Nanoszerkezetek és biomarkerek a gyógyítás szolgálatában Dékány Imre MTA r.tagja MTA SZTE Szupramolekuláris és Nanoszerkezetű Anyagok Kutatócsoport SZTE AOK Orvosi Vegytani Intézet Szeged, Dóm tér 8.
-
-
Tartalmi összefoglaló SPR 2D technológia alkalmazása az adszorpció kvantitativ mérésére: aminosavak és proteinek Hatóanyagok és toxikius molekulák megkötése funkcioanlizált Au felületeken Au nanorészecskék lipid membránokban Au plazmonikus csatolás biomolekulákkal Hatóanyagok nanokapszulázása
Au és Ag nanorészecskék optikai tulajdonságai Surface plasmon resonance (SPR) These phenomena occur when electromagnetic field interacts with conduction band electrons and induces the coherent oscillation of electrons.
E
H
transverse oscillation (TSP)
Normalized absorbance
1
longitudinal oscillation (LSP)
0.75
0.5
Ag TSP : λmax1 = 385 – 420 nm ~ 1/r
0.25
Au TSP : λmax1 = 500 – 550 nm ~ 1/r
0 300
400
500
600
700
800
Wavelength (nm)
Plasmon bands of spherical gold and silver nanoparticles
3
Az SPR mérés kísérleti elrendezése
The prism coupling (Kretschmannconfiguration) in SPR technique Schematic representation of Kretschmann-configuration
SPR mérések és adszorpciós izotermák
2
Dopamine (b)
0,5 0,4 0,3 0,2
Ibuprofen (a)
0,6 2
0,6
0,7
(nmol/cm )
0,7
(nmol/cm )
Specific adsorbed amount
0,8
Specific adsorbed amount
0,8
Dopamine (b)
0,5 0,4 0,3
Ibuprofen (a)
0,2 0,1 0
0,1
0
2
4
6
8
c (mM)
0 25
50
75
100
125
t (min)
The plasmonic curves of adsorption of (a) ibuprofen and (b) dopamine on gold surface at different concentrations (0.5, 1, 2, 4, 6, 10 mmol/dm3 aqueous solutions)
The adsorption isotherm of (a) ibuprofen and (b) dopamine from aqueous solution on gold surface
10
Adszorpció és felületi orientáció
SPR mérések: Au-cisztein- ibuprofen rendszer Specific adsorbed amount (nmol/cm 2)
1,2
1
0,8
0,6
Gold 0.5 1 2
0,4 0.5 mM 1mM
0,2
2mM
4mM 6mM 10mM
4
6
10mM
Ibuprofen
L-cysteine
0 90
140
190
240
290
340
t (min)
The plasmonic curves of adsorption of ibuprofen on L-cysteine functionalized gold surface from aqueous solutions ( at 0.5, 1, 2, 4, 6, 10 mmol/dm3 concentrations )
Table 1. The monolayer adsorption capacities (Gmono) and molecular cross section areas (a) on gold surface for different bioconjugated systems as obtained from adsorption isotherms Molecules Monolayer Cross am/am,calc Calculated Surface on gold capacity, sectional area, cross sectional orientation surface Γm./nmol cm–2 am./nm2 Eq. area * (6) am,calc/nm2 Eq. (5)
L-Cysteine L-Glutathion Ibuprofen Dopamine
0.325 0.135 0.330 0.860
0.513 1.234 0.505 0.194
1.425 1.505 0.789 0.359 Molecules on functionali sed gold surface
0.360 0.820 0.640 0.540
Adsorptio ncapacity, Γm./nmol cm–2 Eq. (5)
Cross sectional area, am./nm2
parallel parallel parallel perpendicular am/am,calc
Calculated
Surface orientation
cross section area, *am,calc/nm2
Eq. (6)
L-CystIbuprofen L-GlutIbuprofen
0.325
0.513
0.801
0.640
parallel
0.180
0.926
1.447
0.640
parallel
L-CystDopamine L-GlutDopamine
0.640
0.260
0.481
0.540
perpendicular
0.580
0.287
0.531
0.540
perpendicular
Arany nanoszenzorok aflatoxinok kimutatására
UV-Vis plazmonikus spektrumok 1.50 Aminodextran reduced AuNPs NaBH4 reduced AuSHbCD nanodispersion
1.25
A, -
1.00
Dl= 20 nm
0.75 0.50 0.25 0.00 350
450
550
650
750
850
l, nm The changes of plasmon bands of aminoldextran reduced gold nanodispersion and AuSHbCD gold nanodispersions(164 mg/ml; 0.5 mM Au) registered by UV-Vis spectroscopy.
O
UV-Vis mérések
O
O
B1 -aflatoxin
O O
O
CH3
Attachment of Aflatoxin B1 molecules to cyclodextrin modified gold surface and bcyclodextrin on gold crystal surface (111).
Hydrophobic S-H group substituted g-cyclodextrin
A, -
1.7 - 3.4 - 8.-3 ng/ml AfB2
0.3
0.15 350
500
650 l, nm
800
The changes of plasmon bands of AuSHbCD gold nanodispersions (164 mg/ml; 0.5 mM Au) added AfB1 (in concentration range 333 ng/ml AfB1 and 1.7-8.3 ng/ml AfB2) to the solution are also registered by UV-Vis spectroscopy in dilute acetonitril solution.
AuSHbCD naodispersion l m ax= 539 nm
0.2
548- 549- 550 nm
0.75
3 - 13 - 33 ng/ml AfB1 0.15
0.5
0.1
A, -
0.45
1
AuSHb CD naodispersion l m ax= 539 nm
0.25
0 350
0.05
0
500
650 l, nm
800
SPR mérések AfB1 molekulával
Desorption
Irreversible Strong physical or chemical interactions
Time
1)
Aflatoxin B1 (AfB1) molecules O
O O
O
O
O
O H3C
O O
Adsorption Desorption
5 4
2
AfB1: 0.4 ng/cm (0.167-32 ng/ml)
3 2 1
O O
O H3C
6
2
Adsorbed amount
Weak physical interactions
(ng/cm )
Reversible
Specific adsorbed amount
Adsorption
Wavelength
nSt(otal adsorbed amount) = nSphys + nSchem
O H3C
O O
Au layer (50 nm) Glass surface
0 0
20
40
60
80 100 120
Time (min)
Fig. 7. Results of SPR measurements: AfB1 solution (0.167-32ng/ml) to gold surface.
SH modified bCD (bCD-SH) molecules
Adsorbed amount (ng/cm
2)
Au layer (50 nm) Glass surface
150
100 50 0 0
2
7
1
2
3
cSHbCD, mg/ml
6
1 0 0
40
80
120
160
Time (min)
Fig. 8. Results of SPR measurements: bCD-SH (0.5-3 mg/ml) to gold surface.
H 3C
O
O
O
O
Au layer (50 nm) Glass surface
O
O
O
O
O H 3C
O
O
O
2
O
O
O
3
O
AfB1 to bCD-SH covered surface O
3)
O
4
H 3C
SH-b -CD: 169 ng/cm2 (0.5- 3 mg/ml)
O
5
O
Specific adsorbed amount (ng/cm )
8
200
H 3C
2)
AuNPs with bCD-SH (bCDAuNPs)
5)
AfB1 molecules attach to bCDs holes of bCDAuNPs O
O O
O
O
O
O
H3 C
O
H3 C
O
O
O
O O
O
O
O
O
O
H 3C
O
H3 C
O
O
O
O
H3 C
O
O
O
O
O
O
C H3
O
O
O
H3 C O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
C H3
O
O
O
O
O
O
C H3
O
H 3C
O
O
H 3C
O
O
H 3C
O
O O
O
O
H 3C
O
O
O
O H3 C
O O
O
O
O
O
O
O O
O
O
O
O
O
O
O
80
O
O
O
O
OH C 3
O
O
H3C
O
H3 C
O
O O
O
O
O
3C
H
O
C H3
O
O
O
O
O
H 3C
O
O
O
O O
O
C H3
O
O
H3C
O
O
3C
H3 C
O O
C H3
O
O
O
O O
O
O
O
Specific adsorbed amount (ng/cm2)
O
OH C 3
O
O O
O
C H3
O
C H3 O
O
Adsorbed amount (ng/cm2)
O O
O
O
H
O
60
Au layer (50 nm) Glass surface
40 AuSHb CD: 0-10 ng/cm2
20 0
40
0
20 0 0.00
O
AuNP
O
60
O
80
O
100
O
O
3C
Au layer (50 nm) Glass surface
3C
Au nanodispersion: 87 ng/cm2
H
AuNP
H
100
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
4)
50 100 150 200 250 300 Time (min)
5.00
10.00
cAu (ng/cm2)
Results of SPR measurements: AuSHbCD gold nanodispersions (0-10 ng/ml Au).
O
O
O
O
O
O O
O
O
O
O
H3 C
O
O
O O
O
OH C 3
O O
H3 C
O
O
O
H3 C
O
H 3C
O
O
O
O
O
O
H3C
O O
H3 C
O
O O
O
O
3C
H
O
O
H 3C
H
C H3
O
O O
O
O O
O
O
O
O
H3C
O
O
C 3
O
O
O
O
O
O
O
O
OH C 3
O
O O
O
O O
3C
H
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
3C
H
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
H3 C
H3 C
O
O
O
O
O
O
O
H
O H3 C
O
H 3C
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
C H3
O
O
O
O
O
O
C H3
O
H 3C
O
O
O
O O
O
O
H 3C
O
O O
C 3
O
H 3C
O
O
O
C H3 O H3 C
O
O O
O
C H3
O
C H3
O
3C
H
O
AuNP
O
O
O
O
O
O O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
Au layer (50 nm) Glass surface
90 80 70 60 Adsorbed amount (ng/cm )
50 2
2
Specific adsorbed amount (ng/cm )
s)
AfB1 molecules attach to bCDs holes of bCDAuNPs
5)
20
AfB1: 16.3 ng/cm2 (1-60 pg/ml)
40 30
15
2 AuSHb CD: 35 ng/cm 10 (3.28 mg/ml)
20 10 0 0
100
5 0
200
Time (min)
0
300 0.02
0.04 cAfB1 (ng/cm3)
Fig. 11. Results of SPR measurements: in first step Au nanodisperson and after added AfB1 (in concentration range 0-32 ng/ml AfB1) in dilute acetonitril solution.
0.06
Biomarker Antitest-2
Antigén-1 Antitest-1
Membránfehérje
Foszfolipid kettősréteg
Nanorészecske
Az animáció kattintásra indul.
Ab oligomer
Blokkoló oldat
7
12 Ab oligomer oldatok
6.8
Dl , nm
10
Dl , nm
Biotinált foldamer
8 6
100 nM
1 mM
6.6 6.4 6.2
Streptavidin
6 140
4
180
220
t, min
2 0 0
40
80
120
160
200
240
t, min
Közeg: PBS puffer oldat Áramlási sebesség: 20 mL/perc 500 mL folyadéktérfogatok kerültek beadagolásra 1. 2. 3. 4. 5.
Lépés: Streptavidin 10 mM Lépés: BSA 1% oldata Lépés: Biotinált foldamer 20 mM oldata Lépés: Ab oligomer 100 nM Lépés: Ab oligomer 1 mM
280
260
A plazmonikus csatolás lehetőségei
Schematic figures of the prepared AuNP samples (a) AuNP(Trp), (b) AuNP(CysTrp), (c) AuNP(Lys) and (d) the plasmonic coupling effect
Fluoreszcencia spekrtumok Au-lizozim rendszereken
HRTEM images of the (a) AuNP(CysTrp) and (b) AuNP(Lys) samples with the ratio of mLys/mAu = 5
XRD mérések
(A) XRD pattern of (a) bulk gold, (b) AuNP(cit), (c) AuNP(Lys) and (d) AuNP(Cys) samples (B) The SAXS curve of (a) AuNP(Lys) sample (cLys=1 mg/ml) and the calculated SAXS curve (GNOM fit)
SAXS mérések
(A) The SAXS curve of the AuNP(Lys) nanoparticles in Kratky representation (B) calculated pair distance distribution function of the AuNP(Lys) samples mLys/mAu = 5 (C) the SAXS curves of Porod representation mAu/mLys = 1:5 (a), 1:15 (b), 1:20 (c)
Langmuir monoréteg vizsgálatok
60
DPPC
(mN/m)
50 40
asolectin
30 20 10
Kibron MicroTroughS
0 0
2000
4000
6000
8000
2
A (mm )
Surface pressure – area isotherms of the model membrane materials: DPPC and asolectin DPPC: dipalmytoil-phosphatidylcholine pure phospholipid
asolectin: mixture of phospholipids and fatty acids
Au nanorészecskék beépülése a lipid membránba 1. Preparation of phospholipid monolayer at liquid/air interface
Schematic representation of the nanoparticles penetration into lipid membrane 1. Preparation of phospholipid monolayer at liquid/air interface 2. Compression 3. Penetration of functionalized nanoparticles into membrane
A monomolekulás réteg átvitele szilárd felületre
Langmuir-Blodgett method
Solid supported monolayer membrane with Au NPs incorporated
Au- cisztein beépülése monoréteges membránba
-O H2N
CH
C
5
O
DPPC S
Au-cys NPs
S S
CH2 CH C H2N
O O-
D, mN/m
H2C
4
Asolectin
3 2
30
1
(mN/m)
25 20 15
Δπ
10 5 0 0
1000
2000
3000
4000
time (s)
Change in the surface pressure of the monolayer during the incorporation
0 0
10
20
30
40
50
0, mN/m
Surface pressure increase (Δπ) as a function of the initial surface pressure (π0) due to the nanoparticle incorporation
Au - glutation beépülése a monoréteges memránba
C
CH
O
C H2
H2 C
HO
C
CH
O CH
O H2C
Au-gsh NPs O
C
H N
S
H2 C
NH2
O H2C C H2
C
N H
CH
C
N H
S
H2 C
C
OH
S
S C O
H N
O C H2
C
4
O
D, mN/m
NH2 HO
OH
3
DPPC
2
Asolectin
1
40
(mN/m)
35 30
0
25
0
20
Δπ
15 10 5 0 0
1000
2000
3000
4000
time (s)
Change in the surface pressure of the monolayer during the incorporation
10
20
30
40
50
60
70
0, mN/m
Surface pressure increase (Δπ) as a function of the initial surface pressure (π0) due to the nanoparticle incorporation
Biofunkcionalizált Au NR beépülése a DPPC membránba
Penetration of the biofunctionalized Au NPs into the different model membranes at different compactnesses ( eg. initial surface pressures)
Au-cys 5 Au-cys Rod 10 nm AR 2.8
D, mN/m
4 3
increase in surface pressure means the penetration of the particles into the membrane
Au-gsh 10 nm
composition and initial surface pressure have marked influence on the penetrated amount
Au-cys 15 nm
2
Au-gsh 15 nm
1 0 0
10
20
30
40
0, mN/m
50
60
70
Biofunkcionalizált Au NR és a phospholipid monoréteg
DPPC
Air O
O
O
O
O
O O O
O O
O O -P O O N
+
N
+
CH
O O O -P O O
N
+
pH 7.4 O O -P O O
N
+
N
CH
O
Au
Au nanoparticles zwitterionic form
C O
H2 C
S
S
-O
H2 N
C
H2 C
+
and DPPC
-O
H2 N
O O
O O -P O O
Aqueous subphase
O O
O O
O O -P O O
O
O O
O O
O O
O O
O O
O O
S
S CH 2 O CH C H2 N O-
Au S
S CH 2 O CH C H2 N O-
TEM image of the 10 nm spherical Au NPs andUV-Vis absorbance spectra of different sized, bioconjugated Au NPs.
TEM image of the Au nanorods, UV-Vis absorbance spectra of the aqueous dispersions of the Au NRs.
Maximum insertion pressure (MIP) and synergy values obtained for the different sized, shaped, surface functionalized nanoparticles with DPPC membrane.
ZnO-Au plazmonikus csatolás
Au és ZnO nanohibrid filmek ZnO (d=3 nm) Langmuir-Blodgett layer
stearic acid (SA) Langmuir-Blodgett layers
layer numbers: 0, 1, 2
Au nanoparticles – d=10 nm Schematic representation of the sample
spray coating technique
quartz
spacer layers between Au and ZnO
ZnO (d=3 nm) Langmuir-Blodgett layer
stearic acid (SA) Langmuir-Blodgett layers
Au film - 47 nm thickness Schematic representation of the sample
SPR substrate
glass
layer numbers: 0, 1, 2, 3, 4, 6
Au-ZnO nanoszerkezetek fotolumineszcenciája Visible emission
UV emission 30
ZnO Au/ZnO Au/SA1/ZnO Au/SA2/ZnO
100 exc.: 350 nm 80
PL intensity (a.u.)
PL intensity (a.u.)
Au NPs based samples
60 40 20
ZnO Au/ZnO Au/SA1/ZnO Au/SA2/ZnO
20
10
exc.: 350 nm 0 300
0
400
500
600
700
800
370
900
intensity
lmax (nm)
558
556
554 ZnO on quartz 552 2
3
distance (nm)
4
5
integrated intensity (a.u.)
wavelength
1
390
400
wavelength (nm)
wavelength (nm)
0
380
100 90 80 70 60 50 40 ZnO on quartz 30 0
1
2
3
distance (nm)
4
5
410
Mag-héj kompozitok Gyógyszermolekula
Negatív töltésű polimer
Mag Pozitív töltésű polimer
Hatóanyag leadás
BSA maggal előállított mag-héj kompozitok Random coil Random coil
BSA/IBU/PSS
bsheet
1648 cm-1
BSA/IBU/PSS/Chit
bsheet
1642 cm-1
Absorbance
1639 cm-1 1649 cm-1
Amid I ( C=O) Amid II ( CN, NH)
BSA/IBU
Random coil
BSA
bsheet
-helix 1650
1600
Wavenumber
1550
1500
(cm-1)
BSA, BSA/IBU, BSA/IBU/PSS valamint a BSA/IBU/PSS/Chit infravörös spektruma, valamint a másodlagos szerkezet változása az amid I sáv eltolódása alapján
BSA/IBU/PSS/Chit fénymikroszkópos képe
BSA/IBU/PSS/Chit TEM képe
Hatóanyag leadás vizsgálata IBUPROFEN meghatározása: BSA mag jelenlétében: 264 nm, 272 nm Szilika mag jelenlétében: 222 nm, 264 nm, 272 nm Mérés: Foszfát pufferben (PBS, pH=7,4) HANSON cellavertikális diffúzió cella Két kamrából áll: donor and receiving (fogadó) chambers Membrán :Dialysis tubing cellulose membrane Cella térfogata: 4ml, de a pontos térfogatot meg kell határozni
Keverés sebességet állandó értéken kell tartani a mérés során.
Elsőrendű Sebességi Modell a kioldódás mechanizmusára 80 BSA/IBU BSA/IBU/PSS BSA/IBU/PSS/Chit
70
First-order Rate Model R2=0,9097 kd=0,0051s -1
Release %
60 50 40
First-order Rate Model R2=0,9823 kd=0,0016s -1
30 20
First-order Rate Model R2=0,9822 kd=0,0017s -1
10 0 0
50
100
150
200
250 t (min)
300
350
400
450
500
1800
SIL/IBU/PEI TEM képe
SIL/IBU/PEI/PSS
SIL/IBU/PEI
448 cm-1
Si-O-Si
440 cm-1 440 cm-1
as Si-O s SO3-
SIL/IBU s Si-OH
as Si-O SIL
1200 1000 Hullámszám (cm-1)
800
600
437 cm-1
-1 1051 cm-1 1065 cm 1054 cm-1
1400
C-C (benzol vázrezgése)
1069 cm-1
as SO3-
CH2 1452 cm-1
1600
1170 cm-1
N-H 1547 cm-1
1712 cm-1
Abszorbancia
C=O
Mezopórusos szilika maggal előállított mag-héj kompozitok
400
A szilika, valamint a mag-héj kompozitok infravörös spektruma A szilanol csoportok, valamint az ibuprofen karboxil csoportjai közt létrejött Hkötések a szilika pórusaiban
Elsőrendű Sebességi Modell a kioldódás mechanizmusára
80 SIL/IBU SIL/IBU/PEI SIL/IBU/PEI/PSS
70
First-order Rate Model R2=0,9846
Release rate %
60
kd=0,0024s-1
50 First-order Rate Model
40
R2=0,9854
30
kd=0,001s-1
20
First-order Rate Model R2=0,9902
10
kd=0,0014s-1
0 0
100
200
300 t (min)
400
500
600
„Hollow spheres” előállítása biokompatibilis poliszacharidokból •kitozán, alginát - biokompatibilis, biodegradábilis, -alkalmazhatóságát széleskörűen vizsgálják hatóanyagok és vakcinák szállítására
nyálkahártyán keresztül •CaCO3 -nem toxikus, -mérete és morfológiája szabályozható, -könnyen eltávolítható,
•CMC -összekapcsolódik a Ca+ ionokkal, ezáltal szabályozza a képződő CaCO3 részecskék méretét, -úgy viselkedik mint egy „ragasztó”, összefogja a nanorészecskéket egymással és gömb alakú mikrorészecskéket formál.
(a) Kitozán, (b) Na-alginát és (c) karboximetil-cellulóz (CMC) szerkezeti képlete
Kitozán alginát „hollow spheres” előállítása
+ kitozán
+ alginát
NaCl közeg,
NaCl közeg,
pH=5
pH=5
CaCO3(CMC) templát + n × (kitozán, alginát)
+ EDTA
+Glutáraldehid
CaCO3(CMC) + n ×
0.05% kitozán (0.5M NaCl, pH=5) 0.1% alginát(0.5M NaCl, pH=5)
CaCO3(CMC) templát (Fénymikroszkópos felvétel)
CaCO3(CMC)-(chit-alg)3 (TEM felvétel)
CaCO3(CMC )-(chit-alg)3
+ 1% Glutáraldehid + Rhodamin B
+ 0.2M EDTA
CaCO3(CMC)/(Chit-Alg)3 – Rhodamin B fénymikroszkópos felvétele
(chit-alg)3 hollow spheres fénymikroszkópos felvétele
Munkatársak MTA-SZTE Szupramolekuláris és Nanoszerkezetű Anyagok Kutatócsoport
Juhászné Dr. Csapó Edit
Dr. Majzik Andrea Dr. Benkő Mária
Juhász Ádám
Garabné Ábrahám Nóra
Varga Viktória
Varga Noémi
Dr. Janovák László
Dr. Sebők Dániel Tallóssy Szabolcs Szalmáné Ménesi Judit
Veres Ágnes
