A flagellin fehérje polimerizációjának jellemzése

A flagellin fehérje polimerizációjának jellemzése

Doktori (PhD) értekezés

Készítette:

Gugolya Zoltán okleveles fizikus

Készült a Pannon Egyetem Kémia Doktori Iskolájához tartozóan

Fizika Intézet 2008

A flagellin fehérje polimerizációjának jellemzése

Értekezés doktori (PhD) fokozat elnyerése érdekében a Pannon Egyetem Kémia Doktori Iskolájához tartozóan.

Írta: Gugolya Zoltán

A jelölt a doktori szigorlaton …......... % -ot ért el.

Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom: Bíráló neve: …........................ …................. igen /nem ………………………. (aláírás) Bíráló neve: …........................ …................. igen /nem ………………………. (aláírás)

A jelölt az értekezés nyilvános vitáján …..........% - ot ért el. Veszprém,

…………………………. a Bíráló Bizottság elnöke

A doktori (PhD) oklevél minősítése…................................. ………………………… Az EDT elnöke

Kivonat Egyes baktériumok flagellumok segítségével mozognak. A flagellumok egy, a sejtmembránba

ágyazódó

motorból

és

a

hozzá

kapcsolódó

5-10 μm hosszúságú

filamentumból állnak, amelyet flagellinmolekulák építenek fel. A Salmonella typhimuriumból származó flagellinmolekula terminális régiói monomer állapotban rendezetlenek. A feltételezések szerint ezek a régiók vesznek részt a filamentumok belső csatornájának felépítésében, fontos szerepet játszanak az önszerveződő képesség szabályozásában. A flagellumok felépülésekor szinte valamennyi fehérjének keresztül kell jutnia a citoplazma membránján és néhánynak még a külső membránon is. Ez a folyamat a flagellumspecifikus export. Az exportrendszer tagjai közül a FliS dajkafehérje a flagellin fehérje szintetizálódása után meggátolja annak polimerizálódását a citoplazmában és elszállítja az exportrendszerhez. A FliI fehérje az exportálandó molekulát megköti és ATP bontással nyert energiával segíti annak membránon való átjutását. A FliH a FliI ATP-áz aktivitását szabályozza. A kutatásoknak célja, hogy a flagellinmolekula önszerveződőképességét alaposan megismerve és ezeket az ismereteket felhasználva, genetikailag módosított flagellinekből olyan filamentumokat építhessünk, amelyek különböző molekulák felismerésére és megkötésére képesek. A kötőhelyek a filamentum felületén több ezer példányban is megjelenhetnek. Az így létrehozott stabil filamentumok a későbbiekben bioszenzorok alapelemeiként szolgálhatnak. A disszertációban limitált proteolízissel előállított, különböző mértékben csonkított, fluoreszcens festékkel jelölt flagellin fragmentumokkal, fluoreszcencia rezonancia energia transzfer segítségével a szerző megmutatja, hogy a flagellin N- és C-terminálisai pontosan hogyan alakítják ki a filamentum belső szerkezetét. A szerző izotermális titrációs kaloriméterrel jellemezte a FliI-FliH kölcsönhatást és kimutatta, hogy a FliH igen erős, specifikus Zn2+-ion és foszfátkötő tulajdonsággal rendelkezik, valamint a FliH foszfolipáz-C enzim aktivitást mutat. A szerző izotermális titrációs kaloriméterrel kimutatta a FliS-flagellin 1:1 arányú kötődését és igazolta a flagellin C-terminálisának szerepét e komplex kialakulásában.

Abstract Characterization of the flagellin protein polymerization

Bacteria swim by means of flagella. Helical filaments of bacterial flagella are constructed from subunits of a single protein, flagellin, by a self-assembly process. Terminal regions of flagellin have no ordered tertiary structure in the monomeric form. They belong to the most conserved parts of the molecule and are thought to be essential in assembly regulation. There is a growing interest in understanding the role of unstructured protein segments in controlling macromolecular recognition and self-assembly. External flagellar proteins, lying beyond the cytoplasmic membrane, are synthesized in the cell and exported by the flagellum-specific export apparatus from the cytoplasm to the site of assembly through the central channel of the flagellar filament. FliS acts as a substratespecific chaperone facilitating the export of flagellin. FliI is an ATPase whose enzymatic activity is necessary to drive the export process, while FliH is believed to function as a negative regulator of FliI. Various terminally truncated fragments of flagellin were prepared and their polymerization ability was investigated. FRET was used to monitor binding of truncated flagellin fragments to the end of flagellar filaments. FliI–FliH complex was quantitatively characterized by isothermal titration calorimetry (ITC) to determine stoichiometry and binding enthalpy. The FliI–FliH interaction is too weak to allow effective binding in the physiological concentration range. Isothermal titration calorimetry was used to show, that FliH can specifically bind zinc atoms and FliH is a phosphate binding protein. The phospholipase C activity of FliH was demonstrated with spectrofluorimeter experiments. Interaction of FliS with flagellin was characterized by isothermal titration calorimetry producing an association constant and a binding stoichiometry of 1:1. Experiments with truncated FliC fragments demonstrated that the C-terminal disordered region of flagellin is essential for FliS binding.

Zusammenfassung Die Charakterisierung der Polymerisation des Flagellin-Protein

Durch Flagellen sind Bakterien beweglich. Das bakterielle Filamentum besteht aus Flagellinmolekülen. Die terminalen Regionen des Flagellinmoleküls des Salmonella typhimuriums sind in monomerem Zustand ungeordnet. Nach der Hypothese nehmen.diese Regionen am Aufbau des inneren Kanals des Filamentums teil, sie spielen eine wichtige Rolle bei der Regelung der selbstorganisatorischen Fähigkeit. Beim Aufbauen des Flagellums muß fast jedes Protein durch die Membran des Cytoplasmas transportiert werden, einige sogar durch die äußere Membran. Dieser Prozeß ist der flagellumspezifische Export. Das Chaperon FliS verhindert die Polymerisation des Flagellinproteins im Cytoplasma, und transportiert es zum Exportapparat. Das FliI-Protein bindet das zu exportierende Molekül, und hilft mit der Energie der ATP-Hydrolyse dessen Export durch die Membran. Die Aktivität der FliI-ATPase wird durch FliH geregelt. Das Flagellin wurde mit limitierter Proteolyse hergestellt, in verschiedenem Maße verkürzt, und mit fluoreszierender Farbe gezeichnet. Mit Hilfe von FRET wird präsentiert, wie durch die N- und C-Terminale des Flagellins die innere Struktur des Filamentums genau gestaltet wird. Die FliI-FliH-Interaktion wurde mit isothermaler Titrationskalorimetrie (ITC) charakterisiert und es wurde nachgewiesen, daß FliH über eine sehr starke, spezifische Zn2+Ion- und phosphatbindende Eigenschaft verfügt, sowie daß FliH eine Phospholipase C Enzymaktivität zeigt. In der Dissertation wurde mit Hilfe von ITC die 1:1 Bindung zwischen FliS und Flagellin gezeigt, sowie die Rolle der C-terminalen Region des Flagellins bei der Entsehung dieses Komplexes nachgewiesen.

Tartalomjegyzék Kivonat ....................................................................................................................................... 4 Abstract ...................................................................................................................................... 5 Zusammenfassung...................................................................................................................... 6 Tartalomjegyzék......................................................................................................................... 7 1. Bevezetés............................................................................................................................ 8 2. Irodalmi áttekintés............................................................................................................ 10 2.1. A bakteriális flagellum szerepe és felépülése .......................................................... 10 2.2. A flagellumspecifikus exportrendszer komponensei ............................................... 14 2.3. A flagellinmolekula szerkezete ................................................................................ 17 3. Alkalmazott módszerek, felhasznált anyagok .................................................................. 21 3.1. Fotometria ................................................................................................................ 21 3.2. Oszlopkromatográfiás technikák.............................................................................. 23 3.2.1. Gélszűrés .......................................................................................................... 23 3.2.2. Ioncserés kromatográfia ................................................................................... 24 3.2.3. Affinitási kromatográfia................................................................................... 25 3.3. Dialízis ..................................................................................................................... 26 3.4. A poliakrilamid gél elektroforézis (PAGE) ............................................................. 26 3.5. Izotermális titrációs kaloriméter (ITC) .................................................................... 29 3.6. Spektrofluoriméter ................................................................................................... 33 3.6.1. Fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FRET) ...................................... 34 3.7. Felhasznált anyagok ................................................................................................. 34 4. Kísérleti eredmények........................................................................................................ 38 4.1. A flagellin tisztítása.................................................................................................. 38 4.2. A flagellin fragmentumok előállítása....................................................................... 40 4.2.1. F49 és F46 fragmentum.................................................................................... 40 4.2.2. F48 fragmentum ............................................................................................... 44 4.2.3. F40 fragmentum ............................................................................................... 45 4.3. Jelölés fluoreszcens festékekkel............................................................................... 46 4.4. Filamentum törzsoldat készítése .............................................................................. 48 4.5. Fragmentumok kötődésének vizsgálata spektrofluoriméterrel ................................ 49 4.6. A FliH fehérje szerepe.............................................................................................. 53 4.6.1. FliH fehérje tisztítása affinitás kromatográfiával............................................. 53 4.6.2. A FliH-FliI kölcsönhatás jellemzése ITC méréssel.......................................... 56 4.6.3. A FliH fehérje kötési tulajdonságainak vizsgálata........................................... 57 4.6.4. A FliH fehérje foszfolipáz C aktivitása............................................................ 61 4.7. FliS – flagellin kölcsönhatás .................................................................................... 64 5. Összefoglalás.................................................................................................................... 67 Irodalomjegyzék....................................................................................................................... 71

1. Bevezetés Egyes baktériumok flagellumok segítségével mozognak. A flagellumok egy, a sejtmembránba ágyazódó motorból és a hozzá kapcsolódó filamentumból állnak, amelyet flagellinmolekulák építenek fel. A filamentumok külső részének szerkezetét röntgendiffrakciós mérések révén már atomi pontossággal ismerjük, a belső rész felépítéséről azonban keveset tudunk. A Salmonella typhimuriumból származó flagellinmolekula terminális régiói monomer állapotban rendezetlenek. A feltételezések szerint ezek a régiók vesznek részt a filamentumok belső csatornájának felépítésében, s fontos szerepet játszanak az önszerveződőképesség szabályozásában. A baktériumok flagelláris rendszerének felépülésekor, a filamentumot felépítő szinte valamennyi fehérjének keresztül kell jutnia a citoplazma membránján és néhánynak a külső membránon is. Ez a folyamat a flagellumspecifikus export, ami sok hasonlóságot mutat a fertőző baktériumok mérgező fehérjéinek kijuttatásával és szintén a III-as típusú exportrendszer csoportjába tartozik. Az exportrendszer tagjai közül az eddigi ismereteink szerint a FliI fehérje az exportálandó molekulát megköti és ATP bontással nyert energiával segíti annak membránon való átjutását. Feltevések szerint a FliH a FliI ATP-áz aktivitását gátolja, amíg az exportrendszer képessé nem válik az exportálandó molekulák továbbítására a citoplazma membránon át, hogy azok beépüljenek a növekvő flagelláris szerkezetbe. A flagellumspecifikus exportrendszer egyik tagjának, a FliS dajkafehérjének a feladata az, hogy a flagellin fehérje riboszómán történő szintetizálódása után meggátolja annak polimerizálódását a citoplazmában és elszállítsa az exportrendszerhez. Munkám során arra a kérdésre kerestem választ, hogy a szomszédos flagellin alegységek N- és C-terminálisai pontosan hogyan alakítják ki a filamentum belső szerkezetét. Szeretném kísérleti eredményekkel alátámasztani azt a hipotézist, miszerint az axiális irányban szomszédos flagellin alegységek N- illetve C-terminális régiói egymásba fonódva építik fel a filamentumok belső gyűrűjének szerkezetét. A FliI-FliH komplexet eddig csak affinitás blottolással, illetve gélszűréssel vizsgálták, a FliI-FliH kötés erősségéről csak kevés információval rendelkezünk. Szeretném precízen jellemezni a FliI-FliH kölcsönhatást. Munkám során szeretném tisztázni a FliH fehérje szerepét a flagellumspecifikus exportrendszer működésében, mert a FliI ATP-áz

8

aktivitása csupán tizedére csökkent a FliH nagy feleslegű hozzáadásának hatására, noha időnként a FliI működésének teljes gátlására is szükség van. Szeretném

a

flagellinmolekula

és

a

FliS

fehérje

közötti

kölcsönhatás

sztöchiometriáját és energetikáját izotermális titrációs kaloriméterrel jellemezni, a kölcsönhatást kialakító flagellin régiót lokalizálni. Ezeknek a kutatásoknak azért lehet jelentősége, mert a flagellinmolekula önszerveződőképességét alaposan megismerve és ezeket az ismereteket felhasználva, genetikailag módosított flagellinekből olyan filamentumokat építhetünk, amelyek különböző molekulák felismerésére és megkötésére képesek. A kötőhelyek a filamentum felületén több ezer példányban is megjelenhetnek. Az így létrehozott stabil filamentumok a későbbiekben bioszenzorok alapelemeiként szolgálhatnak, amelyek a környezetvédelmi analitikában, gyógyszeriparban széleskörű alkalmazásra számíthatnak

9

2. Irodalmi áttekintés 2.1.

A bakteriális flagellum szerepe és felépülése Egyes baktériumok az életben maradáshoz helyváltoztatással keresik meg a számukra

legkedvezőbb feltételeket. Érzékelik a hőmérséklet változását, egyes vegyületek jelenlétét a környezetükben, és ezeknek a függvényében változtatják mozgási irányukat a számukra kedvező feltételeket biztosító hely felé. Mozgásszervük a bakteriális flagellum, melynek segítségével úsznak (2.1. ábra). A Salmonella typhimurium törzsbe tartozó baktériumok is számos flagelláris filamentummal rendelkeznek. Ezek a filamentumok haladó mozgáskor egyetlen helikális köteggé állnak össze, és összehangolt forgásukkal propellerként hajtják előre a baktériumot 20-30 μm/s-os sebességgel [1]. A filamentumok vastagsága 23 nm, hosszúsága 15 μm is lehet. A filamentum a flagellin fehérje több tízezer példányából épül fel. A flagelláris filamentumok több figyelemre méltó tulajdonsággal rendelkeznek. Az egyik érdekes tulajdonságuk az önszerveződő képesség, azaz a flagellin monomerek megfelelő körülmények között spontán módon képesek polimerizálódni a natívval megegyező szerkezetű filamentumokká. Másik figyelemre méltó sajátosságuk, hogy a környezeti tényezőktől függően, egymástól jól megkülönböztethető helikális formákba képesek átrendeződni reverzibilis módon. Ez a jelenség a polimorfizmus. A helikális szerkezeti átrendeződéseket előidézheti a hőmérséklet, az ionerősség vagy a pH megváltoztatása, de mechanikai erőhatás is kiválthatja őket [1]. Minden

egyes

filamentum

egy

sejtmembránba

ágyazott

50 nm

átmérőjű

protongradienssel hajtott motorból indul ki, amely akár 90000-es percenkénti fordulatra is képes. A motor forgásiránya néhány másodpercenként egy rövid időre (0,1 s) megfordul, ennek hatására a helikális köteg szétválik, egymástól függetlenül mozognak a filamentumok. Ekkor létrejön egy „bukdácsoló” mozgás, ami rövid ideig tart az egyenes irányú mozgáshoz képest, majd a motor forgásiránya újra megfordul és a baktérium véletlenszerűen irányt változtatva tovább úszik (2.2. ábra) [1].

10

2.1. ábra Elektronmikroszkópos felvétel a Salmonella typhimurium baktériumról, amelyen jól láthatók a flagelláris filamentumok [1]

2.2. ábra Sematikus rajz, illetve sötétlátóterű mikroszkóppal készített felvétel a baktérium úszási mintájáról [1] A motor tengelye és a flagelláris filamentumok közti kapcsolatot a kampó (hook) biztosítja, amely erősen görbült szerkezetű. A kampó hossza 50 nm, vastagsága 20 nm körül van. A kampó képes a forgástengely irányának a megváltoztatására, mivel a filamentumok

11

nem a motor tengelye körül, hanem arra közel merőlegesen a baktérium hossztengelye körül forognak. A kampó szintén egy fehérjéből, a hook fehérje 120 példányából épül fel. A filamentumok és a kampó között a kapcsolatot egy másik fehérjecsoport, a HAP fehérjék biztosítják. A HAP1 és a HAP3 fehérjék egy átmeneti réteget hoznak létre a két rész között. Fontos szerepe van a harmadik HAP típusú fehérjének, a HAP2-nek, mely a filamentumok végeit lezáró „sapkaként” működik. A HAP2 jelenléte nélkülözhetetlen a flagellin monomerek számára, melyek a citoplazmában szintetizálódnak, keresztülhaladnak a flagellum központi csatornáján, és a filamentum végére polimerizálódnak. A HAP2 hiányában a flagellin monomerek egyszerűen kidiffundálnának a külső környezetbe [2]. A HAP2 sapka speciális módon kötődik a filamentum végéhez, mivel ez a kötődés egyrészt nagyon erős, másrészt az egyes flagellin alegységek beépülésekor a sapka mégis képes elengedni azt a részét a filamentumnak, ahová a flagellin monomer beépül (2.3. ábra) [1]. A bakteriális flagellum kialakulása egy lépésről-lépésre történő felépülési folyamat, amit különböző mutáns baktériumok által létrehozott flagelláris szerkezeteket vizsgálva tanulmányoztak. Először a bazális testet felépítő szerkezetek alakulnak ki, majd a különböző szerkezeti egységek egymást követő sorrendben. Az építkezés a sejtből kifelé haladva történik, kivéve az L és a P gyűrűt, és mindig a növekvő filamentum végére épül be a következő fehérje monomer [1]. Az axiális fehérjéknek tehát, amelyek a sejtben szintetizálódnak, át kell jutniuk a citoplazma membránon, néhánynak pedig a külső membránon is. Szerkezeti vizsgálatok már a 60-as években megmutatták, hogy a filamentum nem tömör, hanem egy belső csatornával rendelkezik és ma már az is ismert, hogy a kampó is hasonló szerkezetű. Az axiális fehérjék a kampó, majd a filamentum belső üreges részén keresztül jutnak el annak távolabbi végébe, ahol beépülnek a növekvő szerkezetbe [3].

12

2.3. ábra A bakteriális flagellum szerkezete A flagellumot felépítő különböző fehérjekomponenseket más színek jelölik. A filamentum belső csatornáját szaggatott vonal jelzi A sejtből kijuttatott axiális fehérjék három alcsoportba sorolhatók. A helikális filamentumokat felépítő flagellin elsődleges szerkezete szerint a HAP3 fehérjével mutat rokonságot. A hook fehérje nem hasonlít a flagellinhez, de terminális régióit tekintve nagymértékű hasonlóságot mutat a motor tengelyét alkotó rod fehérjékkel, és a HAP1 fehérjével. A harmadik alcsoportba a HAP2 fehérje tartozik, amely egyik axiális fehérjével sem mutat szekvenciális hasonlóságot. Az axiális fehérjék közös jellemzője, hogy nagy 13

méretű rendezetlen terminális régiókkal rendelkeznek [4]. Az egyes csoportokon belül a szekvenciális hasonlóság a rendezetlen terminális régiókban a legnagyobb. A flagelláris filamentumot felépítő flagellinnél és a többi axiális fehérje esetén is hasonló jellegzetességeket

mutattak

ki.

A

terminális

rendezetlen

régiók

a

leginkább

konzerválódottak, ami fontos szerkezeti és funkcionális szerepükre utal.

2.2.

A flagellumspecifikus exportrendszer komponensei Ahhoz, hogy a sejtben termelődő axiális fehérjék eljussanak beépülési helyükre,

szükséges

egy

exportrendszer,

amely

felismeri

az

exportálandó

fehérjéket,

megkülönböztetve azokat a sejtplazmában található más fehérjéktől, és elvégzi a kijuttatásukat a sejtmembránon keresztül [5]. Ez a rendszer fontos szerepet játszik a filamentáris rendszer felépülése szempontjából, ennek ellenére sokáig csak a filamentum szerkezetének a meghatározásával foglalkoztak. Az időközben felfedezett flagelláris gének sokasága azt mutatta, hogy létezik a sejtben egy olyan rendszer, amelynek a funkciója még nem tisztázott. A gének funkcióinak a megismerésével vált lehetővé később az exportrendszer

egyes

komponenseinek

azonosítása,

majd

működésük

alaposabb

megismerése [6,14]. Morfológiai vizsgálatok alapján feltételezik, hogy az exportrendszer tagjai a bazális test citoplazmikus oldalán a C gyűrű belsejében, illetve a sejtmembránban helyezkednek el. Az exportrendszert felépítő fehérjék (2.4. ábra) a FlhA, FlhB, FliH, FliI, FliO, FliP, FliQ és FliR [15]. A rendelkezésre álló ismeretek szerint a FliO, FliP, FliQ és FliR valószínűleg integrális membránfehérjék, a FliI és a FliH citoplazmikus, vizes közegben működő fehérjék, míg a FlhA és a FlhB perifériális membránfehérjék, amelyek egy kisebb membránba ágyazott és egy nagyobb citoplazmikus doménből állnak. Az egyes fehérjék szerepének meghatározására különböző mutáns baktériumokkal végeztek kísérleteket és azt találták, hogy a FlhA, FliH és FliI fehérjéknek van meghatározó jelentőségük az exportfolyamatban [15]. Az exportrendszerrel kapcsolatosan azt is megfigyelték, hogy különböző patogén baktériumok virulens fehérjéinek a sejtből való kijuttatása nagy hasonlóságot mutat a flagelláris fehérjék exportjával. Nyolc olyan fehérjét is azonosítottak, amelyek homológiát mutatnak a flagellumspecifikus exportrendszerben megtalálható fehérjékkel. Ez a rendszer szintén a III-as típusú exportrendszerbe tartozik, amelyben a kijuttatott fehérjék nem rendelkeznek semmiféle szignálszekvenciával vagy lehasítható szignálpeptiddel, ami jelként

14

szolgálna a membránon való átjuttatás során. Jelenleg sem pontosan ismert, hogy hogyan kerülnek az axiális fehérjék a lumenbe, és jutnak el a flagellum szűk csatornáján keresztül a beépülési helyükre [1, 14 ,15].

2.4. ábra A flagellumspecifikus exportrendszer feltételezett modellje [15] Meghatározták az exportrendszer legtöbb elemét, és azok helyét a sejtben (2.4. ábra). A membránba ágyazott fehérjék (FlhA, FlhB, FliO, FliP, FliQ, és FliR) helye valószínűleg az MS gyűrű központi üregében van a flagelláris bazális testben, az FlhA, és FlhB fehérjék hidrofil doménjei pedig benyúlnak a motor C gyűrűjének az üregébe. Feltételezték, hogy a chaperon fehérjék (FliS, és FliJ) a FliI-vel és a FliH-val lépnek kölcsönhatásba, de ezt nem tudták eddig közvetlen módon bizonyítani [15]. A kutatások szerint a FliI-nek szerepe van a flagelláris fehérjék kijuttatásában, mivel katalizálja az ATP-hidrolízist, az így nyert energia az axiális fehérjék sejtből való kijuttatását fedezi [16, 17]. Ezt támasztja alá az is, hogy a FliI fehérje aminosavszekvenciája hasonlóságot mutat egyes baktériumok virulens fehérjéinek szekréciójára specializálódott exportrendszerek transzlokációt végző komponenseivel [16]. Herzog és munkatársai

15

megmutatták, hogy ez a funkció csak egy multikomplex rendszerben jelentkezik, mint az F0F1 ATP-áz β alegysége esetén is [18]. Azt vizsgálták, hogy kölcsönhatásba lép-e a FliI fehérje az axiális fehérjék reprezentánsaként választott flagellinnel és a kampó (hook) fehérjével, valamint, hogy ennek milyen hatása van a fehérje ATP-áz aktivitására. Enzimaktivitás mérésekkel azt találták, hogy a flagellin, vagy a hook fehérje jelenléte stimuláló hatással van a FliI ATP-áz aktivitására [16]. A FliI 456 aminosavból álló fehérje. Limitált proteolízisével meghatározták azon részeit, amelyek felelősek az ATP-áz funkcióért, valamint egyéb fehérjékkel való kölcsönhatásért. A FliI fehérje két szakaszra osztható. A fehérje N-terminális végének kb. 110 aminosavból álló része a flagellinmolekula N-terminálisára specifikus régió, valószínűleg ez a rész felelős a FliH fehérjével való kölcsönhatásért is. A 110-456 aminosavnyi rész a C-terminális szakasz, amely a fehérje ATP-áz aktivitásáért felelős [19]. Azt találták, hogy a 235 aminosavból álló FliH gátolja a FliI ATPáz aktivitását [19, 20]. Eddigi ismereteink szerint a FliH dimer molekulákat képez oldatban, míg a FliI monomerként fordul elő, a kialakult komplex pedig egy heterotrimer molekula lesz. Megállapították, hogy a kialakult (FliH)2FliI komplex ATP-áz aktivitása tízszer kisebb lett, mint a monomer FliI fehérjénél mért aktivitás [19]. Az axiális komponensek monomer formában szállítódnak, és csak a flagellum távolabbi végén épülnek be, ezért kell lennie valamilyen mechanizmusnak, ami meggátolja a sejten belüli polimerizációt. Nagyon fontos, hogy ezek a komponensek ne a sejten belül polimerizálódjanak, hanem a megfelelő helyen, ahol betöltik funkciójukat. Feltételezések szerint a polimerizációt a rendezetlen terminális régiók akadályozzák meg. Mivel a rendezetlen terminális régiójú monomer molekulák nem képesek egymáshoz kapcsolódni, nem indul meg a polimerizáció. Publikációk alapján feltételezhetjük, hogy a sejten belüli polimerizáció megakadályozásában a segítő vagy chaperon fehérjék is közreműködnek, melyek a monomer állapotú axiális fehérjék rendezetlen terminális régióihoz kapcsolódnak és megakadályozzák a fehérje monomerek polimerizációját [3]. Ilyen chaperon a FliS fehérje, amely a flagellumspecifikus exportrendszer részeként a flagellin alegységekhez kötődik, és meggátolja azok sejten belüli összekapcsolódását [6]. A FliS 135 aminosavból álló 14,7 kDa molekulatömegű fehérjéről [21] a kutatások egyértelműen kiderítették, hogy a flagellin fehérjék specifikus transzportját végzi [22]. A FliS azáltal, hogy a flagellinmolekula terminális régióihoz kötődik, meg tudja akadályozni a flagellin alegységek degradációját, aggregációját és polimerizációját a citoplazmában.

16

Gélszűrő kromatográfiával vizsgálva azt tapasztalták, hogy a FliS az oszlopról 14,7 kDa helyett körülbelül 30 kDa-nak megfelelő helyen jött le, ebből azt a következtetést vonták le, hogy a FliS stabil dimereket képez. Szintén ezzel a módszerrel kimutatták, hogy ez a dimer képes kötődni a flagellin monomerhez [22]. A flagellinmulekula különböző mértékű limitált proteolízisével végzett kísérletek eredményei szerint a flagellin C-terminális régiójának (rendezetlen C-terminális régió és még 40 aminosav) fontos szerepe van a FliS-hez való kötődésben [23].

2.3.

A flagellinmolekula szerkezete A flagellinmolekula polimerizációs tulajdonságait vizsgálva többen megfigyelték,

hogy a filamentum kialakulása során a flagellinmolekula nagymértékű konformációs átrendeződésen megy keresztül. Ennek szerkezeti okát kutatva limitált proteolízissel és spektroszkópiai mérésekkel kimutatták, hogy a Salmonella typhimuriumból származó flagellin 494 aminosavból álló, 52 kDa molekulatömegű fehérje terminális régiói, 66 Nterminális és 44 C-terminális aminosavnyi rész, oldatban nem rendelkeznek kompakt, stabilis térszerkezettel [1]. Ezek a részek proteolitikus enzimekkel nagyon gyorsan leemészthetők, ami azt mutatja, hogy ezek a peptidláncok az emésztő enzimek számára szabadon hozzáférhetőek. A terminális régiók eltávolítása után egy viszonylag stabil, kb. 40 kDa molekulatömegű fragmentum (F40) marad vissza, amely igen lassan tovább emészthető egy 27 kDa-os fragmentummá (F27). Az F27 fragmentumról kimutatták, hogy az F40 fragmentumhoz képest 112 N-terminális és 28 C terminális aminosav hiányzik róla [6]. (67)

(418) (446)

(179)

NH2

COOH

F27 F40 2.5. ábra Az F40 és F27 fragmentumok elhelyezkedése a flagellinmolekulában [6] Az F40 és F27 fragmentumok hődenaturációja reverzibilis, ami azt mutatja, hogy önálló térszerkezet kialakítására képes egységek (domének) alkotják őket. Kalorimetriás olvadásgörbékből megállapították, hogy a flagellin molekula magja 3 doménből épül fel. Az F27 fragmentumnak megfelelő régió két erős kölcsönhatásban álló doménből áll (G1, G2),

17

míg a harmadik (G3) domén nem folytonos, a 66-177 és a 423-450 szakaszok együttesen alkotják

(2.5. ábra).

Másodlagosszerkezet-jóslással

és

CD-spektrumok

analízisével

kimutatták, hogy az F27 fragmentum doménjei β-szerkezetűek, míg a G3 domén helikális és β-szerkezetet egyaránt tartalmaz. A G3 domén helikális szerkezete meghatározó szerepet játszik a filamentumok struktúrájának kialakításában [7]. A terminális régiókról 1H-NMR-spektroszkópiás vizsgálatokkal kimutatták, hogy gyors, termikus fluktuációkat végeznek. Pásztázó mikrokalorimetriás eredmények szerint ezen régiók belső stabilitása elhanyagolható [4]. A terminális régiók azonban mégsem teljesen rendezetlenek, CD-spektroszkópiás mérésekkel igazolták, hogy nagy mennyiségű ahelikális szerkezeti elemeket tartalmaznak, amit a másodlagosszerkezet-jóslások is megerősítettek [7].

2.6. ábra A flagellinmolekula szerkezeti egységei [7] A flagellin molekula rendezetlen terminális régiói a molekula legkonzervatívabb részét képezik, ami a polimerizációban játszott fontos szerepükre utal. Ennek tisztázása nagy specifitású

enzimekkel

végzett

irányított

emésztéssel

történt.

Az

oldatbeli

rendezetlenségüknél fogva a terminális régiók enyhe emésztési körülmények között, nagy specifitású proteázokkal tervezett módon csonkíthatók. Az Endoproteináz Lys-C-nek (ELC) és az Endoproteináz Glu-C-nek (V8) egyaránt két hasítási helye található a rendezetlen terminális régiókban. Az ELC enzim az N terminálison hasít a 19. és az 58. helyen álló lizin után, így létrejöhet egy 49 (F49) és egy 46 kDa-os (F46) fragmentum. A V8 enzim első hasítóhelye a C-terminálison a 461. helyen álló, a második az N-terminálison a 29. helyen álló glutaminsav után található. V8 enzimmel történő limitált emésztés során egy 48 (F48) és egy 44 kDa-os (F44) fragmentum kapható. Tripszin segítségével a rendezetlen terminális

18

régiók teljesen eltávolíthatók, így a 40 kDa-os (F40) fragmentum, a flagellinmolekula kompakt stabil magja állítható elő. Az így kapott különböző méretű terminálisan csonkított fragmentumok FPLC ioncserélő kromatográfiás eljárással tisztíthatók [8]. A fragmentumok polimerizációs tulajdonságait vizsgálva azt tapasztalták, hogy többségük képes volt ammónium-szulfát jelenlétében filamentumokat létrehozni, ezek stabilitása azonban a hiányzó szegmensek méretétől függően kisebb volt, mint az eredeti flagellinből felépülő filamentumoké. A teljesen csonkított F40 fragmentum semmilyen körülmények között sem volt képes filamentumot alkotni. A csonkított fragmentumokból előállított filamentumok gyakorlatilag elvesztették polimorfikus képességüket, sem a pH, sem az ionerősség változtatásával nem sikerült polimorfikus átmeneteket előidézni a szerkezetükben. A fragmentumok polimerizációs viselkedése szempontjából hasonlónak bizonyult, hogy a C-terminális vagy az N-terminális régiók tartalmazzák a csonkítást. Ez arra utal, hogy a két régió együtt vesz részt a filamentum felépülésében. Ezek a kísérletek azt mutatták, hogy a terminális régiók jelentős része nem szükséges a filamentáris szerkezet kialakításához, de meghatározó szerepük van a stabilizálásban, az önszerveződésben és a polimorfikus képességben [8]. A filamentumok röntgendiffrakciós és elektronmikroszkópos szerkezetanalízisével kimutták, miként építi fel a flagellinmolekula a filamentum szerkezetét. A filamentumok magját két koncentrikus gyűrű alakú struktúra alkotja. A különböző baktériumfajokból származó flagellinek aminosavsorrendjének összehasonlító elemzése azt mutatta, hogy a molekula kb. 180 N-terminális és kb. 100 C-terminális aminosavnyi része a legkonzerválódottabb.

A

csonkított

fragmentumokból

képzett

filamentumok

szerkezetvizsgálata azt mutatta, hogy a monomer állapotban rendezetlen terminális régiók egymással erős kölcsönhatásban elsősorban a belső gyűrű felépítésében vesznek részt. Ez a kölcsönhatás alapvető fontosságú a filamentumok polimorfikus tulajdonságai szempontjából. Már néhány terminális aminosav hiánya is a filamentum belső magjának rendezetlenségét és a polimorfikus tulajdonság elvesztését okozza [9].

19

A külső gyűrűt elsősorban a G3 domént alkotó konzerválódott régiók építik fel, de a rendezetlen régió N-terminális 30-65 szegmense is fontos szerepet játszik. A filamentumok külső részét az F27-es fragmentum G1 és G2 doménjei építik fel, de ezek a régiók alig járulnak hozzá a filamentumok stabilizálásához [10].

2.7. ábra A filamentum szerkezete elektronmikroszkópos és röntgendiffrakciós mérések alapján [11] A mindkét terminálisán erősen csonkított 41 kDa-os (F41) fragmentum kristályosítása és röntgendiffrakciós vizsgálata révén meghatározták a filamentum szerkezetét [12]. A filamentumok külső gyűrűje tehát már atomi precizitással ismert, belső gyűrűjének felépüléséről azonban csak sejtések vannak. A feltételezések szerint a flagelláris filamentumok képződése során az axiálisan szomszédos egységek között az α-hélix képző N- és C-terminális régiók egymással kölcsönhatásba lépve, együtt képeznek helikális kötegeket. A helikális kötegek egymásba fonódó láncolata eredményezi a filamentum szerkezetének kialakulását úgy, hogy a filamentum szabad végén lévő molekula N-terminális végéhez kapcsolódik a következő flagellinmolekula C-terminális része [13].

20

3. Alkalmazott módszerek, felhasznált anyagok 3.1.

Fotometria

A spektrofotometriás analízis egyike a leggyakrabban használt analitikai eljárásoknak. A módszer igen alkalmas kismennyiségű anyag gyors, egyszerű, rutinszerű mérésére. A mérés akkor alkalmazható, ha a vizsgált anyagnak a színkép valamelyik pontján abszorpciós maximuma van. A spektrofotometriás mennyiségi mérések az oldatok fényelnyelésére vonatkozó Lambert-Beer-törvényen alapulnak. A fényelnyelés nagyságából az abszorbeáló komponens koncentrációjára lehet következtetni. Ha a beeső fény I0 intenzitása a közeg l vastagságú rétegén áthaladva I-re csökken, akkor a Lambert-Beer-törvény értelmében:

I0 = β ⋅l , I a közeg Bunsen-féle extinkciós koefficiense, amely az anyag minőségétől és az E = log

ahol β

alkalmazott fény hullámhosszától függ. A törvény kizárólag csak adott hullámhosszú I0 monokromatikus fény esetén érvényes. A log kifejezést extinkciónak (E) vagy I abszorbanciának (A) nevezzük. Az abszorbeáló anyagok oldatának extinkciós koefficiense annál a hullámhossznál, amelynél az oldószernek nincs abszorbciója, a Lambert-Beer-törvény szerint arányos az oldat koncentrációjával, ha az oldott anyag a hígítás alkalmával nem megy át molekuláris változáson: β = ε ⋅c ,

ahol ε az oldott anyag koncentrációjától független állandó, a moláris abszorptivitás (moláris extinkciós koefficiens). A moláris extinkciós koefficiens megadja, hogy adott hullámhosszon 1 cm-es rétegvastagság esetén, 1 mol/1-es oldatnak mekkora extinkció felel meg. Értéke az adott anyagra jellemző, de függ az oldószertől és a hőmérséklettől. A fenti összefüggések alapján tehát a fényabszorpció mértékéből a koncentráció kiszámítható: I0 E = log = ε ⋅ c ⋅ l I Fehérjék esetén ez a módszer azért alkalmazható, mert a fehérjéket felépítő aminosavak közül az aromás aminosavak (tirozin-Tyr, triptofán-Trp, fenilalanin-Phe), és kisebb mértékben a cisztein (Cys) UV tartományban jelentős elnyelést mutatnak (3.1. ábra). Mivel nem kell a méréshez a fehérjéket kémiai reakcióba vinni, ezt az eljárást használják fehérjék kromatográfiás elválasztásának folyamatos követésére is. Mivel az egyes fehérjék különböző

21

arányban tartalmaznak aromás aminosavakat, inkább csak ugyanazon fehérje különböző oldatainak összevetésére alkalmas, nem abszolút módszer.

A

250

270

290

310

330

350

λ (nm)

3.1 ábra Aromás aminosavak abszorpciós spektruma Triptofán (kék), tirozin (lila), fenilalanin (sárga) abszorpciós spektruma [27] A spektrofotométer abszorbancia mérésére alkalmas műszer, amely egy általunk meghatározott hullámhosszúságú fényt állít elő, a fény keresztülhalad a mintán és megméri az átjutó fénysugár intenzitását. A rácsos monokromátor feladata az említett fényforrások folytonos spektrumából egy adott hullámhosszúságú fény kiválasztása. A monokromátorból kilépő fény nem szigorúan monokromatikus, de egy viszonylag szűk hullámhossz tartománnyal jellemezhető. A monokromátorban a be- és kilépő fény réseken halad keresztül, melyek szélessége meghatározza a sávszélességet. Minél szélesebb a rés, annál szélesebb a kilépő fény hullámhossz tartománya. A rés szűkítésével a sávszélesség ugyan csökkenthető, de ezzel a fényintenzitás is csökken, tehát a rés megfelelő beállításával optimumot keresünk a spektrális feloldás és a kellő fényintenzitás között [24]. Az általam használt készülék (Helios-Unicam) egysugaras, azaz egy küvetta befogadására alkalmas. A küvetta minősége és állapota a mérés kritikus tényezője. A küvetta készülhet műanyagból, üvegből vagy kvarcból. A műanyag és üveg küvetták olcsóbbak, de az ultraibolya tartományban a nagy elnyelésük miatt nem használhatók. Mivel a fehérjék abszorpcióját 280 nm-nél mértem, ezért ezekhez a mérésekhez kvarcküvettát használtam. A fehérjeminta mérése előtt a puffer oldattal a készüléket nullázni kell, ettől kezdve a minta

22

abszorbanciájából automatikusan kivonja a referencia oldat abszorbanciáját. A fényforrás az UV tartományban deutérium lámpa, a látható tartományban pedig wolframszálas izzó, mérés előtt beállítható, hogy melyik hullámhossznál történjen a lámpacsere. A kijelzőegységen grafikus formában megjelenő eredményből kurzor segítségével leolvasható a minta elnyelése egy hullámhosszon. A fehérjék koncentrációját a 280 nm-nél mért abszorpcióból számoltam. Az abszorpcióból a moláris extinkciós koefficiens ismeretében a fehérjék koncentrációja meghatározható. A fehérjék extinkciós koefficiensét az irodalomból ismerhetjük. A gyakorlatban sokszor az 1 %-os oldat (1 %= 1g/100 ml=10 mg/ml) extinkciós koefficiensét szokás megadni 280 nm-nél. Ebből az A ⋅ 10 = cfehérje (mg/ml) 1%

ε 280

1% = 3,6, míg az képlet alapján kapjuk az oldat fehérje koncentrációját. Flagellin esetén az ε 280

F40-é 4,3 [8]. A többi fragmentumra ebből a két értékből a következő összefüggéssel 1% számíthatjuk ki az ε 280 értékeket: M fr − M 40 1% 1% 1% 1% ε 280 , fr = ε 280 , F 40 + (ε 280 , F − ε 280 , F 40 ) ⋅ M F − M 40 ahol Mfr a kérdéses fragmentum, MF a flagellin, M40 az F40 molekula tömege [8]. Abban az esetben ha a fehérje extinkciós koefficiense nem ismert, az aminosav összetételéből közelítő értéket kaphatunk az alábbi képlettel [32]: ε = nTrp ⋅ 5500 + nTyr ⋅ 1490 + nCys ⋅ 125 ,

ahol n a fehérjében található aminosavak számát jelenti.

3.2.

Oszlopkromatográfiás technikák

A szennyező fehérjék többségétől megtisztított, de még nem kellően homogén preparátumot általában valamilyen oszlopkromatográfiás módszer segítségével tisztítottam tovább. 3.2.1. Gélszűrés A gélszűrés molekulák méret és alak szerinti szeparálására alkalmas módszer. Gélszűrő kromatográfiás oszlop töltete egy finom szemcsés, 10-300 µm átmérőjű gömbökből álló porózus, hidrofil gél. Ennek hatására a kromatográfiás oszlopban két különböző folyadéktér alakul ki. Az egyik a gélszemcséken kívüli szabadon mozgó mobil fázis, a másik a gélszemcsék belsejében levő korlátozott mozgású folyadéktér. Az oldatba lévő molekulák mozgása egyrészt függ a mobil fázis áramlási sebességétől, másrészt a diffúziótól, ami lehetővé teszi, hogy az oldott molekulák, ha méretük engedi, átjárják a gélszemcsék belsejét. Egy molekulakeverék szétválasztása azon alapul, hogy egy adott mérettartománnyal rendelkező gél esetén egyes molekulák méretüknél fogva nem férnek be a gélszemcsék belsejébe, ezek számára csak a mobil fázis áll rendelkezésre, ezért gyorsan keresztül folynak az oszlopon. A kisebb molekulák viszont méretüknek megfelelően több-kevesebb időt, a 23

gélszemcsék belsejében levő folyadéktérben töltenek, ezért lassabban jutnak keresztül a kromatográfiás oszlopon [24]. 3.2.2. Ioncserés kromatográfia A töltéssel rendelkező molekulák elválasztására az egyik leghatékonyabb módszer az ioncserés kromatográfia. Fehérjék szeparálására térhálósított dextrán gél alapú (Sephadex) ioncserélő tölteteket használtam. Anion-cserélők esetében a hordozóhoz kapcsolt ionos csoport rendszerint dietil-aminoetil (DEAE származékok), vagy kvaterner aminoetil csoport (QAE származékok). Ez utóbbi erősebben bázikus. Kationcserés kromatográfiára karboximetil (CM), foszfoetil (PE), illetve szulfopropil (SP) csoportokat tartalmazó ioncserélőket használnak. Az ioncserés kromatográfiához használt oszloptöltetek egy oldhatatlan hordozó (mátrix) felszínéhez kovalens kötéssel kötött töltött csoportokat tartalmaznak. A vizes oldatban szuszpendált mátrix töltött csoportjai körül az ellentétes töltésű ionok ionfelhőt képeznek. Az ionfelhőben az ionok reverzibilisen kicserélődhetnek, a mátrix jellegének és tulajdonságainak megváltoztatása nélkül. A mátrix töltött csoportjai lehetnek pozitív vagy negatív töltésűek. A pozitív töltésű mátrix az oldatból negatív töltésű ionokat, anionokat köt, ezért anioncserélőnek nevezzük. A kationcserélő mátrixok töltése negatív. A fehérjék töltési sajátossággal bírnak, jellemző értékük a nettó töltés. Ezt úgy kapjuk, hogy a pozitív töltések számából levonjuk a negatív töltések számát. A nettó töltés mellett lényeges a fehérje térfogatán belüli töltéseloszlása is, ami befolyásolhatja a kötődést és az elúciót is. A fehérjét töltését tekintve fontos az izoelektromos pont (pI), ami az a pH érték, amelynél a molekula nettó töltése zérus. Az izoelektromos pontnál savanyúbb oldatban a fehérje pozitív töltésű lesz, lúgosabb pufferben pedig negatív. A legtöbb ioncserés kísérletet öt fő fázisra lehet osztani (3.2 ábra). Az első és az ötödik fázis az ioncserélő oszlopnak az ún. induló pufferrel történő egyensúlyba hozása, a kísérlet kezdeti körülményeinek (pH és ionerő) beállítása. Az ioncserélő töltött csoportjaihoz ebben a fázisban könnyen kicserélhető egyszerű ionok (klorid vagy nátrium) kapcsolódnak. A második fázis a minta felvitele és reverzibilis megkötése az oszlopon. Amennyiben a mintában található szennyező anyagok egy része nem kötődik az oszlophoz, ezeket az induló pufferrel történő mosással eltávolítjuk. A harmadik és negyedik fázis az elúció, a kötött molekulák deszorpciója, amit az eluáló puffer összetételének megváltoztatásával érünk el. Az elúció legegyszerűbb formája az ionerő, azaz a jelenlévő ellenionok koncentrációjának növelése. A deszorpció másik módja az eluáló puffer pH-jának változtatása. A leghatékonyabb módszer az ionerő illetve a pH folyamatos változtatása, az ún. gradiens elúció. Ennek során az oszlopról először a kisebb nettó töltésű, gyengébben kötődő molekulák válnak le, majd a nagyobb nettó töltésűek [24].

24

1

2

+ ++ + + +

3

++ + + + +

++ + + + +

4

++ + + + +

5

+ + + + + +

ellenionok az induló pufferben szétválasztandó ionok ionok a gradiensben

3.2. ábra Az ioncserés kromatográfia fázisai (só gradiens elúció) 3.2.3. Affinitási kromatográfia Az affinitás kromatográfia a fehérjék valamilyen biológiai specifitását használja ki. A módszer alapja az, hogy kovalens kötéssel szilárd hordozóhoz kötnek olyan molekulákat, melyekkel az izolálni kívánt fehérje specifikus kölcsönhatásba lép − enzim esetén ez a szubsztrát vagy egy kompetitív inhibitor, receptor esetében pedig az effektor. A szilárd hordozó lehet a gélszűréshez felhasznált bármely oszloptöltet, leggyakrabban a Sepharose gél [24]. Munkám során az IMAC módszert használtam, ami nem olyan szelektív, mint a többi affinitás kromatográfiás módszer. A fém kelátképző csoport (általában imido-diacetát) rögzítve van az állófázishoz, és ehhez koordinálódik a fémion (Cu2+, Zn2+, Ni2+, Co2+, vagy Fe2+) úgy, hogy egy vagy több koordinációs hely alakul ki a fehérje számára. Az imidodiacetát a fémionokat három helyen köti meg, a többi koordinációs hely szabad marad az izolálandó molekula számára [25]. Néhány, a fehérje felszínén elhelyezkedő aminosav, különösen a hisztidin, specifikusan kötődik ezekhez a szabad koordinációs helyekhez. Így a hisztidinek számától függően elválaszthatók az egyes fehérje molekulák. A fehérjében genetikailag kódolt „His-Tag” (több hisztidint tartalmazó peptidlánc), alkalmas arra, hogy ez alapján affinitás kromatográfiával tisztítani tudjuk. Az állófázisra kötött fémként Ni2+ ionokat alkalmaztam. Az IMAC módszer esetén gradiens elúciót alkalmazunk a molekulák elválasztására. Én a kísérletekben az imidazol koncentráció gradienst alkalmaztam.

25

3.3.

Dialízis

Gyakran van szükség arra, hogy a fehérje oldatok ionösszetételét megváltoztassuk, illetve a fehérje mellől kis molekulasúlyú anyagokat eltávolítsunk. Ez a feladat megoldható gélszűréssel is, de nagyobb térfogatok esetén vagy ha fontos, hogy a fehérje oldat térfogata ne növekedjen jelentősen, a dialízis a legegyszerűbb módszer. A fehérjét, vagy más makromolekula oldatát féligáteresztő hártyából (módosított cellulóz) készült, két végén lezárt csőbe (dialízis zacskó) helyezzük, majd a csövet nagy térfogatú puffer oldatba merítjük. A kis molekulák szabadon áramlanak a dializáló membrán pórusain keresztül, míg a makromolekulák a csőben maradnak. A puffer oldat keverésével az egyensúly beállásához szükséges idő lerövidíthető [24]. A dialízishez hegesztetlen cellulóz dialízis csövet (Sigma) használtam, amit használat előtt 2% NaHCO3 2mM EDTA oldatban, majd desztillált vízben főztem. A csövek egyik végének lezárását követően betöltöttem a fehérje oldatokat, majd a felső végét is zártam. A puffert általában 12 óra elteltével egyszer cseréltem egy minta dialízise során.

3.4.

A poliakrilamid gél elektroforézis (PAGE)

A különböző fehérjék egy adott pH-n más-más töltéssel rendelkeznek. Ha vizes oldatban elektromos erőtér alkalmazásával a fehérjéket vándorlásra késztetjük, az egyes fehérjék eltérő relatív töltésük (egységnyi molekulatömegre eső töltések száma) miatt különböző sebességgel mozognak, így ezen különbség alapján egymástól elválaszthatók. Fehérjék elektroforetikus elválasztására a leginkább elterjedt, rendkívül hatékony módszer a poliakrilamid gélben végzett elektroforézis. Az akrilamid vizes oldatban, megfelelő katalizátorok és iniciátorok jelenlétében gyökös polimerizációra képes, és a reakció során nagymólsúlyú lineáris polimer, ún. poliakrilamid keletkezik. Ez utóbbi vizes oldata rendkívül nagy viszkozitású. Ha megfelelő keresztkötő ágenst, N,N-metilén-bisz-akrilamidot is alkalmazunk, a hosszú poliakrilamid láncok között "hidak" képződnek, és térhálós szerkezetű gél jön létre. Az elektroforézis során a fehérjéket ebben a gélben vándoroltatjuk. Az eljárás különlegesen nagy felbontóképességgel rendelkezik. Ennek az az oka, hogy a relatív töltések különbségén alapuló szeparálással egyidőben a gélben a molekulák méret és alak szerint is elválnak egymástól, a gél mintegy molekulaszűrőként viselkedik. Ezt a molekulaszűrő hatást a gél átlagos pórusmérete szabja meg, ami viszont az akrilamid monomer koncentrációjának és a térhálósító metilén-bisz-akrilamid százalékos arányának alkalmas megválasztásával tág határok között változtatható. A gél mechanikus tulajdonságai kb. 4-20% akrilamid koncentráció-tartományban kedvezőek. A keresztkötő metilén-biszakrilamid mennyisége az alkalmazott akrilamid monomernek rendszerint 1-3%-a. A poliakrilamid számos előnyös tulajdonsággal rendelkezik. Erősen hidrofil, ugyanakkor nem tartalmaz töltéssel rendelkező csoportokat, melyek az elektroforetikus szeparálást károsan befolyásolnák. Kémiailag közömbös, stabil vegyület, az elválasztandó fehérjékkel nincs 26

specifikus kölcsönhatásban, nem zavarja a fehérjék detektálására szolgáló festési reakciókat, kompatibilis a legtöbb általánosan használt pufferrendszerrel. A poliakrilamid gél úgy készül, hogy a megfelelő koncentrációjú akrilamid/metilénbisz-akrilamid oldathoz megfelelő pH-jú pufferoldatot keverünk, majd a gyökös polimerizációt egy alkalmas katalizátor és iniciátor hozzáadásával indítjuk el. A katalizátor általában peroxidiszulfát, mely vizes közegben spontán bomlik, ezáltal szabad gyökök keletkeznek. Ezek a szabad gyökök azonban önmagukban nem képesek az akrilamid molekula kettős kötését felhasítva elindítani a gyökös polimerizációt, viszont gerjesztik az iniciátor molekulákat. Ez utóbbiakból ekkor szabad gyökök alakulnak ki, melyek már kiváltják a polimerizációt. A használt iniciátor a tetrametil-etilén-diamin (TEMED). A katalizátor és az iniciátor koncentrációját úgy választjuk meg, hogy a polimerizáció, így a gélesedés 10-30 perc alatt teljes mértékben végbemenjen. Az iniciátorral összekevert akrilamid / metilén-bisz-akrilamid oldatot két, egymással párhuzamos üveglap közé töltjük. Így egy gél lemez alakul ki, amelyben egyidejűleg, egymás mellett, azonos körülmények között számos mintát futtathatunk, melyek ily módon egymással könnyen összehasonlíthatók. Fehérjék esetén rendszerint az izoelektromos pontnál magasabb pH-n dolgozunk. Ekkor a fehérjék negatív töltésűek, így az anód felé vándorolnak. A puffer szerepe nemcsak abban áll, hogy az elektroforézis ideje alatt a pH-t állandó értéken tartja, hanem a puffer ionjai vezetik az áramot is. Normális esetben a fehérjeionok az áram vezetésében csak elhanyagolható mértékben vesznek részt. A futtató (más néven szeparáló) gél fölé egy ún. koncentráló gélt polimerizálunk. Ennek akrilamid koncentrációja a futtató gélénél jóval alacsonyabb, olyannyira, hogy itt a molekulaszűrő hatás még nem érvényesül. Tank pufferként olyan pufferrendszert alkalmaznak, melynek anion komponense egy gyenge sav savmaradéka, pl. glicinát anion. A tankpufferben a pH 8.3. A kis térfogatú fehérje mintát a koncentráló gél felszínére rétegezzük. Feszültség hatására a fehérje ionok és a tank puffer anionjai belépnek a koncentráló gélbe. A koncentráló gélben a pH 6.5-6.8 között van. Ilyen pH-n a glicin ikerionos állapotban van, elektroforetikus mobilitása lecsökken, így lokálisan csökken a töltéssel rendelkező molekulák koncentrációja. Ez helyileg megnöveli az elektromos ellenállást. Minthogy az elektromos körben az áramerősségnek állandónak kell lenni, Ohm törvényének megfelelően az ellenállással arányosan megnő a térerő is, ezért a fehérjék vándorlása felgyorsul, míg el nem érik az ionokban gazdag klorid ion frontot. Minthogy a klorid ion frontban az ellenállás, és így a térerő kicsi, a fehérjék sebessége csökken, és a front mögött mintegy összetorlódva igen vékony sávban vándorolnak a futtató gél felszínéig. A futtató, vagy más néven szeparáló gélben a helyzet megváltozik. Mivel a szeparáló gél pH-ja 8.8-9.0 között van, a glicin össztöltése itt negatív, ezért mobilitása megnövekedik. Így a töltéshiányból eredő koncentráló hatás megszűnik, a fehérjék a továbbiakban különböző fajlagos töltésük miatt eltérő sebességgel vándorolnak. A futtató gél akrilamid koncentrációját

27

már úgy választjuk meg, hogy a molekulaszűrő hatás is érvényesüljön, és a gél az elválasztani kívánt fehérjék mérettartományában a lehető legnagyobb mértékben szeparáljon. Az elektroforetikus eljárások többségénél a futtatás során jelzőfestéket alkalmazunk, amit a mintába keverünk. Ez a kis molekulatömegű, negatív töltésű festék gyorsabban vándorol a gélben mint a fehérjék, és mintegy láthatóvá teszi a futási frontot, így egyértelművé válik, mikor tekinthető az elválasztás befejezettnek. A poliakrilamid gélelektroforézis egyik leggyakrabban használt változata az SDS (Nadodecil-szulfát) poliakrilamid gélelektroforézis. A fehérjeoldathoz hozzáadott SDS elhasítja a hidrogén hidakat, semlegesíti a fellépő hidrofób kölcsönhatásokat, és végeredményben kitekeri a fehérjét. A polipeptid lánchoz kötődő SDS hatására a fehérje molekuláknak az aminosavak számával arányos nagy negatív töltésük lesz. A futtatás után a fehérjéket a gélben valahogy láthatóvá kell tennünk. Számos olyan vegyület van, mely nagy hatékonysággal kötődik fehérjékhez. Ezek használatakor célunk az, hogy lehetőleg az összes fehérjét kimutassuk a gélben. Én a Coomassie Brilliant Blue-t használtam, segítségével a gél keresztmetszetétől és az adott fehérje speciális festődési tulajdonságától függően akár már 0.1μg fehérje is jól detektálható. Ha a mintánkat ismert molekulatömegű fehérjékkel azonos gélben futtatjuk, a standard fehérjék futása alapján a mintában lévő fehérjék molekulatömege leolvasható. Az SDS poliakrilamid gél elektroforézis a leginkább elfogadott módszer annak eldöntésére, hogy egy fehérjepreparátum homogén-e [24]. Az alábbi táblázat azt mutatja, hogy különböző akrilamid koncentrációjú gélek esetén milyen mérettartományban teljesül a relatív mobilitás és a molekulatömeg logaritmusa között előbb említett összefüggés. Akrilamid koncentráció (%)

Az elválasztás tartománya (kDa)

15

12-43

10

16-68

7.5

36-94

5.0

57-212 2.1. táblázat

Mivel a flagellin molekulatömege 52 kDa, ezért munkám során a flagellin és fragmentumainak tisztaságának ellenőrzésére 10 %-os SDS poliakrilamid gélt használtam. Az SDS gélelektroforézis megvalósításához felhasznált vegyszerek: APS [ammonium-persulfate] (Biorad), mintapuffer (Biorad), ecetsav és etanol (Reanal), Fixing solution (Sigma), Coomassie Blue R250 festék (Merck), kis molekulatömegű standardek (Biorad, Sigma).

28

3.5.

Izotermális titrációs kaloriméter (ITC)

Az izotermális titrációs kaloriméter igen érzékeny eszköz, amivel két molekula kölcsönhatásakor felszabaduló vagy elnyelődő hőt mérhetünk, és ebből következtethetünk különböző számunkra fontos paraméterekre, mint a kötési állandó (K), a kötési sztöchiometria (n), a kémiai reakció entalpiaváltozása (ΔH). Az ITC mérés előnye, hogy egy valódi oldatban alkalmazható módszer. A reagáló komponenseken nem szükséges változásokat létrehoznunk, vagy jelölő molekulákat hozzákötnünk, mint pl. fluoriméteres vizsgálatok esetében. Gyorsabb, mint más analitikai vizsgálatok, pl. ultracentrifugás mérések, amelyek akár napokig is tarthatnak, míg egy ITC-s mérés legfeljebb néhány órát vesz igénybe. Mérhetünk vele fehérje-fehérje vagy fehérje-ligandum kölcsönhatást. Munkám során Microcal VP-ITC (Microcal Inc.) típusú készüléket használtam, ami két fő részből áll: egy termosztált, adiabatikus cellapárból, és egy injektor egységből, amellyel adott mennyiségekben adagolhatjuk a tűben lévő egyik komponenst a cellában lévő másik komponenshez. (3.3. ábra) végállás érzékelő

menetes orsó

végállás érzékelő adagoló dugattyú

keverés

külső szigetelés belső szigetelés

referencia cella

minta cella

3.3. ábra Izotermális titrációs mikrokaloriméter

29

A mintát tartalmazó cella mellett található a referencia cella, amely a referencia oldatként használt desztillált vizet tartalmazza. A készülék a két cella között a titrálás eredményeként kialakuló hőmérsékletkülönbség megszüntetéséhez szükséges fűtési teljesítményt méri. A továbbiakban feltételezzük, hogy az M makromolekula a cellában lévő oldatban az első titrálás előtt Mt0 koncentrációban van, és a hozzá kötődő X ligandum koncentrációja a cellában 0. A munkatérfogata a cellának V0, a i-edik titrálás térfogata ΔVi, a teljes térfogat, amit egy adott pontban a mintához hozzáadtunk ΔV, egyenlő az egyes ΔVi térfogatok összegével. A kísérlet elején a cella és a vékony betöltési cső is tartalmaz makromolekulákat de kalorimetriai szempontból csak a V0 térfogat számít. A makromolekula koncentrációja a cellában a titrálások során hozzáadott folyadék térfogata miatt csökken. Az átlagos makromolekula koncentráció a ΔV térfogatban a számtani közepe lesz a kezdeti Mt0 koncentrációnak és az aktuális Mt koncentrációnak. A tömegmegmaradás miatt: 1 M t0V0 = M t V0 + ( M t + M t0 )ΔV , 2 ebből Mt kifejezve kapjuk: ΔV ⎛ ⎜1− 2V0 M t = M t0 ⎜ ⎜ ΔV ⎜1+ 2V0 ⎝

⎞ ⎟ ⎟. ⎟ ⎟ ⎠

Hasonló gondolatmenettel megkaphatjuk az aktuális ligandkoncentrációt is: ⎛ ΔV X t = X t0 ⎜⎜1 − ⎝ 2V0

⎞ ⎟⎟ . ⎠

Abban az esetben, ha a makromolekulánk a ligandra nézve n db azonos típusú kötőhelyet tartalmaz, ha K a kötési állandó, Θ az X ligand által elfoglalt kötőhelyek aránya akkor: Θ K= (1 − Θ)[X ] X t = [ X ] + nΘM t . A két egyenletből kapjuk: ⎡ X 1 ⎤ Xt Θ 2 − Θ ⎢1 + t + = 0. ⎥+ ⎣ nM t nKM t ⎦ nM t

(1)

A teljes Q hőmennyiség a V0 térfogatban Q = nΘ MtΔHV0,

(2)

30

Az (1) másodfokú egyenletet megoldva Θ-ra, és a megoldást kapjuk: ⎡ ⎛ nM t ΔHV0 ⎢ X X 1 1 − ⎜⎜1 + t + Q= 1+ t + ⎢ nM t nKM t 2 ⎝ nM t nKM t ⎣

behelyettesítve (2)-be 2 ⎤ ⎞ 4Xt ⎥ ⎟⎟ − . ⎠ nM t ⎥⎦

A fenti képlettel Q értékét K, n és ΔH ismeretében ki lehet számolni minden titrálás után. Az egyes titrálások során kapott csúcs alatti területek egyenlők lesznek a titrálások során mért teljes hőfelszabadulással vagy hőelnyeléssel. A mérési eredményekhez legjobban illeszkedő elméleti görbe paramétereit iterációs módszerrel határozza meg a kaloriméterhez mellékelt gyári szoftver. Ha a makromolekulánk két különböző kötőhelye van a ligandra nézve, akkor az előbbi jelöléseket használva: Θ1 Θ2 K1 = K2 = (1 − Θ1 )[ X ] (1 − Θ 2 )[X ] X t = [ X ] + M t (n1Θ1 + n2 Θ 2 ) A első két egyenletből Θ -kat kifejezve és a másodikba behelyettesítve kapjuk: X t = [X ] +

n1 M t [X ]K 1 n 2 M t [X ]K 2 + 1 + [X ]K 1 1 + [X ]K 2

(3)

Átrendezve[X]-re harmadfokú egyenletet kapunk: 0 = [ X ] + p[ X ] + q[ X ] + r 3

2

(4)

ahol p=

1 1 + + (n1 + n2 ) M t − X t K1 K 2

⎛n ⎛ 1 n ⎞ 1 ⎞ 1 ⎟⎟ X t + + q = ⎜⎜ 1 + 2 ⎟⎟ M t − ⎜⎜ K1 K 2 ⎝ K1 K 2 ⎠ ⎝ K1 K 2 ⎠ r=

− Xt K1 K 2

A teljes Q hőmennyiség egy injektálás után most a V0 térfogatban Q = MtV0(n1Θ1 ΔH1+ n2Θ2 ΔH2)

(5)

A titrációs görbe illesztésénél (3),(4) és (5) egyenletek numerikus megoldásával ebben az esetben 6 paraméterünk lesz n1, n2, K1, K2, ΔH1 és ΔH2 A titrálásokhoz tartozó hőmennyiségeket ábrázolva a ligandum és a fehérje moláris arányának a függvényében, egy kötődési izotermát kapunk, amely a kölcsönhatásra lesz jellemző. A 3.4. ábrán látható, hogy a különböző paraméterek hol befolyásolják a görbe

31

alakját. Kritikus paraméter, amely meghatározza a kötési izoterma alakját, a c érték, amely függ a K kötési állandótól, a cellában lévő fehérje teljes koncentrációtól (Mt), és a sztöchiometriai paramétertől (n). c = KMtn Ha c értéke nagyon nagy, az izoterma nagy meredekségű lesz, és ΔH, valamint n pontosan meghatározhatók, de K nem. c túl alacsony értékénél pedig gyakorlatilag ellaposodik a görbe, ilyenkor ΔH, valamint n meghatározása lesz pontatlan. A gyakorlatban meg kell találni egy optimumot, ezért olyan makromolekula koncentrációt kell alkalmaznunk, amelynél a c konstans értéke 5 és 500 közé esik. Ez a tartomány az ún. „kísérleti K ablak”.

3.4. ábra Paraméterek hatása a titrációs görbére A kísérlethez használt fehérjekoncentráció megfelelő megválasztása függ egyrészt a kísérlet céljától (pl.: csak ΔH-t akarjuk meghatározni, vagy ezzel együtt a sztöchiometriát és K értékét is), másrészt figyelemmel kell lennünk a készülék érzékenységének a határára is, ami kb. 0,1 μCal. Egy precíz méréshez tehát legalább 3-5 μCal-nak kell felszabadulnia vagy elnyelődnie [26].

32

3.6.

Spektrofluoriméter

Az olyan fénykibocsátást, ahol a fénykibocsátó anyag gerjesztése a hőmérséklet emelkedése nélkül megy végbe (pl. UV vagy látható fénnyel megvilágítjuk) lumineszcenciának nevezzük. Ha a fény kibocsátása a megvilágítás után még hosszabb ideig (~ms-s) megmarad, akkor foszforeszkálásról, ha a megvilágítás megszűnése után azonnal (~10-9s) leáll a sugárzás is, akkor fluoreszcenciáról beszélünk. (Az elnevezés arra utal, hogy ilyennel először és jellemző módon foszfor-, illetve fluortartalmú vegyületekben találkoztak.) A fluoreszcencia jellemzője, hogy a kisugárzott fény mindig azonos, vagy nagyobb hullámhosszú (kisebb frekvenciájú, kisebb energiájú), mint az elnyelt fény. A fluoreszcens fény nem monokromatikus, mert mindegyik gerjesztett molekula egyedi módon tér vissza az alapállapot valamelyik rezgési szintjére, és így kialakul egy maximummal rendelkező emissziós spektrum. A fluoreszcencia mérésére szolgáló eszköz a spektrofluoriméter. Felépítése hasonlít a spektrométerhez, de ebben két monokromátor van. Az egyik a megvilágító fény hullámhosszának a kiválasztására, a másik pedig a fluoreszcens fény vizsgálatára szolgál. További különbség, hogy a spektrofluoriméterben a fotodetektor a megvilágító fényre merőlegesen helyezkedik el, hogy a küvettán áthaladó megvilágító fény ne befolyásolja a mérést (3.5. ábra). Méréseimhez Fluoromax-2 (Jobin-Yvon) számítógéppel vezérelt spektrofluorimétert használtam.

fényforrás

monokromátor

mintatartó monokromátor

fotodetektor

erősítő és kijelző

3.5. ábra Spektroflouriméter vázlatos felépítése

33

Híg oldatok esetén a fluoreszcens fény intenzitása arányos az oldat koncentrációjával: F= k I0 ε c, ahol c az oldat koncentrációja, ε a besugárzás hullámhosszán érvényes moláris abszorpciós koefficiens, I0 a besugárzó fény intenzitása, k pedig a kvantumhasznosítást összegző küvettára, műszerre és a mintára jellemző állandó. A fehérjék fluoreszcenciája lehet saját vagy külső. A saját fluoreszcencia az aromás gyűrűt tartalmazó aminosavaktól származik. Ezek a triptofán, tirozin és a fenilalanin. Ezen aminosavak fluorszcenciája erősen függ a környezetüktől, ezért ezek fluoreszcenciájának mérésével például fehérjék konformációs változását is nyomon lehet követni. A fehérjékhez külső fluorofor vegyületek is köthetők, elsősorban a lizin és arginin aminosavak NH2 oldalláncain, valamint a cisztein SH csoportján keresztül. 3.6.1. Fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FRET) A fluoreszcencia rezonancia energia transzfer egy sugárzás nélküli energiaátadást jelent a gerjesztett (donor) molekula és egy akceptor molekula között. Az energiaátadás az akceptor és a donor között fellépő nagy hatótávolságú dipól-dipól kölcsönhatás eredménye. Az energiatranszfer hatásfoka a Förster elmélet szerint: R6 E= 6 0 6, R0 + r ahol R0 az úgynevezett Förster távolság, ahol az energia transzfer hatásfoka 50 %-os. Az R0 a következő kifejezéssel adható meg: ∞ 9000(ln 10)κ 2QD 6 4 R0 = ∫0 FD (λ )ε A (λ )λ dλ , 128π 5 Nn 4 ahol QD a donor fluoreszcencia kvantumhatásfoka, n az oldat törésmutatója (biomolekulák vizes oldata esetén általában ez 1,4), N az Avogadro szám, κ az orientációs faktor 2 (véletlenszerű donor-akceptor dipól orientáció esetén κ 2 = ). 3 Két kromofor között a fentiek szerint akkor jöhet létre FRET, ha az akceptor abszorpciós spektruma átfed a donor emissziós spektrumával, és a két molekulának megfelelő közelségbe kell kerülnie a távolság 6. hatványával való fordított arányosság miatt.

3.7.

Felhasznált anyagok

Az FRET mérésekhez az általam kiválaszott festékek a ciszteinen keresztül képesek a felérjemolekulákhoz kötődni. A Salmonella typhimurium SJW1103 vad típusú flagellin molekula nem tartalmaz ciszteint, ezért a fluoreszcens mérésekhez egy olyan pontmutációval létrehozott flagellin molekulát használtam, amelynek aminosavláncában a központi, variábils

34

részben a 356. pozícióban lévő szerint kicserélték ciszteinre (F1103 356C). Erről a szakaszról ismert, hogy nem befolyásolja a flagellumok kialakulását.[1,10] A tisztított vad típusú és a mutáns flagellin molekulák filamentumokká polimerizálva lecentrifugált állapotban álltak a rendelkezésemre. A filamentum csapadékot 20 mM-os Trisz-HCl (pH 7.8) pufferben [Trisz(hidroximetil)-amino-metán] (Reanal)] felszuzpendáltam. A feloldott filamentumokat 70 °Con 10 percig termosztálva a filamentumok szétesnek flagellin molekulává. Az így kapott oldatot Optima MAX-E Ultracentrifugával 20 percig, 70 000-es percenkénti fordulatszámmal centrifugáltam. Az oldatban lévő makroszkópikus szennyeződések és a melegítés után esetleg megmaradó filamentum darabok a centrifugacső aljára kitapadnak. A felülúszó tartalmazza a monomer formában lévő flagellinmolekulákat. A flagellin tisztítása számítógéppel vezérelt FPLC ioncserélő kromatográfiás eljárással történt. A vad típusú és a mutáns flagellin molekulák tisztítása hasonló módon történt, a különbség csak az, hogy a ciszteint tartalmazó mutáns flagellint monomer formában a diszulfid hidakat redukáló DTT [ditiotreitol] (Merck) jelenlétében 1 órát inkubálni kell. A különböző méretű terminális régiókkal rendelkező flagellin fragmentumok előállítása monomer flagellinből limitált proteolízissel történt, és ioncserélő kromatográfiával tisztítottam [8]-as szerint. A limitált proteolízishez használt endoproteináz Lys-C (ELC) és a endoproteináz Glu-C (V8) Boehringer, a tripszin Sigma termék volt. Az F49 és F46 fragmentumot ELC-vel, az F48 fragmentumot V8-cal, míg az F40 fragmentumot tripszinnel történő emésztéssel kaptam. A munkám során használt tiol-reaktív fluoreszcens festékek közül a 7-dietilamino-3(4'-maleimidilfenil)-4-metilkumarin (CPM), mint donor emissziós spektruma, átfed az Alexa Fluor® 488 C5 maleimid (Molecular Probes), mint akceptor abszorpciós spektrumával és elegendően nagy extinkciós koefficienssel rendelkeznek (3.2 táblázat). Festék

abszorciós maximum (nm)

emissziós maximum (nm)

moláris tömeg (g/mol)

extinkciós koefficiens (cm-1M-1)

CPM

384

469

402,45

33000

Alexa

495

519

720,66

72000

Flour®488 3.2. táblázat

35

Ezeknek a festékeknek további előnyös tulajdonságuk, hogy nem érzékenyek a fényre, fluoreszcenciás képességüket hosszú ideig megőrzik.

3.6. ábra 7-dietilamino-3-(4'-maleimidilfenil)-4-metilkumarin (CPM) szerkezete

3.7. ábra Alexa Fluor® 488 C5 maleimid szerkezete A festékek a maleimid csoportjukon keresztül a ciszteint tartalmazó mutáns fehérjék SH csoportján keresztül kovalens kötéssel kapcsolódnak a flagellin molekulához (3.8. ábra).

3.8. ábra A maleimid tartalmú festékek kapcsolódása az SH-csoporthoz A ciszteint tartalmazó mutáns flagellinmolekulák az SH csoportokon keresztül egymáshoz is képesek kötődni. Redukáló szerként a festékkel történő reakciókban DTT [ditiotreitol] (Merck) helyett TCEP-t [trisz(2-karboxietil)foszfin-hidroklorid] (Molecular

36

Probes) használtam, mert ebben a molekulában nincsen SH csoport, így a festési eljárás alatt is a fehérjét tartalmazó oldatban maradhat. A festék hozáadása előtt 1 órán keresztül inkubáltam a flagellin molekulákat a TCEP jelenlétében. A jelölt flagellinmolekulákat a felesleges festéktől Sephadex G-25 gélszűrő oszlopon választottam el. A festékmolekulával jelölt flagellinmolekulák arányát az abszorpciós spektrum alapján a következő összefüggéssel határoztam meg:

η=

Ax

ε

⋅

fehérje molekulatömege , fehérje koncentráció

ahol Ax az abszorbancia, ε a festék moláris extinkciós együtthatója az abszorpciós maximumnál (3.2. táblázat). A foszfolipáz C aktivitás meghatározásához csak a foszfolipáz C enzimre specifikus fluoreszcens próbát (Molecular Probes Inc) alkalmaztam. A méréseimhez használt vegyület a 4-metilumbelliferil-foszfokolin, ezt hasítja a foszfolipáz C foszfodiészteráz enzim, aminek eredménye a 7-hidroxi-4-metilkumarin. A használt festék adatai: KIINDULÁSI

TERMÉK

VEGYÜLET szerkezet

abszorpció maximuma (nm)

313

360

emisszió maximuma (nm)

370

442

12000

19000

341

255

extinkciós együttható (1/cm M) moláris tömeg (g/mol)

37

4. Kísérleti eredmények 4.1.

A flagellin tisztítása

Az FRET mérésekhez az általam kiválaszott festékek ciszteinen keresztül képesek a fehérjemolekulákhoz kötődni. A Salmonella typhimurium SJW1103 vad típusú flagellin molekula nem tartalmaz ciszteint, így a fluoreszcens mérésekhez olyan pontmutációval létrehozott flagellin molekulát használtam, amelynek aminosavláncában a központi, variábilis részben lévő szerint (356. pozícióban) kicserélték ciszteinre (F1103 356C). Erről a szakaszról az irodalom alapján tudjuk, hogy nem befolyásolja a flagellin polimerizáziós képességét, a flagellumok kialakulását [1,10]. A tisztított vad típusú és a mutáns flagellin molekulák filamentumokká polimerizálva lecentrifugált állapotban álltak a rendelkezésemre. A filamentum csapadékot 15 ml 20 mM-os Trisz-HCl pufferbe (pH 7,8) pipettával felszuzpendáltam. Az így feloldott filamentumokat 70 °C-os hőmérsékleten 10 percig termosztálva, a filamentumok szétesnek flagellin molekulává. Az így kapott flagellin monomereket tartalmazó oldatot jeges vízben történő hűtés után ultracentrifugával 20 percig, 70 000-es percenkénti fordulatszámmal centrifugáltam. Az oldatban lévő makroszkópikus szennyeződések és a melegítés után esetleg megmaradó filamentum darabok a centrifugacső aljára kitapadnak. A felülúszó tartalmazza a monomer formában lévő flagellin molekulákat. A flagellin molekulák tisztítása számítógéppel vezérelt FPLC ioncserélő kromatográfiás eljárással történt. A mutáns és a vad típusú fehérjemolekula tisztítása azonos módon zajlott, a különbség annyi volt, hogy a ciszteint tartalmazó mutáns flagellint monomer formában a diszulfid hidakat redukáló 5 mM-os koncentrációjú DTT-vel (ditiotreitol) szobahőmérsékleten a kromatográfiás eljárás előtt 1 órát inkubálni kell. A flagellin izoelektromos pontja pI=5,5 [8], ezért XK16 anioncserélő oszloppal történt a tisztítás. A számítógép vezérelt FPLC programozása a felügyelő szoftverben található paraméterezhető funkcióblokkok segítségével lehetséges. Első lépésként a fehérjeoldat felvitele nem volt programozott, hanem manuálisan történt. A mintát a mintaadagoló egységbe injektáltam (DynaLoop 25), majd 100% A pufferrel mostam az oszlopra 1ml/perc áramlási sebességgel. A flagellin tisztítása során az alábbi programot futtattam le (A puffer : 20 mM Trisz-HCl pH 7,8; B puffer: 20 mM Trisz-HCl, 500 mM NaCl pH 7,8): 38

2ml-es frakciók szedése 0,01-os elnyelés felett

az alapvonal nullázása

5 ml A puffer, 5 ml/perc áramlási sebességgel

lineáris gradiens: 10 ml; 0 %-tól 12 %-ig B/A puffer arány; 5 ml/perc áramlási sebességgel



15 ml B puffer; 5 ml/perc átfolyási sebességgel



program vége Egy tipikus flagellintisztítási kromatogram a 4.1. ábrán látható. A kék vonal jelzi az

oldat abszorbanciáját, a fekete a B puffer arányát, piros pedig a vezetőképességét. A flagellinmolekula az első csúcsnál mosódik le az oszlopról. 1 3

5

7

Fractions 9 11 13 15 17

0.400

50.0 100.0% Buffer B 45.0

0.350 40.0 0.300 75.0

35.0

0.250 30.0

0.200

25.0 50.0 20.0

0.150 15.0 0.100

25.0 10.0

0.050 5.0

0.000

0.0

0.0

-5.0 -0.050

00:00:00 AU

00:10:00

00:20:00 Hr:Min:Sec

mS/cm

4.1. ábra Flagellin tisztításának kromatogramja

39

A flagellin tisztítás eredményét a különböző frakciókban minden esetben SDS gélen ellenőriztem (4.2. ábra). Az SDS gélen megállapítható, hogy melyik frakciók tartalmaznak csak tiszta flagellint.

4.2. ábra Flagellin tisztításának ellenőrzése SDS gélen

4.2. A flagellin fragmentumok előállítása A különböző méretű terminális régiókkal rendelkező flagellin fragmentumok előállítása monomer flagellinből limitált proteolízissel történt. A limitált proteolízishez használt endoproteináz Lys-C (ELC) segítségével F49 és F46, az endoproteináz Glu-C (V8) alkalmazásával F48, a tripszinnel történő emésztéssel F40 fragmentumkat kaptam. 4.2.1. F49 és F46 fragmentum Az endoproteináz Lys-C enzimnek a flagellin molekula N terminálisán két vágóhelye van, a 19. és az 58. helyen álló lizin után. F49 fragmentumot úgy kapunk, hogy az első emésztés a 19. lizin után történik meg. A mérésekhez szükséges mennyiség előállítása előtt próbakísérleteket végeztem a helyes fehérje-enzim arány meghatározására, illetve annak megállapítására, hogy mikor kell leállítani az emésztést, hogy a lehető legnagyobb mennyiségű F49 vagy F46 fragmentumot kapjam. Az endoproteináz Lys-C-vel való emésztésnél 2,8 mg/ml-es koncentrációjú mutáns flagellin (F356C) oldattal dolgoztam. Az irodalom [8] alapján 1:2000 (m/m) flagellin-enzim tömegaránnyal végeztem az emésztést. Az emésztés időbeli függésének követésére 10 percenként 10 μl mintát kivettem a fehérje-enzim oldatból. A kivett mintákat 3 percig 100 °C-on inkubáltam, hogy az enzimműködés leálljon. A félretett mintákat 10 %-os SDS gélen megfuttatva megállapítható az az idő, ameddig az emésztést érdemes végezni (4.3. ábra). Az első és a hatodik oszlop emésztetlen flagellint tartalmaz. A második oszlop a 10., a harmadik a 20., a negyedik a 30., az ötödik oszlop pedig az 50. percnél kivett mintákat tartalmazza. Jól 40

látható, hogy az F49 előállításához az emésztést 20 percnél célszerű megállítani, mert ekkor a legnagyobb az F49 koncentráció, míg 50 perc múlva kapunk nagy mennyiségben F46-ot. Az emésztés időbeli követésére alkalmas az oszlopkromatográfia is.

4.3. ábra Flagellin ELC-vel történő emésztésének nyomonkövetése SDS gélen Az ELC enzim hasítása után keletkező fragmentumok nettó töltése megváltozik, ezáltal más ionerősségnél mosódnak le az anion cserélő oszlopról, mint a flagellin. Ezzel a módszerrel gyakorlatilag „valós időben” követhető az emésztés, mivel sokkal rövidebb ideig tart egy kromatogram elkészítése, mint a minták SDS gélen való futtatása. Az emésztés ebben az esetben az automatikus mintaadagolóban történik. Az ELC-vel való emésztésnél MonoQ kis térfogatú anioncserélő oszlopot használtam. Az emésztés követésére egy kisebb térfogatokat tartalmazó rövidebb futási idejű programot futtattam le ciklikusan ismételve (A puffer : 20 mM Trisz-HCl pH 7,8; a B puffer: 20 mM Trisz-HCl, 500 mM NaCl pH 7,8):

1 ml-es frakciók szedése 0,01-os elnyelés felett





lineáris gradiens: 0,5 ml; 40 %-tól 100 %-ig B/A puffer arány; 1 ml/perc áramlási sebességgel



41


Fractions 0.0400

100.0 100.0% Buffer B 90.0

0.0350 80.0 0.0300 75.0

70.0

0.0250 60.0

0.0200

50.0 50.0 40.0

0.0150 30.0 0.0100

25.0 20.0

0.0050 10.0

0.0000

0.0

0.0

-10.0 -0.0050

00:00:00

00:10:00

AU

00:20:00

00:30:00

Hr:Min:Sec

mS/cm

4.4. ábra Flagellin ELC-vel történő emésztésének nyomonkövetése ioncserélő kromatográfiával A 4.4. ábrán látható kromatogramon az első csúcs a flagellint jelzi, a második futásnál megjelenő második csúcs az F49 fragmentum megjelenésére utal. A nagy mennyiségű emésztésnél az enzim hozzáadás után 20 perccel a mintát Poros 50HQ anioncserélő oszlopra injektáltam, és az F49 fragmentumot az alábbi programmal választottam szét a még meglévő flagellintől és a már keletkezett F46 fragmentumtól (4.5. ábra):







42




program vége Az A puffer : 20 mM Trisz-HCl pH 7,8; a B puffer: 20 mM Trisz-HCl, 500 mM NaCl pH 7,8.

1 3

5

7

9 11

14

Fractions 17 18 21

24

1.00

50.0 100.0% Buffer B

0.90

45.0

0.80

0.70

40.0

75.0

35.0

0.60

30.0

0.50

25.0 50.0

0.40

20.0

0.30

15.0 25.0

0.20

10.0

0.10

0.00

5.0

0.0

0.0

-0.10

00:00:00 AU

-5.0

00:05:00

00:10:00 Hr:Min:Sec

00:15:00

00:20:00 mS/cm

4.5. ábra Az F49 fragmentum tisztításának kromatogramja Az összegyűjtött frakciókat SDS gélen megfuttatva ellenőrizhető az egyes frakciók tisztasága.

4.6 ábra Az F49 fragmentum tisztításának eredménye SDS gélen A megfelelő tisztaságú frakciókat összeöntve spektrofotométerrel meghatároztam a fehérjekoncentrációt, ez az F49 esetén 0,78 mg/ml-re adódott.

43

Az emésztést azonos körülmények között 50 percig végezve, az előzőekkel azonos módon tisztítottam az F46 fragmentumot is, amit 1,23 mg/ml-os koncentrációban sikerült előállítanom. 4.2.2. F48 fragmentum A V8 enzim első hasítóhelye a flagellinmolekula C-terminálisán a 461. helyen álló, a második az N-terminálisán a 29. helyen álló glutaminsav után található. A C-terminálison való hasítás esetén egy 48 kDa-os (F48) fragmentumot kapunk. A V8 proteázzal történő emésztésnél a kiindulási mutáns flagellin (F356C) oldat koncentrációja 3,2 mg/ml volt. Az előkísérletekben 1:600 (m/m) enzim/flagellin arányt alkalmaztam. Az emésztés nyomonkövetése teljesen azonos módon történt az előző pontban ismertetett F49 fragmentuméval. Az 4.7. ábrán látható az emésztés időbeli lefolyása, 0, 5 10, 20 40,60, 90, 150 perces mintavételekkel.

4.7. ábra Flagellin V8-cal történő emésztésének nyomonkövetése SDS gélen

Az F48 elválasztása az F44 fragmentumtól ioncserélő kromatográfiával csak az F49-nél alkalmazottnál jóval kisebb gradiens mellett lehetséges (4.8. ábra). A tisztítást MonoQ oszlopon végeztem az alábbi lépésekben:








44



program vége Az A puffer : 20 mM Trisz-HCl (pH 7,8); a B puffer: 20 mM Trisz-HCl, 500 mM NaCl (pH 7,8).

2

4 5

6

Fractions 7 8

9

10 11

0.400

100.0 100.0% Buffer B 90.0

0.350 80.0 0.300 75.0

70.0

0.250 60.0

0.200

50.0 50.0 40.0

0.150 30.0 0.100

25.0 20.0

0.050 10.0

0.000

0.0

0.0

-10.0 -0.050

00:00:00 AU

00:05:00

00:10:00 Hr:Min:Sec

00:15:00

00:20:00 mS/cm

4.8. ábra F48 tisztításának kromatogramja A kellő tisztaságú frakciókat összegyűjtve az F48 fragmentum töményítéséhez Millipore ill. Whatman (30000MWCO) centrifugális töményítőket használtam. Töményítés után fluoriméterrel megmérve 1,2 mg/ml-es F48 koncentrációjú oldatom lett. 4.2.3. F40 fragmentum Tripszin segítségével a rendezetlen terminális régiók teljesen eltávolíthatók, így a 40 kDa-os F40 fragmentum, a flagellinmolekula kompakt stabil magja állítható elő. Ehhez az emésztéshez felhasználtam az előző fragmentumoknál túlemésztett oldatokat is, mivel a maradék terminális régiók tripszines elemésztése után ezekből is F40 fragmentum keletkezik. A tripszines emésztésnél 1:500 (m/m) enzim-fehérje arányt alkalmaztam. A tripszines emésztés nyomon követése és az F40 fragmentum tisztítása megegyezett az F49

45

fragmentumnál leírtakkal. A tiszta F40 fragmentumot tartalmazó oldatom végső koncentrációja 0,93 mg/ml-nek adódott.

4.3. Jelölés fluoreszcens festékekkel A különböző méretű terminális régiókkal rendelkező flagellin fragmentumokat és a flagellin molekulát fluoreszcens festékekkel jelöltem, hogy FRET segítségével vizsgáljam ezen molekulák kapcsolódását a filamentum végéhez. A ciszteint tartalmazó mutáns flagellinmolekulák az SH csoportokon keresztül egymáshoz is képesek kötődni. Redukáló szerként a festékkel történő reakciókban TCEP-t használtam, mert ennek a molekulának nincsen SH csoportja, így a festési eljárás alatt is az oldatban maradhat. A festék hozzáadása előtt 1 órán keresztül inkubáltam a flagellin és a fragmentum molekulákat a TCEP jelenlétében. A tiol-reaktív fluoreszcens festékekhez mellékelt leírás a festékek 1-10 mM-os törzsoldat elkészítését javasolja, illetve a jelölésnél 1:10 (fehérje:festék) arányt. Én jelöléseket 10 mM-os törzsoldattal és 1:15 aránnyal végeztem. A festék-fehérje oldatot a kötődés alatt nem érheti fény, ezért alufóliába csomagolva, hűtőszekrényben hagytam egy éjszakán keresztül állni. A jelölt flagellinmolekulákat a felesleges festéktől Sephadex G-25 gélszűrő oszlopon választottam el.




a minta beinjektálása a mintatartóból, 10 ml/perc átfolyási sebességgel

az oszlop mosása 120 ml A pufferrel, 10 ml/perc átfolyási sebességgel

program vége A puffer: 20 mM Trisz, 150mM NaCl (pH 7,8)

46

1 3

5 7

9

Fractions 11 13 15 17 19 21 23

0.0400

250.0 100.0% Buffer B

0.0350 200.0 0.0300 75.0

0.0250 150.0

0.0200 50.0 100.0 0.0150

0.0100

25.0 50.0

0.0050

0.0000

0.0

0.0

-0.0050

00:00:00

00:05:00

00:10:00

AU

Hr:Min:Sec

mS/cm

4.9. ábra Flagellin elválasztása a CPM-től A festéktől való elválasztás után a fluoreszcens festékkel jelölt flagellin és fragmentum mintákat kétszer dializálva 150 mM NaCl-ot tartalmazó, 10 mM-os foszfát pufferbe (pH 7,0) kerültek. A 3.7. pontban leírtak szerint fotométerrel meghatároztam az egyes fragmentumok festési arányát. Az eredményeket a 4.1 táblázat tartalmazza. Jól látható, hogy gyakorlatilag minden esetben sikerült a fehérje molekulák legalább felét fluoreszcens festékkel jelölnöm. fehérje – festék

festési arány (%)

flagellin – CPM

72

F49 – CPM

48

Flagellin – Alexa Fluor® 488

42

F49 – Alexa Fluor® 488

65


57


49 4.1. táblázat

A festékmolekulával ellátott flagellin molekula polimerizációs képességét fénymikroszkóppal ellenőriztem. A CPM-mel és Alexa Flour® 488-cal jelölt flagellin molekulákat 150 mM NaCl-ot tartalmazó, 10 mM-os foszfát pufferben (pH 7,0), 1 napig

47

inkubáltam

szobahőmérsékleten

1M

amónium-szulfát

jelenlétében.

A

létrejött

filamentumokat fluoreszcencia feltéttel ellátott Olympus BX50 fénymikroszkóppal figyeltem meg. A 4.10. ábrán az Alexa Flour® 488-cal jelzett flagellinből felépült filamentumokról készült fényképen jól láthatók a kialakult filamentumok.

4.10. ábra Alexa488-cal jelzett flagellinből felépülő filamentumok fénymikroszkópos felvétele

4.4. Filamentum törzsoldat készítése Tisztított vad típusú flagellin molekulákat 1 M amónium-szulfátot, 150 mM NaCl-ot tartalmazó, 10 mM-os foszfát pufferben (pH 7,0) 1 napig inkubáltam szobahőmérsékleten. Az így létrejött filamentumokat ultracentrifugálva (10 perc, 700000 1/perc) a filamentumok kicsapódnak. A csapadékot 150 mM NaCl-ot tartalmazó, 10 mM-os foszfát pufferben (pH 7,0) felvéve az amónium-szulfát kimosható az oldatból. Ezt az eljárást kétszer ismételtem meg. A filamentum törzsoldat végső koncentrációja 5 mg/ml volt. A mérés érzékenységének növelése érdekében, hogy minél több filamentum végződésem legyen, az oldatot ultrahangal kezeltem. A filamentumok darabolására a jeges vízben álló mintában 1 másodperc hosszú ultrahangimpulzusokat alkalmaztam háromszor fél percig, két perces szünetekkel.

48

A filamentum magokat tartalmazó oldathoz 1:50 tömegarányban adtam CPM-mel jelzett flagellint. A jelzetlen flagellinből felépült filamentum magok végére így vékony rétegben CPM-mel jelzett flagellinek polimerizálódtak. Ezt a törzsoldatot használtam valamennyi fluoreszcens mérésnél.

4.5. Fragmentumok kötődésének vizsgálata spektrofluoriméterrel Szeretném meghatározni, hogy a szomszédos flagellin alegységek N- és Cterminálisai pontosan hogyan alakítják ki a filamentum belső szerkezetét. Kísérleti adatokkal szeretném alátámasztani azt a hipotézist, miszerint az axiális irányban szomszédos flagellin alegységek N- illetve C-terminális régiói egymáshoz kapcsolódva építik fel a filamentumok belső gyűrűjének szerkezetét. A különböző fragmentumok polimerizációs képességét fluoreszcens festékkel jelzett fehérjemolekulákkal mértem spektrofluoriméterrel,

a

fluoreszcencia

rezonancia

energia

transzfer

(FRET)

alkalmazásával. A mérések során a mintatartót minden esetben 20 °C-on termosztáltam. A polimerizáció vizsgálata előtt felvettem a CPM-mel jelzett filamentum magokat tartalmazó oldat fluoreszcencia gerjesztési spektrumát (4.11. ábra). A fluoreszcencia fényt 469 nm-nél detektálva azt tapasztaltam, hogy a gerjesztési maximum 394 nm-nél van. Az eltérés a katalógusban szereplő értéktől azzal magyarázható, hogy ott a CPM metanolos oldatára vonatkozik a 384 nm-es adat. Az eltérő oldószer és a fehérjéhez való kötődés kis mértékben átalakítja a festékmolekula elektronszerkezetét, ez okozza az eltérést.

fluoreszcencia intenzitás (cps)

60000

40000

20000

0 300

320

340

360

380

400

420

440

460

hullámhossz (nm)

4.11. ábra CPM-mel jelzett filamentum fluoreszcencia gerjesztési spektruma

49

Az

FRET

módszer

alkalmazhatóságát

a

csonkítatlan

flagellin

molekula

beépülésének mérésével próbáltam ki. A 4.4 pontban leírt CPM-mel jelzett filamentum magokat tartalmazó oldathoz 1:50 tömegarányban adtam az Alexa Flour® 488-cal jelzett flagellinből. A polimerizáció során a CPM molekulákat tartalmazó filamentum véghez hozzákötődik az Alexa Flour® 488-cal jelzett flagellinmolekula, ezzel a két festékmolekula kellően közel kerül egymáshoz, hogy létrejöhessen a fluoreszcencia rezonancia energia transzfer. A mintát a CPM gerjesztési maximumánál, 394 nm-es fénnyel megvilágítva felvettem az emmissziós fény spektrumát. A 4.12. ábrán látható spektrumok közül a kék közvetlenül a CPM-mel jelzett filamentunok és az Alexa Flour® 488-cal jelzett flagellin molekulák összekeverése után, a piros 3 óra elteltével készült. A grafikonon jól látható, hogy a CPM emissziós maximumánál (469 nm) detektált jel időben csökkent, vagyis a fluoreszcenciája kisebb lett, ezzel párhuzamosan az 512 nm-nél mért jel, ami az Alexa Flour® 488 emissziós maximuma, megnőtt az FRET-nek köszönhetően. A jelzett flagellin monomerek beépülését mutatta a 394 nm-es megvilágító fény mellett detektált 512 nm-es fluoreszcens fény intenzitásának időbeli mérése is. A 4.13. ábrán az 1-gyel jelölt kék színű grafikon mutatja a flagellin molekulák beépülését. Referenciaként megmértem a CPM-mel és Alexa Flour® 488-cal jelölt flagellin molekulák 1:1 arányú elegyét is (4.14. ábra), ebben az esetben kis intenzitású konstans jelet kaptam, ami azt mutatta, hogy az oldatban a flagellin molekulákhoz kapcsolt donor akceptor párok nem kerülnek elég közel egymáshoz, hogy létrejöjjön az FRET.

Fluoreszcencia intenzitás (cps)

45000

30000

15000

0 420

440

460

480

500

520

540

560

580

600

Hullámhossz (nm)

4.12. ábra A fluoreszcens spektrum változása az időben

50

1

fluoreszcencia intenzitás

3 2 104 cps 4

0

5000

10000

idő (s)

4.13. ábra

fluoreszcencia intenzitás (cps)

A különböző fragmentumok FRET jele az idő függvényében 5000

0 0

5000

10000

idő (s)

4.14. ábra A jelzett flagellin monomerek keverékének FRET jele az idő függvényében A rendezetlen terminális régiók szerepének tisztázására a flagellinmolekula polimerizációja során méréseket végeztem az Alexa Flour® 488-cal jelölt különböző mértékben csonkított fragmentumokkal is. A kísérleti eredményeket a 4.13. ábra mutatja.

51

Az F49 fragmentum piros színű grafikonja mutatott kötődést a kísérlet során. Ez megfelel annak a modellnek, hogy a filamentum szabad végén lévő molekula N-terminális végéhez kapcsolódik a következő flagellinmolekula C-terminális része [13]. Mivel az F49 fragmentum C-terminálisa teljesen ép, így képes hozzákapcsolódni a filamentum végén lévő N-terminálisokhoz. Az F48 (4.13. ábra fekete) és az F40 (4.13. ábra zöld) fragmentumok esetén nem volt megfigyelhető kötődés. Ebből arra következtethetünk, hogy a C-terminális 33 aminosavjának elvesztése már megakadályozza a polimerizációt fiziológiás körülmények között. Az F40 fragmentum mindkét terminális régiója hiányzik, így ebben az esetben kötődés nem is várható. Az F49 fragmentum a C-terminálisával kötődik a filamentum végén lévő szabad Nterminálisokhoz, de mivel az N-terminálisa már csonkított, így a filamentum nem tud tovább polimerizálódni. Ezt mutatja a következő kísérlet: Első lépésként a CPM-mel jelölt filamentum törzsoldathoz Alexa Flour® 488-cal jelölt F49 fragmentumot adtam. A kötődés lezajlása után (4.13. ábra piros) a filamentumok végén létrejött Alexa Flour® 488-cal jelölt F49 réteghez megpróbáltam második lépésként CPM-mel jelölt F49 fragmentumot polimerizálni (4.13. ábra sárga). A filamentumok végén lévő csonkított N-terminálisokhoz az ép C-terminálisok nem képesek kötődni. Mérési eredményeim alátámasztják azt a modellt [13], miszerint filamentumok szabad végén levő N-terminális régiókhoz kapcsolódik a beépülő flagellinmolekula Cterminálisa (4.15. ábra). N

F

N C F

N C F

N

FILAMENTUM

C

4.15. ábra A flagellin polimerizációjának sematikus modellje

52

4.6. A FliH fehérje szerepe 4.6.1. FliH fehérje tisztítása affinitás kromatográfiával A FliH fehérje génjét tartalmazó baktérium csapadékot felszuszpendáltam 20 mM Trisz-HCl (pH 8,0) 500 mM NaCl tartalmú pufferoldatban, amelybe Complete proteáz inhibitor coctail tablettát tettem. A csapadékot tartalmazó oldatot ezután jeges vízben hűtve ultrahanggal kezeltem. Az ultrahangos sejtfeltárást 1 perces szakaszokban addig folytattam, amíg az elegy homogén nem lett. Az oldatot ezután 30 percig 6500-as percenkénti fordulattal centrifugáltam a nagyobb méretű szennyeződések eltávolítása érdekében, majd a felülúszót ultracentrifugával 30000 1/perces fordulatszámmal 30 percig centrifugálva a kisebb méretű sejtmembrán maradékot is eltávolítottam az oldatból. Az oldatot 0,2 μm-es szűrőn való átszűrés után HiTrap Chelating Hp típusú kelátképző oszlopra vittem fel. Használat előtt az oszlopot NiSO4-tal regeneráltam 1 ml/perc áramlási sebességgel. A fehérje oszlopra kötéséhez 20 mM Trisz-HCl (pH 8,5), 500 mM NaCl oldatot használtam (A puffer), a leoldásra pedig 20 mM Trisz-HCl (pH 8,5), 500 mM NaCl, 500 mM imidazol oldatot (B puffer). A mintát a mintaadagolóból (DynaLoop 25) 100% A pufferrel mostam az oszlopra. A B pufferben lévő imidazolnak jelentős elnyelése van 280 nm-nél, ezért a frakciók szedésénél ezt figyelembe kell venni a küszöb érték magasabbra állításával. A FliH tisztításra használt program:

2ml-es frakciók szedése 0,3-as elnyelés felett


az oszlop mosása 25 ml; 100% A pufferrel; 5 ml/min áramlási sebességgel

az oszlop mosása 40 ml; 10 % B/A puffer arány; 5 ml/min áramlási sebességgel




az oszlop mosása 40ml; 100% B pufferrel; 5ml/min áramlási sebességgel

az oszlop mosása 40ml; 100% A pufferrel;5ml/min áramlási sebességgel

a program vége

53

4.16. ábra FliH fehérje affinitás kromatográfiával való tisztításának kromatogramja A kromatogramon (4.16. ábra) látható első csúcs az oszlopon gyengén megkötött szennyező fehérjéket, a második és a harmadik csúcs a FliH fehérjét tartalmazza. Az affinitás kromatográfia során szedett frakciókat SDS gélen ellenőriztem, mivel a fehérje oldat nem volt kellően tiszta, ezért tovább tisztítottam ioncsere kromatográfiával. Ehhez az imidazol eltávolítása, illetve a magas sótartalom csökkentése miatt először dializáltam az oldatot. Hűtőszekrényben 20 mM Trisz-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 1mM DTT, 100 mM NaCl pufferben végeztem a dialízist egy éjszakán át. A DTT megakadályozza a molekulák között létrejövő diszulfid hidak kialakulását, ami zavarná a tisztítást. Dialízis után HR 10/10 Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech) anioncserélő oszlopon folytattam a tisztítást. A fehérje felvitelére 20 mM Trisz-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 100 mM NaCl oldatot használtam (A puffer), leoldásra 20 mM Trisz-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 M NaCl oldatot (B puffer). A tisztítás során az alábbi programot futtattam:

2ml-es frakciók szedése 0,02-es elnyelés felett


az oszlop mosása 3 ml 100% A pufferrel, 3 ml/min áramlási sebességgel

lineáris gradiens: 40 ml; 0 %-tól 60 %-ig B/A puffer arány; 3 ml/perc áramlási sebességgel 54


lineáris gradiens: 15 ml; 100% B puffer; 3 ml/perc áramlási sebességgel


lineáris gradiens: 30 ml; 100% A puffer; 3 ml/perc áramlási sebességgel

a program vége 1

3 4 5 6 7 8 9

11

13

Fractions 15 17

19

21

23

25

27

29

1.00

100.0 100.0% Buffer B

0.90

90.0

0.80

0.70

80.0

75.0

70.0

0.60

60.0

0.50

50.0 50.0

0.40

40.0

0.30

30.0 25.0

0.20

20.0

0.10

10.0

0.00

0.0

0.0

-0.10

00:00:00 AU

-10.0

00:10:00

00:20:00

00:30:00

Hr:Min:Sec

mS/cm

4.17. ábra FliH fehérje ioncserélő kromatográfiával való tisztításának kromatogramja Az egyes frakciókat SDS gélen futtatva (4.18. ábra) ellenőriztem, a FliI fehérje tisztaságát.

4.18. ábra FliH fehérjetisztításának eredménye SDS gélen A FliI fehérje tisztítása teljesen azonos módon történik, mint a FliH tisztítása, csak ott a FliI génjét tartalmazó baktériumtenyészetből kell kiindulni.

55

Az izotermális titrációs kalorimetriás (ITC) méréseknél fontos, hogy a cellában és a tűben lévő fehérjék teljesen azonos pufferben legyenek, mert különben a két puffer közti összetételbeli különbségből származó keveredési hőeffektus nagysága meghaladhatja a mérendő reakció hőhatását, ezzel jelentősen rontaná a mérés jel/zaj arányát, és ezzel a mérés kiértékelhetőségének pontosságát. Ennek elkerülése érdekében a FliH és FliI oldatokat közös pufferben dializáltam. Egyszeri puffercserével elérhető, hogy a két fehérje gyakorlatilag azonos oldatban legyen. Ebben az esetben ez 20 mM Trisz-HCl (pH 7,8) puffer volt. 4.6.2. A FliH-FliI kölcsönhatás jellemzése ITC méréssel ITC-s méréshez a két fehérjéből megfelelő koncentrációjú oldatot kell létrehozni (2.5. fejezet). A tűben lévő fehérjének célszerű legalább tízszeres moláris koncentrációban lennie a cellában lévő fehérjéhez képest. A FliI fehérje a dialíziskor és a töményítés alatt is könnyen aggregálódik, a FliH fehérje viszont nem, ezért a FliH-t töményítettem megfelelő koncentrációra és töltöttem a tűbe. A koncentrációkat fotométerrel határoztam meg. Az ITC mérés során használt FliI oldat koncentrációja 0,43 mg/ml volt, a töményített FliH koncentrációja 2,29 mg/ml-nek adódott. Az oldatok légtelenítése után a töményebb FliH-t a tűbe, a FliI-t pedig a cellába töltöttem. A kalorimétert vezérlő szoftverben az alábbi paramétereket állítottam be:

összes injektálások száma

32

a mérés hőmérséklete

20 °C

injektált mennyiség

5 μl

injektálás időtartama

10 s

várakozás két inj. között

300 s

kezdeti késleltetés

60 s

referencia fűtési teljesítmény

25 μCal/sec

visszacsatolás mértéke

nagy

keverési sebesség

260 1/perc

Háttérként azonos paraméterekkel elvégeztem azt a mérést, amikor a cellában a dialízis puffer van, a tűben pedig a méréshez is használt fehérje ugyanabban a koncentrációban. A fehérje-puffer kölcsönhatásból adódó hőeffektus így kivonható a mérésből. A mérések kiértékeléshez a készülékkel együtt szállított Origin 5.0 felületen működő szoftvert használtam. A szoftver a kiválasztott modell szerint elvégzi a titrálási

56

görbék pontjaira való nemlináris regressziót, és kiírja az illesztésből számolt termodinamikai paramétereket (4.19. ábra).

4.19. ábra FliH-FliI kötődésének mérése ITC-vel A kapott K egyensúlyi állandóból számolt disszociációs egyensúlyi állandó 1/K=Kd=3,14·10-5M, ami a kölcsönhatás gyenge jellegére utal. Ismert volt, hogy a FliH nagyon híg oldatban is dimert képez [19]. A kiértékelés során alkalmazott koncentrációkban FliH-t már dimerként vettem figyelembe. Nagy koncentrációban a kötés kialakulhat, de a sejtben lévő fiziológiás körülmények közötti kis koncentrációban a FliH dimer nem kötődik a FliI-hez. Erre utal a kapott Kd disszociációs egyensúlyi állandó értéke. A FliI-FliH kölcsönhatás gyengesége felveti azt a kérdést, hogy akkor a FliH milyen szerepet tölthet be az exportrendszerben. 4.6.3. A FliH fehérje kötési tulajdonságainak vizsgálata A FliI-FliH kölcsönhatás gyengesége, valamint az, hogy a FliH a FliI ATP-áz aktivitását csak tizedére csökkenti, felveti annak lehetőségét, hogy valamilyen más szerepet tölthet be az exportrendszerben, mint amit eddig tulajdonítottak neki. Méréseket végeztem annak kiderítésére, hogy rendelkezik-e a FliH fehérje fémion kötő tulajdonsággal. ZnCl2-dal, MgCl2-dal, CaCl2-dal és CoCl2-dal végeztem ITC-s méréseket. Minden mérésnél azonos

57

paramétereket alkalmaztam, mint a FliI-FliH titrálásnál, csak az injektálások számát emeltem 64-re. A titráló oldatokat minden esetben úgy készítettem, hogy a fém-kloridokat abban a dialízis pufferben oldottam, amelyben a fehérjét dializáltam. A ZnCl2-dal történő mérés során a cellában lévő fehérje moláris koncentrációja 0,065 mM, a ZnCl2 ligandum koncentrációja a tűben 3,6 mM volt. A FliH fehérje moláris koncentrációját itt a monomer moláris tömegéből számoltam. A kiértékelést az előzőekkel azonos módon végeztem, csak a pozitív értékek megjelenése miatt itt két kötőhelyes modellt illesztettem, mert egy kötőhely esetén a görbe nem megy át a pozitív tartományba (4.20. ábra).

4.20. ábra FliH Zn2+ kötésének mérése ITC-vel A kapott eredmények alapján arra következtettem, hogy a FliH két különböző cink kötőhelyet tartalmaz. Az egyik kötőhely esetén az egyensúlyi állandó nagy értéke: K1=6,424·105 M-1, valamint a reakcióhő nagy negatív értéke: ΔH1= -1,04·104 kcal/mol arra utal, hogy ez a kötőhely specifikusan és erősen köt kettő vagy három cinket. A másik kötőhelyen gyenge aspecifikus kötés jön létre, amit az entalpiaváltozás pozitív értéke mutat: ΔH2=2100 kJ/mol. Ezen a kötőhelyen a gyenge kötődés entrópiavezérelt és aspecifikus.

58

A MgCl2-dal történő mérést a cinkkel való titrálással teljesen azonos körülmények között végeztem az eredmények összehasonlíthatósága érdekében. A mérési görbe alapján megállapítható, hogy a FliH nem képes kötni a Mg2+ ionokat (4.21. ábra).

4.21. ábra 2+

FliH Mg

kötésének mérése ITC-vel

A CaCl2-dal történt mérés a Mg Cl2 -hoz hasonlóan nem mutatott kötődést. A CoCl2 esetén azt kaptam, hogy a FliH képes kötni a Co2+-kat. A kiértékeléshez egy kötőhelyes modellt használtam és azt kaptam, hogy egy kobalt ion kötődik a dimer FliH fehérjéhez (n=0,66; K=2,5·104 M-1; ΔH=-4,02·104 kcal/mol). A kapott eredmények alapján azt feltételezem, hogy a FliH a multi-cink fehérjék csoportjába tartozik. A multi-cink enzimek szerkezetének a meghatározásakor azt tapasztalták, hogy a fehérje aktív centrumában lévő egy vagy két cink atomot helyettesíthetnek más fémionok is, ezért feltételezhető, hogy kobalt ion valamelyik cink iont helyettesíti.

59

A multi-cink fehérjéknek közös tulajdonsága, hogy a foszfát-észter kötést hidrolizálják. Ezért olyan kísérleteket is végeztem, amelyben a FliH fehérje kötődését vizsgáltam a foszfát csoporttal. Ehhez a méréshez AMP-PNP-t (Sigma) használtam. Ezt a vegyületet használtam izotermális titrációs kaloriméteres mérésekhez a 3-foszo-glicerát kináz (PGK) enzim esetén is. A PGK a glikolízis egyik enzimje, ami ATP kötőhellyel is rendelkezik. Ezekből a mérésekből azt az eredményt kaptam, hogy a kötés energetikájának szempontjából az AMP-PNP teljesen hasonló az ATP molekulához. Az AMP-PNP előnye, hogy lassabban hidrolizál és nem szükséges a kötődéséhez a Mg2+ ionok jelenléte. A mérés előtt a fehérjéhez cink-kloridot adtam, mert feltételezésünk szerint a cink jelenléte szükséges a fehérje foszfátkötő tulajdonságához. Az AMP-PNP-vel történő kísérlet során a cellában lévő fehérje moláris koncentrációja 0,065 mM, az AMP-PNP ligandum koncentráció a tűben 1,3 mM volt, a mérési paraméterek azonosak a korábbiakkal.

4.22. ábra FliH AMP-PNP kötésének mérése ITC-vel

60

A titrálással kapott eredmény megerősítette azt a feltevést, hogy a FliH fehérje ATP kötő tulajdonságot is mutat. A sztöchiometriai faktor értéke arra utal, hogy a fehérje egy AMP-PNP molekulát köt meg erős kölcsönhatással (ΔH=-2,3·104 kcal/mol, K=6,8·106 M-1). 4.6.4. A FliH fehérje foszfolipáz C aktivitása Az ITC-s mérések kimutatták, hogy a vizsgált FliH fehérje specifikus cink kötő tulajdonsággal rendelkezik. Különböző másodlagos szerkezetjósló algoritmusokat [33-35] lefuttatva a FliH-ra azt az eredményt kaptam, hogy a fehérje nagy része a-helikális szerkezetű (4.23. ábra).

4.23. ábra

61

A FliH fehérje különböző módszerekkel jósolt másodlagos szerkezete A másodlagos szerkezetét tekintve a FliH nagymértékben hasonlít a P1 nukleázhoz és a foszfolipáz C enzimekhez. A mérete alapján arra következtettem, hogy a 235 aminosavból álló FliH molekula a bakteriális foszfolipáz C-vel van rokonságban, amely 245 aminosvból épül fel. Annak kiderítésére, hogy az általam vizsgált FliH fehérje rendelkezik-e foszfolipáz C aktivitással, egy fluoreszcens mérési módszert alkalmaztam, amelyet a Molecular Probes Inc. fejlesztett ki és forgalmaz (M-2885). A kísérlethez használt vegyület a 4-metilumbelliferil-foszfokolin, ezt hasítja a foszfolipáz C foszfodiészteráz enzim, aminek eredménye a 7-hiroxi-4-metilkumarin, ami erős fluoreszcenciát mutat 442 nm-en (abszorpciós maximum=360 nm). Az eredeti vegyület fluoreszcencia maximuma 370 nm-nél van, 442 nm-nél gyakorlatilag nincs megfigyelhető fluoreszcencia. A foszfolipáz C enzimaktivitás, mivel a 4-metilumbelliferil-foszfokolin vegyület a foszfolipáz C enzimre specifikus, a 442 nm-nél mért fluorszcens fényintenzitással kimutatható. A fluoreszcencia mérését FluoroMax-2 típusú spektrofluoriméterrel végeztem. Az oldatokat minden komponens esetében a FliH fehérje dialízis pufferéből (10 mM-os foszfát pH 7,0) készítettem. Először felvettem a 4-metilumbelliferil-foszfokolin gerjesztési spektrumát, 370 nm-nél detektálva a fluoreszcens fényt. Megállapítottam, hogy 360 nm

Fluoreszcencia intenzitás (cps)

hullámhosszú megvilágítás mellett gyakorlatilag nincs fluoreszcenciája (4.24. ábra). 1000000

500000

0 250

310

370

Hullámhossz (nm)

4.24. ábra A 4-metilumbelliferil-foszfokolin gerjesztési spektruma

62

A foszfolipáz aktivitás méréséhez egy 50 μl térfogatú, kupakkal lezárható (ezzel megakadályozható a kis mennyiségű minta elpárolgása), kvarcból készült küvettát használtam. Négy mérést végeztem különböző összetételű oldatokkal, melyek az alábbi összetételűek voltak: 0,016 mM FliH

25 μl

10 mM foszfát puffer pH 7,0 25 μl

2.

25 μl

24 μl

1 μl

3.

25 μl

23 μl

1 μl

1 μl

4.

25 μl

22 μl

1 μl

1 μl

minta

0,1 mM 4-metilumbelliferil-foszfokolin

1.

10mM cink klorid

10mM EDTA

1 μl

A mérési eredményeket a 4.25. ábra mutatja.

fluoreszcens fényintenzitás (cps)

9000

festék+H feték festék+H+Zn festék+H+Zn+EDTA

6500

4000 0

5000

10000

15000

idő (s)

4.25. ábra FliH foszfolipáz aktivitásának fluoreszcens mérése A kapott eredmények azt mutatják, hogy a fluoreszcencia intenzitás cink ionok és a FliH fehérje együttes jelenlétében jelentősen megnőtt, mutatva a foszfolipáz aktivitást, míg a többi esetben csak kis mértékű fluoreszcencia intenzitásnövekedést tapasztaltam, ami valószínűleg a festék oldatbeli hidrolízisének a következménye volt. A különböző kísérletek eredményei egyértelműen arra utalnak, hogy a FliH fehérje egy multi-cink enzim, amely foszfolipáz C enzimatikus aktivitással rendelkezik.

63

4.7. FliS – flagellin kölcsönhatás A FliS fehérje és a flagellin molekula kötődésének energetikáját és sztöchiometriáját izotermális titrációs kaloriméterrel határoztam meg. A kalorimetriás mérésekhez a laborban tisztított FliS-t használtam. A mérések során a flagellint és a fragmentumait töltöttem a kaloriméter

adagoló

tűjébe,

ezért

ezeket

az

oldatokat

töményítettem Whatman

(30000MWCO) centrifugális töményítőkkel. A FliS-t és a flagellin monomereket, valamint a fragmentumokat tartalmazó oldatokat együtt dializáltam 20 mM Trisz-HCl, (pH 7,8) pufferbe, egyszer cserélve az oldatot. Az oldatok koncentrációját a mérések előtt spektrofotométerrel határoztam meg. A FliS koncentrációja a mérőcellában 0,18 mg/ml volt. A mérés során a flagellin és az F46 koncentrációja 5,5 mg/ml, az F48-é 5,6 mg/ml volt. A kalorimétert vezérlő szoftverben az alábbi paramétereket állítottam be:

összes injektálások száma

14

a mérés hőmérséklete

25 °C

injektált mennyiség

10 μl

injektálás időtartama

20 s

várakozás két inj. között

300 s

kezdeti késleltetés

60 s

referencia fűtési teljesítmény

25 μCal/sec

visszacsatolás mértéke

nagy

keverési sebesség

260 1/perc

A mérések során mutatkozó hőhatás egyértelműen mutatja a FliS és a flagellin molekulák kölcsönhatását. A mérési adatokra jól illeszthető az egy kötőhelyes modell görbéje. Az illesztésből adódó egyensúlyi állandó K=1,9·107 M-1 és a moláris entalpiaváltozás ΔH=-12,9·kcal/mol nagy értéke azt mutatja, hogy a FliS és a flagellin molekulák között erős kötődés jön létre (4.26. ábra). A sztöchiometriai együttható a mérésből igen pontosan 1-nek adódott, ami 1 az 1 arányú kötődést jelent, szemben a gélszűréssel megállapítottal [22]. A méréseket más hőmérsékleten is elvégeztem és azt tapasztaltam, hogy a hőmérséklet emelkedésével az egyensúlyi állandó csökken, míg a kötési energai nagysága nő (4.2. táblázat). Az 55 °C-os mérésnél a flagellin molekula már kitekeredett állapotban van jelen az oldatban.

64

T (°C)

25

37

55

K (M-1)

1,9·107

6,3·106

1,6·105

ΔH (kcal/mol)

-12,9·

-23,2

-36,4

4.2. táblázat

0

Time (min) 0

20

40

60

80

-2

Data: sc0312191_NDH Model: OneSites Chi^2 = 19933.0 N 0.9979 ±0.00318 K 1.884E7 ±1.704E6 ΔH -1.289E4 ±65.97 ΔS -9.949

0,0 kcal/mole of injectant

µcal/sec

-4

-0,2 -0,4 -0,6

kcal/mol of injectant

0

-6

-8

-10

-4 -8

-12

-12 -14

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0

Molar Ratio

Molar Ratio

4.26. ábra FliS és flagellin kölcsönhatásának mérése ITC-vel A csonkított terminális régiókkal rendelkező fragmentumokkal végzett titrálások eredményei a 4.27. ábrán láthatóak. Az N-terminálisán csonkított F46 fragmentum (4.27. ábrán -tel jelölve) egyértelmű kötődést mutat, és az értékek sem különböznek lényegesen a flagellinnel mértektől (n=0,98; K=8·106 M-1; ΔH=-14,4·kcal/mol).

65

kcal/mol of injectant

0

-4

Data: S4702231_NDH Model: OneSites Chi^2 = 119906 N 0.9752 ±0.00875 K 7.861E6 ±1.339E6 ΔH -1.441E4 ±209.1 ΔS -16,79

-8

-12

-16 0

1

2

3

Molar Ratio

4.27. ábra FliS - F46 () és FliS - F48 () kölcsönhatásának mérése ITC-vel A C-terminálisán csonkított F48 fragmentum (4.27. ábrán -szal jelölve) nem mutat kötődést, ami összhangban van az irodalmi adatokkal, miszerint a FliS fehérje a flagellin Cterminális régiójával hat kölcsön.

66

5.

Összefoglalás Munkám során a bakteriális filamentumot felépítő flagellinmolekula terminális

régióinak a szerepét vizsgáltam a fehérje polimerizációja során. Izotermális titrációs kalorimetriás és spektrofluoreszcenciás méréseket végeztem a flagellinmolekulával és a flagellumspecifikus exportrendszer FliH, FliI és FliS fehérjéivel. Fontosabb eredményeim: 1. Fluoreszcens festékkel jelzett, különböző mértékben terminálisan csonkított flagellinmolekula

fragmentumokkal

FRET

alkalmazásával

végzett

mérésekkel alátámasztottam azt a hipotézist, miszerint a filamentum végén levő flagellinmolekula szabad N-terminálisával képes kapcsolódni egy következő alegység ép C-terminálisához és ezen kötegek egymásba fonódó láncolata eredményezi a folytonos filamentáris szerkezet kialakulás 2. Izotermális titrációs kaloriméterrel meghatároztam a FliI-FliH kötés sztöchiometriáját és moláris entalpiáját. Megállapítottam, hogy a két fehérje között csak gyenge kölcsönhatás létezik, ami nem támasztja alá a FliH irodalom szerinti szerepét a FliI ATP-áz szabályozására vonatkozóan. 3. Izotermális titrációs kaloriméterrel kimutattam, hogy a FliH a. igen erős specifikus Zn2+-ion kötő, b. foszfátkötő tulajdonsággal rendelkezik. 4. Spektrofluoriméterel végzett kísérletekkel kimutattam, hogy a FliH foszfolipáz-C enzimatikus aktivitással rendelkezik. 5. Izotermális titrációs kaloriméterrel meghatároztam a FliS-flagellin kötés sztöchiometriáját és moláris entalpiáját. Mérési eredményeim az irodalommal ellentétben 1:1 arányú kötődést mutattak. A C-terminálisán csonkított fragmentummal való mérés összhangban az irodalmi adatokkal, miszerint a FliS fehérje a flagellin C-terminális régiójával hat kölcsön, nem mutatott kötődést 67

Theses 1. Various terminally truncated fragments of flagellin were labeled with fluorescent dyes, and their binding to the end of flagellar filaments was studied and compared by fluorescence resonance energy transfer (FRET) measurements. My results supported the Homma model of filament formation suggesting that the inner core of flagellar filament involves helical bundles formed by the interaction of N- and C-terminal regions of axially adjacent subunits. 2. The FliI–FliH complex was quantitatively characterized by isothermal titration calorimetry (ITC) to determine the stoichiometry and binding enthalpy. I found that FliS–FliC interaction is too weak to allow effective binding in the physiological concentration range. 3. I demonstrated by isothermal titration calorimetry that a. FliH can specifically bind zinc atoms, b. FliH is a phosphate binding protein. 4. My spectrofluorimeter experiments demonstrated that FliH possesses phospholipase C activity. 5. I characterized the stoichiometry and binding enthalpy of the FliS–flagellin binding by isothermal titration calorimetry. The binding stoichiometry was found to be 1:1. Experiments with truncated FliC fragments demonstrated that the C-terminal disordered region of flagellin is essential for FliS binding.

68

A disszertáció alapját képező publikációk listája Referált kiadványokban megjelent tudományos publikációk: 1. Adél Muskotál, Réka Király, Anett Sebestyén, Zoltán Gugolya, Barbara M. Végh, Ferenc Vonderviszt (2006) Interaction of FliS flagellar chaperone with flagellin. FEBS Letters 580, 3916-3920 2. Sebestyén A., Gugolya Z., Jakab G., Diószeghy Z., Závodszky P., Vonderviszt F. (2005) The FliH component of the flagellar export apparatus is a multi-zinc enzyme with phospholipase activity FEBS Journal 272 (s1), F3-012P 3. Muskotál A., Király R., Sebestyén A., Végh B. M., Gugolya Z., Vonderviszt F. (2005) Characterization of Salmonella FliS flagellar chaperone binding to flagellin FEBS Journal 272 (s1), G1-030P 4. Flachner B, Kovári Z, Varga A, Gugolya Z, Vonderviszt F, Náray-Szabó G and Vas M. (2004) Role of phosphate chain mobility of MgATP in completing the 3phosphoglycerate kinase catalytic site: Binding, kinetic, and crystallographic studies with ATP and MgATP. BIOCHEMISTRY 43: 3436-3449 5. Gugolya Z., Muskotál A., Sebestyén A., Diószeghy Z. and Vonderviszt F. (2003) Interaction of the disordered terminal regions of flagellin upon flagellar filament formation. FEBS Lett 535, 66-70. Előadás: 1. Magyar Biokémiai Egyesület Molekuláris Biológiai Szakosztálya, 8. Munkaértekezlete (2003. május 12-15., Tihany): Vonderviszt Ferenc, Jakab Gábor, Diószeghy Zoltán, Gugolya Zoltán, Závodszky Péter: A FliH fehérje szerepe a flagellum-specifikus exportapparátus működésében. 2. MBFT Molekuláris Biofizikai Szekció (2003. április 25. Veszprém) Gugolya Zoltán, Jakab Gábor, Vonderviszt Ferenc: A flagellum-specifikus exportrendszer FliH komponensének kötődési tulajdonságai. Poszter: 1. Muskotál A., Király R., Sebestyén A., Végh B. M., Gugolya Z., Vonderviszt F.: Characterization of Salmonella FliS flagellar chaperone binding to flagellin. 30th FEBS Congress, 2-7 July 2005, Budapest 2. Sebestyén, Z. Gugolya, G. Jakab, Z. Diószeghy, P. Závodszky and F. Vonderviszt: The FliH component of the flagellar export apparatus is a multi-zinc enzyme with phospholipase activity. 30th FEBS Congress, 2-7 July 2005, Budapest 3. Sebestyén Anett, Gugolya Zoltán, Jakab Gábor, Muskotál Adél, Diószeghy Zoltán, Závodszky Péter, Vonderviszt Ferenc: A flagellumspecifikus exportrendszer FliH komponense foszfolipáz aktivitással rendelkező multi-cink fehérje MBFT Kongresszusa, Debrecen, 2005. június 26-29. 4. Flachner Beáta, Varga Andrea, Kovári Zoltán, Gugolya Zoltán, Vonderviszt Ferenc, Náray-Szabó Gábor és Kazinczyné Vas Mária: A Mg2+ alapvető szerepe az ATP és ADP foszfoglicerát-kinázzal való specifikus kölcsönhatásában. Magyar Biokémiai Egyesület Molekuláris Biológiai Szakosztálya, 8. Munkaértekezlete (2003. május 1215., Tihany)

69

5. Muskotál A.- Sebestyén A.- Gugolya Z.- Diószeghy Z.- Vonderviszt F.: Interaction of the disordered terminal regions of flagellin upon filament formation. Keihanna International Conference on Molecular Biophysics., Kyoto, Japan, 2002. szept. 1921. 6. Muskotál A, Sebestyén A, Gugolya Z, Diószeghy Z, Vonderviszt F: A flagellin molekula rendezetlen terminális régióinak szerepe az alegységek kölcsönhatásaiban. Magyar Biokémiai Egyesület Molekuláris Biológiai Szakosztálya, 7. Munkaértekezlete (2002. május 14-17., Keszthely) 7. Vonderviszt F.- Muskotál A.- Sebestyén A.- Gugolya Z.- Diószeghy Z.: Interaction of the disordered terminal regions of flagellin upon filament formation. XIV. International Biophysics Congress. Buenos Aires, Argentina 2002. ápr. 27.- máj. 1.

A disszertációhoz szervesen nem kapcsolódó publikációk listája Folyóiratcikkek: 1. Z. Gugolya, Zs. Dosztányi, I. Simon: Interresidue interactions in protein classes, in: Proteins. Structure, Function, and Genetics 27, pp. 360-366,1997 2. I. Simon, Z. Gugolya, Zs. Dosztányi: Interresidue interactions in protein classes Prog.Biophys.Molec.Biol. 65, pp.35, 1996 (abstract). 3. Gy. Rontó, S. Gáspár, P. Gróf, A. Bérces and Z. Gugolya: Ultraviolet Dosimetry in Outdoor Measurements Based on Bacteriophage T7 as a Biosensor. Photochemistry and Photobiology 59, 1994 Jegyzetek: 1. Gergelyi Gábor, Gugolya Zoltán, Palágyi Gábor, Kronome Gergely, Vonderviszt Ferenc, Demény Orsolya: Fizikai feladatgyűjtemény I. Mechanika. Veszprémi Egyetemi Kiadó, 2002 2. Gaal Sándor, Gergelyi Gábor, Gugolya Zoltán, Tóth József: Fizikai laboratóriumi gyakorlatok. Veszprémi Egyetemi Kiadó, 1998

70

Irodalomjegyzék 1. K. Namba és mts. (1997) Molecular architecture of bacterial flagellum Quart. Rev. Biophys. 30, 1-65 2. Takeshi Ikeda és mts. (1993) Flagellar growth in a Filament-Less Salmonella FliD Mutant Supplemented with Purified Hook-Associated Protein 2 J. Biochem. 114, 39-44 3. Robert M. Macnab (1999) The Bacterial Flagellum: Reversible Rotary Propellor and Type III Export Apparatus J. Bacteriol. 7149-7153. 4. Vonderviszt F. és mts. (1992) Terminal disorder: A common structural feature of the axial proteins of the bacterial flagellum. J. Mol. Biol. 226, 575-579 5. F. Vonderviszt és mts. (1989) Terminal regions of flagellin are disordered in solution. J. Mol. Biol. 209, 127-133. 6. S. Aizawa és mts. (1990) Termini of Salmonella flagellin are disordered and become organized upon polymerization into flagellar filament. J. Mol. Biol. 211, 673-677. 7. F. Vonderviszt és mts. (1990) Structural organization of flagellin. J. Mol. Biol. 214, 97104. 8. F. Vonderviszt és mts. (1991) Role of the disordered terminal regions of flagellin in filament formation and stability J. Mol. Biol. 221, 1461-1474. 9. Y. Mimori-Kiyosue és mts. (1996) Direct interaction of fagellin termini essential for polymorphic ability of flagellar filament Biophysics 93, 15108-15113. 10. Y. Mimori-Kiyosue és mts. (1997) Locations of terminal segments of flagellin in the filament structure and their roles in polymerization and polymorphism. J. Mol. Biol. 270, 222-237. 11. Yamashita és mts. (1998) Structure and switching of bacterial flagellar filament studied by X-ray fiber diffraction. Nature Struct. Biol. 5, 125-132. 12. F. A. Samatey és mts. (2001) Structure of the bacterial flagellar protofilament and implications for a switch for supercoiling Nature 410, 331-337. 13. Homma, M és mts. (1990)., DeRosier, D. J. & Macnab, R. M. Flagellar hook and hookassociated proteins of Salmonella typhimurium and their relationship to other axial components of the flagellum. J. Mol. Biol. 213, 819−832 14. Robert M. Macnab (1999) The Bacterial Flagellum: Reversible Rotary Propellor and Type III Export Apparatus J. Bacteriol. 7149-7153

71

15. Tohru Minamino és mts. (1999) Components of the Salmonella Flagellar Export Apparatus and Classification of Export Substrates J. Bacteriol. 1388-1394. 16. George Dreyfus és mts. (1993) Genetic and Biochemical Analysis of Salmonella typhimurium FliI, a Flagellar Protein Related to the Catalytic Subunit of the F0F1 ATPase and to Virulence Proteins of Mammalian and Plant Pathogens J. of Bacteriol. 3131-3138 374-383 17. Frédéric Auvray és mts. (2002) Intrinsic Membrane Targeting of the Flagellar Export ATPase FliI: Interaction with Acidic Phopholipids and FliH J. Mol. Biol. 318, 941-950 18. Eugenia Silva Herzog és mts. (1999) Interaction of FliI, a component of the flagellar export apparatus, with flagellin and hook protein Biochimica et Biophysica Acta 1431, 374-383 19. Tohru Minamino és mts. (2001) Proteolytic Analysis of the FliH/FliI Complex, the ATPase Component of the Type III Flagellar Export Apparatus of Salmonella J. Mol. Biol. 312, 1027-1036 20. Tohru Minamino és mts. (2002) Structural Properties of FliH, an ATPase Regulatory Component of the Salmonella.Type III Flagellar Export Apparatus J. Mol. Biol. 322, 281290 21. I. Kawagisi és mts. (1992) Subdivision of flagellar region III of the Escherichia coli and Salmonella typhimurium chromosomes and identification of two additional flagellar genes Journal of General Microbiology, 138 . 1051-1065. 22. Frédéric Auvray és mts. (2001) Flagellin Polymerisation Control by a Cytosolic Export Chaperone J. Mol. Biol.308, 221-229 23. A. J. Ozin és mts. (2003). The FliS chaperone selectively binds the disordered flagellin Cterminal D0 domain central to polymerisation. FEMS Microbiol. Letters. 219, 219-224. 24. ELTE Biokémiai Tanszék: Biokémia gyakorlati jegyzet, Budapest, 2003. 25. Biomolecule Chromatography PerSeptive Biosystem 1996, 165-174, 135-142 26. VP-ITC MicroCalorimeter User’s Manual 1998 27. http://omlc.ogi.edu/spectra/PhotochemCAD 28. http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Research-Tools/FluorescenceSpectraViewer.html?fileId1=1378gsh 29, Richard P. Haugland, Handbook of fluorescent probes and research chemicals, Sixth Edition 30. Jones DT (1999) Protein secondary structure prediction based on position-specific scoring matrices. J. Mol. Biol. 292, 195-202. 72

31. http://www.piercenet.com/files/TR0006dh5-Extinction-coefficients.pdf 32. Gasteiger E. és mts. (2005) Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server; (In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press.pp. 571-607 33. McGuffin LJ és mts. (2000) The PSIPRED protein structure prediction server. Bioinformatics. 16, 404-405. 34. Raghava, G. P. S. (2000) Protein secondary structure prediction using nearest neighbor and neural network approach. CASP4: 75-76. 35. Combet C. és mts. (2000) NPS@: Network Protein Sequence Analysis, TIBS March Vol. 25, No 3 [291]:147-150,

73

A flagellin fehérje polimerizációjának jellemzése

Recommend Documents