Genetikai polimorfizmusok szerepe a bronchopulmonális dysplasia és a perinatális tüdőkárosodás kialakulásában

Genetikai polimorfizmusok szerepe a bronchopulmonális dysplasia és a perinatális tüdőkárosodás kialakulásában

Doktori értekezés

Dr. Bokodi Géza Miklós

Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola

Témavezető:

Dr. Vásárhelyi Barna, tudományos főmunkatárs, Ph.D.

Hivatalos bírálók:

Dr. Hídvégi Edit, Ph.D. Dr. Klausz Gergely, Ph.D

Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Szalai Csaba, az MTA doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Hermann Róbert, tudományos főmunkatárs, Ph.D. Dr. Pós Zoltán, tudományos munkatárs, Ph.D.

Budapest 2007.

1. Tartalomjegyzék 1. Tartalomjegyzék

2

2. Rövidítések jegyzéke

5

3. Bevezetés

8

3.1. A bronchopulmonális dysplasia

8

3.2. A bronchopulmonális dysplasia definíciója

8

3.3. A bronchopulmonális dysplasia története, incidenciája, mortalitása

10

3.4. A bronchopulmonális dysplasia klinikai tünetei

11

3.5. A bronchopulmonális dysplasia radiológiai tünetei

11

3.6. A bronchopulmonális dysplasia szövettani jellemzői

14

3.7 A bronchopulmonális dysplasia típusai

16

3.8. A bronchopulmonális dysplasia kockázati tényezői és patomechanizmusa

17

3.8.1. Oxigénterápia és gépi lélegeztetés

19

3.8.2. A tüdőfejlődés és szabályozó tényezői.

21

3.8.3. A perinatális gyulladás

22

3.8.3.1. A gyulladás sejtes elemei

23

3.8.3.2. A gyulladás és az oxidatív stressz

23

3.8.3.3. A gyulladás szerepe a koraszülésben

23

3.8.3.4. A chorioamnionitis

24

3.8.3.5. A gyulladás szerepe a perinatális adaptáció zavaraiban

25

3.8.3.6. A perinatális gyulladásos reakció fázisai

25

3.8.4. A gyulladással kapcsolatos vizsgálataink

26

3.8.4.1. Az immunrendszer részei

26

3.8.4.2. Az újszülött immunrendszere

27

3.8.4,3. A neutrophil granulocyták, makrofágok és természetes ölősejtek

27

3.8.4.4. A citokinek általános jellemzői

29

3.8.4.5. Az általunk vizsgált citokinek

30

2

3.8.4.6. A renin angiotenzin aldosteron rendszer szerepe a gyulladásban

33

3.8.5. Táplálási ápolási tényezők

33

3.8.6. Örökletes, genetikai tényezők

34

3.8.6.1. Általános genetikai jellemzők

34

3.8.6.2. A genetikai polimorfizmusok

35

3.8.6.3. A bronchopulmonális dysplasia és a lélegeztetés iránti igény genetikai háttere közötti kapcsolat

36

3.8.6.4. A koraszülés és a chorioamnionitis genetikai háttere

38

3.8.6.5. A tüdőfejlődés genetikai háttere

41

3.8.6.6. A perinatális gyulladásos reakció genetikai háttere

44

3.8.6.7. Az általunk vizsgált gén polimorfizmusok

49

4. Célkitűzések

52

5. Betegek és módszerek

54

5.1 Betegek

54

5.2 Módszerek

57

5.2.1 DNS izolálás szűrőpapíros mintából

57

5.2.2 Molekuláris biológiai vizsgálatok

58

5.2.3. Statisztikai elemzés

67

6. Eredmények

72

6.1 A TNFα, IL-1β, IL-6 és IL-10 SNP-k és lélegeztetés

72

6.2. Az IFNγ és IL-12 SNP-k és lélegeztetés

73

6.3. Az ACE I/D és AT1R és lélegeztetés

76

7. Megbeszélés

78

7.1. A TNFα, IL-1β, IL-6 és IL-10 SNP-k és lélegeztetés

78

7.2. Az IFNγ és IL-12 SNP-k és lélegeztetés

79

7.3. Az ACE I/D és AT1R génpolimorfizmusok és lélegeztetés

82

7.4. Az általunk feltárt új összefüggések a perinatális lélegeztetési igény és a BPD genetikájában

82

8. Tézisek

85

3

9. Összefoglalás

86

10. Summary

87

11. Táblázatok és ábrák jegyzéke

88

12. Irodalomjegyzék

89

13. Saját publikációk jegyzéke

104

14. Köszönetnyilvánítás

106

15. Saját publikációk különlenyomata

108

4

2. Rövidítések jegyzéke ACE

angiotenzin konvertáló enzim

APC

antigén prezentáló sejt

ARF

akut veseelégtelenség

AT

angiotenzin

AT1R

1-es típusú angiotenzin receptor

bp

bázispár

BPD

bronchopulmonális dysplasia

BMP-4

bone morphogenetic protein-4

CD

klaszter differentációs antigén

CF

keringési elégtelenség

CI

konfidencia intervallum

CLD

krónikus tüdőbetegség

COX

ciklooxigenáz

CO2

széndioxid

CPAP

folyamatos pozitív légúti nyomás

CRP

C-reaktív protein

CRT

kapilláris újratelődési idő

DNS

dezoxiribonukleinsav

dNTP

dezoxi nukleotid-trifoszfát

ER

ösztrogénreceptor

FGF

fibroblast növekedésifaktor

FIRS

magzati gyulladásos válaszreakció szindróma

FRC

funkcionális reziduális kapacitás

GATA-6

transzkripciós faktor (GATA szekvenciához kötődik)

HLA

humán leukocyta antigén

HSP

hősokkfehérje

HW

Hardy-Weinberg

I/D

inzerció/deléció

IFN

interferon

IFNγ

interferon gamma

5

IL

interleukin

IL-1β

interleukin-1-béta

Il-1ra

interleukin-1 receptor agonista

IL-4RA

interleukin-4 receptor alfa lánc

IL-6

interleukin-6

IL-10

interleukin-10

IL-12

interleukin-12

iNOS

indukálható nitrogénmonoxid szintáz

IRDS

idiopathiás respirációs distressz-szidróma

IUGR

intrauterin növekedési retardáció

IVH

kamrai vérzés

JAK

Janus kináz

kB

kilobázis

kD

kilodalton

LAK

limfokin aktivált ölősejt

LBW

kis születési súlyú

LPS

lipopoliszacharid

LT

limfotoxin

M

mol/dm3

MAP

artériás középnyomás

MAS

mekónium-aspirációs szindróma

MBL

mannózkötő lektin

MHC

fő hisztokompatibilitási komplex

MMP

mátrix metalloproteináz

mRNS

messenger RNS

mtsai.

munkatársai

NCPAP

nazális CPAP

NEC

nekrotizáló enterocolitis

NF-κB

nukleáris faktor-kappa-B

NICU

újszülött intenzív osztály

NK

természetes ölősejt

NO

nitrogén monoxid

6

NOD

nukleáris oligomerizációs domén

NOS

nitrogénmonoxid szintáz

OR

esélyhányados

PCR

polimeráz láncreakció

PDA

nyitott Botallo-vezeték

PE

praeeclampsia

PPHN

újszülöttek perzisztáló pulmonáris hipertóniája

PPV

pozitív nyomású lélegeztetés

RAAS

renin-angiotenzin-aldoszteron rendszer

RFLP

restrikciós fragment hossz polimorfizmus

RDS

respirációs distressz-szindróma

rpm

fordulat másodpercenként

RSV

respiratory syncytial vírus

SNP

egy nukleotidot érintő polimorfizmus

SPA

surfactant protein A

SPB

surfactant protein B

SPC

surfactant protein C

SPD

surfactant protein D

TGFβ

transzformáló növekedésifaktor-béta

Th

T helper lymphocyta

TLC

teljes tüdőkapacitás

TLR

toll-like receptor

TNFα

tumor nekrózis faktor-alfa

TV

légzéstérfogat

U

egység

UTR

nem átíródó régió

UV

ultraibolya

VEGF

vaszkuláris endotheliális növekedési faktor

VEGFR

vaszkuláris endotheliális növekedési faktor receptor

VLBW

igen kis születési súlyú

v/v%

térfogatszázalék

7

3. Bevezetés 3.1. A bronchopulmonális dysplasia A Bronchopulmonális dysplasia (BPD), a koraszülöttek krónikus tüdőbetegsége (CLD) jelentősen hozzájárul a koraszülött populáció morbiditásához és mortalitásához (1,2). A neonatológiai terápiás eljárások fejlődésével egyre éretlenebb újszülöttek maradnak életben, ezzel párhuzamosan emelkedett a BPD előfordulása a nagyon éretlen koraszülött populációban (1-4). A BPD krónikus betegség, egész életük során végigkíséri az érintett koraszülötteket. A csökkent légzésfunkció, perzisztáló légúti tünetek, gyakori és súlyos légúti infekciók miatt jelentősen romlik a betegek életminősége. A gyakran szükségessé váló kórházi kezelések illetve az egész életet végigkísérő gyógyszerfogyasztás súlyos terhet jelent az egészségügyi rendszer számára (1,5,6). Ezért nagy jelentőségű a betegség megelőzése, a BPD kialakulása szempontjából fokozott kockázatú betegek kiszűrése és célzott kezelése. Bár számos tényezőről igazolták, hogy hozzájárul a BPD kialakulásához, a veszélyeztetett betegek azonosítása egyelőre nem megoldott. Egyre nagyobb szerepet tulajdonítanak az örökletes hajlamnak a betegség kialakulásában (4-10). Bár a BPD kockázatát fokozó genetikai polimorfizmusoknak önmagukban csekély a prediktív értékük, kombinált alkalmazásuk, pl. DNS chip technika segítségével, lehetőséget teremthet a veszélyeztetett betegek azonosítására és személyre szabott kezelésére. 3.2. A bronchopulmonális dysplasia definíciója A BPD definíciója többször változott az elmúlt években. Kezdetben a diagnózis a posztmenstruációs kor és az oxigénfüggőség mellett a betegségre jellemző klinikai és radiológiai jeleken alapult (1-4,12). Utóbbiak azonban a betegség karakterisztikájának a változásával együtt változtak, objektív meghatározásuk körülményes. A BPD jelenlegi definíciója több konszenzus-konferencia, illetve klinikai vizsgálat eredményén alapul. A koraszülötteket két csoportra osztják gesztációs kor szerint és ezekben más-más kritériumok alapján döntik el azt, hogy fennáll-e BPD (1. táblázat) (1-3). A 32. gesztációs hét előtt született gyermekek esetén BPD-ről akkor beszélünk, ha a 36. posztmenstruációs héten, vagy a gyermek otthonába bocsátásakor (attól függően, hogy

8

melyik következik be előbb) még mindig oxigéntámogatásra szorul a gyermek. A 32. vagy nagyobb gesztációs hétre születettek esetén akkor beszélünk BPD-ről, ha a gyermek az 56. életnapon, vagy otthonába bocsátásakor, (attól függően, hogy melyik következik be előbb) még mindig oxigén adására szorul. Mindkét csoportban a betegség megállapításának feltétele a legalább 28 napig tartó, 21 %-nál magasabb oxigénkoncentrációval történő kezelés. (A BPD feltétele a parenchymás tüdőkárosodás, illetve az emiatt fokozott légzéstámogatás iránti igény. Akut légzési elégtelenség miatt, vagy más okból (pl.centrális apnoe, diafragma paralízis) kialakuló légzéstámogatási igény a definícióban szereplő időpontban nem jelent BPD-t.) Az oxigénfüggés mértéke alapján a betegséget 3 súlyossági csoportra osztják: Enyhe BPD esetén a definícióban meghatározott időpontban a beteg 21% oxigéntartalmú levegőt igényel. Középsúlyos BPD esetén a levegőben a szükséges oxigéntartalom 2229%. Súlyos BPD esetén a beteg szaturációja csak akkor kielégítő, ha az oxigénkoncentráció ≥30% vagy a megfelelő oxigenizáció biztosításához pozitív nyomás (pozitív nyomású lélegeztetés (PPV) vagy nazális folyamatos pozitív légúti nyomás (NCPAP)) szükséges. (Az, hogy mi tekinthető megfelelő oxigénszaturációnak, jelenleg még vita tárgyát képezi.). Bár a definíció nem tartalmazza a betegségre jellemző klinikai, illetve radiológiai jeleket, ezek segítik a BPD diagnózisának biztos felállítását (1-3,16).

9

1. táblázat: a bronchopulmonális dysplasia definíciója (1) A BPD definíciója Legalább 28 napig tartó 21%-nál magasabb oxigénkoncentrációval történő kezelés krónikus tüdőkárosodás Gesztációs kor születéskor

<32 hét

≥32 hét

36. posztmenstruációs hét

56. életnap

BPD meghatározás ideje vagy otthonába bocsátás Enyhe BPD

21% oxigén koncentráció

Középsúlyos BPD

22-29% oxigén koncentráció

Súlyos BPD

≥30% oxigén koncentráció vagy PPV/NCPAP

3.3. A bronchopulmonális dysplasia története, incidenciája, mortalitása A bronchopulmonális dysplasiát először Northway és munkatársai írták le 1967-ben (11). A betegséget olyan koraszülöttekben figyelték meg, akiket valamilyen tüdőt érintő betegség, legtöbbször idiopátiás respirációs distressz-szindróma (IRDS) miatt hosszú ideig lélegeztettek géppel, vagy kezeltek oxigénnel, és akikben emiatt krónikus tüdőkárosodás alakult ki (1-3). A neonatológiai terápiás eljárások korszerűsödése: az antenatális szteroidprofilaxis bevezetése, a surfactant kezelés, az új, kíméletesebb lélegeztetési stratégiák, a nyitott Botallo-vezeték (PDA) korai és hatékony kezelése, a korszerű táplálás és egyéb terápiás eljárások megjelenése miatt az IRDS-ben szenvedő újszülöttek életminősége és esélyei jelentősen javultak az elmúlt 40 évben (1). Ugyanakkor a BPD incidenciája nem változott (1). Ennek magyarázata az lehet, hogy bár a neonatológia fejlődésével a hagyományosan a BPD hátterében álló, tüdőt érintő perinatális betegségek prevalenciája csökkent, ugyanakkor egyre kisebb súlyú, egyre

10

éretlenebb újszülöttek tarthatók életben, akik között egy „új-típusú” BPD jelent meg, amit nem előz meg más tüdőbetegség (1-4). A betegséget kísérő szövettani elváltozások sokkal enyhébbek, illetve a kialakulásában a tüdőfejlődési zavar dominál. Ezért a BPD továbbra is az igen kis születési súlyú (VLBW) koraszülött populáció jelentős hányadát – 20-30%-át – fenyegeti. Mortalitása is magas, a BPD súlyosságától és a gesztációs kortól függ, súlyos BPD-ben 20-40% (1,2). 3.4. A bronchopulmonális dysplasia klinikai tünetei A BPD-t klinikailag az elhúzódó légzéstámogatási igény, elsősorban oxigén dependencia jellemzi. Az állapot súlyossága széles határok között mozoghat, a látszólagosan tünetmentes betegektől a tartós gépi lélegeztetést igénylőkig. A krónikus hypoxia miatt a fejlődés elmarad, perifériás cianózis, dobverőujj alakulhat ki. A növekedés és fejlődés elmaradásához hozzájárul a fokozott légzési munka miatt megnövekedett energiaigény is. „Mivel minden energiáját légzésre fordítja a gyermek, másra nem marad ereje.” (5,6) Ezzel magyarázható a táplálási nehezítettség is, ami tovább súlyosbítja a retardációt. A szomatikus elmaradások mellett idővel mentális visszamaradás

is

kialakul.

Ebben

nagy

szerepe

van

a

gyakori,

elhúzódó

hospitalizációnak is. A betegek a legyengült szervezet és a károsodott tüdő miatt fokozottan érzékenyek a fertőzésekre, hajlamosak a tüdőgyulladásra. A légzészavart a fertőzések és a szervezetet érő egyéb stresszhatások jelentősen fokozhatják. Ilyenkor még a látszólag panaszmentes gyermekek is rövid időn belül légzéstámogatásra, gyakran gépi lélegeztetésre szorulhatnak. Ezáltal egy önrontó kör alakulhat ki. Az állandó gyulladás tovább roncsolja a tüdőállományt, a beteg ezért egyre rosszabb állapotba kerül, miközben egyre fogékonyabb lesz a fertőzésekre. A betegek halálát is legtöbbször egy pneumoniás epizód okozza. A betegség előrehaladtával a tüdőkárosodás kihat a szívre is, pulmonális hipertónia alakul ki, ami végül akár jobb szívfél elégtelenségig (cor pulmonale) is fokozódhat (1-3). 3.5. A bronchopulmonális dysplasia radiológiai tünetei A mellkasröntgenen a BPD nagyon változatos eltérések formájában jelenhet meg. A BPD radiológiai diagnózisa nehéz, a klinikum ismerete nélkül nem is lehetséges, mivel

11

a BPD számos más betegség radiológiai tüneteit képes utánozni. Mégis a mellkasröntgen az egyetlen, BPD kimutatására alkalmas, széles körben elterjedt vizsgálati módszer (1-3). A tüdőgyógyászatban alkalmazott egyéb vizsgálatok, például a légzésfunkciós tesztek, csecsemőkorban nem kivitelezhetőek a beteg rossz kooperációja miatt. Radiológiailag a legtöbb betegséghez hasonlóan, a BPD-nek is négy stádiumát lehet elkülöníteni. A betegség kezdeti stádiumában csak diffúz mikroatelectasiák láthatók. A kép nagyon hasonlít az IRDS-re. A második stádiumban a lélegeztetési trauma miatt károsodnak az alveolusok, a növekvő atelectasiás területek mellett megjelennek a túllélegeztetett régiók, illetve a levegőszökési szindrómák jelei. Gyakoriak a pulmonális intersticiális emphysemák (PIE). A harmadik stádiumban tovább súlyosbodik a helyzet. Egyszerre találunk atelectasiás területeket és nagy cysticus emphysemás régiókat. Az elpusztult tüdőállomány helyén megjelennek a fibrotikus kötegek is. A negyedik stádiumban a tüdő jelentős része elpusztul. A roncstüdőre jellemző szabálytalan képet látunk volumenveszteséget okozó fibrotikus kötegekkel. A maradék tüdő túlfeszített, emphysemás jellegű. A hegesedések miatt nagy légtelen területek is láthatók. Ebben a stádiumban már az állandósult pulmonális hypertonia miatt a szív is károsodik, cardiomegalia alakul ki (1-3). I: Fátyolozott tüdő, diffúz retikulogranuláris rajzolat, elkülöníthetetlen az IRDS-től II:

Fokozódó

tejszerű

fátyolozottság,

elmosódott

szívkontúr,

atelectasias területek jelennek meg, interstitialis folyadékakkumuláció, levegő bronchogram, PIE III: Cysticus tüdőkép atelectasiákkal és emphysemás területekkel IV: súlyos tüdőfibrosis, kiterjedt emphysema, szálagos atelectasiás területek, inhomogén tüdő, durva kötegek, cardiomegalia

12

1. ábra: A bronchopulmonalis dysplasia röntgen képe

Az ábrán a BPD radiológiai stádiumait szemlélteti. Az első képen egy 30 napos gyermek kezdődő BPD-je látszik diffúz fátyolozottsággal. A második képen egy, két hónapos BPD-s gyermek röntgenképén már durvább dystelectasia látható. A harmadik képen egy négy hónapos BPD-s csecsemő mellkasröntgen felvétele látható, kifejezett emphysemas területekkel. A negyedik képen egy fél éves BPD-s gyermek mellkas röntgen felvételén durva fibrotikus kötegek, cardiomegália látható.

13

3.6. A bronchopulmonális dysplasia szövettani jellemzői A BPD szövettani tünetei sem specifikusak. Kezdetben intersticiális és alveoláris ödéma, hialinmembrán képződés, atelectasia, nyálkahártya nekrózis figyelhető meg. Ezt követően a szubakut stádiumban kialakul a diffúz gyulladásos infiltráció. Ebben a polymorphonuclearis sejtek mellett a makrofágoknak van fontos szerepe. A gyulladásos sejtek által termelt szövetkárosító anyagok hatására az alveolusok destrukciója következik be. Krónikus stádiumban az elpusztult alveolusok helyén megindul a regeneráció. Ez fibroblast és simaizom proliferációval jár, az alveolusok helyén kötőszövetes rostokat találunk. A bronchusok, bronchiolusok hámja metaplasiás, hyperplasiás. Jellemző a fokozott váladékképződés. Végstádiumban a kapillárisok és arteriolák száma csökken, az erek médiája hypertrophizál (1-3).

14

2. ábra: A bronchopulmonalis dysplasia szövettani képe Alveolus

Bronchiolus

Hyalinmembrán

A képeken BPD-s tüdő szövettani képe látható hematoxilin-eosin festéssel, 100x illetve 300x-os nagyítással. Az alsó képen gyulladásos infiltráció és az RDS-re jellemző hyalinmembrán is látható.

15

3.7 A bronchopulmonális dysplasia típusai A korszerű neonatológia eljárások megjelenése előtt a BPD olyan újszülöttekben alakult ki, akiket valamilyen tüdőt érintő betegség, adaptációs zavar miatt hosszú ideig kellett géppel lélegeztetni, illetve oxigénnel kezelni. A lélegeztetési igény hátterében leggyakrabban IRDS állt, de ide sorolható a mekónium aspirációs szindróma (MAS), kongenitális diafragma hernia, tüdő hipoplázia, nyitott Botallo-vezeték is (4). A tüdőkárosodás hátterében több vizsgálat is igazolta a magas oxigénkoncentrációk és a gépi lélegeztetés fiziológiástól eltérő nyomásparamétereinek vezető szerepét (3,4,1215). Manapság ez a klasszikus, régi-típusú BPD ritkább, a BPD-s esetek kb. 30%-át teszi ki. A BPD-s betegek többsége az új típusú BPD-ben szenved. Ez olyan koraszülöttekre jellemző, akik 1000 gramm alatti súllyal születtek és nincs más tüdőbetegségük. A betegség klinikai tünetei sokkal enyhébbek, alacsonyabb oxigénkoncentrációk és nyomásértékek elegendőek a megfelelő oxigenizáció biztosításához. Idővel ez az oxigénigény tovább csökken. A röntgenképen inkább diffúz fátyolozottság látható nagyobb ciszták illetve atelectasiás területek helyett. A szövettani képen sokkal enyhébbek a gyulladásos jelek illetve kevésbé meghatározó az epitheliális metaplasia, simaizom hypertrophia és a fibrózis. Az alveolusok száma és komplexitása illetve a kapilláris hálózat sűrűsége elmarad a normálistól (2. táblázat) (1-4). Ez alapján az új típusú BPD inkább tekinthető tüdőfejlődési rendellenességnek, míg a régi típusú BPD kialakulásában a külső hatások által kiváltott szövetkárosodás illetve regeneráció dominált.

16

2. táblázat: A régi és új típusú bronchopulmonális dysplasia összehasonlítása (1)

A régi és új típusú BPD összehasonlítása Régi típusú BPD

Új típusú BPD Kevesebb regionális különbség a

Alternáló atelectasia és hyperinfláció

tüdőben

Súlyos légúti epitheliális léziók

Ritka légúti epitheliális léziók

(hyperplasia, metaplasia) Légúti simaizom hyperplasia

Enyhe légúti simaizom hyperplasia

Súlyos, diffúz fibroproliferatio

Kevés fibrózis

Pulmonális artériák hypertoniás

Kevesebb, diszmorf artéria

remodellációja

Kevesebb, nagyobb alveolus,

Csökkent alveolarizáció és légzőfelület

egyszerűbb szerkezet

3.8. A bronchopulmonális dysplasia kockázati tényezői és patomechanizmusa A BPD a perinatális morbiditás és mortalitás szempontjából meghatározó jelentőségű kórkép. Pontos patomechanizmusának feltárása érdekében az elmúlt 40 évben számos vizsgálatot végeztek. Jelenleg a BPD-t multifaktoriális kórképnek tartják, ahol együtt játszanak szerepet a betegség kialakulásában a külső környezet tüdőkárosító tényezői és az egyén genetikai hajlama. (3. táblázat)

17

3. táblázat: A bronchopulmonális dysplasia kockázati tényezői A BPD kockázati tényezői Általános, genetikai

Éretlenség

tényezők

Elhúzódó Lélegeztetés lélegeztetéskáros sel járó hatásai betegségek

Férfi nem

Koraszülés

Barotrauma

IRDS

Kaukázusi rassz

Intrauterin retardáció

Volutrauma

MAS

HLA-A2

Alacsony születési súly

Túlfeszítés

Atopiás, asthmás családi anamnézis

Alacsony gesztációs kor

Oxigéntoxicitás

Citokin gén Éretlen tüdő polimor(IRDS) fizmusok?

Elhúzódó lélegeztetés

Gyulladás, infekció

PPHN

Anyai infekció

Energia és esszenciális tápanyaghiány

Chorioamnionitis

Immunglobulin hiány

Magzati infekció

Antioxidáns hiány (Cu, Zn, Se, vit-A, vitE)

Újszülöttkori Diaphragma nosocomialis hernia fertőzés Cardiopulmonalis betegségek

Táplálási, ápolási tényezők

Folyadék túlterhelés

Pneumonia (Ureaplasma Ápolási faktor urealyticum)

Szteroid profilaxis

(Pneumonia)

hiánya

Túlélést javító kezelések

Vastag betűvel emeltem ki a citokin génpolimorfizmusokat, amiknek a BPD kockázatára gyakorolt hatását a disszertációban vizsgáltam.

18

3.8.1. Oxigénterápia és gépi lélegeztetés Első leírásakor a BPD-t az afiziológiás lélegeztetés, magas nyomások, illetve magas oxigénkoncentrációk következtében kialakuló tüdőkárosodásnak tartották. A magas oxigénkoncentrációról illetve a magas lélegeztetési nyomásról több vizsgálat is kimutatta, hogy közvetlenül, (gyulladásos mechanizmussal) károsítják a tüdőt, illetve megzavarják a tüdőfejlődést. Magas oxigénkoncentráció jelenlétében fokozódik a citotoxikus szabad gyökök képződése, ami meghaladhatja a koraszülött szervezet csökkent antioxidáns védelme által közönbösíthető mennyiséget, így közvetlenül tüdőkárosodás alakulhat ki. Az oxigén önmagában képes a szakkuláris fázisban lévő tüdő szeptációjának leállítására (3). Azokban a betegekben, akiknél magasabb oxigénszaturáció elérésére törekedtek, ezért magasabb oxigénkoncentrációt alkalmaztak súlyosabb tüdőkárosodás alakult ki. Magas oxigénkoncentráció jelenlétében csökkent az alveolusok száma, illetve az alveolusok körüli kapilláris hálózat sűrűsége (3,17). Az oxigénkoncentráció mellett erős korrelációt találtak a BPD kockázata és a lélegeztetésre jellemző nyomásértékek között, illetve fordított arányosságot figyeltek meg a BPD kialakulásának kockázata és a lélegeztetés intenzitására jellemző vérgázértékek között (1,4). A gépi lélegeztetés térfogat- és nyomásterheléssel járhat. Ez közvetlenül károsítja az alveolusokat, illetve a szövetkárosodást kísérő gyulladásos reakció révén közvetve is hozzájárul a tüdőkárosodáshoz (4,18). Dreyfuss és Saumon összefoglalták a rendelkezésre álló adatokat, és kimutatták, hogy a tüdőt károsítja, ha a teljes tüdőkapacitást (TLC)-t meghaladó térfogatokra fújják fel (14). A regionális vagy egyenletes túlfúvás a leukociták tüdőbe vándorlását, fokozott permeabilitást, illetve intersticiális és alveoláris ödémát eredményez. A funkcionális reziduális kapacitás (FRC) és tidal volume (TV) különböző kombinációi szintén károsak, ha összegük meghaladja a TLC-t. Ha a mellkas tágulását korlátozzuk kötözéssel vagy öntvénnyel, akkor a nagy nyomások sem eredményeznek tüdőkárosodást (14). A tüdő túlfeszítése strukturális elemeket tehet tönkre a tüdőszövetben, illetve többféle mediátor felszabadulását válthatja ki, amik beindítják a gyulladásos kaszkádot. Ezeket, a faktorokat kezdetben valószínűleg nem a perifériás leukociták termelik, mivel az

19

izolált és perfundált tüdőben is TNFα, IL-1β és IL-6 szabadul fel, illetve két órán belül megemelkedik ezen a citokinek mRNS-ének szintje is. Ugyanezeket a citokineket/kemokineket azonosították a fokozott BPD kockázatú gyermekek amnionfolyadékában. A légúti minták nagy mennyiségben tartalmaznak más faktorokat is, amik elősegíthetik a fehérvérsejtek kivándorlását a tüdőbe, illetve más tüdőkárosító anyagok felszabadulását (laminin, fibronectin, elasztáz, komplement). A gyulladás ellenes citokinek, mint az IL-10, szintje alacsony, ugyanakkor a proinflammatorikus citokinek szintje magas. Az effektor molekula keverék egyes komponenseinek szerepe a folyamatban még nem ismert. A túlfúvott tüdőben extracelluláris mátrix elemek és növekedési faktorok is szintetizálódnak. A tüdő által termelt citokinek és kemokinek felerősítik a közvetlen károsodásra adott választ, azáltal, hogy odavonzzák a perifériás leukocitákat a tüdőbe (14). Egy érett tüdőn végzett vizsgálat azt is kimutatta, hogy a tüdő normális FRC alatti lélegeztetése szintén a tüdő károsodását eredményezi, a tüdőegységek ciklikus nyitásán és zárásán keresztül. A mosással surfactant hiányossá tett tüdők alacsony tüdőtérfogat melletti lélegeztetése in vivo és izolált perfundált tüdőben citokinek felszabadulását eredményezte. A túlfúváshoz hasonlóan, az alacsony tüdőtérfogatok melletti lélegeztetés is elősegíti a perifériás leukociták felhalmozódását és aktivációját a tüdőben. Az optimális FRC és TLC közé eső lélegeztetési térfogatok, amik VLBW gyermekekben valószínűleg 7-10 ml/kg közé esnek, nagyon kevés manőverezési helyet hagynak a klinikusoknak, hogy elkerüljék az alacsony és magas térfogatú tüdőkárosodási zónákban végzett lélegeztetést. Nincsenek elérhető technikák, amikkel rutinszerűen mérhetnénk az FRC-t és TLC-t lélegeztetett koraszülöttekben. Ezért a súlyos IRDS-ben szenvedő VLBW gyermekekben elkerülhetetlen lehet az éretlen tüdő sérülési zónákban történő lélegeztetése, ami gyulladásos citokinek felszabadulásához és tüdőkárosodáshoz vezet (4). Kraybill és munkatársai 10 neonatológiai egység 1000g alatti újszülötteiben elemezték a BPD-vel összefüggő klinikai paramétereket, és azt találták, hogy a géppel lélegeztetett újszülöttekben 48 és 96 órás korban a BPD gyakorisága fordítottan arányos a PCO2 szintekkel (13). Ez az eredmény megkérdőjelezhető, mivel a kevésbé súlyos tüdőbetegségekben szenvedő újszülötteknél általában alacsonyabbak a PCO2 értékek. A legalacsonyabb PCO2 értékeket azoknál a neonatológiai egységeknél találták, ahol

20

legnagyobb arányú volt a BPD előfordulása. A PCO2 hatékonyabban jelezte előre a BPD kialakulását, mint a kezdeti tüdőbetegség súlyossága. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a hyperventilatio hozzájárulhat a BPD kialakulásához. A BPD és a lélegeztetés kapcsolatának hosszú történetét ismerve nem kétséges, hogy az oxigén káros hatásai és az afiziológiás, túlzott gépi lélegeztetés hozzájárulnak a BPD kialakulásához. Az alacsony PCO2 értékek pedig a túlzott lélegeztetés indikátorai (4). 3.8.2. A tüdőfejlődés és szabályozó tényezői Az új típusú BPD inkább tüdőfejlődési zavarnak tekinthető, mint közvetlen tüdőkárosodásnak. A tüdőfejlődés alveoláris szakasza emberben a 24. gesztációs hét és a 18. születés utáni hónap közé esik. Az alveolarizáció legnagyobb része 5-6 hónapos korban következik be, ezért a születés utáni infekciók, gyulladásos reakciók is tüdőkárosodáshoz vezethetnek (3). A tüdőfejlődés két szakaszból áll, ami nem különül el élesen egymástól: az elsődleges szeptációval sacculusok képződnek, amit a másodlagos szeptáció követ. Ennek kapcsán alakulnak ki az alveolusok és a kapilláris hálózat (17,19). A kapilláris hálózat fejlődése az alveolarizáció után is intenzív marad. A tüdőfejlődés során a serkentő és gátló tényezők közötti finom egyensúly szükséges az egyes részfolyamatok megfelelő, térben és időben összehangolt lezajlásához. A tüdőfejlődés legfontosabb mediátorai a TGFβ illetve a glükokortikoidok (3). A glükokortikoidok gyorsítják a parenchyma érését, fokozzák a surfactant termelést és a compliancet, csökkentik az erek permeabilitását és fokozzák tüdőfolyadék clearance-ét. Összességében tehát javítják a tüdőfunkciót (3,19). A TGFβ ezzel szemben gátolja a tüdőfejlődést. A korai embrionális életben izoformáit és receptorát a tüdő fibroblastok és epitél sejtjei termelik. Gátolja a fejlődő hörgőrendszerben az elágazódások képződését és a II-es típusú pneumocyták surfactant termelését. Azoknál, akikben később BPD alakult ki, megemelkedett TGFβ szinteket találtak a tüdőaspirátumban, ami valószínűsíti, hogy a TGFβ szerepet játszik a tüdőkárosodás kialakulásában (3,17). Feltételezhető, hogy azok a VLBW koraszülöttek, akikben később BPD alakul ki, még túl éretlenek ahhoz, hogy a külső stresszhatásokra elegendő kortizolt termeljenek, így

21

náluk az éretlen neuroendokrin rendszeren keresztül a legtöbb környezeti stressz-faktor is hozzájárulhat a BPD kialakulásához (3). A tüdőfejlődés fontos része az érfejlődés, az alveolusok körüli kapilláris hálózat kialakulása, ami a másodlagos szeptáció során következik be (3,17). Ebben a folyamatban jelentős szerepe van a megfelelő angiogenetikus faktorok pontosan szabályozott térbeli és időbeli megjelenésének. Legfőképpen a vascularis endotheliális növekedési

faktor

(VEGF)

szerepét

vizsgálták

a

tüdőfejlődésben.

A

BPD

állatmodelljeiben alacsony VEGF és VEGF-receptor-1 (VEGF-R1) szinteket mutattak ki (12,17). Ugyancsak alacsonyabbnak találták az endotheliális és az indukálható nitrogénoxid szintáz (NOS) aktivitást ezekben az állatokban. Ez valószínűsíti, hogy a nitrogénoxid (NO) rendszer, ami szintén szerepet játszik az érképződésben, fontos lehet a BPD kialakulásában is (17). A tüdőfejlődés egyik legjellemzőbb markere az elasztin, ami elengedhetetlen a tüdő és az erek falának rugalmassága, compliance-e szempontjából. BPD-ben elhunytak boncolási anyagaiban és állatkísérletekben az alveolusok és kapillárisok fejlődészavara mellett károsodott szerkezetű elasztin felhalmozódását figyelték meg (12). A tüdőfejlődés és a gyulladásos reakció szabályzásáért felelős mediátorok egy része – például növekedési faktorok és arachidonsav származékok – a két folyamatban megegyezik. Ezért a fejlődési folyamat megzavarásában az intrauterin életben és születés utáni időszakban központi szerepet tulajdonítanak a gyulladásnak, illetve a gyulladásos reakció során felszabaduló mediátoroknak (4). Különösen igaz ez az egyre éretlenebb koraszülöttekre, akiknél a tüdő még fejletlenebb állapotban található, ugyanakkor az éretlen immunrendszer miatt a gyulladásos reakciók inadekvát módon, kontrollálatlanul zajlanak (20-23). 3.8.3. A perinatális gyulladás A gyulladásos folyamat elkezdődhet már a születés előtt az intrauterin életben, hiszen például a koraszülés egyik legfontosabb okának a chorioamnionitist, és a magzatfüggelékek gyulladását tartják (23,24). A gyulladás, születés után is kialakulhat infekciók, illetve szövetkárosodást okozó ártalmak hatására. A gyulladásos reakcióról

22

kiváltó októl függetlenül több szinten is kimutatták, hogy hatással lehet a BPD illetve a tüdőkárosodás kialakulására (21-23). 3.8.3.1. A gyulladás sejtes elemei A koraszülöttek tüdejében közvetlenül születés után nagyon alacsony az érett neutrofil granulocyták és makrofágok száma. Ugyanakkor állatkísérletek alapján számuk gyorsan emelkedik a gépi lélegeztetés megkezdése után (20-21). A tüdőmosó folyadékban lévő granulocyták száma szoros összefüggést mutat a tüdőödémával és a tüdőkárosodással (21). A gyulladásos reakció kezdetét a vérben lévő neutrofil granulocyták és makrofágok kivándorlása jelzi a szövetkárosodás helyére. Ezzel magyarázzák azt a megfigyelést, hogy azoknál a koraszülötteknél, akiknél egy órás korban a keringő neutrofil szám jelentősen csökkent, gyakrabban alakult ki BPD (21). Az aktivált neutrofil granulocyták által termelt proteolitikus enzimek később aztán további szövetkárosodáshoz vezetnek (21). Állatkísérletekben a BPD kialakulását a hízósejtek, eozinofilek és neuroendokrin sejtek felhalmozódása is kísérte a tüdőben (3). 3.8.3.2. A gyulladás és az oxidatív stressz A gyulladásos folyamat az oxidatív stresszel szemben is érzékenyebbé teszi a tüdőt. A gyulladásos reakció következtében a légutakba kerülő szabad vas elősegíti a szabadgyökképződést, ami TGFβ képződésén keresztül fibrózishoz vezet (3,25). Az általános alultápláltság és elégtelen protein bevitel miatt a koraszülöttekben alacsony a glutation szint, ami tovább fokozhatja a koraszülöttek érzékenységét a szabadgyökök által okozott tüdőkárosodással szemben (3,25). Állatkísérletekben az antioxidánsok hatékonyan megelőzték a BPD kialakulását (1,2,12). Emberben csupán az A-vitamin mutatott valamelyes védő hatást a tüdőkárosodással szemben (2,12). 3.8.3.3. A gyulladás szerepe a koraszülésben A BPD legfontosabb kockázati tényezője a koraszülöttség (1-3). A koraszülések 7080%-a ismeretlen okból bekövetkező úgynevezett idiopathiás koraszülés. Az esetek 20-

23

30%-ában valamilyen ismert anyai eltérés (méh- és/vagy placenta-rendellenesség) áll a hátterében (19,20,24). Az idiopathiás koraszülések pathomechanizmusa vitatott, a legáltalánosabban elfogadott elmélet szerint hátterüken többnyire chorioamnionitis áll. A 30. gesztációs hét előtt spontán koraszülő nők között a chorioamnion tenyészetekben közel 75%-os fertőzöttségett írtak le (26,27). 3.8.3.4. A chorioamnionitis A chorioamnionitis (CA) hátterében legtöbbször Ureaplasma urealyticum-mal történt fertőződés áll. A kórokozó többnyire látens infekciót okoz enyhe, sokszor észrevehetetlen tünetekkel. Ugyanakkor a háttérben folyamatos immunreakció zajlik. A szervezet nem képes a kórokozó eliminálására, a gyulladás a hüvelyből felfele terjedve eléri a méhet és a magzatfüggelékeket is (4,19,20). A CA-re jellemző intrauterin proinflammatorikus citokin emelkedésnek számos anyai és magzati következménye van (28-31). A magzati szervezetben aktiválódnak a fagociták, amik különböző szervekben, így a tüdőben is, szövetkárosdást okozhatnak (32). A CA-ben jellemző magas citokin szintek (elsősorban IL-1β és IL-6) megzavarhatják a magzat normális fejlődését és meghatározhatják az újszülöttkori morbiditást (28,30). Terminusra bekövetkező szülésnél az amnion folyadékban és a placentában megemelkedett citokin (IL-1β, IL-6, IL-8) szinteket figyeltek meg (33,34). Azokban a nőkben, akiknél koraszülés következett be ezek a citokinszintek még tovább emelkedtek, az aktuális fertőzöttségi állapottól függetlenül (35). Ez alátámasztja azt az elméletet, miszerint a gyulladásos mediátorok meghatározó szerepet játszanak mind a szülés mind a koraszülés beindításában (36). A méhnyak érésében és felpuhulásában például, a cervicalis stromában felhalmozódó fehérvérsejtek játszanak központi szerepet (37). Továbbá az IL-1β és TNFα szintek erősen korrelálnak a prosztaglandinok termelődésével, amik a méhösszehúzódásokért felelősek (38). Egy antiinflammatorikus citokinről, az IL-1β receptor antagonistáról kimutatták, hogy képes az IL-1β szüléstelősegítő hatásait ellensúlyozni (39). A magzati oldalon termelődött citokinek szintén hozzájárulhatnak a koraszülés beindulásához (40).

24

3.8.3.5. A gyulladás szerepe a perinatális adaptáció zavaraiban A koraszülötteknél a perinatális adaptáció során fokozott a légzési elégtelenség kockázata. Különösen érzékenyek azok a koraszülöttek, akiknél a tüdőfejlődés már az intrauterin élet során zavar szenvedett, és ezért még kevésbé képesek a környezeti változások kompenzálására (17). A légzési elégtelenség kezeléséhez gyakran magas oxigénkoncentrációk alkalmazására és gépi lélegeztetésre van szükség. A lokális iritáció gyulladásos reakciót, közvetlen és közvetett tüdőkárosodást okozhat (3,17). Az adaptációs zavar során más perinatális szövődmények is kialakulhatnak (41-43). A legtöbb perinatális szövődmény patomechanizmusában szerepe van a gyulladásos reakciónak (42,43). A posztnatális korban jelentkező gyulladás lehet szisztémás (szepszis), illetve szervrendszerre lokalizálódó (nekrotizáló enterocolitis (NEC)). A kontrollálatlan gyulladásos reakció során felszabaduló mediátorok közvetlenül károsítják a tüdőt, illetve a gyakran kialakuló légzési elégtelenség kezelése szintén tüdőkárosodást okozhat. A perinatális infekciók gyakran járnak generalizált szepszis kialakulásával. Az újszülöttkori szepszis illetve a magzati gyulladásos reakció (FIRS) patomechanizmusával számos vizsgálat foglalkozott (43-47). 3.8.3.6. A perinatális gyulladásos reakció fázisai A bakteriális kórokozók eliminálásáért újszülöttkorban döntően a veleszületett immunitás a felelős, az immunreakció szabályozásában azonban a lymphocyták is szerepet játszanak (42). A gyulladásos reakció első lépése, a kórokozó felismerése, a bakteriális mintázat felismerő receptorok (TLR, CD14, MBL) segítségével történik. A sejtek aktivációja intracelluláris kinázokon illetve a nukleotidkötő oligomerizációs domén (NOD) család fehérjéin keresztül történik, ami végül az NF-κB sejtmagba történő transzlokációjához vezet (47-49). Az így aktivált makrofágok és neutrophil granulocyták gyulladásos citokinek szekrécióján keresztül auto- és parakrin módon kommunikálnak egymással és a gyulladásos reakciót szabályzó limfocitákkal, ezáltal további aktivációs lépéseken mennek keresztül. A kemotaktikus faktorok és adhéziós molekulák expressziója fokozódik, lehetővé téve a fagocita sejtek kitapadását és extravazációját. Az extravazációban szerepe van az endothel állapotának is. Ennek

25

jelzője lehet az endotheliális faktoroknak (mint az ACE) expressziója (49,50). A folyamat utolsó lépése a kórokozók elpusztítása fagocitózissal, reaktív oxidatív szabadgyökökkel

és

proteolítikus

enzimekkel

(18,21,22).

A

szepszis

generalizálódásában fontos szerepet játszik a gyulladásos és a véralvadási rendszer kölcsönhatása is (47). 3.8.4. A gyulladással kapcsolatos vizsgálataink A BPD összetett patomechanizmusú kórkép, kialakulásában azonban a gyulladásnak központi szerepe van. Az elhúzódó gépi lélegeztetésre és oxigénterápiára hajlamosító kórképek többségében szintén meghatározó szerepe van a gyulladásnak. A magas oxigénkoncentrációk illetve a gépi lélegeztés által okozott barotrauma, volutrauma és túlfeszítettség szövetkárosító hatása szintén gyulladásos mechanizmussal valósul meg. A gyulladásos reakcióban központi szabályozó szerepe van a gyulladásos citokineknek. A citokinek szabályozzák a fehérvérsejtek gyulladás helyére történő vándorlását, a szövetkárosító proteolítikus enzimek és reaktív oxidatív ágensek felszabadulását. A gyulladásos reakciót szabályzó anyagok és a tüdőfejlődés mediátorai között számos átfedés van, ezért a gyulladásos citokinek megzavarhatják a normális tüdőfejlődést, ezzel is hozzájárulva a BPD kialakulásához (17). Mivel a gyulladás központi szerepet játszik a BPD kialakulásában, vizsgálataink során elsősorban a gyulladásos reakcióval foglalkoztunk. A koraszülöttek immunrendszere éretlen, eltér a felnőttekétől, azonban ezt részleteiben még kevesen vizsgálták. A gyulladásos folyamatok szabályozásában azonban koraszülöttek esetén is a citokinek a legfontosabb

mediátorok,

ezért

genetikai

vizsgálatainkban

a

citokin

gének

polimorfizmusai és a BPD kockázata közötti kapcsolatot vizsgáltuk. 3.8.4.1. Az immunrendszer részei Az immunrendszeren belül elkülönítik a veleszületett immunitást, ami az összes kórokozóval szembeni aspecifikus, gyors, elsődleges védelmi vonalat jelenti, és a szerzett immunitást, ami a T és B sejteken keresztül specifikusan bár, de lassabban reagál az ismert antigénekre. A két rendszer átfedi egymást, szoros együttműködés van

26

közöttük. Minden antigénhatásra először a veleszületett immunitás reagál, majd ezután aktiválja a szerzett immunitás effektor mechanizmusait. A szerzett immunitás esetén is a kórokozók végső eliminálását a veleszületett immunitás sejtes elemei biztosítják (51). 3.8.4.2. Az újszülött immunrendszere Születéskor az immunrendszer még éretlen, különösen igaz ez a szerzett immunitásra, ahol a hatékony működéshez az antigénekkel történő találkozás szükséges. Ezért az újszülöttek immunvédekezésében az anyától kapott immunglobulinok mellett a veleszületett immunitásnak van meghatározó szerepe. A veleszületett immunitás több szinten működik, részt vesznek benne a határfelületek barrierjei, antibakteriális enzimek, pl. lizozim, akut fázis fehérjék, komplement rendszer. Legfontosabb részei azonban a fagocita sejtek, amelyek a kórokozók eliminálását végzik. Különösen fontosak a makrofágok, amelyek az ősi, testidegen anyagokra jellemző molekuláris mintázatokat felismerő receptorokkal rendelkeznek. A veleszületett immunitás sejtes elemei két citokin, az IL-12 és az IFNγ, szabályozása alatt állnak (3. ábra) (52-55). A koraszülöttek éretlen immunrendszerérere jellemző a nem megfelelő citokinválasz, a többi citokinhez hasonlóan az IFNγ és IL-12 termelése is csökkent mértékű koraszülöttekben (52.) 3.8.4.3. A neutrophil granulocyták, makrofágok és természetes ölő sejtek Vizsgálataink során elsősorban a veleszületett immunitás sejtes elemeit vizsgáltuk. A veleszületett immunitáshoz a klasszikus fagocita sejtek tartoznak, a neutrophil granulocyták, a makrofágok és a természetes ölősejtek (NK). Ezekre a sejtekre.az jellemző, hogy kórokozó felismerésük kevésbé specifikus, mint az adaptív immunitás sejtjeinek, a limfocitáknak, antigén felismerése. Általános, ősi, baktériumokra jellemző konzervatív motívumokat ismernek fel, mint például a lipopoliszacharid, CpG szekvenciák. A felismerésben az úgynevezett mintázatfelismerő receptoroknak van szerepe, az egyik legismertebb a toll-like receptor család. Az adaptív immunitás B és T limfocitái peptidkötő-receptoraikkal sokkal specifikusabb antigének felismerésére képesek, a HLA rendszer révén képesek a szervezet saját fehérjéit elkülöníteni a

27

testidegen fehérjéktől. A limfociták hátránya, hogy csak peptid típusú antigének felismerésére képesek (kivétel a CD1 T sejtek), míg a veleszületett immunitás sejtjei lipid és cukor természetű antigéneket is felismernek. A kisebb specificitás és a konzervált motívumok felismerése a veleszületett immunitás sejtjei számára nagyon gyors reakciót tesznek lehetővé. Ezek a sejtek jelentik a szervezet első védelmi vonalát, ezek találkoznak előszőr a kórokozókkal és kezdik meg azok eliminálását, fagocitózisát. Bár ez a folyamat gyors, kevésbé hatékony, mint az adaptív immunreakció. A veleszületett immunitás sejtjei a kórokozókkal való találkozás után a belőlük felszabaduló citokineken, mediátorokon keresztül aktiválják az adaptív immunitás sejtjeit is, illetve az adaptív immunreakció során is szabadulnak fel olyan anyagok, amelyek viszont a veleszületett immunitás sejtjeit aktiválják, például, fokozzák a makrofágokban az oxidatív szabadgyökök termelését. A kétféle immunrendszer tehát nagyon szorosan összefügg, nem választható el egymástól. Sokszor az adaptív immunfolyamatoknál is a végső eliminációs lépést a veleszületett immunitás sejtjei végzik (51). 3. ábra: Az IFNγ és IL-12 hatása egymás termelődésére

NK sejt

Aktivált makrofág

Az NK és T sejtek által termelt IFNγ aktiválja a makrofágokat, fokozza az adhéziós molekulák expresszióját, a fagocitózist, az oxidatív gyökök és az IL12 termelését. Az aktivált makrofágok által termelt IL-12 NK sejt aktivációt, fokozott IFNγ termelést okoz.

28

3.8.4.4. A citokinek általános jellemzői Az immunrendszer sejtjei között a kommunikáció citokineken keresztül valósul meg. Valamennyi immunsejt képes citokinek termelésére, illetve rendelkezik a citokinek érzékeléséhez szükséges specifikus receptorokkal. Az immunsejteken kívül azonban a gyulladásos és immunfolyamatokban szerepet játszó más szervrendszerek, így elsősorban a haemopoeitikus és neuroendokrin rendszer, sejtjei is képesek citokinek termelésére

és

érzékelésére.

A

citokinek

kis

molekulatömegű

(10-40kD)

fehérjemolekulák, elhelyezkedhetnek a sejtfelszínen, vagy szolubilis formában a plazmában. A citokinek nómenklatúrája változatos, a legkorábban felfedezett citokinek a feltételezett funkcióról kapták a nevüket, pl. tumor nekrózis faktor (TNF). Később a citokint termelő sejtek alapján elkülönítettek monokineket, illetve limfokineket. A fehérvérsejtek közötti kommunikációban résztvevő citokineket szokás interleukineknek (IL) nevezni. A citokinek változatos szerkezetű polipeptidek. Közös jellemzőjük, hogy rendszerint valamilyen külső stimulus hatására termelődnek. Általában nem raktároz a sejt előre szintetizált citokineket, a stimulus hatására a sejt aktiválódik, és ez transzkripción keresztül vezet a citokinek szintéziséhez. A szintézis után, a citokinek azonnal kiválasztódnak a sejtből, ezáltal biztosítva a gyors hatás kialakulását. A citokinek hatása pleiotróp és redundáns, azaz a legtöbb citokin többféle sejtre is képes hatást gyakorolni, ugyanakkor többféle citokin is kiválthat azonos hatást a célsejteken. A citokinek hatásukat rendszerint kaszkádok formájában, felerősítve fejtik ki, egyes citokinek további citokinek termelését indukálják. A citokinek hatása lehet autokrin, parakrin, sőt a nagy mennyiségben a keringésbe jutó citokineknek endokrin hatásuk is lehet. A citokinek hatásukat specifikus nagy affinitású receptorokon keresztül fejtik ki, ezért nagyon alacsony 10-10-10-12M koncentrációban is hatásosak. Citokinek hatására rendszerint receptoraik expressziója is változik, tovább erősítve vagy gyengítve a citokinek hatását. Funkciójuk alapján megkülönböztethetők a veleszületett immunitás citokinjei, az adaptív immunitás citokinjei és a haemopoietikus citokinek (51).

29

3.8.4.5. Az általunk vizsgált citokinek Vizsgálataink során, mi elsősorban a klasszikus gyulladásos citokineket és a veleszületett immunitás citokinjeit vizsgáltuk. TNFα A TNFα az akut gyulladásos válasz központi mediátora. Elsősorban az aktivált mononukleáris fagocita sejtek termelik, de a T, NK és hízósejtek is képesek termelésére. A TNFα termelés leghatékonyabb stimulusa a lipopoliszacharid (LPS). Az NK sejtek által termelt IFNγ fokozza a makrofágok TNFα termelését. A TNFα monoglikozilált II-es típusú membránproteinként szintetizálódik, kis intracelluláris

aminoterminussal

és

nagy

extracelluláris

karboxil

terminussal

rendelkezik. A membránban homotrimer formában helyezkedik el, és a II-es típusú TNFα receptorokat képes aktiválni. A szolúbilis TNFα egy membrán metalloproteináz által történt hasítás után keletkezik. Három 17 kD-os polipeptid lánc alkotja az 51 kD-os szolúbilis TNFα molekulát. A szolúbilis TNFα hatását az I-es és II-es típusú TNF receptoron keresztül fejti ki. A receptorok TNFα kötése után intracelluláris jelátviteli kaszkád aktiválódik, majd végül az NF-κB transzkripciós faktoron keresztül alakul ki a TNFα hatása. A TNFα fő funkciója a neutrophil granulocyták és monocyták toborzása a fertőzés helyére. Hatására az endothel sejtek felszínén fokozódik az adhéziós molekulák expressziója, fokozódik a kemokinek szekréciója is. Bizonyos sejtekben a TNFα apoptózist indukál. A gyulladásos válaszreakció során nagymennyiségű TNFα kerül a keringésbe, aminek szisztémás hatásai is lehetnek. A TNFα a hypothalamusban hozzájárul a láz kialakulásához, csökkenti az éhségérzetet, a májban hatására fokozódik az akut fázis fehérjék szintézise, az anyagcserét katabolikus irányba tolja, nagy mennyiségben myocardium depresszor hatással rendelkezik, az endothelre kifejtett hatásai miatt intravasculáris koagulációt is képes okozni. Ezáltal a TNFα a szeptikus sokk és a következményes több szervi elégtelenség kialakulásának központi mediátora (51).

30

IL-1β Az IL-1 a TNFα-hoz hasonlóan a gyulladásos válaszreakció központi mediátora. Az IL1 is elsősorban aktivált makrofágokban termelődik LPS és TNFα hatására, azonban más sejtek, így a neutrophil granulocyták, endothel és epithel sejtek is képesek a termelésére. Az IL-1-nek két izoformája ismert az IL-1α és az IL-1β. Mindkét izoforma azonos sejtfelszíni receptorokhoz kötődik, és azonos hatásokkal rendelkezik. Mindkét izoforma 33 kD-os prekurzorként szintetizálódik, amiből enzimatikus hasítás után alakul ki a 17 kD-os szekretált forma. Az IL-1α mindkét formában aktív, míg IL-1β esetén csak a 17 kD-os hasított formának van biológiai aktivitása. A keringésben inkább az IL-1β izoforma található. AZ IL-1-nek két receptora ismert mindkettő az Ig superfamily-be tartozik. Az I-es típusú receptor majdnem minden sejten megtalálható, a II-es típusú receptor főleg B-lymphocytákon fordul elő. Az IL-1 a receptorkötés után IRAK kinázon keresztül végül az NF-κB transzkripciós faktor segítségével fejti ki hatásait. Az IL-1β hatásai a TNFα-éhez hasonlók. Kis mennyiségben az endothel sejtek aktivációját, a sejtfelszíní adhéziós molekulák expressziójának fokozódását okozza. Nagyobb

mennyiségben

a

szisztémás

keringésbe

kerülve

hozzájárul

a

láz

kialakulásához, és az akut fázis fehérjék szintéziséhez. Bár az IL-1β és a TNFα hatásai hasonlóak az IL-1β nem okoz apoptózist, és önmagában szeptikus sokk kiváltására is képtelen. Az IL-1-nek létezik egy funkció nélküli szerkezeti homológja az IL-1 receptor antagonista. Ez a citokin valószínűleg az IL-1 hatásainak endogén szabályozásában játszik szerepet (51). IL-6 Az IL-6 mind a természetes, mind az adaptív immunitásban szerepet játszó citokin. Proés antiinflammatorikus hatásokkal is rendelkezik. Mononukleáris fagocytákban endothelsejtekben, fibroblastokban és más sejtekben termelődik elsősorban IL-1β és TNFα hatására. Homodimer formában hatásos, mindkét alegység négy globuláris láncból épül fel. Hatásait I-es típúsú citokinreceptoron illetve JAK/STAT kinázokon keresztül fejti ki.

31

Az IL-6 fokozza az akut fázis fehérjék szintézisét, illetve a csontvelőben a neutrophil granulocyták képződését. Az adaptív immunitásban elősegíti a B-sejtek érését és az antitestek termelődését (51). IL-10 Az IL-10 gátló hatású citokin, ami hatással van a természetes és az adaptív immunitás sejtjeire is. Elsősorban aktivált makrofágok termelik, de a T-sejtek és a keratinocyták is képesek termelésére. Négy alfa-hélix szerkezetű globuláris doménből épül fel. Hatásait II-es típusú citokinreceptoron keresztül fejti ki. Az IL-10 feladata az immunreakció kioltása a fertőzés eliminálását követően. Hatásait elsősorban az aktivált makrofágok gátlásán keresztül fejti ki. Az IL-10 gátolja az aktivált makrofágok és dendritikus sejtek IL-12 termelését, illetve gátolja a makrofágok és dendritikus sejtek MHC II expresszióját, ezáltal gátolva a T-sejt választ és az adaptív immunreakciót (51). IL-12 Az IL-12 teremti meg a kapcsolatot a veleszületett és az adaptív immunitás között. A veleszületett immunitás alapvető mediátora, aktiválja a sejt közvetített szerzett immunitást. Az antigénprezentáló sejtek (APC), azaz a makrofágok és dendritikus sejtek termelik bakteriális endotoxin (LPS), intracelluláris kórokozók, és antigénnel stimulált T sejtek hatására. Az IL-12 egyedi szerkezetű citokin, 70 kD tömegű heterodimerek alkotják, melyek egy 35kD és egy 40 kD tömegű alegységből épülnek fel. A p35 alegység 4 α-globulin láncból áll, a 3p12-q13.2 locusban kódolódik. A legtöbb sejtben termelődik. A p40 alegység I-es típusú citokinreceptor szerű, de Ig-like domént is tartalmaz, az 5q31-32 locusban kódolódik, csak az APC sejtek képesek szintetizálni, így csak ezekben alakul ki aktív IL-12 heterodimer. (létezik solubilis p40 is). Hatását I-es típusú wsxws szekvenciát tartalmazó citokinreceptoron keresztül fejti ki. JAK és STAT4 kinázokat aktivál. Az IL-12 fokozza az NK és T sejtek IFNγ termelését, ami makrofág aktivációhoz vezet. Hatására a CD4 pozitív T sejtek Th1 sejtekké differenciálódnak, (T sejt növekedési faktor). A Th1 sejtek az adaptív immunitás fagocitáit aktiválják. Az NK sejtek IL-12

32

hatására limfokin aktivált ölő (LAK) sejtekké alakulnak, aktiválódnak a CD8 pozitív cytotoxikus limfociták is (51,56). IFNγ Az IFNγ (II típusú interferon) a legfontosabb makrofág aktiváló citokin. Az IL-12-vel stimulált NK és T sejtek termelik. Homodimer formában fordul elő. Hatását II-es típusú citokinreceptoron keresztül STAT1 kinázon keresztül fejti ki. Génje a 12q14 locusban található. Az aktivált makrofágok kórokozó elimináló képességét fokozza azáltal, hogy fokozódik a szöveti faktor, a fagocyta oxidáz, az iNOS, a növekedési faktorok, a citokinek (pl. IL-12) és a mikrobicid enzimek szintézise és expressziója. Ugyancsak fokozódik az MHC I és II expressziója az APC sejteken. Az IFNγ az adaptív immunitást Th1 irányba tolja, fokozza a Th1 és gátolja a Th2 sejtek képződését. Az IFNγ hatással van a B-sejtek immunglobulin termelésére is, gátolja az IL-4 függő immunglobulinok képződését. Az IFNγ a neutrofil és NK sejteket is aktiválja (51,57,58). 3.8.4.6. A renin angiotenzin aldosteron rendszer szerepe a gyulladásban Jól ismert az angiotenzin konvertáló enzim (ACE) és termékének az angiotenzin II-nek (AII) a vérnyomás-szabályozásban betöltött szerepe. Újabb vizsgálatok szerint azonban a renin-angiotenzin-aldoszteron rendszer (RAAS) szerepet játszik a gyulladásos folyamatban is. Az AII-ről kimutatták, hogy fokozza a proinflammatorikus citokinek (TNFα, IL-6) termelését (59), míg az ACE gátlás a sejtes gyulladásos válasz csökkenését eredményezte (60). 3.8.5. Táplálási ápolási tényezők Bár a BPD átlagos prevalenciája 20% körül mozog igen kis születési súlyú koraszülöttekben, jelentős különbségeket figyeltek meg az egyes neonatológiai centrumok között. Ennek hátterében állhat az egyes centrumok által alkalmazott eltérő BPD definíció, illetve az eltérő terápiás irányelvek. Különbözik a centrumok technikai felszereltsége is, a korszerűbb lélegeztetési stratégiák pedig bizonyítottan csökkentik a BPD kialakulásának kockázatát (1). Adatok utalnak arra is, hogy az alacsonyabb

33

oxigéntenzióra, 90% alatti oxigénszaturációra való törekvés, illetve a permisszív hypercapnia csökkentette a BPD incidenciáját. Hasonló megfigyeléseket tettek a folyamatos pozitív légúti nyomás (CPAP) szélesebb körű alkalmazásával is (1). A

koraszülöttekre

jellemző

az

esszenciális

tápanyag

és

energiahiány,

az

immunglobulinok és antioxidánsok alacsony szintje. Ennek ellenére eddig nem sikerült randomizált kontrollált vizsgálattal igazolni a korszerű táplálás és az antioxidáns pótlás hatásosságát a BPD megelőzésében (1,52,53). 3.8.6. Örökletes, genetikai tényezők A BPD kialakulásában az egyén genetikai fogékonysága is fontos szerepet játszik. Erre utal, hogy bár a BPD kialakulása szempontjából az újszülött érettsége döntő fontosságú, egy adott kohorszban ugyanolyan terápia mellett is csak a betegek egy részénél jelentkezik ez a szövődmény (5-8). Ugyancsak a genetikai tényezők szerepét támasztják alá az ikervizsgálatok, ahol a BPD fokozott konkordanciáját figyelték meg egypetéjű ikrekben, illetve a BPD kialakulásában a genetikai tényezők szerepét 63,6%-osnak találták (9). A genetikai tényezők nem csak közvetlenül a BPD kialakulási kockázatát befolyásolhatják, hanem a BPD-re hajlamosító egyéb tényezők iránti fogékonyságot is befolyásolhatják. Számos gén illetve génváltozatot próbáltak kapcsolatba hozni a BPD-vel, illetve a BPDre hajlamosító perinatális szövődményekkel. 3.8.6.1. Általános genetikai jellemzők Vannak olyan fenotípusos tulajdonságok, amelyek genetikai háttere vagy nincs pontosan feltárva, vagy több gén által meghatározott úgynevezet poligénes öröklődésű. A klasszikus genetika hőskorában a teljes genom megismerése előtt, csak a fenotípusos jegyek kapcsolódását, együttes előfordulását tudták megfigyelni, és ez alapján próbáltak az öröklődésre következtetni.

34

A BPD esetén is ismertek olyan fenotípusos jegyek, melyek jelenlétében a betegség gyakrabban fordul elő, ezek pontos oka azonban egyelőre még nem ismert, feltárásukhoz további vizsgálatok szükségesek. A férfi nemről, a kaukázusi rasszról, a HLA-A2 antigén hordozásról, valamint az atópiás, asztmás családi anamnézisről bebizonyították, hogy fokozza a BPD kialakulási kockázatát (4). 3.8.6.2. A genetikai polimorfizmusok Az emberi genom kb. 5 milliárd bázispárból épül fel. Az emberi DNS-t felépítő nukleotidok sorrendje egyénenként kisebb-nagyobb eltéréseket mutat. Az eddigi megfigyelések szerint kb. 1250 bázispáronként fordulnak elő 1 nukleotidot érintő egyéni variációk. Ezeket single nucleotide polymorphism-nak, röviden SNP-nek, nevezik (régebbi néven pontmutációk). Az 1%-nál gyakoribb SNP-k száma mintegy 11 millióra, a 10%-ál gyakoribbaké mintegy 5 millióra tehető. Jelenleg kb. 9 millió SNP-t ismerünk. Emellett vannak olyan, több nukleotidból álló DNSszakaszok is, melyek egyéni variációt mutatnak az egyes emberek között. Ezeknek több változata ismert, mi egy inzerciós/deléciós polimorfizmust is vizsgáltunk az SNP-k mellett, ahol az inzerciós génváltozat néhány bázispár beépülésével hosszabb lesz a deléciós változatnál. Az egy nukleotidnyi eltérések és az egyéb polimorfizmusok döntő hányada olyan DNS-szakaszokban található, amelyek nem vesznek részt a sejtműködés szabályozásában. Kis részük, 2-3 százalékuk, azonban fehérjéket kódoló géneket, vagy ezek működését szabályozó DNS-szakaszokat érint, és ezek egy része a fenotípusban is megjelenik. Megegyezés szerint a gyakrabban előforduló génvariáns a „vad”, a ritkábban előforduló a „mutáns”. A polimorfizmusok jelentős részét a Humán Genom Projekt keretében azonosították. Az adatok nyilvános adatbázisokban elérhetők (Human SNP Database, HGBASE).

35

3.8.6.3. A bronchopulmonális dysplasia és a lélegeztetés iránti igény genetikai háttere közötti kapcsolat A BPD-re hajlamosító genetikai tényezők közül elsősorban olyan SNP-k szerepét vizsgálták, melyek a patomechanizmusban szerepet játszó tényezőkkel kapcsolatba hozhatók. Így hagyományosan az RDS talaján kialakuló BPD-nél a surfactant fehérje (SP) gének SNP-i, később pedig az új típusú BPD megjelenéséval a gyulladásos folyamat és az antioxidáns rendszer SNP-i és a BPD illetve lélegeztetési igény között kerestek kapcsolatot. A surfactant fehérje polimorfizmusok közül Weber és mtsai. az SPA1 6A6 allél hordozást gyakoribbnak találták BPD-s koraszülöttekben (61). Makri és mtsai. az SPB intron-4 mutáns allél hordozókban figyelték meg a BPD magasabb incidenciáját (62). Rova és mtsai. szintén az SPB intron-4 deléciós variánsáról mutatta meg, hogy a BPD kockázati tényezője (63). A többi SP polimorfizmus és a BPD között nem sikerült kapcsolatot kimutatni (61,64). Az aktivált fehérvérsejtek nagy mennyiségű citokint termelnek az éretlen tüdőben. A gyulladásos citokinek központi szerepet játszanak a BPD kialakulásában (20-24,65). A citokinek hozzájárulnak a fehérvérsejtek inváziójához, a proteolítikus enzimek és reaktív oxigén intermedierek felszabadulásához. Ezen kívül a citokinek megzavarhatják a tüdőfejlődés jelátviteli útjait is. A citokinek termelését meghatározza az egyén genetikai háttere, csakúgy, mint a fejlettségi állapota és a perinatális körülmények. A legfontosabb citokinek SNP-i és a BPD közötti kapcsolatot már többen vizsgálták. A TNFα G-308A SNP szerepét BPD-ben három csoport is vizsgálta. Az A-allél hordozásáról kimutatták, hogy fokozott TNFα termeléssel jár. A BPD és az SNP hordozás közötti kapcsolatot bemutató eremények azonban ellentmondásosak. Míg Kazzi és mtsai. az A-allél védő szerepét mutatták ki BPD-vel szemben (66), addig Adcock és mtsai. (67) nem találtak kapcsolatot ezen SNP és a BPD kockázata között. A tüdőkárosodásban szintén fontos szerepet játszó monocyta kemoattraktáns protein-1nek (MCP-1) funkcionális SNP-je és a BPD kockázat között sem tudtak kapcsolatot kimutatni (67).

36

A szelektinek lektin kötő fehérjék, amelyek a fehérvérsejtek endothel sejtekhez történő kitapadásában játszanak szerepet. Ez annak az adhéziós kaszkádnak az első lépése, ami a

fehérvérsejtek

gyulladás,

fertőzés

vagy

szövetkárosodás

helyére

történő

kivándorlásához vezet. A közelmúltban munkacsoportunk kimutatta, hogy az L-szelektin gén mutáns alléljének (Ser213) hordozása a BPD kialakulásának valószínűségét 2,45-szörösére emelheti (68), míg az E- és P-szelektin gének SNP-i (E-szelektin Ser128Arg, P-szelektin Thr715Pro) nem befolyásolták a BPD kialakulásának kockázatát. Úgy gondoljuk, hogy ennek a jelenségnek a magyarázata az SNP jelenlétében megváltozott L-szelektin expresszió lehet (68). Az endothel faktorok közül a közelmúltban az ACE inzerciós/deléciós (I/D) polimorfizmus lehetséges szerepét vizsgálták a neonatális tüdő patológiában (50). Kazzi és mtsai. igen kis születésisúlyú koraszülöttekben kimutatták, hogy a D allél (ami magas ACE aktivitással, és ezért magas AII szintekkel jár) prevalenciája magasabb a BPD-s populációban (50). Yanamandra és mtsai. illetve nem tudták ezt az összefüggést igazolni (70). Léteznek a perinatalis tüdőkárosodás ellen védő veleszületett mechanizmusok is. Ezek közé tartozik az antioxidáns rendszer is (25). Állatkísérletek alapján a BPD kezelésében az antioxidánsok pótlása hatékony lehet (1,2,12), ezért felmerült, hogy a természetes antioxidánsrendszert érintő SNP-k hajlamosíthatnak a BPD kialakulására. Manar és mtsai. BPD-s populációban vizsgálták a glutation-S-transzferáz enzim (GST-P1-105ile) genetikáját, és az alacsony aktivitással járó variánst hordozó gyermekeknél 4,5-szörös BPD kockázatot figyeltek meg (71). Mivel a véralvadás és fibrinolízis is hozzájárulhat a BPD kialakulásához, Lin és mtsai. ezen folyamatok genetikájára koncentráltak, és megvizsgálták az urokináz gén egy gyakori polimorfizmusának szerepét BPD-ben. Az eredményeik azonban nem erősítették meg ennek a variánsnak a jelentőségét a BPD kockázatában (72).

37

3.8.6.4. A koraszülés és a chorioamnionitis genetikai háttere A BPD a koraszülöttek szövődménye, prevalenciája drámaian megnő az éretlenebb VLBW populációban. Ezért feltételezhető, hogy a koraszülöttség kockázatát növelő SNP-k fokozzák a BPD kockázatát is. A koraszülés esetében a legnagyobb szerepet a tünetmentes aszcendáló anyai infekció következtében kialakuló chorioamnionitisnek és korai burokrepedésnek tulajdonítanak (27-30), ezért elsősorban a gyulladásos kaszkád citokinjeit és a proteolitikus enzimeket kódoló gének polimorfizmusai és a koraszülés kockázata közötti kapcsolatot vizsgálták. Számos SNP-ről igazolták, hogy mind anyai, mind magzati hordozásuk koraszülésre, illetve koraszülöttségre hajlamosíthat (31-36). A chorioamnionitis fokozza a koraszülés kockázatát, illetve a FIRS révén a posztnatális gyulladás valószínűségét is emeli (19). Adatok vannak arra vonatkozóan is, hogy a chorioamnionitis szempontjából a magzat genotípusa is meghatározó lehet (73,74). Bár nem minden vizsgálat tudott összefüggést kimutatni, több esetben igazolták, hogy kapcsolat lehet a tumornekrózis faktor alfa (TNFα), és limfotoxin alfa (LTα) SNP-k és a magzatfüggelékek gyulladása között (73,74). A citokin genotípusok klinikai szerepét vizsgálták koraszülő és ismételten vetélő (RPL) nőkben is. Bár ezek a klinikai csoportok néhány patofiziológiai aspektusban bizonyosan különböznek, a klinikai megjelenésük gyakran nehezen elkülöníthető, és feltételezhető, hogy a citokin polimorfizmusok hasonló szerepet játszanak mindkettőben. Bár néhány kisebb vizsgálat az IL-6 G-174C, IL-10 G-1082A, IFNγ A-874T és TNFα G-308A SNP-k azonos prevalenciáját írta le RPL és kontroll nőkben (75-79), a vizsgálatok metaanalízise kimutatta, hogy azoknak az SNP-knek a hordozása, melyek magas IFNγ illetve alacsony IL-10 termeléssel járnak (pl. IFNγ -874T, IL-10-1082A allélek) fokozzák a RPL kockázatát (79). Hasonló összefüggést figyeltek meg a TNFα G-308A allél és a RPL kockázata között a fenti a vizsgálatban illetve Reid és mtsai. vizsgálatában (78). Ezeket, az eredményeket megerősítette az IL-10, IL-6, TGFβ, IFNγ és TNFα genotípusok közelmúltban elvégzett haplotípus analízise. Costeas és mtsai. RPL nőkben azoknak a citokin haplotípusoknak a magasabb prevalenciáját figyelték meg, amelyek alacsony Th2/Th3 illetve magas Th1 citokinmintázattal járnak (80). Az IL-1β-nak és antagonistájának, az IL-1 receptor antagonistának (IL-1-ra), szerepét is megvizsgálták

38

RPL-ben. Bár az IL-1β C3954T SNP és az RPL között nem találtak kapcsolatot (79,81), az IL-1-ra alfa lánc gén intronjában lévő tandem repeat variáns (IL-1ra-2N) fokozta az RPL kockázatát (82). A spontán koraszülő nők (sPTB) citokin genetikai adataiból sokkal kevesebb áll rendelkezésre, illetve több az ellentmondó adat. Simhan és mtsai. az IL-6-174CC genotípust ritkábbnak találták a 34. gesztációs hétnél korábban spontán szülő nőkben, ami arra utal, hogy ez az SNP csökkentheti a sPTB kockázatát (83). Hartel és mtsai. eredményei szintén alátámasztják ezt a megfigyelést (84). Az RPL-hez hasonlóan az IL-1ra-2N genetikai variáns az sPTB-ben is fontosnak tűnik; a bakteriális stimulusra alacsonyabb IL-1β válasszal járó allélek védenek a sPTB ellen (85). A TNFα G-308A allél prevalenciáját szintén megvizsgálták sPTB-ben. Dizon-Townson és mtsai. nem találtak különbséget a TNFα genotípusokban sPTB és kontroll terhes nőkben (86). Ezzel szemben mások a TNFα-308A allél hordozókban fokozott CA (74) és sPTB (87) kockázatot figyeltek meg. Egy másik kutatócsoport a koraszülés kockázatát fokozó allél-asszociációk meghatározását tűzte ki célul. Annels és mtsai. az IL-101082

A/-819T/-593A, a TNFα+488A/-238G/-308G és az IL-4-509C/C haplotípusokat azonosították

a koraszülés független kockázati tényezőiként (88). Ezek a vizsgálatok az anyai genotípus és a terhesség kimenetele közötti kapcsolatot vizsgálták. CA-ban azonban a magzat a magas proinflammatorikus citokintermelés fő forrása. Eddig kevés próbálkozás történt a magzati IL-1β és IL-1ra genotípus és a koraszülöttség közötti kapcsolat leírására. Az IL-1β3954T allél magzati hordozása (ami fokozott IL-1β aktivitással jár) fokozott sPTB kockázatot jelentett (89), míg az IL-1ra2N allél jelenléte a magzatban nem volt hatással a sPTB kockázatára (90). Két másik vizsgálat azonban az IL-1ra-2N allél homozigóta hordozásának jelentőségét mutatta ki a koraszülöttség kialakulásában (91,92). Ezek az eredmények alátámasztják, hogy az anyai és/vagy magzati citokin genetikai variánsok meghatározhatják a koraszülöttség kockázatát. Bár az anya és a gyermek között erős genetikai kapcsolat van, szükség lenne olyan vizsgálatokra, amelyek mind az anya, mind a gyermek genotípusát figyelembe veszik, hogy meghatározható legyen a genetikai hátterük független hozzájárulása a terhesség kimeneteléhez. Az anyai és magzati genotípus együttes meghatározásának jelentőségére világítanak rá Kalish és mtsai. eredményei is, akik megfigyelték, hogy egy a 2N-től különböző IL-1-ra genetikai

39

variáns és az IL-4-590T allél – ami megemelkedett IL-4 szintekhez vezet – anyai illetve magzati hordozása ikerterhességekben fokozta az sPTB kockázatát, az IL-10 A-1082G, IL-1β C3954T variánsoké azonban nem (93). Egy bázis cseréje a TNFα génben a -863-as helyen összefüggésben volt a koraszülés utánai kedvezőtlen kimenetellel anya-gyermek párokban, a -308-as helyen bekövetkező báziscsere azonban nem (73). A

citokin

hálózaton

kívül

más

jelátviteli

utak

genetikáját

is

vizsgálták

koraszülöttségben. Mivel a fertőzés a koraszülés egyik legfőbb kiváltó oka, az egyik lehetőség a bakteriális fertőzés felismeréséért felelős fehérjék SNP-inek vizsgálata. Annells és mtsai. a kórokozók felismerésében szerepet játszó mannózkötő lektin (MBL2) esetén a MBL2 codon 54Asp allél anyai jelenlétéről mutatták ki, hogy a 29. gesztációs hét előtti koraszülés független kockázati tényezője (88). Lorenz és mtsai. a toll-like receptor 4 (TLR4) polimorfizmusait vizsgálták (48). A TLR4 szintén a gyulladásos folyamat első lépésében, a baktériumok felismerésében játszik szerepet. A TLR4 Asp299Gly SNP-je esetén koraszülöttek és az egészséges újszülöttek esetében sem az anyai, sem a magzati oldalon nem találtak különbséget a mutáns allél prevalenciájában, viszont a koraszülöttekben az Asp/Gly és Gly/Gly genotípusok szignifikánsan gyakrabban fordultak elő (48). Ezt a megfigyelést azonban munkacsoportunk vizsgálata nem tudta megerősíteni (49). Az L-szelektin a gyulladásos folyamat következő fázisában a leukocyták migrációjában játszik szerepet. Kutatócsoportunk korábbi vizsgálatai alapján az L-szelektin Pro213Ser SNP esetén a mutáns 213Ser allél hordozás gyakoribb volt VLBW koraszülöttek között, mint érett újszülöttekben, illetve VLBW koraszülöttekben a mutáns 213Ser allél hordozása a BPD kialakulásának fokozott kockázatával járt (68). Ugyanakkor E- és Pszelektin polimorfizmusok (E-szelektin Ser128Arg, P-szelektin Thr715Pro) esetén az allélfrekvenciák nem különböztek a vizsgált koraszülött és egészséges újszülött populációkban (68). A fertőzésen kívül a praeeclampsia (PE) is gyakori oka a koraszülésnek. A PE genetikáját is intenzíven kutatják elsősorban a homeosztázist, vérnyomást és gyulladást szabályozó gének SNP-i és a PE közötti lehetséges kapcsolatok feltárását megcélozva. A PE genetikájának irodalmi áttekintése azonban meghaladja a disszertációm kereteit, ezért csak utalok néhány tanulmányra (94-98).

40

Az aszcendáló anyai infekció következtében kialakuló chorioamnionitis során felszabaduló gyulladásos mediátorok korai burokrepedés révén is kiválthatnak koraszülést (22,75). Ebben központi szerepe van a gyulladásos citokineknek és a mátrix metalloproteinázoknak (MMP) (81,82). A mátrix metalloproteinázokat (MMP), amik a magzatburkok lebomlásért és a korai burokrepedésért (PROM) felelősek, valószínűleg olyan citokinek aktiválják, mint a TNFα és az IL-6 (19,73,99). A korai burokrepedés genetikai hátterét is többen vizsgálták, elsősorban a gyulladásos citokin SNP-k illetve a burokrepedésért közvetlenül felelős mátrix metalloproteináz SNP-k és a korai burokrepedés között keresve kapcsolatot. Az MMP-knek több altípusa ismert számos SNP-vel. Ezek közül az MMP8 és MMP9 polimorfizmusai és a korai burokrepedés kockázata között találtak kapcsolatot. Az MMP8 C-799T, A-381G és C+17G SNP-k egyike sem volt önmagában felelős a korai burokrepedésért, a három ritkább allél együttes jelenléte azonban (ami a trophoblast sejtekben a legnagyobb MMP8 szinteket eredményezi), gyakrabban fordult elő korai burokrepedés után született afroamerikai újszülöttekben (100). Ferrand és mtsai. az MMP9 megváltozott szintjével járó 14 CA repeat polimorfizmus és a korai burokrepedés között találtak kapcsolatot afroamerikai anyák újszülöttjeiben (101). A gyulladásos citokin génpolimorfizmusok és a korai burokrepedés kockázata között is többen kerestek kapcsolatot. Bár nem mindegyik vizsgálat talált egyértelmű összefüggést, úgy tűnik, hogy a TNFα G-308A SNP, és a hősokk protein 70 (HSP70) A+1267G SNP magzati hordozása fokozhatja a korai burokrepedés kockázatát elsőszülöttekben (102). Roberts és mtsai. szerint a ritkább TNFα-308A allél anyai hordozása is hajlamosít a korai burokrepedést követő koraszülésre (87). Annels és mtsai. az IL-10

-1082

G/-819C/-593C haplotípus anyai hordozásáról mutatták ki, hogy a

korai burokrepedés független kockázati tényezője (88). 3.8.6.5. A tüdőfejlődés genetikai háttere A tüdő fejlődése összetett folyamat, ahol a sejtosztódást és a sejtek differenciálódását egy komplex autokrin-parakrin jelátviteli rendszer szabályozza. Az éretlenség, a gyulladás és a felszabaduló citokinek megzavarhatják a tüdőfejlődés összetett folyamatának finom szabályozó mechanizmusait. A tüdőfejlődésért felelős gének közül

41

több esetében is leírtak olyan mutációkat, melyek súlyos tüdőfejlődési zavarokhoz vezetnek (17,103). Ezek a mutációk a tüdőfejlődés zavarán, vagy az elhúzódó lélegeztetési igényen keresztül vezethetnek BPD kialakulásához (3). A 24. és 36. gesztációs hét közötti időszak a tüdőfejlődés legintenzívebb periódusa. Az arborizáció, alveolarizáció és vascularizáció egymással párhuzamosan következik be; és összehangolásukért illetve szabályozásukért több száz tagból álló génhálózatok felelősek. A tüdő morfogenezisében, a légutak dichotomicus osztódásában központi szerepet játszik a fibroblaszt növekedési faktor (FGF), a béta-katenin, a bone morphogenetic protein-4 (BMP-4) és a sonic hedgehog (SHH) protein. A tüdőfejlődés szabályozásában több transzkripciós faktor is részt vesz. A legfontosabbak közé tartoznak a tireoid transzkripciós faktor-1 (TTF-1), a GATA-6, a FOX-a2, a FOX-j1, a FOX-f1, a RARa/b, a HOX-b5 és a Gli család tagjai (101). Az alveolusok kialakulásában az FGF szerepe a meghatározó, hatását az FGF-R3/R4, PDGFa, FOX-a2 és GATA-6 útvonalon keresztül fejti ki. A tüdőfejlődésért közvetlenül felelős jelátviteli utakat érintő mutációk általában súlyos fejlődési zavarokhoz vezetnek, magas mortalitással járnak (103). Például az SHH/Gli és a TTF mutációja tracheo-oesophageális fisztulát, trachea malformációt, az FGF receptor mutációja trachea porcrendellenességet, a RARa/b mutációja tüdő hipopláziát, a HOX-b5 mutációja bronchialis sequestratiót, a FOX-j1 mutációja a csillók hiányát okozza. A csökkent tüdőfelület illetve a beszűkült légutak, születés után elhúzódó agresszív gépi lélegeztetést tesznek szükségessé, ami BPD kialakulásához vezethet. Mivel ezek a mutációk nagyon ritkák, valószínűleg a BPD-s betegek többségénél nincs jelentőségük (103). A tüdőfejlődést befolyásoló számos növekedési faktor közül az egyik legfontosabb a transzformáló növekedési faktor-béta (TGFβ), ami a simaizom sejtek és fibroblasztok proliferációját stimulálja, de erős antiinflammatorikus hatással is rendelkezik. Adcock és mtsai. a TGFβ C+915G SNP-t vizsgálták, de nem találtak kapcsolatot a BPD kockázata éa a polimorfizmus hordozása között (67). A további növekedési faktorok közül a mi kutatócsoportunk a tüdőfejlődésben is fontos inzulinszerű növekedésifaktor (IGF) funkcióját befolyásoló SNP-t vizsgált. Nem találtunk kapcsolatot az IGF-1R G+3174A SNP és a BPD kockázata között (104).

42

Az érfejlődés a bronchusok fejlődésével egyszerre bekövetkező folyamat. A megzavart érfejlődésnek egyre nagyobb szerepet tulajdonítanak a BPD kialakulásában (1,3,12). Az érfejlődés irányításában az angiogenetikus faktorok, elsősorban a VEGF és az angiopoietin játszanak központi szerepet (17). BPD-s állatmodellekben illetve BPD-s humán mintákban alacsonyabb VEGF szinteket találtak a plazmában és a tüdőmosó folyadékban (17). Az angiogenetikus faktorok termelését szabályozó gének funkcionális polimorfizmusai szintén befolyásolhatják a BPD kockázatát. Ezt a hipotézist azonban munkacsoportunkból Bányász és mtsai. a VEGF G+405C, T-460C és C-2578A SNP-k vizsgálata során nem tudták igazolni (105). A nagylégutak fejlődési zavara mellett az alveolarizáció zavara is hajlamosít BPD-re (12,17,103). Alveolarizációs zavarral járnak az elasztin és a proteoglikán gének mutációi. Ezek is súlyos tüdőkárosodásal, elhúzódó lélegeztetéssel járnak, ezáltal hozzájárulhatnak a BPD kialakulásához (12). Az elasztin és proteoglikán gének SNP-i és a BPD közötti közvetlen kapcsolatot eddig még nem vizsgálták. A tüdő éretlenségét legkarakterisztikusabban jelző szövődmény a respirációs distresszszindróma (IRDS), ami a 2-es típusú pneumocyták éretlensége miatt kialakuló surfactant hiány következménye (18). Régen az IRDS volt a BPD leggyakoribb oka, de még napjainkban is a BPD egyik legfontosabb kockázati tényezője. Manapság a szteroidprofilaxis és az exogén surfactant pótlás korában az IRDS a VLBW gyermekek 30-40%-át érinti (4). A surfactant négy különböző biológiai funkciójú fehérjét tartalmaz (SP-A, SP-B, SP-C és SP-D) (87,106,107). Az SP-A és SP-D a surfactanthoz kapcsolódó hidrofil fehérjék, melyek a surfactant homeostázisban és a tüdő veleszületett immunitásában játszanak szerepet (108). Az SP-B és SP-C kis, egyedi hidrofób fehérjék, melyek a surfactant lipidek alveolusokon belüli stabilitásában és eloszlásában játszanak fontos szerepet (109). Valamennyi surfactant proteint kódoló génnek számos SNP-je ismert, amiket IRDS-es és/vagy BPD-s gyermekekben vizsgáltak (61-64,110-112) Az SP-A egyik mutációjáról (az SPA1 6A6 allél hordozásáról) (109) és az SP-B gén 4. intronjának deléciós variánsáról kimutatták (62,63), hogy az IRDS és BPD független kockázati tényezői. Míg a surfactant fehérjéket kódoló gének további variációi nem mutattak közvetlen összefüggést a BPD kockázatával (61,64). Az SP-B (Ile131Thr) és SP-C (exon 1,4,5) SNP-i összefüggtek az IRDS-sel (12), ezáltal közvetve hatással lehetnek a

43

BPD kockázatára is. Az SP-B és SP-C néhány deléciója és mutációja a surfactant fehérjék teljes hiányához, vagy kóros surfactant proteinek termelődéséhez vezet, ami akut és krónikus tüdőkárosodás kialakulását eredményezi a hordozó újszülöttekben, illetve gyermekekben. A mutációk prevalenciája azonban nagyon alacsony, és ezért valószínűleg nem járulnak nagymértékben hozzá a BPD-s esetek kialakulásához. A recesszíven öröklődő SP-B mutációk a proSP-B és érett SP-B képződésének hiányához vezetnek. Az örökletes SP-B hiányos újszülöttek általában időre születnek, és mégis IRDS alakul ki náluk az első néhány órában. A surfactant pótlás és a modern lélegeztetési eljárások ellenére ezek a gyermekek általában néhány hónapos korukban meghalnak légzési elégtelenség következtében BPD-re és alveoláris proteinózisra jellemző tünetekkel. AZ SP-C mutációi dominánsan öröklődnek, de gyakoriak az új mutációk is. Az SP-C mutációi szintén IRDS-t, BPD-t és a tüdőszövet egyéb karakterisztikus elváltozásait okozzák (109). Az IRDS kockázata más gének SNP-ivel is kapcsolatba hozható. Munkacsoportunk egy a gyengült sejt védekezéssel összefüggő genotípus (hősokk protein (HSP)-721267GG genotípus) és az IRDS között talált kapcsolatot, ami felveti a HSP-k és a neonatális tüdőpatológia közötti kapcsolat lehetőségét (113). 3.8.6.6. A perinatális gyulladásos reakció genetikai háttere A gyulladás több szinten is befolyásolja a BPD kialakulását. Az aszcendáló anyai infekciók miatt kialakuló magzatfüggelék gyulladás koraszüléshez vezet, ami a BPD legfontosabb rizikótényezője (19). Másrészt a lokálisan (tüdőgyulladásban) és szisztémásan (szepszisben és nekrotizáló enterocolitisben (NEC)) felszabaduló citokinek és más gyulladásos anyagok aspecifikus tüdőkárosodáshoz vezethetnek (2123). Szisztémás gyulladás (szepszis) esetén a gyulladásos faktorok szintje aspecifikusan károsíthatja a szöveteket, így a tüdőt is (21-23). A perinatális szepszis kialakulásában jelentős szerepet tulajdonítanak az egyén genetikai fogékonyságának, a folyamatban résztvevő fehérjéket kódoló gének SNP-inek (47). Az összetett patomechanizmus miatt számos SNP-vel kapcsolatban feltételezték, hogy befolyásolhatja az újszülöttkori szepszis és szövődményeinek kialakulását és lefolyását.

44

A gyulladásos reakció kiváltásához vezető folyamatokban résztvevő fehérjék (így a CD14, TLR2, TLR4, MBL) SNP-i és az újszülöttkori szepszis között egyik vizsgálat sem mutatott ki kapcsolatot, annak ellenére, hogy felnőttek esetén több vizsgálat is összefügést talált a fenti SNP-k és a szepszis kockázata között (49,114). Ahrens és mtsai. a NOD2-3020insC-mutáció és a szepszis kockázata között találtak gyenge összefüggést (p=0,052) (114). A gyulladásos citokinek SNP-i közül a legtöbben a TNFα G-308A SNP-t vizsgálták. Hedberg és mtsai. vizsgálatai szerint az AA éa AG genotípust hordozó lélegeztetett VLBW újszülöttekben magasabb volt a szepszis mortalitása (115). Ugyanakkor a mi kutatócsoportunknak nem sikerült kapcsolatot találni az újszülöttkori szepszis kockázata és a TNFα, IL-1β, IL-4RA, IL-10 és IL-6 SNP-k között (43). Az IL-6 G-174C SNP hordozása és az újszülöttkori szepszis kockázata között Ahrens és Harding is talált kapcsolatot (114,116). Több adat utal arra, hogy a renin-angiotenzin rendszer a gyulladásban is fontos szerepet tölt be (47). Az angiotenzin szintet befolyásoló ACE I/D polimorfizmus és az újszülöttkori szepszis kockázata között ennek ellenére nem találtak összefüggést (117). A keringési elégtelenség (CF) is lehet az újszülöttkori szepszis tünete, ami általában légzéstámogatást is igényel. Nobilis és mtsai. az ACE I/D hordozóknál a DD genotípus védő hatását mutatták ki CF-fel szemben (118). Mások viszont pont ezzel ellentétes jelenséget figyeltek meg (119). A szisztémás gyulladás mellett vannak olyan kórképek, melyek szintén magasabb citokinszintekkel járnak, illetve önmagukban is fokozzák a légzéstámogatás iránti igényt (41,42). A gépi lélegeztetés és oxigénterápia per se fokozza a tüdőkárosodás kockázatát (1,3,4). A legtöbb perinatális szövődmény fokozott légzéstámogatási igénnyel jár, és ezáltal közvetve fokozhatja a tüdőkárosodás kockázatát. A gépi lélegeztetés tüdőfunkcióra gyakorolt hosszútávú hatásai különösen súlyosak lehetnek, ha a légzéstámogatás az első életnapokon következik be. Ezért a perinatális adaptáció zavarai fokozott kockázatot jelenthetnek a tüdőkárosodás és a BPD szempontjából. Perinatális adaptáció / keringési elégtelenség: a genetikai variánsok perinatális adaptációban betöltött szerepéről keveset tudunk. Előzetes adatok vannak az angiotenzin konvertáló enzim (ACE) inzerciós/deléciós (I/D) polimorfizmusáról koraszülöttek korai cardiorespiratoricus adaptációjában. Harding és mtsai. megfigyelték,

45

hogy a DD genotípus károsan befolyásolhatja a koraszülöttek korai egészségét (119). Ezzel szemben kutatócsoportunk vizsgálatai alapján egy érettlenebb populációban a DD genotípus védő hatású volt az első héten kialakuló keringési elégtelenséggel szemben (118). Ennek az ellentmondásnak a magyarázata is a vizsgált populációk eltérő érettségi szintje lehet, akárcsak a BPD – ACE I/D kapcsolat esetén. Nyitott Botallo-vezeték genetikai háttere: az ACE I/D polimorfizmuson kívül az angiotenzin II 1-es típusú receptorának A+1166C SNP-je is befolyásolja a reninangiotenzin rendszer működését. Korábbi vizsgálatainkkal kimutattuk, hogy fontos szerepe lehet PDA kialakulásában, mivel a +1166CC genotípus védő hatásúnak bizonyult a PDA-val szemben (122). A PDA kockázatot csökkentheti egy az ösztrogén érzékenységet befolyásoló SNP (ER PvuII) hordozása is (121). NEC: kutatócsoportunkból Szebeni és mtsai. nem találtak kapcsolatot a NEC gyakorisága és a CD14, TLR4, CARD15 SNP-k között (49). A gyulladásos citokin SNP-k közül Treszl és mtsai. a TNFα, IL-1β, IL-6, IL-10 SNP-i és a NEC kockázata között nem tudtak kapcsolatot kimutatni, viszont az IL-4RA mutáns allél hordozása védő hatást mutatott a NEC-kel szemben (44-46). Héninger és mtsai. megfigyelték, hogy az IL-18-607AA genotípus fokozza a legsúlyosabb stádiumú NEC kockázatát (120). Bányász és mtsai. a VEGF-2578, Derzbach és mtsai az ösztogén receptor (ER) PVUII SNP-je és a NEC kockázata között találtak kapcsolatot (105,121). A Perinatális agykárosodás: genetikai háttere: a kamrai vérzés (IVH), ami a VLBW újszülöttek akár 10%-át is érintheti, erősen fokozza a légzéstámogatás iránti igényt. Az éretlen központi idegrendszerrel rendelkező koraszülötteknél nagy a perinatális időszakban

bekövetkező

fejlődésneurológiai

agykárosodás

következményei

kockázata,

lehetnek.

A

aminek

károsodott

hosszútávú

véralvadási

és

immunfunkciók a perinatális agykárosodás legfontosabb kockázati tényezői közé tartoznak. Az agykárosodás kísérleti modelljeiben a gyulladásos citokinek (TNFα, IL1β, IL-18, MCP-1) fokozták az agykárosodás kiterjedését, míg az anti-inflammatorikus citokinek (IL-6, IL-10, IL-1ra) védő hatásúak voltak. Periventrikuláris leukomaláciában (PVL) emelkedett TNFα, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-10 és IL-18 szinteket figyeltek meg. IVH-ban és cerebrális parézisben emelkedett IL-1β, IL-6 és IL-8 szinteket találtak. Több megfigyelés is alátámasztja a funkcionális citokin SNP-k IVH kockázatban betöltött szerepét. A TNFα G-308A, IL-1β C-511T, IL-6 G-174C, IL-4 T-590C, és IL-10

46

G-1082A SNP-k hordozóiban fokozott a perinatális agykárosodás kockázata (123). Adcock és mtsai. szintén igazolták, hogy a TNFα -308A allél az IVH meghatározó tényezője (67). A többi SNP szerepéről az IVH-ban csak korlátozott mennyiségű adat áll rendelkezésre. Munkacsoportunk korábbi vizsgálatában az ER PvuII polimorfizmus és az IVH között mutattunk ki összefüggést. Baier és mtsai. összefoglalták a véralvadási rendszer mutációinak IVH-ban betöltött szerepét. A XIII-as faktor Val34Leu, az V-ös faktor Leiden, a prothrombin G20210A SNP-i és az IVH között írtak le összefüggést (123).

47

4. ábra: A BPD kockázati tényezői és genetikai hátterük Praeeclampsia Fertőzés (pneumonia) Kapcsolat: IL-12 Nincs kapcsolat: IFNγ

Chorioamnionitis Kapcsolat:TNFα, LTα

Gyulladás

Koraszülés

Szepszis

NEC

Kapcsolat: NOD2, IL-6, IFNγ, ACE Nincs kapcsolat: CD14, TLR4, TNFα, IL-1β, IL-4ra, IL-10, IL-12

Kapcsolat:IL-4ra, IL-12, IL-18, ER,VEGF; Nincs kapcsolat: CD14, TLR4, CARD15, TNFα, IL-1β, IL-6, IL-10, IFNγ

Perinatális adaptáció, keringési elégtelenség Kapcsolat: ACE

Légzéstámogatás Kapcsolat: TNFα, IFNγ, ER

IRDS

PDA Kapcsolat: IFNγ, ATR1, ER

Kapcsolat:TNFα, VEGF, AT, GNβ3,Factor V, MTHFR

Korai burokredés Kapcsolat: TNFα, IL-10, HSP72, MMP8, MMP9

Kapcsolat: TNFα, IFNγ, IL-1ra, IL-4, IL-6, IL-10, MBL, TLR-4, L-szelektin, VEGF, HSP72, SPC Nincs kapcsolat: IL-12, TLR2, CD14, CARD15, E-szelektin, P-szelektin

BPD Kapcsolat: L-szelektin, TNFα, IFNγ, GST, ACE, SPA, SPB, ER Nincs kapcsolat: SPC, LTα, TGFβ, IGF-1R, MCP-1, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12, Eszelektin, P-szelektin, VEGF, AT1R, Urokináz

Kapcsolat: SPA, SPB,

IVH Kapcsolat:TNFα, ER,

Tüdőfejlődés Kapcsolat: VEGF, Angiopoietin, FGF, TTF, SHH, HOX, RAR, Elasztin

A BPD-nek és legfontosabb kockázati tényezőinek genetikai háttere. Ellentmondásos adatok esetén (egyik vizsgálat talált kapcsolatot, míg a másik nem) mi csak a kapcsolatot tüntettük fel az ábrán. További részleteket és a rövidítéseket lásd a szövegben.

3.8.6.7. Az általunk vizsgált gén polimorfizmusok Genetikai vizsgálataink során koraszülöttek mintáival dolgoztunk. A vizsgált populáció alacsony létszáma miatt igyekeztünk olyan polimorfizmusokat vizsgálni, amelyek gyakoriak, magas mutáns allélfrekvenciával járnak, illetve az általunk vizsgált 100-200 fős populációban is kimutatható alléldúsulást okoz, ha összefüggésben állnak valamely vizsgált fenotípussal. Vizsgálatainkban törekedtünk a genetikai polimorfizmusokkal kapcsolatba hozható perinatális szövődmények patomechanizmusának magyarázatára is, ezért előnyben részesítettük a funkcionális polimorfizmusokat, ahol a mutáns allél hordozása a fenotípusban is megjelenik. TNFα A TNFα génje a 6p21.3 locusban helyezkedik el a HLA gének közelében. A TNFα génje számos SNP-t tartalmaz, több funkcionális SNP is ismert, amelyek bizonyítottan megváltozott TNFα termeléssel vagy funkcióval járnak. Az irodalomban legtöbbet a TNFα G-238A és a TNFα G-308A polimorfizmusokat vizsgálták. Mindkét polimorfizmus funkcionális, és prevalenciájuk elég magas a kaukázusi populációban, ahhoz, hogy az általunk

vizsgált

betegcsoportokban

szignifikáns

eltéréseket

detektálhassunk.

Választásunk azért esett a TNFα G-308A promoter polimorfizmusra, mert irodalmi adatok alátámasztják a szerepét tüdőkárosodásban, lélegeztetésben, és koraszülött szövődményekben is (51,124,125). IL-1β Az IL-1 két formában fordul elő. Az IL-1α és IL-1β aminosav szekvenciájukban különböznek, de térbeli szerkezetük hasonló, azonos receptoron fejtik ki hatásukat. Mindkét forma génje a 2. kromoszóma rövid karján helyezkedik el. Az IL-1β génjének számos polimorfizmusa ismert, ezeket hagyományosan a restrikciós enzim alapján nevezték el (Alu1, TaqI, BsoF1), azonban a megismert SNP-k számának növekedésével a pozíció alapján történő elnevezés vált meghatározóvá. Vizsgálatainkhoz olyan polimorfizmust kerestünk, ami magas prevalenciával fordul elő a

kaukázusi

populációban,

illetve

törekedtünk

funkcionális

polimorfizmus

kiválasztására. Választásunk az 5-ös exon 3954-es helyén található citozin-timin (C-T) cserével járó SNP-re esett. Irodalmi adatok szerint a T allél jelenlétében nagyobb mennyiségű IL-1β termelődik. Ezt a polimorfizmust már több betegségben vizsgálták, munkacsoportunk szeptikus újszülöttekben vizsgálta a szerepét (43,51,126-128). IL-6 Az IL-6 génje a 7-es kromoszóma rövid karján található. Számos SNP-t írtak le a gén területén. A legrégebben leírt funkcionális SNP a promoter régióban található IL-6 G-174C SNP. A C-allél hordozása bizonyítottan alacsonyabb citokinszintekkel jár, illetve jelenlétében csökken az LPS-sel vagy IL-1-gyel indukált IL-6 termelés. Számos betegségben illetve koraszülöttekben is vizsgálták már ennek a polimorfizmusnak a szerepét (51,129-133). Prevalenciája elég magas az általunk vizsgált populációban. IL-10 Az IL-10 génje az 1-es kromoszómán helyezkedik el. Szintén számos polimorfizmusa ismert. Az általunk vizsgált IL-10 G–1082A funkcionális polimorfizmus bizonyítottan megváltozott citokin termeléssel jár. Számos irodalmi adat támasztja alá szerepét gyulladásos mechanizmusú betegségekben és koraszülöttekben (51,134). IL-12 Az IL-12 p35 alegység génje a 3p12-q13.2 locusban, a p40 alegység génje a 5q31-32 locusban helyezkedik el. Az IL-12 p40 alegység génje sajátos szerkezetű, 8 exonja közül csak a 2-6 tartalmaz átíródó szekvenciát. Fontos biológiai funkciója miatt a gén konzervatív szerkezetű, kevés SNP-t tartalmaz. Eddig az irodalomban 14 SNP-t írtak le, ezek többsége ritka, és nem jár a citokintermelés megváltozásával. A promoter és a 3’UTR régióban is egy-egy polimorfizmust írtak le, de csak a promoter polimorfizmus járt bizonyítottan csökkent IL-12 expresszióval, gyakorisága is megfelelő a kaukázusi populációban (allélfrekvencia 30-40%) (51,135-137). IFNγ Az IFNγ génje a 12q14 locusban helyezkedik el. Α génben eddig 20 polimorfizmust írtak le. Ezek többsége nagyon ritka, az irodalomban 3 polimorfizmust vizsgáltak

50

részletesebben. A 3’UTR polimorfizmusnál nem tudtak egyértelmű citokinexpresszió változást kimutatni. A

+1004

CA repeat polimorfizmusról bebizonyították, hogy egyes

allélok csökkent IFNγ expressziót eredményeznek, de ezek kimutatása nehéz, mert közöttük csak 2 bp különbség van. Szerencsére a CA repeat polimorfizmus szoros kapcsoltságot mutat a T+874A polymorfizmussal, ami megfelelő gyakorisággal fordul elő a kaukázusi populációban (51, 138,139). ACE I/D Az angiotenzin konvertáló enzim génje a 17q23.3 locusban helyezkedik el. 36 SNP-je ismert, ezek közül 5 prevalenciája nagyobb 10%-nál. Az irodalomban azoban a legtöbb vizsgálat nem az SNP-kel hanem az úgynevezett inzerciós-deléciós polimorfizmussal kapcsolatos. Ez a polimorfizmus több elsősorban cardiovascularis megbetegedéssel is kapcsolatot mutatott. I allél esetén a gén 16. intronjába beépül egy 287 bp hosszúságú DNS szakasz. A D allél hordozóknál magasabb AII szinteket mértek a plazmában, és magasabb volt az ACE szöveti aktivitsa. (140) Kazzi és mtsai. összefüggést találtak a polimorfizmus és a BPD kockázata között koraszülöttekben, ezért vizsgálatunkban mi is ennek a polimorfizmusnak az előfordulását vizsgáltuk VLBW koraszülöttekben (50). AT1R Az angiotenzinnek két receptora ismert, a hatások többségét az egyes típusú receptoron (AT1R) keresztül fejti ki. Az AT1R génje több mint 55 kB hosszúságú, a 3q21-q25 locusban helyezkedik el. Legalább négy féle transzkripciós variánsa ismert, a teljes kódoló szekvencia az 5. exonban található. A génben számos polimorfizmust leírtak, a legismertebb a 3’ át nem íródó régióban (3’ UTR) elhelyezkedő AT1R A1166C SNP. Ez a polimorfizmus számos, elsősorban hipertóniával összefüggő állapottal mutatott összefüggést, bár a pontos hatásmechanizmus nem ismert, hiszen az SNP nem kódoló régióban helyezkedik el. Egyes vizsgálatok kapcsolatot találtak az ACE I/D és az AT1R A1166C SNP-k között, ezért mi is mindkét polimorfizmus szerepét megvizsgáltuk a koraszülöttek tüdőkárosodásában (141).

51

4. Célkitűzések A TNFα, IL-1β, IL-6 és IL-10 SNP-kel kapcsolatos vizsgálatok Egyre több adat utal a gyulladás központi szerepére a koraszülöttek tüdőkárosodásában, a BPD kialakulásában. A gyulladásos reakcióban a sejtek közötti kommunikáció a gyulladásos citokineken keresztül valósul meg. A gyulladásos citokinek termelődését a környezeti tényezőkön kívül az egyén genetikai adottságai is meghatározzák. A funkcionális polimorfizmusok esetén a mutáns allél eltérő citokin expresszióhoz vagy funkcióhoz vezet. Több vizsgálat igazolta egyes gyulladásos citokin polimorfizmusok szerepét gyulladásos mechanizmusú kórképekben, szepszisben, koraszülésben, sőt BPD-ben is. Ez alapján célul tűztük ki a legfontosabb proinflammatorikus citokinek (TNFα, IL-1β, IL-6) és a legismertebb antiinflammatorikus citokin az IL-10 funkcionális polimorfizmusainak a koraszülöttek tüdőkárosodásában és a BPD kialakulásában betöltött szerepének vizsgálatát. Az IFNγ és IL-12 SNP-kel kapcsolatos vizsgálatok A koraszülöttek immunrendszere éretlen, gyulladásos folyamataikban a veleszületett immunitás szerepe a meghatározó. A veleszületett immunitás két központi jelentőségű citokinje az IFNγ és az IL-12. Ezek termelődését is meghatározza az egyén genetikai háttere. Ismertek funkcionális polimorfizmusaik, ahol a mutáns allél hordozás megváltozott citokinexpresszióval jár. Több vizsgálat igazolta a két citokin jelentőségét a koraszülött patológiában, illetve tüdőbetegségekben. Vizsgálatunkban célul tűztük ki a veleszületett immunitás két központi citokinjének, az IFNγ-nak és IL-12-nek, legfontosabb funkcionális polimorfizmusai és a perinatális szövődmények kockázata közötti kapcsolat vizsgálatát, különös tekintettel a koraszülöttek tüdőkárosodására és a BPD-re.

52

ACE I/D és AT1R SNP-k vizsgálata Egyre több adat támasztja alá, hogy a RAAS a vérnyomásszabályozáson kívül a gyulladásos folyamatokban is szerepet játszik. A közelmúltban Kazzi és mtsai. kimutatták az ACE I/D polimorfizmusról, hogy befolyásolja a BPD kockázatát. Ez alapján mi is elvégeztük az ACE leggyakrabban vizsgált I/D polimorfizmusának illetve a RAAS funkcióját szintén befolyásoló AT1R polimorfizmusnak meghatározását LBW koraszülött populációban. Vizsgálatunk célja volt a Kazzi és mtsai. által közölt eredmények verifikálása, a renin-angiotensin-aldoszteron rendszer koraszülöttek tüdőkárosodásában és a BPD patomechanizmusában betöltött szerepének vizsgálata.

53

5. Betegek és módszerek 5.1. Betegek A vizsgálatban résztvevő újszülötteket a Semmelweis Egyetem II. sz. Nőgyógyászati Klinikájának Perinatális Intenzív Centrumában kezelték 2000 és 2003 között. A betegek személyes adatait (név, anyja neve, születési idő, születési hely) csak a betegek beazonosítására, a klinikai paraméterek begyűjtésére és a genetikai vizsgálatokhoz szükséges anyagcsereszűrésből visszamaradt vérminták bekérésére használtuk. (Az anyagcsere szűrés céljából a vérminták levétele az ötödik életnapon vagy az orális táplálás megkezdése után 3 nappal történt. Az anyagcsereszűrést a Budai Gyermekkórház Anyagcsereszűrő Központjában végezték, a vizsgálatból visszamaradt szűrőpapírra szárított vérmintákat is itt tárolták.) A további vizsgálatok során a betegekhez kódszámot rendeltünk, az analízis és adatfeldolgozás a kódszám alapján, anonim módon történt. A vizsgálati protokollt a Semmelweis Egyetem Tudományos Kutatás Etikai Bizottsága jóváhagyta (engedély száma: 16/2003). A klinikai adatok közül a születési súly, a gesztációs kor születéskor és a lélegeztetési paraméterek mellett a perinatális szövődményeket használtuk fel az adatok elemzése során. A perinatális szövődmények diagnosztizálásánál a II. sz. Nőgyógyászati Klinika munkatársai nemzetközileg elfogadott kritériumokat használtak. Az infekció klinikai jeleit és tüneteit – Dollner szerint – hat kategóriába sorolták: (I) pallor és icterus; (II) letargia, apnoe, bradycardia, irritábilitás és görcsök; (III) tachypnoe és dyspnoe; (IV) hipotónia, tachycardia és a mikrocirkuláció zavara; (V) hányás és hasi dystensio; (VI) láz, illetve hőmérséklet instabilitás. A szepszis diagnózisához legalább 3 kategóriában legalább 1 tünet jelenléte és emelkedett (>10mg/l) CRP érték volt szükséges. A pneumonia diagnózia a mellkasröntgen, az infekció jelei és az emelkedett (>10mg/l) CRP értékek alapján történt. A nekrotizáló enterocolitis diagnózisát a Bell-féle kritériumok alapján állították fel (I. stádium: véres széklet és hasi dystensio, II. stádium: intestinalis pneumatosis, III. stádium: bélperforáció).

54

A nyitott Botallo-vezeték szívultrahangos vizsgálattal, az IRDS a légzési elégtelenség jelei és a mellkasröntgen alapján került diagnosztizálásra. A BPD diagnózisát az 3.4. pontban ismertetett definíció alapján állították fel. Az akut veseelégtelenség (ARF) diagnózisa Modi kritériumain alapult: szérum kreatinin >120 μmol/l a második posztnatális napon mérve vagy a szérum urea >9mmol/l, illetve a diurézis <1,0ml vizelet/kg(testsúly)/24óra. A kamrai vérzés (IVH) diagnózisát a neurológiai tünetek és a kopony ultrahang alapján állították fel. A keringési elégtelenséget a tartósan (≥30 perc) fennálló súlyos hipotóniával, ahol a Hgmm-ben mért artériás középnyomás (MAP) a hetekben mért gesztciós kor számértéke alatt volt, illetve megemelkedett kapilláris telődési idővel (CRT) definiáltuk. A CRT-t a homlokra vagy a sternumra 30 másodpercig kifejtett közvetlen nyomás után vizsgáltuk, és 5 másodperc felett tekintettük megemelkedettnek. A TNFα, IL-1β, IL-6 és IL-10 SNP meghatározás Retrospektív vizsgálatunkba 123 kis születési súlyú (LBW, születési súly ≤ 1500 gramm) koraszülöttet vontunk be. A betegcsoport (59 fiú és 64 lány) heterogén volt a születési súly (középérték [tartomány]: 1200 [640-1500]), gesztációs kor születéskor (30 [24-36]), a perinatális szövődmények (nyitott Botall-vezeték: 46/123; respirációs distressz szindróma: 59/123, szepszis: 30/133; pneumonia: 38/123; nekrotizáló enterocolitis: 41/123), és a gépi lélegeztetés (2 [0-80] nap) illetve oxigénterápia (10 [0-83] nap) szempontjából. 99 beteget kellett oxigénterápiában részesíteni, közülük 82 gépi lélegeztetést is igényelt. 26 betegnél alakult ki BPD. IFNγ és IL-12 SNP meghatározás A vizsgálatba 172 egészséges érett újszülöttet (87 fiút és 85 lányt; születési súly (középérték[tartomány]): 3400 [2700-4200] gramm; gesztációs kor születéskor: 40 [3742] hét; az intrauterin retardáció (IUGR) prevalenciája (IUGR-t a gesztációs kornak megfelelő születési súly 10 percentilis alatti értékével definiáltuk): 0,03; perinatális komplikáció a kontrollcsoportban nem fordult elő) és 153 LBW újszülöttet (76 fiút és 77 lányt; születési súly (középérték[tartomány]): 1180 [510-1500] gramm; gesztációs

55

kor születéskor: 29 [24-36] hét; az intrauterin retardáció (IUGR) prevalenciája:0,18) vontunk be. Az LBW betegeknél rögzítettük a gépi lélegeztetés időtartamát ((középérték, [tartomány]) 4 [0-60] nap), az oxigénterápia teljes hosszát (12 [0-80] nap) valamint a perinatális szövődmények prevalenciáját. BPD 27 újszülöttnél alakult ki. Pneumonia 36, NEC 52, szepszis 47, ARF 40, infekció következtében kialakult alacsony vérnyomás 49, IRDS 80, PDA 50, IVH 47 esetben volt megfigyelhető. 51 koraszülött részesült születés előtti szteroid profilaxisban, születés után 23 újszülött kapott surfactant kezelést, 44 újszülött kapott dobutamint, és 11 újszülött igényelt sebészeti beavatkozást. ACE I/D és AT1R SNP vizsgálat Kazzi és mtsai. vizsgálatából kiundulva, a munkacsoportunk által korábban ACE I/D és AT1R

polimorfizmusok

szempontjából

megvizsgált

koraszülött

populációban

vizsgáltuk a légzéstámogatás idejének illetve a BPD előfordulásának kapcsolatát a fenti polimorfizmusokkal. 120 újszülött szűrőpapírra szárított vérmintája volt hozzáférhető a további vizsgálataink számára. Az orvosi dokumentáció átvizsgálása után kizártunk a további vizsgálatokból 6 újszülöttet, akik az első 3 életnapon transzfúzióra szorultak. A maradék 114 újszülöttből 33 szorult volumen-pótlásra vagy katecholamin kezelésre az első 3 életnapon kialakuló keringési elégtelenség (CF) miatt.

56

4. táblázat: Az ACE-AT1R SNP vizsgálatban résztvevő betegek klinikai jellemzői A betegek klinikai paraméterei ACE genotípus

DD/DI (n=105)

II (n=9)

Születési súly (gramm)

1233 ± 358

1497 ± 472

Gesztációs kor (hét)

30 ± 3

31 ± 4

Fiú

51%

67%

IRDS

49%

56%

2 (0-8)

1 (0-7)

Oxigén terápia ideje (nap)

3 (0-8)

11 (3-13)

BPD

18 (17%)

3 (33%)

Nincs BPD

87 (83%)

6 (67%)

Gépi lélegeztetés ideje (nap)

5.2. Módszerek 5.2.1. DNS izolálás szűrőpapíros mintából A mérésekhez az újszülöttek anyagcsere szűréséből visszamaradt, szűrőpapírra szárított vérmintáit használtuk. A DNS kivonását Chelex 100 (Chelex®, BioRad, Germany) gyanta segítségével végeztük. A DNS izolálás során a szűrőpapírból kivágott 2-3 mm2 felületű mintára 200μl 5%-os Chelex 100 oldatot mértünk. Ezután a mintákat előbb 90 percig 56˚C-on, majd 10 percig 99˚C-on inkubáltuk. Az így előkészített mintákat szobahőmérsékletre

hűtöttük,

majd

vortexxel

megkevertük.

Végül

10000rpm

fordulatszámmal 2 percig centrifugáltuk a mintáinkat a szennyeződések leülepítése céljából. A DNS-t tartalmazó felülúszót kódszámmal jelölt eppendorf csövekbe pipettáztuk és a további vizsgálatokig -20˚C-on tároltuk. A módszer során a DNS fragmentálódik, ezért néhány ezer bázispárnál hosszabb szakaszok amplifikálására az így kinyert DNS nem alkalmas.

57

5.2.2. Molekuláris biológiai vizsgálatok 5. ábra: A PCR-RFLP elve

DNS IZOLÁLÁS

Az ábrán a polimorfizmusok meghatározására használt PCR-RFLP módszer elve látható. A szűrőpapírra szárított vérmintából Chelex 100 segítségével izoláljuk a DNS-t, a polimorfizmust tartalmazó néhány száz bázispárnyi DNS szakaszt PCR segítségével amplifikáljuk, majd restrikciós enzimmel emésztjük, ami csak a mutáns allél jelenlétében hasítja el a vizsgált DNS szakaszt. A DNS-t agaróz gélelektroforézis segítségével méret alapján választjuk szét, majd UV fény alatt etidium-bromid festéssel jelenítjük meg. A TNFα, IL-1β, IL-6 és IL-10 meghatározás A vizsgált génpolimorfizmusok meghatározásához anyagcsereszűrésből visszamaradt, szűrőpapírra szárított vérmintákból izolált DNS-t használtunk. A PCR reakciót 50μl végtérfogatú elegyben végeztük, amely tartalmazott 5,0µl 1x PCR puffert (Invitrogen Corp. Carlsbad, California, USA), 1,0-1,0µl-t az 5. táblázatban jelzett sens és antisens primerekből (25pmol), 4,0µl dNTP keveréket (végkoncentráció 0,2mM), 3,0µl MgCl2-t (25mM) (végkoncentráció 1,5mM), 2,0µl genomikus DNS-t, 0,3µl Taq polimeráz-t gyári pufferben (Invitrogen Corp. Carlsbad, California, USA, 10U/μl) és 33,7µl desztillált vizet. A mintákra 2 csepp PCR olaj került majd a táblázatban feltüntetett idő és hőmérséklet értékeken PCR automatában amplifikáltuk a vizsgált DNS szakaszokat. A felszaporított DNS-t 2,5%-os agaróz gélen 200V feszültség mellett futtató pufferban (EDTA, Bórsav,

58

TRIS) választottuk szét, majd etidium-bromid festéssel (0,4mg/l) UV fény alatt tettük láthatóvá. Sikeres PCR reakció után, a restrikciós fragment hossz polimorfizmus (RFLP) vizsgálatot a táblázatban feltüntetett enzimekkel a megadott emésztési körülmények mellett végeztük el. A restrikciós enzimeket a Fermentas Life Sciences cégtől szereztük be (Fermentas Inc. Hanover, Maryland, USA). Az RFLP termékeket 3%-os agaróz gélen 200V feszültség mellett futtató pufferban (EDTA, Bórsav, TRIS) választottuk szét, majd etidium-bromid festéssel (0,4mg/l) UV fény alatt tettük láthatóvá.

59

5. táblázat: A TNFα, IL-1β, IL-6 és IL-10 meghatározás PCR-RFLP körülményei

TNFa G–308A Forward primer

Reverse primer Kezdeti denaturáció

5’-ATC TGG AGG AAG CGG TAG TG3’

IL-1ß C3954T

5’-AAT AGG 5’-AGA AGA 5’-GCC TTG 5’-TTA CCT TTT TGA GGG CCC CCC TCG TAA CCA GCC ATC CCT ACT CCA TG-3’ GAA CC-3’ TCT CCT-3’ TCC TC-3’ 94oC, 5perc

94oC, 5perc

Denaturáció Anneláció

55oC, 1perc

Extenzió

72oC, 30másodperc

97oC, 90/30másodperc 55oC, 90/30másodperc 72oC, 90/30másodperc

72oC, 7perc

Termék hossz

IL-10 G–1082A

5’-ATC TGG 5’-GCC CCC 5’-GTC AGT AGG AAG ACC AGT GGC GTT CCT CCC CGG TAG TGTAC C-3’ AGT-3’ 3’

94oC, 10másodperc

Végső extenzió Ciklusok száma Termék hossz Restrikciós enzim Restrikció körülményei

IL-6 G–174C

94oC, 5perc

94 C, 1perc

94oC, 30másodperc

60oC, 1perc

55oC, 1perc

72oC, 1perc

72oC, 1perc

72oC, 10perc

72oC, 5perc

72oC, 5perc

35

3/32

30

35

220bp

249bp

302bp

295bp

10U NcoI

10U TaqI

10U NlaIII

10U EarI

37oC, 16óra

65oC, 16óra

37oC, 16óra

37oC, 16óra

202/18bp G-allél esetén 220bp A-allél esetén

135/114 bp T-allél esetén 249bp C-allél esetén

134/111/57bp C-allél esetén 302bp G-allél esetén

275/20bp A-allél esetén 295bp G-allél esetén

60

o

6. ábra: A TNFα meghatározás PCR-RFLP képe

202bp GG

GG

220bp GA

GA

GA

200bp 100bp

AA

A TNFα vizsgálat képe emésztés után

Az IFNγ és IL-12 meghatározás A vizsgált génpolimorfizmusok meghatározásához anyagcsereszűrésből visszamaradt, szűrőpapírra szárított vérmintákból izolált DNS-t használtunk. A PCR reakciót 50μl végtérfogatú elegyben végeztük, amely tartalmazott 5,0µl 1x PCR puffert (Invitrogen Corp. Carlsbad, California, USA), 1,0-1,0µl-t a 6. táblázatban jelzett sens és antisens primerekből (25pmol), 4,0µl dNTP keveréket (végkoncentráció 0,2mM), 4,0µl MgCl2-t (40mM) (végkoncentráció 3,2mM), 2,0µl genomikus DNS-t, 0,3µl Taq polimeráz-t gyári pufferben (Invitrogen Corp. Carlsbad, California, USA, 10U/μl) és 32,7µl desztillált vizet. A mintákra 2 csepp PCR olaj került, majd a táblázatban feltüntetett idő és hőmérséklet értékek mellett PCR automatában amplifikáltuk a vizsgált DNS szakaszokat. A felszaporított DNS-t 2,5%-os agaróz gélen 200V feszültség mellett futtató pufferban (EDTA, Bórsav, TRIS) választottuk szét, majd etidium-bromid festés (0,4mg/l) után UV fény alatt vizualizáltuk. Sikeres PCR reakció után, a restrikciós fragment hossz polimorfizmus (RFLP) vizsgálatot a táblázatban feltüntetett enzimekkel a megadott emésztési körülmények mellett végeztük el. A Restrikciós enzimeket a Fermentas cégtől szereztük be (Fermentas Inc. Hanover, Maryland, USA). Az RFLP termékeket 3,5%-os agaróz gélen 200V feszültség mellett futtató pufferban (EDTA, Bórsav, TRIS) választottuk szét, majd etidium-bromid festés (0,4 mg/l) után UV fény alatt vizualizáltuk.

61

6. táblázat: Az IFNγ és IL-12 meghatározás PCR-RFLP körülményei IFNg T+874A

IL-12GC/CTCTAA

5’-TTC TTA CAA CAC AAA ATC AAG TC-3’ 5’-AGT ATT CCC AAA AGG CTT ATG T-3’

5’-TGT TCT AAT GTG GGG GCC ACG-3’ 5’-CTG TTT GTC AGC AGA CCT TCC T-3’

Kezdeti denaturáció

94oC, 5perc

94oC, 5perc

Denaturáció

94°C, 20másodperc

94°C, 20másodperc

Anneláció

50°C, 20másodperc

55°C, 20másodperc

Extenzió

72°C, 30másodperc

72°C, 30másodperc

Végső extenzió

72°C, 7perc

72°C, 7perc

Ciklusok száma

40

40

Termék hossz

366bp

227-223bp

Restrikciós enzim

8U Alw26

10U TaiI

Restrikciós körülmények

37°C, 16óra

65°C 16óra

340/26bp A-allél esetén

205/22 bp CTCTAA-allél esetén

366 bp T-allél esetén

223 bp GC-allél esetén

Forward primer Reverse primer

Termék hossz

Az IL-12 CTCTAA/GC polimorfizmus területén a DNS szakasz nem tartalmazott restrikciós hasító helyet. Az irodalomban a polimorfizmus kimutatására allélspecifikus PCR-t használtak, ezeket azonban nekünk nem sikerült reprodukálni. Ezért DNA-STAR program segítségével saját primerpárt terveztünk, majd a polimorfizmus mellett 1 bázis kicserélésével elértük, hogy az amplifikált DNS-ben CTCTAA allél esetén TaiI restrikciós hely képződjön.

62

7. ábra: Primer tervezés az IL-12 polimorfizmus detektálásához 8761 tgggatgggg ctcaggaacc tgcattttaa caatggaggt tctaatgtgg tcattggcag GC 8821 gttgttctaa tgtgggggcc acaTTAGAGc ctctctcgga gacaggctgt acatggccag 8881 ccagcattct ggtaatatga gccaaatgcc cattgaccta attttggaga agaggtttat 8941 caacatgtcc cacttcacaa tccagaccct gatcccaggc aaaataaact gatacctata 9001 agctttctat tgcttaccct atgggcgagg aaggtctgct gacaaacaga gggcgtgctg 8843-as A-G módosítással TaiI restrikciós hely (5’-ACGT-3’) kialakítása. 8761 tgggatgggg ctcaggaacc tgcattttaa caatggaggt tctaatgtgg tcattggcag GC 8821 gttgttctaa tgtgggggcc acGTTAGAGc ctctctcgga gacaggctgt acatggccag 8881 ccagcattct ggtaatatga gccaaatgcc cattgaccta attttggaga agaggtttat 8941 caacatgtcc cacttcacaa tccagaccct gatcccaggc aaaataaact gatacctata 9001 agctttctat tgcttaccct atgggcgagg aaggtctgct gacaaacaga gggcgtgctg Az irodalomban a polimorfizmust CTCTAA/GC névvel szokták jelölni, az ábrán az IL12 gén cDNS-ének érintett szakaszán a reverz komplement bázissorrend, TTAGAG/GC látható. A sárgával kiemelt szakaszok a PCR reakció során alkalmazott primereket, a zölddel kiemelt szakaszok a polimorfizmust, az aláhúzott bázisok a restrikciós hasítási helyet jelölik.

63

8. ábra: Az IFN-IL12 vizsgálat PCR-RFLP képe

IL-12GC/CTCTAA

205 bp

223 bp 200bp

II

DD

DI DD

II DD

II

II DD DD

100bp

IFNγ T+874A 366 bp 300bp TT

TA TA TT

AA

TA TA TT

340 bp

200bp 100bp

ACE I/D és AT1R meghatározás A vizsgált génpolimorfizmusok meghatározásához anyagcsereszűrésből visszamaradt, szűrőpapírra szárított vérmintákból izolált DNS-t használtunk. A PCR reakciót 50μl végtérfogatú elegyben végeztük, amely tartalmazott 5,0µl 1x PCR puffert (Invitrogen Corp. Carlsbad, California, USA), 1,0-1,0µl-t a 7. táblázatban feltüntetett sens és antisens primerekből (25pmol), 4,0µl dNTP keveréket (végkoncentráció 0,2mM), 3,0µl MgCl2-t (25mM) (végkoncentráció 1,5mM), 1,0µl genomikus DNS-t, 0,2µl Taq polimeráz-t gyári pufferben (Invitrogen Corp. Carlsbad, California, USA, 10U/μl) és 34,8µl desztillált vizet. A mintákra 2 csepp PCR olaj került majd a táblázatban feltüntetett idő és hőmérséklet értékeken PCR automatában amplifikáltuk a vizsgált DNS szakaszokat. A felszaporított DNS-t 2,5%-os agaróz gélen 200V feszültség mellett futtató pufferban (EDTA, Bórsav, TRIS) választottuk szét, majd etidium-bromid festéssel (0,4mg/l) UV fény alatt tettük láthatóvá. Az ACE I/D polimorfizmus detektálására két PCR reakciót végeztünk. A D-allél kimutatására alkalmas primerpár elvileg az inzerció esetén is DNS amplifikációt okoz, ez azonban a két reakció kompetíciója miatt a megadott körülmények között csak

64

homozigóta II genotípusnál figyelhető meg. Heterozigóta DI genotípus esetén a Dallélre jellemző (190 kb) termék dominál. Ezért a D-allélre tervezett PCR reakció elvégzése után, ha kimutatható volt a D allél jelenléte (DI, DD genotípus) elvégeztük a második I-allélre specifikus PCR reakciót is, ezáltal lehetővé vált a heterozigóták egyértelmű azonosítása. A D- és I-allél detektálására alkalmas primer párral külön PCR csőben végeztük el a reakciót a táblázatban feltüntetett körülmények között. Az AT1R polimorfizmust RFLP segítségével mutattuk ki. Sikeres PCR reakció után, az RFLP vizsgálatot AflIII restrikciós enzimmel végeztük (New England Biolabs, Beverly, MA, U.S.A.). Az emésztés körülményeit a 7. táblázat tartalmazza. Az RFLP termékeket 3%os agaróz gélen 200V feszültség mellett futtató pufferban (EDTA, Bórsav, TRIS) választottuk szét, majd etidium-bromid festéssel (0,4mg/l) UV fény alatt vizualizáltuk.

65

7.táblázat: Az ACE és AT1R meghatározás PCR-RFLP körülményei ACE I/D D-allél Forward primer Reverse primer Kezdeti denaturáció Denaturáció Anneláció Extenzió

ACE I/D I-allél

5’-CTG GAG ACC 5’-CTG GAG ACC ACT CCC ATC ACT CCC ATC CTT TCT-3 CTT TCT-3’ 5’-GAT GTG GCC 5’-TCG AGA CCA ATC ACA TTC TCC CGG CTA GTC AGA T-3’ AAA C-3’ 94oC, 5perc

94oC, 5perc

AT1R A1166C 5’-ATA ATG TAA GCT CAT CCA CCA AGA AG-3’ 5’-TCT CCT TCA ATT CTG AAA AGT ACT TAA-3’ 94oC, 4perc

94°C, 30másodperc 94°C, 30másodperc 94°C, 30másodperc 64oC, 1perc

64oC, 1perc

72°C, 30másodperc 72°C, 30másodperc

50oC, 1perc 72oC, 1perc

Végső extenzió

72°C, 10perc

72°C, 10perc

72°C, 10perc

Ciklusok száma

35

35

35

Termék hossz

190bp (D)/490bp (I)

278bp (I)

176bp

Restrikciós enzim

Afl-III

Restrikciós

37oC 16óra

körülmények

122/54bp C-allél esetén

Termék hossz

176bp A-allél esetén

66

5.2.3. Statisztikai elemzés A genetikai számításokhoz szükséges fogalmak Gén: Az örökítő anyag (DNS) azon részlete, amely egy meghatározott tulajdonság kialakításáért felelős fehérje felépülését határozza meg. Az öröklődés elemi egysége. Allél: Génváltozat. Az apai és az anyai kromoszóma ugyanazon helyén (locus) található gén eltérő módosulatainak egyike. A leggyakrabban előforduló módosulatot hordozó egyedeket vad típusnak nevezzük. Homozigóta: Egy adott tulajdonságra nézve azonos génváltozatokat (alléleket) hordozó egyed. A homológ kromoszómák adott génhelyén azonos allélek találhatók. Heterozigóta: Egy adott tulajdonságra nézve eltérő génváltozatokat (alléleket) hordozó egyed. A homológ kromoszómák adott génhelyén eltérő allélek találhatók. Genotípus: Az élőlény genetikai információ tartalma, azaz tulajdonképpen az egyed alléljainak összesége. Egy tulajdonságra nézve az egyed lehet homo- vagy heterozigóta. Fenotípus: Az élőlény mérhető, megnyilvánuló tulajdonságai. Génmutáció: A gén bázissorrendjében bekövetkező változás, amely megváltoztathatja a kódolt polipeptidlánc aminosavsorrendjét, így annak funkcióját, vagyis a gén által meghatározott tulajdonságot (fenotípus) Több típusa lehet: inzerció, deléció, báziscsere, tandem repeat stb. SNP: Single nucleotid polymorphism, egy bázis cserével járó polimorfizmus, régi nevén pontmutáció. Allélfrekvencia: Az allélok relatív gyakorisága, értéke 0 és 1 között lehet. Allélfrekvencia számítása: Legyen egy génnek két allélje „A” és „a”. Legyen a vizsgált populációban 100 egyed. (N=100) Ebből „AA” genotípusú 20, „Aa” genotípusú 70, „aa” genotípusú 10. Az összes allél száma ilyenkor 2N, azaz 200 (2x„AA”+ „Aa”+ „Aa”+2x„aa”). Az „A” allélek száma: 2x„AA”+ „Aa”=2x20+70=110 Az „a” allélek száma: „Aa”+2x„aa”=2x10+70=90 Az „A” allél relatív gyakorisága: p=(2x„AA”+„Aa”)/(2x„AA”+„Aa”+„Aa”+2x„aa”)=110/200=0,55 azaz 55%

67

Az „a” allél relatív gyakorisága: q=(„Aa”+2x„aa”)/(2x„AA”+„Aa”+„Aa”+2x„aa”)=90/200=0,45 azaz 45% Hardy-Weinberg szabály: Az ideális populáció zárt szaporodási közösségében az egyes allélok relatív gyakorisága nemzedékről nemzedékre állandó. Az ideális populáció feltételei a nagy egyedszám, a véletlen szaporodási közösség, az egyes genotípusok azonos szaporodási esélye, az hogy ne jelenjen meg új mutáció és az, hogy a populáció legyen elszigetelt, azaz ne keüljenek bele új génváltozatok. Bár a valóságban ideális populáció nem létezik, populáció genetikai vizsgálatoknál szokás a populációkat ideálisnak tekinteni, és összehasonlítani a mért illetve a Hardy-Weinberg egyensúly alapján számoított genotípus gyakoriságokat. Amennyiben a mért és számított értékek között szignifikáns különbséget találunk, az azt jelenti, hogy a populáció nem tekinthető ideálisnak, azaz a fenti feltételek valamelyike nem teljesül. Általában valamelyik allél vagy genotípus szelekciós előnyt jelent, ezért feldúsul a vizsgált populációban, vagy beteg populációt vizsgálva, ha a vizsgált allél és a betegség között kapcsolat van, akkor az allél feldúsul a beteg populációban. A Hardy-Weinberg szabályt matematikailag a Hardy-Weinberg egyenlet írja le. Legyen egy génnek két allélje „A” és „a”, az allélok gyakorisága az első nemzedékben p és q. Ez esetben p+q=1. A következő nemzedékben, mivel az ivarsejtek csak az egyik allélt tartalmazhatják, és azonos valószínűséggel kombinálódhatnak, az egyes genotípusok gyakorisága a következő lesz. „AA”: pxp=p2, „Aa”: 2xpxq=2pq, „aa”:qxq=q2 Az egyes genotípusok relatív gyakoriságának összege ebben a nemzedékben is 1, azaz p2+2pq+ q2=1 Tehát az allélgyakoriság változatlan maradt. A Hardy-Weinberg egyenlet általánosítható, kettőnél többallél leírására is alkalmas. Formája ekkor: (p+q+r+….)x(p+q+r+….)=1

68

Példa a Hardy-Weinberg egyensúly számításra: A vizsgált 100 fős populációban „AA” genotípusból 20-t, „Aa” genotípusból 70-t, „aa” genotípusból 10-t mértünk. Az allélfrekvenciák ekkor: p=0,55, q=0,45 A Hardy-Weinberg egyenlet (p2+2pq+ q2=1) alapján számított relatív genotípus gyakoriságok: p2=0,55x0,55=0,3025, 2pq=2x0,55x0,45=0,495, q2=0,45x0,45=0,2025 A 100 fős populációban az allélfrevenciák alapján tehát a genotípusok száma „AA”=0,3025x100=30,25 „Aa”=0,495x100=49,5 „aa”=0,2025x100=20,25 lenne a Hardy-Weinberg egyenlet alapján számítva. A mért genotípusok száma: „AA”=20 „Aa”=70 „aa”=10. A számított és mért genotípus frekvenciák khí-négyzet próbával összehasonlíthatók, amennyiben szignifikáns különbséget találunk nem teljesül a Hardy-Weinberg egyensúly. Példánkban (30,25-49,5-20,25 : 20-70-10) Khí-négyzet: 8,67, szabadsági fok: 2, p=0,013 Azaz a mért és számított értékek között szignifikáns különbség van, a Hardy-Weinberg egyensúly nem teljesül. Statisztikai módszerek Power analízis. A statisztikai power a vizsgálat erejét mutatja meg. Alkalmas arra, hogy a kimutatandó különbséghez megadjuk a szükséges mintaszámot, vagy fordított esetben arra is alkalmas, hogy egy adott mintaszámnál meghatározzuk a legkisebb kimutatható különbség mértékét. Vizsgálatainkban a poweranalízist Statistica 6.0-s statisztikai szoftverel végeztük. Valamennyi vizsgálatban 100-200 fős populáció állt rendelkezésre, kétszeres különbség kimutatását tűztük ki célul. A α értéket 0,05-ként, a β értéket (power) 0,8-ként definiáltuk. A poweranalízis alapján vizsgálataink 20-30%-os különbségek kimutatására voltak alkalmasak. A kategorikus változók összehasonlítására khí-négyzet próbát, illetve ennek speciális esetét a Fischer egzakt próbát használtuk. A folytonos normális eloszlású változók összehasonlítása t-próbával történt. A változók normális eloszlásának meghatározása

69

Kolgomorov-Smirnov próbát használtunk. A varianciákat F-próbával hasonlítottuk össze. A nem normális eloszlást követő vagy eltérő varianciájú folytonos változókat Mann-Whitney féle U-próbával hasonlítottuk össze. A folytonos, normális eloszlású változók közötti kapcsolat leírására lineáris regressziót használtunk. A kategorikus függő változók esetén logisztikus regresszióval kerestük a kapcsolatot. A regressziós vizsgálatok során a legfontosabb ismert kockázati tényezőkre korigáltuk az összefüggést, hogy a független változók önálló hatását vizsgálhassuk. A szignifikancia szintet minden vizsgálatnál p<0,05-ként határoztuk meg. Valamennyi statisztikai számítást az SPSS 10.0 statisztikai programcsomaggal végeztünk. (SPSS Inc, Chicago, IL). A TNFα, IL-1β, IL-6 és IL-10 SNP-kel végzett vizsgálatok kiértékelésénél alkalmazott statisztikai módszerek A genotípusok és az oxigénterápia és/vagy gépi lélegeztetés iránti igény, illetve a BPD kockázata között a kapcsolatot khí-négyzet próbával vizsgáltuk. Az összefüggéseket korrigáltuk a gesztációs korra és a BPD kialakulását befolyásoló perinatális komplikációkra. Ehhez logisztikus regressziót használtunk. Az oxigénterápia, illetve a gépi lélegeztetés napokban mért hosszának ezután a logaritmusát képeztük, hogy normális eloszlású változót kapjunk. Ezután többszörös regressziós analízist végeztünk, ahol a genotípusok, gesztációs kor és a perinatális szövődmények voltak a független változók, míg az oxigénterápia illetve gépi lélegeztetés logaritmizált hossza volt a függő változó. Azt is megvizsgáltuk, hogy a két citokin polimorfizmus variánsainak együttes hordozása befolyásolja-e a lélegeztetési paramétereket. Ehhez is a korábban ismertetett módszereket használtuk. Az IFNγ és IL-12 SNP-kel végzett vizsgálatok kiértékelésénél alkalmazott statisztikai módszerek A számított és a mért genotípus gyakoriságok összehasonlításához elvégeztük HardyWeinberg egyensúly kiszámítását. A kategórikus változók közötti kapcsolatot khínégyzet próbával vizsgáltuk, a folytonos, normális eloszlású változók összehasonlítása t-próbával történt. A gépi lélegeztetés és oxigénterápia napokban mért hosszának a logaritmusát képeztük, hogy normális eloszlású változókat kapjunk. Többszörös lineáris

70

regressziós analízist végeztünk, hogy meghatározzuk a genotípusok hatását a lélegeztetésre. A BPD és a polimorfizmusok közötti, más tényezőktől független kapcsolat meghatározása céljából stepwise bináris logisztikus regressziót végeztünk. Mindkét regressziós vizsgálat során korrigáltuk az összefüggéseket a gesztációs korra és a klinikai paraméterekre. Megvizsgáltuk a genotípusok kapcsolatát a BPD-től független, egyéb perinatális szövődményekkel is. Ehhez a vizsgálathoz is logisztikus regressziót használtunk és az összefüggéseket a gesztációs korra illetve a klinikai paraméterekre korigáltuk. A vizsgálataink során a szignifikancia szintet p<0,05 értékkel definiáltuk. Minden statisztikai számítást az SPSS 10.0 statisztikai programcsomaggal végeztünk. (SPSS Inc, Chicago, IL). Az ACE I/D és AT1R SNP-kel végzett vizsgálatok kiértékelésénél alkalmazott statisztikai módszerek A vizsgálat során a Kazzi és mtsai által közölt BPD és ACE I/D polimorfizmus közötti kapcsolatra vonatkozó eredményeket hasonlítottuk össze az általunk ACE I/D illetve AT1R polimorfizmusokra vizsgált populáció klinikai jellemzőivel. A kategorikus változól összehasonlítását khí-négyzet próbával végeztük, a folytonos normális eloszlású változókat Student féle t-próbával, a nem normális eloszlást követő folytonos változókat Mann-Whitney féle U-próbával hasonlítottuk össze. A statisztikai számításokat az SPSS 10.0 statisztikai programcsomaggal végeztünk. (SPSS Inc, Chicago, IL).

71

6. Eredmények 6.1. A TNFα, IL-1β, IL-6 és IL-10 SNP-k és a lélegeztetés Valamennyi vizsgált polimorfizmus esetén a genotípusok eloszlása Hardy-Weinberg egyensúlyban volt. A TNFα -308A allél gyakorisága 0,12, az IL-1β 3954T allél gyakorisága 0,23, az IL-6-174C allél gyakorisága 0,27, és az IL-10-1082A allél gyakorisága 0,46 volt, ami megfelel a korcsoportban mért magyar referencia értékeknek (43). A fentiek közül egyik genotípus sem mutatott összefüggést a gépi lélegeztetés illetve az oxigénterápia idejével vagy a BPD kialakulási kockázatával. A stepwise többszörös regressziós vizsgálat eredményei ugyanakkor azt mutatták ki, hogy a TNFα -308A allél hordozása átlagosan 40 órával hosszabb gépi lélegeztetést (p=0,004), és átlagosan 36 órával hosszabb oxigénkezelést (p=0,0008) tett szükségessé. (8. táblázat) A vizsgált citokin polimorfizmusok együttes hordozása nem járt elhúzódó légzéstámogatással. 8.táblázat: Az oxigénterápia és a gépi lélegeztetés hosszával szignifikáns összefüggést mutató paraméterek illetve a stepwise többszörös regressziós vizsgálat eredményei a TNFα, IL-1β, IL-6 és IL-10 vizsgálatban Változók

béta

p

Járulékos légzéstámogatási idő órákban. (eβ*24)

Oxigénterápia hossza Respirációs distressz-szindróma

0,60

0,014

44

Tüdőgyulladás

0,41

0,020

36

TNFα -308A allél hordozás

0,48

<0,001

39

Gépi lélegeztetés hossza Respirációs distressz szindróma Születési súly (1000g alatt) TNFα -308A allél hordozás

0,97

<0,001

63

-0,28

0,007

4,6/100g

0,74

0,004

50

72

6.2. Az IFNγ és IL-12 SNP-k és lélegeztetés Valamennyi genotípus Hardy-Weinberg egyensúlyban volt, az összes vizsgált populációban. Az IFNγ T+874A genotípusok (TT/TA/AA) prevalenciája az érett illetve LBW újszülöttekben 0,33/0,46/0,21 illetve 0,17/0,56/0,25 volt. Az IFNγ+874A allél szignifikánsan gyakrabban fordult elő koraszülöttekben (0,44 vs. 0,54, OR [95% CI]: 1,50 [1,10-2,05]). Az IL-12 p40 promoter CTCTAA/GC (I/D) genotípusok (II/ID/DD) prevalenciája érett illetve LBW újszülöttekben 0,33/0,47/0,20 illetve 0,28/0,50/0,20 volt. A mutáns allél prevalenciája megegyezett a két csoportban (0,44 vs. 0,46). A

stepwise

lineáris regressziós

modelünk

szerint

A

légzéstámogatás

ideje

összefüggésben volt a születéskori gesztációs korral, az IVH előfordulásával és az IFNγ Α+874T genotípussal. Az IFNγ+874T allél hordozók 41%-kal rövidebb gépi lélegeztetést illetve 34%-kal rövidebb oxigénterápiát igényeltek, mint az IFNγ+874AA genotípusú újszülöttek (9. táblázat). A vizsgált IL-12 polimorfizmus nem mutatott összefüggést a lélegeztetéssel. Megvizsgáltuk a genotípusok és a perinatális szövődmények közötti kapcsolatot is. Khínégyzet próbával csak az IL-12 genotípus (II/ID/DD) eloszlásában találtunk különbséget azon LBW újszülöttek között, akiknél tüdőgyulladás alakult ki, illetve akiknél nem (0,23/0,57/0,20 vs. 0,47/0,36/0,17 OR [95% CI]: 1,76 [1,13-2,76] p=0,014). Azonban stepwise bináris logisztikus regresszióval az IFNγ+874T allél hordozása a BPD független kockázati tényezőjének bizonyult (OR: 0,35 [0,12-0,99]). Az IL-12 polimorfizmus önmagában nem mutatott összefüggést a BPD kockázatával, de az IL-12 CTCTAA allél hordozókban fokozott volt a tüdőgyulladás kockázata (OR: 1,76 [1,13-2,76]). A Bináris logisztikus regressziós vizsgálat több más összefüggést is kimutatott a légzéstámogatás hosszát befolyásoló perinatális szövődmények kockázata és az IFNγ A+874T genotípus között. Az IFNγ+874T allél hordozók védettek voltak PDA kialakulásával szemben (a megfelelő esélyhányadosokat lásd a 9. táblázatban). Az IFNγ+874A allél hordozóknál magasabb volt a fertőzés következtében kialakult súlyos hipotónia és az IRDS kockázata. Ezek az összefüggések adjustálva lettek a gesztációs korra és más kockázati tényezőt jelentő perinatális szövődményekre.

73

Az IL-12 p40 promoter CTCTAA/GC polimorfizmussal kapcsolatos vizsgálataink szerint az IL-12 GC allél hordozóknál alacsonyabb volt a tüdőgyulladás kialakulásának kockázata, illetve az IL-12 CTCTAA allél hordozóknál fokozott volt a NEC kialakulásának a kockázata. A heterozigótáknál csökkent a tüdőgyulladás és nőtt a NEC kialakulásának kockázata a homozigótákhoz képest. Megvizsgáltuk az IFNγ+874A x IL-12 GC allélek együttes hordozásának hatását is a perinatális szövődmények kialakulására. Azoknál az újszülötteknél, akik mindkét allélt hordozták nagyobb volt a fertőzés következtében kialakuló súlyos hipotónia kockázata.

74

9. táblázat: Az IFNγ és IL-12 vizsgálat eredményeinek összefoglalása: a vizsgált genotípusok és a lélegeztetési paraméterek illetve a perinatális szövődmények kapcsolata

A többszörös lineáris regressziós analízis eredményei Függő változó log(gépi lélegeztetés hossza) log(oxigén terápia hossza)

Független változók IFN T allél hordozás IFN T allél hordozás

p

B

eB †

0,002

-0,533

0,59

0,003

-0,438

0,65

A stepwise bináris logisztikus regressziós analízis eredményei Függő változó Bronchopulmonális dysplasia Nyitott Botallo-vezeték Idiopátiás respirációs distressz-szindróma Fertőzés következtében kialakuló súlyos hipotónia Tüdőgyulladás

Nekrotizáló enterocolitis

Független változók

p

Béta

eβ=OR [95% CI]

IFN T allél

0,049

-1,054

0,35 [0,12-0,99]

IFN AA x IL12 ID genotípus

0,042

1,488

4,43 [1,06-18,6]

IFN T allél

0,043

-0,837

0,43 [0,19-0,97]

IFN A allél

0,016

1,395

4,03 [1,30-12,5]

IFN A allél

0,049

1,225

3,40 [1,01-11,5]

IL-12 D allél

0,009

-1,135

0,322 [0,14-0,75]

IL-12 DI genotípus

0,016

-1,076

0,341 [0,14-0,82]

IL-12 I allél

0,046

0,862

2,369 [1,01-5,53]

IL-12 DI genotípus

0,004

1,069

2,914 [4,41-6,02]

Többszörös lineáris regressziós analízis: A gépi lélegeztetés és az oxigénterápia napokban mért hosszának logaritmusát képeztük, hogy normális eloszlású változót kapjunk. A változókat korrigáltuk a születéskori gesztációs korra és azokra a perinatális szövődményekre, amelyek valószínűleg befolyásolják a lélegeztetési paramétereket. A születéskori gesztációs kor valamennyi összefüggésnél szignifikáns (p < 0,001) kockázati tényező volt. B jelenti a regressziós koefficienst;

75

†

eB = az IFNγ T allélt

hordozó illetve nem hordozó újszülöttek gépi lélegeztetési idejeinek, illetve oxigénterápiás idejeinek aránya. Stepwise bináris logisztikus regresszió: A genotípusok és a perinatális szövődmények közötti összefüggéseket a születéskori gesztációs korra és az ismert kockázati tényezőkre korrigáltuk. A születéskori gesztációs kor valamennyi összefüggés esetén szignifikáns (p < 0,05) kockázati tényező volt, az IVH szignifikáns kockázati tényezője volt a lélegeztetési időknek és a BPD kialakulásának, a fertőzés következtében kialakuló súlyos hipotónia szignifikáns kockázati tényezője volt a tüdőgyulladás kialakulásának, és az IRDS szignifikáns kockázati tényezője volt a fertőzést kísérő súlyos hipotónia kialakulásának. Béta a standardizált regressziós koeficiens, OR az esélyhányados, CI a 95%-os konfidencia intervallum. 6.3. Az ACE I/D és AT1R SNP-k és lélegeztetés Kutatócsoportunk számos más polimorfizmus szerepét is vizsgálta a koraszülöttek morbiditásában, így az ACE I/D és AT1R A1166C polimorfizmusok is meghatározásra kerültek több mint száz, 1750g alatti születési súlyú újszülöttben (10. táblázat). Kazzi és mtsai. ötletére alapozva az adatok újraértékeléséval megvizsgáltam, hogy a fenti polimorfizmusok befolyásolják-e a BPD kialakulási kockázatát illetve a lélegeztetési időket. Mindkét vizsgált polimorfizmus Hardy-Weinberg egyensúlyban volt. Érdekes módon Kazzi és mtsai-val ellentéten nem sikerült összefüggést kimutatni sem az ACE sem az AT1R genotípusok és a BPD kockázat illetve a lélegeztetési idők között.

76

10.táblázat: ACE I/D polimorfizmus VLBW koraszülöttekben, Kazzi és mtsai. illetve saját eredményeink összehasonlítása Az újszülöttek klinikai paraméterei Vizsgálat Genotípus Születési súly (g)* Gesztációs kor születéskor

Bokodi és mtsai.

Kazzi és mtsai.

DD/DI

II

DD/DI

II

(n=105)

(n=9)

(n=97)

(n=23)

938 ± 204

925 ± 196

1233 ± 358§ 1497 ± 472§ 30 ± 3

31 ± 4

28 ± 3

28 ± 2

51%

67%

42%

48%

49%

56%

76%

74%

2 (0-8)

1 (0-7)

13 (1-45)

8 (1-27)

3 (0-8)

11 (3-13)

52 (7-74)

31 (3-60)

BPD†

18 (17%)

3 (33%)

46 (47%)$

5 (22%) $

Nincs BPD†

87 (83%)

6 (67%)

51 (53%)$

18 (78%) $

(hét)* Fiú † Respirációs distresszszindróma† Gépi lélegeztetés ideje napokban# Oxigénterápia ideje napokban#

A vastag betűvel jelölt változók különböztek a két vizsgálatban *

Student féle t-próba. Az értékek átlag ± szórás formában vannak megadva.

†

khí2-próba. Az értékek százalékban vannak megadva.

#

Mann-Whitney féle U-próba, az értékek medián (25-75 percentilis) formában vannak

megadva. §

p<0,05, $ p<0,025

77

7. Megbeszélés 7.1. A TNFα, IL-1β, IL-6 és IL-10 SNP-k és lélegeztetés A perinatális tüdőkárosodás patogenezisében tagadhatatlan a citokinek központi szerepe, bár a pontos kölcsönhatások feltárásához még további vizsgálatok szükségesek (65,142,143). Egyes vizsgálatok szerint a gyulladásos citokinek (IL-1β, TNFα) szintjei nőttek, míg az antiinflammatorikus citokinek (IL-6, IL-10) szintjei csökkentek a hosszú idejű oxigénterápiában részesülő újszülöttek trachea váladékában és vérmintáiban (65,124,144). A mi vizsgálatunk célja az volt, hogy meghatározzuk, hogy van-e kapcsolat ezen citokinek funkcionális polimorfizmusai és a BPD kockázata illetve az oxigénterápia és gépi lélegeztetés hossza között. Nem tudtunk kimutatni összefüggést a vizsgált SNP-k és a BPD kockázata között. Ez összhangban van Adcock és mtsai. eredményeivel, akik szintén nem találtak kapcsolatot BPD kockázata és a TNFα G-308A genotípus között (67). Ennek ellenére a BPD összetett patomechanizmusa és az érintett populáció heterogenitása miatt további vizsgálatok szükségesek nagyobb számú VLBW újszülött bevonásával, hogy biztosan kizárható legyen a vizsgált citokin polimorfizmusok hatása a BPD kialakulási kockázatára. Enyhébb tüdőkárosodást elszenvedett betegekben azonban ki tudtuk mutatni, hogy a TNFα G-308A genotípus – ami emelkedett TNFα szintekkel jár – mégis befolyásolhatja a VLBW újszülöttek oxygén támogatási igényét. Ez az eredmény összhangban van a TNFα tüdőkárosodásban betöltött központi szerepével (23,43,67,124). Érdekes módon az eredményeink különböznek a felnőtt betegekben megfigyeltektől. Yende és mtsai. hosszabb gépi lélegeztetési időket figyeltek meg coronaria bypass műtét után azokban a betegekben, akik alacsony TNFα szekrécióval járó haplotípust hordoztak. (pl. lymphotoxin-α+250G és TNFα-308G allélok) (125). Ezért a különbségért az eltérő patomechanizmusú kórkép, illetve az eltérő betegpopuláció lehet a felelős, hiszen Yende és mtsai. egészséges tüdejű felnőtt betegeket vizsgáltak coronaria műtét után, míg mi tüdőkárosodásra hajlamos VLBW koraszülötteket vizsgáltunk.

78

Összefoglalva az eredményeink alátámasztják azt a hipotézist, hogy a TNFα G-308A genotípus hozzájárul a beteg koraszülöttek gépi lélegeztetés, illetve oxigénterápia iránti igényéhez. 7.2. Az IFNγ és IL-12 SNP-k és lélegeztetés A veleszületett és adaptív immunreakciók csökkent értékűek koraszülöttekben. Ennek közismert klinikai jele a koraszülöttek fokozott érzékenysége a fertőzésekkel szemben, beleértve az intracelluláris kórokozókat is (52-55). Összehangolatlan immunreakciókat azonban számos más stimulus is kiválthat, ami szerv- és szövetkárosodáshoz vezethet. Szövetkárosodás szempontjából a tüdő az egyik legérzékenyebb szerv. Több vizsgálat is kapcsolatot talált a gyulladásos citokinek, mint a TNFα, IL-8 és IL-1β, fokozott termelése és a gépi lélegeztetés iránti igény illetve a BPD kialakulási kockázata között (4,23). Azt is többen kimutatták, hogy a veleszületett immunitás két legfontosabb citokinjének, az IFNγ-nak és IL12-nek a termelése még nem megfelelő koraszülöttekben. Bár kevés adat van arról, hogy mi a szerepe ezeknek a citokineknek a perinatális szövődmények patomechanizmusában, feltételezhető a gyulladásos mechanizmusú szövődmények és a nem megfelelő IFNγ illetve IL12 termelés kapcsolata koraszülöttekben (52,53). Ebben a vizsgálatban az IFNγ+874A és IL-12 CTCTAA allélok hordozása – mindkettőt alacsony citokinszintekkel hozták kapcsolatba – és a születés utáni oxigénigény, illetve a légzéstámogatás iránti igényt befolyásoló perinatális szövődmények kockázata között kerestünk kapcsolatot (135,138,145-147). Egészséges, érett újszülöttekben a referencia értékeknek megfelelő allélfrekvenciákat találtunk mind az IFNγ mind az IL-12 polimorfizmus esetén (42,145,148). LBW koraszülöttekben azonban a IFNγ+874A allél gyakoribb volt mint érett újszülöttekben. Ez az eredmény utalhat az IFNγ koraszülés patomechanizmusában betöltött szerepére. Mi azonban csak az újszülöttek genotípusát vizsgáltuk a szülőkét nem. Mivel az újszülöttek alléljainak fele származik csak az anyától, nem tudhatjuk, hogy a koraszülés hátterében az újszülött vagy az anya genotípusa áll. Ezért az IFNγ Τ+874A polimorfizmus koraszülés patomechanizmusában betöltött szerepének tisztázásához további vizsgálatok szükségesek, amelyek figyelembe veszik az újszülött mellett az anya és az apa genotípusát is.

79

A genotípusok és a lélegeztetési paraméterek közötti kapcsolat vizsgálata során megfigyeltük, hogy az IFNγ+874T allél hordozók körülbelül 40%-kal rövidebb gépi lélegeztetést, illetve oxigénterápiát igényeltek, mint az állélt nem hordozó újszülöttek. Az IFNγ+874T allél hordozás emelkedett IFNγ szintekkel jár, ezért eredményeink összhangban vannak Bont és mtsai. megfigyeléseivel, akik összefüggést találtak az elhúzódó gépi lélegeztetés és az alacsony szérum IFNγ szintek között RSV-vel fertőzött újszülöttekben (149, 150). Vizsgálataink szerint az IFNγ+874T allél hordozók a BPD kialakulásával szemben is védettek voltak, míg az IFNγ+874AA és IL-12 GC/CTCTAA genotípusokat együtt hordozó újszülötteknél fokozott volt a BPD kialakulásának kockázata. Bár egyelőre nincsenek adatok emberben a BPD és az IL-12 illetve IFNγ szintek közötti kapcsolatra, eredményeink összhangban vannak az újszülöttek krónikus tüdőkárosodásának kialakulását leíró legfrissebb elméletekkel. Ezek szerint a citoknek termelődését a fertőzések, a gyulladásos mechanizmusú perinatális szövődmények és a gépi lélegeztetés szövetkárosító hatásai váltják ki. Az emelkedett gyulladásos citokinszintek, mint az IL-1β, a TNFα és az IL-8 igazoltan központi szerepet játszanak a BPD és a tüdőkárosodás patomechanizmusában (4,23). Ezekről a citokinekről azt is kimutatták, hogy befolyásolják más gyulladásos citokinek, így az IL-12 és az IFNγ termelődését, amik így szintén részt vehetnek a BPD kialakulásában (151). A gépi lélegeztetés, illetve oxigénterápia iránti igényt számos perinatális szövődmény befolyásolja (3,23,152-154). Ezért megvizsgáltuk az IL-12 p40 promoter GC/CTCTAA és IFNγ T+874A genetikai polimorfizmusok és a NEC, tüdőgyulladás, perinatális fertőzés, illetve szepszis közötti kapcsolatot, mivel mind a négy perinatális szövődmény kialakulásában központi szerepe van a gyulladásnak. A szepszis és a vizsgált polimorfizmusok között nem találtunk kapcsolatot, azonban a vizsgált IFNγ allélek hordozása mégis hatással lehet a szepszis súlyosságára. Ugyanis az alacsony IFNγ termelésre hajlamosító allél hordozóinál vizsgálataink szerint, fokozódott a fertőzés következtében kialakuló hipotónia kockázata, ami a szepszis kísérő tünete lehet. Az alacsony IL-12 termeléssel járó allél hordozóinál fokozott NEC és tüdőgyulladás kockázatot figyeltünk meg. Bár logikus lenne az összefüggést a megváltozott citokintermeléssel magyarázni, egyelőre nem áll elegendő emberi vizsgálatból származó adat a rendelkezésünkre, illetve a vizsgálatunk retrospektív

80

jellege nem tette lehetővé ennek a feltételezésnek az igazolását. A genetikai variánsok gyulladásos

mechanizmusú

perinatális

szövődmények

kialakulásában

betöltött

szerepének pontos feltárásához az IL-12 és IFNγ szérum szintjeinek meghatározása is szükséges lenne. Az összefüggések lélegeztetést befolyásoló egyéb perinatális szövődményekre történő adjusztálása közben kimutattuk, hogy az alacsony IFNγ szintekkel járó allél hordozói között fokozott volt a PDA és az IRDS kockázata. A Botallo-vezeték záródásában legfontosabb szerepe az érfalban lévő ciklooxigenáz (COX) enzimnek van. Bár az IFNγ szerepét eddig még nem vizsgálták a PDA kialakulásában, feltételezhető, hogy mégis részt vesz a folyamatban, hiszen az IFNγ szabályozó tényezője a COX2 enzimnek. (155,156). Ez alapján jogosan feltételezhető, hogy az alacsony IFNγ szint a COX aktivitáson keresztül fokozza a PDA kockázatát. A vizsgálataink alátámasztják ezt az elméletet, mert az IFNγ AA genotípus esetén a PDA kialakulásának fokozott kockázatát figyeltük meg. Bár az IRDS legfontosabb kockázati tényezője az éretlenség, a gyulladásos citokinek, mint az IL-1β és a TNFα is befolyásolják a tüdőfejlődést (124,157). Bár nincs adat arra, hogy az IFNγ-nak milyen közvetlen hatása van az újszülöttek surfactant termelésére, az eredményeink alapján mégis felmerül, hogy az IFNγ genotípus hatással lehet az IRDS kialakulásának kockázatára az IFNγ illetve más gyulladásos citokinek termelésére gyakorolt hatásán keresztül. Összefoglalva vizsgálataink eredményei felvetik az IFNγ and IL-12 polimorfizmusok és a perinatális morbiditás kapcsolatát. Az IFNγ+874A allél hordozása esetén, ami feltételezhetően alacsony szérum IFNγ szintekkel jár, a koraszülöttség, a tüdőkárosodás és néhány más perinatális szövődmény fokozott kockázatát figyeltük meg. Az IL-12 GC/CTCTAA polimorfizmus a tüdőgyulladás és a NEC kockázatával mutatott összefüggést. Bár a citokintermelő képesség megváltozása logikus magyarázat lenne az összefüggésekre, a vizsgálatunk retrospektív jellege miatt nem alkalmas ennek az elméletnek az alátámasztására. Javasoljuk további vizsgálatok végzését a genotípusok és a szérum IFNγ illetve IL-12 szintek összehasonlításával, hogy igazolni lehessen, hogy a megfigyelt összefüggések hátterében valóban a LBW koraszülöttek megváltozott citokintermelő képessége állt.

81

7.3. Az ACE I/D és AT1R génpolimorfizmusok és lélegeztetés A Kazzi és mtsai. illetve az általunk végzett vizsgálatok eredményei közötti különbséget magyarázhatja a vizsgálatokba bevont populációk különbözősége. (Részletesen lásd 10. táblázat) Az általunk vizsgált betegcsoport érettebb volt, kevesebb légzéstámogatásra szorult, alacsonyabb volt a BPD prevalenciája. Ezek alapján úgy gondoljuk, hogy a Kazzi és mtsai. által tett megfigyelések érvényessége valószínűleg csak egy nagyon éretlen, 1250 gramm alatti súllyal született koraszülött populációra korlátozódik. Több vizsgálat is igazolta a renin-angiotensin rendszer funkcionális változásait a magzat érése során (158). Talán az ACE genotípus tüdőfunkcióra gyakorolt hatása is kifejezettebb a magzati élet korábbi szakaszában és eltűnik az érettebb koraszülöttekben. 7.4. Az általunk feltárt új összefüggések a perinatális lélegeztetési igény és a BPD genetikájában A BPD összetett patomechanizmusú kórkép, melynek kialakulásában egyre nagyobb szerepet

tulajdonítanak

a

genetikai

tényezőknek,

elsősorban

a

genetikai

polimorfizmusoknak. A genetikai polimorfizmusok közvetlenül fokozhatják a BPD kialakulásának kockázatát, vagy hajlamosíthatnak olyan perinatális állapotokra, amelyekben gyakrabban alakul ki BPD. Eredményeink az irodalmi adatok tükrében jól kiegészítik az eddigi ismereteket. Több genetikai polimorfizmus hordozása és a BPD, illetve

más

perintális

szövődmények

kockázata

között

sikerült

összefüggést

kimutatnunk. Az általunk igazolt összefüggések beillesztehetők a BPD iránti genetikai hajlammal kapcsolatos tudásba (A 2. ábrán összefoglaltuk a BPD legfontosabb kockázati tényezőit és ezek eddig feltárt genetikai hátterét. Pirossal tüntettük fel az általunk kimutatott összefüggéseket). A genetikai polimorfizmusokkal kapcsolatos vizsgálataink arra is rávilágítottak, hogy a genetikai tényezők mellett a környezeti hatások is jelentős szerepet játszanak a vizsgált szövődmények kialakulásában. Egyes genetikailag meghatározott tulajdonságok penetranciája eltérő lehet a különböző környezeti hatásoknak kitett populációkban, mint

82

ahogy a vizsgált ACE I/D polimorfizmus is másként járult hozzá a BPD kockázatához egy érettebb és egy éretlenebb koraszülött populációban. A BPD hátterében álló genetikai faktorok ismerete segíthet a jövőben a veszélyeztetett betegek felismerésében, és a terápia optimálásában, személyre szabott kezelés alkalmazásában. A genetikai szűrővizsgálatok alkalmazásának feltétele, hogy nagyszámú polimorfizmust gyorsan és olcsón meg lehessen határozni. A technika fejlődésével, a chip technika egyre szélesebb körű elterjedésével ez megvalósulni látszik. Az egyes betegségek hátterében álló genetikai polimorfizmusok ismeretében lehetővé válik a betegségekre specifikus diagnosztikus DNS-chipek tervezése.

83

9. ábra: A BPD kockázati tényezői és genetikai hátterük, saját vizsgálataink helye Praeeclampsia Fertőzés (pneumonia) Kapcsolat: IL-12 Nincs kapcsolat: IFNγ

Chorioamnionitis Kapcsolat:TNFα, LTα

Gyulladás

Koraszülés

Szepszis

NEC

Kapcsolat: NOD2, IL-6, IFNγ, ACE Nincs kapcsolat: CD14, TLR4, TNFα, IL-1β, IL-4ra, IL-10, IL-12

Kapcsolat:IL-4ra, IL-12, IL-18, ER,VEGF; Nincs kapcsolat: CD14, TLR4, CARD15, TNFα, IL-1β, IL-6, IL-10, IFNγ

Perinatális adaptáció, keringési elégtelenség Kapcsolat: ACE

Légzéstámogatás Kapcsolat: TNFα, IFNγ, ER

IRDS

PDA Kapcsolat: IFNγ, ATR1, ER

Kapcsolat:TNFα, VEGF, AT, GNβ3,Factor V, MTHFR

Korai burokredés Kapcsolat: TNFα, IL-10, HSP72, MMP8, MMP9

Kapcsolat: TNFα, IFNγ, IL-1ra, IL-4, IL-6, IL-10, MBL, TLR-4, L-szelektin, VEGF, HSP72, SPC Nincs kapcsolat: IL-12, TLR2, CD14, CARD15, E-szelektin, P-szelektin

BPD Kapcsolat: L-szelektin, TNFα, IFNγ, GST, ACE, SPA, SPB, ER Nincs kapcsolat: SPC, LTα, TGFβ, IGF-1R, MCP-1, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12, Eszelektin, P-szelektin, VEGF, AT1R, Urokináz

Kapcsolat: SPA, SPB,

IVH Kapcsolat:TNFα, ER, Factor V, Factor XIII, Prothrombin

Tüdőfejlődés Kapcsolat: VEGF, Angiopoietin, FGF, TTF, SHH, HOX, RAR, Elasztin

A BPD-nek és legfontosabb kockázati tényezőinek genetikai háttere. Ellentmondásos adatok esetén (egyik vizsgálat talált kapcsolatot, míg a másik nem) mi csak a kapcsolatot tüntettük fel az ábrán. További részleteket és a rövidítéseket lásd a szövegben. A pirossal feltüntettet összefüggések saját vizsgálataink eredményei.

8. Tézisek Vizsgálataim alapján a következő új megállapításokat tettem: 1. Bár a TNFα G–308A, IL-1ß C3954T, IL-6 G–174C, IL-10 G–1082A polimorfizmusok egyike sem mutatott közvetlen összefüggést a BPD kockázatával, kimutattuk, hogy a TNFα A allél hordozók átlagosan 40 órával hosszabb gépi lélegeztetést (p=0,004) és átlagosan 36 órával hosszabb oxigénterápiát (p=0,0008) igényeltek, mint az allélt nem hordozó koraszülöttek. Az összefüggés a tüdőkárosodás perinatális kockázati tényezőire történő korigálás után is szignifikáns maradt. 2. Az IFNγ+874A allél hordozás gyakoribb volt kis súlyú koraszülöttekben, mint érett egészséges újszülöttekben. 3. Kimutattuk, hogy az IFNγ+874T allél hordozó koraszülötek 41%-kal rövidebb gépi lélegeztetésre és 34%-kal rövidebb oxigénterápiára szorultak. A vizsgált IL-12 polimorfizmus nem mutatott összefüggést a légzéstámogatás idejével. 4. Az IFNγ+874T allél hordozás 65%-os BPD kockázat csökkenéssel járt LBW koraszülöttekben, az IL-12 polimorfizmus nem mutatott összefüggést a BPD-vel. 5. A többi vizsgált perinatális szövődmény esetén az IFNγ+874T allél hordozás védett a PDA kialakulásával szemben, az IFNγ+874A allél hordozás fokozta az IRDS és a fertőzés következtében kialakuló súlyos hipotónia kockázatát. AZ IL-12 p40 promoter GC allél hordozás védett a tüdőgyulladás kialakulása ellen, a CTCTAA allél hordozókban fokozott volt a NEC kockázata az allélt nem hordozókkal szemben. 6. Kazzi és mtsai. eredményével ellentétben nem sikerült összefüggést találnunk az ACE I/D és az AT1R A1166C polimorfizmusok és a BPD kockázata, illetve a gépi lélegeztetés és oxigénterápia ideje között 2000 gramm alatti születési súlyú koraszülöttekben.

9. Összefoglalás A koraszülöttek tüdőkárosodása a bronchopulmonális dysplasia (BPD). A BPD kialakulásában szerepet játszó kockázati tényezők az éretlenség, a megzavart tüdőfejlődés, a szisztémás és lokális gyulladás és a perinatális időszak terápiás beavatkozásai, mint a gépi lélegeztetés vagy a nem megfelelő táplálás. Újabb vizsgálatok szerint a genetikai polimorfizmusokis hozzájárulhatnak a BPD és legfontosabb kockázati tényezőinek kialakulásához. Vizsgálataink során a BPD genetikai hátterét vizsgáltuk alacsony születési súlyú koraszülöttekben PCR-RFLP módszerrel. Kimutattuk, hogy a TNFα G–308A, IL-1ß C3954T, IL-6 G–174C és IL-10 G–1082A polimorfizmusok közül a TNFα A allél hordozása esetén allél hordozók átlagosan 40 órával hosszabb gépi lélegeztetést (p=0,004) és átlagosan 36 órával hosszabb oxigénterápiát (p=0,0008) igényeltek, mint az allélt nem hordozó koraszülöttek. Az összefüggés a tüdőkárosodás perinatális kockázati tényezőire történő korigálás után is szignifikáns maradt. Az IFNγ T+874A és IL-12 p40 promoter GC/CTCTAA polimorfizmusok esetén IFNγ+874A allél gyakoribb volt LBW koraszülöttekben. Az IFNγ+874T allél hordozók 41- illetve 35%-kal rövidebb gépi lélegeztetést illetve oxigénterápiát igényeltek, mint a T-allélt nem hordozó koraszülöttek. Az IFNγ+874T allél hordozása védett a BPD (OR[95% CI]: 0,35 [0,120,99]) és a nyitott Botall-vezeték (0,43 [0,19-0,97]) kialakulása ellen is. Az IFNγ+874A allél hordozóknaál nagyobb volt a súlyos hipotónia (3,40 [1,01-11,52]) és a respirációs distressz-szindróma (4,03 [1,30-12,50]) kockázata. Az IL-12 GC allél hordozása védelmet jelentett a tüdőgyulladás (0,32 [0,14-0,75]) kialakulásával szemben. Az IL-12 CTCTAA allél hordozókban nagyobb volt a nekrotizáló enterocolitis (2,37 [1,01-5,53]) kialakulásának kockázata.A vizsgált renin-angiotenzin aldoszteron génpolimorfizmusok nem függtek össze a lélegeztetés iránti igénnyel. Eredményeink alapján a genetikai tényezők szerepet játszhatnak a perinatális tüdőkárosodásban. Ezek ismerete lehetővé teheti a veszélyeztetett betegek korai azonosítását, így megteremti annak a lehetőségét, hogy az érintett koraszülöttek időben célzott kezelésben részesüljenek.

86

10. Summary Chronic lung damage of preterm infants is called bronchopulmonary dysplasia (BPD). The risk factors for BPD are prematurity, disturbed lung development, systemic and local inflammation as well as therapeutic interventions of the perinatal period such as mechanical ventilation and inadequate nutrition. Furthermore, recent research highlighted the potential implication of genetic polymorphisms, mainly single nucleotide polymorphisms (SNPs) in BPD and the majority of its risk factors. In our study we investigated the association of SNPs with BPD and ventilation characteristics in low birth weight infants. We investigated TNFα G–308A, IL-1ß C3954T, IL-6 G–174C és IL-10 G–1082A SNPs and demonstrated that the carrier state of the TNFα G-308A allele was associated with a 40-hour longer period of mechanical ventilation (p=0.004) and an additional 36 hours of oxygen supplementation on average (p=0.0008). The association was significant after its adjustment for perinatal risk factors for lung damage. Examining the IFNγ T+874A és IL-12 p40 promoter GC/CTCTAA polymorphisms we found that IFNγ+874A allele is overrepresented in LBW infants. Carriers

of

IFNγ+874T

allele

required

mechanical

ventilation

and

oxygen

supplementation for a 41% and 35% shorter period of time, respectively, than those not carrying IFNγ+874T allele. Stepwise logistic regression analyzis revealed that carriers of IFNγ+874T allele are protected against BPD (OR[95% CI]: 0.35 [0.12-0.99]) and patent ductus arteriosus (0.43 [0.19-0.97]), while carriers of IFNγ+874A allele are at higher risk of severe hypotension (3.40 [1.01-11.52]) and respiratory distress syndrome (4.03 [1.3012.50]). Some SNPs were associated with other perinatal complications with an impact on ventilation and BPD-risk. Carriers of IL-12 GC allele were protected against pneumonia (0.32 [0.14-0.75]). Carriers of IL-12 CTCTAA allele were at higher risk of developing necrotizing enterocolitis (2.37 [1.01-5.53]). Examining the ACE I/D and AT1R A1166C polymorphisms we did not detect any association between ACE and AT1R genotype and BPD or ventilation characteristics. According to our results genetic factors may play a role in perinatal lung damage. Identification of genetic risk factors may establish the possibility of indentifying infants at high BPD risk and the targeted and individual prevenetion and treatment of the disease.

87

11. Táblázatok és ábrák jegyzéke Táblázatok jegyzéke 1. táblázat: A régi és új típusú BPD összehasonlítása 2. táblázat: A BPD definíciója 3. táblázat: A BPD kockázati tényezői 4. táblázat: Az ACE-AT1R vizsgálatba bevont betegek klinikai jellemzői 5. táblázat: A TNFα, IL-1β, IL-6 és IL-10 meghatározás PCR-RFLP körülményei 6. táblázat: Az IFNγ és IL-12 meghatározás PCR-RFLP körülményei 7. táblázat: Az ACE és AT1R meghatározás PCR-RFLP körülményei 8. táblázat: Az oxigénterápia és a gépi lélegeztetés hosszával szignifikáns összefüggést mutató paraméterek illetve a stepwise többszörös regressziós vizsgálat eredményei a TNFα, IL-1β, IL-6 és IL-10 vizsgálatban 9. táblázat: Az IFNγ és IL-12 vizsgálat eredményeinek összefoglalása: a vizsgált genotípusok és a lélegeztetési paraméterek illetve a perinatális szövődmények kapcsolata. 10. táblázat: ACE I/D polimorfizmus VLBW koraszülöttekben, Kazzi és mtsai. illetve saját eredményeink összehasonlítása Ábrák jegyzéke 1. ábra: A bronchopulmonalis dysplasia röntgen képe 2. ábra: A bronchopulmonalis dysplasia szövettani képe 3. ábra: Az IFNγ és IL-12 hatása egymás termelődésére 4. ábra: A BPD és kockázati tényezői és genetikai hátterük 5. abra: A PCR-RFLP elve 6. ábra: A TNFα meghatározás PCR-RFLP képe 7. ábra: Primer tervezés az IL-12 polimorfizmus detektálásához 8. ábra: Az IFN-IL12 vizsgálat PCR-RFLP képe 9. ábra: A BPD és kockázati tényezői és genetikai hátterük, saját vizsgálataink helye

88

12. Irodalomjegyzék 1. Kinsella JP, Greenough A, Abman SH. (2006) Bronchopulmonary dysplasia. Lancet, 367(9520): 1421-1431. 2. Christou H, Brodsky D. (2005) Lung injury and bronchopulmonary dysplasia in newborn infants. J Intensive Care Med, 20(2): 76-87. 3. Jobe AH, Bancalari E. (2001) Bronchopulmonary dysplasia. Am J Respir Crit Care Med, 163(7): 1723-1729. 4. Jobe AH, Ikegami M. (1998) Mechanisms initiating lung injury in the preterm. Early Hum Dev, 53(1): 81-94. 5. Maródi L. Gyermekgyógyászat. Medicina Könyvkiadó Rt., Budapest, 2002: 285-314. 6. Nelson WE. Textbook of Pediatrics 17th Edition. Saunders, Philadelphia, 2005: 519640, 1466-1467, 1510-1512. 7. Parton LA, Strassberg SS, Qian D, Galvin-Parton PA, Cristea LA. (2006) The genetic basis for bronchopulmonary dysplasia. Front Biosci, 11: 1854-1860. 8. Hallman M, Haataja R. (2003) Genetic influences and neonatal lung disease. Semin Neonatol, 8(1): 19-27. 9. Bhandari V, Bizzarro MJ, Shetty A, Zhong X, PageGP, Zhang H, Ment LR, GruenJR and for the Neonatal Genetics Study Group. (2006) Familial and Genetic Susceptibility to Major Neonatal Morbidities in Preterm Twins. Pediatrics, 117: 1901-1906. 10. Bhandari V, Gruen JR. (2006) The genetics of Bronchopulmonary Dysplasia. Semin Perinatol, 30(4): 185-191. 11. Northway WH Jr, Rosan RC, Porter DY. (1967) Pulmonary disease following respiratory therapy of hyaline membrane disease: bronchopulmonary dysplasia. N Eng J Med, 276(7): 357-368. 12. Bland RD. (2005) Neonatal chronic lung disease in the post-surfactant era. Biol Neonate, 88(3): 181-191. 13. Kraybill EN, Runyan DK, Bose CL, Khan JH. (1989) Risk factors for chronic lung disease in infants with birth weights of 751 to 1000 grams. J Pediatr, 115: 115-120. 14. Dreyfuss D, Saumon G. (1998) Ventilator-induced lung injury: lessons from experimental studies. Am J Respir Crit Care Med, 157(1): 294-323.

89

15. Avery ME, Tooley WH, Keller JB, Hurd SS, Bryan MH, Cotton RB, et al.. (1987) Is chronic lung disease in low birth weight infants preventable? A survey of eight centers. Pediatrics, 79: 26-30. 16. Ehrenkranz RA, Walsh MC, Vohr BR, Jobe AH, Wright LL, Fanaroff AA, Wrage LA, Poole K; National Institutes of Child Health and Human Development Neonatal Research Network. (2005) Validation of the National Institutes of Health consensus definition of bronchopulmonary dysplasia. Pediatrics, 116(6): 1353-1360. 17. Stenmark KR, Abman SH. (2005) Lung vascular development: implications for the pathogenesis of bronchopulmonary dysplasia. Annu Rev Physiol, 67: 623-661. 18. Zoban P, Cerny M. (2003) Immature lung and acute lung injury. Physiol Res, 52(5): 507-516. 19. Jobe AH. (2005) Antenatal associations with lung maturation and infection. J Perinatol, 25 Suppl 2: S31-35. 20. Li YH, Tullus K. (2002) Microbial infection and inflammation in the development of chronic lung disease of prematurity. Microbes Infect, 4(7): 723-732. 21. Speer CP. (2003) Inflammation and bronchopulmonary dysplasia. Semin Neonatol, 8(1): 29-38. 22. Speer CP (2006) Inflammation and bronchopulmonary dysplasia: A continuing story. Semin Fetal Neonatal Med, 11(5): 354-362. 23. De Dooy JJ, Mahieu LM, Van Bever HP. (2001) The role of inflammation in the development of chronic lung disease in neonates. Eur J Pediatr, 160(8): 457-463. 24. Dammann O, Leviton A, Gappa M, Dammann CE. (2005) Lung and brain damage in preterm newborns, and their association with gestational age, prematurity subgroup, infection/inflammation and long term outcome. BJOG, 112 Suppl 1: 4-9. 25. Asikainen TM, White CW. (2005) Antioxidant defense in the preterm lung: role for hypoxia-inducible factors in BPD? Toxicology and Applied Pharmacology, 203: 177188. 26. Alexander JM, McIntire DM, Leveno KJ. (1999) Chorioamnionitis and the prognosis for term infants. Obstet Gynecol, 94: 274–278. 27. Andrews WW, Hauth JC, Goldenberg RL. (2000) Infection and preterm birth. Am J Perinatol, 17: 357-365.

90

28. Bracci R, Buonocore G. (2003) Chorioamnionitis: a risk factor for fetal and neonatal morbidity. Biol Neonate, 83: 85-96. 29. Arias F, Victoria A, Cho K, Kraus F. (1997) Placental histology and clinical characteristics of patients with preterm premature rupture of membranes. Obstet Gynecol, 89: 265-271. 30. Dexter SC, Malee MP, Pinar H, Hogan JW, Carpenter MW, Vohr BR. (1999) Influence of chorioamnionitis on developmental outcome in very low birth weight infants. Obstet Gynecol, 94: 267-273. 31. Gomez R, Romero R, Ghezzi F, Yoon BH, Mazor M, Berry SM. (1998) The fetal inflammatory response syndrome. Am J Obstet Gynecol, 179: 194-202. 32. Chaiworapongsa T, Romero R, Kim JC, Kim YM, Blackwell SC, Yoon BH, Gomez R. (2002) Evidence for fetal involvement in the pathologic process of clinical chorioamnionitis. Am J Obstet Gynecol, 186: 1178-1182. 33. Keelan JA, Marvin KW, Sato TA, Coleman M, McCowan LM, Mitchell MD.(1999) Cytokine abundance in placental tissues: evidence of inflammatory activation in gestational membranes with term and preterm parturition. Am J Obstet Gynecol, 181: 1530-1536. 34. Keelan JA, Blumenstein M, Helliwell RJ, Sato TA, Marvin KW, Mitchell MD.(2003) Cytokines, prostaglandins and parturition--a review. Placenta, 24: S33-46. 35. Makhseed M, Raghupathy R, El-Shazly S, Azizieh F, Al-Harmi JA, Al-Azemi MM. (2003) Pro-inflammatory maternal cytokine profile in preterm delivery. Am J Reprod Immunol, 49: 308-318. 36. Winkler M. (2003) Role of cytokines and other inflammatory mediators. BJOG, 110: S20: 118-123. 37. Junqueira LC, Zugaib M, Montes GS, Toledo OM, Krisztán RM, Shigihara KM. (1980) Morphologic and histochemical evidence for the occurrence of collagenolysis and for the role of neutrophilic polymorphonuclear leukocytes during cervical dilation. Am J Obstet Gynecol, 138: 273-281. 38. Saji F, Samejima Y, Kamiura S, Sawai K, Shimoya K, Kimura T. (2000) Cytokine production in chorioamnionitis. J Reprod Immunol, 47: 185-196. 39. Baggia S, Gravett MG, Witkin SS, Haluska GJ, Novy MJ. (1996) Interleukin-1 beta intra-amniotic infusion induces tumor necrosis factor-alpha, prostaglandin production,

91

and preterm contractions in pregnant rhesus monkeys. J Soc Gynecol Investig, 3: 121126. 40. Romero R, Gomez R, Ghezzi F, Yoon BH, Mazor M, Edwin SS, Berry SM. (1998) A fetal systemic inflammatory response is followed by the spontaneous onset of preterm parturition. Am J Obstet Gynecol, 179: 186-193. 41. Bokodi G, Treszl A, Derzbach L, Balogh A, Vasarhelyi B. (2005) The association of the carrier state of the tumor necrosis factor-alpha (TNFalpha) -308A allele with the duration of oxygen supplementation in preterm neonates. Eur Cytokine Netw, 16(1): 7880. 42. Bokodi G, Derzbach L, Banyasz I, Tulassay T, Vasarhelyi B. (2006) The association of Interferon-Gamma T+874A and Interleukin-12 p40 promoter CTCTAA/GC polymorphism with the need for respiratory support and perinatal complications in low birth weight neonates. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed, [Epub ahead of print] 43. Treszl A, Kocsis I, Szathmari M, Schuler A, Heninger E, Tulassay T, Vasarhelyi B. (2003) Genetic variants of TNF-[FC12]a, IL-1beta, IL-4 receptor [FC12]a-chain, IL-6 and IL-10 genes are not risk factors for sepsis in low-birth-weight infants. Biol Neonate, 83(4): 241-245. 44. Treszl A, Heninger E, Kalman A, Schuler A, Tulassay T, Vasarhelyi B. (2003) Lower prevalence of IL-4 receptor alpha-chain gene G variant in very-low-birth-weight infants with necrotizing enterocolitis. J Pediatr Surg, 38(9): 1374-1378. 45. Treszl A, Kocsis I, Szathmari M, Schuler A, Tulassay T, Vasarhelyi B. (2001) Genetic variants of the tumour necrosis factor-alpha promoter gene do not influence the development of necrotizing enterocolitis. Acta Paediatr, 90(10): 1182-1185. 46. Treszl A, Tulassay T, Vasarhelyi B. (2006) Genetic basis for necrotizing enterocolitis--risk factors and their relations to genetic polymorphisms. Front Biosci, 11: 570-580. Review. 47. Holmes CL, Russell JA, Walley KR. (2003) Genetic polymorphisms in sepsis and septic shock: Role in prognosis and potential for therapy. Chest, 124: 1103-1115. 48. Lorenz E, Hallman M, Marttila R, Haataja R, Schwartz DA. (2002) Association between the Asp299Gly polymorphisms in the Toll-like receptor 4 and premature births in the Finnish population. Pediatr Res, 52(3): 373-376.

92

49. Szebeni B, Szekeres R, Rusai K, Vannay A, Veres G, Treszl A, Arato A, Tulassay T, Vasarhelyi B. (2006) Genetic polymorphisms of CD14, toll-like receptor 4, and caspase-recruitment domain 15 are not associated with necrotizing enterocolitis in very low birth weight infants. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 42(1): 27-31. 50. Kazzi SN, Quasney M. (2005) Deletion Allele of Angiotensin-Converting Enzyme is Associated with Increased Risk and Severity of Bronchopulmonary Dysplasia. J Pediatr, 147(6): 818-822. 51. Abbas AK, Lichtman AH. Cellular and Molecular Immunology, 5th ed. Saunders, Elsevier Science, Philadelphia, 2003: 41-125, 241-297. 52. Marodi L. (2001) IL-12 and IFN-gamma deficiencies in human neonates. Pediatr Res, 49(3): 316. 53. Marodi L. (2002) Down-regulation of Th1 responses in human neonates. Clin Exp Immunol, 128(1): 1-2. 54. Gasparoni A, Ciardelli L, Avanzini A, Castellazzi AM, Carini R, Rondini G, Chirico G. (2003) Age-related changes in intracellular TH1/TH2 cytokine production, immunoproliferative T lymphocyte response and natural killer cell activity in newborns, children and adults. Biol Neonate, 84(4): 297-303. 55. Jones CA, Warner JO. (1999) Regulating a regulator: IFNgamma production by the neonate. Clin Exp Allergy, 29(7): 865-868. 56. Watford WT, Moriguchi M, Morinobu A, O’Shea JJ. (2003) The biology of IL-12: coordinating innate and adaptive immune responses. Cytokine Growth Factor Rev, 14(5): 361-368. 57. Gessani S, Belardelli F. (1998) IFN-gamma expression in macrophages and its possible biological significance. Cytokine Growth Factor Rev, 9(2): 117-123. 58. Pestka S, Krause CD, Walter MR. (2004) Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors. Immunol Rev, 202: 8-32. 59. Ruiz-Ortega M, Ruperez M, Lorenzo O, Esteban V, Blanco J, Mezzano S, Egido J. (2002) Angiotensin II regulates the synthesis of proinflammatory cytokines and chemokines in the kidney. Kidney Int Suppl, 82: 12-22. 60. Guba M, Steinbauer M, Buchner M, Frolich D, Farkas S, Jauch KW, Anthuber M. (2000) Differential effects of short-term ace-and AT1-receptor inhibition on postischemic injury and leukocyte adherence in vivo and in vitro. Shock, 13: 190–196.

93

61. Weber B, Borkhardt A, Stoll-Becker S, Reiss I, Gortner L. (2000) Polymorphisms of surfactant protein A genes and the risk of bronchopulmonary dysplasia in preterm infants. Turk J Pediatr, 42(3): 181-185. 62. Makri V, Hospes B, Stoll-Becker S, Borkhardt A, Gortner L. (2002) Polymorphisms of surfactant protein B encoding gene: modifiers of the course of neonatal respiratory distress syndrome? Eur J Pediatr, 161(11): 604-608. Epub 2002 Sep 13. 63. Rova M, Haataja R, Marttila R, Ollikainen V, Tammela O, Hallman M. (2004) Data mining

and

multiparameter

analysis

of

lung

surfactant

protein

genes

in

bronchopulmonary dysplasia. Hum Mol Genet, 13(11): 1095-1104. Epub 2004 Apr 21. 64. Lahti M, Marttila R, Hallman M. (2004) Surfactant protein C gene variation in the Finnish population - association with perinatal respiratory disease. Eur J Hum Genet, 12(4): 312-320. 65. Speer CP. (2001) Newinsights into the pathogenesis of pulmonary inflammation in preterm infants. Biol Neonate, 79: 205. 66. Kazzi SN, Kim UO, Quasney MW. (2004) Buhimschi I: Polymorphism of tumor necrosis factor-alpha and risk and severity of bronchopulmonary dysplasia among very low birth weight infants. Pediatrics, 114(2): e243-248. 67. Adcock K, Hedberg C, Loggins J, Kruger TE, Baier RJ. (2003) The TNF-alpha 308, MCP-1 -2518 and TGF-beta1 +915 polymorphisms are not associated with the development of chronic lung disease in very low birth weight infants. Genes Immun, 4(6): 420-426. 68. Derzbach L, Bokodi G, Treszl A, Vasarhelyi B, Nobilis A, Rigo J Jr. (2006) Selectin polymorphisms and perinatal morbidity in low birth weight infants. Acta Paediatr, 95(10): 1213-1217. 69. Bokodi G, Derzbach L, Vasarhelyi B. (2006) Re: Deletion allele of angiotensinconverting enzyme. J Pediatr, 149(4): 579, author reply 579-580. 70. Yanamandra K, Loggins J, Baier RJ. (2004) The Angiotensin Converting Enzyme Insertion/Deletion polymorphism is not associated with an increased risk of death or bronchopulmonary dysplasia in ventilated very low birth weight infants. BMC Pediatr, 4(1): 26.

94

71. Manar MH, Brown MR, Gauthier TW, Brown LA. (2004) Association of glutathione-S-transferase-P1

(GST-P1)

polymorphisms

with

bronchopulmonary

dysplasia. J Perinatol, 24(1): 30-35. 72. Lin HC, Su BH, Lin TW, Hsu CM, Wan L, Tsai CH, Tsai FJ. (2004) No association of urokinase gene 3'-UTR polymorphism with bronchopulmonary dysplasia for ventilated preterm infants. Acta Paediatr Taiwan, 45(6): 315-319. 73. Amory JH, Adams KM, Lin MT, Hansen JA, Eschenbach DA, Hitti J. (2004) Adverse outcomes after preterm labor are associated with tumor necrosis factor-alpha polymorphism -863, but not -308, in mother-infant pairs. Am J Obstet Gynecol, 191(4): 1362-1367. 74. Simhan HN, Krohn MA, Zeevi A, Daftary A, Harger G, Caritis SN. (2003) Tumor necrosis factor-alpha promoter gene polymorphism -308 and chorioamnionitis. Obstet Gynecol, 102: 162-166. 75. Babbage SJ, Arkwright PD, Vince GS, Perrey C, Pravica V, Quenby S, Bates M, Hutchinson IV. (2001) Cytokine promoter gene polymorphisms and idiopathic recurrent pregnancy loss. J Reprod Immunol, 51: 21-27. 76. Baxter N, Sumiya M, Cheng S, Erlich H, Regan L, Simons A, Summerfield JA. (2001) Recurrent miscarriage and variant alleles of mannose binding lectin, tumour necrosis factor and lymphotoxin alpha genes. Clin Exp Immunol, 126: 529-534. 77. Karhukorpi J, Laitinen T, Karttunen R, Tiilikainen AS. (2001) The functionally important IL-10 promoter polymorphism (-1082G-->A) is not a major genetic regulator in recurrent spontaneous abortions. Mol Hum Reprod, 7: 201-203. 78. Reid JG, Simpson NA, Walker RG, Economidou O, Shillito J, Gooi HC, Duffy SR, Walker JJ. (2001) The carriage of pro-inflammatory cytokine gene polymorphisms in recurrent pregnancy loss. Am J Reprod Immunol, 45: 35-40. 79. Daher S, Shulzhenko N, Morgun A, Mattar R, Rampim GF, Camano L, DeLima MG. (2003) Associations between cytokine gene polymorphisms and recurrent pregnancy loss. J Reprod Immunol, 58: 69-77. 80. Costeas PA, Koumouli A, Giantsiou-Kyriakou A, Papaloizou A, Koumas L. (2004) Th2/Th3 cytokine genotypes are associated with pregnancy loss. Hum Immunol, 65: 135-141.

95

81. Hefler LA, Tempfer CB, Bashford MT, Unfried G, Zeillinger R, Schneeberger C, Koelbl H, Nagele F, Huber JC. (2002) Polymorphisms of the angiotensinogen gene, the endothelial nitric oxide synthase gene, and the interleukin-1beta gene promoter in women with idiopathic recurrent miscarriage. Mol Hum Reprod, 8: 95-100. 82. Unfried G, Tempfer C, Schneeberger C, Widmar B, Nagele F, Huber JC. (2001) Interleukin 1 receptor antagonist polymorphism in women with idiopathic recurrent miscarriage. Fertil Steril, 75: 683-687. 83. Simhan HN, Krohn MA, Roberts JM, Zeevi A, Caritis SN. (2003) Interleukin-6 promoter -174 polymorphism and spontaneous preterm birth. Am J Obstet Gynecol, 189: 915-918. 84. Hartel Ch, Finas D, Ahrens P, Kattner E, Schaible T, Muller D, Segerer H, Albrecht K, Moller J, Diedrich K, Gopel W, Genetic Factors in Neonatology Study Group. (2004) Polymorphisms of genes involved in innate immunity: association with preterm delivery. Mol Hum Reprod, 10(12): 911-915. 85. Genc MR, Onderdonk AB, Vardhana S, Delaney ML, Norwitz ER, Tuomala RE, Paraskevas LR, Witkin SS, MAP Study Group. (2004) Polymorphism in intron 2 of the interleukin-1 receptor antagonist gene, local midtrimester cytokine response to vaginal flora, and subsequent preterm birth. Am J Obstet Gynecol, 191(4): 1324-1330. 86. Dizon-Townson DS, Major H, Varner M, Ward K. (1997) A promoter mutation that increases transcription of the tumor necrosis factor-alpha gene is not associated with preterm delivery. Am J Obstet Gynecol, 177: 810-813. 87. Roberts AK, Monzon-Bordonaba F, Van Deerlin PG, Holder J, Macones GA, Morgan MA, Strauss JF, Parry S. (1999) Association of polymorphism within the promoter of the tumor necrosis factor alpha gene with increased risk of preterm premature rupture of the fetal membranes. Am J Obstet Gynecol, 180: 1297-1302. 88. Annells MF, Hart PH, Mullighan CG, Heatley SL, Robinson JS, Bardy P, McDonald HM. (2004) Interleukins-1, -4, -6, -10, tumor necrosis factor, transforming growth factor-beta, FAS, and mannose-binding protein C gene polymorphisms in Australian women: Risk of preterm birth. Am J Obstet Gynecol, 191(6): 2056-2067. 89. Witkin SS, Vardhana S, Yih M, Doh K, Bongiovanni AM, Gerber S. (2003) Polymorphism in intron 2 of the fetal interleukin-1 receptor antagonist genotype influences midtrimester amniotic fluid concentrations of interleukin-1beta and

96

interleukin-1 receptor antagonist and pregnancy outcome. Am J Obstet Gynecol, 189: 1413-1417. 90. Genc MR, Gerber S, Nesin M, Witkin SS. (2002) Polymorphism in the interleukin-1 gene complex and spontaneous preterm delivery. Am J Obstet Gynecol, 187: 157-163. 91. Bessler H, Osovsky M, Sirota L. (2004) Association between IL-1ra gene polymorphism and premature delivery. Biol Neonate, 85: 179-183. 92. Kalish RB, Vardhana S, Gupta M, Chasen ST, Perni SC, Witkin SS. (2003) Interleukin-1 receptor antagonist gene polymorphism and multifetal pregnancy outcome. Am J Obstet Gynecol, 189: 911-914. 93. Kalish RB, Vardhana S, Gupta M, Perni SC, Witkin SS. (2004) Interleukin-4 and 10 gene polymorphisms and spontaneous preterm birth in multifetal gestations. Am J Obstet Gynecol, 190: 702-706. 94. Chappell S, Morgan L. (2006) Searching for genetic clues to the causes of preeclampsia. Clin Sci (Lond), 110(4): 443-458. 95. Broughton Pipkin F. (1999) What is the place of genetics int he pathogenesis of preeclampsia. Biol Neonate, 76(6): 325-330. 96. Morrison ER, Miedzybrodzka ZH, Campbell DM, Haites NE, Wilson BJ, Watson MS, Greaves M, Vickers MA. (2002) Prothrombotic genotypes are not associated with pre-eclampsia and gestational hypertension: results from a large population-based study and systematic review. Thromb Haemost, 87(5): 779-785. 97. Fatini C, Sticchi E, Gensini F, Genuardi M, Tondi F, Gensini GF, Riviello C, Parretti E, Mello G, Abbate R. (2006) Endothelial nitric oxyde synthase gene influences the risk of pre-eclampsia, the recurrence of negative pregnancy events, and the maternal-fetal flow. J Hypertens, 24(9): 1823-1829. 98. Banyasz I, Szabo S, Bokodi G, Vannay A, Vasarhelyi B, Szabo A, Tulassay T, Rigo J Jr. (2006) Genetic polymorphisms of vascular endothelial growth factor in severe preeclampsia. Mol Hum Reprod, 12(4): 233-236. 99. Park JS, Romero R, Yoon BH, Moon JB, Oh SY, Han SY, Ko EM. (2001) The relationship between amniotic fluid matrix metalloproteinase-8 and funisitis. Am J Obstet Gynecol, 185: 1156-1161. 100. Wang H, Parry S, Macones G, Sammel MD, Ferrand PE, Kuivaniemi H, Tromp G, Halder I, Shriver MD, Romero R, Strauss JF 3rd. (2004) Functionally significant SNP

97

MMP8 promoter haplotypes and preterm premature rupture of membranes (PPROM). Hum Mol Genet, 13(21): 2659-2669. Epub 2004 Sep 14. 101. Ferrand PE, Parry S, Sammel M, Macones GA, Kuivaniemi H, Romero R, Strauss JF 3rd. (2002) A polymorphism in the matrix metalloproteinase-9 promoter is associated with increased risk of preterm premature rupture of membranes in African Americans. Mol Hum Reprod, 8(5): 494-501. 102. Kalish RB, Vardhana S, Gupta M, Perni SC, Chasen ST, Witkin SS. (2004) Polymorphisms in the tumor necrosis factor-alpha gene at position -308 and the inducible 70 kd heat shock protein gene at position +1267 in multifetal pregnancies and preterm premature rupture of fetal membranes, 191(4): 1368-1374. 103. Whitsett JA, Wert SE, Trapnell BC. (2004) Genetic disorders influencing lung formation and function at birth. Hum Mol Genet, 13 Spec No 2: R207-215. Review. 104. Balogh A, Treszl A, Vannay A, Vasarhelyi B. (2006) A prevalent functional polymorphism of insulin-like growth factor system is not associated with perinatal complications in preterm infants. Pediatrics, 117(2): 591-592. 105. Bányász I, Bokodi G, Vásárhelyi B, Treszl A, Derzbach L, Szabó A, Tulassay T, Vannay Á. (2006) Genetic polymorphisms of vascular endothelial growth factor in perinatal complications. (in press) 106. Cole FS, Hamvas A, Nogee LM. (2001) Genetic disorders of neonatal respiratory function. Pediatr Res, 50(2): 157-62. 107. Hallman M, Haataja R, Marttila R. (2002) Surfactant proteins and genetic predisposition to respiratory distress syndrome. Semin Perinatolm, 26(6): 450-460. 108. Kishore U, Bernal AL, Kamran MF, Saxena S, Singh M, Sarma PU, Madan T, Chakraborty T. (2005) Surfactant proteins SP-A and SP-D in human health and disease Arch Immunol Ther Exp (Warsz), 53(5): 399-417. 109. Jeffrey A. Whitsett SE, Wert YX. (2005) Genetic Disorders of Surfactant Homeostasis Biol Neonate, 87(4): 283-287. 110. Haataja R, Marttila R, Uimari P, Lofgren J, Ramet M, Hallman M. (2001) Respiratory distress syndrome: evaluation of genetic susceptibility and protection by transmission disequilibrium test. Hum Genet, 109(3): 351-355.

98

111. Haataja R, Ramet M, Marttila R, Hallman M. (2000) Surfactant proteins A and B as interactive genetic determinants of neonatal respiratory distress syndrome. Hum Mol Genet, 9(18): 2751-2760. 112. Marttila R, Haataja R, Ramet M, Lofgren J, Hallman M. (2003) Surfactant protein B polymorphism and respiratory distress syndrome in premature twins. Hum Genet, 112(1): 18-23. Epub 2002 Oct 10. 113. Fekete A, Treszl A, Toth-Heyn P, Vannay A, Tordai A, Tulassay T, Vasarhelyi B. (2003) Association between heat shock protein 72 gene polymorphism and acute renal failure in premature neonates. Pediatr Res, 54(4): 452-455. 114. Ahrens P, Kattner E, Kohler B, Hartel C, Seidenberg J, Segerer H, Moller J, Gopel W. (2004) Genetic Factors in Neonatology Study Group. Mutations of genes involved in the innate immune system as predictors of sepsis in very low birth weight infants. Pediatr Res, 55(4): 652-656. 115. Hedberg CL, Adcock K, Martin J, Loggins J, Kruger TE, Baier RJ. (2004) Tumor necrosis factor alpha -- 308 polymorphism associated with increased sepsis mortality in ventilated very low birth weight infants. Pediatr Infect Dis J, 23(5): 424-428. 116. Harding D, Dhamrait S, Millar A, Humphries S, Marlow N, Whitelaw A, Montgomery H. (2003) Is interleukin-6 -174 genotype associated with the development of septicemia in preterm infants? Pediatrics, 112(4): 800-803. 117. Baier RJ, Loggins J, Yanamandra K. (2006) IL-10, IL-6 and CD14 polymorphisms and sepsis outcome in ventilated Very Low Birth Weight infants. BMC Med, 4(1): 10. 118. Nobilis A, Szabo M, Kocsis I, Sulyok E, Tulassay T, Vasarhelyi B. (2006) Angiotensin-converting enzyme DD genotype is preventive against circulatory failure in very-low-birthweight neonates. Acta Paediatr, 95(6): 747-750. 119. Harding D, Dhamrait S, Marlow N, Whitelaw A, Gupta S, Humphries S, Montgomery H. (2003) Angiotensin-converting enzyme DD genotype is associated with worse perinatal cardiorespiratory adaptation in preterm infants. J Pediatr, 143: 746-749. 120. Heninger E, Treszl A, Kocsis I, Derfalvi B, Tulassay T, Vasarhelyi B. (2002) Genetic variants of the interleukin-18 promoter region (-607) influence the course of necrotising enterocolitis in very low birth weight neonates. Eur J Pediatr, 161(7): 410411.

99

121. Derzbach L, Treszl A, Balogh A, Vasarhelyi B, Tulassay T, Rigo J J. (2005) Gender dependent association between perinatal morbidity and estrogen receptor-alpha Pvull polymorphism. J Perinat Med, 33(5): 461-462. 122. Treszl A, Szabó M, Dunai Gy, Nobilis A, Machay T, Tulassay T, Vásárhelyi B. (2003) Angiotensin II type 1 receptor A1166C polymorphism and prophylactic indomethacin treatment induced ductus arteriosus (DA) closure in very low birth weight neonates. Ped Res, 54: 753-755. 123. Baier RJ. (2006) Genetics of perinatal brain injury in the preterm infant. Front Biosci, 11: 1371-1387. 124. Hitti J, Krohn MA, Patton DL, Tarczy-Hornoch P, Hillier SL, Cassen EM, Eschenbach DA. (1997) Amnionic fluid tumor necrosis factor-alpha and the risk of respiratory distress syndrome among preterm infants. Am J Obstet Gynecol, 177: 50-56. 125. Yende S, Quasney MW, Tolley E, Zhang Q, Wunderink RG. (2003) Association of tumor necrosis factor gene polymorphisms and prolonged mechanical ventilation after coronary artery bypass surgery. Crit Care Med. 31: 133. 126. Dinarello CA. (1994) The biological properties of interleukin-1. Eur Cytokine Netw, 5(6): 517-531. 127. Dinarello CA. (2002) The IL-1 family and inflammatory diseases. Clin Exp Rheumatol, 20(5 Suppl 27): S1-13. 128. Moos V, Rudwaleit M, Herzog V, Hohlig K, Sieper J, Muller B. (2000) Association of genotypes affecting the expression of interleukin-1beta or interleukin-1 receptor antagonist with osteoartritisz. Artritisz Rheum, 43(11): 2417-2422. 129. Luheshi GN. (1998) Cytokines and fever. Mechanisms and sites of action. Ann N Y Acad Sci, 856: 83-89. 130. Romagnoli C, Frezza S, Cingolani A, De Luca A, Puopolo M, De Carolis MP, Vento G, Antinori A, Tortorolo G. (2001) Plasma levels of interleukin-6 and interleukin-10 in preterm neonates evaluated for sepsis. Eur J Pediatr, 160(6): 345-350. 131. Morecroft JA, Spitz L, Hamilton PA, Holmes SJ. (1994) Plasma interleukin-6 and tumour necrosis factor levels as predictors of disease severity and outcome in necrotizing enterokolitis. J Pediatr Surg, 29(6): 798-800.

100

132. Yoon BH, Romero R, Kim KS, Park JS, Ki SH, Kim BI, Jun JK. (1999) A systemic fetal inflammatory response and the development of bronchopulmonary dysplasia. Am J Obstet Gynecol, 181(4): 773-779. 133. Kotecha S, Wilson L, Wangoo A, Silverman M, Shaw RJ. (1996) Increase in interleukin (IL)-1 beta and IL-6 in bronchoalveolar lavage fluid obtained from infants with chronic lung disease of prematurity. Pediatr Res, 40(2): 250-256. 134. Bazrafshani MR, Ollier WE, Hajeer AH. (2000) A novel PCR-RFLP assay for the detection of the single nucleotide polymorphism at position -1082 in the human IL-10 gene promoter. Eur J Immunogenet, 27(3): 119-120. 135. Huang D, Cancilla MR, Morahan G. (2000) Complete primary structure, chromosomal localisation, and definition of polymorphisms of the gene encoding the human interleukin-12 p40 subunit. Genes Immun, 1(8): 515-520. 136. Morahan G, Huang D, Wu M, Holt BJ, White GP, Kendall GE, Sly PD, Holt PG. (2002) Association of IL12B promoter polymorphism with severity of atopic and nonatopic asthma in children. Lancet, 360(9331): 455-459. Erratum in: Lancet 2002; 360(9348): 1892. 137. Morahan G, Boutlis CS, Huang D, Pain A, Saunders JR, Hobbs MR, Granger DL, Weinberg JB, Peshu N, Mwaikambo ED, Marsh K, Roberts DJ, Anstey NM. (2002) A promoter polymorphism in the gene encoding interleukin-12 p40 (IL12B) is associated with mortality from cerebral malaria and with reduced nitric oxide production. Genes Immun, 3(7): 414-418. 138. Pravica V, Perrey C, Stevens A, Lee JH, Hutchinson IV. (2000) A single nucleotide polymorphism in the first intron of the human IFN-gamma gene: absolute correlation with a polymorphic CA microsatellite marker of high IFN-gamma production. Hum Immunol, 61(9): 863-866. 139. Warle MC, Farhan A, Metselaar HJ, Hop WC, Perrey C, Zondervan PE, Kap M, Kwekkeboom J, Ijzermans JN, Tilanus HW, Pravica V, Hutchinson IV, Bouma GJ. (2003) Are cytokine gene polymorphisms related to in vitro cytokine production profiles? Liver Transpl, 9(2): 170-181. 140. Agerholm-Larsen B, Tybjserg-Hansen A, Schnohr P, Nordestgaard BG. (1999) ACE gene polymorphism explains 30-40% of variability in serum ACE activity in both

101

women and men

in the population at large: the Copenhagen City Heart Study.

Atherosclerosis, 147: 425-427. 141. Baudin B. (2002) Angiotensin II receptor polymorphisms in hypertension. Pharmacogenomic considerations. Pharmacogenomics, 3(1): 65-73. 142. Committee on Fetus and Newborn. (2002) Postnatal corticosteroids to treat or prevent chronic lung disease in preterm infants Pediatrics, 109: 330. 143. Rojas MA, Gonzalez A, Bancalari E, Claure N, Poole C, Silva-Neto G. (1995) Changing trends in the epidemiology and pathogenesis of neonatal chronic lung disease. J Pediatr, 126: 605. 144. D'Angio CT, Basavegowda K, Avissar NE, Finkelstein JN, Sinkin RA. (2002) Comparison of tracheal aspirate and bronchoalveolar lavage specimens from premature infants. Biol Neonate, 82: 145. 145. Warle MC, Farhan A, Metselaar HJ, et al..(2003) Are cytokine gene polymorphisms related to in vitro cytokine production profiles? Liver Transpl, 9(2): 170-181. 146. Prigoshin N, Tambutti M, Larriba J, Gogorza S, Testa R. (2004) Cytokine gene polymorphisms in recurrent pregnancy loss of unknown cause. Am J Reprod Immunol, 52(1): 36-41. 147. Daher S, de Arruda Geraldes Denardi K, Blotta MH, Mamoni RL, Reck AP, Camano L, Mattar R. (2004) Cytokines in recurrent pregnancy loss. J Reprod Immunol, 62(1-2): 151-157. 148. Morahan G, Huang D, Ymer SI,, Cancilla MR, Stephen K, Dabadghao P, Werther G, Tait BD, Harrison LC, Colman PG. (2001) Linkage disequilibrium of a type 1 diabetes susceptibility locus with a regulatory IL12B allele. Nat Genet, 27(2): 218-221. Erratum in: Nat Genet, 27(3): 346. 149. Bont L, Heijnen CJ, Kavelaars A, van Aalderen WM, Brus F, Draaisma JM, Pekelharing-Berghuis M, van Diemen-Steenvoorde RA, Kimpen JL. (2001) Local interferon-gamma levels during respiratory syncytial virus lower respiratory tract infection are associated with disease severity. J Infect Dis, 184(3): 355-358. 150. Bont L, Heijnen CJ, Kavelaars A, van Aalderen WM, Brus F, Draaisma JT, Geelen SM, van Vught HJ, Kimpen JL. (1999) Peripheral blood cytokine responses and disease severity in respiratory syncytial virus bronchiolitis. Eur Respir J, 14(1): 144-149.

102

151. Suzuki N, Chen NJ, Millar DG, Suzuki S, Horacek T, Hera H, Bouchard D, Nakanishi K, Penninger JM, Ohashi PS, Yeh WC. (2003) IL-1 receptor-associated kinase 4 is essential for IL-18-mediated NK and Th1 cell responses. J Immunol, 170(8): 4031-4035. 152. Bourbon J, Boucherat O, Chailley-Heu B,. Delacourt C. (2005) Control mechanisms of lung alveolar development and their disorders in bronchopulmonary dysplasia. Pediatr Res, 57(5 Pt 2): 38R-46R. 153. Ng PC, Li K, Wong RP, Chui K, Wong E, Li G, Fok TF. (2003) Proinflammatory and anti-inflammatory cytokine responses in preterm infants with systemic infections. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed, 88(3): F209-213. 154. Hodge G, Hodge S, Haslam R, McPhee A, Sepulveda H, Morgan E, Nicholson I, Zola H. (2004) Rapid simultaneous measurement of multiple cytokines using 100 microl sample volumes--association with neonatal sepsis. Clin Exp Immunol, 137(2): 402-407. 155. Hanna N, Bonifacio L, Reddy P, Hanna I, Weinberger B, Murphy S, Laskin D, Sharma S. (2004) IFN-gamma-mediated inhibition of COX-2 expression in the placenta from term and preterm labor pregnancies. Am J Reprod Immunol, 51(4):311-318. 156. Stamp LK, James MJ, Cleland LG. (2004) Paracrine upregulation of monocyte cyclooxygenase-2 by mediators produced by T lymphocytes: role of interleukin 17 and interferon-gamma. J Rheumatol, 31(7): 1255-1264. 157. Fraser J, Walls M, McGuire W. (2004) Respiratory complications of preterm birth. BMJ, 329(7472): 962-965. 158. Norwood VF, Fernandez LG, Tufro A, Gomez RA. Development of the reninangiotensin system. In: Polin RA, Fox WW, Amban SH, (eds.) Fetal and neonatal physiology. 3rd ed. Saunders, Philadelphia, 2004: 1249-1255.

103

13. Saját publikációk jegyzéke Disszertációhoz kapcsolódó közlemények Bokodi G, Treszl A, Derzbach L, Balogh A, Vasarhelyi B. The association of the carrier state of the tumor necrosis factor-alpha (TNFalpha) -308A allele with the duration of oxygen supplementation in preterm neonates. Eur Cytokine Netw. 2005 Jan-Mar;16(1):78-80. (IF: 1,073) Bokodi G, Derzbach L, Banyasz I, Tulassay T, Vasarhelyi B. The association of Interferon-Gamma T+874A and Interleukin-12 p40 promoter ctctaa/gc polymorphism with the need for respiratory support and perinatal complications in low birth weight neonates. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 2007 Jan; 92(1):F25-29. (IF: 0,0) Bokodi G, Derzbach L, Vasarhelyi B. Re: Deletion allele of angiotensin-converting enzyme. J Pediatr. 2006 Oct;149(4):579. (IF: 0,0) Banyasz I, Bokodi G, Vannay Á, Szebeni B, Treszl A, Vásárhelyi B, Tulassay T, Szabó A. Genetic polymorphisms of vascular endothelial growth factor and angiopoietin2 in retinopathy of prematurity Curr Eye Res. 2006 Jul-Aug;31(7-8):685-90. (IF: 1,116) Derzbach L, Bokodi G, Treszl A, Vasarhelyi B, Nobilis A, Rigo J Jr. Selectin polymorphisms and perinatal morbidity in low birth weight infants Acta Paediatr 2006 Oct;95(10):1213-7. (IF: 1,277) Bányász I, Bokodi G, Vásárhelyi B, Treszl A, Derzbach L, Szabó A, Tulassay T, Vannay Á. Genetic polymorphisms of vascular endothelial growth factor in perinatal complications

104

Eur Cytokine Netw. (in press). (IF: 1,073) Disszertációtól független közlemények Banyasz I, Szabo S, Bokodi G, Vannay A, Vasarhelyi B, Szabo A, Tulassay T, Rigo J Jr. Genetic polymorphisms of vascular endothelial growth factor in severe pre-eclampsia. Mol Hum Reprod. 2006 Apr;12(4):233-236. Epub 2006 Mar 3. (IF: 3,191) Derzbach L, Balogh A, Bokodi G, Vásárhelyi B, Rigo J Jr. The Ser1238Arg E-selectin and Thr715Pro P-selectin polymorphisms and severe preeclampsia J Reprod Med (in press). (IF: 0,835) Derzbach L, Treszl A, Bokodi G , Vasarhelyi B. Estrogen receptor polymorphism and retinopathy of prematurity. E-letter to the editor Invest Ophthalmol Vis Sci 2006 May 24. (IF: 3,643) Szebeni B, Dezsőfi A, Veres G, Rusai K, Vannay Á, Bokodi G, Arató A. Toll-szerű receptor 2 (TLR2-), TLR3- és TLR4-expresszió cöliákiás gyermekek vékonybélnyálkahártyájában. Gyermekgyógyászat 2006;57(3):299-306. (IF: 0,0)

105

14. Köszönetnyilvánítás Mindenek előtt köszönetet szeretnék mondani Tulassay Tivadar professzor úrnak, az MTA

levelező

tagjának,

a

Semmelweis

Egyetem

rektorának,

az

I.

sz.

Gyermekgyógyászati Klinika igazgatójának, aki létrehozta azt a szellemi alkotó műhelyt, ahol az elmúlt két évben nappali tagozatos, ösztöndíjas PhD hallgatóként dolgozhattam. Ebben a környezetben lehetőségem volt elsajátítani a kutatásban nélkülözhetetlen problémaorientált látásmódot és kérdésfelvetést. Bekapcsolódhattam olyan korszerű műszerek és eszközök használatába, amelyek lehetővé tették az orvosi kutatások nemzetközi szintű művelését. Köszönettel tartozom témavezetőmnek, Vásárhelyi Barna tudományos főmunkatársnak, az I. sz. Gyermekgyógyászati Klinika Kutató Laboratóriumának vezetőjének, aki kutató munkám során végig mellettem állt. Inspiráló kérdésfeltevésével, ötleteivel hatékonyan vezette végig kutatásainkat. Már TDK hallgatóként bekapcsolódhattam az Intézetben folyó tudományos munkába, később önálló kutatási feladatokkal látott el. Segítségével tanultam meg a tudományos gondolkodás, kérdésfelvetés, adatelemzés és kiértékelés módszereit. Köszönetet szeretnék mondani Treszl Andrásnak, aki elkezdte a koraszülöttekkel kapcsolatos vizsgálatokat, számos klinikai adatot és genetikai vizsgálati eredményt gyűjtött össze fáradságos munkával. Munkám során mindig segítségemre volt a statisztikai számítások során felmerülő problémák megoldásában, a cikkíráshoz szükséges angol nyelvi fordulatok megalkotásában. Köszönetet szeretnék mondani a laborban dolgozó főállású kutatóknak: Vannay Ádám tudományos munkatársnak és Kozma Gergely Tibor tudományos segésmunkatársnak, akikre mindig számíthattam a munkám során felmerülő technikai problémák megoldásában. Nagyon jól összefogták a PhD hallgatók közösségét, megtanították a szakmai kooperáció jelentőségét. Köszönöm a labor valamennyi PhD hallgatójának: Bányász Ilonának, Rusai Krisztinának, Szebeni Beátának és Balogh Ádámnak, hogy munkám során mindig számíthattam baráti segítségükre, támogatásukra. Külön kiemelném Derzbach Lászlót, aki sokáig állt mellettem közös kutatómunkánk során, számos ötletet adott az

106

irodalmazáshoz, és mindig segített kitartani, mikor a felmerülő nehézségek miatt az én türelmem már elfogyott. Köszönettel tartozom Bernáth Mária vezető asszisztensnek, aki észrevétlenül mindig megteremtette a labor hatékony működéséhez szükséges tárgyi feltételeket, és aki nélkül a vizsgálatok során felmerülő technikai nehézségeket nem sikerült volna legyőzni. Köszönet illeti Somoskői Zsuzsanna központi gyakornokot, akivel együtt kezdtünk a laborban TDK tevékenységünket, együtt gyűjtöttük be a klinikai adatokat, és együtt indultunk el a kutatás ösvényén. Ő később, bár nem lett kutató, gyakorló gyermekgyógyászként,

klinikai

szemléletű

észrevételeivel

mindig

segítette

kutatásaimat. A kutatócsoport a Semmelweis Egyetem I.sz. Gyermek Klinikájának részeként szoros együttműködésben dolgozott a klinikusokkal. A heti rendszerességgel tartott tudományos referálókon a klinikusoktól kapott gyakorlati ötletek segítettek bennünket a kutatások továbbvitelében, gyakorlati jelentőségű kérdések megfogalmazásában, eredményeink klinikai értelmezésében. Köszönöm Körner Anna, Fekete Andrea, Szabó Miklós, Reusz György, Arató András, Szabó András, és Szabó Attila segítségét. A sikeres vizsgálatokhoz más intézetekkel is szoros együttműködésre volt szükség. Köszönöm Nobilis Andrásnak és munkatársainak, hogy lehetővé tették a koraszülött és újszülött betegek bevonását vizsgálatainkba, és mindig segítettek a klinikummal kapcsolatos kérdéseink megválaszolásában. Köszönet illeti a Budai Gyermekkórház Anyagcsere Szűrő központjának munkatársait, akik lehetővé tették a PKU szűrésből visszamaradt vérminták megszerzését.

107