Flagellin alapú filamentáris nanoszerkezetek létrehozása
Vonderviszt Ferenc PE MÜKKI Bio-Nanorendszerek Laboratórium MTA Enzimológiai Intézete MTA MFA
Bakteriális flagellumok
Flagelláris filamentum: • ~104 flagellin alegység • hosszúság: 10-20 µm • átmérő: 23 nm
A flagelláris filamentumokat felépítő flagellin alegységek szerkezete D3
(a) D2
(b)
A flagellin fehérje jellemzése • A flagellin polimerizációra képes • A molekula terminális régiói játszanak meghatározó szerepet a filamentáris szerkezet kialakításában • Az aminosavszekvencia 190-284 hipervariábilis szegmense által felépített D3 domén nem vesz részt a filamentumépítésben
Célkitűzés A D3 domén átalakításával vagy más fehérjékkel történő helyettesítésével kívánunk létrehozni olyan előnyös tulajdonságokkal rendelkező flagellin variánsokat, amelyekből filamentáris nanoszerkezetek építhetők.
flagellin-GFP jelző-alegységek flagellin-enzim fúziós konstrukciók (flagzimek) flagellin alapú kötőfehérjék
Flagellin alapú fúziós konstrukciók előállítása D3-deléciós flagellin variáns (∆D3-FliC) előállítása és jellemzése A beültetendő fehérje szerkezetének analízise Megfelelő linkerek tervezése A fúziós génkonstrukció létrehozása Bakteriális termeltetés, tisztítás Helyes feltekeredettség ellenőrzése Polimerizációs képesség vizsgálata
D3-deléciós flagellin előállítása és jellemzése • ∆D3_FliC polimerizációra képes • a natívval megegyező szerkezetű és stabilitású filamentumokat alkot ∆D3-FliC alegység
A D3 domén nem játszik lényeges szerepet a filamentáris szerkezet stabilizálásában.
Natív filamentumok
∆D3_FliC filamentumok
Kalorimetriás stabilitásvizsgálat
A FliC-sfGFP létrehozása A szuperstabil GFP variáns (sfGFP) beillesztése a D3 helyére A beépített GFP helyesen feltekeredik (fluoreszcencia) A flagellin-sfGFP fúziós fehérje polimerizációra képes
FliC-sfGFP
∆D3_FliC
Ni-NTA tisztítás
Filamentumépítés AS polimerizációval
sfGFP
A FliC-CHMO flagzim előállítása CHMO: ciklohexanon monooxigenáz (543 aa) FliC-CHMO génkonstrukció elkészült Termeletetés E.coli sejtekben Tisztítási eljárás kidolgozás alatt Emésztési kísérletek alapján a beillesztett CHMO feltekeredett
CHMO
Flagellin alapú kötőfehérjék
Flagellin alapú receptorok A flagellin külső D3 doménjének átformálásával hozunk létre adott célmolekulák felismerésére képes mesterséges receptorokat. Előállítás: • Fehérjetervezés • Irányított evolúció Előnyök: Baktériumokkal termeltethetők Könnyen izolálhatók és tisztíthatók Nanostruktúrák építhetők belőlük
D3
Cys-mutáns flagellin: T239C Helyspecifikus jelölhetőség
D3
Felületi rögzíthetőség
Ni-kötő flagellin variáns L209H – V235H – K241H
D3
D3 kötődomén létrehozása irányított evolúcióval D3
D3
Célkitűzés: a D3 domén L1-L3 hurokrégióiban randomizált variánsainak előállítása → a célmolekula kötésére képes változatok kiválasztása
Miért jó filamentáris receptorokat építeni? Előnyök: - stabilitás - nagy felületi kötőhelysűrűség - azonos lokális környezet (nincs szükség hordozó mátrixra) - lehetőség különféle módosított flagellinek együttes polimerizációjára
Rekonstruált flagelláris filamentumok
Filamentáris receptorok felületi rögzítése D3
Ni-kötő filamentáris receptorok felületi rögzítése és alkalmazása Kötőhelysűrűség: ~ 104 BS/µm2
C1 chip
SPR mérés
Összefoglalás • A D3 domén helyére történő beépítés révén polimerizációra képes kötőfehérjék, enzimek, jelölőmolekulák előállítására nyílik lehetőség • A flagellin alapú fúziós konstrukciók építőelemként szolgálhatnak filamentáris nanoszerkezetek kialakításában.
PE MÜKKI: Jankovics Hajnalka Klein Ágnes Muskotál Adél Szabó Veronika Tóth Balázs
Köszönetnyilvánítás: MTA Enzimológiai Intézete: Závodszky Péter Kamondi Szilárd Sajó Ráchel
