FÁJDALOMCSILLAPÍTÓ HATÁSÚ NR2B ALTÍPUSSZELEKTÍV NMDA ANTAGONISTÁK KUTATÁSA. Borza István

Budapesti Mőszaki és Gazdaságtudományi Egyetem

FÁJDALOMCSILLAPÍTÓ HATÁSÚ NR2B ALTÍPUSSZELEKTÍV NMDA ANTAGONISTÁK KUTATÁSA PhD ÉRTEKEZÉS

Borza István

Témavezetı: Dr. Domány György Richter Gedeon Nyrt. Gyógyszerkémiai Kutatólaboratórium I Konzulens: Dr. Keglevich György BME Vegyészmérnöki Kar, Szerves Kémia és Technológia Tanszék

Budapest, 2010

Nyilatkozat

Alulírott Borza István kijelentem, hogy ezt a doktori értekezést saját magam készítettem meg nem engedett segítség nélkül, és csak a megadott forrásokat használtam fel. Minden olyan részt, amelyet szó szerint vagy azonos értelemben, de átfogalmazva más forrásból átvettem, egyértelmően a forrás megadásával megjelöltem.

Budapest, 2010 …………………… Borza István

1

TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSEK 1. BEVEZETÉS, CÉLKITŐZÉS .........................................................................................6 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS.............................................................................................8 2.1. A fájdalom érzékelése ....................................................................................................8 2.1.1. Fájdalomtípusok és mechanizmusok ........................................................................................... 8 2.1.2. A fájdalom vázlatos élettana ...................................................................................................... 10 2.1.2.1. A fájdalominger útvonala ................................................................................................... 10 2.1.2.2. Kapuzárásos fájdalom kontroll (wind up).......................................................................... 12 2.1.2.3. Centrális fájdalom kontroll (analgetikus leszálló pályarendszer)...................................... 13 2.1.3. Receptorok, ioncsatornák és mediátorok a gerincvelı hátsó szarvában ................................... 14

2.2. Glutaminsav receptorok .............................................................................................. 15 2.2.1. 2.2.2. 2.2.3. 2.2.4.

Nem-NMDA glutaminsav receptorok és élettani jelentıségük ................................................. 15 NMDA receptorok élettani jelentısége ..................................................................................... 17 NMDA receptorok felépítése és mőködése................................................................................ 18 Az NMDA receptorok expressziója........................................................................................... 20

2.3. Az NMDA receptorok mint terápiás célpontok .......................................................... 20

2.3.1. Glicin antagonisták .................................................................................................................... 21 2.3.2. Glutaminsav antagonisták (kompetitív NMDA receptor antagonisták) ................................... 22 2.3.3. NMDA csatorna blokkolók (nem kompetitív NMDA receptor antagonisták).......................... 22 2.3.4. NR2B szelektív NMDA antagonisták ........................................................................................ 23 2.3.4.1. Ifenprodil típusú NR2B szelektív NMDA antagonisták ................................................... 23 2.3.4.2. Nem ifenprodil típusú NR2B szelektív NMDA antagonisták ........................................... 35

3. KÍSÉRLETI MODELLEK, VIZSGÁLATI MÓDSZEREK ........................................ 40 3.1. Farmakológiai szőrırendszer...................................................................................... 40 3.2. In vitro vizsgálatok ....................................................................................................... 42 3.2.1. Kötıdési tesztek......................................................................................................................... 42 3.2.2. Funkcionális tesztek .................................................................................................................. 42 3.2.2.1. Funkcionális teszt primer neokortikális tenyészeten.......................................................... 42 3.2.2.2. Funkcionális teszt NR1a/NR2B és NR1/NR2A alegység összetételő rekombináns NMDA receptorokon ...................................................................................................................... 43

3.3. In vivo tesztek............................................................................................................... 44

3.3.1. Egér formalin teszt..................................................................................................................... 44 3.3.2. Neuropátiás fájdalom Seltzer modellje (antihiperalgézia) ........................................................ 44 3.3.3. Neuropátiás fájdalom CCI (chronic constriction injury) modellje (antiallodínia).................... 44 3.3.4. Diabéteszes neuropátia modell ................................................................................................... 45

3.4. Nemkívánatos mellékhatásokra utaló tesztek............................................................. 45

3.4.1. Irwin teszt................................................................................................................................... 45 3.4.2. Spontán lokomotoros aktivitás mérése rágcsálókon.................................................................. 45 3.4.3. Rotarod teszt .............................................................................................................................. 45 3.4.4. QT-megnyúlás ............................................................................................................................ 46

4. SAJÁT EREDMÉNYEK................................................................................................ 47 4.1. Fahéjsavamidok ........................................................................................................... 50 4.1.1. Tiraminszármazékok ................................................................................................................. 51 4.1.2. Oktopaminszármazékok ............................................................................................................ 52 4.1.3. Fahéjsavamidok elıállítása ........................................................................................................ 55

2

4.2. Indol-2-karbonsav-származékok................................................................................. 57 4.2.1. Hidroxilcsoport helyzete az indolgyőrőn ................................................................................... 58 4.2.2. Az X-csoport természete ............................................................................................................ 60 4.2.3. A piperidingyőrő szubsztituensének helyzete........................................................................... 60 4.2.4. Az Y összekötı lánc helyzete ..................................................................................................... 61 4.2.5. A Z-csoport természete és helyzete ........................................................................................... 61 4.2.6. Indol-2-karbonsav-származékok elıállítása ............................................................................. 62

4.3. Benzimidazol-2-karbonsav-származékok ................................................................... 65 4.3.1. 4.3.2. 4.3.3. 4.3.4.

Az indol pirrolrészének helyettesítése más karbo-, illetve heterociklusokkal .......................... 65 Benzimidazol-2-karboxamidok optimalizációja ....................................................................... 66 Benzimidazol-2-karbonsav-származékok elıállítása ................................................................ 67 Indol- és benzimidazol-származékok in vivo aktivitása ............................................................ 70

4.4. Oxálsavdiamidok ......................................................................................................... 71

4.4.1. Eredmények, szerkezet-hatás összefüggések............................................................................. 71 4.4.2. Oxálsavszármazékok elıállítása................................................................................................ 76

4.5. Kinurénsav amidszármazékok .................................................................................... 78

4.5.1. Eredmények, szerkezet-hatás összefüggések............................................................................. 78 4.5.2. Kinurénsav amidszármazékainak elıállítása ........................................................................... 82

4.6. Benzoil-karbamid-származékok.................................................................................. 83 4.6.1. Eredmények, szerkezet-hatás összefüggések............................................................................. 83 4.6.2. Benzoil-karbamid-származékok elıállítása .............................................................................. 88

4.7. Indol-2-karboxamidin-származék............................................................................... 89 4.7.1. Eredmények, szerkezet-hatás összefüggések............................................................................. 89 4.7. 2. Indol-2-karboxamidin-származékok elıállítása........................................................................ 93

4.8. Benzilidén-piperidin-származékok.............................................................................. 94

4.8.1. Eredmények, szerkezet-hatás összefüggések az indol- és benzimidazol-...................................... származékok körében .......................................................................................................................... 95 4.8.2. Indol- és benzimidazol-származékok elıállítása ....................................................................... 98 4.8.3. Eredmények, szerkezet-hatás összefüggések az oxálsavdiamidok körében.............................. 98 4.8.4. Oxálsavdiamidok elıállítása..................................................................................................... 100

5. A PROJEKT BEFEJEZÉSE.......................................................................................101 6. ÖSSZEFOGLALÁS.....................................................................................................102 7. TÉZISEK .....................................................................................................................109 8. MOLEKULALISTA....................................................................................................111 9. IRODALOMJEGYZÉK..............................................................................................118 10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS......................................................................................126

3

RÖVIDÍTÉSEK Ac

acetil

BA

biohasznosulás (Bioavailability)

Bn

benzil

cAMP

ciklikus adenozin-monofoszfát

CC test

patkány hipokampális neuronok primer tenyészetében meghatározott glutaminsav-indukált sejthalál gátlás

CFA

komplett Freund adjuváns (Complete Freund's Adjuvant)

CGRP

kalcitonin gén-rokon peptid (Calcitonin gene related peptide)

COX

ciklooxigenáz

CYP

citokróm P450

DAU

dopamin felvétel

DEAD

dietil-aza-dikarboxilát

DIC

diizopropil-karbodiimid

DIPEA

diizopropil-etil-amin

DMAP

4-dimetil-amino-piridin

DRG

hátsó gyöki ganglionsejtek (Dorsal root ganglion)

ED

effektív dózis

GABA

γ-amino-vajsav

HBTU

2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurónium-hexafluorofoszfát

hERG

Kv11.1 káliumcsatorna (Human Ether-à-go-go Related Gene)

HPCD

hidroxipropil-β-ciklodextrin

HTS

nagy áteresztı-képességő szőrés (High-throughput Screening)

i.p.

intraperitoneális

IP3

inozitol-trifoszfát

i.v.

intravénás

IVM FM%

in vitro metabolizmus, becsült maximális felszívódás

LMA

lokomotoros aktivitás

LTP

hosszú távú aktiváció kialakulása (Long-term potentiation)

mCPBA

meta-klór-perbenzoesav

MCP-1

monocita kemoattraktáns protein-1 (Monocyte chemotactic protein-1)

MED

minimum effektív dózis

Mez

mezil 4

mGluR

metabotróp glutaminsav receptor

NCS

N-klór-szukcinimid

N.D.

nincs meghatározva (not determined)

NK-1

neurokinin 1 receptor

NMDA

N-metil-D-aszparaginsav

NOS

nitrogén-monoxid szintáz

PCP

1-(1-fenil-ciklohexil)piperidin

PK

farmakokinetika

p.o.

per os, szájon át

QT

a szív elektromos ciklusának a Q hullám elejétıl a T hullám végéig tartó idıintervalluma

SAR

szerkezet-hatás összefüggés (Structure-activity relationship)

s.c.

szubkután, bır alá

t.

termelés

TFA

trifluorecetsav

Toz

tozil

5

1. BEVEZETÉS, CÉLKITŐZÉS Bár a fájdalomcsillapítás a legısibb orvosi feladatok közé tartozik, a krónikus és neurogén fájdalmak a mai napig megoldatlan terápiás problémát jelentenek. Neuropátiás fájdalom az idegrendszer tartós sérülése vagy mőködéscsökkenése, például baleseti sérülés, mőtét, kemoterápia és különbözı betegségek (AIDS, szklerózis multiplex, artritisz, cukorbetegség) következtében alakulhat ki.1 Tünetei a körülményektıl függıen különbözıek lehetnek, de leggyakrabban allodíniában (fájdalmatlan inger által kiváltott fájdalom) és hiperalgéziában (felfokozódott fájdalomérzékenység) nyilvánulnak meg. A fájdalom krónikussá válásában fıleg a perifériás idegek és a gerincvelı, ritkábban agyi területek is érintettek. Kezelésében a közismert fájdalomcsillapító gyógyszerek hatása elégtelen, ennek ellenére

a neuropátiás

fájdalomban szenvedık többségénél még mindig ezeket a szereket alkalmazzák. A gyógyszeres és egyéb terápiák a krónikus neurogén fájdalomban szenvedı betegek felének csillapítják csak a fájdalmát, ezért égetı szükség van új, hatékony gyógyszerekre.2 Az a tény, hogy hagyományos analgetikumokra ez a fájdalomforma alig reagál, más terápiás területek (antidepresszánsok, antiepileptikumok) meglévı gyógyszereinek „off label” alkalmazásához vezetett. Késıbb ezek közül a leghatásosabbakat törzskönyvezték az új indikációra, ennek ellenére a triciklusos antidepresszánsok és az arany standardnak tekintett gabapentin és pregabalin a betegek nagy részénél gyenge hatékonyságot mutatnak.3 Az elmúlt néhány évtizedben bebizonyosodott, hogy a glutaminsav receptorok fontos szerepet töltenek be a perifériás szövetek és idegek sérüléseivel kapcsolatos fájdalomérzékelésben.3-5 A glutaminsav a központi idegrendszer fı serkentı neurotranszmittere, számos metabotróp és három ionotróp receptort aktivál (NMDA, AMPA és kainsav). Az ionotróp glutaminsav receptorok serkentı szinaptikus jelátvitelt közvetítenek a központi idegrendszerben. Normális, nociceptív fájdalom esetén a gerincvelı hátsó szarvában az afferens idegekbıl érkezı serkentı jelet elsısorban a gyors aktivációra és deszenzibilizációra képes AMPA és kainsav receptorok közvetítik. A hosszabb ideig tartó, intenzívebb, fájdalmas ingerek akkumulálódó, elnyújtott, lassan depolarizáló szinaptikus potenciált alakítanak ki. Ezeket a krónikus és neuropátiás fájdalomra jellemzı ingereket a lassabban reagáló NMDA receptor-ioncsatornák közvetítik. Az idegi sérülés helyén neuroma, egy hiperérzékeny struktúra keletkezik, mely intenzív fájdalom bemenetet ad a gerincvelı hátsó szarvába. Az ottlévı idegek a megnövekedett bemenet miatt túlérzékeny állapotba kerülnek, csökken az ingerküszöbük, a nem fájdalmas ingereket is fájdalomként továbbítják (allodínia), illetve a fájdalmas ingereket abnormálisan felerısítik (hiperalgézia). Ezt a gerincvelıben jelentkezı hiperérzékeny állapotot ( „wind-up”) 6

már 1966-ban leírták.6 Az NMDA antagonisták lehetséges szerepének felvetését a neuropátiás fájdalom enyhítésében 1987-re tehetjük amikor kimutatták, hogy NMDA antagonisták gátolják a „wind-upot”.7, 8 Ezután számos in vivo modellben sikerült igazolni, hogy az NMDA receptor antagonisták hatékonyan csillapítják mind a neurogén9,

10

, mind a gyulladásos

fájdalmat11. Az NMDA antagonista hatás mellett egyéb receptoriális aktivitással is rendelkezı, forgalomban lévı gyógyszerekkel szerzett klinikai tapasztalatok is megerısítik használhatóságukat fájdalomcsillapításban, Parkinson- és Alzheimer-kórban (pl. ketamin12-14, dextrometorfán15, memantin16). Ezek a vegyületek nem kompetitív antagonisták, az ioncsatorna belsejében lévı csatornát blokkoló kötıhelyhez, az ún. fenciklidin kötıhelyhez kapcsolódva fejtik ki hatásukat. Hatékony terápiás használatukat elsısorban az NMDA receptor által mediált szinapszisokat túlzottan blokkoló hatásuk gátolta. Ennek ellenére a kutatások elsı szakaszában népszerő célpont volt a fenciklidin kötıhely de az újonnan elıállított antagonisták fejlesztése is abbamaradt tipikus mellékhatásaik (pszichotomimetikus, szedatív, memóriarontó) miatt.17 Jelentıs elırelépést jelentettek az NR2B alegység altípusra szelektív antagonisták megjelenése, melyek mentesek ezektıl a mellékhatásoktól. Elsıként egy forgalomban lévı vérnyomáscsökkentıt, az ifenprodilt azonosítottak NR2B szelektív NMDA antagonista hatású vegyületként. Az ifenprodil és analogonjai (pl. az eliprodil) vegyes profilú anyagok, alkalmazásukat olyan mellékhatások korlátozták melyek nem függnek össze az NMDA hatásmechanizmussal. Idıközben számos NR2B szelektív NMDA antagonista vegyületet írtak le és védtek szabadalmi bejelentésekben, melyeket fıleg neuroprotektív területen vizsgáltak. Késıbb merült fel fájdalomcsillapításra való felhasználásuknak a lehetısége, és mivel mellékhatásaik egyéb receptoriális aktivitásuknak köszönhetı, okkal remélhettük, hogy egy tiszta profilú, szelektív vegyület mellékhatásmentesen csillapíthatja a neuropátiás fájdalmat. A kielégítetlen gyógyászati igényt és a hatásmechanizmus újdonságát mérlegelve, Társaságunk a Richter Gedeon Gyógyszervegyészeti Gyár 1999-ben NR2B szelektív NMDA antagonista hatásmechanizmuson alapuló új fájdalomcsillapító kutatási projekt elindítása mellett döntött. Terápiás célunk egy orálisan adható fájdalomcsillapító volt, krónikus és neurogén fájdalmak enyhítésére. Ennek érdekében ifenprodil típusu, NR2B szelektív antagonista hatású molekulák elıállítását és tesztelését határoztuk el. Mivel abban az idıben a receptor szerkezete nem volt teljesen felderítve és egy nagy áteresztıképességő biológiai szőrésnek sem volt meg a feltétele, kémiai munkánkat a versenytársak ismert anyagainak a szerkezetére alapoztuk.

7

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. A fájdalom érzékelése 2.1.1. Fájdalomtípusok és mechanizmusok A Nemzetközi Fájdalom Társaság (IASP) definíciója szerint a fájdalom: „ Kellemetlen érzéki és emócionális élmény, amely valódi vagy lehetséges szövetkárosodással jár, vagy ehhez hasonló panaszokat okoz. A fájdalom mindig szubjektív és emiatt mindig érzelmi töltése is van”. A fájdalom funkcióját mind a mai napig Hippokratész fogalmazta meg a legtalálóbban: „A fájdalom a szervezet házırzı kutyája”. Vagyis a fájdalom egy olyan életfontosságú biológiai jelzırendszer, mely egyrészt segít az ártalmas ingerek elkerülésében , másrészt jelzi a szervek, szövetek károsodását vagy megbetegedését. A fájdalom komplex fogalom, testi, lelki, értelmi, szociális és spirituális összetevıi vannak.18 A fájdalomnak kórtani alapon három típusa különíthetı el: nociceptív, gyulladásos és neuropátiás fájdalom (1. ábra).1 A nociceptív fájdalom sérülést követıen többnyire akutan alakul ki. Biológiailag hasznos védı szerepet ellátó fiziológiai jelenség. Figyelmeztet a kialakult vagy fenyegetı vázizomrendszeri és zsigeri szövetkárosodásra, a károsodás elhárítását célzó magatartást, illetve reflexeket vált ki. Az okozott fájdalom általában jól kezelhetı hagyományos fájdalomcsillapító szerekkel. Az 1.a. ábra egy normál, fiziológiás állapotú fájdalomérzékelést illusztrál. Alacsony intenzitású inger, pl. érintés, alacsony küszöbértékő afferenseket (Aβ) aktivál fájdalom nélküli, ártalmatlan érzetet keltve. Egy nagy intenzitású, fájdalmat elıidézı ártalmas inger pl. hı (az ábrán tő), magasküszöbértékő (C és Aδ) afferenseket aktivál. A gyulladásos fájdalmat perifériás szöveti sérülés, trauma, fertızés, mőtéti beavatkozás, égés okozta gyulladás vagy gyulladásos betegségek , pl. artritisz váltanak ki. A gyulladt, károsodott szövetben számos fájdalomkeltı mediátor válhat szabaddá: szerotonin, ATP, monoaminok, citokinek, kininek, kemokinek, prosztaglandinok és növekedési faktorok. Ezek a mediátor anyagok különbözı intracelluláris jelátalakító folyamatokon keresztül aktiválják, érzékenyítik a helyi nociceptív mechanizmusokat. Például a prosztaglandin E2 (PGE2) aktiválja az EP prosztanoid receptort amely aktiválja a protein kináz A-t (PKA), kiváltva ezzel a tetrodotoxin (TTX) rezisztens Nacsatorna foszforilálódását, mely kizárólag a primer fájdalomérzı idegekben (afferens nociceptorok) expresszálódik.

8

1

1. ábra. Normál, gyulladásos és neuropátiás fájdalom érzékelésének folyamata.

Az 1.b. ábra olyan perifériás szövetkárosodást vagy gyulladást követı fájdalomérzékelési folyamatokat mutat be, ahol ártalmas és nem ártalmas ingerekre is abnormális válasz indukálódik. A periféria érzékennyé válik, csökken a magas ingerküszöbő (C és Aδ) rostok ingerküszöbe, fájdalmas ingerek abnormálisan megnövekedett fájdalmérzetet okoznak a sérülés, gyulladás helyén (primer hiperalgézia). Az érzékenyített területekrıl induló nociceptív rostok képesek érzékenyíteni a közeli intakt területek nociceptorait is, így a hiperalgézia ezeket a területeket is érinti (szekunder hiperalgézia). Az érzékennyé vált nociceptorokból induló, felerısödött C-rost impulzus hiperérzékennyé teszi a gerincvelı és az agy fájdalmat közvetítı és érzékelı területeit (centrális szenzitizáció). Ennek eredményeként az alacsony küszöbértékő Aβ rostok is fájdalomérzést váltanak ki, nem fájdalmas inger (az ábrán tollpihe) is fájdalmat okoz (allodínia). A neuropátiás fájdalom az idegrendszer primer károsodása, vagy mőködészavara által kiváltott vagy fenntartott fájdalom. A neuropátiás fájdalomnak nincs védı szerepe. Gyakran válik krónkussá, a betegek értelmetlen szenvedését okozó fájdalommá. A neuropátiás fájdalom kiváltásában toxikus, vaszkuláris, traumás, gyulladásos, tumoros, metabolikus és iatrogén tényezık egyaránt szerepet játszhatnak. Az idegsérülés helyén keletkezı neurómákon és a vele kapcsolatban lévı hátsó gyöki ganglionsejteken (DRG) rendellenes kisülések keletkeznek, a sérülés helyén égı fájdalom jelentkezik (1.c. ábra). A megnövekedett 9

impulzusáram a gerincvelı hiperexcitibilitását és centrális szenzitizálását eredményezi aminek következtében hiperalgézia és allodínia alakul ki.1 A különbözı humán fájdalomformák az akut, gyulladásos és neurológiai fájdalomtípusok valamelyikébe besorolhatók, bár sok esetben a fájdalomnak gyulladásos és neuropátiás komponense is van egyszerre (2. ábra). akut fájdalom -vénás szúrás/ tő okozta fájdalom -égés -posztoperatív azonnali fájdalom -poszttraumás azonnali fájdalom -akut betegségek (hasnyálmirigy gyulladás, infarktus, stb.) -alhasi fájdalom

perzisztens/gyulladásos fájdalom -artritisz -posztoperatív fájdalom -irritábilis bél szindróma -viszcerális fájdalom -égési fájdalom -traumás szövetkárosodás -migrén -derékfájdalom -endometriózis -diszmenorrea -urológiai fájdalom

krónikus/neuropátiás fájdalom -oszteoartritisz -derékfájás (isiász, lumbágó) -fibromialgia -rákos csontfájdalom

neuropátiás fájdalom perifériás neuropátia -posztherpeszes neuralgia -toxikus neuropátia -fokális traumás neuropátia -fantom és csonk fájdalom centrális neuropátiák -iszkémiás cerebrovaszkuláris sérülés (stroke) -szklerózis multiplex okozta fájdalom -gerincvelı sérülés -Parkinzon kór -amiotrópiás laterális szklerózis vegyes neuropátiák -diabéteszes neuropátiák -szimpatikus rendszer által fenntartott fájdalom

2. ábra. Humán fájdalomtípusok.

2.1.2. A fájdalom vázlatos élettana 2.1.2.1. A fájdalominger útvonala A fájdalmat érzékelı receptoroktól az inger döntıen a gerincvelıben futó afferens rostokon keresztül jut a központi idegrendszerbe, ahol kialakul a fájdalomérzet (3. ábra).19 A központi idegrendszer válaszreakcióját az efferens rostok közvetítik. A fájdalomérzı receptorok, másnéven nociceptorok az agyszövet kivételével mindenütt jelen vannak. A nociceptorokat elsıdlegesen hı, mechanikai és kémiai ingerek aktiválják. Az inger hatására megváltozik a receptor extracelluláris részének konformációja, ennek következtében az érzıidegsejt kationcsatornája megnyílik. Generátorpotenciál képzıdik, amelynek amplitúdója a behatás erısségétıl függ. Ha a generátorpotenciál eléri a közeli Na+ csatorna küszöbét, akkor tovaterjedı akciós potenciál keletkezik. Külsı hı, mechanikai és kémiai ingerek mellett vannak olyan szövetkárosodáskor felszabaduló molekulák („gyulladásos leves”: hisztamin, szerotonin, bradikinin, stb.) amelyek önmagukban is kiváltják a nociceptor ingerületét, sıt jelentıs ingerküszöb fölötti stimulust idézhetnek elı. Míg más felszabaduló faktorok (leukotriének, prosztaglandinok, substance-P, CGRP, NO, stb) csak érzékenyítik a nociceptív

10

idegvégzıdéseket,

csökkentik

a

receptor

ingerküszöbét,

fokozott

fájdalomérzetet,

hiperalgéziát idézve elı.

DRG

3. ábra. Fájdalom „szupersztráda”: felszálló és leszálló fájdalompályák. A perifériáról induló fájdalomjelek a hátsó gyöki ganglionsejteken (DRG) keresztül a gerincvelı hátsó szarvában lévı szinapszisokba jutnak, majd tovább folytatják útjukat a központi idegrendszer magasabb régiói felé. A felszálló és leszálló pályák kulcsszerkezetei összegyőjtik és módosítják ezeket a jeleket. Az ingertovábbítás különbözı helyein sárga háttérrel ki vannak emelve azok a mediátorok és gyógyszercélpontok amelyek fontos szerepet játszanak a fájdalom folyamatában.19

Az akciós potenciált különbözı rostok közvetítik a központi idegrendszer felé. A rostokat átmérıjük és vezetési sebességük alapján több csoportba sorolják. A viszonylag vastag és nagy vezetési sebességő Aα és Aβ rostok a fájdalmat nem okozó ingereket továbbítják, a fájdalmas stimulusokat a legvékonyabb és legkisebb vezetési sebességő velıhüvelyes Aδ és

11

velıtlen C rostok szállítják a gerincvelıbe, illetve a trigeminus érzı magvába. Az Aδ rostok az azonnal fellépı, éles, szúró jellegő fájdalmat közvetítik, míg a C rostok a fájdalom második fázisából eredı, lassú, de tartós, égetı jellegő ingert szállítják.20 A nociceptív afferensek többsége a gerincvelı hátsó szarvába fut be, ahol három fı idegcsoporttal, serkentı és gátló interneuronokkal és projekciós neuronokkal szinaptizálnak. A gerincvelı hátsó szarvának mind a hat rétege tartalmazza ezeket a fájdalomingert továbbító, nociceptív struktúrákat. A projekciós neuronok a bejövı szenzoros információkat agyi központokba szállítják. A serkentı interneuronok a projekciós neuronok felé közvetítik a szenzoros információkat.

Az

inhibitorikus

interneuronok

a

bejövı

szenzoros

információkat

szabályozzák. A projekciós neuronok lehetnek nociceptív specifikusak, amelyek csak az Aδ és C rostoktól kapnak ingereket és lehetnek széles-dinamikus sávú idegek, melyek mind a fájdalmat közvetítı Aδ és C rostoktól, mind pedig a fájdalmatlan ingereket továbbító Aα és Aβ rostoktól kaphatnak információt.

A fájdalomérzetet perifériás (spinális) és centrális

(supraspinális) mechanizmusok szabályozzák. Mindkét gátló mechanizmusban a hátsó szarvi gátló interneuronok játszanak kulcsszerepet.20 2.1.2.2. Kapuzárásos fájdalom kontroll (wind up) Miközben a C típusú rostok a fájdalmas ingereket, az Aα és Aβ rostok a fájdalmatlan ingereket a projekciós neuronok felé továbbítják, ugyanazzal a projekciós neuronnal kapcsolatban lévı gátló interneuronhoz is

csatlakoznak (4. ábra) Az így létrejövı kör

szabályozza perifériásan a fájdalomérzetet. A C rostok gátló neurotranszmittereket, az Aα és Aβ rostok serkentı neurotranszmittereket bocsájtanak ki az inhibíciós interneuronok felé.

A 4. ábra. A fájdalominger spinális gátlása: A kapu nyitása, B kapu zárása.21

B

A perifériás idegsérülések miatt felszabaduló mediátorok (bradikinin, szerotonin, hisztamin, prosztaglandin, acetilkolin, substance-P stb.) a környezı niciceptorokat direkt aktivációval vagy az ingerlési küszöb csökkentésével hiperérzékennyé teszik. A nociceptorok állandó ingerlésének következtében a C rostok folyamatosan tüzelnek. Ennek hatására a C rostokból 12

felszabaduló gátló transzmitterek blokkolják a gátló interneuronokat, a projekciós neuron felszabadul a gátlás alól és a fájdalomérzés akadálytalanul továbbítódik (kapu nyitása) (4.A ábra). Ha ugyanakkor más, fıleg mechanoreceptorokból származó ingerület érkezik a hátsó szarvba, az Aα és Aβ rostok hatása érvényesül: a felszabaduló serkentı neurotranszmitterek (fıként glutaminsav) serkentik a gátló interneuronokat, amik így gátolják a projekciós neuronokat (gátlás gátlása), csökkentve vagy megszüntetve a továbbítandó fájdalom ingerületét (kapu zárása) (4.A ábra).20 A kapu nyitásakor a C rostok végzıdésein a projekciós neuronok irányába ugyanakkor serkentı transzmitter, glutaminsav szabadul fel, aminek hatására gyors

excitatorikus

posztszinaptikus potenciál jön létre a projekciós neuronokon. Posztszinaptikusan a glutaminsavat a projekciós neuronokon elhelyezkedı AMPA, kainsav és NMDA receptorok fogadják. Az AMPA és kainsav receptorok gyors és éles fájdalmat, az NMDA receptorok elhúzódó fájdalmat közvetítenek. (Lassú excitatorikus posztszinaptikus potenciált létrehozó neurotranszmitterek is felszabadulnak, legismertebb közülük a substance-P és a CGRP.) A perifériás idegsérülés miatt folyamatosan tüzelı C rostok végzıdésein felszabaduló nagymennyiségő glutaminsav hatására a projekciós neuronokon lévı AMPA és kainsav receptorok háttérbe szorulnak és az NMDA receptorok tartós aktivitása alakul ki. Az NMDA receptorok által folyamatosan aktivált projekciós neuronok ráadásul szelektíven toxikusak lehetnek az inhibíciós interneuronokra, így a leírt szabályozó körben az

inhibíciós

interneuronok kiiktatásával megszünhet a fájdalominger negatív szabályozása. Az íly módon progresszíven fokozódó fájdalominger következménye az agyi struktúrák szenzitizációja, az allodínia és a hiperalgézia megjelenése.22 A folyamatban számos egyéb receptor (prosztanoid, kemokin, COX, NOS, stb.) és mechanizmus is részt vesz, az NMDA receptornak azonban központi szerepe van a centrális szenzitizáció kialakításában. 2.1.2.3. Centrális fájdalom kontroll (analgetikus leszálló pályarendszer)20 A dorzális szarv öt Rexed laminájából öt különféle idegpálya továbbítja a fájdalomingerületet a felsıbb agyi struktúrákhoz. Ezek a pályák az agy különféle területein végzıdnek, amelyek a fájdalom ingerre eltérı válaszokat adnak. A talamuszban történik a fájdalom lokalizálása, a limbikus kéregben történik a fájdalom affektív feldolgozása (emlékezés a fájdalomra, a fájdalom tolerálása). A nyúltvelı noredrenerg sejtjeiben végzıdı idegpályák a központi noradrenerg rendszert aktiválják, a hipotalamuszban végzıdık endokrin választ váltanak ki.

13

Az ötödik pályának a fájdalom központi gátlásában van szerepe. A felszálló pálya a hátsó szarvból közvetlenül a középagy substancia grisea centralisába fut, ahol enkefalin, dinorfin, βendorfin és szerotonin tartalmú idegsejtek foglalnak helyet. Az innen visszainduló, a nyúltvelın keresztülmenı és a hátsó szarvi gátló interneuronokig leszálló pályák vesznek részt a fájdalom supraspinális gátlásában. A fájdalom centrális gátlása végeredményben ugyanazokon a hátsó szarvi gátló interneuronokon valósul meg, mint a perifériás fájdalomcsillapítás. A leszálló rendszer pályája két irányba fut (5. ábra). Az enkefalintartalmú rostok leszállnak a nyúltvelıbe, ahol GABAerg interneuronokon végzıdnek, gátolják

azok

GABA sejtek

(gátló)mőködését. a

ventrális

A

nyúltvelı

szerotonin, subtance-P és thyreotropreleasing

hormon

tartalmú

sejteire

fejtenek ki tónikus gátlást. Fájdalom 5. ábra: A fájdalominger supraspinális gátlása Dy=dinorfin-; és ENK=enkefalin-tartalmú idegsejtek a substantia grisea centralisban (SGC); NE=noradrenalin; 5HT-SP-TRH=szerotoninsubstanceP-thyreotrop releasing hormon-tartalmú idegsejtek a nyúltvelõ rostroventrális részében

esetén

a

középagyban

felszabaduló

enkefalin gátolja a GABA sejteket, melyeknek gátló hatása alól felszabaduló 5HT-SP-TRH neuronok serkentı hatást

továbbítanak a hátsó szarv enkefalin tartalmú gátló interneuronjaihoz, melyek gátolják a fájdalomingert felfelé továbbító hátsó szarvi projekciós neuronokat. A leszálló rendszer másik pályáján dinorfin tartalmú rostok szállnak le a nyúltvelıbe, ahol noradrenerg sejtekbe végzıdnek. A noradrenerg sejtek axonjai kapcsolatba kerülnek a hátsó szarv gátló interneuronjaival, aktiválják azokat, gátolva a projekciós neuronok fájdalomtovábbító képességét. 2.1.3. Receptorok, ioncsatornák és mediátorok a gerincvelı hátsó szarvában A 6.

ábrán

a

gerincvelı

hátsó

szarvában

megvalósuló

perifériás

és

centrális

fájdalomszabályozás fıbb receptoriális és molekuláris történései láthatók. A nociceptív afferensek végzıdésein fájdalom inger hatására nagymennyiségő glutaminsav és substance-P szabadul fel. Ezeket a mediátorokat a posztszinaptikus projekciós neuronok megfelelı glutaminsav illetve NK-1 receptorai fogadják. Az ábrán látható módon a felszálló pálya GABAerg és glicinerg inhibíciós interneuronjai, valamint a leszálló pálya noradrenerg neuronjai képesek a fájdalomingert gátolni. A fent leírt folyamatokat kiegészíti, hogy az idegrendszer immunrendszerének legfontosabb eleme, a mikroglia különbözı gyulladásos 14

mediátorokat, citokineket, kemokineket bocsát ki, melyek szintén jelentıs szerepet játszanak a fájdalom kialakulásában. Perifériás idegsérülés és gyulladás aktiválja a gerincvelı hátsó szarvában lévı mikrogliát, aminek hatására vegyes, gyulladásos-neuropátiás fájdalom alakul ki. Az egyik legfontosabb kemokin az MCP-1 csak a sérült idegben segíti elı az akciós potenciál kialakulását, ráadásul képes gátolni a GABA neuronok gátló szignáljait.23 Ily módon a centrális szenzitibilitás kialakulásában az idegsejtek és a mikroglia közötti MCP-1 mediált párbeszéd is közrejátszik.

6. ábra. Serkentı és gátló ideghálózatok receptoriális kapcsolatai a gerincvelı hátsó szarvában.

2.2. Glutaminsav receptorok 2.2.1. Nem-NMDA glutaminsav receptorok és élettani jelentıségük A központi idegrendszer fı serkentı transzmittere a glutaminsav, receptorai minden agyi és gerincvelıi neuronon megtalálhatók.17 Két fı típusát különböztetjük meg, metabotróp és ionotróp receptorokat. A metabotróp receptorok aktivitásukat G fehérjéken keresztül fejtik ki, 15

családjuk három csoportból áll. Az I. csoport (mGluR1, mGluR5) ingerlése a foszfolipáz CIP3 jelátviteli utat aktiválja. Az endoplazmatikus retikulum Ca2+ csatornáinak nyitásával növelik a citoszol Ca2+ koncentrációját. A II. (mGluR2, 3) és III. csoport (mGluR4, 6, 7, 8) tagjai az adenil cikláz enzim gátlásával csökkentik a cAMP szintézisét. A három altípusba sorolható ionotróp glutaminsav receptorokat erıs exogén agonistáik alapján nevezték el : NMDA (Nmetil-D-aszparaginsav), kainsav és AMPA (alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-izoxazolpropionsav). Minhárom receptor glutaminsav receptor és ioncsatorna is egyben (7. ábra).

7. ábra. Glutaminsav receptorok osztályozása filogenetikai fa alapján.25

Szerkezetük közös jellemzıje, hogy négy alegységbıl felépőlı hetero-tetramerek. Az egyes alegységek három transzmembrán régiót és egy a membránon teljesen át nem menı, a citoszol felé vissza-kanyarodó régiót tartalmaznak. Nélkülözhetetlenek a szinaptikus plaszticitásban, több posztszinap-tikus membrán szinaptikus transz-missziójában. Az AMPA receptoroknak négy altípusát különböz-tetik meg (GluR1-4). Az aktivált AMPA receptorok K+, Na+, kisebb mértékben Ca2+ ionokra permeábilisak. A GluR2 alegység tartalmú receptorok Ca2+ ionokra nem permeábilisak, így védve a sejteket a túlzott

Ca2+ ion beáramlásból adódó

citotoxicitástól.24 Az AMPA receptorok gyors szinaptikus ingerületátvitelt tesznek lehetıvé. 16

Aktivációjuk és deaktivációjuk gyors és rövid idejő (< 1msec). Tartós agonista jelenlét a receptor deszenzitizációját okozhatja.26 A kainsav receptorok fıként K+ és Na+ ionokra permeábilisak,

Ca2+ ionokra kevésbé. Ioncsatornájának nyitása és zárása az AMPA

receptoréhoz hasonlóan gyors és rövid idejő. A kainsav receptorok kis affinitású GluR5-7 és nagy affinitású KA1-2 alegységekbıl épülhetnek fel. Elıbbiek elsısorban a dominsav exogén agonistára specifikusabbak, míg az utóbbiak a kainsavra. Az AMPA receptorral ellentétben kevésbé a szinaptikus jelátvitelért, mint inkább a szinaptikus plaszticitásért felelısek. Fıleg preszinaptikusan fordulnak elı, neurotranszmitterek kibocsátását szabályozzák.27 2.2.2. NMDA receptorok élettani jelentısége28 Az NMDA receptor a központi idegrendszer leggyakoribb glutaminsavfüggı ioncsatornája. Számos neurológiai betegségben szerepet játszik, ezért intenzíven kutatott, jól jellemzett terápiás célpont. Az NMDA receptor, két olyan fontos, a többi ionotróp glutaminsav receptortól eltérı sajátsággal rendelkezik melyek alapvetıen meghatározzák farmakológiai és funkcionális tulajdonságait. Az NMDA receptor-ioncsatorna aktivációja az agonista glutaminsavra lassabban következik be, mivel az ioncsatorna a nyugalmi membránpotenciálon Mg2+ ionok által blokkolt. Depolarizáció hatására ez a feszültségfüggı blokád megszőnik az ioncsatorna maximális aktivitását eredményezve.29 Fontos tulajdonsága, hogy különösen nagy áteresztıképességő Ca2+ ionokra, így a legjobb Ca2+ vezetıképességgel rendelkezik. A csatorna nyitvatartási idıtartama is nagy, akár több száz msec is lehet. E tulajdonságai miatt az NMDA receptorok fiziológiás körülmények között fontos szerepet játszanak a szinaptikus plaszticitás jelenségeiben (idegsejtek migrációja, túlélése, szinaptikus kapcsolatok kialakítása, fenntartása) és a szinaptikus jelátvitel tartós serkentésében (LTP), melyek fontos elemei a tanulás és a hosszútávú memória mechanizmusának.30 Az NMDA receptoroknak patológiás állapotokban is kulcsszerepet tulajdonítanak. Különbözı neurodegeneratív betegségek mechanizmusának végsı közös eleme a glutamáterg rendszer kóros túlmőködése. Akut rendellenességek pl. stroke, agyi, gerincvelıi iszkémia vagy epilepsziás roham során az idegsejtek környezetében a glutaminsav koncentrációja megnı, ami elsısorban az NMDA receptorok hiperaktivitását váltja ki. Az idegsejtekbe a receptor-ioncsatornán keresztül túlzott mértékben beáramló Ca2+ ionok

az idegsejtek károsodásához és pusztulásához vezetı

biokémiai folyamatokat indítanak be.31 Krónikus betegségek, pl. Parkinson kór, Alzheimer kór, skizofrénia, krónikus fájdalom esetén is hasonló excitotoxikus állapotok alakulhatnak ki,

17

ezért az NMDA receptorok a neuroprotekció mellett ezen betegségek kiemelkedı molekuláris célpontjaivá is váltak. 2.2.3. NMDA receptorok felépítése és mőködése Az N-metil-D-aszparaginsav receptor heteromer alegységekbıl álló tetramer felépítéső receptor. Kutatásunk kezdetekor még két fajta alegységet azonosítottak, az NR1 és NR2 alegységeket. Késıbb számoltak be az NR3 alegység létezésérıl.31 Az NR1 alegységnek egy gén által kódolt egy izoformája létezik. Az alegységnek 3 exon eltérı expressziója révén 8 splice variánsa (1-4a, 1-4b) lehetséges, leggyakoribb ezek közül az 1a. Az NR2 alegységnek négy különbözı gén által kódolt altípusa NR2A, NR2B, NR2C, NR2D van (8. ábra).25 Az emlısök központi idegrendszerében lévı NMDA receptorban az NR1 alegység mellett legalább az egyik NR2 alegység altípusnak jelen kell lennie, hogy a receptor mőködıképes legyen.32

8. ábra. Az NMDA receptor NR1/NR2B heterotetramer formája a módosító kötıhelyekkel.28

Mindegyik alegység három hidrofób transzmembrán régióból (I, III, IV) és a membránban a citoszol felé hajtőkanyarszerően visszakanyarodó régióból (II) áll. Az ioncsatorna pórusát ez utóbbi (II) szegmens alkotja. A fehérje extracelluláris N-terminálisán többféle specifikus affinitással rendelkezı kötıhely, míg az intracelluláris C-terminálisán a receptor mőködésének sejten belüli szabályozásában résztvevı foszforilációs helyek találhatók. Az ioncsatorna pórusa Mg2+ ion által blokkolt, depolarizálódás hatására ez a tónikus blokk megszőnik. A receptor aktiválódásához még két ko-agonista, a glicin és a glutaminsav

18

egyidejő kötése is szükséges, ekkor az ioncsatorna Na+, K+, és Ca2+ ionokra permeábilis lesz. Az NR1NR2 összetételő receptorokban glicin kötıhelye az NR1 alegység N terminálisán, míg a ko-agonista glutaminsav kötıhelye az NR2 alegységek N-terminális részén helyezkednek el. Az agonista kötıhelyeken kívül az NR2 alegységek több allosztérikus modulátor és antagonista kötıhelyet is tartalmaznak. A különbözı NR2 alegységösszetételő receptorok eltérı érzékenységgel és farmakológiai profillal viszonyulnak a különféle modulátorokhoz. A Zn2+ ionok az N terminálison lévı kötıhelyükhöz kapcsolódva feszültségfüggetlen módon az NR2A tartalmú receptorokat antagonizálják. Nagyobb koncentrációban feszültségfüggı mechanizmus szerint az ioncsatorna Mg2+ kötıhelyéhez kapcsolódva már az NR2B tartalmú receptorokat is gátolja. Feszültségfüggetlen módon befolyásolja a receptor mőködését a környezetében lévı pH és redoxpotenciál is. A pH bázikus irányba történı kismértékő eltolása vagy redukáló hatású környezet a receptor aktivitását fokozza míg, a pH kismértékő savas irányban történı eltolása vagy oxidáló hatású környezet a receptor aktivitását gátolja.33 Endogén poliaminok, pl. a spermin és spermidin az NR2B és NR2A alegységeken lévı poliamin

kötıhelyhez

kapcsolódva

alacsony

koncentrációban,

feszültségfüggetlen

mechanizmussal fokozzák a receptorok aktivitását. NR2B alegységtartalmú receptorok esetében az endogén és exogén poliaminok a csatorna nyitvatartási frekvenciájának növelésével serkentik a receptor mőködését. NR2A alegységtartalmú receptoroknál a poliaminok közvetve, a glicin affinitásának növelésével fokozzák a receptor aktivitását. Míg magasabb koncentrációban vélhetıen az ioncsatorna Mg2+ kötıhelyéhez kapcsolódva feszültségfüggı módon mindkét alegységtartalmú receptor mőködését antagonizálják.25 Az 1980-as évek végén fedezték fel, hogy az amúgy neuroprotektív és értágító hatású alfaadrenerg antagonista ifenprodil sperminszenzitiv módon blokkolja az NMDA receptort, így vélhetıen kapcsolódik a poliamin kötıhelyhez. Késıbb igazolták, hogy az ifenprodil nem a poliamin kötıhelyhez, hanem tıle független helyhez, az NR2B alegységen megtaláható, róla ifenprodil kötıhelynek nevezett aktív helyhez kapcsolódik. Az ifenprodil kötıhely allosztérikus kölcsönhatásban áll a poliamin kötıhellyel és a glicin kötıhellyel.34 A nyitott ioncsatorna belsejében lévı csatornablokkoló helyhez használatfüggı módon („usedependence”, azaz gátló hatásuk az agonista koncentrációjának növekedésével fokozódik) nemkompetitív antagonisták kötıdhetnek. Ezt az aktív helyet a hozzá nagy affinitással kötıdı 1-(1-fenil-ciklohexil)piperidinrıl PCP-kötıhelynek nevezzük. A PCP kötıhelyhez kis affinitású vegyületek (pl. a memantin) is kapcsolódnak. Az újonnan felfedezett NR3 alegységnek két altípusa ismert az NR3A, és NR3B. Az NR1/NR3A és NR1/NR3B receptorokra jellemzı, hogy glutaminsavra érzéketlenek, glicin hatására aktiválódnak. 19

Csökkentik az ioncsatorna vezetıképességét, a Ca2+ ionokat nem engedik át és a Mg2+ ionok sem blokkolják a csatorna pórusát. A csatorna nem kompetitív antagonistái (MK-801, memantin) nem gátolják a receptor mőködését.35 A glicin mindkét alegységhez kötıdik, az NR3A alegységhez azonban nagyságrendekkel nagyobb affinitással vonzódik, mint az NR1 alegységhez. Ezért NR3 nagy affinitású glicin kötıhelyet és NR1 kis-affinitású glicin kötıhelyet különböztünk meg. Az NR3A alegységtartalmú receptorok farmakológiai jelentısége még kevéssé ismert, de tekintve a glicin hozzá való kötıdésének szelektivitását egy NR3A szelektív kompetitív antagonista vagy allosztérikus inhibitor terápiásan értékes lehet.28 2.2.4. Az NMDA receptorok expressziója Az NMDA receptor alegységek térben és idıben eltérı génexpressziós mintázatot mutatnak. In situ hibridizációs technikával bizonyították, hogy rágcsálók agyában leggyakrabban az NR1 alegység fordul elı.36 NR2 alegységek közül az NR2A altípus expresszálódik a legnagyobb mértékben, fıként az agykéregben, hippokampuszban, a kisagy kérgében és a szaglószervi gumókban fordul elı. NR2B alegység leginkább az agykéregben, kisebb mértékben a köztiagyban és az agytörzsben figyelhetı meg. NR2C alegység elsısorban a kisagykéreg szemcsesejtjeiben expresszálódik, az NR2D alegység a köztiagy és az agytörzs régiójában figyelhetı meg.30 Az egyedfejlıdés során az egyes alegységek idıbeli megjelenése jelentısen eltér. Míg az NR1 alegység folyamatosan jelen van, az NR2 alegységek expressziója folyamatosan változik. Patkány embrionális agyban fıként az NR2B kisebb részben NR2D alegység van jelen. NR2B alegység az egész agyban kifejezıdik, NR2D alegység csak a köztiagyban és az agykéregben található meg. Embrionális stádiumban NR2A és NR2C alegység nem expresszálódik, születés után jelennek meg különbözı agyterületeken. Az alegységek expressziójának idıbeli változása és agyi régiók szerinti megoszlása az alegységek különbözı funkciójára utalnak. 2.3. Az NMDA receptorok mint terápiás célpontok A 2.1.1. fejezetben leírt betegségek neuropátiás fájdalomkomponensének patomechanizmusa az NMDA receptorok kóros túlmőködésével hozhatók összefüggésbe, ezért a receptor mőködését gátló anyagok alkalmazásával valószínőleg csökkenthetık, megállíthatók a fenti kórfolyamatok. Az NMDA receptorok blokkolásának lehetséges célpontjai a 2.2.3. fejezetben számbavett valamennyi kötıhely:

20

- agonista kötıhelyek: glicin, glutaminsav - ioncsatorna pórusa - allosztérikus modulátor régiók (poliamin kötıhely, ifenprodil kötıhely, Zn2+ kötıhely, pH és redox érzékeny régió) A felsorolt kötıhelyek terápiás felhasználhatósága eltérı, ezért csak a gyógyszerkutatás által ígéretesnek tartott célpontokat és azok gátló szereit ismertetem.28 2.3.1. Glicin antagonisták Az NR1NR2 összetételő receptorokban a glicin kötıhely az NR1 alegységen helyezkedik el, de a glicin és a glicin agonisták receptorhoz való affinitását az NR2 alegységek is befolyásolják. A glicin és glicin agonisták legkevésbé az NR2A, leginkább az NR2B alegységet tartalmazó receptorokhoz kötıdnek. Így a glicin antagonisták is az NR2B alegységet tartalmazó receptorokon fejtik ki leginkább gátló hatásukat. A glicin kötıhely egyetlen ismert endogén antagonistája a triptofán egyik metabolikus terméke, a kinurénsav. Neuroprotektív hatása és a fájdalomcsillapításban betöltött szerepe közismert, hatástartama gyors kiürülése miatt azonban rövid. A triptofán két különbözı metabolikus úton, két ellentétes hatású anyaggá, kinurénsavvá és az NMDA agonista kvinolinsavvá alakul.37 A kutatások elsı idıszakában a kompetitív lebomlási útvonal enziminhibitorokkal való gátlásával próbálták növelni az endogén kinurénsav koncentrációját. Az elképzelés nem váltotta be a hozzá főzött reményeket, exogén antagonisták hatékonyabbnak bizonyultak. Elsı képviselıjük az 5,7-diklór-kinurénsav volt (DCKA). A Glaxo egy 4,6-diklórindol-2karbonsav-származékot (GV-150526A), a CoCensys a Novartissal együttmőködve egy 6,7diklór-kinoxalin-származékot (ACEA-1021) fejlesztett neuroprotektív indikációval, de a klinikai vizsgálatok III. fázisában megbuktak. A sikeres állatkísérletes eredmények ellenére emberben a placebóval összehasonlítva nem voltak kellıképpen hatásosak. O O

Cl

O

Cl

O

N H

OH N H

kinurénsav

OH O

OH

N

Cl

O

kvinolinsav

N H

OH O

DCKA

Cl

N H

OH O

GV-150526A

21

NO2 Cl Cl

H N N H

ACEA-1021

O O

Több nagy gyógyszergyár is bekapcsolódott a glicin antagonisták kutatásába de egy idı után valamennyien abbahagyták a hasonló vegyületek fejlesztését. 2.3.2. Glutaminsav antagonisták (kompetitív NMDA receptor antagonisták) Az NR2 alegység glutaminsav kötıhelyén ható kompetitív antagonisták szerkezete a glutatminsavból vezethetı le. A glutaminsav távolabbi karboxil csoportját foszfonsav csoport helyettesíti. A molekulák a glutaminsavtól általában néhány metiléncsoporttal hosszabbak (DAP5). Merevebb szerkezető származékokkal nagyobb aktivitást és szelektivitást értek el. A legelırehaladottabb munka a Novartis selfotel és az SDZ-EAA-494 jelő vegyületével folyt, stroke és traumás agysérülés indikációval klinikai vizsgálatokat is folytattak. O

HO

O

OH

H2N

O

O

P OH OH

P OH OH

OH

H2N

glutaminsav

D-AP5

N

OH

N H

O

O

P OH OH

N H

O

selfotel

OH O

SDZ-EAA-494

2.3.3. NMDA csatorna blokkolók (nem kompetitív NMDA receptor antagonisták) Az NMDA csatorna blokkolók nem kompetitív antagonisták, nem a glutaminsav kötıhelyéhez kapcsolódnak. A nyitott csatornában használatfüggı módon (use dependence) alakít ki blokádot. Kis és nagy affinitású képviselıiket különböztetjük meg. A kis-közepes affinitású vegyületek (pl. ketamin, dextrometorfan, memantin) gyors blokkoló kinetiájuknak és erıs feszültségfüggésüknek köszönhetıen általában jobb terápiás mutatókkal rendelkeznek mint a nagy affinitású, ám lassú kinetikájú csatorna blokkolók (pl. PCP, MK-801, aptiganel). A kis affinitású, gyors kinetikával rendelkezı vegyületek egy fiziológiai aktiváció átmenete alatt gyorsan elhagyják az ioncsatornát millimoláris szinaptikus glutaminsav koncentráció mellett is, míg patológiás körülmények között, már a mikromoláris glutaminsav koncentráció hatására kialakuló folyamatos aktivációt is blokkolják. N CH3

CH3 HN O

Cl

NH2

H

H3C

CH3

CH3O

ketamin

dextrometorfan

22

memantin

CH3

CH3

H N

N

N

NH

CH3

NH

PCP

(+)-MK-801

aptiganel

2.3.4. NR2B szelektív NMDA antagonisták 2.3.4.1. Ifenprodil típusú NR2B szelektív NMDA antagonisták38 Az elsıként azonosított NR2B altípus szelektív NMDA anatagonista hatású molekula az ifenprodil volt. Az ifenprodil (4-[2-(4-benzil-piperidin-1-il)-1-hidroxi-propil]-fenol) tartarát sója piacon lévı vérnyomáscsökkentık hatóanyaga (Cerocral, Dilvax, Vadilex).39 Az 1973ban forgalomba kerülı ifenprodilt α-1 adrenoceptor antagonista hatása alapján fejlesztették a Synthelabo kutatói.40 Késıbb kiderült, hogy vegyes profilú, számos receptor és ioncsatorna, többek között az NMDA receptor mőködését is gátolja.41 Nem sokkal ezután kimutatták, hogy az ifenprodil nem kompetitív, NR2B altípus szelektív antagonistája az NMDA receptornak.42 Az ezen a területen megindult kutatásokban leggyakrabban az ifenprodilt választották kiindulópontként, aminek eredményeként számos hatásos, hozzá hasonló farmakofórral rendelkezı molekulát és vegyületcsaládot fedeztek fel.43-45 A Pfizer kutatói megvizsgálták a két aszimmetriacentrumot tartalmazó ifenprodil sztereoizomer formáinak eltérı aktivitását.46 Az α-1 adrenerg affinitás meghatározásához a standard [3H]-prazozin kötıdési tesztet használták. Az NMDA antagonizmust egy funkcionális teszt eredményével jellemezték, melynek során glutaminsav-indukált sejthalál gátlásának mértékét határozták meg patkány hipokampális neuronok primer tenyészetében (CC). Az eredmények azt mutatták, hogy a (+)treo-ifenprodil hatásosabb a CC tesztben, mint a (+)-eritro-ifenprodil, ugyanakkor kisebb az α-1 adrenoceptorhoz való affinitása. OH

OH

N

N HO

CH3

HO

(+)-eritro-ifenprodil CC-IC50: 263 nM α-1-IC50: 100 nM

CH3

(+)-treo-ifenprodil CC-IC50: 55 nM α-1-IC50: 843 nM

A (+)-eritro-ifenprodilt kivéve izolálták és megvizsgálták az egyes diasztereomereket is. Azt találták, hogy a legnagyobb NMDA antagonista hatása a (-)-treo-ifenprodilnak van, amely α23

1 receptorokhoz képest kb. ötvenszeres szelektivitással rendelkezik (CC-IC50: 13,3 nM; α-1IC50: 629 nM). Az ifenprodilból kiinduló kutatások alapvetı törekvése az NMDA antagonista hatás erısítése mellett az α-1 receptorokhoz való affinitás csökkentése volt. Érdekes módon ezt az elvet, miszerint a több támadáspontú szereket szelektívvé lehet tenni, többek között úgy, hogy a fıhatás kitervezésével egy mellékhatást erısítünk fel új fıhatásnak, csak a közelmúltban fogalmazták meg mint lehetséges stratégiát (selective optimization of side activities = SOSA).47 Szerkezet-hatás összefüggések (SAR) felderítése céljából a Pfizer kutatói ifenprodilszármazékokat állítottak elı. Az ifenprodilon véghezvitt módosításaik gyengébb NMDA antagonistákat eredményeztek, ráadásul az NMDA és az α-1 receptorokon való aktivitáskülönbség sem javult a (-)-treo-ifenprodilhoz képest. A baloldali benzolgyőrő hidroxilcsoportjának hiánya (1) jelentısen csökkentette mindkét teszten az aktivitást, míg a piperidingyőrő 4-es helyzetében lévı benzilcsoport elhagyása mindkét receptoriális hatás teljes eltőnésével járt (2). A 3-as vegyület eredményei jelzik, hogy bár az alkil összekötı láncnak jelentıs szerepe van, a rajta lévı benzil-helyzető hidroxilcsoport jelenléte nem elengedhetetlen egyik hatás szempontjából sem. OH

OH N

N

CH3

HO

1 CC-IC50: 3700 nM α-1-IC50: 3400 nM

A Synthélabo

CH3

2 CC-IC50: >10000 nM α-1-IC50: >10000 nM

N HO

CH3

3 CC-IC50: 153 nM α-1-IC50: 130 nM

Recherche kutatói az ifenprodil sztereoizomerek NMDA receptor

alegységszelektivitását vizsgálták. Az egyes antipódok inhibíciós képességét NR1a/NR2A és NR1a/NR2B alegységeket tartalmazó rekombináns NMDA receptorokat expresszáló Xenopus oocytában határozták meg patch-clamp technikával.48 Méréseik szerint mind a négy sztereoizomer jóval hatásosabb antagonistája az NR1a/NR2B alegységet tartalmazó receptornak (IC50: < 0,8 µM), mint az NR1a/NR2A receptornak (IC50: > 100 µM). Az NR1a/NR2B receptoron a (+) eritro- és (-)-treo-ifenprodil (IC50: 0,21 µM és 0,22 µM) négyszer potensebb volt mint a (-)-eritro- és (+)-treo-ifenprodil (IC50: 0,81 µM és 0,76 µM). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az ifenprodil sztereoizomerjei bár kismértékő, de szignifikáns sztereoszelektivitási különbséget mutatnak az NR1a/NR2B receptorokon.

24

A Pfízer egy további módosítása igen értékes szerkezet-hatás összefüggésre derített fényt.49 Felfedezték, hogy a piperidin 4-es helyzetében lévı hidroxilcsoport az α-1 adrenoceptor affinitást megszünteti, az NMDA aktivitást azonban nem befolyásolja (4). OH OH N CH3

HO

4 CC-IC50: 58 nM α-1-IC50: >10000 nM

A piperidingyőrő négyes helyzete és a jobboldali benzolgyőrő közötti alkil lánc hosszának a változtatásása (mind a rövidítése (5), mind a hosszabbítása (6)) növelte mindkét receptorhoz való affinitást. További hosszabbítás kevésbé aktív vegyületeket eredményezett. Optimális szelektivitás az 5-ös vegyület esetében figyelhetı meg. OH

OH

OH

OH N

HO

N

CH3

HO

5 CC-IC50: 10,2 nM α-1-IC50: 5700 nM

CH3

6 CC-IC50: 1,3 nM α-1-IC50: 137 nM

Ennek két sztereoizomerje közül jobb szelektivitása alapján a balra forgató sztereoizomert CP-101,606 (traxoprodil) néven, mint centrális és perifériás neuropátiás fájdalom csillapítására alkalmas anyagot klinikai vizsgálatok céljából kiválasztották.50 OH OH N (1S,2S)

CH3

HO

CP-101,606 CC-IC50: 11 nM α-1-IC50: 19520 nM

A piperidin négyes helyzetében lévı benzolgyőrő szubsztitúciója (F, Cl, Me) nem növelte jelentısen az aktivitást. A baloldali benzolgyőrő és az alkillánc metilcsoportjának oxigénatommal történı összekapcsolása krománszármazékokat eredményez. Ezzel a módosítással eltőnt az adrenerg receptorhoz való affinitás. Az ily módon merevített szerkezet leghatásosabb képviselıjének (7, balraforgató enantiomer) hatása és szelektivitása összemérhetı a CP-101,606 vegyületével.51 25

OH OH N F HO

O

7 CC-IC50: 58 nM

Az eddigi adatok alapján a következıképpen összegezhetık az ifenprodil típusú NMDA antagonisták farmakofór jellemzıi: két benzolgyőrőt egy meghatározott hosszúságú lánc köt össze. Az egyik benzolgyőrőn egy hidroxilcsoport jelenléte szükséges. Bár az összekötı lánc szubsztituenseit és azok sztereokémiáját részletesen vizsgálták, egyértelmő következtetés nem vonható le az eredményekbıl. A Merck KGaA kutatói kiemelt vegyületük (8, EMD 95885) és az ifenprodil összehasonlító receptor kötıdési adatait tették közzé egyik tanulmányukban.52 Patkány cortexben radioligandként [3H]-ifenprodilt használva 8 vegyület nagyobb affinitással kötıdött az ifenprodil kötıhelyhez (IC50: 3,9 nM), mint maga az ifenprodil (IC50: 23,3 nM). H N O

N

O

F

O

8

Mint késıbb kiderült ez a vegyület fontos mérföldkı volt az ifenprodil farmakofór fejlıdésében. Megmutatta, hogy nem szükséges királis szénatom jelenléte az összekötı láncban. A vegyületnek gyenge az affinitása az α-1 adrenoceptorhoz (IC50: 332 nM).38 Ráadásul az eddig alkalmazott fenolos hidroxilcsoportot sikerült

helyettesíteni a

metabolikusan stabilabb, hasonlóan hidrogénkötés donor tulajdonságú NH-csoportot tartalmazó benzoxazolinon győrővel. Ez a vegyület olyan 1-szubsztituált benzil-piperidin NR2B altípusszelektív NMDA antagonisták prototípusává vált, ahol egy hidrogénkötés donorcsoportot tartalmazó benzolgyőrő három atom hosszúságú láncon keresztül kapcsolódik a piperidin nitrogénjéhez . Az F. Hoffmann-La Roche Ltd. kutatói szintén sok energiát fektettek az ifenprodil típusú farmakofór fejlesztésébe. Egyik elsı vezérmolekulájuk az ifenprodil homológ 9 (Ro 25-6981, ((1R,2S)-3-(4-benzil-piperidin-1-il)-1-(4-hidroxi-fenil)-2-metil-1-propanol), számos in vitro és in vivo tesztben jobbnak bizonyult az ifenprodilnál.53 Racém formájának triciált analogonja az NR2B szelektív NMDA antagonisták azonosítására szolgáló kötıdési teszt leggyakrabban alkalmazott radioligandja lett.54

26

HO

CH3 N OH

9

Hasonló aktivitást mutat 10-es számú kiemelt vegyületük (Ro 8-4304). A molekula hosszúsága megegyezik 9 hosszúságával, de a baloldali benzolgyőrő és a piperidin nitrogénje között lévı lánc egy oxigén atommal hosszabb, kompenzálva a piperidin 4-es helyzete és a jobboldali benzolgyőrő közötti metiléncsoport elhagyását. Hasonló affinitással rendelkezik az NR2B tartalmú NMDA receptorokhoz, mint az ifenprodil, de gyorsabb on/off kinetika jellemzi.55 NH2 O O

N OH F

10

A 9-es vegyület in vitro aktivitása az ifenprodiléhoz hasonló, azonban in vivo kardiovaszkuláris mellékhatás jelentkezik, amely szignifikáns α-1 adrenoceptor antagonista hatásával (Ki: 0,18 µM [3H]-prazozin kötıdési tesztben56) állhat összefüggésben. Az NMDA és az α-1 aktivitás szétválasztását célul kitőzı optimalizálási programjuk kiindulási pontja 9 vezérmolekula volt.57 Kitartó munkájuk eredménye a 11-es vegyület, melynek NR2B receptorhoz való affinitása nem javult ugyan számottevıen a 9-es vegyülethez képest (Ki: 4,9 nM szemben a 5,6 nM értékkel a [3H]-Ro 25-6981 kötıdési tesztben54), az

α-1

adrenoceptorhoz való affinitása azonban jelentısen lecsökkent (Ki: 7,30 µM). A két aktivitás közötti különbség íly módon történı növelése ebben az esetben is a piperidin 4-es helyzetében lévı hidroxilcsoport jelenlétével magyarázható. HO

OH OH N

CH3

11

További módosítások vezettek a 12 (Ro 63-1908) vegyülethez, melyet kisebb NR2B és α-1 aktivitásbeli különbséget jellemez (IC50: 10 nM a [3H]-Ro 25-6981, és IC50: 3,5 µM a [3H]prazozin kötıdési tesztben), de egyéb tulajdonságai miatt részletes in vitro és in vivo

27

vizsgálatoknak vetették alá.58, 59 Sajnos ez a vegyület hatásosan blokkolja a hERG káliumcsatornát (EC50: 0,6 µM), mely fontos szerepet játszik a szív akciós potenciál repolarizációs fázisában. Blokkolása QT megnyúlást és szívritmuszavart okoz.60 Az éteres O helyettesítése SO2-csoporttal, továbbá a OH-csoport áthelyezése a piperidin 4-es helyzetébıl a hármas helyzetbe egy aktívabb és szelektívebb NMDA antagonistát, a 13 vegyületet eredményezte, mely még inkább elkülönítette az NMDA (14 nM) és a hERG (24 µM) aktivitást.61 HO

OH

HO N

O

N

S

CH3

O

12

OH

O

CH3

13

Az ifenprodil típusú farmakofór modell fejlıdéséhez különösen értékes módon járultak hozzá az University of Oregon, a CoCensys Inc. és a Parke-Davis Pharm. Res. együttmőködı kutatói. Bebizonyították, hogy a piperidingyőrő és az alkil lánc szubsztitúciója nem feltétele sem a receptorhoz való kötıdés mértékének, sem a szelektivitásnak. Emellett ık írták le az elsı farmakofór modellt. Az ifenprodilból és tercier helyett szekunder amint tartalmazó analogonjából, a nylidrinbıl kiindulva állapították meg a hatás szempontjából kritikus részeket (9. ábra). Klónozott patkány NMDA receptor alegységek bináris kombinációit (NR1a-NR2A, NR1a-NR2B, NR1a-NR2C) expresszáló Xenopus oocytákban vizsgálták az aktivitást és a szelektivitást.62 Az alkoholos hidroxilcsoportok és a metilcsoportok elhagyása (14, 15) az IC50 értékek nagyságrendi megváltozását nem eredményezték, jelezve, hogy a lánc szubsztituálása nem alapvetı követelmény. A 15 származék fenolos hidroxilcsoportjának elhagyása az ifenprodiltól tízszer gyengébben ható molekulát eredményezett. További egyszerősítéseket hajtottak végre a molekulákon annak érdekében, hogy meghatározzák mely elemek szükségesek a hatás szempontjából. Elıállították a piperidingyőrő 3. és 4. szénatomja közötti kötés felbontásával levezethetı molekulát (17). A győrő felnyitása csak kis mértékben csökkentette az aktivitást, vagyis a konformációs kényszer megszüntetése nem zárja ki a szelektív NR2B antagonista hatást. Legaktívabb származékok a szekunder aminok voltak. A nitrogén atom és a receptor közötti elektrosztatikus kölcsönhatás nagyon fontos, oxigén atom beépítése a nitrogén helyére (14 → 16) mintegy negyvenszeres aktivitáscsökkenést eredményezett. Különbözı hosszúságú szénlánc beépítésével változtatták az aromás győrők és a nitrogén közötti távolságot.

28

OH

OH

HN

nylidrin IC50: 0,18 µM

N CH3

OH

OH

N

HN

14 IC50: 0,096 µM

CH3

ifenprodil IC50: 0,11 µM

OH

15 IC50: 0,20 µM

OH

N O OH

16 IC50: 3,7 µM

17 IC50: 0,30 µM

OH

HN

18 Co 101677 IC50: 0,008 µM

OH

9. ábra. NR2B altípusszelektív szubsztituált aminok szerkezet-hatás összefüggései.

Mindezek a változtatások olyan, tovább már nem egyszerősíthetı molekulát (18) eredményeztek, melyrıl közvetlenül le lehet olvasni a farmakofór modell tulajdonságait, a receptorral való kölcsönhatás minimális követelményeit (10. ábra).

10. ábra. A receptor aktív centrumának az inhibitor kötıdése szempontjából fontos, feltételezett tulajdonságai.61

29

Ezek szerint kellı nagyságú NR2B aktivitást és szelektivitást el lehet érni fenilalkil csoportokkal helyettesített szekunder aminokkal. Az aromás győrők feltételezhetıen a receptor egy-egy hidrofób zsebébe illeszkednek,

míg

a nitrogén elektrosztatikus

kölcsönhatásba lép a receptor megfelelı részével. A fenolos hidroxilcsoport jelenléte az egyik aromás győrőn esszenciális a hatás szempontjából, vélhetıen hidrogénhidas kötéssel kapcsolódik a receptor megfelelı részéhez. A fenolos hidroxilcsoport oxigénje és az A győrő para-helyzető szénatomja közötti optimális távolság 17,5 Å, ami 3 Å-mel rövidebb az ifenprodil esetében számított értéknél. Ezen belül az oxigén és nitrogén távolsága 7,8 Å. Az egyszerősítések irányába haladó, egyfajta optimalizáció volt ez a tanulmány, melynek szerkezet-hatás összefüggései a maximális hatás minimális követelményeit leíró farmakofór modellt határozták meg. Az optimalizáció mindemellett az abban az idıben a leghatásosabb NR2B szelektív NMDA antagonista hatású anyagot is szolgáltatta (18). A vegyületcsaládot szabadalmi bejelentésben nem védték, aminek vélhetıen az volt az oka, hogy bár az NMDA receptoron szelektíven fejti ki hatását, több más receptoron és ioncsatornán is aktív lehet. Méréseink szerint a 18 bisz-arilalkil-származék az α-1 és az 5HT2A receptorokon is hat. Ez is megerısíti azt az általános felfogást, miszerint egy merevebb, kevesebb konformerrel rendelkezı struktúra specifikusabban viselkedik biológiai rendszerekben. Ennek a minimalista struktúrának a merevített változatai (19, 20) is hasonlóan aktívak.63 HO

HO N

N

19 NR2B-IC50: 17 nM

20 NR2B-IC50: 22 nM

A szerkezet további merevítése (21 és 22) az aktivitás kismértékő csökkenését eredményezte.64 HO N

HO

N H

21 NR2B-IC50: 87 nM

N H

N

22 NR2B-IC50: 50 nM

Bár az University of Oregon, a CoCensys Inc. és a Parke-Davis Pharm. Res. kutatóinak közös tanulmánya jelentıs elırelépés volt a farmakofór modell fejlıdésében, megfelelıen szelektív,

30

fejleszthetı molekulákat nem eredményezett. Annak ellenére, hogy a modell a 4-benzilpiperidinnek nem tulajdonít különös jelentıséget, csak mint a benzolgyőrő és a nitrogén közötti megfelelı távolságot biztosító szerkezetként értékeli, új NR2B szelektív NMDA antagonisták elıállításakor a 4-benzil-piperidinek a továbbiakban is kedvenc építıelemek maradtak. Érdekes megjegyezni, hogy a Roche által felfedezett és Ro 63-1908 számon fejlesztett 12-es számú vegyületet a CoCensys/Parke-Davis kutatói szintén azonosították, ráadásul védelmére hét hónappal korábban tettek szabadalmi bejelentést (Co 101244/PD 174494).65 Ebben leírják, hogy a kívánt elınyös tulajdonságok az összekötı láncban lévı sztereocentrumok nélkül is elérhetık. A 23-as molekulából (Co 101071) kiindulva alternatív hidrogénkötés donor tulajdonságú csoportokkal, benzimidazolonokkal és hidantoinokkal próbálkoztak.66 Mindkét származék esetében megvizsgálták a különbözı hosszúságú összekötı láncot tartalmazó homológok aktivitását.

Optimális

lánchosszúságú

képviselıik

alapján

elmondható,

hogy

a

benzimidazolon (24) képes helyettesíteni a fenolt, míg hidantoin (25) nem. Ez újabb bizonyíték arra, hogy az NR2B receptor aktivitáshoz az aromás győrőre és a hidrogénkötés donorra is szükség van. HO N

O

23 NR2B-IC50: 25 nM H

H

O

N

O

N N

N

N

N

O

24 NR2B-IC50: 95 nM

25 NR2B-IC50: 1000 nM

Másik közleményükben tioéterekbıl kiinduló hasonló kísérleteikrıl adnak számot.67 Néhány heterociklus és kondenzált heterobiciklus mellett a 27 aminotriazol-származék is aktívabbnak bizonyult a kiinduló 26 fenolszármazéknál. H N N

HO S

N

H2N

26 NR2B-IC50: 100 nM

N

S

N

27 NR2B-IC50: 35 nM

A CoCensys Inc. és a Warner-Lambert együttmőködésében elıállított 28-as számú vegyületben (CI-1041, besonprodil, (+)-6-[2-[4-(4-fluorbenzil)piperidin-1-il]etilszulfinil]-

31

benzoxazol-2(3H)-on) a 8-as számú rokonvegyülethez hasonlóan a benzoxazolon játsza a fenol szerepét.68 H N O O

N

S

F

O

28 NR2B-IC50: 6,6 nM

Kísérleteket végeztek a piperidin és a baloldali benzolgyőrő közötti lánc acetiléncsoporttal történı merevítésével. A 29-es számú, viszonylag gyenge aktivitású NR2B szelektív antagonistát egy vegyülettár in vitro szkrínelésekor találták.69

N

29 NR2B-IC50: 4,7 µM

Ahogy várható volt, a baloldali benzolgyőrő kiegészítése hidrogénkötés donor tulajdonságú csoporttal aktívabb vegyületeket eredményezett. A legaktívabb származékok a 4-hidroxi 30 és 31 analogonok voltak. Sajnos ez a vegyületcsalád az α-1 adrenoceptorok és a dopamin D2 receptorokhoz is affinitást mutatott. A rövidebb, három atom hosszúságú összekötı láncot tartalmazó 31 származékban válik szét leginkább a fıhatás a mellékhatástól.

N

N

HO

HO

30 NR2B-IC50: 0,17 µM α-1-IC50: 0,58 µM; D2-IC50: 0,29 µM


Fenolos hidroxilcsoport helyett heterociklusos fenol bioizosztérek alkalmazásával próbálták növelni a metabolikus stabilitást.70 A heterobiciklusos származékok közül a benzimidazolinon (32) volt a legaktívabb, ugyanakkor szelektív és orálisan felszívódó vegyület.

32

N

H N O N H


A vegyületcsalád további optimalizációja során az NR2B receptorhoz való affinitást [3H]ifenprodil radioligand kötıdési tesztben határozták meg natív patkány agyat felhasználva.71 F

N

H N

N

H N

O

F

O N H

N H

N

33 IC50: 3 nM

34 IC50: 2 nM

A nagy affinitással és NR2B szelektivitással rendelkezı 33-as vegyület hatékonynak mutatkozott

Parkinson-kór és neuropátiás fájdalom modellekben. A molekula további

módosítása hasonlóan potens vegyületeket eredményezett (pl. 34). Az University of Oregon, CoCensys, Parke-Davis közös kutatócsoportja azt a további értékes megfigyelést tette, hogy a bázikus nitrogén jelenléte nem feltétele az NMDA receptor antagonizmusnak.

állítottak

N-(2-feniletil)-fahéjsavamidokat

elı

melyeket

NMDA

antagonistaként teszteltek Xenopus oocytában minhárom altípusra (NR1a/2A-C). A 35-ös vegyület potens és NR2B szelektív antagonistának bizonyult.72 Cl H N HO

O

35 NR2B-IC50: 170 nM

A vegyületcsalád optimalizációja során még aktívabb analogonokat is találtak, például a 36 és 37 vegyületeket.73 O

O N H

N

HO

HO

36 NR2B-IC50: 77 nM

37 NR2B-IC50: 120 nM

Funkcionális tesztben a 36-os vegyület az ifenprodilnál (IC50: 110 nM) potensebbnek mutatkozott, a (+)-5 (CP-101,606) vegyülettel (IC50: 73 nM) azonos aktivitással bírt. A 37-es

33

vegyület az ifenprodil fejlıdésének új szintjét képviseli. Benzil-piperidin három atom hosszúságú láncon keresztül kapcsolódik egy fenol négyes helyzetéhez olymódon, hogy a molekulában lévı nitrogén nem bázikus. A jelentısége ennek a fejleménynek abból a megfigyelésbıl ered, hogy a bázikus nitrogént tartalmazó természetes ligandumok (pl. adrenalin, dopamin, szerotonin stb.) receptorai a bázikus nitrogént tartalmazó vegyületeket részesítik elınyben. A bázikus nitrogén jelenléte sok esetben elıfeltétele a jó affinitásnak ezekhez a mellékhatásokért felelıs receptorokhoz, vagyis a farmakofór modelljük tartalmazza a bázikus nitrogént. Ebbıl az következik, hogy ha egy NR2B aktív vegyületcsalád nem tartalmaz bázikus nitrogént, nagy valószínőséggel kevesebb mellékhatással fog rendelkezni, mint a bázikus nitrogént tartalmazók. A Merck Research Laboratories kutatói szintén állítottak elı ifenprodil farmakofórral rendelkezı molekulákat, eredményeiknek azonban csak egy részét közölték. Vegyülettárukat tesztelve egy benzimidazol származékot (38) azonosítottak.74 Másik vezérmolekulájukat (39) egy száztagú benzimidazol könyvtárból azonosították. Egyik molekula sem tartalmaz hidrogénkötés donorcsoportot a terminális benzolgyőrőkön. Az optimalizáció során a baloldali benzolgyőrőt kiegészítették hidrogénkötés donorcsoporttal. A vegyületeket NR2B szelektív kötıdési tesztben és sejt alapú Ca2+ influxot meghatározó funkcionális tesztben75 mérve mindkét vegyületcsaládban nagyon potens képviselıkhöz jutottak. N

O

N N

N H

N H

38 NR2B kötıdés Ki: 420 nM; Ca2+-IC50: 710 nM hERG-IP: 1400 nM; α-1-IC50: 2800 nM

39 NR2B kötıdés Ki: 260 nM; Ca2+-IC50: 200 nM hERG-IP: 2000 nM; α-1-IC50: 4200 nM

A legaktívabbak a 40 és 41-es vegyületek voltak, melyek ráadásul jó szelektivitással rendelkeztek az NMDA receptor NR2A, NR2C és NR2D altípusával, a hERG csatorna aktivitással és az α-1 adrenerg kötıdéssel szemben. A 41-es vegyület kiválóan aktív volt a karragén-indukált mechanikai hiperalgézia tesztben patkányban és jó farmakokinetikai tulajdonságokkal bírt kutyában. F HO

CH3

N N H

O

N

S

H N

N

O

O N H

41 NR2B kötıdés Ki: 0,68 nM; Ca2+-IC50: 0,72 nM hERG-IP: 120 nM; α-1-IC50: 4000 nM

40

NR2B kötıdés Ki: 0,85 nM; Ca2+-IC50: 9,7 nM hERG-IP: 2900 nM; α-1-IC50: 730 nM

34

Azt a jelenséget, miszerint a bázikus nitrogén nem feltétele az altípusszelektív NMDA receptor antagonisták hatásosságának a Merck & Co. Inc. is vizsgálta. A egyik szabadalmi bejelentésükben 42 és 43 jellemzı példákkal N-benziloxikarbonil-piperidin-származékokat védenek.76 Biológiai adatokat nem közölnek, saját méréseink szerint77 ezek a vegyületek hatásos NR2B receptor antagonisták. O

O HO H N

N

H N

O

O

H N

N

O

O

O

42 NR2B-IC50: 4,8 nM

43 NR2B-IC50: 6,0 nM

Az irodalom áttekintésével az a következtetés vonható le, hogy az elmúlt tíz évben több kutatóegység is óriási erıfeszítéseket tett annak érdekében, hogy az ifenprodilt olyan NR2B altípusszelektív NMDA receptor antagonistává alakítsák, mely más receptorokhoz nem kötıdik számottevıen. Tanulmányaik alapján a következı megállapítások tehetık az ifenprodil farmakofór modellt illetıen: A leghatásosabb szerkezetek két terminális benzolgyőrőt tartalmaznak, melyek közül az egyik egy metabolikusan stabil hidrogénkötés donorcsoportot visel. A két benzolgyőrőt elınyösen bázikus csoportot nem tartalmazó, különbözı hosszúságú és heteroatom-tartalmú lánc köti össze. Ez az összekötı lánc nem egyszerően távtartó, hanem fontos szerepet tölt be a receptorral való kölcsönhatásban. Az elmúlt idıszakban számos, az ifenprodil farmakofór modellbe illeszkedı in vitro és in vivo aktív, orálisan is hatásos, biztonságos vegyület állítottak elı, melyek közül a közeljövıben új gyógyszer forgalombahozatalát is remélhetjük. 2.3.4.2. Nem ifenprodil típusú NR2B szelektív NMDA antagonisták Az elmúlt években több, az ifenprodil farmakofór modellbe nem illeszkedı molekulatípust is azonosítottak. A legtöbb adatot velük kapcsolatban szőkszavú szabadalmi bejelentésekben tették közzé. Részletes szerkezet-hatás összefüggések ismerete nélkül nehéz egy közös farmakofór modellt felállítani, ennek ellenére néhány egyedi kivételtıl (pl. fehérjék) eltekintve több hasonló szerkezeti elem is felfedezhetı ezekben a molekulákban. Nem tartalmaznak hidrogénkötés donorcsoportot és a legtöbb esetben hiányzik belılük az ifenprodil típusú NR2B szelektív NMDA antagonistákra korábban jellemzı bázikus nitrogén. Meglehetısen kompakt molekulák, általában két terminális arilcsoportot tartalmaznak,

35

melyeket egy sokszor győrőbe zárt, merev, rövid lánc köt össze. A legszembetőnıbb közös szerkezeti elem az amidincsoport, az összes molekula leírható 44 általános képlettel. R2 N R3 R1 N R4

44

Az elsı NR2B szelektív NMDA antagonista hatású amidin-típusú vegyületcsaládot a Merck Sharp & Dohme kutatói azonosították. Új vegyületek tesztelése során az

E-N1-

(benzil)fahéjsav-amidin (45) jelentıs affinitást mutatott az NR2B-tartalmú receptorokhoz.78 Mivel ez a molekula az ifenprodil farmakofór modelltıl eltérı szerkezető, ezért az NR2B szelektív NMDA antagonista hatású vegyületek új típusú, reménykeltı jelöltje lehet. Ez a felismerés egy új gyógyszerkémiai programot indított el a Mercknél. A vegyületcsalád optimalizációja során legaktívabbnak a 2-metoxi-benzil-származék (46) adódott. NH

NH

O N H

N H

45 NR2B kötıdés Ki: 9 nM

46 NR2B kötıdés Ki: 0,7 nM

Mivel a molekula sztiril szerkezeti része potenciális Michael akceptor, rögtön megindult az ezt a lehetıséget kizáró rokon szerkezetek keresése. Így találtak rá a benzil-benzamidin vegyületcsaládra, amelynek szubsztituálatlan képviselıje (47) hatástalan volt, megfelelıen helyettesített benzolgyőrőkkel viszont aktív származékokat sikerült elıállítaniuk.79 A vegyületek aktivitását [3H]-ifenprodil-kötıdési tesztben és teljes sejtes patch-clamp technikán alapuló funkcionális esszében határozták meg.

Funkcionális tesztben leghatásosabb a

benzilcsoport 2-es helyzetében szintén metoxicsoporttal szubsztituált 48 származék volt. NH

NH

O

N H

N H CF3O

47 NR2B kötıdés Ki > 15000 nM

48 NR2B kötıdés Ki: 5,7 nM NR2B funkcionális teszt IC50 : 4,1 nM

A vegyületcsalád aktív tagjai általában jó orális farmakokinetikával rendelkeztek, és a karragén-indukált hiperalgézia tesztben rágcsálókban hatásosak, ugyanakkor a nemszelektív NMDA

antagonistákra

jellemzı

lokomotoros 36

mellékhatástól

mentesek

voltak.

A

farmakokinetikai paraméterek különösen szubsztituensfüggı jellemzıknek bizonyultak. A kötıdési teszten legaktívabb 49 származék klóratomjait metilcsoportra cserélve (50) a felezési idı kevesebb mint negyedére, a biohasznosulás a töredékére csökkent. Ugyanakkor az 51 vegyület trifluormetil-csoportja szokatlan módon 100 %-os biohasznosulást kölcsönzött a nagyon poláris amidincsoportot tartalmazó molekulának is. A közölt adatok ismét rávilágítanak arra, hogy a biohasznosulásnak (BA) milyen fontos szerepe van a jó in vivo hatás elérésében. A funkcionális tesztben közepes hatékonyságú (IC50 : 24 nM), 68 % biohasznosulást elérı 49 származék a karragén-indukált hiperalgézia tesztben is közepes hatású (ED50: 16 mg/kg). Az in vitro aktívabb (IC50 : 4,2 nM) de alig felszívódó (BA : 4%) 50 in vivo hatástalan. Míg az in vitro fele olyan aktív 51 a teljes felszívódásának köszönhetıen kiváló in vivo aktivitással rendelkezik. NH

NH

NH Cl

N H

CH3

N H

CF3O

CF3O

CF3

N H CF3O

Cl

CH3

49 NR2B Ki: 0,6 nM; IC50 : 24 nM BA: 68 %; T1/2 : 420 perc, ED50: 16 mg/kg

50 NR2B Ki: 1,2 nM; IC50 : 4,2 nM BA: 4 %; T1/2 : 92 perc, ED50: >30 mg/kg

51 NR2B Ki: 72 nM; IC50 : 47 nM BA: 100 %; T1/2 : 147 perc ED50: 5,5 mg/kg

Hamarosan a Hoffmann La Roche is jelentkezett egy az amidin szerkezeti elemet rejtetten tartalmazó molekulacsaláddal. 52 triazolszármazékuk a [3H]-Ro 25-6981 kötıdési tesztben kiváló affinitást mutatott.80 A vegyületcsaládot jobban megvizsgálva derült ki, hogy a triazol összekötı elem különbözı heterociklusokkal, pl. piridazinnal (53) vagy imidazollal (54) való helyettesítése is aktív molekulákat eredményez.81, 82 H N N

CH3

N H3C

N

NH2

O

N

N

CH3

CH3

Cl

52 NR2B kötıdés IC50 : 8,3 nM

H2N

O

N

O


N N


37

N

54 NR2B kötıdés IC50 : 1 nM

HN

N

N

Cl


HN

N

N

N

Kiemelkedı in vitro aktivitásaik ellenére a vegyületeket nem fejlesztették tovább. A Roche kutatói egy [3H]-Ro 25-6981 kötıdési teszten alapuló HTS vizsgálat során egy NR2B aktív imidazolin származékot azonosítottak (55).83 A vegyületcsalád optimalizálásakor az egyik kritikus paraméternek a molekulák pKa értékét feltételezve a bázicitást jelentısen befolyásoló szerkezeti módosításokat is végrehajtottak. Megfigyeléseik alapján fontos, hogy a vegyület fiziológiai pH-n protonálódjon, ugyanakkor a túlzott bázicitás sem elınyös. A legaktívabb 56 származék pKa értéke (9,9) az optimálishoz közeli lehet, mind a bázicitás csökkentése, mind a növelése kevésbé aktív vegyületeket eredményezett. 56 egy antikonvulzív tulajdonságot vizsgáló egér audiogén roham modellben, i.p. adagolást követıen elfogadható agyi penetrációt mutatott. Valószínő, hogy egy kedvezı pKa érték nemcsak a receptorral való kölcsönhatás szempontjából fontos, de befolyásolhatja a sejtmembránokon, így az vér-agy gáton való átjutást is. A Roche vegyülettárának [3H]-Ro 25-6981 kötıdési teszt alapú HTS szőrésekor egy 4aminokinolin származékot (57) is NR2B szelektív NMDA antagonistaként azonosítottak.84 HN

OH

HN

OH

OH

N

N


N


A vegyületcsalád optimalizálása során megállapították, hogy a 4-es helyzető aminocsoporthoz képest vicinális helyzetben legalább egy hidrogénkötés donorcsoport jelenléte szükséges. Elınyös, ha a C2 helyzetben lévı lipofil aromás győrő nem közvetlenül kapcsolódik a kinolingyőrőhöz. Valamennyi aktív származék protonálódik fiziológiás pH-n (pKa > 8,4), valószínősítve, hogy ez a bioaktív forma. A leghatásosabb származékban a kinolingyőrő 2-es helyzető szénatomja egy 3,4-dihidro-1H-izokinolin nitrogénatomjához kapcsolódik (58). A vegyület egér audiogén roham modellben i.p. adagolás mellett in vivo is hatékonynak bizonyult (ED50<12 mg/kg).84,85 A kinolinszármazékok α1 és muszkarin M1 receptorral szemben mutatott jelentıs affinitása miatt az optimalizációt tovább folytatták. Kinolingyőrő helyett piridint alkalmazva az NR2B aktivitás megtartása mellett sikerült jelentıs mértékben növelni az ezekkel a receptorokkal szembeni szelektivitást. Az NR2B receptorokhoz közel azonos affinitással rendelkezik az 59 4-aminopiridin, a 60 2-aminopiridin, és a mindkét aminocsoporton szubsztituált 61 származék is.86-88

38

NH2

NH2

OH

HN

N N

N

N


N


N


Többek között a mi, késıbb ismertetett, hasonló vegyületek körében elért eredményeinkre hivatkozva a Merck kutatói folytatták az amidin típusú molekulákkal korábban megkezdett munkájukat. Öt, hat és héttagú ciklikus benzamidineket állítottak elı, melyek közül NR2B aktivitással csak az öttagúak rendelkeztek.89 Korábbi 48 benzamidin-származékuk szerkezetét kétféleképpen merevítették. Az amidincsoport szubsztituálatlan nitrogénje és a benzilcsoport alifás szénatomja közzé beépített metiléncsoport 4,5-dihidro-1H-imidazol származékokat eredményezett.

A vegyületcsalád

leghatásosabb,

egy klóratommal is

szubsztituált

származékának (62) az aktivitása elmarad a 48 anyavegyület aktivitásától. A benzamidin szubsztituált nitrogénje és orto-helyzető szénatomja közé egy metiléncsoport beépítésével levezethetı izoindolin-1-imin (63) az anyavegyületnél hatásosabbnak bizonyult. CH3O

NH

N Cl

OCH3

N H

N H


OCH3

N CF3O

CF3O

CF3O

NH



A vegyület viszonylag gyenge farmakokinetikai sajátságokkal bír: 5 % biohasznosulás, 2 óra plazma féléletidı, 215 nM cmax. Orálisan aktív, a karragén-indukált hiperalgézia tesztben meghatározott ED50 értéke 20 mg/kg. Ennél a dózisnál 50 %-os hiperalgézia válasz csökkenést eredményezett a kontrollhoz képest. A Merck ezeken kívül több 64 reprezentatív molekulával jellemezhetı iminopirimidin származékot védett szabadalmi bejelentésben.90

NH N

N

64

39

3. KÍSÉRLETI MODELLEK, VIZSGÁLATI MÓDSZEREK 3.1 Farmakológiai szőrırendszer Az elıállított vegyületek biológiai hatását gondosan összeválogatott, egymásra épülı tesztsorozatban vizsgáltuk. Ez a kaszkádszerően felépített farmakológiai szőrırendszer négy jól elkülönülı részbıl állt. Egyik lépcsıbıl a következıbe csak az elıre felállított kritériumoknak megfelelı vegyületek juthattak át. A projekt négy éves idıtartama alatt a kaszkádrendszer számos pontját megváltoztattuk. Menet közben új módszereket fejlesztettünk ki, az egyes teszteket átrangsoroltuk, legtöbbször a szelekciós kritériumokat módosítottuk. Eredményeinket, lehetıségeinket és a szők keresztmetszeteket figyelembe véve szigorítottuk, vagy lazítottuk a továbbjutás feltételeit. Az 11. ábrán tesztrendszerünk egy jellemzı állapotát mutatom be. Szelektivitás >100

IC50 < 25 nM

1. lépcsı NMDA antagonizmus Fluorometriás [Ca2+] meghatározás

Mellékhatást, szelektivitást feltérképezı tesztek α, 5ΗΤ2Α, NR2A, DAfelvétel

In vitro metabolizmus Met.stab. patkány és humán mikroszómán (Fm % > 70)

>100 x szelektivitás, stabilitás (FM > 70 %)

2. lépcsı

Egér formalin teszt Egyszeri 10 mg/kg dózis, Inh > 60 % →ED50 Orális ED50 < 5 mg/kg Egér lokomotoros aktivitás (LMA) MED p.o.

Irwin teszt egérben – minimális effektív dózis (MED) p.o.

MED/ ED50 > 10 Farmakokinetika (PK) orális biohasznosulás (BA) (patkány)

3. lépcsı

BA > 20%

Orális hatás neuropátiás fájdalom modellben ED50

Patány lokomotoros aktivitás (LMA) Nincs effektus az ED50 - nél

QT megnyúlás nyúl szíven Nincs effektus 1 µM-nál

4. lépcsı Fı hatások: Seltzer modell (antihiperalgézia) Gyulladásos fájdalom modell Termális hiperalgézia Ismételt adás Elektrofiziológiás wind up

Biztonság/fejleszthetıség Irwin teszt patkányban CYP2D6 metabolizmus Kognitív teszt Toxicitás Kardiovaszkuláris mellékhatások

Rotarod teszt P450 enzim indukció NR2B szelektivitás AMES teszt

11. ábra. Az NR2B szelektív NMDA antagonisták projekt farmakológiai tesztrendszere

40

Az 1. lépcsıben a hatékony NMDA antagonistákat válogattuk ki, egy, a kortikális neuron tenyészeteken az NMDA intracelluláris Ca2+-szintet növelı hatásának antagonizmusa alapján mőködı funkcionális teszt segítségével. E teszt eredménye elsı közelítésben a kémiai munka megfelelı

és gyors visszacsatolásának

bizonyult. Hatásos vegyületek esetében a

legvalószínőbb mellékhatások feltérképezése céljából α1 és 5HT2A receptor kötıdési teszteket, a szelektivitás alátámasztása céljából további funkcionális teszteket végeztünk NR1a/NR2B és NR1/NR2A alegység összetételő rekombináns NMDA receptorokon, illetve egy további kötıdési tesztet melyben egy NR2B szelektív referenciavegyület tríciált változatát (3H-Ro 256981 ) használtuk fel radioligandként. Az 1. lépcsı része volt még az in vitro metabolizmus, melynek során a hatásos vegyületek metabolikus stabilitását patkány és humán mikroszómán mértük. Az in vitro kellıen hatékony, szelektív és metabolikusan stabil vegyületekkel a kaszkád 2. lépcsıjében megkezdıdtek az in vivo vizsgálatok. A fájdalomcsillapító fıhatást egér formalin tesztben határoztuk meg, míg a lehetséges CNS mellékhatásokat Irwin teszt és egér lokomotoros aktivitást (LMA) mérı teszt alapján próbáltuk meg feltérképezni. Ha a mellékhatásokra és a fıhatásra jellemzı dózisok közötti különbség, vagyis a terápiás ablak, illetve a kettı hányadosa a terápiás index kellıen nagy (MED/ED50>10) és a vegyület kielégítı fájdalomcsillapító hatással rendelkezett, akkor a 3. lépcsıbe került. Ebben a fázisban a továbbjutott vegyületekrıl részletes farmakokinetikai és farmakodinámiás jellemzés készült. Az ADME tulajdonságokat leíró farmakokinetikai jellemzık, a kiürülés, féléletidı, megoszlási térfogat, cmax, biohasznosulás, agyi penetráció közül a biohasznosulás (BA) szelekciós tényezı volt. A hatékonyságot CCI neuropátiás fájdalommodellben, míg a mellékhatást patkány lokomotoros aktivitást (LMA) mérı modellben vizsgáltuk tovább. A CNS mellékhatásokat jelzı LMA méréseket a szív arritmiájával kapcsolatba hozható QT megnyúlás mérésével egészítettük ki. Ebben a fázisban kerül sor az adásmódok összehasonlítására. Rosszul felszívódó vagy a first-pass metabolizmuson lebomló vegyületek sok esetben nem mutatnak per os hatékonyságot, de más adásmóddal (i.v., s.c., i.p.) még hatékonyak lehetnek. A rosszul oldódó és felszívódó vegyületek biohasznosulását, ezáltal in vivo hatékonyságát különbözı komplexképzık és oldószerek segítségével, vagy a hatóanyag mikronizálásával több esetben jelentısen sikerült javítani. Az utolsó lépcsıben még több a fı hatást és a lehetséges mellékhatásokat feltáró vizsgálatnak vetettük alá az ide kerülı vegyületeket. Bár új molekulákat elsısorban az in vitro eredmények alapján terveztünk, a kaszkád elsı három lépcsıjének teszteredményei is hatással voltak a kémiai munkára. A tervezett molekulák szerkezeti, fiziko-kémiai paraméterein (oldékonyság, PAMPA, clogP, pK 41

predikciók) keresztül eredményesen tudtuk befolyásolni a felszívódást, biohasznosulást, agyi penetrációt, ezeken keresztül pedig az orális hatékonyságot. Gyógyszerkémiai szabályokat alkalmazva több esetben pozitívan alakítottuk a metabolikus stabilitást. A 4. lépcsı sem teljesen fekete doboz, a benne lévı tesztekre vonatkozóan is alkalmazhatunk racionális megfontolásokat, különbözı predikciós módszereket. Ebben a fázisban fontoltuk meg a prodrug startégia lehetıségét. Túl sok paraméterre azonban nem lehet optimalizálni így a 4. lépcsı teszteredményei már csak rangsorolják az idáig jutott vegyületeket. A fıhatás, biztonság és fejleszthetıség szempontjait alaposan mérlegelve közülük választottuk ki a továbbfejlesztésre alkalmas jelölteket. Mivel a kémiai tervezımunkát az 1. lépcsı meghatározó in vitro vizsgálatai mellett a következı két lépcsı in vivo teszteredményei is befolyásolták, és dolgozatomban a szerkezet-hatás összefüggések elemzésekor felhasználom ezeket az erdményeket, röviden ismertetem az elsı három lépcsı tesztjeit. A kaszkád felépítése és a kritériumrendszer az 11. ábrán kísérhetı figyelemmel. 3.2. In vitro vizsgálatok 3.2.1. Kötıdési tesztek Az NMDA antagonisták mellékhatásaiért elsısorban az α1 és az 5-HT2A receptorok felelısek, ezért már korai szakaszban fontos, hogy ismerjük a vegyületek affinitását ezekhez a receptorokhoz. Az α1 kötıdési tesztben56 [3H]-prazozint, az 5-HT2A kötıdési tesztben91 [3H]ketanszerint használtunk radioligandként. A funkcionális tesztadatok mellett elsısorban QSAR módszerek kiindulási adataként egy NR2B kötıdési tesztre54 is szükségünk volt. Méréseink során radioligandként egy nagy NR2B szelektivitással rendelkezı triciummal jelzett referenciavegyületet, a [3H]-Ro 256981-et alkalmaztuk. 3.2.2. Funkcionális tesztek 3.2.2.1. Funkcionális teszt primer neokortikális tenyészeten Az elıállított új vegyületek NMDA antagonista hatását a következı, intracelluláris Ca2+ koncentráció mérésen alapuló funkcionális tesztben vizsgáltuk.76 Az NMDA receptorok az agonista NMDA alkalmazását követıen ingerült állapotba kerülve Ca2+-ra permeábilisak. Funkcionális tesztünkben a vegyületeknek az NMDA által kiváltott intracelluláris Ca2+koncentráció emelkedésre gyakorolt gátló hatását határoztuk meg fluoreszcenciás Ca2+ méréssel. 42

A méréshez 17 napos Charles River-patkány embriókból származó, standard 96-lyukú szövettenyésztı lemezekre szélesztett primer neokortikális tenyészeteket használtunk. Mivel a patkány és az ember NMDA receptorainak nagyon nagy a szekvencia hasonlósága (99, 95, 97 % az NR1, NR2A illetıleg az NR2B alegységek esetén), farmakológiai érzékenységükben nagyon kicsi a különbség, ha van egyáltalán. Ezért azok az eredmények, amelyeket patkány NMDA receptorokon kaptunk, reményeink szerint jól extrapolálhatók az emberre is. Mérés elıtt a sejteket feltöltöttük Fluo-4 fluoreszcens Ca2+ indikátorral, majd a tesztelendı vegyületeket végül NMDA-t adagoltunk a sejtekhez. A Ca2+ koncentráció mérését egy plate reader fluoriméter készülékkel végeztük. A vegyület gátló hatását különbözı koncentrációknál a kalcium felszabadulás csökkenésének mérésével határoztuk meg. Egy konkrét koncentrációnál a vegyület gátló hatását a kontrol NMDA válasz gátlás százalékában fejezzük ki. Ezt az értéket elosztva az ifenprodil esetében mért százalékos gátlással egy relatív értékhez jutunk. A vegyület 0,1 µM koncentrációnál meghatározott gátló hatását osztottuk a 10 µM ifenprodil gátló hatásával. Tanulmányomban a receptor gátlását a közvetlenül mérhetı abszolút százalékos adat helyett ezzel a relatív értékkel jellemzem (Inh %). A tesztrendszerben adott százalékos érték felett IC50 értéket is meghatároztunk, így a hatásosabb vegyületeket IC50 értékkel jellemzem. Az idegsejtek NMDA receptor alegység összetétele a születést követı fejlıdés során változik. Hasonló változás figyelhetı meg neuronális sejttenyészetekben.92 Az irodalmi adatok, és saját immunocitokémiai vizsgálataink szerint a 4 - 7 napig in vitro tenyészetben tartott neuronok túlnyomórészt NR2B alegységet expresszálnak az NR1 mellett. Így az NMDA antagonizmus ilyen sejteken végzett funkcionális tesztje elsısorban az NR2B alegység tartalmú receptorokon való hatást mutatja. 3.2.2.2. Funkcionális teszt NR1a/NR2B és NR1/NR2A alegység összetételő rekombináns NMDA receptorokon Bár az elızı megfontolások alapján a natív idegsejteken meghatározott funkcionális teszt elsısorban az NR2B alegység tartalmú receptorok gátlását fejezi ki, a vegyületek egyértelmő jellemzése miatt a mérést NR1a/NR2B alegység összetételő NMDA receptorokat stabilan expresszáló sejtvonalakon is végrehajtottuk. A Ca2+ koncentráció fent leírt fluoreszcenciás meghatározását patkány NR1a és NR2B NMDA receptor alegység kombinációt stabilan expresszáló HEK293 sejteken hajtottuk végre. Vegyületeink NR2B szelektív hatásának alátámasztására a mérést NR1/NR2A alegység összetételő rekombináns NMDA receptorokat stabilan expresszáló sejtvonalakon is végrehajtottuk. 43

3.3. In vivo tesztek 3.3.1. Egér formalin teszt Egerek hátsó lábába injektált higított formalin kétfázisú, fájdalommal kapcsolatos viselkedést vált ki, amely a sérült láb nyalakodási/harapdálási idejével mérhetı. Az elsı fázis az azonnal jelentkezı nociceptív válasz. A második fázis az azon fájdalommal kapcsolatos események, amelyek a formalin injektálását követıen 15-60 percen belül jelentkeznek. Az NMDA receptorok a formalin injektálásra adott válasz második fázisában játszanak szerepet, és ez a viselkedési válasz az NMDA receptorok gátlására érzékeny.93 Ezért mi a formalin teszt második - “ hiperalgéziás” - fázisát használtuk, hogy a vegyületek in vivo hatékonyságát jellemezzük. A válasz második fázisának gátlása a kémiailag indukált állandó fájdalommal szembeni analgetikus hatás mértékének tekinthetı.94 A vizsgálandó vegyületeket orálisan adagoltuk 15 perccel a formalin injektálás elıtt. Az injektált láb nyalásával és harapdálásával töltött idıt mértük a formalin injektálástól számított 20-25. percben. Az eredményeket az azonos napon megfigyelt kontrollcsoportban mért nyalakodási idıkhöz viszonyítva %-os gátlásban fejeztük ki, hatásos vegyületek esetén ED50 értéket határoztunk meg. 3.3.2. Neuropátiás fájdalom Seltzer modellje (antihiperalgézia) Egerek egyik oldali nervus ischiadicusát az állat combján részlegesen kipreparáltuk és szorosan elkötöttük szilikonos varróanyaggal, majd a sebet lezártuk. Ez az ideglekötés a láb spontán fájdalmát és mechanonociceptív küszöbének csökkenését idézi elı.95 A kialakuló mechanikai hiperalgézia mértékét egy analgeziméterrel határoztuk meg és grammban fejeztük ki. Az állatok lábát egyenletesen fokozódó erıhatásnak tettük ki. A fájdalomküszöb elérésekor az állat kirántja a lábát a mőszerbıl, így a fájdalomküszöb grammban kifejezhetı. ED50 érték helyett egy minimális effektív dózist (MED) állapítottunk meg ahol a vegyület statisztikailag szignifikánsan visszafordítja a hiperalgéziát. 3.3.3. Neuropátiás fájdalom CCI (chronic constriction injury) modellje (antiallodínia) Az idegsérülés hatását ebben a modellben a jobboldali ülıidegnek egy kettéhasított polietilén csıbe való zárásával modelleztük. Az operációt követı 30. napon stabil allodínia alakul ki, amely még két hónapig fennáll.

A fájdalom küszöbértékét a hátsó láb Von Frey

filamentumokkal való érintésével határoztuk meg. A fájdalom küszöbértékének annak a Von Frey szálnak a grammokban kifejezett értékét tekintettük, ahol az állat a lábát visszahúzta a

44

fájdalom miatt (láb-visszahúzási küszöbérték). A mért értéket a hatóanyag helyett csak vivıanyaggal kezelt kontrollcsoport adataihoz viszonyítottuk. 3.3.4. Diabéteszes neuropátia modell Patkányokban sztreptozotocin egyszeri adásával két hét alatt diabéteszt idéztünk elı. További hat hét alatt diabéteszes neuropátia alakult ki. A láb-visszahúzási küszöbértéket Von Frey filamentumokkal való mechanikus ingerléssel határoztuk meg. A mért értéket a hatóanyag helyett csak vivıanyaggal kezelt kontrollcsoport adataihoz viszonyítottuk. 3.4 Nemkívánatos mellékhatásokra utaló tesztek 3.4.1. Irwin teszt A központi idegrendszerre ható szerek gyors szőrésre alkalmas aktivitásvizsgálat, amely az állatok spontán magatartásváltozásáról (pl. szedáció, excitáció, sztereotípia, agresszivitás, motoros inkoordináció, izomtónus, stb) ad kvalitatív jellegő felvilágosítást. Az egyes állatokat minden egyes tesztben vizuálisan megfigyeltük, és a tesztben mutatott reakcióját ( pl. önápolás, hangadás, remegés, görcsök, passzivitás, fájdalomreakció, ingerlékenység stb.) pontokkal osztályoztuk, a kapott pontokat összehasonlítottuk a kontroll azonos tesztben mutatott pontjaival. A teszt eredményeként minimális effektív dózis (MED) került meghatározásra. 3.4.2. Spontán lokomotoros aktivitás mérése rágcsálókon A spontán lokomotoros aktivitást egy, a mozgási aktivitást fotocella sorral automatikusan detektáló készülékben vizsgáltuk. Harminc perccel a tesztvegyület vagy a vivıanyag orális adagolása után az állatok horizontális és vertikális mozgását határoztuk meg a fénysugár megszakítások számaként egy órán keresztül 15 perces intervallumokban. A mérést a horizontális aktivitás adatainak kontrollcsoporthoz (vivı anyaggal kezelt) viszonyított százalékos változása jellemzi. Egy vegyület akkor lokomotoros stimuláló hatású, ha 50 %-nál nagyobb emelkedést váltott ki a fénysugár megszakításokban. Vagyis, definíciószerően a lokomotoros aktivitás mentes (LMAfree) dózisok 50 %-nál kisebb emelkedést mutattak. 3.4.3. Rotarod teszt A rotarod teszt

széleskörben használt

egyszerő

módszer a

vegyületek

motoros

mellékhatásának detektálására. A teszt során a rágcsálót forgó rúdra állítottuk, ezzel motoros 45

aktivitásra kényszerítettük. A forgó rúdon való tartózkodási idı arányos az állat egyensúlyozási, koordinációs képességével. A meghatározott ED50 érték a vizsgált vegyületnek ezekre a képességekre, motoros funkciókra gyakorolt hatását jellemzi. 3.4.4. QT-megnyúlás A kísérlet során azt vizsgáltuk, hogy izolált nyúlszíven vagy érzéstelenített kutyában i.v.adagolt tesztvegyület meghosszabbítja-e az EKG-görbe QT tartamát. QT megnyúlás esetén fatális kamrai tachycardia, ún. torsades de pointes típusú ritmuszavar jelentkezhet. A Q hullám a kamrai depolarizációt (gyors Na+ beáramlás), a T hullám a repolarizációt tükrözi. A repolarizáció több ionáram egymás utáni vagy egyidejő mőködésének az eredménye, legnagyobb részét a human Ether-à-go-go Related Gene (hERG) gén által kódolt K+ ioncsatornán keresztüláramló kifelé irányúló késıi egyenirányító K+ áram határozza meg. Így sok esetben a QT megnyúlás arányos a vegyület hERG K+ csatornára gyakorolt gátló hatásával. A QT megnyúlását msec-ban vagy a kontrollhoz viszonyítva, százalékosan adják meg.

46

4. SAJÁT EREDMÉNYEK Az NR2B projekt indulásakor ifenprodil típusú molekulák elıállítását határoztuk el. Mivel abban az idıben cégünknél még nem voltak meg a feltételei egy nagy áteresztıképességő biológiai szőrésnek, kémiai munkánkat a versenytársak ismert molekuláira alapoztuk, és a mai szakirodalomban lead-hoppingnak nevezett módszer segítségével reméltünk új, hatásos szerkezeteket találni. A lead-hopping vagy scaffold-hopping során egy hatásos molekulából kiindulva hasonló aktivitású, de eltérı szerkezető molekulát azonosítunk. Ma már különféle számítógépes technikák generálnak ezen az elven új szerkezeteket. A dolgozatomban feldolgozott, általunk azonosított NR2B aktivitással rendelkezı vegyületcsaládok fejlıdését, logikai kapcsolatát, a vegyületcsaládokat jellemzı molekulák alapján a 12. ábrán foglalom össze. Kémiai munkánk kiindulópontja az egyik versenytárs a CoCensys abban az idıben legújabb eredménye, a 35-ös számú fahéjsavamid volt. A molekula az akkor már jól ismert farmakofor modellt azzal az új elemmel egészítette ki, hogy nem szükséges bázikus nitrogén jelenléte az NR2B aktivitás eléréséhez. Feltételezésünk szerint a mellékhatások döntı részéért éppen az ifenprodil analogonokban lévı bázikus nitrogén a felelıs. A 35 fahéjsavamid amin komponensének elınyös cseréjével egy aktívabb származékhoz jutottam (69). Közben az University of Oregon, a CoCensys és a Parke Davis közös kutatócsoportja újabb közleményben számolt be a fahéjsavamidok körében végzett további munkájáról. Megfigyelték, hogy a klóratom és a hidroxilcsoport helyzetének felcserélése szintén hatásos molekulát (65) eredményezett. Ennek alapján a szerzık azt a következtetést vonták le, hogy a molekulák a receptorzsebbel minkét orientációból képesek kapcsolatot létesíteni. A 4-hidroxi-fahéjsavamid (65) amidkomponensét 4-benzil-piperidinre cserélve egy közel háromszor aktívabb molekulához jutottak (37). Korábban az ifenprodil analogonok szekunder amin része kizárólag 4-es helyzetben szubsztituált piperidinek voltak. Elhatároztam, hogy felderítem, milyen szekunder aminok eredményeznek még hatásos fahéjsavamidokat. Másik célom a fenolos hidroxilcsoport cseréje vélhetıen metabolikusan stabilabb csoportra. A két célkitőzést kombinatorikus kémia eszközökkel, a molekula két részének egyidejő szerkezeti változtatásával próbáltam egyszerre elérni. A megtervezett vegyülettár létrehozásához elıször a fenolos hidroxilcsoporttal izosztér, heterociklusokkal kondenzált fahéjsavakat állítottam elı, melyekben a hidrogénkötés donor szerepet egy NHcsoport tölti be. A fahéjsavakkal, szilárd fázishoz kötött kapcsolószer segítségével, válogatott szekunder aminokat acileztem. A fahéjsavamidok körében végzett kombinatorikus kémiai tanulmány eredményeként a 37 anyavegyülethez képest négyszer aktívabb molekulához

47

jutottam (81). Munkánkban alapvetı fordulatot a fahéjsavszerkezet merevítésére tett erıfeszítéseink sikere hozott. A fahéjsav α-szénatomjának összekötése az orto-helyzető aromás szénatommal egy hétszer aktívabb molekulához, a 82 indol-2-karboxamidszármazékhoz vezetett. A 82 vezérmolekula optimalizációja számos hasonlóan aktív molekulát eredményezett. A molekula összes pontján megvizsgáltam a lehetséges szerkezeti módosítások hatását. Legeredményesebb változtatás az indol 3-as helyzetében lévı CHcsoportnak nitrogénatomra történı cseréje volt (142). Az ilymódon levezethetı benzimidazol2-karboxamidok általában tízszer aktívabbak voltak a megfelelı indol-2-karboxamidoknál. Mind az indol, mind a benzimidazol-származékok körében számos in vivo is hatásos vegyület található.

Az

indolgyőrő

bıvítésével

egy

szintén

aktív

vegyületcsaládot,

a

kinurénsavamidokat azonosítottuk (230). Az indol és benzimidazol-2-karboxamidok körében megismert szerkezet-hatás összefüggések a kinurénsavamidok gyors optimalizációját tették lehetıvé. A projekt igazi sikerét az indolgyőrő felnyitásával levezethetı oxálsavdiamidok (183) hozták meg. Az in vivo leghatásosabb molekulák közülük kerültek ki. A vegyületcsalád tagjait hatás-mellékhatás szempontjából egymással összehasonlítva a 185-ös vegyületet választottuk ki klinikai vizsgálatok céljából. Az oxalilcsoport eredményességét követıen elhatároztam,

hogy

más

háromtagú

összekötı

láncot

is

megvizsgálok.

Számos,

gyógyszerszerő molekulát eredményezı háromtagú lánccal kötöttem össze a baloldali aromás győrőt a piperidin nitrogénjével. Ezek közül legaktívabb vegyületcsaládnak a benzoilkarbamidok bizonyultak (274). Dolgozatomban az egyes vegyületcsaládokat, a molekulák egymásra épülését, logikai kapcsolatát érzékeltetve, felfedezésük idırendjében mutatom be. Így a benzilidén-piperidin-származékokat az utolsó fejezetben ismertetem, annak ellenére, hogy szerkezetük alapján az ifenprodil típusú molekulákat leíró korábbi fejezetekhez kapcsolódnak szorosan. Elınyös tulajdonságaikat a projekt végén ismertük fel. A korábban elıállított leghatásosabb molekulák szekunder amin része valamennyi esetben szubsztituált 4benzil-piperidin volt. Ezek benzilidén-piperidin megfelelıi (312, 321) hasonlóan aktívnak bizonyultak, ráadásul jóval nagyobb terápiás ablakkal rendelkeztek. Az indol- és benzimidazol-2-karbonsavak benzilidén-piperidinekkel képezett amidjait hagyományos módon, míg az oxálsavdiamidokat oldatfázisú parallel szintézissel állítottam elı. A nem ifenprodil típusú molekulák kutatását egy korábbi Merck közleményt követıen indítottuk el, melyben NR2B receptoron ható amidinekrıl számoltak be (46, 48) kutatóinak

eredményeit

felhasználva,

korábbi

tapasztalatom

119

(13. ábra). A Merck

alapján

új

típusú,

gyógyszerszerőbb szerkezetet, indol-2-karboxamidineket terveztem (299). A vegyületeket kombinatorikus kémia segítségével állítottam elı. 48

OH

O

Cl

O

N H

O N

N H

Cl

HO

HO

35 (Co 101526) NR2B-IC50 : 319 nM (irodalmi: 170 nM)

65 NR2B-IC50 : 385 nM (irodalmi: 330 nM)

37 NR2B-IC50: 131 nM (irodalmi: 120 nM)

OH

O N H Cl

O

HO

OH

N H

69 NR2B-IC50: 130 nM

O

N

N

O N H

O

82 NR2B-IC50: 18 nM

81 NR2B-IC50: 28 nM

O

HO

N

N H

O

142 NR2B-IC50: 2,2 nM

N H

N H

N H

O

230 NR2B-IC50: 9,1 nM

N O

312 NR2B-IC50: 3,3 nM

H N

N O

O

183 NR2B-IC50: 11 nM

N H

N O

185 (radiprodil) NR2B-IC50: 4 nM

12. ábra. Ifenprodil típusú NR2B szelektív NMDA antagonista hatású vezérmolekulák fejlıdése.

49

O

O

O F

N

274 NR2B-IC50: 24 nM

H N

O

O O

HO

O

N

H N

N HO

HO

HO

N

O

N H

N O

321 NR2B-IC50: 21 nM

NH Richter

CH3O H N

N H

NH

OCH3 Merck

N H

OCH3

N H CF3O

NH2

OCH3

Cl

299 NR2B-IC50: 5,4 nM

46 (Merck) NR2B-Ki: 0,7 nM (irod. adat) NR2B-IC50: 4,2 nM (saját mérés)

48 NR2B- Ki: 5,7 nM (irod. adat)

13. ábra. Nem ifenprodil típusú NR2B szelektív NMDA antagonista hatású vegyületek kutatása.

4.1. Fahéjsavamidok Kutatásunk elején az ismert NR2B altípusszelektív NMDA antagonisták, mint az ifenprodil, CP-101,606 (traxoprodil), Ro-25-6981 (9) bázikus nitrogént tartalmazó 1,4-diszubsztituált piperidin-származékok voltak. OH OH

OH

N

N HO

(1S,2S)

CH3

CH3

HO

ifenprodil

CP-101,606

HO

CH3 N OH

(9) Ro-25-6981

A központi idegrendszer számos receptorának endogén ligandja és a velük szerkezetileg rokon, természetes eredető feniletil-amin-származékok szintén tartalmaznak bázikus nitrogént: V

W

X

NH Z

Y

tiramin

X

Y

V

Z

W

H

OH

H

H

H

H

OH

OH

H

H

OH

OH

H

H

H

efedrin

H

H

OH

CH3

CH3

norefedrin

H

H

OH

CH3

H

adrenalin

OH

OH

OH

H

CH3

noradrenalin

OH

OH

OH

H

H

oktopamin dopamin

50

Ezekkel az aminokkal további szerkezeti hasonlóság is megfigyelhetı. Közös elem a 4hidroxi-feniletil-amin rész is, bár az NMDA antagonisták körében az etil lánc hosszabb is lehet egy metiléncsoporttal (9), vagy egy heteroatommal (12). A szerkezeti hasonlóság eredményeként ezek a vegyületek nemcsak az NMDA receptorhoz kötıdnek, hanem pl. az α1 adrenerg és a szerotonin receptorokhoz. A feniletil szerkezeti elem mellett a biogén aminok bázikus nitrogénjének alapvetı szerepe van a receptorukhoz való kötıdésben. Munkánk kezdetekor tették közzé az University of Oregon, a CoCensys és a Parke-Davis kutatócsoportjai közös munkájukban azt a megfigyelést, miszerint a bázikus nitrogén jelenléte nem feltétele az NMDA receptor antagonizmusnak. Az általuk elıállított 35-ös N-(2feniletil)fahéjsavamid-származék hatásos és NR2B szelektív NMDA antagonistának bizonyult.72 Más receptorokhoz mutatott affinitásáról az irodalom nem közölt adatokat, feltételeztük azonban, hogy ez a bázikus nitrogént nem tartalmazó molekula nem, vagy jóval kisebb mértékben kötıdik a biogén aminok receptoraihoz. Hipotézisünk igazolása céljából megvizsgáltuk a 35-ös fahéjsavszármazékot. Natív NMDA receptorokon végzett funkcionális teszt 319 nM-os

IC50 értéke hasonló moláris hatékonyságot mutatott az irodalmi

rekombináns NR2B receptorokon mért 170 nM-os értékkel. Sejtésünknek megfelelıen a vegyület egyáltalán nem kötıdött az α-1 adrenerg és a szerotonin 5HT2a receptorokhoz. Az eredményeken felbuzdulva újabb fahéjsavamid-származékokat és analogonokat terveztünk és állítottunk elı további szerkezet-hatás összefüggések felderítése érdekében. Az elıállított vegyületek biológiai aktivitását elsısorban NR2B receptorokat expresszáló natív idegsejteket felhasználó funkcionális esszében határoztuk meg, melynek során az NMDA által kiváltott intracelluláris Ca2+ szint növekedésének gátlását mértük. 4.1.1. Tiraminszármazékok Kémiai munkám kiindulópontja a CoCensys 35-ös számú molekulája. Ahogy az ifenprodil esetében, úgy a 35 fahéjsavszármazéknál is egy fenolos hidroxilcsoport szubsztituálja 4-es helyzetben az egyik benzolgyőrőt. Az University of Oregon, a CoCensys, Inc. és a ParkeDavis Pharm. Res. kutatói közös tanulmányukban72 szerkezet-hatás összefüggésben elemezték a molekulát. A fenolos hidroxilcsoport para helyzetbıl meta helyzetbe történı áthelyezése egy nagyságrenddel csökkentette az aktivitást, míg elhagyása a hatás teljes elvesztésével járt. A klóratom és a hidroxilcsoport helyzetének felcserélésével közel azonos hatsú molekulákhoz jutottak (35, 65). A fahéjsavamid mindkét végének hidroxilcsoporttal történı helyettesítése a hatás jelentıs csökkenésével járt (NR2B-IC50 : 21 µM).

51

Cl

OH

H N HO

H N O

O

Cl

35 (Co 101526) NR2B-IC50 : 319 nM (irodalmi: 170 nM)

65 NR2B-IC50 : 385 nM (irodalmi: 330 nM)

Saját méréseink nem mutatták az irodalomban közölt meggyızı különbséget, a továbbiakban új molekulák tervezésekor azért az aktívabb, 35 molekula szerkezetét részesítettem elınyben. A molekula baloldali részét változatlanul hagyva, 4-hidroxi-feniletil-amin, triviális nevén tiraminszármazékokat állítottam elı. Fahéjsavamid helyett vele azonos hosszúságú, heteroatomot is tartalmazó amid- (66) illetve karbamidszármazék (67) teljesen hatástalannak bizonyult. Cl H N HO

Cl H N

O O

H N O

HO

66

67

A tiramin etilén láncának egy oxigén atommal való meghosszabbítása (68) szintén a hatás elvesztésével járt. O O

N H

HO

Cl

68 NR2B-IC50 : 3520 nM

4.1.2. Oktopaminszármazékok A 35 vegyület tiramin részének 1-(4-hidroxi-fenil)-1-hidroxi-etil-aminnal (triviális nevén oktopaminnal) való kicserélése az anyavegyületnél kétszer hatékonyabb vegyületet eredményezett (69). Az α1 és 5-HT2A receptorokhoz nem mutatott affinitást. Ez volt az elsı hatást javító változtatás az anyavegyületen, ezért további alapvetı szerkezetmódosításokkal járó, új molekulák elıállítása mellett a 69 molekula optimalizációját határoztuk el (1. táblázat).

52

1. táblázat. Oktopaminszármazékok flourimetriás módszerrel meghatározott NMDA antagonista hatása patkány kortikális sejteken. OH

X H N O

HO

a b

vegyület

X

NMDA-kiváltott ∆[Ca2+]ia inhibíció (%)b IC50 (nM)

69

4-Cl

130 nM

70

4-H

1220 nM

71

4-F

978 nM

72

4-CH3O

513 nM

73

4-OH

10,1 % 2+

NMDA-kiváltott intracelluláris Ca koncentrációváltozás. Inhibíció (%) a vegyület 0,1 µM koncentrációjánál meghatározva.

A fahéjsav klór szubsztituense valószínőleg optimális, más csoportokra való kicserélése (70, 71, 72) ugyanis a hatás nagymértékő csökkenésével járt. Hidroxilcsoportok egyidejő jelenléte a két benzolgyőrőn (73) az oktopaminszármazékok körében is az aktivitás teljes elvesztését eredményezte. Egy fenolos hidroxilcsoport jelenléte mindenképpen szükséges, hiánya (74) a hatás elvesztését vonta maga után. OH

Cl H N O

74 NR2B-inhibíció: 31,3 %

A 69-es molekula optimalizálása során merész lépésnek tőnt más hidroxilcsoportot is tartalmazó természetes feniletil-amin felhasználása oktopamin analogonok elıállítása céljából, de bízva munkahipotézisünkben, miszerint a biogén aminok acilezésüket követıen elvesztik természetes receptoraik iránti affinitásukat, a hozzáférhetı 4-hidroxi-feniletilaminokat rendre acileztem 4-klór-fahéjsavval. A 4-hidroxi-norefedrinbıl (75), szinefrinbıl (76), adrenalinból (77) és a tirozin metilészterébıl (78) képzett 4-klór-fahéjsavamidok azonban hatástalannak bizonyultak.

53

Cl

OH

H N CH3

HO

OH

N

O

CH3

O

HO

75 NR2B-IC50 : 516 nM OH

76 NR2B-inhibíció.: 68,5 % Cl

Cl H N

N

HO

O

HO

Cl

CH3

HO

CH3O

77 NR2B-IC50 : 4880 nM

O

O

78 NR2B-IC50 : 8860 nM

A 69 anyavegyület benzil-helyzető hidroxilcsoportjának oxidációja ketocsoporttá (79) az aktivitás kismértékő javulását, míg a nagyobb térkitöltéső triazolcsoporttal való kicserélése (80) az aktivitás jelentıs csökkenését eredményezte. N O

HO

N

Cl H N O

N

Cl H N O

HO

79 NR2B-IC50 : 105 nM

80 NR2B-IC50 : 443 nM

A projekt elsı évében (1999) közel 250 vegyületet szintetizáltunk és teszteltünk. A bevezetıben leírt stratégiánk alapján elsısorban bázikus nitrogént nem tartalmazó molekulákat terveztünk. Kisebb mértékben azért a hagyományos ifenprodil struktúrából kiinduló kutatást is folytattunk. Kutatásunk elejét jellemzı merész próbálkozásaink, bár nem eredményeztek az irodalomban leírt fahéjsavszármazéknál hatásosabb molekulát, a tanulási folyamatunk fontos részévé váltak. Egy év elteltével véglegesen elvetettük a bázikus nitrogént tartalmazó

ifenprodil-analogonok

szintézisét.

A

CoCensys

cég

újtípusú,

hatásos

molekulájából (35) kiindulva, szerkezetét módosítva, egy aktívabb vegyületcsaládhoz, oktopaminszármazékokhoz jutottunk. Ekkor számolt be újra az University of Oregon, a CoCensys és a Parke-Davis közös kutatócsoportja a fahéjsavamidok körében végzett munkájuk legfrissebb eredményeirıl.73 Közleményükben részletesen bemutatták

35

vezérmolekulájuk optimalizációját. Az egyik leghatékonyabb molekulának bizonyúló 37 piperidinszármazékuk termékenyítıleg hatott munkánkra.

54

O N HO

37 NR2B-IC50: 131 nM (irodalmi: 120 nM)

Elhatároztuk, hogy feltérképezzük, milyen, az NR2B szelektív NMDA antagonisták körében közkedvelt piperidinektıl eltérı szekunder aminnal képezett fahéjsavamid mutat még kellı hatékonyságot. 4.1.3. Fahéjsavamidok elıállítása Néhány fahéjsavszármazék hagyományos módon történı elıállítása után a kombinatorikus megközelítés mellett döntöttünk. Idıközben ugyanis felmerült a fenolos hidroxilcsoport metabolikusan stabilabb csoportra történı cseréjének szükségessége is. Így a kombinatorikus kémia alkalmazhatóságának feltétele, a minimum két diverzitási pont, adott volt a molekulán (14. ábra). Egyik változó a szekunder amin komponens, másik variálási lehetıség a fenolos hidroxilcsoport helyett, hozzá hasonlóan hidrogénkötés donor sajátságú, NH-elemet tartalmazó különféle csoportok, heterociklusok alkalmazása. Ennek érdekében elıször tíz ilyen, vélhetıen metabolikusan stabilabb szerkezeti részt, többnyire benzolgyőrővel kondenzált heterociklust tartalmazó fahéjsavat szintetizáltam (15. ábra). A fahéjsavakat a megfelelı aldehidbıl kiindulva Knoevenagel-szintézissel állítottam elı. A fahéjsavakkal 24 piperidin és piperazinszármazékot acileztem a peptidkémiában használatos pentafluorfenolos kapcsolási módszer szilárd fázisra adaptált megfelelıjével. A fahéjsavból elıször Argonaut PS-TFP gyanta fenol funkciójával aktív észtert képeztem diizopropil karbodiimid segítségével, majd szőrés, mosás után az aktív észterrel 0,9 ekvivalens szekunder amint acileztem dimetilformamidban. A gyanta kiszőrése után a reakcióelegyben csak a termék maradt. Ha az amin sósavsóként volt hozzáférhetı, a reakcióelegyhez adott, gyantához kötött trimetil-amin hidrokarbonáttal szabadítottam fel a bázist. 24 győrős szekunder amint acileztem ílymódon (16. ábra). A célmolekulák harmadát sikerült izolálni, a kiindulási fahéjsav és a termékek rendkívül rossz oldékonysága miatt. A rosszul oldódó fahéjsavakból nem képzıdött aktív észter, míg a rosszul oldódó termékek a gyantával együtt kiszőrésre kerültek.

55

O A

COOH

O

B

+

C

A

piperidin

COOH

piridin

C

3 óra reflux

F

OH

B

F

H CH2 N C

OH

O Argonaut PS-TFP 1,1 mmol/g

F

F F

DIC, DMAP H CH2 N

F

C

O C CH

O

DMF, DCM , 5 óra szobahõfokon

A CH

O F

F 0,1 mmol

0,09 mmol

HN

R1 R

2

,

HCl x HN

R1 R2

HCO3

O

N(CH3)3

A B

R2

C

DMF, 5 óra szobahõfokon

R1

N

14. ábra. Fahéjsavamidok szilárd fázisú, kombinatorikus kémiai elıállítása . O

O O

OH

O

H N

OH

O N H

N H

O

OH Ac OH

N H

OH

O

N H

O OH

O N H

OH O

O

O

Mez N H

O O

N H

OH

N H

S

N H

O

O O

O S

OH O

O O

OH

N H O

15. ábra. Fahéjsavamidok szilárd fázisú, kombinatorikus kémiai elıállításához felhasznált fahéjsavak.

56

B C

HO

F

CH2

NH

CH2

NH

Cl

Cl

NH

O

NH

CH2 O

NH

NH

OCH3 CH3

CH2

NH

N

NH

N

NH

CH CH CH2

NH

F3C Cl

CH2

NH

N NH N H

CH2

NH

H N

Br

NH N H

CH3 CH3O

CH2

NH

CH3

N

NH

CH3 CH3O

Cl

CH2

N

N

NH

NH

NH

NH CH3O

H CH2 N

CH2

NH

HN CH2

N

NH

F

CH2 CH2

NH

16. ábra. Fahéjsavamidok szilárd fázisú, kombinatorikus kémiai elıállításához felhasznált szekunder aminok.

A biológiailag tesztelt 74 vegyület közül a benzoxazolonnal kondenzált fahéjsavval acilezett 4-benzil-piperidin-származék (81) bizonyult a leghatásosabbnak. O

O O

N

O

N

N H

HO

37 NR2B-IC50: 131 nM

81 NR2B-IC50: 28 nM

4.2. Indol-2-karbonsav-származékok Kutatásunk elsı idıszakára az útkeresés volt jellemzı. A CoCensys elsı publikációi után a fı csapásirányt a bázikus nitrogént nem tartalmazó, savamid jellegő vegyületek irányában határoztuk meg. A fahéjsavamidok körében végzett munkám utólag egy tanulási folyamatként fogható fel. Kisebb-nagyobb lépésekkel próbáltam tágítani az addig ismert farmakofór modell szők kereteit. A fenolos hidroxilcsoport helyett metabolikusan stabilabb hidrogénkötés donor

57

tulajdonságú csoportokkal szubsztituáltam az aromás győrőt. Az NR2B szelektív NMDA antagonistákra addig kizárólag jellemzı 4-fenil-piperidin és 4-benzil-piperidin szekunder aminkomponens helyett más aminokat is felhasználtam. Törekedtem a fahéjsav sztiril részének eliminálására, mivel biológiai rendszerekben potenciálisan elektrofil támadás célpontja lehet. Módosításaimmal nem sikerült kellıképpen eltávolodni a CoCensys 35 és 37 számú fahéjsavamidjaitól. Az elsı hatásos molekulát eredményezı jelentıs változtatás aztán alapvetıen új irányt szabott munkánknak. Feltételeztük, hogy egy újabb hidrogénkötés donor tulajdonságú csoporttal történı

merevítéssel növelhetjük az aktivitást. A fahéjsav α

szénatomja és a benzolgyőrő közé beépített nitrogén 6-hidroxi-2-indolkarboxamidszármazékot eredményezett (82) mely hétszer hatásosabb volt 37 anyavegyületnél.

HO

N H

5 Q

N

4

6 O

7

82 NR2B-IC50: 18 nM

Y

3 W

Z

V 2 X 1

N

A

Vezérmolekulánknak a 82 indol-2-karboxamidot választottuk és elhatároztuk, hogy a molekulát optimalizáljuk, származékok képzésével feltárjuk, milyen kapcsolat van a biológiai aktivitás és az A általános képleten jelölt, következı szerkezeti változtatások között: Hidroxilcsoport helyzete a benzolgyőrőn (4.2.1.). Az X-csoport természete (4.2.2.). A piperidingyőrő szubsztituensének a helyzete (4.2.3.). Az Y összekötı lánc helyzete (4.2.4.). A Z-csoport természete és helyzete (4.2.5.). Az indol pirrolrészének lehetséges helyettesítése más karbo- ill. heterociklusokkal (4.2.6.). Vezérmolekulánkat a farmakológiai szőrırendszerünk 1. lépcsıjében lévı funkcionális NMDA teszt alapján optimalizáltuk. Már a molekulák tervezésekor figyelemmel voltunk a szabadalmaztathatóságra. Az optimalizálás során az in vitro aktivitás növelése mellett a gyógyszerszerőség (Lipinsky szabályok, stb.) és az ADME tulajdonságok (logP, oldhatóság, stb.) javítására is törekedtünk. 4.2.1. Hidroxilcsoport helyzete az indolgyőrőn Elsıként az indolgyőrő hidroxiszubsztituensének szerepét tanulmányoztam. Azt vizsgáltam, hogy a hidroxilcsoport helyének és számának változtatása hogyan befolyásolja a biológiai aktivitást. Az eredmények a 2. táblázatban azt mutatják, hogy a 82 vegyület 5- és 4-hidroxi58

analogonjai (83 és 84) hasonló aktivitással rendelkeznek, míg a 7-hidroxi-analogonnak (85) kisebb az aktivitása. Ez azt jelzi, hogy valószínőleg egynél több hidrogénkötés akceptor csoport van a receptor megfelelı helyein. Feltételezésünket megerısíti az a megfigyelés, miszerint a 4,6-dihidroxi-származéknak (86) nagyobb az aktivitása a monohidroxiszármazékoktól, a vegyület azonos hatású volt a legaktívabb referenciavegyülettel a besonprodillal (28) (3.táblázat). A 85 vegyület hatásának a csökkenése a 82-84 vegyületekhez képest, valamint a 87 vegyület kisebb aktivitása a 86-os vegyülethez képest a 7-es helyzető hidroxilcsoport gyenge kölcsönhatását tükrözi a receptorral. Ennek oka valószínőleg az, hogy ez a hidroxilcsoport nem a receptorral, hanem az indol NH-csoportjával létesít intramolekuláris hidrogénkötést. 2. táblázat. Hidroxilcsoportok helyének és számának hatása a biológiai aktivitásra, funkcionális és kötıdési tesztadatok alapján. Q N H

a

N O

n

[3H]Ro-25,6981 kötıdés IC50 ± S.E.M. (nM)

n

vegyület

Q

NMDA-kiváltott ∆ [Ca2+]ia IC50 ± S.E.M. (nM)

82

6-OH

18 ± 4

13

12±2

4

83

5-OH

25 ± 8

3

31±10

3

84

4-OH

16 ± 2

8

18±5

4

85

7-OH

165 ± 30

4

380±141

3

86

4,6-di-OH

6,5 ± 0,7

3

6±1

3

87

5,7-di-OH

31 ± 3

3

106±19

3

2+

NMDA-kiváltott intracelluláris Ca koncentrációváltozás patkány kortikális sejteken meghatározva.

3. táblázat. Referenciavegyületek in vitro biológiai adatai.

n

[3H]Ro-25,6981 kötıdés IC50 ± S.E.M. (nM)

n

41 ± 5

7

7±1

6

28 (besonprodil)

6,6 ± 1,2

3

4±1

3

9 (Ro-256981)

159 ± 29

3

6±1

3

37

131 ± 10

2

196 ± 43

3

NMDA-kiváltott ∆[Ca2+]ia IC50 ± S.E.M. (nM)

CP-101,606

referenciavegyületek

a

NMDA-kiváltott intracelluláris Ca2+ koncentrációváltozás patkány kortikális sejteken meghatározva.

59

4.2.2. Az X-csoport természete Megvizsgáltam

a

82

molekula

karbonsavamid

funkciójának

szerepét.

Cseréje

karbonsavamidinre aktívabb analogont (88) eredményezett, míg a CO-csoport cseréje CH2vagy SO2-csoportra (89 és 90) a hatás elvesztésével járt (4. táblázat). 4. táblázat. A 82 molekula különbözı X-csoportot tartalmazó származékainak funkcionális és kötıdési tesztadatai.

HO

N H

X

N

n

[3H]Ro-25,6981 kötıdés IC50 (nM)

n

vegyület

X


88

C=NH

8,5 ± 1,7

5

10

2

89

CH2

1158 ± 231

3

N.D.

-

90

SO2

> 8000

1

N.D.

-

a

2+


4.2.3. A piperidingyőrő szubsztituensének helyzete A benzilcsoport piperidingyőrőn való helyzetének szerepét a 4-metoxi-benzil-származékok esetében tanulmányoztam (91-93). Ebben az esetben mind a 3-as (92) mind a 2-es helyzet (93) szubsztitúciója a hatás alapvetı csökkenésével járt (5. táblázat). 5. táblázat. A 82 molekula piperidingyőrőjén lévı benzilcsoport helyzetének in vitro biológiai hatása funkcionális és kötıdési tesztadatok alapján. OMe

4 HO

.

N H

N O

3 2

n


n

vegyület

szubsztitúció


91

4-(4-MeO)Bn

80 ± 14

3

17

2

92

3-(4-MeO)Bn

2206 ± 406

7

N.D.

-

93

2-(4-MeO)Bn

> 8000 ± 2

2

N.D.

-

a

2+


60

4.2.4. Az Y összekötı lánc helyzete A 82 molekula másik érzékeny pontja a terminális benzolgyőrőt és a piperidingyőrő 4-es helyzető

szénatomját

összekötı

lánc.

A

metiléncsoport

elhagyása

(94)

és

egy

metiléncsoporttal való megnyújtása (95) kevésbé aktív vegyületeket eredményezett. A hatás hasonló csökkenése figyelhetı meg, amikor a CH2-csoportot CO-, CHOH- vagy NHcsoportra cseréljük (99-101). Meglepı módon a benziloxi-piperidin- és a fenoximetilpiperidin-származékok aktivitása (97 és 98) közelebb áll a 82 vegyület aktivitásához, mint a geometriailag hozzá hasonlóbb 95 feniletil-piperidin-származékéhoz (6.táblázat). Ez egy nyilvánvalóan új példája a Friedman paradoxonnak.96 6. táblázat. A 82 molekula különbözı Y-csoportot tartalmazó származékainak in vitro biológiai hatása funkcionális és kötıdési tesztadatok alapján. Y HO

N

N H

O

n


n

vegyület

Y


94

-

> 8000 ± 2

2

N.D.

-

95

CH2CH2

875 ± 187

5

359 ± 93

3

96

O

107 ± 27

3

89

2

97

OCH2

16 ± 3

9

47 ± 4

3

98

CH2O

36 ± 6

7

19 ± 2

3

99

CO

744 ± 131

4

N.D.

-

100

CHOH

111 ± 23

4

60

2

101

NH

348 ± 75

6

1084

2

a

2+


4.2.5. A Z-csoport természete és helyzete A 82 molekula benzil-piperidin részének benzolgyőréjét helyettesítı csoportok minıségének és helyzetének aktivitásra gyakorolt hatását a 7. táblázatban foglalom össze. Az elıállított néhány származék (102-105) kisebb aktivitással rendelkezik a kiindulási 82 anyavegyülethez képest.

61

7. táblázat. A 82 molekula különbözı Z-csoportot tartalmazó származékainak in vitro biológiai hatása funkcionális és kötıdési tesztadatok alapján.

HO

N H

N

Z 4

2 3

O

n


n

vegyület

Z


102

4-F

90 ± 15

6

12 ± 3

3

103

4-Me

208 ± 34

3

28

2

104

2-MeO

249 ± 55

3

N.D.

-

105

3-F

38 ± 8

6

31

1

a

2+


4.2.6. Indol-2-karbonsav-származékok elıállítása A 82-85, 91-105 monohidroxiszármazékokat a megfelelı indol-2-karbonsavakból (106-109) és piperidinszármazékokból állítottam elı egy ma már gyakori amid kapcsolási reakciót felhasználva.97 A

kapcsolási reakcióban karbonsavból 2-(1H-benztriazol-1-il)-1,1,3,3-

tetrametilurónium-hexafluorofoszfáttal (HBTU) és trietil-aminnal képzett aktív észter szerepel acilezı ágensként (17. ábra).

Y

Z Y i

Q N H

OH +

HN

N H

O 106 107 108 109

Q

82, 91-105 83 84 85

Q = 6-OH Q = 5-OH Q = 4-OH Q = 7-OH

Z

N O Q = 6-OH Q = 5-OH Q = 4-OH Q = 7-OH

(t.82: 71 %) (t.: 31 %) (t.: 90 %) (t.: 25 %)

17. ábra. Monohidroxiszármazékok elıállítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) HBTU, Et3N, DMF, 0°C - szobahımérséklet, 16 óra.

A kereskedelmi forgalomban nem lévı és az irodalomban sem ismertetett indol-2karbonsavak egy részének metilésztereit (114, 115) Hemetsberger-Knittel szerint állítottam elı.98 A 86 és 87 dihidroxiszármazékokhoz a megfelelı dibenziloxiszármazékok (116 és 117) katalitikus hidrogenolízisével jutottam (18. ábra).

62

O CHO

i

Q

OCH3

Q

ii

N3

110 Q = 2,4-di-BnO 111 Q = 3,5-di-BnO

N H

N H 116 86 117 87

v v

OCH3 O

114 Q = 4,6-di-BnO (t.: 63 %) 115 Q = 5,7-di-BnO (t.: 27 %)

112 Q = 2,4-di-BnO (t.: 38 %) 113 Q = 3,5-di-BnO (t.: 70 %)

Q

iii, iv

Q

N O Q = 4,6-di-BnO (t.: 43 %) Q = 4,6-di-OH (t.: 60 %) Q = 5,7-di-BnO Q = 5,7-di-OH (t.: 21 %)

18. ábra. Dihidroxiszármazékok elıállítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) metil-azidoacetát, NaOMe, MeOH, 0°C, 4 óra (ii) forralás xilolban; (iii) KOSi(CH3)3, THF, reflux, 1 óra; (iv) 4-benzil-piperidin, HBTU, Et3N, DMF, 0°C - szobahımérséklet, 16 óra; (v) H2, 10 % Pd/C, MeOH, szobahımérséklet.

A 88 amidint 6-benziloxi-1H-indol-2-karbonsavból (118) kiindulva nitrilen (119) keresztül Pinner reakcióban99 alakítottam ki (19. ábra).

N H

BnO

iii, iv

i, ii

OH

BnO

O

N H

HO

CN

N H

119 (t.: 57 %)

118

N NH 88 (t.: 4,5 %)

19. ábra. 88 karbonsavamidin elıállítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) 1. SOCl2, CHCl3, reflux, 1 óra; 2. NH3; (ii) POCl3 CHCl3, reflux, 2 óra; (iii) HCl, MeOH, 5 óra; (iv) 4-benzil-piperidin.

A 89 vegyületet 82 karbonsavamid lítium-alumíniumhidrides redukciójával állítottam elı (20. ábra). i HO

N H

N

HO

O

82

N H

N

89 (t.: 15 %)

20. ábra. 89 származék elıállítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) LiAlH4, THF, szobahımérséklet, 1óra.

90 szulfonamid elıállításakor 6-benziloxi-1H-indolból (120) indultam ki. Többlépéses reakciót egy edényben végrehajtva alakítottam ki 121 szulfonsav-kloridot. Az amidképzés után a benzil védıcsoport hidrogenolízissel történı eltávolítása eredményezte 90 célvegyületet (21. ábra).

63

i, ii BnO

iii, iv BnO

N H 120

N H

S O

Cl

HO

O

121 (ti.: 99 %) (tii+iii.:17 %)

S

N

N H

O

90

(tiv.:12 %)

O

21. ábra. 90 származék elıállítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) t-Boc2O, DMAP, CH2Cl2, szobahımérséklet, 2óra; (ii) 1. n-BuLi, SO2, THF, -70°C - szobahımérséklet; 2. NCS, CH2Cl2, 5°C; (iii) 4-benzil-piperidin, szobahımérséklet, 24 óra; (iv) H2, 10 % Pd/C, MeOH, szobahımérséklet.

A

szintézisek

során

felhasznált

piperidinszármazékok

kereskedelmi

forgalomban

beszerezhetıek vagy az irodalomból ismert eljárás szerint elıállíthatók. 4-fenoxipiperidineket 4-klór-piridinbıl és fenolokból képzett 4-fenoxi-piridin-származékok két lépésben történı telítésével állítottam elı (22. ábra).100 Cl OH

O

(i)

+

N

N

Y 122

123

N

Y

Br

124 tY = H.:79 %

O

(iii) N 126

O

(ii)

Y 125 tY = H.:99 %

O

(iv) HN

Y

Y 127

tY = H.:69 %

tY = H.:99 %

22. ábra . 4-fenoxi-piperidinek elıállítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) kat. 1-(4-piridil)piridiniumklorid hidroklorid, 220 oC, 6 óra; (ii) benzil-bromid, dietil éter, 20 oC, 48 óra; (iii) NaBH4, EtOH; (iv) H2, 10% Pd/C, MeOH, szobahımérséklet.

Fenoximetil-piperidineket etil-izonipekotátból kiindulva ismert módszer alapján állítottam elı (23. ábra).101 A nitrogén védése után az észtercsoportot litium-alumíniumhidriddel a megfelelı alkohollá redukáltam. Az alkoholból metánszulfonil-kloriddal mezilátot képeztem, mellyel ekvivalens nátrium-hidroxiddal deprotonált fenolokat O-alkileztem. A Boc védıcsoportot sósavas etilacetáttal távolítottam el. Y

COOEt (i) (ii) (iii) N H 128

OMez (iv) Boc

N

129

O Boc

(v)

O HN

N

130

ti.: 94 %, tii.: 78 %, t iii.: 93 %

Y

131 Y = F : tiv, v.: 78 %

23. ábra. 4-fenoximetil-piperidinek elıllítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) Boc2O, EtOAc, 22 óra, 0 oC - szobahımérséklet; (ii) LiAlH4, THF, 0 oC - szobahımérséklet; (iii) MezCl, Et3N, CH2Cl2, 0 oC – szobahımérséklet; (iv) szubsztituált fenolok, NaOH, DMF, 2 óra reflux; (v) 1. 10% HCl/EtOAc, 18 óra, 2. NaHCO3.

64

4-benziloxi-piperidineket N-Boc-4-piperidinol102 O-benzilezésével állítottam elı (24. ábra.). Y OH Boc

O

(i)

N

Boc 132

Y O

(ii)

N

HN 133

134 (Y = H : t.: 36 %)

(Y = H : t.: 58 %)

24. ábra. 4-benziloxi-piperidinek elıállítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) NaH, DMF, benzilkloridok, 2 óra, szobahımérséklet; (ii) 1. 30% TFA - CH2Cl2, 1 óra szobahımérséklet, 2. NaHCO3.

4-benzoil-piperidint egy új, eddig nem publikált eljárással állítottam elı. Nitrogénen nem védett etil-izonipekotátot Grignard reakcióban ekvivalens fenil-magnézium-bromiddal reagáltatva jó termeléssel 4-benzoil-piperidint eredményezett. A piperidin nitrogénjének Boccsoporttal történı védelme után a karbonilcsoport nátrium-borohidrides redukciójával, majd a védıcsoport eltávolításával a megfelelı alkoholhoz jutottam (25. ábra). O

O OEt

(i)

(ii) (iii) (iv) HN

HN 128

OH

HN 135 ( t.: 70 %)

136 ( tii, iii, iv.: 54 %)

25. ábra. 4-benzoil-piperidin elıállítása és redukciója. Reagensek és reakciókörülmények: (i) PhMgBr, THF, 1óra reflux; (ii) Boc2O, Et3N, dioxán-víz, 18 óra, szobahımérséklet; (iii) NaBH4, MeOH, 18 óra, szobahımérséklet; (iv) ) 1. 10% HCl/EtOAc, 18 óra, 2. NaHCO3.

2-, 3- és 4-(szubsztituált-benzil)piperidineket egy új és hatékony eljárás szerint állították elı mőegyetemi partnereink.103 4.3. Benzimidazol-2-karbonsav-származékok 4.3.1. Az indol pirrolrészének helyettesítése más karbo-, illetve heterociklusokkal A továbbiak során a 82 molekula NH-csoportjának fontosságát mértük fel. Az N-Me analogon (137) inaktív volt. Kutatótársaimmal benztiazol, benzofurán és benztiofén analogonokat állítottunk elı. A megfelelı benzofurán (138) és benztiazol (139) származékoknak szintén gyenge volt az aktivitásuk. Az 5-hidroxi-benzofurán izomer (141) és az 5-hidroxi-benztiofénszármazék (140) hasonlóan inaktívnak bizonyultak. Az eredmények azt jelzik, hogy a 82 vegyület NH-csoportjának fontos szerepe van a receptorral való kölcsönhatásban. Ezt a megfigyelést támasztja alá az a tény, hogy a 142 benzimidazol-2-karboxamid szintén hatásos

65

vegyület. Egy nitrogénatom beépítése a 82 molekulába kilencszeres aktivitásnövekedéssel az egyik leghatásosabb NR2B szelektív NMDA antagonistát eredményezte (142) (8. táblázat). 8. táblázat. Az indol pirrolrészének helyettesítése különbözı V- és W-csoportokkal. 4 5

W

HO 6

vegyület szubsztituens

a

142

N

V 7

O

V

W


n


n

137

6-OH

NMe

CH

5773 ± 958

4

N.D.

-

138

6-OH

O

CH

6920 ± 1280

4

>10000

1

139

6-OH

S

N

2597 ± 369

3

N.D.

-

140

5-OH

S

CH

5613 ± 1066

5

>10000

1

141

5-OH

O

CH

1901 ± 295

5

>10000

1

142

5(6)-OH

NH

N

2,2 ± 0,4

7

4

2

2+


benzimidazol-származékot,

mivel

funkcionális

teszteredménye

csaknem

egy

nagyságrenddel jobb volt mint a 82 anyavegyületé, új vezérmolekulává választottuk és megkezdtük a molekula optimalizálását. 4.3.2. Benzimidazol-2-karboxamidok optimalizációja A benzimidazol és indolgyőrők szerkezeti hasonlósága miatt remélhettük, hogy a molekula többi részére érvényesek lesznek az indolszármazékoknál megfigyelt szerkezet-hatás összefüggések. Néhány benzimidazol analogon elıállítása és tesztelése után feltételezésünk igazolódott, a két heterociklus az NR2B receptoron bioizosztér párként viselkedik, ráadásul a legtöbb esetben érvényesült a 142 és 82 vegyületpárnál megfigyelhetı egy nagyságrendbeli in vitro aktivitásbeli különbség a benzimidazol-származékok javára. Ezek után elsısorban a hatásos indolszármazékok benzimidazol megfelelıjét állítottam elı, jelentısen lecsökkentve az optimalizáció idejét. Az elıállított és tesztelt vegyületek közül néhányat a 9. táblázatban mutatok be. A 4(7)-hidroxi-izomer (143) azonos hatású a 142 vezérmolekulával. Az OHcsoport cseréje NH2-csoporttal kevésbé aktív analogont eredményezett (144). A megfelelı mezilamino-származék (145) egy kicsit hatásosabb a 142 anyavegyületnél. A 142 molekulában az OH helyettesítése egy a benzimidazollal kondenzált oxazolinongyőrő NH-

66

csoportjával (146 és 147) kevésbé aktív vegyületekhez vezetett. Érdekes módon az Y- és Zcsoportok módosításának (148-153) nem volt alapvetıen hatása a vegyületek aktivitására. 9. táblázat. Benzimidazol-2-karboxamidok in vitro biológiai adatai. 4 5 Q 6

7

N H

Z

N O

n


n

vegyület

Q

Y

Z


143

4(7)-OH

CH2

H

3,0 ± 0,4

4

10 ± 4

3

144

5(6)-NH2

CH2

H

40 ± 10

3

143

2

145

5(6)-MezNH

CH2

H

1,3 ± 0,2

4

3

2

146

H

CH2

H

193 ± 42

11

N.D.

-

CH2

H

328 ± 70

3

N.D.

-

5,6(6,5)- O

N O

O

147

4,5(6,7)-

a

Y

N

H N

O

148

5(6)-OH

CH2

4-F

1,2 ± 0,3

5

4

2

149

5(6)-OH

CH2

3-Me

2,4 ± 0,5

6

5

2

150

5(6)-OH

CH2

3-MeO

2,5 ± 0,6

3

3

1

151

5(6)-OH

O

4-Me

1,1 ± 0,2

4

3

2

152

5(6)-OH

O

4-Cl

1,7 ± 0,4

6

14

2

153

5(6)-OH

O

4-F

2,9 ± 0,6

3

6

2

2+


4.3.3.

Benzimidazol-2-karbonsav-származékok elıállítása

A 162, 138, 139, 163, 141 és 164 vegyületeket a megfelelı heterobiciklusos karbonsavakból (155, 156, 158, 159, 160 és 161) és 4-benzil-piperidinbı l állítottam elı HBTU kapcsolószert felhasználva. A termékek egy részét továbbalakítottam. 137 és 140 hidroxiszármazékok kialakítása érdekében 162 vegyületet debenzileztem, 163 metoxiszármazékot demetileztem. A 145 5(6)-mezilamino-származékot 164 5(6)-nitro-1H-benzimidazol-2-karboxamidból 144

5(6)-amino-származékon keresztül állítottam elı (26. ábra).

67

HN

W

R2

HBTU, Et3N, DMF

OR3

V

W

R2

N

V

O

O

154 R2 = 6-BnO

i, ii

iii, iv, v

162 R2 = 6-BnO

155 R2 = 6-BnO

W1= CH R3 = Me vi V1= MeN W1= CH R3 = H (t.: 51 %)

137 R2 = 6-OH

156 R2 = 6-OH

V1= O

W1= CH R3 = H

138 R2 = 6-OH

V1= MeN W1= CH (t.: 40 %) V1= MeN W1= CH (t.: 45 %) V1= O W1= CH (t.: 55 %)

157 R2 = 6-MeO

V1= S

W1= N

R3 = H

139 R2 = 6-OH

V1= S

W1= N

158 R2 = 6-OH

V1= S

W1= N

R3 = H (t.: 23 %)

163 R2 = 5-MeO

V1= S

159 R2 = 5-MeO

V1= S

W1= CH R3 = H

140 R2 = 5-OH

V1= S

W1= CH (t.: 58 %) W1= CH (t.: 94 %)

W1= CH R3 = H

141 R2 = 5-OH

V1= O

W1= CH (t.: 49 %)

W1= N

164 R2 = 5,(6)-NO2

V1= NH

W1= N

144 R2 = 5,(6)-NH2

V1= NH

W1= N

145 R2 = 5,(6)-MezNH V1= NH

W1= N

V1= NH

160 R2 = 5-OH V1= O 161 R2 = 5,(6)-NO2 V1= NH

R3 = H

iv

vii viii

(t.: 51 %)

(t.: 46 %) (t.: 40 %) (t.: 54 %)

26. ábra. Reagensek és reakciókörülmények: (i) MeI, KOtBu, DMF, szobahımérséklet, 24 óra; (ii) KOSi(CH3)3, THF, reflux, 1 óra; (iii) SOCl2, MeOH, 0°C - szobahımérséklet, 10 óra; (iv) BBr3, CH2Cl2, -15°C - szobahımérséklet, 10 óra; (v) KOH, MeOH, reflux 1 óra; (vi) 33 % HBr-AcOH, 10 perc; (vii) H2, 10 % Pd/C, MeOH, szobahımérséklet; (viii) MezCl, piridin, CH2Cl2, szobahımérséklet, 5 óra.

5(6)-hidroxi-1H-benzimidazol- és 4(7)-hidroxi-benzimidazol-2-karbonsavakat (173 és 174) irodalmi elızmények alapján mőegyetemi partnereink által kidolgozott eljárás szerint állítottam elı (27. ábra).104 NO2 R1

i

NO2

NH2

NH2

ii, iii

R1 NH O

C

iv

R1

N

R1 N H

NH C

O

O

OEt

C

nBu

165 R1 = 4-MeO

167 R1 = 4-MeO (t.: 96 %)

166 R1 = 3-BnO

168 R1 = 3-BnO (t.: 20 %)

C

O

NHnBu O

NH

169 R1 = 4-MeO (t.: 83 %) 170 R1 = 3-OH (t.: 80 %)

171 R1 = 5(6)-MeO (t.: 69 %) 172 R1 = 4(7)-OH (t.: 84 %)

Y Z

HN

v

, HBTU, Et3N

N

R1 N H

OH

R1

N

N H

O

Y

N

Z

O R1 = 5 (6)-OH (t.: 28 - 57 %) 143 R1 = 4 (7)-OH (t.: 28 %)

142, 148-153

173 R1 = 5(6)-OH (t.: 76 %) 174 R1 = 4(7)-OH (t.: 73 %)

27. ábra. Reagensek és reakciókörülmények: (i) ClCOCOOEt, Et3N, CH2Cl2, 0°C - szobahımérséklet; (ii) nBuNH2, toluol, szobahımérséklet, 10 óra; (iii) H2, 10 % Pd/C, MeOH, szobahımérséklet; (iv) 240°C, 10 perc (v) 48 % HBr, reflux, 48 óra.

68

Az piperidinszármazékokat 173 és 174 savakkal acilezve 142, 143 és 148-153 hidroxibenzimidazol-2-karboxamidokhoz jutottam. A kapcsolási reakcióban HBTU-t alkalmaztam (27. ábra). 146 heterociklusos karbonsavamidot a 25. ábrán bemutatott benzimidazolszintézishez hasonló módon állítottam elı 178 anilinszármazékból és 176 savkloridból. Ez utóbbiakat 6-aminobenzoxazolinonból (177) és 4-benzil-piperidinbı l (175) alakítottam ki (28. ábra). O HN

Cl

i, ii, iii

N O 176 (t.: 92 %)

175 H N

H N

iv

O O

v

NO2

O O

NH2

NH2 178 (t.: 78 %)

177 H N

NO2

vi, vii

O

O O

H N O

N

N H

N

O

N

N H

O

O 179 (t.: 46 %)

146 (t.: 5,7 %)

28. ábra. Reagensek és reakciókörülmények: (i) ClCOCOOEt, DIPEA, CH2Cl2, 0°C; (ii) 1.KOH, MeOH, szobahımérséklet; 2. HCl; (iii) SOCl2, reflux, 2 óra; (iv) NaNO3, TFA, szobahımérséklet; (v) CHCl3, Et3N, szobahımérséklet; (vi) H2, 10 % Pd/C, MeOH, szobahımérséklet; (vii) 240°C, 10 perc.

147

heterociklusos

karbonsavamid

elıállításakor

5(6)-hidroxi-1H-benzimidazol-2-

karbonsavból (173) indultam ki. A 4(7) helyzetben történı nitrálás és 4-benzil-piperidinnel való kapcsolás 182 karbonsavamidot eredményezte. A nitrocsoport redukcióját követı karbonildiimidazolos győrőzárás vezetett a kívánt végtermékhez (29. ábra). NO2

NO2 HO

HO

N N H

OH

HO

N

i N H

O

OH

N

ii N H

O 181 (t.: 65 %)

O 180 (t.: 68 %)

173

iii N

O NH2

NH

HO

O

N N H

N

iv N

N H

N

O 147 (t.: 93 %)

O 182 (t.: 54 %)

29. ábra. Reagensek és reakciókörülmények: (i) NaNO3, TFA, szobahımérséklet; (ii) 4-benzil-piperidin, HBTU, Et3N, DMF; (iii) H2, 10 % Pd/C, THF, szobahımérséklet; (iv) 1,1’-karbonildiimidazol, THF, szobahımérséklet.

69

4.3.4. Indol- és benzimidazol-származékok in vivo aktivitása

Indol-2-karboxamidok közül az in vitro kevésbé aktív 102 (IC50: 90 nM), benzimidazol-2karboxamidok

közül

a

142

szubsztituálatlan

származék

rendelkezett

kiemelkedı

farmakokinetikai tulajdonságokkal és in vivo aktivitással (10. táblázat). 10. táblázat. Kiemelkedıen hatásos indol-és benzimidazol-származékok farmakokinetikai, metabolikus stabilitási és egér formalin neuropátiás fájdalomteszt adatai. i.v. T1/2 [óra]

BA

vegyület

IVM FM%

egér formalin teszt p.o. ED50 [mg/kg]

%

humán µS

patkány µS

102

1,4

27

99

92

19

142

0,78

32

88

94

6

referenciavegyületek CI-1041 (28)

1,1

67

-

-

5,3

Co-101244 (12)

0,5

4,5

-

-

> 20 *

CP-101,606

0,3

2,4

-

-

>20 *

Rövidítések: i.v.T1/2: intravénás féléletidı; IVM FM%: in vitro metabolizmus, becsült maximális felszívódás; µS: mikroszóma *: ED50 értéket nem határoztunk meg, ha a gátlás 20 mg/kg, p.o. dózisban 50%-nál kisebb volt.

Féléletidejük (T1/2) és biohasznosulásuk (BA) a referenciavegyületekkel összehasonlítva kielégítı. Metabolikusan stabil vegyületek (FM). Egér formalin neuropátiás fájdalomteszten per os aktívak. 102 a mechanikai allodíniát per os 10 mg/kg dózisban hasonló mértékben fordította vissza, mint a CP-101606 referenciavegyület, Seltzer hiperalgézia modellben is hatékony (MED = 5 mg/kg i.p.). 142 a mechanikai allodíniát i.p. 10 mg/kg dózisban teljesen visszafordította, per os azonban sokkal kevésbé hatásos. Gyulladásos hiperalgézia modellben a 102, míg termális allodínia modellben a 142 hatásosabb. Mindkét vegyület továbbjutott a tesztrendszerünk negyedik szakaszába, ahol a toxikológiai vizsgálatok is eredményesen zárultak. Ennek ellenére a molekulák nem kerültek fejlesztésre, idıközben ugyanis további szerkezetmódosítással egy új, ígéretes vezérmolekulához jutottunk. Az

indol és benzimidazol-származékok körében elért eredményeinket szabadalmi

bejelentésben105 védtük és három közleményben106-108 ismertettük.

70

4.4. Oxálsavdiamidok 4.4.1. Eredmények, szerkezet-hatás összefüggések

Eddigi

kutatásunk

során

N-acilezett

4-benzil-piperidin-származékokkal,

indol

és

benzimidazol-2-karboxamidokkal sikerült bizonyítanunk hipotézisünk helyességét, miszerint bázikus nitrogén jelenléte nem alapfeltétele az aktivitásnak. Megállapítottuk továbbá, hogy az indol és benzimidazolgyőrő szubsztituálatlan NH-csoportja fontos a hatás szempontjából. Új szerkezetek tervezésekor olyan módosításokat hajtottunk végre, amelyek nem érintik ezeket a farmakofór jellemzıket. Egyik ilyen szerkezeti módosítás eredménye az 183 oxálsavdiamidszármazék lett, mely kétszer olyan hatásos volt, mint a 83 indolszármazék, mind a natív patkány idegsejteken mért funkcionális, mind a kötıdési teszten. HO

HO N H

O

N

N H

O

83 NR2B-IC50: 25 nM [3H]Ro-25,6981-IC50: 31 nM

N O

183 NR2B-IC50: 11 nM [3H]Ro-25,6981-IC50: 16 nM

Elhatároztuk, hogy a fenolos hidroxilcsoportot, kedvezıtlen metabolikus tulajdonságai miatt legalább egy NH-csoportot tartalmazó kondenzált heterociklussal helyettesítjük, ezzel pótolva a hidroxilcsoport hidrogénkötés donor sajátságát. Célunk volt továbbá a piperidin 4-es helyzetét a jobboldali benzolgyőrővel összekötı lánc és a benzolgyőrő szubsztitúciójának optimalizálása.

Reprezentatív

oxamidszármazékok

(183-188),

valamint

a

referenciavegyületek biológiai adatait az 11. táblázat tartalmazza. Az elıállított vegyületek biológiai aktivitását [3H]Ro-25,6981 kötıdési tesztben és a rekombináns NR1/NR2B receptorokat expresszáló sejteket felhasználó funkcionális esszében határoztuk meg, melynek során az NMDA által kiváltott intracelluláris Ca2+ szint növekedésének gátlását mértük. Szelektivitásukat az NR1/NR2A alegységeket tartalmazó NMDA rceptorokhoz képest ugyanebben a funkcionális esszében határoztuk meg, rekombináns NR1/NR2A receptorokat expresszáló sejteket használva. In vivo analgetikus hatást a hosszantartó fájdalmat modellezı egér formalin tesztben mértük.

71

11. táblázat. Referenciavegyületek és néhány reprezentatív oxálsavdiamid-származék (183-188) kötıdési és funkcionális tesztjeinek eredményei valamint in vivo aktivitási adatai. X

O Q

Q

vegyület

X

N H

Y

83

N

Y

O

oldékonyság [µg/ml]

[3H]Ro25,6981 kötıdésa IC50 (nM)

NMDAkiváltott ∆[Ca2+]ia,b IC50 (nM)

NR1/NR2Aa inhibícióc (%)

egér formalin teszt, p.o. ED50 (mg/kg)

156

31±10

42±13

18

1,4

HO

CH2

H

-

16±2

31±6

20

9,4

CH2

H

13

8±2

3±1

9

0,9

CH2

F

15,2

6±1

4±1

5

7,7

CH2

H

12

4±1

6±1

-1

14

CH2

H

26,5

17±4

9±2

17

0,4

CH2

CH3

23,3

54±6

15±2

7

0,5

Ro-25,6981 (9)

6±1

57±5

1

p.o. inaktív 5,1 (i.p.)

Co-101,244 (12)

4±1

5±1

-8,7

p.o. inaktív 5,9 (i.p.)

EMD 95885 (8)

8±1

48

0,1

3,7

CP-101,606

7±1

30±4

2,5

>20 (s.c és p.o.)

4±1

8±1

21,0

2,4

183 184

H N O O

185d

H N O O

186

H N O N H

187

H N O S

188

H N O

CI-1041(28) a

3

Átlagértékek ± szórás. A kísérletek száma [ H]Ro-25,6981 kötıdési teszt esetében 3-4, NR1/NR2B funkcionális teszt esetében 4-5, NR1/NR2A esetében 1-2. b NMDA-kiváltott intracelluláris Ca2+ koncentrációváltozás rekombináns NR1/NR2B receptorokat expresszáló sejteken meghatározva. c Inhibíció (%) a vegyület 15 µM koncentrációjánál meghatározva. d Klinikai fejlesztésre kiemelt vegyület.

A fenolos hidroxilcsoport helyére a versenytársak által is alkalmazott heterociklusokat beépítve rendkívől aktív és szelektív benzoxazolon (184, 185), benzimidazolon (186), benztiazolon- (187) és indanon- (188) származékokat sikerült elıállítani. Ezek a vegyületek in vitro és in vivo is felülmúlják az anyavegyületek (83, 183) és a referenciavegyületek

aktivitását. A sikereken felbuzdulva folytattuk az oxálsavdiamidok körében végzett kémiai munkát, hiszen egyrészt a tesztrenszerben elırehaladva számos vizsgálatnál elbukhattak még ezek az igen aktív vegyületek is, másrészt közepes farmakokinetikai paramétereik javításától

72

in vivo még hatásosabb származékokat reméltünk. Iparjogvédelmi szempontból is kívánatos

volt minél többféle származék elıállítása. A vegyületcsalád kutatásába bekapcsolódva két irányba indultam el. Egyik kitőzött célom a versenytársak által még nem alkalmazott, egyéb területen is ritkán elı forduló, de azért gyógyszerszerő heterociklusokkal kondenzált anilinek, majd ezekbı l oxálsavdiamidok elıállítása volt. Másik célom az indolszármazékoknál szerzett pozitív tapasztalatok alapján a 4-benzil-piperidin helyett olyan analogonok elıállítása amelyben a piperidint és a benzolgyőrőt összekötı lánc oxigént vagy kenet tartalmaz. Elsıként ez utóbbi területen elért eredményeimet foglalom össze. Mivel a leghatásosabb molekulák általában benzoxazolon győrőrendszert tartalmaznak, ezért a 12. táblázatban csak a benzoxazolon-származékok natív idegsejteken mért funkcionális teszteredményeit mutatom be. 12. táblázat : A piperidin 4-es helyzetében oxigén- és kéntartalmú összekötı láncot tartalmazó benzoxazolonszármazékok (189-199) NMDA antagonista hatása patkány kortikális sejteken. H N O

vegyület

189

190

191

R1

O

O

N

N H

192

R2

O

193

194

195

196

197

198

199

F

Cl O

1

R N

R2

NMDA-kiváltott ∆[Ca2+]ia inhib. %b IC50 (nM) a b

O

S

O

O

S

S

O

S

O S

O

O

O

O

N

7

N

3,9

N

85

N

N

11

9

N

9,9

N

11,7 %

N

N

26

12

O

S

N

220

N

25,7 %

NMDA-kiváltott intracelluláris Ca2+ koncentrációváltozás. Inhibíció (%) a vegyület 0,1 µM koncentrációjánál meghatározva.

Érdekes módon az oxigéntartalmú összekötı lánc hosszára az aktivitás nem igazán érzékeny. A lánc egy-egy metiléncsoporttal történı hosszabbítása az aktivitás kismértékő csökkenését idézi csak elı (189, 192, 197). A háromtagú összekötı lánc esetében már az oxigén láncon belül elfoglalt helyzete is meghatározó. A 197, melyben az oxigénatom a piperidinhez közelebb van, kétszer aktívabb mint a 196. A kénanalogonok hasonlóan aktívak, metabolikus stabilitásuk azonban nem kielégítı, (190 humán mikroszóma 50 %, patkány mikroszóma 58 %; 194 humán mikroszóma 87 %, patkány mikroszóma 64 %). A kén oxidációjával az aktivitás nagymértékben lecsökken (198, 191, 199, 195).

73

Számos oxigén és kéntartalmú összekötılánccal rendelkezı molekula továbbjutott az elsı in vitro szőrıteszteken. A kaszkád második tesztrendszerében a legfontosabb szelekciós

kritérium a biohasznosulás és az egér formalin teszt elfogadható eredménye. Innen a harmadik tesztrendszerbe csak a 193 jutott tovább. Egér formalin tesztben ED50 értéke 1,4 mg/kg. Gyenge, 7 %-os biohasznosulását hidroxipropil-ciklodextrinnel (HPCD) képzett komplexe révén sikerült 20 %-ra megemelni. Ezt a formulációt alkalmazva egér neuropátiás modellben 0,25 mg/kg dózisban 60,2 %-os választ váltott ki. Bennett-Xie patkány mechanikai allodíniás modellben hasonló nagyságú választ (54%) csak 16 mg/kg dózisban sikerült elérni. Diabéteszes neuropátiás fájdalomtesztben is hatásos, 8 mg/kg dózisban 46 % a válasz. 193 a gyulladásos fájdalommodellekben a leghatékonyabb. Patkány gyulladásos artritisz modellben 0,2 mg/kg dózisban hatásos. A komplett Freund adjuvánssal (CFA) indukált gyulladásos egér fájdalomtesztben kialakúló allodíniát pedig már 0,1 mg/kg dózisban teljes mértékben gátolta. Neuropátiás fájdalomtesztben tolerancia nem alakult ki. A vegyület jelentısebb, nagy kockázatú

mellékhatásoktól

mentes.

Nem

gátolja

a

hERG

csatornákat,

nincs

kardiovaszkuláris mellékhatása. A CYP enzimekkel végzett vizsgálatok is eredményesen zárultak. Ames teszt alapján nem mutagén. A Morris vízlabirintus tesztben nincs hatása a tanulási folyamatokra. Terápiás dózisban a lokomotoros aktivitást nem növelte. Patkány toxikológiai vizsgálatban 150 mg/kg/nap dózist is jól toleráltak az állatok. A reménykeltı képet azonban néhány kedvezıtlen tulajdonság árnyalta. Ismételt adáskor kismértékben csökkent az expozíció és az analgetikus dózishoz közel szedatív típusú mellékhatások jelentkeztek. A vegyület inkább a gyulladásos fájdalmat csillapítja mint a célúl kitőzött neuropátiás fájdalmat. Ellene szólt a kis biohasznosulási értéke is, emiatt HPCD komplexre vagy valamilyen hatásos formulációra minden bizonnyal a humán alkalmazás során is szükség lenne. Végül a vegyület nem került továbbfejlesztésre. Az oxálsavdiamidok körében végzett munkám másik célkitőzése új kondenzált heterociklusok alkalmazása a molekula baloldali részén. Ennek érdekében elıször a farmakofór modellbe illeszkedı anilineket kellett elıállítani. Mivel a vegyületcsaládra jellemzı viszonylag gyenge biohasznosulás oka a rossz oldékonyságból eredı elégtelen felszívódás, ezért új vegyületek tervezésekor elsısorban az oldékonyság növelésére törekedtem, bár iparjogvédelmi szempontból, a vegyületkör minél teljesebb lefedése érdekében bármilyen, a megfelelı pozícióban NH-csoportot tartalmazó heterociklussal kondenzált anilinszármazék elıállítása kívánatos volt. Az oldékonyság és ezen keresztül a többi ADME paraméter érdemi javulását

74

leginkább a molekula ezen részének megfelelı változtatásától remélhettük. Eredményeimet a 13. táblázatban foglalom össze. Legrosszabb

oldékonysággal

éppen

az

igen

hatásos

benzimidazolon-származékok

rendelkeztek (186, 11. táblázat). A két hidrogénkötés donor NH-csoport egyikének metilezésével (200) sikerült a kristályrács energia csökkentésén keresztül az oldékonyságot növelni, az aktivitás azonban a 186 anyavegyülethez képest egy nagyságrendet romlott. Az oxigén bázikus jelleget kölcsönzı aminocsoporttal (207) való helyettesítésével szintén javult az oldékonyság, a receptorhoz való affinitás azonban csökkent.

Az indanon- (188) és

benzoxazolon- (184) származékok karbonilcsoportjának szulfocsoportra történı cseréje az oldékonyság várt mértékő növelése mellett az aktivitás drasztikus mértékő csökkenéséhez (201), illetve teljes hatástalansághoz (208) vezetett. A még jó oldékonysággal rendelkezı 206 is

hatástalan.

Anyavegyületeiknél jóval gyengébb a 184 benzoxazolon-származék

benzoxazoltion analogonja (203) és a 186 benzimidazolon-származékból levezethetı trifluormetil-csoportot tartalmazó molekula (204) is. 13. táblázat. Különbözı, NH-tartalmú heterociklusokkal kondenzált anilinszármazékok (200-208) NMDA antagonista hatása patkány kortikális sejteken. O Q

vegyület

Q

200

HN

N CH 3

N

N H

O

201

HN

202

HN

S O

O

203

HN

O

204

HN

N

205

HN

206

HN

HN

O

N

207

N H

208

N

HN

NH2

O

S

O

O

O

Oldékonyságc [µg/ml]

135

>200

71.3

12,7

3,5

5,4

-

>200

>200

NMDA-kiváltott ∆ [Ca2+]ia inhibíció %b; IC50 (nM)

42

99

15,2 %

88

48,1 %

29

62 %

99

4%

S

CF3

O

O

O

a

NMDA-kiváltott intracelluláris Ca2+ koncentrációváltozás. Inhibíció (%) a vegyület 0,1 µM koncentrációjánál meghatározva. c Kinetikai oldékonyság pH=7,4-en és szobahımérsékleten meghatározva.

b

Annak ellenére, hogy az oxazol és az imidazolgyőrők egy metiléncsoporttal történı bıvítésével levezethetı heterociklusokat tartalmazó származékok (205, 206) in vitro eredményei nem érik el az anyavegyületek (184, 186) megfelelı értékeit, 205 in vivo igen hatásosnak bizonyult. Egér formalinos fájdalomtesztben elért ED50 < 0,1 mg/kg a legalacsonyabb a projektben meghatározott értékek között. A gyógyszerkémiai gyakorlatban

75

nem példanélküli eredmény, miszerint egy vegyület in vivo aktivitása jóval nagyobb, mint az a mért in vitro adatok alapján várható lenne, arra figyelmeztet, hogy az elsıdleges szőrésre használt in vitro adatokat csak kellı körültekintéssel, több adat összevetésével szabad a vegyületek kiválasztására használni. Sajnos 205 analgetikus hatása nem volt dózisarányos, ezért nem került továbbfejlesztésre. 4.4.2. Oxálsavszármazékok elıállítása

A 189 – 197 és 200 – 206 vegyületeket a 30. ábrán látható módon állítottam elı. A piperidineket trietil-amin jelenlétében etil-oxalil-kloriddal acileztem. Az észtercsoportot lúgosan hidrolizáltam, majd a sósavval felszabadított karbonsavval (210) HBTU kapcsolószer segítségével az anilineket acileztem (30. ábra). X

(i)

HN

Y

X

O

(ii)

N

HO

209

Q

Y

O

X

O N H

210

N O

Y 189 - 197, 200 - 206 190 iii 198 194 iii 199

30. ábra. Oxálsavdiamidok elıállítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) (1) ClCOCOOEt, Et3N, CHCl3, 10oC, 2 óra; (2) KOH, EtOH/H2O, szobahımérséklet, 2óra; (3) 6N HCl, 10oC, 2 óra; (ii) anilinek, HBTU, Et3N, DMF, szobahımérséklet, 18 óra; (iii) H2O2, ecetsav, szobahımérséklet, 18 óra.

A 198 és 199 szulfoxidszármazékokat a megfelelı tiovegyületek (190 és 194) hidrogénperoxidos oxidációjával állítottam elı ecetsavban, szobahımérsékleten. A 207 2-amino-benzimidazol-származékhoz a 30. ábra szerint elıállított 1-es helyzetben Boccsoporttal védett származék védıcsoportjának savas eltávolításával jutottam. A 208 származékot 2-amino-5-nitrofenolból kiindulva öt lépésen keresztül a 31. ábrának megfelelıen alakítottam ki. Toz H2N

i

HO

NO2

211

Toz

HN

ii

HO

NO2

212 (ti.: 34 %)

HN

iii, iv,v

HO

NH2

213 (tii.: 87 %)

H N

O O

O

S O

N H

N

O 208 (tiii.: 66 %) (tiv.: 46 %) (tv.: 40 %)

31. ábra. 208 elıállítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) TozCl, CaCO3, CH3CN, reflux, 8 óra; (ii) H2, 10 % Pd/C, CH3OH - THF, szobahımérséklet, 6 óra; (iii) (4-benzil-piperidin-1-il)-oxo-ecetsav, HBTU, Et3N, DMF, szobahımérséklet, 6 óra; (iv) SO2Cl2 CH2Cl2, Et3N, -78°C – szobahımérséklet; (v) NaN3, víz – CH3CN szobahımérséklet, 12 óra.

4-feniltiometil-piperidint (216) tiofenol N-Boc-4-meziloximetil-piperidinnel (129) történı Salkilezésével állítottam elı. A kén meta-klór-perbenzoesavval történı oxidációjával a megfelelı szulfonszármazékhoz (217) jutottam (32. ábra).

76

OMez (i) Boc

N

X Boc

129

(iii)

X

N

HN

214 X = S

(ii)

215 X =

S

216 X = S

(ti.: 95 %) O

(tiii.: 99 %) O

217 X = S

O

(tii, iii.: 87 %)

O

32. ábra. 4-feniltiometil-piperidin és oxidált származékának elıllítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) NaH, szubsztituált tiofenolok, DMF, 3 óra szobahımérséklet; (ii) mCPBA, 1 óra szobahımérséklet; (iii) 1. 10% HCl/EtOAc, 18 óra, 2. NaHCO3.

4-feniltio-piperidint (220)

N-Boc-4-piperidinolból (132) kiindulva ismert eljárás szerint

állítottam elı.109 A kén meta-klórperbenzoesavval történı oxidációjával a megfelelı szulfonszármazékhoz jutottam (221) (33. ábra). OH

X

(i)

N

Boc

N

Boc

132

X

(iii) HN

218 X = S

(ii)

219 X = S

220 X = S O

221 X = S

O

O O

(ti, iii.: 69 %) (ti - iii.: 95 %)

33. ábra. 4-feniltio-piperidin és oxidált származékának elıllítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) (nBu)3P, PhSSPh, THF, 6 óra reflux; (ii) mCPBA, 1 óra szobahımérséklet; (iii) 1. 10% HCl/EtOAc, 18 óra, 2. NaHCO3.

4-Benziloximetil-piperidint (224) N-Boc-4-hidroxi-metil-piperidin (222) O-benzilezésével (34. ábra), míg 4-fenoxietil-piperidint (227) fenol N-Boc-4-meziloxietil-piperidinnel történı alkilezésével állítottam elı (35. ábra). OH (i) Boc

N

O Boc

(ii)

N

O HN

222

223 (t.: 38 %)

224 (t.: 67 %)

34. ábra. 4-benziloximetil-piperidin elıllítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) NaH, DMF, benzilbromid, 6 óra szobahımérséklet (ii) 1. 10% HCl/EtOAc, 18 óra, 2. NaHCO3.

OH Boc

N

O

(i) (ii) Boc

225

N

O

(iii) HN

226 (t.: 83 %)

227 (t.: 77 %)

35. ábra. 4-fenoxietil-piperidin elıllítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) CH3SO2Cl, Et3N, CH2Cl2, 18 óra szobahımérséklet; (ii) fenol, K2CO3, DMF 5 óra reflux; (iii) 1. 10% HCl/EtOAc, 18 óra, 2. NaHCO3.

Eredményeinket szabadalmi bejelentésben110 védtük és egy közleményben111 ismertettük.

77

4.5. Kinurénsav amidszármazékok 4.5.1. Eredmények, szerkezet-hatás összefüggések

Miután a fahéjsavszerkezetet sikeresen transzformáltuk merevebb indol- és benzimidazol győrőrendszerré, elhatároztuk, hogy megvizsgáljuk az ezekkel rokon, hasonlóan merev szerkezetek NR2B aktivitását. Az indol és benzimidazol heterociklusos részének egy karbonilcsoport beépítésével történı hipotetikus győrőbıvítésével 1-H-kinolin-4-on és 1Hkinazolin-4-on analogonokhoz jutunk: O W

X

Y N H

Y

N

N H

Z

O

W

X N

Z

O

82 X = CH, Y = 6-OH 83 X = CH, Y = 5-OH 142 X = N, Y = 5,(6)-OH

Ténylegesen

elıállítva

ezeket

a

szerkezeteket

elsısorban

a

1-H-kinolin-4-on

savszármazékának, a kinurénsavnak piperidinekkel alkotott amidjai voltak a hatásosak. A vegyületcsaládot az indol és benzimidazol-származékok körében szerzett tapasztalatok alapján rövid idı alatt, mindössze két tucat vegyület elıállításával sikerült optimalizálni. Az elıállított vegyületek biológiai aktivitását natív patkány idegsejteket és rekombináns NR1/NR2B receptorokat expresszáló sejteket felhasználó funkcionális esszében is meghatároztuk. Ha a vegyület az NMDA receptorcsaládon belül csak az NR2B altípust gátolja, és az NMDA-n kívül más receptoron keresztül nem befolyásolja az intracelluláris Ca2+ koncentrációt, úgy a két teszt eredményeinek jó egyezést kell mutatniuk. Szelektivitásukat az NR2A alegységeket tartalmazó NMDA rceptorokhoz képest ugyanebben a funkcionális esszében határoztuk meg, rekombináns NR1/NR2A receptorokat expresszáló sejteket felhasználva. In vivo analgetikus hatást a hosszantartó fájdalmat modellezı egér formalin tesztben

mértük.

Szerkezet-hatás

összefüggéseket

reprezentáló

molekulák

funkcionális esszé eredményeit az 14. táblázatban válogattam össze. A natív patkány kortikális sejteken és a rekombináns NR1a/NR2B receptorokat expresszáló sejteken végrehajtott funkcionális esszé eredményei, ha számszerően nem is, de nagyságrendileg jó egyezést mutatnak. Bár hasonló szerkezet-hatás összefüggés olvasható ki mindkét teszt eredményeibı l, következtetéseimet a leggyorsabban rendelkezésünkre álló natív patkány kortikális sejteken mért adatok alapján vonom le. Rekombináns NR1a/NR2B és NR1/NR2A receptorokat expresszáló sejteken csak az elsı szőrın aktív vegyületeket mértük. A csoport leghatásosabb képviselı je egy 6-hidroxi-kinurénsav-származék, a 236. 78

A 6-hidroxi-származékok többsége közel azonos mértékő, kiváló aktivitással rendelkezik, függetlenül a piperidingyőrő szubsztitúciójától. Bár nem vizsgáltam a szubsztituensek eléggé széles körét, úgy tőnik, hogy nincs jelentıs elektronikus vagy sztérikus hatásuk az affinitásra. A hidroxilcsoport áthelyezése az 1H-kinolin-4-on váz 6-os helyzetébı l a 7-esbe (229) a hatás drámai csökkenését eredményezte, ellentétben az indolszármazékokkal, ahol az ennek megfelelı 5- és 6-hidroxi-származékok azonos hatásúak. 14. táblázat. A vegyületek flourimetriás módszerrel meghatározott NMDA antagonista hatása patkány kortikális sejteken és NR1a/NR2B vagy NR1/NR2A alegységeket expresszáló sejteken. O R6

Y

X

R7

N

N H

Z

O

vegyület

R6

R7

X

Y

Z

NMDA-kiváltott ∆[Ca2+]ia,b inhibíció (%)c IC50 (nM)

n

NR1a/NR2Bd IC50 (nM)

NR1/NR2Ad inhibíció % at 15 µM

228

H

H

CH

CH2

H

4,5 %

1

-

-

229

H

OH

CH

CH2

H

27,9 %

1

-

-

230

OH

H

CH

CH2

H

9,1 ± 0, 8

5

3,7

7,0

231

OH

H

CH

CH2

F

8,7 ± 1,0

3

4,0

-0,9

232

OH

H

CH

CH2

Cl

9,1 ± 0,58

3

1,9

-5,1

233

OH

H

CH

CH2

CH3

11,0 ± 0,8

3

3,8

-2,4

234

OH

H

CH

O

H

49,6 ± 9,9

4

28,0

0,2

235

OH

H

CH

O

Cl

7,1 ± 0,8

3

5,1

5,1

236

OH

H

CH

O

CH3

6,2 ± 0,78

3

3,3

-3,5

237

AcNH

H

CH

CH2

H

2,6 %

3

-

-

238

-HN-C(O)-O-

CH

CH2

H

21,7 ± 2,8

3

5,6

-2,1

239

OH

NH

CH2

H

317 ± 8

6

-

-

eritro ifenprodil

470 ± 51

9

treo ifenprodil

162 ± 15

7

83

25 ± 8

3

82

18 ± 4

13

2,2 ± 0,4

7

H

142 a

Átlagértékek ± szórás (± S.E.M. A kísérletek száma (n). NMDA-kiváltott intracelluláris Ca2+ koncentrációváltozás. c Inhibíció (%) a vegyület 0,1 µM koncentrációjánál meghatározva. d A kísérletek száma NR1a/NR2B esetében 2-3, NR1/NR2A esetében 1. b

79

A hidroxilcsoport eltávolítása (228) – a várakozásnak megfelelıen – teljesen inaktívvá teszi a molekulát. A fenolos hidroxilcsoport NH tartalmú lánccal vagy heterociklusos győrővel történı cseréjétıl a korábbi tapasztalatoknak megfelelıen lassabb metabolizmust reméltünk. A hidroxilcsoport helyett acetilamino-csoport alkalmazása (237) a hatás teljes elvesztésével járt, míg heterociklussal való cserét (238) a hatás jól tolerálta. Összeségében az indolgyőrő bıvítésével

levezethetı

6-hidroxi-kinurénsavamid-származékok

két-háromszoros

hatásnövekedést eredményeztek az indolanalogonokhoz képest. A benzimidazolgyőrő bıvítése kinazolinszármazékká nem volt ilyen eredményes módosítás. 239 1H-kinazolin-4on- származék IC50 értéke a benzimidazol anyavegyületénél két nagyságrenddel nagyobb. Az in vitro és in vivo leghatékonyabb vegyületek oldékonyságát, szelektivitási és in vitro

metabolikus stabilitási adatait, valamint az egér formalin fájdalomteszt ED50 értékeit a 15. táblázatban foglalom össze. 15. táblázat. Oldékonyság, α1, 5HT2A és [3H]-dopamin kötıdési tesztek a lehetséges mellékhatások monitorozására, in vitro metabolikus stabilitás és egér formalin neuropátiás fájdalomteszt adatok.

vegyület

α1 5HT2A DAU IVM FM% kötıdés kötıdés oldékonyság IC50 hum. pat. I% I% [µM] [µM] µS µS (1 µM) (1 µM)

egér formalin teszt, p.o. ED50 [mg/kg]

230

362

4

11

1,7

99

99

>20 *

231

505

0

5

5,2

99

99

9,5

232

341

3

31

0,8

79

84

>20 *

233

282

2

27

3,6

99

85

>20 *

235

40

6

45

8,3

79

91

>20 *

236

51

3

66

12

97

90

8,2

238

57

0

45

6,3

38

64

>20 *

CI-1041 (28)

16

39

15,5

-

-

5,3

Co-101244 (12)

20

62

10,8

-

-

> 20 *

EMD 95885 (8)

57

75

0,98

-

-

5,9

CP-101,606

2

41

-

-

-

>20 *

Ro-256981 (9)

58

41

4,4

-

-

>20 *


Rövidítések: I %: gátlás százaléka a vegyület megadott koncentrációjánál ; DAU: dopamin felvétel; IVM FM%: in vitro metabolizmus, becsült maximális felszívódás, µS: mikroszóma * ED50 értéket nem határoztunk meg, ha a gátlás 20 mg/kg, p.o. dózisban 50%-nál kisebb volt. ** Kinetikai oldékonyság pH=7,4-en és szobahımérsékleten meghatározva.

80

A 6-hidroxi-kinurénsav benzilpiperidinekkel alkotott származékai (230-233) rendkívül oldékonyak, míg a fenoxipiperidinekkel alkotott származékok (235, 236) és a heterociklust tartalmazó 238 oldékonysága az elı bbiekétıl egy nagyságrenddel roszabbak. A nem szelektív NMDA antagonisták mellékhatásaiért leginkább felelı ssé tehetı α1 receptorokhoz egyáltalán nem kötıdnek és az 5-HT2A receptorokhoz sem mutatnak nagy affinitást. A dopamin felvételt (DAU) azonban viszonylag nagymértékben gátolják. In vitro metabolizmusuk mértékét humán és patkány mikroszómán meghatározva a 238 heterociklust tartalmazó származék kivételével metabolikusan stabil vegyületek. In vivo, egér formalin tesztben leghatásosabb származék az in vitro is legaktívabb 236. A vegyület szelektív, nem kötıdik az NR1/NR2A, az α1 és 5HT2A receptorokhoz. A dopamin felvételt (DAU) is ez gátolja a legkevésbé. Összefoglalva, hatásos indol és benzimidazol-származékokból kiindulva az NR2B altípusszelektív NMDA receptor antagonisták új osztályát, kinurénsav-származékokat azonosítottam. A vegyületcsalád in vitro legaktívabb tagja a 236, egyben in vivo is a leghatásosabb. A vegyület további fejlesztését gyenge farmakokinetikai jellemzı i, 158ng/ml cmax és 0,8 óra plazma féléletidı, de legfıképpen 8 %-os biohasznosulási adata hiúsította meg. Emellett az idegrendszeri mellékhatásokat jelzı Irwin tesztben már 30 mg/kg dózisnál detektálható tünetek jelentkeztek. Ezt a számot elosztva a formalin tesztben mért 8,2 mg/kg ED50 értékkel, négynél kisebb, kockázatosnak ítélhetı terápiás index adódik.

81

4.5.2. Kinurénsav amidszármazékainak elıállítása 228-238 vegyületeket szubsztituált kinurénsav és piperidinszármazékok reakciójával

állítottam elı a szokásos HBTU-t felhasználó kapcsolási eljárás szerint (36. ábra).7

R

i

+ NH2

O

O

COOCH3

OCH3

R N H

COOCH3

240 R = H 241a R = 3-BnO, 241b R = 4-BnO 242 R = 4-NO2 HN 243 R = 4,5- O

ii

R

OCH3 O

252 R = 4-NO2 (t.: 88 %) (t.: 73 %) 253 R = 6-AcNH HN O R = 6,7 (t.: 76 %) 254

iii, iv

O

O v, vi

O

N H

vii vii

O

Y

viii

R

O

249 R = H (t.: 60 %) 250 R = 7-BnO 251 R = 6-BnO (t.: 62 %)

244 R = H 245 R = 3-BnO (t.: 91 %) 246 R = 4-BnO (t.: 32 %) 247 R = 4-NO2 HN (t.: 77 %) 248 R = 4,5- O (t.: 87 %)

O

OCH3

N H

R

OH

N H

O

(t.: 99 %) 255 R = H 256 R = 7-BnO 257 R = 7-OH (t.: 70 %) 258 R = 6-BnO (t.: 99 %) 259 R = 6-OH (t.: 83 %) 260 R = 6-AcNH HN (t.: 99 %) 261 R = 6,7- O (t.: 99 %)

228

N

Z

O R =H

(t.: 57 %)

R = 7-OH 230-236 R = 6-OH

(t.: 52 %)

229

(t.: 32 - 57 %) (t.: 55 %)

237

R = 6-AcNH

238

R = 6,7-

H N

O O

(t.: 42 %)

O

36. ábra. Kinurénsav amidszármazékainak elıállítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) MeOH, reflux, 2 óra; (ii) Dowtherm, 240 °C,10 perc; (iii) H2, 10 % Pd/C, MeOH, szobahımérséklet; (iv) Ac2O, reflux; (v) NaOH, MeOH, H2O, szobahımérséklet; (vi) HCl; vii) H2, 10 % Pd/C, MeOH, szobahımérséklet; (viii) piperidinek, HBTU, Et3N, DMF, szobahımérséklet.

A kinurénsav intermediereket anilinszármazékokból kiindulva módosított Conrad-Limpach módszer alapján szintetizáltam.112 253 acetilamino-szubsztituált kinurénsav észtert a nitroszármazék (252) katalitikus redukciójával képzıdött amino intermedier acetilezésével állítottam elı. Az észterek alkalikus hidrolízisével szubsztituált kinurénsavakhoz jutottam. Hidroxiszubsztituált kinurénsavakat O-benzilszármazékuk katalitikus hidrogenolízisével állítottam elı. A kinazolinszármazék (239) szintézisekor a kereskedelmi forgalomban beszerezhetı 4hidroxi-antranilsavból (262) indultam ki és a 37. ábrának megfelelıen folytattam. 265 antranilamidot hat lépésben a szokásos reakciókkal állítottam elı. A kinazolingyőrőt 266 oxálsavdiamid termális kondenzációjával alakítottam ki. A végtermékekhez az O-benzil védıcsoport katalitikus hidrogenolízisével jutottam.

82

HO

O

O

O C OH

HO

i, ii

C OCH3

BnO

C OCH3 NH2

N Ac H

NH2 262

263 (t.: 70 %)

BnO

264 (t.: 88 %)

O

O v, vi

iii,iv

C NH2

vii

BnO

C NH2 N C C N H O O 266 (t.: 12 %)

NH2 265 O HO

N

viii N H

N O 239 (t.: 21 %)

37. ábra: Kinazolinszármazék (239) elıállítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) SOCl2, MeOH, -20°C - szobahımérséklet; (ii) 1. Ac2O, 50°C; 2. Na2CO3 aq, szobahımérséklet; (iii) benzil-bromid, K2CO3, aceton, reflux, 4 óra; (iv) HCl, MeOH, reflux, 1 óra; (v) 1. 10 % NaOH, MeOH, reflux, 1 óra; 2. HCl; (vi) SOCl2, CHCl3, 1csepp DMF, reflux, 2 óra; 2. NH3, víz, 0°C; (vii) (4-benzil-piperidin-1-il)oxo-ecetsav, HBTU, Et3N, DMF; (viii) 1. 250°C, 1,5 óra; 2. H2, 10 % Pd/C, THF, szobahımérséklet.

Eredményeinket szabadalmi bejelentésben113 védtük és egy közleményben114 ismertettük. 4.6. Benzoil-karbamid-származékok 4.6.1. Eredmények, szerkezet-hatás összefüggések

A fahéjsavamidok, indol- és benzimidazol-2-karboxamidok és az oxálsavdiamidok körében végzett kutatásunk alapján a következı megállapítások tehetık az ifenprodil farmakofór modellt illetıen. A leghatásosabb szerkezetek két terminális benzolgyőrőt tartalmaznak, melyek közül az egyik egy metabolikusan stabil hidrogénkötés donorcsoportot visel. A két benzolgyőrőt elınyösen bázikus csoportot nem tartalmazó, különbözı hosszúságú és heteroatomtaralmú lánc köti össze. Kémiai munkánk kiinduló pontja az University of Oregon, a CoCensys és a Parke-Davis 37-es fahéjsavamid-származéka volt. A fahéjsav α szénatomja és a benzolgyőrő közé beépített nitrogén indol-2-karboxamid-származékot eredményezett (82),

mely hétszer

hatásosabb

volt

37

anyavegyületnél.

Az

indol-2-karboxamid

pirrolgyőrőjének újbóli képzeletbeli felnyitásával és az így képzıdött metiléncsoport oxigénre való cseréjével levezethetı oxálsavszármazék (183) kétszer aktívabb volt in vitro a 82 indol2-karboxamidnál. Bár ezek az intuitív szerkezeti módosítások eredményesnek bizonyultak, a rendelkezésünkre álló kémiai tér teljesebb körő feltérképezéséhez, újabb hatásos 83

vegyületcsaládok azonosításához a következı analitikus megközelítésre volt szükség. A tervezett új vegyületekben a farmakofór modell legbiztosabb elemeit, a hidrogénkötés donorcsoportot tartalmazó benzolgyőrőt és a leggyakrabban elı forduló 4-benzil-piperidint állandónak hagytam, csak az ezeket összekötı, a leghatásosabb molekulákra jellemzı háromtagú

láncot

változtattam.

A

hidrogénkötés

donor

praktikus

okokból vagy

hidroxilcsoport vagy benzolgyőrővel kondenzált oxazolon volt, attól függıen, hogy melyik származékot lehetett egyszerőbben, gyorsabban elıállítani. A hidrogénkötés donorcsoporthoz képest para-helyzető aromás szénatomot a 4-benzil-piperidin nitrogénjével számos stabilnak és gyógyszerszerőnek tőnı háromtagú lánccal kötöttem össze. Az elıállított vegyületek patkány kortikális sejteken meghatározott funkcionális tesztjének eredményeit a képletek alatt tüntetem fel (38. ábra). HO A

B

C

O

O

O 37 131 nM

N H

N

O

O

267 511 nM

183 11 nM

H N

O O 270 366 nM

O 268 32 %

H N O

271 354 nM

OH

O

272 461 nM

O O 273 -2,8 %

269 100 nM

H N S O

O

O

274 24 nM

38. ábra. 4-hidroxi-benzol és 4-benzil-piperidin nitrogénjét összekötı háromtagú A-B-C összekötı láncok.

Az összekötı lánc nem egyszerően távtartó, hanem fontos szerepet tölt be a receptorral való kölcsönhatásban. Ezt támasztja alá az a megfigyelés, miszerint a lánc elemei, ahogy azt a példák is mutatják, nem kombinálhatók szabadon. Vizsgálatunk etalonja a CoCensys fahéjsavamidja (37) és a kutatócsoportunk oxálsavdiamid vezérmolekulája (183). A fahéjsavamid (37) kettıs kötésének telítése (268) a hatás elvesztésével járt. A savamid jelleg megszüntetésével (269) a hatás kismértékben javult de nem közelítette meg az oxálsavdiamid vezérmolekuláét. A 267, 270, 271 és 272 három atom hosszúságú acilszármazékok gyenge in vitro aktivitást mutattak, míg a 273 szulfamidszármazék teljesen inaktív volt. A 274 benzoil-

karbamid-származékot viszont optimalizálásra alkalmasnak találtuk. Fenol helyett 3,4benzoxazolont tartalmazó modellvegyületek esetében is hasonló eredményre jutottam (39. ábra). Az oxálsavdiamid anyavegyület (184) aktivitását egyik származék sem közelítette meg, 84

a korábban optimalizált fahéjsavamid-származékunk (81) teszteredményét azonban három molekula is (275, 279, 281). A 147 oxálsavdiamid kén tartalmú megfelelı je (275) tizenötször kevésbé hatásos az anyavegyületnél (184). Szerkezete alapvetıen nem különbözik tıle, drasztikus hatásnövekedést az optimalizációjától nem várhatunk, ezért több kéntartalmú származékot nem állítottam elı. A 279 szerkezete már jelentısen eltér az oxálsavdiamid anyavegyületekétıl. Tartalmaz azonban egy bázikus nitrogént, amit el szerettünk volna kerülni. Ily módon a 3,4-benzoxazolont tartalmazó modellvegyületek funkcionális teszteredményei alapján is a benzoil-karbamid-származék (281) bizonyult optimalizációra alkalmas molekulának. Újabb származékok képzése elıtt a két benzoil karbamidot (274 és 281) további biológiai vizsgálatoknak vetettük alá. Meglepı módon a heterociklussal

kondenzált benzoil-karbamid-származék (281) hatása az anyavegyületekéhez képest nem volt olyan meggyızı, mint a hidroxianalogon (274) esetében. H N O O

A

B

O

O 81 28 nM

N H

N H 278 345 nM

O

O

184 2,4 nM

N H

N H 279 39 nM

S

N H

N H

O 277 1800 nM

276 395 nM

H N O

O

O

280 162 nM

N H

O

CH3

CH3

NOH

NH

275 38 nM

O

NH

N

C

281 59 nM

39. ábra. 3,4-benzoxazolont és 4-benzil-piperidin nitrogénjét összekötı különbözı háromtagú láncok hatása a vegyületek funkcionális tesztjeinek eredményére.

A kielégítı in vitro aktivitás és a szerkezeti újdonság miatt további származékok képzését határoztam el. Az eddig kutatott vegyületcsaládoktól eltérıen a hidroxiszármazék hatásosabb volt a 3,4-benzoxazolon analogonnál, ezért elsısorban hidroxiszármazékokat állítottam elı. A benzoil-karbamidok biológiai aktivitását mindhárom funkcionális esszében meghatároztuk. E három funkcionális esszé eredményeit, szerkezet-hatás összefüggéseket is reprezentáló molekulák esetében, valamint a referenciavegyületek NR1a/NR2B és alegységeket expresszáló sejteken meghatározott aktivitását össze.

85

NR1/NR2A

a 16. táblázatban foglaltam

16. táblázat. Benzoil-karbamid-származékok NMDA antagonista aktivitása natív patkány kortikális sejteken, valamint NR1a/NR2B és NR1/NR2A alegységeket expresszáló sejteken fluorometriás módszerrel meghatározva. O C X

O N H

C

N

Z Y

vegyület

X

Y

Z

NMDA-kiváltott ∆ [Ca2+]ia,b inhibíció (%)c IC50 (nM)

NR1a/NR2Bd IC50 (nM)

NR1/NR2Ad inhibíció % at 15 µM

282

4-OH

CH2

Cl

14

5,3

1,8

283

4-OH

CH2

4-CH3

13

6,2

8,7

284

4-OH

CH2

4-OCH3

16

7,6

-5,7

285

4-OH

CH2

4-CF3

37

8,3

19,7

286

4-OH

CH2

F

23

19,3

4,9

274

4-OH

CH2

H

24

28,0

2,6

287

4-OH

CH2

3-OCH3

46

58,9

-0,9

288

4-OH

CH2CH2

4-CH3

42

14,3

11,4

289

4-OH

CH2S

H

35

59,1

-2,9

CI-1041 (28)

8,4

21,0

Co-101244 (12)

4,8

-8,7

EMD 95885 (8)

48

0,1

CP 101,606

30

2,5

Ro 25.6981 (9)

57

1,0

eritro ifenprodil

459

-2,7

MK-801

43

IC50=386 nM


a

A kísérletek száma natív patkány kortikális sejteken 4-6 NMDA-kiváltott intracelluláris Ca2+ koncentrációváltozás. c Inhibíció (%) a vegyület 0,1 µM koncentrációjánál meghatározva. d A kísérletek száma NR1a/NR2B esetében 2, NR1/NR2A esetében 1. b

Bár következtetéseimet az NR1a/NR2B receptorokat expresszáló sejteken meghatározott adatok alapján vonom le, a nagyfokú NR2B szelektivitásnak köszönhetıen a leírt összefüggések a natív patkány kortikális sejteken mért adatok alapján is helytállóak. A fenilgyőrő 4-es helyzetének különféle szubsztitúciója nem befolyásolja alapvetıen az aktivitást, elektronküldı (283, 284) és elektronszívó (282, 285) csoportok is kiváló hatású, szelektív vegyületeket eredményeznek. A 4-fluorfenil (286) és fenil (274) származékok ezekhez képest 3 - 4-szeres NR1a/NR2B aktivitáscsökkenést mutatnak. Az aktivitási sorrend 86

arra utal, hogy a nagyobb affinitás elérésében a hidrofób kölcsönhatásnak nagyobb szerepe lehet, mint az elektronikus faktoroknak. A metoxicsoport 3-as helyzetbe történı áthelyezése (287) a hatás egyértelmő csökkenését vonta maga után. Az Y összekötı lánc 283 molekula esetében egy metiléncsoporttal (288), 174 molekula esetében egy kén atommal (289) történı meghosszabbításával az aktivitás a felére csökkent. Az összes vegyület magas NR1a/NR2B szelektivitást mutat, az NR1/NR2A receptorokon inaktívak. A leghatásosabb benzoil-karbamid-származékok elérik a legaktívabb referenciavegyületek megfelelı in vitro értékeit, a klinikai fázisba került CP-101,606 hatását pedig többszörösen felülmúlják. In vivo analgetikus hatást a hosszantartó fájdalmat modellezı egér formalin tesztben mértük (17. táblázat). Leghatásosabb, orálisan is felszívódó származék a szubsztituálatlan 274 analogon, jelezve, hogy a benzoil-karbamidok nem csak in vitro aktivitásban és szelektivitásban de in vivo aktivitásban is összemérhetıek a referenciavegyületekkel. 17. táblázat. Egér formalin neuropátiás fájdalomteszt adatok. vegyület

ED50 (mg/kg p.o. vagy jelezve)

274

1,6

286

27


2,4

Co-101244 (12)

>20* (5,9 mg/kg i.p.)

EMD 95885 (8)

3,7

CP-101,606

>20*

Ro-256981 (9)

>20* (5,1 mg/kg i.p.)

*: ED50 értéket nem lettek meghatározva, ha a gátlás kevesebb mint 50 % 20 mg/kg, p.o..

A 274 vegyület egér formalin tesztben kiváló hatással rendelkezett, ráadásul a projekt vegyületei közül egyedülálló módon nem növelte a lokomotoros aktivitást (15 mg/kg dózisig nincs effektus). Jó oldékonysága (44 µg/ml) és metabolikus stabilitása (95 % humán mikroszóma) ellenére a molekula nem szívódott fel kellı mértékben, biohasznosulása csak 11 %. A többi farmakokinetikai paramétere sem kielégítı: alacsony cmax (652 ng/ml) és féléletidı (0,6 óra), ugyanakkor magas kiürülés (31,7 ml/perc/kg) jellemzi. Egér neuropátiás fájdalom modellben nem mutat antiallodíniás hatást. Ennek oka valószínőleg a kismértékő felszívódás mellett a gyenge agyi penetráció. Ez lehet az oka a lokomotoros aktivitást nem befolyásoló mellékhatás-mentességének is. A vegyület nem került továbbfejlesztésre.

87

4.6.2. Benzoil-karbamid-származékok elıállítása

A tervezett vegyülettár minél gyorsabb létrehozása érdekében szilárd fázisú parallel reakciók kivitelezése mellett döntöttem. A gyorsaság mellett célszerő is volt ez a megközelítés, mivel a kiindulási 4-hidroxi-benzoesavamidot a fenolos hidroxilcsoporton keresztül könnyen szilárd fázisú gyantához lehetett kötni. Megközelítı leg 50 vegyületet állítottam elı ily módon (40. ábra).

A 4-hidroxi-benzamidot (290) Mitsunobu körülmények között Wang gyantához

kötöttem, majd a benzamidot (291) oxalil-kloriddal benzoil-izocianáttá (292) alakítottam.115 A benzoil-karbamid-származékokat a benzoil-izocianát (292) és különbözı piperidinek addícós reakciójában állítottam elı. Végül a 4-hidroxi-benzoil-karbamid célvegyületeket TFA 10 % diklórmetános oldatával hasítottam le a gyantáról. O

C

O

NH2

C

NH2

O

C

NCO

ii

i

O C

iii, iv

O N H

C

Y N

HO OH

290

O

291

X

O

274, 282-289 (t.: 5-10 %)

292

40. ábra. 4-hidroxi-benzoil-karbamid-származékok elıállítása szilárd fázison. Reagensek és reakciókörülmények: (i) Wang gyanta, Ph3P, DEAD, THF, 0°C - szobahımérséklet, 24 óra; (ii) ClCOCOCl, 1,2-diklóretán, 75°C, 0,5 óra; (iii) piperidinszármazékok, 1,2-diklóretán, DIEA, szobahımérséklet, 1 óra; (iv) 10 % TFA - CH2Cl2, 2 óra, szobahımérséklet.

A bepárlási maradék oszlopkromatográfiás tisztítását követıen a termék azonosságát és tisztaságát HPLC-MS módszerrel határoztuk meg. A hatásos vegyületeket újraszintetizáltuk, szerkezetüket igazoltuk (IR,1-H NMR, HRMS). Az újraszintézist 4-benziloxi-benzamidból kiindulva a szilárd fázisú eljárással analogon módon végeztem el. Iparjogvédelmi szempontból a szintézisutat az irodalomban elı forduló másik gyakori benzoilizocianát elıállítási módszerrel is kidolgoztam (41. ábra).116 4-benziloxi-benzoesavból tionilkloriddal savkloridot állítottam elı, majd a savkloridból nátrium-cianáttal ón-tetraklorid jelenlétében izocianátot képeztem. A végtermékeket a megfelelı benziloxiszármazékok katalitikus

hidrogenolízisével,

hidrogénezésre

hidrogénbromidos hasításával állítottam elı.

88

érzékeny

csoportok

jelenléte

esetén

O

O C

OH

C i, ii

O NCO

BnO

BnO 293

C

iii, iv

O N H

C

HO 294 (t.: 38 %)

N

R

1

2

R

274, 282-289 (t.: 56 %)

41. ábra. 4-hidroxi-benzoil-karbamid-származékok elıállítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) SOCl2, reflux, 3 óra; (ii) NaOCN, SnCl4, acetonitril, benzol, reflux, 3 óra; (iii) szekunder amin, szobahımérséklet, 1óra; (iv) H2, 10 % Pd/C, MeOH, szobahımérséklet vagy 33 % HBr/ecetsav, 1 óra, szobahımérséklet.

Eredményeinket szabadalmi bejelentésben117 védtük és egy közleményben118 ismertettük.

4.7. Indol-2-karboxamidin-származék 4.7.1. Eredmények, szerkezet-hatás összefüggések

A Merck Sharp & Dohme kutatói új vegyületek tesztelése során az E-N1-(benzil)fahéjsavamidint (45) az NR2B-tartalmú receptorokhoz erısen kötıdı molekulaként azonosították.119 A molekula teljesen új szerkezet, eltér az ifenprodil farmakofór modelltı l, hiányzik belı le a fenolos hidroxilcsoport és a benzil-piperidin, ezért reménykeltı jelöltként egy új gyógyszerkémiai programot iniciált a Mercknél. Az optimalizáció során az egyik legaktívabb származéknak a 2-metoxi-benzil-származék (46) adódott. NH

NH

O

N H

N H

45 NR2B-Ki: 9 nM (irod. adat)

46 NR2B-Ki: 0,7 nM (irod. adat) NR2B-IC50: 4,2 nM (saját mérés)

Gyógyszerszerőbb származékokat keresve találtak rá a benzil-benzamidin vegyületcsaládra, amelynek szubsztituálatlan képviselı je (47) hatástalan volt, megfelelı en helyettesített benzolgyőrőkkel viszont aktív származékokat sikerült elıállítaniuk.79 Az egyik leghatásosabb képviselı a benzilcsoport 2-es helyzetében szintén metoxicsoporttal szubsztituált (48). A vegyületcsalád aktív tagjai jó orális farmakokinetikával rendelkeztek és a karragén-indukált hiperalgézia tesztben rágcsálókban hatásosak, ugyanakkor a nemszelektív NMDA antagonistákra jellemzı lokomotoros mellékhatástól mentesek voltak.

89

NH

NH

O

N H

N H CF3O

47 Ki > 15000 nM (irod. adat)

48 Ki = 5,7 nM (irod. adat)

Kutatásunk elején a Cocensys fahéjsavamid (37) sztirol részének merevítésével jutottunk az elsı vezérmolekulánkhoz, a (82) indol-2-karboxamid-származékhoz. O N HO

HO

37 NR2B-IC50: 131 nM

N H

N O

82 NR2B-IC50: 28 nM

Feltételezésem, miszerint ez a transzformáció az amidinek esetében is sikeres lesz, helyesnek bizonyult. Indol-2-karboxamidineket (295-309) állítottam elı, melyek hatásosan gátolták az NR2B

receptorokat. 119, 79

közleményei

A vegyületcsalád

optimalizációját

megkönnyítették

a

Merck

. E eredményeiket felhasználva határoztam meg az elıállítandó molekulák

szubsztituenseit. Az elıállított vegyületek biológiai aktivitását funkcionális esszében határoztuk meg, melynek során az NMDA által kiváltott intracelluláris Ca2+ szint növekedésének gátlását mértük patkány kortikális sejteken. Szelektivitásukat az NR2A alegységeket tartalmazó NMDA rceptorokhoz képest ugyanebben a funkcionális esszében határoztuk meg, rekombináns NR1/NR2A receptorokat expresszáló sejteket felhasználva. Az in vivo analgetikus hatást a hosszantartó fájdalmat modellezı egér formalin tesztben mértük. A szerkezet-hatás összefüggéseket reprezentáló molekulák funkcionális esszé eredményeit a 18. táblázatban válogattam össze. A benzilcsoport szubsztitúciója azt mutatja, hogy a hatás nem viseli el a 3-as és a 4-es helyzetek helyettesítését. A 3-metoxi (307) és 4-metoxi (308) analogonok teljesen hatástalanok a funkcionális teszten. A 2-metoxi-származék (295) azonban igen aktív, míg más csoportok ebben a pozícióban (305, 306) kevésbé hatásos molekulákat eredményeznek. A 2es és 6-os helyzetben metoxicsoportokkal diszubsztituált származékok aktivitása hasonló (300, 302), vagy nagyobb (299, 301) a monoszubsztituált analogonokhoz (296, 298 és 295, 297) képest. Más diszubsztitúció (303 és 304) gyengébb vegyületeket eredményezett.

90

18. táblázat. Indol-2-karboxamidin-származékok flourimetriás módszerrel meghatározott NMDA antagonista hatása patkány kortikális sejteken. 1

N H

1

2

H N

R

NH2

2

R Cl

d

NMDA-kiváltott ∆[Ca2+]ia,b inhibíció (%)c IC50 (nM)

vegyület

R

R

k’

295

H

2-OCH3

5,23

35 ± 5

5

296

5-MeO

2-OCH3

5,56

19 ± 3

3

297

5-F

2-OCH3

5,63

33 ± 6

3

298

5-Cl

2-OCH3

6,55

64 ± 12

3

299

H

2,6-(OCH3)2

3,67

5,4 ± 0,8

3

300

5-MeO

2,6-(OCH3)2

3,61

26 ± 5

5

301

5-F

2,6-(OCH3)2

3,80

17 ± 3

3

302

5-Cl

2,6-(OCH3)2

3,90

69 ± 13

4

303

H

2,6-di-F

3,52

143 ± 27

4

304

H

3,5-di-Cl

3,91

159 ± 17

3

305

H

2-CH3

3,73

170 ± 34

4

306

H

2-F

3,54

232 ± 36

3

307

H

3-OCH3

2,61

57,0 %

2

308

H

4-OCH3

2,58

10,5 %

1

309

H

H

2,46

32,8 %

1

eritro ifenprodil

470 ± 51

9

37

131 ± 10

2

82

18 ± 4

13

46

6,6 ± 1,1

3

n

Referenciavegyületek

a

Az értékek az átlagot és a szórást (± S.E.M) képviselik. A kísérletek száma (n). NMDA-kiváltott intracelluláris Ca2+ koncentrációváltozás. c Inhibíció (%) a vegyület 0,1 µM koncentrációjánál meghatározva. d HPLC-MS kapacitás faktora. b

Valószínőleg azért vezet hatásos vegyületekhez az orto-szubsztitúció és méginkább a nagyobb kiterjedéső 2,6-diszubsztitució, mivel az orto-szubsztitúció képes az aromás B győrőt kifordítani a benzamidincsoport síkjából. A 2-metoxi R2 csoportot konstansként tartva az

91

indolgyőrő szubsztitúciójának jelentıs hatása figyelhetı meg az affinitásra. Az aktivitás az R1 szubsztituens elektron küldı sajátságától függ, az 5-klórtól kiindulva az 5-fluoron át az 5metoxicsoportig nı. Leghatásosabb vegyület az indolrészen nem szubsztituált, 2,6dimetoxibenzil-származék (299). A nem szubsztituált analogon (309) inaktív, ami azt jelzi, hogy önmagában a váz nem elég az aktivitás eléréséhez. Az in vitro és in vivo leghatékonyabb vegyületek oldékonyságát, szelektivitási és in vitro metabolikus stabilitási adatait a 19. táblázatban, az egér formalin fájdalomteszt ED50 értékeit a 20. táblázatban foglalom össze. 19. táblázat. Oldékonyság, α1, 5HT2A és [3H]-dopamin kötıdési tesztek a lehetséges mellékhatások monitorozására, NR1/NR2A szelektivitási adatok, in vitro metabolikus stabilitás és egér formalin neuropátiás fájdalomteszt adatok. DAU IC50 [µM]

NR1/NR2A I% (15 µM)

10

2.5

16

18

578

39

550

42

α1 5HT2A Old. kötıdés kötıdés I% I% [µM] (1 µM) (1 µM)

vegyület

R1

R2

295

H

2-OCH3

200

40

297

5-F

2-OCH3

599

299

H

2,6-(OCH3)2

5-F 2,6-(OCH3)2

301

IVM FM% humán µS

patkány µS

-

68

93

31

-

99

67

48

1,2

32,1

99

61

47

0,8

-

99

68

Rövidítések: I %: gátlás százaléka a vegyület megadott koncentrációjánál; DAU: dopamin felvétel; IVM FM%: in vitro metabolizmus, becsült maximális felszívódás; µS: mikroszóma; Old.: kinetikai oldékonyság pH=7,4-en és szobahımérsékleten meghatározva.

Az indol-2-karboxamidinek a projekt legoldékonyabb vegyületei. A nem tiszta profilú NR2B szelektív NMDA antagonisták mellékhatásaiért leginkább felelı ssé tehetı α1 és 5-HT2A receptorokhoz nem mutatnak affinitást, ellenben a dopamin felvételt (DAU) viszonylag nagymértékben gátolják. A humán és patkány mikroszómán mért in vitro metabolikus stabilitási értékek jelentıs eltérése ellenére, a relevánsabb humán adatok alapján metabolikusan stabil vegyületek. Bár a csoport metabolikusan legkevésbé stabil képviselı je éppen az in vivo, egér formalin fájdalomteszten leghatékonyabb 295 származék. Ebben a tesztben az 295

vegyület

jó

közepes hatást

referenciavegyületek értékének alig

mutatott, ED50 értéke a legjobb

háromszorosa,

referenciavegyület nem hatékony.

92

míg a

többi NR2B szelektív

20. táblázat. Egér formalin neuropátiás fájdalomteszt adatok. vegyület

R1

R2

egér formalin teszt, p.o. ED50 [mg/kg]

295

H

2-OCH3

15

297

5-F

2-OCH3

>20*

299

H

2,6-(OCH3)2

>20*

301

5-F

2,6-(OCH3)2

-


5,3

Co-101244 (12)

>20* (5,9 mg/kg i.p.)

EMD 95885 (8)

5,9 >20*

CP-101,606 Ro-256981(9)

>20* (5,1 mg/kg i.p.)

*: ED50 értéket nem határoztunk meg, ha a gátlás 20 mg/kg, p.o. dózisban 50%-nál kisebb volt.

Összefoglalva, új indol-2-karboxamidin-származékokat állítottam elı, amelyek hatásos és NR2B szelektív antagonistái az NMDA receptornak. A vegyületcsalád körében végzett vizsgálatainkból az a következtetés vonható le, hogy az ilyen típusú vegyületek aktivitása az aromás győrők szubsztituenseinek karakterétıl és helyzetétıl szokatlanul nagymértékben függ. A legjobb orális hatása egér formalin tesztben az 295 vegyületnek volt. Eredményeinket szabadalmi bejelentésben120 védtük és egy közleményben121 ismertettük. Az általam, a Roche és a Merck kutatói által elıállított aciklusos és ciklusos amidinek in vitro igen aktív és NR2B szelektív, in vivo a referenciavegyületekhez képest elfogadható hatású vegyületek, az újabb generációs leghatásosabb ifenprodilszerő anyagokkal szemben azonban nem állják ki az összehasonlítás próbáját, sem farmakodinámiai, sem farmakokinetikai szempontból. 4.7. 2. Indol-2-karboxamidin-származékok elıállítása

Az indol 2-es helyzetében korábban még senki sem alakított ki amidincsoportot A tervezett vegyületeket oldatfázisú parallel szintézissel állítottam elı (42. ábra). i, ii, iii

1

R

N H 310

OH O

iv, v, vi

1

R

N H

CN

311 ti, ii.: 90 - 99 %; tiii.: 41- 84 %

1

R

N H

H N NH2

R

2

Cl

295-309 tiv.: 82 - 99 %; tv, vi.:3 - 59 %

42. ábra. Indol-2-karboxamidin-származékok elıállítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) SOCl2, CHCl3, reflux 2 óra; (ii) NH4OH; (iii) POCl3, CHCl3, reflux 2 óra; (iv) HCl, EtOH, szobahımérséklet, 2 óra; (v) benzilaminok, szobahımérséklet, 6 óra; (vi) HCl.

93

Közel 200 tagú vegyülettárat hoztam létre nemszubsztituált és 5-szubsztituált-indol-2karbonsavnitrilekbı l kiindulva benzilaminokkal, Pinner szintézisen keresztül. Az indol-2karbonsavnitrileket a kereskedelmi forgalomból beszerezhetı indol-2-karbonsavakból állítottam elı a szokásos eljárásokkal. A nitrileket Pinner reakcióban alakítottam a megfelelı imidátokká8. Ezeket benzilaminokkal reagáltatva jutottam az amidin végtermékekhez. A nyerstermék oszlopkromatográfiás tisztítását követıen a termék azonosságát valamint tisztaságát HPLC-MS módszerrel határoztuk meg, és k' értékkel (tisztaság-kapacitás faktor) jellemeztük. A k' faktorokat a következı képlet szerint határoztuk meg:

k' = (tR - t0) / t0

ahol k’= kapacitás faktor, tR = retenciós idı és t0 = az eluens retenciós ideje. A hatásos vegyületeket újraszintetizáltuk, szerkezetüket igazoltuk (IR,1H-NMR, HRMS). 4.8. Benzilidén-piperidin-származékok

Az NR2B szelektív NMDA antagonisták várhatóan csak kis mértékben, vagy egyáltalán nem rendelkeznek azokkal a mellékhatásokkal, amelyek a nem szelektív NMDA antagonistákra jellemzıek. A nem szelektív NMDA antagonista fenciklidin és ketamin pszichotomimetikus hatásokat, hallucinációt, rosszullétet, katatóniát, amnéziát idéznek elı. Ezek a komoly mellékhatások gátolják gyógyszerként való használatukat. Az ebbe a csoportba tartozó vegyületek állatoknál is viselkedési rendellenességeket okoznak, például erısen stimulálják a motoros aktivitást, amnéziát és csökkent motoros koordinációt váltanak ki. NR2B altípus szelektív antagonistáknál kevés humán vizsgálat áll rendelkezésre, így ennek hiányában az állatokban tapasztalt mellékhatásokat tekintjük meghatározónak. Az NR2B szelektív vegyületek a nem szelektív NMDA antagonistákra jellemzı komoly mellékhatásokat nem mutatják, állat viselkedés tanulmányokban azonban a legtöbbnél lokomotoros aktivitást fokozó hatást figyeltek meg. A referenciavegyületek közül az Ro 25-6981-nél tapasztaltak ilyen hatást122, a CP-101,606 vegyületnél még nagyobb dózisokben sem123. Az irodalom alapján a CP-101,606 jelő vegyület az egyetlen NR2B szelektív antagonista, mely nem rendelkezik mozgást stimuláló hatással. Mivel a CP-101,606 jelő vegyület gyenge orális hatékonysággal rendelkezik és a közölt adatok alapján embereknek csak intravénásan adagolták, valamint polimorf CYP2D6 mediált metabolizmusa van124, nagy szükség van egy új NR2B szelektív antagonistára, mely kevés mellékhatással (magas terápiás index) és jó orális hatékonysággal (biológiai hasznosíthatóság) rendelkezik és terápiás célokra, fı leg orális kezelésekre, jól fejleszthetı. Munkánk során azt tapasztaltuk, hogy ha az eddig általunk azonosított hatásos szerkezetekben a benzil-piperidin részt benzilidén-piperidinre cseréljük szintén hatásos NR2B szelektív NMDA antagonistákhoz jutunk, amelyek in vivo 94

fájdalomcsillapító hatással rendelkeznek, hasonlóan a telített benzil-piperidin analogonokhoz. Ráadásul míg az utóbbi molekulák analgetikus dózisukban kisebb-nagyobb mértékben fokozták a lokomotoros aktivitást, addig a benzilidén-piperidin-származékok nem rendelkeznek mozgást stimuláló hatással a hatékony dózis legalább 6-szoros mennyiségénél sem. Ezen tulajdonságuk miatt terápiásan kedvezıbbek, mint az alacsonyabb terápiás indexszel rendelkezı NR2B szelektív NMDA antagonisták. Benzilidén-piperidin analogonokat a leghatásosabb vegyületcsaládokban, az indol, benzimidazol és oxálsavdiamidok körében állítottam elı. 4.8.1. Eredmények, szerkezet-hatás összefüggések az indol- és benzimidazolszármazékok körében

Az NR2B és rekombináns NR1/NR2A receptorokat expresszáló sejteken meghatározott funkcionális esszék eredményeit a 21. táblázatban foglaltam össze. Az 5(6)-hidroxibenzimidazol-2-karbonsav 4-benzilidén-piperidinnel képezett amidja (312) az in vitro funkcionális tesztben ugyanolyan hatásos, mint a korábban elıállított telített analogonja. Bár a 4-fluor-származék (314) IC50 értéke egy nagyságrenddel nagyobb a telített változatétól, még így is igen aktív vegyület. 21. táblázat. A benzimidazol- és indolszármazékok flourimetriás módszerrel meghatározott NMDA antagonista hatása patkány kortikális sejteken és NR1/NR2A transzfektált sejteken. Y HO

vegyület

a

N

N H

X

O

NMDA-kiváltott NR1/NR2A I % ∆ [Ca2+]ib (15 µM) c IC50 (nM)

Y

X

312 (142)

N

H

3,3

313

N

CH3

28

314 (148)

N

F

11

315

N

Cl

21

<30%.

316

N

CH3O

10

52%

CH

H

77

317 (82) a

Zárójelben a telített analogon száma. NMDA-kiváltott intracelluláris Ca2+ koncentrációváltozás. c Zárójelben a telített analogon IC50 értéke.

b

95

(2,2)

33% 34%

(1,2)

(18)

<30%

<30%

A metoxi-, klór- és metilcsoporttal helyettesített származékok (316, 315, 313) is kellı hatékonyságot mutattak ezen a teszten. A 6-hidroxi-indol-2-karbonsav 4-benzilidénpiperidinnel képezett amidja (317) négyszer kevésbé aktív, mint a telített (82) analogon. Szelektivitásuk az NR2A alegységeket tartalmazó NMDA receptorokhoz képest kielégítı. Affinitásuk az NR2A receptorokhoz szokatlanul nagy. Bár a 316 származék 52 %-os gátlása NR2A transzfektált sejteken a projektben mért legmagasabb hasonló érték, a szelektivitás még így is kb. 100. A benzilidén-piperidin-származékok a többi NR2B szelektív NMDA anatagonista vegyületcsalád közül azzal tőnnek ki, hogy az in vivo analgetikus tesztekben meghatározott hatékony dózisai a leginkább elkülönülnek azoktól a dózisoktól, ahol már mellékhatások figyelhetık meg. A farmakon biztonságosságát a két dózis hányadosával az ún. terápiás index-szel jellemzzük. Minél nagyobb ez az érték, a szer annál inkább biztonságos, a dozírozási lehetıségek nem lesznek szők korlátok közé szorítva. A vegyületek in vivo analgetikus hatását a tesztrendszerünknek megfelelıen elıször egér formalin tesztben mértük, a többi analgetikus modellt csak a tesztrendszer következı szintjein alkalmaztuk. Az elsı CNS mellékhatást jelzı teszt a lokomotoros aktivitás (LMA) mérése, így a terápiás ablakot elıször e két teszt alapján határozhatjuk meg. Egy vegyületet akkor tekintettünk lokomotor stimuláló hatásúnak, ha 50 %-nál nagyobb emelkedést váltott ki a mozgékonyságban. Vagyis, definíciószerően a lokomotoros aktivitás mentes (LMAfree) dózisok 50 %-nál kisebb emelkedést mutattak. A terápiás indexet a LMAfree és a formalin teszt ED50 értékének hányadosaként értelmezhetjük. A 22. táblázatban két jellemzı benzilidén-piperidin (312, 317) valamint azok telített analogonjainak analgetikus és lokomotoros aktivitás tesztben meghatározott eredményeit tüntettem fel. Referenciavegyületek hasonló értékeit a 23. táblázat tartalmazza. Látható, hogy míg a telített analogonok esetében nincs különbség az analgetikus dózis és a lokomotoros aktivitást stimuláló dózis között, addig a benzilidén-piperidin-származékok nem okoznak hiperaktivitást az analgetikus dózisok 6-szorosában sem. Ennyire különbözı hatásprofil nem volt várható ilyen látszólag minimális szerkezeti módosítás esetén. A referenciavegyületek közül a nem szelektív NMDA receptor antagonista MK-801 erısen növeli a lokomotoros aktivitást a farmakológiailag hatékony dózis tartományban (23. táblázat). A szelektív NR2B antagonista vegyületek közül a CI-1041 jelő referencia vegyület esetében sincs nagy különbség a hatékony dózis és a lokomotoros aktivitást fokozó dózis között. A CP-101,606 és az Ro-256981 az egér formalin tesztben nem volt hatásos.

96

22. táblázat. Benzimidazol- és indol-2-karboxamidok körében a benzilidén-piperidin-származékok és telített analogonjainak jellemzése formalin tesztben és lokomotoros aktivitás (LMA) tesztben. Terápiás indexek (TI) számolása.

benzilidén-piperidinek vegyület

312

317

egér formalin teszt, p.o. ED50 mg/kg 2,6

0,43

LMA

TI

15

%-os növekedés 27

30

63

3,75

0

7,5

55

15

69

dózis mg/kg

LMAmentes/ED50 5,8

8,7

benzil-piperidinek vegyület

egér formalin teszt, p.o. ED50 mg/kg

LMA

TI

dózis mg/kg

%-os növekedés

LMAmentes/ED50

142

1,6

1,875

80

< 1,2

82

1,7

1,875

90

< 1,1

23. táblázat. NMDA antagonista referencia vegyületek, a nem szelektív NMDA antagonista MK-801 és szelektív NR2B antagonista CI-1041 jellemzése formalin tesztben és lokomotoros aktivitás (LMA) tesztben. Terápiás indexek (TI) számolása.

vegyület

MK-801

egér formalin teszt, p.o. ED50 mg/kg 0,15

CI-1041

2,4

Ro 25-6981

>20*

CP-101,606

>20*

LMA dózis mg/kg

%-os növekedés

0,1

114

0,3

217

10

137

TI LMAmentes/ED50 <1 <4

* CP-101,606 és Ro-256981 20 mg/kg dózisban csak 38 %-os illetve 12 %-os gátlást mutatott a formalin tesztben.

Eredményeinket szabadalmi bejelentésben125 védtük.

97

4.8.2. Indol- és benzimidazol-származékok elıállítása

A 312-316 és 317 vegyületeket a megfelelı indol- és benzimidazol-2-karbonsavakból (106 és 173) és 4-benzilidén-piperidinekbı l (318) állítottam elı HBTU kapcsolószer segítségével (43.

ábra). Y HO

N H

Y

i OH +

HN

X

HO

O

173 Y = N 106 Y = CH

N

N H

318

X

O

312-316 Y = N (t.:19 - 41 %) 317 Y = CH (t.: 65 %)

43. ábra. A 312-316 és 317 vegyületek elıállítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) HBTU, Et3N, DMF, szobahımérséklet, 16 óra.

A nitrogénen benzilcsoporttal védett 4-benzilidén-piperidineket (318) 1-benzil-piperidin-4onból kiindulva Horner-Wadsworth-Emmons reakcióval állítottam elı (44. ábra). A kereskedelmi forgalomban nem hozzáférhetı szubsztituált benzilfoszfonát reagensekhez Arbuzov-reakcióval a megfelelı benzil-halogenid és trietil-foszfit hevítésével jutottam. A piperidin benzil-védıcsoportjának 1-klóretil-kloroformáttal történı eltávolításával a termék sósavsóként, tisztán és jó termeléssel izolálható volt. A kettıskötés a piperidingyőrőhöz képest 100 %-ban exo-helyzető, míg benzil helyett Boc-védıcsoport alkalmazásakor a védıcsoport sósavas eltávolítása exociklusos és endociklusos termékek 5 : 1 arányú keverékét eredményezte.

A

benzil

védıcsoporttal

kialakított

4-benzilidén-piperidinben

és

származékaiban a kettıskötés exo helyzete már stabil, savak, lúgok hatására sem változik. 4benzilidén-piperidin-származékok az irodalomban nem voltak ismert vegyületek. Benzilpiperidinek szintézisekor alkalmazták ugyan a Horner-Wadsworth-Emmons reakciót, de a telítetlen terméket senki sem izolálta, azonnali hidrogénezéssel a telített származékot nyerték ki. O N 319

i

ii N

X 320

Cl

H

N

X

H

318 (tx = H.: 70 %)

44. ábra. 4-benzilidén-piperidinek elıllítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) dietil-benzilfoszfonátok, NaH, DMF, 0-20oC, 2óra (ii) (1) 1-klóretil-kloroformát, diklóretán, 0-10oC 1 óra, reflux 1 óra; (2) metanol, reflux 1 óra.

4.8.3. Eredmények, szerkezet-hatás összefüggések az oxálsavdiamidok körében

Az oxálsavdiamid vegyületcsalád benzil-piperidin szerkezeti részének benzilidén-piperidinre való cseréje a terápiás index még nagyobb mérvő emelkedését eredményezte. In vitro 98

aktivitásuk a legtöbb estben elmarad a telített analogonokhoz képest in vivo aktivitásuk azonban lényegesen nem változott. A lokomotoros aktivitást jelentısen emelı dózis viszont jóval nagyobb, így a számított terápiás index is ezzel arányosan nı (24. táblázat). 24. táblázat. Oxálsavdiamidok körében a benzilidén-piperidin-származékok és telített analogonjainak jellemzése formalin tesztben és lokomotoros aktivitás (LMA) tesztben. Terápiás indexek (TI) számolása. O Q

N

N H

X

O

benzilidén-piperidinek vegyület

Q

X

H N

321

O

322

O

O

N H

H N N H

NMDA-kiváltott egér formalin teszt, p.o ∆ [Ca2+]ia ED50 mg/kg IC50 (nM)

LMA dózis mg/kg

%-os növekedés

TI LMAmentes /ED50

H

21

1,3

60 120

35 69

46

CH3

90

0,94

60

13

>64

benzil-piperidinek vegyület

a

Q

X

H N

184

O

188

O

O

N H

H N N H

NMDA-kiváltott egér formalin teszt, p.o ∆ [Ca2+]ia ED50 mg/kg IC50 (nM)

H

2,4

0,85

CH3

11

0,48

LMA dózis mg/kg

%-os növekedés

1 3

34 62

3,75

72

7,5

141

TI LMAmentes /ED50 < 1,2 <8

NMDA-kiváltott intracelluláris Ca2+ koncentrációváltozás.

Az 321 benzilidén-piperidin-származék a vegyületcsalád egyik leghatásosabb vegyülete. A terápiás dózisban a lokomotoros aktivitást nem növelte. Egyéb CNS mellékhatásokat jelzı tesztekben, PCP és CCI modellben, rotarod tesztben sem mutat aktivitást. A Morris vízlabirintus tesztben nincs hatása a tanulási folyamatokra. Ames teszt alapján nem mutagén. Nem gátolja a hERG csatornákat, nincs kardiovaszkuláris mellékhatása. Patkány toxikológiai vizsgálatban 150 mg/kg/nap dózist is jól toleráltak az állatok, a kutya toxigológia is biztonságos profilt mutatott. 99

Seltzer féle egér neuropátiás modellben 2 mg/kg dózisban 50,2 %-os választ váltott ki. A karragén-indukált hiperalgézia tesztben patkányokban hatásos, akut és krónikus modellben egyaránt. A vegyület magas terápiás indexe lehetıvé teszi, hogy a viszonylag gyenge 20 %-os biohasznosulását egy nagyobb dózis kompenzálja. Magasabb dózisban azonban enyhe tolerancia alakult ki. Eredményeinket szabadalmi bejelentésben126 védtük. 4.8.4. Oxálsavdiamidok elıállítása

A telítetlen oxálsavdiamidok kialakításakor a telített analogonoknál bevált reakcióutat alkalmaztam. Elıször a benzilidén-piperidineket acileztem etil-oxalil-kloriddal. Majd az észtercsoport hidrolízését követıen az oxálsav másik karboxilcsoportjával anilineket acileztem. (45. ábra). A tervezett vegyületeket oldatfázisú parallel szintézissel állítottam elı 10, a telített analogonoknál bevált anilin és 5 szubsztituált benzilidén-piperidin felhasználásával (46. ábra). A nagyobb mennyiségben elıállított oxálsav-félamiddal párhuzamosan acileztem a 10 anilint. A nyerstermékek oszlopkromatográfiás tisztítását követıen a termék azonosságát és tisztaságát HPLC-MS módszerrel határoztuk meg. A hatásos vegyületeket újraszintetizáltuk, szerkezetüket igazoltuk (IR,1-H NMR, HRMS). O

i HN

X

HO O

318

O

ii N

Q

X

323 (tX = H.: 88 %)

N H

N

X

O 321, 322 (t321.: 65 %)

45. ábra. Oxálsavdiamidok elıállítása. Reagensek és reakciókörülmények: (i) (1) ClCOCOOEt, Et3N, CHCl3, 10 - 20oC, 1 óra; (2) NaOH, EtOH/H2O, szobahımérséklet, 1 óra; (3) 1 N HCl; (ii) QNH2, HBTU, Et3N, DMF, szobahımérséklet, 18 óra. H N

H N

O

H N

O O

H N NH2

Ac

H N

NH2

H N

H N

NH2

NH2

NH2

Mez

H N

O

O N H

O

CH3

O O

N

NH2

O

S

H N

O N H

NH2

O

S

NH2

NH2

HN

NH2

X

X : H, CH3, F, Cl, CH3O 46. ábra. Telítetlen oxálsavdiamidok parallel szintézise során felhasznált 10 anilin és 5 benzilidén-piperidin származék.

100

5. A PROJEKT BEFEJEZÉSE

Az NR2B receptor antagonista hatású vegyületek kutatása nyolc éven át tartott (1998-2006). Ezen idı alatt 2805 molekulát állítottunk elı és vizsgáltak meg farmakológus kollégáink. A vegyületek döntı részét az elsı 4-5 évben szintetizáltuk, 1527-et hagyományos módon, 1278at a kombinatorikus kémia eszközeivel. Eközben 8 alapszabadalmi bejelentést nyújtottunk be. A 47. ábrán a versenytársak szabadalmi bejelentéseit is összefoglaltam. 1989-tıl 2008-ig 88 bejelentést tettek a felsorolt gyógyszergyárak. Ebbı l 40-et a legintenzívebb idıszaknak tekinthetı 1999 és 2001 között nyújtottak be. A terület kutatásába 1998-ban, a versenytársak maximális aktivitásakor kapcsolódtunk be. A viszonylag kései indulás miatti hátrányunkat az addigra

felhalmozott

tudásnak

köszönhetıen

hamar

behoztuk.

Elsı

szabadalmi

bejelentésünket már 2000-ben benyújtottuk az indol és benzimidazol-2-karboxamidok védelmére. A következı évben az oxálsavdiamid-származékokat védtük. 2004-ben egyszerre hat szabadalmi bejelentést nyújtottunk be, az ismertetett vegyületcsaládok oltalmát kérve. Ezt követıen a versenytársak szabadalmi aktivitása is megszőnt. Cégünk kutatási vezetése 2001 december 19-én döntött a 185-ös számú (RGH-896, radiprodil) oxálsavdiamid-származék klinikai fejlésztését illetıen. Ezt követıen backup és follow-up kutatást végeztünk. A számos in vitro aktív származék közül, valamennyi ismertetett vegyületcsaládban sikerült azonosítani

orálisan is felszívódó, in vivo hatékony vegyületeket. Cég/év Searle Pfizer Warner-L. CoCensys Pharmacia Roche Merck KGaA Synthelabo Merck& Co. Alcon Richter Vertex Shionogi

‘89 ‘90 ‘91 ‘92 ‘93 ‘94 ‘95 ‘96 ‘97 ‘98 ‘99 ‘00 1 4 1 2 3 1 1 1 5 6 1 1 1 4 1 1 4 4 1 2 2 1 1 1 2 9 2 1 1

‘01 ‘02 ‘03 ‘04 ’05 ‘06 ‘07 ‘08 1

2

5 3

1 2

3

1

1 1

3 6 1

1

47. ábra. NR2B szelektív NMDA antagonista hatású vegyületek védelmére benyújtott alapszabadalmi bejelentések.

101

6. ÖSSZEFOGLALÁS

Doktori munkámban a Richter Gedeon Vegyészeti Gyárban folytatott NR2B szelektív NMDA antagonisták körében végzett kutatás gyógyszerkémiai vonatkozásait mutatom be. Az NMDA receptor az ionotróp glutaminsav receptorok egyik típusa. NR1 és NR2 alegységekbı l épül fel, melyek közül az utóbbinak négy (A-D) altípusa ismert. Az NMDA antagonisták alkalmazhatósága számos területen felmerült és kísérletes bizonyítást nyert neuroprotekció, fájdalomcsillapítás, görcsgátlás, Parkinson modellek, drog- és alkohol-függıség esetén. A tisztán NMDA antagonista hatású vegyületek fejlesztése tipikus mellékhatásaik miatt (pszichotomimetikus, szedatív, memóriarontó) abbamaradtak. Az NR2B alegység altípusra szelektív antagonisták mentesnek bizonyultak ezektıl a mellékhatásoktól. A krónikus és neurogén fájdalmak csillapítása megoldatlan terápiás probléma. Társaságunk a kielégítetlen gyógyászati igényt és a hatásmechanizmus újdonságát mérlegelve, 1999-ben döntött az NR2B szelektív NMDA antagonista hatásmechanizmuson alapuló új fájdalomcsillapító kutatási projekt elindításáról. Terápiás célunk egy orálisan adható fájdalomcsillapító volt krónikus és neurogén fájdalmak enyhítésére. Ennek érdekében ifenprodil típusu, NR2B szelektív antagonista hatású molekulák elıállítását és tesztelését határoztuk el. Egy az irodalomból ismert közepes hatású molekulából kiindulva több, számos szerkezeti módosításra lehetıséget adó, hatásos vegyületcsaládot azonosítottunk. Az egyes vegyületcsaládok vezérmolekuláit a klasszikus gyógyszerkémia szabályainak megfelelıen optimalizáltuk. Az in vitro és in vivo biológiai vizsgálati módszerek egymásra épülı rendszert, ún. szkrínkaszkádot alkottak. Új molekulák tervezésekor elsısorban egy NMDA funkcionális teszt adatait vettük figyelembe. Az elıállított molekulákat a farmakofor modellünk fejlıdését leginkább tükrözı idırendi sorrend alapján mutatom be. Saját kutatásunk és a versenytársak reprezentatív eredményeit 47. ábrán egy idıskálán állítom párhuzamba. Az elsıként azonosított NR2B altípus szelektív NMDA anatagonista hatású molekula az ifenprodil volt. Az ifenprodil azonban vegyes profilú anyag, számos receptor és ioncsatorna mőködését is gátolja. Az eredetileg α-1 adrenoceptor antagonista hatása alapján vérnyomáscsökkentésre kifejlesztett ifenprodilról késıbb mutatták ki, hogy nem kompetitív antagonistája az NR2B altípust tartalmazó NMDA receptornak. Az ezen a területen megindult kutatásokban leggyakrabban az ifenprodilt választották kiindulópontként, aminek eredményeként számos hatásos, hozzá hasonló farmakoforral rendelkezı molekulát és vegyületcsaládot fedeztek fel.

102

OH N CH3

HO

ifenprodil

Hosszú idın keresztül az ifenprodilhoz hasonlóan bázikus nitrogént is tartalmazó farmakofor modell alapján folyt a vegyületek elıállítása. A kilencvenes évek elején társaságunknál is nagyszámú ifenprodil analogon készült in vivo CNS vizsgálatok céljából. 1998-ban jelent meg az irodalomban az a megfigyelés, miszerint a bázikus nitrogén nem alapfeltétele a szelektív NMDA receptor antagonizmusnak. Az University of Oregon, a CoCensys és a Parke Davis közös kutatócsoportja egy fahéjsavamidot (35) azonosított hatásos és szelektív NR2B antagonistaként. Kémiai munkánk kiindulópontjaként választottuk ezt a vegyületet mivel feltételezésünk szerint a mellékhatások döntı részéért éppen az ifenprodil analogonokban lévı bázikus nitrogén a felelıs. A 35 fahéjsavamid aminkomponensének elınyös cseréjével egy aktívabb származékhoz jutottam (69). OH

O

OH

O

N H

N H

Cl

Cl

35

OH

69

Közben az University of Oregon, a CoCensys és a Parke Davis közös kutatócsoportja egy újabb közleményben további megfigyelésekrı l számolt be. Többek között leírták, hogy a klóratom és a hidroxilcsoport helyzetének felcserélése szintén hatásos molekulát (65) eredményezett, vagyis mindkét orientációjú molekula képes kötıdni a receptorhoz. A 4hidroxi-fahéjsavamid (65)

4-klór-feniletil-amin

amidkomponensét

4-benzil-piperidinre

cserélve egy közel háromszor aktívabb molekulához jutottak (37). Cl

O

HO

N H

N

HO

O

65

37

Felismerve a bázikus nitrogént nem tartalmazó molekulák vélhetı elınyeit, kémiai munkánkat erre a megfigyelésre alapoztuk, és sokáig egyedül a versenytársak közül savamid típusú vegyületeket állítottunk elı. Az ifenprodilszerő anyagokat leíró farmakofor modell esszenciális és a változtatásokat jobban toleráló részeinek megismerése után igazoltuk 103

feltételezésünket, miszerint a fahéjsav szerkezeti rész merevítésével még hatásosabb molekulákhoz juthatunk. A fahéjsav α-szénatomjának és benzolgyőrőjének összekötése a protondonor sajátságú NH-csoporttal egy hatszor hatásosabb vegyülethez a 6-hidroxi-indol-2karboxamidhoz (82) vezetett.

HO

5 Q

N

N H

4

6 O

7

Y

3 W

Z

V 2 X 1

82

N

A

Az indolszármazékok optimalizációja során az összes lehetséges ponton megvizsgáltuk a gyógyszerszerő

molekulákat

eredményezı

változtatások

biológiai

hatását

(A).

Tanulmányoztuk miként befolyásolja az aktivitást a hidroxilcsoportok száma és pozíciója. Vizsgáltuk az indolgyőrő 1-es és 3-as helyzetének helyettesíthetıségét, a karbonilcsoport szerepét. A farmakofor modell legkonzervatívabb részének a piperidingyőrő bizonyult, más aminra való lecserélése a hatás elvesztésével járt. Változtattuk a piperidingyőrőn a benzilcsoport helyét, az aromás rész szubsztituenseit, a piperidin 4-es helyzető szénatomja és a jobboldali aromásgyőrőt összekötı láncot. A fahéjsav merevítésével levezethetı indolszármazékok kedvezı farmakológiai eredménye után más heterobiciklusokat is megvizsgáltunk. Az indolváznak a vele potenciálisan izoszter benzimidazol győrőrendszerrel való helyettesítése még aktívabb származékot (142) eredményezett. A benzimidazolszármazékokat az indolszármazékok körében nyert tapasztalatok alapján optimalizáltuk. N HO

N

N H

O

142

Az indol- és benzimidazol-2-karboxamidokat védı szabadalmi bejelentésünk benyújtása után egy évvel, egy Merck szabadalmi bejelentés nyilvánossá válásakor derült ki, hogy a Merck kutatói

velünk

egyidıben

szintén

benzimidazol-származékokat

vizsgáltak.

Bár

példavegyületeikben a győrő kettes helyzető szénatomját karbonil helyett alkillánc köti össze a piperidin nitrogénjével, a fél évvel hamarabb benyújtott bejelentésükben megfogalmazott túl általános képlet rontotta a mi vegyületeink újdonságát. További iparjogvédelmi lépésekre nem volt szükség, ugyanis idıközben egy még aktívabb vegyületcsaládot azonosítottunk. Az indol pirrolrészének képzeletbeli győrőfelnyitásával egy új hatásos szerkezethez, oxálsavdiamidhoz jutottunk (183). Sikeres stratégiát dolgoztunk ki a metabolikusan instabil fenolos 104

hidroxilcsoport helyettesítésére. A fenol molekularész lecserélése protondonor sajátságú NHcsoportot tartalmazó heterobiciklusokra az ADME tulajdonságok mellett a hatás javulását is eredményezte. A molekula optimalizálását követıen a legelı nyösebb tulajdonságokkal rendelkezı 185-ös származékot (RGH-896, radiprodil) választottuk ki klinikai vizsgálatok céljából. HO

H N

O N H

O

O

N

O

N

N H

O

183

F

O

185 (RGH-896, radiprodil)

Az indolgyőrő pirrolrészének egy karbonilcsoporttal történı képzeletbeli győrőbıvítésével levezethetı kinurénsavszármazék (230) szintén hatásos molekula. A 230 vezérmolekulát az indol- és benzimidazol-2-karboxamidok körében nyert tapasztalatok alapján rövid idın belül, egy tucat származék képzésével sikerült optimalizálni. O HO N

N H

O

230

Az oxálsavdiamidok eredményességét követıen tíz olyan háromtagú láncot vizsgáltam meg mellyel összekötve a baloldali aromásgyőrőt és a piperidin nitrogénjét, gyógyszerszerő molekulához jutunk (B). Ezek közül legaktívabbnak egy benzoil-karbamid-származék bizonyult (274). A molekula optimalizációját oldatfázisú kombinatorikus kémiai szintézissel oldottam meg. HO

HO A

B

C

H N

N O

B

N O

274

A nem ifenprodil típusú molekulák kutatását egy korábbi Merck közleményt követıen indítottuk el 2003-ban, melyben NR2B receptoron ható amidinekrı l számoltak be (46, 48)119, 79

. Szabadalmi védelmükrı l már, 1999-ben és 2000-ben gondoskodtak. A Merck kutatóinak

eredményeit felhasználva, korábbi tapasztalatom alapján új típusú, gyógyszerszerőbb

105

szerkezetet, indol-2-karboxamidineket (299) terveztem. A vegyületeket kombinatorikus kémia módszerével állítottam elı. NH

N H

Richter

CH3O H N

NH

OCH3 Merck

N H

OCH3

N H CF3O

NH2

OCH3

Cl

299

46 (Merck)

48

Az utolsó fejezetben 4-benzilidén-piperidin-származékokat ismertetek. A korábban elıállított hatásos molekulák többsége 4-benzil-piperidin-származék volt. Ezek benzilidén-piperidin megfelelı i azon túlmenıen, hogy hasonló affinitással kötıdnek az NR2B receptorokhoz, még egy elı nyös tulajdonsággal rendelkeznek. A vizsgált mellékhatásokkal kapcsolatban, különös tekintettel a lokomotoros aktivitás fokozására, jóval nagyobb a terápiás ablakuk. Ez a hatás kiváltképpen a benzimidazol (312) és az oxálsavdiamid-származékok (321) esetében figyelhetı meg. H N

N HO

N

N H

O

O O

O

312

N

N H

O

321

Az indol- és benzimidazol-2-karbonsavak benzilidén-piperidinekkel képezett amidjait hagyományos módon, míg az oxálsavdiamidokat oldatfázisú parallel szintézissel állítottam elı. Kutatómunkánk több preklinikai vizsgálatokig jutó ígéretes anyagot eredményezett, melyek közül egy (RGH-896, radiprodil) klinikai vizsgálatokra került. Munkánk eredményeirı l eddig 8 szabadalmi bejelentésben és 9 gyógyszerkémiai tárgyú cikkben számoltunk be.

106

47. ábra. A Richter Gedeon és a versenytársak kiemelt NR2B szelektív NMDA antagonista hatású reprezentatív vegyületei az idı tükrében.

Versenytársak

Richter Gedeon

1982

OH

ifenprodil Synthelabo

N

szabadalmaztatás ideje

elõállítás ideje

1966

CH3

HO

OH N

F

eliprodil Synthelabo

HO OH OH

1989

CH3

HO

Nagyszámú ifenprodil analóg in vivo CNS vizsgálatokra OH

traxoprodil, CP-101606 Pfizer

N

1991

Y

N X

OH

9, Ro 25.6981 Hoffmann La Roche

N

1993

CH3

HO

NR2B altípus meghatározása, ifenprodil mint NR2B szelektív anyag Molecular Pharmacology 1993; 851-859

H N

1996

O

N

O

F

O O HO

1998

NR2B kutatás indulása N H Cl

OH

H N O O

OH

O

N

S O

1998.08. OH

F OH

O N H

69

CH3

N

1997

8, EMD-95885 Merck 12, Co101,244 Warner Lambert 28, bezonprodil, CI-1041 CoCensys 35,Co 101526 CoCensys

Cl O N HO

107

37

Versenytársak

Richter Gedeon

NH

1999

HO

1999.11.

N

N H

OH

HN

N

N

N

38 analóg Merck

N

N H

OH

O

CH3

N

HO

OH

12 Hoffmann La Roche

N

142 HO

184

61 Hoffmann La Roche

N

1999.10. 2000

O

51 Merck

CF3O

szabadalmaztatás ideje

elõállítás ideje

82

CF3 N H

H N

NH

2000.07.

I

N H

O

O

O O

N

N H

2001.01.

N

N H

46 Merck

2001 O HO

O

N

H N

42 Merck

O

O

321

H N O

2002

O

O

N

N H

274

H N

O

HO H N

2002.04.

N

O

O

O O

O

N H

N

Merck

O

O O

230

HO

2002.11.

N

N H

O

2003

H N

HO H N O

CH3O

299 N H

H N NH

Pfizer

N

2003.07. OCH3 OH OH

OEt N

2004

108

O

N H

N

Pfizer

7. TÉZISEK 1.

Felismerve a bázikus nitrogént nem tartalmazó molekulák vélhetı elınyeit egy, az

irodalomból ismert közepes hatású, ám nem bázikus nitrogént tartalmazó savamid típusú molekulából kiindulva, in vitro aktív, NR2B szelektív NMDA antagonista hatású fahéjsavamidokat állítottam elı. Feltevésünk igazolódott, az NR2B szelektív NMDA antagonisták mellékhatásaiért leginkább felelıssé tehetı α1 és 5-HT2A receptorokhoz a fahéjsavamidok nem mutatnak affinitást. 2.

Az University of Oregon, a CoCensys és a Parke Davis közös kutatócsoportjának a

fahéjsavamidok kutatásában elért eredményeit felhasználva feltérképeztem milyen, az ifenprodil analogonok körében közkedvelt piperidinektıl eltérı szekunder aminnal képezett fahéjsavamid mutat még kellı hatékonyságot. A kiválasztott szekunder aminokat, kombinatorikus kémiai módszerrel több, a fenolos hidroxilcsoporttól metabolikusan stabilabb, de hasonlóan protondonor csoporttal szubsztituált fahéjsavval acileztem. Ílymódon a versenytársak és saját korábbi leghatásosabb vegyületeinknél is aktívabb, vélhetıen metabolikusan stabilabb fahéjsavszármazékot sikerült elıállítanom. 3. Igazoltam feltételezésünket, miszerint a fahéjsav szerkezeti rész merevítése még aktívabb

molekulákat eredményez. A fahéjsav α-szénatomjának és benzolgyőrőjének protondonor sajátságú NH-csoporttal való összekötésével egy, a fahéjsavamidoktól sokkal aktívabb vegyületcsaládhoz, 6-hidroxi-indol-2-karboxamidokhoz jutottam. Több képviselı jük, in vivo is hatásos,

megfelnek egy gyógyszerrel szemben támasztott farmakokinetikai és

farmakodinámiai követelményeknek. A vezérmolekula optimalizálása során elıállított nagyszámú származék szerkezet-hatás összefüggéseit felhasználva igyekeztem teljeskörően felderíteni a farmakofor modellt, lehetıvé téve újabb hatásos vegyületcsaládok azonosítását, azok minél hatékonyabb optimalizálását.105, 106, 108 4.

A 6-hidroxi-indol-2-karboxamidok indolvázának benzimidazol győrőrendszerrel való

helyettesítésével elıállítanom. 5.

általánosan

egy

nagyságrenddel

aktívabb

származékokat

sikerült

105, 107, 108

A 6-hidroxi-indol-2-karboxamidokban az indol pirrolrészének képzeletbeli győrőfel-

nyitásával egy új hatásos szerkezethez, oxálsavdiamidhoz jutottunk. Sikeres, a fahéjsav-

109

amidok körében már bevált stratégiát dolgoztunk ki a metabolikusan instabil fenolos hidroxilcsoport helyettesítésére. A fenol molekularész lecserélése protondonor sajátságú NHcsoportot tartalmazó heterobiciklusokra az ADME tulajdonságok mellett a hatás javulását is eredményezte.110, 111 6.

A 6-hidroxi-indol-2-karboxamidokban az indol pirrolrészének egy karbonilcsoporttal

történı

képzeletbeli

győrőbıvítésével

szintén

aktív

molekulacsaládhoz,

kinurénsavszármazékokhoz jutottam.113, 114 7.

Az oxálsavdiamidok eredményességét követıen analitikus módon megvizsgálva és

változtatva a baloldali aromásgyőrőt és a piperidin nitrogénjét összekötı láncot, in vivo is hatásos, NR2B szelektív NMDA antagonista hatású benzoil-karbamid-származékokat azonosítottam.117, 118 8.

Az NR2B szelektív NMDA antagonistákra jellemzı 4-benzil-piperidin aminkomponenst

az általunk korábban elıállított hatásos származékokban 4-benzilidén-piperidinre cserélve az NR2B receptorokhoz hasonló affinitással kötıdı, de sokkal kedvezıbb mellékhatásprofillal rendelkezı

vegyületekhez

jutottam.

A

4-benzilidén-piperidinek

gyógyszerkémiai

alkalmazását az általam kidolgozott elıállítás tette lehetıvé, melynek során a kettıskötés exo helyzete stabil marad.125, 126 9. A nem ifenprodil típusú molekulák körében végzett munkám során a Merck kutatói által

azonosított E-N1-(benzil)fahéjsavamidint választva kiindulópontnak, felhasználva a korábban tapasztalt fahéjsav-indol szerkezeti elemek bioizosztériáját, gyógyszerszerőbb szerkezetet, indol-2-karboxamidineket terveztem. A vegyületeket kombinatorikus kémiai módszerrel állítottam elı.120, 121

110

8. MOLEKULALISTA

Dolgozatom a Richterben végzett NR2B szelektív NMDA antagonista kutatás egészét átfogja. A hagyományos módon elıállított vegyületek szerkezetét NMR és MS spektroszkópiával, tisztaságát (min. 95 %) HPLC módszerrel igazoltuk. A kombinatorikus kémiai módon vagy parallel reakciókkal elıállított vegyületeket HPLC-MS alapján azonosítottuk (tisztaság min. 85 %), a közülük hatásosnak bizonyúló molekulákat hagyományos módszerrel is elıállítottuk, szerkezetüket

igazoltuk.

Munkánk

eredményeirı l

eddig

a

következı

szabadalmi

bejelentésekben, cikkekben és elıadásokban számoltunk be. Cikkek: 1./ 38. Borza, I.; Domány, Gy. NR2B Selective NMDA Antagonists: The Evolution of the Ifenprodil-Type Pharmacophore. Curr. Top. In Med. Chem. 2006, 6, 687-695. (IF: 4,40; I: 22) 2./ 106. Borza, I.; Kolok, S.; Gere, A.; Ágai-Csongor, É.; Ágai, B.; Tárkányi, G.; Horváth, Cs.; Barta-Szalai, G.; Bozó, É.; Kiss, Cs.; Bielik, A.; Nagy, J.; Farkas, S.; Domány, Gy. Indole-2-carboxamides as Novel NR2B Selective NMDA Receptor Antagonists. Bioorg. Med. Chem. Letters 2003, 13, 3859-3861. (IF: 2,182; I: 19) 3./ 107. Borza, I.; Kolok, S.;Gere, A.; Nagy, J.; Fodor, L.; Galgóczy, K.; Fetter, J.; Bertha, F.; Ágai, B.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Domány, Gy. Benzimidazole-2-carboxamides as Novel NR2B Selective NMDA Receptor Antagonists. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 4638-4640. (IF: 2,538; I: 8) 4./ 108. Borza, I.; Bozó, É.; Barta-Szalai, G.; Kiss, Cs.; Tárkányi , Á.; Demeter Á.; Gáti T.; Háda, V.; Kolok, S.; Gere, A.; Fodor, L.; Nagy, J.; Galgóczy, K.; Magdó, I.; Ágai, B.; Fetter,J.; Bertha, F.; M. Keserő, Gy.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Greiner, I.; Domány, Gy. Selective NR1/2B N-Methyl-D-aspartate Receptor Antagonists among Indole-2-carboxamides and Benzimidazole-2-carboxamides. J. Med. Chem. 2007, 50, 901-914. (IF: 4,895; I: 5) 5./ 111. Barta-Szalai, G.; Borza, I.; Bozó, É.; Kiss, Cs.; Ágai, B.; Proszenyák, Á.; Keserő, Gy. M.; Gere, A.; Kolok, S.; Galgóczy, K.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Domány, Gy. Oxamides as novel NR2B selective NMDA receptor antagonists. Bioorg. Med. Chem. Letters 2004, 14, 3953-3956. (IF: 2,333; I: 19) 6./ 114. Borza, I.; Kolok, S.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Domány, Gy. New kynurenic acid amides as novel NR2B selective NMDA receptor antagonists. Bioorg. Med. Chem. Letters 2007, 17, 406-409. (IF: 2,604; I: 2) 7./ 118. Borza, I.; Greiner, I.; Kolok, S.; Galgóczy, K.; Ignácz-Szendrei, Gy.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Gáti, T.; Háda, V.; Domány, Gy. New benzoyl urea derivatives as

111

novel NR2B selective NMDA receptor antagonists. Die Pharmazie 2006 61(9), 799800. (IF: 0,606; I: 2) 8./ 121. Borza, I.; Kolok, S.; Ignácz-Szendrei, G.; Greiner, I.; Tárkányi, G.; Galgóczy K.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Domány, Gy. Indole-2-carboxamidines as novel NR2B selective NMDA receptor antagonists. Bioorg. Med. Chem. Letters 2005, 15, 54395441. (IF: 2,478; I: 4) 9./

Wéber, Cs.; Bielik, A.; Demeter, Á.; Borza, I.; Ignácz-Szendrei, G.; Keserő, Gy.; Greiner, I.; Solid-phase synthesis of 6-hydroxy-2,4-diaminoquinazolines. Tetrahedron 2005, 61, 9375-9380. (IF: 2,61; I: 3)

Szabadalmak: 1./ 105. Borza, I.; Bartáné Szalai, G.; Domány, Gy.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Nagy, J.; Kolok, S. Amide derivatives as NMDA receptor antagonists. WO 2002/34718A1. 2./ 110. Domány, Gy.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Barta-Szalai, G.; Nagy, J.; Kolok, S.; Bozó, É.; Borza, I.; Vágó, I.; Bielik,A.; Ignácz-Szendrei Gy.; Keserő, Gy. M. Piperidine derivatives as NMDA receptor antagonists. WO 2003010159A1. 3./ 113. Borza, I.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Nagy, J.; Kolok, S. Kynurenic acid amide derivatives as NR2B receptor antagonists. WO 2006010967A1. 4./ 117. Borza, I.; Bartáné Szalai, G.; Bozó, É.; Kis, Cs.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Nagy, J.; Kolok, S. New benzoyl urea derivatives. WO 2006010966A1. 5./ 120. Borza, I.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Nagy, J.; Kolok, S. Indole-2-carboxamidine derivatives as NMDA receptor antagonists. WO 2006010965A1. 6./ 125. Borza, I.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Gyertyán, I.; Nagy, J.; Kolok, S.; Galgóczy, K.; Sághy, K. New heterocyclic acid amide derivatives. WO 2006010969A1. 7./ 126. Borza, I.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Gyertyán, I.; Nagy, J.; Kolok, S.; Galgóczy, K.; Sághy, K. New 4-benzylidene-piperidine derivatives. WO 2006010964A1. 8./

Keserő, Gy. M.; Vágó, I.; Farkas, S.; Horváth, Cs.; Bielik, A.; Borza, I.; Wéber, Cs.; Kolok, S. New aryloxy acetic acid amide derivatives. WO 2006010968A1.

Elıadások: 1./

Új, NR2B-szelektív NMDA antagonista hatású indol-2-karbonsav-amid és benzimidazol-2-karbonsav-amid származékok Borza István, Tárkányi Gábor, Demeter Ádám, Kolok Sándor, Bartáné Szalai Gizella, Bozó Éva, Kis Csilla, Ágai Béla, Berta Ferenc, Fetter József, Domány György 2002. Balatonszemes, Heterociklusos Kémiai Munkabizottsági Őlés

2/

Új, NR2B-szelektív NMDA antagonista benzimidazol-2-karbonsav-amid származékok 112

hatású

indol-2-karbonsav-amid

és

Borza István, Tárkányi Gábor, Demeter Ádám, Kolok Sándor, Bartáné Szalai Gizella, Bozó Éva, Kis Csilla, Ágai Béla, Berta Ferenc, Fetter József, Domány György 2002. Visegrád, Gyógyszerkémiai és Gyógyszertechnológiai Szimpózium 3/

Fenol bioizosztér heterociklusok NR2B szelektív NMDA antagonisták körében Borza István, Bozó Éva,Tárkányi Gábor, Demeter Ádám, Kolok Sándor, Kis Csilla, Domány György 2003. Eger, Gyógyszerkémiai és Gyógyszertechnológiai Szimpózium

4/

Újabb eredmények a heterobiciklusok körében Borza István 2003. Budapest, Flavonoidkémiai Munkabizottsági Őlés

Poszterek: 1./

Indole-2-carboxamides as novel NR2B selective NMDA antagonists Borza István, Tárkányi Gábor, Demeter Ádám, Kolok Sándor, Bartáné Szalai Gizella, Bozó Éva, Kis Csilla, Ágai Béla, Berta Ferenc, Fetter József, Domány György 2002. Barcelona, XVII th. International Symposium on Medicinal Chemistry

2./

Fenol bioizosztér heterociklusok NR2B szelektív NMDA antagonisták körében Borza István, Bozó Éva,Tárkányi Gábor, Demeter Ádám, Kolok Sándor, Kis Csilla, Domány György 2003. Hajdúszoboszló, Vegyészkonferencia

3/

Benzimidazole-2-carboxamides as novel NR2B selective NMDA receptor antagonists György Domány, István Borza, Sándor Kolok, Anikó Gere, Kornél Galgóczy, Ildikó Magdó, József Fetter, Ferenc Bertha, Béla Ágai, Csilla Horváth, Sándor Farkas, György M. Keserő 2006. San Francisco, American Chemical Society 232nd National Meeting and Exposition

4/

CoMSIA Study of Oxamide and Glycineamide-type NR2B Selective NMDA Receptor Antagonists Magdó Ildikó. - Borza István. - Bartáné Szalai Gizella. - Bozó Éva. - Gere Anikó. Horváth Csilla. - Farkas Sándor. - Domány György. - Keserő György M. Austrian-German-Hungarian-Italian-Polish-Spanish Joint Meeting on Medicinal Chemistry (2005. június 20-23.) (Bécs, Ausztria)

5/

CoMSIA Study of Indole- and Benzimidazole-2-carboxamide-type NR2B Selective NMDA Receptor Antagonists Magdó Ildikó. - Borza István. - Kolok Sándor. - Gere Anikó. - Horváth Csilla. Bartáné Szalai Gizella. - Domány György. - Keserő György M. 15th European Symposium on QSAR (Euro-QSAR 2004) (2004. szeptember 5-1) (Isztanbul, Törökország)

6/

Antinociceptive Effect of NR2B Selective NMDA Receptor Antagonists in Chronic Pain Models, in Comparison with Pregabalin. 2003 Horváth Csilla. - Farkas Sándor. - Kedves Rita. - Galgóczy Kornél. - Egyed R. - Nagy

113

József, Kolok Sándor. - Borza István. - Domány György. - Szombathelyi Zsolt 23rd European Winter Conference on Brain Research (2003. március 8-15.) (Les Arcs, Franciaország) 7/

Kynurenic Acid Amides as Novel NR2B Selective NMDA Receptor Antagonists István Borza, Sándor Kolok, Kornél Galgóczy, Csilla Horváth, Sándor Farkas, István Greiner, György Domány 11th Belgian Organic Synthesis Symposium (2008. július-13-18) (Ghent, Belgium)

Dolgozatomban a témában közölt kilenc kémiai tárgyú cikkbı l nyolcat, a benyújtott nyolc alapszabadalmi bejelentésbıl hetet idézek. A Bioorganic & Medicinal Chemistry Lettersben megjelentetett cikkekben közöltük a molekulák elıállításának módját, a Journal of Medicinal Chemistry és a Pharmazie folyóiratokban, valamint a szabadalmi bejelentésekben részletes receptekkel együtt mutattuk be a vegyületeket. Mivel a dolgozatomban szereplı vegyületek jelentıs részét leírtuk, terjedelmi okokból a kémiai kísérleti részt a bemutatott molekulák publikációs listájával helyettesítem.

114

Végtermékek listája, elıfordulásuk közleményekben, szabadalmi bejelentésekben. Példaszám szabadalmi bejelentésben

vegyületszám

vegyületszám a közleményben

példaszám szabadalmi bejelentésben

98

6i108

29105

65

99

6j108

19105

66

100

6k108

67

101

6l108

5105

68

102

6m108

12105

69

103

6n108

40105

70

104

6o108

71

105

6p108

72

137

55108

73

138

56108

74

139

57108

75

140

58108

76

141

59108

vegyületszám


FAHÉJSAVSZÁRMAZÉKOK

77

BENZIMIDAZOL-2-KARBOXAMIDOK

78

142

60a108

79

143

61a108

80

144

62108

81

145

63108

146

64108

INDOL-2-KARBOXAMIDOK

100105

82

6a108

1105

147

65108

83

7a108

3105

148

60m108

84

8a108

49105

149

60q108

85

9a108

150

60r108

86

10108

26105

151

60s108

87

11108

42105

152

60t108

88

23108

153

60u108

89

24108

90

108

25

183

2111

91

6b108

184

3d111

8110

92

6c108

43105

185

3e111

3110

93

6d108

33105

186

3b111

7110

94

6e108

7105

187

3g111

61110

95

6f108

6105

188

3i111

101110

96

6g108

9105

189

3f111

31110

97

6h108

4105

190

OXÁLSAVDIAMIDOK

115

vegyületszám


Példaszám szabadalmi bejelentésben

vegyületszám

OXÁLSAVDIAMIDOK



9118

1117

270

191

271

192

272

193

273

194

274

195

275

196

276

197

277

198

278

199

279

200

280

201

281

202

282

4118

4117

7117

203

32110

283

5118

3117

204

48110

284

6118

2117

285

7118

29117

286

8118

5117

287

10118

26117

288

11118

27117

289

12118

28117

205

3k111

206 39110

207 208 KINURÉNSAVAMIDOK 228

28 114

INDOL-2-KARBOXAMIDINEK 113

229

29

12

295

5a121

42120

230

30a114

2113

296

5b121

151120

231

30b114

1113

297

5c121

76120

232

30c114

4113

298

5d121

117120

233

30d114

3113

299

5e121

36120

234

30e114

10113

300

5f121

147120

235

30f114

7113

301

5g121

72120

236

30g114

8113

302

5h121

112120

237

31114

303

5i121

31120

238

32114

304

5j121

38120

239

38114

305

5k121

32120

BENZOIL-KARBAMIDOK

306

5l121

29120

267

307

5m121

17120

268

308

5n121

18120

269

309

5o121

1120

9113

116

vegyületszám



BENZILIDÉN-PIPERIDINEK 312

1125

313

2125

314

3125

315

4125

316

5125

317

6125

321

1126

322

24126

117

9. IRODALOMJEGYZÉK

1. Williams, M.; Kowaluk, E. A.; Arneric, S. P. Emerging Molecular Approaches to Pain Therapy. J. Med. Chem. 1999, 42, 1481-1500. 2. Int. Assoc. For Study of Pain. 1994. Pain Vol. II. Issue3, Neuregenic Pain: Diagnosis and Treatment. 3. Sindrup, S. H.; Jensen, T. S. Efficacy of pharmacological treatments of neurophtic pain: an update and effect releated to mechanism of drug action. Pain 1999, 83, 389-400. 4. Chizh, B. A.; Headley, P. M. NMDA antagonists and neuropathic pain-multiple drug targets and uses. Cur. Pharm. Des. 2005, 11, 2977-2994. 5. Salter, M.W. Cellular signalling pathways of spinal pain neuroplasticity as targets for analgesic development. Cur. Top. Med. Chem. 2005, 5, 557-567. 6. Mendel, L. M., Physiological properties of unmyelinated fiber projections to the spinal cord. Exp. Neurol. 1966, 16, 316-332. 7. Davies, S. N.; Lodge, D. Evidence for involvement of N-methylaspartate receptors in”windup” of class 2 neurones in the dorsal horn of the rat. Brain Res. 1987, 424, 402406. 8. Dickenson, A. H.; Sullivan, A. F. Evidence for a role of the NMDA receptor in the frequency dependent potentiation of deep rat dorsal horn nociceptive neurones following C fibre stimulation. Neuropharmacology 1987, 26, 1235-1238. 9. Kim, Y. I.; Na, H. S., NMDA receptors are important for both mechanical and thermal allodynia from peripheral nerve injury in rats. Neuroreport 1997, 8, 2149-53. 10. Wong, C. S.; Cherng, C. H. Intrathecal administration of excitatory amino acid receptor antagonists or nitric oxide synthase inhibitor reduced automy behavior in rat. Anesth. Analg. 1998, 87, 605-608. 11. Ren, K.; Williams, G. N. The intrathecal administration of excitatory amino acid receptor antagonists selectively attenuated carrageenan-induced behavioral hyperalgesia in rats. Eur. J. Pharmacol. 1992, 219, 235-243. 12. Klepstad, P.; Maurset, A. Evidence of a role for NMDA receptors in pain perception. Eur. J. Pharmacol. 1990, 187, 513-518. 13. Nikolajsen, L.; Hansen, P. O. Oral ketamine treatment of postamputation stump pain. Acta Anaesthesiol. Scand. 1997, 41, 427-429. 14. Eide, P. K.; Stubhag, A. Continuous subcutaneous administration of the N-methyl-Daspartate receptor antagonist ketamine in the treatment of post-herpetic neuralgia. Pain 1995, 2, 221-228. 15. Price, D. D.; Mao, J. The N-methyl-D-aspartate receptor antagonist dextromethorphan selectively reduces temporal pain summation in man. Pain 1994, 59, 165-174. 16. Nikolajsen, L.; Gottrup, H.; Kristensen, A. G. D.; Jensen, T. S. Memantine (a N-MethylD-Aspartate Receptor Antagonist) in the Treatment of Neuropathic Pain After Amputation or Surgery: A Randomized, Double-Blinded, Cross-Over Study 17. Madsen, U.; Brauner-Osborne, H.; Greenwood, J. R.; Johansen, T. N.; KrogsgaardLarsen, P.; Liljefors, T.; Nielsen, M.; Frolund, B. GABA and Glutamate Receptor Ligands and Their Therapeutic Potential in CNS Disorders. ed. Shayne Cox Gad, Drug Discovery Handbook, John Wiley & Sons Ltd, Chichester West Sussex, 2005: ch. 18, 797-907. 18. Borbényi, E.; Dank, M. Makó, E. Fájdalomcsillapítás a daganatos betegek kezelésében Magyar Onkológia 2001, 45, 81-88. 19. Kennedy, J. D. Neuropathic Pain: Molecular Complexity Underlies Continuing Unmet Medical Need J. Med. Chem. 2007, 50, 2547-2556. 20. Palkovits, M. Az agy és a fájdalom: az érzékelés és a válasz agypályái és transzmitterei. Orvosi Hetilap 2000, 141, 2231-2239. 118

21.http://cogsci.bme.hu/~ktkuser/KURZUSOK/BMEGT47MN10/DOC/05_fajdalom_latas_be vezeto.pdf 22. Schwartzman, R. J.; Grothusen, J.; Kiefer T. R.; Rohr, P. Arch Neuropathic Central Pain: Epidemiology, Etiology, and Treatment Options. Neurology 2001, 58, 1547-1550. 23. Zhang, J.; Hoffert, C.; Vu, H. K.; Groblewski, T.; Ahmad, S.; O’Donnell, D. Induction of CB2 receptor expression in the rat spinal cord of neuropathic but not inflammatory chronic pain models. Eur.J. Neurosci. 2003, 17, 2750-2754. 24. Kim, D. Y.; Kim, S. H.; Choi, H. B.; Min, C.; Gwag, B. J. High abundance of GluR1 mRNA and reduced Q/R editing of GluR2 mRNA in individual NADPH-diaphorase neurons. Mol. Cell. Neurosci. 2001, 17, 1025–33. 25. Parsons, C. G.; Danysz, W. Quack, G. Glutamate in CNS Disorders as a Target for Drug Development: An Update. Drug news and perspectives 1998, 11, 523-569. 26. Conti, F.; Weinberg, R.J.; Shaping excitation at glutamatergic synapses Trends Neurosci. 1999, 22, 451-458. 27. Huettner, J. E. Kainate receptors and synaptic transmission. Prog. Neurobiol. 2003, 70, 387–407. 28. Paoletti, P.; Neyton, J. NMDA receptor subunits: function and pharmacology. Current Opinion in Pharmacology 2007, 7, 39-47. 29. Chen, P. E.; Wyllie, D. J. A. Pharmacological insights obtained from structure-function studies of ionotropic glutamate receptors. Br. J. Pharmacol. 2006, 147, 839-853. 30. Michaelis, E. K. Molecular biology of glutamate receptors in the central nervous system and their role in excitotoxicity, oxidative stress and aging. Prog. Neurobiol. 1998, 54, 369-415. 31. Chen, H. S. V.; Lipton, S. A. The chemical biology of clinically tolerated NMDA receptor antagonists. J. Neurochem. 2006, 97, 1611-1626. 32. a, Blahos, J.; Wenthold, R. J. Relationship betwen N-methyl-D-aspartate receptor NR1 splice variants and NR2 subunits. J. Biol. Chem. 1996, 271, 15669-15674. B, Chazot, P.; Coleman, S. K.; Cik, M..; Stephenson, F. A. Molecular characterization of N-methyl-D-aspartate receptors expressed in mammalian cells yields evidence for the coexistence of three subunit types within a discrete receptor molecule. J. Biol. Chem. 1994, 269, 24403-24409. 33. Dingledine, R.; Borges, K.; Bowie, D.; Traynelis, S. F. The glutamate receptor ion channels. Pharmacol. Rev. 1999, 51, 7-61. 34. Kew, J. N. C.; Kemp, J. A. An allosteric interaction between the NMDA receptor polyamine and ifenprodil sites in rat cultured cortical neurones. The Journal of Physiology, 1998, 512, 17-28. 35. Chatterton, J. E.; Awobuluyi, M.; Premkumar, L. S.; Takahashi, H.; Talantova, M.; Shin, Y.; Cui, J.; Tu, S.; Sevarino, K. A.; Nakanishi, N.; Tong, G.; Lipton, S. A.; Zhang, D. Excitatory glycine receptors containing the NR3 family of NMDA receptor subunits. Nature, 2002, 415, 793-798. 36. a, Monyer, H.; Sprengel, R.; Schoepfer, R.; Herb, A.; Higuchi, M.; Lomeli, H.; Burnashev, N.; Sakmann, B.; Seeburg, P.H. Heteromeric NMDA receptors: molecular and functional distinction of subtypes. Science 1992, 256, 1217-1221. b, Ishii, T.; Moriyoshi, K.; Sugihara, H.; Sakurada, K.; Kadotani, H.; Yokoi, M.; Akazawa, C.; Shigemoto, R.; Mizuno, N.; Masu, M.; Nakanishi, S.; Molecular characterization of the family of the N-methyl-D-aspartate receptor subunits. J. Biol. Chem. 1993, 268, 2836-2843. 37. Kékesi, G.; Horváth, GY. A kinurénsav fájdalomcsillapító hatása. Ideggyógyászati Szemle 2002, 55, 313–322. 38. Borza, I.; Domány, Gy. NR2B Selective NMDA Antagonists: The Evolution of the

119

Ifenprodil-Type Pharmacophore. Curr. Top. In Med. Chem. 2006, 6, 687-695. 39. The Merck Index (Thirteenth Edition) Merck Research Laboratories Division of Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, NJ, 2001, page 878. 40. Carron, C.; Jullien, A.; Bucher, B. Synthesis and Pharmacological Properties of a Series of 2-Piperidino Alkanol Derivatives. Arzneim. Forsch.1971, 21, 1992-1998. 41. Scatton, B.; Carter, C.; Claustre, Y.; L’Heureux, R.; Arbilla, S.; Langer, S. Z.; Gotti, B.; Duverger, D.; MacKenzie, E. T. The Cerebral Anti-ischemic Agents, Ifenprodil and SL82.0715, Antagonise the Effects of NMDA. Proceedings of the Xth International Congress of Pharmacology, Sydney, Australia, 1987; Abstract No. 012.064. 42. Williams, K. Ifenprodil Discriminates Subtypes of the N-Methyl-D-aspartate Receptor: Selectivity and Mechanisms at Recombinant Heteromeric Receptors. Mol. Pharm. 1993, 44, 851-859. 43. Chenard, B. L.; Menniti, F. S. Antagoists Selective for NMDA Receptors Containing the NR2B Subunit. Curr. Pharm. Des. 1999, 5, 381-404. 44. Nikam, S. S.; Meltzer, L. NR2B Selective NMDA Receptor Antagonists. Curr. Pharm. Des. 2002, 8, 845-855. 45. McCauley, J. A. NR2B Subtype-selective NMDA Receptor Antagonists: 2001-2004. Expert Opin. Ther. Patents 2005, 15, 389-407. 46. Chenard, B. L.; Shalaby, I. A.; Koe, B. K.; Ronau, R.T.; Butler, T. W.; Prochniak, M. A.; Schmidt, A. W.; Fox, C. B. Separation of α1 Αdrenergic and N-Methyl-D-aspartate Antagonist Activity in a Series of Ifenprodil Compounds. J. Med. Chem. 1991, 34, 30853090. 47. Wermuth, C. G. Selective Optimization of Side Activities: Another Way for Drug Discovery. J. Med. Chem. 2004, 47, 1-12. 48. Avenet, P.; Léonardon, J.; Besnard, F.; Graham, D.; Frost, J.; Depoortere, H.; Langer, S. Z.; Scatton, B. Antagonist Porperties of the Stereoisomers of ifenprodil at NR1a/NR2A and NR1a/NR2B subtypes of the NMDA receptor expressed in Xenopus oocytes. Eur. J. Pharm. 1996, 296, 209-213. 49. Chenard, B. L.; Bordner, J.; Butler, T. W.; Chambers, L. K.; Collins, M. A.; De Costa, D. L.; Ducat, M. F.; Dumont, M. L.; Fox, C. B.; Mena, E. E.; Menniti, F. S.; Nielsen, J.; Pagnozzi, M. J.; Richter, K. G. E.; Ronau, R. T.; Shalaby, I. A.; Stemple, J. Z.; White, W. F. (1S,2S)-1-(4-Hydroxyphenyl)-2-(4-hydroxy-4-phenylpiperidino)-1-propanol: A Potent New Neuroprotectant Which Blocks N-Methyl-D-aspartate Responses. J. Med. Chem. 1995, 38, 3138-3145. 50. Sang, C. N.; Weaver, J. J.; Jinga, L.; Wouden, J.; Salterelli, M. D. The NR2B subunitselective NMDA receptor antagonist, CP-101,606, reduces spontaneous pain intensity in patients with central and peripheral neuropathic pain. Program No 814.9 2003 Abstract Viewer/Itinerary Planner; Society for Neuroscience: Washington, DC, 2003. Online. 51. Butler, T. W.; Blake, J. F.; Bordner, J.; Butler, P.; Chenard, B. L.; Collins, M. A.; DeCosta, D.; Ducat, M. J.; Eisenhard, M. E.; Menniti, F. S.; Pagnozzi, M. J.; Sands, S. B.; Segelstein, B. E.; Volberg, W.; White, W. F.; Zhao, D. (3R,4S)-3-[4-(4-Fluorophenyl)-4hydroxypiperidin-1-yl]chroman-4,7-diol: A Conformationally Restricted Analogue of the NR2B Subtype-Selective NMDA Antagonist (1S,2S)-1-(4-Hydroxyphenyl)-2-(4-hydroxy4-phenylpiperidino)-1-propanol. J. Med. Chem. 1998, 41, 1172-1184. 52. Leibrock, J.; Prücher, H.; Rautenberg, W. EMD 95885, a new eliprodil analogue with higher affinity for the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Pharmazie 1997, 52, 479480. 53. Fischer, G.; Mutel, V.; Trube, G.; Malherbe, P.; Kew, J. N. C.; Mohacsi, E.; Heitz, M. P.;

120

Kemp, J. A. Ro 25-6981, a Highly Potent and Selective Blocker of N-Methyl-D-aspartate Receptors Containing the NR2B Subunit. Characterization in Vitro. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997, 283, 1285-1292. 54. Mutel, V.; Buchy, D.; Klingelschmidt, A.; Messer, J.; Bleuel, Z.; Kemp, J. A.; Richards, J. G. In Vitro Binding Properties in Rat Brain of [3H]-Ro 25-6981, a Potent and Selective Antagonist of NMDA Receptors Containing NR2B Subunits. J. Neurochem. 1998, 70, 2147-2155. 55. Kew, J. N. C.; Trube, G.; Kemp, J.A. State-dependent NMDA receptor antagonism by Ro 8-4304, a novel NR2B selective, non-competitive, voltage-independent antagonist. Brit. J. Pharmacol. 1998, 123, 463-472. 56. Greengrass P.; Bremmer, R. Binding characteristics of 3H-Prazosin to rat brain αadrenergic receptors. Eur. J. Pharmacol. 1979, 55, 323-326. 57. Pinard, E.; Alanine, A.; Bourson, A.; Büttelmann, B.; Gill, R.; Heitz, M.-P.; Jaeschke, G.; Mutel, V.; Trube, G.; Wyler, R. Discovery of (R)-1-[2-Hydroxy-3-(4-hydroxy-phenyl)propyl]-4-(4-methyl-benzyl)-piperidin-4-ol: a Novel NR1/2B Subtype Selective NMDA Receptor Antagonist. Bioorg. Med. Chem. Letters 2001, 11, 2173-2176. 58. Gill, R.; Alanine, A.; Bourson, B.; Buttelmann, B.; Fischer, G.; Heitz, M.-P.; Kew, J. N. C.; Levet-Trafit, B.; Lorez, H.-P.; Malherbe, P.; Miss, M.-T.; Pinard, E.; Roever, S.; Schmitt, M.; Trube, G.; Wybrecht, R.; Wyler, R.; Kemp, J. A. Pharmacological Characterization of Ro 63-1908 (1-[2-(4-Hydroy-phenoxy)-ethyl]-4-(4-methyl-benzyl)pipridin-4-ol), a Novel Subtype-Selective N-Methyl-D-aspartate Antagonist. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2002, 302, 940-948. 59. Higgins, G. A.; Ballard, T. M.; Huwyler, J.; Kemp, J. A.; Gill, R. Evaluation of the NR2B-selective NMDA receptor antagonist Ro 63-1908 on rodent behaviour: evidence for an involvement of NR2B NMDA receptors in response inhibition. Neuropharm. 2003, 44, 324-341. 60. Gill, R.; Lorez, H. P.; Wybrecht, R.; Miss, M.-T.; Bourson, A.; Fischer, G.; Kew, J.; Mutel, V.; Trube, G.; Roever, S.; Heitz, M.-P.; Kemp, J. A. Novel, Activity-dependent NMDA NR2B Subtype Selective Antagonists as Neuroprotective Agents. Abstracts book, XVIth International Symposium on Medicinal Chemistry, Bologna, 2000,: Abst ML-43. 61. Jaeschke, G.; Alanine, A.; Sleight, A. B.; Büttelman, B.; Fischer, H.; Gill, R.; Neidhart, M.-P. H.; Huwyler, J.; Kemp, J. A.; Kansy, M.; Mutel, V.; Pinard, E.; Trube, G.; Wyler, R. Synthesis and Biological Evaluation of β-Aminosulfones as Novel NMDA-NR1/2B Subtype Selective Antagonists. Drugs Fut. 2002, 27(Suppl. A): Abst C76. 62. Tamiz, A. P.; Whittemore, E. R.; Zhou, Z.-L.; Huang, J.-C.; Drewe, J. A.; Chen, J.-C.; Cai, S.-X.; Weber, E.; Woodward, R. M.; Keana, J. F. W. Structure-Activity Relationships for a Series of Bis(phenylalkyl)amines: Potent Subtype-Selective Inhibitors of N-MethylD-aspartate Receptors. J. Med. Chem. 1998, 41, 3499-3506. 63. Guzikowski, A. P.; Tamiz, A. P.; Acosta-Burruel, M.; Hong-Bae, S.; Cai, S. X.; Hawkinson, J. E.; Keana, J. F. W.; Kesten, S. R.; Shipp, C. T.; Tran, M.; Whittemore, E. R.; Woodward, R. M.; Wright, J. L.; Zhou, Z.-L. Synthesis of N-Substituted 4-(4Hydroxy-phenyl)piperidines, 4-(4-Hydroxybenzyl)piperidines, and (+)-3-(4Hydroxyphenyl)-pyrrolidines: Selective Antagonists at the 1A/2B NMDA Receptor Subtype. J. Med. Chem. 2000, 43, 984-994. 64. Tamiz, A. P.; Whittemore, E. R.; Woodward, R. M.; Upasani, R. B.; Keana, J. F. W. Structure-Activity Relationship for a Series of 2-Substituted 1,2,3,4-Tetrahydro-9Hpyrido[3,4-b]indoles: Potent Subtype-Selective Inhibitors of N-Methyl-D-aspartate (NMDA) Receptors. Bioorg. Med. Chem. Letters 1999, 9, 1619-1624. 65. Zhou, Z.-L.; Cai, S. X.; Whittemore, E. R.; Konkoy, C. S.; Espitia, S. A.; Tran, M.; Rock, D. M.; Coughenour, L. L.; Hawkinson, J. E.; Boxer, P. A.; Bigge, C. F.; Wise, L. D.;

121

Weber, E.; Woodward, R. M.; Keana, J. F. W. 4-Hydroxy-1-[2-(4hydroxyphenoxy)ethyl]-4-(4-methylbenzyl)piperidine: A Novel, Potent, and Selective NR1/2B NMDA Receptor Antagonist. J. Med. Chem. 1999, 42, 2993-3000. 66. Shelkun, R. M.; Yuen, P., Serpa, K.; Meltzer, L. T.; Wise, L. D. Subtype-Selective NMethyl-D-aspartate Receptor Antagonists: Benzimidazolone and Hydantoin as Phenol Replacements J. Med. Chem. 2000, 43, 1892-1897. 67. Gregory, T. F.; Wright, J. L.; Wise, L. D.; Meltzer, L. T.; Serpa, K. A.; Konkoy, C. S.; Whittemore, E. R.; Woodward, R. M. Parallel Synthesis of a Series of Subtype-Selective NMDA Receptor Antagonists Bioorg. Med. Chem. Letters 2000, 10, 527-529. 68. Wright, J. L.; Kesten, S. R.; Upasani, R. B.; Lan, N. C. 4-Benzylpiperidinylalkylsulfinylsubstituted heterocycles and their use as subtype-selective NMDA receptor antagonists. PCT Int. Appl. WO 2000/000197-A1, Jan 6, 2000; Chem. Abstr. 2000, 132, 64255. 69. Wright, J. L.; Gregory, T. F.; Bigge, C. F.; Boxer, P. A.; Serpa, K.; Meltzer, L. T.; Wise, L. D.; Cai, S. X.; Hawkinson, J. E.; Konkoy, C. S.; Whittemore, E. R.; Woodward, R. M.; Zhou, Z. L. Subtype-Selective N-Methyl-D-aspartate Receptor Antagonists: Synthesis and Biological Evaluation of 1-(Aralkynyl)-4-benzylpiperidines. J. Med. Chem. 1999, 42, 2469-2477. 70. Wright, J. L.; Gregory, T. F.; Kesten, S. R.; Boxer, P. A.; Serpa, K. A.; Meltzer, L. T.; Wise, L. D. Subtype-Selective N-Methyl-D-aspartate Receptor Antagonists: Synthesis and Biological Evaluation of 1-(Heteroarylalkynyl)-4-benzylpiperidines. J. Med. Chem. 2000, 43, 3408-3419. 71. Kornberg, B. E.; Nikam, S. S.; Wright, J. L.; Kesten, S. R.; Meltzer, L. T.; Coughenour, L.; Barr, B.; Serpa, K. A.; McCormick, J. Subtype selective NMDA receptor antagonists: evaluation of some novel alkynyl analogues. Bioorg. Med. Chem. Letters 2004, 14, 12131216. 72. Tamiz, A. P.; Whittemore, E. R.; Schelkun, R. M.; Yuen, P.-W.; Woodward, R. M.; Cai, S.-X.; Weber, E.; Keana, J. F. W. N-(2-(4-Hydroxyphenyl)ethyl)-4-chlorocinnamide: a Novel Antagonist at the 1A/2B NMDA Receptor Subtype. Bioorg. Med. Chem. Letters 1998, 8, 199-200. 73. Tamiz, A. P.; Cai, S. X.; Zhou, Z.-L.; Yuen, P.-W.; Schelkun, R. M.; Whittemore, E. R.; Weber, E.; Woodward, R. M.; Keana, J. F. W. Structure-Activity Relationship of N(Phenyl-alkyl)cinnamides as Novel NR2B Subtype-Selective NMDA Receptor Antagonists. J. Med. Chem. 1999, 42, 3412-3420. 74. McCauley, J. A.; Theberge, C. R.; Romano, J. J.; Billings, S. B.; Anderson, K. D.; Claremon, D. A.; Freidinger, R. M.; Bednar, R. A.; Mosser, S. D.; Gaul, S. L.; Connolly, T. M.; Condra, C. L.; Xia, M. Cunningham, M. E.; Bednar, B.; Stump, G. L.; Lynch, J. J.; Macaulay, A.; Wafford, K. A.; Koblan, K. S.; Liverton, N. J. NR2B-Selective N-MethylD-aspartate Antagonists: Synthesis and Evaluation of 5-Substituted Benzimidazoles. J. Med. Chem. 2004, 47, 2089-2096. 75. McCauley, J. A.; Theberge, C. R.; Liverton, N. J.; Claremon, D. A.; Claiborne, C. F. 2Benzyl and 2-Heteroaryl Benzimidazole NMDA/NR2B Antagonists. U.S. Patent 6,316,474 B1, November 13, 2001. 76. Liverton, N. J.; Butcher, J. W.; McIntyre C. J.; Claiborne, C. F.; Claremon, D. A.; McCauley, C. J.; Romano, J. J.; Thompson, W.; Munson, P.M. N-substituted nonarylheterocyclo amidyl NMDA/NR2B antagonists. PCT Int. Appl. WO 2002080928-A1, Apr 3, 2001. 77. Nagy, J.; Boros, A.; Dezsı, P.; Kolok, S.; Fodor, L. Inducible expression and pharmacology of recombinant NMDA receptors, composed of rat NR1a/NR2B subunits. Neurochem. Int. 2003, 43, 19-29. 78. Curtis, N. R.; Diggle, H. J.; Kulagowski, J. J.; London, C.; Grimwood, S.; Hutson, P. H.;

122

Murray, F.; Richards, P.; Macaulay, A.; Wafford, K. A. Bioorg. Med. Chem. Letters 2003, 13, 693-696. 79. Curtis, N. R.; Diggle, H. J.; Kulagowski, J. J.; London, C.; Grimwood, S.; Hutson, P. H.; Murray, F.; Richards, P.; MaCaulay, A.; Wafford, K. A. Bioorg. Med. Chem. Letters 2003, 13, 697-700. 80. US6265426 (2001) 81. WO03097637 (2003) 82. US6683097 (2004) 83. Alanine, A.; Bourson, A.; Buttelmann, B.; Gill, R.; Heitz, M.-P.; Mutel, V.; Pinard, E.; Trube, G.; Wyler, R. 1-Benzyloxy-4,5-dihydro-1H-imidazol-2-yl-amines, a novel class of NR1/2B subtype selective NMDA receptor antagonists. Bioorg. Med. Chem. Letters. 2003, 13, 3155-3159. 84. Pinard, E.; Alanine, A.; Bourson, A.; Buttelmann, B.; Heitz, M.-P.; Mutel, R.G.; Trube G.; Wyler R. 4-Aminoquinolines as a novel class of NR1/2B subtype selective NMDA receptor antagonists. Bioorg. Med. Chem. Letters. 2002, 12, 2615-2619. 85. US6440995 (2002) 86. Büttelmann, B.; Alanine, A.; Bourson, A.; Gill, R.; Heitz, M. P.; Mutel, V.; Pinard, E.; Trube, G.; Wyler, R. 4-(3,4-Dihydro-1H-isoquinolin-2yl)-pyridines and 4-(3,4-Dihydro1H-isoquinolin-2-yl)-quinolines as potent NR1/2B subtype selective NMDA receptor antagonists. Bioorg. Med. Chem. Letters. 2003, 13, 1759-1762. 87. Büttelmann, B.; Alanine, A.; Bourson, A.; Gill, R.; Heitz, M. P.; Mutel, V.; Pinard, E.; Trube, G.; Wyler, R. 2-(3,4-Dihydro-1H-isoquinolin-2yl)-pyridines as a novel class of NR1/2B subtype selective NMDA receptor antagonists. Bioorg. Med. Chem. Letters. 2003, 13, 829-832. 88. US6831087 (2004) 89. Nguyen, K. T.; Claiborne, C. F.; McCaulay, J. A.; Libby, B. E.; Claremon, D. A.; Bednar, R. A.; Mosser, S. D.; Gaul, S. L.; Connolly, T. M.; Condra, C. L.; Bednar, B.; Stump, G. L.; Lynch, J. J.; Koblan, K. S.; Liverton, N. J. Cyclic benzamidines as orally efficacious NR2B-selective NMDA receptor antagonists. Bioorg. Med. Chem. Letters 2007, 17, 3997-4000. 90. US6440976 (2002) 91. Gozlan, H.; Emerit, M. B.; Hall, M. D.; Nielsen M.; Hamon, M. In situ molecular sizes of the various types of 5-HT binding sites in the rat brain Biochem. Pharmacol. 1986, 35, 1891–1897. 92. Li, J. H.; Wang, Y. H.; Wolfe, B. B.; Krueger, K. E.; Corsi, L.; Stocca, G.; Vicini, S. Developmental changes in localization of NMDA receptor subunits in primary cultures of cortical neurons. Eur. J. Neurosci. 1998, 10, 1704-1715. 93. Dickenson, A. and Besson J.-M. (Editors): Chapter 1, pp. 6-7: Animal models of Analgesia; and Chapter 8, pp. 180-183: Mechanism of Central Hypersensitivity: Excitatory Amino Acid Mechanisms and Their Control – In Pharmacology of Pain. Springer-Verlag (Berlin) 1997.]. 94. Hunskaar, S.; Fasmer, O. B.; Hole, K. Formalin Test in Mice, a Useful Technique for Evaluating Mild. Journal of Neuroscience Methods, 1985, 14, 69-76. 95. Seltzer, Z.; Dubner, R.; Shym, Y. A novel behavioral model of neurophaticpain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury. Pain 1990, 43, 205-218. 96. a, Wermuth, C. G. In The Practice of Medicinal Chemistry, Wermuth, C. G., Ed.; Academic Press : London, San Diego, New York, Boston, Sydney, Tokyo, Toronto, 1996; p 228. b, Friedman, H. L. (1951) Influence of isosteric replacements upon biological activity. In Symposium on Chemical-Biological Correlation. National Research Council Publication,

123

Washington D.C. 97. Nicolaou, K. C.; Ramanjulu, Joshi M.; Natarajan, Swaminathan; Braese, Stefan; Li, Hui; et al. A Suzuki coupling-macrolactamization approach to the AB-COD bicyclic system of vancomycin. Chem. Commun. 1997, 19, 1899-1900. 98. (a) Kondo, K.; Morohoshi, S.; Mitsuhashi, M.; Murakami, Y. Chem. Pharm. Bull. 1999, 47, 1227. (b) Boger, D. L.; Cerbone, L. R.; Yohannes, D. Oxidative Coupling of Methyl 6-Hydroxyindole-2-carboxylate with Primary Amines: Preparation of 2-Substituted Methyl Pyrrolo[2,3-e]benzoxazole-5-carboxylates. J.Org. Chem. 1988, 53, 5163. 99. Doyle, F. P.; Ferrier, W.; Holland, D. O.; Mehta, M. D.; Nayler, J. H. C. Potential Antituberculosis Agents of the Indole Series. J. Chem. Soc. 1956, 78, 2853-2856. 100. Parke Davis; NL 6409825 1965; Chem. Abstr. 1965, 63, 11517d. 101. Lu, T.; Soll, R. M.; Illig, C. R.; Bone, R.; Murphy, L.; Spurlino, J.; Salemme, R. R.; Tomczuk, B. E. Structure-Activity and Crystallogrphic Analysis of a New Class of Nonamide-Based Thrombin Inhibitor. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000, 10, 79-82. 102. Xue, C. B.; Roderick, J.; Jackson, S.; Rafalski, M.; Rockwell, A.; Mousa, S.; Olson, R.E.; DeGrado, W. F. Design, Synthesis, and In vitro Activities of Benzamide-Core Glycoprotein IIb/IIIa Antagonists: 2,3-Diaminopropionic Acid Derivatives as Surrogates of Aspartic Acid. Bioorg. Med. Chem. 1997, 5, 693-705. 103. (a) Ágai, B.; Nádor, A.; Proszenyák, Á.; Tárkányi, G.; Faigl, F. A facile synthesis of 3(substituted benzyl)piperidines. Tetrahedron 2003, 59, 7897-7900. (b) Ágai, B.; Proszenyák, Á.; Tárkányi, G.; Vida, L.; Faigl, F. Convenient, benign and scalable synthesis of 2- and 4-substituted benzylpiperidines. Eur. J. Org. Chem. 2004, 3623-3632. (c) Proszenyák, Á.; Ágai, B.; Hegedős, L.; Faigl, F. Hydrogenation of a 4benzylpiperidine derivative over supported precious metal catalysts. Applied Catalysis A 2004, 269, 249-253. 104. Crowther, A. F.; Curd, F. H. S.; Davey, D. G.; Stacey, G. J. Synthetic Antimalarials. Dialkylaminoalkylaminoquinoxalines. J. Chem. Soc. 1949, 1260. 105. Borza, I.; Bartáné Szalai, G.; Domány, Gy.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Nagy, J.; Kolok, S. Amide derivatives as NMDA receptor antagonists. WO 2002/34718A1. 106. Borza, I.; Kolok, S.; Gere, A.; Ágai-Csongor, É.; Ágai, B.; Tárkányi, G.; Horváth, Cs.; Barta-Szalai, G.; Bozó, É.; Kiss, Cs.; Bielik, A.; Nagy, J.; Farkas, S.; Domány, Gy. Indole-2-carboxamides as Novel NR2B Selective NMDA Receptor Antagonists Bioorg. Med. Chem. Letters 2003, 13, 3859-3861. 107. Borza, I.; Kolok, S.; Gere, A.; Nagy, J.; Fodor, L.; Galgóczy, K.; Fetter, J.; Bertha, F.; Ágai, B.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Domány, Gy. Benzimidazole-2-carboxamides as Novel NR2B Selective NMDA Receptor Antagonists.Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 4638-4640. 108. Borza, I.; Bozó, É.; Barta-Szalai, G.; Kiss, Cs.; Tárkányi , Á.; Demeter Á.; Gáti T.; Háda, V.; Kolok, S.; Gere, A.; Fodor, L.; Nagy, J.; Galgóczy, K.; Magdó, I.; Ágai, B.; Fetter, J.; Bertha, F.; M. Keserő, Gy.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Greiner, I.; Domány, Gy. Selective NR1/2B N-Methyl-D-aspartate Receptor Antagonists among Indole-2carboxamides and Benzimidazole-2-carboxamides. J. Med. Chem. 2007, 50, 901-914. 109. Gilligan, P. J.; Cain, G. A.; Christos, T. E.; Cook, L.; Drummond, S .; Johnson, A. L.; Kergay, A. A.; McElroy, J. F.; Rohrbach, K. W.; Schmidt, W. K.; Tam, S . W. Novel Piperidine s receptor ligands as potential antipsychotic drugs. J. Med. Chem., v.35, p.4344-4361, 19921. 110. Domány, Gy.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Barta-Szalai, G.; Nagy, J.; Kolok, S.; Bozó, É.; Borza, I.; Vágó, I.; Bielik,A.; Ignácz-Szendrei Gy.; Keserő, Gy. M. Piperidine derivatives as NMDA receptor antagonists. WO 2003010159A1. 111. Barta-Szalai, G.; Borza, I.; Bozó, É.; Kiss, Cs.; Ágai, B.; Proszenyák, Á.; Keserő, Gy.

124

M.; Gere, A.; Kolok, S.; Galgóczy, K.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Domány, Gy. Oxamides As novel NR2B selective NMDA receptor antagonists. Bioorg. Med. Chem. Letters 2004, 14, 3953-3956. 112. Jaen, J. C.; Laborde, E.; Bucsh, R. A.; Caprathe, B. W.; Sorenson, R. J.; Fergus, J.; Spiegel, K.; Marks, J.; Dickerson, M. R.; Davis, R. E. J. Med. Chem. 1995, 38, 44394445. 113. Borza, I.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Nagy, J.; Kolok, S. Kynurenic acid amide derivatives as NR2B receptor antagonists. WO 2006010967A1. 114. Borza, I.; Kolok, S.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Domány, Gy. New kynurenic acid amides as novel NR2B selective NMDA receptor antagonists. Bioorg. Med. Chem. Letters 2007 17, 406-409. 115. Holland G.F. (1979) Heterocyclylcarbonyl derivatives of urea, agents for dissolution of gallstones. US 4,163 784 116. Deng, M. Z.; Caubere, P.; Senet, J. P.; Lecolier, S. Tetrahedron, 1988, 44, 6079 – 6086. 117. Borza, I.; Bartáné Szalai, G.; Bozó, É.; Kis, Cs.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Nagy, J.; Kolok, S. New benzoyl urea derivatives. WO 2006010966A1. 118. Borza, I.; Greiner, I.; Kolok, S.; Galgóczy, K.; Ignácz-Szendrei, Gy.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Gáti, T.; Háda, V.; Domány, Gy. New benzoyl urea derivatives as novel NR2B selective NMDA receptor antagonists. Die Pharmazie 2006 61(9), 799-800. 119. Curtis, N. R.; Diggle, H. J.; Kulagowski, J. J.; London, C.; Grimwood, S.; Hutson, P. H.; Murray, F.; Richards, P.; Macaulay, A.; Wafford, K. A. Bioorg. Med. Chem. Letters 2003, 13, 693-696. 120. Borza, I.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Nagy, J.; Kolok, S. Indole-2-carboxamidine derivatives as NMDA receptor antagonists. WO 2006010965A1. 121. Borza, I.; Kolok, S.; Ignácz-Szendrei, G.; Greiner, I.; Tárkányi, G.; Galgóczy K.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Domány, Gy. Indole-2-carboxamidines as novel NR2B selective NMDA receptor antagonists. Bioorg. Med. Chem. Letters 2005, 15, 5439-5441. 122. Chaperon, F.; Müller, W.; Auberson, Y. P.; Tricklebank, M. D.; Neijt, H. C. N-methylD-aspartate receptor antagonists: preferential involvement of the NR2B rather than NR2A subunit. Behavioural Pharmacology 2003, 14, 477-487. 123. Boyce, S.; Wyatt, A.; Webb, J. K.; O'Donnell, R.; Mason, G.; Rigby, M.; Sirinathsinghji, D.; Hill, R.G.; Rupniak, N. M. J. Selective NMDA NR2B antagonists induce antinociception without motor dysfunction: correlation with restricted localisation of NR2B subunit in dorsal horn. Neuropharmacology 1999, 38, 611-623. 124. Johnson, K.; Shah, A.; Jaw-Tsai, S.; Baxter, J.; Prakash, C. Metabolism, Pharmacokinetics, and Excretion of a Highly Selective N-Methyl-d-aspartate Receptor Antagonist, Traxoprodil, in Human Cytochrome P450 2D6 Extensive and Poor Metabolizers. Drug metabolism and disposition 2003, 31, 76-87. 125. Borza, I.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Gyertyán, I.; Nagy, J.; Kolok, S.; Galgóczy, K.; Sághy, K. New heterocyclic acid amide derivatives.WO 2006010969A1. 126. Borza, I.; Horváth, Cs.; Farkas, S.; Gyertyán, I.; Nagy, J.; Kolok, S.; Galgóczy, K.; Sághy, K. New 4-benzylidene-piperidine derivatives.WO 2006010964A1

125

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Köszönettel tartozom valamennyi

közremőködınek,

akikkel

együtt

fáradhatatlanul

dolgoztunk, segítettük egymást közös célunk elérése érdekében. Külön köszönöm Domány Györgynek a biztatást, iránymutatást és segítséget a kutatómunkában, a publikációk, valamint a doktori dolgozat elkészítésében. Hálás vagyok Bozó Évának, Bartáné Szalai Gizellának és Ignáczné Szendrei Györgyinek a baráti biztatásért, szakmai tanácsaikért, pótolhatatlan segítségükért. Köszönöm a családomnak a folyamatos, lelkes támogatást. KÖZREMŐKÖDİK KUTATÁSVEZETÉS Szombathelyi Zsolt Greiner István Tihanyi Károly Farkas Sándor PROJEKTVEZETİ Horváth Csilla GYÓGYSZERKÉMIA Domány György Ágainé Csongor Éva Bartáné Szalai Gizella Bielik Attila Borza István Bozó Éva Galambos János Greiner István Kiss Csilla Szentirmay Éva Vágó István Wágner Gábor Wéber Csaba BME Ágai Béla Bertha Ferenc Fetter József Proszenyák Ágnes MOLEKULATERVEZÉS Keserő György Miklós Kovári Zoltán Kósa János Magdó Ildikó SZERKEZETKUTATÁS Demeter Ádám Hegedős Béla Ignáczné Szendrei Györgyi Mák Mariann Szántay Csaba jr. Tárkányi Gábor KÖNYVTÁR Fazekas Andrea

VEGYÉSZTECHNIKUSOK András Judit Bozsokiné Téglás Ildikó Csomontányi Józsefné Csomós Erzsébet Csontosné Brunner Éva Demeter Lászlóné Huszár Lászlóné Jéney Erzsébet Kállayné Sohonyai Anna Mikó Istvánné Molnár Magdolna Stark Istvánné ANALITIKA Demeter Mária Meszlényi Gábor Meszlényiné Sipos Márta Rill Attila Tischler Ferenc NEUROFARMAKOLÓGIA Horváth Csilla Felmérai Laura Házi Zsolt Galgóczy Kornél Kis-Varga Ágnes Kordás Krisztina TOXIKOLÓGIA Hegyi Lászlóné Horváth Irén Karsai Edit Krajcsovicz Zoltán Selényi György Varga Márta ÁLTALÁNOS FARMAKOLÓGIA Dézsi László Hornok Katalin Komlódi Zsolt Makó Éva Orosz Szabolcs

126

SEJTBIOLÓGIA Dezsı Péter Kolok Sándor Krizsán Ágnes Nagy József Tomic Marianna VISELKEDÉS FARMAKOLÓGIA Gyertyán István Egyed Róbert Kedves Rita Laszy Judit Orosz Szabolcs Sághy Katalin Gál Krisztina IN VITRO METABOLIZMUS Dalmadi Balázs Leibinger János Tihanyi Károly Vastag Mónika Szeberényi Szabolcs MOLEKULÁRIS FARMAKOLÓGIA Gere Anikó Kiss Béla Schmidt Éva Szikra Judit Fazekas Károly FARMAKOKINETIKA Dallos Szvetlana Gémesi Larisza Kapás Margit Nagy Zoltán Trafikánt Gábor Terjéki Etelka ELEKTROFIZIOLÓGIA Fodor László Kocsis Pál Tarnawa István Boros András Kovács Gyula FORMULÁCIÓ Bódis Attila

FÁJDALOMCSILLAPÍTÓ HATÁSÚ NR2B ALTÍPUSSZELEKTÍV NMDA ANTAGONISTÁK KUTATÁSA. Borza István

Recommend Documents