FT-IR alapú fehérje másodlagos szerkezet meghatározás optimálása TDK dolgozat Kalocsai Réka I. éves biomérnök M.Sc. hallgató
Témavezető:
Konzulens:
Dr. Gergely Szilveszter
Prof. Salgó András
egyetemi docens
egyetemi tanár
Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék
2014
Tartalomjegyzék 1. Rövidítésjegyzék ......................................................................................... 1 2. Bevezetés és célkitűzés ............................................................................... 2 3. Irodalmi áttekintés ..................................................................................... 3 3.1. Aminosavak ............................................................................................................... 3 3.2. Fehérjék szerkezete .................................................................................................... 4 3.3. Fehérjék elválasztása ................................................................................................. 7 3.3.1. Gélelektroforézis ................................................................................................... 7 3.3.2. Izoelektromos fókuszálás ...................................................................................... 8 3.3.3. Gélszűrés ............................................................................................................... 8 3.3.4. Ioncserélő és affinitás kromatográfia .................................................................... 9 3.4. Másodlagos szerkezet meghatározási módszerek ...................................................... 9 3.4.1. Fourier-transzformációs infravörös spektroszkópia ............................................. 9 3.4.1.1. Infravörös spektroszkópia ............................................................................. 10 3.4.1.2. ATR technika ................................................................................................ 14 3.4.1.3. Fehérje másodlagos szerkezet meghatározás ATR FT-IR módszerrel ......... 14 3.4.1.4. FT-IR további alkalmazási lehetőségei ......................................................... 15 3.4.2. Cirkuláris dikroizmus.......................................................................................... 17 3.4.3. NMR spektroszkópia .......................................................................................... 17 3.4.4. Raman-spektroszkópia ........................................................................................ 18
4. Anyagok és módszerek ............................................................................. 20 4.1. A vizsgált minták ..................................................................................................... 20 4.2. Az alkalmazott készülék .......................................................................................... 20 4.3. A mérések menete .................................................................................................... 21 4.4. Alkalmazott matematikai módszerek....................................................................... 22 4.4.1. Dekonvolúció ...................................................................................................... 22 4.4.2. Deriváltak ............................................................................................................ 23
5. Eredmények .............................................................................................. 24 5.1. Nyomóerő hatásának vizsgálata............................................................................... 24 5.2. Mérési körülmények optimalizálása ........................................................................ 25 5.3. FT-IR spektrumok értékelése dekonvolúciós módszerrel ....................................... 27 5.4. FT-IR spektrumok értékelése második derivált módszerrel .................................... 29
6. Diszkusszió ................................................................................................ 36 7. Irodalomjegyzék ....................................................................................... 39
1. Rövidítésjegyzék ATR: attenuated total reflection (csillapított teljes reflexió) BaF2: bárium-fluorid CaF2: kálcium-fluorid CD: cirkuláris dikroizmus CdTe: kadmium-tellurit CsI: cézium-jodid DNáz I.: dezoxiribonukleáz I. DNS: dezoxiribonukleinsav FIR: far-infrared spectroscopy (távoli infravörös spektroszkópia) FT-IR: Fourier-transzformációs infravörös /spektroszkópia/ GaAs: gallium-arzenid IR: infrared (infravörös) KBr: kálium-bromid MIR: mid-infrared spectroscopy (közép [analitikai] infravörös spektroszkópia) MRI: magnetic resonance imaging (mágneses rezonancia képalkotás) mRNS: messenger (hírvivő) ribonukleinsav NIR: near-infrared spectroscopy (közeli infravörös spektroszkópia) NMR: nuclear magnetic resonance (nukleáris mágneses rezonancia) RMSEC: root mean square error of calibration (kalibráció átlagos hiba négyzetösszege) RPD: residual predictive deviation (relatív korrigált tapasztalati szórás) SDS: sodium dodecyl sulfate (nátrium-dodecil-szulfát) ZnSe: cink-szelenid UV: ultra violet (ibolyántúli)
1
2. Bevezetés és célkitűzés A fehérjék olyan, aminosavakból felépülő makromolekulák, melyek fontos szerepet töltenek be a sejtek életében. Számos képviselőjük rendelkezik enzimaktivitással, így katalizálva a sejtben lejátszódó biokémiai folyamatokat. Vannak olyanok, melyek szerkezeti funkcióval bírnak, de találunk közöttük transzporter-, motor-, tartalék- és receptor fehérjéket is. A szervezetünk számára veszélyes toxinok, és a szervezet működéséhez elengedhetetlen hormonok is mind fehérje molekulák. A fehérjék aktivitása és biológiai funkciójuk szorosan összefügg másodlagos szerkezetükkel, így ennek megismerése egyre fontosabbá válik a tudományban. A fehérjeszerkezet megismerése különféle kromatográfiás és spektroszkópiás módszerekkel is lehetséges. Ezek közé tartozik többek között az általam is alkalmazott Fouriertranszformációs infravörös spektroszkópia, ami egy nagy érzékenységű, roncsolásmentes technika, gyors mérést tesz lehetővé, nem igényel bonyolult minta előkészítést, valamint többféle üzemmódban, szilárd halmazállapotú és oldatbeli minták mérésére is alkalmas. A nyomóerő hatásának vizsgálatához 4 különböző nyomáson (25 N, 50 N, 75 N, 100 N) 3 enzim (DNáz I., Lizozim, Tripszin) FT-IR spektrumát vettem fel 4 cm-1-es felbontás mellett, mintánként 4 letapogatással. A felbontás és a letapogatások számának optimalizálása érdekében a glutén fehérje spektrumát vettem fel 1 cm-1, 2 cm-1 és 4 cm-1-es felbontás mellett, miközben a letapogatások számát 4 és 128 között változtattam. A spektrumokat Gauss-, ill. Lorentz-illesztéseken alapuló dekonvolúciós, valamint mozgó átlagolással, ill. Savitzky–Golay-féle illesztéssel kombinált második derivált matematikai módszerekkel is kezeltem. TDK munkám során célom a következő volt: a letapogatások számának, valamint a különböző felbontások hatásának vizsgálata az infravörös spektrumokon, a nyomóerő hatásának vizsgálata, valamint megtalálni a legmegfelelőbb matematikai módszert az FT-IR spektrumok értékelésére.
2
3. Irodalmi áttekintés A fehérjék olyan, aminosavakból felépülő makromolekulák, melyek fontos szerepet töltenek be a sejtek életében. A molekuláris biológia centrális dogmája alapján a DNS-ben tárolt információ először átíródik mRNS-sé (transzkripció), majd a transzláció során jönnek létre a fehérjék. A természetben előforduló kb. 1012-féle különböző fehérje közül kb. 105féle megtalálható az emberi szervezetben. Ezek a molekulák nagyon változatosak, molekulatömegük 5 és 1000 kDa között változik [1]. Az egyszerű fehérjék csak aminosavakból állnak, míg az összetett fehérjék lipideket, szénhidrátokat, vagy akár fém ionokat is tartalmazhatnak. Számos fehérje rendelkezik enzimaktivitással [2], így katalizálva a sejtben lejátszódó biokémiai folyamatokat. Vannak szerkezeti funkcióval bíró fehérjék (pl. citoszkeleton), de találunk közöttük transzporter(pl. hemoglobin), motor- (aktin, miozin), tartalék- és receptor fehérjéket is. Egy makromolekulán belül is találhatunk különböző funkcióval bíró részleteket, ezeket nevezzük fehérje doméneknek. Az emberi szervezet számára veszélyes toxinok, mint például a diftériatoxin, és az annak működéséhez elengedhetetlen hormonok is mind fehérje molekulák [1].
3.1.
Aminosavak
Az emberi szervezetet felépítő sejtek fehérjéinek aminosav sorrendje 20 féle különböző αL-aminosavból (1. ábra) jöhet létre (ezek közül 9 esszenciális). Ezek az aminosavak a fehérjén belül tovább módosulhatnak, így ez a szám bőven elegendő a természetben előforduló nagyszámú fehérje megvalósulásához [3]. Az aminosavak jellegzetessége, hogy az α-szénatomon tartalmaznak egy karboxil- és egy amino-csoportot is, így vizes közegben az oldat pH-jától függő mértékben proton donorként és proton akceptorként is viselkedhetnek (fiziológiás körülmények között ikerionos állapotban vannak, vagyis a karboxil- és az amino-csoport is ionizált) [4]. Eltérő oldalláncaik miatt különböznek a kémiai és a fizikai tulajdonságaik, ezért csoportosításuk is az oldalláncok minősége alapján történik [4]: Apoláros (glicin, alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, triptofán, metionin, cisztein) Poláros, töltéssel nem rendelkező (szerin, treonin, aszparagin, glutamin, tirozin) Savas karakterű (aszparaginsav, glutaminsav) 3
Bázikus karakterű (lizin, arginin, hisztidin)
1. ábra Aminosav szerkezet. R: oldallánc
A fehérjéket felépítő aminosavak között peptidkötések jönnek létre (2. ábra), melynek során mindig az utolsó aminosav karboxil-csoportjához kapcsolódik a következő aminosav amino-csoportja, vagyis a fehérjék irányított polimerek lesznek. Az N-terminális végen lévő aminosav α-amino-csoportja marad szabadon, míg a C-terminálison lévő aminosav αkarboxil-csoportja [1].
2. ábra 4 aminosavból álló oligopeptid lánc a peptidkötések jelölésével
3.2.
Fehérjék szerkezete
A fehérjéknek négy térszerkezeti szintjét különböztetjük meg (4. ábra): Elsődleges szerkezet Elsődleges szerkezet alatt a fehérje aminosav szekvenciáját értjük [5]. Az aminosavak közötti peptidkötésben részt vevő atomok egy síkban helyezkednek el. A π-delokalizáció 4
miatt a C–N kötés körüli rotáció gátolt, míg az α- és a karbonil-szénatom, valamint az αszénatom és a nitrogén atom között megengedett (itt már σ-kötések vannak) [1]. Másodlagos szerkezet Másodlagos szerkezet alatt a peptidlánc gerincének H-kötések által stabilizált elrendeződését értjük. Másodlagos szerkezeti elemek az α-hélix, a β-redő (parallel és antiparallel), a β-turn és a random coil [4]. Az α-hélix egy helikális alakzat, melyben a stabilizáló H-kötések az egymástól négy peptidkötés távolságra lévő aminosavak között jön létre, és párhuzamosak a jobbmenetes hélix hossztengelyével. A prolin megszakítja az α-hélixet, a nagy térkitöltésű és ionos aminosavak pedig gátolják a kialakulását [3]. β-redőzött struktúra esetén a H-hidak egymás mellett párhuzamosan elhelyezkedő peptid szakaszok között alakulnak ki. Ha a láncok azonos lefutásúak (vagyis az N- és a Cterminális irány megegyezik), akkor parallel, ha ellentétes lefutásúak, akkor antiparallel βredő szerkezetről beszélünk. Míg az α-hélix esetén az aminosav oldalláncok a hélix felületére, addig a β-redőnél a lemez síkja alá és fölé orientálódnak [3]. A β-turn a peptidlánc irányának megváltozását idézi elő. Szerkezete hasonlít az α-hélix szerkezetéhez, de a H-hidak az egymástól három peptidkötésre lévő aminosavak között alakulnak ki, valamint gyakran tartalmaz prolint [3]. A random coil egy rendezetlen struktúra [1]. A fehérjék nagy része többszörösen tartalmazza ezeket a szerkezeti elemeket [5]. Ezt a szerkezeti szintet jellemezhetjük a peptidsíkok egymáshoz képest történő elfordulásával, vagyis az φ és ψ torziós szögekkel, melyeknek könnyebben értelmezhető, grafikus megjelenítésére szolgál a Ramachandran-diagram (3. ábra). Ez jellemzően két részre osztható, a tiltott és a megengedett régióra [6]. A diagram mindössze 2%-a tartozik az utóbbi, megengedett régióhoz, melyen az aminosavak kb. 40%-a foglal helyet [7]. A Ramachandran-diagram egy 1960-as évekbeli próbálkozás eredménye, amikor is az atomok közötti vonzás és taszítás jelenségét és annak törvényszerűségeit egy egyszerű térképen szerették volna ábrázolni [8].
5
3. ábra Ramachandran-diagram [9]
A másodlagos szerkezet meghatározása történhet cirkuláris dikroizmussal, aminek alapja a molekulák különböző mértékű polarizált fény-elnyelő képessége. Emellett alkalmazzák még az NMR spektroszkópiát, valamint a Raman-, illetve a Fourier-transzformációs infravörös spektroszkópiát [10]. Harmadlagos szerkezet Harmadlagos szerkezet alatt a polipeptid-lánc teljes térbeli konformációját értjük, amelyben az aminosav szekvenciában egymástól távol eső részek közel kerülhetnek egymához. Az így kialakult háromdimenziós struktúra legfőbb stabilizáló kölcsönhatásai a H-kötések, az elektrosztatikus kölcsönhatások, a diszulfid-hidak és az apoláros kölcsönhatások. A fehérjék a feltekeredés (folding) során nyerik el azt a szerkezetet, melyben biológiai funkciójukat betöltik. Ennek a natív szerkezetnek a kialakulása legtöbbször vizes közegben megy végbe, így a poláros és ionos aminosav-oldalláncok a fehérje külső felülete felé, a hidrofób oldalláncok pedig a fehérje belseje felé néznek [5]. Negyedleges szerkezet Vannak bizonyos fehérjék (pl. hemoglobin), amelyek több polipeptid-láncból, alegységből állnak. Ezek az alegységek lehetnek azonosak, ekkor homomerről, vagy eltérőek, ekkor heteromerről beszélünk. A kapcsolódás a legtöbb esetben nem kovalens jellegű, és a kapcsolódó alegységek száma általában alacsony [1].
6
4. ábra Fehérjék szerkezeti szintjei [11]
A fehérjék magasabb rendű szerveződési szintjei is ismertek, mint például a szupramolekuláris struktúrák és multienzim komplexek (riboszóma, légzési elektron transzport lánc) [12].
3.3.
Fehérjék elválasztása
A fehérjék szerkezetének megismerése fontos a tudomány számára, mivel a szerkezet szorosan összefügg a biológiai funkcióval. A szerkezet meghatározásához azonban a fehérjéket először izolálni kell, majd el kell választani őket egymástól, ami különböző tulajdonságaik (pl. méret, töltés) alapján történhet. A fehérjék nagyon érzékenyek a környezeti körülmények megváltozására, így például a hőmérséklet, vagy a pH megváltozása, különféle könnyűfémek és detergensek jelenléte denaturációt idézhet elő, vagyis a molekulát stabilizáló gyenge kölcsönhatások (pl. Hkötések) megszűnnek. Ez a denaturáció lehet reverzibilis, vagy irreverzibilis, ami lehetővé teszi a fehérjék izolálását és elválasztását [1]. 3.3.1. Gélelektroforézis Ennél a módszernél lehetőség nyílik arra, hogy a fehérjéket méretük, alakjuk, illetve töltésük alapján megkülönböztessük egymástól. Maga az elválasztás elektromos térben, egy térhálós szerkezetű anyagban történik, ami lehet agaróz, vagy akrilamid (ezekkel az anyagokkal nem reagálnak a fehérjék, így alkalmasak az elválasztásra). A molekulák futási 7
sebessége a töltésüktől, a tömegüktől és az alakjuktól is függ [1]. Fehérjék elektroforetikus elválasztására főleg akrilamid gélelektroforézist használnak. Az akrilamid egy polimerizációra képes vegyület, mely N,N’-metilén-biszakrilamiddal térhálós szerkezetet alakít ki. Ennek a térhálónak a sűrűségét egyrészt az oldott akrilamidkoncentráció, másrészt pedig az akrilamid és a biszakrilamid aránya szabja meg [1]. A natív gélelektroforézis során – ahogy a neve is mutatja – a fehérje natív konformációja megmarad, vagyis az alakja és feltekeredettsége nem változik. A futtatást lúgos kémhatású pufferben végezzük, így az aminosavak oldalláncai deprotonálódnak, és a minta a pozitív pólus felé vándorol [1]. Ha a cél a méret szerinti elválasztás, akkor az SDS-poliakrilamid gélelektroforézist kell alkalmazni. Ekkor a fehérjemintához SDS-t és redukálószert (legtöbbször βmerkaptoetanolt) adagolunk. Az SDS egy detergens, ami kitekeri a fehérjéket és negatív töltéssel vonja be őket, a β-merkaptoetanol pedig a diszulfid-hidakat bontja el. Ekkor a több tulajdonságukban is eltérő fehérjék már csak méretükben különböznek, az elválasztás csak ez alapján történik. A futtatás során érdemes egy molekulamarkert is futtatni a mintával, ami segíti a komponensek tömegének meghatározását az elválasztás végén. A futtatás után a fehérjék láthatóvá tehetők különféle festési eljárásokkal (coomassie-festés, ezüstfestés), vagy Western blot technikával [1]. 3.3.2. Izoelektromos fókuszálás A fehérjék pozitív és negatív töltésű aminosavakat is tartalmaznak, melyek megszabják a fehérje össztöltését. Azt, az adott fehérjére jellemző pH értéket, melynél ez az össztöltés nullává válik, izoelektromos pontnak nevezzük. Ha az elválasztás során egy olyan pH gradienst hozunk létre, melyben a fehérjék izoelektromos pontjukig vándorolnak, izoelektromos fókuszálásról beszélünk [1].
3.3.3. Gélszűrés A dialízis során a fehérjéket főleg kis molekuláktól, vagy ionoktól lehet elválasztani féligáteresztő (szemipermeábilis) hártya segítségével, míg a gélszűréses technika alkalmazásával a fehérjéket egymástól is el lehet választani, valamint a fehérjék relatív molekulatömegét is meg lehet határozni. A gél vízben oldhatatlan, hidratált polimerekből áll, amelyekben eltérő méretű pórusok vannak. A gélt egy oszlopba töltik, aminek a tetejére 8
helyezik a fehérjeoldatot. Az oszlop alján a nagyobb méretű molekulák jelennek meg előbb, mivel nagyságuk miatt ezek csak elhaladnak a pórusok mellett, nem lépnek be azokba (vagyis
a töltés nem, csak a molekulaméret befolyásolja a vándorlást). A
gélelektroforézisnek jobb a felbontóképessége, de a gélszűréssel nagyobb mennyiségű fehérje izolálható [1]. 3.3.4. Ioncserélő és affinitás kromatográfia A kromatográfiás eljárások során a fehérje mintát egy álló-, és egy azon keresztül haladó mozgófázis segítségével választjuk el, valamilyen kémiai vagy fizikai tulajdonság alapján. Az ioncserés kromatográfia segítségével töltéssel rendelkező molekulákat lehet elválasztani egymástól. Ilyenkor az állófázis töltéssel rendelkező részecskéket tartalmaz, melyekhez a mozgófázissal haladó minta hozzá tud tapadni, ha ellenkező töltéssel rendelkezik. Az elúció a mozgófázis pH-jának, vagy ionerősségének megváltoztatásával valósítható meg [1]. Affinitás kromatográfia esetén az állófázisra egy, az elválasztani kívánt fehérjéhez nagy affinitással, specifikusan kötődő anyag van kötve. Ez lehet például egy enzimfehérje szubsztrátja, illetve a kötődés alapja lehet antigén-antitest kapcsolat is. Az elúció itt is, hasonlóan az ioncserélő kromatográfiához, a pH, az ionerősség megváltoztatásával, vagy nagy mennyiségű szubsztrát adagolásával érhető el [1].
3.4.
Másodlagos szerkezet meghatározási módszerek
3.4.1. Fourier-transzformációs infravörös spektroszkópia Sir Frederic William Herschel, brit tudós a XIX. század elején feltételezte, hogy a napsugárzással nemcsak fény, hanem hő is érkezik a Földre. Egy hetekig tartó kísérletsorozatban vizsgálta ezeket a hősugarakat. Végül arra jutott, hogy ugyanúgy megtörnek, visszaverődnek és elhajlanak, mint a fénysugarak [13]. Kísérletei során szétválasztotta a napfény sugarát egy prizma segítségével a szivárvány színeire, majd megmérte a hőmérsékletüket, ami a kék színtől egészen a vörösig emelkedett, de ez az emelkedő tendencia a vörös színen túli területen is folytatódott. Mivel ez a tartomány az emberi szem számára láthatatlan, ezért vörös alatti, vagyis infravörös tartomány lett a neve [14]. Majd egy évszázaddal később Coblentz állapította meg, hogy minden vegyületnek különbözik valamilyen szinten az infravörös spektruma, még akkor is, ha azok azonos 9
atomokból épülnek fel. Ezen kívül a hasonló kémiai csoportok IR elnyelési sávjai is hasonlók, függetlenül attól, hogy milyen molekulában találhatók [15].
3.4.1.1. Infravörös spektroszkópia A spektroszkópiai módszerek a műszeres analitikai eljárások közé tartozó, az adott minta és az elektromágneses sugárzás (5. ábra) kölcsönhatásán alapuló módszerek [16]. Az infravörös spektroszkópia segítségével szerves és szervetlen molekulák egyaránt vizsgálhatók [17]. Az infravörös spektroszkópia az infravörös sugárzás elnyelésén, kibocsátásán, és visszaverésén alapszik. A vizsgált elektromágneses sugárzás hullámhossza 780 nm és 300 µm közé esik, hullámszám-tartománya pedig 12820 cm-1 és 33 cm-1 közé. Ez a hullámszámtartomány további három részre osztható [18]: közeli infravörös, vagy NIR: 12820 cm-1 - 4000 cm-1 analitikai infravörös, vagy MIR: 4000 cm-1 - 400 cm-1 távoli infravörös, vagy FIR: 400 cm-1 - 40 cm-1.
5. ábra Az elektromágneses sugárzás spektruma
Főként a közeli és a közép (ún. analitikai) infravörös spektrumban a molekulák rezgési
10
sávjai jelennek meg [10]. Ez a rezgés abból származik, hogy az egyes molekulák állandó mozgásban vannak. Maga a molekula is mozog a térben, illetve a molekulát alkotó atomok is mozognak – ekkor az atomok távolsága, vagy a kötésszögek változnak meg [18]. Egy adott molekula normálrezgéséről akkor beszélünk, ha az összes atom megegyező frekvenciával és eltérő amplitúdóval rezeg, egyesek egymással azonos, mások ellentétes fázisban. Egy N atomból álló molekulának 3N-6, illetve lineáris molekula esetén 3N-5 ilyen normálrezgése van [19]. A
molekulák
rezgései
lényegében
belső
koordinátaváltozások,
és
lehetnek
vegyértékrezgések, deformációs rezgések, valamint torziós rezgések. A szimmetrikus és az aszimmetrikus vegyértékrezgés során a rezgés az atomok közötti kötések hossztengelye mentén történik, vagyis a kötésszögek nem változnak meg. Ezzel ellentétben a deformációs rezgésnél a kötésszögek változnak. Ha egy hármas molekula egységben a három atom az eredeti síkjában rezeg, akkor síkbeli, ha arra merőlegesen, akkor síkra merőleges deformációs rezgésről van szó. Egy rezgésben ezek a kötéshossz-, illetve kötésszög változások kombinálódhatnak [18]. Mivel a legtöbb energia a kötések nyújtásához és összenyomásához kell, ezért a vegyértékrezgések jelennek meg a legnagyobb hullámszámoknál. A közeli infravörös tartományban a vegyértékrezgések felhangjai és a kombinációs rezgések (két normálrezgés között oszlik meg egyetlen foton energiája), az analitikai tartományban a vegyérték- és deformációs rezgések, a távoli infravörös tartományban pedig a nehézatomot tartalmazó csoport deformációs rezgéseinek, illetve kristályrács rezgéseinek sávjai jelennek meg az infravörös spektrumban [20]. Ez viszont csak akkor következik be, ha a rezgés közben megváltozik a molekula dipólus momentuma [20]. Amikor infravörös sugárzás éri a mintát, az elnyelt hullámhossz a mintában előforduló molekularezgésektől függ, ebből pedig kémiai és strukturális információkat is nyerhetünk [16]. Így az infravörös spektrum alapján azonosítható egy ismeretlen vegyület valamilyen korábban felvett, referencia spektrum alapján. Megállapítható, hogy az adott molekula szerkezete lineáris, vagy elágazó láncokból áll, tartalmaz-e telítetlen és/vagy aromás gyűrűket, vagy bármilyen specifikus funkciós csoportot [17]. Az analitikai infravörös spektrum két fő részre osztható, melyek közül az 1500 cm-1 - 400 cm-1 tartományban található sok rezgési sáv. Ebben a tartományban nehéz megkülönböztetni és azonosítani az egyes rezgési sávokat, de a sok sáv miatt lehetővé teszi a minta és a referencia összehasonlítását, ezért ezt ujjlenyomat-régiónak is nevezzük [18].
11
Mivel az analitikai tartományba esik a rezgések legnagyobb része, ezért ezt a sávot használják a leggyakrabban. A közeli infravörös tartományt gyors azonosításra, mennyiségi meghatározásra használják [18]. A csillapított teljes reflexiós (ATR) technika elterjedése előtt a gyakorlatban leginkább a transzmissziós infravörös spektroszkópiát alkalmazzák, mellyel szilárd anyagok, folyadékok, és gázok is vizsgálhatók [21]. Ekkor az infravörös sugárzás két IR átlátszó ablak közötti mintán halad keresztül. Az IR cella többféle oldhatatlan anyagból is készülhet, gyakran használt a ZnSe, CdTe, BaF2 vagy CaF2 cella [10]. Ez a módszer nagyon rövid úthosszt igényel (6-10 µm), különösen vizes közegű minták esetén, mivel a víz erős elnyelést mutat az IR tartományban, így ha túl hosszú lenne az úthossz, a sugárzás nem érne el a detektorig [16]. A víz zavaró hatásának kiküszöbölése érdekében deuterált vizet lehet használni, aminek nincs olyan erős elnyelése az infravörös tartományban, de ha az izotóp csere nem lett teljes, akkor a spektrum még bonyolultabbá válhat. A jel-zaj arány javítható, ha növeljük a mintánkénti letapogatások számát [10]. A gázok vizsgálatát speciális, a két végén tükröző felületet tartalmazó küvettákban végzik, így radikálisan megnövelve a fény úthosszát [18]. A folyadékok vizsgálhatók oldatban és hígítatlanul is, de oldatos vizsgálatnál ügyelni kell az oldószer elnyelésére az infravörös spektrumban [18]. Szilárd anyagok az ún. nujolos, vagy a pasztillakészítéses módszerrel vizsgálhatók [18]. Az infravörös spektroszkópia nem csak minőségi, hanem mennyiségi elemzésre is alkalmas, a Bouguer-Lambert-Beer-törvény alapján [17]:
ahol A az abszorbancia, I0 a háttéren, míg I a mintán áthaladó fény intenzitása, ε a moláris abszorpciós koefficiens, l az optikai úthossz, c a moláris koncentráció. A Fourier-transzformációs infravörös spektroszkópia egy olyan biofizikai módszer, ami sokoldalú kutatási eszközzé vált a biokémiában és a gyógyszerészeti tudományokban [22]. Ez egy roncsolásmentes technika, ami számos, egymástól jelentősen eltérő molekulák vizsgálatára alkalmas, eltérő környezeti körülmények között [16]. Legnagyobb előnye a gyorsaság: nem igényel bonyolult minta előkészítést, és a mérés is gyorsan lezajlik [23]. A Fourier-transzformációs spektrométereket főleg az infravörös tartományban alkalmazzák. Ezekkel az interferométert tartalmazó készülékekkel a teljes spektrum detektálható [10].
12
6. ábra Interferogram [24]
7. ábra Fourier-transzformált infravörös transzmittancia spektrum
A leggyakoribb interferométer a Michelson-interferométer. Ez a konstrukció egy fényosztóból, egy álló és egy mozgó tükörből áll. A fényosztó egy KBr-ból, vagy CsI-ból álló, germánium-, vagy szilíciumfilmmel bevont féligáteresztő tükör, amely a ráeső fény 50%-át átereszti a mozgó tükörre, a másik 50-%-ot pedig visszaveri az álló tükörre. A tükrökről visszavert sugarak a detektor felé haladva egyesülnek, és interferálnak a két sugárnyaláb aktuális útkülönbségének megfelelően. A detektor egy periodikus intenzitásgörbét érzékel, mely nulla útkülönbség esetén maximális, vagyis az interferométer azokat a sugarakat erősíti, melyek hullámhossza az optikai úthosszal megegyezik, vagy 13
annak egész számú többszöröse. Így kapjuk meg az interferogramot (6. ábra), amely a hullámhossz-kombinációk függvényében adja meg az elnyelést [19]. Ebből a Fouriertranszformáció matematikai módszer segítségével kapjuk meg az infravörös spektrumot (7. ábra) [20]. 3.4.1.2. ATR technika A visszaverésen alapuló módszerek közül nagyon elterjedté vált az ATR, vagyis csillapított teljes reflexiós technika, melyet a bakteriorodopszin vizsgálatakor alkalmaztak először, 1987-ben [20]. Ennek alapja a teljes visszaverődés jelensége, de egy kis eltérés lehetővé teszi, hogy ez a technika információt nyújtson a vizsgált minta minőségéről és összetételéről. Amikor ugyanis a sugárnyaláb megérkezik az ATR kristály felületére, a visszaverődés előtt kissé behatol a másik közegbe, vagyis a közeg a sugárzás egy részét abszorbeálja, a visszavert sugárnyaláb pedig viszi magával az információt a mintáról [25]. Az ATR egység egy, az infravörös sugárzásnak átlátszó kristály, leggyakrabban gyémánt/ZnSe kompozit. Az infravörös sugárzás a kristály egyik végén belép, majd végighalad benne, miközben a kristályról és a mintáról is többször visszaverődik [25]. Az ATR technika több előnnyel is rendelkezik, például egyszerű a kristály tisztítása, kis mennyiségű minta is elegendő a vizsgálathoz, egyszerű a minta előkészítés, és sokféle anyag (pl. textíliák, műanyagok) is vizsgálhatók vele. Azonban mint minden technikának, ennek is vannak hátrányai, például a kristály nagymértékű érzékenysége a mechanikai hatásokkal szemben, a magasabb kimutatási határ, valamint, hogy csak a minta felülete vizsgálható [25]. 3.4.1.3. Fehérje másodlagos szerkezet meghatározás ATR FT-IR módszerrel A fehérjék konformációja döntően meghatározza funkcionális tulajdonságaikat [26], ezért fontos, hogy szerkezetüket minél egyszerűbben és pontosabban meg lehessen határozni. A másodlagos szerkezet meghatározása infravörös spektroszkópiás módszerrel az 1950-es évekre tekint vissza. Az 1970-es években az IR-t már, mint analitikai módszert alkalmazták a fehérjék konformációjának és feltekeredésének tanulmányozására [22], később pedig kiterjesztették nukleinsavak és lipidek, valamint szénhidrátok vizsgálatára is [27]. Az IR spektrumban kilenc, ún. amid sávot különböztetünk meg, ezek rendre az, amid A, az amid B, a többi sávot pedig I-től VII-ig római számokkal jelöljük, a csökkenő frekvenciának megfelelően. A különböző másodlagos szerkezeti elemek az amid I. régióban, vagyis az 14
1700 cm-1 - 1600 cm-1 hullámszám tartományban mutatnak elnyelést [28], így ez, a főleg C=O kötések megnyújtásakor keletkező rezgésekből álló sáv lett a fehérje másodlagos szerkezet meghatározásának alapja [29]. A C=O nyújtásból származó rezgések a fehérje nagy részére delokalizálódnak, így könnyen determinálhatóak [30]. Ez a karakterisztikus abszorpciós sáv egy összetett sáv, ami négy átlapoló komponensből tevődik össze (α-hélix, β-redő, β-turn és random coil), és leginkább a β-redő struktúrára érzékeny [31]. A spektrum intenzitást több tényező is befolyásolja, többek között a H-kötések erőssége, valamint a βredő csomagolódása [32]. Az α-hélix 1650 cm-1 és 1655 cm-1 hullámszámok között, a β-redő 1612 cm-1 és 1640 cm-1 között, valamint 1685 cm-1 körül, a random struktúra pedig 1645 cm-1 hullámszámnál ad csúcsot. A β-turn átlapol az α-hélix és a β-redő struktúrákkal, így nehéz meghatározni [10]. Mivel a víznek erős elnyelése van ebben a régióban, ezért a gyakorlatban sokszor deuterált vizet használnak, aminek nagyobb áteresztő képessége van ebben a tartományban [26], vagy az FT-IR mérést kiegészítik Raman-spektrometriás méréssel [10]. Az IR a technika nagyon érzékeny a H-kötésekben bekövetkező változásokra, ezért alkalmas a fehérjékben bekövetkező rendkívül apró változások detektálására [13]. Az amid I. régión kívül az amid II., és amid III. régiót is lehet szerkezet meghatározásra alkalmazni [10]. Az amid II. sáv a hidrogén-csere kinetikájára érzékeny [28].
3.4.1.4. FT-IR további alkalmazási lehetőségei Az FT-IR technikát fehérjék reakcióinak és biológiai viselkedésüknek a meghatározására is alkalmazzák [33], viszont ilyen vizsgálatoknál ügyelni kell a megfelelő jel-zaj arány fenntartására (a jelnek legalább 3-szor nagyobbnak kell lennie, mint a zajnak ahhoz, hogy a detektálás lehetővé váljon) [16]. Vizsgálhatók vele fehérje-fehérje kapcsolatok, méghozzá úgy, hogy GaAs ATR felületére antigént immobilizálnak. Ehhez az antigénhez specifikusan köt az antitest. Ezek után egy nem specifikus antitesttel is felveszik az FT-IR spektrumot, és ebből következtetnek a fehérje-fehérje kapcsolatra [34]. Az ATR FT-IR technika kombinálható fotokémiával és elektrokémiával is, vizsgálhatók vele oxidációs-redukciós reakciók, ligand kötődési mechanizmusok, valamint a katalitikus intermedierek egymásba alakulási folyamatai [20].
15
Ezen kívül alkalmas arra, hogy különbséget lehessen tenni rákos és egészséges sejtek között arany nanorészecskék segítségével [35]. Az FT-IR technikával kapcsolt mikro- és makro-képalkotásnak több alkalmazhatósági területe van. Felhasználható gyógyszertabletták analíziséhez [36], bőrön keresztüli gyógyszer felszívódás tanulmányozásához [37], szennyezett hőcserélők vizsgálatánál [38], valamint különféle orvosi tanulmányokban (például artériás atheroszklerotikus plakkok esetén) [39]. A mikro ATR FT-IR képalkotás lehetővé teszi fehérjék tanulmányozását, valamint az elérhető nagy felbontásnak köszönhetően tanulmányozhatóak vele sejtek, szövetek, valamint erek is [40]. Több élelmiszer-fehérje szerkezetét is vizsgálták ilyen módon, például a zab globulinét [26], tejsavó fehérjéket [41], szójabab glicint [42], valamint búza glutént [43]. Alkalmas hőmérséklet [44], pH [45], nyomás [46], kémiai vegyületek [47], valamint különböző pufferek [26] indukálta fehérje konformáció változások tanulmányozására. Vizsgálhatók vele alacsony oldhatóságú növényi proteinek, valamint monitorozhatók hőindukálta fehérje-aggregációk is [26]. Használják a prion protein szerkezeti sajátságainak értelmezésére, illetve a prion protein által az idegszövetben és a vérben indukált molekuláris változások tanulmányozására [22]. A celluláris prion protein konverziója fertőző prion proteinné együtt jár az α-helikális és a β-turn struktúrák csökkenésével, valamint a β-redő struktúra arányának növekedésével [48]. Membrán-kötött fehérjék és kisebb peptidek szerkezet meghatározására is használják [49]. A fehérje aggregátumok szerkezetének meghatározása fontos a tudományban, például fehérje lerakódással járó betegségek esetén, a fehérje feltekeredési, valamint a fehérje tartalmú gyógyszerek stabilitási tanulmányaiban. Az ATR FT-IR technikával ezen fehérje aggregátumok konformációjának vizsgálata lehetővé válik in vivo és in vitro. Már több különböző fehérje aggregátumot tanulmányoztak, többek között amiloid szálakat, zárvány testeket és oldható oligomereket. Ezek alapján a mérések alapján megállapítható, hogy minden fehérje aggregátum egy új, sajátos β-redő struktúrát vesz fel, ami alacsonyabb hullámszámoknál jelenik meg. Ennek az új β-redő struktúrának a létrejöttét erősebb intermolekuláris H-kötéseknek tulajdonítják [50]. A lineárisan polarizált ATR FT-IR technika egy újabb spektroszkópiai módszer, mellyel meghatározható a funkciós csoportok helyzete olyan fehérjékben, melyek magas szinten rendezett struktúrákban, például membránokban találhatók [51]. Összefüggést állapítottak meg a citotoxicitás és az antiparallel β-redő struktúra között [31]. 16
Az FT-IR odáig fejlődött, hogy ma már alkalmas mikroorganizmusok megkülönböztetésére és identifikálására [52], ezzel elősegítve a gyógyítást és a bioterrorizmus elleni védekezést.
3.4.2. Cirkuláris dikroizmus A cirkuláris dikroizmus (CD) különösen alkalmas fehérjék másodlagos szerkezetének meghatározására [53], valamint hőmérséklet függésének vizsgálatára, de csak olyan esetekben alkalmazható, amikor a vizsgálandó molekulák a jobbra-, illetve balra cirkulárisan polarizált fényt különböző mértékben nyelik el. A fehérjében található amid kromofórok (a molekula azon atomcsoportjai, amelyeknek egy-egy elektronátmenetéhez rendelhetők a spektrumokban megjelenő sávok) CD spektruma jellemzően 250 nm alatt jelentkezik [10]. Egy hagyományos CD műszerben a monokromatikus, lineárisan polarizált fény egy ún. piezoelasztikus modulátoron keresztülhaladva válik cirkulárisan polarizált fénnyé. Ha a minta valamely komponense abszorbeálja a jobbra vagy balra cirkulárisan polarizált fényt, akkor az annak megfelelő transzmittancia sugárzásnak csökken az intenzitása [53]. A CD spektroszkópiai méréseket kevés mennyiségű (0,35 ml), főleg híg (0,01-0,2 mg/ml, így a koncentráció-függő aggregáció minimalizált) fehérje oldatokkal végzik, egy rövid úthosszal rendelkező, kvarcból készült küvettában [54]. Egy α-hélix szerkezeti elemben gazdag fehérje esetén megfigyelhető egy negatív sáv 222 nm környékén, a szerkezeti elemben jelen lévő erős H-kötések miatt. Ez általában független a hélix hosszától. Egy másik negatív sáv jelentkezik 208 nm-nél, valamint egy pozitív 192 nm-nél. Ezeknek a csúcsoknak az intenzitása már függ a hélix hosszától, rövidebb α-hélix esetén csökkent intenzitásúak [55]. A β-redő egy negatív csúcsot mutat 216 nm-nél, egy pozitívat 195 nm és 200 nm között, valamint még egy negatívat 175 nm-nél. Mivel ezeknek a csúcsoknak a helye és az amplitúdója változékony, ezért a β-redő szerkezet meghatározása cirkuláris dikroizmussal kevésbé pontos [10]. 3.4.3. NMR spektroszkópia A nukleáris mágneses rezonancia (NMR) egy roncsolásmentes technika család. Olyan spektroszkópiai módszerek tartoznak ide, melyeknél a folyékony, vagy szilárd mintát állandó mágneses térbe (egy cseppfolyós héliummal hűtött szupravezető elektromágneses 17
tekercs) helyezzük, és a ráeső rádióhullám miatt bekövetkező emissziót és abszorpciót mérjük [10]. Egy atommagot akkor tekintünk NMR aktívnak, ha a benne lévő protonok és/vagy neutronok száma páratlan. Az NMR aktív atommagok a mágneses térben abszorbeálják a rájuk jellemző sugárzás frekvenciáját, így ha van egy vegyületünk, aminek a különböző atomjai (atommagjai) különböző frekvenciánál nyelnek el, akkor az fontos információt hordoz a vegyület szerkezetéről. Az atommagok rezonancia frekvenciája függ attól is, hogy hol helyezkednek el a molekulán belül. A jelenséget kémiai eltolódásnak nevezzük, és ez szolgáltatja az elsődleges információt az NMR spektrumban [56]. Az NMR spektroszkópia az egyik a közül a két technika közül, melyek részletes szerkezeti információt szolgáltatnak makromolekulákról. Más, szerkezet meghatározásra alkalmas optikai módszerekkel ellentétben az NMR spektroszkópiával az is meghatározható, hogy az adott másodlagos szerkezeti elem hol helyezkedik el a fehérje szekvenciában [10]. Az NMR spektroszkópiának számos felhasználási területe van, többek között az élelmiszeriparban, szerkezetkutatásban, valamint az orvostudományban is (az MRI képalkotó orvosi eljárás lényegében egy in vivo NMR technika) [56].
3.4.4. Raman-spektroszkópia A Raman-spektrum is, hasonlóan az FT-IR spektrumhoz, a molekulák rezgéseiből származik, de alapja nem a fény elnyelés, hanem a fény szóródása. Ez a két technika lényegében egymást kiegészítő információkkal szolgál a vizsgált mintáról [10]. A mérés során a mintát monokromatikus fénnyel sugározzák be, melyhez régebben UV, ma már inkább argon-ion lézert használnak [57]. A beeső fénysugár egy része visszaverődik, míg a másik (kisebbik) része rugalmatlanul szóródik. Ez a szóródó fény kerül a spektrométerbe. A spektrumban két féle sáv figyelhető meg: a Rayleigh-vonalak, melyek a beeső fény frekvenciájánál jelennek meg, illetve a Raman-sávok, melyek a Rayleighvonalhoz képest eltolódva jelentkeznek, és intenzitásuk nagyon kicsi. Ha ez az eltolódás kisebb frekvenciák felé történt, akkor Stokes-vonalakról, ha nagyobb frekvenciák felé, akkor anti-Stokes-vonalakról beszélünk [58]. A mérést vizes oldattal, egyszerű üveg küvettában el lehet végezni, nem igényel bonyolult minta előkészítést [59]. Előnye az FT-IR-rel szemben, hogy a víznek nincs erős Ramanspektruma, így nem zavarja a mérést. Oldat minta esetén a spektrum analízis előtt a puffer 18
spektrumát ki kell vonni az oldat spektrumából [10]. A Raman-spektroszkópiát valós idejű detektálásra is lehet használni, így különböző reakciókat (pl. gyógyszergyártási, kristályosítási eljárások) lehet nyomon követni. A gyakorlatban fehérje másodlagos szerkezet meghatározáshoz az amid I. és amid III. rezgési sávot vizsgálják a Raman-spektrumban [10].
19
4. Anyagok és módszerek 4.1.
A vizsgált minták
A mérések során négy, szilárd halmazállapotú (por) fehérjét használtam fel: DNáz I.* liofilizált por, 85 %-nál magasabb fehérje tartalom termék száma: DN25 CAS szám: 9003-98-9 Lizozim* liofilizált por termék száma: L7001 CAS szám: 12650-88-3 Tripszin* liofilizált por szarvasmarha hasnyálmirigyből termék száma: T8003 CAS szám: 9002-07-7 Glutén* por, búzából, 82% fehérjetartalom termék száma: G5004 CAS szám: 8002-80-0 (* Sigma-Aldrich, Inc., Saint Louis, MO, USA)
4.2. Méréseim
Az alkalmazott készülék során
egy,
az
alábbi
paraméterekkel
rendelkező
FT-IR/FT-NIR
spektrofotométert használtam. Spektrofotométer
Spectrum 400*
Mintakezelő egység (8. ábra)
Universal ATR Sampling Accessory (UATR)* Single Bounce Flat Top Plate* (l = 2 μm) + Composite Diamond/ZnSe Crystal*
Mintatartó
UATR Sample Plate (3 mm hole)*+ UATR Cone Shoe*
Optikai elrendezés (8. ábra)
Fourier- transzformációs (FT)
20
Működési mód
csillapított teljes reflexiós (attenuated total reflectance, ATR)
Hullámhosszválasztó elem
Michelson-interferométer
Fényforrás
védjegyezett, közép és távoli IR tartományban sugárzó, hosszú élettartamú fényforrás túlmelegedés elleni stabilizációval
Referencia
levegő
Mérési hullámhossztartomány
4000-650 cm-1 = 2500-15385 nm
Detektor
deuterált triglicin-szulfát (DTGS)
Lépésköz
1 cm-1
Spektrum adatpontjainak száma
3351
Mintánkénti spektrumok száma
4
Műszert vezérlő és kiértékelő szoftver Spectrum 6.3.2* (* PerkinElmer, Waltham, MA, USA) (a)
8. ábra Mintakezelő egység (balra) és optikai elrendezés (jobbra)
4.3.
A mérések menete
A méréseket a BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék NIR Spektroszkópia Csoportjának laboratóriumában végeztem. A spektroszkópiai vizsgálatig a mintákat -15 °C-os hűtőben tároltam. A mintákból igen kevés mennyiség állt rendelkezésemre, így párhuzamos mérésekre nem volt lehetőségem. A minták spektrumainak felvétele előtt a levegő spektrumát vettem fel háttérként. 21
Minden mérés előtt közvetlenül kivettem a mintát a hűtőből, majd egy kis mennyiséget az ATR kristályra helyeztem. A minták kis mennyisége és az ATR kristályt körül ölelő fémkorong jó hővezető-képessége miatt feltételeztem, hogy az anyag mérésre való előkészítése közben, a spektrumfelvétel megkezdéséig a minta eléri a 22-24 °C-os szobahőmérsékletet. Ügyeltem arra, hogy a kis mennyiségű fehérje por befedje a kristályt. A nyomóerő hatásának vizsgálatakor egymást követően 4 mérést végeztem minden mintán, 25 N, 50 N, 75 N, és 100 N nyomóerőt beállítva. A felbontás és a letapogatások számának vizsgálatakor a méréseket úgy végeztem el, hogy a felbontást állandó értéken tartottam addig, amíg a letapogatások számát 4 és 128 között változtattam. Amikor a 128 letapogatás végére értem, változtattam a felbontáson, és elölről kezdtem a letapogatások számának változtatását. A mérések végeztével a mintákat visszahelyeztem a hűtőbe, majd a keresztszennyezések elkerülése végett desztillált vízzel és acetonnal letisztítottam az ATR kristály felületét.
4.4.
Alkalmazott matematikai módszerek
4.4.1. Dekonvolúció A dekonvolúció célja, hogy növelje a spektrum felbontását, vagy csökkentse a sáv szélességet. Azokban a régiókban, melyekben széles, egymással átlapoló csúcsok találhatók, a dekonvolúció segítségével szétválaszthatók éles, egyedüli csúcsokká (9. ábra). A dekonvolúció csak olyan esetekben alkalmazható, amelyeknél a spektrum elnyelési sávjai lényegesen szélesebbek, mint a spektrális felbontás. A dekonvolúció elvégezhető Gauss-, vagy Lorentz-illéesztéssel. A választás a sávszélesítő hatásoktól függ. Ha ezekről nem rendelkezünk pontos információkkal, akkor ajánlott a Lorentz-illesztést alkalmazni. Az értékelés során meg kell adni 1) vagy egy dekonvolúciós és egy zajcsökkentő faktort, 2) vagy meg kell határozni egy faktort, mely jellemzi a sávok szélességét, és egy másikat, ami pedig a felbontás növeléséért felel. Lorentz-illesztés esetén az 1) lehetőséget választva a dekonvolúciós faktor értékét érdemes 50, 100, 1.000, 5.000, vagy ennél nagyobb értékekre beállítani, de csak addig, amíg meg nem jelennek magas frekvenciájú oszcillációk (i.e. a zajok) a spektrumban. A méréseim során 5.000, 50.000 és 500.000 értékeket állítottam be. A zajcsökkentő faktort 0.0 és 1.0 között érdemes változtatni. A méréseim során 0,25; 0,5 és 0,75 értékeket állítottam be.
22
9. ábra Dekonvolúció hatása a spektrumra 4.4.2. Deriváltak A deriváltakkal értékelt spektrumokban általában élesebbek a csúcsok, ami csökkenti az átlapoló sávok, valamint a háttér zavaró hatását. Kvantitatív méréseknél alapvonal illesztésből származó hatásokat is eliminálni lehet ezzel a matematikai előkezeléssel. Első deriválttal konstans alapvonal-eltolódást lehet kompenzálni, míg a második derivált a lineáris alapvonal-eltolódásokat eliminálja. A második derivált görbéknek éles minimuma van ott, ahol az eredeti spektrumban széles maximum volt, ami lehetővé teszi a csúcsok pozíciójának pontosabb meghatározását komplex, összetett elnyelési sávokban is. A harmadik és a negyedik deriváltakat nehéz értelmezni, és csak akkor használhatóak, ha nagyon magas a jel-zaj arány.
23
5. Eredmények 5.1. Nyomóerő hatásának vizsgálata Méréseim során elsőként azt vizsgáltam, hogy az alkalmazott nyomóerő milyen hatással van a spektrumra. Ennek érdekében 3 tiszta enzim (DNáz I., Lizozim, Tripszin) spektrumát vettem fel 25 N, 50 N, 75 N és 100 N nyomóerőnél (Resolution: 4, Scan: 4) (10. ábra).
DNáz I.
DNáz I.
Lizozim
Lizozim
Tripszin
Tripszin
10. ábra Nyomóerő hatása a spektrumra a teljes mért (4000-650 cm-1) infravörös tartományban, traszmittancia értékben (bal oldalon), valamint a nyomás hatása a spektrumra az általam vizsgált Amid I. sávban, abszorbancia értékben (jobb oldalon) Piros: 25 N, Kék: 50 N, Zöld: 75 N, Rózsaszín: 100 N
24
A vizsgálatot kiterjesztettem a teljes infravörös spektrumra, de a fehérjék másodlagosszerkezet meghatározásánál fontos és leginkább informatív amid I. (1700-1600 cm-1) régióra koncentráltam. A mérés során kapott transzmittancia értékeket az A = -lgT egyenlet alapján számoltam át abszorbancia értékre. A 10. ábra alapján elmondható, hogy a változó nyomóerő hatására a spektrumok kissé eltolódnak, főleg a Lizozim esetén, amiből arra lehet következtetni, hogy a DNáz I. és a Tripszin morfológiája (pl. szemcseméret-eloszlása, keménysége) feltehetően hasonló, míg a Lizozim szerkezete ezektől jelentősen eltér. Ezek az eltolódások azonban nem változtatják meg az IR spektrumok lefutását, karakterisztikáját, így megállapítható, hogy az alkalmazott nyomóerőnek nincs hatása a fehérjék kémiai tulajdonságaira. Mivel a 100 N nyomóerő esetén kaptam a legjobb jel-zaj arányt, a további méréseimhez is ezt a nyomóerőt választottam.
5.2. Mérési körülmények optimalizálása Következő feladatom az volt, hogy megállapítsam, milyen felbontásnál kapom meg a legtöbb információt tartalmazó spektrumot, illetve hogy mintánként mekkora az optimális letapogatások száma. A glutén fehérje spektrumát felvettem 1 cm-1-es, 2 cm-1-es és 4 cm-1-es felbontásnál (12. ábra), valamint ezzel párhuzamosan a letapogatások számát 4-128 között változtattam (11. ábra).
11. ábra Letapogatások számának változtatása 4 cm-1-es felbontás mellett Letapogatások száma: Piros: 4, Kék: 8, Zöld: 16, Rózsaszín: 32, Fekete: 64, Lila: 128 25
Azonos felbontás esetén a letapogatások számának változtatása (11. ábra) nincs számottevő hatással a spektrumra. Az optimális letapogatás-szám kiválasztásánál így az időtényezőt vettem figyelembe, hiszen minden mérésnél az egyik legfontosabb cél, hogy azt minél rövidebb idő alatt lehessen elvégezni, vagyis a 4 letapogatást választottam ki.
12. ábra Felbontások hatása az infravörös spektrumra, különböző letapogatási számok esetén Szürke: 1 cm-1-es felbontás, Barna: 2 cm-1 felbontás, Kék: 4 cm-1-es felbontás Az 1 cm-1-es felbontásnál felvett spektrumok (12. ábra) jelentősen el vannak tolódva az egymással szinte együtt futó, 2 cm-1-es és 4 cm-1-es felbontásnál felvett spektrumokhoz képest, ez alapján pedig a további két felbontás közül kellett választanom. Végül a 4 cm-1es felbontást tartottam optimálisabbnak, mivel ennél a beállításnál kevésbé zajos a spektrum.
26
5.3. FT-IR spektrumok értékelése dekonvolúciós módszerrel Elsőként az irodalomban leginkább alkalmazott Lorentz-, illetve Gauss-illesztéseken alapuló dekonvolúciós módszerrel kezeltem a DNáz I, a Lizozim, és a Tripszin 4 cm-1-es felbontás és 4 letapogatás melletti FT-IR spektrumát. Az értékelés során két faktort lehetett változtatni, a dekonvolúciós faktort és a zajcsökkentő faktort. Mindkettő szubjektíven változtatható, de az irodalmi adatok alapján a dekonvolúciós faktort 5.000 és 500.000, a zajcsökkentő faktort pedig 0,25 és 0,75 között változtattam (13. ábra, 14. ábra, 15. ábra).
13. ábra Lorentz-illesztésen alapuló dekonvolúciós módszerrel kezelt spektrumok, dekonvolúciós faktor: 5.000 Narancssárga: DNáz I., Kék: Lizozim, Fekete: Tripszin
27
14. ábra Lorentz-illesztésen alapuló dekonvolúciós módszerrel kezelt spektrumok, dekonvolúciós faktor: 50.000 Narancssárga: DNáz I., Kék: Lizozim, Fekete: Tripszin
15. ábra Lorentz-illesztésen alapuló dekonvolúciós módszerrel kezelt spektrumok, dekonvolúciós faktor: 500.000 Narancssárga: DNáz I., Kék: Lizozim, Fekete: Tripszin 28
Az ábrák alapján arra a következtetésre jutottam, hogy a dekonvolúciós faktortól függetlenül a 0,5-ös zajcsökkentő faktor a legmegfelelőbb. A 0,25-ös faktor túlzottan kisimítja a spektrumot, így az információt tartalmazó csúcsok is eltűnhetnek. A 0,75-ös faktor esetén pedig már túl zajossá válik a spektrum, a zajt és az információt tartalmazó csúcsokat nehéz elkülöníteni. A dekonvolúciós faktorok közül az 50.000 volt a legoptimálisabb. Az okok hasonlóak, mint a zajcsökkentő faktor esetén: 5.000-es értéknél túlzottan kisimul a spektrum, 500.000-es értéknél pedig már megjelennek zavaró csúcsok is. A dekonvolúciós értékelésnél alkalmazható Lorentz- és Gauss-illesztés is. Az irodalomban legtöbbször a Lorentz-illesztést alkalmazzák, ezért így tettem én is. Viszont ezt a döntést alátámasztandó az 50.000-es dekonvolúciós faktor és 0,5-ös zajcsökkentő faktor beállításnál elvégeztem a dekonvolúciót Gauss-illesztéssel is (16. ábra).
16. ábra Gauss- (jobb) és Lorentz- (bal) illesztéseken alapuló dekonvolúciók Narancssárga: DNáz I., Kék: Lizozim, Fekete: Tripszin A Lorentz- és a Gauss-illesztés között nem mutatkozik különbség, így az irodalom által javasolt Lorentz-illesztés alkalmazása a saját méréseim alapján is alátámasztott. A hasonlóság nem csak a diagram, hanem a pontos abszorbancia adatokat figyelembe véve is megalapozott.
5.4. FT-IR spektrumok értékelése második derivált módszerrel A második derivált módszert az irodalomban is ajánlják a dekonvolúciós módszerrel kapott eredmények alátámasztására. Hasonlóan a dekonvolúcióhoz, ez is kétféleképpen alkalmazható: mozgó átlagos módszerrel, vagy Savitzky–Golay-illesztéssel kombinálva.
29
A mozgó átlaggal kombinált esetben a rés (gap) értékét mindig 1-nek vettem, a kapu (segment) értéket pedig 1 és 9 között változtattam (17. ábra).
17. ábra Második derivált módszer mozgó átlaggal kombinálva Narancssárga: DNáz I., Kék: Lizozim, Fekete: Tripszin Az ábrák alapján azt a következtetést vontam le, hogy a legoptimálisabb az 1-es értékű rés, és a 3-as értékű kapu, mivel ennél kisebb kapu értéknél még túl zajos a spektrum, nagyobbnál pedig már túlzottan kisimult. Megjegyzendő, hogy a későbbi értékelések (sokváltozós adatelemzés) alapján azonban kiderült, hogy ez a következtetés nem volt megfelelő. Savitzky–Golay-illesztésnél a polinomok számát 2 és 6 között, a simító pontok számát 3 és 15 között változtattam. Az irodalomban a 2-es, 3-as és 4-es polinom a gyakori, de a pontos eredmények érdekében a polinom illesztést a 6-os értékig elvégeztem. Ugyanez vonatkozik a simító pontok számára is: az irodalomban 9-es értékű simítás a legnagyobb, én elvégeztem 15-ös értékű simításig az értékelést.
30
Az értékelés során kapott eredményekből részleges legkisebb négyzetek módszerén alapuló sokváltozós adatelemzés segítségével megállapítottam, hogy melyik szerkezeti elemre melyik módszer a legérzékenyebb. A különböző módszereknél az R2, az RPD és az RMSEC értékeket hasonlítottam össze, majd kiválasztottam mindegyik másodlagos szerkezeti elem esetén azt az egyet, amelyiknél a legnagyobb az R2 értéke, a legkisebb az RMSEC, valamint az RPD 3 feletti (18. ábra). Az ábrák alapján is látható volt, hogy a második derivált módszerrel jobb eredményeket lehet elérni (19. ábra, 20. ábra, 21. ábra), így az adatok alapján már csak el kellett döntenem, hogy melyik szerkezeti elem meghatározására pontosan melyik beállítás optimális. Alfa-helix Deconvolution Mathematical treatment factor Deconv. 5k 0,25 Deconv. 5k 0,50 Deconv. 5k 0,75 Deconv. 50k 0,25 Deconv. 50k 0,50 Deconv. 50k 0,50 G Deconv. 50k 0,75 Deconv. 500k 0,25 Deconv. 500k 0,50 Deconv. 500k 0,75 2nd Deriv. g1 s1 2nd Deriv. g1 s3 2nd Deriv. g1 s5 2nd Deriv. g1 s7 2nd Deriv. g1 s9 p2sp3 p2sp5 p2sp7 p2sp9 p2sp11 p2sp13 p2sp15 p3sp5 p3sp7 p3sp9 p3sp11 p3sp13 p3sp15 p4sp5 p4sp7 p4sp9 p4sp11 p4sp13 p4sp15 p5sp7 p5sp9 p5sp11 p5sp13 p5sp15 p6sp7 p6sp9 p6sp11 p6sp13 p6sp15
5 000 5 000 5 000 50 000 50 000 50 000 50 000 500 000 500 000 500 000 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 6 6 6 6 6
Noise reduction factor 0,25 0,5 0,75 0,25 0,5 0,5 Gauss 0,75 0,25 0,5 0,75 1 3 5 7 9 3 5 7 9 11 13 15 5 7 9 11 13 15 5 7 9 11 13 15 7 9 11 13 15 7 9 11 13 15
Beta-sheet
Turn
Other
RMSEC
R2
RPD
RMSEC
R2
RPD
RMSEC
R2
RPD
RMSEC
R2
RPD
8,3803 8,1774 8,1369 8,2548 8,0307 8,0307 7,9502 8,1165 7,8801 7,2967 7,4799 5,5411 4,6724 4,7599 5,0741 7,4087 7,4624 6,7646 5,7685 5,118 4,7828 4,6272 7,4624 6,7646 5,7685 5,118 4,7828 5,8961 7,3406 7,7197 7,8142 7,3621 6,5691 5,8961 7,7197 7,8142 7,3621 6,5691 5,8961 7,288 7,6107 7,9371 7,9818 7,6147
0,469 0,4944 0,4994 0,4848 0,5124 0,5124 0,5221 0,5019 0,5305 0,5975 0,577 0,7679 0,8349 0,8287 0,8053 0,585 0,579 0,654 0,7484 0,8019 0,827 0,8381 0,579 0,654 0,7484 0,8019 0,827 0,7371 0,5926 0,5494 0,5383 0,5902 0,6737 0,7371 0,5494 0,5383 0,5902 0,6737 0,7371 0,5984 0,5621 0,5237 0,5183 0,5616
1,37 1,41 1,41 1,39 1,43 1,43 1,45 1,42 1,46 1,58 1,54 2,08 2,46 2,42 2,27 1,55 1,54 1,70 1,99 2,25 2,40 2,49 1,54 1,70 1,99 2,25 2,40 1,95 1,57 1,49 1,47 1,56 1,75 1,95 1,49 1,47 1,56 1,75 1,95 1,58 1,51 1,45 1,44 1,51
7,5354 7,3649 7,3452 7,3518 7,1638 7,1638 7,2057 7,1501 6,9668 7,4118 6,7452 3,3005 0,9163 0,7242 0,9505 7,0554 6,6785 5,6191 3,812 2,2142 1,2885 0,8218 6,6785 5,6191 3,812 2,2142 1,2885 3,9529 7,1172 7,0956 6,9087 6,3325 5,2373 3,9529 7,0956 6,9087 6,3325 5,2373 3,9529 7,1175 7,1405 7,1361 7,0049 6,5992
0,5042 0,5264 0,5289 0,528 0,5519 0,5519 0,5466 0,5536 0,5762 0,5203 0,6027 0,9049 0,9927 0,9954 0,9921 0,5653 0,6105 0,7243 0,8731 0,9572 0,9855 0,9941 0,6105 0,7243 0,8731 0,9572 0,9855 0,8636 0,5577 0,5604 0,5832 0,6498 0,7605 0,8636 0,5604 0,5832 0,6498 0,7605 0,8636 0,5576 0,5548 0,5553 0,5715 0,6197
1,42 1,45 1,46 1,46 1,49 1,49 1,49 1,50 1,54 1,44 1,59 3,24 11,70 14,74 11,25 1,52 1,60 1,90 2,81 4,83 8,30 13,02 1,60 1,90 2,81 4,83 8,30 2,71 1,50 1,51 1,55 1,69 2,04 2,71 1,51 1,55 1,69 2,04 2,71 1,50 1,50 1,50 1,53 1,62
2,818 2,7459 2,7385 2,7352 2,6563 2,6563 2,6812 2,6444 2,5691 2,8106 2,4864 0,8901 0,374 0,5102 0,4299 2,6392 2,4551 1,9835 1,1423 0,3308 0,1659 0,4238 2,4551 1,9835 1,1423 0,3308 0,1659 1,2027 2,672 2,6411 2,5448 2,2918 1,807 1,2027 2,6411 2,5448 2,2918 1,807 1,2027 2,6748 2,6687 2,6482 2,5813 2,4057
0,6522 0,6698 0,6716 0,6723 0,691 0,691 0,6851 0,6937 0,7109 0,654 0,7292 0,9653 0,9939 0,9886 0,9919 0,6949 0,736 0,8277 0,9428 0,9952 0,9988 0,9921 0,736 0,8277 0,9428 0,9952 0,9988 0,9366 0,6873 0,6945 0,7164 0,7699 0,857 0,9366 0,6944 0,7164 0,7699 0,857 0,9366 0,6866 0,6881 0,6928 0,7082 0,7465
1,70 1,74 1,75 1,75 1,80 1,80 1,78 1,81 1,86 1,70 1,92 5,37 12,80 9,37 11,11 1,81 1,95 2,41 4,18 14,43 28,87 11,25 1,95 2,41 4,18 14,43 28,87 3,97 1,79 1,81 1,88 2,08 2,64 3,97 1,81 1,88 2,08 2,64 3,97 1,79 1,79 1,80 1,85 1,99
3,2055 2,7589 2,7172 2,6687 2,1697 2,1697 2,3731 2,0476 1,5983 3,2317 1,2441 2,6811 3,3344 3,499 3,6712 2,2586 1,0463 0,9825 2,4539 3,0438 3,251 3,3387 1,0463 0,9825 2,4539 3,0438 3,251 2,4544 2,4714 2,1746 1,4569 0,0659 1,4894 2,4544 2,1746 1,4569 0,0659 1,4894 2,4544 2,4995 2,3856 2,1469 1,6347 0,5988
0,7005 0,7781 0,7848 0,7924 0,8628 0,8628 0,8358 0,8778 0,9255 0,6956 0,9549 0,7905 0,6759 0,6431 0,6071 0,8513 0,9681 0,9719 0,8245 0,7299 0,6919 0,6751 0,9681 0,9719 0,8245 0,7299 0,6919 0,8244 0,822 0,8621 0,9381 0,9999 0,9353 0,8244 0,8621 0,9381 0,9999 0,9353 0,8244 0,8179 0,8341 0,8656 0,9221 0,9895
1,83 2,12 2,16 2,19 2,70 2,70 2,47 2,86 3,66 1,81 4,71 2,18 1,76 1,67 1,60 2,59 5,60 5,97 2,39 1,92 1,80 1,75 5,60 5,97 2,39 1,92 1,80 2,39 2,37 2,69 4,02 100,00 3,93 2,39 2,69 4,02 100,00 3,93 2,39 2,34 2,46 2,73 3,58 9,76
18. ábra Részleges legkisebb négyzetek módszerén alapuló sokváltozós adatelemzés összesített kimeneti mutatói
31
Az értékelés végén az alábbi következtetésre jutottam: α-hélix esetén az optimális matematikai módszer a második derivált Savitzky–Golayillesztéssel, 2-es polinom és 15-ös simító pont beállítás mellett; β-redőnél a második derivált módszert mozgó átlagolással kell kombinálni, 1-es rés és 7-es kapu beállítással; β-turn meghatározásnál a matematikai módszer azonos az α-hélixnél alkalmazottal, de a simítópontok száma 13 kell, legyen, és a 3-as polinom illesztés is megfelel; random coil esetén is ugyanezt kell alkalmazni, de az illesztett polinom 4 vagy 5, a simítópontok száma pedig 11.
32
19. ábra RMSEC értékek dekonvolúció és második derivált módszerek esetén
33
20. ábra R2 értékek dekonvolúció és második derivált módszerek esetén 34
21. ábra RPD értékek dekonvolúció és második derivált módszerek esetén 35
6. Diszkusszió A fehérjék olyan, aminosavakból felépülő makromolekulák, melyek fontos szerepet töltenek be a sejtek életében. Számos képviselőjük rendelkezik enzimaktivitással, így katalizálva a sejtben lejátszódó biokémiai folyamatokat. Vannak olyanok, melyek szerkezeti funkcióval bírnak, de találunk közöttük transzporter-, motor-, tartalék- és receptor fehérjéket is. A szervezetünk számára veszélyes toxinok és a szervezet működéséhez elengedhetetlen hormonok is mind fehérje molekulák. A fehérjék aktivitása és biológiai funkciójuk szorosan összefügg másodlagos szerkezetükkel, így ennek megismerése egyre fontosabbá válik a tudományban. A fehérjeszerkezet megismerése különféle kromatográfiás és spektroszkópiás módszerekkel is lehetséges. Ezek közé tartozik többek között az általam is alkalmazott Fouriertranszformációs infravörös spektroszkópia, ami egy nagy érzékenységű, roncsolásmentes technika, gyors mérést tesz lehetővé, nem igényel bonyolult minta előkészítést, valamint többféle üzemmódban, szilárd halmazállapotú és oldatbeli minták mérésére is alkalmas. TDK munkám során célom a következő volt: a letapogatások számának, valamint a különböző felbontások hatásának vizsgálata az infravörös spektrumon, a nyomóerő hatásának vizsgálata, valamint megtalálni a legmegfelelőbb matematikai módszert az FT-IR spektrumok értékelésére. A nyomóerő hatásának vizsgálatához 4 különböző nyomáson (25 N, 50 N, 75 N, 100 N) 3 enzim (DNáz I., Lizozim, Tripszin) FT-IR spektrumát vettem fel 4 cm-1-es felbontás mellett, mintánként 4 letapogatással. Eredményként elmondható, hogy a változó nyomóerő hatására a spektrumok kissé eltolódnak, főleg a Lizozim esetén. Ebből arra lehet következtetni, hogy a DNáz I. és a Tripszin morfológiája (pl. szemcseméret-eloszlása, keménysége) feltehetően hasonló, míg a Lizozim szerkezete ezektől jelentősen eltér. Ezek az eltolódások azonban nem változtatják meg az IR spektrumok lefutását, karakterisztikáját, így megállapítható, hogy az alkalmazott nyomóerőnek nincs hatása a fehérjék kémiai tulajdonságaira. A felbontás és a letapogatások számának optimalizálása érdekében a glutén fehérje spektrumát vettem fel 1 cm-1, 2 cm-1 és 4 cm-1-es felbontás mellett, miközben a letapogatások számát 4 és 128 között változtattam. Azonos felbontás esetén a letapogatások számának változtatása nincs számottevő hatással a spektrumra. Az optimális letapogatás36
szám kiválasztásánál így az időtényezőt vettem figyelembe, hiszen minden mérésnél az egyik legfontosabb cél, hogy azt minél rövidebb idő alatt lehessen elvégezni, vagyis a 4 letapogatást választottam ki. Az 1 cm-1-es felbontásnál felvett spektrum jelentősen el van tolódva az egymással szinte együtt futó, 2 cm-1-es és 4 cm-1-es felbontásnál felvett spektrumhoz képest, ez alapján pedig a további két felbontás közül kellett választanom. Végül a 4 cm-1-es felbontást tartottam optimálisabbnak, mivel ennél a beállításnál kevésbé zajos a spektrum. A spektrumokat Lorentz-, ill. Gauss-illesztéseken alapuló dekonvolúciós, valamint mozgó átlagolással, ill. Savitzky–Golay-féle illesztéssel kombinált második derivált matematikai módszerekkel is kezeltem. Elsőként az irodalomban leginkább alkalmazott Lorentz-, illetve Gauss-illesztéseken alapuló dekonvolúciós módszerrel kezeltem a DNáz I, a Lizozim, és a Tripszin 4 cm-1-es felbontás és 4 letapogatás melletti FT-IR spektrumát. Az értékelés során két faktort lehetett változtatni, a dekonvolúciós faktort és a zajcsökkentő faktort. Mindkettő szubjektíven változtatható, de az irodalmi adatok alapján a dekonvolúciós faktort 5.000 és 500.000, a zajcsökkentő faktort pedig 0,25 és 0,75 között változtattam. Arra a következtetésre jutottam, hogy a dekonvolúciós faktortól függetlenül a 0,5-ös zajcsökkentő faktor a legmegfelelőbb. A 0,25-ös faktor túlzottan kisimítja a spektrumot, az információt tartalmazó csúcsok is eltűnhetnek. A 0,75-ös faktor esetén pedig már túl zajossá válik a spektrum, a zajt és az információt tartalmazó csúcsokat nehéz elkülöníteni. A dekonvolúciós faktorok közül az 50.000 volt a legoptimálisabb. Az okok hasonlóak, mint a zajcsökkentő faktor esetén: 5.000-es értéknél túlzottan kisimul a spektrum, 500.000-es értéknél pedig már megjelennek zavaró csúcsok is. A dekonvolúciós értékelésnél alkalmazható Lorentz- és Gauss-illesztés is. Az irodalomban legtöbbször a Lorentz-illesztést alkalmazzák, ezért így tettem én is. Viszont ezt a döntést alátámasztandó az 50.000-es dekonvolúciós faktor és 0,5-ös zajcsökkentő faktor beállításnál elvégeztem a dekonvolúciót Lorentz- és Gauss-illesztéssel is. Az alkalmazott illesztések között nem mutatkozik különbség, így az irodalom által javasolt Lorentzillesztés alkalmazása a saját méréseim alapján is alátámasztott. A hasonlóság nem csak a diagram, hanem a pontos abszorbancia adatokat figyelembe véve is megalapozott. A második derivált módszert az irodalomban is ajánlják a dekonvolúciós módszerrel kapott eredmények alátámasztására. Hasonlóan a dekonvolúcióhoz, ez is kétféleképpen alkalmazható: mozgó átlagos módszerrel, vagy Savitzky–Golay-illesztéssel kombinálva.
37
A mozgó átlaggal kombinált esetben a rés (gap) értékét mindig 1-nek vettem, a kaput (segment) értéket pedig 1 és 9 között változtattam. A legoptimálisabb az 1-es értékű rés, és a 3-as értékű kapu, mivel ennél kisebb kapu értéknél még túl zajos a spektrum, nagyobbnál pedig már túlzottan kisimult. A későbbi értékelések alapján (a sokváltozós adatelemzések során) azonban kiderült, hogy ez a következtetés nem volt megfelelő. Savitzky–Golay-illesztésnél a polinomok számát 2 és 6 között, a simító pontok számát 3 és 15 között változtattam. Az irodalomban a 2-es, 3-as és 4-es polinom a gyakori, de a pontos eredmények érdekében a polinom illesztést a 6-os értékig elvégeztem. Ugyanez vonatkozik a simító pontok számára is: az irodalomban 9-es értékű simítás a legnagyobb, én elvégeztem 15-ös értékű simításig az értékelést. Az értékelés során kapott eredményekből részleges legkisebb négyzetek módszerén alapuló sokváltozós adatelemzés segítségével megállapítottam, hogy melyik szerkezeti elemre melyik módszer a legérzékenyebb. A különböző módszereknél az R2, az RPD és az RMSEC értékeket hasonlítottam össze, majd kiválasztottam mindegyik másodlagos szerkezeti elem esetén azt az egyet, amelyiknél a legnagyobb az R2 értéke, a legkisebb az RMSEC, valamint az RPD 3 feletti. Az értékelés végén az alábbi következtetésre jutottam: α-hélix esetén az optimális matematikai módszer a második derivált Savitzky–Golayillesztéssel, 2-es polinom és 15-ös simító pont beállítás mellett; β-redőnél a második derivált módszert mozgó átlagolással kell kombinálni, 1-es rés és 7-es kapu beállítással; β-turn meghatározásnál a matematikai módszer azonos az α-hélixnél alkalmazottal, de a simítópontok száma 13 kell, legyen, és a 3-as polinom illesztés is megfelel; random coil esetén is ugyanezt kell alkalmazni, de az illesztett polinom 4 vagy 5, a simítópontok száma pedig 11.
38
7. Irodalomjegyzék
1.
Ádám, V., Orvosi biokémia. 2006.
2.
Szabó, G., Sejtbiológia. 2009.
3.
Richardson, J.S., The Anatomy and Taxonomy of Protein Structure.
4.
Szeberényi, J., Molekuláris sejtbiológia. 2004.
5.
Alberts, B., Essential cell biology. 2009.
6.
Ramakrishnan, C. and G.N. Ramachandran, Stereochemical criteria for polypeptide and protein chain conformations. II. Allowed conformations for a pair of peptide units. Biophys J, 1965. 5(6): p. 909-33.
7.
Lovell, S.C., et al., Structure validation by Calpha geometry: phi,psi and Cbeta deviation. Proteins, 2003. 50(3): p. 437-50.
8.
Ramachandran, G.N., C. Ramakrishnan, and V. Sasisekharan, Stereochemistry of polypeptide chain configurations. J Mol Biol, 1963. 7: p. 95-9.
9.
The mysterious regions of the Ramachandran plot. 2006.
10.
Pelton, J.T. and L.R. McLean, Spectroscopic methods for analysis of protein secondary structure. Anal Biochem, 2000. 277(2): p. 167-76.
11.
Heim, M., Hierarchical structures made of proteins. The complex architecture of spider webs and their constituent silk proteins. Chemical Society Reviews, 2010. 39: p. 156-164.
12.
Dong, Z., Q. Luo, and J. Liu, Artificial enzymes based on supramolecular scaffolds. Chem Soc Rev, 2012. 41(23): p. 7890-908.
13.
Haven, K., 100 Greatest Science Discoveries Of All Time. 2007.
39
14.
McClure, W., 204 years of near infrared technology:1800–2003. Journal of Near Infrared Spectroscopy, 2003. 11(1): p. 487.
15.
Burns, D., Handbook of Near-Infrared Analysis. 2007.
16.
Glassford, S.E., B. Byrne, and S.G. Kazarian, Recent applications of ATR FTIR spectroscopy and imaging to proteins. Biochim Biophys Acta, 2013. 1834(12): p. 2849-58.
17.
Coates, J., Interpretation of infrared spectra, a practical approach. Encyclopedia of Analytical Chemistry, 2000: p. 10815-10837.
18.
Pokol, G., Analitikai kémia. 2011.
19.
Griffiths, P.R., Fourier Transform Infrared Spectrometry. 2007.
20.
Rich, P.R. and M. Iwaki, Methods to probe protein transitions with ATR infrared spectroscopy. Mol Biosyst, 2007. 3(6): p. 398-407.
21.
Kumosinski, T.F., Determination of the global secondary structure of proteins by Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy. Trends in Food Science and Technology, 1993. 4(6): p. 169-175.
22.
Beekes, M., Analytical applications of Fourier trasnform-infrared (FT-IR) spectroscopy in microbiology and prion research. Veterinary Microbiology, 2007. 123(4): p. 305-319.
23.
Sinha, S., et al., Protein conformation in amorphous solids by FTIR and by hydrogen/deuterium exchange with mass spectrometry. Biophys J, 2008. 95(12): p. 5951-61.
24.
Scott, R.P.W. ANALYTICAL SPECTROSCOPY: Essential Information for the Analytical Chemist.
25.
Chittur, K.K., FTIR/ATR for protein adsorption to biomaterial surfaces. Biomaterials, 1998. 19(4-5): p. 357-69.
40
26.
Ellepola, S.W., S.M. Choi, and C.Y. Ma, Conformational study of globulin from rice (Oryza sativa) seeds by Fourier-transform infrared spectroscopy. Int J Biol Macromol, 2005. 37(1-2): p. 12-20.
27.
Matsch, H.H., Infrared and Raman spectroscopy of biological materials.
28.
Krimm, S. and J. Bandekar, Vibrational spectroscopy and conformation of peptides, polypeptides, and proteins. Adv Protein Chem, 1986. 38: p. 181-364.
29.
Barth, A., What vibrations tell us about proteins. Quarterly Reviews of Biophysics, 2002. 35(4): p. 369-430.
30.
Baiz, C.R., M. Reppert, and A. Tokmakoff, Amide I two-dimensional infrared spectroscopy: methods for visualizing the vibrational structure of large proteins. J Phys Chem A, 2013. 117(29): p. 5955-61.
31.
Sarroukh, R., et al., ATR-FTIR: a "rejuvenated" tool to investigate amyloid proteins. Biochim Biophys Acta, 2013. 1828(10): p. 2328-38.
32.
Surewicz, W.K., New insight into protein secondary structure from resolutionenhanced infrared spectra. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology, 1988. 952: p. 115-130.
33.
Schartner, J., et al., Universal method for protein immobilization on chemically functionalized germanium investigated by ATR-FTIR difference spectroscopy. J Am Chem Soc, 2013. 135(10): p. 4079-87.
34.
K., O., Label-Free Detection of Protein-Protein Interactions at the GaAs/Water Interface through Surface Infrared Spectroscopy: Discrimination between Specific and Nonspecific Interactions by Using Secondary Structure Analysis. Langmuir, 2007. 23(24): p. 12287-12292.
35.
Lane, R., Attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy method to differentiate between normal and cancerous breast cells. Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 2012. 12(9): p. 7395-7400.
41
36.
Wray, P., et al., Compaction of pharmaceutical tablets with different polymer matrices studied by FTIR imaging and X-ray microtomography. J Pharm Sci, 2008. 97(10): p. 4269-77.
37.
Andanson, J.-M., High-Throughput Spectroscopic Imaging Applied to Permeation Through the Skin. Applied Spectroscopy, 2009. 63(5): p. 512-517.
38.
Tay, F.H., Study of petroleum heat-exchanger deposits with ATR-FTIR spectroscopic imaging. Energy Fuels, 2009. 23(8): p. 4059-4067.
39.
Palombo, F., Application of Fourier transform infrared spectroscopic imaging to the study of effects of age and dietary l-arginine onaortic lesion composition in cholesterol-fed rabbits. Journal of the Royal Society Interface, 2008. 6(37): p. 669680.
40.
Kuimova, M.K., K.L. Chan, and S.G. Kazarian, Chemical imaging of live cancer cells in the natural aqueous environment. Appl Spectrosc, 2009. 63(2): p. 164-71.
41.
Allain, A.-F., Relationships between conformation of β-lactoglobulin in solution and gel states as revealed by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy. International Journal of Biological Macromolecules, 1999. 26(5): p. 337-344.
42.
Subirade, M., Molecular basis of film formation from a soybean protein: comparison between the conformation of glycinin in aqueous solution and in films. International Journal of Biological Macromolecules, 1998. 23(4): p. 241-249.
43.
Popineau, Y., A Study by Infrared Spectroscopy of the Conformations of Gluten Proteins Differing in their Gliadin and Glutenin Compositions. Journal of Cereal Science, 1994. 20(1): p. 15-22.
44.
Ismail, A.A., H.H. Mantsch, and P.T. Wong, Aggregation of chymotrypsinogen: portrait by infrared spectroscopy. Biochim Biophys Acta, 1992. 1121(1-2): p. 183-8.
45.
Casal, H.L., U. Kohler, and H.H. Mantsch, Structural and conformational changes of beta-lactoglobulin B: an infrared spectroscopic study of the effect of pH and temperature. Biochim Biophys Acta, 1988. 957(1): p. 11-20.
42
46.
Wong, P.T. and D.W. Armstrong, FTIR spectroscopic kinetic analysis of alkaline phosphatase under hyperbaric manipulation. Biochim Biophys Acta, 1992. 1159(3): p. 237-42.
47.
Jackson, M., Halogenated alcohols as solvents for proteins: FTIR spectroscopic studies. Biochim Biophys Acta, 1992. 1118(2): p. 139-143.
48.
Zhang, H., Conformational Transformations in Peptides Containing Two Putative αHelices of the Prion Protein. Journal of Molecular Biology, 1995. 250(4): p. 514526.
49.
Tatulian, S.A., Attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy: a method of choice for studying membrane proteins and lipids. Biochemistry, 2003. 42(41): p. 11898-907.
50.
Shivu, B., et al., Distinct beta-sheet structure in protein aggregates determined by ATR-FTIR spectroscopy. Biochemistry, 2013. 52(31): p. 5176-83.
51.
Goormaghtigh, E., et al., Protein secondary structure content in solution, films and tissues: redundancy and complementarity of the information content in circular dichroism, transmission and ATR FTIR spectra. Biochim Biophys Acta, 2009. 1794(9): p. 1332-43.
52.
Rebuffo, C.A., et al., Reliable and rapid identification of Listeria monocytogenes and Listeria species by artificial neural network-based Fourier transform infrared spectroscopy. Appl Environ Microbiol, 2006. 72(2): p. 994-1000.
53.
Toumadje, A. and W.C. Johnson, Jr., Effects of relative band intensity on prediction of protein secondary structure from CD. Anal Biochem, 1993. 211(2): p. 258-60.
54.
Johnson, W.C., Jr., Protein secondary structure and circular dichroism: a practical guide. Proteins, 1990. 7(3): p. 205-14.
55.
Greenfield, N.J., Methods to estimate the conformation of proteins and polypeptides from circular dichroism data. Anal Biochem, 1996. 235(1): p. 1-10.
56.
Salgó, A., Élelmiszeranalitika gyors és automatizált módszerei. 2011.
43
57.
Laporte, L., J. Stultz, and G.J. Thomas, Jr., Solution conformations and interactions of alpha and beta subunits of the Oxytricha nova telomere binding protein: investigation by Raman spectroscopy. Biochemistry, 1997. 36(26): p. 80539.
58.
Raman, C.V., A new type of secondary radiation. Nature, 1928. 121(3048): p. 501502.
59.
Vankeirsbilck, T., Applications of Raman spectroscopy in pharmaceutical analysis. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 2002. 21(12): p. 869-877.
44
Köszönetnyilvánítás Szeretném megköszönni témavezetőmnek, Dr. Gergely Szilveszternek, hogy lehetővé tette TDK dolgozatom elkészítését, segítette munkámat, tudásával hozzájárult szakmai fejlődésemhez. Köszönettel tartozom még a NIR Spektroszkópia Csoport doktoráns hallgatóinak segítségéért.
45
