CYP2C19 polimorfizmusok szerepe a clopidogrel rezisztencia vizsgálatában iszkémiás stroke-on átesett betegekben Bádogos Ágnes DE-ÁOK V. évfolyam Témavezető: Dr. Bagoly Zsuzsa Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Laboratóriumi Medicina Intézet, Klinikai Laboratóriumi Kutató Tanszék
A clopidogrel hatása és alkalmazási területe Alkalmazási terület: A clopidogrel széles körűen alkalmazott szer a kardiovaszkuláris események szekunder prevenciójára, önmagában vagy aszpirinnel kombinálva. Hatásmechanizmus:
A clopidogrel molekulamodellje
A clopidogrel a P2Y12 ADP receptor irreverzibilis gátlószere. A receptor gátlása következtében a thrombocyták aggregációja elmarad. Magyarországon jelenleg több, mint 35.000 beteg részesül clopidogrel terápiában. A gyógyszert szedők kb. 10-40%-a nem ad megfelelő választ a kezelésre (clopidogrel rezisztencia), melynek hátterében elsősorban az aktív metabolit képződésének elmaradása áll.
A clopidogrel prodrug átalakulása aktív vegyületté COOCH3
Észterázok
N S
Inaktív metabolit (a bevett clopidogrel 85%-a)
Cl Clopidogrel O
CYP 1A2 CYP 2B6
CYP 2C19 Metabolizmus a májban
O
C
O CH3
N S
Cl 2-oxo vegyület
CYP 3A4(5) CYP 2C9 CYP 2B6
CYP 2C19 Metabolizmus a májban
O N
HOOC * HS
Cl Aktív metabolit
OCH3
A clopidogrel hatásának vizsgálatára szolgáló módszerek funkcionális tesztek
1/ Lumiaggregometria ADP-indukálta thrombocyta aggregáció 2/ Áramlási citometria Vazodilátor asszociált stimulált foszfoprotein (VASP) foszforiláció vizsgálata 3/ Betegágy melletti meghatározás (Point-of-care) VerifyNowTM P2Y12 4/ Genetikai vizsgálatok CYP polimorfizmusok vizsgálata a módszerek egy részét az aszpirin terápia befolyásolja nincs elfogadott “gold-standard” módszer a legtöbb módszer esetén jó, de nem túl szoros a korreláció
Célkitűzés Megvizsgálni a CYP2C19 *2, *3 (funkcióvesztő) illetve *17 (fokozott metabolizmussal járó) allélek szerepét a clopidogrel terápia hatékonyságára nézve olyan iszkémiás stroke-on átesett betegekben, akik a clopidogrelt legalább egy hónapja monoterápiaként (aszpirin nélkül) szedték.
Betegek és módszerek I. 111 iszkémiás stroke-on átesett, clopidogrel monoterápián lévő beteg 140 gyógyszert nem szedő, egészséges kontroll
A vizsgálat a DE-KK Neurológiai Klinikával kollaborációban zajlott.
Betegek és módszerek II. CYP2C19 *2,*3 funkcióvesztő allélek vizsgálata CYP2C19 *17 fokozott metabolizmussal járó allél vizsgálata
Módszer: valós idejű PCR alapú, FRET-el kombinált olvadáspontanalízisen alapuló detektálás (Roche LightCycler 480 készülék)
Betegek és módszerek III. Funkcionális módszerek a clopidogrel hatás vizsgálatára
1. P2Y12 specifikus ADP indukálta thrombocyta aggregáció
PGE1[ADP40]
clopidogrel reszponder kontroll, clopidogrel non-reszponder
Eredmény értékelése: maximális aggregáció alapján Non-reszponder: >1% max. aggr.
Betegek és módszerek III. Funkcionális módszerek a clopidogrel hatás vizsgálatára
1. P2Y12 specifikus ADP indukálta thrombocyta aggregáció
PGE1[ADP40]
clopidogrel reszponder
2. VASP foszforiláció vizsgálata áramlási citometriával Clopidogrel
ADP
PGE1
P2Y12
IP
Gs
Gi
kontroll, clopidogrel non-reszponder
AC
ATP
cAMP PKA
VASP
Eredmény értékelése: maximális aggregáció alapján Non-reszponder: >1% max. aggr.
VASP-P
Eredmény értékelése: PRI (%)alapján Non-reszponder: >50% PRI
Betegek és módszerek III. Funkcionális módszerek a clopidogrel hatás vizsgálatára
1. P2Y12 specifikus ADP indukálta thrombocyta aggregáció
PGE1[ADP40]
clopidogrel reszponder
2. VASP foszforiláció vizsgálata áramlási citometriával Clopidogrel
ADP
PGE1
P2Y12
IP
Gs
Gi
kontroll, clopidogrel non-reszponder
AC
ATP
cAMP PKA
VASP
Eredmény értékelése: maximális aggregáció alapján Non-reszponder: >1% max. aggr.
3. VerifyNow P2Y12 teszt
VASP-P
Eredmény értékelése: PRI (%)alapján Non-reszponder: >50% PRI
Eredmény értékelése: PRU alapján Non-reszponder: >220 PRU
Betegek és módszerek IV. Statisztikai módszerek: normalitás vizsgálat: Kolgomorov-Smirnov teszt és Shapiro-Wilk próba ANOVA/ Student t próba
Kruskal-Wallis/Mann Whitney U teszt χ2 próba/ Fischer exakt teszt
Szoftver: GraphPad Prism
Eredmények I. Allélfrekvenciák összehasonlítása Vizsgált allél
Kaukázusi populáció (CEU)allélfrekvencia
Kontroll populáció allélfrekvencia
CYP2C19*2
0,155
0,130
*0,122
*p=0.388
CYP2C19*3
0,014
0,000
*0,004
*p=0.968
CYP2C19*17
0,067
*0,282
*0,252
*p<0.001
§
Beteg populáció Szignifikancia allélfrekvencia (CEU-hoz viszonyítva)
A CYP2C19 *2 és *3 allélek esetén a betegpopulációban számolt allélfrekvenciák nem tértek el jelentősen a kaukázusi populációétól. A CYP2C19 *17 esetén a kaukázusi populációhoz képest szignifikánsan magasabb allélfrekvenciákat találtunk a stroke-on átesett betegekben és az egészséges kontrollokban egyaránt. §=HAPMAP
adatbázis alapján
Eredmények II: A CYP2C19 *2 hordozása és a clopidogrel hatástalansága közötti összefüggés PGE1[ADP40] teszt
NR (%)
56,8 73,7
75
73,9
VASP foszforiláció
53,4 73,7
75
73,9
VerifyNow P2Y12 teszt
51,2 68,4
75
69,6
A CYP2C19*2 allél esetén gén-dózis-hatás összefüggés volt megfigyelhető az allél jelenléte és a clopidogrel hatástalansága között. A CYP2C19*3 allél rendkívül ritka, egyetlen beteg esetén tudtuk kimutatni, az allél hordozása clopidogrel rezisztenciával társult.
Eredmények III: A CYP2C19 *17 allél hordozása növeli a clopidogrel hatékonyságát
NR (%)
PGE1[ADP40] teszt
VASP foszforiláció
63,5 52,8
63,5 44,4
60
54,3
60
47,8
VerifyNow P2Y12 teszt
59,7 47,2
50
A CYP2C19 *17 allél hordozása fokozott clopidogrel hatással társult *1/*1 genotípushoz képest.
47,8
Eredmények IV: A CYP2C19*2 allél hatása a *17 allél hiányában PGE1[ADP40] teszt
NR (%)
58,3 83,3
75
81,3
VASP foszforiláció
58,3 83,3
75
81,3
VerifyNow P2Y12 teszt
53,2 83,3
75
A CYP2C19 *2 hordozása a *17 allél nélkül jelentősen csökkentette a clopidogrel hatását, a *2 allél jelenléte önmagában a non-responderek arányát mintegy 25%-al növelte a vizsgált betegpopulációban.
81,3
Eredmények V: CYP2C19*2 allél hatásának összehasonlítása a CYP2C19*2 és *17 együttes előfordulásával PGE1[ADP40] teszt
NR (%)
81,3
50
VASP foszforiláció
81,3
50
VerifyNow P2Y12 teszt
81,3
33,3
A *2 allélt hordozó egyénekben a *17 allél társulása hatékonyan ellensúlyozta a gyengébb clopidogrel hatást, a clopidogrel non-responderek arányát jelentősen csökkentve.
Konklúzió A CYP2C19 *2, *3 és *17 kiemelt fontosságúak az egyes gyógyszerek metabolizmusában, a clopidogrel metabolizmusában is. Vizsgálatainkban a *2, *3 allélek hordozása a clopidogrel hatástalanságával volt összefüggésben, míg a *17 allél hordozása fokozott gyógyszerhatás kialakulásához vezetett.
A *2 és *17 allélek együttes jelenléte fokozta a clopidogrel hatását a *2 allél hordozásához képest, tehát javította a *2 allél jelenléte miatt fennálló csökkent hatást. A *17 allél az általunk vizsgált populációban gyakoribb volt, mint a kaukázusi populációban, mely elvileg jobb clopidogrel hatást feltételez. Eredményeink felhívják a clopidogrel hatás tesztelésének fontosságára a figyelmet, kihangsúlyozva a hatástalanság hátterében rejlő genetikai okok vizsgálatának lehetőségét.
Köszönet DE-ÁOK Laboratóriumi Medicina Intézet Klinikai Laboratóriumi Kutató Tanszék Dr. Bagoly Zsuzsa Prof. Dr. Muszbek László Sarkady Ferenc Gindele Réka Szabó Edina DE-ÁOK Laboratóriumi Medicina Intézet Prof. Dr. Kappelmayer János Kissné Sziráki Valéria Minden betegnek és kontrollnak a véradásért
DE-ÁOK Neurológiai Klinika Prof. Dr. Csiba László Dr. Magyar Tünde Dombi Brigitta Szent Imre Kórház, Budapest Dr. Pongrácz Endre Neurológia Járóbeteg Szakrendelő Hajdúszoboszló Dr. Sóvágó Judit
Függelék Önállóan elvégzett munkák: CYP2C19 polimorfizmusok mérése valós idejű PCR alapú,
FRET-el kombinált olvadáspont-analízisen alapuló detektálással 111 beteg és 140 kontroll esetén 30 beteg ill. kontroll esetén a clopidogrel hatás funkcionális tesztjeinek elvégzése: PGE1[ADP40] thrombocyta aggregáció, VerifyNow P2Y12 teszt
Segítséggel elvégzett munkák: DNS izolálás, koncentráció ill. tisztaság meghatározása spektrofotométerrel 30 beteg ill. kontroll esetén a VASP foszforiláció mérése Eredmények értékelése, statisztikai számítások
