Vakgroep Organische Chemie Onderzoeksgroep Scheidingstechnieken
Fractionatie van lipideklassen in biologische vloeistoffen
Proefschrift voorgelegd tot het behalen van de graad van Master in de Chemie door
Mike DE VRIEZE
Academiejaar 2008-2009
Promotor: Prof. Dr. P. Sandra Begeleidster: Dr. B. Bicalho
Dankwoord Ik zou hierbij enkele personen willen bedanken zonder wie ik dit resultaat niet had kunnen bereiken. In eerste instantie wil ik mijn promotor, Prof. Dr. P. Sandra en mijn begeleidster, Dr. B. Bicalho bedanken voor de kans die ik kreeg om mijn thesis te realiseren en voor de voortreffelijke begeleiding tijdens het onderzoek. Verder wil ik iedereen in de onderzoeksgroep “Scheidingstechnieken” bedanken voor hun hulpvaardigheid bij allerhande problemen en voor de aangename sfeer. Tot slot wil ik mijn familie en vrienden bedanken voor de financiële en emotionele steun, dankzij hen kreeg ik de kans om mijn studies tot een goed einde te brengen.
Inhoudstafel 1.
Inleiding en doelstellingen........................................................................................... 1
2.
Fundamentele chromatografische aspecten ................................................................. 2 2.1.
Ontstaan van de chromatografie ........................................................................... 2
2.2.
Theorie omtrent chromatografie ........................................................................... 2
2.3.
Vormen van chromatografie aangewend in dit werk ........................................... 5
2.3.1.
Dunnelaagchromatografie (TLC).................................................................. 6
2.3.2.
Hoge performantie vloeistofchromatografie (HPLC) ................................... 7
2.3.2.1. HPLC-opstelling ....................................................................................... 7 2.3.2.2. Detectoren ................................................................................................. 8 2.3.2.3. Modes in HPLC ...................................................................................... 10 2.3.3.
Gaschromatografie (GC) ............................................................................. 12
2.3.3.1. GC-opstelling .......................................................................................... 13 2.3.3.2. De injectie bij CGC ................................................................................. 13 2.3.3.3. Soorten kolommen bij GC ...................................................................... 14 2.3.3.4. Detectoren ............................................................................................... 15 3.
Lipidenonderzoek in biologische vloeistoffen .......................................................... 16 3.1.
Overzicht van de lipideklassen ........................................................................... 16
3.1.1.
Neutrale lipiden ........................................................................................... 17
3.1.1.1. Vrije vetzuren.......................................................................................... 17 3.1.1.2. Glycerolipiden......................................................................................... 17 3.1.1.3. Sterolen en sterolesters ........................................................................... 18 3.1.2.
4.
Polaire lipiden ............................................................................................. 19
3.2.
Lipidenonderzoek met TLC ............................................................................... 19
3.3.
Lipidenonderzoek met HPLC............................................................................. 20
3.4.
Lipidenonderzoek met GC ................................................................................. 21
Experimenteel gedeelte.............................................................................................. 24 i
4.1.
Doelstellingen..................................................................................................... 24
4.2.
Gebruikte chemicaliën........................................................................................ 24
4.3.
Evaluatie van een TLC-methode voor het scheiden van de lipideklassen ......... 24
4.3.1.
Reagentia en standaarden ............................................................................ 24
4.3.2.
Instrumentatie ............................................................................................. 24
4.3.3.
Extractie van de lipiden uit eigeel ............................................................... 25
4.3.4.
Methode ...................................................................................................... 25
4.3.5.
Resultaten en bespreking ............................................................................ 25
4.3.6.
Conclusie..................................................................................................... 26
4.4.
Analyse van lipiden via HPLC ........................................................................... 26
4.4.1.
Evaluatie van een silica-kolom voor het scheiden van lipideklassen ......... 27
4.4.1.1. Instrumentatie ......................................................................................... 27 4.4.1.2. Aangewende methodes ........................................................................... 27 4.4.1.3. Resultaten en bespreking ........................................................................ 30 4.4.1.4. Conclusies bij het gebruik van een silica-kolom .................................... 33 4.4.2.
Evaluatie van een diol-kolom voor het scheiden van lipideklassen ........... 33
4.4.2.1. Instrumentatie ......................................................................................... 33 4.4.2.2. Aangewende methodes ........................................................................... 34 4.4.2.3. Resultaten en bespreking ........................................................................ 36 4.4.2.4. Conclusies bij het gebruik van een diol-kolom....................................... 42 4.4.3.
Concentratiebepaling van de lipideklassen in plasma ................................ 43
4.4.3.1. Doel ......................................................................................................... 43 4.4.3.2. Instrumentatie ......................................................................................... 43 4.4.3.3. Methode .................................................................................................. 43 4.4.3.4. Resultaten en bespreking ........................................................................ 43 4.4.4. 4.5.
Fractieverzameling met HPLC ................................................................... 45
Analyse van vetzuren via GC-FID ..................................................................... 46 ii
4.5.1.
Instrumentatie ............................................................................................. 46
4.5.2.
Omestering van de vetzuren naar FAMEs .................................................. 46
4.5.3.
Injectie bij GC-FID ..................................................................................... 47
4.5.4.
Resultaten en bespreking ............................................................................ 47
4.5.5.
Conclusies bij de analyse van de vetzuursamenstelling ............................. 51
5.
Besluit ........................................................................................................................ 53
6.
Referentielijst............................................................................................................. 54
Appendix A: Lijst met de gebruikte afkortingen ................................................................ 56 Appendix B: Overzicht van de gebruikte standaarden ....................................................... 58
iii
1.
Inleiding en doelstellingen De laatste jaren is er heel wat vooruitgang geboekt bij de instrumentatie voor
chromatografie en massaspectrometrie. Deze vooruitgang heeft bijgedragen tot een sterke uitbouw van de “omics”-onderzoeksgebieden in de systeembiologie. Voorbeelden hiervan zijn lipidomics, proteomics, genomics en metabolomics. Lipidomics wordt omschreven als de studie (identificatie en kwantificatie) van lipiden en hun interacties met andere lipiden, proteïnen en andere metabolieten. Lipidomics is een snel groeiend onderzoeksveld waarbij de vooruitgang aan de kennis omtrent lipiden een analoge trend volgt aan de voorafgaande explosie aan informatie uit de genomics en proteomics. Lipiden spelen een cruciale rol in de cel, in weefsels en bij de fysiologie van organen. Dit wordt aangetoond door een groot aantal genetische studies en door meerdere menselijke ziektes waarbij enzymen voor het lipidenmetabolisme afgebroken worden of het reactiemechanisme onderbroken wordt. Voorbeelden van ziektes waarbij lipiden een belangrijke rol spelen zijn diabetes, obesitas, atherosclerose, hoge bloeddruk, hartaanvallen en kanker. Lipidomics is derhalve een veelbelovend gebied bij biomedisch onderzoek, met een waaier aan mogelijke toepassingen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en het ontdekken van biomarkers. Het doel van dit werk is het opstellen van een bruikbare methode voor een fractionatie van de verschillende lipideklassen en deze methode te toetsen voor biologische vloeistoffen. Voorts zal gepoogd worden om de verschillende lipideklassen preparatief op te vangen zodat een verdere analyse hiervan mogelijk wordt, zoals de bepaling van hun individuele vetzuursamenstelling.
1
2.
Fundamentele chromatografische aspecten
2.1.
Ontstaan van de chromatografie
Het woord chromatografie is afgeleid van de Griekse woorden χρωμα (‘chroma’, kleur) en γραφειν (‘graphein’, schrijven). De Russische botanicus Mikhail Semyonovich Tswett (figuur 2.1) legde in 1901 de basis voor chromatografie tijdens zijn onderzoek op plantenpigmenten, waarbij hij erin slaagde om chlorofyl (= bladgroen) te scheiden van carotenoïden. Hiertoe gebruikte hij glazen kolommen gepakt met CaCO3 als stationaire fase en een mengsel van petroleumether en ethanol als mobiele fase. De pigmenten, die zichtbaar waren als verschillende gekleurde banden in de kolom, werden van elkaar gescheiden door de verschillende snelheid waarmee ze door de kolom
Figuur 2.1: Mikhail S. Tswett
bewogen. De mobiele fase werd doorheen de gepakte kolom gestuurd onder invloed van de zwaartekracht, dit zorgde er echter voor dat de experimenten nogal traag verliepen. Desondanks was de basis gelegd voor vloeistofchromatografie. Archer John Porter Martin en Richard Laurence Millington Synge legden in de periode 1941-1943 de basis voor gaschromatografie. Hierna volgde een snelle ontwikkeling van de verschillende vormen van chromatografie. Chromatografie is intussen zo ver geëvolueerd dat deze techniek kan aangewend worden als een algemene routine analysetechniek.
2.2.
Theorie omtrent chromatografie
Bij een chromatografische analyse wordt een monster met verschillende componenten aangebracht op een plaat (zoals bij TLC, zie verder) of op een kolom. De snelheid waarmee verschillende componenten de kolom doorlopen varieert naargelang de affiniteit die ze vertonen voor de stationaire en de mobiele fase. De elutie- of retentietijd (tR) van een component wordt langer wanneer de affiniteit van de component voor de stationaire fase groter wordt ten opzichte van de mobiele fase. Elke component heeft bijgevolg een karakteristieke retentietijd voor elke combinatie van stationaire en mobiele fase. Dit leidt tot de definitie van de retentiefactor k (zie vergelijking 2.1), die de retentietijd tR relateert aan de tijd die een component spendeert in de mobiele fase (tM). tM is de retentietijd van een component die niet weerhouden wordt en wordt ook wel de dode tijd van de kolom genoemd. 2
−
=
=
(2.1)
Hierbij is tR’ de tijd die een component doorbrengt in de stationaire fase. Door een chromatogram, waarin het signaal van een detector wordt uitgezet in functie van de tijd, kan dit verduidelijkt worden (figuur 2.2). signaalsterkte
ΔtR tR1 tR2
σ1
σ2
tR1’ tR2’ Wh1
Wh2
tM
Wb1
Wb2 tijd
Figuur 2.2: Chromatogram voor een mengsel van 2 componenten
De belangrijkste methode om de waarde van k te wijzigen is door de samenstelling van de mobiele fase te veranderen: hoe kleiner de affiniteit van de componenten is voor de mobiele fase, hoe langer de retentietijd zal zijn, en hoe groter k zal zijn. k is ook afhankelijk van de hoeveelheid stationaire fase aangezien de interactie met de stationaire fase dan groter wordt. Dit laatste wordt verduidelijkt met behulp van vergelijking 2.2. De distributiecoëfficiënt KD, gedefinieerd als de verhouding van de concentratie van een component in de stationaire fase (CS) over de concentratie in de mobiele fase (CM), kan herschreven worden als het product van de retentiefactor en de fase ratio β. De fase ratio is de verhouding van het volume van de mobiele fase (VM) over het volume van de stationaire fase (VS).
=
=
⁄ ⁄
=
×
=
×
(2.2)
De selectiviteitsfactor α is de verhouding van de retentiefactor van de later eluerende component over deze van de eerder eluerende component en wordt berekend met behulp van 3
vergelijking 2.3. In HPLC wordt de waarde van α, die altijd groter is dan 1, bepaald door de keuze van de stationaire en mobiele fase. Bij GC zal verandering van de mobiele fase weinig invloed hebben op de selectiviteit.
=
=
− −
=
(2.3)
Het plaatgetal N levert een idee omtrent de efficiëntie van de scheiding. N wordt bekomen via vergelijking 2.4. Wb is de piekbreedte aan de basis van de piek, Wh is de piekbreedte op halve hoogte, σ is 1⁄4 van Wb. Deze piekbreedte komt voor op 88,2% van de hoogte van de piek wanneer de piekverdeling Gaussiaans is.
= 16
= 5,54
=
(2.4)
Het verwachte plaatgetal kan theoretisch worden berekend met behulp van vergelijking 2.5 of 2.6, respectievelijk voor vloeistofchromatografie (met gepakte kolommen) en gaschromatografie (met open tubulaire kolommen). In beide vergelijkingen staat L symbool voor de lengte van de kolom. H is de afkorting van HETP, dit is het hoogte-equivalent van een theoretische plaat.
N=
≈
2
(2.5)
dp staat voor de diameter van de deeltjes waarmee de kolom gepakt is. Het kan aangetoond worden dat H bij een optimaal gepakte kolom gelijk is aan 2dp [1].
=
≈
(2.6)
dc is de interne diameter van de kolom. De eenvoudigste manier om N te verhogen is dus door de kolomlengte (L) te verhogen of door de partikelgrootte (dp) of de kolomdiameter (dc) te verkleinen. Bij een hogere N is de
4
scheiding beter: ofwel wordt de piekbreedte kleiner, ofwel wordt de retentietijd van de componenten langer. Eén van de meest gebruikte kolommen bij HPLC is een kolom met een lengte van 25 cm en een interne diameter van 4,6 mm waarbij de diameter van de deeltjes 5 µm is. Een eenvoudige berekening leert ons dat het theoretisch plaatgetal van deze kolom 25.000 bedraagt. De meest gebruikte kolom bij GC is een capillaire kolom met een lengte van 25 m met als interne diameter 0,25 mm en een filmdikte van 0,25 µm. Het theoretisch plaatgetal van deze kolom bedraagt 100.000. De mate van scheiding tussen twee componenten wordt weergegeven door de resolutie R S. De resolutie kan experimenteel bepaald worden uit een chromatogram zoals figuur 2.2 via vergelijking 2.7.
=
− (
)
≈
−
=
∆
(2.7)
Hierbij stellen tR1 en tR2 de retentietijden voor van de eerste en de tweede component. Wb1 en Wb2 komen overeen met de piekbreedtes aan de basis van deze pieken. Omdat het verschil tussen Wb1 en Wb2 dikwijls klein is, kan meestal een vereenvoudiging gemaakt worden. De samenhang tussen de retentiefactor, de selectiviteitsfactor en het plaatgetal komt tot uiting in de resolutievergelijking (vergelijking 2.8).
=
2.3.
√ 4
−1 +1
(2.8)
Vormen van chromatografie aangewend in dit werk
De International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) definieert chromatografie als een fysische scheidingsmethode waarin de te scheiden componenten verdeeld worden over twee fasen, waarvan er één stationair is, terwijl de andere beweegt in een bepaalde richting [2]. De stationaire fase kan hierbij een vaste stof, een gel of een vloeistof zijn. Men spreekt van kolomchromatografie wanneer de stationaire fase zich in een cylindrische kolom bevindt. Hier kan een onderscheid gemaakt worden tussen enerzijds een gepakte kolom, waarbij deeltjes de volledige kolom opvullen, en anderzijds een open buis kolom, waarbij de deeltjes of de stationaire fase als een dunne laag aangebracht zijn op de
5
binnenkant van de kolom en waarbij in het midden van de kolom een vrije doorgang is voor de mobiele fase. De mobiele fase kan een vloeistof (vloeistofchromatografie, LC), een gas (gaschromatografie, GC) of een superkritische vloeistof (superkritische vloeistofchromatografie, SFC) zijn. Men spreekt van planaire chromatografie wanneer de stationaire fase op een vlak verspreid is. Hier kunnen we een onderscheid maken tussen papierchromatografie en dunnelaagchromatografie (TLC). TLC, HPLC en GC worden hieronder kort uiteengezet aangezien deze technieken aangewend werden in dit werk.
2.3.1. Dunnelaagchromatografie (TLC) Bij deze vorm van chromatografie wordt een vlakke ondergrond (meestal een glazen of aluminium plaat) bedekt met de stationaire fase bestaande uit een dunne laag sorberend materiaal zoals silicagel of aluminiumoxide. Bij TLC (Thin Layer Chromatography) wordt het te analyseren monster aangebracht (gespot) op de plaat, en wordt de plaat rechtop geplaatst in de elutietank. Deze tank is gevuld met het eluens (de mobiele fase). De spot moet boven het eluensniveau komen wanneer de plaat in de elutietank wordt geplaatst. De beweeglijkheid van het eluens wordt verkregen door capillaire opstijging. Om te vermijden dat dit mechanisme verstoord wordt, wordt er eerst voor gezorgd dat de atmosfeer in de afgesloten elutietank verzadigd is met eluensdamp. Het monster wordt altijd in oplossing gebracht vooraleer het op de plaat te spotten. Tijdens de chromatografie komt het eluens in contact met het monster. De componenten van het monster bewegen met een verschillende snelheid afhankelijk van hun relatieve affiniteit voor de stationaire en mobiele fase. Aan de hand van figuur 2.3 zijn de verschillende stappen te volgen. Bij deze figuur worden er drie monsters aangebracht op de plaat. De plaat wordt in de
Figuur 2.3: Ontwikkeling van een TLC-plaat
elutietank geplaatst, die vervolgens wordt afgesloten. Na verloop van tijd zullen de mobiele fase en de componenten voldoende gestegen zijn om de plaat uit de elutietank te halen. Hierna wordt het eluens op de plaat verdampt. 6
Iedere component heeft onder bepaalde omstandigheden een karakteristieke chromatografische index, de zogenoemde Rf-waarde (Rf = retention/ retardation factor). Deze waarde is de verhouding van de afstand die de component afgelegd heeft (korte pijl rechts in figuur 2.3) tot de afstand die het eluens afgelegd heeft (lange pijl rechts in figuur 2.3). Er werden heel wat strategieën ontwikkeld om de spots zichtbaar te maken. Veelal wordt een UV-lamp (254 nm) gebruikt. Absorptie van I2-dampen kan ook als methode gebruikt worden. Het is ook mogelijk om de plaat onder te dompelen of te besproeien met een bepaalde oplossing, zoals een oplossing van zwavelzuur, permanganaat, anisaldehyde of ammoniummolybdaat [3]. TLC is een goedkope techniek die snel en gemakkelijk uitvoerbaar is. Daarom wordt TLC dikwijls gebruikt om het verloop van reacties op te volgen en voor een kwalitatieve analyse van reactieproducten. Een ander voordeel is dat er meerdere monsters simultaan gescheiden kunnen worden op één TLC-plaat. Enkele nadelen zijn onder andere het gering scheidend vermogen – dit kan gedeeltelijk worden opgelost door een 2D-scheiding uit te voeren – en de moeilijkheid om de resultaten kwantitatief te beoordelen.
2.3.2. Hoge performantie vloeistofchromatografie (HPLC) 2.3.2.1.
HPLC-opstelling
Bij de kolomchromatografie door Tswett werden grote, ruwe partikels gebruikt en werd de mobiele fase door de kolom gestuurd onder lage (gravitatie) druk. De term HPLC (High Performance Liquid Chromatography) wordt gebruikt bij het aanwenden van hoge drukken en veel kleinere, homogene partikels. Een HPLC-systeem kan schematisch voorgesteld worden zoals in figuur 2.4. Het eluens, dat zich in een reservoir bevindt, wordt ontgast vooraleer het in het systeem wordt gebracht. De pomp moet in staat zijn om het debiet constant te houden. Dit kan slechts als de druk heel goed gecontroleerd wordt. Bij vele pompen bedraagt de maximale druk 400 bar, recentere pompen halen reeds 1200 bar. Menging van de verschillende solventen is ook belangrijk. Bij een isocratische elutie blijft de samenstelling van de mobiele fase constant gedurende de analyse. Bij een gradiëntelutie verandert de samenstelling van de mobiele fase. Het monster wordt via de injector als een smalle plug in de mobiele fase gebracht, dit gebeurt met behulp van een zeswegkraan met injectielus.
7
Eluens
Filter Pump
HPLC-pomp
Monster
Injectiesysteem Meting van druk en stroomsnelheid Afval Kolom
Detector Dataverwerking
Fractiecollector
Figuur 2.4: Schematische voorstelling van een HPLC-opstelling
De mobiele fase wordt vervolgens door de kolom gestuurd, die al dan niet gethermostatiseerd is, waarna het eluens naar een detector of naar een fractiecollector gaat. Indien er een niet-destructieve detector gebruikt wordt, is het plaatsen van de fractiecollector na de detector ook mogelijk. Het signaal van de detector wordt via een dataverwerkingssysteem omgezet in een chromatogram.
2.3.2.2.
Detectoren
Het is belangrijk om een geschikte detector te gebruiken bij een bepaalde meting. De respons van de detector is dikwijls afhankelijk van de component die onderzocht wordt. Wanneer een detector eenzelfde signaal levert voor elke molecule die uit een kolom komt, spreekt men van universele detectie. Gevoeligheid, selectiviteit en lineaire respons zijn belangrijke aspecten voor een detector. Enkele beschikbare HPLC-detectoren zijn UV-Vis, diode array detectie, laser geïnduceerde fluorescentie, massaspectrometrie, elektrochemische detectie en geïoniseerde aërosol detectie (CAD). Hieronder worden de meest relevante detectoren voor dit werk nader uitgelegd.
a) UV-detectie UV-detectoren, zoals de variabele golflengte detector afgebeeld in figuur 2.5, werden reeds heel vroeg geïntroduceerd en worden aangewend voor veel toepassingen in HPLC. Met behulp van een rooster en spleten kan de gewenste golflengte geselecteerd worden uit het licht geëmitteerd door een breed spectrum UV-lamp. Het licht wordt vervolgens in een stroomcel 8
door de mobiele fase gestuurd. Een deel van het licht wordt hierbij geabsorbeerd.
Lichtsensor
Bij aanwezigheid van een component wordt er meer licht geabsorbeerd, waardoor
er
een
piek
in
I’ Stroomcel
Uitlaat HPLC kolom
Afval I0
het
chromatogram komt. Lichtbron
Een nadeel van deze detector is dat
Rooster
niet alle componenten gedetecteerd kunnen worden, enkel chromoforen
Figuur 2.5: Werkingswijze van een UV-detector
hebben een UV-spectrum.
b) CAD-detectie Geïoniseerde aërosol detectie of Charged Aerosol Detection (CAD) is een recente detector. De detector geeft een bijna universele respons voor componenten die weinig vluchtig zijn. Voor componenten met een intermediaire vluchtigheid is het signaal dikwijls inconsistent, voor vluchtige componenten geeft de CAD geen signaal [4, 5]. De werking van de detector wordt uiteengezet aan de hand van figuur 2.6. De mobiele fase
Verstuiver en impactplaat
Elektrometer
Uitlaat HPLCkolom
Signaal
Verwarmde buis Deeltjes met hoge beweeglijkheid worden verwijderd Gastoevoer
Collector Afvoer grote druppels Gasstroom positief geladen door hogespanningsbron Positieve lading wordt overgedragen op componenten
Figuur 2.6: Werkingswijze van een CAD-detector
9
die doorheen de kolom is gegaan wordt daarbij verneveld. De grootste druppels worden onmiddellijk verwijderd, de kleinere druppels komen in een verwarmde buis waar het solvent (gedeeltelijk) verdampt, zodat een aërosol van analietdeeltjes overblijft. De deeltjes worden positief geladen door contact met een geïoniseerd gas (meestal N2-gas). Vervolgens worden deeltjes met een hoge beweeglijkheid (zoals de N2-ionen) verwijderd onder invloed van een elektrisch veld. Hierna komen de geladen aërosoldeeltjes terecht op een geleidende filter die de lading overbrengt naar een elektrometer voor signaaltransductie. De detector heeft een lineair bereik over meerdere grootte-ordes en is vrij gevoelig (tot ongeveer 1 µg/mL). De respons is onafhankelijk van de chemische eigenschappen van de component. Eén van de grootste beperkingen bij deze techniek is dat de respons van de detector varieert volgens de samenstelling van de mobiele fase; de respons is hoger naarmate de mobiele fase meer organisch is. In principe kan dit probleem opgelost worden door met een andere pomp de tegengestelde gradiënt te leveren, waardoor de totale mobiele fase constant wordt.
c) MS-detectie Massaspectrometrie of Mass Spectrometry (MS) is een zeer krachtige techniek die een groeiend gebruik kent. De mobiele fase die uit de kolom komt wordt naar een ionisatiebron gestuurd. Voorbeelden van ionisatiebronnen zijn ESI (Electrospray Ionization) en APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization). Met behulp van de ionisatiebron worden organische componenten omgezet in geladen ionen. De ionen worden vervolgens gescheiden volgens hun massa/ladingsverhouding (m/z) met de
massaspectrometer
die
onder
hoog-vacuüm
staat.
Er
bestaan
verschillende
massaspectrometers, de belangrijkste zijn de quadrupool, ion trap, magnetische sector-veld en time of flight.
2.3.2.3.
Modes in HPLC
Bij HPLC kunnen meerdere modes aangewend worden ter scheiding van de componenten. Van de meest gebruikte modes wordt in tabel 2.1 een overzicht gegeven. Omkeerfase, normaalfase en hydrofiele interactiefase worden hieronder besproken aangezien deze relevant zijn in dit werk.
10
Affiniteitschromatografie Chirale chromatografie Hydrofiele interactie chromatografie Ionenpaar chromatografie Ionenuitwisselingschromatografie Normaalfase chromatografie Omkeerfase chromatografie Size Exclusion chromatografie Tabel 2.1: Verschillende modes in HPLC
a) Omkeerfase chromatografie Bij omkeerfase of RP (Reversed-Phase) chromatografie is de mobiele fase polair en de stationaire fase apolair. Als mobiele fase wordt meestal water en water-oplosbare organische solventen – zoals acetonitril en methanol – gebruikt. De mobiele fase kan gemodificeerd worden met een zuur of base. De scheiding bij RPLC gebeurt op basis van de hydrofobiciteit, waarbij de meest hydrofobe (meest C-atomen) component het langst weerhouden wordt. Hoe groter de hydrofobiciteit van de mobiele fase, hoe groter de eluerende kracht. Als stationaire fase wordt meestal C18 gebonden silicagel gebruikt. Andere stationaire fasen zijn C8, C4, CN en phenyl. RPLC heeft een brede waaier aan mogelijke toepassingen en is meestal heel reproduceerbaar, wat ervoor zorgt dat dit de meest gebruikte mode is bij HPLC.
b) Normaalfase chromatografie Normaalfase of NP (Normal-Phase) chromatografie is de eerst ontwikkelde HPLC-mode. De stationaire fase is hierbij polairder dan de mobiele fase. Deze methode wordt vooral aangewend voor het scheiden van componenten die onoplosbaar zijn in water. De scheiding gebeurt op basis van polariteit, waarbij de minst polaire structuur het minst geretenteerd is. Apolaire componenten worden niet efficiënt gescheiden met NPLC. Silica (SiO2.xH2O) is één van de gebruikte stationaire fasen in NPLC, maar polair gebonden fasen met amino (-NH2), cyano (-CN) of diol (-CHOHCH2OH) als functionele groepen worden ook veel gebruikt. Onbehandelde silica is minder populair aangezien dit problemen geeft voor het behouden van een constante oppervlakteactiviteit, wat een nefaste invloed heeft op de reproduceerbaarheid. Bij het gebruik van gebonden fasen is de 11
reproduceerbaarheid beter, wat het uitvoeren van gradiënteluties ook mogelijk maakt. Enkele veelgebruikte solventen voor de mobiele fase zijn hexaan, heptaan, isopropanol, methanol, chloroform, dichloormethaan en ethylacetaat. Tot de jaren ’70 was NPLC een heel populaire methode, maar door de opkomst van RPLC nam het gebruik sterk af. Door verbetering van de kolommen wordt NPLC opnieuw meer gebruikt. In dit werk wordt deze techniek aangewend aangezien hierbij de lipiden gescheiden worden op basis van hun klasse. Bij RPLC gebeurt de scheiding eerder volgens de vetzuursamenstelling [6].
c) Hydrofiele interactie chromatografie HILIC (Hydrophilic Interaction (Liquid) Chromatography) kan beschouwd worden als een uitbreiding van NPLC naar een waterige mobiele fase [7]. Acetonitril wordt het meest gebruikt als solvent, alhoewel in principe elk aprotisch solvent dat mengbaar is met water gebruikt kan worden. Voor het uitvoeren van een gradiëntelutie vertrekt men van een mobiele fase die typisch 95% organisch solvent bevat. Elutie wordt bekomen door het watergehalte en zo de hydrofiliciteit van de mobiele fase te verhogen. Er wordt aangenomen dat in een HILIC-systeem de mobiele fase een waterrijke laag vormt op het oppervlak van de polaire stationaire fase, waardoor er vloeistof-vloeistof verdeling gebeurt [7]. De componenten worden verdeeld tussen de quasi-stationaire waterrijke laag en de waterarme mobiele fase. Componenten die meer polair zijn zullen een hogere affiniteit vertonen voor de waterige laag dan minder polaire componenten. De scheiding tussen de componenten gebeurt hier dus ook op basis van polariteit. Er werden verschillende stationaire fasen ontwikkeld voor HILIC. Enkele voorbeelden hiervan zijn silica (met functionele groepen), ionenuitwisselaars [8, 9] en “click”-saccharides [10]. Het verschil in retentieprofiel is redelijk klein aangezien het grootste gedeelte van de scheiding gebeurt tussen de waterige laag op de stationaire fase en de hoofdzakelijk organische mobiele fase. Er is echter nog onduidelijkheid over het mechanisme van HILIC en of er een fundamenteel verschil is met NPLC.
2.3.3. Gaschromatografie (GC) Het concept van GC (Gas Chromatography) werd bedacht in 1941 door A.J.P. Martin en R.L.M. Synge. Hierna duurde het nog 10 jaar vooraleer deze uitvinding in praktijk werd getest [11]. GC is een uitstekende techniek voor de scheiding en analyse van componenten die in de dampfase gebracht kunnen worden zonder dat er ontleding optreedt. 12
2.3.3.1.
GC-opstelling
Een GC-systeem kan voorgesteld worden zoals in figuur 2.7. Het systeem start bij het draaggas (= de mobiele fase). Normaal gezien wordt als draaggas helium (He), waterstofgas (H2) of stikstofgas (N2) gebruikt. Het geïnjecteerde monster wordt met behulp van het draaggas
door
de
kolom
2
gestuurd. De kolom bevindt
5 3
zich in een oven, waarbij het temperatuursprogramma
een
1
bepalende factor is voor de scheiding en retentie. De
snelheid
draaggas
heeft
van een
4
6
het grote
invloed op de kwaliteit van de scheiding en op de analysetijd.
1. Draaggas 2. Injectie 3. Kolom
4. Oven 5. Detectie 6. Data collectie en verwerking
Figuur 2.7: Voorstelling van een GC-opstelling
De optimale snelheid voor het draaggas bij kolommen waarbij N2, He of H2 gebruikt wordt is respectievelijk ongeveer 10 cm/s, 25 cm/s en 40 cm/s. Een kleine variatie in de snelheid van het draaggas heeft het grootste effect bij N2 en het kleinste effect bij H2. He en H2 zijn betere draaggassen aangezien de scheiding veel sneller gaat met eenzelfde efficiëntie als met N2. Na de kolom wordt er gedetecteerd. De bekomen signalen worden verzameld met een computer, waardoor een chromatogram bekomen wordt. Niet alle componenten kunnen met GC geanalyseerd worden. Zo is een analyse van macromoleculen en biologisch interessante componenten wegens hun hoge kookpunten en/of instabiliteit dikwijls niet mogelijk, terwijl deze analyse wel mogelijk is met HPLC. HPLC en GC hebben elk hun voor- en nadelen, beide technieken hebben vele interessante toepassingen en soms kan de ene techniek een aanvulling zijn op de andere.
2.3.3.2.
De injectie bij CGC
De capaciteit van een capillaire kolom ligt meestal tussen de 0,1 en 3000 ng per component die geïnjecteerd wordt, afhankelijk van de karakteristieken van de kolom, de temperatuur en de retentiefactor. De injectie gebeurt meestal automatisch met een micro-spuit waarmee een volume van 1 µL kan geïnjecteerd worden. De precisie en accuratesse van een GC-analyse kan slechts zo goed zijn als deze van de injector. Bij gaschromatografie wordt de injector beschouwd als de achilleshiel van het 13
systeem. Er kan gebruik gemaakt worden van split injectie of splitless injectie. Beide methodes worden hieronder in het kort aangehaald. Bij split injectie wordt het monster in de dampfase gebracht. Na menging met het draaggas wordt de stroom opgesplitst in twee delen, waarvan één deel op de kolom gebracht wordt en het andere deel verwijderd wordt. De verhouding van de twee delen kan gekozen worden door de verhouding van het gasvolume dat door de kolom of naar de afvoer gaat aan te passen. Split injectie is niet geschikt voor monsters waarbij de componenten slechts voorkomen in spoorconcentraties. De concentratie kan dan immers beneden de detectielimiet liggen. Bij dergelijke monsters wordt er gekozen voor splitless injectie, waarbij het geïnjecteerde monster (bijna) volledig in de kolom wordt gebracht. De keuze tussen split of splitless injectie hangt niet enkel af van de concentratie van het monster, maar ook van de gebruikte detector.
2.3.3.3.
Soorten kolommen bij GC
De scheiding is bij GC vrijwel onafhankelijk van de mobiele fase. De interacties die het inerte draaggas aangaat zijn niet specifiek en hebben een gelijke invloed op alle componenten [11]. De stationaire fase heeft echter wel een grote invloed op de scheiding van de componenten. Tegenwoordig worden vrijwel uitsluitend nog open tubulaire capillaire kolommen gebruikt (CGC = capillaire gaschromatografie). De capillaire kolommen zijn uitgevonden door M.J.E. Golay, die de techniek ontwikkelde vanaf 1956 [12]. Wanneer de stationaire fase een vloeistof is, wordt er van een WCOT-kolom (Wall-Coated Open-Tubular) gesproken. Wanneer er een vaste stof als stationaire fase op de wand van de kolom is aangebracht, spreekt men van een PLOT-kolom (Porous-Layer Open-Tubular). De interne diameter van een capillaire kolom is meestal kleiner dan 500 µm, de dikte van de coating bedraagt maximaal enkele µm. De lengte van de kolom is heel variabel, frequent gebruikt men kolommen met een lengte van 25 tot 50 m. Er bestaan verschillende stationaire fases voor CGC. De meest universele en meest gebruikte fase is polydimethylsiloxaan (PDMS), de formule-eenheid van het polymeer is -(CH3)2SiO-. Bij een ongekend monster wordt eerst dit type kolom aangewend. De meeste andere types kolommen hebben dezelfde basisstructuur als PDMS, waarbij een bepaald percentage van de methylgroepen vervangen is door een andere groep. Bij een fenylkolom is deze groep -C6H5. Dit soort kolom kan onder meer bij geneesmiddelen of milieustudies gebruikt worden. Bij een cyanopropylkolom is de groep -(CH2)3CN. Dit soort kolom kan bijvoorbeeld aangewend worden bij vetzuuranalyse of bij onderzoek op dioxines. Bij een 14
polyethyleenglycol-kolom (WAX) is de basisstructuur -CH2CH2O-. Dit is de beste stationaire fase voor de analyse van meer polaire componenten.
2.3.3.4.
Detectoren
Er zijn meerdere types GC-detectoren, waaronder de thermische conductiviteit detector, de electron capture detector, vlamionisatiedetector, stikstof-fosfor detector en de massaspectrometer. De vlamionisatiedetector en de massaspectrometer worden hieronder nader uitgelegd.
a) FID Bij de vlamionisatiedetector (FID = Flame Ionization Detector)
Collectorplaten
wordt het gas afkomstig van de kolom gemengd met H2-gas in een oven. Het gasmengsel wordt verbrand in de aanwezigheid van lucht. De collectorplaten verzamelen de ionen die bij de verbranding gevormd zijn en het signaal wordt gemeten met een ampèremeter. In figuur 2.8 wordt de opstelling van een FID
lucht, 200-300 ml/min
schematisch weergegeven. Enkel organische componenten waarbij het mogelijk is om koolstof of waterstof te oxideren geven hierbij
H2, 50 ml/min
een respons. De respons van de detector is evenredig met het aantal CH2 groepen. De detector is robuust, goedkoop en zeer gevoelig. Heteroatomen verlagen de gevoeligheid van de detector.
Uitlaat van kolom
Figuur 2.8: FID-opstelling
b) MS Alhoewel de ionisatiebron verschillend is, is de werking van de massa-analysator dezelfde als hoger uiteengezet (2.3.2.2.). Bij GC-MS wordt de mobiele fase in hoog-vacuüm gebracht voor de ionisatiebron. Twee belangrijke ionisatietechnieken zijn EI (Electron Impact ionization) en CI (Chemical Ionization). EI wordt het meest gebruikt. De ionen die hierbij gevormd worden kunnen fragmenteren door het verbreken van zwakkere bindingen. Het ion met de hoogste m/z-waarde is meestal afkomstig van de origineel geïoniseerde molecule. Om een voldoende sterk signaal te verkrijgen bij detectie wordt er een elektron multiplier gebruikt.
15
3.
Lipidenonderzoek in biologische vloeistoffen
3.1.
Overzicht van de lipideklassen
Het is moeilijk om een precieze definitie aan lipiden te geven. Dikwijls worden lipiden gedefinieerd als vetten en vetachtige stoffen die goed oplosbaar zijn in organische solventen, aangezien in een (biologisch) monster de extractie van lipiden meestal gebeurt met een organisch solvent (bvb. ether, dichloormethaan, alcoholen). Enkele heel polaire lipiden kunnen echter in de waterige fase terechtkomen bij de fasescheiding, zodat deze definitie zeker niet sluitend is [6].
Lipids
Sterols
Free sterols
Sterol lipids
Fatty acids
Bound sterols Sterol lipids
Glycerolipids
Glycerophospholipids
Sphingolipids
Monoacylglycerols
Phosphatidic acids
Sphingoid bases
Diacylglycerols
Phosphatidylcholines
Ceramides
Triacylglycerols
Phosphatidylserines
Phosphosphingolipids
Phosphatidylinositols
Phosphonosphingolipids
Phosphatidylethanolamines
Neutral glycosphingolipids
Phosphatidylglycerols
Acidic glycosphingolipids
Steryl glycosides
Phosphoinositides Plasmalogens
Figuur 3.1: Overzicht van de verschillende lipideklassen
Een overzicht van de lipideklassen, zoals opgesteld door M.R. Wenk [6], wordt weergegeven in figuur 3.1. De ingekleurde kaders op de figuur geven de klassen weer waarvan er in dit werk standaarden werden gebruikt. Een volledig overzicht van de gebruikte standaarden is te vinden in appendix B. De variatie aan lipideklassen in het menselijk lichaam is groot. Verscheidene lipideklassen vervullen belangrijke biologische functies. Zonder lipiden kan het lichaam niet functioneren, terwijl te hoge concentraties aan lipiden schadelijk zijn. Aangezien de lipiden een zeer ruime groep aan verbindingen omvatten, is het praktisch om ze in te delen in verschillende groepen. Deze classificatie is arbitrair en kan op verschillende 16
manieren gebeuren. Een eenvoudige manier is een onderverdeling in twee groepen: polaire en neutrale (apolaire) lipiden. Hieronder volgt een korte bespreking van deze groepen met hun voornaamste klassen.
3.1.1. Neutrale lipiden De groep van de neutrale lipiden omvat de sterolen, sterolesters, vrije vetzuren en glycerolipiden (in figuur 3.1 zijn dit de Sterols, Sterol lipids, Fatty acids en Glycerolipids). De structuur en enkele belangrijke kenmerken van deze klassen worden besproken.
3.1.1.1.
Vrije vetzuren
Een vetzuur is een carbonzuur, meestal met een lange, onvertakte alifatische keten. Vetzuren kunnen gebonden zijn aan andere moleculen. Wanneer dit niet het geval is, spreekt men van vrije vetzuren. Wanneer de keten verzadigd is, is de chemische formule als volgt: CH3(CH2)nCOOH. Bij onverzadigde natuurlijke vetzuren is de dubbele binding meestal van het cis-type (zie bijvoorbeeld oliezuur in figuur 3.2). In figuur 3.2 worden enkele van de frequent voorkomende vrije vetzuren voorgesteld. CH2(CH2)11CH3
HO O
CH2(CH2)13CH3
HO O
Myristinezuur
CH2(CH2)15CH3
HO O
Palmitinezuur
Stearinezuur CH2(CH2)6CH3
HO H O
H
Oliezuur Figuur 3.2: Enkele veel voorkomende vrije vetzuren
Natuurlijke vetzuren in planten en dieren hebben meestal een even aantal koolstofatomen. Vetzuren met een oneven aantal koolstofatomen komen in de natuur ook voor aangezien sommige bacteriën in staat zijn om deze te synthetiseren.
3.1.1.2.
Glycerolipiden
Deze lipideklasse is verder onder te verdelen in mono-, di- en triglyceriden.
17
Een monoglyceride (of monoacylglycerol) bestaat uit een vetzuur dat via een esterbinding gebonden is aan glycerol (figuur 3.3). Men spreekt van een 1-monoglyceride wanneer de esterbinding zich op één van de buitenste OH functies van glycerol bevindt. Indien het vetzuur gekoppeld is aan de middelste OH functie, spreekt men van een 2-monoglyceride. Bij een diglyceride (of diacylglycerol) zijn er twee vetzuren via
OH
esterbindingen gebonden aan glycerol. Wanneer deze vetzuren voorkomen op de twee buitenste OH functies spreekt men van een 1,3-
HO
diglyceride. Indien ze voorkomen op één van de buitenste en op de
HO
middelste OH functie spreekt men van een 1,2-diglyceride. Het is mogelijk dat hetzelfde vetzuur tweemaal voorkomt op glycerol of dat
Figuur 3.3: Glycerol
er twee verschillende vetzuren op gebonden zijn. Bij een triglyceride (of triacylglycerol) is glycerol veresterd met drie vetzuren. Bij de triglyceriden maakt men dikwijls het onderscheid tussen vetten en oliën, aangezien plantaardige oliën en dierlijke vetten voornamelijk (niet enkel) zijn opgebouwd uit triglyceriden. Wanneer de vetzuren verzadigd zijn, spreekt men van een vet. Als er één of meerdere onverzadigdheden voorkomen, zoals bij plantaardige oliën, zijn de triglyceriden veel moeilijker te stapelen en ligt het smeltpunt veel lager. Die zijn daarom vloeibaar bij kamertemperatuur. Triglyceriden, die fungeren als een energiebron in het lichaam, worden voornamelijk opgenomen uit het vet in de voeding. De energie die eruit gerecupereerd kan worden is mede afhankelijk van het aantal onverzadigdheden.
3.1.1.3.
Sterolen en sterolesters
De meest voorkomende verbinding bij de klasse van de sterolen (deze naam is een contractie van de termen steroïde en alcohol) is cholesterol. Cholesterol (zie figuur 3.4), gemaakt in de lever of H
opgenomen uit de voeding, kan dienen als bouwstof voor lichaamscellen en H
hormonen.
H
HO
Wanneer het alcohol op een sterol met een vetzuur omgezet wordt in een ester,
Figuur 3.4: Cholesterol
18
ontstaat een sterolester. De belangrijkste groep verbindingen hierbij zijn de cholesterolesters.
3.1.2. Polaire lipiden De polaire lipiden worden in figuur 3.1 weergegeven door de klassen Glycerophospholipids en Sphingolipids. De glycerofosfolipiden bezitten een glycerolstructuur waarbij aan één van de hydroxylgroepen een fosfaatgroep met een eenvoudige organische molecule gebonden is. De andere OH
R2
CH3
O
O
O
O O
O
P O
-
+
N H3C
CH3
O
functies zijn veresterd met een vetzuur. Als voorbeeld wordt in figuur 3.5 de structuur van een fosfatidylcholine gegeven. R1 en R2
R1
Figuur 3.5: Fosfatidylcholine
duiden op verschillende mogelijke vetzuren. Een celmembraan bij de mens is een dubbellaag die voornamelijk bestaat uit fosfolipiden: hun hydrofiele kopgroep bevindt zich aan het oppervlak van het membraan, de hydrofobe staart bevindt zich in het midden. De sfingolipiden hebben een sfingosinestructuur als basis. De meest voorkomende vorm van sfingosine is HO
getekend in figuur 3.6. Sfingomyeline komt het meest voor bij de sfingolipiden. De belangrijkste taken van deze lipide zijn de bescherming van de
HO
H (CH2)12CH3
H
NH2
cel en de doorgifte van signalen van de buitenkant naar de binnenkant van de cel. In appendix B
Figuur 3.6: Sfingosine
worden de structuren van de in dit werk gebruikte polaire lipiden weergegeven.
3.2.
Lipidenonderzoek met TLC
Rond 1960 begon het onderzoek naar de scheiding van lipideklassen met behulp van chromatografie. Gedurende de jaren ’60 gebeurde dit onderzoek vooral met TLC. Het gebruik van deze techniek werd kleiner naarmate HPLC meer toegankelijk werd, maar de laatste jaren heeft TLC een comeback gemaakt, voornamelijk dankzij de lage kostprijs van commerciële platen gecoat met silicagel [13, 14]. De afname van de grootte van de silicadeeltjes en de daaruitvolgende betere uniformiteit van de coating van de platen hebben geleid tot wat HPTLC (High Performance TLC) genoemd wordt, waarbij de scheiding van de componenten significant beter is [15].
19
De afmetingen van de platen die gebruikt worden bij de scheiding via TLC zijn meestal 20 cm x 20 cm. Soms worden er ook platen met andere afmetingen gebruikt, zoals 34 cm x 20 cm of 10 cm x 20 cm. Bij TLC is men niet beperkt tot het gebruik van één eluens, het gebeurt veel meer dat er 2 of 3 mobiele fasen gebruikt worden bij de ontwikkeling van de plaat. Na de ontwikkeling in het ene solvent, wordt de plaat gedroogd en kan ze in het volgende solvent geplaatst worden. Er bestaat een eenvoudige verklaring voor het gebruik van meerdere mobiele fasen: via een bepaald eluens is het mogelijk om ofwel de neutrale lipiden te scheiden terwijl de polaire lipiden niet migreren, ofwel de polaire lipiden te scheiden terwijl de neutrale lipiden dichtbij het solventfront blijven met een slechte scheiding in verschillende klassen [16]. Een volledige scheiding kan dus slechts bekomen worden bij het gebruik van meerdere solventen. Een groot voordeel van TLC is dat het toelaat om meerdere monsters tegelijkertijd te analyseren als parallelle banden op de plaat. Wanneer een complex monster moet onderzocht worden, kan 2D-TLC uitgevoerd worden. De plaat wordt daarbij na de eerste ontwikkeling 90° gedraaid waarna een tweede ontwikkeling volgt in een ander solvent. Dit leidt tot een drastische verhoging van de piekcapaciteit. Polaire lipiden kunnen op een goede manier gescheiden worden met een solvent dat bestaat uit chloroform, methanol en water. Neutrale lipiden worden goed gescheiden met een solvent bestaande uit hexaan en aceton of diëthylether [13, 14, 17, 18]. In dit werk worden de lipiden zichtbaar gemaakt door de TLC-plaat te besproeien met een ammoniummolybdaat-oplossing.
Ammoniummolybdaat
kan
door
vele
biologische
componenten in een zure oplossing gereduceerd worden. Het molybdeen komt hierdoor in een blauwe oxidevorm terecht [19]. Blauwe spots op de TLC-plaat geven dus aan waar de lipiden zich bevinden.
3.3.
Lipidenonderzoek met HPLC
HPLC werd rond de jaren ’80 populair als techniek voor het onderzoek op lipideklassen. Eén van de doelstellingen was het scheiden van alle lipideklassen gedurende één analyse. Een belangrijke stap in deze richting kwam er door het werk van Christie [20], die erin slaagde om de belangrijkste lipideklassen te scheiden. Om de lipideklassen, die een groot verschil in polariteit hebben, in één stap te scheiden, was bij normaalfase een gradiëntanalyse aangewezen waarbij het beginsolvent een lage polariteit had en het eindsolvent tot 8% water bevatte.
20
De solventen die gebruikt worden om lipiden te extraheren moeten een hoge oplosbaarheid voor alle lipiden hebben en moeten voldoende polair zijn om de lipiden te verwijderen van de celmembranen en de lipoproteïnen. In 1957 werd door Folch een methode ontwikkeld waarbij lipiden uit biologische monsters geëxtraheerd werden met een overmaat aan chloroform-methanol (2:1, v/v) [21]. De methode is in essentie dezelfde gebleven, behalve enkele kleine aanpassingen zoals de extractievolumes [22 – 24]. De extractieefficiëntie lijkt groter bij een groter volume aangezien een grotere fractie van de organische fase gerecupereerd wordt. De evolutie van de beschikbare detectoren speelde een belangrijke rol bij het onderzoek naar de lipideklassen. UV-detectie kan aangewend worden als techniek [25]. In dit geval is het nodig om bij zeer lage golflengtes (rond de 200 nm) te meten. Ook ESI-MS en APCI-MS zijn goede technieken gebleken voor de detectie van lipiden, waarbij zich echter het probleem voordoet dat verschillende componenten met een verschillende respons gedetecteerd worden [26]. De gevoeligheid van de detectie hangt af van de ketenlengte, het aantal onverzadigdheden, de polaire kopgroep, het solvent en de instellingen van de meetapparatuur. Om deze redenen zijn kwantitatieve analyses via deze methode moeilijk haalbaar. Massadetectoren, zoals de ELSD zijn ook zeer geschikt voor lipidenonderzoek, zowel voor de neutrale als voor de polaire lipiden. In dit werk wordt gebruik gemaakt van CAD (Charged Aerosol Detection, zie 2.3.2.2.). Deze detector leent zich uitstekend tot het lipidenonderzoek [27, 28].
3.4.
Lipidenonderzoek met GC
Omwille van het hoge kookpunt van lipiden is de analyse van de lipideklassen niet zomaar mogelijk via GC. Het is echter wel mogelijk om via GC de samenstelling van de vetzuren bij de lipiden te achterhalen. Omwille van de relatief hoge polariteit is het moeilijk om carbonzuren te scheiden met GC. Om deze reden wordt er voor de analyse een derivatisatie uitgevoerd. De meest populaire derivatisatiemethode voor lipiden is een omestering (= transesterificatie) tot de corresponderende FAME (Fatty Acid Methyl Ester) [29]. Na de omestering volgt de analyse van de FAMEs met GC. Aangezien enkel de vetzuren van de lipiden bepaald worden, is het onmogelijk om via GC te bepalen welke lipideklasse(n) een monster bevat. Daarom is het aangeraden om eerst de verschillende lipideklassen van elkaar te scheiden (vb. via HPLC), zodat men vervolgens via GC de samenstelling van de vetzuren
21
in een bepaalde lipideklasse kan onderzoeken. De detectie van de FAMEs gebeurt dikwijls met MS (Mass Spectrometry) of met FID (Flame Ionization Detection). Vroeger werden de vetzuren eerst afgesplitst van de lipiden door verzeping met natriumhydroxide of kaliumhydroxide, waarna ze gemethyleerd werden. De verzeping bij deze methode gaat echter heel traag. De rechtstreekse omestering van de lipiden, waarbij hydrolyse en verestering in één stap plaatsvinden, gaat veel sneller dan de verzeping. Aangezien slechts één reagens nodig is, is de rechtstreekse omestering niet enkel sneller maar ook eenvoudiger dan verzeping gevolgd door verestering [30]. De reagentia die gebruikt worden bij de methylatie bevatten voornamelijk methanol. Apolaire lipiden zoals triglyceriden en cholesterolesters zijn niet oplosbaar in deze reagentia. Om deze componenten op te lossen kan er bijvoorbeeld dichloormethaan gebruikt worden. De rechtstreekse omestering van lipiden kan via een zuur- of een basegekatalyseerde reactie. Bij zuurgekatalyseerde omestering kan men gebruik maken van waterstofchloride, zwavelzuur, boortrifluoride (BF3) of acetylchloride in methanol [30 – 34]. Er is verwarming nodig om de reactie door te laten gaan. BF3-methanol wordt het meest gebruikt voor de omestering van lipiden. Bij basegekatalyseerde omestering zijn natriummethoxide of kaliumhydroxide in methanol de populairste reagentia. Voordelen van deze methode zijn snelle reactietijden en reactie bij kamertemperatuur; nadelen zijn dat de verestering van de vetzuren en de omestering van de sfingolipiden niet doorgaan en dat er een risico is op verzeping. Er kunnen zich meerdere problemen voordoen bij de bereiding van de esters. De conversie van lipiden naar FAMEs kan onvolledig zijn; de vetzuurcompositie kan tijdens de omestering veranderen; onvolledige extractie van de gevormde FAMEs ... [30] De extractie werkt heel goed met hexaan aangezien de vetzuurketens bij de FAMEs meestal lang zijn, en de FAMEs bijgevolg apolair zijn. De scheiding van de FAMEs gebeurt met capillaire GC, waarbij de retentietijden van de componenten bepaald worden door de polariteit van de stationaire fase. Wanneer complexe mengsels zoals deze van biologische membranen onderzocht worden, is het aangeraden om te werken met een polaire stationaire fase (bijvoorbeeld met een WAX kolom). Hierbij is de retentietijd groter bij een toenemend aantal dubbele bindingen. Minder polaire stationaire fasen volstaan in de meeste gevallen voor scheiding van FAMEs uit biologische monsters zoals plasma. Wanneer men niet-polaire stationaire fasen gebruikt bij de scheiding van de FAMEs, loopt men het risico op overlapping van enkele belangrijke onverzadigde FAMEs.
22
Aangezien onverzadigde vetzuren belangrijk zijn in biologische monsters, werd in dit werk een polaire kolom gebruikt met cyanopropyl siloxaan als stationaire fase.
23
4.
Experimenteel gedeelte
4.1.
Doelstellingen
Het doel van dit werk is om via HPLC en TLC een methode op te stellen om lipideklassen te scheiden. Eenmaal deze doelstelling bereikt is zal via GC gepoogd worden om de vetzuursamenstelling van de verschillende lipideklassen in plasma te onderzoeken.
4.2.
Gebruikte chemicaliën
Aceton, dichloormethaan, isopropanol, methanol en water werden aangekocht bij SigmaAldrich (Bornem, België). Ammoniumformiaat, ammoniumacetaat en chloroform waren afkomstig van Aldrich (Milwaukee, WI, VS). Hexaan werd aangekocht bij Fisher Scientific (Loughborough, Leicestershire, Engeland). Azijnzuur en acetylchloride werden bekomen bij Fluka (Buchs, Zwitserland), mierenzuur bij Biosolve (HA Valkenswaard, Nederland). Alle solventen waren van HPLC-kwaliteit. De lipidestandaarden worden samen met hun leverancier vermeld in appendix B (Janssen is gelegen in Beerse, België; Avantipolar Lipids ligt in Alabaster, AL, VS).
4.3.
Evaluatie van een TLC-methode voor het scheiden van de lipideklassen
Een scheiding van enkele lipideklassen is relatief eenvoudig te bekomen via TLC. TLC is dus een aangewezen techniek om vertrouwd te raken met het onderwerp van dit onderzoek. Hierbij wordt ook een poging ondernomen om de lipiden uit eigeel te scheiden en de verschillende lipiden via extractie te recupereren om verder te gebruiken bij HPLC.
4.3.1. Reagentia en standaarden Als lipidestandaarden werden cholesteryloleaat, trioleïne, cholesterol en oliezuur (CO, TO, C en OA) gebruikt. De concentratie van de oplossingen bedroeg 10 mg/mL; cholesterol werd opgelost in hexaan, de andere standaarden in dichloormethaan. De ammoniummolybdaat-oplossing werd bereid door 1 g ceriumsulfaat, 25 g ammoniummolybdaat tetrahydraat en 13,6 mL geconcentreerd zwavelzuur met water aan te lengen tot 1L.
4.3.2. Instrumentatie Analyses werden uitgevoerd op de analytische silicagel ‘GHLF’-platen van Analtech (Newark, DE, VS). De afmetingen van deze platen zijn 20 cm x 20 cm; de silicagellaag heeft een dikte van 250 µm. 24
4.3.3. Extractie van de lipiden uit eigeel De hiertoe aangewende methode is gebaseerd op deze van Folch [21]. Aan een volledige eierdooier werd 50 mL koude methanol toegevoegd. Het geheel werd 15’ in een ultrasoonbad en in een centrifuge geplaatst. Aan het supernatant werd 100 mL dichloormethaan toegevoegd, waarna gedurende 30’’ hevig geschud werd. Vervolgens werd er 50 mL water toegevoegd, waarna het geheel opnieuw 15’ in een ultrasoonbad en in een centrifuge werd geplaatst. De bodemfractie met dichloormethaan werd verdampt, vervolgens werd deze opnieuw opgelost in dichloormethaan tot een concentratie van 100 mg/mL.
4.3.4. Methode Op een TLC-plaat werd links een mengsel gespot van de 4 standaarden, elk bij een concentratie van 2,5 mg/mL. Daarnaast werd over de rest van de plaat het extract van het ei gespot. De spots werden aangebracht op 2 cm van de onderkant van de plaat. De scheiding van de lipiden werd uitgevoerd zoals in een artikel van Pucsok [18]. De eerste ontwikkeling gebeurde met het mengsel chloroform-methanol-water (65:25:4), waarbij men het solvent tot 8 cm boven de oorspronkelijke spots liet stijgen. Na het drogen werd de plaat in dezelfde richting ontwikkeld met het mengsel hexaan-aceton (100:10). Ditmaal liet men het solvent stijgen tot 17 cm boven de oorspronkelijke spots. Na het drogen werden de spots zichtbaar gemaakt door de plaat te besproeien met de ammoniummolybdaat-oplossing. Hierbij werd enkel de linkerzijde (= het A-gedeelte) van de plaat besproeid. De silicagel werd van de rechterzijde (= het B-gedeelte) geschraapt en er werd een poging gedaan om de lipiden hieruit opnieuw te extraheren met een dichloormethaan-methanol (2:1) oplossing.
4.3.5. Resultaten en bespreking Met de methode zoals beschreven in 4.3.4. werd het resultaat in figuur 4.1 bekomen. De standaarden (links) werden aangeduid en de zichtbare spots afkomstig van het eigeel (2de band van links) werden omkaderd. Het is duidelijk dat er triglyceriden, cholesterol en vrije vetzuren in het eigeel aanwezig zijn; cholesterolesters zijn hier niet abundant genoeg om zichtbaar te zijn. De onderste fracties zijn waarschijnlijk fosfolipiden [18]. Bij de spots in het A-gedeelte van de plaat is het mogelijk om de Rf-waarden van de verschillende componenten te bepalen. De Rf-waarde van OA, C, TO en CO zijn respectievelijk 0,37; 0,47; 0,75 en 0,96. Van het B-gedeelte werden de omkaderde fracties afgeschraapt van de plaat en apart verzameld. Vervolgens werd gepoogd om de lipiden hieruit opnieuw te extraheren. De lipiden 25
zouden na deze stap gebruikt kunnen worden bij de metingen
CO
met HPLC. Enkele testen in HPLC toonden aan dat dit niet
TO
succesvol was, mogelijks was er onvoldoende extractie of was de hoeveelheid eigeel te laag.
C OA
De scheiding zoals in figuur 4.1 combineert de voordelen van de twee mobiele fasen.
2 cm
Indien enkel de eerste mobiele fase gebruikt wordt, kunnen de
A
B
Figuur 4.1: TLC-scheiding met standaarden en eigeel
polaire lipiden op een mooie manier gescheiden worden. De neutrale lipiden worden in dit solvent echter niet gescheiden, deze blijven bij het solventfront. Indien enkel de tweede mobiele fase gebruikt zou worden, verandert de positie van de polaire lipiden niet, terwijl de neutrale lipiden wel goed worden gescheiden.
4.3.6. Conclusie Met behulp van TLC kunnen lipideklassen zoals de cholesterolesters, triglyceriden, cholesterol en vrije vetzuren relatief eenvoudig gescheiden worden. Wegens de grootte van de spots ten opzichte van de lengte van de TLC-plaat lijkt het onwaarschijnlijk dat deze methode de mogelijkheid zou bieden om veel lipideklassen te scheiden.
4.4.
Analyse van lipiden via HPLC
Er werd reeds heel wat onderzoek uitgevoerd omtrent dit onderwerp. Enkele mooie voorbeelden omtrent de scheiding worden gegeven in de artikels van Christie en Silversand [20, 35]. Het laatste werd aangewend als uitgangspunt voor de ontwikkeling van een eigen procedure. Het doel was hierbij om uiteindelijk de verschillende lipideklassen te scheiden zodat ze preparatief opgevangen konden worden voor verdere analyse van de individuele vetzuursamenstelling van elke klasse.
26
4.4.1. Evaluatie van een silica-kolom voor het scheiden van lipideklassen In de literatuur omtrent het lipidenonderzoek wordt voornamelijk gebruik gemaakt van normaalfase vloeistofchromatografie (NPLC) aangezien de mobiele fases die hierbij gebruikt worden toelaten om het monster op te lossen. Kolommen met silica of diol worden het meest gebruikt. In het eerste deel van het onderzoek werd getracht om met een silica-kolom goede scheidingen te bekomen. De gebruikte kolom wordt gecommercialiseerd als een HILICkolom, maar de stationaire fase is eigenlijk gewone ongederivatiseerde silica die dus toelaat om zowel NPLC als HILIC analyses uit te voeren.
4.4.1.1.
Instrumentatie
De experimenten werden uitgevoerd op een Alliance, Waters 2690 (Milford, MA, VS). Dit systeem was uitgerust met een quaternaire pomp, een ontgasser, een automatische injector en een Corona CAD-detector (ESA Analytical, Aylsbury, Buckinghamshire, Engeland). De N2druk bij de detector bedroeg 35 psi en het detectiebereik was 500 pA. Het systeem werd manueel bestuurd en de datacollectie en –verwerking gebeurden met een PeakSimple Chromatografie Data Systeem (model 202) en bijhorende PeakSimple software (SRI Instruments, Torrance, CA, VS). De kolom die gebruikt werd was een Atlantis HILIC Silica (5 µm) kolom, 250 x 4,6 mm (Waters, Milford, MA, VS).
4.4.1.2.
Aangewende methodes
De gehanteerde strategie verliep als volgt: eerst werd de analyse van de neutrale lipiden ontwikkeld, vervolgens werd een methode ontwikkeld voor de analyse van de polaire lipiden en tenslotte werden er manieren bestudeerd om alle lipideklassen gelijktijdig te scheiden. Alle experimenten werden uitgevoerd bij kamertemperatuur. Bij de metingen werd een lineaire gradiënt gebruikt. De detectie gebeurde steeds met de CAD-detector.
a) Condities ontwikkeld voor de analyse van neutrale lipiden De concentraties van de stockoplossingen van cholesteryloleaat, trioleïne, oliezuur, cholesterol, het diglyceride en het monoglyceride bedroegen 10 mg/mL. Deze standaarden werden opgelost in een solvent bestaande uit 5% dichloormethaan en 95% hexaan. De uiteindelijke concentratie bedroeg 50 µg/mL. Bij elke analyse werd 10 µL geïnjecteerd.
27
Het verloop van de samenstelling van de mobiele fase wordt weergegeven in tabel 4.1. Tijd (min) 0 4 29 36 37 52 53 70
Debiet Hexaan Hexaan - isopropanol Isopropanol - mierenzuur (mL/min) 80 - 20 100 - 0,4 97 3 97 3 100 0,5 100 100 100 97 3 97 3
Tabel 4.1: Gradiëntcondities aangewend voor de analyse van neutrale lipiden waarbij geen zuur toegevoegd werd aan de mobiele fase
Identieke metingen (met uitzondering van het ontbreken van het monoglyceride) werden uitgevoerd met 0,5% azijnzuur in de eerste twee solventlijnen. Het verloop van de samenstelling van de mobiele fase wordt weergegeven in tabel 4.2. Tijd (min) 0 4 29 36 37 52 53 70
Debiet Hexaan - azijnzuur (mL/min) 100 - 0,5 97 97 0,5
Hexaan - isopropanol - azijnzuur 80 - 20 - 0,5 3 3 100 100
Isopropanol - mierenzuur 100 - 0,4
100 100 97 97
3 3
Tabel 4.2: Gradiëntcondities aangewend voor de analyse van neutrale lipiden met azijnzuur in de mobiele fase
b) Condities ontwikkeld voor de analyse van polaire lipiden De concentraties van de stockoplossingen van sfingomyeline, fosfatidylethanolamine, fosfatidylserine, fosfatidylinositol en fosfatidylcholine bedroegen 10 mg/mL. Deze standaarden werden opgelost in een solvent bestaande uit 5% dichloormethaan en 95% isopropanol. De uiteindelijke concentratie bedroeg 40 µg/mL. Bij elke analyse werd 10 µL geïnjecteerd. Het verloop van de samenstelling van de mobiele fase wordt weergegeven in tabel 4.3. Bij het buffersolvent bedroegen de concentraties van ammoniumformiaat en mierenzuur 20 mM. Tijd
Debiet
Hexaan - isopropanol
Isopropanol - H2O - ammoniumformiaatbuffer
Isopropanol - mierenzuur
(min) 0 25 63 64 78 79 100
(mL/min)
80 - 20 95 70 70
80 - 20 - 20 mM 5 30 30
100 - 0,4
0,5
100 100 95 95
5 5
Tabel 4.3: Gradiëntcondities aangewend voor de analyse van polaire lipiden met een ammoniumformiaatbuffer in de mobiele fase
28
Bij het gebruik van een ammoniumacetaatbuffer werden dezelfde standaarden opgelost in een solvent bestaande uit 55% dichloormethaan en 45% hexaan. De uiteindelijke concentratie bedroeg 40 µg/mL. Bij elke analyse werd 10 µL geïnjecteerd. Het verloop van de samenstelling van de mobiele fase wordt weergegeven in tabel 4.4. Bij het buffersolvent bedroegen de concentraties van ammoniumacetaat en azijnzuur 20 mM. Bij het spoelen met 0,4% mierenzuur in isopropanol werd een debiet van 0,7 mL/min aangewend aangezien een hoger debiet zorgde voor een te hoge druk bij het HPLC-systeem. Tijd
Debiet
Hexaan - isopropanol
Isopropanol - H2O - ammoniumacetaatbuffer
Isopropanol - mierenzuur
(min) 0 25 44 45 46 56 57 62 70
(mL/min) 1 1 1 0,7 0,7 0,7 0,7 1 1
80 - 20 95 70 70 70
80 - 20 - 20 mM 5 30 30 30
100 - 0,4
100 100 95 95 95
5 5 5
Tabel 4.4: Gradiëntcondities aangewend voor de analyse van polaire lipiden met een ammoniumacetaatbuffer in de mobiele fase
c) Aangewende condities voor de analyse van neutrale en polaire lipiden De concentraties van de stockoplossingen van cholesteryloleaat, trioleïne, oliezuur, cholesterol, het diglyceride, het monoglyceride, sfingomyeline, fosfatidylethanolamine, fosfatidylserine, fosfatidylinositol en fosfatidylcholine bedroegen 10 mg/mL. Deze standaarden werden opgelost in een solvent bestaande uit 5% dichloormethaan en 95% isopropanol. De concentratie van de neutrale lipiden bedroeg 20 µg/mL, voor de polaire lipiden was dit 50 µg/mL. Bij elke analyse werd 10 µL geïnjecteerd. Het verloop van de samenstelling van de mobiele fase wordt weergegeven in tabel 4.5. Tijd (min) 0 4 29 81 82 101 102 120
Debiet Hexaan (mL/min) 97 97 0,5
Hexaan - isopropanol 80 - 20 3 3 100 48
Isopropanol - H2O 80 - 20
Isopropanol - mierenzuur 100 - 0,4
52 100 100
97 97
3 3
Tabel 4.5: Gradiëntcondities aangewend voor de analyse van neutrale en polaire lipiden zonder additieven in de mobiele fase
Identieke metingen werden uitgevoerd met 20 mM ammoniumacetaatbuffer in de derde solventlijn.
29
4.4.1.3.
Resultaten en bespreking
a) Resultaten voor de analyse van de neutrale lipiden Figuren 4.2 en 4.3 tonen de chromatogrammen bekomen bij de analyse van de neutrale lipiden onder de hierboven beschreven condities. In de analyse in figuur 4.3 werd geen monoglyceride geïnjecteerd. Een opvallend feit is de twee pieken die geobserveerd worden voor het diglyceride. Bij de productinformatie van Sigma-Aldrich staat vermeld dat ongeveer 85% van het product aanwezig is als het 1,3-isomeer en ongeveer 15% als het 1,2-isomeer. Hieruit kan afgeleid worden dat de eerste piek afkomstig is van het 1,3-isomeer en de tweede piek van het 1,2-isomeer. Dit kan ook enigszins verwacht worden daar de resterende polaire OH-groep van het 1,2-isomeer veel meer toegankelijk is voor polaire interacties dan de OH-
Respons (mV)
groep van het 1,3-isomeer. 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 -50
1,3-DOG CO TO
C MOG
OA
0
5
10
1,2-DOG
15
20
25
30
35
Tijd (min)
Figuur 4.2: Analyse van de neutrale lipiden zonder toegevoegd zuur; voor condities: zie §4.4.1.2.a en tabel 4.1
Bij
vergelijking
van
de
scheiding
tussen
de
cholesterolesters en triglyceriden groter is wanneer zuur aanwezig is in de mobiele fase. Merk op dat in het experiment in tabel 4.1 ook zuur
gebruikt
wordt.
De
Respons (mV)
figuren 4.2 en 4.3 blijkt dat
500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0
CO
1,3-DOG
C
TO
1,2-DOG OA
0
5
10
15
20
Tijd (min)
Figuur 4.3: Analyse van de neutrale lipiden met azijnzuur; voor condities: zie §4.4.1.2.a en tabel 4.2
functie hiervan is echter om de kolom te spoelen na analyse, het zuur neemt niet actief deel aan de scheiding zelf. Bij een zure mobiele fase is de retentietijd van de vrije vetzuren korter. Door protonatie van de 30
carboxylfunctie wordt het vrije vetzuur minder polair en daarom ook minder geretenteerd bij normaalfase HPLC. Onder invloed van het zuur komt cholesterol dichter te liggen bij de eerste piek van het diglyceride.
b) Resultaten voor de analyse van de polaire lipiden Bij de eerst uitgevoerde metingen werd, naar analogie met het artikel van Silversand [35], 0,08% triëthylamine toegevoegd aan de mobiele fase. Het gebruik van dit additief wordt echter afgeraden in combinatie met de CAD-detector. Bovendien konden zonder additie van triëthylamine betere piekvormen bekomen worden. Deze observatie strookt dus niet met de conclusies van Silversand et al. Waarschijnlijk is dit gerelateerd aan de zuiverheid van de silica-fase in het materiaal; dit punt werd echter niet verder bestudeerd. Er werden testen uitgevoerd zonder additieven, met toevoeging van azijnzuur of van mierenzuur in de eerste 2 solventlijnen. Via deze testen was een scheiding van alle polaire standaarden echter niet mogelijk, zodat getracht werd om de scheiding te verbeteren via bufferoplossingen van ammoniumformiaat en ammoniumacetaat. Van deze buffers is bekend dat ze een goed additief zijn voor de scheiding van fosfolipiden [36]. Zoals te zien is in figuur 4.4 wordt met de aangelegde gradiënt (waarbij gebruik gemaakt wordt van een ammoniumformiaatbuffer zoals aangeduid in tabel 4.3) echter geen scheiding bekomen tussen fosfatidylserine en -inositol enerzijds en fosfatidylcholine en sfingomyeline anderzijds. In plasma zijn fosfatidylcholines echter abundant, het apart verkrijgen van deze
Respons (mV)
klasse is derhalve belangrijk voor dit werk.
600 500 400 300 200 100 0 -100
PC36:2+SPM PE36:2 PS+PI
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Tijd (min) Figuur 4.4: Analyse van de polaire lipiden met een ammoniumformiaatbuffer; voor condities: zie §4.4.1.2.b en tabel 4.3
De scheiding bekomen bij de analyse met behulp van de ammoniumacetaatbuffer in figuur 4.5 is beter dan wat bekomen kon worden door gebruik te maken van de ammoniumformiaatbuffer. Sfingomyeline is bijna volledig gescheiden van fosfatidylcholine. 31
Bij een debiet van 0,5 mL/min wordt de scheiding van deze standaarden iets beter, maar ze blijft onvolledig. Waarschijnlijk is de betere scheiding bij een lager debiet te wijten aan het feit dat het optimale debiet voor dit type lipiden een stuk lager ligt dan wat courant wordt aangenomen op basis van de analyse van kleine moleculen [37]. Om de scheiding verder te verbeteren is het mogelijk om het watergehalte in de mobiele fase te verlagen en zo de
Respons (mV)
retentie te verhogen. 400 350 300 250 200 150 100 50 0 -50
PC36:2 SPM
PE36:2 PS+PI
0
5
10
15
20
25
30
35
Tijd (min) Figuur 4.5: Analyse van de polaire lipiden met een ammoniumacetaatbuffer; voor condities: zie §4.4.1.2.b en tabel 4.4
c) Resultaten voor de analyse van de neutrale en polaire lipiden De resultaten bekomen bij de analyse van alle lipideklassen samen op de zuivere silica worden weergegeven in figuur 4.6. In figuur 4.6A worden de neutrale lipiden geanalyseerd zoals in figuur 4.2. De scheiding tussen de polaire lipiden is bij deze methode echter niet optimaal. In figuur 4.6B is bij het neutraal gedeelte een grote verandering te zien. Voor de metingen bij de figuren 4.6A en 4.6B werd hetzelfde monster gebruikt en de condities gedurende de eerste 29 min waren identiek. De meest logische verklaring voor de verandering bij het neutrale gedeelte is dat de solventsamenstelling van het monster (5% dichloormethaan en 95% isopropanol) niet geschikt is voor de neutrale lipiden. Om reproduceerbare metingen te verkrijgen bij het analyseren van monsters met neutrale lipiden wordt hierna gebruik gemaakt van solventen met een hoog hexaangehalte, zodat de eluerende kracht van de solventplug zo hoog mogelijk is. De scheiding van de polaire lipiden in figuur 4.6B is beter dan bij figuur 4.6A, maar zeker niet optimaal.
32
Respons (mV)
Polair gedeelte
900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 -100
Neutraal gedeelte
A
PC36:2+SPM PE36:2
CO TO
1,3-DOG OA
0
5
10
15
C 1,2-DOG
20
25
MOG
30
PS+PI
35
40
45
50
55
60
65
70
75
Respons (mV)
Tijd (min)
B
Polair gedeelte
700 600 500 400 300 200 100 0 -100
Neutraal gedeelte PC36:2 +SPM
PE36:2 TO CO X
0
5
OA
10
15
DOG+C
20
MOG
25
30
PS+PI
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
Tijd (min)
Figuur 4.6: Analyse van de neutrale en polaire lipiden (A) zonder additieven en (B) met een ammoniumacetaatbuffer; voor condities: zie §4.4.1.2.c en tabel 4.5
4.4.1.4.
Conclusies bij het gebruik van een silica-kolom
Met de gebruikte silica-kolom kon een goede scheiding van de neutrale lipiden bekomen worden. De scheiding tussen cholesterolesters en triglyceriden werd hierbij beter door additie van azijnzuur. Bij de analyse van de polaire lipiden werden de beste resultaten bekomen met een ammoniumacetaatbuffer. Een echte scheiding van de polaire lipiden werd echter niet bekomen bij deze kolom. Daarom werd besloten om een ander kolomtype aan te wenden.
4.4.2. Evaluatie van een diol-kolom voor het scheiden van lipideklassen Behalve silica-kolommen wordt in de literatuur ook dikwijls gebruik gemaakt van diolkolommen voor de scheiding van lipideklassen [28, 32, 35]. Voor de polaire lipiden kan een beter resultaat verwacht worden bij een diol-kolom: de OH-groepen maken de diol-kolom meer polair dan een kolom met zuivere silica. De retentie van meer polaire componenten zou dus groter moeten zijn, aldus ook de scheiding tussen deze componenten.
4.4.2.1.
Instrumentatie
De gebruikte instrumentatie is dezelfde als deze in paragraaf 4.4.1.1. In dit gedeelte wordt gebruik gemaakt van 2 kolommen gepakt met dezelfde stationaire fase maar die verschillen in lengte en interne diameter. Kolom A: SFC Diol (5 µm), 250 x 4,6 mm (Princeton, Cranbury, NJ, USA) Kolom B: SFC Diol (5 µm), 150 x 3,0 mm (Princeton, Cranbury, NJ, USA) 33
4.4.2.2.
Aangewende methodes
De aangewende strategie met de diol-kolom is vergelijkbaar met de aanpak beschreven voor de silica-kolom (zie §4.4.1.2.). Eenmaal de analyse van de neutrale en de polaire lipiden geoptimaliseerd was, werd opnieuw naar een manier gezocht om alle lipideklassen gelijktijdig te scheiden. Alle experimenten werden uitgevoerd bij kamertemperatuur. Bij de metingen werd een lineaire gradiënt gebruikt. De detectie gebeurde steeds met de CAD-detector.
a) Condities ontwikkeld voor de analyse van neutrale lipiden Om op een eenvoudige manier een idee te krijgen omtrent het verschil in scheiding tussen de diol- en de silica-kolom, werden scheidingen uitgevoerd onder identieke condities als bij figuren 4.2 en 4.3. De concentraties van de stockoplossingen van cholesteryloleaat, trioleïne, oliezuur, cholesterol, het diglyceride en het monoglyceride bedroegen 10 mg/mL. Deze standaarden werden opgelost in een solvent bestaande uit 5% dichloormethaan en 95% hexaan. De uiteindelijke concentratie bedroeg 50 µg/mL. Bij elke analyse werd 10 µL geïnjecteerd. De kolom die hier gebruikt werd is de SFC Diol 250 mm x 5 µm x 4,6 mm. Het verloop van de samenstelling van de mobiele fase wordt weergegeven in tabellen 4.1 en 4.2 (zie §4.4.1.2.a).
b) Condities ontwikkeld voor de analyse van polaire lipiden De concentraties van de stockoplossingen van sfingomyeline, fosfatidylethanolamine, serine, -inositol, -choline en lysofosfatidylcholine bedroegen 10 mg/mL. Deze standaarden werden opgelost in een solvent bestaande uit 90% dichloormethaan en 10% isopropanol. De uiteindelijke concentratie bedroeg 40 µg/mL. Bij elke analyse werd 5 µL geïnjecteerd. De kolom die hier gebruikt werd is de SFC Diol 150 mm x 5 µm x 3 mm. Het verloop van de samenstelling van de mobiele fase wordt weergegeven in tabel 4.6. Bij het buffersolvent bedroegen de concentraties van ammoniumacetaat en azijnzuur 20 mM. Tijd (min) 0 15 60 61 76 77 95
Debiet Hexaan - isopropanol (mL/min) 80 - 20 95 80 80 0,3 95 95
Isopropanol - H2O - ammoniumacetaatbuffer 80 - 20 - 20 mM 5 20 20
Isopropanol - mierenzuur 100 - 0,4
100 100 5 5
Tabel 4.6: Gradiëntcondities aangewend voor de analyse van polaire lipiden met een ammoniumacetaatbuffer in de mobiele fase
34
c) Condities ontwikkeld voor de analyse van neutrale en polaire lipiden Eerst werd de bestaande methode voor de neutrale lipiden gekoppeld aan deze voor de polaire lipiden. Alle standaarden die in appendix B vermeld worden werden hier gebruikt. De standaarden werden opgelost in een solvent bestaande uit 10% dichloormethaan, 10% isopropanol en 80% hexaan. De uiteindelijke concentratie bedroeg 100 µg/mL. Bij elke analyse werd 10 µL van dit solvent geïnjecteerd. De kolom die hier gebruikt werd is de SFC Diol 250 mm x 5 µm x 4,6 mm. Het verloop van de samenstelling van de mobiele fase wordt weergegeven in tabel 4.7. Bij het buffersolvent bedroegen de concentraties van ammoniumacetaat en azijnzuur 20 mM. Tijd
Debiet
(min) (mL/min) 0 4 29 49 71 0,5 87 88 103 104 125
Hexaan - azijnzuur
Hexaan - isopropanol - azijnzuur
Isopropanol - H2O - ammoniumacetaatbuffer
Isopropanol - mierenzuur
100 - 0,5 97 97
80 - 20 - 0,5 3 3 100 80 80 64
80 - 20 - 20 mM
100 - 0,5
20 20 36 100 100
97 97
3 3
Tabel 4.7: Oorspronkelijke gradiëntcondities aangewend voor de analyse van neutrale en polaire lipiden met azijnzuur en een ammoniumacetaatbuffer in de mobiele fase
Een betere scheiding werd bekomen met de gradiënt uit tabel 4.8. Alle standaarden die in appendix B vermeld worden werden hier gebruikt. De standaarden werden opgelost in een solvent bestaande uit 25% dichloormethaan en 75% hexaan. De uiteindelijke concentratie bedroeg 500 µg/mL. Bij elke analyse werd 5 µL geïnjecteerd. De kolom die hier gebruikt werd is de SFC Diol 250 mm x 5 µm x 4,6 mm. Het verloop van de samenstelling van de mobiele fase wordt weergegeven in tabel 4.8. Bij het buffersolvent was de concentratie van ammoniumacetaat 20 mM. Het solvent werd verder met azijnzuur aangezuurd tot pH 3. Tijd
Debiet
(min) (mL/min) 0 4 29 30 65 0,5 66 80 81 110
Hexaan - azijnzuur
Dichloormethaan - isopropanol - azijnzuur
Isopropanol - H2O - ammoniumacetaatbuffer
100 - 0,5 97 97
50 - 50 - 0,5 3 3 100 80 80
50 - 50 - 20 mM pH 3
Isopropanol
20 20 100 100
97 97
3 3
Tabel 4.8: Geoptimaliseerde gradiëntcondities aangewend voor de analyse van neutrale en polaire lipiden met azijnzuur en een ammoniumacetaatbuffer in de mobiele fase
35
d) Extractie van lipiden uit plasma en analyse van plasmastalen met een diol-kolom De methode voor de extractie van lipiden uit plasma is gebaseerd op deze van Folch [21] en vertoont een zekere analogie met de extractie van lipiden uit eigeel zoals beschreven is in 4.3.3. Aan 100 µL plasma werd 1,5 mL dichloormethaan-methanol (2:1) toegevoegd. De oplossing werd gedurende 30” hevig geschud en vervolgens gedurende 15’ in een centrifuge geplaatst. Aan het supernatant werd 6 mL water toegevoegd, waarna de oplossing gedurende 30” hevig geschud werd en 15’ in een centrifuge werd geplaatst. De bodemfractie met dichloormethaan werd verdampt, vervolgens werden de lipiden opgelost in 50 µL dichloormethaan en 150 µL hexaan. Bij injectie werd 10 µL van deze oplossing geïnjecteerd. De kolom die hier gebruikt werd is de SFC Diol 250 mm x 5 µm x 4,6 mm. Het verloop van de samenstelling van de mobiele fase wordt weergegeven in tabel 4.8.
e) Extractie van lipiden uit eigeel en analyse van eieren met een diol-kolom De methode voor de extractie van lipiden uit eigeel staat beschreven in paragraaf 4.3.3. De concentratie van het eigeel bedroeg 50 mg/mL. Het solvent bestond uit 25% dichloormethaan en 75% hexaan. Het injectievolume was 10 µL. De kolom die hier gebruikt werd is de SFC Diol 250 mm x 5 µm x 4,6 mm. Het verloop van de samenstelling van de mobiele fase wordt weergegeven in tabel 4.8.
4.4.2.3.
Resultaten en bespreking
a) Resultaten voor de analyse van de neutrale lipiden De chromatogrammen die bekomen werden voor de analyse van de neutrale lipiden worden weergegeven in figuur 4.7. X1 en X2 op chromatogram B zijn ook aanwezig bij een blanko-injectie van 10 µL van het solvent (5% dichloormethaan en 95% hexaan). Bij vergelijking van figuur 4.7A en figuur 4.2 worden een aantal verschillen zichtbaar. Bij de diol-kolom is de piek van oliezuur veel scherper. De reden hiervoor werd niet meteen gevonden. Cholesterol komt nu net na het 1,2-isomeer van het diglyceride. Een belangrijk voordeel van deze kolom met het oog op latere fractionatie is de grotere scheiding tussen cholesteryloleaat en trioleïne. Wanneer de scheiding plaatsvindt met een half procent azijnzuur komen de pieken van cholesteryloleaat en trioleïne iets dichter bij elkaar. Het zuur verhoogt de polariteit van de mobiele fase immers, waardoor deze componenten nog sneller elueren. Oliezuur wordt onder invloed van azijnzuur geprotoneerd, daardoor wordt het minder polair en dus ook minder geretenteerd. Hierdoor wordt oliezuur gescheiden van het diglyceride. Cholesterol komt 36
tussen de pieken van het diglyceride te liggen onder invloed van het zuur. Aangezien oliezuur volledig afgescheiden wordt kan uit figuur 4.7 geconcludeerd worden dat de scheiding van de
Respons (mV)
neutrale lipiden bevorderd wordt onder zure omstandigheden. OA
950 850 750 650 550 450 350 250 150 50 -50
A
1,3-DOG CO
C
TO
MOG
1,2-DOG
0
5
10
15
20
25
30
35
Respons (mV)
Tijd (min)
600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 -50
B
1,3-DOG CO TO
MOG
C
X1
1,2-DOG
X2
OA
0
5
10
15
20
25
30
35
Tijd (min) Figuur 4.7: Analyse van de neutrale lipiden (A) zonder toegevoegd zuur (tabel 4.1) en (B) met 0,5% azijnzuur in de eerste twee solventlijnen (tabel 4.2); voor condities: zie §4.4.2.2.a
b) Resultaten voor de analyse van de polaire lipiden Figuur 4.8 geeft een typisch chromatogram voor de analyse van de polaire lipidestandaarden met een diol-kolom. Bij de silica-kolom leverde de analyse van de polaire lipiden de grootste problemen. Bij het analyseren van biologische vloeistoffen is het voor de polaire lipiden vooral belangrijk om de klasse van de fosfatidylcholines te kunnen isoleren. Deze lipiden zijn immers relatief abundant
in
biologische
vloeistoffen
en
de
studie
van
de
corresponderende
vetzuursamenstelling is dan ook zeer interessant. Uit het chromatogram in figuur 4.8 blijkt dat fosfatidylethanolamine, -choline, -inositol en lysofosfatidylcholine gescheiden kunnen 37
worden, fosfatidylserine overlapt echter met de tweede piek van sfingomyeline. De twee verschillende pieken bij SPM en LPC worden veroorzaakt door verschillende vetzuren die gesubstitueerd zijn op deze standaarden. Deze scheiding toont aan dat de diol-kolom betere
Respons (mV)
perspectieven biedt dan de silica-kolom, vooral bij het scheiden van de polaire lipiden. 300 270 240 210 180 150 120 90 60 30 0
PE36:2 PC36:2
SPM+PS PI
0
5
10
15
20
25
30
35
40
LPC
45
50
Tijd (min) Figuur 4.8: Analyse van de polaire lipiden met een ammoniumacetaatbuffer; voor condities: zie §4.4.2.2.b en tabel 4.6
c) Resultaten voor de analyse van de neutrale en polaire lipiden Figuur 4.9 toont het resultaat van de scheiding waarbij de gradiënt uit tabel 4.7 aangewend werd. Via deze methode worden de neutrale lipiden normaal gescheiden maar treden er grote veranderingen op in het gedeelte van de polaire lipiden. De veranderingen ten opzichte van figuur 4.8 kunnen grotendeels verklaard worden door de aanwezigheid van azijnzuur in de solventlijn met hexaan-isopropanol. De scheiding van de polaire lipiden kan iets verbeterd worden door een langere isocratische stap, maar hiermee wordt fosfatidylcholine niet gescheiden van SPM. Het resultaat uit figuur 4.9 was niet veelbelovend voor de polaire
Respons (mV)
fractie, zodat gezocht werd naar andere mobiele fasen voor het uitvoeren van de scheiding. 600 500 400 300 200 100 0 -100
LPC CO
TO
1,3-DOG C OA
0
10
SPM+PS MOG
20
30
PC36:2
PE36:2
1,2-DOG
40
50
60
PI
70
80
90
Tijd (min) Figuur 4.9: Analyse van de neutrale en polaire lipiden met azijnzuur en een ammoniumacetaatbuffer; voor condities: zie §4.4.2.2.c en tabel 4.7
38
Er werd daarom gekozen om een methode uitgewerkt door Christie [20] te testen. In het artikel waren de solventlijnen als volgt: isoöctaan-tetrahydrofuran (99:1) in lijn A, isopropanol-chloroform (4:1) in lijn B en isopropanol-water (1:1) in lijn C. Hexaan en dichloormethaan werden gebruikt in plaats van isoöctaan en chloroform. Een test van Christie’s methode leverde een goed vooruitzicht voor de afscheiding van PC. Om een goede scheiding te bekomen werden meerdere veranderingen aan de methode doorgevoerd. Tetrahydrofuran had geen merkbare positieve invloed en werd dus verwijderd. Aan solventlijn A en B werd opnieuw 0,5% azijnzuur toegevoegd wegens het reeds aangetoonde positieve effect op de neutrale lipiden. Een te hoge verhouding isopropanol/dichloormethaan in lijn B zorgde voor overlap van enkele polaire lipiden, betere resultaten werden bekomen bij een 1:1 verhouding van deze twee solventen. In solventlijn C werd opnieuw de ammoniumacetaatbuffer toegevoegd aangezien deze buffer een positief effect heeft op de scheiding van de fosfolipiden. Testen waarbij de ammoniumacetaatbuffer werd aangezuurd tot pH 3 leverden betere resultaten. Om de kolom te spoelen werd puur isopropanol in lijn D toegevoegd. Na alle aanpassingen werd de gradiënt uit tabel 4.8 bekomen.
Respons (mV)
Figuur 4.10 toont het resultaat van de scheiding die met deze gradiënt werd bekomen. 1,3-DOG
900 850 800 750 700 650 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 -50
MOG C CO TO PE36:2 1,2-DOG
OA
PC36:2 PI+PS
SPM
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
LPC
55
60
Tijd (min)
Figuur 4.10: Analyse van de neutrale en polaire lipiden met azijnzuur en een ammoniumacetaatbuffer; voor condities: zie §4.4.2.2.c en tabel 4.8
Bij deze methode is er een gedeeltelijke overlapping tussen het diglyceride en cholesterol; fosfatidylinositol en -serine worden niet van elkaar gescheiden. Tussen de overige standaarden is de scheiding wel volledig. Dit is de methode die uiteindelijk gebruikt werd voor het scheiden van lipideklassen in biologische vloeistoffen. 39
d) Resultaten voor de analyse van plasmastalen In figuur 4.11 wordt een chromatogram weergegeven van het plasma van een gezonde
Respons (mV)
persoon. De afkortingen op het chromatogram staan respectievelijk voor de klassen van de 750 700 650 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 -50
CE TG C
PC X
0
5
DG FFA
10
15
MG
20
PE
25
30
35
40
SPM
45
50
LPC
55
60
Tijd (min)
Figuur 4.11: Analyse van de lipideklassen in plasma; voor condities: zie §4.4.2.2.d en tabel 4.8
cholesterolesters (CE), triglyceriden (TG), vrije vetzuren (FFA), diglyceriden (DG), sterolen (cholesterol, C), monoglyceriden (MG), fosfatidylethanolamines (PE), fosfatidylcholines (PC), fosfosfingolipiden (sfingomyeline, SPM) en lysofosfatidylcholines (LPC). Piek ‘X’ werd niet verder onderzocht. Op het chromatogram is duidelijk te zien dat de cholesterolesters, de triglyceriden, cholesterol en de fosfatidylcholines veel abundanter zijn dan de andere lipideklassen. De concentratie en de variatie in vetzuren bij de cholesterolesters en de triglyceriden is zodanig dat er geen volledige scheiding tussen deze klassen is. Vervolgens werden er enkele andere plasmastalen onderzocht om het verschil in samenstelling tussen verschillende plasmastalen na te gaan. In figuren 4.12 A, B en C worden de chromatogrammen weergegeven die bekomen werden met het plasma van gezonde personen op nuchtere maag. Het profiel van deze 3 chromatogrammen is zeer gelijkaardig, het duidelijkst zichtbare verschil is de variatie in relatieve verhouding van de signalen van de cholesterolesters en de triglyceriden. In figuren 4.12 D, E en F worden de chromatogrammen weergegeven van plasma van personen met obesitas (personen met een Body Mass Index die hoger is dan 30 kg/m²). Bij figuur 4.12 E zijn de signalen van de vrije vetzuren, de diglyceriden en de signalen bij ‘X’ (werd niet verder onderzocht) merkelijk hoger dan bij de andere plasmastalen. Bij figuur 4.12 F liggen de meeste signalen iets hoger dan bij figuur 4.12 D. Bij vergelijking van figuur 4.11 met figuren 4.12 A,B en C valt op dat bij figuur 4.11 de intensiteit van het signaal van diglyceride (DG) lager is en dit van cholesterol (C) hoger is. Dit 40
wijst op een bepaalde variabiliteit van deze componenten in gezond plasma. Kwantitatieve beoordelingen omtrent de lipideklassen kunnen gemaakt worden na de concentratiebepaling
A
CE
550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 -50
Respons (mV)
Respons (mV)
(zie 4.4.3.).
C TG DG
0
5
PC
FFA
X
10
SPM
15
20
25
30
35
40
45
50
LPC
CE
600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 -50
55
D
C
TG
DG PC
X
0
5
FFA
10
SPM
15
20
600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 -50
CE
B
TG
C DG PC
X
0
5
FFA
10
SPM
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Respons (mV)
Respons (mV)
C DG PC
5
FFA
10
15
LPC
SPM
20
25
30
Tijd (min)
40
45
50
55
E DG
TG
C
FFA
X
PC SPM
0
C
TG
0
35
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Tijd (min)
CE
X
30
CE
600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 -50
Tijd (min)
600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 -50
25
Tijd (min)
Respons (mV)
Respons (mV)
Tijd (min)
35
40
45
50
55
650 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 -50
F
CE
C
TG
DG
PC
X FFA
0
5
10
15
SPM
20
25
30
35
40
45
50
LPC
55
Tijd (min)
Figuur 4.12: Analyse van de lipideklassen in plasma bij (A - C) gezonde personen en (D - F) personen met obesitas; voor condities: zie §4.4.2.2.d en tabel 4.8
41
e) Resultaten voor de analyse van eigeel Om aan te tonen dat de ontwikkelde methode niet enkel toepasbaar is op plasma, maar ook
werden enkele kwalitatieve analyses verricht op eierdooiers. In figuur 4.13 A staat het lipidenprofiel
Respons (mV)
op andere biologische monsters,
bekomen uit een kwartelei, figuren
A
450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 -50
C
TG
PC
FFA
0
4.13 B en C geven de lipiden-
PE
DG
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Tijd (min)
eieren.
Opvallend
is
dat
het
kwartelei geen zichtbare verschillen vertoont
ten
opzichte
van
de
Respons (mV)
samenstelling bij gewone kippen-
kippeneieren. Zoals reeds werd
450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 -50
cholesterol
en
polaire
lipiden
gescheiden worden. Via HPLC
Respons (mV)
triglyceriden, de vrije vetzuren,
FFA
450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 -50
duidelijk
dat
er
5
10
15
20
zitten, de aanwezige polaire lipiden
30
35
40
45
50
55
C PC PE
DG
TG
FFA
5
10
15
20
ook
diglyceriden (DG) in het eigeel
25
C
0
wordt
PC
DG
Tijd (min)
cholesterolesters weinig of niet voor in eigeel. Via TLC konden de
PE
TG
0
opgemerkt in sectie 4.3.5. komen
B
C
25
30
35
40
45
50
55
Tijd (min)
Figuur 4.13: Analyse van de lipideklassen in eigeel bij (A) een kwartelei en (B - C) kippeneieren; voor condities: zie §4.4.2.2.e en tabel 4.8
omvatten bijna uitsluitend fosfatidylethanolamines (PE) en fosfatidylcholines (PC), zoals bepaald kon worden via analyse van de zuivere standaarden. De vrije vetzuren (FFA), die bij TLC zeer goed zichtbaar waren, hebben een zeer lage respons bij HPLC.
4.4.2.4.
Conclusies bij het gebruik van een diol-kolom
Bij de analyse van de neutrale lipiden heeft additie van azijnzuur een positief effect op de scheiding van de vrije vetzuren. Met een diol-kolom is het eenvoudiger om de polaire lipiden te scheiden dan met een silica-kolom. Met de methode die uiteindelijk werd opgesteld voor de analyse van biologische vloeistoffen is het mogelijk om de meest relevante lipideklassen te scheiden.
42
4.4.3. Concentratiebepaling van de lipideklassen in plasma 4.4.3.1.
Doel
In dit deel wordt de concentratie bepaald van de lipideklassen in de verschillende plasmastalen behandeld in figuren 4.11 en 4.12. Om deze concentraties te kunnen bepalen moeten eerst kalibratiecurven worden opgesteld voor de verschillende lipideklassen. Er werd geopteerd om dit te doen via externe kalibratie daar de herhaalbaarheid van analyse tot analyse zeer goed bleek te zijn.
4.4.3.2.
Instrumentatie
De gebruikte instrumentatie is dezelfde als deze in paragraaf 4.4.1.1. De volgende kolom werd gebruikt: SFC Diol (5 µm), 250 x 4,6 mm (Princeton, Cranbury, NJ, USA).
4.4.3.3.
Methode
Dezelfde methode als in 4.4.2.2.c werd gebruikt. De kalibratiecurven werden opgesteld aan de hand van vijf kalibratiepunten. Monsters met als concentratie 25, 50, 100, 200 en 400 µg/mL werden bereid uit een oplossing met alle lipidenstandaarden (zie appendix B). Het solvent was hexaan-dichloormethaan (75:25). Alle metingen werden in tweevoud uitgevoerd. De gradiënt die gebruikt werd is dezelfde als deze in tabel 4.8, het debiet was 0,5 mL/min, het injectievolume 10 µL.
4.4.3.4.
Resultaten en bespreking
In tabel 4.9 worden de vergelijkingen van de kalibratiecurven bekomen via lineaire regressie voor elke standaard gegeven. De correlatiecoëfficiënt (R²) is hoger dan 0,99 voor elke component. Hieruit kan opgemaakt worden dat de meetpunten gekozen werden in het lineaire detectiegebied van de CAD-detector. Bij de vergelijking y = ax + b is y de oppervlakte van de gedetecteerde piek en x is de concentratie in µg/mL. Om de onbekende concentraties van de lipideklassen in plasma te bepalen werden de piekoppervlaktes ingevuld in deze vergelijkingen. De resultaten voor de 7 plasmastalen die in figuren
Standaard CO TO OA 1,3-DOG 1,2-DOG C MOG PE PI+PS PC SPM LPC
y = ax + b a b 9,77 732,6 8,38 597,3 9,24 183,4 5,29 467,3 2,34 94,5 7,25 680,4 10,57 795,4 5,98 137,0 23,32 189,3 11,11 110,3 14,30 -192,5 16,23 -114,0
R² 0,9997 0,9994 0,9992 0,9939 0,9989 0,9987 0,9995 0,9946 0,9984 0,9992 0,9969 0,9987
Tabel 4.9: Vergelijkingen van de kalibratierechten
4.11 en 4.12 geanalyseerd werden, worden weergegeven in tabel 4.10. Plasma A tot en met 43
plasma F zijn respectievelijk de plasmastalen A tot en met F uit figuur 4.12. Plasma G is het plasmastaal uit figuur 4.11. In de tabel staan de hoeveelheden lipiden die aanwezig zijn in plasma, uitgedrukt in µg/mL. De verschillende lipiden staan gerangschikt volgens elutievolgorde. De klassen van de monoglyceriden, fosfatidylserines en fosfatidylinositolen staan niet in de tabel vermeld aangezien hun concentratie in het geïnjecteerde plasma lager lag dan 25 µg/mL. Bij een concentratie lager dan 25 µg/mL werd ‘-‘ in de tabel geplaatst. Zoals reeds uit de chromatogrammen af te leiden was, is de concentratie van cholesterolesters, triglyceriden, fosfatidylcholines en cholesterol in plasma hoger dan die van de andere lipideklassen. Klasse CE TG FFA DG C PE PC SPM LPC
Plasma A 2640,8 591,4 196,6 242,9 715,4 148,3 83,5
Plasma B 2491,9 2222,1 138,0 45,2 328,1 560,4 99,2 -
Plasma C 3005,2 1364,7 71,9 89,3 383,0 774,8 214,9 83,3
Plasma D 2797,4 727,0 153,2 70,2 226,0 443,0 83,7 -
Plasma E 2867,5 2293,1 607,1 344,1 364,7 634,5 109,6 -
Plasma F 3496,0 2007,9 140,8 188,1 405,2 836,9 242,5 81,6
Plasma G 2170,4 3233,3 97,7 377,4 95,9 1197,7 203,1 78,4
Tabel 4.10: Concentratie van de lipideklassen in µg/mL in plasma
De bekomen resultaten stemmen goed overeen met waarden uit de literatuur [15, 23, 38, 39], behalve de waarden voor de fosfatidylcholines. Bij fosfatidylcholine variëren de gerapporteerde waarden van 1237-2476 µg/mL [38] tot 2898-4489 µg/mL [23]. De waarden die hier bekomen werden liggen systematisch lager. Een mogelijke verklaring is dat de gebruikte extractiemethode niet in staat is om alle fosfolipiden te extraheren. De concentratie aan triglyceriden in plasma kan sterk verschillen. Triglyceriden worden voornamelijk uit het vet in de voeding opgenomen in het lichaam, waar ze gebruikt worden als energiebron. Het gehalte aan triglyceriden wordt dus mede bepaald door de verstreken tijdsduur sinds de laatste maaltijd. Plasmastalen A tot en met C komen van donors op nuchtere maag, bij plasmastaal G is dit niet zo. Het gehalte aan triglyceriden bij deze persoon ligt duidelijk hoger. Bij plasmastaal E is het gehalte aan vrije vetzuren en diglyceriden veel hoger dan bij de andere 6 plasmastalen. Plasmastalen A tot en met C zijn afkomstig van personen zonder gezondheidsproblemen, plasmastalen D tot en met F komen van zwaarlijvige personen. Bij deze kleinschalige test is het niet mogelijk om deze twee groepen van elkaar te onderscheiden aan de hand van de samenstelling van de lipideklassen.
44
4.4.4. Fractieverzameling met HPLC De scheiding van de verschillende lipideklassen met HPLC was de eerste belangrijke stap bij dit werk. Het volgende doel is het onderzoeken van de vetzuursamenstelling van de verschillende lipideklassen in plasma. Om dit te kunnen onderzoeken is het noodzakelijk om deze lipideklassen afzonderlijk te verkrijgen. Met behulp van een fractiecollector werd het mogelijk om alle besproken lipideklassen apart te verzamelen. Aangezien diglyceriden niet volledig gescheiden zijn van cholesterol werden deze lipideklassen samen verzameld. Er werd gebruik gemaakt van een Waters Fraction Collector II (Milford, MA, USA). De opstelling wordt gegeven in figuur 4.14. Aangezien de CAD-detector destructief is, is het niet mogelijk om de fractiecollector na de detector te plaatsen. Om deze reden werd er na de kolom een T-stuk geplaatst (D op figuur 4.14) waarbij de mobiele fase in twee deelstromen werd opgesplitst. 20% van de mobiele fase werd naar de detector gestuurd, 80% ging naar de fractiecollector. Om voldoende lipiden te kunnen recupereren werd het plasmastaal uit figuur 4.11 12 maal geïnjecteerd en verzameld. Voor fosfatidylethanolamine, sfingomyeline en lysofosfatidylcholine bleek 12 injecties onvoldoende. Voor deze klassen werden 24 injecties uitgevoerd. A : Alliance 2690 B : Prekolom C : Kolom D : Stroomsplitser E : Detector F : Fractiecollector G : Afvalfles E D G
A
F
C
B
Figuur 4.14: Opstelling bij fractiecollectie
45
De verzamelde fracties werden ingedampt in een oven op 80 °C en vervolgens heropgelost in 25 µL dichloormethaan en 75 µL hexaan. Van deze oplossing werd 5 µL opnieuw geïnjecteerd om na te gaan of de verzamelde lipideklassen wel degelijk aanwezig waren.
4.5.
Analyse van vetzuren via GC-FID
4.5.1. Instrumentatie De experimenten werden uitgevoerd op een Agilent
6890
GC
(Agilent
Technologies,
Wilmington, DE, VS) met bijhorende FID. Automatische injecties gebeurden met een 7683B Injector (Agilent Technologies). De scheiding werd uitgevoerd op een HP-88 kolom met als afmetingen 100 m x 0,25 mm interne diameter x 0,2 µm filmdikte (Agilent Technologies). Het systeem werd bestuurd en de data werden verwerkt met Chemstation software. De opstelling wordt
getoond
in
figuur
4.15.
H2
werd
gegenereerd via een Parker Chromgas Gas generator 9150 (Parker Hannifin, Haverhill, MA, VS).
Figuur 4.15: Opstelling van de GC-FID
4.5.2. Omestering van de vetzuren naar FAMEs Als uitgangspunt werden de via HPLC verzamelde lipideklassen (behandeld in 4.4.4.) genomen. Hieraan werd 500 µL gedeutereerde tristearine (10 µg/mL) toegevoegd als interne standaard. De oplossingen werden in een oven ingedampt bij een temperatuur van 80 °C. Hierna werd een zuurgekatalyseerde omestering van de vetzuren uitgevoerd door aan elke verzamelde lipideklasse 500 µL van een vers bereidde oplossing van 5% acetylchloride in methanol toe te voegen en het geheel gedurende 30’ in een oven op 90 °C te houden. Vervolgens werd 1 mL hexaan toegevoegd en werden de gevormde FAMEs via hevig schudden uit methanol geëxtraheerd. Om de concentratie van de FAMEs te verhogen werd de hexaanfractie ingedampt en opnieuw opgelost in 100 µL hexaan.
46
4.5.3. Injectie bij GC-FID Het injectievolume bedroeg 1 µL. De temperatuur bij injectie bedroeg 250 °C. Gedurende de eerste twee min werd het monster overgebracht in splitless mode, hierna werd overgeschakeld naar split mode. De oventemperatuur bedoeg 50 °C gedurende één min, steeg vervolgens met 15 °C/min tot 175 °C en steeg daarna met 1 °C/min tot 240 °C. Het volledige programma duurde 74,33 min. H2 werd gebruikt als draaggas bij een lineaire snelheid van 31 cm/s. De identificatie van de pieken gebeurde met behulp van een FAME-mengsel met 37 componenten (Supelco). De gekozen draaggassnelheid en temperatuursprogramma leverden een retentietijd van 25,36 min voor methylstearaat. Bij de FID was het debiet van H2 30 mL/min en dit van lucht 300 mL/min, de menging van het H2-gas met de uitlaat van de kolom gebeurde bij een temperatuur van 250 °C. 4.5.4. Resultaten en bespreking Bij de HP-88 kolom zijn ongeveer 88% van de methylgroepen op PDMS vervangen door cyanopropylgroepen. Het is een polaire kolom die geschikt is voor FAME-analyses. Op cholesterol zijn er geen vetzuren aanwezig, zodat de omesteringsreactie hierbij geen FAMEs oplevert. Wegens zijn hoge kookpunt (360 °C) wordt cholesterol niet in de gasfase gebracht bij de vooropgestelde analysemethode en levert dit dus geen interferentie met de FAMEs. De diglyceriden, die niet volledig gescheiden zijn van cholesterol, kunnen derhalve samen met cholesterol verzameld en geanalyseerd worden. Monoglyceriden, fosfatidylserines en fosfatidylinositolen zijn in te lage concentratie aanwezig om gedetecteerd te worden, hierop werd geen omestering uitgevoerd. Omestering en bijhorende vetzuuranalyse met GCFID werden wel uitgevoerd op de overige besproken lipideklassen. De chromatogrammen die voor deze klassen verkregen werden worden weergegeven in figuur 4.16. Aangezien cholesterolesters, triglyceriden en fosfatidylcholines veel meer voorkomen in plasma dan de andere lipideklassen worden deze chromatogrammen het eerst getoond. De FAMEs worden genoteerd als volgt: Ca:b nxz; a is het aantal koolstofatomen in de vetzuurketen, b het aantal dubbele bindingen, nx is de positie van de eerste dubbele binding gezien vanaf het uiteinde van de vetzuurketen en z is de configuratie van deze dubbele binding (c voor cis, t voor trans). De interne standaard staat op de chromatogrammen aangegeven met de afkorting IS.
47
FID1 B, (MIKE\APR09000.D)
A
6.208
pA
225 225 200 200
50 50
C14:0
C12:0
75 75
IS
C16:0
100 100
C18:1 n9c
C18:0
125 125
C18:2 n6c
C16:1 n7c
pA
150 150
C18:1 n9t
175 175
25 25
00
10 10
20 20
30 30
40 40
50 50
60 60
min
Tijd (min)
B
200 200
C18:1 n9c
C16:0
6.196
FID1 B, (MIKE\APR09003.D) pA
225 225
175 175
C18:2 n6c
C18:0
pA
150 150 125 125
C20:4 n6c
C20:3 n6c
C18:3 n3c
50 50
IS
C14:0
75 75
C18:1 n9t
C16:1 n7c
100 100
25 25 00
10 10
20 20
30 30
40 40
50 50
60 60
min
Tijd (min) FID1 B, (MIKE\APR10001.D)
C
6.171
pA
225 225
C22:6 n3c
50 50
IS
C16:1 n7c
75 75
C20:5 n3c
100 100
C18:1 n9c
125 125
C18:0
pA
150 150
C20:3 n6c C20:4 n6c
C16:0
175 175
C18:2 n6c
C18:1 n9t
200 200
25 25 00
10 10
20 20
30 30
40 40
50 50
60 60
min
Tijd (min) FID1 B, (MIKE\APR10003.D)
D
55 55
IS
50 50
C18:1 n9t
6.165
pA
C18:1 n9c
35 35
C18:0
40 40
C17:0
C16:0
pA
45 45
30 30 25 25 20 20
00
10 10
20 20
30 30
40 40
50 50
60 60
min
Tijd (min)
48
FID1 B, (MIKE\APR10002.D)
E
6.193
pA 55 55
C22:1 n9c
C18:1 n9c
35 35
C18:0
40 40
C16:0
pA
45 45
C18:2 n6c
IS
50 50
?
?
30 30 25 25 20 20
0
10 10
0
20 20
30 30
40 40
50 50
60 60
min
Tijd (min)
F
IS
7.117
FID1 B, (MIKE\MAY 18001.D) pA
C14:0 C15:0
30 30 25 25 20 20
C16:1 n7c
35 35
00
10 10
C20:4 n6c
C18:1 n9c
40 40
C18:2 n6c
pA
45 45
20 20
30 30
C22:6 n3c
C16:0
50 50
C22:1 n9c
C18:0 C18:1 n9t
55 55
40 40
50 50
60 60
min
Tijd (min)
55 55
C18:1 n9c
50 50 45 45
20 20
0
10
0
20
10
30
20
40
30
40
C24:1 n9c
C24:0
C20:3 n6c
C22:1 n9c
25 25
C18:2 n6c
30 30
C16:1 n7c
C14:0 C15:0
35 35
C20:1 n9c
40 40
C18:1 n9t
pA
G
C18:0
IS
C16:0
7.074 7.270
FID1 B, (MIKE\MAY 18002.D) pA
?
?
50
60
50
min
60
Tijd (min)
55 55 50 50
IS
H
C18:0 C18:1 n9c
C16:0
7.086 7.240
FID1 B, (MIKE\MAY18003.D) pA
C22:1 n9c
C20:1 n9c
C18:2 n6c
30 30
C14:0
35 35
C18:1 n9t
C16:1 n7c
40 40
C12:0
pA
45 45
? ?
25 25 20 20
0
0
10
10
20
20
30
30
40
40
50
50
60
60
min
Tijd (min)
Figuur 4.16: Analyse van de vetzuren in het plasma van een gezond persoon voor de lipideklassen: (A) cholesterolesters, (B) triglyceriden, (C) fosfatidylcholines, (D) vrije vetzuren, (E) diglyceriden, (F) fosfatidylethanolamines, (G) sfingomyelines en (H) lysofosfatidylcholines
49
Uit figuur 4.16 blijkt dat de C16- en C18-vetzuren veel sterker vertegenwoordigd zijn dan de andere vetzuren. Bij elke lipideklasse zijn de relatieve verhoudingen van de signalen anders. Bij de cholesterolesters zorgt het methylester van linolzuur (C18:2 n6c) voor het hoogste signaal, bij de tri- en diglyceriden is dit het methylester van oliezuur (C18:1 n9c), bij de vrije vetzuren, lyso- en fosfatidylcholines is dit het methylester van palmitinezuur (C16:0) en bij de fosfatidylethanolamines en sfingomyelines levert het methylester van stearinezuur (C18:0) het hoogste signaal. De chromatogrammen voor de fosfatidylethanolamines, sfingomyelines en lysofosfatidylcholines vertonen veel onverklaarde onzuiverheden. Enkel de pieken die met enige zekerheid benoemd kunnen worden zijn aangeduid op de chromatogrammen. De overige signalen werden bij een verdere verwerking niet in rekening gebracht. Aangezien deze lipideklassen verzameld werden bij een andere fractiecollectie dan de andere lipideklassen (24 plasmainjecties in plaats van 12), kan de oorsprong van de onzuiverheden niet onmiddellijk verklaard worden.
In wat volgt wordt het begrip ‘vetzuur’ gebruikt in plaats van ‘FAME’ aangezien er een rechtstreeks verband is tussen deze twee begrippen. In tabel 4.11 wordt de samenstelling van de vetzuren weergegeven van de verschillende lipideklassen zoals deze weergegeven worden in figuur 4.16. Er werd geopteerd om de hoeveelheden van de verschillende vetzuren uit te drukken in molpercent (aantal mol/ 100 mol vetzuren). Aangezien de hoeveelheid interne standaard bij elke injectie dezelfde was, was het ook mogelijk om een tabel op te stellen met de absolute hoeveelheden van de verschillende vetzuren. Om de vetzuursamenstelling te analyseren was de tabel in molpercent echter beter geschikt. Bij het uitvoeren van metingen in triplicaat werd voor de interne standaard een relatieve standaarddeviatie van 2,63% bekomen. Om voor elk vetzuur een idee te krijgen omtrent zijn relatieve standaarddeviatie werden de metingen van een mengsel met 37 FAMEs (Supelco) in triplicaat uitgevoerd. De standaarddeviatie σ(x) werd berekend via vergelijking 4.1, de relatieve standaarddeviatie (RSD) via vergelijking 4.2. Hierbij staat ̅ voor de gemiddelde meetwaarde en is n het aantal uitgevoerde metingen, zijnde 3.
( )=
∑
(%) =
(
− ̅ )² −1
(4.1)
( ) × 100% ̅
(4.2) 50
Tijd
Vetzuur
CE
TG
FFA
(min) 15,73 16,78 18,04 19,08 19,42 20,70 21,12 22,35 23,07 25,36 26,31 26,81 27,02 29,19 30,17 31,01 32,23 32,76 35,72 37,92 39,64 39,99 43,40 43,61 45,81 48,12 54,34 58,00
C12:0 C13:0 C14:0 C14:1 n5c C15:0 C15:1 n5c C16:0 C16:1 n7c C17:0 C18:0 C18:1 n9t C18:1 n9c ongekend C18:2 n6c ongekend C20:0 C18:3 n3c C20:1 n9c C20:2 n6c C20:3 n6c C20:4 n6c C22:1 n9c C22:2 n6c C20:5 n3c C24:0 C24:1 n9c C22:6 n3c ongekend
1,3 0,1 0,9
1,1
0,7
0,3
0,2
0,4
21,3 2,8
38,3
3,3 0,5 28,3 2,3 38,6
29,4 2,8 0,2 4,9 1,7 40,9 2,9 13,2
0,1 0,2
0,3 1,0 0,2 0,1 0,2 0,8
0,9 29,5 0,6 28,2 0,5 0,3
0,6
DG
16,5
17,9 33,8 7,9 22,6
1,3
PE
PC
SPM
LPC
0,6 0,2 1,4 0,2 4,7
0,2
0,4
0,2
1,5
1,2 0,4 2,2
0,1
0,7
1,0
24,1 1,3 1,7 35,5 5,6 9,0
33,2 1,4
26,4 2,0
33,2 7,9 8,2
14,9 11,8 16,9
5,6
31,9 0,5 0,3 19,5 0,2 12,4 1,9 23,4
1,7
2,9
3,0
9,9
6,6 2,1
0,1 0,2 0,1 0,3 2,0 5,1 0,5
2,2 2,1
5,8 1,0
0,3 1,1 2,0 1,5
0,6 1,4
3,6
RSD (%) 39,13 7,87 0,78 1,51 0,5 0,33 0,55 2,16 2,01 0,55 1,68 0,58 ongekend 2,61 ongekend 1,32 1,18 0,71 1,97 5,76 2,71 3,38 1,48 2,06 10,43 8,03 1,06 ongekend
Tabel 4.11: Vetzuursamenstelling, uitgedrukt in molpercent, van de uit plasma verzamelde lipideklassen en de relatieve standaardafwijking bij elk vetzuur
De verschillende lipiden staan in tabel 4.11 gerangschikt volgens elutievolgorde. In de literatuur [39 – 43] is het aantal bestudeerde vetzuren vaak heel wat lager dan in tabel 4.11. De vetzuren die wel in de literatuur bestudeerd worden (de meest abundante vetzuren) komen goed overeen met de bekomen resultaten. Zoals ook uit de chromatogrammen in figuur 4.16 af te leiden was, komen C16- en C18-vetzuren veruit het meeste voor bij de bestudeerde lipideklassen. Tussen de lipideklassen onderling zijn er duidelijke verschillen te zien. De relatieve standaardafwijking ligt onder de 3% bij de meest abundante vetzuren. Deze afwijking wordt groter bij de kortere vetzuren (C13 of kleiner) en bij de langere vetzuren (C22 of groter).
4.5.5. Conclusies bij de analyse van de vetzuursamenstelling De aangewende methode laat toe om voor elke verzamelde lipideklasse in een biologische vloeistof de vetzuursamenstelling te onderzoeken. Via deze methode wordt een zeer goede
51
scheiding van de FAMEs bekomen. De retentietijden en piekoppervlaktes vertonen een goede reproduceerbaarheid.
52
5.
Besluit De gedetailleerde studie van lipiden en hun interacties (‘lipidomics’) is een relatief recent
onderzoeksdomein waarin nog heel wat vooruitgang kan geboekt worden. De literatuur omtrent de scheiding van lipideklassen via HPLC biedt vooralsnog geen resultaten waarbij de relevante lipideklassen in één analyse gescheiden kunnen worden. In dit werk werd getracht om een dergelijke fractionatie met HPLC te bekomen. Representatieve standaarden uit de meest relevante lipideklassen werden daarbij gebruikt voor de ontwikkeling van de procedure. Alhoewel de bekomen methode ontoereikend was voor een basislijnscheiding van alle standaarden, was ze wel geschikt voor de scheiding van de lipideklassen uit plasma en eigeel. Enkele besluiten die uit dit werk kunnen getrokken worden:
Bij dit onderzoek is een diol gederivatiseerde stationaire fase beter geschikt gebleken dan niet gederivatiseerde silica voor het scheiden van de polaire lipiden.
De additie van zuur bleek wenselijk voor de analyse van de neutrale lipiden aangezien de vrije vetzuren hierdoor geïsoleerd werden van de rest van de lipiden. De additie van een ammoniumacetaatbuffer leverde betere resultaten voor de scheiding van de polaire lipiden.
Additieven die in de literatuur gebruikt werden, zoals tetrahydrofuran [20] en triëthylamine [35], leverden hier geen betere resultaten.
Verder werd in dit werk een poging ondernomen om de vetzuursamenstelling van de verschillende verzamelde lipideklassen te onderzoeken. De hiervoor gebruikte GC methode, ontwikkeld in het Laboratorium voor Scheidingstechnieken [31], leverde goede resultaten. De procedure die in dit werk geformuleerd wordt laat nu toe om de meest relevante lipideklassen in biologische vloeistoffen te scheiden en om, na fractiecollectie, de vetzuursamenstelling van deze lipideklassen nauwkeurig te onderzoeken.
53
6.
Referentielijst [1]
J.C. Giddings, Dynamics of Chromatography: Principles and Theory, Marcel Dekker, Inc., New York 1965
[2]
L.S. Ettre, Pure & Appl. Chem. 65 (1993) 819
[3]
R. Johnsson, G. Träff, M. Sundén, U. Ellervik, J. Chromatogr. A 1164 (2007) 298
[4]
T. Górecki, F. Lynen, R. Szucs, P. Sandra, Analyt. Chem. 78 (2006) 3186
[5]
P.H. Gamache, R.S. McCarthy, S.M. Freeto, D.J. Asa, M.J. Woodcock, K. Laws, R.O. Cole, LC GC Europe 18 (2005) 345
[6]
M.R. Wenk, Nature Reviews Drug Discovery 4 (2005) 594
[7]
P.J. Boersema, S. Mohammed, A.J.R. Heck, Anal. Bioanal. Chem. 391 (2008) 151
[8]
H. Lindner, B. Sarg, C. Meraner, W. Helliger, J. Chromatogr. A 743 (1996) 137
[9]
A.J. Alpert, Analyt. Chem. 80 (2008) 62
[10] Z.M. Guo, A.W. Lei, Y.P. Zhang, Q. Xu, X.Y. Xue, F.F. Zhang, X.M. Liang, Chem. Commun. 24 (2007) 2491 [11] R.P.W. Scott, Gas Chromatography, Library4science 2003 p 1,16,23,39 [12] J.V.
Hinshaw,
L.S.
Ettre,
Introduction
to
Open-Tubular
Column
Gas
Chromatography, Advanstar Communications, Ohio 1994 p 3,15,18-19,127-144 [13] W.W. Christie, Lipid Tech. 2 (1990) 22 [14] W.W. Christie, G. Dobson, Lipid Tech. 11 (1999) 64 [15] T. White, S. Bursten, D. Federighi, R.A. Lewis, E. Nudelman, Analyt. Biochem. 258 (1998) 109 [16] J.F. Pernes, J. Chromatogr. 181 (1980) 254 [17] I.R. Kupke, S. Zeugner, J. Chromatogr. 146 (1978) 261 [18] J. Pucsok, L. Kovacs, A. Zalka, R. Dobo, Clin. Biochem. 21 (1988) 81 [19] C.W. Miller, A.E. Taylor, J. Biol. Chem. 19 (1914) 531 [20] W.W. Christie, J. Lipid Res. 26 (1985) 507 [21] J. Folch, M. Lees, G.H. Sloane Stanley, J. Biol. Chem. 226 (1957) 497 [22] F. Smedes, T.K. Askland, Marine Pollution Bulletin 38 (1999) 193 [23] T. Seppänen-Laakso, I. Laakso, H. Vanhanen, K. Kiviranta, T. Lehtimäki, R. Hiltunen, J. Chromatogr. B 754 (2001) 437 [24] V.P. Skipski, R.F. Peterson, M. Barclay, Biochem. J. 90 (1964) 374 [25] T.H. Yoon, I.H. Kim, J. Chromatogr. A 949 (2002) 209
54
[26] M. Koivusalo, P. Haimi, L. Heikinheimo, R. Kostiainen, P. Somerharju, J. Lipid Res. 42 (2001) 663 [27] R.G. Ramos, D. Libong, M. Rakotomanga, K. Gaudin, P.M. Loiseau, P. Chaminade, J. Chromatogr. A 1209 (2008) 88 [28] R.A. Moreau, Lipids 41 (2006) 727 [29] C. Hallmann, B.G.K. van Aarssen, K. Grice, J. Chromatogr. A 1198 (2008) 14 [30] K. Eder, J. Chromatogr. B 671 (1995) 113 [31] B. Bicalho, F. David, K. Rumplel, E. Kindt, P. Sandra, J. Chromatogr. A 1211 (2008) 120 [32] P. Soudant, Y. Marty, J. Moal, J.F. Samain, J. Chromatogr. B 673 (1995) 15 [33] J. Giacometti, A. Milosevic, C. Milin, J. Chromatogr. A 976 (2002) 47 [34] W.R. Morrison, L.M. Smith, J. Lipid Res. 5 (1964) 600 [35] C. Silversand, C. Haux, J. Chromatogr. B 703 (1997) 7 [36] H.S.H. Yip, M. Ashraf-Khorassani, L.T. Taylor, Chromatographia 65 (2007) 655 [37] A. Villiers, F. Lynen, P. Sandra, J. Chromatogr. A 1216 (2009) 3431 [38] H. Hidaka, K. Yamauchi, H. Ohta, T. Akamatzu, T. Honda, T. Katsuyama, Clin. Biochem. 41 (2008) 1211 [39] R.M. Dougherty, C. Galli, A. Ferro-Luzzi, J.M. Iacono, Am. J. Clin. Nutr. 45 (1987) 443 [40] L. Hodson, C.M. Skeaff, B.A. Fielding, Progress Lipid Res. 47 (2008) 348 [41] G.C. Burdge, P. Wright, A.E. Jones, S.A. Wootton, British J. Nutr. 84 (2000) 781 [42] G.J. Nelson, N.K. Freeman, J. Biol. Chem. 235 (1960) 578 [43] S. Uran, A. Larsen, P.B. Jacobsen, T. Skotland, J. Chromatogr. B, 758 (2001) 265
55
Appendix A: Lijst met de gebruikte afkortingen
APCI: Atmospheric Pressure Chemical Ionization
C: Cholesterol
CAD: Charged Aerosol Detection; geïoniseerde aërosol detectie
CE: Cholesterol Esters; cholesterolesters
CI: Chemical Ionization
CGC: Capillary Gas Chromatography; capillaire gaschromatografie
DG: Diacylglycerol; diglyceride
EI: Electron Impact Ionization
ELSD: Evaporative Light Scattering Detection
ESI-MS: Electrospray Ionisation-Mass Spectrometry; elektrospray ionisatie massaspectrometrie
FAME: Fatty Acid Methyl Ester
FFA: Free Fatty Acid; vrij vetzuur
FID: Flame Ionization Detector; vlamionisatiedetector
GC: Gas Chromatography; gaschromatografie
HETP: Height Equivalent of one Theoretical Plate; hoogte-equivalent van een theoretische plaat
HILIC: Hydrophilic Interaction (Liquid) Chromatography; hydrofiele interactie chromatografie
HPLC: High Performance Liquid Chromatography; hoge performantie vloeistofchromatografie
IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry
LPC: Lysophosphatidylcholine; lysofosfatidylcholine
MG: Monoacylglycerol; monoglyceride
MS: Mass Spectrometry; massaspectrometrie
NPLC:
Normal-Phase
Liquid
Chromatography;
normaalfase
vloeistof-
chromatografie
PDMS: Polydimethylsiloxane; polydimethylsiloxaan
PC: Phosphatidylcholine; fosfatidylcholine
PE: Phosphatidylethanolamine; fosfatidylethanolamine
PI: Phosphatidylinositol; fosfatidylinositol 56
PLOT: Porous-Layer Open-Tubular
PS: Phosphatidylserine; fosfatidylserine
RPLC:
Reversed-Phase
Liquid
Chromatography;
omkeerfase
vloeistof-
chromatografie
SFC: Supercritical-Fluid Chromatography; superkritische vloeistofchromatografie
SPM: Sphingomyelin; sfingomyeline
TG: Triacylglycerol; triglyceride
TLC: Thin Layer Chromatography; dunnelaagchromatografie
UV: Ultraviolet; ultraviolet
WCOT: Wall-Coated Open-Tubular
57
Appendix B: Overzicht van de gebruikte standaarden Klasse
Subklasse
Gebruikte standaard
Afkorting
Leverancier
Oliezuur
OA
Aldrich
I
Monoglyceriden
1-oleoyl-rac-glycerol
MOG
Sigma
II
Diglyceriden
Dioleoylglycerol
DOG
Sigma
III
Triglyceriden
Trioleïne
TO
Fluka
IV
Cholesterol
C
Fluka
V
Cholesteryloleaat
CO
Janssen
VI
1,2-dioleoyl-glycero-3-fosfocholine
PC36:2
Sigma
VII
Fosfatidylcholines
L-α-lysofosfatidylcholine
LPC
Avantipolar Lipids
VIII
Fosfatidylserines
1,2-diacyl-glycero-3-fosfo-L-serine
PS
Sigma
IX
Fosfatidylinositolen
L-α-fosfatidylinositol
PI
Sigma
X
Fosfatidylethanolamines 1,2-dioleoyl-glycero-3-fosfoethanolamine PE36:2
Fluka
XI
Fosfosfingolipiden
Sigma
XII
Neutrale lipiden
Vetzuren Glycerolipiden
Sterolen Sterol lipiden
Cholesterolesters
Polaire lipiden
Glycerofosfolipiden Fosfatidylcholines
Sfingolipiden
Sfingomyeline
SPM
Structuur
CH2(CH2)6CH3
I: OA
HO
V: C
H O
H
CH2(CH2)6CH3
H
O
II: MOG
OH
O
H
CH2(CH2)6CH3
III: DOG
H
HO
OH
O OR2
O
VI: CO
OR1
Waarbij R1 en R2 = H of H
O CH2(CH2)6CH3 H
H
O
OR
CH2(CH2)6CH3 O
IV: TO
RO RO
Waarbij R = O CH2(CH2)6CH3
58
CH2(CH2)6CH3
O
O
VII: PC36:2
O
O
CH3
O
P O
-
+
N H3C
CH3
O O CH2(CH2)6CH3
CH3
O
O
VIII: LPC
O
P R1
O
O
O
N
-
+
CH3
H3C
OH
R1
IX: PS
O R2
O
O
O
O P
O
-
NH2 O
CO2H
O
R1
X: PI
O R2
O
O
OH
O P
O
O
O
HO
OH OH
OH
HO
CH2(CH2)6CH3
O
O
XI: PE36:2
P O
O
O NH2 OH
O O CH2(CH2)6CH3
CH3 O
XII: SPM
+
O
R1
P N
O
N
O O
-
H3C
CH3
H HO
Bij de structuren VIII tot en met XII duiden R1 en R2 op verschillende mogelijke vetzuren. Palmitinezuur, stearinezuur en oliezuur (zie figuur 3.2) vertegenwoordigen dikwijls de overgrote meerderheid hiervan.
59
