4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1
Pengaruh konsentrasi papain terhadap hidrolisis kitosan Pengaruh papain dalam menghidrolisis kitosan dapat dipelajari secara
viskometri. Metode viskometri merupakan salah satu cara dasar yang dapat mengukur kemampuan enzim untuk mendegradasi kitosan dalam memecah rantai linear
polisakarida
dimana
perubahan
viskositas
pada
larutan
kitosan
menunjukkan perubahan derajad polimerisasi dari rantai linear kitosan tersebut. Pada penelitian ini diukur perubahan viskositas intrinsik kitosan selama waktu hidrolisis. Viskositas intrinsik merupakan nilai viskositas spesifik larutan ketika konsentrasi pelarutnya sama dengan nol (Li et al. 2007). Viskositas intrinsik [η] kitosan mengalami penurunan yang signifikan dengan adanya penambahan papain yang terjadi pada awal dua jam waktu hidrolisis dan mulai melambat setelah dua jam (Gambar 2). Penambahan konsentrasi papain sebanyak 12 mg/ml substrat mengakibatkan penurunan viskositas intrinsik terbesar yaitu dari 466,68 ml/g menjadi 52,71 ml/g. Kitosan yang dihidrolisis dengan konsentrasi papain 6, 9, dan 12 mg/ml mampu menurunkan viskositas kitosan secara signifikan hingga 82,5%; 85,5%; dan 88,7% dibandingkan tanpa penambahan papain yang hanya mampu menurunkan sebesar 38,6%. Pengaruh papain dalam menghidrolisis kitosan ditunjukkan dengan nilai viskositas intrinsik setelah waktu hidrolisis tertentu dapat dilihat pada Gambar 2 dan Lampiran 1a.
Gambar 2 Penurunan viskositas intrinsik kitosan setelah hidrolisis dengan papain.
16
Berdasarkan analisis ragam (Lampiran 1b) pada tingkat kepercayaan 95%, penambahan konsentrasi papain untuk mendegradasi kitosan memiliki pengaruh yang signifikan (Fhit>Ftab) terhadap penurunan viskositas intrinsik kitosan. Penambahan konsentrasi papain mampu mendegradasi kitosan dengan memotong ikatan glikosidik rantai kitosan sehingga dihasilkan kitosan dengan ukuran yang lebih kecil. Perubahan ukuran kitosan dapat dilihat dari perubahan viskositas intrinsik kitosan dalam larutan dengan nilai viskositas intrinsiknya yang semakin kecil. Perlakuan waktu dalam menghidrolisis kitosan juga berpengaruh secara signifikan (Fhit>Ftab) dalam menurunkan viskositas kitosan. Semakin lama waktu hidrolisis dan semakin besar konsentrasi papain yang digunakan untuk mendegradasi juga akan mengakibatkan penurunan viskositas intrinsik yang tinggi. Hal tersebut dapat dilihat dari nilai viskositas intrinsik kitosan terkecil (52,71 ml/g) setelah dihidrolisis enzim papain dengan konsentrasi 12 mg/ml larutan kitosan 1% selama 6 jam. Konsentrasi larutan kitosan yang digunakan dalam proses hidrolisis juga mempengaruhi proses degradasi kitosan. Pada penelitian ini digunakan larutan kitosan 1% yang dilarutkan dalam asam asetat 2%. Menurut Mao et al. (2004), ketika konsentrasi larutan yang digunakan rendah, kitosan akan lebih sensitif terhadap pemecahan rantai kitosan meskipun dengan konsentrasi asam yang sama. Hal tersebut berkaitan dengan struktur kitosan pada larutan. Ketika konsentrasi larutan kitosan yang digunakan tinggi (lebih dari 4%) akan menghasilkan viskositas yang tinggi dan kental yang berpengaruh pada interaksi antarmolekul lebih kuat dan kaku. Selain itu segmen dari rantai kitosan yang dapat terpotong akan terbatas pada area tertentu saja. Penurunan jumlah segmen yang kontak dengan enzim pada proses hidrolisis akan menghasilkan laju hidrolisis yang rendah. Oleh karena itu konsentrasi larutan kitosan yang rendah (di bawah 4%) lebih cocok untuk menghasilkan berat molekul rendah dengan waktu hidrolisis yang singkat. Menurut Zhang dan Neau (2001), berat rata-rata molekul kitosan dapat diukur dengan menurunkan viskositas intrinsik pada persamaan Mark-Houwink. Nilai dari K dan a tergantung dari derajad deasetilasi kitosan yang dinyatakan
17
dalam persentase. Derajad deasetilasi kitosan dapat mengubah kekakuan rantai polimer kitosan pada larutan. Penambahan papain mampu mendegradasi kitosan dengan menurunkan berat molekulnya hingga dibawah 105 kDa. Penambahan papain dengan konsentrasi 12 mg/ml merupakan konsentrasi terbaik yang mampu mendegradasi kitosan dengan penurunan berat molekul kitosan tertinggi yaitu sebesar 89% (dari 603 kDa menjadi 68 kDa) setelah enam jam waktu hidrolisis (Gambar 3). Kitosan dengan perlakuan kontrol atau tanpa penambahan papain juga mengalami pemurunan berat molekul dari 699 kDa hingga 430 kDa. Hal ini dimungkinkan karena pengaruh panas selama proses hidrolisis dalam mendegradasi kitosan. Panas juga dapat menyebabkan terjadinya pemecahan rantai polimer akibat tidak stabilnya ikatan glikosidik sehingga mengakibatkan berat molekul dan viskositas intrinsik turun dengan meningkatnya suhu. Nilai berat molekul kitosan terdegradasi tersaji pada Lampiran 2 dan pada Gambar 3 dapat dilihat berat molekul kitosan yang telah dihidrolisis dengan penambahan beberapa konsentrasi papain.
Gambar 3 Berat molekul kitosan (kDa) setelah hidrolisis dengan papain. Papain dapat digunakan sebagai alternatif pengganti kitosanase karena lebih murah dan ketersediannya yang banyak tetapi peranannya dalam menghidrolisis kitosan tergolong non-spesifik karena memiliki aktivitas kitosanolitik (4,98 unit) yang lebih kecil dibandingkan kitosanase (50 unit) (Kumar dan Tharanathan 2004). Satu unit aktivitas kitosanolitik didefinisikan sebagai jumlah enzim per miligram untuk mendegradasi kitosan per menit pada suhu 37 oC menghasilkan 1µmol glukosamin. Penggunaan kitosanase lebih cocok untuk memperoleh oligomer kitosan dengan derajad polimerisasi 2-3. Sedangkan enzim non-spesifik
18
lebih cocok untuk memperoleh kitosan dengan berat molekul rendah dengan cara mengatur kondisi proses hidrolisisnya (konsentrasi enzim, konsentrasi substrat, waktu hidrolisis, suhu). Menurut Lee et al. (2008), enzim non-spesifik dapat mengkatalisis dua reaksi yang berbeda karena memiliki dua sisi aktif pada molekul enzim atau satu sisi aktif yang dwifungsional. Pada kitosan jumlah dari gugus N-asetil, sebaran gugus N-asetil dalam rantai linear, serta berat molekul atau sebaran rantai panjangnya akan mempengaruhi kemampuan enzim tersebut dalam mendegradasi kitosan. Peranan enzim dalam mendegradasi rantai polisakarida dapat dibedakan berdasarkan cara enzim tersebut mendepolimerisasi rantai polisakarida dengan memotong ikatan glikosidik. Tipe pertama bersifat endo-aksi dengan memotong interior ikatan glikosidik secara acak. Akibatnya polisakarida terurai menjadi bentuk yang lebih kecil dengan ukuran yang acak. Pada tipe ini berat molekul dari polimer turun secara cepat. Sedangkan tipe kedua adalah ekso-aksi yang lebih suka memotong ikatan glikosidik pada ujung rantai sehingga menghasilkan bentuk monomer. Umumnya berat molekul polimer kitosan turun secara konstan dan lambat pada tipe ekso-aksi (Li et al 2007). Titik pemotongan ikatan glikosidik dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4 Titik pemotongan ikatan glokosidik oleh enzim Berdasarkan kedua tipe aksi tersebut dalam mendegradasi polimer, papain dapat digolongkan dalam tipe endo-aksi. Hal tersebut disimpulkan dari pola penurunan nilai berat molekul yang turun secara signifikan pada dua jam awal hidrolisis dan mulai melambat setelah dua jam waktu hidrolisis (Gambar 3). Berdasarkan Gambar 3, penambahan konsentrasi papain 12 mg/ml untuk mendegradasi larutan kitosan 1% mampu menurunkan berat molekulnya secara
19
signifikan setelah dua jam hidrolisis dari 603 kDa hingga 104 kDa. Setelah enam jam dihidrolisis, berat molekul kitosan hanya turun mencapai 68 kDa. Pada awal hidrolisis, papain memecah interior rantai glikosidik kitosan menjadi bentuk yang lebih kecil dengan ukuran yang acak. Semakin kecil ukuran akibat proses hidrolisis akan menurunkan kekakuan rantai polimer sehingga menghasilkan kitosan dengan berat molekul yang lebih kecil. Li et al. (2007) juga menambahkan bahwa pada interaksi antara endo enzim dan substrat polisakarida, enzim membutuhkan beberapa tempat pelekatan di unit glikosil yang berbeda pada substrat untuk bereaksi yang selanjutnya akan menghasilkan sakarida berbobot molekul rendah dan oligosakarida.
4.2
Laju hidrolisis dan degradasi kitosan Data viskositas intrinsik yang diplotkan sebagai ∆(1/[η]1/α) terhadap waktu
hidrolisis digunakan untuk menentukan laju hidrolisis kitosan oleh papain. Nilai ∆(1/[η]1/α) menunjukkan derajad kemampuan enzim dalam mendegradasi kitosan yang ditunjukkan dalam viskositas intrinsik kitosan terhadap waktu hidrolisis. Semakin lama waktu hidrolisis, laju hidrolisis kitosan juga meningkat. Laju hidrolisis kitosan selama dua jam awal memiliki bentuk kurva yang linear dengan peningkatan ∆(1/[η]1/α) yang signifikan, tetapi dengan meningkatnya waktu hidrolisis membentuk kurva yang sigmoid. Berdasarkan bentuk tersebut dapat diperoleh informasi laju hidrolisis kitosan oleh papain tertinggi pada waktu hidrolisis dua jam dan mulai melambat setelah dua jam hidrolisis. Proses pemotongan ikatan glikosidik kitosan berlangsung signifikan selama dua jam menghasilkan kitosan dengan berat molekul lebih kecil dengan ukuran rantai yang acak. Setelah melewati dua jam waktu hidrolisis, proses degradasi menjadi melambat dikarenakan enzim yang mulai jenuh dalam menghidrolisis substratnya. Laju hidrolisis kitosan oleh papain dapat dilihat pada Gambar 5 dan Lampiran 3a.
20
Konsentrasi Papain: Gambar 5 Laju hidrolisis kitosan oleh beberapa konsentrasi papain. Berdasarkan analisis ragam (Lampiran 3b) pada tingkat kepercayaan 95%, perbedaan konsentrasi papain yang digunakan untuk menghidrolisis kitosan memiliki pengaruh yang nyata (Fhit>Ftab) terhadap peningkatan laju hidrolisis kitosan. Semakin tinggi konsentrasi papain yang digunakan untuk menghidrolisis kitosan maka semakin tinggi laju hidrolisis dalam mendegradasi sejumlah kitosan yang berlangsung. Pengujian secara viskometri juga dapat digunakan untuk menentukan laju degradasi kitosan oleh enzim. Pengukuran laju degradasi kitosan (r) menggunakan data viskositas intrinsik yang mengacu persamaan Mark-Houwink untuk mengkonversi penurunan viskositas terhadap derajad pemotongan rantai glikosidik kitosan oleh enzim. Laju degradasi kitosan diperoleh dari slope (k) nilai ∆(1/[η]1/α) terhadap waktu dan dimasukkan pada rumus yang mengacu pada metode yang dilakukan oleh Li et al (2007). Nilai r menunjukkan kemampuan sejumlah papain dalam menghidrolisis kitosan dalam memotong ikatan glikosidik yang dinyatakan dalam jumlah mikrogram per mililiter jam. Hidrolisis kitosan tanpa penambahan papain memiliki nilai r nol atau tidak mampu mendegradasi kitosan. Semakin tinggi konsentrasi papain yang ditambahkan untuk menghidrolisis kitosan maka laju degradasi kitosan juga semakin meningkat. Nilai r tertinggi terjadi pada perlakuan penambahan konsentrasi papain 12 mg/ml yang mampu menghidrolisis kitosan sebesar 2,77 µg/ml jam. Artinya kitosan telah terhidrolisis dengan pemutusan ikatan glikosidiknya sebanyak 2,77 µg/ml larutan per jam. Histogram pengaruh
21
konsentrasi enzim papain terhadap laju hidrolisis kitosan dapat dilihat pada Gambar 6 dan nilai laju degradasi kitosan (r) dapat dilihat pada Lampiran 4.
Gambar 6 Laju degradasi kitosan pada beberapa konsentrasi papain.
4.3
Rendemen kitosan terdegradasi Kitosan terdegradasi yang telah dikeringkan dalam oven pada suhu 40oC
selama 12 jam dan beratnya konstan, dihitung nilai rendemennya dengan membandingkan berat awal kitosan dengan berat kitosan terdegradasi yang dihasilkan. Besarnya nilai rendemen menunjukkan efisiensi produk kitosan terdegradasi dari proses hidrolisis kitosan. Kitosan yang dihidrolisis dengan konsentrasi papain 12 mg/ml diberikan perlakuan waktu hidrolisis 6 sampai 24 jam untuk mengetahui waktu optimal proses. Hasil nilai rendemen dari hidrolisis kitosan berkisar antara 72% hingga 97%. Nilai rendemen kitosan terdegradasi pada berbagai waktu hidrolisis dapat ditunjukkan pada Gambar 7.
Gambar 7 Nilai rendemen kitosan terdegradasi
22
Semakin lama waktu hidrolisis menghasilkan nilai rendemen yang tinggi. Hal tersebut dapat dikarenakan semakin banyak kitosan yang terdegradasi oleh papain menjadi rantai yang lebih sederhana sehingga dapat diendapkan dengan penambahan basa kuat (NaOH 10%). Walaupun penambahan waktu hidrolisis lebih dari enam jam tidak berpengaruh signifikan terhadap penurunan berat molekul tetapi akan berpengaruh terhadap jumlah kitosan terdegradasi yang dapat diendapkan.
4.4
Kelarutan kitosan terdegradasi Kitosan terdegradasi terpilih yaitu dengan berat molekul terkecil 68 kDa
diperoleh dari hidrolisis larutan kitosan 1% dengan konsentrasi papain 12 mg/ml, selanjutnya dilarutkan pada berbagai konsentrasi pelarut asam asetat (0,3-2%). Larutan kitosan terdegradasi tersebut akan menghasilkan pH dan kelarutan yang bervariasi, untuk pH larutan diukur dengan pH meter dan kelarutan kitosan terdegradasi secara turbidimetri diukur nilai transmitannya mengacu pada metode Li et al (2005). Semakin besar nilai transmitan menunjukkan semakin tinggi kelarutan dari kitosan dan kitosan terdegradasi. Kelarutan kitosan terdegradasi dengan berat molekul 68 kDa larut hingga pH 6 serta mulai mengendap dan sulit larut pada pH di atas 6. Di sisi lain kitosan hanya mampu dilarutkan pada pH 4. Nilai transmitan dari kelarutan kitosan dan kitosan terdegradasi pada berbagai pH dapat dilihat pada Gambar 8.
Gambar 8 Nilai transmitan kelarutan kitosan dan kitosan terdegradasi pada berbagai pH. Kitosan larut sempurna menggunakan asam asetat 2% dengan pH 4. Kitosan mulai mengendap serta sulit larut pada pH di atas 4. Di sisi lain kitosan
23
terdegradasi dapat larut sempurna dalam konsentrasi larutan asam yang lebih rendah menggunakan asam asetat 0,3% pada pH larutan mencapai 6. Akan tetapi kitosan terdegradasi belum dapat dilarutkan dalam air akuades yang diharapkan menghasilkan larutan yang memiliki pH netral. Hal tersebut karena kitosan terdegradasi masih memiliki berat molekul yang besar. Li et al. (2005) menyatakan bahwa kitosan terdegradasi dengan berat molekul 5-20 kDa dapat larut dalam air akuades dan pada kisaran pH yang luas. Selain itu peningkatan kelarutan dari kitosan terdegradasi dapat disebabkan oleh penurunan interaksi antar molekul seperti gaya van der Waals dan ikatan hidrogen.
4.5
Aplikasi kitosan terdegradasi Kitosan memiliki gugus amin yang reaktif sehingga dapat diaplikasikan
pada berbagai bidang sebagai pengkelat, flokulan, pengikat, pengabsorbsi, pembentuk film, penstabil, penjernih, dan koagulan (Shahidi et al. 1999). Selain itu kitosan merupakan salah satu golongan gum alami yang berperan sebagai penstabil di bidang kosmetika. Kitosan dengan berat molekul tinggi akan menghasilkan viskositas yang sangat kental dan cocok sebagai pembentuk lapisan tipis. Aplikasinya telah digunakan pada berbagai produk kosmetika, terutama produk perawatan rambut dan kulit. Penggunaan kitosan pada shampoo mampu memperkuat rambut karena adanya interaksi ionik antara kitosan dengan protein rambut. Kitosan juga telah digunakan pada produk perawatan kulit seperti lotion sebagai pelembab. Kitosan yang digunakan pada permukaan kulit akan membentuk perlindungan dan lapisan elastik yang akan melembabkan (Champagne 2008). Peningkatan kelarutan kitosan dan penurunan berat molekulnya juga akan meningkatkan aplikasinya. Kitosan dengan berat molekul yang lebih kecil (sekitar <100 kDa) akan lebih mudah larut dalam larutan asam dengan konsentrasi yang lebih rendah sehingga penggunaannya sebagai bahan baku ataupun bahan pembantu dalam formulasi produk akan lebih praktis dan mudah. Penggunaan kitosan yang larut dalam konsentrasi asam yang rendah akan mengurangi pengaruh pada pH dari suatu produk.
24
Kitosan terdegradasi yang memiliki berat molekul lebih kecil juga memiliki aktivitas fungisidal dan bakterisidal yang lebih tinggi dibandingkan kitosan (Shahidi 1999). Kitosan dengan berat molekul di <300 kDa lebih efektif menghambat pertumbuhan S. aureus dibandingkan E..coli. Sedangkan kitosan terdegradasi
dengan
berat
molekul
mencapai
5-10
kDa
menunjukkan
penghambatan yang tinggi terhadap bakteri patogen (Xia et al. 2010). Hal tersebut dimungkinkan karena semakin pendek dan fleksibel rantai polimer kitosan mengakibatkan gugus amin akan menjadi lebih reaktif dan berperan sebagai kationik yang baik. Kitosan terdegradasi yang mudah larut juga cocok digunakan dalam formulasi produk kosmetika karena penambahan kitosan sebagai polimer kationik dapat menambah kestabilan sistem emulsi produk dan pengental (Haryono et al. 2007). Kitosan terdegradasi yang memiliki berat molekul di bawah 100 kDa juga dapat digunakan sebagai bahan enkapsulasi dalam sistem pengantar bahan aktif kosmetik ke dalam kulit untuk mengurangi kemungkinan iritasi pada kulit luar (Rosen MR 2005).
