érhető. A monocyta-eredetű makrofágok sejteket eliminálnak és antigéneket prezentálnak, valamint hidrolitikus enzimeket, metalloproteinázokat, citokineket, kemokineket, növekedési faktorokat szecernálnak. A makrofágok atheroscleroticus laesiokba történő ki-be vándorlásához elengedhetetlen szerepe van a M-CSF-nek (macrophag colonystimulating factor), a GM-CSF-nek (granulocyta-macrophag colony-stimulating factor), a lymphocyták mozgásához pedig IL-2 (interleukin-2) kell (Libby, 2002). A M-CSF folyamatos jelenléte képessé teszi a makrofágokat, hogy az elváltozásban maradjanak, és ott szaporodjanak. Ellentétes folyamatként a gyulladásos citokinek, mint az interferon-γ, bizonyos körülmények közt a makrofágok apoptosisát indítják el. Amikor ez in vivo következik be, a makrofág az előrehaladott plakk nekrotikus magjának lesz a része. Kezdetben úgy vélték, hogy a plakk növekedésekor csak a simaizom elemek proliferálnak, pedig a monocyta-eredetű makrofágok és a T-sejtek szaporodása legalább

17

ilyen fontos. A makrofágok azon képessége, hogy citokineket (TNF-α, IL-1, TGF-β), proteolyticus enzimeket (metalloproteinázok), növekedési faktorokat (PD-GF, insulinlike growth factor) szintetizálnak, kritikus lehet a sejtek építő vagy romboló szerepét illetően, amelyet ezek a plakk öregedése során betöltenek (Libby, 2002). A TNF-α a gyulladásos válasz egyik legfontosabb mediátora (Stenvinkel, 2001, Libby et al., 2002, Monraats et al., 2004). Az

aktivált

makrofágok

II.

típusú

hisztokompatibilitási

antigéneket

expresszálnak, mint pl. a HLA-DR, ami lehetővé teszi számukra, hogy antigéneket prezentáljanak lymphocytáknak. Így nem meglepő, hogy a cellularis immunválasznak köze lehet az atherosclerosishoz, márcsak azért is, mert mind a CD4+, mind a CD8+ sejtek megtalálhatóak a plakkban (Lusis, 2000, Zhou et al., 2005). A T-sejtek akkor aktiválódnak, amikor a makrofág által kötött és prezentált antigénnel kötődnek. A Tsejtek aktivációja citokinek szekrécióját eredményezi, (IF-γ és a TNF-α), amelyek felerősítik a gyulladásos választ. A laesiokban lévő simaizom sejteknek szintén vannak felszíni II. típusú HLA molekuláik és szintén képesek antigén prezentációra. Az egyik lehetséges és kiemelt szerepű antigén az oxidált LDL, amit a makrofágok termelhetnek. A hőshock-protein (HSP) 60 szintén közrejátszhat az autoimmunitásban (Mullenix et al., 2005). Ez és más hőshock-fehérjék számos feladatot látnak el a fehérjék összeépítése, sejten belüli transzportja és denaturálódástól való védelme tekintetében. Ennek a fehérjének a szintje emelkedett lehet az endothelben és szerepe lehet az immunválaszban. A fenti folyamatok mellett a fibrosus laesio progresszióját más tényezők is erősítik, így hormonális hatások, hypertonia, a homocystein emelkedett szintje (Lusis, 2000). Utóbbi szerepe fontos, mivel erősen károsítja az endothel sejtet és stimulálja a simaizom sejt proliferációt. A plakk progressziója következtében a fibrosus sapka növekszik, szűkíti a lument, felszínén megnő az enzimaktivitás, így a PDGF (Giese et al., 1999, Jaeger et al. 2003) TGF-β, TNF-α, IL-1, valamint az IL-6 (Chapman et al., 2003) aktivitása, melynek következtében fokozódik a vérlemezkék adhéziója, a thrombus kialakulása. Az aktiválódott thrombocytákban szabad arachidonsav képződik, ami thromboxan A2-vé (Khan et Metha, 2005), a ma ismert legerősebb vasoconstrictorrá és thrombocyta-aggregátorrá, vagy leukotriénekké transzformálódhat, amelyek viszont a gyulladásos választ erősítik (Steinbuhl et Moliterno, 2005).

18

A növekvő plakk belsejében erősödnek az apoptoticus folyamatok, a plakk instabil lesz (Berliner et al., 1995). Hirtelen klinikai tünetek kialakulásához vezet a plakk-ruptura, az alávérzés vagy a plakk-thrombosis, amely az ér lumenét akutan occludálja (Corti et al., 2003). Ez legtöbbször az elváltozás vállánál következik be, ahol a makrofágok ki-be mozognak, kumulálódnak és aktiválódnak (Libby, 1995). A fibrosus sapka degradálódását metalloproteinázok okozzák, pl. a kollagenáz, az elasztáz és a stromalysinek. Az aktivált T-sejtek metalloproteinázok kiválasztására serkentik a makrofágokat a laesioban, ami a plakk instabilitását és az immunválasz elmélyülését eredményezi. Ezeket a változásokat végig kísérheti a szöveti faktor és más prokoagulánsok produkciója, ami szintén a thrombosis irányába visz (Libby, 2002). A folyamatot a 3. kép mutatja be.

3. kép: Atheromatosus plakk kialakulásának sémás vázlata. (Libby P.: Inflammation in Atherosclerosis. Nature 2002; 20, 868-874) Szerencsésebb esetben, ha kicsi marad a lipid „pool”, és a fibrosus sapka vastagodik, a lumen nem szűkül jelentősen, majd a ruptura lehetősége is fokozatosan csökken. Az idő előrehaladtával a gyógyulási folyamat dominál, a fibroticus plakk hegesedik, vaskos,

19

fibrosus intima alakul ki, stabil plakk alakul ki. Az érlumen ugyan jelentősen szűkül, de ez lassan következik be, és az akut elzáródás esélye minimális maradhat (Libby et al., 2002).

1.5. Diabetes 1.5.1. A diabetes jellemzése A diabetes mellitus (cukorbetegség,) olyan anyagcsere-betegség, amelynek központjában a szénhidrát-anyagcsere zavara áll, de a kórfolyamat következményesen érinti a zsír- és a fehérje-anyagcserét is, a só-víz és a sav-bázis háztartás zavarával. A cukorbetegség alapvető oka az inzulin viszonylagos vagy teljes hiánya, illetve az inzulinhatás elmaradása. Bizonyos körülmények között mindkét eltérés együttesen fordulhat elő. A cukorbaj okozta patofiziológiai eltérések számos szerv működését károsíthatják. A cukorbetegségnek ismert heveny és idült (micro- és macroangiopathiás) szövődményei vannak. Vezető tünetek a hyperglycaemia, glucosuria, polydypsia, polyuria, ketosis, acidosis, fokozott fehérje- és zsírbontás, hyperlipaemia, magas zsírsavszint a vérben, negativ N-egyensúly, só-és vízvesztés, végül eszméletvesztés (Szollár, 2005). A diabetes és szövődményeinek kezelése nagy terhet jelent a betegnek és a társadalomnak egyaránt (Stratmann et al., 2009). 1-es

típusú

diabetes

esetén

a

béta-sejtek

autoimmun

folyamat

következményeként károsodnak és ez olyan diabetes mellitus kialakulását eredményezi, ahol az érintett egyén életben maradásához inzulin adása szükséges. Inzulin nélkül ketoacidoticus kóma, végül halál következik be. A kórkép általában klasszikus klinikai tünetekkel, zömében 35 év előtt manifesztálódik (korábbi nomenklatura: IDDM), de az életkor alapján önmagában nem lehet a diabetes típusát megállapítani. Az 1-es típusú diabetest a korai stádiumban az autoimmun folyamat fennállását jelző autoantitestek (szigetsejt-

anti-GAD-,

tirozinfoszfatáz-,

vagy

inzulin-ellenes

antitestek)

kimutathatósága jellemzi. 2-es típusú diabetest az inzulinelválasztás és az inzulinhatás károsodása jellemzi, ezek közül valamelyik kórtani folyamat az adott esetben meghatározó lehet. Típusos

20

esetben klasszikus tünetek nélkül, elhízáshoz társulóan, 35 év felett jelenik meg (korábbi nomenclatura: NIDDM). További típusok a gesztációs diabetes, az inzulinhatás genetikai zavarai, a pancreas

exocrin

állományának

megbetegedéseihez

társuló

formák,

endocrinopathiákhoz csatlakozó, gyógyszerek és kémiai anyagok által kiváltott, infekciókhoz társuló formák, illetve az immungenezisű diabetes szokatlan formái, és más, esetenként diabetesszel társuló genetikai szindrómák. 1.5.2. A diabetes érszövődményeinek kialakulása A

cukorbetegség

idült

szövődményeit

jól

ismert

módon

micro-

és

macroangiopathiás szövődményekre osztjuk. Míg a microangiopathiás szövődményeket diabetes-specifikus

eltérésként

tartjuk

számon,

addig

a

macroangiopathiás

szövődmények lényegében atherosclerosist jelentenek, melynek patomorfológiai értelemben véve diabeteses jellegzetessége nincs. Ugyanakkor a klinikumban mégis azonosíthatók bizonyos különbségek az egészséges anyagcseréjű egyénekben észlelhető és a diabetesben kialakuló atherosclerosis között. Macroangiopathiás szövődmények kialakulhatnak 1-es és 2-es típusú diabetesben egyaránt. Az 1-es típusú diabetesben idült szövődmények (köztük a macroangiopathiás eltérések) jelenlétével csak hosszabb betegségtartam után, rossz anyagcsere-helyzet esetén kell számolni. Az endothel sejteknek meghatározó szerepük van az érfal adaptációs folyamataiban (remodelling). A diabetes

kis-

és

nagyér-szövődményeinek

patomechanizmusában

a

kóros

endothelműködés a közös kiindulási alap, melyben kulcsfontosságú szerepet tulajdonítunk az endothelialis nitrogén-monoxid-szintáz (eNOS) csökkent aktivitásának, ezáltal a gátolt nitrogén-monoxid kínálatnak (Nieszner és mtsai, 2005). Mindezek kórosan befolyásolják a microvascularis szabályozáson túl az akcelerált, diffúz atherogenesis folyamatát. Az emelkedett vércukorszint részben akut és reverzíbilis, részben kumulatív és irreverzibilis változásokat hoz létre a sejtek anyagcserefolyamataiban. Az akut és reverzibilis hatások között kiemelkedő jelentősége van az aktívan működő poliol anyagcsereútnak, a proteinkináz C megváltozott aktivitásának, az oxidatív stressznek és a korai glikációs termékek megjelenésének. A hyperglycaemia által okozott legfontosabb kumulatív és irreverzíbilis hatás a késői glikációs

21

végtermékek kialakulása és felhalmozódása. E végtermékek megváltoztatják a bazális membrán és az extracellularis mátrix szerkezetét, hozzájárulnak az érfalban észlelhető kóros endothel- és simaizom-működéshez, valamint fokozzák a thrombusképződést. Úgy tűnik, hogy mind az akut, mind a kumulatív változások kialakulásában fontos szerepet játszanak a mitogén-aktivált proteinkinázok. Az endotheldysfunctio érzékeny markere a mérhető microalbuminuria (Nieszner és mtsai., 2005). 1.5.3. Metabolikus szindróma elmélet Régóta ismert, hogy a diabetes, a hypertonia, a dyslipidaemia és az elhízás az atherosclerosis kockázati tényezői. Reaven kaliforniai kutató azonban 1988-ban az ismert kockázati tényezők együttes előfordulásának magyarázatául megalkotta a metabolikus X-szindróma koncepcióját (Reaven et al., 1988). Az eredeti elmélet szerint a glukóz-intolerancia, a dyslipidaemia és a hypertonia egymástól nem függetlenül jelenlévő atheroscleroticus kockázati tényezők, hanem azok közös megjelenése hátterében egységes molekulárbiológiai ok: az inzulinrezisztencia és következményes hyperinzulinizmus áll. Később a szindróma jellegzetességei közé a centrális, vagy visceralis típusú elhízás is bekerült (Libby, 2002). Napjainkban a szindróma tagjai közé további tényezőket is besorolandónak vélnek, ez alapján haemostaseológiai eltérések (PAI-1 szintnövekedés), microalbuminuria, hyperhomocysteinaemia, hyperuricaemia, legújabban inflammatorikus tényezők (növekedett CRP-szint) jelenléte is hozzájárulhat a metabolikus szindrómában észlelhető accelerált atherosclerosishoz. A metabolikus szindróma alapvető „jéghegycsúcsait" azonban nem vitatott módon a glukózintolerancia, a hypertonia, az atherogen dyslipidaemia és a centrális típusú elhízás alkotják (Jermendi, 2001). Az új módszertani levél szerint: obesitasról beszélünk, ha a BMI >27, haskörfogat >80cm nőknél, >94cm férfiaknál dyslipidaemia kimondható, ha a triglicerid >1,7 vagy a HDL cholesterin <1,0 vagy az összcholesterin >5,2 mmol/l.

22

vércukor esetében >7,0 mmol/l éhomi érték és a 11,0 mmol/l feletti postprandiális érték tekinthető kórosnak. Bevezették az emelkedett éhomi vércukor (IFG, impaired fasting glucose) fogalmát, ez 6,1-6,9 mmol/l éhomi vércukor értékek esetén mondható ki. csökkent glukóz toleranciáról (IGT) „oralis glucose-tolerancia-test” után mért 7,8-11,1 mmol/l értékek esetén beszélünk. hypertonia a 130/85 Hgmm érték felett mondható ki (Pados, 2002). A

metabolikus

szindróma

magyarázatakor

egyesek

nem

az

inzulinnak

(hyperinsulinismusnak), hanem a proinzulin-szintnek tulajdonítanak jelentőséget. Napjainkban a metabolikus szindróma kórfejlődésében egyre nagyobb szerepet tulajdonítanak a citokineknek, ebben a vonatkozásban elsősorban a tumornecrosis factor-α (TNF-α) szerepe került előtérbe (Nieszner és mtsai, 2005). Egyre több adat szól amellett, hogy a gesztációs diabetes és a metabolikus szindróma egymással összefüggenek. A legújabb klinikai észlelések az inflammatorikus tényezők (CRP-szint növekedés) jelentőségét vetik fel a kórfejlődésben (Libby et al., 2002). Újabban az obesitast magában is kritikus kockázati tényezőnek tartják, mivel kimutatták, hogy a zsírszövet fokozottan termel TNF-α-t, mely részben közvetlenül az érfalon hat, részben beavatkozik az inzulin anyagcsere folyamatokba (Dalziel et al., 2002, Libby et al., 2002, Hotamisligil, 2006). Érdekes, hogy egyesek a microalbuminuriát is felveszik a szindróma jellegzetességei közé. Ennek feltehetően az a magyarázata, hogy diabetesben a microalbuminuria nemcsak a veseérintettség korai stádiumát jelenti, hanem azt az általános vascularis károsodás markereként és az infarctus korai jelzőjeként is számon tartják (Nieszner és mtsai., 2005). A hyperinzulinizmus és az atherosclerosis oki összefüggését sokat citált experimentális munkák eredményei alapozták meg. Kétségtelen továbbá, hogy több prospektív klinikai megfigyelés is igazolta a hyperinzulinizmus

és

a később bekövetkező

coronaria-események statisztikai

összefüggését. Napjainkban a hyperinzulinizmus kóroki szerepét a postprandialis hyperglycaemia szerepének felértékelődése kezdi háttérbe szorítani. Jelentős ezen a téren a DECODE-tanulmány, amely a diabetes új klasszifikációjának és diagnosztikai kritériumainak értékelése kapcsán rávilágított arra, hogy a terhelés utáni vércukor prediktív értéke kifejezettebb, mint az éhomié (Jermendi, 2001). Fontos körülmény ezzel összefüggésben, hogy nemcsak a manifeszt 2-es típusú diabetes, hanem a

23

csökkent glukóztolerancia stádiuma is a cardiovascularis megbetegedések fokozott kockázatával jár együtt. Bár az elméleti kérdések még nem kerültek nyugvópontra, a gyakorló orvos számára a tennivalók egyértelműek: fel kell ismerni (olykor szűrővizsgálattal) a metabolikus szindróma jellegzetességeit hordozó egyéneket, s őket a holisztikus kezelési elvek szerint kezelésbe kell vonni. Ez azt jelenti, hogy nemcsak az egyes, hanem a potenciálisan jelenlévő összes „jéghegycsúcsot” kezelni kell, életmódbeli, étrendi tanácsok adását követően, szükség esetén gyógyszeresen is. 1.5.4. Patofiziológiai változások diabetes mellitusban A cukorbetegség microvascularis szövődményének tekintjük a retino-, nephroés neuropathia diabeticát, bár ez utóbbinak kizárólag, mint érszövődménynek a megítélése nem egyértelmű. A közepes nagyságú és a nagyobb erekben kialakuló kiterjedt

atherosclerosis

felelős

a

cukorbetegekben

gyakrabban

előforduló

macrovascularis eseményekért és a korai cardiovascularis halálozásért. E különböző szervrendszereket érintő szövődmények közös jellemzője az adott szervet ellátó erekben a cukorbetegség korai szakában észlelhető fokozott vasodilatatio, majd a későbbiekben kialakuló progresszív lumenszűkület és a következményes, elégtelen perfúzió. Ezt az angiopathia diabeticának is nevezett érszűkületet a cukorbetegségre jellegzetes funkcionális és strukturális változások hozzák létre. A legjellemzőbb funkcionális változások a következők: Kezdetben a kapillárisok véráramlása növekszik. Romlik az endothel funkció, fokozódik az érpermeabilitás. Később megváltoznak a rheológiai viszonyok, nő a plazmaviszkozitás, csökken a vörösvértest-deformabilitás, fokozódik a vérlemezke-aggregáció. A legfontosabb strukturális elváltozások a következők: Szénhidráttartalmú plazmafehérjék rakódnak le a kis- és nagyerek falában. Az extracellularis mátrix mennyisége megnő, ennek következtében az erek bazális membránja vastagodik, a glomerulusban a mesangialis mátrix felszaporodik, az érfal kollagéntartalma megnövekszik.

24

Endothel-, mesangium- és artériás simaizomsejt-hypertrophia és -hyperplasia észlelhető. Mindezen változások létrejöttében kiemelkedő szerepet játszik az emelkedett vércukorszint. A hyperglycaemia egyrészt akut, reverzibilis módosulásokat okoz a sejtek anyagcsere-folyamataiban, másrészt kumulatív, irreverzibilis hatása van a stabil makromolekulákban. A magas vércukorszint elsősorban azon sejtek, szövetek metabolikus folyamataira van hatással, amelyeknek glükózfelvétele az inzulintól függetlenül történik. A diabetes korai szakában döntően a hyperglycaemia okozta akut és reverzibilis intracellularis változásoknak van szerepük a patofiziológiai eltérések kialakulásában. Hosszabb betegségtartamnál azonban a kumulatív és irreverzibilis hatások kerülnek előtérbe (Hosszúfalusi , 2000). 1.5.5. A hyperglycaemia által okozott akut, reverzibilis változások A poliol anyagcsereút Működése során a glükózból az aldóz-reduktáz enzim segítségével, NADPH felhasználásával szorbitol keletkezik Azokban a szövetekben, amelyekben a glükózfelvétel az inzulintól független, emelkedett vércukorszint esetén a fenti enzimrendszer fokozott aktivitással működik; nemcsak a hyperglycaemia miatti ozmotikus

stressz

következtében,

hanem

a

megnövekedett

intracellularis

szubsztrátkínálat (magas intracellularis glükóztartalom) miatt is. Így igen nagy intracellularis szorbitolkoncentráció alakul ki, amely "túlkompenzálja" a környezet hyperozmolaritását és a sejt ozmotikus károsodását eredményezheti. Proteinkináz C A proteinkináz C (PKC), mint másodlagos jelátvivő jelentősen befolyásolja a sejtek működését: hormonok, növekedési faktorok, neurotranszmitterek és esetleg gyógyszerek hatását közvetíti. Az aktív proteinkináz C hatására nő a vascularis endothelialis növekedési faktor elválasztása (Kimura et al., 2006). Ugyancsak felelőssé tehető a proteinkináz C az érfal kóros prosztanoid- és nitrogén-oxid-elválasztásáért és ennek hemodinamikai következményeiért (Nieszner és mtsai, 2007). Érdekes módon,

25

amíg a hyperglycaemia az érfalban fokozott proteinkináz C-aktivitást eredményez, addig a perifériás idegekben aktivitásának csökkenését észlelték. Ez az eltérés is amellett szól, hogy jelentős különbség van az emelkedett vércukorszint vesére és a szemre, illetve az idegrendszerre gyakorolt toxikus hatása között. Oxidatív stressz A hyperglycaemia miatt fokozott a glükózoxidáció, és a keletkezett reaktív intermedier termékek jelentős szabadgyök-képződéshez vezetnek. A plazma emelkedett lipidperoxidszintje a véráramban és az érfalban zajló oxidatív folyamatokat tükrözi, és az atherosclerosis kialakulásának hírnöke (Yang et Ming, 2006). Korai glikációs termékek A glükóz aránylag gyorsan kötődik nem enzimatikus módon a fehérjékhez, elsősorban a lizin és az arginin aminocsoportjához. A glikáció egyaránt érinti az intracellularis, az interstitialis és a plazmafehérjéket. A diabetesben észlelhető cardiovascularis szövődmények kialakulásában például a glikált low density lipoproteinnek (gLDL) kulcsszerepe lehet. A gLDL kevésbé kötődik a specifikus LDLreceptorhoz, annál inkább a makrofágok scavanger típusú receptorához, és így a cholesterinben gazdag habos sejtek képződéséhez vezet. Szintén kedvezőtlen jelenség, hogy a gLDL lipidösszetétele is megváltozik. Ennek következtében könnyebben oxidálódik és intracellularis felhalmozódása is kifejezettebb. Egyes szerzők szerint a glikált-oxidált LDL jobban károsítja az endothelfunkciót, mint az "egyszerű" oxidált LDL. A gLDL fokozza a makrofágokban a szuperoxid-anionok képződését, elősegíti az endothelsejteken az adhéziós molekulák expresszióját, és csökkenti az endothelsejt nitrogén-oxid-termelését. Mindezek a folyamatok az instabil plakk képződéséhez, az atherosclerosis felgyorsulásához vezetnek (Hosszúfalusi N., 2000).

26

1.5.6. A hyperglycaemia által okozott kumulativ, irreverzibilis változások Késői glikációs végtermékek szerepe Egyes, a hosszú életidejű fehérjéken (például kollagén, stabil makromolekulák) vagy a nukleotidok aminocsoportjain képződött korai glikációs termékek nem bomlanak el, hanem

a

kémiai

átrendeződés

lassan

folytatódik.

Az

Amadori-termékek

összekapcsolódhatnak, oxidatív és nem oxidatív módon, immár irreverzíbilisen átalakulhatnak. Az így létrejövő stabil késői glikációs végtermékek (AGE) igen aktívak, és kovalens keresztkötéseket alakítanak ki egymás között, felszaporodásuk pedig kumulatív jellegű (Libby et al., 2002). A késői glikációs végtermékek patofiziológiai hatásai A káros hatásokban kulcsszerepe van a fehérje- és kollagén-keresztkötések kialakulásának az extracellularis mátrixban. Kimutatták, hogy az LDL háromszorosan nagyobb affinitással kötődik az AGE által módosított kollagénhez, mint a fiziológiás szerkezetűhöz. A kialakult stabil keresztkötések miatt átépül a bazális membrán finom szerkezete, és megváltozik a kollagén szabályos struktúrája. A létrejött stabil szerkezetek a degradációs, "eltakarító" folyamatoknak is jobban ellenállnak. Mivel a bazális membrán elveszti precíz geometriai elrendeződését, a pórusnagyság növekszik, és az eredeti negatív töltés csökken. Ezáltal tovább fokozódik a membrán permeabilitása, újabb plazmafehérjék kerülnek ki az érpályából a "mátrixcsapdába", tovább nő a lumenszűkület. A bazális membránban, illetve a kollagénen kialakult késői glikációs végtermékek hatására csökken a membrán proteoglikán tartalma, ezáltal gyengül a membrán heparinkötő képessége, amely thrombusképződéshez vezethet. A megváltozott mátrixszerkezet következtében kóros mátrix-endothel, mátrix-thrombocyta kapcsolat alakulhat ki (Hosszúfalusi N., 2000). Receptoriális hatás megjelenése Ha a makrofág AGE-receptora az AGE-proteint megköti, ez számos monokin elválasztását

eredményezi,

így

például

tumornecrosis-factor-α,

interleukin-1

szabadulhat fel. Az endothelsejtekben a növekedési faktorok termelése és elválasztása fokozódik, a következményes endothel- és simaizomsejt-proliferáció hivatott az

27

"eltakarító folyamat" által okozott sérülések "gyógyítására". Ugyanakkor ezek a változások a thrombusképződés irányába is hatnak: a TNF-α és az IL-1 hatására az endothelsejtben megindul a szövetifaktor-szerű prokoaguláns és a plazminogén aktivátor-inhibitor termelése (Spronk et al., 2004). Megbomlik a finom fiziológiás egyensúly. Ennek következtében az endothel, a simaizom és a mesangium sejtjeinek kifejezett proliferációja alakul ki, valamint thrombus képződik. Az AGE-protein fokozza a humán endothelsejteken az adhéziós molekulák expresszióját. Főleg a VCAM-1, de kisebb mértékben az ICAM-1 és az E-selectin megjelenését észlelték.

1.6. Az artériás érbetegségek klinikuma diabetesben 1.6.1. Microvascularis szövődmények Az egyik microvascularis szövődmény a vakság, amelynek a 30-69 év közötti betegeknél legfőbb oka a retinopathia. A retina pusztulásában egyaránt szerepe van a hajszálerek szivárgásának és elzáródásának. A folyamat szemtükörrel végzett szemfenékvizsgálaton kívül fluorescein angiographiás vizsgálattal detektálható (Donelly et al., 2000). A diabeteses nephropathia jellemző tünetei: a proteinuria > 300 mg/24óra, a magas vérnyomás és a vesefunkció beszűkülése. A betegség progressziójának végállapota veseelégtelenséghez és vesetranszplantációhoz vezet. A folyamat korai diagnózisa

microalbuminuriás

stádiumban

(20–300

mg/24óra,

vagy

20–200

mikrogramm/perc fehérjeürítés) szűréssel lehetséges és szükséges. A proteinuria fokozódása

markere

az

endothel-dysfunctionak

és

a

szervezetben

kialakuló

macrovascularis szövődményeknek, így a coronaria-betegségnek. A micro- és macroalbuminuria mindkét diabetes típusban szorosan összefügg a túlélés progresszív csökkenésével. A diabeteses neuropathiának számtalan megjelenési formája van. Jól ismert az alsó végtagokat érintő progresszív polyneuropathia, dominálóan szenzoros jellegű, gyakran kevés tünettel jár és a betegek közel 50 %-ában megtalálható.

28

Erectilis dysfunctio az ötven év feletti férfiak felét érinti, a hasonló korú nem diabeteses népességben 20%-ban található ilyen panasz. A patogenezisben autonóm neuropathia, microvascularis elégtelenség és pszichés tényezők egyaránt szerepet játszhatnak. 1.6.2. Macrovascularis szövődmények Ezek közt a coronariák érintettsége és a következményesen kialakuló myocardialis infarctus kiemelt szerepet játszik. Bár cukorbetegekben a szív működési zavarának hátterében secunder szívizom-károsodás („cardiomyopathia diabetica"), illetve autonóm beidegzési zavar is állhat, kétségtelenül döntő jelentősége van a coronariák megbetegedésének. Diabeteses és nem diabeteses egyének klinikai és patológiai összehasonlításakor kiderült, hogy cukorbetegségben a koszorúerek atherosclerosisa gyakoribb, a megjelenési forma súlyosabb, a betegség kezdete fiatalabb életkorra tehető, s hiányzik a nők relatív védettsége (Moore et al., 2009). Ezzel összefüggésben diabetesben a myocardialis infarctus előfordulása gyakoribb, az akut szak halálozása magasabb, az infarctus átvészelése utáni congestiv szívelégtelenség, illetve a bal kamrai diszfunkció kialakulásának aránya nagyobb, a re-infarctus gyakoribb, az öt éves túlélés alacsonyabb, ha az egészséges anyagcseréjű egyének adataihoz viszonyítjuk. A cerebrovascularis inzultus (stroke) klinikumának diabetesben nincs külön jellegzetessége. Az

indokolt

koponya CT-vizsgálaton túlmenően napjainkban

felértékelődött a carotis duplex-scan vizsgálata (cukorbetegekben is) (Lange et al., 2002). Ezen vizsgálattal nemcsak korai elváltozások detektálása, hanem az intimamedia vastagsági adatainak mérésével a gyógyszeres intervenciók eredménye is lemérhető. A cukorbeteg-ellátás során úgy szokás említeni, hogy fundus-vizsgálattal a micro-, carotis duplex-scan vizsgálattal pedig a macroangiopathiás szövődmények láthatók, illetve vizualizálhatók, így elvégzésük bizonyos rendszerességgel indokolt. A szignifikanciát elért szűkület esetén a nemzetközi ajánlások alapján a carotis stenosis műtéti megoldása szükséges (Halliday et al., 2004). Cukorbetegségben az alsó végtagi obliteratív atherosclerosis lábpanaszok forrása lehet. Fontos tudni, hogy cukorbetegekben diabeteses neuropathia is vezethet alsó

29

végtagi panaszokhoz, de az előzményi adatok gondos értékelése és alapvető vizsgálati eredmények alapján el lehet igazodni, hogy az adott betegnél elsősorban melyik kóroki tényező jelenlétét gyaníthatjuk (Huysman et al., 2009). Természetesen a két kórok szimultán is jelen lehet. Cukorbetegekben az alsó végtagi obliteratív érsclerosis általában kétoldali (bár súlyosság tekintetében különbség lehet a két láb között), a folyamat gyakran segmentalis jellegű és inkább distalis lokalizációjú szokott lenni. Cukorbetegségben

az

alsó

végtagi

obliteratív

érsclerosis

szövetelhaláshoz,

gangraenához vezet. A macroangiopathiát azonban gyakran microangiopathia is kíséri, utóbbi a microcirculatio további romlásával súlyosbítja a helyzetet (Dinh et al., 2009). Egyes esetekben Mönckeberg-sclerosis jelenléte igazolható. Minden esetben gondosan vizsgálandó, hogy infectio nem súlyosbítja-e az adott helyzetet. Ha egy cukorbeteg lábpanaszainak előterében ischaemiás jelek állnak, vagy kombinált neuropathiásischaemiás kóreredet tételezhető fel, a neuropathiát vizsgáló módszereken túlmenően az angiológiai kivizsgálás is indokolttá válik. Ennek során alapvető a Doppler vizsgálat és a Doppler-index meghatározása, egyes esetekben sor kerülhet a laser-Doppler vizsgálatra, illetve a transcutan pO2 mérésre is. Progresszió, illetve helyreállító érsebészeti beavatkozás szükségessége esetén indokolt az angiographia elvégzése.

1.7. Molekuláris vizsgáló módszerek Miután az atherosclerosis rendszerbetegség, a szervezet minden erét érinti, de különböző mértékben. A klinikai tünet attól függ, aktuálisan melyik a legérintettebb érszakasz. A klinikai vizsgálatok során leggyakrabban a coronaria erek, a végtagi erek és a carotis artéria beszűkülése okozta tünetekkel találkozunk. A szívkoszorúér betegség sokáig tünetmentes lehet, a betegség első jelei terhelésnél jelentkező, később nyugalomban is megjelenő mellkasi fájdalom, legsúlyosabb esetben myocardialis infarctus. Vizsgálata legegyszerűbben (nyugalmi, illetve terheléses) EKG-val, cardialis ECHO és laboratóriumi vizsgálatokkal lehetséges, újabban MR vizsgálat is rendelkezésre áll. Invazív módszer a coronarographia, ez egyben a terápiás lehetőséget is biztosíthatja (PTCA). A láb ereinek érintettsége esetén járási panasz, ún. claudicatio

30

jelentkezik. A keringés romlása a járásképesség csökkenéséhez, súlyosabb esetben a láb kisebesedéséhez, gangrena kialakulásához vezet, mely állapot végső soron amputációt tehet szükségessé. Vizsgálata az egyszerű kézi dopplertől a boka-kar index meghatározásán át a CT és MR angiographian keresztül az invazív angiographiaig terjed, utóbbi a diagnosztika mellett gyakran terápiás lehetőséget is jelent (PTA). A nyaki verőér, a carotis artéria beszűkülésének következménye az agy keringészavara, enyhébb esetben TIA, súlyosabb esetben stroke lehet. Vizsgálata a duplex vizsgálaton túl CT, MR és invazív angiographias (DSA) vizsgálattal lehetséges. A fenti klinikai vizsgálati módszerek mellett egyre inkább előtérbe kerül a betegséget kiváltó okok kutatása, keresése. Az atherosclerosis multifaktoriális betegség. Részletes kórélettanát és patomechanizmusát az előző fejezetekben ismertettem. Mint a másik népbetegség, a daganatos betegségek kutatásában már eredményekre vezető irány a kiváltó okok, a genetikai háttér keresése, a célmolekulák meghatározása (pl.tirozin kináz gátlók, mint terápiás lehetőség), az érbetegségek hátterének kutatása a genetikai vizsgálatok irányába mozdult el. Amennyiben a sok kiváló tényező közt sikerülne azonosítani egy-egy konkrét faktort, azok célzott gátlása reményteli terápiás lehetőségeket biztosíthatna. Számos adat utal arra, hogy a környezeti tényezők meghatározóak lehetnek az atherosclerosis kialakulásában. Például a Japánban élő japánoknál viszonylag alacsony a cardiovascularis betegségek gyakorisága. Azonban, ha például az USA-ba költöznek, a betegség gyakorisága eléri az ott lakó európai (kaukázusi) eredetű lakosságban tapasztalható értéket. Mivel a japánok genetikai adottságai nyilvánvalóan nem változtak meg, a tapasztaltak hátterében a megváltozott környezeti (általában étkezési) feltételek állnak. Ezek az adatok szükségessé teszik, hogy tudományosan is vizsgálják a betegségre való hajlam örökölhetőségét. A betegség kialakulásának egyik legfontosabb nem-genetikai tényezője az életkor. Megfelelően idős korban gyakorlatilag mindenkinél kialakul bizonyos mértékű atherosclerosis. Nyilvánvaló, hogy a fiatal korban kialakuló cardiovascularis betegségeknél erősebb a genetikai hatás. Később a környezeti tényezők hatása erősödik. Ezért a betegség genetikai hátterét a viszonylag fiatal betegeknél kiemelten indokolt vizsgálni. Ez az életkor férfiaknál 65, nőknél 55 év. Ezek az adatok arra is utalnak, hogy

31

az egyik legfontosabb, genetikainak tekinthető kockázat a férfi nem. Fiatal férfiakban a betegség sokkal gyakrabban fordul elő, mint hasonló korú nőkben. A genetikai vizsgálatoknál legtöbbször, praktikus okokból nem magát az atherosclerosist,

hanem

annak

manifesztálódó

formáit,

például

a

coronaria

atherosclerosis betegséget, az ischaemiás szívbetegséget, a myocardialis infarctust, vagy a carotis szűkület okozta stroke-ot szokták vizsgálni. Az öröklődés vizsgálatára a legfontosabb módszer a rokon-vizsgálat. Ezekben a vizsgálatokban azt nézik, hogy egy beteg rokonaiban mekkora az esélye annak, hogy hasonló betegség alakuljon ki, és ezt összehasonlítják a hasonló környezeti feltételek mellett élő populációban tapasztalható kockázattal. Ezeknek a kutatásoknak az eredményei egyértelműen arra utalnak, hogy az atherosclerosisra való hajlam öröklődő. Így a CAD-ban szenvedő férfiak első fokú rokonai között a betegség kialakulásának relatív kockázata 5, míg a nők esetében 7. Az egypetéjű ikreknél az ún. kétpetéjű ikreknél 3,8. A

s

s

érték 8,1,

-t úgy számolják ki, hogy elosztják annak az esélyét, ha egy

betegnek a testvére is beteg, annak az esélyével, ha egy nem-rokon egyén beteg. A szám 1 körül van, ha a betegségnek nincs genetikai háttere, és minél nagyobb, annál határozottabban állíthatjuk, hogy a betegség öröklődő. Ez a szám értelemszerűen magasabb a megegyező genetikai hátterű egypetéjű ikreknél, mint az átlag 50 % közös génállománnyal rendelkező kétpetéjűeknél. Összehasonlításképpen a monogén módon öröklődő cysticus fibrosis-nak a

s

értéke 500, míg a többi komplex multifaktoriális

betegség közül az I-es típusú cukorbetegségnek 15, a II-es típusúnak 3,5, a skizofréniának 8,6 és az asthmának 2 (Szalai, 2009). Ezek az eredmények mind alátámasztják a CAD genetikai hátterét. A különböző becslések az öröklődő komponens arányát a legtöbb populációban 40-60 % közé teszik. 1.7.1. Általános genetikai vizsgáló módszerek A betegségre való hajlamosító gének keresésére a humán genomban három alapvető módszert lehet megkülönböztetni: teljes genomszűrést, ezen belül megkülönböztethetünk mikroszatellita és SNP („single nucleotide polymorphism”, azaz pontmutáció) analízist, ez utóbbit teljes genom asszociációs vizsgálatnak hívják

32

jelölt gén analízist microarray génexpressziós vizsgálatokat A drága, munkaigényes és komoly bioinformatikai, statisztikai hátteret igénylő, de sok információt adó eljárások a teljes genomot vizsgáló kapcsoltsági módszerek. Ezek közül az egyik leggyakrabban használt a mikroszatellita analízis. A mikroszatelliták olyan ismétlődő DNS szekvenciák (pl.: (TA)n, vagy (CAG)n) amelyek nagyfokú polimorfizmust mutatnak a genomban. A humán genom teljes hosszában számos ilyen polimorf mikroszatellita markert találtak, amelyekkel végig lehet szűrni az egész genomot. A Human Genome Project „melléktermékeként” hatalmas mennyiségű (jelenleg több mint 10 millió darab) SNP-t detektáltak, azaz a különböző vizsgált humán mintákban ennyi különbséget találtak, egy elméleti, „vad” szekvenciához képest. Becslések szerint 10 független SNP együttes vizsgálata egy millió, 20 pedig már egy milliárd ember közül képes egyet kiválasztani. Ennek óriási jelentősége van, hiszen ezek a genetikai differenciák adják döntően az emberek közötti különbségeket. Az SNPket a mikroszatellitákhoz hasonlóan fel lehet használni teljes genomszűrésre is. Az utóbbi időben kifejlesztett microarray módszer segítségével egyszerre akár 100.000 SNP-t is lehet vizsgálni (Szalai, 2009). Ha egyes SNP-k a betegekben gyakrabban fordulnak elő, az azt jelzi, hogy ott valamilyen betegségre hajlamosító gén lehet (McGeachie et al., 2009). A módszer hátránya, hogy a hagyományos statisztikai eljárásokkal nehezen értékelhető óriási adathalmazt eredményez, és a munkának viszonylag nagy a költsége. A hagyományos statisztikai értékelést manapság felváltja a korszerű bioinformatika, a korrelációs analízisek új számítógépes megoldásai (Swabe et al., 2004). A másik elterjedt módszer az asszociációs vizsgálat. Ezekben valamilyen génvariációt vizsgálnak beteg és egészséges csoportokban, és elemzik, hogy kapcsolható-e az adott klinikai képhez. Ezt „jelölt gén” (candidate gene) vizsgálatoknak is hívjuk, hiszen itt olyan géneket vizsgálunk, amelyekről feltételezzük, hogy szerepet játszanak az adott betegség kialakulásában. A két módszer együtt a leghatásosabb, azaz a teljes genomszűrés után az adott területeken kereshetünk jelölt géneket, amelyekben aztán kereshetünk a betegekre jellemző mutációkat. Mindkét módszernek hátránya az atherosclerosis kutatásában az,

33

hogy mivel rengeteg gén szerepelhet hajlamosító faktorként, óriási beteganyagot kell felhasználni ahhoz (több ezret), hogy statisztikailag értékelhető eredményhez jussunk. Egy ettől eltérő, más-más kérdésre választ kereső megközelítést jelentenek a génexpressziós vizsgálatok, a funkcionális genomika egyik ága. A már előbb említett microarray módszert arra is fel lehet használni, hogy egyszerre több tízezer gén RNS és fehérjeszintű expresszióját vizsgáljuk. Azok a gének, amelyek eltérően expresszálódnak a beteg szövetben, mint az egészségesben, valószínűleg szerepet játszanak a betegség kialakulásában. A módszer hátránya, hogy humán mintákat csak korlátozottan lehet használni, hiszen itt szöveti expressziót kell vizsgálni, és az atheroscleroticus laesiokból történő mintavétel csak bizonyos esetekben lehetséges. 1.7.2. Molekuláris genetikai vizsgálómódszerek az atherosclerosis diagnosztikájában Az atherosclerosis genetikai hátterének vizsgálatában fontos szerepe van az állatkísérleteknek. Bár a kísérletekben legtöbbször használt állatnál, az egérnél, normális körülmények között nem alakul ki atherosclerosis, megfelelő gének kiütésével és ún. western típusú diétával egyes egértörzseknél az emberi atherosclerosishoz hasonló fenotípust lehet kialakítani. A leggyakrabban az apoE, vagy az LDLR géneket ütik ki és a C57BL/6J egértörzset használják (Stoll et al., 2006). Ilyen genetikai háttérre alakítanak ki genetikailag módosított állatokat, melyekben egy, vagy több gént inaktiválnak („knock-out” vagy „KO állatok”), vagy akár egyes szervekben, vagy az egész szervezetben módosíthatnak génexpressziókat. Ez a módszer alkalmas a gének funkcióinak, esetleg betegségekben betöltött szerepüknek a vizsgálatára. Az embernél lényegesen rövidebb reprodukciós idejű egerekből adott idő alatt nagyságrendekkel több információt nyerhetünk. Mivel az egér genom kevesebb, mint 300 génben különbözik az emberétől, az ezekben a kísérletekben kapott eredmények általában jól alkalmazhatók emberre.

34

1.7.3. Az atherosclerosis genetikai háttere 1.7.3.1. Monogénes atherosclerosis Bár az atherosclerosis monogénes formái az összes eset kb. 2 %-át teszik ki, felfedezésük nagyban hozzájárult a betegség patomechanizmusának megfejtéséhez. Annak a felfedezése például, hogy a hypercholesterinaemia kapcsolatban van az atherosclerosis

kialakulásával,

hypercholesterinaemiás,

géndefektusos

betegek

vizsgálatának köszönhető. Ezek az eredmények hozzájárultak a cholesterin anyagcsere tisztázásához, és hatékony cholesterinszint csökkentő gyógyszerek kifejlesztéséhez. Ilyen betegségek az autoszomális domináns hypercholesterinaemiák, (pl. familiáris hypercholesterinaemia (FH), familiáris defektív apolipoprotein (apo(B FBD)), az autoszomális recesszív hypercholesterinaemiak (ARH), Tangenier betegség, familiaris hypoalfalipoproteinaemia (FHA). 1.7.3.2. Poligénes (multifaktoriális) atherosclerosis Az atheroscleroticus betegségek túlnyomó része multifaktoriális, így ezek gazdasági, népegészségügyi jelentősége meghaladja a ritka monogénes kórképekét. A molekuláris genetikai módszerek fejlődésével a kutatók óriási erőfeszítéseket tettek, hogy megfejtsék a multifaktoriális atherosclerosis genetikai hátterét. Több ezer gén asszociációs vizsgálatot végeztek el annak a reményében, hogy olyan genetikai variációkat találjanak, amelyek segítségével kiszűrhetők a fokozott kockázatú egyének, és megfelelő preventív lépésekkel megelőzhető legyen a betegség kialakulása. A genetikai vizsgálatok másik fontos célja volt, hogy genetikai hátterük alapján el tudják különíteni az egyes betegeket, és hogy egyénre szabott terápiával lehessen kezelni őket (farmaco-genomica). A kutatásban a nehézségek fő oka abban rejlik, hogy a betegségre hajlamosító génpolimorfizmusok („genetikai sokalakúság”) viszonylag gyakoriak (populációs gyakoriságuk >1 %) és gyenge hatásúak. Ez utóbbi azt jelenti, hogy az egészséges élettel teljes mértékben összeegyeztethetőek, és csak valamilyen környezeti, vagy más genetikai kölcsönhatás révén nyilvánul meg a hatásuk. Ezt ugyan már korábban is tudták, de időközben kiderült, hogy az eddig alkalmazott egyszerűsített

35

modellek nem tudják megjósolni a több ezer, időben és térben folyamatosan változó kölcsönhatás eredményét. Állatkísérletekben igazolták, hogy ugyanaz a génvariáció különböző genetikai hátterű egérben egyszer atherosclerosisra hajlamosíthat, máskor védhet ellene. Tovább nehezíti a helyzetet, hogy adott időpontban a fenotípust meghatározza az adott környezet és a genotípus egymásra hatása, amit befolyásol a korábbi környezet és a genotípus interakciójából származó fenotípus és így tovább. A betegségekre való hajlamban komoly szerepet játszanak az embert a magzati korban ért, egész életet befolyásoló hatások, melyek sokszor epigenetikai szinten hatnak. Egy adott populációban egy génvariáció hatása általában kicsi, ráadásul az egyes populációk mind genetikai eloszlásban, mind környezeti hatásokban különböznek egymástól. Így nagyon sokszor előfordul, hogy egyik populációban fontosnak bizonyult génpolimorfizmus egy másik populációban semleges hatásúnak bizonyul. Az sem járható út, ha nagyon sok embert vizsgálunk és megpróbálunk nagyon sok gén-gén, gén-környezet kölcsönhatást is vizsgálni. Egyrészt még két gén kölcsönhatása is lehet többféle (pl. additív, szinergisztikus, szabályozó, stb.), de kettőnél több gén kölcsönhatását vizsgálni már szinte megoldathatatlanul bonyolult feladat, másrészt, minél több összefüggést vizsgálunk, annál nagyobb az esély, hogy nem valós összefüggéseket találunk (1-es típusú statisztikai hiba). Továbbá az atheroscleroticus laesio keletkezésénél több citokin, kemokin, adhéziós molekula, és egyéb molekula (pl. NO, receptorok, hormonok, lipidek stb.) kölcsönhatása játszódik le, és ezeknek a géneknek a szabályozása is összetett. Az eddig megoldhatatlannak látszó problémára megoldást jelenthetnek a rendszer-biológia („systems biology”) eredményei, amely az ilyen rendszerek sajátosságai alapján modellezi a bonyolult biológiai hálózatokat és megpróbál választ adni a fenti kérdésekre (Szalai, 2009). A „systems biology” jelentőségét bizonyítja, hogy azt a Science tudományos folyóirat a 2005-ös év áttörései közé választotta. A jövőbeni siker reményéhez hozzájárul még az internetes adatbázisok léte (SNP adatbázis, génexpressziós adatbázisok, stb.), az adatcserék felgyorsulása és a humán genom ismerete. Néhány eredményt több szempontból is igazoltak, ez nagyban hozzájárult az atherosclerosis patomechanizmusának megismeréséhez. A fentieket figyelembe véve azonban hozzá kell még tenni, hogy ha egy populáción kapott eredményt egy másik populáción, vagy másik vizsgálatban nem tudnak igazolni, az még nem jelenti azt, hogy

36

annak a betegség szempontjából nincs is jelentősége. Lehet, hogy egy adott polimorfizmus egy bizonyos genetikai, vagy környezeti kölcsönhatásban hajlamosít csak a betegségre. 1.7.4. Génpolimorfizmus vizsgálatok atherosclerosisos, diabeteses betegeken és állatkísérletekben Állatkísérleteknél számos olyan módszer áll rendelkezésre, amelyekkel a humán vizsgálatoknál lényegesen pontosabban lehet az atherosclerosisban szerepet játszó géneket meghatározni. Természetesen az így kapott eredményeket azután humán vizsgálatokkal kell igazolni. Ebben a fejezetben áttekintést nyújtok az eddigi génpolimorfizmus-vizsgálatok állatkísérletes tapasztalatairól. 5-lipoxigenáz gén Az egyik olyan gén, amely szerepét később embereken is igazolták, az 5lipoxigenáz (5-LO, vagy ALOX5). Atherosclerosisra hajlamos LDLR KO egerekben nem lehetett atherosclerosist kiváltani, ha az 5-LO génjüket is kiütötték. Az 5-LO a leukotrién szintézis egyik kulcsenzimje. A leukotriének proinflammatorikus lipid mediátorok, hozzájárulnak az LDL oxidálásához Feltehetőleg a polimorfizmus megnöveli a leukotrién B4 szintézist, így az oxidált LDL mennyisége megnövekszik, és nő az atherosclerosis kockázata. ApoA2 gén Állatkísérletek alapján az apoA2 gén is fontos szerepet játszik az atherosclerosisban. Az apoA2 az apoA1 mellett a HDL másik fő fehérjéje. Emelkedett szintje nagyobb CAD kockázattal (fordítva, mint az apoA1 esetében), emelkedett zsírsav szinttel, csökkent inzulin rezisztenciával, obesitással asszociált, de pontos funkciója nem ismert. Humán genomszűréseknél plazma koncentrációja a TG szinttel és familiáris kombinált hyperlipidaemiával (FCHL) mutatott szoros összefüggést. Az ezért felelős genetikai variációt emberben azonban még nem találták meg.

37

Limfotoxin-α gén A limfotoxin-

(LTA) gént is először állatkísérletekben azonosították, mint a

betegségben szerepet játszó DNS szakaszt Az említett gén expresszálódik az atheroscleroticus laesiokban, ahol adhéziós molekulák (VCAM, ICAM, E-selectin) és gyulladásos

citokinek

(TNF-α,

IL-1a

és

1b)

expresszióját

fokozza.

Egyik

polimorfizmusa humán összefüggést mutat a MI kockázatával. ApoE gén Az atherosclerosisban talán az egyik legtöbbet tanulmányozott gén, a nagy populációs heterogenitást mutató apoE. Becslések szerint az MI kockázat 2-3 %-áért felelősek az apoE variációk. Az E2 variáns relatív védelmet jelent, az E4 variáns 1,8-szoros kockázatot jelent CAD okozta halálra.

ApoA1-C3-A4-A5 cluster Az apoA1-C3-A4-A5 géncluster a 11q23 kromoszómarégióban központi szerepet tölt be a lipidanyagcserében. Számos SNP-t találtak és tanulmányoztak a régióban, melyek közül több az FCHL-re, a korai CAD egyik legfontosabb rizikófaktorára hajlamosít. Két SNP-t fedeztek fel, amelyekben a ritka allél több populációban (magyarban is) emelkedett TG szinttel asszociált. (Pallaud et al., 2001). Bizonyították a család másik tagjának, az apolipoprotein E polimorfizmusának is a szerepét cardiovascularis betegségekben (Eichner et al. 2002) Cholesterin észter transzfer protein gén A CETP központi szerepet játszik a reverz cholesterin transzportban, mivel a HDL-ről a cholesterin észtert LDL/VLDL-re juttatja, amely így a májba jut az LDLR-n keresztül. Mivel a hordozókban a reverz cholesterin transzport sérült, magas HDL szintjük ellenére is emelkedett CAD kockázatot mutatnak (Attie et al., 2001). Lipoprotein lipáz gén A lipoprotein lipáz (LPL) feladata, hogy a HDL-ből és TG gazdag lipoproteinekből a TG-t szabad zsírsavakra és glicerinre bontsa. A perifériás sejtek így képesek a TG-eket felvenni. Az LPL ezen kívül „híd” funkciót lát el a lipoproteinek és a

38

sejtfelszín között. A leggyakrabban tanulmányozott polimorfizmusa a kaukázusi populációban 2-5 %-os gyakoriságot mutató D9N. 9N hordozókban az enzim szekréciója romlik, ami dohányos, vagy obes férfiakban alacsony HDL-lel, magas TGvel, korai CAD-dal és MI-vel asszociált. A magyarázat szerint az LPL csökkent aktivitása nem tud megbirkózni az obesitasban a megnövekedett VLDL szinttel, amely így fokozott mértékben marad a keringésben. ABCA1 gén Az ABCA1 génben a Tangier betegséget és az FHA-t okozó ritka, súlyos mutációk mellett gyakoriak az enyhe funkcióváltozást okozó SNP-k. Az egyik vizsgálatban az ABCA1 génben található 12 SNP járt lipid-plazmaszint különbséggel, vagy atherosclerosis kockázatváltozással, 7 mutatott csak atherosclerosis kockázatában változást anélkül, hogy a lipidszint változott volna. Ez azt jelzi, hogy az ABCA1 nemcsak a HDL-C szinten keresztül befolyásolja az atherosclerosis kockázatát (Clee et al., 2001), feltételezések szerint a HDL szerkezete és minősége is számít (Attie et al., 2001). Ez utóbbit állatkísérletekben is igazolták. Paraoxonáz gén A paraoxonáznak (PON) három izoenzimje létezik, de atherosclerosisban a PON1 formának mutatták ki jelentőségét. A PON1 a HDL-hez kapcsolódik, fő jelentősége, hogy védi az LDL-t az oxidálás ellen és inaktiválja az oxidált LDL-t. Jelentőségét állatkísérletek is igazolják, hiszen a PON1 mennyisége egerekben befolyásolja az atheroscleroticus laesiok méretét. Lipoprotein a gén Az Lp(a) cholesterinben gazdag LDL-szerű részecske. Apo(a)-t tartalmaz, amely diszulfid-kötéssel kapcsolódik az apoB-100-hoz. Hajlamos oxidálódásra és oxidált formája igen erőteljesen atherogén. Szintje, mely genetikailag meghatározott és 90%ban az apo(a) genotípustól függ, korrelál CAD kockázatával. Az apo(a) szerkezetileg hasonlít a plazminogén-hez (aminek véralvadásban a fibrinolízisben van szerepe). Feltételezések szerint versenyezhet a plazminogénnel a thrombusban a fibrinért, de nem

39

emészti meg, lassítva így annak felszívódását. Az oxidált forma atherogén hatása mellett, ezzel is magyarázzák jelentőségét CAD-ban és MI-ben. Interleukin-6 gén Az IL-6 egy proinflammatorikus citokin, a CRP termelését stimulálja a májban. Szintje asszociált a CAD emelkedett kockázatával (Tedgui, 2005). A leggyakrabban tanulmányozott variánsa a gén promoter régiójában található -174 G/C polimorfizmus, mely egy transzkripciós faktor kötőhelyet befolyásol (Lieb et al., 2003). A C allél emelkedett IL-6 szinttel asszociált. A C allél hordozása a különböző nagy vizsgálatokban 1,32-2,95-szörös relatív CAD kockázattal társult (Chapman et al., 2003). Peroxisome proliferator-activated receptor-α gén A PPAR-α egy sejtmagba integrálódó hormonreceptor. Többek között májban, szívben, vázizomban, zsírsavakat lebontó szövetekben, endothel sejtekben expresszálódik. Az atherosclerosis szempontjából fontos ligandjai a zsírsavak és a fibrátok. Többek között lipid metabolizmusban és gyulladásban résztvevő géneket is szabályoz, pl. MCP-1, VCAM-1 (adhéziós fehérje), SF-BI (scavanger receptor, habos sejt kialakulása), ABCA-1 stb. A PPAR-α KO egerekben emelkedett a gyulladásos válasz és magasabb a lipid peroxid szint. Toll-Like receptorok gének A TLR patogén-asszociált molekuláris mintázatokat ismernek fel, és számos gyulladásos gén expresszióját indukálják. A TLR1, TLR2 és TLR4 expressziója az atheroscleroticus plakkokban jelentősen emelkedett. A TLR2 és TLR4 génekben írtak le cardiovascularis betegségek kockázatát befolyásoló polimorfizmusokat. (Ohsuzu, 2004). Alkohol dehidrogenáz gén Az atherosclerosis patomechanizmusában közvetve olyan gének is szerepet játszhatnak, mint például az ADH. Az ADH3 izoenzimnek Két gyakori allélja van: 1 (40 % allélgyakoriságú, gyors metabolizmus) és 2 (60 %, lassú 2,5x-es különbség). Az alkoholt fogyasztó ADH3

genotípusúaknak volt a legmagasabb a HDL

40

szérumszintjük. A vizsgálat alapján az alkohol részben a HDL szint emelésével csökkenti az MI kockázatát. A lassabban lebontó izoenzimekkel rendelkezőkre erőteljesebb ez a hatás. Statisztikai elemzések alapján az alkohol más mechanizmussal is (pl. csökkenti a gyulladási hajlamot) csökkenti a CAD kialakulását. A myocardialis infarctussal a különböző nemekben a legerősebb összefüggést mutató távoli gének a következők voltak: Connexin-37 (férfiakban az endothel sejtek közötti kommunikációban, a gap junction felépítésében van szerepe; atherosclerosis kialakulásakor a lipidek számára megnövekszik az endothel sejtek átjárhatósága); p22phox (férfiakban ér-simaizmok reaktív oxigén termelése: atherogén oxLDL kialakulásában lehet szerepe); Plasminogen-activator inhibitor type 1 (PAI-I) (nőkben: fibrinolízis, thrombosis, az erek elzáródása); Stromelysin-1 (nőkben az erek falában a mátrix metabolizmusban van szerepe).

2. Célkitűzések I. Az atherosclerosis kialakulása tehát multifaktoriális folyamat, amely során környezeti és genetikai tényezők kölcsönhatásaként alakul ki a kórkép (Ross, 1993). A betegséget klasszikus rizikófaktorain kívül (magas vérnyomás, lipid-anyagcserezavar, diabetes, dohányzás) a betegség kialakulását az endothel sejtek funkcióját a thrombusképzést befolyásoló enzimek genetikai variánsai (génpolimorfizmus) is befolyásolhatják (Topol et al., 2001, Gonzalez et al., 2004, Miwa et al., 2004, Jilma et al., 2005). A diabetes

kis-

és

nagyér-szövődményeinek

patomechanizmusában

a

kóros

endothelműködés a közös kiindulási alap, melyben kulcsfontosságú szerepet tulajdonítunk az endothelialis nitrogén-monoxid-szintáz (eNOS) csökkent aktivitásának, ezáltal a gátolt nitrogén-monoxid kínálatnak (Nieszner és mtsai, 2005). A hypertensio az angiotensin II (AT-II) emelkedett szintje miatt növeli a simaizom lipoxigenáz aktivitást, mely gyulladásnövelő hatású, de önmagában is vannak inflammatoricus hatásai: serkenti a hidrogén peroxid, a szuperoxid anion és a hydroxyl-gyök képződését a plazmában. Ezek az anyagok redukálják a nitrogén-monoxid (NO) képződést az

41

endothelben, növelve így a leukocyták kötődését, és ezzel a perifériás ellenállást (Davignon et al., 2004). Bebizonyosodott, hogy az érendothel és simaizomsejtek fokozott proliferációja is hozzájárul az érszűkület, stenosis kialakulásához. Az endothel nitrogén oxid szintetáz (eNOS) által termelt nitrogén oxid (NO) atheroprotektív hatású (Hingorani et al., 1997). Előzetes vizsgálatok alapján az is bizonyítást nyert (Marroni et al., 2005), hogy az eNOS 298 Glu/Asp polimorf változata alacsony NO termeléssel társul, amely az endothel funkció károsodása következtében (Yang et al., 2005) vérnyomás-emelkedéshez, thrombusképzéshez és az erek tónusának növeléséhez vezet, ami hozzájárul az atherosclerosis kialakulásához (Hingorani et al., 1997, Cai et al., 1999), Ross et al., 2003, JuanCasas et al., 2004). Az irodalmi adatok azonban ellentmondóak az eNOS polimorfizmusnak az atherosclerosisban betöltött szerepét illetően (Tanus-Santos, 2001). ●Vizsgálatainkban ezért célul tűztük ki, hogy meghatározzuk az eNOS Glu298Asp (G→T) polimorfizmust egészséges, atherosclerosisos nem diabeteses és cukorbeteg személyekben. A munka során összefüggést kerestünk az akut myocardialis infarctus és a stroke gyakorisága, valamint az eNOS 298 Asp/Asp és eNOS 298 Glu/Asp génpolimorfizmusok között. II. Felmerült annak a lehetősége, hogy a plazma homocystein-szint károsíthatja a kisartériák endothel sejtjeit, amely az atherosclerosis kialakulásának kezdeti lépéseit jelenti (Bova et al., 1999, Mazza et al., 2000a). A magas plazma homocystein szint és folát metabolizmusban a methylenetetrahydrofolat reduktáz (MTHFR) C677T enzim játszik szerepet. A magas plazma homocystein szintet kezdettől összefüggésbe hozták az atherosclerosissal (Selhub et al., 1995, Mazza et al., 2000a). A homocystein metabolizmusát

végző

enzimeket

(mint

a

cystation-β-reduktázt,

vagy

a

methylentetrahydrofolat reduktázt) kódoló génre nézve homozigóta elhunytak boncolásakor kifejezett atherosclerosis igazolódott (Ross, 1999). A homocystein önmaga toxikus az endothelre nézve és prothromboticus hatású is, valamint növeli a kollagén szintézisét és gátolja az angioprotektív NO hatását. A TT/MTHFR genotípus magasabb homocystein-szinttel társul, amely alapján feltételezik, hogy növeli az atherosclerosis kialakulásának rizikóját (Refsum et al., 1998, Lusis, 2000, Passaro et al., 2001, Inamoto et al., 2003), de vannak ennek ellentmondó eredmények is (Mazza et al.,

42

2000b, PerUeland et al., 2000). A plazma homocystein szintje kissé emelkedett sok olyan betegben is, akiknek nincs enzimdefektusuk. Ezeknek a betegnek az esetében is fokozott

a

kockázata

a

szimptómás

cardialis,

perifériás

és

agyi

artériák

érelmeszesedésének. ●Vizsgálatainkban ezért összefüggést kerestünk a diabeteses, valamint atherosclerosisos nem diabeteses betegekben előforduló stroke, myocardialis infarctus és a C677T MTHFR polimorfizmus előfordulása között. III. Az elmúlt évtizedben derült ki, hogy az atherosclerosis egyik legfontosabb tényezője a gyulladás. Míg korábban a legtöbb klinikus úgy tekintette az atheromát, mint egy sima laesiot, az újabb eredmények azt mutatják, hogy az atherogenesis folyamatához nagyban hozzájárul a lokális gyulladás és az immunválasz aktív folyamata Szoros összefüggést találtak a magas CRP szint és az endothelialis dysfunctio közt (Blake et al. 2001, Ablij et al., 2002) és ugyancsak több tanulmány szól a tumor necrosis factor kulcs-mediátor szerepéről az endothel működési zavarai kiváltásában (Ridker et al., 2000, Stenvinkel, 2001). Ha az endothelsejtekben a növekedési faktorok termelése és elválasztása fokozódik, a következményes endothel- és simaizomsejtproliferáció hivatott az "eltakarító folyamat" által okozott sérülések "gyógyítására". Ugyanakkor ezek a változások a thrombusképződés irányába is hatnak. Számos tanulmány alapján bebizonyosodott, hogy az atherosclerosis egy gyulladásos betegség (Yang et al., 2005). Az atherosclerosis laesiokban számos cellularis és molekuláris folyamat is arra utal, hogy ezen állapot legjobban egy krónikus gyulladáshoz hasonlít. Ezt a feltételezést támasztja alá az is, hogy a gyulladást kísérő plazmaproteinek szintje megemelkedik cardiovascularis betegségben. Ezek a transzmembrán fehérjék, amelyek úgy tűnik, a sejt-sejt kölcsönhatásokban működnek közre (Shah, 1998), az extracellularis szakaszukon tartalmaznak egy metalloproteinase szekvenciát, amely képessé teszi őket arra, hogy olyan molekulákat aktiváljanak, mint a TNF-α (Geisler et al., 2004). A vascularis endothelialis sejtek elégtelen funkciója meghatározó szerepet játszik az atheroscleroticus plakkok kialakulásában (Stoll et al., 2006). Az endothelialis sejtek abnormális funkciója eredményeként gyulladásos citokinek szabadulnak fel, mint pl. az interleukin-1b, a tumor necrosis factor-α és a C-reaktív protein (Fiotti et al.,

43

1999). A gyulladásos folyamat a C-reaktív protein megemelkedéséhez vezet, amely a keringő monocytákat és makrofágokat aktiválja az atheroscleroticus laesion belül. A Tsejtek aktivációja citokinek szekrécióját eredményezi, (IFN-γ és a TNF-α), amelyek szintén felerősítik a gyulladásos választ. A TNF-α a gyulladásos válasz egyik legfontosabb mediátora (Stenvinkel, 2001, Libby et al., 2002, Monraats et al., 2004). A monocyták autocrin és paracrin aktivációjában a TNF-α lényeges szerepet játszik, amelyek a különböző citokinek szintézisét eredményezik. TNF-α fontos szerepet játszik az érrendszeri betegségek patofiziológiájában, a lipid metabolizmus, az elhízás és az inzulin rezisztenciára kifejtett hatásán keresztül. Újabban az obesitast magában is kritikus kockázati tényezőnek tartják, mivel kimutatták, hogy a zsírszövet fokozottan termel TNF-α-t, mely részben közvetlenül az érfalon hat, részben beavatkozik az inzulin anyagcsere folyamatokba (Dalziel et al., 2002, Libby et al., 2002, Hotamisligil, 2006). Napjainkban a metabolikus szindróma kórfejlődésében egyre nagyobb szerepet tulajdonítanak a citokineknek, ebben a vonatkozásban elsősorban a tumornecrosis factor-α szerepe került előtérbe (Nieszner és mtsai, 2005). Ismertté vált az is, hogy a TNF-α-szint megemelkedése szerepet játszik a myocardialis ischaemia kialakulásában és a myocardialis infarctusban (Ridker et al., 2000, Vendrell et al., 2003). Az atheroscleroticus plakk progressziója következtében a fibrosus sapka növekszik, szűkíti a lument, felszínén megnő az enzimaktivitás, így a TNF-α is, amelynek következtében fokozódik a vérlemezkék adhéziója, a thrombus kialakulása. A cardiovascularis betegségben szenvedő betegeknél gyakran előfordul a restenosis, különösen olyanoknál, ahol gyulladásos folyamatok fennállnak. Mivel a gyulladásos folyamatokban a tumor necrosis faktor-α központi szerepet játszik, a TNF-α szintet

szabályozó

folyamatok

vizsgálata

hozzájárulhat

az

atherosclerosis

patomechanizmusának megismeréséhez. A TNF-α-t számos sejt, így makrofágok, neutrofil sejtek és endothelialis sejtek egyaránt szintetizálják, lokálisan a károsodott érfal területén hat, ezért feltételezik, hogy a restenosis kialakulásában központi szerepet játszik. A TNF-α bioszintézis gátlása csökkenti műtét után a neointima kialakulást, amely újabb bizonyíték arra vonatkozólag, hogy a megemelkedett TNF-α szint fontos szerepet játszik a restenosisban. Mivel a TNF-α expresszió mértékét genetikai faktorok

44

is nagymértékben befolyásolják, fontos annak ismerete, hogy az egyes betegek esetében milyen valószínűséggel alakul ki stenosis, illetve műtét után a restenosis. Ennek megállapítására alkalmas a TNF-α génpolimorfizmusok meghatározása. A gén promoter régiója számos polimorfizmust tartalmaz, amely a TNF-α szint mértékét szabályozza. ●Vizsgálataink ezért arra irányultak, hogy meghatározzuk a TNF-α 308GA polimorfizmusát diabeteses betegekben, atherosclerosisos nem diabeteses betegekben és egészséges kontroll személyekben. Összefüggést kerestünk a TNF-α génpolimorfizmus előfordulása, valamint a diabeteshez és atherosclerosishoz társuló myocardialis infarctus között. A fentiek alapján a vizsgálatsorozat célkitűzései az alábbiak: I.

eNOS G298T polimorfizmus meghatározása a./ egészséges, b./ atherosclerosisos nem diabeteses, c./ atherosclerosisos és diabeteses betegcsoportokban.

II.

MTHFR C677T polimorfizmus meghatározása a./ egészséges, b./ atherosclerosisos nem diabeteses, c./ atherosclerosisos és diabeteses betegcsoportokban.

III.

TNF-α G308A polimorfizmus meghatározása a./ egészséges, b./ atherosclerosisos nem diabeteses, c./ atherosclerosisos és diabeteses betegcsoportokban.

3. Módszerek A vizsgálat során összesen 992 személy adatait elemeztük. Ezen kutatásunk során 2003. novembere és 2005. júniusa között a Semmelweis Egyetem Érsebészeti Klinikájára felvett 608 beteg került vizsgálatra (1. táblázat). Részletes klinikai adataik, teljes laboratóriumi eredményeik rögzítésre kerültek, tőlük a szokásos rutin vérvétel

45

mellett egy további, véralvadásgátlóval preparált (EDTA) kémcsőbe vettünk perifériás vénás vért. Ezt a megfelelő azonosítókkal ellátva 5 ºC fokon tároltuk szállításig, majd eljutattuk az Országos Onkológiai Intézet Pathogenetikai Osztályára, ahol -20ºC-ra hűtötték, majd feldolgozásra kerültek. A betegek a vizsgálatban való részvételhez beleegyező nyilatkozatot írtak alá. Személyes adataikat nem tároltuk, a vérminták és a tárolt laboreredmények egyedi azonosítóval rendelkeztek. A betegek atherosclerosisos érbetegségük miatt különböző típusú érműtéteken estek át. A társbetegségeik miatt szedett gyógyszereiken felül mindannyian megkapták az érbetegek számára kötelező thrombocyta-antiaggregatios és statin kezelést. A betegeket két csoportra osztottuk, egy része az atherosclerosis mellett diabeteses is volt, másik részének ilyen anyagcserebetegsége nem volt. A kontroll csoportot az Onkológiai Intézetben szűrés miatt megfordult, teljesen egészséges 384 személy képezte (1. ábra). A kapott eredményeket statisztikai módszerekkel elemeztük, így kétmintás Student t próba, Odds ratio (esélyhányados) meghatározás, Fischer exact teszt, khi-négyzet próba, átlag- és szórásvizsgálat (SD) és grafikus értékelés is történt. Azon eltéréseket tekintettük szignifikánsnak, ahol a statisztikai eltérés során *p<0,05, továbbá **p<0,005., ***p<<0,001.

3.1. Vizsgálati csoportok Valamennyi

személynél

rögzítésre

került

az

atherosclerosis

esetében

rizikófaktorként számon tartott dohányzás, kóros lipid-eltérés, diabetes előfordulása. Az atherosclerosis végpontjaiként a myocardialis infarctus (MI), illetve stroke előfordulása, valamint a carotis stenosis fennállása is rögzítésre került. Az összes, 608 beteget négy csoportba osztottuk: 1./ atheroscleroticus diabeteses infarctuson átesett betegek, 2./ atheroscleroticus diabeteses stroke-ot elszenvedett betegek, 3./ atheroscleroticus nem diabeteses infarctuson átesett betegek és 4./ atheroscleroticus nem diabeteses stroke-ot elszenvedett betegek. A vizsgált gének polimorfizmusai homo- és heterozygota variánsának előfordulását elemeztük minden betegcsoportban, ezek gyakoriságát a kontroll, egészséges mintákhoz viszonyítva.

46

Mintaszám

ASO: 348

Kontroll: 384

DM+ASO: 260

Kontroll: 384

DM+ASO: 260

ASO: 348

1. ábra: Teljes vizsgálati minta megoszlása. A 992 egyed több mint harmada (38%) az egészséges, harmada (35%) az atheroscleroticus nem diabeteses (ASO) és közel harmada (26%) az atheroscleroticus diabeteses (DM) csoportba tartozott. A 384 kontroll beteg az Országos Onkológiai Intézetben esett át a rendes éves orvosi szűrésen. Anamnézisükben nincs infarctus, stroke, agyi betegség, coronaria betegség, vagy más atherosclerosisra utaló kór, sem thrombosis, embólia, vérzéses rendellenesség. A betegek mindannyian átestek valamilyen érsebészeti rekonstrukciós beavatkozáson a Semmelweis Egyetem Érsebészeti Klinikáján (1. táblázat). Összes anamnesztikus adataik, orvosi dokumentációjuk és laboreredményeik rögzítésre került. Életkor szempontjából a két betegcsoport közt jelentős különbség nem volt, a diabeteses betegcsoport átlagéletkora 70 év, a nem diabeteses atheroscleroticus betegcsoport átlagéletkora 68 év. A legfiatalabb beteg 40 éves, a legidősebb 93 éves volt. A diabeteses betegek fele per os, harmada inzulinos kezelést igényelt, 20% diétával volt egyensúlyban.

47

1. táblázat: Műtétek megoszlása a két betegcsoportban Atherosclerosisos diabeteses

Atherosclerosisos nem

csoport

diabeteses csoport

N:219

%

N:313

%

Carotis

53

24,2

74

23,6

Alsó végtag

140

63,9

190

60,7

Aneurysma

5

2,3

16

5,1

Diagnosztika, PTA

21

9,6

33

10,6

A betegségek megoszlása infarctus tekintetében hasonló volt, azaz az atheroscleroticus diabeteses csoportban 38,9 % az atheroscleroticus nem diabeteses csoportban 39 %. A stroke aránya a diabeteses csoportban szignifikánsan magasabb volt, majdnem kétszerese az atheroscleroticus nem diabetess csoporthoz képest (38 % versus 20 %) (2 ábra).

Infarctus és stroke előfordulása 45 40

38.9

39

38

35

%

30 25 20 20

DM ASO

15 10 5 0 AMI

Stroke

2. ábra: Infractus és stroke gyakorisága az atheroscleroticus diabeteses (DM) és az atheroscleroticus nem diabeteses (ASO) csoportban. Míg a myocardialis infarctus (AMI) aránya hasonló, a cerebrovascularis események (Stroke) a diabeteses betegeknél kétszer gyakrabban jelentkeztek.

48

A betegek laboreredményei részletes elemzésre és statisztikai feldolgozásra kerültek. A véralvadási paraméterek (prothrombin, INR), az ionok (Na, K), az összfehérje és a fehérvérsejtszám tekintetében - statisztikai módszerrel is vizsgálva - a két vizsgált betegcsoport közt szignifikáns eltérés nem igazolódott, az egészséges csoporttal együtt értékeik a normál tartományban voltak. A vesefunctios értékekben jelentkező különbség alátámasztja a klinikumból ismert tényt: a diabeteses betegek gyakoribb vese-érintettségét. (2. táblázat).

2. táblázat: Atherosclerosisos nem-diabeteses betegek és atherosclerosisos diabeteses betegek releváns laboreredményeinek összehasonlítása (Az egészséges kontrollokra vonatkozó normál értékek a laboratóriumi érték-pontossággal lettek feltüntetve) Labor eredmények

Diabeteses csoport

Atherosclerosisos

Normál

(n=260)

csoport (n=348)

érték

átlag

szórás

átlag

szórás

Haemoglobin (g/l)

12,7

2,0

13,5

1,8

13-18

Haematocrit (%)

37,1

5,7

39,2

5,3

39-49

Prothrombin (%)

0,8

0,1

0,9

0,1

0,7-1

INR

1,2

0,6

1,1

0,2

0-1,3

Natrium (mmol/l)

140,8

4,1

140,8

6,7

135-145

Kalium (mmol/l)

4,7

0,4

5,1

7,7

3,5-5,1

Urea(mmol/l)

8,4

4,6

6,6

2,9

1,7-8,3

Kreatinin (umol/l)

100,6

39,6

90,1

26,6

80-133

Glucose (mmol/l)

10,2

3,7

5,8

1,7

3,8-5,8

Összfehérje (g/l)

71,1

12,6

74,6

7,1

55-83

Cholesterin (mmol/l)

5,2

1,2

5,5

1,3

2,8-5

Triglicerid (mmol/l)

2,2

1,4

1,9

1,2

0,5-1,7

HDL (mmol/l)

1,3

0,3

1,5

0,5

1-1,4

LDL (mmol/l)

3,6

1,1

3,6

1,3

2,5-30

Fehérvérsejt(10^3/mm3)

9,0

3,5

8,9

3,9

4-10,1

49

Értelemszerűen a diabeteses csoport éhomi vércukorszintje jelentősen, majd kétszer magasabb volt az atherosclerosisos csoporthoz képest. A cholesterin, triglicerid és LDL szint a két vizsgált betegcsoportban egymáshoz képest szignifikáns eltérést nem mutatott (p<0,15), de az egészséges kontroll csoport értékeit jelentősen meghaladta. Ez az atheroscleroticus betegeknél ismert adat (2. táblázat). Amennyiben a laboratóriumi adatokat egy-egy betegcsoporton belül a társbetegségek előfordulását vizsgálva is elemeztük, egyértelmű eltérések igazolódtak. Az atherosclerosisos nem diabeteses csoportban a fontosabb laboratóriumi összetevőket a myocardialis infarctus előfordulásának függvényében vizsgálva azt találtuk, hogy az infarctuson átesett betegek körében a lipidszint (különösképpen az LDL) szignifikánsan magasabb a korábban cardialisan nem érintett betegekhez képest (p<0,05) (3. táblázat). Hasonlóképpen elemezve az atherosclerosisos diabeteses csoportot, köztük ez az eltérés nem jelentkezett ilyen jelentős mértékben, a különbség nem volt szignifikáns (p>0,05) (4. táblázat).

3. táblázat: Atherosclerosisos, nem-diabeteses betegek klinikai jellemzői. Az atherosclerosisos betegek esetében minden lipid szintben eltérés látható, de csak az LDL cholesterin esetén mutattak az értékek szignifikanciát (*p<0,05). Myocardialis Infarctussal

Myocardialis Infarctus nélkül

73/45

110/73

Serum glucose

5,7±1,6

5,7±1,6

Össz cholesterin

5,5±1,2

5,2±0,9

Triglycerid

2,2±1,2

1,7±0,6

HDL cholesterin

1,2±0,4

1,5±0,5

LDL cholesterin

4,2±1,3*

2,7±1,2

Nem Ffi/Nő 183/118

50

4.

táblázat:

Atherosclerosisos,

diabeteses

betegek

klinikai

jellemzői.

Az

atherosclerosisos és diabeteses betegek lipid szint eltérése az infarctuson átesett, illetve általa nem érintett betegek közt nem tér el jelentősen (p>0,05) Myocardialis Infarctussal

Myocardialis Infarctus nélkül

71/30

99/59

Serum glucose

10,3±3,9

10,1±3,6

Össz cholesterin

5,8±2,0

5,6±1,3

Triglycerid

2,3±1,2

2,3±1,6

HDL cholesterin

1,2±0,3

1,2±0,3

LDL cholesterin

4,3±1,3

4,1±0,8

Nem Ffi/Nő 170/89

3.2. Génpolimorfizmus vizsgálatok 3.2.1. Endothelialis nitrogénoxid szintetáze és methylenetetrahidrofolatreduktáz vizsgálat DNS izolálás A DNS izoláláshoz 3-6 ml, véralvadásgátlós (EDTA) csőbe levett, perifériás vérmintát használtunk. A vért az izolálásig –20 ºC-on tároltunk. Az izolálás a Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega) alkalmazásával, a használati útmutató utasításai szerint történt. Genotípus analízis/SNP analízis A minták genotípusát PCR-RFLP módszerrel illetve LightCycler real-time PCRon alapuló olvadáspont (melting curve) analízissel határoztuk meg.

51

LightCycler olvadáspont („melting curve”) analízis: A módszer elve: A real-time PCR anellációs fázisa során amplifikált PCR fragmentum egy belső szekvencia részletéhez két, eltérő oligonukleotidból felépülő hibridizációs próba kapcsolódik. Az egyik próba 5’ vége LightCycler Red fluorophorral (LCRed-640 vagy LCRed-705) jelölt, a 3’ vég pedig foszforilált (így itt nem indulhat el extenzió); a másik próba 3’ vége fluoreszceinnel jelölt. A két próba egymás közelében hibridizálódik a DNS szekvenciához és a közöttük fellépő fluoreszcens rezonancia energia transzfer (FRET) következtében kialakuló szignál intenzitása a target PCR termék mennyiségével arányosan

nő.

különböztethetők

Az meg

olvadáspont-analízis egymástól,

hogy

során a

az

DNS

eltérő

genotípusok

szekvenciával

úgy

tökéletesen

komplementer, illetve a mutáció következtében megváltozott szekvenciához már tökéletesen kapcsolódni nem tudó próba eltérő hőmérsékleten válik le. Az eNOS Glu/Asp 298 (GT) polimorfizmus vizsgálatára az alábbi PCR primer párt használtuk: sense primer: 5’-CAGCTCTGCATTCAGCAC-3’; antisense primer: 5’-CATCCCACCCAGTCAATC-3’; sensor: 5’-LCRed640-GTTCTGGGGGCTCATCTGGG-PH3’(designed for the wild type allele); anchor: 5’-CAGCTCGGGGGGCAGAAGGAA-FL-3’. Amplifikációhoz 50 ng DNS templátot 0,5 µM primer és 0,2 µM fluorescens próba jelenlétében LightCycler FastStart DNA Master HybProbe mix (Roche Diagnostics GmbH) alkalmaztunk. Az olvadáspont analízisre alapozott SNP vizsgálatot LightCycler készüléken határoztuk meg. Az olvadáspont analízishez a hőmérsékletet 95°C-ra emeltük, majd 45 °C-ra csökkentettük, végül ismételten 85 °C-ra emeltük. A hőmérséklet-változás alatt a fluorescens intenzitást monitoroztuk. A DNS melting curve generálását LC vs. 3.5 szoftver alkalmazásával végeztük, amely alapján az eltérő genotípusok azonosítása lehetővé válik.

52

DNS szekvenálás Az eNOS génpolimorfizmusok jelenlétének igazolására a melting curve alapján polimorf eNOS mintákat direkt DNS szekvenálással is meghatároztuk. A DNS szekvenáláshoz előállítandó PCR termék primerei megegyeztek az SNP analízisre használt primerekkel. A DNS szekvenálási reakciót BigDye terminátor szekvenáló kittel (Applied Biosystem) végeztük, és a DNS szekvenciát ABI-PRISM 3130 Genetikai Analizátorral határoztuk meg.

Az MTHFR gén C677T polimorfizmusának vizsgálata LightCycler (Roche) segítségével történt. polimorfizmus

MTHFR C677T

Primerek

hibridizációs próbák

5’3’

5’3’

sense

sensor:

AGG-CCA-GCC-TCT-

CGG-GAG-CCG-ATT-TCA-

CCT-GAC-TG

TCA-FL-3

antisense:

anchor:

AGG-ACG-GTG-CGG-

LCRed

TGA-GAG-TG

TCT-TTG-AGG-CTG-ACA-PH

640-CGC-AGC-TTT-

Az MTHFR C677T polimorfizmus vizsgálatát egy korábban leírt módszer felhasználásával végeztük, de a PCR programot egy kicsit módosítottuk: kezdeti denaturálás 95ºC 5 perc, melyet a 45 ciklus denaturáló (95ºC, 3 s) , anellációs (52ºC, 5s) és extenziós lépése (72ºC, 13s), majd az olvadáspont-analízis (40-75ºC, 5s) és a végső hűtés (40ºC, 30s) követ.

53

A genotípusokhoz tartozó olvadáspont értékek: gén

Melting curve (Tm) értékek (± 2 ºC)

polimorfizmus

Homozigóta

Heterozigóta

normál MTHFr C677T (CT)

Homozigóta mutáns

60

51,5+60

51,5

3.2.2. Tumornecrosis factor-α vizsgálat DNS izolálás: A DNS izoláláshoz 3-6 ml, véralvadásgátlós (EDTA) csőbe levett, perifériás vérmintát használtunk. A vért az izolálásig -20 °C-on tároltuk. Az izolálás a Wizard Genomic DNS Purification Kit (Promega) alkalmazásával, a használati útmutató utasításai szerint történt. Genotípus analízis/SNP analízis: TNF-α 308GA polimorfizmus meghatározására az alábbi PCR primert használtuk. 5'-AGGCAATAGGTTGAGGGCCAT-3' and 5'-TCCTCCCTGCTCCGATTCCG-3' A 308 GA polimorfizmus meghatározásait F. Real és munkatársai módszere alapján végeztük (Fernandez-Real et al., 1997).

4. Eredmények 4.1. eNOS Glu298Asp (GT) polimorfizmus vizsgálata atherosclerosisos diabeteses és atherosclerosisos nem diabeteses betegeken Irodalmi adatok alapján a nitrogén monoxid fontos szabályozó szerepet tölt be az endotheliumban, gátolva az atherogenesist. Az endotheliumban az eNOS (endothelialis

54

nitrogén oxid szintáz) L-argininből szintetizálja a NO-t. A gén több polimorfizmusát is leírták, melyek közül a 894GT (E298D) és a 786TC promoter polimorfizmus szerepét bizonyították CAD-ban (Hingorani et al., 1997).

GG-vad homozigóta

TT-mutáns homozigóta

GT-mutáns heterozigóta

3. ábra: eNOS G298T polimorfizmus meghatározása DNS olvadáspont alapján (melting curve analysis)

384 egészséges, 348 atherosclerosisos nem diabeteses, és 260 atherosclerosisos diabeteses személynél DNS melting curve alapján határoztuk meg a nitrogén oxid szintetáz polimorfizmust. A 3. ábrán egy reprezentatív DNS melting curve analízist mutatunk be, amely alapján az eltérő genotípusok azonosíthatók. A különböző genotípusú eNOS génszekvenciákat DNS szekvenálással is meghatároztuk, amelynek reprezentatív példáját a 4.a. és 4.b. ábrán mutatjuk be.

55

GG-vad

4.a. ábra: Az eNOS 298GG vad genotípus DNS szekvenciája

GT-heterozigóta

4.b. ábra: Az eNOS 298GT heterozigóta genotípus DNS szekvenciája

56

A DNS olvadáspont-analízis alapján meghatározott eNOS genotípusok %-os megoszlását az 5. táblázatban tüntettük fel. A vad változat Glu/Glu GG, míg a mutáns változat Asp/Asp TT aminosav, illetve DNS szekvenciáknak felelt meg. Vizsgáltuk a vad (GG), a mutáns (TT) és a heterozigóta (GT) genotípusok gyakoriságát különböző betegségek, betegségkombinációk esetében. Igazolódott, hogy a mutáns TT variáns előfordulása szignifikánsan magasabb az infarctusos betegek esetében. Méréseink szerint a kontroll csoportban az eNOS 298 Asp/Asp TT mutáns variáns aránya 5,7%, a diabeteses csoportban az infarctusos beteg esetén 14,8% (p<0,005), stroke-on átesettek körében 12,9%-ban fordul elő (p<0,05). (5. táblázat)

5. táblázat: Nitrogén monoxid szintetáz (eNOS) 298 Glu/Asp génpolimorfizmus százalékos megoszlása atherosclerosisos diabeteses és atherosclerosisos nem diabeteses betegeken infarctus és stroke szempontjából. A mutáns eNOS 298TT variáns szignifikánsan nagyobb arányban fordult elő a betegek közt, mint a kontroll csoportban (*p<0,05, **p<0,005, ***p<<0,001) Vizsgálati csoportok

1. Kontroll (n=384) 2. Diabetes + MI (n=101) 3. Diabetes + Stroke (n=108) 4. Atherosclerosis+MI (n=118) 5. Atherosclerosis+Stroke (n=106)

eNOS298TT

eNOS298 GT

eNOS298 GG

Homozigóta

Heterozigóta

Homozigóta

Mutáns

Mutáns

Normál

%

%

%

5,7

41,9

52,4

22/384

161/384

201/384

14,8**

44,6

40,6

15/101

45/101

41/101

12,9*

43,5

43,6

14/108

47/108

47/108

16,9***

49,2

33,9

20/118

58/118

40/118

15,1***

48,1

36,2

16/106

51/106

39/106

57

A nem diabeteses, atherosclerosisos csoportban az infarctusos betegeknél 16,9% (p<<0,001), a stroke-os betegek közt 15,1%-ban jelentkezik (p<<0,001), mely mind szignifikáns különbség (5. táblázat). Szignifikancia számolásnál a homozigóta TT és a homozigóta GG gyakoriságot hasonlítottuk össze az egyes betegcsoportok és a kontroll csopoert között. Az eset-kontroll analízis valamely megbetegedés kialakulásának relatív esélye kimutatására ad információt. A homozigóta TT mutáns allél esetén eszerint a diabeteses-atherosclerosisos csoportban az infarctus esélye

OR 3,34 (1,61-6,92), a

stroke kockázat OR 2,72 (1,31-5,66). Az atherosclerosisos nem diabeteses csoportban az előző csoporthoz képest az infarctus kockázat a legjelentősebb, OR 4,58 (2,29-9,08) de a stroke fellépésének esélye is magas: OR 3,74 (1,82-7,71). .

eNOS 298 Glu/Asp polimorfizmusok 60

%

50 40

Asp/Asp TT

30

Glu/Asp GT

20

Glu/Glu GG

10

t ro ke

I AS

O +S

M O +A

tro +S M D

AS

ke

M +A M D

Ko

nt ro ll

I

0

Csoportok

5. ábra: eNOS polimorfizmusok megoszlása az öt vizsgált csoportban. Az atherosclerosisos nem diabeteses betegcsoportokban a kontrollhoz képest szignifikánsan magasabb a mutáns TT homozigóta genotipus aránya (*p<0,05, **p<0,005, ***p<<0,001)

58

A heterozigóta GT változat gyakorisága a betegcsoportokban a kontrollhoz képest jelentősen nem tér el, míg a normál GG előfordulása (a TT csoport növekedése miatt) viszonylag kisebb (5. ábra). Eredményeink arra utalnak, hogy a mutáns eNOS 298 TT genotípus, valamint a myocardialis infarctus és stroke között pozitív korreláció áll fenn.

4.2. MTHFR C677T polimorfizmus vizsgálata atheosclerosisos diabeteses és atherosclerosisos nem diabeteses betegekben Irodalmi adatok alapján az egyik legtöbbet vizsgált genetikai variáció, a homocystein lebontásában fontos szerepet betöltő MTHFR C677T polimorfizmusa. Az emelkedett homocystein szint hozzájárul az endothel sejtek sérüléséhez és a simaizom proliferációhoz. Az MTHFR C677T hőlabil változatának CAD-ban betöltött szerepe ellentmondásos. Jelentősége feltehetőleg a fólsavhiányos táplálkozásban van, amikor a TT homozigótákban (ennek gyakorisága a magyar populációban kb. 10%) magas a homocystein szint és, így emelkedik a CAD kockázata. Az MTHFR génpolimorfizmust DNS olvadáspont analízis alapján LightCycler segítségével 384 kontroll, 260 atherosclerosisos diabeteses, illetve 348 atherosclerosisos nem diabeteses egyénben határoztuk meg.

homozigóta mutáns TT

homozigóta normál CC

heterozigóta CT

6. ábra: MTHFR C677T polimorfizmus olvadáspont analízise (melting courve analysis)

59

Az MTHFR polimorfizmus vizsgálat reprezentatív példáját a 6. ábrán szemléltetjük. Vizsgáltuk a mutáns MTHFR 677TT és a heterozigóta CT gyakoriságát különböző betegségek, betegségkombinációk esetében. Igazolódott, hogy a heterozigóta CT variáns előfordulása szignifikánsan magasabb az infarctusos betegek esetében. A mérések szerint míg a kontroll csoportban 32%-ban fordult elő a mutáns MTHRF 677CT heterozigóta variáns, addig az atherosclerosisos diabeteses betegek csoportjában az infarctuson átesett betegeknél ez 53,5% (p<<0,001 vs kontroll) a stroke-ot szenvedett betegek közt 51,8% az aránya (p<<0,001). (6. táblázat)

6.

táblázat:

MTHFR

C677T

génpolimorfizmusok

százalékos

megoszlása

atherosclerosisos diabeteses és atherosclerosisos nem diabeteses betegeken infarctus és stroke szempontjából. A mutáns MTHFR 677CT heterozigóta variáns minden betegcsoportban, míg a MTHFR 677TT homozigóta az atherosclerosisos nem diabeteses csoportban erősen szignifikáns mértékben fordult elő a kontroll csoporthoz visznyítva (*p<0,05, **p<0,005, ***p<<0,001) Vizsgálati csoportok

1. Kontroll (n=384) 2. Diabetes + MI (n=101) 3. Diabetes + Stroke (n=108) 4. Atherosclerosis+MI (n=118) 5. Atherosclerosis+Stroke (n=106)

MTHFR TT

MTHFR CT

MTHFR CC

Homozigóta

Heterozigóta

Homozigóta

Mutáns

Mutáns

Normál

%

%

%

10,9

32

57,1

42/384

123/384

219/384

16,8*

53,5***

29,7

17/101

54/101

30/101

14,8**

51,8***

33,4

16/108

56/108

36/108

21,2***

55,1***

23,7

25/118

65/118

28/118

19,8***

53,7***

26,5

21/106

57/106

28/106

60

A heterozygota MTHFR CT variáns a nem diabeteses, atherosclerosisos csoportban az infarctusos betegeknél 55,1%-ban jelentkezik (p<<0,001) a stroke-os betegek közt 53,7%-ban fordult elő, mely szintén szignifikáns különbség a kontroll csoporthoz képest (p<<0,001). A homozigóta MTHFR TT változat a diabeteses-atherosclerosisos betegek csoportjában kisebb mértékben, de még szignifikánsan van jelen, azaz az infarctusos betegek közt 16,8% (p<0,05), a stroke-os betegeknél 14,8% (p<0,005). Az atheroscelerosisos nem diabeteses betegeknél viszont ismét kimagaslóan magas az előfordulási arány, így az infarctusos csoportban 21,2% (p<<0,001), a stroke csoportnál 19,8% (p<<0,001). (6. táblázat) Amennyiben az összes beteg allél (TT+CT) jelenlétét vizsgáljuk a négy betegcsoportban a normál CC variánshoz képest, minden értékelésnél erősen szignifikáns eltérést találtunk (p<<0,001).

MTHFR C677T polimorfizmusok 60 50

%

40

677 TT

30

677 CT 677 CC

20 10

+S tr o ke AS O

I

DM

AS O

+S tro

+A M

ke

I +A M DM

Ko nt ro ll

0

7. ábra: az MTHFR polimorfizmusok megoszlása az öt vizsgált csoportban. Az atherosclerosisos nem diabeteses betegcsoportokban szignifikánsan magasabb mind a 677 CT heterozigóta mind a homozigóta 677TT genotipus aránya a vad típusohoz képest (*p<0,05, **p<0,005, ***p<<0,001).

61

Az eset-kontroll analízisnél azt találtuk, hogy a homozigóta TT mutáns genotípus esetén a diabeteses-atherosclerosisos csoportban az infarctus esélye OR 2,95 (1,51-5,79), a stroke kockázat OR 2,31 (1,18-4,52). Az atherosclerosisos nem diabeteses csoportban az infarctus kockázat a legjelentősebb, OR 4,65 (2,48-8,72) azonban a stroke esélye is meglehetősen magas: OR 3,91 (2,04-7,49). A heterozigóta CT változat esetében a diabeteses-atheroscerosisos csoportban az infarctus kockázat OR 3,21 (1,955,25), míg a stroke esélye OR 2,79 (1,72-4,43). CT genotípus jelenléte esetén az atherosclerosisos csoportban az infarctus esélye OR 4,13 (2,52-6,76), míg a stroke kockázat OR 3,62 (2,19-5,97). Eredményeink alapján megállapítható, hogy pozitív kapcsolat mutatható ki az mind az MTHFR TT, mind az MTHFR CT genotípusok, valamint a myocardialis infarctus és stroke előfordulása között (7. ábra). Az infarctus és a stroke kialakulásának esélye az egyes betegcsoportokban mindkét allélt tekintve igen hasonlónak és jelentősnek bizonyult.

4.3. TNF-α vizsgálatok atherosclerosisos diabeteses és atherosclerosisos nem diabeteses betegeken Vizsgáltuk a TNF-α génpolimorfizmusok megoszlását különböző betegségek, betegségkombinációk esetében. A 308 mutáns homozigóta AA, a normál homozigóta GG és a heterozigóta GA gyakoriságát ellenőriztük infarctus, stroke előfordulása esetén az atherosclerosisos nem diabeteses és atherosclerosisos diabeteses betegcsoportban. Igazolódott, hogy a homozigóta AA variáns előfordulása szignifikánsan magasabb az infarctusos betegek esetében. Méréseink szerint a TNF-α mutáns AA genotípusa a kontroll csoportban alacsony, 1,6%, míg a diabeteses betegek csoportjában az infarctuson átesett csoportban 9,2%, (p<0,05) a stroke-ot elszenvedettek közt 7,7%-ban jelentkezett (p<0,005). A nem diabeteses, atherosclerosisos betegek csoportjában az infarctusos betegek közt 10,7%,(p<0,005) a stroke-ot elszenvedett betegnél 11,1%-ban fordult elő, mely szintén szignifikáns eltérés a kontrollhoz viszonyítva (p<0,005) (7. táblázat). A heterozigóta GA változat gyakorisága a kontrollhoz képest jelentősen nem

62

tér el, míg a GG előfordulása (a mutáns AA csoport növekedése miatt) viszonylag kisebb (8. ábra).

7. táblázat: TNF-α génpolimorfizmus megoszlása atherosclerosisos diabeteses és atherosclerosisos nem diabeteses betegeken infarctus és stroke szempontjából (*p<0,05, **p<0,005 vs. kontroll) Vizsgálati csoportok

1. Kontroll (n=184) 2. Diabetes + MI (n=65) 3. Diabetes + Stroke (n=65) 4. Atherosclerosis +MI (n=75) 5. Atherosclerosis + Stroke (n=45)

TNF-α Homozigóta Mutáns 308 AA % 1,6

TNF-α Heterozigóta Mutáns 308 GA % 21,7

TNF-α Homozigóta Normál 308 GG % 76,7

3/184

40/184

141/184

9,2 *

26,2

64,6

6/65

17/65

42/65

7,7**

30,7

61,6

5/65

20/65

40/65

10,7**

28

61,3

8/75

21/75

46/75

11,1*

28,9

60,0

5/45

13/45

27/45

Az eset-kontroll analízisnél azt találtuk, hogy a homozigóta AA mutáns genotípus esetén minden betegség előfordulási esélye igen magas. A diabetesesatherosclerosisos csoportban az infarctus esélye és a stroke kockázata jelentő és gyakorlatilag azonos [OR 6,71 (1,72-25,55), OR 5,87 (1,48-23,21)]. A nem diabeteses atherosclerosisos csoportban az infarctus kockázata hasonlóképpen jelentős, OR 8,17 (2,24-29,55) és a stroke esélyéhez közelít OR 8,71 (2,15-34,98).

63

TNF-α polimorfizmusok 90 80 70

%

60 AA

50

GA 40

GG

30 20 10 0 Kontroll

DM+AMI

DM+Stroke

ASO+AMI ASO+Stroke

8. ábra: a TNF-α polimorfizmusok megoszlása az öt vizsgált csoportban. Az atherosclerosisos nem diabeteses betegcsoportban szignifikánsan magasabb a mutáns 308 AA homozigóta genotipus aránya kontroll csoporthoz képest (*p<0,05, **p<0,005).

5. Megbeszélés 5.1. Endothelialis nitrogénoxid szintetáz Kapcsolatot találtunk az eNOS gén variánsai és a myocardialis infarctus közt. A kapcsolat fennáll mind a diabeteses, mind a nem diabeteses betegek esetén is, jelezvén a NO fontos szerepét a coronaria betegségekben, függetlenül a diabetológiai statustól. Manapság elfogadott állítás, hogy a NO-függő endothelialis dysfunctio kulcsszerepet játszik az atherothrombosis kialakulásában (Jeerooburkhan et al., 2000,

64

Colombo et al., 2003). Az endotheliumból származó NO az érrendszerben (endothel) termelődik, L-argininből és molekuláris oxigénből,

az endothelialis nitrogén oxid

szintetáz által, melyet a 7. kromoszómán lévő NOS3 gén kódol (Hingorani et al., 1997). Kimutatták, hogyha az egyed homozigóta az Asp 298 allélre, kevesebb NO-t termel, és ezáltal vélhetően sokkal fogékonyabb az endothelialis dysfunctiora, így nagyobb az atherosclerosis kockázata is (Alvarez et al., 2001). A 7-es exonon a 894-es helyzetben történő GT báziscsere következménye a Glu298Asp szubsztitúció, amely az egyetlen ismert polimorfizmus, amelyik megváltoztatja a protein primer szerkezetét. Korábban számos vizsgálat történt annak kimutatására, hogy ezen polimorfizmusnak milyen szerepe van az atherosclerosis kialakulásában. Hasonló eredményeket találtak, mint a promoter 786 polimorfizmus esetén, azaz a 298 Asp isoform hordozókban a legtöbb pozitív eredményű kutatás kétszeres növekedést igazolt az infarctus és hypertonia kockázatában. Ezen vizsgálatunk egyik fontos eredménye, hogy szoros összefüggést találtunk a Glu298Asp eNOS polimorfizmus és a coronariasclerosis kockázata között. A magasabb kockázat azon egyénekre korlátozódott, akik Asp298 homozigóták (TT) voltak, náluk négyszeres a coronariasclerosis kockázata azokhoz képest, akik Glu298 homozigóták voltak (GG). Az egészséges kontroll csoporthoz képest szignifikánsan több Asp298 homozigóta volt található azon betegek közt, akik akut infarctuson és stroke-on estek át. Mivel a NO atheroprotectiv ágensként ismert, és az Asp298 homozigóták közt az eNOS mennyisége vagy aktivitása alacsonyabb, számukra a coronariasclerosis, vagy infarctus kockázata jelentősen nagyobb (Hibi et al., 1998). Megállapíthatjuk, hogy azonosítottunk egy polimorfizmust a NOS3 génen és a coronariasclerosisra nézve a Glu298Asp átalakulás bizonyult az egyik fő kockázati tényezőnek. Ez a felismerés potenciálisan fontos, de további megerősítést igényel más populációk esetében is. A következő grafikonon polimorfizmusok szerint csoportosítva láthatjuk a különböző rizikócsoportok eltéréseit a kontroll egyénekhez képest (9. ábra) Ismert az is, hogy számos további ismert gén polimorfizmusa társul coronaria és carotis atherosclerosishoz. Noha

az

individuális

SNP

meghatározás

keretet

adhat

a

genetikai

fogékonyságnak, a single gene polimorfizmus karakterizáció elégtelen arra, hogy leírja a genetika átfogó hatását az ASO fenotípusára (Szabó és mtsai, 2009).

65

eNOS 298 Glu/Asp polimorfizmusok 60 50 Kontroll

40

%

DM+AMI 30

DM+Stroke ASO+AMI

20

ASO+Stroke

10 0 Asp/Asp TT

Glu/Asp GT

Glu/Glu GG

9. ábra: az eNOS polimorfizmusok megoszlása egészséges, atherosclerosisos diabeteses és atherosclerosisos nem diabeteses betegekben, genotípusok szerint csoportosítva. A kontroll csoportban a vad GG, az atherosclerosisos nem diabeteses csoportban a mutáns TT esetén a legnagyobb a százalékos növekedési arány.

5.2. Methylentetrahidrofolatreduktáz Korábbi

meta-analysisek

következtetései

szerint

a

MTHFR

C677T

polimorfizmus és az atherosclerosis között a magasabb homocystein (He) plazma szinten van összefüggés (Pallaud et al., 2001). A homocystein vélhetően a fokozott vascularis sejt proliferácio és fokozott érfali prothromboticus aktivitás révén segíti elő az atherosclerosist és a thrombosist. A mutáns genotípus (T allélek a MTHFR gén 677 pozíciójában) ismerten társul fokozott stenosis hajlammal. Más tudományos vizsgálatok viszont nem találtak összefüggést a MTHFR A677V allél gyakoriság és a carotis atherosclerosisa közt (Zuliani et al., 2000). Ennek tisztázására választottuk vizsgálatunk tárgyául a MTHFR C677T gyakoriságát az átlagos populációban, különböző fenotípusokkal társulva.

66

Vizsgálatunk másik célja az volt, hogy meghatározzuk a MTHFR C677T allél gyakoriságát stroke-os és infarctusos betegeken. Jelen vizsgálatunk eredménye szerint a MTHFR 677 CT heterozigóta és a 677 TT homozigóta genotípus a stroke genetikai rizikó faktora és az infarctus kockázati tényezője.Ezen vizsgálat esetszáma megfelelő annak a kiindulási hypothesisnek a megerősítésére, hogy a MTHFR genotípus befolyásolja a coronariasclerosist, azonban a genetikai és a környezeti faktorok közötti összefüggések igazolásához kiterjedtebb vizsgálatok szükségesek. Következtetésünk szerint a MTHFR 677CT variáns és az infarctus, valamint a stroke gyakorisága között szignifikáns összefüggés van. A MTHFR 677CT genotípusnak, mint terápiás és prognosztikai markernek valószínűleg van klinikai jelentősége, de ezen hypothesis alátámasztásához további vizsgálatok szükségesek. (Szabó és mtsai, 2009). Érdekes eredményt mutat a következő ábra, amelyben genotípusok szerint csoportosítva szerkesztettük meg az oszlopokat (10. ábra). Nagyon jól látszik, hogy a heterozigóta 677CT allél esetén nagyobb arányban jelentkeznek a tünetek, mint a homozigóta mutáns 677TT változat esetén. Statisztikai analízis szerint mindkét beteg allél jelentős rizikó tényező, de heterozigóta CT esetében az esélyhányados magasabb. Az eredmények újabb kérdéseket vetnek fel, melyeknek megválaszolásához további vizsgálatokok szükségesek.

67

MTHFR C677T polimorfizmusok 60 50 Kontroll

40

%

DM+AMI 30

DM+Stroke ASO+AMI

20

ASO+Stroke

10 0 677 TT

677 CT

677 CC

10. ábra: az MTHFR polimorfizmusok megoszlása egészséges, atherosclerosisos diabeteses és atherosclerosisos nem diabeteses betegekben, genotípusok szerint csoportosítva. A kontroll csoportban a vad CC, az atherosclerosisos diabeteses és atherosclerosisos nem diabeteses csoportban a mutáns CT aránya a legnagyobb.

5.3. Tumornecrosis factor-α Az atherosclerosis kialakulásában multifaktoriális - környezeti és genetikai tényezők - játszanak szerepet. A cardiovascularis betegségekben rizikófaktorként szerepel a dohányzás, az elhízás, a lipid anyagcsere zavara. Ismertté vált az is, hogy a 2. típusú diabeteses állapot hajlamosít cardiovascularis betegség kialakulására. Számos adat utal arra, hogy az atherosclerosis és a 2. típusú diabetes között a lipid metabolizmus zavarán kívül a gyulladásos citokinek is szerepük van (Welt et al., 2002). A citokinek közül a tumor necrosis factor játszik központi szerepet, mivel a TNF-α szint

68

mutatott pozitív korrelációt a magas triglicerid- és cholesterolszint között. A TNF-α szerepére utal az is, hogy a hyperlipidaemia és hypercholesterinaemia kezelésére használt simvastatin és atorvastatin csökkenti a TNF-α szintet (Ascer et al., 2004). A TNF-α elősegíti az endothel sejtek kóros működéséhez vezető aktív gyökök szintézisét. A TNF-α szerepet játszik a vasodilatatio mechanizmusában is, a szabad gyökök szintézisének és a nitrogén oxid (NO) szint szabályozásán keresztül (Goodwin et al., 2007). Ennek alapján a TNF-α szintnek meghatározó szerepe van az érrendszeri betegségek kialakulásában. A TNF-α expresszió mértékét a gén promoter régiójában lévő 308GA polimorfizmus befolyásolja. A mutáns 380AA genotípus és 308GA heterozigóta genotípusok esetében a TNF-α szint megemelkedik. Vizsgálatainkban ezért meghatároztuk 184 kontroll, 65 atheroclerosisos diabeteses és 75 atherosclerosisos nem diabeteses személy esetében a TNF-α 308GA polimorfizmusát. Megállapítottuk, hogy az egészséges kontroll populációban a vad típusú TNF-α 308GG genotípus előfordulási gyakorisága 76,6 %, a heterozigóta genotípus gyakorisága (308GA) 21,7%, míg a 308 AA mutáns genotípus 1,6%-ban fordul elő. Megállapítottuk, hogy azon diabeteses-atherosclerosisos betegekben, (2. vizsgálati csoport) akiknél myocardialis infarctus előfordult, a 308AA mutáns genotípus előfordulási gyakorisága a kontroll egyénekben lévő 1,6%-ról 9,2%-ra emelkedett. A 3. vizsgálati csoportban a TNF-α genotípus megoszlása a következő: a magas rizikót jelentő AA mutáns genotípus 7,7%-ban, míg az A allélt tartalmazó GA heterozigóta genotípus 30,7%-ban és a vad típusú GG genotípus 61,5%-ban fordult elő. Azoknál a betegeknél, ahol az A allél előfordult, a TNF-α szint megemelkedett, ami növeli a cardiovascularis betegség progressziójának esélyét (Wilson et al., 1997). A 4. és 5. vizsgálati csoportba az atherosclerosisos nem diabeteses betegeket soroltuk: a 4. vizsgálati csoportban az atherosclerosishoz myocardialis infarctus, míg az 5. vizsgálati csoportban stroke társult. Megállapítottuk, hogy a magas rizikócsoportot jelentő AA genotípus nagyobb gyakorisággal fordul elő (10,7%, 11,1%), mint a kontroll csoportban (1,6%). A heterozigóta GA genotípus gyakorisága is magasabb az atherosclerosisos betegeknél (28%, 28,9%), összehasonlítva a kontroll populációval, amelyben a TNF-α heterozigóta genotípus csak 21,7%-ban mutatható ki (7. táblázat).

69

Előzetes vizsgálatok szerint a francia és észak-írországi populációkban a myocardialis

infarctusos

betegekben

a

TNF-α

308AA

genotípusa

nagyobb

gyakorisággal fordult elő (Herrmann et al., 1998). Más vizsgálatok szerint azonban a TNF-α szint és az atherosclerosis kialakulása között csak fiatal személyek között mutattak ki pozitív korrelációt (Elkind et al., 2002). A 11. ábrán látható grafikonon jól láthatóak a mi eredményeink szerinti genotípus megoszlások a különböző klinikai csoportok között, magyar populáción, átlagos koreloszlás esetén.

TNF-α polimorfizmusok 90 80 70 Kontroll

%

60

DM+AMI

50

DM+Stroke 40

ASO+AMI

30

ASO+Stroke

20 10 0 AA

11.

ábra:

a

TNF-α

GA

GG

polimorfizmusok

megoszlása

egészséges,

diabeteses-

atherosclerosisos és atherosclerosisos nem diabeteses betegekben, genotípusok szerint csoportosítva. A kontroll csoportban a vad GG, az atherosclerosisos diabeteses valamint az atherosclerosisos nem diabeteses csoportban a mutáns AA esetén a legnagyobb a százalékos növekedési arány.

70

Úgy tűnik, a TNF-α szintnek lényeges szerepe van az érstenosis kialakulásában (Monraats et al., 2005). Esetkontroll analízisünk a tanulmányban vizsgált három polimorfizmus közül a TNF-α esetén igazolta a legnagyobb kockázatot cardiovascularis esemény bekövetkeztére, így kiemelten infarctus tekintetében: OR 8,71 (2,15-34,98), rendkívül magas. A vizsgálatban két diabeteses-atherosclerosisos és két diabetesben nem szenvedő atherosclerosisos betegcsoportunk volt. Míg az összes vizsgált beteg közt az infarctuson átesettek csoportjában azonos számban voltak atherosclerosisos nem diabeteses és diabeteseses atherosclerosisos betegek, a stroke-os betegek közt a diabetes aránya jelentősen megasabb volt. Érdekes eredménye a vizsgálatnak, hogy ezen utóbbi különbség ellenére a három vizsgált polimorfizmus esetén a beteg allél hordozása mellett a diabetes léte nem jelentett magasabb kockázati tényezőt az infarctus, illetve a stroke kialakulására - a statisztikai elemzések sem százalékos különbséget, sem szignifikáns eltérést nem tudtak igazolni.

6. Következtetések A cardiovascularis betegségek aránya növekszik, hazánkban is a vezető halálokok közt szerepel. Ennek oka az, hogy atherosclerosis mára népbetegség lett, patomechanizmusának

megismerése

a

gyógyítás

szempontjából

kiemelkedő

jelentőséggel bír. Multifaktoriális betegség lévén, kialakulása számos összekapcsolódó folyamat következménye. Az utóbbi években ismertté vált a korábbi response-to-injury elmélet mellett (Giese et al., 1999) a gyulladásos tényezők pathogenetikai szerepe és a kóros metabolikus mechanizmusok részvétele a folyamatban (Corti et al., 2004). Felmerült egy új elnevezés szükségessége is, a kifejezőbb „gyulladásos, sclerotizáló artériás betegség” azaz ISAD (Inflammatory Sclerosing Arterial Disease) név használata (Parámo et al., 2001). Mára az alapkutatások már molekuláris genetikai szinten zajlanak. Vizsgálatunk célja az volt, hogy meghatározzunk három különféle polimorfizmust

egészséges,

atherosclerosisos

71

nem

diabeteses

és

diabeteses

atherosclerosisos betegcsoportban, kapcsolatot találjuk ezen eltérések gyakorisága és a jelentkező betegségek közt. Ezen alapkutatások jelentősége abban van, hogy a betegség kialakulására hajlamosító tényezőket megismerjük, az okokat felderítve célzott kezelési lehetőségeket keressünk, új terápiás célmolekulákat biztosítva az atherosclerosis gyógyításában. A vizsgálat során a kitűzött célokat elértük, sikerült pozitív összefüggéseket igazolni minden csoportban. Igazolódott, hogy az atherosclerosisos betegek közt az infarctuson átesettek lipidszintje szignifikánsan magasabb a cardialisan nem érintett betegekhez képest.

Bizonyított téziseink: Kimutattuk, hogy az eNOS Glu298Asp mutáns TT variáns esetén szignifikánsabban gyakoribb a myocardialis infarctus a heterozigóta GT és normál GG genotípusú egyedekhez képest. Bebizonyosodott, hogy a mutáns MTHFR 677CT heterozigóta variáns esetén a betegek közt a legmagasabb az infarctus és a stroke aránya, de az MTHFR 677 TT homozigóta allél esetén is szignifánsan magasabb a gyakoriság.. Vizsgálataink szerint a mutáns TNF-α AA allél hordozók közt szignifikánsan magasabb a cardiovascularis események kialakulásának valószínűsége.

Fenti megállapítások alapján hosszú távon megfontolandó a veszélyeztetett, családilag terhelt anamnézisű rizikócsoportok szűrése – egy betegség, vagy arra való hajlam korai felfedezése esetén a megelőzés és gyógyítás sokkal jobb eredményekkel kecsegtet. Az atherosclerosis kialakulásában szerepet játszó gyulladásos mechanizmusok megismerése újabb terápiás célpontokat biztosít a farmakológusok számára. Egyik ilyen lehetőség a gyulladásos folyamat csökkentése, leállítása, ezáltal az atherosclerosis kezelése (Suckling, 2007). Ismert az atherosclerosis kezelésében széles körben alkalmazott statinok antiinflammatoricus, antithromboticus, plakk-stabilizáló hatása

72

(Meskó, 1997, Libby, 2002, Mason, 2003, DeGraba, 2004). Szintén plakkstabilizálónak bizonyultak az angiotenzin-II receptor blokkolók (Murtagh et al., 2004, Cipollone et al., 2004) és a gyulladásgátló terápia részét képező trombocyta aggregációt gátló szerek (acetylsalycilsav, dipyridamole, clopidogrel) (Khan et al., 2005, Gardner et al., 2009). Kísérlet folyik a citokinek és a mátrix metalloproteinázok hatásának gátlásán keresztül történő beavatkozásra (Geisler et al., 2004). Még az egyszerű halolajnak is igazolták a kóros lipoid frakciók szintjének csökkentése révén kifejtett jótékony hatását (Paoletti et al., 2004). Mivel ismert és igazolt a nitrogén monoxid atheroprotectiv szerepe, minden olyan szer, mely ennek szintjét emeli, jótékony hatású lehet érszűkület ellen. Ehhez kapcsolódik, hogy a plazma homocystein magas szintje gátolja a NO hatását. Sikeres vizsgálatok zajlanak fólsav kezeléssel, hogy normalizálják a szérum homocystein szintet és így óvják meg a beteget a korai atherosclerosistól és infarctustól (Ross, 1999). Vizsgálatunkkal igazoltuk, hogy annak a betegnek, aki a homocystein lebontásában fontos szerepet játszó MTHFR 677CT heterozigóta vagy 677TT heterozigóta variánsának hordozója, jelentősen emelkedett az infarctus kockázata. Ez fólsav bevitellel bizonyos esetekben csökkenthető. A TNF-α kulcsszerepe a folyamat sok szintjén ugyancsak bizonyított. Bioszintézisének gátlása csökkenti a plakk képződés, illetve a neointima kialakulás folyamatát (Monraats et al., 2004, Ascer et al., 2004, Hotamisligil, 2006). A gén különböző polimorfizmusai eltérő kockázati tényezőt jelentenek, az AA mutáns genotípus jelenléte bizonyult a legnagyobb kockázati faktornak. Ennek korai felismerése és kimutatása a betegség korai stádiumban kezdődő kezelését eredményezheti, ezáltal jelentősen csökkentve a CAD kockázatát, a beteg életkilátásait. Sikeres kutatások történtek egy pharmacophore modell generálásán alapuló hatóanyag molekula optimalizációs módszer létrehozására. különböző

patomechanizmusokhoz

rendelt

validált

Ezzel a módszerrel célmolekulák

ellen

vezetőmolekulákat azonosítottak (tumor, angiogenezis, gyulladás). A módszer igen eredményesnek bizonyult nemcsak tumor, de különböző gyulladásos és fertőző betegségek validált célmolekulái esetében is (Kéri és mtsai, 2006). Ezen eredmények a továbbiakban remélhetőleg a farmakológiai kutatásokban sikeresen hasznosíthatók, közelebb hozva az elméleti kutatást a gyakorló medicinához.

73

7. Összefoglalás Az

atherosclerosis

kialakulása

multifaktoriális

folyamat.

Klasszikus

rizikófaktorain kívül (magas vérnyomás, lipid-anyagcserezavar, diabetes, dohányzás) a betegség kialakulását az endothel sejtek funkcióját és a thrombus-képzést befolyásoló enzimek genetikai variánsai (génpolimorfizmus) is befolyásolhatják. A

vizsgálat

célja

az

anyagcsere

folyamatokban

résztvevő

három

génpolimorfizmus vizsgálata volt. A vizsgálat során összesen 992 személy adatait elemeztük. A Semmelweis Egyetem Érsebészeti Klinikáján másfél év alatt kezelt 348 atherosclerosisos nem cukorbeteg és 260 atherosclerosisos diabeteses beteg adatait hasonlítottuk össze a 384 fő egészséges kontroll adataival. Vizsgáltuk a különböző polimorfizmusok esetén az infarctus, a stroke gyakoriságát az atherosclerosisos diabeteses és az atherosclerosisos nem diabeteses csoportban, a kontroll csoporthoz viszonyítva. A vizsgálat során a kitűzött célokat elértük, minden csoportban sikerült pozitív összefüggéseket kimutatni. Kimutattuk, hogy az eNOS Glu298Asp mutáns TT variáns esetén szignifikánsabban gyakoribb a myocardialis infarctus a heterozigóta GT és normál GG genotípusú egyedekhez képest (TT alél: kontroll csoport 5,7%, MI csoport 16,9%, p<<0,001, OR: 4,56). Bebizonyosodott, hogy a mutáns MTHFR 677 CT heterozigóta variáns esetén a betegek közt magasabb az infarctus aránya (CT allél: kontroll csoport 32,%, MI csoport 55,1%, p<<0,001, OR: 4,13), és a homozigóta TT variáns esetén is szignifikáns a különbség (TT genotípus: kontroll csoport 10,9%, MI csoport 21,2%, p<<0,001, OR: 4,65). Vizsgálataink szerint a mutáns TNF-α AA genotípusuak közt szignifikánsan magasabb a cardiovascularis események kialakulásának valószínűsége (AA allél: kontroll csoport 1,6%, MI csoport 10,7%, p<0,005, OR: 8,17). Következtetés: Hosszú távon megfontolandó a veszélyeztetett, családilag terhelt anamnézisű rizikócsoportok szűrése, – egy betegség vagy arra való hajlam korai felfedezése esetén a megelőzés és gyógyítás sokkal jobb eredményekkel kecsegtet. Az atherosclerosis gyulladásos mechanizmusainak megismerése újabb terápiás célpontokat biztosít a farmakológusok számára.

74

Summary

The development of the atherosclerosis is a multifactorial process. Except for the classical risk factors of the atherosclerosis (hypertension, lipid-metabolic disorders, diabetes, smoking) the clinical signs can be influenced by the genetic variants (polymorphisms) of the enzymes which are responsible for the endothelial cells function and for the thrombotic factors. The purpose of the study was to examine three genetic polymorphisms playing a role in the metabolic processes. In this examination 992 patients’ data was analysed. We compared the data of 348 atherosclerotical non-diabetic patients and 260 atherosclerotic diabetic patients treated at the Cardiovascular Department of the Semmelweis University during a oneand-half-year period with the 384 healthy control samples. We analysed the frequency of myocardial infarction and stroke in the case of different polymorphisms in the atherosclerotic non-diabetic and atherosclerotic diabetic group, and it was compared to the healthy group. In this examination the planed aim was reached, positive correlations were proved in every group. It was verified that the lipid (LDL) level is higher in patients who underwent myocardial infarction than those without infarction (4,2 vs 2,7, p<0,05). It was also proved if the mutant TT eNOS Glu298ASP variant is present, the myocardial infarction is significantly higher than with patients carrying heterozygote GT and normal GG genotype (TT genotype: control group 5,7%, MI group 16,9%, p<<0,001, OR: 4,56). We proved that with mutant MTHFR 677CT heterozygote variant, the occurrence of myocardial infarction is significantly higher (CT allele: control group 32%, MI group 55,1%, p<<0,001, OR: 4,13) and in the relation of the 677TT homozygote variant the difference is also significant (TT variant: control group 10,9% MI group 21,2% p<<0,001, OR: 4,65). It was verified that among patients with the mutant TNF-α AA genotype the occurrence of cardiovascular events is significantly higher (AA allele: control group 1, 6%, MI group 10,7%, p<0,005, OR: 8,17). Screening the endangered or genetically high risk groups is to be considered on the long run - an early detection of a susceptibility of the disease gives better chances for prevention and treatment. Understanding the inflammatory mechanisms of the atherosclerosis gives new therapeutical targets to pharmacologists.

75

Irodalomjegyzék:

Ablij H.C, Meinders A.E.: C-reactive protein: history and revival. Eur. J. Int. Med. 2002: 13, 412-422 Acsády Gy., Nemes A.: Az érsebészet tankönyve. Medicina Budapest 2001 Alvarez R., Gonzalez P., Batalla A., Reguero J.R., Iglesias-Cubero G., Hevia S., Cortina A., Merino E., Gonzalez I., Alvarez V., Coto E.: Association between the NOS3 (-786 T/C) and the ACE (I/D) DNA genotypes and early coronary artery disease. Nitric Oxide, 2001: 5, 343–348 Ascer E, Bertolami M., Venturinelli M., Buccheri V., Souza J., Nicolau J., Ramires J.A., Serrano C.: Atorvastatin reduces proinflammatory markers in hypercholesterolemic patients. Atherosclerosis, 2004: 177, 161-166 Attie A., Kastlein J., Hayden M.: Pivotal role of ABCA1 in reverse cholesterol transport infulencing HDL levels and susceptibility to atherosclerosis. J. Lipid R. 2001: 42, 1717-1726 Ballantyne Ch., Nambi V.: Markers of inflammation and their clinical significance. Atherosclerosis, Supplements 2005: 6, 21-29 Berliner J., Navab M., Fogelman A., Frank J., Demer L., Edwads P.: Atherosclerosis: Basic mechanisms. Oxidation, inflammation and genetics. Circulation, 1995: 91(9), .2488-2496 Blanke G., Ridker P.: Inflammatory mechanisms in atherosclerosis: from laboratory evidence to clinical application. Ital Heart J., 2001: 2(11), 796-800 Boerwinkle E., Elsworth D.L., Hallman D.M., Biddinger A.: Genetic analysis of atherosclerosis: a research paradigm for the common disease. Hum Mol Genet., 1996: 5, 1405-1410 Bova I., Chapman J., Sylantiev C., Korczyn A.D., Bornstein N.M.: The A677V methylenetetrahydrofolate

reductase

gene

polymorphism

and

carotid

atherosclerosis. Stroke, 1999: 30, 2180-2182 Cai H., Wilcken D.E, Wang XL.: The Glu-298—>Asp (894G—>T) mutation at exon 7 of the endothelial nitric oxide synthase gene and coronary artery disease. J. Mol. Med., 1999: 77, 511–514

76

Cattaruzza M., Guzik T., Slodowski W., Pelvan A., Becker J., Halle M., Buchwald A., Channon K., Hecker M.: Shear stress intensivity of endothelial nitric oxid synthase expression as a genetic risk factor for coronary heart disease. Circ Res., 2004: 95, 841-847 Chapman C., Beilby J., Humphries S., Palmer L., Thomson P., Hung J.: Association o fan allelic variant of interleukin-6 with subclinical carotid atherosclerosis in an Australian community population. Eur. Heart J., 2003: 24, 1494-1499 Cipollone F., Fazie M., Iezzi A., Pini B., Cuccurullo C., Zucchelli M., de Cesare D., Ucchino S., Spigonardo F., de Luca M., Muraro R., Bei R., Bucci M., Cuccurullo F., Mezzetti A.: Blockade of the angiotensine II type 1 receptor stabilizes atherosclerotic plaques in humans by inhibiting prostaglandin E2dependent mátrix metalloproteinase activity. Circulation, 2003: 109, 1482-1488 Clee S., Zwinderman A., Engert J., Zwarts K., Molhuizen H., Roomp K., Jukema W., Wijland M., Dam M., Hudson T., Brooks-Wilson A., Genest J., Kastelein J., Hayden M.: Common genetic variation in ABCA1 is associated with altered lipoprotein levels and a modified risk for coronary artery disease. Circulation, 2001: 103, 1198-1205 Colombo M.G., Paradossi U., Andreassi M.G., Botto N., Manfredi S., Masetti S, Biagini A, Clerico A.: Endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms and risk of coronary artery disease. Clin. Chem., 2003: 49, 389–395 Corti R., Fuster V., Badimon J.J.: Pathogenic concepts of acute coronary syndrome. J. Am. Coll. Cardiol., 2003: 41, 7-14 Corti R., Hutter R., Badimon J.J., Fuster V.: Envolving concepts int he triad of atherosclerosis, inflammation and thrombosis. J. Thromb. Thrombolysis, 2004: 17(1), 35-44 Dalziel B., Gosby A., Richman R., Bryson J., Caterson I.: Association of the TNF-α (-308 G/A) promoter polymorphism with insulin resistance in obesity. Obes. Res., 2002: 10(5) 401-407 Davignon J., Ganz P.: Role of endothelial dysfunction in atherosclerosis. Circulation, 2004: 109, 27-3.

77

DeGraba

T.J.:

Immunogenetic

susceptibility of

atherosclerotic

stroke:

implications on current and future treatment of vascular inflammation. Stroke, 2004: 35, 2712-2719 Dinh T., Scovell S., Veves A.: periferial arterial disease and diabetes:clinical update. Int. J. Low. Extr. Wounds, 2009: 8(2), 75-81 Donelly R., Emlie-Smith A., Gardner I., Morris A.: Vascular complication of diabetes BMJ, 2000: 320(7241), 1062-1066 Eicher J., Dunn S.T., Perveen G., Thompson D., Stewart K.,Stroehla B.: Apolipoprotein E polymorphisms and cardiovascular disease: A HuGE Review. Am. J. Epidemiol., 2002: 155(6), 487-495 Elkind M.S, Cheng J, Boden-Albala B. Rundek T., Thomas J., Chen H., Rabbani LE., SaccoRL.: Tumor necrosis factor receptor levels are associated with carotid atherosclerosis. Stroke, 2002: 33, 31-38. Fernandez-Real J.M, Gutierrez C, Ricart W, Casamitjana R., FernandezCastaner M., Vendrell J., Richart C., Soler J.: The TNF-alpha gene Nco I polymorphism influences the relationship among insulin resistance, percent body fat, and increased serum leptin levels. Diabetes, 1997: 46(9), 2096-2098 Fiotti N., Giansante C., Ponte E., Delbello C., Calabrese S., Zacchi T., Dobrina A., Guarnieri G.: Atherosclerosis and inflammation. Patterns of cytokine regulation in patients with periferial arterial disease. Atherosclerosis, 1999: 145, 51-60 Gardner M., Palmer J., Manrique C., Lestra G., Gardner DW., Sower J.R.: Utility of aspirin therapy in patients with the cardiometabolic syndrom and diabetes. J. Cardiometab. Syndr., 2009: 4(2), 96-101 Geisler T., Bhatt D.L.: The role of inflammation in atherosclerosis: current and future strategies of medical treatment. Med. Sci. Monit., 2004: 10(12), 308-316 Genest J., Cohn J.: Clustering of cardiovascular risk factors: Targeting high-risk individuals. Am. J. Cardiol, 1995: 76, 8-20 Giese N., Marijianowski M., McCook O., Hancock A., Ramakrishnan V., Fretto L., Chen C., Kelly A., Koziol J., Wilcox J., Hanson S.: The role of alpha and beta platlet-derived growth factor in the vascular response to injury in nonhuman primates. Atheroscler, Thromb, Vasc, Biol., 1999: 19, 900-909

78

Gonzalez P., Diez-Juan A., Coto E., Alvarez V., reguero J., Batalla A., Andres V.: A singe nucleotide polymorphism in the human p27kipI gene (-838C>A) affects basal promoter activity and risk of myocardial infaction. BMC Biology, 2004: 2(5), 1-6 Goodwin B.L., Pendleton L.C., Levy M.M., Solomonson L.P., Eichler D.C.: Tumor necrosis factor- α reduces argininosuccinate synthase expression and nitrix oxide production in aortic endothelial cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 2007: 293, 1115-1121. Halliday A., Mansfield A., Marro J., Peto C., Peto R., Potter J., Thomas D.: MRC Asymptomatic Carotid Surgery Trial (ACST) Collaborative Group.: Prevention of disabling and fatal strokes by successful carotid endarterectomy in patients without recent neurological symptoms: randomisad controlled trial. Lancet, 2004: 363, 1491-1502 Hegymegi-Barakonyi B., Erős D., Szántai-Kis Cs., Breza N., Bánhegyi P., Szabó G.V., Várkondi E., Peták I., Őrfi L., Kéri Gy.: Tyrosine kinase inhibitors –Small molecular weight compouds inhibiting EGFR. Cur. Op. Mol. Ther., 2009: 11(3), 308-321 Herrmann S.M., Ricard S., Nicaud V., Arveiler D., Evans A, Ruidavets J.B., Luc G., Bara l., Parra H.J., Poirier O., Cambien F.: Polymorphisms of the tumour necrosis factir- α gene, coronary heart diseases and obesity. Eur J Clin Invest, 1988: 92, 14-8 Hibi K., Ishigami T., Tamura K., Mizushima S., Nyui N., Fujita T., Ochiai H., Kosuge M., Watanabe Y., Yoshii Y., Kihara M., Kimura K., Ishii M., Umemura S.: Endothelial nitric oxide synthase gene polymorphism and acute myocardial infarction. Hypertension, 1998: 32, 521–526 Hingorani A., Liang Ch., Fatibene J., Monteith S., Parsons A., Haydock S., Hopper R., Stephens N.: A common variant of the endothelial nitric oxid synthase (Glu298-Asp) is a major risk factor for coronary artery disease in the UK. Circulation, 1999: 100, 1515-1520 Hosszúfalusi N.: A hyperglycaemia szerepe a diabetes mellitus késői szövődményeinek kialakulásában. LAM, 2000: 10(1), 40-48

79

Hotamisligil G.: Inflammation and metabolic disorders. Nature, 2006: 444(14), 860-867 Huysman E., Mathieu C.: Diabetes and periferial vascular disease. Acta Chir Belg., 2009: 109(5), 587-594 Inamoto N., Katsuya T., Kokubo Y., Mannami T., Asai T., Baba S., Ogata J., Tomoike H., Ogihara T.: Association of methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphism with carotid atherosclerosis depending on smoking status in a Japanese general population. Stroke, 2003: 34, 1628–1633 Jaeger B.R., Labarrrere C.A.: Fibrinogen und atherothrombose: vulnerable plaque oder vulnerabler patient? Herz, 2003: 28, 530-538 Jeerooburkhan N., Jones L.C., Bujac S., Cooper J.A., Miller G.J., Vallance P., Humphries S.E., Hingorani A.D.: Genetic and environmental determinants of plasma nitrogen oxides and risk of ischemic heart disease. Hypertension, 2001: 38, 1054–1061 Jermendi Gy.: Diabetes mellitus és az artérias érbetegségek. Hippocrates, 2001: 3(5), 319-314 Jerrard-Dunne P., Markus H.S., Steckel D.A., Buehler A., von Kegler S., Sitzer M.: Early carotid atherosclerosis and family history of vascular disease: specific effects on arterial sites have implications for genetic studies. Arterioscler Thromb Vasc Biol., 2003: 23, 302-306 Jilma B., Marsik C., Kovar F., Wagner O., Endler G.: The single nucleotide polymorphisms Ser128Arg in the E-selectin gene is associated with enhanced coagulation during human endotoxemia. Blood, 2005: 15;105(6), 2380-2383 JuanCasas P., Bautista L.E., Humphries S.E., Hingorani A.D.: Endothelial Nitric Oxide Synthase Genotype and Ischemic Heart Disease. Circulation, 2004: 109, 1359-1365 Kannel W., D’Agostino R., Belanger A.: Fibrinogen, cigarette smoking and risk of cardiovascular disease: Insights from the Framingham study. Am. Heart J., 1987: 113(4), 1006-1010 Kéri Gy., Őrfi L., Erős D., Hegymegi-Barakonyi B., Szántai-Kis Cs., Horváth Z., Wáczek F., Marosfalvi J., Szabadkai I., Pató J., Greff Z., Hafenbradl D., Daub H., Müller G., Klebl B., Ullrich A.: Signal Transduction Therapy with

80

Rationally Designed Kinase Inhibitors. Curr. Sign. Transduct. Ther., 2006: 1, 67-95 Khan Q., Metha J.L.: Relevance of platalet independent effects of aspirin to its salutary effect in atherosclerosis-related events. J. Atheroscler. Thromb., 2005: 12, 185-190 Kimura K., Haschiguchi T., Deguchi T., Horinouchi S., Uto T., Oku H., Setoyama S., Maruyama I., Osame M., Arimura K.: Serum VEGF-As a prognostic factor of atherosclerosis. Atherosclerosis, 2007: 194(1), 182-188 Kukherjee D.: Periferial and cerebrovascular atherosclerotic disease in diabetes mellitus. Best. Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab., 2009: 23(3), 335-345 Lange L., Bowden D., Langefeld C., Wagenknecht L., Carr J., Rich S., Riley W., Freedman B.: Heretability of carotid artery intima-medial thickness in type 2 Diabetes. Stroke, 2002: 33, 1876-1881 Libby P., Ridker P.M., Maseri A.: Inflammation and Atherosclerosis. Circulation, 2002: 105, 1135-1143 Libby P.: Inflammation in Atherosclerosis. Nature, 2002: 20, 868-874 Libby P.: Molecular bases of the acute coronary syndromes. Circulation, 1995: 91, 2844-2850 Lieb W., Pavlik R., Erdmann J., Mayer B., Holmer S., Fischer M., Baessler A., Hengstenberg C., Loewel H., Doering A., Riegger G., Schunkert H.: No association of interleukin-6 gene polymorphism (-174 G/C) with myocardial infaction or traditional cardiovascular risk factors. Int. J. Cardiol., 2004: 97, 205212 Lobstein J.F.: Traité d’anatomie pathologique, Levrault, Paris 1883 Lombardo A., Biasucci L.M., Lanza G.A., Coli S., at all: Inflammation as a possibile link between coronary and carotid plaque instability. Circulation, 2004, 109, 3158-3163 Lusis A.: Atherosclerosis. Nature, 2000: 407(14), 233-241 Ma K., Cilingiroglu M., Otvos J, Ballantyne C., Marian A., Chan L.: Endothelial lipase is a major genetic determinant for high-density lipoprotein concentration, structure and metabolism. PNAS, 2003: 4; 100(5), 2748-2753 Magyar I., Petrányi Gy: A belgyógyászat alapvonalai. Medicina Budapest, 1986

81

Marroni A.S., Metzger I.F., Souza-Costa D.C., Nagassaki S., Sandrim V.C., Correa R.X., Rios-Santos F., Tanus-Santos J.E.: Consistent interethnic differences in the distribution of clinically relevant endothelial nitric oxide synthase genetic polymorphisms. Nitric Oxide, 2005: 12, 177–182 Mason J.C.: Statins and their role in vascular protection. Clin. Sci., 2003: 105, 251-266 Maxfield F., Tabas I.: Role of cholesterol and lipid organisation in disease. Nature, 2005: 438(1), 612-621 Mazza A., Giugliano D., Motti C., Cortese C., Andreotti F., Marra G., Nulli A.: Glycemia, MTHFR genotype and low homocysteine in uncomplicated type 2 diabetic patients. Atherosclerosis, 2000a: 149, 223–224 Mazza A., Motti C., Nulli A., Marra G., Gnasso A., Pastore A., Federici G., Cortese C.: Lack of association between carotid intima-media thickness and methylenetetrahydrofolate reductase gene polymorphism or serum homocysteine in non-insulin-dependent diabetes mellitus. Metabolism, 2000b: 1949, 718–723 McGeachie M., Ramoni R.B., Mychaleckyj J., DPhil M., Furie K., Dreyfuss J., Liu Y., Herrington D., Guo X., Lima J., Post W., Rotter J., Rich S., Sale M., Ramoni M.: Integrative predictive model of coronary artery calcification in atheroscerosis. Circulation, 2009: 120, 2448-2454 Medzhitov R.: Origin and physiological roles of imflammation. Nature 2008: 454 (7203), 428-435 Meskó É.: A peripherias obliterativ arteriosclerosis gyógyszeres kezelése. Gyógyszereink, 1997: 47, 161-167 Meskó É. Szollár L.: Az arteriosclerosis kórélettana. In: Meskó É., Farsang Cs., Pécsvárady Zs. (szerk): Belgyógyászati angiologia. Medintel Könyvkiadó, 1999, 55-67 Miwa Y., Takiuchi S., Kamide K., Yosii M., Horio T., Tanaka C., Banno M., Miyata T., Sasaguri T., Kawano Y.: Identification of gene polymorphisms in lipocalin-type prostaglandin D synthase and its association with carotid atherosclerosis in Japanese hypertensive patients. Biochem. Biophys. Res. Comm., 2004: 322, 428-433

82

Monraats P.S., Pires N.M.M., Schepers A., Agema W., Boesten L., Vries M., Zwinderman A., de Maat M., Doevendans P., Winter R., Tio R., Waltenberger J., Hart L., Frants R., Quax P., Vlijmen B., Havekes L., Laarse A., Wall E., Jukema W.: Tumor necrosis factor- α plays and important role in restenosis development The FASEB J., 2005: 19, 1998-2004 Moore D.J., Gregory J.M., Kumah-Crystal Y.A., Simmons J.H.: Mitigating micro-and macro-vascular complications of diabetes beginning in adolescence Vasc Health Risk Manag., 2009: 5, 1015-1031 Mullenix P.S, Andersen C.A, Starnes B.W. :Atherosclerosis as Inflammation. Ann. Vasc. Surg., 2005: l9(1), 130-138 Murtagh B., Anderson V.: Inflammation and atherosclerosis in acute coronary syndromes. J. Inv. Cardiol., 2004: 16(7), 377-384 Nakayama T., Soma M., Sato N., Haketa A., Kosuge K., Aoi N., Sato M., Izumi Y., Matsumoto K., Kanmatsuse K., Kokubun S.: An association study in essentioal hypertension using functional polymorphisms in lymphotoxin-α gene. AJH, 2004: 17, 1045-1049 Nieszner É., Baranyi É., Préda I.: A szulfanilureák cardiovascularis hatásai. LAM, 2007: 17(2), 123-127 Nieszner É., Bárdos P., Baranyi É., Préda I.: A diabetes mellitus cardiovascularis szövődményei és diagnózisuk. LAM, 2005: 15(10), 722-729 Ohsozu F.: The roles of cytokines, inflammation and immunity in vascular diseases. Atheroscler. Thromb., 2004: 11, 313-321 Pados Gy.: Új módszertani levél a cukorbetegség kórismézésére. LAM, 2002: 12(6-7), 372-377 Pallaud C., Sass C., Zannad F., Siest G., Visvikis S.: APOC3, CETP, fibrinogen, and MTHFR are genetic determinants of carotid intima-media thickness in healthy men (the Stanislas cohort). Clin. Genet., 2001: 59, 316–324 Paoletti R., Gotto A., Phil D., Hajjar D.: Inflammation in atherosclerosis and implications for therapy. Circulation, 2004: 109(3), 20-26 Páramo J., Beloqui O., Diez J.: Atherosclerosis: It is time for a new name? (ISAD) Circulation, 2001: 104, 38

83

Passaro A., Vanini A., Calzoni F., Alberti L., Zamboni P.F., Fellin R., Solini A.: Plasma homocysteine, methylenetetrahydrofolate reductase mutation and carotid damage in elderly healthy women. Atherosclerosis, 2001: 157, 175–180 PerUeland P., Refsum H., Beresford S., Vollset S.E.: The controversy over homocysteine and cardiovascular risk. Am. J. Clin. Nutr., 2000: 72, 324-332 Raines E.: PDGF and cardiovascular disease. Cytok. Growth Factor Rew., 2004: 15, 237-254 Randi M., Biguzzi E., Falciani F., Merlini P., Bramucci E., Lucreziotti S., Lennon M., Faioni M., Ardissino D., Manicci P.M.: Identification of differentially expressed genes in coronary atherosclerotic plaques from patients with stable or unstable angina by cDNA array analysis. J. Thromb. Haemost., 2002: 1, 829-835 Reaven G.M: The role of insulin resistance in human disease. Diabetes, 1988: 37, 1595-1607 Refsum H., PUeland M., Nygard O., Vollset S.E.: Homocysteine and cardiovascular disease. Ann. Rev. Med., 1998; 49, 31–62 Ridker P., Rifai N., Pfeffer M., Sacks F., Lepage S., Braunwald E: Elevation of tumor necrosis factor-alfa, and increased risk of recurrent coronary events after myocardial infarction. Circulation, 2000: 101, 2149-2153 Ridker P.M.: High-Sensity C-reactive Protein. Potential adjust for global risk assessement in primary prevention of cardiovascular disease. Circulation, 2001: 103, 1813-1818 Ross R.: Atherosclerosis - an inflammatory disease. N. Engl. J. Med., 1999: 340, 115-126 Ross R.: The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature, 1993: 362, 801–809 Rossi G.P., Cesari M., Zanchetta M., Colonna S., Maiolino G., Pedon L., Cavallin M., Maiolino P., Pessina A.C.: The T-786C endothelial nitric oxide synthase genotype is a novel risk factor for coronary artery disease in Caucasian patients of the GENICA study. J. Am. Coll. Cardiol., 2003: 41, 930–937 Sanz J., Fayad Z.: Inaging of atherosclerotic cardiovascular disease. Nature, 2008: 451(21), 953-957

84

Sawabe M., Arai T., Kasahara I., Esaki Y., Nakahara K., Hosoi T., Orimo H., Takubo K., Murayama S., Tanara N.: Development geriatric autopsy database and internet-based database of Japanese single nucleotide polymorphisms for geriatric research (JG-SNP). Mech.of Ag. Dev., 2004:125, 547-552 Selhub J., Jacques P.F., Bostom A.G., D Agostino R.B., Wilson P.W., Belanger A.J., O Leary D.H, Wolf P.A., Schaefer E.J., Rosenberg I.H.: Association between plasma homocysteine concentrations and extracranial carotid-artery stenosis. N. Engl. J. Med., 1995: 332, 286–291 Shah P.: Role of infalammation and metalloproteinases in plaque disruption and thrombosis. Vasc. Med., 1998: 3, 199-206 Shibuya M.: Vascular endothelial growth factor receptor-1 (VEGEFR-’/Flt-1): a dual regulator for angiogenesis. Angiogenesis, 2006: 9, 225-230 Spronk H., Voort

D., Cate H.: Blood coagulation and the risk of

atherothrombosis:a complex relationship.Thromb. J., 2004:2, 12 Steinbuhl S., Moliterno D.J.: The role of the platelet in the pathogenesis of atherothrombosis. Am. J. Cardiovasc. Drugs, 2005: 5, 399-408 Stenvinkel P.: Endothelial dysfunction and inflammation – is there a link? Nephrol. Dial. Transplant., 2001: 16, 1968-1971 Stoll G., Bendzus M.: Inflammation and atherosclerosis: novel insights into plaque formation and destabilization. Stroke, 2006: 37, 1923-1932 Strattmann B., Tschoepe D.: Atherogenesis and atherothrombosis – focus on diabetes mellitus. Best. Pract. Rec. Clin. Endocrinol. Metab., 2009: 23(3), 291303 Suckling K.E.: From pathophysiology to targeted therapy for atherothrombosis: A role for the combination of statin and aspirin in secondary prevention. Pharmac. Therap., 2007: 113, 184-196 Szabó G.V., Kunstár A., Acsády Gy.: Methylentetrahydrofolate reductase and nitric oxid synthase polymorphysm in patients with atherosclerosis and diabetes. Pathol. Oncol. Res., 2009: 15, 631-637 Szalai Cs.: Atherosclerosis. Genetikai alapok. Jegyzet. 2009; 1-18 Szollár Lajos: Az anyagcsere kórélettena. In: Szollár Lajos (szerk) Kórélettan Semmelweis kiadó 2005: 160-245

85

Szollár Lajos: Az atherosclerosis. In: Szollár Lajos (szerk) Kórélettan Semmelweis kiadó 2005: 304-328 Tanus-Santos J.E., Desai M., Flockhart D.A.: Effects of ethnicity on the distribution

of

clinically

relevant

endothelial

nitric

oxide

variants.

Pharmacogenetics, 2001: 11, 719–725 Tedgui A.: The role of inflammation in atherothrombosis: implications for clinical practice. Vasc. Med., 2005: 10, 45-53 Topol E., McCarthy J., Gabriel S., Moliterno D., Rogers W., Newby K., Freedman M., Metiver J., Cannata R., O’Donnel C., Kotte-Marchant K., Murugesan G., Plow E., Stenina O., Daley G.:

Single nucleotide

polymorphysmes in multiple novel thrombospodin genes may be associated with familial premature myocardial infarction. Circulation, 2001: 104, 2641-2644 Vendrell J., Fernandez-Real JM., Gutierrez C., Gutierrez C., Zamora A., Simon I., Bardaji A., Ricart W., Richart C.: A polymorphysm in the promoter of the tumor necrosis facrtor-α gene (-308) is associated with coronary heart disease in type 2 diabetic patients. Atherosclerosis, 2003: 167, 257-264 Welt F.G.P., Rogers C.: Inflammation and restenosis in the stent era. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2002: 22, 1769-1776 Willerson J., Ridker P.: Inflammation as a cardiovascular risk factor. Circulation, 2004: 109, 2-10 Wilson A.G., Symons J.A., McDowell T.L., McDevitt H.: Effects of a polymorphism in the human tumor necrosis factor α promoter on transcriptional activation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997: 94, 3195-3199 Yang Z., Ming X.: Recent advances in understanding endothelial dysfunction in atherosclerosis. Clinical Medicine and Res., 2006: 4(1), 53-65 Zhang H., Chalothorn D., Jackson L.F., Lee D.C., Faber J.E.: Transactivation of epidermal growth factor receptor mediates catecholamine-induced growth of vascular smooth muscle. Circ. Res., 2004: 95, 989-997 Zhou X., Robertson A.K., Rudling M., Parani P., Hansson G.: Lesion development and response to immunisation reveal a complex role for CD4 in atherosclerosis. Circ. Res., 2005: 96, 427-434

86

Zuliani G., Volpato S., Mecocci P., Cherubini A.: The A677V MTHFR allele is not associated with carotid atherosclerosis in octogenarians. Stroke, 2000: 31, 990–991

87

Saját publikációk jegyzéke I. A dolgozat témájában megjelent közlemények: 1. Szabó G.V., Kunstár A., Acsády Gy.: Methylentetrahydrofolate reductase and nitric oxid synthase polymorphysm in patients with atherosclerosis and diabetes. Pathol. Oncol. Res., 2009: 15, 631-637 2. Szabó G.V., Acsády Gy.: Tumornecrosis-factor-α 308 GA Polymorphism in therosclerotic patients. Pathol. Oncol. Res., 2011: DOI:10.1007/s12253-0119393-8 3. Hegymegi-Barakonyi B., Erős D., Szántai-Kis Cs., Breza N., Bánhegyi P., Szabó G.V., Várkondi E., Peták I., Őrfi L., Kéri Gy.: Tyrosine kinase inhibitors Small molecular weight compouds inhibiting EGFR. Curr. Opin. Mol. Therap., 2009: 11(3), 308-321 II. A dolgozattól független közlemények: 1. Szabó G.V., Laczkó Á., Entz L.: Acut carotis műtétek angiomorphologiai indikációja Magyar Sebészet, 2001: 54(1), 7-10 2. Szabó G.V, Laczkó Á., Szeberin Z., Windisch M., Százados M., Kristóf V., Acsády Gy.: Anatomikus és extraanatomikus rekonstrukciók az artéria iliaca rendszer occlusiv betegségeiben. Magyar Sebészet, 2001: 54(6), 60-62 3. Acsády Gy., Laczkó Á., Szabó A., Szabó G.V, Szeberin Z., Gálfy I., Turbók E., Nemes A.: Az érsebészeti szövődmények kezelési lehetőségei. Magyar Sebészet, 2001: 54(6), 75-80 4. Laczkó Á., Szabó G.V, Szeberin Z., Nemes ., Bobek I., Kristóf V., Selmeci Z., Acsády Gy.: Érsebészeti és intervencionális radiologiai beavatkozások előkészítése trombolízis alkalmazásával. Magyar Sebészet, 2001: 54(6), 69-73 5. Szabó G.V., Laczkó Á., Acsády Gy., Nemes A.: Szekunder aorto-enteralis fistulák - 22 év anyaga és irodalmi áttekintés. Magyar.Sebészet, 2002: 55, 295300 6. Szabó G.V., Szeberin Z., Bíró G.: Jósló tünetek jelentősége a szekunder stroke prevenciójában. Háziorvosi.Továbbképző Szemle, 2006: 11, 678-682

88

7. Szeberin Z., Szabó A., Gősi G., Szabó G.V.: Kezelési határterületek heveny artériás kórképekben. Háziorvosi.Továbbképző.Szemle, 2006: 11, 688-694 8. Dzsinich Cs., Acsády Gy., Hüttl K., Bodor E., Szabó G.V., Szeberin Z., Windisch M.: New Opportunities in Treatment of Aortic Arch Aneurysms. Int. J. Angiol., 2006: 15(4), 1061-1711 9. Dzsinich Cs, Hüttl K., Bodor E., Nemes A., Bíró G., Szabó G.V., Szeberin Z., Bodor G., Windisch M., Gálfy I., Széphelyi K.: Hybrid megoldások az aortaív sebészetben. Magyar Sebészet, 2007: 60, 494-500 10. Szabó G.V., Szeberin Z., Bodor G., Kertai M., Bíró G., Dzsinich Cs.: Mortalitást befolyásoló peri- és postoperatív tényezők elemzése infrarenalis aorta aneurysmák esetén. Érbetegségek, 2007: 14(1), 4-6 11. Szeberin Z., Bíró G., Szabó G.V, Százados M., Nemes Balázs, Dzsinich Cs.: Aorto-bifemoralis graft készítése vena femoralis superficialisból. Érbetegségek, 2007: 14(1): 7-11 12. Dzsinich Cs., Acsády Gy., Hüttl K., Bíró G., Szabó G.V., Szeberin Z.: Thoracoabdominal endarterectomy in case of type B aortic dissection. Slovenska Chirurgia SK Chir., 2006: 22-26 13. Dzsinich Cs., Acsády Gy., Hüttl K., Bodor E., Szeberin Z., Szabó G.V., Windisch M.: New Approaches for the Treatment of Aortic Arch Aneurysms. Int. J. Angiol., 2007: 15, 151-157 14. Szabó G.V., Szeberin Z., Bíró G., Laczkó Á., Dzsinich Cs., Acsády Gy.: Bilateralis carotis aneurysma- esetismertetés. Magyar Sebészet, 2007: 60, 252256 15. Szeberin Z., Firneisz G., Bíró G., Szabó G.V., Sótonyi P., Windisch M., Krepuska M., Sípos F., Mihály E., Acsády Gy.: B típusú aorta dissectio sebészi kezelése kokaint használó beteg esetében. Orv. Hetil., 2009:150 (3), 129-131 III. Könyvfejezet: 1. Acsády Gy., Szabó G.V.: A hasi aorta és a medencei verőerek occlusiv betegségei. In: Acsády Gy, Nemes A.: Az érbetegségek klinikai és műtéttani atlasza, Medicina Könyvkiadó, Budapest 2005: 187-200

89

Köszönetnyilvánítás

A munka, melyen a fenti tézisek alapulnak, két intézetben zajlott. Egyrészt munkahelyemen, a Semmelweis Egyetem Érsebészeti Klinikáján, másrészt az Országos Onkológiai Intézet Pathogenetikai Osztályán. Köszönöm klinikánk igazgatójának és egyben témavezetőmnek, Dr. Acsády Györgynek, hogy elindított a kutatómunkában, lehetővé tette, hogy a mindennapi gyógyító munka mellett tudományos kutatást végezhessek. Köszönöm hathatós támogatását, iránymutató tanácsait. Köszönöm Dr. Kéri Györgynek, hogy Doktori programjában készíthettem el disszertációmat és munkámban oly hatékonyan támogatott. Köszönöm legjobb barátom és minden kollégám elméleti és gyakorlati tanácsait, segítségét a kutatói munkám során. Köszönöm az Érsebészeti Klinikánkon dolgozó minden nővér és ápoló segítségét a minták levételében, a betegek irányításában. Köszönöm Országos Onkológiai Intézet Pathogenetikai Osztályán dolgozó orvos és laboratóriumi kolléga munkáját és értékes támogatását. Külön köszönöm édesapám segítő bíztatását, nehézségeimen átlendítő jótanácsait, édesanyám, feleségem és gyermekeim türelmét, mellyel ezen hosszú munka mellett biztosították számomra a biztos hátteret. Nélkülük és a fentebb említett valamennyi munkatársam nélkül ez a munka nem jöhetett volna létre.

90