FACULTEIT WETENSCHAPPEN VAKGROEP BIOCHEMIE, FYSIOLOGIE en MICROBIOLOGIE Laboratorium voor Eiwitbiochemie en Eiwitengineering

FACULTEIT WETENSCHAPPEN VAKGROEP BIOCHEMIE, FYSIOLOGIE MICROBIOLOGIE

en

Laboratorium voor Eiwitbiochemie en Eiwitengineering

Klonering en expressie van het Chlorobium limicola forma thiosulfatophylum cytochroom c-551 gen, deel uitmakend van een thiosulfaatverbruikend gencluster

Mathias Vandenbogaert

Promotor: Prof. Dr. J. Van Beeumen Academiejaar 1998-1999 Scriptie voorgelegd tot het behalen van de graad van Licentiaat in de Biochemie

Dankwoord Vooreerst wens ik Prof. Dr. J. Van Beeumen te bedanken als promotor van dit werk, en die me de gelegenheid en de middelen gegeven heeft om in zijn labo dit werk tot een goed einde te brengen. In het bijzonder wil ik van ganser harte Fabienne Verté bedanken die mij gedurende het ganse jaar in het praktische werk heeft begeleid, en die voor de keuringe omlijning en de verbetering van dit thesiswerk heeft gezorgd. Ik richt mij hierbij ook tot Dr. Yves Guisez, wiens tips en advies met het herlezen van deze thesis veel geholpen hebben bij de finale afwerking ervan. Ook aan hun medewerkers op het labo wil ik mijn dank betuigen. Hun steun als grote stimulans was voor mij onontbeerlijk bij het opdoen van kennis in de meest essentiële aspekten van de praktijk in het laboratorium. Tenslotte dank ik mijn ouders aan wie ik nooit genoeg lof zal kunnen getuigen voor hun stimulerend vertrouwen, voor het geduld, en voor de bezorgde maar levendige hoop die zij tot hiertoe hebben onderhouden. Mathias.

i

INLEIDING. Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum bevat drie tot nog toe bestudeerde oplosbare c-type cytochromen die een rol spelen bij de oxidatie van zwavelbevattende elektronendonors. Flavocytochroom c-553 is een sulfide dehydrogenase dat de elektronen van sulfide naar cyt c555 transporteert. Cytochroom c-555 fungeert niet alleen als elektronenacceptor bij de oxidatie van sulfide maar ook als elektronenacceptor bij de oxidatie van thiosulfaat (Davidson et al., 1986). Cytochroom c-551 speelt een rol als elektronenacceptor van thiosulfaat reductase. Cyt c551 zou een specifieke rol kunnen spelen bij thiosulfaat oxidatie omdat het enkel voorkomt in de thiosulfaatverbruikende biovars van Chlorobium. De sequentie van het cyt c-551 werd recentelijk opgehelderd (Klarskov et al., 1998), en blijkt homoloog te zijn met SoxA van Paracoccus denitrificans dat deel uitmaakt van een thiosulfaat verbruikende gencluster. Deze studie heeft tot doel de flankerende genen van het cyt c-551 gen op te pikken, om aldus aan te tonen af het cytochroom c-551 eveneens deel uitmaakt van een thiosulfaatverbruikend gencluster, analoog aan deze van Paracoccus denitrificans. Het cyt c-551 genproduct is een periplasmatisch proteïne, zodat het met een signaalsequentie naar de periplasma moet worden getransporteerd. De signaalsequentie van het organisme zelf bezit echter geen duidelijke klievingssite omdat het proteïne waarschijnlijk membraangebonden blijft na zijn translocatie uit het cytoplasma. In deze studie wordt het export van het matuur eiwit vergemakkelijkt door gebruik te maken van de signaalsequentie van de cytochroomsubeenheid van het Chromatium vinosum flavocytochroom c sulfide dehydrogenase (FCSD), dat wel duidelijk afgesplitst wordt na export, zodat het proteïne vrij in de periplasma terecht komt. Het gen coderend voor cyt c-551 zal eveneens gefusioneerd worden met een signaalsequentie afkomstig van E. coli. Om het eiwit te overexpresseren worden verschillende constructen aangemaakt, waarbij signaalsequenties van verschillende oorsprong worden gebruikt, nl. dit van E. coli, en van Chromatium vinosum. Er zullen verschillende E. coli stammen worden uitgetest bij de overexpressie-experimenten. In een laatste deel van dit studiewerk zal getracht worden het gen van het cyt c-551 te inactiveren via homologe recombinatie. Een suicide vector wordt gebruikt waarbij een kanamycineresistentiemerker wordt ingebouwd in de sequentie van het cyt c-551, zodat bij conjugatieve transfer van het plasmide door homologe recombinatie het gen coderend voor cyt c-551 in het operon wordt vervangen door het geïnactiveerde homoloog. Op deze manier kan aangetoond worden of het cyt c-551 gen al dan niet noodzakelijk is voor fotolithotrofe groei op thiosulfaat.

ii

AFKORTINGEN Ω β-gal µF µg µl µM A Ab Ac AmpR APS ATP BAP Bchl bp BPB C Cb Chl chrDNA CIP CSPD dH2O DMSO DNA Dnase dNTP ds DNA DTT EDTA EPR es DNA EtBr EtOH FAD FCSD FMN g G IPTG kb kDa Km kV l LB M

Ohm; insertiesegment beta-galactosidase microfarad microgram microliter micromol adenine of adenosine antibiotica acetaat ampicilineresistentiegen ammonium persulfaat adenosinetrifosfaat bovine alkaline phosphatase bacteriochlorofyl baseparen broom phenol blue cytosine of cytidine carbeniciline chlorofyl chromosomaal DNA Calf intestinal phosphatase disodium 3-(4-methoxyspiro{1,2 dioxetaan-3,2’-(5’-chloro) tricyclo (3.3.1.1) decaan}-4-yl) fenyl fosfaat gedestilleerd water dimethylsulfoxide deoxynucleïnezuur deoxyribonuclease deoxynucleotidetrifosfaat dubbelstrengig DNA dithiotreïtol ethyleendiaminetetra-acetaat electron paramagnetic resonance enkelstrengig DNA ethidium bromide ethanol flavine adenine dinucleotide flavocytochroom c sulfide dehydrogenase flavine mononucleotide gram; valversnelling 9.81 m/s2 guanine of guanosine β-D-isopropyl-thiogalactopyranoside kilobase kilodalton kanamycine kilovolt liter Luria-Bertani molair iii

MCS MeOH mg MG min ml mM Mm MOPS MQ mRNA NAD Ni-NTA nm OPA ori PCR pDNA Pi pmol RBS RNA SDS SDS-PAGE sec Sp Srp SSC T TAE TEM TEMED TMBZ TRIS Tween-20 u U U.V. UTP X-gal

multiple cloning site methanol milligram moleculair gewicht minuut milliliter millimolair moleculaire massa 3-N-morpholinopropaansulfonzuur Milli-Q messenger RNA of boodschapper RNA nicotinamide adenine dinucleotide Nickle Nitrilotriacetic acid nanometer One-Phor-All (Pharmacia) origin polymerase chain reaction plasmide DNA anorganisch fosfaat picomol ribosome binding site ribonucleïnezuur sodium dodecyl sulfate of natriumdodecylsulfaat sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electroforesis seconde Spectinomycine Streptomycine SDS-sodiumcitraat-NaCl thymine of thymidine Tris-acetaat-EDTA transmissie elektronen microscopie N,N,N’,N’-tetramethylethyleen diamine 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine tris(hydroxymethyl)aminometaan; 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propaan diol polyoxyethyleensorbitaanmonolauraat unit of eenheid uracil of uridine ultraviolet uridinetrifosfaat 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galactopyranoside

iv

De genetische code. First position

Second position U

U

C

A

G

C

Third position

A

G

UUU UUC

F F

UCU UCC

S S

UAU UAC

Y Y

UGU UGC

C C

U C

UUA

L

UCA

S

UAA

Ochre

UGA

opal

A

UUG

L

UCG

S

UAG

Amber

UGG

W

G

CUU

L

CCU

P

CAU

H

CGU

R

U

CUC

L

CCC

P

CAC

H

CGC

R

C

CUA

L

CCA

P

CAA

Q

CGA

R

A

CUG

L

CCG

P

CAG

Q

CGG

R

G

AUU

I

ACU

T

AAU

N

AGU

S

U

AUC

I

ACC

T

AAC

N

AGC

S

C

AUA

I

ACA

T

AAA

K

AGA

R

A

AUG

M

ACG

T

AAG

K

AGG

R

G

GUU

V

GCU

A

GAU

D

GGU

G

U

GUC

V

GCC

A

GAC

D

GGC

G

C

GUA GUG

V

GCA GCG

A

GAA GAG

E

GGA GGG

G

A G

V

A

E

v

G

INHOUDSTAFEL Dankwoord Inleiding. Afkortingen De genetische code. Inhoudstafel

i ii iii v vi

I. LITERATUURSTUDIE

1

1. Algemene bespreking van de familie van de Chlorobiaceae.

1

2. Zwaveloxidatie door fototrofe bacteriën. 2.1. Chlorobiaceae 2.2. Chromatiaceae 2.3. Ectothiorhodospiraceae 2.4. Rhodospirillaceae

6 6 7 7 7

3. Enzymologie van de zwaveloxidatie 3.1. Oxidatie van H2S naar S0 3.2. Oxidatie van H2S tot SO32-: sulfiet reductase 3.3. Oxidatie van elementair zwavel 3.4. Sulfiet oxidatie 3.5. Thiosulfaat oxidatie 3.5.1. Thiosulfaat:acceptor oxidoreductase 3.5.2. Rhodanese en thiosulfaat reductase 3.5.3. Hydrolytische ontbinding van thiosulfaat

8 8 9 9 10 10 10 11 12

4. Elektronentransport en CO2 fixatie door fototrofe bacteriën 4.1. Groen-zwavelbacteriën. 4.2. Purper zwavelbacteriën

12 12 14

5. Fotosynthetische reactie in groen-zwavelbacteriën

15

6. Bespreking van de Cytochromen – classificatie

16

7. Structuur en functie van c-type cytochromen

20

8. De cytochromen van Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum 8.1. Cytochroom c-551 8.2. Cytochroom c-555 8.3. Flavocytochroom c-553 8.4. Complexvorming tussen de cytochromen

23 24 25 26 27

9. Cytochroom c biogenese 9.1. Systeem I 9.2. Systeem II 9.3. Systeem III 9.4. Opeenvolgende stappen in cytochroom c biogenese

27 28 29 30 30

vi

10. Gentransformatiesystemen 10.1. Transductie 10.2. Transpositie 10.3. Transformatie van natuurlijk competente cellen 10.4. Transformatie van cellen door geïnduceerde competentie 10.5. Conjugatie 10.6. Elektroporatie 10.7. Transposon mutagenese

33 33 34 34 36 36 38 39

II. MATERIAAL EN METHODE

42

1. Media. 1.1. Medium voor Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum. 1.2. Medium voor Chlorobium tepidum. 1.3. Minimaal zoutmedium. 1.4. Luria-Bertani medium (LB medium) 1.5. SOC medium

42 42 43 44 44 44

2. Bereiding van chromosomaal DNA 2.1. Principe. 2.2. Materiaal 2.3. Methode

45 45 45 45

3. Bereiding van pDNA 3.1. pDNA bereiding volgens Birnboim en Doly 3.1.1. Principe. 3.1.2. Materiaal. 3.1.3. Methode. 3.2. pDNA bereiding volgens de QIAGEN methode. 3.2.1. Principe 3.2.1. Materiaal. 3.2.2. Methode.

46 47 47 47 47 48 48 49 50

4. Enzymatische reacties. 4.1. Restrictieënzymen. 4.2. CIP-reactie. 4.2.1. Principe 4.2.2 Materiaal. 4.2.3. Methode. 4.3. PCR (‘Polymerase Chain Reaction’). 4.3.1. Principe. 4.3.2. Principe van chimeer PCR. 4.3.3. Reactiemengsel: 4.4. Ligatie.

50 50 52 52 52 52 53 53 55 57 57

5. Transformatie. 5.1. Transformatie via elektroporatie. 5.1.1. Eigenschappen en efficiëntie van de methode. 5.1.2. Bereiding van elektrocompetente cellen.

58 58 58 59

vii

5.1.3. Elektroporatie-protocol. 5.2. Transformatie via de CaCl2-methode. 5.2.1. Principe. 5.2.2. Bereiding van competente cellen d.m.v. de CaCl2 methode. 5.2.3. Protocol voor CaCl2-Transformatie.

59 59 59 60 60

6. Agarosegelelektroforese. 6.1. Principe 6.2. Materiaal. 6.3 Methode.

60 60 62 63

7. Zuivering van DNA. 7.1. see-DNA 7.1.1. Principe. 7.1.2. Materiaal en Methode 7.2. QIAquick 7.2.1. Principe 7.2.2. Materiaal en Methode. 7.3. QIAEX II Gel Extraction kit. 7.3.1. Principe. 7.3.2. Materiaal. 7.3.3. Methode. 7.4. QIAquick Gel Extraction kit. 7.4.1. Principe. 7.4.2. Materiaal en Methode.

63 63 63 63 64 64 65 65 65 66 66 67 67 67

8. Southernblotting en hybridisatie. 8.1 Southernblotting 8.1.1. Principe. 8.1.2. Materiaal. 8.1.3. Methode 8.2. Aanmaak DIG-gelabelde probe. 8.2.1. Principe. 8.2.2. Materiaal. 8.2.3. Methode 8.3. Opbrengst DIG-gelabelde probe 8.3.1. Principe. 8.3.2. Materiaal. 8.3.3. Methode. 8.4. Hybridisatie. 8.4.1. Principe. 8.4.2. Materiaal. 8.4.3. Methode. 8.5. Detectie 8.5.1. Principe. 8.5.2. Materiaal. 8.5.3. Methode. 8.6. Koloniehybridisatie. 8.6.1. Principe. 8.6.2. Materiaal.

68 68 68 68 69 70 70 70 70 70 70 70 71 71 71 72 72 73 73 73 74 74 74 74 viii

8.6.3. Methode. 8.7. “Stripping” en “reprobing” 8.7.1. Principe. 8.7.2. Materiaal. 8.7.3. Methode.

75 75 75 75 75

9. Eiwitextracten. 9.1. Periplasmatische eiwitextractie volgens de Tris-HCl methode. 9.1.1. Principe. 9.1.2. Materiaal. 9.1.3. Methode. 9.2. Periplasmatische eiwitextractie volgens de sucrose methode. 9.2.1. Principe. 9.2.2. Materiaal. 9.2.3. Methode. 9.3. Totaal extract door sonicatie. 9.3.1. Principe. 9.3.2. Materiaal en Methode.

76 76 76 76 76 76 76 76 77 77 77 77

10. SDS-PAGE. 10.1. Principe. 10.2. Materiaal. 10.3. Methode.

77 77 78 80

11. Detectie van proteïnen. 11.1. Kleuring met Coomassie. 11.1.1. Principe. 11.1.2. Materiaal 11.1.3. Methode 11.2. Zilverkleuring 11.2.1. Principe. 11.2.2. Materiaal. 11.2.3. Methode. 11.3. Haem detectie. 11.3.1. Principe. 11.3.2. Materiaal. 11.3.3. Methode.

80 80 80 80 81 81 81 81 81 82 82 82 82

12. Gebruikte bacteriële (Chlorobium en E. coli) stammen en plasmiden. 12.1. Chlorobium-stammen 12.2. E. coli stammen. 12.3. Vectoren. 12.3.1. De pGEM-T vector. 12.2.2. De pUC-18 vector. 12.2.3. De pQE-60 vector 12.2.4. De pKK233-3 vector. 12.2.5. Pt10 12.2.6. De pLPP vector. 12.2.6. De pRVS2 Suicide vector. 12.2.7. De pACYC184 vector.

82 82 82 83 83 84 85 86 87 88 89 90

ix

I. LITERATUURSTUDIE 1. Algemene bespreking van de familie van de Chlorobiaceae. Taxonomische situering: De Chlorobiaceae behoren tot de groep van de fototrofe bacteriën. Algemeen worden de fototrofe bacteriën onderverdeeld in de oxygene fotosynthetische bacteriën, waartoe de Cyanobacteriën en de Prochlorales behoren, en de anoxygene fotosynthetische bacteriën (Overmann et al., 1997) waartoe de purperbacteriën, de groene bacteriën en de heliobacteriën behoren. Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum behoort tot de familie van de Chlorobiaceae. Naast de Chlorobium soorten worden Ancalochloris, Chloroherpeton, Pelodictyon en Prosthecochloris in deze familie ondergebracht. Op basis van 16S ribosomaal sequentieanalyse werd de fylogenie van de groene zwavelbacteriën onderzocht (zie figuur 1.1.) (Overmann et al., 1997).

Chlorobiaceae

Ancalochloris

Ancalochloris perfilievii

Chlorobium

Chl. vibrioforme Chl. vibrioforme f. thiosulfatophylum Chl. chlorovibrioides Chl. limicola Chl. limicola f. thiosulfatophylum Chl. phaeobacteroides Chl. phaeovibrioides

Chloroherpeton

Chloroherpeton thalassium Pelodictyon luteolum Pelodictyon clathratiforme Pelodictyon phaeocelathratiforme Pelodictyon phaeum Prosthecochloris aestuarii Prosthecochloris phaeoasteroidea

Pelodictyon Prosthecochloris

Figuur 1.1. Taxonomische situering volgens genus en species van Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum in de Chlorobiaceae (Overmann et al., 1997).

De familie van de Chlorobiaceae is een goed geïsoleerde groep binnen de anoxygene fototrofe bacteriën. Zij komen voornamelijk voor in zoetwaterhabitats, in lagen aan uitstromende zwavelbronnen. Hun voorkomen kan worden opgemerkt bij de hoogste sulfideconcentraties, in anaërobe omstandigheden, dit in tegenstelling tot de groep van de purper zwavelbacteriën, die bij lagere zwavelconcentraties voorkomen. Meestal komen groene en purperbacteriën samen voor in lagen, en worden groen-zwavelbacteriën net onder de purper zwavelbacteriën aangetroffen. Dit kan worden verklaard door het enorm efficiënte licht opvangende chlorosoom-complex van de 1

Chlorobiaceae, welke minder extensieve radiaties behoeven. Chlorobiaceae hebben slechts één vierde van de lichtbehoeften nodig van de purperbacteriën (Biebl en Pfennig, 1978). De groen-zwavelbacteriën bezitten de mogelijkheid een symbiotisch bestaan te leiden. Daarbij wordt een centrale chemoörganotrofe (mobiele) bacterie overgroeid door synchroon delende groen-zwavelbacteriën (zie figuur 1.2.). Dit consortium houdt in dat er een hoge metabolische afhankelijkheid bestaat tussen de cellen onderling (Trüper and Pfennig, 1978).

Figuur 1.2. (a) Fase contrast microscopisch beeld en (b) TEM beeld van een groene bacteriële consortium (Brock et al., 1994). In (a) is het niet fotosynthetische centrale organisme lichter in kleur dan de gepigmenteerde fototrofe bacteriën. In (b) zijn de chlorosomen zichtbaar als lichtere globules aan de buitenzijde van de fototrofe bacteriën.

Het Chlorochromatium consortium bestaat uit 1 enkele coccusvormige en polair geflagelleerde, mobiele en kleurloze centrale bacterie, waarop 6 tot 12 coccusvormige, onbeweeglijke groene cellen van het Chlorobium limicola - type vastgehecht zijn. De niet beweeglijke fototrofe Chlorobium symbionten produceren aldus een positieve fototactische respons. De consortia zijn in staat om te accumuleren aan de verlichte zijde van de cultuur. Door de symbiose zijn de niet-beweeglijke Chlorobium cellen in staat om te reageren op verschillende lichtintensiteiten, zoals de beweeglijke Chromatiaceae (Pfennig, 1980). Deze symbiontische consortia kunnen gevonden worden in zoetwaterhabitats, welke anaërobe en sulfidebevattende moerassen en meren zijn. Een mogelijke rol van de centrale kleurloze bacterie, naast de geïnduceerde mobiliteit, kan worden afgeleid van de waarneming dat het sulfide dat nodig is voor de Chlorobiaceae-species afkomstig kan zijn van sulfaat of elementair zwavel reducerende bacteriën die met hen geassocieerd zijn. Deze bacteriën verbruiken organische componenten als elektronendonoren en reduceren sulfaat of elementair zwavel naar sulfide, welke door de fototrofe bacterie kan worden gebruikt die het sulfide in het licht terug naar sulfaat omzetten. Indien het organisch materiaal dat wordt geproduceerd door de fototrofe groene bacterie, gebruikt wordt door de sulfaatreducerende bacterie, dan ontstaat een systeem dat autonoom in zijn voedingscomponenten voorziet, gedreven door lichtenergie (Brock et al., 1994). 2

De meromictische meren, welke een permanente stratificatie vertonen wegens de aanwezigheid van een densere hoeveelheid water (meestal ook zoutwater) aan de bodem van het meer, vormen een speciale omgeving met eigenschappen tussen de holomictische zoetwatermeren, welke een seizoensgebonden stratificatie vertonen wegens thermale verschillen, en de ondiepe mariene habitats. Sterke bloei van fototrofe zwavelbacteriën kan worden teruggevonden in het uiterst stabiele gebied tussen het stagnerend anaërobe en sulfidebevattende zeewater, en het erboven gelegen zoet- of brakwater. In deze meromictische meren zijn verscheidene soorten Chlorobiaceae permanent te vinden. De fotosynthetische activiteit van deze bacteriën is groot genoeg om het ecosysteem van het meer van zijn organisch materiaal te bevoorraden (Brock et al., 1994). Groene Chlorobiaceae zijn dominante soorten in meren waar zij groeien nabij het oppervlak (2-4m), terwijl de soorten die op 5-9m diepte groeien, van het groene en/of bruine type zijn. Soorten die op 9-25m groeien, behoren uitsluitend tot het bruine type. Door het verschijnsel van de selectieve filtering van de golflengten van het licht door het water op successieve dieptes, hebben de bruine Chlorobiaceae een selectief voordeel boven de groene door het licht in het golflengtegebied tussen 450-550 nm (smalle band van blauwgroen licht) dat het diepst in de waterkolom treedt, op te vangen. Enkel de carotenoïde antennepigmenten van de bruine species (isorenierateen en β-isorenierateen) hebben een breed absorptie gebied tussen 450-550 nm, zodat deze soorten efficiënt de blauwgroene golflengten kunnen absorberen (Pfennig, 1989). De carotenoïden van de purper zwavelbacteriën absorberen ook in dit gebied, maar de soorten hebben een hogere radiatie intensiteit nodig voor vergelijkbare groeisnelheden, waardoor zij niet in competitie kunnen treden met de bruine Chlorobiaceae bij limiterende lichtintensiteit (Biebl en Pfennig, 1978). Er werden sporen van bacteriochlorofyl e op 80m diepte gevonden in de Zwarte Zee, waar H2S werd gedetecteerd. Dit is een voorbeeld van het vermogen van de bruine Chlorobium soorten om te overleven bij lage blauwgroene radiatie-intensiteiten. De purper- en groene bacteriën vormen een groep met diverse kenmerken op morfologisch en fylogenetisch niveau. Morfologisch kunnen coccen, staafjes, vibrio’s, spirillen, knopvormige bacteriën en glijdende types onderscheiden worden. Figuur 1.3. laat een celsuspensie van een Chlorobium limicola cultuur zien.

Figuur 1.3. Celsuspensie van Chlorobium limicola (Brock et al., 1994), waarbij de extracellulaire zwavelglobules te zien zijn..

In tabel I worden verschillende Chlorobiaceae-speciës met elkaar vergeleken.

3

Speciës

AggregatieVorm en vorm grootte (µm)

Chlorobium chlorovibrioides

Vibrio, 0.30.4 X 0.7-1.4 Staaf, 0.7Chlorobium limicola 1.1 X 0.9-1.5 Chlorobium Staaf, 0.6phaeobacterioides 0.8 X 1.3-2.7 Chlorobium Vibrio, 0.3phaeovibrioides 0.4 X 0.7-1.4 Chlorobium Vibrio, 0.5vibrioforme 0.7 X 1.0-1.2 Chloroherpeton thalassium Pelodictyon clathratiforme

Staaf, 1.0 X 8-30

Aanwezigheid Dominante Kleur van de van celsuspensie Bacteriochlorofyl gasvacuolen

Dominante carotenoïde pigmenten

GC %

Speciale benodigdheden

54

2-3% NaCl

Spiralen

-

Groen

c of d

Chlorobacteen

Ketens

-

Groen

c of d

Chlorobacteen 51.0-58.1

/

Ketens

-

Bruin

e

Isorenierateen 49.0-50.0

Vit. B12

Spiralen

-

Bruin

e

Isorenierateen 52.0-53.0

2% NaCl, Vit. B12

Spiralen

-

Groen

d of e

Chlorobacteen 52.0-57.0

2% NaCl

Groen

c

γ-caroteen

45-48.2

1-3% NaCl, Vit. B12

+

Groen

c of d

Chlorobacteen

48.5

Vit. B12

+

Groen

c of d

Chlorobacteen 53.5-58.1

+

Bruin

e

Isorenierateen

-

Groen

c

Chlorobacteen 52.0-56.0

- en + Unicellulaire afhankelijk glijdende van het filamenten onwikkelingsstadium

Staaf, 0.7Netten 1.2 X 1.5-2.5 Ovoied, 0.6- Aggregaties, Pelodictyon luteolum 0.9 X 1.2-2.0 sferen Pelodictyon Staaf, 0.75Netten phaeoclathratiforme 1.1 X 1.5-3 Prosthecochloris Sfeer, 0.5Ketens aestuarii 0.7 X 1.0-1.2

Tabel I. Eigenschappen van een aantal soorten van het Chlorobium genus (Trüper en Pfennig, 1978).

4

47.9

0-3% NaCl, Vit. B12 / 1-18% NaCl, Vit. B12

Het meest opvallende verschil tussen Chlorobiaceae en de purperzwavel bacteriën (Chromatiaceae en Ectothiorhodospiraceae) is de aard van het fotosynthetische membraansysteem en de Bchl pigmenten. De eenvoudigste manier om Chlorobiaceae en purper zwavel bacteriën te differentiëren, is door de absorptiespectra te meten van celsuspensies. In figuur 1.4. wordt een absorptiespectrum van Chlorobium limicola weergegeven. De absorptiegolflengte typerend voor de 3 gekende antenne Bchl in levende Chlorobiaceae zijn: - Bchl c, 745-755 nm, - Bchl d, 715-745 nm, - Bchl e, 710-715 nm.

Figuur 1.4. Absorptiespectrum van een celsuspensie van Chlorobium limicola.

In purperbacteriën behoren de fotosynthetische pigmenten tot een goed uitgewerkt intern membraansysteem, welke verbonden is met de cytoplasmatische membraan. In sommige gevallen is het membranair systeem opgebouwd uit een reeks platte lamellen, en in andere gevallen worden ronde tubulen waargenomen, vesikels genaamd. De aard en de hoeveelheid pigmentmoleculen in de membraan wordt bepaald door de aanwezigheid van O2 en de lichtintensiteit. Als de cellen aëroob worden opgegroeid, dan wordt synthese van Bchl geïnhibeerd, zodat geen fotosynthese meer kan optreden door het ontbreken van fotosynthetische pigmenten en van interne membranaire structuren. Bijgevolg is fotosynthetische groei enkel mogelijk in anaërobe omstandigheden. In cellen die in een hoge lichtintensiteit worden opgegroeid, wordt de synthese van de fotosynthetische pigmenten eveneens geïnhibeerd, terwijl cellen die in lage lichtintensiteiten worden opgegroeid grote hoeveelheden fotosynthetische pigmenten vertonen zodat zij relatief goed kunnen groeien bij deze lage lichtintensiteiten. In groene bacteriën is het fotosynthetische apparaat opgebouwd uit een reeks cylindrische structuren, de chlorosomen, welke verbonden zijn met de binnenzijde van de cytoplasmatische membraan, en in rechtstreekse associatie met de plasmamembraan. Zij bevatten de antenne Bchl, en dragen energie over op reactiecentrum Bchl in de plasmamembraan, welke steeds Bchl a is bij Chlorobiaceae. Bchl c, d of e (afhankelijk van de species) zijn in deze chlorosomen gelokaliseerd, terwijl de meeste Bchl a pigmenten en componenten van de fotosynthetisch elektronentransportketen in de cytoplasmatische membraan gelokaliseerd zijn. Bchl a is slechts 5

in zeer kleine hoeveelheden aanwezig in vergelijking tot de totale hoeveelheid Bchl in Chlorobiaceae, en is dus weinig uitgesproken in zulke spectra. 2. Zwaveloxidatie door fototrofe bacteriën. De meeste fototrofe bacteriën kunnen gereduceerde zwavelcomponenten gebruiken als elektronendonoren voor fotosynthetische CO2 reductie. Indien H2S de elektronendonor is, accumuleren microscopisch waarneembare zwavelglobules, intra- of extracellulair. Dissimilatorisch zwavelmetabolisme (d.i. het gebruik van zwavelcomponenten als elektronenbron of -reservoir, in tegenstelling tot het assimilatorische zwavelmetabolisme die de componenten gebruikt als biosynthetische substraten) werd het meest intensief bestudeerd in de purper- en groen-zwavelbacteriën (Brune, 1989). Purperzwavelbacteriën worden tegenwoordig in drie families ondergebracht: de Chromatiaceae, Ectothiorhodospiraceae, en de Rhodospirillaceae. De dichte verwantschap tussen de families van de purperbacteriën blijkt uit hun gemeenschappelijke paden inzake fotosynthetisch elektronentransport en CO2 fixatie, die verschillend zijn van de groen-zwavelbacteriën. 2.1. Chlorobiaceae Chlorobiaceae zijn obligate fotoautotrofen, die H2S of S0 als elektronendonor kunnen gebruiken. Extracellulaire S0 globulen zijn de enige waarneembare intermediairen tijdens de H2S-oxidatie tot SO42-. Twee Chlorobium cellijnen, Chlorobium vibrioforme f. thiosulfatophylum en Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum kunnen thiosulfaat (S2O32-) naar SO42- oxideren. Deze twee lijnen zijn uniek binnen de fototrofe bacteriën in diverse opzichten, ook in het feit dat zij de enigen zijn die tetrathionaat (S4O62-) als elektronendonor kunnen gebruiken (Larsen et al., 1952). Zij zijn ook de enige fototrofe bacteriën die een chemische disproportionering (d.i. het chemisch splitsen van een substraat in twee componenten, waarbij de ene component meer geoxideerd is, en de andere component meer gereduceerd is dan het originele substraat) kunnen uitvoeren van S0 naar H2S en S2O32-, in belichte omstandigheden en in afwezigheid van CO2, de terminale elektronenacceptor (Paschinger et al., 1974). De disproportioneringsreactie wordt gebruikt als een manier van energiemetabolisme wanneer organische substraten tekort schieten, en als gereduceerde zwavelcomponenten nog aanwezig zijn. Sporen SO32- waargenomen tijdens deze reactie suggereren dat H2S en SO32- de initiële producten zijn, waarbij S2O32- in een zuiver chemische reactie tussen SO32- en S0 wordt gevormd (Trüper en Fischer, 1982). Het feit dat thiosulfaat-verbruikende purperbacteriën geen zwavel disproportioneringsreactie kunnen uitvoeren, suggereert dat ferredoxine (welke wordt gereduceerd tijdens het fotosynthetisch elektronentransport in Chlorobiaceae, maar niet in purperbacteriën) de elektronen kan leveren voor reductie van S0 naar H2S. De twee thiosulfatophylum species verschillen van de andere Chlorobiaceae door het opstapelen van zowel S2O32- als S0 als intermediair tijdens H2S oxidatie in cultuur, waarbij in beide soorten S2O32- vorming vóór S0 vorming optreedt. Zij verschillen onderling in het feit dat bij Chlorobium vibrioforme f. thiosulfatophylum S0 wordt gevormd (extracellulaire globules) als intermediair tijdens S2O32- oxidatie, en niet bij Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum (Fischer, 1984). Geen enkel lid van de Chlorobiaceae kan SO32- als elektronendonor gebruiken.

6

2.2. Chromatiaceae Deze familie kan in twee groepen worden opgedeeld (Trüper, 1978). De eerste groep, de Chromatium soorten met brede cellen, kunnen enkel H2S of elementair zwavel als elektronendonor gebruiken. Leden uit deze groep zijn niet in staat tot assimilatorische sulfaat reductie en behoeven H2S of S0 als zwavelbron voor biosynthese. H2S wordt tot SO42geoxideerd, waarbij extracellulaire zwavelglobules worden geaccumuleerd als intermediair product. De tweede groep, de Chromatium soorten met smalle cellen, gebruiken zowel S2O32- als H2S en S0 als elektronendonor. Vele soorten uit deze groep zijn in staat tot assimilatorische sulfaatreductie indien zij fotoheterotroof gegroeid worden. Intracellulaire S0 globules accumuleren als intermediair tijdens S2032- oxidatie. Chromatium vinosum culturen bij zwak zure omstandigheden (pH 6.25) oxideren S2O32- naar S4O62-, welke niet verder kan worden gemetaboliseerd, in plaats van naar S0 + SO42-. S4O62- is een inhibitor van de oxidatie van S2O32- naar S0 + SO42-, maar is er geen voor de oxidatie tot S4O62- bij neutrale pH. Hypothetisch komt dit omdat S4O62- de opname blokkeert van S2O32- naar het cytoplasma toe (waar S2O32- wordt geconverteerd naar S0 + SO42-). Oxidatie van S2O32- naar S4O62- gebeurt t.h.v. het periplasma, en deze reactie wordt dus niet geblokkeerd. Het is niet geweten of S4O62- een gelijkaardig effect heeft op andere bacteriële soorten (Smith, 1966; Smith en Lascalles, 1966). 2.3. Ectothiorhodospiraceae In deze groep blijken enkel de Bchl b - bevattende extreme halofiele Ectothiorhodspira halochloris en Ectothiorhodspira abdelmalekii geen ware zwavel bacteriën te zijn, wegens het feit dat zij niet in staat zijn fotoautotroof te groeien op gereduceerde zwavelcomponenten en bicarbonaat (Then en Trüper, 1984). Desondanks verdragen zij ongewoon hoge concentraties aan sulfide in het cultuurmedium, welke zij oxideren naar elementair zwavel, waarbij ze hoge concentraties aan polysulfide als intermediair accumuleren, wanneer ze fotomixotroof gegroeid worden (d.i. als ook een organische component en CO2 als C-bron voorhanden zijn). Het is niet duidelijk waarom deze soorten niet fotoautotroof kunnen groeien, gegeven het feit dat sulfide oxidatie met CO2 fixatie gekoppeld is via de Calvin-cyclus. De fotoautotrofe soorten uit deze familie foto-oxideren sulfide naar sulfaat, waarbij als intermediair extracellulair elementaire zwavelglobules worden geaccumuleerd. Transiënte vorming van polysulfide tijdens de sulfideoxidatie bij deze soorten wordt toegewezen aan een chemische reactie tussen H2S en elementair zwavel, gekatalyseerd door het alkalische cultuurmedium. Elementair zwavel en S2O32- worden beide geoxideerd naar SO42- zonder vorming van waarneembare intermediairen. Dit is verschillend van wat bij de thiosulfaat oxiderende Chromatiaceae gebeurt, welke S0 produceren als intermediair tijdens S2O32- oxidatie. SO32- wordt als elektronendonor gebruikt voor fotoautotrofe groei door Ectothiorhodospira mobilis, welke het oxideert naar SO42- (Trüper, 1968). 2.4. Rhodospirillaceae De concentratie H2S die gebruikt wordt voor het in cultuur brengen van purper en groenzwavelbacteriën is toxisch voor Rhodospirillaceae. Eén species die in elk geval niet met sulfide als elektronendonor kan groeien is Rhodocyclus purpureus. De Rhodospirillaceae species die sulfide kunnen gebruiken variëren in sterke mate m.b.t. hun oxidatiecapaciteiten. Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter sphaeroides en Rhodobacter capsulatus kunnen H2S alleen tot elementair zwavel oxideren, die extracellulair accumuleert. 7

Rhodopseudomonas marina, Rhodomicrobium vanniellii en Rhodopila globiformis produceren allen S4O62- of S2O32- als eindproduct bij zwaveloxidatie. Rhodopseudomonas sulfoviridis, Rhodobacter adriaticus, Rhodobacter veldkampii en Rhodobacter sulfidophilus gelijken op de ware zwavelbacteriën wegens hun vermogen tot sulfidetolerantie en wegens sulfidefotooxidatie naar SO42- (Neutzling et al., 1985). 3. Enzymologie van de zwaveloxidatie Elektronen vrijgesteld uit zwaveloxidatiereacties komen de fotosynthetische elektronentransportketen binnen op het niveau van de c-type cytochromen en/of quinonen. De verscheidene enzymen die de zwavel redoxreacties katalyseren zijn voorgesteld in figuur 1.5.

Figuur 1.5. Zwavel redox reacties en de enzymen die ze katalyseren in sulfide en thiosulfaat oxidatie. 1. Flavocytochroom c. 2. Sulfiet reductase. 3. APS reductase + ADP sulfurylase. 4. Sulfiet oxidoreductase. 5. Thiosulfaat reductase. 6. Rhodanese. 7. Thiosulfaat oxidoreductase.

3.1. Oxidatie van H2S naar S0 Het flavocytochroom c sulfide dehydrogenase (FCSD) oxideert het sulfide naar elementair zwavel. In deze reactie worden twee cytochroom c moleculen gereduceerd per molecule gevormd elementair zwavel (Kusai en Yamanaka, 1973) in de flavocytochroom c-553 gekatalyseerde reactie. Een stoichiometrische hoeveelheid S0 wordt gevormd, terwijl geen S2O32of SO42- kan worden waargenomen (Gray en Knaff, 1982). H2S reduceert de FAD-groep van het FCSD, welke dan de elektronen naar de haemgroep van het FCSD transfereert. Het cyt c-555 bindt specifiek met de haemsubeenheid van flavocytochroom c-553 om de elektronen te accepteren, zodat deze elektronen naar het reactiecentrum kunnen overgebracht worden. De haemsubeenheid van flavocytochroom c-553 bevat slechts één enkele haemgroep en bindt slechts op één cyt c-555 molecule (figuur 1.6.). 8

Figuur 1.6. Katalytische actiemodus van flavocytochroom c als sulfide dehydrogenase: één cyt c-555 molecule bindt aan de haemgroep van cyt c553, waarbij het de elektronen verder doorgeeft om P870 te reduceren.

Een alternatieve pathway verloopt via het quinon oxidoreductase dat via sulfide een quinon reduceert. De redoxpotentiaal van het Q/QH2 koppel voor menaquinon of ubiquinon is duidelijk lager dan dit voor het H2S/S0 koppel, en wordt dus thermodynamisch bevoordeligd. Elektronen komen de fotosynthetische elektronentransportketen binnen via quinonmoleculen in groene en in purperbacteriën. Omdat in sommige soorten die H2S tot S0 kunnen oxideren geen flavocytochroom c werd teruggevonden, werd gedacht dat andere cytochromen het flavocytochroom c zouden substitueren in de functie van sulfide dehydrogenase. Meestal werd deze rol toevertrouwd aan monohaem-type cytochromen, en omdat deze monohaem cytochromen slechts één elektron per keer kunnen transfereren zouden onstabiele sulfide radicaal tussenproducten moeten ontstaan, zoals dit voorkomt in aërobe sulfideoxidatie. Er wordt verondersteld dat het flavocytochroom c het sulfide veel sneller kan oxideren dan de andere c-type cytochromen, omdat het simultaan 2 elektronen kan accepteren, zodat sulfide radicaalintermediairen worden vermeden. 3.2. Oxidatie van H2S tot SO32-: sulfiet reductase H2S kan ook rechtstreeks geoxideerd worden tot SO32- door een sulfiet reductase, welke in de omgekeerde reactierichting werkt. Dit enzym functioneert in sulfide oxidatie i.p.v. in sulfaatassimilatie, wat kan worden afgeleid uit het feit dat het voorkomt in cellen welke op sulfide en CO2 fotoautotroof groeien, en die niet in malaat en sulfaat fotoheterotroof kunnen groeien. 3.3. Oxidatie van elementair zwavel Enzymen die S0 oxidatie katalyseren werden nog niet geïsoleerd uit fototrofe bacteriën. De niet-fotosynthetische zwaveloxiderende bacterie Thiobacillus denitrificans beschikt over een 9

systeem waarbij een glutathion-vereisend enzym S0 oxideert naar SO32- in anaërobe omstandigheden met Fe3+ als elektronenacceptor. Omdat er geen fototroof bacterieel enzym gekend is, welke de S0 oxidatie kan uitvoeren, moet de mogelijkheid overwogen worden dat S0 gevormd kan worden t.h.v. een zijvertakking van de hoofdweg voor sulfideoxidatie, en welke dan terug gereduceerd moet worden tot sulfide alvorens verder oxidatie kan optreden (via sulfiet reductase). 3.4. Sulfiet oxidatie SO32- wordt gevormd ofwel door (1) oxidatie van H2S via sulfiet reductase of (2) door reductie van S2O32- naar H2S + SO32-. Dit wordt verder geoxideerd tot SO42-, het finaal zwaveloxidatieproduct in fototrofe bacteriën. Algemeen katalyseren twee enzymen de sulfiet oxidatie: Adenosine Fosfosulfaat (APS) reductase en sulfiet acceptor oxidoreductase, waarbij het laatste niet bij de Chlorobiaceae voorkomt. 2−

Het APS reductase katalyseert de volgende reactie: SO3 + AMP → APS + 2e − . Het APS reductase enzym heeft AMP nodig om Fe(CN)63- te reduceren. Daaruit valt af te leiden dat het enzym in vivo over een elektronenaccepterend vermogen beschikt. SO42- wordt uit APS gesynthetiseerd door reactie met Pi tot vorming van ADP + SO42-, gekatalyseerd door ADP sulfurylase, zodat een deel van de hoogenergetische fosfosulfaatbindingen in de fosforanhydridebinding geconserveerd blijft. APS + Pi → ADP + SO42− APS reductase werd gedetecteerd in Chromatiaceae en in Chlorobiaceae, maar niet bij de Rhodospirillaceae die sulfide oxideren naar sulfaat. Ectothiorhodospiraceae beschikken algemeen niet over APS reductase. Sulfaat reducerende bacteriën gebruiken APS reductase om SO42- naar SO32- te reduceren, m.a.w. het enzym ageert in de zin gespecificeerd door zijn benaming. Reductie van het geoxideerde reactiecentrum is een periplasmatisch gebeuren, terwijl APS reductase een cytoplasmatisch enzym is, wegens zijn AMP-afhankelijke natuur, en het feit dat verder metabolisme van APS naar ADP (en ATP) enkel m.b.v. intracellulaire enzymen kan gebeuren. Deze manier van elektronentranslocatie kan enkel optreden m.b.v. een membraanoverspannende carrier zoals het b/c1 complex. 3.5. Thiosulfaat oxidatie 3.5.1. Thiosulfaat acceptor oxidoreductase In het eenvoudigste geval wordt S2O32- rechtstreeks geoxideerd naar tetrathionaat (S4O62-) in een enzym gekatalyseerde reactie. In Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum is het cyt c-551 de elektronenacceptor van het thiosulfaat oxidoreductase enzym. Van Grondelle et al. (1977) stelden vast dat het cyt c-550 van Chromatium vinosum wordt gereduceerd door S2O32-, waarschijnlijk via een intermediair enzymsysteem, welke volgens Fisher (1984) een periplasmatisch thiosulfaat oxidoreductase is. Een alternatief voor deze thiosulfaatoxidatieweg is dat S2O32- kan worden opgenomen in het cellulaire cytoplasma en reductief gesplitst wordt in H2S en SO32-, welke dan cyt c-550 reduceert via een membraanoverspannend cyt b/c1 complex in het cyclisch elektronentransportsysteem.

10

Het thiosulfaat oxidoreductase in Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum is analoog aan dit van Chromatium vinosum geïsoleerd door Smith (1966) in het feit dat het ook een hoge Kmwaarde heeft voor S2O32- en een zuur pH-optimum. De elektronenacceptor voor het enzym blijkt cyt c-551 in Chlorobium te zijn. De vorming van het aangetoonde complex tussen cyt c-551 en cyt c-555 van Chlorobium vormt een geprefereerde elektronenacceptor in deze reactie. Het enzym wordt voor 80% geïnhibeerd bij 0.1mM SO32-, en voor 47% bij 0.1 mM CN-. Elektronen van cyt c-551 (Em,7 = +135mV) worden getransfereerd via cyt c-555 (Em,7 = +145mV) naar P840, het reactiecentrum Bchl a. De specifieke functie van cyt c-551 in S2O32- oxidatie wordt gestaafd door de aanwezigheid van een dergelijk cyt c-551 in Chlorobium vibrioforme f. thiosulfatophylum (Steinmetz en Fischer, 1982) en de afwezigheid in de soorten die geen thiosulfaat kunnen oxideren (Fischer, 1984). De initiële stap in S2O32- oxidatie blijkt een splitsing te zijn van de twee zwavelatomen van S2O32- naar S0 en SO42-, welke volgens verschillende wegen verder worden gemetaboliseerd, in plaats van een oxidatieve combinatie van twee S2O32- tot S4O62-. Een argument dat kan worden ingebracht tegen een initiële oxidatie van S2O32- naar S4O62- op weg naar SO42-, is dat S4O62enkel verder wordt gemetaboliseerd in Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum en in Chlorobium vibrioforme f. thiosulfatophylum, maar niet in ander fototrofe bacteriën. S4O62inhibeert oxidatie naar SO42- + S0 bij Chromatium vinosum, mogelijks door te interfereren met S2O32- transport in bacteriële cellen. 3.5.2. Rhodanese en thiosulfaat reductase De initiële reactie voor thiosulfaat reductie grijpt plaats m.b.v. twee enzymsystemen, namelijk rhodanese en thiosulfaat reductase, waarbij thiolen zoals lipoinezuur en glutathion de beste elektronendonoren zijn voor de betrokken reacties. Beide enzymen functioneren als thiosulfaat:zwavel transferasen, waarbij SO32- uit S2O32- en persulfiden (RSSH) uit thiolacceptoren worden vrijgesteld. In deze reactie reageert het persulfide met een tweede –SH groep (uit dezelfde molecule bij lipoinezuur en uit een andere molecule bij glutathion) om een disulfide te vormen en H2S vrij te stellen. De functie van rhodanese bestaat erin om cyanide te detoxificeren en om sulfide te vormen voor Fe-S clusters in Fe-S proteïnen. Het eiwit reageert initieel met S2O32- om een cysteïne persulfide te vormen t.h.v. het actieve centrum, waarbij SO32- in de omgeving wordt vrijgegeven. De enzymgebonden zwavelmolecule wordt in een tweede reactiestap naar een thiofiele acceptor (CN-, SO32- of een thiol), dat veeleer CN- blijkt te zijn, wegens de geprefereerde vorming van SCN-. Het is deze reactie die van belang is bij de CN- detoxificatie. Rhodanese activiteit is wijd verspreid onder de fototrofe bacteriën. Trüper en Fisher (1982) meldden dat geen rhodanese noch thiosulfaat reductase kon gedetecteerd worden in de nietthiosulfaat oxiderende Chlorobium limicola soorten, terwijl beide enzymen zowel in Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum als in Chlorobium vibrioforme f. thiosulfatophylum voorkwamen. Een ander (niet-ondersteunde) werking van rhodanese bestaat erin het sulfaan zwavelatoom van S2O32- naar een zwavelglobule te mobiliseren, zonder vooreerst reductie te ondergaan naar H2S, waarschijnlijk door een groeiende polysulfide keten als thiofiele acceptor te gebruiken. Thiosulfaat reductase verschilt van rhodanese in het feit dat het een minder goede thiofiele acceptor is.

11

3.5.3. Hydrolytische ontbinding van thiosulfaat Trüper en Pfennig (1966) suggereerden een laatste mogelijkheid om S2O32- te ontbinden, nl. door rechtstreekse hydrolytische splitsing tot H2S + SO42-. Deze tweestapsreactie zou bestaan uit een initiële reductie van S2O32- naar H2S en SO32-, gevolgd door een oxidatie van SO32- naar SO42-, gekatalyseerd door APS reductase en ADP sulfurylase, waarbij de energie geput wordt door fosforylatie op substraatsniveau. Een enzym die een gecombineerde 1-stapsreaktie zou kunnen katalyseren werd nog niet gevonden. Het zou SO32- rechtstreeks beschikbaar maken voor fototrofe bacteriën, maar waarschijnlijk is de ontbinding van S2O32- een nadelige stap welke de hoeveelheid H2S op een toxisch niveau zou brengen. 4. Elektronentransport en CO2 fixatie door fototrofe bacteriën Gereduceerde zwavelcomponenten zijn een bron van elektronen voor CO2 fixatie tijdens fotoautotrofe groei. De elektronen afkomstig uit de zwavelcomponenten worden getransfereerd via een fotosynthetisch elektronentransportketen naar elektronen acceptoren (NAD+ en ferredoxine), welke dan worden gebruikt om CO2 te reduceren. 4.1. Groen-zwavelbacteriën. Elektronentransport wordt geïnitieerd door fotochemische elektronentransfer van P840, reactiecentrum Bchl a, naar een elektronenacceptor (Bchl c of een verwant bestanddeel). Het elektron wordt snel overgedragen naar een membraangebonden Fe-S proteïne, en daarna naar ferredoxine (zie figuur 1.7.).

Figuur 1.7. Elektronentransport en zwavelredoxreacties in de groen-zwavelbacterie Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum. De redoxpotentialen van de verschillende elektronencarriers en zwavel-redoxkoppels staan links van de figuur aangeduid. (AMP: adenosine monofosfaat, APS: adenosine fosfosulfaat, Fcyt: flavocytochroom, FNR: ferredoxine-NAD+reductase, P840: fotoactieve Bchl a met absorptiemaximum bij 840 nm. (Brune, 1989).

12

Ferredoxine reduceert NAD+ (en waarschijnlijk ook NADP+) via Fd-NAD+ reductase (een flavoproteïne). Gereduceerd ferredoxine, NADH en NADPH worden opeenvolgend gebruikt in CO2 reductie. Ondertussen wordt geoxideerd P840+ gereduceerd door een membraangebonden ctype cytochroom. Naast niet-cyclisch elektronentransport van gereduceerde zwavelcomponenten naar NAD+, bestaat bij Chlorobiaceae ook cyclisch transport. Dit houdt in dat elektronen worden getransfereerd van gereduceerde ferredoxines naar menaquinonen, en vervolgens via het cyt b/c1complex naar de c-type cytochromen. Het cyclisch transport geeft het ontstaan aan een transmembranaire protonengradiënt (chemische potentiaal) met hieraan gekoppeld een elektrische potentiaal die gebruikt wordt om de ATP-synthese aan te zetten. De rol van ferredoxine in het cyclische transport is analoog aan het cyclisch elektronentransportsysteem in fotosysteem I in hogere planten. Alhoewel cyclische fotofosforylatie bij Chlorobiaceae analoog is aan dit van de Chromatiaceae, is het mechanisme voor NAD+ reductie verschillend. Bij Chlorobiaceae is de primaire fotosynthetische elektronenacceptor geen bacteriofeofytine, zoals bij de purperbacteriën, maar een Fe-S proteïne (reductie potentiaal van -540 mV). Dit staat de groen zwavel bacteriën toe om rechtstreeks NAD+ te reduceren via gereduceerd ferredoxine. De elektronen worden weggehaald door de niet-cyclische elektronenflow, en worden vervangen door externe elektronen die het systeem binnen komen ter hoogte van een minder elektronegatief gebied, via cyt c-555, welke de elektronen opnieuw doorgeeft aan het reactiecentrum Bchl. Cyt c-555 speelt dezelfde rol als cyt. c2 in purperbacteriën, waarbij ubiquinonen vervangen worden door menaquinonen, die als mobiele intramembranaire waterstof dragers fungeren. Gereduceerde ferredoxine, NADH, NADPH, en ATP worden gebruikt in CO2 fixatie via een reductieve carboxylzuurcyclus, gelijkaardig aan de citroenzuurcyclus in omgekeerde beweging.

Figuur 1.8. De gereverseerde citroenzuurcyclus is het mechanisme waarbij in Chlorobium CO2 wordt gefixeerd (Brock et al., 1994).

13

3 moleculen CO2 worden geïncorporeerd in oxaalacetaat welke als acetyl-CoA verder m.b.v. gereduceerd ferredoxine naar pyruvaat wordt omgezet (zie figuur 1.8.). De ontbinding van het citraat regenereert oxaalacetaat (een C-4 zuur) en produceert acetyl-CoA voor biosynthese. Voor het omzetten van pyruvaat naar fosfo-enolpyruvaat zijn twee hoogenergetische fosforbindingen nodig. 4.2. Purper zwavelbacteriën Initieel worden Bchl antennepigmentmoleculen geoxideerd waarbij elektronen worden getransfereerd naar bacteriopheofytine (BPheo) en vervolgens naar een quinon acceptor in het reactiecentrumcomplex. Het geoxideerde Bchl wordt door een gereduceerde c2-type cytochroom gereduceerd. De twee elektronen, die uit het P870 worden vrijgesteld door opeenvolgende absorptie van twee fotonen, worden opgenomen door ubiquinon (QB), terwijl twee protonen uit het cytoplasma worden opgenomen zodat ubiquinol ontstaat (QH2). Nadat het quinon twee elektronen heeft opgenomen wordt de ontstane quinolmolecule (QH2) vervangen door een geoxideerd quinon. Het QH2 diffundeert weg doorheen de fotosynthetische membraan naar het cyt b/c1 complex toe, waardoor het in een tweestaps-oxidatieproces geoxideerd wordt naar ubiquinon, waarbij twee protonen in het externe medium worden vrijgesteld. Eén van de twee elektronen wordt via een [Fe-S] cluster en cyt c1, naar cyt c2 (een perifeer membranair proteïne) getransfereerd die in de externe laag van de membraan diffundeert om het geoxideerde P870 in het reactiecentrum te reduceren. Het tweede elektron uit QH2 migreert via een Q cyclus naar de haemgroepen bL en bH in het cyt b/c1 complex, en staat vervolgens in voor de reductie van een ubiquinon-molecule (Q), waarbij tezelfdertijd twee of meer protonen worden opgenomen uit het cytoplasma (zie figuur 1.9.).

Figuur 1.9. Het fotosynthetisch elektronentransportsysteem van de purper fotosynthetische bacteriën. Het systeem is opgebouwd uit twee componenten: het fotosynthetische reactiecentrum en het cyt b/c1 complex. (Voet en Voet, 1996).

14

Het nettoresultaat uitgaande van de redoxreacties met het cyt b/c1 complex is dat 2 protonen uit het cytoplasma naar de periplasma per elektron worden rondgebracht. De geproduceerde NADH en ATP worden gebruikt om CO2 te fixeren d.m.v. de Calvin cyclus. 5. Fotosynthetische reactie in groen-zwavelbacteriën De groenzwavel bacteriën beschikken over antennepigmenten, Bchl’s c, d, of e, welke geassembleerd worden in kleine ellipsoïdale structuren, chlorosomen genaamd, en die vastgehecht zitten aan het cytoplasmatisch oppervlak van de binnenste celmembraan (Pierson en Castenhols, 1978). Voor de fotosynthese van planten en bacteriën kan de zonne-energie geconverteerd worden in chemische energie in de reactiecentrumcomplexen (Oh-oka et al., 1993). Er zijn twee types reactiecentra gekend, namelijk deze die een quinonpaar bevatten die sequentieel als secundaire en tertiaire elektronenacceptoren fungeren (quinon-type RC), en deze die een laagpotentiële quinon en een Fe-S centrum bevatten (Blankenship et al., 1988). Algemeen kunnen we 4 groepen onderscheiden: (i) het reactiecentrum van fotosysteem I en (ii) fotosysteem II van planten en cyanobacteriën; (iii) de reactiecentra van de purperbacteriën; en (iv) de reactiecentra van de groen-zwavelbacteriën. In tegenstelling tot de heterodimere opbouw van de reactiecentra van de eerste drie groepen, zou het reactiecentrum van de groen-zwavelbacteriën homodimeer zijn opgebouwd, bestaande uit een set van twee identische subeenheden, welke de vier cysteïneliganden bevatten die nodig zijn om de Fe-S clusters te ondersteunen (Oh-oka et al., 1995). Het reactiecentrum van de groen-zwavelbacterien vertoont de volgende gelijkenissen met fotosysteem I (PSI) (Zie ook figuur 1.10.) (Nitschke en Rutherford, 1991): (1) De primaire elektronenacceptoren van de groen-zwavelbacteriën vertonen gelijkaardige absorptiespectra en vertonen ook homologie met deze van PSI, A0 (een chlorofylmolecule). (2) De secundaire elektronenacceptorketen in groen-zwavelbacteriën blijkt identisich te zijn aan deze van PSI. 3 Fe-S clusters (FA, FB en FX) vertonen identische oriëntaties t.o.v. deze van PSI. (3) In groen-zwavelbacteriën vertonen FA en FB onderling magnetische interacties, en bijgevolg zijn beide in elkaars buurt gelokaliseerd, nl. op dezelfde proteïne subeenheid. (4) Fotosynthetische reacties in beide types bacteriële reactiecentra zijn gelijkaardig aan deze in PSI. (5) Een quinon-type acceptor, equivalent met A1 in PSI is eveneens aanwezig in groenzwavelbacteriën. (6) De kern van de reactiecentra van groen-zwavelbacteriën bestaat uit twee polypeptiden van elk 65 kDa, zoals deze van PSI. De reactiecentrumpolypeptiden van groen-zwavelbacteriën bevatten grote hoeveelheden licht-verzamelende antennepigmenten, naast de componenten die de ladingsverdeling in de hand werken, net als in PSI.

15

Figuur 1.10. Elektronentransfer mechanisme in fotosynthetische reactiecentra. De reactiecentrakomponenten worden op een redoxschaal overeenkomstig met hun gemiddelde redoxpotentiaal gepositioneerd (Nitschke, en Rutherford, 1991).

Twee merkwaardige eigenschappen illustreren het Chlorobium limicola reactiecentrum complex. Het complex beschikt over een Fe-S-type RC, zoals het reactiecentrum van fotosysteem I. Op basis van EPR (elektron paramagnetische resonantie) -studies werd aangetoond dat Chlorobium limicola de drie types Fe-S-centra bevat, welke overeenkomen met de FX, FA en FB in de fotosysteem I reactiecentra (Nitschke en Rutherford, 1991). Er werd eveneens gevonden dat zij een bijna identieke oriëntatie aannemen t.o.v. de primaire donor (P840) als de elementen in fotosysteem I. Daarom werd gesuggereerd dat het reactiecentrum van de groen-zwavelbacteriën analoog is aan het fotosysteem I reactiecentrum. Een tweede eigenschap is dat een gebonden c-type cytochroom rechtstreeks een elektron vrijstelt naar P840+ aan de donorzijde. Deze gebonden elektronendonor werd nooit in het reactiecentrum van fotosysteem I teruggevonden, en kan eerder vergeleken worden met deze in het reactiecentrum van de purperbacteriën. Dit groenzwavel bacterieel type - reactiecentrum zou daarom een missende evolutionaire link kunnen voorstellen tussen de reactiecentra van de purperbacteriën en fotosysteem I. 6. Bespreking van de Cytochromen – classificatie Cytochromen zijn haembevattende proteïnes die een reversiebele oxidatie-reductiereactie kunnen ondergaan, waarbij het ferro-ferri koppel van de prosthetische groep deel neemt aan elektronentransferreacties. De a-type cytochromen bezitten een haem-a groep, d.i. een haemgroep met een formyl zijketen. De b-type cytochromen bevatten protohaem. De c-type cytochromen bevatten een haemgroep welke covalent gebonden is aan het proteïne. De haemgroep van deze c-type cytochromen kan gesplitst worden van het proteïne door de thioether bindingen tussen de cysteïne residu’s van het proteïne en de gesubstitueerde vinylzijketen van de haemgroep te doorbreken (Bartsch, 1978). De d-type cytochromen komen voor in veel aërobe bacteriën wanneer ze gegroeid worden in zuurstoflimiterende condities, zoals in E. coli en Aerobacter aerogenes. Meestal zijn deze eiwitten opgebouwd uit verschillende subeenheden die ook andere prosthetische groepen bevatten. 16

Cytochromen voeren hun activiteiten uit door in de redoxtoestanden van hun haemgroepen reversiebele overgangen uit te voeren tussen de Fe II en de Fe III toestand. Behalve cytochroom oxidase, kunnen cytochromen als dehydrogenasen bestempeld worden. De identificatie en studie ervan wordt eenvoudiger door de aanwezigheid van een karakteristieke absorptieband in de gereduceerde toestand, welke verdwijnt in de geoxideerde toestand (zie figuur 1.11).

Figuur 1.11. Absorptiespectrum van cytochroom c (Voet en Voet, 1996).

De haemgroepen van de cytochromen zijn structureel invariant, en het zichtbare spectrum wordt enkel beïnvloed door de extraplanaire liganden welke uit het overeenkomstige proteïne voortkomen, en enigszins ook door de rechtstreekse omgeving van het cytochroom. Zo hebben de c’- type cytochromen een pentagecoördineerde haemgroep, zodat een “high-spin” spectrum verkregen wordt. Andere cytochromen hebben een “low-spin” spectrum, waarbij de voornaamste subdivisie gebaseerd is op de 695 nm band, karakteristiek voor het ferricytochroom. Dit soort spectrum is zichtbaar voor deze cytochromen welke een histidinyl-methionyl-Fe coördinatie vertonen, terwijl deze die een bishistidinyl coördinatie hebben de band van 695 nm missen. Onderscheid tussen de verscheidene low-spin cytochromen is gebaseerd op de algemeen verschillende omgevingen rond de cytochromen (Pettigrew en Moore 1987). De positie van de α-band varieert van 549 nm tot 556 nm. Asymmetrie in deze band wordt meestal waargenomen in proteïnes met één of twee haemgroepen. De α/β-verhouding kan variëren van 1.1 tot 2.0. Deze gegevens dragen bij tot de classificatie van de cytochromen. Classificatie van de cytochromen in types a, b, c en d, op basis van de geassocieerde haemprosthetische groepen, blijkt voldoende te zijn omdat deze groepen in voldoende mate van elkaar verschillen om een duidelijk verschil in optische absorptiespectra te geven (zie figuur 1.12.). De cytochroomfractie van Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum vertoont enkel mesoheem. Het organisme heeft duidelijk geen b-type cytochromen. Er bestaat een grote gelijkenis tussen Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum en Chromatium vinosum in het feit dat beiden geen oplosbare hoog-potentiaal c-type cytochromen met Em,7 > 200 mV hebben, en dat beiden geen b-type cytochromen bezitten (Meyer et al., 1968).

17

Figuur 1.12. De haemgroepen van de cytochromen. a. protohaem IX b. gesubstitueerd protohaem IX (haem c) c. haem a d. voorgestelde structuur van haem d e. voorgestelde structuur van haem d1 f. voorgestelde structuur van haem d1 (methylester derivaat)

De c-type cytochromen worden verder onderverdeeld op basis van de covalente binding van hun haemgroepen aan het proteïne. Ze kunnen ook gekwantificeerd worden in complexe mengsels, na extractie van de niet-covalent gebonden haemgroepen van andere cytochromen in verzuurd aceton. Deze alomtegenwoordige kleine bacteriële c-type cytochromen werden onderverdeeld in drie klassen, gebaseerd op aminozuursequentie (Ambler, 1980) en achteraf bevestigd door x18

stralen kristallografische studies. Ze worden klasse I, II en III genoemd (Ambler, 1980) (Zie tabel II). Klasse Eigenschappen Onderverdeling Eigenschappen I Low-spin, (a) Groot Een lus vormt een deksel Histidinyldat de groef die toegang methionine haem verleent tot de haemgroep coördinatie, afsluit. Haemgroep nabij (b) Klein Vertoont de lus niet zoals de N-terminus, 80in (a). De linkerzijde buigt 120 aminozuren naar onder toe zodat de onderzijde van de haemgroef gesloten wordt. II De haemgroep (a) High-spin Haemgroep enkel histidyl bevindt zich nabij gecoördineerd de C-terminus (b) Low-spin Histidylmethioninegecoördineerde haemgroep III Multihaem, één Gebaseerd op haemgroep per 30- de configuratie 40 aminozuren, van de waarbij de haemgroep. haemgroep bishistidyl gecoördineerd is.

Voorbeelden Mitochondriaal cyt c, Cyt c2 Pseudomonas cyt c-551 Chlorobium cyt c-555 (Algen cyt c-553) Cyt c4, cyt c5 (Desulfovibrio cyt c553) Cyt c’

(Cyt c-556) [Cyt c3 (3 haemgroepen)] Cyt c3 (4 haem-groepen) [Cyt c3 (8 haemgroepen)]

Tabel II. Classificatie van de c-type cytochromen; voornaamste structurele verschillen.

Behalve de Cys-X-Y-Cys-His haem-bindingssequentie, bestaan er geen andere similariteiten tussen de drie klassen onderling, zodanig dat elk cytochroom ondubbelzinnig in een specifieke klasse kan worden ondergebracht. Omdat niet alle aminozuursequenties gekend zijn is het van belang andere, beter toegankelijke parameters te analyseren op basis van spectra, moleculaire grootte, redoxpotentialen en reactiviteit t.o.v. gekende oxidase en reductase systemen. De klasse I cytochromen hebben allen een 695 nm band in de gereduceerde toestand. Dit is een eigenschap dat eigen is aan de histidinyl-methionyl-Fe coördinatie. Deze klasse wordt gedefinieerd als bestaande uit één haemgroep per 70-120 aminozuurresidu’s. Zij fungeren als rechtstreekse elektronendonor voor een terminaal oxiderend centrum. Dit kan zowel een fotogeoxideerd chlorofylsoort zijn als een terminaal respiratorisch enzym. Omdat deze terminale oxiderende centra sterk variërende redoxpotentialen hebben, beschikken de cytochromen over redoxpotentialen met een reikwijdte van 0 tot +500mV. Klasse I cytochromen vertonen sequentie- en structuurhomologie met mitochondriale c-type cytochromen. Dit omvat cytochroom c2 van de purper fotosynthetische bacteriën, oplosbare c-type cytochromen van algenchloroplasten en cyanobacteriën, cyt c4 en c5 van Azotobacter vinelandii. De cytochromen in deze klasse hebben een eenvoudige elektronentransfer functie (Wood, 1983).

19

De klasse II cytochromen bevatten oorspronkelijk enkel de high-spin c’ cytochromen welke voornamelijk in fotosynthetische bacteriën werden gevonden, maar naderhand werden homologen toegekend met een low-spin, met een 695 nm band, en met een methionine als zesde haemligand. De low-spin cytochromen zoals deze van Agrobacterium tumefaciens cyt c-556 worden tot deze klasse gerekend (Wood, 1983). Klasse III cytochromen onderscheidt men door de aanwezigheid van multipele haemgroepen, en door hun lage redoxpotentialen. Ze kunnen geïdentificeerd worden door een schouder aan de staartzijde van de Soretpieken, een hoge Soret (red.) / Soret (ox.) verhouding, en de afwezigheid van een 695 nm band in de geoxideerde vorm. Deze omvatten Desulfovibrio cyt c3 en Desulfuromonas cyt c7. Klasse II en III cytochromen fungeren in oxidaties en reducties van anorganische of organische substraten. In de meeste gevallen gebeurt dit in de aanwezigheid van een supplementaire prosthetische groep (Wood, 1983). De weinig gebruikte vierde klasse (IV) omvat een aantal c-type cytochromen van dewelke minder sequentie- en structuurinformatie voorhanden is. Sommigen ervan zijn complexe proteïnes waarbij naast c-type haemgroepen, ook andere prosthetische groepen bestaan. Anderen zijn intrinsieke membranaire proteïnes, zoals cytochroom c1 van de mitochondriën en bacteriën, en cytochroom f van de chloroplasten (Wood, 1983). 7. Structuur en functie van c-type cytochromen De meeste organismen zijn afhankelijk van geleidende elektronentransportketens voor ATP-productie, het algemene hoogenergetisch metabolisch intermediair in levende cellen. In groen-zwavelbacteriën wordt de elektronentransport gemedieerd door onder andere c-type cytochromen, die elektronen verplaatsen van een gereduceerde verbinding naar geoxideerd NAD+ zodat verder ATP en celmateriaal kan worden opgebouwd (Salemme, 1977). Een c-type cytochroom wordt gedefinieerd als zijnde een eiwit met één of meer protohaem IX prosthetische groepen covalent gebonden aan de polypeptideketen door thioether bindingen, door condensatie van haem-vinylgroepen met de cysteïne-sulfhydrylgroepen van de polypeptideketen (zie figuur 1.13.). Deze subklasse in de cytochromen wordt gekarakteriseerd door: (i) Een enkele polypeptideketen bestaande uit 85 tot 135 residu’s, met een enkele covalent gebonden haem-prosthetische groep nabij de N-terminus, (ii) Ze bezitten histidine en methionine als Fe-liganden aan de axiale zijde van de haemgroepen, (iii) Ze hebben een relatief hoge redoxpotentiaal (van +150 tot +380 mV). In tegenstelling met de structuur van het mitochondriaal c-type cytochroom, welke vanaf het ontstaan van de eukaryotische organismen als het meest geconserveerd eiwit wordt beschouwd, bestaat er een duidelijke graad aan structurele diversificatie onder de prokaryotische c-type cytochromen.

20

Figuur 1.13. Structuur van Fe-protoporfyrine IX en haem c.

In c-type cytochromen is de haemgroep covalent gebonden aan het polypeptide, waarbij het haembindend gebied Cys-X-X-Cys-His een geconserveerde sequentie in praktisch alle c-type cytochromen is. C-type cytochromen worden algemeen geassocieerd met de periplasmatische ruimte. Een grote groep oplosbare c-type cytochromen komen voor in de periplasmatische ruimte, of komen voor in zwakke associatie met de buitenste laag van de cytoplasmatische membraan. De verklaring voor dit gegeven ligt bij de dissociatieconstante, eigenschap van niet-covalent gebonden prosthetische groepen. Binnenin de cel heerst een constante concentratie aan vrije haemgroepen, zodat reassociatie (zoals in biosynthese) ongemoeid kan optreden, zoals het geval is voor b-type cytochromen. In de periplasmatische ruimte bestaat het gevaar dat de gedissocieerde haemgroepen naar het externe medium kunnen wegdiffunderen, en verloren gaan doorheen de poriën van de gramnegatieve bacteriën (exclusielimiet vergelijkbaar met het MG van vrij haem). Er wordt met enige voorzichtigheid gepostuleerd dat de meeste oplosbare cytochromen van de fotosynthetische bacteriën periplasmatisch gelokaliseerd zijn. Echter niet alle c-type cytochromen die instaan voor snelle lichtgedreven fotosynthetische oxidatiereacties, hebben een periplasmatische locatie. Sommigen ervan zijn volledig ingebed in de hydrofobe omgeving van de membraan (Bartsch, 1978). Cytochromen worden als co-factors beschouwd, m.b.t. de eiwitten waarmee zij interageren, eerder dan als enzymen. C-type cytochromen associëren met hun overeenkomstige membraangebonden fysiologische oxidoreductasen. Deze associaties ontstaan door complementaire ladingsinteracties, welke gevormd worden door een positief geladen oppervlaktedomein van het c-type cytochroom en het overeenkomstig negatief geladen oppervlaktedomein van het oxidoreductase. Bij de c-type cytochromen, is het positief geladen 21

oppervlaktedomein gelokaliseerd ter hoogte van een gebied van het proteïne, waar de haem prosthetische groep, dat normaal in het eiwit begraven ligt, het meest naar het solvent toe blootgesteld is. Dit suggereert dat zowel oxidatie als reductie plaats grijpt d.m.v. een reversiebel mechanisme, waarbij rechtstreekse interactie tussen de prosthetische groepen van het c-type cytochroom en van de oxidoreductase kan gebeuren. Dit houdt ook in dat rechtstreekse interactie van de haemgroepen optreedt in het elektronentransferproces. Algemeen kunnen de c-type cytochroommoleculen structureel beschreven worden als bestaande uit één laag polypeptiden met een α-helicale secundaire structuur, welke de haemprosthetische groep omhelst, waarbij slechts één hoek van de haemgroep aan de solvenszijde bloot wordt gesteld. Het haem-Fe atoom vormt axiaal gecoördineerde bindingen met twee sterke liganden, waaronder het stikstof atoom van een histidine imidazoolgroep, en een methionine zwavelatoom, zodat een low-spin haem-Fe complex ontstaat, welke in zowel geoxideerde als in gereduceerde toestand zijn planaire conformatie behoudt. Dit patroon van covalente bindingen en waterstofbruggen is in staat om de haemgroep zodanig vast te houden, dat slechts één hoek aan de solvenszijde wordt vrijgegeven. De waterstofbinding tussen de haem-propionaatgroep en een Trp-residu blijkt van belang te zijn in het behoud van de integriteit van de geoxideerde toestand, omdat chemische modificatie van dit Trp-residu samen gaat met verlies van de methionine-haem ligatie. Naast deze waterstofgebonden en covalent gebonden bindingen bevatten haeminteracties ook nog ongebonden hydrofobe haeminteracties, gebaseerd op de pakkingsinteracties tussen interne aromatische en alifatische groepen. Het ordenen van deze aromatische en alifatische aminozuurzijketens zorgt ervoor dat het haemgebied een heel hydrofoob karakter vertoont. Dit gegeven, in samenspraak met de aard van de Fe-liganden, is verantwoordelijk voor de hoge redoxpotentialen van de c-type cytochromen, in vergelijking met de haemgroepen die in een waterige omgeving ingebed zitten. Deze hoge redoxpotentialen weerspiegelen de hoge affiniteit van het haem-Fe atoom voor een reducerend elektron. Het is daarbij mogelijk dat het verschil in redoxpotentiaal tussen deze c-type cytochromen en mitochondriaal cytochroom c verklaard kan worden a.d.h.v. het verschil in hydrofobiciteit van de omgevingen van hun haemgroepen. Oxidatie en reductie van het cytochroom gebeurt aan de voorzijde van de molecule, nl. aan de kant waar de haemgroep het meest naar de solvenszijde geëxposeerd ligt. Deze binding gebeurt d.m.v. complementaire ladingsinteracties, waarbij een alternerende en reversiebele binding moet kunnen plaatsgrijpen met de fysiologische oxidoreductase (Salemme, 1977). Fysische en chemische gegevens tonen aan dat er een structureel verschil bestaat tussen de gereduceerde en de geoxideerde structuur. De grotere structurele rigiditeit van de gereduceerde vorm van het c-type cytochroom kan hierbij verklaard worden door de grotere bindingssterkte van de gereduceerde toestand, gebaseerd op het zesde methionineligand in coördinatie met het haem Fe-atoom, welke in de haemreductiereaktie deelneemt (Harbury et al., 1965). In evolutionaire zin is het idee over het bestaan van een gemeenschappelijke voorouder van alle fotosynthetische organismen algemeen aanvaard (Okkels et al., 1992). De meeste fotosynthetische purper- en groene niet-zwavelbacteriën beschikken over een gebonden tetrahaem cytochroom als rechtstreekse elektronendonor voor het fotosynthetisch reactiecentrum. Eerder werd een gelijkaardig cytochroom in groen-zwavelbacteriën en heliobacteriën teruggevonden. Uit deze twee gegevens werd verondersteld dat de ancestrale vorm van de reactiecentrumcomplexen een gebonden tetrahaem cytochroom bevatte.

22

Een ander evolutief scenario beschrijft het bezit van een oplosbare elektronendonor als originele eigenschap van de ancestrale bacterie. In een daarmee onafhankelijke evolutionaire gebeurtenis zouden de purper- en de groen-zwavelbacteriën gebonden cytochromen in het reactiecentrumcomplex hebben opgenomen. Het voordeel van een gebonden cytochroom zit in het feit dat snellere reductie van het reactiecentrum kan optreden, vòòr dat de elektronen terug door elektronenacceptoren worden opgenomen. Secundair verlies van dit gebonden type cytochroom is naderhand opgetreden bij sommige purperbacteriën, waarbij het meer reactieve cytochroom c2 in gebruik werd genomen. Er werden nog geen groen-zwavelbacteriën teruggevonden zonder gebonden cytochroom, maar de afwezigheid van een dergelijk cytochroom in het reactiecentrum van fotosysteem I suggereert dat een dergelijk verlies in de loop van de evolutie is opgetreden. 8. De cytochromen van Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum bezit drie reeds bestudeerde c-type cytochromen, nl. cytochroom c-555, flavocytochroom c-553 en cytochroom c-551 (T.E. Meyer et al., 1968). De fysico-chemische eigenschappen van deze cytochromen worden in tabel III opgesomd en de absorptiespectra worden weergegeven in figuur 1.14.

Flavocyt c-553 + 98 mV (pH 6-8)

Cyt c-551 + 135 mV (pH 6-8)

MG

Cyt c-555 + 145 mV (pH 6.0) + 114 mV (pH 8.0) 10000

50000

PI

10.5

6.7

60000 (30000 per subeenheid) 6.0

Em,7

Tabel III. Eigenschappen van de drie c-type cytochromen van Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum

Figuur 1.14. Absorptiespectrum van het Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum cyt c-551, flavocyt c-553 en cyt c-555, in hun gereduceerde toestand (___) en in hun geoxideerde toestand (----).

23

8.1. Cytochroom c-551 (Klarskov et al., 1998) Het cyt c-551 is een dimeer proteïne welke enkel in de 3 thiosulfaat biovarcellijnen (Pond Mud, Larssen en Tassajara) werd gevonden, en welke twee identische subeenheden van ongeveer 30 kDa bevatten. De aminozuursequentie bevat 258 residu’s met een enkele haembindingsplaats op Cys172 en Cys175 (zie aminozuursequentie, figuur 1.15.). Cyt c-551 is homoloog aan het soxA eiwit van Paracoccus denitrificans, dat deel uitmaakt van een thiosulfaat verbruikend operon. Beide eiwitten functioneren als elektronenacceptoren voor een thiosulfaatoxiderend enzym en bewerkstelligen de reductie van een c2-type cytochroom (cyt c-555 in het geval van Chlorobium). Tussen cyt c-551 en cyt c-555 bestaat een sterke interactie: een elektrostatisch gestabiliseerd complex wordt gevormd bij lage ionensterkte. T A N I V H T S

D Y L D G K N E D V ME L H N G

Q E S C K Y R L

K D L R V A R E

L A A V K G Y Y

V R S K S R A N

D T C N K H G G

A Q F G A L C P

10 D T WQ P D E K A Y R A N K A S

Q E G A D E N R

A F ME G A WP A Y I V I G K

Q S E F V R WG MK S P A K

Y P G K G A P

F P Q G K L F

Q Y Y D K G P

20 K E E L P Y L A F F Q T A Q

F D F K Y T S

P Y D V A H E

E E E S K F E

V A K A R P Y

K G R Y G V R

L K G M Q F D

A A E A L R L

D L V Y N S E

30 F A N F N K V T L I S R MS C K WG F F Q

G P E G S E T

V Y F A MA E K G C I G A M

Figuur 1.15. Aminozuursequentie (totaal 258) van cytochroom c-551 van Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum (Klarskov et al., 1998).

Het Chlorobium limicola cyt c-551 verschilt met de andere cytochromen in die zin dat de polypeptideketenlengte (258 aminozuren, zie figuur 1.15.) tweemaal groter is dan deze van de klasse I eiwitten. De positie van het haembindend domein Cys-X-X-Cys-His (posities 172-176) is eveneens zeer ongewoon: in de klasse I cytochromen vindt men dit domein terug ter hoogte van het N-terminaal gebied. Uit de vier klassen cytochromen die werden gevonden op basis van aminozuursequentie en structuur (Pettigrew en Moore, 1987), is klasse II de enige klasse waarbij de haemgroep in de omgeving van de C-terminus is gelokaliseerd. In deze klasse zou ook het cyt c-551 kunnen ondergebracht worden. Echter, het haembindende gebied van cyt c-551 is midden in een hydrofiel gebied gelokaliseerd, wat niet overeenstemt met de eigenschappen van de klasse II cytochromen. Sequentiesimilariteit hiervoor kan in beperkte mate worden gevonden in sommige c-type cytochromen van klasse I, maar in deze klasse ligt het haembindend gebied nabij de Nterminus. Behalve het SoxA-genprodukt van Paracoccus denitrificans, bestaan geen similariteiten tussen het Chlorobium cyt c-551 en de andere cytochromen van de groene bacteriën, het cyt c555 en flavocytochroom c-sulfide dehydrogenase (Van Beeumen et al., 1976 en 1990). Zowel cyt c-555 en de haemsubeenheid van FCSD zijn kleine klasse I c-type cytochromen van ongeveer 10 kDa grootte. Op structureel niveau en met het oog op de redoxpotentiaal van 135-150 mV, blijkt de zesde haemligand een methionine residu te zijn. Er wordt een secundaire structuur aangetroffen met 40% α-helix en 25% β-streng. Geen enkel ander gekend cytochroom c bezit een dergelijk 24

gemengde structuur; ze zijn ofwel helicaal ofwel met β-strengen. Dit betekent dat cyt c-551 en het soxA eiwit een nieuwe klasse c-type cytochromen vertegenwoordigen. Er zijn zeven methionines in het eiwit welke als ligand kunnen dienen, maar slechts één is geconserveerd in het overlappend gebied (165-residu’s) van de twee homologen (cyt c-551 en soxA). Het Chlorobium cyt c-551 wordt niet gevonden in andere groen-zwavelbacteriën. Indien het toch aanwezig is, zal het membraangebonden zijn of niet geëxpresseerd worden. Meestal oxideren deze cellijnen geen thiosulfaat. Er moet dus een verband zijn tussen het verbruik van thiosulfaat en de aanwezigheid van het cyt c-551. Chlorobium limicola (Thio- fenotype) werd getransformeerd met een plasmide geïsoleerd uit een Thio+ -soort, waarbij het vermogen tot thiosulfaatoxidatie dat plasmidegebonden is overgebracht werd (Mendez-Alvarez et al., 1994). De thiosulfaat oxidatiegenen zijn gelokaliseerd op een 14 kb plasmide in strain Tassajara. Het plasmide is gelijkaardig in zowel Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum als in Chlorobium vibrioforme f. thiosulfatophylum m.b.t. grootte en restrictiepatroon. Het plasmide kan getransfereerd worden naar een Thiocelllijn. Deze genen werden eveneens teruggevonden in een niet-verwante thiosulfaatoxiderende cellijn, maar op een veel grotere plasmide, namelijk 650 kb (Mendez-Alvarez et al., 1994 en 1995). Het plasmide vertegenwoordigt een potentiële kloneringvector om observaties inzake genetische modificatie te vergemakkelijken binnen de Chlorobium-cellijn, waarbij het als genetische merker kan dienen, nl. het vermogen tot thiosulfaatoxidatie.

8.2. Cytochroom c-555 Het algemeen bij de groen-zwavelbacteriën voorkomende cyt c-555 is analoog aan het algen cyt c6, dat het transport van elektronen tussen het cyt b6f complex en fotosysteem I coördineert. Het vertoont eveneens structurele gelijkenissen met de mitochondriale c-type cytochromen en het cyt c2 van de fotosynthetische purper niet-zwavel bacterie Rhodospirillum rubrum. In groen-zwavelbacteriën medieert het oplosbare cyt c-555 eveneens de elektronentransport tussen het cyt b/c1 complex en het gebonden reactiecentrum. Cyt c-555 fungeert als elektronenacceptor voor het flavocytochroom c - sulfide dehydrogenase, waarmee het een elektrostatisch stabiel complex vormt (Kusai en Yamanaka, 1973). Cytochroom c-555 katalyseert de reductie van Na2S2O3 via cytochroom c-551. Het oplosbare cytochroom c-555 bezit 86 aminozuren met een enkele covalent gebonden protohaem IX. Het bezit een heel lage standaard reductiepotentiaal (Em,7 = +145 mV). Experimenteel vertoont het reactiviteit in het mitochondriale cytochroom c oxidase systeem, terwijl het inactief is met het reductase analoog (Davis et al., 1972). In tegenstelling hiermee vertonen bacteriële en prokaryotische c-type cytochromen een geheel tegengestelde reactiviteit. Er bestaat geen verband tussen dit gegeven en zijn lage Em,7-waarde (Korszun en Salemme, 1977). Het 5de en het 6de haemligand zijn respectievelijk een His- en een Met-residu. Cytochroom c-555 verschilt met de grotere hoge-potentiaal c-type cytochromen in het feit dat een ongeveer 20 residu lange deletie merkbaar is in een gebied overeenkomend met de basis van de grotere moleculen. Dit gebied zorgt voor waterstofbruginteracties met de afgeschermde haem-propionaat groepen (Salemme, 1977). Deze sequentiedeletie wordt structureel gecompenseerd door een inwaartse opvouwing van een reeks sequentiële aminozuren die de linkerzijde van de homologe grotere cytochroommoleculen uitmaken, zodat de deletie de mate 25

van expositie van de haemgroep van cyt c-555 naar het solvent toe niet beïnvloedt. Ondanks deze deletie is er dus geen verschil in de mate van expositie van de haemgroepen tussen cyt c555 en de andere c-type cytochromen. Algemeen vertonen haemprosthetische groepen die ingegraven zitten in de hydrofobe binnenzijde van proteïnen (waar een lage diëlektrische constante de regel is, zoals dit waargenomen wordt bij c-type cytochromen), (1) een stabielere conformatie in de ongeladen gereduceerde toestand van het proteïne, en (2) hogere redoxpotentialen in vergelijking met de situatie in een waterige omgeving met hoge diëlektrische constante (Kassner, 1972). Dit effect verklaart het verschil in redoxpotentiaal tussen c-type cytochromen en haemcomplexen in een waterige omgeving, maar wordt niet toegewezen aan het potentiaalverschil tussen het cyt c-555 en de andere c-type cytochromen met hogere potentiaal. In dit opzicht zorgen andere verschillen in conformatie of aminozuursequenties nabij de haemgroep voor de waargenomen verschillen in redoxpotentiaal tussen deze cytochromen. De lage redoxpotentiaal van het cyt c-555 (figuur 1.16) weerspiegelt zijn rol in de elektronentransportketen, waar het aangepast is aan een sterk reducerende omgeving, dat waarschijnlijk bestond vòòr dat fotosynthetische organismen in staat waren H2O te splitsen.

Figuur 1.16. duidt de lage standaard redoxpotentiaal aan van cytochroom c-555.

8.3. Flavocytochroom c-553 (Kusai en Yamanaka, 1973) Het flavocytochroom c-553 is met zijn covalent gebonden flavinemolecule (waarschijnlijk een FAD) een sulfide cytochroom c dehydrogenase, waarbij dat cyt c-555 als elektronenacceptor fungeert voor het cytochroom of enzym. De reactie wordt in sterke mate geïnhibeerd door CN-, dat waarschijnlijk t.h.v. het flavinegedeelte van het cyt c-553 associeert. De absorptiepieken op 450 en 480 nm worden toegewezen aan de gebonden flavinemoleculen. Een gelijkaardig cytochroom met covalent gebonden flavinemolecule, het Chromatium cyt c-552, vertoont dezelfde enzymatische activiteit als het sulfide cytochroom c dehydrogenase van Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum. De katalytische activiteit van het cyt c-553 (reductie van cyt c-555 met sulfide) wordt tenietgedaan door het proteïne te verwarmen, en gaat eveneens verloren door inhibitie met cyanide en atebrine.

26

Het flavocytochroom c-553 bestaat uit (1) een 47 kDa subeenheid welke een enkele covalent gebonden FAD-molecule bevat, en (2) een 11 kDa subeenheid met een enkele c-type haemgroep (Kusai en Yamanaka,1973). 8.4. Complexvorming tussen de cytochromen (Davidson et al., 1986) Het cyt c-555 speelt een centrale rol in het zwavelmetabolisme van Chlorobium: het dient als elektronenacceptor voor zowel sulfide en thiosulfaat (Kusai en Yamanaka, 1973). Bij thiosulfaatoxidatie is cyt c-555 niet de initiële acceptor, maar ontvangt de elektronen van cyt c-551, welke het substraat is voor het thiosulfaat/cytochroom c oxidoreductase reactie van de bacterie (zie figuur 1.17).

Figuur 1.17. Interactie tussen de cytochromen van Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum in het elektronengeleidingsmechanisme dat instaat voor de reductie van pyridinenucleotiden (Kusai en Yamanaka, 1973).

Het thiosulfaat-cytochroom c reductase-enzym en het cytochroom c-555 maken een functionele eenheid uit, wat blijkt uit het feit dat het versnellingseffect van cyt c-555 op het thiosulfaat-cytochroom c reductiereactie stijgt totdat de molaire concentraties van het cytochroom en het enzym dezelfde worden. Het cyt c-555 wordt niet gereduceerd door het enzym, wat aangeeft dat het als een effector molecule fungeert voor het enzym, alhoewel de mogelijkheid niet mag uitgesloten worden dat het cyt c-555 kan dienen om de reactieproducten te elimineren. Elektronen vanuit het enzym worden eerst overgebracht naar cyt c-551, en pas daarna naar het cyt c-555, waarbij het cyt c-555 deelneemt in de reductie van cyt c-551, op een bepaalde manier gekatalyseerd door het enzym. Enerzijds kan complexvorming tussen beide cytochromen het eigenlijke substraat zijn voor de thiosulfaat/cytochroom c oxidoreductasereactie, of anderzijds kan - na complexvorming - de interactie tussen beide cytochromen een conformationele verandering in het cyt c-551 induceren, zodanig dat het een beter substraat wordt voor het enzym. Deze gegevens zijn consistent met het model dat stelt dat elektronentransport optreedt van sulfide naar het flavine gedeelte van flavocytochroom c, daarna naar het haemgedeelte, en finaal naar de haemgroep van de acceptor (cyt c-555 in Chlorobium). 9. Cytochroom c biogenese Cytochroom c biogenese beschrijft de posttranslationele weg van de omzetting van preapocytochroom naar het mature holocytochroom c.

27

In de biogenese van c-type cytochromen kunnen drie verschillende systemen worden onderscheiden (zie figuur 1.18.) (Kranz et al., 1998).

Figuur 1.18. Vergelijking van de drie verschillende systemen in cytochroom c biogenese (Kranz et al., 1998).

9.1. Systeem I Systeem I gebruikt specifieke proteïnes gecodeerd door tenminste 9 genen, en deze werden tot nu toe enkel in Gram-negatieve bacteriën gevonden. De proteïnes HelABCD tot Ccl1 fungeren om het haem Fe-atoom aan te brengen en in de gereduceerde toestand te houden. Ligatie van de twee thiolgroepen van het apoproteïne met de haemgroep is de laatste stap. Om een overzicht te schetsen kan het systeem onderverdeeld worden in twee functionele subpathways, nl. (1) een weg bestaande uit eiwitten die instaan voor haemtranslocatie, en (2) een tweede weg voor apocytochroom presentatie en thioreductie. (1) De eerste pathway wordt onderhouden door o.a. de eiwitten HelABCD, Ccl1, en CycJ. De HelABCD genen coderen voor de subeenheden van een ABC (ATP-bindende cassette) transporter (Ramseier et al., 1991; Beckman et al., 1992). Het haem blijkt een geschikt substraat te zijn, omdat apocytochroom c zonder twijfel in Hel-mutanten wordt getransloceerd. Studies met gen-inactivaties, gebruik makend van de PhoA- en de lacZmethodologie, brachten een membranair exportcomplex aan het licht bestaande uit vier 28

subeenheden. De ATP-bindende cassette subeenheid, HelA, blijkt een oplosbaar proteïne te zijn, en moet met de HelB en HelC genproducten associëren om specifiek met de membraan geassocieerd te worden. In de aminozuursequentie van HelC en Ccl1 werd een geconserveerd motief WWD teruggevonden, karakteristiek voor het binden en aanbieden van haem. Dit WWD motief blijkt bovendien naar de periplasma gekeerd te zijn, zodat wordt gesteld dat het haem door het Ccl1-proteiïne t.h.v. zijn cysteïne residu’s wordt aangeboden. Aldus wordt gesteld dat haem doorheen de HelABCD transportcomplex wordt getransloceerd naar Ccl1 toe, waar het wordt vastgehouden aan de periplasmatische zijde van de membraan, waarbij de vinyl zijketens worden geëxposeerd. Hypothetisch wordt gesteld dat het CycJ genproduct een periplasmatisch gekeerde geconserveerde histinylzijketen heeft dat in het doorgeven kan fungeren van de haemgroep van HelABCD naar Ccl1. (2) De parallelle weg naast dit haemtranslocatiemechanisme, bestaat uit het mechanisme voor apocytochroom presentatie en thioreductie, dat gelijk met het eerste mechanisme moet optreden. Het wordt gemedieerd door de Ccl2, HelX, en CycH genen. Na translocatie van het apocytochroom naar de periplasma, wordt dit geoxideerde apoproteïne gereduceerd door Ccl2, welke in de membraan verankerd is, terwijl het aan de haemgroep wordt gepresenteerd, dat door Ccl1 wordt vastgehouden. Na de redoxreactie van het Ccl2proteïne wordt dit geoxideerde enzym opnieuw gereduceerd door het HelX genprodukt (Monika et al., 1997). HelX wordt in een volgende stap gereduceerd door de algemene thioreductor proteïne, DipZ. Het DipZ-gen bezit een periplasmatisch gericht globulair domein welke een disulfide-isomerase activiteit vertoont. Het fungeert als reductans zodat disulfidebruggen in het periplasma kunnen herschikt worden. Omdat het apocytochroom in geoxideerde toestand aanwezig moet zijn in het periplasma om gereduceerd te worden door Ccl2, moet een periplasmatische redoxproteïne, DsbA, het apocytochroom reduceren van zodra het getransloceerd wordt. Het geoxideerd DsbA proteïne wordt dan opnieuw gereduceerd door DsbB. Het CycH proteïne wordt verondersteld een rol te spelen in de translocatie van het apocytochroom c polypeptide naar Ccl2/Ccl1. 9.2. Systeem II Systeem II is karakteristiek voor Gram-positieve bacteriën, cyanobacteriën en chloroplasten, waarbij tenminste 4 genen noodzakelijk zijn. Enerzijds zijn voor het haemtranslocatiepad twee proteïnes belangrijk: CcsA en Ccs1. In dit systeem bevat het CcsA-proteïne een WWD consensusmotief, vergelijkbaar met de Ccl1-en HelC-proteïnen in systeem I, die nodig is voor haembinding, zodat het haem aan de apocytochromen kan aangeboden worden. Daarnaast wordt gesuggereerd dat het CcsA-proteïne een rol speelt in een equivalent mechanisme als wordt voorgesteld door het haemtranslocatiesysteem van HelABCD tot Ccl1 uit systeem I. Dit CcsA-proteïne moet in complex met het Ccs1-proteïne voorkomen om een effect te vertonen in haemtranslocatie. De rol van het Ccs1 op zich werd nog niet ontrafeld, maar men denkt dat het Ccs1-proteïne enkel een zuiver structurele rol speelt in het Ccs1-CcsA-complex voor haemtranslocatie. Anderzijds bestaat het thioreductie-oxidatiepad in systeem II over twee andere proteïnes, nl. ResA en CcdA. Het ResA-proteïne, gecodeerd door het Bacillus ResABC operon, fungeert in analogie met het HelX/Ccl2 systeem uit systeem I, in thioreductie van het apocytochroom c. Het CcdA29

proteïne, gerelateerd met het disulfide isomerase proteïne DipZ uit systeem I, speelt een rol in de transfer van gereduceerde moleculen doorheen de membraan. Dit CcdA/ResA translocatie systeem voor apocytochroom en haem blijkt een mogelijke weg voor te stellen in de regulatie van de cytochroom biogenese, in analogie met het systeem I. In sommatie voor systeem II, kan gesteld worden dat 4 proteïnes, CcsA, Ccs1, ResA, en CcdA gebruikt worden in cytochroom c biogenese in Gram-positieve bacteriën. 9.3. Systeem III In mitochrondria van fungi, vertebraten en invertebraten blijkt de c-type cytochroom biogenese minder complex te zijn. De cytochroom haemlyasen vormen de centrale componenten in de c-type cytochroom biogenese in systeem III. Deze lyasen zijn essentieel voor covalente binding van de haemgroepen met het apocytochroom (Dumont et al., 1988; Nicholson et al., 1988). Import van het apocytochroom c wordt niet gemedieerd door een translocase systeem in de buitenste membraan van de mitochrondria. Er bestaat een evenredig verband tussen het transport van apocytochroom c en de hoeveelheid CCHL aanwezig in de cel (Dumont et al., 1988). Naast rechtstreeks binden van CCHL op het apoproteïne, blijkt ook het opvouwen van het apocytochroom in de intermembranaire ruimte noodzakelijk te zijn voor het transport van het apocytochroom. Het signaal dat er voor zorgt dat het vervoer van het apocytochroom naar de intermembranaire ruimte gebeurt, is inherent verbonden met de protease-gevoeligheid van het niet-opgevouwde apocytochroom c. Het ferrochelatase incorporeert Fe in de porphyrinegroep van het haem, waarna de haemgroep door het CCHL met het apocytochroom kan geligeerd worden. Het CCHL enzym heeft een sterke affiniteit voor het niet-gevouwde apocytochroom. In de intermembranaire ruimte vouwt het apocytochroom zich op, zodat het preproteïne niet meer protease-gevoelig is, en dissociatie van het CCHL uit het cytochroom-CCHL-complex kan gebeuren, en het cytochroom c – haem complex vrij kan komen in de intramembranaire ruimte. Binnenin de haem-lyase enzymen blijkt een hoog-geconserveerd motief, CPV, nodig te zijn dat als reversiebele haembindingsgebied fungeert (Steiner et al., 1996). 9.4. Opeenvolgende stappen in cytochroom c biogenese Om algemeen een meer mechanistisch werkschema weer te geven, zijn een aantal mogelijke stappen die de translocatie mediëren van de precursorpolypeptide en de haemgroep naar het periplasma, en die vervolgens de covalente binding tussen deze twee moleculen katalyseren, de volgende (zie figuur 1.19.) (Thöny-Meyer et al., 1994):

30

Figuur 1.19. Werkschema ter illustratie van de opeenvolgende stappen in cytochroom c biogenese (Thöny-Meyer et al., 1994).

1. Export van apoproteïne en haem: Na biosynthese van het pre-apocytochroom en het haem in het cytoplasma, moeten de twee componenten doorheen de membraan vervoerd worden. Het pre-apocytochroom maakt gebruik van het sec-transmembranair transportmechanisme in de bacteriële cel, die in samenwerking met de signaalsequentie naar de periplasma geloodst moet worden (Pugsley, 1993). De N-terminale signaalsequentie bevat positieve ladingen aan de N-terminus, en een reeks hydrofobe residu’s, 31

gevolgd door een –3 tot –1 peptidase herkennings- en klievingsgebied. De functionele rol van het signaalpeptide werd aangetoond d.m.v. een gefusioneerd alkalisch fosfatasegen (PhoA), welke doorheen de membraan in het periplasma geactiveerd wordt (von Wachenfeldt & Hederstedt, 1990). De laatste stap in de haembiosynthese is de incorporatie van Fe in de porphyrinering. Deze stap wordt gekatalyseerd door een ferrochelatase, een enzym aanwezig aan de cytoplasmatische zijde van de membraan. Aldus dient haem op een of andere manier de membraan te doorkruisen. Aangezien haem een kleine lipofiele molecule is, kan het de periplasma bereiken door de cytoplasmatische membraan te penetreren. Toch wordt er verondersteld dat een eiwitachtige translocator een rol speelt bij de export van haem naar de periplasma. CycVW bij Bradyrhizobium japonicum en HelAB bij Rhodobacter capsulatus zijn mogelijke kandidaten (Ramseier et al., 1991; Beckman et al., 1992). CycV/HelA coderen voor een eiwit homoloog met de ATP-bindende subeenheid van de ABC-translocator (Hyde et al., 1990), terwijl CycW/HelB coderen voor een hydrofoob, integraal membranair eiwit met zes mogelijke transmembranaire helices, een typisch kenmerk voor kanaalvorming. Het is mogelijk dat de haemtransporter de translocatie van haem koppelt aan deze van het apocytochroom om de binding tussen de twee te vergemakkelijken. De exportproteïnes vertonen een motief welke aantoont dat ze betrokken zijn in het binden en het aanbieden van haemmoleculen. Daarnaast vertonen zij 2 geconserveerde histidine residu’s in de onmiddellijke omgeving van dit consensusmotief. Deze residu’s dienen als liganden voor het haem Fe-atoom. In evolutionaire zin fungeerde dit motief in het binden met de haemgroep zodat reactie met zuurstof of oxidatie niet kon optreden tijdens de translocatie. Op deze manier wordt haem getransloceerd vanuit HelABCD naar Ccl1, waar het naar de periplasma begeleid wordt met de haem-vinyl zijketen naar de buitenzijde geëxposeerd. Het CycJ proteïne zorgt voor effectieve translocatie van haem van helABCD naar Ccl1. Deze genen zijn onmisbaar in cyt c biogenese. Het Ccl2 speelt een rol, naast de reductie van het apocytochroom c, in de specifieke herkenning en aanbieding van het apocytochroom aan de haemmolecule, welke gebonden is aan het Ccl1 proteïne. Het CycH genproduct begeleidt de apocytochroom c polypeptiden in hun translocatie naar ccl2/ccl1. 2. Covalente binding van haem met het apoproteïne: De ligatiereactie houdt in dat de twee gereduceerde thiolgroepen van de cysteïneresidu’s van het apocytochroom met de vinylzijketens van de haemgroep worden gefusioneerd. Naast het lyase enzym, zijn ook andere enzymatische reacties nodig om de haemgroep en het apocytochroom voor te bereiden op deze ligatiereactie. Het HelX is een periplasmatisch enzym, wegens het feit dat zijn signaalsequentie in staat is om alkalisch fosfatase te exporteren. 3. Ligatie van haem met het apocytochroom. Dit wordt uitgevoerd d.m.v. CCHL, bestaande uit de cycHJK/ccl1 genproducten (dit Cytochroom c Haem Lyase is enkel aangetoond voor systeem III). Het Ccl1 genproduct is hydrofoob, en is waarschijnlijk membraangebonden (terwijl het ccl2 genproduct hydrofiel is). Mutanten in deze genen vertonen cytochroom c deficiëntie. Aangezien geen van deze proteïnes homologie vertonen met proteïnes van gekende functie, werden hieruit mogelijke haembindende motieven afgeleid. Het motief dat afgeleid werd uit 32

Ccl1 en homologen, werd ter bevestiging ook teruggevonden in het mitochondriaal CCHL, zowel als in het haem-transmembranair transportmechanisme. 4. Proteolytische splitsing van een signaalpeptide. Een peptidase herkent een klievingsplaats bestaande uit kleine ongeladen residu’s op posities –1 en –3, vaak alanine of glycine, en splitst het signaalpeptide van het oplosbare c-type cytochroom, zodat het cytochroom uiteindelijk van de membraan kan wegdiffunderen. Proteolytische splitsing gebeurt ofwel na haembinding ofwel onafhankelijk ervan. Aangezien echter verscheidene c-type cytochromen over een N-terminale signaalsequentie beschikken die niet wordt afgesplitst, wordt gedacht dat proteolytische splitsing van het signaalpeptide niet noodzakelijk is om de haemgroep covalent met het apoproteïne te binden. 5. Opvouwen van de subeenheden en complexvorming tot een structureel gestabiliseerd multi-subeenheid complex: Algemeen blijken twee functionele domeinen, nl. de haembindingsplaats CXXCH, en het C-terminale hydrofobe (staart-) uiteinde van de cytochromen, noodzakelijk te zijn voor correcte opvouwing en opbouw van de verschillende subeenheden. De vierde stap ontbreekt in de maturatie van membraangebonden c-type cytochromen, uitgezonderd voor het cyt c1, welke met zijn hydrofobe C-terminus in de membraan vastgehecht zit, en waarvan ook het N-terminale signaalpeptide wordt afgesplitst door een peptidase. Van sommige c-type cytochromen wordt het N-terminale signaalpeptide echter niet afgesplitst, zodat zij met deze sequentie aan de membraan vastgehecht blijven. 10. Gentransformatiesystemen In de laatste decennia werd uitermate veel gewerkt met fototrofe organismen. Dankzij het feit dat deze organismen heel veelzijdig zijn, is het aantal genetische werktuigen die heden in dit gebied gebruikt worden enorm uitgebreid, met het zicht op het karakteriseren van het fotosynthetisch apparaat, evenals het ophelderen van de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de N2 en CO2 fixatie. 10.1. Transductie Transductie wordt gedefinieerd als bacteriofaag gemedieerde transformatie. Het DNA integreert in het bacteriële genoom of het getransformeerde DNA repliceert autonoom. Bij algemene transductie transfereren fagen, die een stukje eigen genoom verloren hebben, een willekeurig DNA-fragment van de waardcel. Bij speciale transductie worden enkel deze loci overgedragen die naburig zijn aan de vasthechtingspunten van de profaag in het bacterieel genoom. Transductie is meestal een weinig succesvolle methode gebleken als toepassing in de moleculaire biologie. Transductie wordt echter wel met succes aangewend bij het bepalen van de relatieve ligging van genen en het bepalen of een gen plasmide of chromosomaal gecodeerd is. Bovendien speelt transductie een belangrijke rol bij het stabiliseren, door chromosomale integratie van plasmide gecodeerde genen (Fitzgerald & Gasson, 1988).

33

10.2. Transpositie Transposeerbare elementen zijn DNA-fragmenten die zich kunnen verplaatsen van één replikon naar een ander. Ze worden ingedeeld in transposons (Tn) en insertiesequenties (IS). Insertiesequenties zijn mobiele DNA fragmenten die op willekeurige plaatsen in het DNA kunnen geïntegreerd worden waardoor genen geïnactiveerd kunnen worden. Transposons zijn eveneens mobiele DNA fragmenten maar zijn groter dan insertiesequenties. Ze worden geflankeerd door “direct repeats” en bezitten een “target site repeat”. Bovendien coderen ze voor een eiwit. 10.3. Transformatie van natuurlijk competente cellen Avery et al. (1944) bewezen voor het eerst het bestaan van natuurlijke competentie bij Streptococcus pneumoniae. Intussen werden er reeds tenminste 15 genera beschreven die over een natuurlijk transformatiesysteem beschikken (Achromobacter, Acinetobacter, Azotobacter, Bacillus, Haemophilus, Halobacterium, Pseudomonas, Streptococcus, Streptomyces, Methylobacterium, Micrococcus, Moraxella, Mycobacterium, Neisseria en Synechococcus) (Mercenier & Chassy, 1987). De vereiste condities om natuurlijke competentie te verkrijgen zijn echter nog niet gekend. PH, groeifase, medium, compositie en celdensiteit zouden een rol spelen. De aanwezigheid van het CF- (Competentie Factor) proteïne blijkt ook essentieel te zijn. De opeenvolgende stappen die voorkomen bij natuurlijke transformatie zijn: 1) ontwikkeling van competentie voor de opname van DNA, 2) binding van het DNA op de receptorcellen, 3) opname van het DNA door de receptorcellen, 4) intracellulaire werking van het DNA. Zoals natuurlijke genetische transformatie voorkomt bij de cyanobacteriën, evenals bij de purperbacteriën na een CaCl2-behandeling (Fornari en Kaplan, 1982), ging J.G. Ormerod (1988) na of dit ook het geval was bij de Chlorobium species. Daarvoor werd een natuurlijke streptomycine-resistente mutant van de 8327 cellijn gebruikt, die goede groeirendementen vertoonde op agar met 100 µg streptomycine/ml (deze stam wordt 8327 SmR genoemd), terwijl men weet dat de wild type stam gevoelig is voor 2 µg Sm /ml. Het groeimedium bestond uit een basis van thiosulfaat-acetaat (TA), waaraan voor 66% 3.5 % agar en 0.05% Na-thioglycolaat en resazurine (1mg/l) als redox-indicator werden toegevoegd. Een filtergesteriliseerde Sm-oplossing werd toegevoegd tot een finale concentratie van 20µg Sm/ml (TASm agar). Om de cellen competent te maken voor transformatie werd een kolonie van de acceptorcellen in een verdunde oplossing van Na-citraat/Na-Cl/SDS geïncubeerd bij 60°C gedurende 1 uur. Een kleine hoeveelheid donor DNA werd met de acceptorcellen gemengd op TA agar en geïncubeerd gedurende 10-12 uur in het licht, waarna de cellen op TASm agar werden geïncubeerd gedurende 2-6 dagen.

34

Figuur 1.20. Competentie van een Chlorobium species, geregistreerd tijdens de groeicyclus (Ormerod, 1988).

De experimenten toonden aan dat competentie van de cellen plaats vond vanaf een SDSconcentratie van 0.01%, terwijl de transformatie optreedt in afwezigheid van SDS. Kwantitatief werden in het experiment 10 µl DNA gebruikt voor transformatie van 100-200 µl 8327 cellen in TA medium. Voor het bepalen van de opnametijd van het exogeen DNA werd 1mg/ml DNase aan de agar gevoegd op verscheidene tijdsintervallen na transformatie. Deze behandeling met DNase fungeert als ultieme controle voor het bekomen van het finaal fenotype (Sm-resistent) dat enkel via echte transformatie kon optreden. Er werden transformanten aangetoond na een interval van 30 min tussen additie van het 8327 SmR DNA en het DNase. De transformatiefrequentie werd gevoelig verhoogd door het interval te vergroten tot 1 à 2 uur, waarna verdere toename van de frequentie nog moeilijk aan te tonen was. Deze methode van uitplaten werd gebruikt om te bepalen of een extract van de SmR 8327 cellen getransformeerd kon worden in andere Chlorobium cellijnen. Enkel de Tassajara cellijn gaf geen transformanten. Er werden ook geen transformanten teruggevonden bij een poging om dezelfde cellen (8327 en Tassajara) met exogeen DNA (nl. dit van Rhodobacter capsulatus met de plasmiden R6845 en R1822, welke een Km-resistentiegen bevatten) te transformeren. Ditzelfde negatief resultaat werd bereikt bij de poging om deze plasmiden over te brengen met Rb capsulatus of plasmide RP4 via E. coli J53. Er werd veronderstelt dat incorporatie van chromosomaal DNA van de acceptorstam rondom het doelgen in het plasmide de transformatie gemakkelijker moet laten verlopen, zoals dit is aangetoond bij andere bacteriën (Carlson et al., 1983 en 1984). Het opnameproces is lichtonafhankelijk, en er blijkt zelf dat in donkere omstandigheden de opname wordt bevorderd. Het licht is echter noodzakelijk in de daaropvolgende incubatieperiode, v r de cellen worden blootgesteld aan streptomycine. In de Chlorobium cellen kan competentie worden geïnduceerd in alle stadia van de groei (zie figuur 1.20.), evenals in de stationaire fase. De verhouding van het aantal transformanten tot de DNA-concentratie is relatief hoog, tot het systeem saturatie vertoont bij concentraties lager dan 1 ng DNA / ml. De transformatiefrequentie in dit systeem werd ruw geschat op 1 cel per 105. 35

Uit deze experimenten kan worden besloten dat wegens het feit dat geen detergenten nodig zijn in de DNA-extractieprocedures en dat slechts een kleine hoeveelheid DNA nodig blijkt te zijn, het goed mogelijk is dat transformatie van de Chlorobium species echt voorkomt in natuurlijke omstandigheden. 10.4. Transformatie van cellen door geïnduceerde competentie De cellen moeten in een fysisch competente toestand verkeren, waarbij de binding van nucleïnezuren aan het celoppervlak toegelaten wordt, waarna de nucleïnezuren opgenomen worden door de gastheercel. De cellen kunnen competent gemaakt worden voor transformatie door een voorafgaande behandeling met CaCl2. Naast calcium zouten kunnen tevens strontium, barium en magnesium substituenten aangewend worden voor de inductie van chemische competentie. Een opeenvolging van vriezen en dooien verzwakt bovendien de celwand waardoor het DNA gemakkelijker kan binnen treden. Tot op heden kunnen 1010 transformanten per µg te transformeren DNA bekomen worden. Meestal wordt 0.5 à 1% van de populatie getransformeerd. 10.5. Conjugatie Het conjugatie-mechanisme in gram-negatieve bacteriën wordt gecodeerd door plasmiden. Plasmiden worden dankzij hun mobiel karakter gemakkelijk uitgewisseld en kunnen gemakkelijk nieuwe genen opnemen. Plasmiden worden ingedeeld in incompatibiliteitsgroepen: dit houdt in dat twee plasmiden die niet samen stabiel kunnen worden overgeërfd in één cel incompatibel genoemd worden en worden aldus geklasseerd in dezelfde incompatibiliteitsgroep (Thomas en Smith, 1987). Bij conjugatie is er contact noodzakelijk tussen de donor- en acceptorcellen: dit gebeurt door middel van de sex-pili (F-pili). Het transferproces voor autotransfereerbare (F-factor type) plasmiden kan onderverdeeld worden in 5 stappen, waarbij de transfer d.m.v. het rollend circel mechanisme verloopt: 1. 2. 3. 4. 5.

F-pilus celwandcontact. Onstabiele celwand-celwand contact. Stabiel contact. Verzwakkend contact. Verbreken van het contact.

In de donorcel wordt het plasmide DNA nabij het OriT (origin of transfer) gebied geknipt. Een nieuw gesynthetiseerde kopij wordt als enkelstrengig DNA (ssDNA) getransfereerd naar de acceptorcel. Deze DNA-transfer gebeurt doorheen de F-pilus. Zowel in de donor als in de acceptorcel wordt een tweede streng gesynthetiseerd waarna het dubbelstrengig plasmide DNA zich cirkelvormig sluit. De splitsing nabij het OriT gebied, de “nicking”, wordt uitgevoerd door het endonuclease dat gecodeerd wordt door een transfer (tra) systeem op hetzelfde of op een ander (helper) plasmide (Thomas en Smith, 1987). Bij conjugatie kunnen zowel plasmiden als het gehele chromosoom of gedeelten ervan getransfereerd worden naar de acceptor. Bij grampositieve bacteriën zijn niet enkel plasmiden verantwoordelijk voor de transfersystemen maar ook andere DNA elementen zoals conjugatieve transposons (Bertram et al., 1991). Vele plasmiden kunnen op autonome wijze hun eigen transfer bepalen: ze zijn conjugatief, en ze worden aangeduid als Tra+, wat wil zeggen dat ze over een geschikt tra-systeem beschikken. De conjugatie wordt mogelijk gemaakt door de aanwezigheid van zowel het OriT gebied, waar de 36

replicatie v r de transfer geïnitieerd wordt na “nicking”, als van de tra-genen, die nodig zijn voor het celcontact met de acceptorcel, en voor de initiatie en het behoud van de controle van deze processen. Een grote groep van voornamelijk kleine plasmiden (< 30 kb) beschikken niet over een volledig tra-systeem en worden daarom niet-conjugatief genoemd (Tra-). Een niet-conjugatief plasmide heeft een conjugatief plasmide nodig om getransfereerd te worden. Dit proces wordt mobilisatie genoemd. Mobiliseerbare vectoren bezitten een OriT gebied en enkele genen die instaan voor conjugatie. Een niet-mobiliseerbare vector bevat geen OriT gebied. Aangezien het OriT gebied in cis positie moet aanwezig zijn ten opzichte van het DNA dat getransfereerd wordt is de enige mogelijkheid voor transfer van de plasmidegenen hun integratie in het conjugatieve ‘helper’plasmide. Dit nieuwe (groter geworden) plasmide wordt vervolgens getransfereerd. Er bestaan drie verschillende modellen voor plasmide mobilisatie: a) Bij directe mobilisatie zijn zowel het Tra+ als het Tra- plasmide aanwezig in één en dezelfde donorcel. De acceptor is plasmidevrij. b) Bij een triparentale mobilisatie bevat de donor de Tra- vector, een helpercel bevat het Tra+ plasmide. De acceptorcel is plasmidevrij. c) Sommige conjugatieve plasmiden kunnen niet-conjugatieve plasmiden mobiliseren, zowel van donor naar acceptor van het conjugatieve plasmide als in de tegengestelde richting, namelijk van acceptor naar donor van het conjugatieve plasmide. Ondanks het feit dat bij conjugatie de interactie vereist is tussen twee cellen is de transfer niet beperkt tot nauw verwante organismen: sommige plasmiden zijn in staat om conjugatieve transfer of mobilisatie uit te voeren in bijna alle gram-negatieve species en zelfs in grampositieven. Ze worden “broad host range” plasmiden genoemd. Hierdoor is conjugatie vermoedelijk het belangrijkste genuitwisselingsmechanisme in de natuur. Voorbeelden van conjugatie in purper en groen-zwavelbacteriën. • Een systeem voor conjugatieve transfer van mobiliseerbare plasmiden van E.coli naar Chromatium vinosum werd ontwikkeld door Pattaragulwanit en Dahl (1995). Plasmiden van de P-incompatibiliteitsgroep werden met succes geconjugeerd, terwijl vectoren van de Q-incompatibiliteitsgroep d.m.v. een helperplasmide RP4, die extrachromosomaal of geïntegreerd in het E.coli genoom voorkomt, werden getransformeerd. Daarbij werden transformatieëfficiënties (d.i. het aantal transformanten per acceptorcellen) bereikt van 1:1. Alle genetische merkers werden fenotypisch in Chromatium vinosum teruggevonden. Chromatium vinosum wordt hierbij als modelorganisme genomen wegens zijn mogelijkheden om zowel fototroof als fotoorganotroof te groeien in micro-aërobe omstandigheden (Kämpf en Pfennig, 1980; Pfennig, 1989). Deze O2-tolerantie en relatief snelle groei van het organisme vergemakkelijken de moleculair biologische technieken. De plasmidetransfer werd uitgevoerd d.m.v. de “filter mating” methode, waarbij donor (E. coli) en acceptor (Chromatium vinosum) cellen samen gemengd werden en op een filter aangebracht worden, die zelf op een voedingsbodem gehecht is. De analyse van de geconjugeerde plasmiden gebeurt m.b.v. agarosegelelektroforese, waarbij de cellen in situ gelyseerd worden. Omdat de RP4 helperplasmiden in de conjugatie-experimenten te groot en weinig geschikt bleken te zijn voor efficiënte conjugatie, werden vectoren van het type pRK290 gebruikt. Zij hebben een bredere gastheerspecificiteit, zijn mobiliseerbaar en hebben een polylinkersite. Ze zijn echter niet autotransfereerbaar, zodat ze d.m.v. de tra-

37

functies van RP4 aanwezig in het chromosoom van sommige E.coli stammen, worden getransfereerd. • Het voorkomen van natuurlijke conjugatie werd aangetoond in de meeste Chlorobium cellijnen, uitgezonderd voor Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum strain Tassajara (Ormerod, 1988). Bij de conjugatie van een plasmide uit E. coli naar Chlorobium tepidum wordt eveneens gebruik gemaakt van een helper plasmide. De donorcellen worden in een eerste fase gemengd met de helperplasmidecellen, waarna ze in een tweede fase met de acceptorcellen worden gemengd (Wahlund en Madigan, 1995). Er wordt geselecteerd naar transconjuganten a.d.h.v. meegetransformeerde resistentiemerkers op het plasmide, naast selectie naar sulfideverbruikende Chlorobium cellen door enkel sulfide aan het medium toe te dienen. Uit de Chlorobium cellen die bestendig zijn aan het antibioticum (Km) kan pDNA worden geïsoleerd door de cellen te lyseren d.m.v. een lichte centrifugatie in het groeimedium, waarna met restrictiedigesten en agarosegelelektroforese het insert kan worden aangetoond. Succesvolle conjugatie werd ter controle aangetoond door het plasmide terug naar een E. coli stam te transformeren, waarbij het intacte plasmide opnieuw kon worden geïsoleerd. Daarbij werd ook bewezen dat het plasmide stabiel wordt getransformeerd. De meest optimale conjugaties werden bereikt met culturen uit de midden-exponentiële tot stationaire fase. In dit expressiegebied werden gelijkaardige conjugatiefrequenties gevonden. De minimale tijd die nodig is voor optimale conjugatie tussen E. coli en Chlorobium tepidum blijkt 90 min te zijn. De grootste moeilijkheid in de transformatie naar Chlorobium tepidum zit in de thermolabiliteit van het plasmide bij temperaturen die optimaal zijn voor Chlorobium. Uitgaande van dit gegeven wordt nu gezocht naar plasmiden die endogeen in Chlorobium aanwezig zijn, en die als thermostabiele shuttle-vector kunnen dienen, zowel in Chlorobium, als in andere thermofiele organismen. Wegens de nauwe verwantschappen tussen de thermofiele Chlorobium species en andere mesofiele Chlorobium species, wordt verwacht dat transconjugatie met dezelfde vectoren mogelijk moet zijn in de verschillende Chlorobium soorten. Desondanks wordt Chlorobium tepidum, wegens zijn korte generatietijd als modelorganisme beschouwd in genetische analyses.

10.6. Elektroporatie Specifiek voor de elektroporatietechniek is de efficiëntie van transformatie en de leefbaarheid van de getransformeerde cellen afhankelijk van de initiële veldsterkte van de gegeven puls. Uit experimenten van Dower et al. (1988), blijkt dat de leefbaarheid van de cellen in evenredige mate afneemt met stijgende veldsterkte, en dat een maximale transformatieefficiëntie wordt bereikt als 30-40% van de cellen de puls overleven. Een verhoogde pulsduur geeft een verhoogde transformatie-efficiëntie en een verlaagde kans op overleven van de cellen, en bij een nog hogere pulsduur stijgt de celsterfte op significante manier. Bij transfectie van exogeen DNA naar Chlorobium vibrioforme gebeurt DNA integratie in het genoom d.m.v. homologe recombinatie. Chlorobium vibrioforme vertoont bij transconjugatie echter een lage natuurlijke transformatieëfficiëntie van homologe chrDNA segmenten, welke nochtans een goede stabiliteit vertonen. Daarom werd getracht een elektroporatietechniek te ontwerpen voor de groenzwavelbacteriën (Kj rulff et al., 1994). Hierbij werden bij optimale elektroporatieomstandigheden (een puls van 25 µF, 7.5 kV/cm veldsterkte, en een pulsduur van 14 msec) 30 tot 50 ng van het plasmide met 100 µl cellen (109 cellen per ml) gemengd. De cellen werden in 38

groeimedium overgebracht om te recupereren, en in het licht geïncubeerd. Southernblothybridisatie toonde aan dat de getransformeerde plasmide door homologe recombinatie geïntegreerd was in het genoom van Chlorobium vibrioforme. Integratie van vreemd DNA in het genoom van Chlorobium vibrioforme vereist de aanwezigheid van homoloog DNA in het plasmide, in het geval het plasmide niet autonoom in de gastheer repliceert. Daarnaast moet een supplementaire resistentiemerker worden ingebouwd (d.m.v. transpositie) om voor resistentie te selecteren, omdat de insertie mogelijks uit het genoom kan worden gedeleteerd door natuurlijke selectie, waarbij opnieuw het wild fenotype wordt verkregen. 10.7. Transposon mutagenese Dit omvat het genetisch modelleren van de transposons welke aanwezig zijn in een conjugatieve plasmide, met verschillende resistentiemerkers om bredere selectiemogelijkheden te verkrijgen. Bij interposon mutagenese wordt een insertie in een gekloneerd gensegment geïntroduceerd, waarbij de insertie een selectiemerkergen bevat. Een interposon is een DNA-fragment (< 4 kb) die codeert voor een selectiemerker, geflankeerd door restrictiesites, en bevat ook transcriptie- en translatieterminatie plaatsen in beide richtingen. Dit mutagenese principe wordt voornamelijk gebruikt voor het genereren van knock-out mutaties (bijvoorbeeld: het 2.0 kb Ω interposon, welke voor spectinomycine en spectromycineresistentie codeert). De verschillende insertiemutagenese methoden werden ontwikkeld om de biochemische activiteit van natieve genen in verscheidene Gram-negatieve bacteriën te karakteriseren (Fellay et al., 1987). De mutaties worden verkregen door de organismen te transformeren met vectoren die de transfer van merkergenen mediëren naar het genoom van het organisme via recombinatie. De voordelen van de insertiemutagenese methode zijn: 1. de transformanten kunnen op basis van antibioticumresistentie gescreend worden, 2. de inserties zijn gemakkelijk te bepalen a.d.h.v. flankerende transcriptie- en translatieterminatiesignalen en door synthetische polylinkers, zodat de precieze posities van het interposon in de gekloneerde vector in kaart kunnen worden gebracht door specifieke enzymatische digesten t.h.v. deze polylinkers. 3. Een andere eigenschap van het interposon is dat het de activiteit van de genetische eenheid waarin het werd gekloneerd volledig stillegt. Het originele plasmide pHP45:Ω bevat de Spc en Sm resistentiegenen (zie figuur 1.22). Met dit genotype kunnen echter niet in alle gevallen efficiënte conclusies worden getrokken voor insertiemutagenese, want sommige bacteriële species zijn van nature uit resistent tegen deze antibiotica, en sommige vectoren bevatten reeds deze resistentiemerkers. Een verzameling interposons werd gecreëerd welke de voordelen van de originele Ω-interposon bevatte, naast verschillende resistentie merkergenen. Uit het originele pHP45 plasmide (figuur 1.21.) werden de Sm en Spc resistentiemerkergenen verwijderd, zonder dat de flankerende transcriptie- en translatieterminatiesignalen van Ω worden verwijderd.

39

Figuur 1.21. Weergave van de pHP45 vector.

Door uitwisseling met een kanamycine resistentiemerker werd het pHP45 Ω Km geconstrueerd (figuur 1.22).

Figuur 1.22. pHP45Ω en pHP45Ω-Km (Fellay et al., 1987).

Het Ω -segment in het originele pHP45Ω plasmide is een 2.0 kb DNA-fragment, dat de RNA- en eiwitsynthese voorbarig afbreekt, zodat transcriptie en translatie sites in kaart kunnen worden gebracht. Het antibioticumresistentiegen kan uit het Ω-fragment worden gedigereerd, waarna de flankerende restrictiesites achterblijven. De transcriptie-terminatiesequenties die het antibioticumresistentiemerker flankeren bevatten de C-terminale gedeelten van bacteriofaag T4 gen 32. Dit zijn: 40

1. de laatste 8 codons van gen 32, 2. 2 opeenvolgende translatieterminatiecodons (TAA,TAG), 3. een transcriptieterminatie-hairpin-sequentie. De translatieterminatiesequentie is zodanig georiënteerd dat transcriptie vanuit het Ω fragment niet wordt geblokkeerd. Na het hairpin-transcriptieterminatiesignaal volgen 3 TCA nonsense codons op de complementaire streng in 3 fasen, zodat met een deletie mutatie van 1, 2 of 3 bp de stopcodons toch nog worden herkend (zie figuur 1.23.) (Prenti en Krisch, 1984).

Figuur 1.23. Structuur van het Ω-element. (a) stelt het recombinante plasmide pHP45 voor, waarbij het plasmide circulair is voorgesteld en het Ω-fragment in lineaire vorm. Het Sm/Spc resistentiegen wordt geflankeerd door korte geïnverteerde repeats waarop de T4 transcriptieterminatiesignalen zitten, het translatieterminatiesignaal en de polylinker. (b) Nucleotidesequentie van de geïnverteerde herhaling van Ω (Prenti en Krisch, 1984).

De aanwezigheid van de 2 terminatiesequenties in geïnverteerde repeats die de antibioticum resistentiegenen flankeren kunnen d.m.v. elektronenmicroscopie waargenomen worden. Als besluit kan worden gesteld dat het gebruik van DNA-fragmenten voor de mutagenese van genomen eenvoudiger is gemaakt door het invoeren van polylinker-fragmenten rondom de gebruikelijke transposons zodat met 1 enkel enzymatisch digest kan bepaald worden waar de mutatie plaats vond. Op deze manier kan op welbepaalde plaatsen in het genoom worden gemutageniseerd. Daarnaast kunnen ook selecteerbare transcriptionele en translationele stopsignalen ingebouwd worden, zodat transcriptionele en translationele eenheden in het gekloneerde DNA in kaart kunnen worden gebracht. 41

II. MATERIAAL EN METHODE 1. Media. 1.1. Medium voor Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum. Het cultuurmedium wordt bereid naar een gemodificeerd recept van Biebl en Pfennig (1978). Samenstelling van 1 liter medium voor Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum (Biebl en Pfennig, 1978). Oplossing I: • dH2O • KH2PO4 • NH4Cl • MgSO4.7H2O • CaCl2.2H2O • NaOOCCH3 • Na2S2O3.5H2O • Na2S • NaHCO3

1000 ml 1.00 g 0.50 g 0.40 g 0.10 g 0.27 g 0.25 g 0.60 g 1.60 g

Oplossing II: Bereiding 100 ml SL10 Chlorobium sporenoplossing: • dH2O 100 ml • HCl (25%) 1.00 ml • FeSO4.7H2O 210 mg • ZnCl2 7 mg • MnCl2.4H2O 10 mg • H3BO3 0.6 mg • CoCl2.6H2O 19 mg • CuCl2.2H2O 0.2 mg • NiCl2.6H2O 2.4 mg • NaMoO4.2H2O 3.6 mg Oplossing III: 1 ml Vit B12 (2 mg/100ml) Bij het toevoegen van de SL10 sporenoplossing wordt een zwart precipitaat zichtbaar. Het mengsel wordt gedurende 15 min met argon doorborreld terwijl magnetisch wordt geroerd onder kiemvrije omstandigheden om zuurstof te verwijderen. Het mengsel wordt geautoclaveerd, waarna, zodra de fles koud (25°C) is, 1 ml filtergesteriliseerde Vitamine B12 oplossing wordt toegevoegd met behulp van steriele spuit en naald. De pH moet op punt worden gesteld met 10% H2SO4 (eveneens met steriele spuit en naald), tot een pH van 6.8 tot 7.0 bereikt wordt. Dit cultuurmedium wordt geïnoculeerd met 30 ml (per liter) van een cultuurfles welke de steady state reeds bereikt heeft, waarna het inoculaat voor een warme lichtbron wordt geplaatst. De afstand tussen de fles en de lichtbron bedraagt 40 - 50 cm, en de temperatuur ongeveer 28°C. Een continue belichting wordt vereist van 5 tot 300 lux. Alle sulfide en elementair zwavel zullen door fotoöxidatie worden opgebruikt, en de groei van de cultuur zal stoppen, waarna beschadiging kan optreden indien verder belicht wordt. 42

Daarom kan de cultuur gevoed worden met een steriele geneutraliseerde sulfide-oplossing om hoger celrendement te verkrijgen. Om de cultuur op petriplaten te doen groeien moet aan ditzelfde medium nog 2% agar toegevoegd worden. Dit kan worden uitgevoerd in een anaëroob recipiënt waarin een hoeveelheid thioacetamide als primaire H2S bron (0.1 g TAA en 1 ml 0.2N HCl) dient (Irgens, 1983). De vloeibare cultuur wordt gedurende 7 dagen geïncubeerd bij 30°C in het licht. Het anaëroob recipiënt moet gedurende 2 weken geïncubeerd worden bij 30°C in het licht om aparte kolonies te verkrijgen. 1.2. Medium voor Chlorobium tepidum. Oplossing I : • dH2O • Na2S2O3.5H2O • KH2PO4 • Ammonium acetaat • NH4Cl • NaCl • MgSO4.7H2O • CaCl.2H2O • EDTA

800 ml 1.0 g 500 mg 500 mg 400 mg 400 mg 200 mg 50 mg 12.5 mg

Oplossing II : • 0.002% Vitamine B12 1.0 ml Oplossing III : • dH2O • EDTA • FeCl3.6H2O • CoCl2.6H2O • Na2MoO4.2H2O • ZnSO4.7H2O • MnCl2.4H2O • VOSO4.2H2O • NiCl2.6H2O • CuCl2.2H2O • H3BO3 • Na2WO4.2H2O • Na2SeO3

1000 ml 6.7 g 2.0 g 190 mg 190 mg 150 mg 100 mg 30 mg 25 mg 17 mg 6 mg 2 mg 2 mg

Oplossing IV : • Na2S.9H2O 600 mg Oplossen in H2O (10% van het finaal volume), waarna het geautoclaveerd wordt. Oplossing V : • NaHCO3

2g 43

Oplossen in H2O (4% van het finaal volume), waarna het doorborreld wordt met argon en vervolgens filtergesteriliseerd. 1 ml sporenoplossing wordt toegevoegd aan oplossing I en gesteriliseerd. Oplossing IV en V worden aan het medium toegevoegd als het nog warm is. Na afkoeling wordt 1 ml filtergesteriliseerde Vitamine B12 oplossing toegevoegd. Het medium wordt op pH 6.9 gebracht met 1 M HCl. 30 ml van een volgroeide cultuur wordt geënt op 1 liter vers medium. De cultuur moet continu belicht worden bij een incubatietemperatuur van ongeveer 42°-45°C. 1.3. Minimaal zoutmedium. • • • • • • • • • • • • • •

KH2PO4 K2HPO4 (NH4)2SO4 Sodium Citraat MgSO4.7H2O Na-fumaraat NaNO2 Trypton Gistextract NaCl dH2O Sodium selenaat Ammonium molybdate Zwavelvrije sporenoplossing

4.5g 10.5g 1.0g 0.5 g 0.1 g 6.4 g 0.27 g 0.5 g 0.25 g 0.25 g 1000 ml 1 µmol 1 µmol 1 ml

Zwavelvrije sporenoplossing: • • • • • •

MgCl2.7H2O MnCl2.4H2O FeCl3.6H2O CaCl2 Geconcentreerd HCl dH2O

8.2 g 1.0 g 0.4 g 0.1 g 2 ml 100 ml

1.4. Luria-Bertani medium (LB medium) • • •

Trypton Gistextract NaCl

1% 0.5 % 0.5 %

Indien men culturen op petriplaten wenst op te groeien moet 1.8% (w/v) agarose aan dit medium toegevoegd worden. 1.5. SOC medium • • •

Gistextract Trypton NaCl

0.5 % 2% 10 mM 44

• • • •

KCl MgCl2 MgSO4 Glucose

2.5 mM 10 mM 10 mM 20 mM

2. Bereiding van chromosomaal DNA 2.1. Principe. Chromosomaal DNA werd geïsoleerd volgens de methode van Brown et al., 1991. Hierbij wordt de peptidoglycanlaag van de bacterie afgebroken door inwerking van lysozyme, en SDS zorgt ervoor dat de plasmamembraan wordt gedestabiliseerd. Via een fenol/chloroform/isoamylalcohol behandeling wordt het chrDNA van de andere celcomponenten gescheiden, waarna het DNA door isopropanol wordt geprecipiteerd. 2.2. Materiaal •

• • • • • • •

STE-buffer (pH 9,0): 10 mM Tris 100 mM NaCl 1 mM EDTA Lysozyme: 1 mg/ml p-Aminosalicylaat: 4,5% SDS: 0,75% Fenol / Chloroform / Isoamylalcohol: 25/24/1 verhouding. Na-acetaat: 3M Isopropanol Ethanol: 70%

2.3. Methode • • • • • •

• • • •

Groei 1 liter bacteriële cultuur tot verzadiging. Centrifugeren gedurende 10 min bij 8000 tpm en 4°C. Cellen resuspenderen in STE-buffer tot 15ml/g cellen. Lysozyme toevoegen en gedurende 30 min incuberen bij 37°C. p-Aminosalicylaat (4,5%) en SDS (0,75%) toevoegen en incuberen gedurende 10 min bij 70°C. Voeg een equivalent volume fenol / chloroform / isoamylalcohol toe (fenol, pH = 7,8 à 8,0), meng de inhoud tot een emulsie gevormd wordt. Centrifugeer het mengsel bij 12000 g gedurende 5 min en transfereer de waterige fase (met een verwijde pipetpunt) naar een verse falcon. 1% SDS, proteïnase K tot een finale concentratie van 500 µg/ml, en RNase toevoegen tot een finale concentratie van 20 µg/ml en gedurende 1 uur incuberen bij 37°C. Opnieuw een equivalent volume fenol/chloroform/isoamylalcohol toevoegen, mengen, centrifugeren en opnieuw de waterige fase afnemen. Herhaal deze stap tot geen eiwitten meer zichtbaar zijn in de interfase. Voeg een equivalent volume chloroform / isoamylalcohol toe (om de fenolresten te verwijderen). 45

• • • • •

3 M Na-acetaat toevoegen tot een finaal volume van 0,3 M. DNA precipiteren door 1 volume isopropanol toe te voegen. De goed zichtbare DNA vlok wordt met een glazen staaf uit het mengsel opgenomen. DNA wassen met 70% ethanol en afcentrifugeren gedurende 5 min. Luchtdrogen en oplossen in STE-buffer (pH 8,0) of steriel dH20.

De DNA-concentratie wordt bepaald door de extinctie te meten bij 260 en 280 nm (1 O.D. eenheid gemeten bij 260 nm komt overeen met 50 µg/ml dsDNA). Een zuivere DNA-oplossing heeft een optische densiteitsverhouding 260 nm/280 nm van 1.8. Wanneer deze verhouding te hoog is, is er RNA aanwezig. Wanneer deze verhouding lager is zijn er eiwitten met aromatische aminozuren aanwezig. 3. Bereiding van pDNA Plasmiden zijn dubbelstrengige, circulaire DNA moleculen die zelf en onafhankelijk van het chromosomaal DNA kunnen repliceren. In bacteriën dragen zij genen welke unieke eigenschappen van de cellijn vertegenwoordigen. De nu bestaande en gebruikte vectoren zijn afkomstig van natuurlijk voorkomende plasmiden die gemodificeerd zijn om als kloneringsvector dienst te doen. De meeste vectoren bevatten een multicloneringssite, die herkenningsplaatsen bevat voor meerdere restrictieënzymen. Een nadeel van een dergelijke multicloneringssite, waarbij alle restrictiesites bijeen worden getrokken, houdt in dat geen inactivatie van een merker meer kan optreden om naar recombinante klones te screenen, omdat de merkers geen inwendige restrictiesites meer zouden bevatten. Dit nadeel wordt nu opgelost door de insertie van een aantal kloneringssites binnenin het gen coderend voor β-galactosidase, waarbij recombinante klones het gekleurde substraat X-gal niet meer kan hydrolyseren. Dit βgalactosidasegen, afkomstig van het lac-operon van E. coli, codeert voor het N-terminaal fragment van het β-galactosidase. Dit fragment kan worden geïnduceerd met isopropylthio-β-Dgalactoside (IPTG), en is in staat tot intra-allelische complementatie met een defectieve vorm van het β-galactoside in de gastheer. Inductie met IPTG geeft expressie van beide fragmenten van het enzym als gevolg, zodat de bacteriën waarvan het gen niet onderbroken is, blauwe kolonies geven indien ze uitgeplaat werden op medium met het chromogene substraat 5-bromo4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-gal). Recombinante plasmiden getransformeerd in bacteriën zullen witte kolonies geven. Kleine plasmidevectoren worden preferentieel gebruikt en gesynthetiseerd wegens: (1) De transformatie-efficiëntie is omgekeerd evenredig met de grootte van het plasmide, welke een limiterende factor wordt als de grootte van het plasmide 15 kb overstijgt. Kleinere plasmiden kunnen grotere DNA segmenten opnemen voordat de transformatieefficiëntie begint af te nemen. (2) Grote plasmiden repliceren met een lager kopijenaantal dan kleinere, zodat het rendement aan geligeerd DNA daalt, en het verwachte signaal bij screening zwakker wordt. Dit komt doordat het snelheidsvoordeel als overlevingfactor eigen is aan kleinere plasmiden. Vaak is het nodig deze plasmiden te isoleren voor moleculaire studies, zoals voor bepaling van de grootte en van de restrictieknipplaatsen, of om nieuwe plasmiden te construeren. De mate van zuiverheid uitgaande van de gekozen isoleermethode voor het plasmide hangt af van het doel dat er mee wordt beoogd. Hierna worden methoden uitgewerkt voor het isoleren van pDNA. 46

3.1. pDNA bereiding volgens Birnboim en Doly (Birnboim en Doly, 1979). 3.1.1. Principe. De methode van Birnboim en Doly is een snelle screeningsmethode die gebruik maakt van een basische lysestap. Het geïsoleerde DNA is voldoende zuiver om gedigereerd te worden door restrictieënzymen, wat belangrijk is voor het screenen. De cellen worden gesuspendeerd in een glucosebufferoplossing met EDTA als chelaterend middel. De cellen worden vervolgens blootgesteld aan alkalische omstandigheden (pH12.0 – 12.6), waardoor het lineair chromosomaal DNA zal denatureren, terwijl het covalent gesloten circulair pDNA ongedeerd blijft. Bij het neutraliseren van het extract in aanwezigheid van hoge zoutconcentratie, zal precipitatie van het chromosomaal DNA optreden. Dit gebeurt door het reassocieren van de twee gedenatureerde strengen waardoor een onoplosbaar DNA-kluwen ontstaat. Het gesloten covalent gebonden pDNA blijft in de oplosbare fractie. Het merendeel van het cellulair RNA en eiwitten zullen eveneens precipiteren in deze omstandigheden, indien het proteïne eerst gecomplexeerd wordt met een anionisch detergens, SDS. Het hydrofoob karakter van SDS complexeert met het hydrofobe gedeelte van de aminozuren. De eiwitmoleculen worden omgeven door SDS moleculen, waardoor deze een negatieve lading krijgen en elkaar afstoten, met denaturatie als gevolg. pDNA wordt in een laatste stap geprecipiteerd door isopropanol. 3.1.2. Materiaal. •

Oplossing I:

•

Oplossing II:

•

Oplossing III:

• • • •

50 mM glucose 25 mM Tris-HCl (pH 8.0) 10 mM EDTA 100µg/ml RNase 0,2N NaOH 1% SDS

5 M K-acetaat (60 ml) azijnzuur (11,5 ml) steriel dH2O (28.5 ml) Fenol / Chloroform / Isoamylalcohol (25/24/1) Isopropanol 70% ethanol Steriel dH2O

3.1.3. Methode. • • • •

Eén enkele kolonie wordt in 2 ml LB (met het gepaste antibioticum) geënt. Deze enting wordt overnacht opgegroeid bij 37°C en 220 tpm. De overnacht geïncubeerde culturen worden gecentrifugeerd gedurende 1 min, bij 14.000 tpm en 4°C. Het supernatans wordt verwijderd d.m.v. een waterstraalpomp, en de pellet wordt geresuspendeerd in 200µl oplossing I door intens te vortexen. 200µl oplossing II wordt toegevoegd, 5 maal omgekeerd, en 5 min geïncubeerd bij kamertemperatuur. 47

• •

• • • • • •

200µl oplossing III wordt toegevoegd, 5 maal omgekeerd, en 15 min geïncubeerd op ijs. Een equivalente hoeveelheid (=600µl) fenol/chloroform/isoamylalcohol (25/24/1) wordt toegevoegd en geschud. Deze behandeling dient om de celresten, aanwezige eiwitten en andere onzuiverheden te verwijderen. Daarna wordt gecentrifugeerd gedurende 5 min bij 14.000 tpm en 4°C. De waterige fase (bevat pDNA) wordt overgebracht naar een vers epje, waarna 450 µl isopropanol wordt toegevoegd om het DNA te precipiteren, mengen, en 2 min incuberen bij kamertemperatuur. 15 min centrifugeren bij 14.000 tpm en 4°C. Het supernatans wordt verwijderd en de DNA-pellet wordt gewassen met 200 µl 70% EtOH. 5 min centrifugeren bij 14.000 tpm en 4°C. EtOH is vluchtiger dan isopropanol, waardoor alle sporen isopropanol verwijderd worden, en het DNA beter elueerbaar wordt gemaakt. Het supernatans wordt verwijderd, en de pellet gedroogd. De pellet wordt geresuspendeerd in een gepast volume ( = 20 µl) steriel dH2O. Het pDNA kan aldus bewaard worden bij –20°C.

3.2. pDNA bereiding volgens de QIAGEN methode. 3.2.1. Principe De pDNA isolatie is gebaseerd op een basische SDS extractie, gevolgd door een zuivering van het pDNA op een macroporeuze anionenuitwisselaar. Het silicagel is opgebouwd uit anionenuitwisselings-groepen met een hoge ladingsdichtheid, zodat een breed scheidingsgebied kan worden bereikt (van 0.5M NaCl, waarbij dNTP’s elueren, tot 1.6M, waarbij dsDNA elueert). Het hoge scheidingsvermogen van de QIAGEN harsen garandeert dat zowel proteïnen, polysacchariden en kleurstoffen duidelijk kunnen worden gescheiden van het pDNA, tot op een niveau welke met traditionele anionenuitwisselaars niet kan worden bereikt (zie figuur 2.1. en 2.2.).

Figuur 2.1. Elutie van dsDNA, in vergelijking met andere nucleïnezuren, als functie van de zoutconcentratie en de pH.

48

Figuur 2.2. Illustreert het scheidingsvermogen van de QIAgen silicafilters (Qiagen plasmid purification handbook).

De silicagelfilters bezitten een hydrofobe coating zodat niet-specifieke bindingen worden voorkomen. Naast aanpassen van de zoutconcentratie kan het aanpassen van de pH de elutie van plasmiden, cosmiden, faag- en chrDNA selectief scheiden. Bij een NaCl-concentratie van 750mM en bij pH 7.0, wordt pDNA selectief op de kolom weerhouden, terwijl chrDNA, RNA en eiwitten uit de kolom worden geëlueerd. De wasstap (1M NaCl, pH 7.0) verzekert het verwijderen van niet-gebonden bestanddelen. De elutie van het pDNA gebeurt bij 1.25M NaCl en pH 8.2. 3.2.1. Materiaal. • •

Qiagen-tip 100 kolom Oplossing P1 (resuspensiebuffer):

•

Deze oplossing wordt bij 4°C bewaard. Oplossing P2 (lyse buffer):

• •

•

•

50 mM Tris-HCl, pH 8,0 10 mM EDTA 100 µg/ml RNase A

200 mM NaOH 1% SDS IJskoude oplossing P3 (neutralisatiebuffer): M K-acetaat pH 5.5 Buffer QBT (equilibratie buffer): 750 mM NaCl 50 mM MOPS, pH 7.0 15% isopropanol 0.15% Triton X-100 Buffer QC (wasbuffer): M NaCl 50 mM MOPS, pH 7.0 15% isopropanol Buffer QF (elutiebuffer): 1.6 M NaCl 50 mM Tris-HCl; pH 8.5 49

• • •

15% ethanol Isopropanol 70% ethanol Steriel dH2O

3.2.2. Methode. • • • • • • • •

• • • •

Een kolonie wordt geënt in 50 ml vers LB-medium (met het gepaste antibioticum). Deze enting wordt overnacht geïncubeerd bij 37°C en 220 tpm. De cellen worden gecollecteerd door centrifugatie bij 4000 tpm en 4°C, 15 min. De pellet wordt geresuspendeerd in 4 ml buffer P1 (met RNase A), door intens te vortexen. 4 ml buffer P2 wordt toegevoegd, gemengd en geïncubeerd gedurende 5 min bij kamertemperatuur. De P2-bufferreactie is de lysereactie. 4 ml koude buffer P3 wordt toegevoegd (precipitatie), gemengd, en geïncubeerd op ijs gedurende 15 min. Men krijgt een vlokkige en viskeuze precipitatie (bevat genomisch DNA, proteïnen, celdebris en SDS). Het supernatans wordt gecentrifugeerd bij 14.000g en 4°C, gedurende 30 min. Deze stap wordt herhaald tot geen celdebris meer te zien is. Het heldere supernatans wordt op de geëquilibreerde QIAGEN-tip (4 ml buffer QBT) aangebracht, waarbij het pDNA in de resine van de kolom zal blijven vasthangen. De tip wordt 2 maal gewassen met 10 ml buffer QC. De 1ste wasbeurt verwijdert contaminanten. De 2de wasbeurt verwijdert eventuele koolhydraten die door sommige bacteriële stammen overdadig worden geproduceerd. De doorgekomen fractie wordt verwijderd. Het pDNA wordt geëlueerd van de kolom met 5 ml buffer QF. Het pDNA wordt geprecipiteerd met 0.7 volumes isopropanol, door centrifugatie bij 14.000g en 4°C, gedurende 30 min. Het supernatans wordt voorzichtig verwijderd. De DNA-pellet wordt gewassen met 200 µl 70% ethanol, bij kamertemperatuur. Hierbij worden geprecipiteerde zouten verwijderd, en isopropanol wordt vervangen door ethanol. Centrifugeren bij 14.000g, 10 min. Het supernatans wordt verwijderd. De pellets worden aan de lucht gedroogd gedurende 15 min, en daarna opnieuw opgelost in een gepast volume dH2O of 10 mM Tris-HCl, pH 8.5.1

4. Enzymatische reacties. 4.1. Restrictieënzymen. Restrictieënzymen binden specifiek aan dsDNA en knippen op specifieke plaatsen in de streng die karakteristiek zijn voor de aard en afkomst van het enzym. Elk enzym heeft zijn eigen herkenningssequentie. Algemeen kunnen drie klassen restrictieënzymen onderscheiden worden: • • •

De klasse I restrictieënzymen herkent een bepaalde sequentie maar knipt 400 tot 700 bp verder in de sequentie. De klasse II restrictieënzymen herkent een specifieke sequentie en knipt in de rechtstreekse omgeving van zijn herkenningsplaats. Deze enzymen zijn het meest geschikt voor kloneringsexperimenten. De klasse III enzymen herkent een bepaalde sequentie maar knipt 25 tot 30 bp verder dan deze herkenningssite. 50

De klasse II restrictieënzymen worden gebruikt bij het digereren van pDNA of genomisch DNA, in de bijhorende buffer met de gepaste concentratie. Restrictieënzymen knippen een DNA-molecule steeds tot een 3’hydroxyluiteinde (3’NOH) en een gefosforyleerd 5’-uiteinde (5’pN). Mogelijke verknippingswijzen kunnen: (1) aanleiding geven tot effen eindjes (blunt ends), (2) of kunnen palindromisch gebeuren, waarbij t.o.v. een denkbeeldige symmetriepunt wordt geknipt, en waarbij overhangende eindjes ontstaan (sticky of protruding ends). De geschikte reactietemperatuur voor de meeste enzymen bedraagt 37°C. De toegepaste in vitro DNA-digesten worden uitgevoerd met restrictie-endonucleasen van de firma’s Biolabs of Pharmacia. De Pharmacia restrictieënzymen werken optimaal in de bijgevoegde OPA-buffer (One Phor All buffer: 100 mM Tris-acetaat, 100 mM Mg-acetaat en 500 mM Ka-acetaat). De Biolabs restrictieënzymen werken optimaal in de bijgeleverde buffers (zie tabel 2.I.). Enzym

Herkenningsplaats

Buffer

Samenstelling van de buffer

50 mM potassium acetate, 20 mM TrisNEBuffer 4 acetate, 10 mM magnesium acetate, 1 mM ApaI 5’ GGGCC C 3’ + BSA dithiothreitol (pH 7.9, 25°C). Het mengsel voorzien van 100 µg/ml BSA. NEBuffer 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM BamHI 5’ G GATCC 3’ BamH I + MgCl2, 1 mM dithiothreitol (pH 7.9, 25°C). BSA Het mengsel voorzien van 100 µg/ml BSA. 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM BglI 5’ A GATCT 3’ NEBuffer 3 MgCl2, 1 mM dithiothreitol (pH 7.9, 25°C). 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM BglII 5’ A GATCT 3’ NEBuffer 3 MgCl2, 1 mM dithiothreitol (pH 7.9, 25°C). NEBuffer 50 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, 10 mM EcoRI 5’ G AATTC 3’ EcoR I MgCl2, 0.025% Triton X-100 (pH 7.5, 25°C). 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM HindIII 5’ A AGCTT 3’ NEBuffer 2 MgCl2, 1 mM dithiothreitol (pH 7.9, 25°C). 10 mM Bis Tris Propane-HCl, 10 mM NaeI 5’ GCC GGC 3’ NEBuffer 1 MgCl2, 1 mM dithiothreitol (pH 7.0, 25°C). 50 mM potassium acetate, 20 mM TrisNcoI 5’ C CATGG 3’ NEBuffer 4 acetate, 10 mM magnesium acetate, 1 mM dithiothreitol (pH 7.9, 25°C). 50 mM potassium acetate, 20 mM TrisNdeI 5’ CA TATG 3’ NEBuffer 4 acetate, 10 mM magnesium acetate, 1 mM dithiothreitol (pH 7.9, 25°C). 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM PstI 5’ CTGCA G 3’ NEBuffer 3 MgCl2, 1 mM dithiothreitol (pH 7.9, 25°C). 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM NEBuffer 3 PvuI 5’ CGAT CG 3’ MgCl2, 1 mM dithiothreitol (pH 7.9, 25°C). + BSA Het mengsel voorzien van 100 µg/ml BSA 5'CAG CTG 3' 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM PvuII NEBuffer 2 MgCl2, 1 mM dithiothreitol (pH 7.9, 25°C). SacI 5’ GAGCT C 3’ NEBuffer 1 10 mM Bis Tris Propane-HCl, 10 mM 51

Temperatuur 25°C

37°C 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C 37°C

+ BSA

SacII SalI SmaI XbaI

MgCl2, 1 mM dithiothreitol (pH 7.0, 25°C). Het mengsel voorzien van 100 µg/ml BSA 50 mM potassium acetate, 20 mM Tris5’ CCGC GG 3’ NEBuffer 4 acetate, 10 mM magnesium acetate, 1 mM dithiothreitol (pH 7.9, 25°C). 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM NEBuffer 5’ G TCGAC 3’ MgCl2, 1 mM dithiothreitol (pH 7.9, 25°C). Sal I + BSA Het mengsel voorzien van 100 µg/ml BSA 50 mM potassium acetate, 20 mM Tris5’ CCC GGG 3’ NEBuffer 4 acetate, 10 mM magnesium acetate, 1 mM dithiothreitol (pH 7.9, 25°C). 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM NEBuffer 2 5’ T CTAGA 3’ MgCl2, 1 mM dithiothreitol (pH 7.9, 25°C). + BSA Het mengsel voorzien van 100 µg/ml BSA

37°C 37°C 25°C 37°C

Tabel 2.I. De gebruikte restrictie-enzymen: benaming, knipplaats, overeenkomstige buffer, buffersamenstelling en –temperatuur (New England Biolabs).

4.2. CIP-reactie. 4.2.1. Principe Het Calf Intestinal Phosphatase-enzym elimineert hydrolytisch de 5’ fosfaatgroepen van lineair DNA zodat circularisatie (zelfsluiting) van de vector, indien het geknipt werd met één enkel restrictie-enzym, niet kan optreden tijdens de ligatiereactie. CIP is een dimeer glycoproteïne, waarbij elk monomeer een Zn-atoom draagt, noodzakelijk voor de activiteit van het enzym. CIP wordt geïnactiveerd bij 75°C gedurende 10 min in aanwezigheid van 5mM EDTA (pH 8.6). 4.2.2 Materiaal. Reactiemengsel : 20 µl pDNA digest (gezuiverd met QIAquick) x µl CIP 3 µl NEBuffer 3 30 µl totaal. Samenstelling 10 X CIP defosforylatiebuffer: 1mM ZnCl2 10mM MgCl2 0.5M Tris-HCl (pH 8.3) 10mM spermidine 4.2.3. Methode. De vector wordt gelineariseerd met een restrictie-enzym, waarna CIP wordt toegevoegd in de hoeveelheid bepaald door de formule: µgDNA × 3.04 = pmol eindjes grootte DNA in kb waarbij 0.01U/pmol eindjes worden toegevoegd. 52

Protocol: • 1 uur incuberen bij 37°C. • Hitteschok bij 65°C gedurende 15 min om enzym te inactiveren (+ 2 µl 0.5 M EDTA toevoegen) 4.3. PCR (‘Polymerase Chain Reaction’). 4.3.1. Principe. De PCR-reactie is een techniek die gebruikt wordt om een DNA-segment tussen twee regio’s met gekende sequentie te amplificeren (Sambrook et al., 1989) (zie figuur 2.3.). Twee oligonucleotiden worden gebruikt als primers voor een reeks synthetische reacties die gekatalyseerd worden door het DNA-polymerase. Deze primers bevatten sequenties die het te vermenigvuldigen segment flankeren, en die gedeeltelijk of geheel complementair zijn aan sequenties gelegen op de tegenovergestelde strengen van het template-DNA. De specificiteit wordt bepaald door de sequentie van de primers, die een bepaalde graad van degeneratie vertonen. (1) Denaturatie: Opdat deze initiële complementatie tussen template en primer kan optreden, wordt het template-DNA eerst gedenatureerd bij hoge temperatuur (95°C) in aanwezigheid van de twee oligonucleotideprimers en de vier dNTP’s. Een te lange denaturatieperiode kan breuken in het DNA brengen, waardoor verhoogde incorporatie van nucleotiden zal optreden. Voor volledige denaturatie van genomische DNA is althans een langere tijd nodig, zodat bij de volgende PCR-cycli kortere denaturatietijden nodig zijn. Dit komt omdat het genomisch DNA na de eerste denaturatie niet meer volledig renatureert. Indien het polymerase pas in de eerste cyclus wordt toegediend (hot start) worden mismatch incorporaties vermeden. Aldus wordt de specificiteit verhoogd. (2) Hybridisatie: Het reactiemengsel wordt vervolgens gekoeld tot een temperatuur, de annealing temperatuur, waarbij de primers specifiek met de complementaire plaatsen op de templatemoleculen kunnen associëren. De temperatuur bij deze stap is heel kritisch, omdat bij een te hoge temperatuur geen hybridisatie kan optreden, en bij een te lage temperatuur aspecifiek wordt gehybridiseerd. (3) Elongatie: Het geheel wordt dan opgewarmd tot 72°C, de temperatuur waarbij de primers verlengd kunnen worden met DNA-polymerase. De verlenging gebeurt door inbouw van nucleotiden aan het 3’-uiteinde (Contreras, R., 1998). De meeste polymerasen hebben een extensiesnelheid van 1000 nucleotiden per minuut.

53

Figuur 2.3. Illustratie van het PCR-principe (Lodish et al., 1995)

Een vooraf bepaald aantal cycli van denaturatie, annealing, en polymerase activiteit wordt doorlopen. Er moet rekening worden gehouden met het feit dat het aantal ongewenste producten zal toenemen met het aantal cycli. Elke geproduceerde streng fungeert als template voor de volgende cyclus, zodat een logaritmische amplificatie wordt bekomen van het beoogde fragment. Op het einde wordt de toename echter lineair, omdat de concentratie aan PCR-product hoger wordt dan de concentratie aan DNA-polymerase. Na de laatste hybridisatiecyclus wordt normaal afgekoeld tot 4°C (Contreras, 1998).

54

Het gebruikte Taq DNA-polymerase is een DNA-afhankelijk DNA-polymerase geïsoleerd uit Thermophilus aquaticus die thermostabiel is tot ongeveer 90°C. Het enzym vertoont volgende activiteiten: • •

Polymerase activiteit in 5’ → 3’ richting Exonuclease activiteit in 5’ → 3’ richting

Het bouwt meer fouten in dan het Pwo DNA-polymerase omdat het niet over een 3’ → 5’ exonuclease activiteit beschikt, die als proofreading wordt gebruikt. Het Taq DNA-polymerase voegt aan het 3’ uiteinde van dsDNA een enkel nucleotide toe, meestal een adenosine. Dit overhangend residu kan ligatie vergemakkelijken wanneer de kloneringsvector de complementaire thymidinebase bevat, zoals dit het geval is met de pGEM-T vector (Promega) (Sambrook et al., 1989). Het Pwo DNA-polymerase dat uit de thermofiele archaebacterie Pyrococcus woesei werd geïsoleerd wordt eveneens in PCR amlificatiereacties aangewend, en bezit volgende eigenschappen: • • •

Polymerase activiteit in 5’ → 3’ richting Exonuclease activiteit in 3’ → 5’richting ( = proofreading activiteit). Er is geen exonuclease activiteit in 5’ → 3’ richting.

Het Pwo DNA-polymerase bezit een verhoogde thermische stabiliteit met een halfwaardetijd van meer dan twee uur bij 100°C, terwijl het Taq DNA-polymerase bij deze temperatuur slechts een halfwaardetijd heeft van minder dan vijf minuten. 4.3.2. Principe van chimeer PCR. Het principe voor de constructie van chimere primers in een tweestapsreactie (figuur 2.4., Pont-Kingdon, 1994): Het betreft een variant op de methode van de recombinante PCR-amplificatie, gebaseerd op de vorming van een chimeer product uitgaande van twee verschillende template-moleculen. In deze benadering wordt een chimere primer gebruikt die aan het 5’ en aan het 3’ uiteinde homologie vertoont met de templates die gefusioneerd moeten worden. Op deze manier kan eveneens een deletiemutatie in 1 template worden ingebouwd, waarbij de chimere primer homologie vertoont met beide kanten rond een deletiesite, zodat het chimere PCR-construct de beoogde deletie vertoont.

55

Figuur 2.4. Detailweergave van de recombinante tweestaps PCR methode (PontKingdon, 1994)

De 3’ helft van de chimere primer associeert met de eerste template (volle lijn in Fig. 2.4.) en de 5’ helft associeert met de tweede template (stippellijn in Fig. 2.4.). In de eerste PCRreactie zullen de buitenste primer (I in Fig. 2.4.) en de chimere primer (II in Fig. 2.4.) associëren met de eerste template, zodat een eerste PCR-product kan gevormd worden. Dit eerste PCRproduct, in combinatie met de tweede template (stippellijn in Fig. 2.4.) en de twee buitenste primers (I en III in Fig. 2.4.) worden in de tweede PCR-reactie gemengd, zodat het uiteindelijke chimere product kan worden gevormd. In deze tweede reactie associeert het 3’ einde van een streng van het eerste PCR-product met de tweede template, waarna dNTP’s de streng verder zullen invullen, complementair met de tweede streng. •

Primers die gebruikt werden bij het amplificeren van de doelfragmenten (tabel 2.II):

Primer

Sequentie

Chimere primer CHIMCCI

5'A G C C T G G T A A T T G A C G G C G G C G C C G G C G T T G G A T G C 3' 5’ G C T A G A T C T T C A C T T G G A T T G G C C A C A 3’ (BglII) 5’ T C A A C C A T G G C C C A A A G C A C C C C G 3’ (NcoI)

CYTSTBGL SignChrNco C551N

5’ T T C C A A C C A C A G G A G A A C C C A 3’ 56

C551C

5’ T T C T T A T T T T C T T G G A T G C C G G 3’

C551OmpA

5’ G C C G T C A A T T A C C A G G C T 3’

C551EcoRI

5’ G C C T T A A G T T A T T T T C T T G A T G C C G G 3’ (EcoRI)

FlavotepN

5’ A T G G G A A A T A C G A T T T C T C G C 3’

FlavotepC

5’ A C C C C A G G T G T C C T G T G A A A T 3’ Tabel 2.II. De gebruikte primers ter synthese van de PCR-produkten

4.3.3. Reactiemengsel: •

•

• • •

Primers : (upper primer & lower primer) De sequentie en de combinatie van beide primers bepalen voornamelijk de efficiëntie van de PCR-reactie. Er moet op gelet worden dat beide primers niet complementair of zelfcomplementair zijn. Ook zal een gelijkwaardige Tm voor beide primers voordelig zijn voor de reactie (evenwichtige verdeling van het A/T en G/C gehalte) Reactiebuffer : 500 mM KCl 15 mM MgCl2 100 mM Tris-HCl, pH 9.0 Template-DNA: kan zowel chrDNA als gedigereerd pDNA zijn, maar het DNA is steeds dubbelstrengig. DNA-polymerase: Taq DNA-polymerase of Pwo DNA-polymerase. DNTP’s: 10mM

4.4. Ligatie. Een ligatiereactie van vreemd DNA in een gelineariseerde plasmidevector houdt in dat nieuwe bindingen worden gevormd tussen fosfaat residu’s op 5’ termini van dubbelstrengig DNA en tegenoverliggende 3’-OH helften. Als beide strengen van het plasmide 5’P-residus dragen, zullen 4 nieuwe fosfodiësterbindingen worden gegenereerd. Indien het plasmide DNA d.m.v. CIP gedefosforyleerd geweest is, zullen slechts 2 nieuwe fosfodiësterbindingen gevormd worden. De resulterende hybride moleculen bevatten 2 enkelstrengige knippen, welke hersteld worden nadat de hybriden worden getransformeerd in de competente bacterie. Bacteriofaag T4 DNA ligase katalyseert de vorming van fosfodiësterbinding tussen dsDNA-fragmenten met een 5’P-groep en een 3’OH-groep, ontstaan na restrictieënzymdigestie in vitro. T4 DNA-ligase bezit geen exonuclease activiteit. T4 DNA ligase is in staat twee strengen die met overhangende eindjes door een endonuclease werden geknipt (“sticky ends”), opnieuw te ligeren door een nieuwe fosfodiësterbinding te vormen. Het kan eveneens twee complementaire strengen ligeren die recht tegenover elkaar een breuk vertonen (“blunt ends”), maar met een verminderde efficiëntie dan bij het ligeren van overhangende eindjes. Overhangende eindjes kunnen opgevuld worden door een polymerase enzym, en als blunt eindjes geligeerd worden. 57

Het ligatiemengsel bevat: • T4 DNA-ligase (3U/µl, Promega) • T4 DNA-ligasebuffer: 300mM Tris-HCl, pH7.8 100mM MgCl2 100mM DTT 5mM ATP • Insert • Gedigereerd pDNA (vectorplasmide) De hoeveelheid insert die nodig is voor ligatie met de vector wordt berekend met de formule: ng (vector ) × kb(insert ) 3 × = ng (insert ) kb(vector ) 1 Ligatiemengsel :

2 µl T4-DNA ligase (10x buffer) x µl vector (50ng) x µl PCR-product 1 µl T4-DNA ligase x µl H2O 20 µl totaal reactiemengsel Sticky ligaties worden overnacht bij 4°C geligeerd, terwijl blunt ligatiereacties overnacht bij 23°C worden uitgevoerd.

5. Transformatie. 5.1. Transformatie via elektroporatie. 5.1.1. Eigenschappen en efficiëntie van de methode. • • •

De efficiëntie ligt 10 tot 20 keer hoger dan bij chemische transformatie. De techniek wordt uitgevoerd bij lage temperatuur (0-4°C). Het DNA wordt gemengd met een koude celsuspensie en overgebracht naar een ijsgekoelde kuvet.

Optimale condities voor bacteriële transformatie vraagt kleine volumes (20-40 µl) waarvoor speciale hoog-voltage mini-elektrodes en monsterhouders werden ontworpen (Dower et al., 1988), die commercieel beschikbaar zijn. De efficiëntie wordt bepaald door: •

• •

De sterkte van het elektrisch veld: bij te hoog voltage gaan de celmembranen op irreversibele manier kapot. Voor de meeste cellijnen bekomt men een maximale expressie bij voltages tussen 250V/cm en 750V/cm. Algemeen bedraagt de overlevingskans van de cellen 20% tot 50%. De duur van de elektrische puls. Normaliter wordt slechts een enkele puls gegeven. De temperatuur: een maximale hoeveelheid transformanten worden bekomen bij 0°C. 58

• •

Conformatie en concentratie van het DNA: enkel circulair DNA kan worden getransformeerd waarbij effectieve transfectie wordt bekomen met een concentratie van het DNA gaande van 1µg/ml tot 40µg/ml. Ionische samenstelling van het medium: de efficiëntie wordt verhoogd bij suspensie van de cellen in gebufferde zoutoplossing in plaats van een gebufferde oplossing van niet-ionische stoffen zoals mannitol of sucrose.

Het voordeel van de elektroporatietechniek is dat de methode goed kan worden toegepast op cellijnen die niet bruikbaar zijn met andere technieken, zoals Ca-fosfaat-DNA coprecipitatie. 5.1.2. Bereiding van elektrocompetente cellen. • • • • • • • • • •

De gewenste E. coli stam wordt overnacht opgegroeid in 5 ml LB bij 37°C. 200 ml LB in een erlenmeyer van 1 liter wordt geënt met 2ml gegroeide cultuur, waarna de cellen geïncubeerd worden bij 37°C en 220 tpm tot een OD600 van 0.6 tot 0.8 bereikt wordt. De fles wordt op ijs gekoeld gedurende 15 à 30 min. De cellen worden gecollecteerd door centrifugatie gedurende 15 min bij 4°C en 2600 tpm. Na verwijderen van het supernatans wordt de pellet geresuspendeerd in een equivalent volume ijskoude steriele MQ (200ml). Opnieuw centrifugeren gedurende 10 min bij 4°C en 2600 tpm. Resuspenderen in 200ml ijskoude steriele MQ en opnieuw centrifugeren gedurende 10 min. Resuspenderen in een totaal volume van 20 ml ijskoude 10% glycerol en opnieuw centrifugeren; supernatans voorzichtig afgieten. De pellet wordt geresuspendeerd in 500 µl 10% ijskoude glycerol. De epjes worden verdeeld per 40 µl (bewaard bij -20°C) en bewaard bij -80°C.

5.1.3. Elektroporatie-protocol. • • • • • •

Voorbereiding bij wit/blauw screening: aan de agarplaten met antibioticum wordt met 100 mM IPTG en 50 mg/ml X-gal toegevoegd. 1/10 van de ligatie wordt aan 40 µl competente cellen toegevoegd, en overgebracht naar een gekoelde elektroporatiekuvet. De kuvet wordt in het elektroporatietoestel gebracht. Parameters van het toestel: 2.5 kV, 200Ω, 25 µF. Na de elektrische puls, wordt de tijdsconstante gecontroleerd: +/- 5,0. Er wordt onmiddellijk 1 ml SOC of LB toegevoegd om de cellen te laten recupereren, en de suspensie wordt overgebracht in een 10 ml buisje. De buisjes worden al schuddend 1 uur geïncubeerd bij 37°C. 100 µl wordt uitgeplaat op een LB-plaat met het passende antibioticum en geïncubeerd bij 37°C.

5.2. Transformatie via de CaCl2-methode. 5.2.1. Principe. E. coli stammen kunnen competent gemaakt worden om exogeen pDNA op te nemen, door de cellen in hun omgeving bloot te stellen aan 50 mM CaCl2, gevolgd door een hitteschok (Mandel, 1970). Tot 1010 transformanten per µg DNA dat getransformeerd moet worden kan met de huidige technieken bekomen worden. Er worden normaal tot ongeveer 1% van de populatie getransformeerd (Sambrook et al., 1989). 59

5.2.2. Bereiding van competente cellen d.m.v. de CaCl2 methode. • •

Een E.coli cultuur van 2ml wordt geënt in 200 ml LB (1/100 enting), welke bij 37°C en 220 tpm wordt geïncubeerd tot een O.D. waarde van 0.5-0.8. Deze cultuur wordt gecentrifugeerd bij 4°C. De cellen worden opgenomen in 60 ml CPGoplossing. CPG-oplossing: 100 mM KCl 50 mM CaCl2.2H2O 10% glycerol 10 mM Kalium acetaat (pH 7,5) finale pH = 6,2 Oplossing filtreren met een bacteriefilter (doorsnede = 0,22 µm)

• • •

De oplossing wordt 30 min op ijs gehouden. De cellen worden gecentrifugeerd bij 4°C. De cellen worden opgenomen in 1 ml CPGoplossing. Het geheel wordt ingevroren bij -80°C in porties van 100 µl.

5.2.3. Protocol voor CaCl2-Transformatie. • • • • • •

1/2 van het ligatieproduct wordt toegevoegd aan 100 µl cellen Het mengsel wordt 1 uur op ijs gehouden. De transformatie wordt gecontroleerd 1 min bij 42°C in een warmwaterbad gehouden. Het mengsel wordt opnieuw op ijs geplaatst gedurende 2 min, en 900 µl SOC-medium wordt toegevoegd om de cellen te laten recupereren. De getransformeerde cellen worden 1 uur geïncubeerd bij 37°C en 220 tpm. 100 µl wordt uitgeplaat op selectieve platen.

6. Agarosegelelektroforese. 6.1. Principe Deze scheidingstechniek wordt uitgevoerd om DNA-moleculen van verschillende grootte te scheiden in aanwezigheid van een moleculaire DNA-merker (Sambrook et al., 1989). Het kan enerzijds preparatief gebruikt worden als zuiveringsmethode, en anderzijds analytisch om de DNA-fragmenten op grootte te karakteriseren. Agarose is een lineair polymeer (zie figuur 2.5.) dat geëxtraheerd wordt uit zeewierbereidingen.

Figuur 2.5. Structuur van agarose.

60

Het agarosepoeder wordt oplosbaar gemaakt in een TAE-buffer bij kooktemperatuur, waarna bij het afkoelen (en stollen) de densiteit van de agarosematrix wordt bepaald door de concentratie aan agarose dat in de TAE-buffer werd opgelost. Algemeen komen DNA-moleculen voor in drie vormen, namelijk (I) De superhelicale circulaire vorm. (II) De circulaire vorm met één knip in één van beide strengen. (III) De lineaire vorm. Verschillende DNA-moleculen met dezelfde moleculaire grootte kunnen in elk van deze drie vormen voorkomen, waarbij elke vorm een ander mobiliteitspatroon in agarosegels vertoont. Het DNA bezit inherente negatief geladen fosfaatgroepen. In een elektrisch veld zullen de negatief geladen DNA-moleculen naar de anode migreren. De elektroforese wordt bij alkalische pH uitgevoerd zodat de nucleïnezuren negatief geladen en in dubbelstrengige toestand blijven. De mobiliteit van de DNA-moleculen is, naast een functie van de agaroseconcentratie in het gel, ook afhankelijk van • • •

de aangelegde stroomsterkte, de ionensterkte van de buffer, en de densiteit van de superhelicale twists in de superhelicale circulaire vorm van het DNA.

Bij een relatief lage spanning is de mobiliteit van lineaire DNA-moleculen in het agarose proportioneel met de aangelegde spanning. Bij een toename van de elektrische veldsterkte gaat deze proportionaliteit niet meer in dezelfde mate op, zodat een verlies van effectieve scheiding kan worden waargenomen bij een verhoogd voltage. De elektroforetische mobiliteit van DNA-moleculen in een oplossing van lage ionensterkte is heel laag, in tegenstelling tot buffers van hoge ionensterkte, waar het scheidingsvermogen duidelijk hoger is wegens de grote geleidbaarheid in de oplossing aanwezig. Indien echter de ionenconcentratie in de loopbuffer te hoog wordt aangemaakt, bestaat de mogelijkheid dat de agarosegels gaan smelten onder invloed van de verhoogde geleidbaarheid en daarmee gepaard gaande excessieve warmteontwikkeling. De TAE loopbuffer heeft een beperkte buffercapaciteit. Daarom moet deze buffer regelmatig vervangen worden om een relatief constante scheidingsresolutie te behouden. Aan de agarose-oplossing wordt Ethidium Bromide (EtBr) toegevoegd tot een concentratie van 0.5µg/ml, zodat de nucleïnezuurfragmenten zichtbaar worden onder UV-licht. EtBr is een planaire molecule die tussen de opeenvolgende basen van het nucleïnezuur intercaleert en onder UV-licht van 300nm fluoresceert. De mate van oplichting geeft ook een aanwijzing van de concentratie aan nucleïnzuren dat in het agarosegel aanwezig is. Dit houdt in dat hoe meer fragmenten van dezelfde grootte aanwezig zijn, hoe meer EtBr kan intercaleren, en bijgevolg hoe intenser het te detecteren signaal wordt. De ladingsbuffers die met de DNA-stalen gemengd worden bevatten een glyceroloplossing, welke dient om de monsters te verzwaren, en een kleurstof, welke toelaat de migratie van de fragmenten visueel op gel te volgen. 61

Om de grootte van de DNA-moleculen te meten, wordt naast het DNA een moleculaire gewichtsmerker meegelopen. Meestal wordt de λ Pst I lengtemerker of de SMART-ladder in dit opzicht gebruikt. 6.2. Materiaal. •

• •

• •

1X TAE-buffer (elektroforese buffer) pH 8.5: Tris-base: 48.4 g IJsazijnzuur: 11.42 ml Na2EDTA.2H2O: 7.44 g Aanlengen tot 1000 ml met dH2O Agarose poeder Ladingsbuffer I: 0.25% broomfenolblauw (deze merker migreert in agarosegels ondergedompeld in TAE met dezelfde snelheid als lineair dsDNA van < 500 bp). 30% glycerol Ladingsbuffer II: 0.25% xyleen cyanol FF (deze merker migreert in agarosegels ondergedompeld in TAE met dezelfde snelheid als lineair dsDNA van ongeveer 4 kb) 30% glycerol Ethidium bromide λ Pst I lengtemerker: bacteriofaag λ DNA geknipt met het restrictie-enzym PstI (figuur 2.6.).

Figuur 2.6. λ Pst I lengtemerker

•

SMART ladder (Eurogentec): een mengsel van DNA van verschillende oorsprong en grootte (figuur 2.7.).

62

Figuur 2.7. SMART ladder (Eurogentec)

6.3 Methode. • • • • • •

Agarosepoeder wordt opgekookt in TAE-buffer (1% voor pDNA en 0.7% voor chrDNA) waarna ethidiumbromide (10µg/ml) wordt toegevoegd. De warme agarose wordt in een gelhouder gegoten, waarin een kam gefixeerd wordt, waarbij door het stollen van de agarose slotjes ontstaan om de DNA-stalen in aan te brengen. Na afkoeling wordt de gel in een elektroforesebadje (gevuld met 1X TAE) gelegd. De stalen en λ Pst I worden gemengd met 3µl ladingsbuffer en in de slotjes geladen. Over de gel wordt een elektrisch veld (100V en 500mA) aangelegd: het DNA (negatief geladen) migreert naar de anode (positieve lading). Visualisering gebeurt door UV-licht en ethidiumbromide. Ethidiumbromide is een carcinogene fluorescente kleurstof waarvan de planaire groep intercaleert tussen de opeenvolgende baseparen. Aan de hand van UV-straling bij 254 of 302nm kan men het DNA visualiseren. Bij 254 nm wordt het UV-licht door het DNA geabsorbeerd en overgedragen aan het EtBr. Bij 302nm wordt het UV-licht geabsorbeerd door het EtBr zelf. Het DNA mag niet te lang onder UV-licht gehouden worden omdat het dan vlug afbreekt en mutaties kunnen optreden.

7. Zuivering van DNA. 7.1. see-DNA (Amersham). 7.1.1. Principe. Deze DNA-zuiveringsmethode is gebaseerd op de specifieke interactie tussen DNAmoleculen, waarbij het gecomplexeerde DNA gepelleteerd en gevisualiseerd kan worden in de alcoholprecititatiestap wegens de aanwezigheid van een kleurstof in het see-DNA mengsel. 7.1.2. Materiaal en Methode • •

Het ligatiemengsel wordt aangelengd tot een totaal volume van 100µl. Een equivalent volume fenol/chloroform/isoamylalcohol (25/24/1) wordt toegevoegd, en gemengd. 63

• • • • • • •

Het mengsel wordt gedurende 1 min gecentrifugeerd bij 14000 tpm, waarna het supernatans wordt afgenomen. 3 M NaOAc (pH 5.3) wordt toegevoegd tot een finale concentratie van 0.3 M. 2.5 volumes EtOH (100%) wordt toegevoegd. 1 µl see-DNA (Amersham) wordt toegevoegd, en 15 min bij –70°C bewaard. 15 min afcentrifugeren bij 4°C en 14000 tpm. 200 µl 70% EtOH wordt toegevoegd. Afcentrifugeren en oplossen in 20 µl dH2O.

7.2. QIAquick 7.2.1. Principe QIAquick-kits worden gebruikt voor het zuiveren van nucleïnezuren. Hierbij worden hoge rendementen behaald, wat zeer geschikt is voor rechtsreeks gebruik in downstream toepassingen zoals restrictie, labeling, hybridisatie, PCR, ligatie en transformatie. Specifieke buffers, geoptimaliseerd voor efficiënte DNA-recuperatie en het verwijderen van onzuiverheden in verscheidene toepassingen, worden meegeleverd. Nucleïnezuren absorberen aan silica-gel oppervlakken in aanwezigheid van hoge concentraties chaotrope zouten. Tot 10 µg DNA kan op een QIAquick-kolom binden. Adsorptie van DNA op silica is afhankelijk van de pH. De bindingsefficiëntie bij adsorptie bedraagt 95% bij een pH kleiner dan 7.5 (zie figuur 2.8.). Deze pH wordt gereguleerd door de bindingsbuffer.

Figuur 2.8. pH afhankelijkheid van DNA binding aan silica

Buffer PB katalyseert efficiënte binding van enkelstrengige en dubbelstrengige nucleïnezuren tot 10 kilobaseparen, en verwijdert primers tot 40 baseparen. Tijdens de DNA-adsorptiestap komen ongewenste primers en onzuiverheden (zouten, enzymen, niet-geïncorporeerde nucleotiden, agarose, kleurstoffen en detergenten zoals DMSO en Tween20) door de filter heen. Zouten worden in een bijkomende wasstap kwantitatief verwijderd door behandeling met de ethanol-bevattende buffer PE. Overtollige PE wordt verwijderd door een extra centrifugatie.

64

De elutie-efficiëntie is afhankelijk van de concentratie van het zout en van de pH van de elutiebuffer. In tegenstelling tot adsorptie, is elutie het meest efficiënt in alkalische omstandigheden en onder lage zoutconcentraties. Het rendement van de elutie van het DNA is afhankelijk van 3 factoren: - het volume van de elutiebuffer, - de manier waarop de buffer wordt toegevoegd op de kolom, - de incubatietijd van de buffer op de kolom. Indien de minimale hoeveelheid aan elutievloeistof wordt gebruikt (d.i. 30 µl), wordt een bijkomende incubatieperiode (bij kamertemperatuur) aanbevolen van 1 minuut om een maximale elutie-efficiëntie te garanderen. 7.2.2. Materiaal en Methode. • • • • • •

Aan een oorspronkelijk volume pDNA wordt dH2O toegevoegd tot 100µl. 5 volumes buffer bindingsbuffer PB worden toegevoegd aan dit ene volume pDNA en gemengd. Het mengsel wordt aangebracht op een QIAquick Spin kolom dat in het overeenkomstig 2mlbuisje wordt geplaatst. Het DNA bindt aan de silicamatrix, terwijl enzymen, zouten, nucleotiden en primers niet weerhouden worden. Centrifugeren gedurende 60 seconden bij 14000 tpm, waarna het geëlueerde wordt verwijderd. Wasstap: 0.75 ml wasbuffer PE wordt toegevoegd op de kolom, waarna 60 sec wordt gecentrifugeerd en de wasbuffer wordt verwijderd. Er wordt opnieuw gecentrifugeerd om alle resten te elimineren. De kolom wordt op een leeg epje geplaatst. Het DNA wordt geëlueerd met 20µl MQ of elutiebuffer (= 10mM Tris-HCl, pH 8.5), waarna een minuut geïncubeerd wordt gevolgd door een laatste centrifugestap. De elutie is het meest efficiënt bij pH 8.5.

7.3. QIAEX II Gel Extraction kit. 7.3.1. Principe. Het principe van deze procedure is gebaseerd op het vloeibaar maken van agarose, waarbij een selectieve en kwantitatieve adsorptie van nucleïnezuren aan de silica-gelpartikels van QIAEX II in aanwezigheid van hoge zoutconcentraties optreedt. Elutie van het DNA gebeurt met een lage zoutoplossing zoals H2O. Deze procedure wordt gebruikt om DNA-fragmenten van 40 bp tot 50 kb te extraheren uit 0.3-2% agarosegels in TAE (Tris-acetaat/EDTA) buffer. Het agarosegel wordt oplosbaar gemaakt door 3 volumes buffer QX1 aan 1 volume gel toe te voegen, en door 10 min bij 50°C te incuberen. Het oplossen van de gelmatrix is gebaseerd op het principe dat de hoge concentratie aan chaotroop zout in buffer QX1 de waterstofbindingen tussen suikers in het agarosepolymeer verbreekt. Bij deze hoge zoutconcentratie dissociëren eveneens de DNA-bindende eiwitten van de DNA-fragmenten. Er wordt een incubatietijd van 10 min gebruikt om de adsorptie van DNA aan de QIAEX II partikels toe te laten. Adsorptie van DNA aan glas of silicagel in hoge zoutconcentratie is een algemeen gekend fenomeen. Een waterige oplossing met een hoge concentratie elektrolyten modificeert de normale structuur van water, zodat in een dergelijke oplossing het DNA gedwongen wordt aan 65

de silica-partikels te binden. Adsorptie vergemakkelijkt door de zoutconcentratie te lagere zoutconcentraties adsorberen. Deze afhankelijk. De efficiëntie is normaal 95% drastisch bij hogere pH.

van fragmenten kleiner dan 100 bp wordt verhogen, terwijl fragmenten groter dan 4kb bij adsorptie van DNA aan silicadeeltjes is pHwanneer de pH < 7.5 bedraagt, en vermindert

Buffer QX1 bevat een pH indicator die gemakkelijk de optimale pH voor DNA binding toelaat te bepalen. DNA adsorptie wordt enkel waargenomen bij pH < 7.5 en de pH indicator kleurt geel in dit pH-gebied. Wanneer de pH > 7.5, kleurt het mengsel oranje of violet. Deze pH kan bereikt worden als de agarosegelelektroforesebuffer te frequent gebruikt wordt of niet correct bereid werd. In dit geval kan gecorrigeerd worden door een klein volume 3 M natriumacetaat, pH 5.0, toe te voegen. De kleurindicator interfereert niet met de DNAbindingsefficiëntie en wordt volledig verwijderd bij het wassen. In de adsorptiestap bindt het DNA aan de glaspartikels, terwijl alle onzuiverheden (agarose, proteïnen, EtBr en zouten) in het supernatans terechtkomen. De wasstap met de QX1buffer (hoge zoutconcentratie) verwijdert de agarosematrix, terwijl de twee opeenvolgende wasstappen met buffer PE, welke ethanol bevat, de zoutcontaminanten verwijdert. Na deze wasstappen wordt de pellet (de QIAEX II partikels die het geadsorbeerde DNA bevatten) aan de lucht gedroogd om alle sporen ethanol te verwijderen, die met de enzymatische reacties kunnen interfereren. De elutie-efficiëntie is afhankelijk van de pH, van de zoutconcentratie, en van de temperatuur. Elutie gebeurt best in alkalische omstandigheden en onder lage zoutconcentratie, in tegenstelling tot adsorptie. De maximale elutie-efficiëntie wordt bereikt bij een pH tussen 7.0 en 8.5. DNA-fragmenten kleiner dan 4 kb worden geëlueerd met 70-95% efficiëntie bij kamertemperatuur, terwijl de incubatietemperatuur voor fragmenten groter dan 4kb best tot 50°C wordt verhoogd. 7.3.2. Materiaal. Samenstelling van de bufferoplossingen: Bindingsbuffer (QXI): • 3 M guanidine-thiocyanaat • 10 mM Tris-HCl, pH 6.6 • 5% ethanol Wasbuffer (PE): • 20 mM NaCl • 2mM Tris-HCl, pH 7.5 7.3.3. Methode. • •

De DNA-band overeenkomend met het gewenste fragment wordt uit het agarosegel gesneden met een steriele scalpel. 3 volumes buffer QX1 worden toegevoegd aan 1 volume gel voor DNA-fragmenten van 100bp – 4kb. Voor andere fragmentgrootten, geldt: DNA-fragmenten < 100 bp

6 volumes buffer QX1 66

DNA-fragmenten > 4kb > 2% agarose gels •

QIAEX II partikels suspenderen door 30 sec te vortexen. De gehaltes QIAEX II partikels die nodig zijn voor het mengsel, worden als volgt weergegeven: < 2 µg DNA 2-10 µg DNA Elke 10µg supplementair DNA

• • • • • •

•

10 µl QIAEX II toevoegen 30 µl QIAEX II toevoegen 30 µl extra QIAEX II toevoegen

Er wordt 10 min geïncubeerd bij 50°C om de agarose op te lossen en om het DNA te binden aan de matrix. Elke 2 min wordt gemengd om QIAEX II - partikels in oplossing te houden, en men houdt de kleur in het oog. De suspensie wordt 30 sec gecentrifugeerd, en het supernatans wordt voorzichtig verwijderd met een pipet. De pellet wordt met 500µl buffer QX1 gewassen, en 30 sec gecentrifugeerd, waarna het supernatans wordt verwijderd. De pellet wordt een tweede keer met 500 µl buffer PE gewassen. De pellet wordt aan de lucht gedroogd tot een witachtige kleur bekomen is. 20µl H2O wordt toegevoegd om het DNA te elueren van de matrix. Het DNA wordt opgelost, waarna moet geïncubeerd worden: DNA-fragmenten < 4 kb DNA-fragmenten 4-10 kb DNA-fragmenten > 10 kb

•

3 volumes buffer QX1 + 2 volumes H2O 6 volumes buffer QX1

5 min bij kamertemperatuur 5 min bij 50°C 10 min bij 50°C

Er wordt 30 sec gecentrifugeerd en het supernatans (het geëlueerde DNA) wordt in een vers epje gebracht. Optioneel kunnen de 2 laatste stappen herhaald worden: een tweede elutiestap verhoogt de opbrengst met ongeveer 10-15%

7.4. QIAquick Gel Extraction kit. 7.4.1. Principe. Deze techniek werd opgesteld om DNA-moleculen van 70bp tot 10 kb uit standaard agarosegels in TAE-buffers te elueren. 7.4.2. Materiaal en Methode. • •

Het gewenste DNA-fragment wordt uit de agarosegel gesneden met een propere, steriele scalpel, en wordt ondergebracht in eppendorfjes. 3 volumes buffer QG worden per volume agarose toegevoegd. Er wordt gesteld dat aan 100 mg agarosegel ongeveer 100 µl buffer QG moet worden toegevoegd. De volumes worden 10 min in een warmwaterbad geïncubeerd bij 50°C. De volledige oplossing van het gel kan worden vereenvoudigd door de epjes om de 2 min om te draaien. Als de kleur van het mengsel oranje of paarsachtig wordt moet 3M Na-acetaat, pH 5.0, toegevoegd worden totdat de kleur opnieuw geel wordt en het mengsel daarbij de goede pH aanneemt. De absorptie van 67

•

• • • • •

het DNA op de QIAquick membranen is alleen efficiënt bij pH waarden < 7.5. Buffer QB bevat een pH indicator welke geel is bij pH < 7.5 en oranje of violet bij hogere pH. Op deze manier kan eenvoudig de meest optimale pH voor DNA-binding gecontroleerd worden. Nadat de agarose volledig vloeibaar is geworden, wordt 1 volume isopropanol aan het mengsel toegevoegd en gemengd. Deze stap laat toe dat DNA-fragmenten < 500 bp en > 4 kb efficiënt aan de membranen gebonden worden. De binding van fragmenten tussen 500 bp en 4 kb op de membranen wordt niet verbeterd door toevoegen van isopropanol. Het mengsel wordt op een QIAquick spin kolom aangebracht (maximaal 800 µl), welke op een overeenkomstige 2 ml collecteerbuisje werd gebracht. Het geheel wordt gedurende 1 min gecentrifugeerd. Het DNA bindt in deze stap op de kolom, en het eluaat wordt verwijderd. Er kan optioneel 500 µl buffer QG op de kolom worden aangebracht om alle agaroseresten te verwijderen. 750 µl (was-)buffer PE worden op de kolom gepipetteerd om contaminanten te verwijderen, waarna de kolom wordt gecentrifugeerd. De kolom wordt andermaal gecentrifugeerd om alle vloeistof uit de kolom te verwijderen. De kolom wordt op een 1.5 ml eppendorfje gebracht. 30 µl buffer EB (10 mM Tris-HCl, pH 8.5) of H2O worden midden op de membraan van de kolom aangebracht en gedurende 1 min geïncubeerd bij kamertemperatuur, waarna 1 min wordt gecentrifugeerd. De elutie is pHafhankelijk. Een maximale elutie-efficiëntie wordt bereikt tussen pH 7.0 en 8.5.

8. Southernblotting en hybridisatie. 8.1 Southernblotting 8.1.1. Principe. De meeste hybridisatietoepassingen worden uitgevoerd op een vaste drager. Hierbij wordt vooreerst het te onderzoeken materiaal (chrDNA of pDNA in het geval van Southern analyse) op agarosegel gescheiden, en gedenatureerd onder alkalische omstandigheden. Daarna wordt het scheidingspatroon op een vaste drager (filter) overgebracht via blotting in denaturerende omstandigheden. Alleen enkelstrengige nucleïnezuren binden op het filtermateriaal. Bij de blotting worden de relatieve posities van de DNA-fragmenten behouden. Het doorgedrukte nucleïnezuurmateriaal wordt op een nylonfilter gefixeerd door U.V. bestraling. In de volgende stap (hybridisatie) wordt het gebonden materiaal met de gemerkte probe gehybridiseerd (Sambrook et al., 1989). 8.1.2. Materiaal. • • • • • •

Een positief geladen nylonmembraan (Boehringer Mannheim) Depurinatie-oplossing: 0.25 M HCl Denaturatie-oplossing: 0.5 N NaOH 1.5 M NaCl Neutralisatie-oplossing: 0.5 M Tris-HCl 3 M NaCl pH 7.5 met HCl gesteld 20X SSC (transferoplossing): 3 M NaCl 0.3 M Na-citraat pH 7.0 Whattman 3MM filterpapier 68

8.1.3. Methode • •

•

•

•

Het chrDNA wordt gedigereerd met een reeks restrictieënzymen, waarna de fragmenten gescheiden worden volgens grootte d.m.v. agarosegelelektroforese. De snelheid waarmee DNA-fragmenten door de capillaire kracht uit het gel migreren is afhankelijk van de grootte van de fragmenten, waarbij grotere fragmenten moeilijker uit het gel migreren. Een bijkomende moeilijkheid is dat tijdens het blotten het gel sterk gedehydrateerd wordt waardoor de grote DNA-fragmenten niet meer uit het gel kunnen migreren. Om dit te vermijden kan het DNA, alvorens te blotten, in kleinere stukken worden gesplitst door depurinatie. De agarosegel wordt daartoe gedurende 10 min in een depurinatieoplossing ondergedompeld, waarbij de purines worden verwijderd. De depurinatie is ten einde als de broomfenolblauw-kleurmerker geel is geworden. De moleculaire verklaring ligt bij het feit dat de covalente binding tussen een purinebase en een deoxyribose gevoeliger is voor HCl dan de binding tussen een pyrimidinebase en de deoxyribose. Het gel wordt gedurende 30 min ondergedompeld in een denaturatie-oplossing. Bij deze behandeling wordt het dsDNA omgezet in esDNA zodat de transfer uit de gel naar de membraan eenvoudiger wordt. De omzetting naar esDNA is ook noodzakelijk om het DNA toegankelijk te maken voor de probe. De krachten die een dubbelstreng samenhouden zijn afkomstig van waterstofbruggen en stapelingskrachten. Door het DNA bij hogere pH te brengen krijgen de basen een andere ladingsverdeling en is waterstofbrugvorming niet meer mogelijk, het DNA is dan volledig gedenatureerd. Dit proces is reversibel, want bij verlagen van de temperatuur of de pH renatureren de complementaire strengen. Omdat nucleïnezuurhybriden onstabiel zijn bij de hoge pH van de alkalische denaturatieoplossing, wordt het gel ondergedompeld in een neutralisatie-oplossing gedurende 15 min bij kamertemperatuur. De neutralisatiestap vermijdt een verhoogde achtergrond van het membraan na hybridisatie welke ook veroorzaakt kan worden door de denaturatie-oplossing. Na deze behandelingen wordt een opstelling gemaakt waarbij het gel op een wiek gelegd wordt die gedrenkt is in een 20 X SSC-oplossing (zie figuur 2.9). De membraan wordt op het gel gelegd. Hier bovenop komen drie Whattman 3MM filterpapiervelletjes gedrenkt in 20 X SSC-oplossing. Tenslotte wordt 5 cm absorberend papier op de opstelling gelegd. Het zout in de SSC-oplossing vergemakkelijkt de transfer, alhoewel MQ al voldoende is om het DNA efficiënt te binden op de membraan. Door de capillaire zuigkracht van het papier wordt het esDNA op de membraan gebonden. Na ongeveer 16 uur wordt de membraan van de opstelling genomen en wordt het DNA gefixeerd door de membraan gedurende 2 min onder het UV-licht te plaatsen of gedurende 1 uur bij 80°C te verwarmen (Boehringer Mannheim, catalogus 1997).

Figuur 2.9. Opstelling voor een Southern blot: Transfer van nucleïnezuurmateriaal uit een agarosegel naar een positief geladen membraan (Sambrook et al., 1989).

69

8.2. Aanmaak DIG-gelabelde probe. 8.2.1. Principe. Een probe is een gemerkte enkelstrengige nucleïnezuurmolecule die complementair is aan een gedeelte van de sequentie die gedetecteerd moet worden. Digoxigenine-11-dUTP (DIGdUTP) kan ingebouwd worden door het Taq DNA-Polymerase tijdens de PCR-reactie. De PCR DIG Probe synthese kit bevat een 1:2 DIG-11-dUTP:dTTP verhouding, welke kan gebruikt worden om probes te genereren voor een breed gamma filterhybridisatie-toepassingen. De probes die op deze manier werden bereid, kunnen gebruikt worden om single-copy genen in genomische Southern blotprocedures op te sporen. De gesynthetiseerde probe is heel gevoelig en de opbrengst van deze labelingsreactie is hoog (Boehringer Mannheim, catalogus, 1997). 8.2.2. Materiaal. • • • • • • •

“PCR DIG Probe Synthesis Mix” is een dNTP-mengsel dat bestaat uit 2mM dATP, 2mM dCTP, 2mM dGTP, 1.3mM dTTP, 0.7mM DIG-11-dUTP, pH 7.0 Steriel dH2O Taq DNA-polymerase (5 u/µl) Upper en lower primer: afhankelijk van de sequentie van het gen. Template DNA Reactiebuffer: 100mM Tris-HCl, 500mM KCl, pH 8.3 PCR toestel

8.2.3. Methode Het gebruikt PCR-programma: • 7 min bij 95°C • 45 sec bij 95°C, 60 sec bij 52°C, 90 sec bij 72°C (30 cycli) • afkoelen tot 4°C. Na de PCR-reactie wordt de “DIG-gelabelde” probe gezuiverd over een QIAquick Spin kolom om de niet geïncorporeerde nucleotiden van de DIG DNA labelingsreactie te verwijderen. Van de probe wordt 1/10 van het totaal volume op gel geladen om de concentratie te bepalen. 8.3. Opbrengst DIG-gelabelde probe 8.3.1. Principe. Een kwantitatieve bepaling van het “DIG-gelabelde” DNA in de labelingsreaktie wordt uitgevoerd om optimale en reproduceerbare resultaten bij de hybridisatie te verzekeren. Als een te hoge concentratie van de probe aan de hybridisatiemix wordt toegevoegd, leidt dit tot achtergrond bij de detectie, terwijl een te lage concentratie tot een zwak signaal zal leiden (Boehringer Mannheim, catalogus 1997). 8.3.2. Materiaal. •

Positief geladen nylonmembraan (Boehringer Mannheim) 70

• •

Gelabeld controle DNA: Digoxigenine gelabeld pBR328 DNA dat willekeurig gelabeld is volgens de standaard labelingsprocedure. De totale DNA-concentratie aanwezig in de controle is 25 µg/ml , waarvan slechts 5 µg/ml DIG-gelabeld is. Gelabelde DNA-probe, aangemaakt via PCR.

8.3.3. Methode. Er wordt een verdunningsreeks aangelegd van het DIG-gelabelde controle DNA door 5µl DIG-gelabelde controle DNA te mengen met 20µl DNA verdunningsbuffer (finale concentratie 1ng/µl) (figuur 2.10.).

Figuur 2.10. Verdunningsreeks van DIG-gelabelde controle DNA (Boehringer Mannheim catalogus, 1997).

Dezelfde verdunningsreeks wordt eveneens aangelegd om de DIG-gelabelde probe te testen. Van beide verdunningsreeksen wordt telkens 1µl gespot op de positief geladen nylonmembraan (Boehringer Mannheim). De membraan wordt vervolgens gedurende 2 min voor U.V.-licht gehouden om het DNA te fixeren. De detectie gebeurt net zoals bij de Southernhybridisatie. De spotintensiteit wordt vergeleken om de concentratie van de experimentele probe te schatten (Boehringer Mannheim, 1997). 8.4. Hybridisatie. 8.4.1. Principe. Hybridisatie is de techniek waarbij complementaire nucleïnezuren mekaar kunnen terugvinden, baseparen en als dubbelstreng (duplex) kunnen geïdentificeerd worden. Men start met gedenatureerde (ontvouwen en dus enkelstrengige) nucleïnezuren, dat men laat reageren met 71

een gemerkte complementaire streng of met een gemerkte probe in hoog zout en bij een geschikte temperatuur, en ook vaak in de aanwezigheid van denaturerende stoffen. De hybridisatiereactie in 50% formamide verloopt veel sneller dan de hybridisatiereacties in dH2O, en kan daarbij bij een lagere temperatuur worden uitgevoerd. Formamide veroorzaakt denaturatie bij kamertemperatuur zonder de strengen te breken. Om de snelheid van de “annealing” te maximaliseren, wordt de hybridisatie uitgevoerd in een oplossing van hoge ionische sterkte (5x SSC). Er wordt de voorkeur gegeven aan kleinere hybridisatie volumes, omdat in kleine volumes de reassociatie van de nucleïnezuren sneller verloopt, zodat de hoeveelheid probe gereduceerd kan worden. Op die manier wordt specifiek met het DNA op de membraan gereageerd. Toch moet er voldoende oplossing aanwezig zijn zodat de membraan niet zonder hybridisatieoplossing droog komt te liggen (Boehringer Mannheim, catalogus 1997). Om de grootte van de DNA-fragmenten te bepalen die met de gemerkte sonde hebben gehybridiseerd wordt een chemiluminescent substraat covalent gebonden aan de probe, waarbij het oplichtende signaal m.b.v. autoradiografie op een fotografische film wordt vastgelegd (Sambrook et al., 1989). 8.4.2. Materiaal. •

•

•

•

Malaat buffer: 100mM maleïnezuur 150mM NaCl pH 7.5 Blocking reagens Malaat buffer 10% blocking reagens (poeder Boehringer Mannheim) Roeren bij 60°C gedurende 30 min en daarna autoklaveren. Prehybridisatie-oplossing: 5x SSC 50% formamide 0.1% lauroylsarcosine 0.02% SDS 2% Blocking reagens Hybridisatie-oplossing: prehybridisatie-oplossing waaraan 20ng/ml probe werd toegevoegd.

8.4.3. Methode. •

•

Tijdens de prehybridisatie worden de plaatsen waar geen DNA aanwezig is geblokkeerd door het blocking reagens, waardoor de achtergrondsignalen verlaagd worden. Er wordt tenminste 20 ml prehybridisatie-oplossing gebruikt per 100 cm2 membraanoppervlak. Er wordt minimum gedurende 30 min geschud bij 42°C. Wanneer gebruik wordt gemaakt van dsDNA probes, wordt de probe gedurende 10 min in een warmwaterbad opgekookt om het DNA te denatureren. Vervolgens wordt het DNA onmiddellijk op ijs afgekoeld, om te vermijden dat het DNA renatureert. De prehybridisatieoplossing wordt verwijderd en vervangen door 5 ml hybridisatie-oplossing (prehybridisatieoplossing + 20 ng probe/ml) per 100 cm2 membraanoppervlak. Vervolgens wordt er overnacht geschud bij 42°C.

De stabiliteit van de gelabelde DIG-probe vormt een van de grote voordelen van het systeem. Na de hybridisatie is het mogelijk de hybridisatie-oplossing te hergebruiken omdat de 72

oplossing nog grote hoeveelheden niet gebonden probe bevat. De oplossing wordt bewaard bij – 20°C. Bij hergebruik wordt er eerst gedenatureerd bij 68°C gedurende 10 min. 8.5. Detectie 8.5.1. Principe. Voor het detecteren van de gehybridiseerde gelabelde probes wordt gebruik gemaakt van chemiluminescentie. In de eerste stap wordt de membraan behandeld met blocking reagens om niet-specifieke aantrekking van het “antibody” te verhinderen. In de tweede stap wordt de membraan geïncubeerd met een verdunde oplossing van anti-DIG-AP. Vervolgens gaat de membraan die de gehybridiseerde probe met het gebonden “antibody conjugaat” draagt reageren met een chemiluminescent substraat (CSPD). Ten slotte wordt de membraan voor een X-ray film geplaatst om het signaal te detecteren. 8.5.2. Materiaal. • • • • •

• • • •

• • •

CSPD: een chemiluminescent alkalisch fosfatase substraat: disodium 3-(4-methoxyspiro{1,2 dioxetaan-3,2’-(5’-chloro)tricyclo(3.3.1.1)decaan}-4-yl)fenyl fosfaat. Anti-Digoxigenine-AP: Anti-Digoxigenine, Fab-fragmenten geconjugeerd aan alkalisch fosfatase. Wasoplossing 1: 2 x SSC 0.1% SDS Wasoplossing 2: 0.5 x SSC 0.1% SDS Malaat-buffer: 100mM maleïnezuur 150mM NaCl pH 7.5 Wasbuffer: Malaatbuffer 0.3% Tween-20 Blocking reagens (stockoplossing): Malaatbuffer 10% blocking reagens (Boehringer Mannheim) Blocking buffer: Blockingreagens stockoplossing, 1/10 verdund in malaatbuffer Detectiebuffer: 100mM Tris-HCl 100mM NaCl pH 9.5 X-ray film Ontwikkelingsvloeistof (Agfa) Fixatievloeistof (Agfa)

73

8.5.3. Methode. Na hybridisatie wordt de membraan 2 keer gewassen met wasoplossing 1 gedurende 5 min bij kamertemperatuur, en vervolgens 2 keer met wasoplossing 2 gedurende 15 min bij 68°C om de overmaat niet-gehybridiseerde probe weg te wassen. De membraan wordt geëquilibreerd in wasbuffer gedurende 1 tot 5 min, waarna de membraan gedurende 30 min in blockingbuffer bij kamertemperatuur geëquilibreerd wordt. Het anti-DIG-AP wordt verdund in de blockingbuffer (1 : 10000). De blockingbuffer wordt verwijderd, de verdunde anti-DIG-AP-oplossing wordt toegevoegd en het mengsel wordt gedurende 30 min geïncubeerd bij kamertemperatuur. Vervolgens wordt de membraan 2 keer gewassen in wasbuffer gedurende 15 min bij kamertemperatuur. De wasbuffer wordt verwijderd en de membraan wordt gedurende 5 min geïncubeerd in detectiebuffer bij kamertemperatuur. Ondertussen wordt CSPD in detectiebuffer verdund (1 : 100). 1 ml van de CSPD-verdunning wordt op een plasticfolie gepipetteerd, de membraan wordt hierin geïncubeerd gedurende 5 min terwijl de overtollige vloeistof weg kan vloeien. Vervolgens moet de membraan geïncubeerd worden om de alkalische fosfatase-reaktie in een “steady-state” te krijgen. Dit is nodig om een korte blootstellingstijd te verkrijgen aan de X-ray-film. Bij kamertemperatuur duurt het 7 to 8 uur alvorens de “steady-state” bereikt wordt. Als men dan wil ontwikkelen moet men de membraan minstens 60 min voor de film laten zitten. Om deze tijd te reduceren incubeert men gedurende 10 min bij 37°C. De membraan wordt vervolgens gedurende ongeveer 30 min voor de X-ray-film geplaatst. Ten slotte wordt de film ontwikkeld. 8.6. Koloniehybridisatie. 8.6.1. Principe. Bij de koloniehybridisatietechniek is het de bedoeling in een selectieve genomische bank deze cellen te detecteren welke een plasmide met het gewenste, gekloneerde gen bevatten, afgeleid uit de Southern hybridisatie (Brock et al., 1994). Daartoe wordt het chrDNA gedigereerd met restrictieënzymen, waarna de bekomen fragmenten gescheiden worden via agarosegelelektroforese. Deze DNA-fragmenten worden geligeerd in een passende kloneringsvector en via transformatie geïntroduceerd in een gastheer (E. coli). Door analyse m.b.v. Southernhybridisatie kunnen we een selectieve bank aanleggen waarbij enkel de DNAfragmenten van de juiste grootte gebruikt worden. Er wordt eveneens gebruik gemaakt van het DIG-systeem, dat een gevoelige en vlugge methode is bij het detecteren van een kolonie die het plasmide met het gewenste gen bevat. Daarbij is snelle screening van bacteriële recombinante banken voor specifieke DNA sequenties mogelijk. De kolonies worden getransfereerd naar een positief geladen nylonmembraan. Behandeling met een alkalische oplossing zorgt voor lyse van de kolonies. Het gedenatureerde DNA wordt geïmmobiliseerd op de membraan, waarna interfererende proteïnen met een proteïnase K digest verwijderd worden. Een DIG-gelabelde probe wordt gebruikt voor hybridisatie en detectie (Boehringer Mannheim, 1997). 8.6.2. Materiaal. • • • • •

Denaturatieoplossing (zie 8.1.2.) Neutralisatieoplossing (zie 8.1.2.) Prehybridisatieoplossing (zie 8.4.3.) Hybridisatieoplossing (zie 8.4.3.) 2X SSC 74

• • •

Proteïnase K: 2mg/ml Positief geladen nylonmembraan (Boehringer Mannheim) 3MM Whattman papier

8.6.3. Methode. • • • • • • •

Het 3MM Whattman papier en de membraan worden op de juiste grootte van de LB-plaat uitgeknipt en geautoclaveerd. De membraan wordt op de LB-plaat gelegd gedurende 1min. De membraan en de plaat worden gemerkt met een steriele naald om correcte oriëntatie van de kolonies te verzekeren; intussen drenken we het 3MM Whattman papier in denaturatiebuffer. De membraan wordt op het doordrenkte papier gelegd gedurende 15 min met de kolonies naar de bovenkant. 3MM Whattman papier wordt gedrenkt in neutralisatiebuffer en de membraan wordt erop gelegd gedurende 15 min met het DNA naar de bovenkant. 3MM Whattman papier weken in 2X SSC en de membraan er 15 min laten opliggen met het DNA naar de bovenkant. Gedurende 1 uur behandelen met proteïnase K bij 37°C. Om het DNA te fixeren op de membraan wordt deze verwarmd bij 80°C gedurende 1uur of wordt deze onder een U.V.-lamp gehouden gedurende 2 min. De probe-aanmaak, prehybridisatie en hybridisatie worden op dezelfde manier uitgevoerd als beschreven voor de Southernhybridisatie. Er moet wel op gelet worden dat de probe geen sequentiehomologie vertoont met de vector, dit om niet-specifieke hybridisatie te vermijden. Het is belangrijk dat bij koloniehybridisatie heel steriel gewerkt wordt om valse resultaten te vermijden. Om een nog beter interpretatie te krijgen van de afdrukken bij de ontwikkeling van de film worden vaak twee afdrukken genomen van dezelfde plaat.

8.7. “Stripping” en “reprobing” 8.7.1. Principe. Wanneer de membraan bewaard wordt bij 4°C en niet uitgedroogd is, is het mogelijk om de gebonden probe te verwijderen (“strippen”) zodat de membraan kan hergebruikt worden. Dit gebeurt door te denatureren onder een verhoogde zoutconcentratie in aanwezigheid van SSC (Boehringer Mannheim, catalogus 1997). 8.7.2. Materiaal. • • • •

50mM EDTA, 2X SSC 2X SSC, 0.1% SDS 0.1% SDS, 0.2N NaOH 2X SSC

8.7.3. Methode. De membraan wordt 2 maal gedurende 15 min in 50mM EDTA, pH 8, 2XSSC bij 85°C gewassen. Vervolgens gedurende 2 keer 15 min in 2X SSC, 0.1% SDS, bij kamertemperatuur. De membraan wordt nadien gedurende 15 min in 0.1% SDS, 0.2N NaOH bij 37°C gewassen. In een laatste stap wordt de membraan kort in 2X SSC gewassen. Daarna kan men terug prehybridiseren en hybridiseren met de nieuwe probe. 75

9. Eiwitextracten. 9.1. Periplasmatische eiwitextractie volgens de Tris-HCl methode. 9.1.1. Principe. EDTA en Tris-HCl destabiliseren de celwand. Lysozyme breekt de peptidoglycaanlaag af, zodat sferoplasten ontstaan. Daarbij komt de periplasmatische eiwitfractie vrij. De sucroseoplossing zorgt voor een osmotische stabilisatie van de sferoplasten. Na centrifugatie zullen de sferoplasten in de pellet te vinden zijn, terwijl het supernatans de periplasmatische eiwitten zal bevatten. 9.1.2. Materiaal. • • • • •

Oplossing I: 200mM Tris-HCl pH 8.0 Oplossing II: 200mM EDTA opgelost in 100mM Tris-HCl, pH 8.0 Oplossing III: 200mM Tris-HCl, 1M sucrose, pH 8.0 Oplossing IV: lysozyme opgelost in oplossing I. Steriel dH2O

9.1.3. Methode. • • • • • • • • • •

De optische densiteit van de cultuur wordt gemeten bij 580nm. De cellen afcentrifugeren bij 4000 tpm gedurende 10 min bij kamertemperatuur. De cellen hersuspenderen in oplossing I tot een O.D. van 200 bij 580nm. 1/100 volume oplossing II toevoegen en voorzichtig mengen. 1 volume oplossing II toevoegen en voorzichtig mengen. Oplossing IV toevoegen tot een concentratie van 1mg/ml en voorzichtig mengen. Het mengsel incuberen bij 30°C gedurende 30 min. Het mengsel op ijs plaatsen. Het mengsel centrifugeren bij 14000 tpm en 4°C gedurende 30 min. De periplasmatische fractie (supernatans) scheiden van de sferoplasten (pellet).

9.2. Periplasmatische eiwitextractie volgens de sucrose methode. 9.2.1. Principe. Nadat de cellen gecollecteerd werden door centrifugatie, wordt een sucroseoplossing toegevoegd, om de concentratie aan opgeloste stof buiten de cel te balanceren met deze binnenin, zodat geen lyse van de cel optreedt en een intacte protoplast gevormd wordt. Als daarna de cellen in ijskoud water worden opgelost, zal de celwand open breken, en de periplasmatische eiwitten zullen vrijkomen. 9.2.2. Materiaal. •

Sucrosebuffer: 20% sucrose 5mM EDTA 76

•

100mM Tris-HCl pH8.0 IJskoud steriel dH2O

9.2.3. Methode. • • • • • • •

De cellen centrifugeren bij 4000 tpm en 4°C gedurende 10 min. De cellen concentreren in een gepaste hoeveelheid sucrosebuffer tot een O.D. van 200 bereikt wordt bij 580 nm. Het mengsel 5 min op ijs plaatsen. De cellen centrifugeren gedurende 30 min. De cellen hersuspenderen in een gepast volume ijskoud steriel dH2O, de suspensie 5 min op ijs plaatsen. Afcentrifugeren gedurende 20 tot 30 min bij 4°C. De periplasmatische eiwitten zitten in het supernatans.

Een roodbruine kleur van het periplasmatisch extract kan wijzen op de aanwezigheid van cytochroom c. 9.3. Totaal extract door sonicatie. 9.3.1. Principe. Een totaalextract kan worden verkregen door de cellen in de expressiefase te pelleteren door centrifugatie en te resuspenderen in een gepast volume buffer, waarna de cellen aan ultrasonore golven worden blootgesteld. Deze trillingen zorgen ervoor dat de plasmamembraan en de cytoplasmatische membraan begeven, zodat zowel de periplasmatische membraanextracten als de cytoplasmatische in het buffermedium terechtkomen. 9.3.2. Materiaal en Methode. De gepelleteerde cellen worden geresuspendeerd in een ijskoude glucosebuffer. Het soniceren wordt op ijstemperatuur uitgevoerd. Het uiteinde van de sonde wordt ongeveer 1 cm in de celsuspensie gebracht waarbij gedurende 4 min met intervallen van een paar seconden wordt gesoniceerd. De extracten worden vervolgens gecentrifugeerd, waarna het supernatans op SDSPAGE gel kan worden geladen. 10. SDS-PAGE. 10.1. Principe. Polyacrylamidegels worden gebruikt om eiwitten en polypeptiden te scheiden. Deze gels worden gesynthetiseerd door monomeren van acrylamide te polymeriseren tot lange ketens, door in aanwezigheid van vrije radicalen, bekomen met ammonium persulfaat (APS), een ketenreactie te initiëren die gestabiliseerd wordt door TEMED (N,N,N’,N’-tetramethylethyleendiamine). Met behulp van het bifunctionele agens N,N’-methyleenbisacrylamide zullen de ketens gecrosslinked worden. De ontstane gelmatrix heeft een porositeit die bepaald wordt door de lengte van de ketens en de graad van de cross-linking (Voet en Voet, 1996). Het efficiënte, hoge-resolutie twee-gelsysteem dat gebruik maakt van een runninggel en een stackinggel is een vorm van de discontinue pH- of disc-elektroforese. 77

Het hoog efficiënte scheidingsvermogen van het discontinue pH-gelsysteem kan als volgt worden verklaard: Onder invloed van het aangelegde elektrische veld zullen de bufferionen aan de top van de stackinggel naar de stackinggelmatrix toe bewegen. Als zij deze matrix bereiken zullen deze ionen hun lading verliezen, omdat zij een gebied binnen komen met een lagere pH (pH 6.8) dan hun eigen pK-waarde. Daardoor worden zij elektroforetisch immobiel. Wegens hun immobiliteit (en hun nul-lading), zullen zij in dit gebied een omgeving scheppen met een tekort aan ladingsdragers en bijgevolg een gebied met een verhoogde weerstand. Dit volgt uit de wet van Ohm die stelt dat een verhoogde weerstand een groter elektrisch veld opwekt (E = IR). Daardoor zullen de anionische macromoleculen aan de top van de stackinggel snel naar de stackinggel migreren. Daar aangekomen, zullen ze vertragen omdat zij geen ladingsverlies ondergaan. Vanaf daar kunnen de macromoleculen traag en volgens hun elektroforetische ladingsdichtheid doorheen het stackinggel migreren, naar de runninggel toe. Dit fysisch verschijnsel maakt dat de eiwitten in grootteorde (grootte van de eiwitten evenredig met hun lading) naar de runninggel zullen migreren. Als zij in contact komen met de runninggel, welke een hogere pH heeft (pH 8.8), krijgen de moleculen hun volledig geladen vorm, waardoor zij in de runninggel kunnen binnendringen. De mobiliteit in de runninggel kan ook trager verlopen wegens gelfiltratieeffekten. Aan de ladingsbuffer wordt SDS toegevoegd, waarbij het SDS op een homogene manier aan de polypeptideketens bindt waardoor zij een negatieve lading krijgen, evenredig met de grootte van de polypeptideketens (bij verzadiging bindt 1.4 g SDS per gram polypeptide). Het mengsel wordt daarbij opgekookt. Daardoor zullen de SDS-moleculen in maximale hoeveelheid aan de ontvouwen polypeptideketens binden. Door de gebonden (en negatief geladen) SDSmoleculen zullen de eiwitten naar de (positieve) anode bewegen. Wegens de opgewekte proportionaliteit tussen lading en grootte van de eiwitten kan een scheiding volgens ketenlengte, en dus volgens moleculair gewicht, bekomen worden. 10.2. Materiaal. Totaal: 40% Acrylamide/Bis 0.5 M Tris-HCl pH 6.8 0.5 M Tris-HCl pH 8.8 10 % SDS Milli-Q (MQ) TEMED (Bio-Rad) 10% APS (Bio-Rad)

Running 14% 20 ml 9.24 ml / 5 ml 200 µl 5.46 Ml 10 µl 100 µl

Stacking 4% 10 ml 1 ml 2.5 ml / 100 µl 6.36 ml 10 µl 50 µl

Running gel (14%): 14% Acrylamide/Bis 0.375 M Tris-HCl + SDS, pH 8.8 0.005% TEMED 0.05% APS

Stacking gel: 4% Acrylamide/Bis 0.125 M Tris-HCl + SDS, pH 6.8 0.001% TEMED 0.05% APS

Running buffer: Glycine 14.375 g

Ladingsbuffer: 50% Glycerol in 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8) 78

Tris SDS MQ

3.0 g 1.0 g 1000 ml

1% SDS 10g broomfenolblauw (BPB)

Proteïne-merker Bio-Rad, SDS-PAGE standaard: Bio-Rad Samenstelling Fosforylase b Serum albumine Ovalbumine Carbonaat anhydrase Trypsine inhibitor Lysosyme

97.4 66.2 45 31 21.5 14.4

Proteïne (Sigma) α2-Macroglobuline β-Galactosidase Fructose-6-Fosfaat Kinase Pyruvaat Kinase Fumarase Melkzuurdehydrogenase Triosefosfaat Isomerase

MG 180 116 84 58 48.5 36.5 26.6

New England Biolabs Inc. Eiwit1: 175 kDa Eiwit2: 83 kDa Eiwit3: 62 kDa Eiwit4: 47.5 kDa Eiwit5: 32.5 kDa Eiwit6: 25 kDa Eiwit7: 16.5 kDa Eiwit8: 6.5 kDa

kDa kDa kDa kDa kDa kDa

kDa kDa kDa kDa kDa kDa kDa

Band Overeenstemmend nummer M.G. (kDa) 1. 182 2. 115 3. 84 4. 62 5. 51 6. 38 7. 26 8. 20 9. 15 10. 9

Figuur 2.11. Eiwitmerker.

79

10.3. Methode. •

• •

• • • •

Twee glazen platen worden op elkaar gelegd met de spacers ertussen. Beide platen worden in de verticale houders bevestigd, zodat de spacers niet aan de onderzijde van de glazen platen uitsteken. Het geheel wordt stevig samengehouden door de platen tegen de houder aan samen te schroeven. Steriel dH2O wordt tussen beide platen gegoten om eventuele lekken te detecteren. Onmiddellijk nadat het APS bij de runninggel werd gevoegd, wordt het gel tussen de platen gegoten, waarna een dun laagje verzadigde isobutanol erover heen gebracht wordt om contact met de lucht te vermijden, waardoor een maximale polymerisatiereactie verkregen wordt. De gel moet 30 min polymeriseren. Het isobutanol wordt verwijderd, en de stackinggel wordt over de gepolymeriseerde runninggel gegoten. De kam die de slotjes vormt wordt onmiddellijk aangebracht. Na polymeriseren van de stackinggel, wordt de kam voorzichtig verwijderd, en het geheel wordt in de runningbuffer gedompeld. Het gel wordt geladen met 20 µl eiwitextract + 5 µl ladingsbuffer. De merker wordt opgekookt en 5µl wordt geladen. Programma: Voor kleine gels: 1 uur, 130V. Voor grote gels: overnacht, 75V.

11. Detectie van proteïnen. 11.1. Kleuring met Coomassie. 11.1.1. Principe. De Coomassiekleuring is gebaseerd op de elektrostatische associatie van deze kleurstoffen in zuur milieu met de aminogroepen van de proteïnen. Het te kleuren gel wordt in een zuur methanol-watermengsel ondergebracht, waaraan het Coomassie briljant blauw toegevoegd is. De incubatietijd bedraagt ongeveer 1 uur. De proteïnen denatureren ter plaatse in het gel, waarna de kleurstof in complex treedt met deze gefixeerde proteïnen. Bij deze behandeling kleurt het gel volledig blauw, zodat achteraf de gelmatrix ontkleurd moet worden, door het gel in dezelfde oplossing zonder de Coomassiekleurstof te incuberen, gedurende 3 keer 30 min. Dit elimineert de blauwe kleur uit de gelmatrix. De proteïnen zijn uiteindelijk te zien als helblauwe spots. De limietwaarde m.b.t. gevoeligheid van de Coomassiekleuring bedraagt 0.3µg. 11.1.2. Materiaal Coomassie kleuringsoplossing: • • • •

Coomassie Methanol Azijnzuur dH2O

250 mg 87.5 ml 12.5 ml 150 ml

Ontkleuringsoplossing •

Methanol

150ml 80

• •

H2 O 300ml Azijnzuur 50ml

11.1.3. Methode • • •

Het gel wordt gedurende 1 uur in de Coomassieoplossing geïncubeerd. Vervolgens wordt het gel 3 X 30 min in de ontkleuringsoplossing geïncubeerd. Analyse van de blauw gekleurde proteïne bandjes.

11.2. Zilverkleuring 11.2.1. Principe. De redoxpotentiaal van zilver bedraagt 0.8eV. Daarmee is het een van de meest reduceerbare metalen. Bij zilverkleuring wordt gebruik gemaakt van het verschijnsel dat metallisch zilver de reductie zijn eigen ionen katalyseert. Het gel wordt zuur gemaakt, waarna een oplossing van zilvernitraat in het gel gaat dringen. De complexatie van het zilver met de proteïnen wordt geïnduceerd door ladingsinteracties met carboxylgroepen van Asp en Glu of door complexatie met de nucleofiele zijketens zoals imidazol-, thiol-, of aminegroepen. Daarbij moet achteraf het gel gewassen worden om de zilverionen die met de gelmatrix zijn gecomplexeerd, te laten wegdiffunderen. De ontwikkeling gebeurt door het reductans in een sterk basische oplossing over het gel te gieten. De ontwikkeling wordt stopgezet door het gel in een zure oplossing te leggen (Rabbiloud, 1990). 11.2.2. Materiaal. • • • • • • • •

50% EtOH Oplossing I: 50 mg Na2S2O3 / 250ml dH2O steriel dH2O Oplossing II: 500 mg AgNO3, 188 µl 37 % formaldehyde in 250 ml dH2O 3X wassen in dH2O gedurende 20 sec. Oplossing III: 125 µl 37 % formaldehyde, 15 g Na2CO3, 1 mg Na2S2O3 in 250 ml dH2O Oplossing IV: 50 % MeOH, 10 % ijsazijnzuur 50 % MeOH.

11.2.3. Methode. Het gel wordt gedurende 20 min met een 50% EtOH-oplossing gewassen. Deze behandeling wordt driemaal herhaald. Vervolgens wordt 1 minuut gewassen met oplossing I. De gels worden drie maal gewassen met steriel dH2O gedurende 20 sec. Het gel wordt in oplossing II gelegd gedurende 20 min, waarna het gel opnieuw driemaal met steriel dH2O wordt gewassen gedurende 20 sec. De gels worden in oplossing III gelegd voor ontwikkeling. Om de ontwikkeling te stoppen wordt het 10 min in oplossing IV gelegd. De gels kunnen enkele maanden bewaard worden in een 30-50 % MeOH oplossing bij 4°C.

81

11.3. Haem detectie. 11.3.1. Principe. De methode is gebaseerd op de interactie van 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine-H2O2 met de covalent gebonden haemgroep van het cytochroom. Het TMBZ-H2O2 vormt een oxideerbaar substraat voor het cytochroom, welke visueel een blauwe kleur weergeeft met een maximale absorptie bij 690 nm (Thomas et al., 1976). 11.3.2. Materiaal. • • •

Oplossing I: is een oplossing van 0.3 mM TMBZ, als volgt samengesteld: 45 mg TMBZ (3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine) oplossing in 30 ml MeOH, en 0.25 M Naacetaat pH 5.3(70 ml). H2O2 tot 30 mM (300 µl) Oplossing II: 3:7 verhouding van Isopropanol 0.25 M : Na-acetaat, pH 5.0

11.3.3. Methode. De gel wordt ondergedompeld in oplossing I, waarin het gedurende 1 tot 2 uur in het donker wordt bewaard. Vervolgens wordt H2O2 toegevoegd tot een concentratie van 30 mM. De kleuring wordt na enkele minuten reeds zichtbaar. Om de ontwikkeling te stoppen en achtergrond te vermijden wordt het gel ondergedompeld in oplossing II. In deze oplossing kunnen de gels gedurende enkele maanden in het donker bij kamertemperatuur bewaard worden. 12. Gebruikte bacteriële (Chlorobium en E. coli) stammen en plasmiden. 12.1. Chlorobium-stammen Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum en Chlorobium tepidum werden voor het onderzoek geleverd door Dr. Sirev g (Noorwegen) en Chlorobium tepidum door Dr. Miller (Denemarken). 12.2. E. coli stammen. XLI-blue: F’::Tn10 proA+B+ lacIq ∆(lacZ)M15/recA1 endA1 gyrA96 (NaIr) thi hsdR17 (rk- mk+) supE44 relA1 lac. Mogelijkheid tot blauw/wit screening. Afkomst: Stratagene. DH10B:

De DH10B E. coli cellen zijn geschikt voor de opname van grote pasmiden (of van plasmiden met grote inserts).

MC1061: F-araD139 ∆(ara-leu)7696 galE15 galK16 ∆(lac)X74 rpsL (Strr) hsdR2 (rk- mk+) mcrA mcrB1

82

M15:

Verzekert een goede controle op transcriptioneel niveau Wordt gebruikt als gastheer-cellijn voor de productie van recombinante proteïnes in combinatie met de pQE expressieplasmiden Deze E. coli stam bevat het pREP4 plasmide (3740 bp, laag kopijenaantal), dat constitutief het lac repressor proteïne tot expressie brengt. Vertoont resistentie tegen kanamycine. Afkomst: Prof. J. Cole, Birmingham.

JCB7123: De E. coli stam JCB7123 is een narL derivaat van stam JCB712. Wanneer deze stam opgegroeid wordt in de aanwezigheid van nitraat worden endogene cytochromen onder anaërobe groeicondities het sterkst geproduceerd. Afkomst: Prof. J. Cole, Birmingham. 12.3. Vectoren. 12.3.1. De pGEM-T vector. De pGEM-T vector (Promega, Madison, V.S.) (zie figuur 2.12.) beschikt aan het 3’uiteinde over een overhangend deoxythymidineresidu, waardoor het efficiënt ligeert met PCRprodukten geamplificeerd met Taq DNA-polymerase. Dit (thermostabiele) Taq DNA-polymerase voegt een deoxyadenosine aan het 3’-eind toe bij de PCR-reactie. Ligatie in de pGEM-T vector wordt meestal uitgevoerd met T4 DNA-ligase. De ligatie van een PCR-product in deze vector wordt vergemakkelijkt door de complementariteit van de thymidines van de vector, en de adenosines van het PCR-product. De vector bezit de oorsprong van replicatie van de filamenteuse faag f1 en kan dus worden gebruikt om enkelstrengig DNA te produceren. Daarnaast bevat het een T7 RNA- en SP6 RNApolymerasepromotoren nabij een MCS binnenin het coderend gebied voor het α-peptide van βgalactosidase, een ampicilline of carbenicilline resistentie merker, en een multipele kloneringssite. Expressie wordt geïnduceerd door het T7-RNA polymerase in de gastheercel. T7RNA polymerase zorgt ervoor dat het produkt van de target gen tot 50% van de totale eiwitproductie kan bedragen. In de nietgeïnduceerde toestand blijft het target gen transcriptioneel “silent”. Het T7-RNA polymerase gen staat onder controle van lacUV5 en expressie wordt geinduceerd door toevoeging van IPTG. In de vector werd ook een deletie ingebouwd van het 3’-uiteinde van het lacZ-gen, waardoor blauw-wit screening mogelijk wordt. Door deze deletie wordt enkel het N-terminaal gedeelte van het lacZ-genproduct, het α-peptide, geëxpresseerd, dat inactief is in afwezigheid van het product van het C-terminale gensegment. Om de screening mogelijk te maken wordt de vector getransformeerd in een gastheer die het product van het C-terminale gedeelte, het ωgensegment van lacZ, aanmaakt. De associatie van beide genproducten laat de vorming toe van een enzymatisch actief complex, welke bij inductie door het toegevoegde IPTG het chromogeen substraat X-gal afbreekt, wat visueel waarneembaar wordt door de blauwe kleur die uit deze afbraak volgt. De blauwe kleur in de omgeving van de kolonies duidt aan dat geen insert in de vector werd opgenomen, dit in tegenstelling tot de witte kolonies.

83

Figuur 2.12. pGEM-T vector (Promega, Madison, V.S.)

12.2.2. De pUC-18 vector. pUC-18 (zie figuur 2.13.) is een kleine E. coli plasmide-kloneringsvector met een hoog kopijenaantal. Het bevat een 54 baseparen MCS polylinker. Het wordt veelvuldig en efficiënt gebruikt om exogene genen in E. coli te kloneren. De vectoren bevatten zowel het ampicilline resistentie gen, evenals het origin voor replicatie, afgeleid uit pBR322. Daarnaast codeert het βgalactosidasegen in de pUC-18 vector voor de resistentie tegen ampicilline en carbenicilline. LacZ’ is een gemodificeerde vorm van lacZ, dat codeert voor β-galactosidase. Het bevat tevens een Muctiple Coning Site. DNA fragmenten die in dit LacZ’ MCS geïnsereerd worden inactiveren het LacZ’ gen, zodat blauw/wit screening mogelijk wordt. Genen welke in deze MCS gekloneerd worden, kunnen geëxpresseerd worden als fusie-proteïnes, waarbij de expressie gecontroleerd wordt door de lac promotor. LacI codeert voor de lac-repressor, een proteïne dat de transcriptie van het lacZ-gen controleert. De polylinker, dat een 18-residu polypeptide segment codeert aan de N-terminus van het β-galactosidase, bevat 13 verschillende unieke restrictieplaatsen. Verschillende voorgeknipte versies van de pUC vectoren zijn voorhanden, waarbij elk gelineariseerd werd, behandeld met BAP and gezuiverd d.m.v. gel filtratiechromatografie (Pharmacia).

84

Figuur 2.13. De pUC-18 vector (Pharmacia).

12.2.3. De pQE-60 vector De pQE-60 vector constructen staan toe dat een authentiek (d.i. behorend aan het insert) ATG initiatiecodon wordt gebruikt, waarbij tevens een geoptimaliseerde Shine Dalgarno regio van de pQE-vector kan worden gebruikt. Het insert moet aan zijn 5’ uiteinde een NcoI restrictiesite hebben. De sequentie 3’ van de NcoI site van de vector bevat een ATG initiatie-codon. Bij het knippen van zowel de vector als het coderend fragment met het overeenkomstig enzym (NcoI) wordt de ATG codon van de vector geëlimineerd, zodat een authentieke ATG-initiatiecodon kan worden ingebouwd. De pQE –vectoren (zie figuur 2.14.) bevatten een 6xHis-tag welke zowel aan de 3’ kant als aan het 5’ uiteinde van de insert kan worden geïnsereerd. Deze 6xHis affiniteitslabel vergemakkelijkt binding van het proteïne op Ni-Nitrilotriacetic acid (Ni-NTA). Dit affiniteitslabel is klein bij pH 8.0, ongeladen, en interfereert niet met de secretie, compartimentalisatie of opvouwing van het proteïne in de cel. De 6xHis-tag bevordert de immobilisatie van het proteïne op metaal-chelaterende oppervlakken zoals Ni-NTA substraten zodat proteïne-interactie studies kunnen vereenvoudigd worden. Deze interactie is zodanig efficiënt dat zuivering van het proteïne in één enkele stap kan worden uitgevoerd, uitgaande van een proteïnesamenstelling van minder dan 1% in een totaal eiwitmengsel tot 95% homogeniciteit van het betreffende proteïne (The QIA expressionist, 3rd edition, july 1997, QIAGEN). Andere eigenschappen van de pQE vectoren: • Laag kopijen aantal • T5 promotor • 2 lac promotor sequenties • 2 sterke transcriptionele terminatoren 85

• •

6xHis-tag aan de 3’ zijde van het kloneringsgebied IPTG inductie

De pQE-60 vector vertoont resistentie tegen carbenicilline. Expressie van deze vector in de M15 E. coli cellijn verhoogt de stringentie op transcriptioneel niveau. Afkomst: Prof. J. Cole, Birmingham.

Figuur 2.14. de pQE-60 vector (QIAGEN)

12.2.4. De pKK233-3 vector. De expressievector pKK233-3 (Brosius en Holy, 1984) (zie figuur 2.15.) wordt algemeen gebruikt voor het overexpresseren van proteïnen (Amann et al.,1983; Frost et al., 1984; Yaffe et al., 1988). Het bevat de sterke tac-promotor, welke gereguleerd wordt door de lac-repressor (in een geschikte gastheercel), en welke geïnduceerd wordt door additie van IPTG in het medium. Onmiddellijk stroomafwaarts van de tac-promotor bevindt zich de pUC8 MCS en de sterke rrnB ribosomale terminator, welke het vector-gastheer systeem stabiliseert doordat doorlezen van de sequentie vanuit de tac-promotor van het originele plasmide wordt vermeden. Genen welke een RBS en een ATG-initiatiecodon bevatten, kunnen worden geëxpresseerd na insertie in een unieke restrictiesite in de MCS. De RBS van het plasmide kan worden gebruikt om inserts te expresseren indien het initiatiecodon van het insert binnen 13 baseparen van de EcoRI-site gelegen is. Het plasmide vertoont resistentie tegen 100 µg/ml ampicilline.

86

Figuur 2.15. De pKK233-3 expressievector.

12.2.5. Pt10 In de pT10sOmpArPDI vector (De Sutter et al., 1994) (zie figuur 2.16.) werd het signaal van de buitenste membraanproteïne II van E.coli (outer membrane protein II) gefusioneerd met de nucleotide sequentie coderend voor het rat proteïne disulfide isomerase (rPDI), wat resulteert in de expressie van hoge hoeveelheden enzymatisch actieve rat proteïne disulfide isomerase (van dewelke het sOmpA signaalpeptide verwijderd wordt bij maturatie) in het bacterieel periplasma. Bij incorporatie van het sOmpA signaalpeptide voor het te expresseren gen zal het genprodukt beter uit de cel worden vrijgesteld. Deze pT10sOmpArPDI vector werd gebruikt om het over te expresseren gen (cyt c-551) te subkloneren, voordat het in de pLPP vector werd gekloneerd

87

Figuur 2.16. De pT10-vector.

12.2.6. De pLPP vector. Bij de pLPPsOmpArPDI vector (De Sutter et al., 1994) (zie figuur 2.17.) werd het complete signaal van de buitenste membraanproteïne II van E.coli (outer membrane protein II) gefusioneerd (in fase) met de nucleotide sequentie coderend voor de laatste 2 aminozuren van de signaalsequentie van het rat proteïne disulfide isomerase (rPDI). Expressie van het gefusioneerde gen, gecontroleerd door lpp en de lacUV5 promotoren, resulteert in hoge hoeveelheden enzymatisch actieve rat proteïne disulfide isomerase (van dewelke het sOmpA peptide verwijderd wordt bij maturatie) in het bacterieel periplasma. De pLPP vector is een bacterieel expressiesysteem die in hoge mate de synthese toelaat van het genprodukt in de periplasmatische ruimte. De periplasma-inhoud kan d.m.v. een koude osmotische shock worden vrijgesteld. Bij incorporatie van het sOmpA signaalpeptide voor het te expresseren gen zal het genprodukt beter uit de cel worden vrijgesteld, waarna het signaalpeptide volledig wordt afgesplitst. Het gefusioneerde gen (met sOmpA in fase) staat onder controle van zowel de lpp promotor (Plpp) en de lac promotor-operator (POlac), wat resulteert in een overmaat in expressie van het gefusioneerde gen. Het plasmide pLPPsOmpArPDI, afgeleid uit p714 (Parker and Wiley, 1989), werd gebruikt om het cyt c-551 erin te kloneren, samen met het sOmpA signaal, onder controle van Plpp en POlac. In de pLPP plasmide is de expressie van het lacI in niet-geïnduceerde omstandigheden te zwak om het Plpp te represseren, zodat expressie kan worden opgemerkt.

88

Figuur 2.17. De pLPPsOmpArPDI vector.

12.2.6. De pRVS2 Suicide vector. De pRVS2 suicide vector (zie figuur 2.18.) wordt gebruikt voor inactivatie-experimenten via interposon mutagenese. Het werd afgeleid uit de pRVS1 vector (Van Spanningen et al., 1990 en 1991), dat gebruikt werd om frame shift mutaties in het genoom van Paracoccus denitrificans in te voeren. Diezelfde pRVS1 vector is een afgeleide van de suicide vector pGRPd1, welke een lacZ gen bezit coderend voor β-galactosidase. Dit reportergen bleek ook hier succesvol te zijn in het onderscheiden van cellijnen waarin een plasmide geïntegreerd was, versus mutante cellen die het plasmide verloren hadden door homologe recombinatie. De pGRPd1 werd gebruikt om een plasmide te construeren waarbij de sequentie van het doelgen onderbroken wordt door een kanamycine resistentiebox. Na conjugatie van dit construct met een cellijn die het wild type genoom bezit, kunnen recombinante cellen gescreend worden naar resistentie voor kanamycine. In de recombinante cellen werd het wild type gen vervangen door het geïnactiveerde gen. Bijkomende screening naar β-galactosidase is mogelijk in aanwezigheid van het chromogene substraat X-gal. De suicide vector kan niet in episomale vorm in de cel aanwezig blijven. Door de insertie van de kanamycine resistentiebox zullen de stroomafwaarts gelegen genen wegens de aangebrachte frame shift mutatie ook niet meer gelezen kunnen worden. Daarom werd de pRVS1 suicide vector gebruikt om, na selectie van de kanamycine resistente cellen, de sequentie van het inactieve gen (met de KmΩ) te vervangen door een sequentie van het gen waarin een frame shift mutatie werd ingebouwd, waarbij weinig verder in de sequentie een stopcodon geïnsereerd werd. De frame shift mutatie werd ingevoerd door ter hoogte van een bestaande restrictiesite een invulreactie uit te voeren. Op die manier worden de stroomafwaarts gelegen genen normaal geprocessed, en kan de hoofdactiviteit van het geïnactiveerde gen worden bestudeerd. 89

Figuur 2.18. De pRVS2 Suicide vector.

12.2.7. De pACYC184 vector. Deze pACYC184-vector (zie figuur 2.19.) werd gebruikt om samen in de E. coli gastheer cellen getransformeerd te worden, zodanig dat de inherent aanwezige proteasen in de gastheercellen gedeterioreerd worden. Op deze manier worden de te expresseren eiwitten niet vernietigd.

Figuur 2.19. De pACYC184 vector met de Ccm genen.

90

III. RESULTATEN

91

I. Bepalen van de flankerende sequenties van cytochroom c-551 die deel uitmaken van het thiosulfaat-operon.

91

1. Opgroeien van een Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum cultuur. 1.1. Bereiden van chromosomaal DNA 1.2. Digest van het chromosomaal DNA. 1.3. Southern blot procedure 1.4. Bereiding van de probe. 1.5. Hybridisatie en detectie van de membraan.

94 94 95 95 96 97

2. Koloniehybridisatie met HindIII fragment van 4000 baseparen. 2.1. Het pUC18 + H4000 construct. 2.1.1. Digest van chrDNA met HindIII. 2.1.2. Ligatie van de 4000bp fragmenten in de pUC18-vector 2.1.3. Transformatie van het construct. 2.1.4. Streepenting voor koloniehybridisatie. 2.1.5. Prehybridisatie, hybridisatie en detectie van de membraan. 2.1.6. Controle van positieve signalen.

97 98 98 98 99 100 100 100

3. Het pUC18 + E8000 construct. 3.1. Koloniehybridisatie op het EcoRI fragment van 8000 bp 3.1.1. Digest van chromosomaal DNA met EcoRI 3.1.2. Ligatie van de 8000 bp fragmenten in de pUC18 vector. 3.1.3. Transformatie. 3.1.4. Controle van de gegroeide kolonies.

109 109 109 110 110 111

4. Hybridisatie van het chromosomaal DNA van Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum met het flavoproteïne van Chlorobium tepidum. 111 4.1. Principe (doel) 111 4.2. PCR amplificatie van het flavoproteïne van Chlorobium tepidum. 111 4.3. Zuivering van het PCR produkt. 112 4.4. Klonering van het PCR produkt in de pGEM-T vector. 113 4.5. Electroporatie van de ligatie, bereiding van pDNA en controle van de ligatie. 113 4.6. Hybridisatie. 114 4.6.1. Digest van het chromosomaal DNA. 115 4.6.2. Transfer van het restrictiepatroon op een positief geladen membraan (Southern blot procedure). 115 4.6.3. Bereiding van de probe (DIG-gelabeled) 115 4.6.4. Prehybridisatie, hybridisatie en detectie van de membraan. 116 II. Overexpressie van het cyt c-551 gen.

117

1. Doel en principe bij de constructie van de plasmiden voor de overexpressie-experimenten. 117 2. Construct pQE-60 + sign.chr. + cyt c-551. 2.1. Tweestaps PCR-amplificatie van het chimere construct. 2.2. Digest van de pQE-60 vector en het PCR-produkt met NcoI en BglII 2.3. Ligatie. x

117 117 120 121

2.4. Electroporatie van de ligatie. 2.5. Controle van de ligatie 2.6. Controledigesten op de constructen.

121 121 122

3. Construct pKK233-3 + sign.chr. + cyt c-551. 3.1. Digest van de pKK233-3 vector en het pQE-60 construct. 3.2. Invulreactie met T4 DNA polymerase 3.3. Digest met EcoRI 3.4. Zuivering van de fragmenten 3.5. Ligatie van sign.chr. + cyt c-551 in de pKK-vector

123 123 124 124 124 125

4. Construct pLPP + sOmpA + cyt c-551 128 4.1. PCR amplificatie van cyt c-551 met de primers C551OmpA en C551ECORI 128 4.2. Digest van pT10sOmpArpDI met NaeI en EcoRI 129 4.3. Ligatie cyt c-551 met pT10 130 4.4. Birnboim pDNA bereiding van pT10 + sOmpA + cyt c-551 en digestie met XbaI-HindIII131 4.5. Ligatie van het sOmpA + cyt c-551 insert in de pLPP vector 132 4.5.1. Digest van pT10 + sOmpA + c-551 met XbaI-EcoRI 132 4.5.2. Digest van pLPP met XbaI-EcoRI 132 4.5.3. Zuivering en bepalen van de concentratie 133 4.6. Ligatie van pLPP met sOmpA + cyt c-551. 134 4.7. Birnboim pDNA bereiding uit 12 kolonies van het construct pLPP + sOmpA+ cyt c-551. 136 4.8. pDNA bereiding volgens de QIAGEN methode van pLPP + sOmpA + cyt c-551 en enzymatische digesten ter controle. 137 5. Construct pLPP + sign.chr. + cyt c-551 137 5.1. PCR van cyt c-551 met signchXba en c551EcoRI op template pQE-60 + sign.chr. + cyt c551. 137 5.2. Digest van PCR-product en pLPP vector. 138 5.2.1. Digest van het PCR product (sign.chr. + cyt c-551; XbaI-EcoRI uiteinden) met XbaIEcoRI: 138 5.2.2. Digest van de pLPP vector met XbaI-EcoRI 139 5.2.3. Bepaling van de concentratie voor de ligatie 139 5.3. Ligatie van het insert in de pLPP vector. 139 5.4. pDNA bereiding van een aantal kolonies 140 6. Overexpressieëxperimenten met de verschillende constructen 6.1. Overexpressie met het pQE-60 + sign.chr. + cyt c-551 construct. 6.2. Overexpressie met het pKK233-3 + sign.chr. + cyt c-551 construct 6.3. Overexpressie met het pLPP + sOmpA + cyt c-551 construct 6.4. Overexpressie met het pLPP + sign.chr. + cyt c-551 construct

141 142 143 143 145

III. Inactivatie (knock out) van het cyt c-551 gen

146

1. Principe en doel

146

2. Klonering van het B2400 fragment in de pRVS2 suicide vector. 2.1. Controledigest van pUC18+B2400 2.2. Digest van genomische kloon pUC18+B2400 met SacI-SalI 2.3. QIAquick zuivering van pRVS2 suicide vector en van het B2400 fragment.

146 146 147 147

xi

2.4. Digestie van pRVS2 met SalI 2.5. Bepalen van de concentratie van de fragmenten 2.6. Ligatie pRVS2 en B2400 2.7. Digestie van het ligatieprodukt met PstI 2.8. Transformatie in MC1061 E. coli cellen, en Birnboim pDNA isolatie van 24 kolonies. 2.9. Digest van het construct pRVS2 + B2400 met BamHI en HindIII. 2.10. Digest van het pDNA

147 148 148 149 149 149 150

3. Insertie van de KmΩ resistentiebox in het pRVS2+B2400 construct. 3.1. Klonering van de KmΩ resistentiebox uit pUC4K/BamHI en pHP42ΩKm/HindIII naar pRVS2+B2400/HindIII. 3.1.1. QIAgen pDNA bereiding van pUC-4K 3.1.2. Digestie van pRVS2+B2400 met HindIII 3.1.3. Digestie van pHP42 ΩKm met HindIII

151

BESLUIT

154

REFERENTIELIJST

156

xii

151 151 152 152

III. RESULTATEN I. Bepalen van de flankerende sequenties van cytochroom c-551 die deel uitmaken van het thiosulfaat-operon. In een vorige studie werd ter bepaling van de thiosulfaatverbruikende gencluster reeds een BamHI fragment van 2.4 kb uit Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum geïsoleerd en gekloneerd in de pUC18 vector (de sequentie is weergegeven in figuur 3.1.1.). ttaacgacggccgtgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatcccttccga 1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60 aattgctgccggcacggttcgaacgtacggacgtccagctgagatctcctagggaaggct tccaggaatcaacggcaatccagatcaaggctcccgagatcgccgagaacggcgctttcg 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120 aggtccttagttgccgttaggtctagttccgagggctctagcggctcttgccgcgaaagc tgccagtaacggtagcgaccagtattcccggcgcgaccaatatcagcattttcactccgg 121 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180 acggtcattgccatcgctggtcataagggccgcgctggttatagtcgtaaaagtgaggcc caaacttcagcccgatggtggcttcgttcgacgtgctgccgcgcatgaagcccgaggttt 181 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240 gtttgaagtcgggctaccaccgaagcaagctgcacgacggcgcgtacttcgggctccaaa cgcttcgcatgaggatggccaagaccgaaaatctcgtcgtcgtcgtccaggcgggcggca 241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300 gcgaagcgtactcctaccggttctggcttttagagcagcagcagcaggtccgcccgccgt agctctaccgggcggttcgcgaagtcaaggtgaccatcggcggctgtggcggataatcga 301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 360 tcgagatggcccgccaagcgcttcagttccactggtagccgccgacaccgcctattagct taaccattcaaaacacatttcaggagtgaaataatgaaaatcaaagcagtagtccagaat 361 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420 attggtaagttttgtgtaaagtcctcactttattacttttagtttcgtcatcaggtctta gacgccgtctcggtcaaaatgctcatcccgcatccgatggagaccggccgccgcaaagag 421 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 480 ctgcggcagagccagttttacgagtagggcgtaggctacctctggccggcggcgtttctc cagaacggtacgcttgtcccgcaccatttcatcaccgaggtgacggccactcacaacggc 481 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 540 gtcttgccatgcgaacagggcgtggtaaagtagtggctccactgccggtgagtgttgccg cagaccgttttccatgccgaactcggccccggcgtctcgaaagatccctatctgtctttc 541 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600 gtctggcaaaaggtacggcttgagccggggccgcagagctttctagggatagacagaaag cagttcaccggcgccaaggcaggcgacatgctgaaggtctcctgggttgacaacaaaggc 601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 660 gtcaagtggccgcggttccgtccgctgtacgacttccagaggacccaactgttgtttccg RBS ggttccgaaaccgctgaggcagccattacggcgatgtaattccaaccacaggagaaccca 661 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 720 ccaaggctttggcgactccgtcggtaatgccgctacattaaggttggtgtcctcttgggt

91

Startkodon voor de signaalsequentie tccatgaaaaaaacaattcagcgagggctgtttaccggcgcgctcgttctcttgacagcc 721 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 780 aggtactttttttgttaagtcgctcccgacaaatggccgcgcgagcaagagaactgtcgg M K K T I Q R G L F T G A L V L L T A klievingssite atgacgtcgaagccggctcacgccgccgtcaattaccaggctctggtcgatgcggatgtc 781 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 840 tactgcagcttcggccgagtgcggcggcagttaatggtccgagaccagctacgcctacag M T S K F A H A A V N Y Q A L V D A D V aaaaaattccagggctattttctcaaggagtttccgggcgtgaagcttgaggacttcggc 841 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900 ttttttaaggtcccgataaaagagttcctcaaaggcccgcacttcgaactcctgaagccg K K F Q G Y F L K E F P G V K L E D F G gatggcgtttacgctctcgatgaggattcccgcaagcagtgGaaggagatggaggagttt 901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 960 ctaccgcaaatgcgagagctactcctaagggcgttcgtcaccttcctctacctcctcaaa D G V Y A L D E D S R K Q W K E M E E F ccgccttatgaactcgatgtcgaggcgggcaaggcgctcttcaacaagcccttcgccaat 961 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1020 ggcggaatacttgagctacagctccgcccgttccgcgagaagttgttcgggaagcggtta P P Y E L D V E A G K A L F N K P F A N ggcaaatcgctggggagctgcttttcgaacgggggagccgtgcgcggcatgtatccctac 1021 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1080 ccgtttagcgacccctcgacgaaaagcttgccccctcggcacgcgccgtacatagggatg G K S L G S C F S N G G A V R G M Y P Y ttcgacgagaagcgcaaagaggtgataacgctcgaaatggccatcaacgagtgccgcgtg 1081 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1140 aagctgctcttcgcgtttctccactattgcgagctttaccggtagttgctcacggcgcac F D E K R K E V I T L E M A I N E C R V gccaatggcgaaaaaccctatgccccgaaaaaaggggacattgccagggtttcggcctac 1141 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200 cggttaccgctttttgggatacggggcttttttcccctgtaacggtcccaaagccggatg A N G E K P Y A P K K G D I A R V S A Y atcgcctcgatcagccgcggccagaaaatcgatgtcaaggtgaagagcaaggcggcttac 1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1260 tagcggagctagtcggcgccggtcttttagctacagttccacttctcgttccgccgaatg I A S I S R G Q K I D V K V K S K A A Y gacgcctacatgaaggcaaggagatgttttacgccaagcgcgggcaactcaacatgtcgt 1261 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1320 ctgcggatgtacttccgttcctctacaaaatgcggttcgcgcccgttgagttgtacagca D A Y M K G K E M F Y A K R G Q L N M S C gctccggctgccacatggagtattccggacgtcacctgagggccgaaatcatcagcccgg 1321 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1380 cgaggccgacggtgtacctcataaggcctgcagtggactcccggctttagtagtcgggcc S G C H M E Y S G R H L R A E I I S P A cgctcggacacaccacgcacttcccggtgttccgctcgaaatggggcgaaatcggcacct 1381 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1440 gcgagcctgtgtggtgcgtgaagggccacaaggcgagctttaccccgctttagccgtgga L G H T T H F P V F R S K W G E I G T L -

92

tgcacagacgctacgccggttgcaacgaaaacatcggagccaagccgttccctgcgcaga 1441 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500 acgtgtctgcgatgcggccaacgttgcttttgtagcctcggttcggcaagggacgcgtct H R R Y A G C N E N I G A K P F P A Q S gcaaagagtatcgcgatctggaatttttccagacggtcatgtcaaacggcctgaagttca 1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1560 cgtttctcatagcgctagaccttaaaaaggtctgccagtacagtttgccggacttcaagt K E Y R D L E F F Q T V M S N G L K F N atggcccggcatcaagaaaataagaagaagaaaccatgaaaaaagtgttatcgctcttga 1561 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1620 taccgggccgtagttcttttattcttcttctttggtacttttttcacaatagcgagaact G P A S R K * gcttgctgctactcacgccttccgcttcattgctgctggccgaaccaacggcggctccgg 1621 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1680 cgaacgacgatgagtgcggaaggcgaagtaacgacgaccggcttggttgccgccgaggcc cggtctcttcgccgctgatcgaccaggcagaggcggcgcgcaaggaggcggacgcgctcg 1681 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1740 gccagagaagcggcgactagctggtccgtctccgccgcgcgttcctccgcctgcgcgagc gttacgagtggcgtgatacgggcgcattgattcagtccgccaaggatgcgctccagaaag 1741 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800 caatgctcaccgcactatgcccgcgtaactaagtcaggcggttcctacgcgaggtctttc gccagcaggcggagtccgacaaactcgcttcgcaagcgcttttccaggcccgcgcggcga 1801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1860 cggtcgtccgcctcaggctgtttgagcgaagcgttcgcgaaaaggtccgggcgcgccgct cagcgcagggccagtacatggcaaagaactggaagatgatgattcccaaaaactgatttc 1861 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1920 gtcgcgtcccggtcatgtaccgtttcttgaccttctactactaagggtttttgactaaag cgtcgggatgtcggctgagcccctcaccgacgtcccgatcttcattgatcagtagtttta 1921 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1980 gcagccctacagccgactcggggagtggctgcagggctagaagtaactagtcatcaaaat cggcaacccaaaccgccccgattcatgaacctatcccgtcgtgagtttctccgcattctc 1981 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2040 gccgttgggtttggcggggctaagtacttggatagggcagcactcaaagaggcgtaagag ggatttgccggagccgcaggccttctgcctgggctggcttccgcggcaggcagcccctcc 2041 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2100 cctaaacggcctcggcgtccggaagacggacccgaccgaaggcgccgtccgtcggggagg gatctttatgatctcggtcagtccggcgacattcgcttgttgcacatcacggatacccat 2101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2160 ctagaaatactagagccagtcaggccgctgtaagcgaacaacgtgtagtgcctatgggta gcccagctcatgccgatctactaccgtgaacccagcctgaacctcgggctcggccaggca 2161 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2220 cgggtcgagtacggctagatgatggcacttgggtcggacttggagcccgagccggtccgt ttcggacgtcctcctcacctcgtgacggagtcgctcttgaaatattacggcatcgcacct 2221 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2280 aagcctgcaggaggagtggagcactgcctcagcgagaactttataatgccgtagcgtgga

93

ggtacgccgctcgcacatgcctataccgcgatcaactatgccgaggcggcgcagcggttc 2281 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2340 ccatgcggcgagcgtgtacggatatggcgctagttgatacggctccgccgcgtcgccaag ggaaaggttggcggtttcgcgcatctgaagacgctcgttgaccggatgcgttcggagtac 2341 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2400 cctttccaaccgccaaagcgcgtagacttctgcgagcaactggcctacgcaagcctcatg ggatccccgggtaccgagctcgaattcgtaatcaggtcata 2401 ---------+---------+---------+---------+- 2441 cctaggggcccatggctcgagcttaagcattagtccagtat Figuur 3.1.1. B2400 fragment, waarbij de sequentie van het cyt c-551 aangeduid is (258 aminozuren), voorafgegaan door de signaalsequentie.

1. Opgroeien van een Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum cultuur. Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum werd in cultuur gebracht in vloeibaar medium gemodificeerd naar Biebl en Pfennig (1978). 1.1. Bereiden van chromosomaal DNA De bereiding van chrDNA werd uitgevoerd volgens de methode van Brown et al. (1991). Het chrDNA werd gecontroleerd op agarosegel. 1

2

3

4

Figuur 3.1.2. Controle van de concentratie van het chrDNA. Laan 1: 3 µl λ PstI Laan 2: 2 µl chrDNA Laan 3: 5 µl chrDNA Laan 4: 10 µl chrDNA

94

1.2. Digest van het chromosomaal DNA. Het chrDNA werd gedigereerd met een aantal restrictie-enzymen: BamHI (Unique B buffer) EcoRI (Unique E buffer) HindIII (NEB buffer 2) 10 µl chrDNA 5 µl reactiebuffer 1 µl enzym 34 µl dH2O 50 µl Totaal. De digesten werden bij 37°C geïncubeerd, gedurende 6 uur, waarna de fragmenten op gel elektroforetisch werden gescheiden. Een duidelijk restrictiepatroon was zichtbaar, wat aanwijst dat het chrDNA goed geknipt was. 1

2

3

4

5

6

7

8

9

Figuur 3.1.3. Digest van het chromosomaal DNA Laan 1: Smart lengtemerker Laan 5: ChrDNA/BamHI Laan 2: ChrDNA/BamHI Laan 6: ChrDNA/EcoRI Laan 3: ChrDNA/EcoRI Laan 7: ChrDNA/HindIII Laan 4: ChrDNA/HindIII Laan 8: 3 µl λ PstI Laan 9: ongedigereerd chrDNA (6µl)

Vervolgens werd dit scheidingspatroon onderworpen aan een Southern analyse. 1.3. Southern blot procedure De agarosegel werd gedurende 10 min in een depurinatie-oplossing ondergedompeld. Het gel werd vervolgens 30 min behandeld met een denaturatie-oplossing, waarna de gel in een neutralisatie-oplossing werd geplaatst gedurende 15 min bij kamertemperatuur. Uiteindelijk werd de gel overnacht aan Southern blotting (met 20X SSC) onderworpen. Het doorgedrukte

95

nucleïnezuurmateriaal werd op de nylonfilter (Boehringer Mannheim) gefixeerd door U.V. bestraling gedurende 2 min. 1.4. Bereiding van de probe. Als template voor de PCR-amplificatie van de probe werd het pUC18 + B2400 construct gebruikt (zie figuur 3.1.1. sequentie van B2400 fragment). Als primers werden de upper primer C551N en de lower primer C551C (zie Materiaal en Methode tabel 2.II.) gebruikt. Om de hybridisatie te kunnen detecteren, werden digoxigenine11-dNTP’s d.m.v. PCR ingebouwd, waarbij 100 µM van elke primer, 10 mM dNTP (DIG Synthesis Mix), 5U Taq DNA-polymerase en 10 ng template, in een totaal volume van 50 µl werden gebracht. 5 µl DIG dNTP’s 5µl reactiebuffer 1 µl primer 1 (C551N) 1 µl primer 1 (C551C) 1 µl template (pUC18 + B2400 construct) 1 µl Taq DNA polymerase 36 µl dH2O 50 µl totaal. PCR programma: 1. Denaturatie: 95°C gedurende 7 min 2. 30 cycli: • denaturatie: 95°C gedurende 45 sec • annealing: 60°C gedurende 1 min • extentie: 72°C gedurende 2 min 3. einde bij 4°C. De PCR-geamplificeerde probe werd met QIAquick gezuiverd, om niet-geïncorporeerde DIGdNTP’s te verwijderen. Ter controle werd 2 µl probe op gel geladen (zie figuur 3.1.4.): 1 2

Figuur 3.1.4. Controle van de probe Laan 1: 3 µl λ PstI Laan 2: 2 µl c-551 probe (880 bp)

96

1.5. Hybridisatie en detectie van de membraan. De membraan werd 30 min geprehybridiseerd, waarna de probe 10 min werd opgekookt en onmiddellijk afgekoeld. 20 ng probe werd per ml hybridisatieoplossing toegevoegd. De membraan werd overnacht bij 42°C met de probe gehybridiseerd. Detectie gebeurde via de chemiluminescentie-methode. Er werd een BamHI fragment van 2400 bp, een EcoRI fragment van 8000 bp en twee HindIII fragmenten van 900 bp en 4000 bp waargenomen (zie figuur 3.1.5.). 1

2

3

4

Figuur 3.1.5. Southernhybridisatie van het chrDNA van Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum. Laan 1: Smart lengtemerker, Laan 2: BamHI fragment van 2400 bp, Laan 3: EcoRI fragment van 8000 bp, Laan 4: HindIII fragmenten van 900 bp en 4000 bp,

2. Koloniehybridisatie met HindIII fragment van 4000 baseparen. Uitgaande van de Southern hybridisatie van het chromosomaal DNA van Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum (figuur 3.1.5.) werd besloten een HindIII genbank aan te leggen. HindIII geeft één fragment van 4000 baseparen en een kleiner fragment van 900 baseparen, doch het fragment van 900 bp levert te weinig informatie op om mee verder te werken.

97

2.1. Het pUC18 + H4000 construct. 2.1.1. Digest van chrDNA met HindIII. ChrDNA werd gedigereerd met HindIII om daarna preparatief uit agarose te worden geëxtraheerd. De digesten werden in tienvoud ingezet, en gedurende 6 uur bij 37°C geïncubeerd, waarna de fragmenten d.m.v. elektroforese gescheiden werden. Digest: ChrDNA: Buffer 2 (NEB): HindIII (10U/µl): dH2O:

20 µl 3 µl 3 µl 24 µl 50 µl totaal.

De digesten werden op gel geladen, waarna een band van 4000 bp met een steriele scalpel uitgesneden werd en gezuiverd met de QIAquick gel extraction kit (Westburg). Uit dit gezuiverde DNA werd telkens 2 µl gecontroleerd op agarose om de concentratie ervan te schatten (zie figuur 3.1.6.). 1

2

3

4

Figuur 3.1.6. Digest van het chrDNA met HindIII Laan 1: Smart lengtemerker Laan 2: chrDNA/HindIII Laan 3: 4000 bp HindIII fragment Laan 2: 3 µl λ PstI.

2.1.2. Ligatie van de 4000bp fragmenten in de pUC18-vector Vervolgens werden de HindIII fragmenten rond de 4 kb in de pUC18-vector (pUC18/HindIII/BAP, Pharmacia) geligeerd, om een selectieve genomische bank aan te leggen. 98

De concentratie werd bepaald via de intensiteit van de banden op de agarosegel: ng (vector ) × kb(insert ) 3 Via de formule × = ng insert , berekent men de hoeveelheid kb(vector ) 1 chrDNA die nodig is voor ligatie van het 4000 bp fragment in de pUC18-vector, 50ng (vector ) × 4kb(insert ) 3 vertrekkend van 50 ng vector, × = 200ng . De verhouding 3kb( pUC18 − vector ) 1 insert / vector moet dus 4:1 bedragen. De ligatie van H4000 met de pUC18-vector werd ingezet: 8 µl insert DNA 2 µl vector DNA 2 µl T4-DNA ligase buffer 1 µl T4-DNA ligase 7 µl dH2O Het ligatiemengsel werd overnacht geïncubeerd bij 4°C. Vervolgens werden de ligatieproducten met QIAquick gezuiverd en geëlueerd in steriel dH2O.

Figuur 3.1.7a. De pUC18 vector met H4000 insert.

Figuur 3.1.7b. pUC18

2.1.3. Transformatie van het construct. 2 µl van het ligatiemengsel (figuur 3.1.7b.) werd gemengd met 40 µl elektrocompetente DH10B cellen, en geëlektroporeerd (2.5 kV, 200 Ω, 25 µF). De cellen werden onmiddellijk na transformatie in LB gebracht om te recupereren, waarna de suspensie bij 37°C geïncubeerd werd bij 200 tpm. Na een uur schudden werd 100 µl uitgeplaat op selectieve platen (met 100 µl IPTG uit een stockoplossing van 100mM, en 20 µl X-gal per plaat, uit een stockoplossing van 50 mg/ml). De plaat werd overnacht bij 37°C geïncubeerd.

99

2.1.4. Streepenting voor koloniehybridisatie. Op basis van blauw-wit screening werden een 1000-tal witte kolonies overgeënt naar 4 petriplaten, welke na incubatie gebruikt werden voor koloniehybridisatie. Er werd een afdruk genomen van de platen waarna de cellen op de membraan gelyseerd werden, zodat uiteindelijk het DNA overgebracht werd naar de nylonmembraan. Het DNA werd op de membraan gefixeerd door UV-bestraling. 2.1.5. Prehybridisatie, hybridisatie en detectie van de membraan. De membranen werden gedurende 30 min pregehybridiseerd, waarna de probe 10 min opgekookt werd, onmiddellijk afgekoeld, en bij de hybridisatieoplossing werd gevoegd. De membranen werden overnacht gehybridiseerd bij 42°C. ’s Anderendaags werd de detectie uitgevoerd. Er werd op drie platen een positief signaal gedetecteerd (zie figuur 3.1.8. een weergave van één der platen, met één positief signaal).

Figuur 3.1.8. Weergave van de ontwikkelde film welke een positief signaal (hybridisatie van construct pUC18 + H4000 met cyt c-551) laat zien.

2.1.6. Controle van positieve signalen. Van de overeenkomstige kolonies werd pDNA bereid volgens de Birnboimmethode waarop ter controle een restrictieanalyse werd uitgevoerd (zie Materiaal en Methode tabel 2I voor gebruikte buffers). 100

Digest: 5 µl pDNA 3 µl reactiebuffer 1 µl enzym 21 µl dH2O 30 µl totaal. 3 uur incuberen bij 37°C. De digesten worden op een 1% agarosegel geladen (zie figuur 3.1.9.)

1

2

3

4

5

6

7

Figuur 3.1.9. Digesten uitgevoerd op de kolonies van het 4000bp insert + pUC18 vector. Laan 1: HindIII Laan 2: PvuII Laan 3: BamHI-HindIII Laan 4: BglI Laan 5: HaeII Laan 6: SacII Laan 7: 3 µl λ PstI

De bekomen fragmenten stemmen overeen met de berekende waarden. Het flankerende construct werd vervolgens gesequeneerd, waaruit de sequentie van het cyt c-551 en de naastliggende genen afgeleid kon worden. Het 4000 bp HindIII fragment bezit het gen voor het cyt c-551 (zie figuur 3.1.10. 4000 bp fragment). De sequentie in dit fragment bevat echter enkel de sequenties van de genen die stroomafwaarts van het cyt c-551 gen gelegen zijn, terwijl stroomopwaarts nog een aantal genen moeten bepaald worden.

101

ttaacgacggccgtgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatcccttccga 1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60 aattgctgccggcacggttcgaacgtacggacgtccagctgagatctcctagggaaggct N D G R A K L A C L Q V D S R G S L P I 1. Putative protein tccaggaatcaacggcaatccagatcaaggctcccgagatcgccgagaacggcgctttcg 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120 aggtccttagttgccgttaggtctagttccgagggctctagcggctcttgccgcgaaagc Q E S T A I Q I K A P E I A E N G A F V tgccagtaacggtagcgaccagtattcccggcgcgaccaatatcagcattttcactccgg 121 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180 acggtcattgccatcgctggtcataagggccgcgctggttatagtcgtaaaagtgaggcc P V T V A T S I P G A T N I S I F T P A caaacttcagcccgatggtggcttcgttcgacgtgctgccgcgcatgaagcccgaggttt 181 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240 gtttgaagtcgggctaccaccgaagcaagctgcacgacggcgcgtacttcgggctccaaa N F S P M V A S F D V L P R M K P E V S cgcttcgcatgaggatggccaagaccgaaaatctcgtcgtcgtcgtccaggcgggcggca 241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300 gcgaagcgtactcctaccggttctggcttttagagcagcagcagcaggtccgcccgccgt L R M R M A K T E N L V V V V Q A G G K agctctaccgggcggttcgcgaagtcaaggtgaccatcggcggctgtggcggataatcga 301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 360 tcgagatggcccgccaagcgcttcagttccactggtagccgccgacaccgcctattagct L Y R A V R E V K V T I G G C G G * S I taaccattcaaaacacatttcaggagtgaaataatgaaaatcaaagcagtagtccagaat 361 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420 attggtaagttttgtgtaaagtcctcactttattacttttagtttcgtcatcaggtctta * P F K T H F R S E I M K I K A V V Q N 2. Putative protein gacgccgtctcggtcaaaatgctcatcccgcatccgatggagaccggccgccgcaaagag 421 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 480 ctgcggcagagccagttttacgagtagggcgtaggctacctctggccggcggcgtttctc D A V S V K M L I P H P M E T G R R K E cagaacggtacgcttgtcccgcaccatttcatcaccgaggtgacggccactcacaacggc 481 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 540 gtcttgccatgcgaacagggcgtggtaaagtagtggctccactgccggtgagtgttgccg Q N G T L V P H H F I T E V T A T H N G cagaccgttttccatgccgaactcggccccggcgtctcgaaagatccctatctgtctttc 541 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600 gtctggcaaaaggtacggcttgagccggggccgcagagctttctagggatagacagaaag Q T V F H A E L G P G V S K D P Y L S F cagttcaccggcgccaaggcaggcgacatgctgaaggtctcctgggttgacaacaaaggc 601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 660 gtcaagtggccgcggttccgtccgctgtacgacttccagaggacccaactgttgtttccg Q F T G A K A G D M L K V S W V D N K G ggttccgaaaccgctgaggcagccattacggcgatgtaattccaaccacaggagaaccca 661 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 720 ccaaggctttggcgactccgtcggtaatgccgctacattaaggttggtgtcctcttgggt G S E T A E A A I T A M * F Q P Q E N P -

102

tccatgaaaaaaacaattcagcgagggctgtttaccggcgcgctcgttctcttgacagcc 721 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 780 aggtactttttttgttaagtcgctcccgacaaatggccgcgcgagcaagagaactgtcgg S M K K T I Q R G L F T G A L V L L T A 3. c-551 homoloog SoxA atgacgtcgaagccggctcacgccgccgtcaattaccaggctctggtcgatgcggatgtc 781 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 840 tactgcagcttcggccgagtgcggcggcagttaatggtccgagaccagctacgcctacag M T S K P A H A A V N Y Q A L V D A D V aaaaaattccagggctattttctcaaggagtttccgggcgtgaagcttgaggacttcggc 841 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900 ttttttaaggtcccgataaaagagttcctcaaaggcccgcacttcgaactcctgaagccg K K F Q G Y F L K E F P G V K L E D F G gatggcgtttacgctctcgatgaggattcccgcaagcagtggaaggagatggaggagttt 901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 960 ctaccgcaaatgcgagagctactcctaagggcgttcgtcaccttcctctacctcctcaaa D G V Y A L D E D S R K Q W K E M E E F ccgccttatgaactcgatgtcgaggcgggcaaggcgctcttcaacaagcccttcgccaat 961 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1020 ggcggaatacttgagctacagctccgcccgttccgcgagaagttgttcgggaagcggtta P P Y E L D V E A G K A L F N K P F A N ggcaaatcgctggggagctgcttttcgaacgggggagccgtgcgcggcatgtatccctac 1021 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1080 ccgtttagcgacccctcgacgaaaagcttgccccctcggcacgcgccgtacatagggatg G K S L G S C F S N G G A V R G M Y P Y ttcgacgagaagcgcaaagaggtgataacgctcgaaatggccatcaacgagtgccgcgtg 1081 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1140 aagctgctcttcgcgtttctccactattgcgagctttaccggtagttgctcacggcgcac F D E K R K E V I T L E M A I N E C R V gccaatggcgaaaaaccctatgccccgaaaaaaggggacattgccagggtttcggcctac 1141 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200 cggttaccgctttttgggatacggggcttttttcccctgtaacggtcccaaagccggatg A N G E K P Y A P K K G D I A R V S A Y atcgcctcgatcagccgcggccagaaaatcgatgtcaaggtgaagagcaaggcggcttac 1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1260 tagcggagctagtcggcgccggtcttttagctacagttccacttctcgttccgccgaatg I A S I S R G Q K I D V K V K S K A A Y gacgcctacatgaagggcaaggagatgttttacgccaagcgcgggcaactcaacatgtcg 1261 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1320 ctgcggatgtacttcccgttcctctacaaaatgcggttcgcgcccgttgagttgtacagc D A Y M K G K E M F Y A K R G Q L N M S tgctccggctgccacatggagtattccggacgtcacctgagggccgaaatcatcagcccg 1321 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1380 acgaggccgacggtgtacctcataaggcctgcagtggactcccggctttagtagtcgggc C S G C H M E Y S G R H L R A E I I S P gcgctcggacacaccacgcacttcccggtgttccgctcgaaatggggcgaaatcggcacc 1381 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1440 cgcgagcctgtgtggtgcgtgaagggccacaaggcgagctttaccccgctttagccgtgg A L G H T T H F P V F R S K W G E I G T -

103

ttgcacagacgctacgccggttgcaacgaaaacatcggagccaagccgttccctgcgcag 1441 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500 aacgtgtctgcgatgcggccaacgttgcttttgtagcctcggttcggcaagggacgcgtc L H R R Y A G C N E N I G A K P F P A Q agcaaagagtatcgcgatctggaatttttccagacggtcatgtcaaacggcctgaagttc 1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1560 tcgtttctcatagcgctagaccttaaaaaggtctgccagtacagtttgccggacttcaag S K E Y R D L E F F Q T V M S N G L K F aatggcccggcatcaagaaaataagaagaagaaaccatgaaaaaagtgttatcgctcttg 1561 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1620 ttaccgggccgtagttcttttattcttcttctttggtacttttttcacaatagcgagaac N G P A S R K * E E E T M K K V L S L L 4. Putative protein agcttgctgctactcacgccttccgcttcattgctgctggccgaaccaacggcggctccg 1621 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1680 tcgaacgacgatgagtgcggaaggcgaagtaacgacgaccggcttggttgccgccgaggc S L L L L T P S A S L L L A E P T A A P gcggtctcttcgccgctgatcgaccaggcagaggcggcgcgcaaggaggcggacgcgctc 1681 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1740 cgccagagaagcggcgactagctggtccgtctccgccgcgcgttcctccgcctgcgcgag A V S S P L I D Q A E A A R K E A D A L ggttacgagtggcgtgatacgggcgcattgattcagtccgccaaggatgcgctccagaaa 1741 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800 ccaatgctcaccgcactatgcccgcgtaactaagtcaggcggttcctacgcgaggtcttt G Y E W R D T G A L I Q S A K D A L Q K ggccagcaggcggagtccgacaaactcgcttcgcaagcgcttttccaggcccgcgcggcg 1801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1860 ccggtcgtccgcctcaggctgtttgagcgaagcgttcgcgaaaaggtccgggcgcgccgc G Q Q A E S D K L A S Q A L F Q A R A A acagcgcagggccagtacatggcaaagaactggaagatgatgattcccaaaaactgattt 1861 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1920 tgtcgcgtcccggtcatgtaccgtttcttgaccttctactactaagggtttttgactaaa T A Q G Q Y M A K N W K M M I P K N * F ccgtcgggatgtcggctgagcccctcaccgacgtcccgatcttcattgatcagtagtttt 1921 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1980 ggcagccctacagccgactcggggagtggctgcagggctagaagtaactagtcatcaaaa acggcaacccaaaccgccccgattcatgaacctatcccgtcgtgagtttctccgcattct 1981 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2040 tgccgttgggtttggcggggctaagtacttggatagggcagcactcaaagaggcgtaaga R Q P K P P R F M N L S R R E F L R I L 5. Homoloog SoxB sulfur oxidation protein cggatttgccggagccgcaggccttctgcctgggctggcttccgcggcaggcagcccctc 2041 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2100 gcctaaacggcctcggcgtccggaagacggacccgaccgaaggcgccgtccgtcggggag G F A G A A G L L P G L A S A A G S P S cgatctttatgatctcggtcagtccggcgacattcgcttgttgcacatcacggataccca 2101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2160 gctagaaatactagagccagtcaggccgctgtaagcgaacaacgtgtagtgcctatgggt D L Y D L G Q S G D I R L L H I T D T H -

104

tgcccagctcatgccgatctactaccgtgaacccagcctgaacctcgggctcggccaggc 2161 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2220 acgggtcgagtacggctagatgatggcacttgggtcggacttggagcccgagccggtccg A Q L M P I Y Y R E P S L N L G L G Q A attcggacgtcctcctcacctcgtgacggagtcgctcttgaaatattacggcatcgcaCC 2221 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2280 taagcctgcaggaggagtggagcactgcctcagcgagaactttataatgccgtagcgtGG F G R P P H L V T E S L L K Y Y G I A P tggtacgccgctcgcacatgcctataccgcgatcaactatgccgaggcggcgcagcggtt 2281 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2340 accatgcggcgagcgtgtacggatatggcgctagttgatacggctccgccgcgtcgccaa G T P L A H A Y T A I N Y A E A A Q R F cggaaaggttggcggtttcgcgcatctgaagacgctcgttgaccggatgcgttcggagta 2341 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2400 gcctttccaaccgccaaagcgcgtagacttctgcgagcaactggcctacgcaagcctcat G K V G G F A H L K T L V D R M R S E Y cggatccgacaagaccctcctgctcgatggcggcgacacctggcagggttcgggaacagc 2401 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2460 gcctaggctgttctgggaggacgagctaccgccgctgtggaccgtcccaagcccttgtcg G S D K T L L L D G G D T W Q G S G T A gttctggaatcgcggcatggacatggtcgaggcctgcaatttgctcggcgtcgatgtgat 2461 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2520 caagaccttagcgccgtacctgtaccagctccggacgttaaacgagccgcagctacacta F W N R G M D M V E A C N L L G V D V M gacgggtcactgggagttcacctatctcgaagaggaggtactcaaaaacctcgcggcttt 2521 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2580 ctgcccagtgaccctcaagtggatagagcttctcctccatgagtttttggagcgccgaaa T G H W E F T Y L E E E V L K N L A A F caagggcgacttcgtggcgcagaatatcaaggtcaaggaggatgcgctcttcaacggagc 2581 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2640 gttcccgctgaagcaccgcgtcttatagttccagttcctcctacgcgagaagttgcctcg K G D F V A Q N I K V K E D A L F N G A caaggcgttcgacgagaattccggacacgccttccgtccctacgtggtcaaagcggtggg 2641 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2700 gttccgcaagctgctcttaaggcctgtgcggaaggcagggatgcaccagtttcgccaccc K A F D E N S G H A F R P Y V V K A V G caagcaccgcgtcgccgtgattggccaggcgtttccctacacgccgatcgccaatcccgc 2701 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2760 gttcgtggcgcagcggcactaaccggtccgcaaagggatgtgcggctagcggttagggcg K H R V A V I G Q A F P Y T P I A N P A ccgcttcattccgaactggaccttcggcatcaatgccagcgacatgcagcagcttgtcga 2761 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2820 ggcgaagtaaggcttgacctggaagccgtagttacggtcgctgtacgtcgtcgaacagct R F I P N W T F G I N A S D M Q Q L V D taccgttcgctccaagaagaagcctgacgcggtcgtgctgatctcgcacaacgggatgga 2821 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2880 atggcaagcgaggttcttcttcggactgcgccagcacgactagagcgtgttgccctacct T V R S K K K P D A V V L I S H N G M D -

105

tgttgacgtcaagctcgcgcaggtggtcagcggcatcgacgtgattttcggcggccacac 2881 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2940 acaactgcagttcgagcgcgtccaccagtcgccgtagctgcactaaaagccgccggtgtg V D V K L A Q V V S G I D V I F G G H T ccatgacggcgtaccgcagcccttcgtcgtgcagaacgccaaggggcgaacgctcgtcac 2941 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3000 ggtactgccgcatggcgtcgggaagcagcacgtcttgcggttccccgcttgcgagcagtg H D G V P Q P F V V Q N A K G R T L V T caacgccggatcgaacggcaaattcctcggcgtcatcgacctcaagctcggcaatggcgg 3001 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3060 gttgcggcctagcttgccgtttaaggagccgcagtagctggagttcgagccgttaccgcc N A G S N G K F L G V I D L K L G N G G cgtcaaggagtataattacaagttgcttcccgtcttttccaacgaacttccggcgcacaa 3061 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3120 gcagttcctcatattaatgttcaacgaagggcagaaaaggttgcttgaaggccgcgtgtt V K E Y N Y K L L P V F S N E L P A H N cgggatgcaggcgctgatcgacaaaacccgcgcaccctacctcgacaagctcaacgagcc 3121 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3180 gccctacgtccgcgactagctgttttgggcgcgtgggatggagctgttcgagttgctcgg G M Q A L I D K T R A P Y L D K L N E P actcgccgtggccggatcgctgctctaccggcgcggcaatttcgacggcccgttcgacca 3181 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3240 tgagcggcaccggcctagcgacgagatggccgcgccgttaaagctgccgggcaagctggt L A V A G S L L Y R R G N F D G P F D Q gatcatctgcaacgcgcttcgccagcagaacgacgcgcagatttcgctttcgcccggctt 3241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3300 ctagtagacgttgcgcgaagcggtcgtcttgctgcgcgtctaaagcgaaagcgggccgaa I I C N A L R Q Q N D A Q I S L S P G F ccgctggggtacgagcattttgcccggccagaccatcacgatggagcacgtgctcgacca 3301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3360 ggcgaccccatgctcgtaaaacgggccggtctggtagtgctacctcgtgcacgagctggt R W G T S I L P G Q T I T M E H V L D Q gacctgcatgacctatcccgaaacctacgtgcgcgacatgaccggccagcagatcaagga 3361 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3420 ctggacgtactggatagggctttggatgcacgcgctgtactggccggtcgtctagttcct T C M T Y P E T Y V R D M T G Q Q I K D cattctcgaagacgtggccgacaaccttttcaatctcgatcccttctaccagcagggcgg 3421 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3480 gtaagagcttctgcaccggctgttggaaaagttagagctagggaagatggtcgtcccgcc I L E D V A D N L F N L D P F Y Q Q G G cgacatggtgcgcaccggcggtctgagctatcggatcgatccgatggcctcgatgggcaa 3481 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3540 gctgtaccacgcgtggccgccagactcgatagcctagctaggctaccggagctacccgtt D M V R T G G L S Y R I D P M A S M G K gcgcatcgacaacatgcggctcgaaaacggcaaggtggtggatgcttcgcaaaagtaccg 3541 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3600 cgcgtagctgttgtacgccgagcttttgccgttccaccacctacgaagcgttttcatggc R I D N M R L E N G K V V D A S Q K Y R tgttgcaggctgggcgaccgtgggcgcaaagtcgccgggcgagccggtttgggataccgt

106

3601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3660 acaacgtccgacccgctggcacccgcgtttcagcggcccgctcggccaaaccctatggca V A G W A T V G A K S P G E P V W D T V ggccgcttatctgaaagataaaaaggtggtcgaagtgaaaaagctcaaccagcccgaatt 3661 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3720 ccggcgaatagactttctatttttccaccagcttcactttttcgagttggtcgggcttaa A A Y L K D K K V V E V K K L N Q P E F caaaaacatgggcagcaatccgggaatcgatctcacctgaggcgaagatcgtcagcggac 3721 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3780 gtttttgtacccgtcgttaggcccttagctagagtggactccgcttctagcagtcgcctg K N M G S N P G I D L T * G E D R Q R T aaggctgttgcagaagcgaaaccgcgactgattcccgtttctgtcctgaacggagggctg 3781 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3840 ttccgacaacgtcttcgctttggcgctgactaagggcaaagacaggacttgcctcccgac gaatgtgcacccttcgtcagccaacagatttttgcttttgagaactccgtttgctttttt 3841 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3900 cttacacgtgggaagcagtcggttgtctaaaaacgaaaactcttgaggcaaacgaaaaaa tctgaaagagcctgttgacggacttcgtttgttttgaaaagctcaatccatgaatggttc 3901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 3960 agactttctcggacaactgcctgaagcaaacaaaacttttcgagttaggtacttaccaag atgaaatccattaaaaaattgttcgccacctcaatcgtggcgctttcgatgattggcgcg 3961 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4020 tactttaggtaattttttaacaagcggtggagttagcaccgcgaaagctactaaccgcgc M K S I K K L F A T S I V A L S M I G A 6. Thioldisulfide interchange protein : HelX homoloog cttccggcaacaagcgcgagcgcggcggttcctcccgcgagccaggccgtcgcgggcaaa 4021 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4080 gaaggccgttgttcgcgctcgcgccgccaaggagggcgctcggtccggcagcgcccgttt L P A T S A S A A V P P A S Q A V A G K gtcgccccggcgttccggatcaaaacgctcgacggcaaggagttgaagagttcgcagctt 4081 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4140 cagcggggccgcaaggcctagttttgcgagctgccgttcctcaacttctcaagcgtcgaa V A P A F R I K T L D G K E L K S S Q L gccggacggccctacatcgtcaactttttcgcctcgtggtgcccgccctgccgtgaggag 4141 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4200 cggcctgccgggatgtagcagttgaaaaagcggagcaccacgggcgggacggcactcctc A G R P Y I V N F F A S W C P P C R E E ctgcccggcatggtggcattgcagaaaaagtatgcaaacaagggcttcacttttatcggc 4201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4260 gacgggccgtaccaccgtaacgtctttttcatacgtttgttcccgaagtgaaaatagccg L P G M V A L Q K K Y A N K G F T F I G atcgcttttcgggatcgccccgcgacgctgcccgattttctctgggagatgggggtcgac 4261 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4320 tagcgaaaagccctagcggggcgctgcgacgggctaaaagagaccctctacccccagctg I A F R D R P A T L P D F L W E M G V D tatccggtcggcctcaccactcctgaactcgaagccgcgtttggcaagctcatgccgggc 4321 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4380 ataggccagccggagtggtgaggacttgagcttcggcgcaaaccgttcgagtacggcccg Y P V G L T T P E L E A A F G K L M P G -

107

ggaaaaatccgcgcgattccggcaaccttcgtcgttggccgcgatggcaagattctcaat 4381 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4440 cctttttaggcgcgctaaggccgttggaagcagcaaccggcgctaccgttctaagagtta G K I R A I P A T F V V G R D G K I L N gccgtgagtggcggcctcaccagagaggacttcgagtcgctcatcatcaaggcggtcaac 4441 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4500 cggcactcaccgccggagtggtctctcctgaagctcagcgagtagtagttccgccagttg A V S G G L T R E D F E S L I I K A V N accagacctgtaaagtaagctcacgaagcgaggcttcccggatttccctctccctcgacc 4501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4560 tggtctggacatttcattcgagtgcttcgctccgaagggcctaaagggagagggagctgg T R P V K * A H E A R L P G F P S P S T ctgcccgaacatcctctccatctcctccattcgctgaaccggcccagagagagcgccggt 4561 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4620 gacgggcttgtaggagaggtagaggaggtaagcgacttggccgggtctctctcgcggcca tcagcgattcttgctttatgcgtggcgatcatttgcagccggccatcacggagctgtcag 4621 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4680 agtcgctaagaacgaaatacgcaccgctagtaaacgtcggccggtagtgcctcgacagtc gcaaaatggcttttccgcgccggcgctgtttcttgtttggttttgtagttcatattaaat 4681 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4740 cgttttaccgaaaaggcgcggccgcgacaaagaacaaaccaaaacatcaagtataattta atattcatttgtttgataaacgatttggttatatagttaaatcgttgattttaaggcagt 4741 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4800 tataagtaaacaaactatttgctaaaccaatatatcaatttagcaactaaaattccgtca gacaggtttctgtttccaaggctgtttgggcgttatgcgcgcaggctgtgcgcggagagc 4801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4860 ctgtccaaagacaaaggttccgacaaacccgcaatacgcgcgtccgacacgcgcctctcg tgaaaaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccgggtaccgagctcgaat 4861 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 4920 actttttcgaacgtacggacgtccagctgagatctcctaggggcccatggctcgagctta ta 4921 -- 4922 at Figuur 3.1.10. Nucleotidesequentie van het HindIII fragment van 4000 baseparen. De in contrast aangeduide aminozuursequenties stemmen in volgorde overeen met de volgende genummerde proteïnes : 1. Putative protein 2. Putative protein 3. c-551 homoloog SoxA 4. Putative protein 5. Homoloog SoxB sulfur oxidation protein 6. Thioldisulfide interchange protein : HelX homoloog

De sequentie-informatie werd in databanken gebracht, zodat homologe proteïnen ermee kunnen gealigneerd worden. Op deze manier kan voor elk open leesraam een functie toegezegd worden. Om het ganse operon van de thiosulfaatverbruikende gencluster te kennen moet een groter gensegment gekloneerd worden. Er werd verder gewerkt met een EcoRI fragment van 8000 baseparen.

108

3. Het pUC18 + E8000 construct. Aangezien de flankerende sequenties stroomopwaarts van het cytochroom c-551 gen nog moeten bepaald worden, werd geopteerd om een genomische bank met het E8000 fragment aan te leggen. 3.1. Koloniehybridisatie op het EcoRI fragment van 8000 bp 3.1.1. Digest van chromosomaal DNA met EcoRI Digest van het chromosomaal DNA (het digest werd in tienvoud uitgevoerd): 15 µl chrDNA 5 µl EcoRI buffer 3 µl enzym EcoRI 27 µl dH2O 50 µl totaal Het digest werd gedurende 6 uur geïncubeerd bij 37°C. De digesten werden op agarosegel geladen, waarna het 8000 bp fragment preparatief werd uitgesneden, en met QIAEX II geëlueerd. Het eluaat werd op 1% agarosegel gecontroleerd (zie figuur 3.1.11).

1

2

3

Figuur 3.1.11. Gezuiverde EcoRI digesten van 8000 bp Laan 1 en 2: 2µl 8000 bp Laan 3: 3µl λ PstI

109

3.1.2. Ligatie van de 8000 bp fragmenten in de pUC18 vector. •

Bepalen van de concentratie: via de intensiteit van de banden op de agarosegel (zie figuur 3.1.11.) vindt men: voor het E8000 fragment: 40 ng / 2 µl. ng (vector ) × kb(insert ) 3 Via de formule × = ng insert , berekent men voor de kb(vector ) 1 hoeveelheid chrDNA die nodig is voor ligatie, vertrekkend van 50 ng vector 50ng (vector ) × 8kb(insert ) 3 (pUC18/EcoRI/BAP, Pharmacia) , × = 400ng . 3kb( pUC18 − vector ) 1 400ng insert stemt overeen met 20 µl insert. De verhouding insert / vector moet tenminste 8:1 bedragen.

•

Ligatie van het insert in de pUC18 vector. Ligatiemengsel: 20 µl insert (E8000) 1 µl vector (pUC18/EcoRI/BAP, Pharmacia) 2.5 µl ligasebuffer 1 µl ligase 0.5 µl dH2O 25 µl totaal. De ligatie werd overnacht geïncubeerd bij 4°C.

De ligatieprodukten (figuur 3.1.12b.) werden met QIAquick gezuiverd en geëlueerd in steriel dH2O.

Figuur 3.1.12a. pUC18 vector vector met E8000 bp insert

Figuur 3.1.12b. pUC18

3.1.3. Transformatie. Elektroporatie van het ligatieprodukt gebeurde in DH10B elektrocompetente cellen (2.5 kV, 200 Ω, 25 µF). De DH10B cellen zijn geschikt voor de opname van grote pasmiden (of van plasmiden met grote inserts). 100 µl cellen werden vervolgens uitgeplaat op selectieve agarplaten, en overnacht geïncubeerd bij 37°C. 110

3.1.4. Controle van de gegroeide kolonies. 12 witte kolonies werden afgepikt waarvan pDNA volgens de Birnboimmethode bereid werd. Na een restrictieanalyse met EcoRI werd nagegaan welk percentage van de kolonies een insert van 8000 bp bevat. Telkens bleek een onvoldoende aantal kolonies een insert van de juiste grootte te bevatten. Daarom werd er niet verder doorgegaan met deze bank, en werd geopteerd om een kleiner fragment te zoeken die de nodige informatie zou geven omtrent de flankerende genen. 4. Hybridisatie van het chromosomaal DNA van Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum met het flavoproteïne van Chlorobium tepidum. 4.1. Principe (doel) Omdat het experiment met de genbank van E8000 te moeilijk en zonder resultaat verlopen is, en omdat we nu slechts de ene helft van het thiosulfaat verbruikend operon kennen (uit het HindIII fragment van 4000 bp), werd getracht de andere helft te bepalen, door het chrDNA te hybridiseren met een heteroloog gen. Van Chlorobium tepidum is het volledige genoom gekend, en men weet dat er een flavoproteïne voorkomt dat aan het gen coderend voor het cytochroom c-551 voorafgaat. In een eerste fase werd nagegaan of Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum eveneens over het flavoproteïne beschikt, en in een tweede fase of het deel uitmaakt van het operon. 4.2. PCR amplificatie van het flavoproteïne van Chlorobium tepidum. Een PCR-amplificatiereactie werd ingezet op het flavoproteïne van Chlorobium tepidum met de primers FlavotepN en FlavotepC (zie Materiaal en Methode: primers in Tabel 2.II.). De amplificatie werd in vijfvoud ingezet (5 X 50 µl). 5 µl dNTP’s (10 mM) 5 µl reactiebuffer 1 µl primer 1 1 µl primer 2 1 µl template (totaalchromosomaal DNA bereid van Chlorobium tepidum) 1 µl Taq DNA polymerase 36 µl dH2O 50 µl totaal volume. Het Taq DNA-polymerase voegt aan het 3’ uiteinde van dsDNA een enkel nucleotide toe, meestal een adenosine. Dit overhangend residu kan ligatie vergemakkelijken wanneer de kloneringsvector de complementaire thymidinebase bevat, zoals dit het geval is met de pGEM-T vector (Promega) (Sambrook et al., 1989). PCR programma: 1. Denaturatie: 95°C gedurende 7 min 2. 30 cycli: • denaturatie: 95°C gedurende 45 sec • annealing: 52°C gedurende 1 min • extentie: 72°C gedurende 1 min 111

3. 10 min bij 72°C 4. einde bij 4°C. 4.3. Zuivering van het PCR produkt. Het PCR-amplificatie product werd preparatief op gel geladen om het fragment te zuiveren (figuur 3.1.13), waarna het DNA uit de agarose werd geëxtraheerd met de QIAquick gel extraction kit. Elutie gebeurde in een totaal volume van 60 µl dH2O. 5 µl van het eluaat werden ter controle op agarosegel geladen (figuur 3.1.14.).

1

2

Figuur 3.1.13. PCR amplifikaat van het flavoproteïne van Chlorobium tepidum Laan 1: λ PstI, 3 µl Laan 2: 1300 bp band van het flavoproteïne

1

2

Figuur 3.1.14. Gezuiverde PCR amplificatieprodukt van het flavoproteïne van Chlorobium tepidum Laan 1: flavoproteïne, 5µl. Laan 2: 3 µl λ PstI

112

4.4. Klonering van het PCR produkt in de pGEM-T vector. Bepalen van de concentratie: via de intensiteit van de banden op de agarosegel (zie figuur 3.1.14.) vindt men: voor het flavoproteïne fragment: 100 ng / 2 µl. ng (vector ) × kb(insert ) 3 Via de formule × = ng insert , berekent men voor de hoeveelheid kb(vector ) 1 insert die nodig is voor ligatie, vertrekkend van 50 ng vector, 50ng (vector ) × 1.3kb(insert ) 3 × = 200ng . 3kb( pGEM − Tvector ) 1 200ng stemen overeen met 4 µl insert. We nemen 5 µl insert voor het ligatiemengsel. Ligatie in pGEM-T vector: 5 µl insert 2 µl ligasebuffer 1 µl pGEM-T vector (50ng/µl) 11 µl dH2O 1 µl ligase Overnacht ligeren bij 4°C. De ligatie (figuur 3.1.15b.) werd met QIAquick gezuiverd.

Figuur 3.1.15a. pGEM-T vector met flavotep insert (1250 bp)

Figuur 3.1.15b. pGEM-T vector

4.5. Electroporatie van de ligatie, bereiding van pDNA en controle van de ligatie. Elektrotransformatie gebeurde in XLI-blue cellen (2.5 kV, 200 Ω, 25 µF), waarop wit/blauw screening (50ng/ml X-gal, 100mM IPTG) de identificatie van de positieve klones mogelijk maakt. Uit 24 positieve kolonies werd pDNA bereid volgens de Birnboim methode.

113

Digesten op BB pDNA’s: ApaI- PstI 5 µl pDNA 3 µl One Phor All buffer (Pharmacia) 1 µl RNase 1 µl ApaI (Pharmacia) 1 µl PstI (Pharmacia) 19 µl dH2O 30 µl Totaal. Digesten incuberen bij 37°C, gedurende 3 uur. Men verwacht een bandje van 3003 bp en een bandje van 1250 bp. De digesten werden op 1% agarosegel geladen (figuur 3.1.16.).

1

2

14 15

3

4

5

16 17 18 19 20

6

7

21 22

8

23 24

9

10

11

12

13

25 26

Figuur 3.1.16. 24 Birnboimkolonies gedigereerd met ApaI-PstI Laan 1-6, 8-13, 14-22 en 24-26 : digesten Laantjes 7 en 23: 3 µl λ PstI

Besluit: men stelt vast dat er meerdere goede kandidaten voorkomen. Eén van de kolonies werd ingediend voor sequentiebepaling. 4.6. Hybridisatie. In deze eerste fase wenst men te weten te komen of Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum, net zoals Chlorobium tepidum, over een flavoproteïne beschikt. Daarvoor werd het chrDNA van Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum gehybridiseerd met het gen coderend voor het flavoproteïne van Chlorobium tepidum als probe.

114

4.6.1. Digest van het chromosomaal DNA. ChrDNA van Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum werd gedigereerd met BamHI, EcoRI, HindIII, en op gel geladen (figuur 3.1.17). Digesten: 3 µl buffer 5 µl chrDNA 1 µl enzym 21 µl dH2O 30 µl totaal. 3 uur incuberen bij 37°C.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11

Figuur 3.1.17. Digesten op chrDNA: BamHI, EcoRI, en HindIII Laan1: λ PstI Laan 2: BamHI Laan 3: EcoRI Laan 4: HindIII

Laan 5: Smart lengtemerker Laan 6: BamHI Laan 7: EcoRI Laan 8: HindIII

Laan 9: Smart Laan 10: chrDNA ongedigereerd Laan 11: chrDNA ongedigereerd

4.6.2. Transfer van het restrictiepatroon op een positief geladen membraan (Southern blot procedure). Het gel werd gedurende 10 min in een depurinatie-oplossing gebracht. Vervolgens werd het gel 30 min behandeld met een denatruatie-oplossing, waarna het gel in een neutralisatieoplossing werd geplaatst gedurende 15 min bij kamertemperatuur. Het nucleïnezuurmateriaal werd overgebracht naar een nylonfilter en erop gefixeerd door UV-bestraling. 4.6.3. Bereiding van de probe (DIG-gelabeled) Het flavoproteïne werd PCR-geamplificeerd met de primers FlavotepN en FlavotepC (zie Materiaal en Methode Tabel 2.II.).

115

De PCR reactie werd in vijfvoud ingezet: 5 µl DIG dNTP’s 5 µl reactiebuffer 1 µl primer 1 (FlavotepN) 1 µl primer 2 (FlavotepC) 1 µl template (pGEM-T + flavotep) 1 µl Taq DNA polymerase 36 µl dH2O 50 µl totaal. PCR programma: 1. Denaturatie: 95°C gedurende 7 min 2. 30 cycli: • denaturatie: 95°C gedurende 45 sec • annealing: 52°C gedurende 1 min • extentie: 72°C gedurende 1 min 3. einde bij 4°C. 4.6.4. Prehybridisatie, hybridisatie en detectie van de membraan. De membraan werd 30 min geprehybridiseerd, terwijl de probe gedurende 10 min opgekookt en onmiddellijk afgekoeld werd. 20 ng probe per milliliter hybridisatie-oplossing werd toegevoegd. De membraan werd overnacht bij 42°C met de probe gehybridiseerd. Detectie gebeurde op basis van chemiluminescentie. Het gen van het flavoproteïne van Chlorobium tepidum hybridiseert met een BamHI-fragment van 7000bp, met een EcoRI-fragment van ongeveer 8500 bp, en met een HindIII-fragment van ongeveer 3500bp (zie figuur 3.1.18).

1

2 3

4

5

6 7 8

9 10 11

Figuur 3.1.18. Hybridisatie van chrDNA van Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum met het flavoproteïne van Chlorobium tepidum Laan 1: λ PstI Laan 5: Smart lengtemerker Laan 9: Smart Laan 2: BamHI Laan 6: BamHI Laan 10: chrDNA ongedigereerd Laan 3: EcoRI Laan 7: EcoRI Laan 11: chrDNA ongedigereerd Laan 4: HindIII Laan 8:HindIII

116

II. Overexpressie van het cyt c-551 gen. 1. Doel en principe bij de constructie van de plasmiden voor de overexpressie-experimenten. Aangezien de signaalsequentie van het cyt c-551 gen waarschijnlijk geen klievingssite bevat, werd besloten om de signaalsequentie van de cytochroom subeenheid van flavocytochroom c552 van Chromatium vinosum te gebruiken. Op deze manier kan bij overexpressie het proteïne van cyt c-551 oplosbaar in de periplasma terecht komen. Zodoende moeten beide sequenties aan elkaar gehecht worden. Dit gebeurt a.d.h.v. een chimere primer in een tweestaps PCR-amplificatiereactie, waarbij het eerste PCR-produkt, de signaalsequentie van Chromatium vinosum, met zijn 18 overhangende baseparen aan het einde, zal associeren met het cyt c-551. Dit zal leiden tot amplificatie van het cyt c-551 in de tweede PCR-reactie (zie figuur 3.2.1.).

Figuur 3.2.1. Principe van de tweestaps-PCR reactie ter synthese van de chimere primer.

Uiteindelijk zal hierbij een chimeer construct volgen (signchr. + cyt c-551) met een NcoI restrictiesite op 5’ en een BglII site op 3’, die kan ingebouwd worden in een plasmide. Deze plasmiden worden getransformeerd in een geschikte gastheer, waarna overexpressie kan ingezet worden. 2. Construct pQE-60 + sign.chr. + cyt c-551. 2.1. Tweestaps PCR-amplificatie van het chimere construct. Bij de PCR-amplificatie van de signaalsequentie van Chromatium vinosum werd een 300 bp segment dat de signaalsequentie bevat als template gebruikt. Er werd een eerste buitenste primer gebruikt (SignChrNco) die een NcoI restrictiesite bevat, en die gebaseerd is op het Nterminale gedeelte van de signaalsequentie van Chromatium vinosum. De tweede (chimere) primer (ChimccI) is opgebouwd uit 18 bp van cyt c-551 en 18 bp van de signaalsequentie. In de eerste reactie werd de signaalsequentie van Chromatium vinosum geamplificeerd, waarna het met zijn 18 bp overhangend gedeelte (afkomstig van de chimere primer ChimccI) zal hybridiseren met de sequentie van het cyt c-551 gen. PCR-Reactie 1: 1 µl dNTP mix (dNTP’s 10 X verdund) 1 µl primer SignchrNCOI 1 µl primer ChimccI 5 µl PCR reactiebuffer 1 µl Chr. vinosum FCSD template 40 µl dH2O 117

0.5 µl Pwo DNA-polymerase enzym PCR programma: • 90 sec 95°C • 2 min 80°C • 30 sec 95°C 60 sec 50°C • 30 sec 95°C 30 sec 52°C

30 sec 72°C 30 sec 72°C

(5 cycli) (30 cycli)

Het Pwo DNA-polymerase bezit een 3’-5’ exonuclease activiteit, zodat in dit geval geen adenosine nucleotide aan het 3’ uiteinde van het PCR-product werd toegevoegd. Dit maakt de fusie tussen de twee doelsequenties mogelijk. Dit eerste PCR-product (de signaalsequentie) werd op agarosegel geladen (figuur 3.2.2.) om het overeenkomstig 100 bp bandje preparatief uit te snijden. Het DNA werd uit de agarose geëxtraheerd met QIAEX II en op gel gecontroleerd (figuur 3.2.3.).

1

2

3

4

5

6

Figuur 3.2.2. PCR produkt: signaalsequentie van Chromatium vinosum (100bp) Laan 1: 3 µl λ PstI Laan 2-6: PCR produkt.

In de tweede PCR-reactie gaat het eerste PCR-product via zijn overhangend uiteinde hybridiseren met het cyt c-551 gen in het pUC18 + B2400 construct en het fragment zal geamplificeerd worden door toevoegen van de primers Signchrnco en Cytstbgl (zie Materiaal en Methode tabel 2.II.).

118

1

2

Figuur 3.2.3. PCR produkt: signaalsequentie van Chromatium vinosum (100bp) Laan 1: 3 µl λ PstI Laan 2: 2 µl PCR produkt.

PCR-Reactie 2: 1 µl dNTP mix (dNTP’s 10 X verdund) 1 µl SignchrNCOI (1ste buitenste primer) 1 µl CytstBgl (2de buitenste primer) 5 µl PCR reactiebuffer 1 µl B2400 (50 X verdund) 1 µl PCR-reactieproduct 1 40 µl dH2O 0.5 µl Pwo DNA-polymerase enzym PCR programma: • 90 sec 95°C • 2 min 80°C • 30 sec 95°C 60 sec 50°C • 30 sec 95°C 30 sec 52°C

30 sec 72°C 30 sec 72°C

(5 cycli) (30 cycli)

In de volgende stap werd dit chimeer PCR-product in de pQE-60 vector geligeerd.

119

2.2. Digest van de pQE-60 vector en het PCR-produkt met NcoI en BglII: in viervoud uitgevoerd. pDNA van de pQE-60 vector (3431 bp) werd bereid volgens de QIAgen methode. Digesten: 4 µl pDNA (pQE-60) 3 µl NEB reactiebuffer 3 1 µl NcoI enzym 1 µl BglII enzym 23 µl dH2O 30 µl Totaal, 3 uur incuberen bij 37°C.

5 µl chimeer PCR-produkt 3 µl NEB reactiebuffer 3 1 µl NcoI enzym 1 µl BglII enzym 20 µl dH2O 30 µl Totaal, 3 uur incuberen bij 37°C.

De digesten werden op agarosegel 1% geladen, geëxtraheerd en gezuiverd met QIAEX II, waarna de gedigereerde pQE-60 vector en het chimeer produkt (sign.chr. + cyt c-551) op agarosegel geladen werden om de concentratie ervan te kunnen bepalen (figuur 3.2.4.).

1

2

3

Figuur 3.2.4. pQE-60 vector en chimeer PCR produkt. Laan 1: 3 µl 3 µl λ PstI Laan 2: 2 µl chimere PCR produkt (900bp) Laan 3: pQE-60 vector (3431bp)

120

2.3. Ligatie. Via intensiteit van de banden op de agarosegels (figuur 3.2.4.) kon besloten worden dat ongeveer 10ng/2µl voor de insert, en ongeveer 50ng/2µl vector aanwezig is. ng (vector ) × kb(insert ) 3 Via de formule × = ng insert , bekomt men kb(vector ) 1 50ng (vector ) × 0.9kb(insert ) 3 × = 40ng 3.4kb(vector ) 1 40 ng komt overeen met 8 µl insert, en 50 ng vector met 2 µl vector Ligatiemengsel: 8 µl insert (signchr + cyt c-551) 2 µl pQE-60 vector 2 µl ligase buffer 1 µl T4 DNA ligase 7 µl dH2O 20 µl Totaal, overnacht bij 4°C geïncubeerd. De ligatie werd gezuiverd met QIAquick. De ligatie pQE-60 + sign.chr. + cyt c-551 (figuur 3.2.5b.) werd met BamHI gedigereerd om zelfligatie van de pQE-60 vector te voorkomen. De BamHI site zit in het deel dat normaal uitgedigereerd wordt om er het insert in te ligeren.

Figuur 3.2.5a. pQE-60 vector

Figuur 3.2.5b. pQE-60 + sign.chr. + c-551

2.4. Electroporatie van de ligatie. 1/10 van de ligatie werd getransformeerd via electroporatie naar E.coli XLI-blue competente cellen. De transformatie werd gedurende 1 uur geïncubeerd bij 37°C en 200 tpm. Na incubatie werd 100 µl van de cultuur uitgeplaat op selectieve platen. 2.5. Controle van de ligatie Van 12 kolonies werd pDNA bereid volgens de Birnboimmethode, en nadien met NcoI en BglII gedigereerd. 121

Digest: 5 µl pDNA 3 µl reactiebuffer 1 µl RNase 1 µl enzym 20 µl dH2O 30 µl totaal. Het mengsel werd 3 uur geïncubeerd bij 37°C, en op 1% agarosegel geladen (figuur 3.2.6.). De grootte van de verwachte banden bedraagt 3431bp (pQE-60 vector) en 900bp (insert sign.chr. + cyt c-551).

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Figuur 3.2.6. Birnboim pDNA gedigereerd met NcoI en BglII Laan 1: 3 µl λ PstI Laan 2-12: construct pQE-60 + sign.chr. + cyt c-551 / NcoI en BglII

In laan 3 en laan 8 bevat het plasmide een insert van de juiste grootte. Van kolonie 3 werd pDNA volgens de QIAgen methode bereid. 2.6. Controledigesten op de constructen. Op het QIAgen pDNA van pQE-60 + sign.chr. + c-551 werden volgende controledigesten uitgevoerd: 5 µl pDNA SacII-NcoI 3 µl reactiebuffer HindIII 1 µl RNase NcoI-BglII 1 µl enzym 20 µl dH2O 30 µl totaal. De digesten werden gedurende 3 uur bij 37°C geïncubeerd, waarna ze op 1% agarosegel werden geladen (zie figuur 3.2.7.)

122

1

2

3

4

Figuur 3.2.7. Controledigesten op construct pQE-60 + sign.chr. + cyt c-551 Laan 1: 3 µl λ PstI Laan 2: SacII-NcoI: 3794 bp + 517 bp Laan 3: HindIII: 3568 bp + 723 bp Laan 4: NcoI-BglII: 3,4 kbp + 880 bp

De kolonie geeft het verwachte digestiepatroon en werd gecontroleerd via sequentieanalyse. 3. Construct pKK233-3 + sign.chr. + cyt c-551. Het insert uit het construct van de pQE-60 vector werd in de pKK233-3 vector (4584 bp) gesubkloneerd. De pKK233-3 vector heeft een sterke tac-promotor. De pQE-60 vector moet met EcoRI-BglII worden geknipt zodat de RBS-sequentie (AGGA) mee wordt gekloneerd. Er kan niet met HindIII worden geknipt omdat cyt c-551 een interne HindIII knipplaats bevat. 3.1. Digest van de pKK233-3 vector en het pQE-60 construct. De pKK233-3 vector werd geknipt met HindIII. Tezelfdertijd werd de pQE-60 vector geknipt met BglII. Beide fragmenten werden gezuiverd met QIAquick. Digesten: pKK233-3: 8 µl pKK233-3 3 µl NEB buffer 2 1 µl HindIII 18 µl dH2O 30 µl totaal

pQE-60 + signchr + c-551: 8 µl pQE-60 3 µl NEB buffer 3 1 µl BglII 18 µl dH2O 30 µl totaal

De digesten werden 3 uur geïncubeerd bij 37°C. 123

3.2. Invulreactie met T4 DNA polymerase Op beide fragmenten werd bij 12°C met T4 DNA polymerase en dNTP’s een invulreactie gedaan zodat beide blunt eindjes vertonen. De fragmenten werden opnieuw gezuiverd met QIAquick. Blunten: 30 µl totaal restrictiemengselvolume (pKK233-3/HindIII en pQE-insert/BglII) 1µl BSA (50 µg/ml) 7.5 X verdund 1 µl dNTP’s (5 mM, 20X verdund) 1 µl T4 DNA-polymerase 20 min incuberen bij 12°C. Daarna werd T4 DNA-polymerase geïnactiveerd door een warmtebehandeling gedurende 10 min bij 75°C. 3.3. Digest met EcoRI De gelineariseerde pQE-60 vector en de pKK233-3 vector werden daarna geknipt met EcoRI. Aldus bekomt men in beide gevallen een EcoRI sticky uiteinde en een blunt uiteinde. Digesten: pKK233-3: 8 µl pKK233-3 3 µl EcoRI buffer 1 µl EcoRI 18 µl dH2O 30 µl totaal

pQE-60 + signchr + c-551 8 µl pQE-60 3 µl EcoRI buffer 1 µl EcoRI 18 µl dH2O 30 µl totaal

3.4. Zuivering van de fragmenten De bekomen fragmenten werden op agarosegel geladen om daarna de fragmenten uit het gel te extraheren met QIAEX II (zie figuur 3.2.8.).

1

2

3

Figuur 3.2.8. Digesten: Laan 1: pQE-60 + sign.chr. + cyt c-551 / BglII/bl - EcoRI Laan 2: 3µl λ PstI Laan 3: pKK233-3 / HindIII/bl - EcoRI

124

3.5. Ligatie van sign.chr. + cyt c-551 in de pKK-vector De pKK233-3 vector en het cyt c-551 segment werden naast elkaar op gel geladen om de concentraties ervan te bepalen (figuur 3.2.9.).

1

2

3

Figuur 3.2.9. Concentratiebepaling van pKK233-3 vector en het cyt c-551 segment. Laan 1: 3 µl λ PstI Laan 2: Fragment uit pQE-60: cyt c-551 (948 bp) Laan 3: pKK233-3 vector

Men stelt vast dat voor het fragment ongeveer 10ng/3µl aanwezig zijn, en voor de vector 25ng/3µl. 50ng (vector ) × 0.948kb(insert ) 3 Men bekomt voor het cyt c-551 segment: × = 30ng insert. 4.584kb(vector ) 1 Ligatie van het cyt c-551 segment in de pKK233-3 vector: 6 µl pKK233-3 vector 1 µl ligase 1 µl T4 ligase buffer 3 µl insert DNA De ligatie werd overnacht bij 4°C geïncubeerd.

125

Figuur 3.2.10. Schema voor de synthese van het construct pKK233-3 + sign.chr. + cyt c-551

126

Deze ligatie werd vervolgens geëlectroporeerd in XLI-blue E. coli cellen en uitgeplaat. Er werden uit 12 kolonies pDNA bereid volgens de Birnboimmethode, waarna op elke pDNA controledigesten werden uitgevoerd (HincII): Digest:

5 µl pDNA 3 µl HincII reactiebuffer 1 µl Rnase 1 µl HincII 20 µl dH2O 30 µl Totaal, 3 uur geïncubeerd bij 37°C.

De digesten werden op 1% agarosegel geladen (zie figuur 3.2.11).

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Figuur 3.2.11. Digesties van de Birnboim pDNAs (HincII) Laan 1-7, 9-13: pKK233-3 + sign.chr. + cyt c-551 Laan 8: 3 µl λ PstI

De digesten van kolonies 4, 6 en 9 vertoonden het goede digestiepatroon, waaruit kon worden besloten dat zij een correct construct bevatten.

127

13

4. Construct pLPP + sOmpA + cyt c-551 4.1. PCR amplificatie van cyt c-551 met de primers C551OmpA en C551ECORI (zie Materiaal en Methode Tabel 2.II.) PCR-reactiemengsel: in vijfvoud uitgevoerd. Upper primer C551OmpA: 1µl Lower primer C551ECORI: 1 µl dNTP’s (10mM): 5 µl (10 X verdund) reactiebuffer: 5 µl Template: pUC18 + B2400: 1 µl Pwo DNA polymerase: 1 µl dH2O: 36 µl 50 µl totaal. PCR programma: • 7 min bij 94°C • 30 sec bij 94°C, 30 sec bij 50°C, 120 sec bij 68°C (5 cycli) • 30 sec bij 94°C, 30 sec bij 52°C, 120 sec bij 72°C (30 cycli) • 4°C. Controle van de PCR-producten op 1% agarosegel (zie figuur 3.2.12.).

1

2

Figuur 3.2.12. Controle van de PCR reactie van cyt c-551 (OmpA – ECORI). Laan 1: 3 µl λ PstI Laan 2: cyt c-551 (OmpA – ECORI).

Het geamplificeerde fragment werd uit de agarose geëxtraheerd en gezuiverd met de QIAEX II gel extraction kit. Digestie van het PCR-product met EcoRI zodat aan de ene zijde een overhangend EcoRI site onstaat die gemakkelijk in de pT10 vector kan worden geligeerd.

128

Digest: 20 µl PCR-product 3 µl reactiebuffer (EcoRI) 1 µl enzym EcoRI 6 µl dH2O 30 µl totaal. Digest incuberen bij 37°C gedurende 3 uur. Zuiveren met QIAquick. 4.2. Digest van pT10sOmpArpDI met NaeI en EcoRI pT10sOmpA vector werd gedigereerd met NaeI en EcoRI zodat enerzijds een blunt end en anderzijds een sticky end ontstaan. Digest met NaeI: 5 µl pDNA 3 µl buffer 1 µl Rnase 1 µl NaeI 20 µl dH2O 30 µl totaal. Digest incuberen bij 37°C. Het reactiemengsel werd gezuiverd met QIAquick. Digest met EcoRI: 5 µl pDNA 3 µl buffer 1 µl Rnase 1 µl EcoRI 20 µl dH2O 30 µl totaal. De digesten werden geïncubeerd bij 37°C, op gel geladen (zie figuur 3.2.13.) en gezuiverd.

1

2

Figuur 3.2.13. pT10sOmpArpDI/NaeI/EcoRI Laan 1: Digest (NaeI-EcoRI) Laan 2: 3 µl λ PstI

129

4.3. Ligatie cyt c-551 met pT10 pT10/NaeI-EcoRI en cyt c-551(OmpA-EcoRI) werden naast elkaar geladen om de concentratie ervan te bepalen (zie figuren 3.2.14a en b).

1

2

1

Figuur 3.2.14a. Concentratiebepaling van de pT10 vector. Laan 1: 3 µl λ PstI Laan 2: 2 µl pT10 / NaeI-EcoRI

2

Figuur 3.2.14b. Concentratiebepaling van insert cyt c-551 (OmpA-EcoRI). Laan 1: 2 µl cyt c-551 (OmpA-EcoRI) Laan 2: 5 µl Smart lengtemerker

Via intensiteiten van de banden op de agarosegels (figuur 3.2.14a en b) kon besloten worden dat ongeveer 100ng/2µl voor de insert, en ongeveer 50ng/2µl vector aanwezig is. ng (vector ) × kb(insert ) 3 Via de formule × = ng insert , kb(vector ) 1 50ng (vector ) × 0.780kb(insert ) 3 bekomt men × = 40ng 3kb(vector ) 1 Ligatiemengsel: 1 µl insert cyt c-551 (OmpA-ECORI) 6 µl pT10 / NaeI-EcoRI 2 µl ligase buffer 1 µl T4 DNA ligase 10 µl dH2O 20 µl Totaal, overnacht bij 4°C geïncubeerd. De ligatie (zie figuur 3.2.15b.) werd gezuiverd met QIAquick.

130

Figuur 3.2.15a. Map van pT10sOmpArPDI

Figuur 3.2.15b. Map van pT10 + insert cyt c-551

De ligatie werd in MC1061 E. coli elektrocompetente cellen getransformeerd, en uitgeplaat. 4.4. Birnboim pDNA bereiding van pT10 + sOmpA + cyt c-551 en digestie met XbaI-HindIII Digest: 5 µl pDNA 3 µl reactiebuffer 1 µl RNase 1 µl enzym (XbaI-HindIII) 20 µl dH2O 30 µl totaal. Incuberen gedurende 3 uur bij 37°C. De grootte van de verwachte bandjes bedraagt 4229 bp (pT10) en + 900 (insert sOmpA + cyt c-551) (zie figuur 3.2.16.).

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

Figuur 3.2.16. Digestie van Birnboim pDNA met XbaI-HindIII (Laan 1-13)

Enkele kolonies (kolonies 8 en 9) vertonen het juiste restrictiepatroon. 131

12

13

4.5. Ligatie van het sOmpA + cyt c-551 insert in de pLPP vector 4.5.1. Digest van pT10 + sOmpA + c-551 met XbaI-EcoRI (kolonie 8) Digest: 5µl pDNA 1 µl enzym (XbaI-EcoRI) 3 µl reactiebuffer 1 µl RNase 20 µl dH2O 30 µl totaal. De digesten werden gedurende 3 uur bij 37°C geïncubeerd, waarna ze op 1% agarosegel werden geladen (zie figuur 3.2.17.).

Figuur 3.2.17. Digest pT10 + c-551 / XbaI-EcoRI

Het insert fragment werd uit de agarose geëxtraheerd en gezuiverd met QIAEX II. 4.5.2. Digest van pLPP met XbaI-EcoRI •

Digestie van pLPPsOmpArpDI met XbaI en EcoRI Digest met XbaI: 5 µl pDNA 3 µl buffer 1 µl Rnase 1 µl XbaI 20 µl dH2O 30 µl totaal. Digestie incuberen bij 37°C. De digesten werden met QIAquick gezuiverd.

132

Digest met EcoRI: 5 µl pDNA 3 µl buffer 1 µl Rnase 1 µl EcoRI 20 µl dH2O 30 µl totaal. Digestie incuberen bij 37°C. Het fragment werd preparatief uitgezuiverd. •

Het fragment werd op gel geladen (zie figuur 3.2.18.).

1

2

Figuur 3.2.18. Digestie van pLPPsOmpArpDI met XbaI en EcoRI Laan 1: 3 µl λ PstI Laan 2: Digest.

4.5.3. Zuivering en bepalen van de concentratie De fragmenten (figuur 3.2.18. en 3.2.19.) op agarose werden met QIAEX II geëxtraheerd, gezuiverd en geëlueerd in steriel dH2O, waarna nog een controle op agarosegel werd uitgevoerd om de concentratie te bepalen (zie figuur 3.2.19.): 1 2 3

Figuur 3.2.19. Digesten ter controle van de concentratie. Laan 1: pLPP / XbaI-EcoRI (4229 bp) Laan 2: c-551 / XbaI-EcoRI (900 bp) Laan 3: 3 µl λ PstI

133

Via de intensiteiten op de agarosegel vindt men voor de hoeveelheid cyt c-551 gen dat aanwezig is: 10 ng. Voor de pLPP vector vindt men 100 ng. Via de formule

ng (vector ) × kb(insert ) 3 × = ng insert berekende men: kb(vector ) 1

50ng (vector ) × 0.880kb(insert ) 3 × = 18.3 ng insert die nodig waren voor de ligatiereactie. 7.2kb(vector ) 1 4.6. Ligatie van pLPP met sOmpA + cyt c-551. Het ligatiemengsel: 4 µl insert DNA 0.5 µl vector DNA 2 µl T4-DNA ligase buffer 1 µl T4-DNA ligase 14.5 µl dH2O Dit gaf het construct pLPP + sOmpA+ cyt c-551 (figuur 3.2.20). Dit ligatieprodukt werd getransformeerd in MC1061 E. coli elektrocompetente cellen en uitgeplaat, waaruit 12 kolonies Birnbiom pDNA werd bereid.

134

Figuur 3.2.20. Schema bij de synthese van construkt pLPP+sOmpA+cytc-551.

135

4.7. Birnboim pDNA bereiding uit 12 kolonies van het construct pLPP + sOmpA+ cyt c-551. Digest: 5 µl pDNA 3 µl reactiebuffer 2 1 µl RNase 1 µl enzym XbaI-HindIII 20 µl dH2O 30 µl totaal. Het digest werd 3 uur geïncubeerd bij 37°C.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

Figuur 3.2.21. Digest van 12 kolonies van het construct pLPP + sOmpA + cyt c551 / XbaI-HindIII Laan 1-6, 8-13: digesten Laan 7: 3 µl λ PstI

Uit kolonie 10 werd pDNA bereid volgens de QIAGEN methode.

Figuur 3.2.22. Map construct pLPP + sOmpA + cyt c-551

136

4.8. pDNA bereiding volgens de QIAGEN methode van pLPP + sOmpA + cyt c-551 en enzymatische digesten ter controle. Digest pDNA: Digesten die werden ingezet: 1 µl pDNA XbaI-EcoRI 3 µl reactiebuffer XbaI-HindIII 1 µl enzym EcoRI-SacII 25 µl dH2O 30 µl totaal. 3 uur incuberen bij 37°C. Controleren op 1% agarosegel (zie figuur 3.2.23.).

1

2

3

4

Figuur 3.2.23. Digesten op pLPP + sOmpA + cyt c-551 construct. Laan 1: 3 µl λ PstI Laan 2: XbaI-EcoRI digest Laan 3: XbaI-HindIII digest Laan 4: EcoRI-SacII digest

5. Construct pLPP + sign.chr. + cyt c-551 5.1. PCR van cyt c-551 met signchXba en c551EcoRI (zie Materiaal en Methode tabel 2.II.) op template pQE-60 + sign.chr. + cyt c-551. PCR-reactiemengsel: Upper en lower primer: 2X1µl Reactiebuffer: 5µl dNTP’s (10mM): 1 µl (10X verdund) template DNA: 1µl Pwo-DNA polymerase: 1 µl dH2O: 40 µl

137

PCR programma: • 7 min bij 94°C • 30 sec bij 94°C, 30 sec bij 50°C, 120 sec bij 68°C (5 cycli) • 30 sec bij 94°C, 30 sec bij 52°C, 120 sec bij 72°C (30 cycli) • 4°C. Het PCR-produkt werd op 1% agarosegel geladen (zie figuur 3.2.24.)

1

2

Figuur 3.2.24. Controle van het PCR-amplifikaat. Laan 1: sign.chr. + cyt c-551 (XbaI-EcoRI) Laan 2: 3 µl λ PstI

Het PCR-produkt werd met QIAEX II uit de agarose geëxtraheerd, gezuiverd, en geëlueerd in 20 µl dH2O. 5.2. Digest van PCR-product en pLPP vector. 5.2.1. Digest van het PCR product (sign.chr. + cyt c-551; XbaI-EcoRI uiteinden) met XbaIEcoRI: 5µl PCR produkt 3 µl reactiebuffer 1 µl XbaI-EcoRI 21 µl dH2O 30 µl totaal. Het digest werd bij 37°C geïncubeerd gedurende 3 uur. Het digest werd gezuiverd met QIAquick en geëlueerd in 20 µl dH2O.

138

5.2.2. Digest van de pLPP vector met XbaI-EcoRI 5µl pLPP vector 3 µl reactiebuffer 1 µl XbaI-EcoRI 21 µl dH2O 30 µl totaal. Het digest werd bij 37°C geïncubeerd gedurende 3 uur. Het digest werd op 1% agarosegel geladen. De fragmenten (pLPP / XbaI-EcoRI) werden met QIAEXII geëxtraheerd uit de agarose, en geëlueerd in 20 µl dH2O. 5.2.3. Bepaling van de concentratie voor de ligatie Beide digesten (pLPP / XbaI-EcoRI en sign.chr. + cyt c-551 / XbaI-EcoRI ) werden op gel geladen om er de concentratie uit te bepalen (zie figuur 3.2.25).

1

2

3

4

Figuur 3.2.25. Controle van de digesten. Laan 1: sign.chr.Xba + cyt c-551 EcoRI: 2µl Laan 2: pLPP / XbaI-EcoRI: 2 µl Laan 3: pLPP / XbaI-EcoRI: 2 µl Laan 4: 3 µl λ PstI

5.3. Ligatie van het insert in de pLPP vector. Via de intensiteiten op het agarosegel schat men de concentratie van het insert op 40ng/2µl en voor de pLPP vector 15ng/2µl.

139

Voor de ligatie van dit fragment in de pLPP vector werd berekend via de formule ng (vector ) × kb(insert ) 3 × = ng insert 1 kb(vector ) 50ng (vector ) × 0.880kb(insert ) 3 × = 20ng insert 7.2kb(vector ) 1 Ligatiemengsel: 1 µl insert DNA (sign.chr. + cyt c-551 met XbaI en EcoRI uiteinden, 5X verdund) 4 µl vector DNA (pLPP met XbaI en EcoRI uiteinden) 2 µl T4 DNA ligase buffer 1 µl T4 DNA ligase 12 µl dH2O De ligatie werd overnacht bij 4°C geïncubeerd. Construct pLPP + sign.chr. + c-551 (figuur 3.2.26.). Dit werd getransformeerd in MC1061 E. coli cellen en uitgeplaat.

Figuur 3.2.26. Het pLPP + sign.chr. + c-551 construct.

5.4. pDNA bereiding van een aantal kolonies Uit 24 kolonies werd pDNA bereid volgens de Birnboimmethode. Uit een kolonie met een goede restrictiepatroon werd QIAGEN pDNA bereid, waarna de plasmiden werden gedigereerd met: XbaI-EcoRI XbaI – HindIII EcoRI – SacII De digesten werden op 1% agarosegel geladen (zie figuur 3.2.27.).

140

1

2

3

4

Figuur 3.2.27. Digestie van pLPP + sign.chr. + cyt c-551 Laan 1: 3 µl λ PstI Laan 2: XbaI-EcoRI Laan 3: XbaI – HindIII Laan 4: EcoRI – SacII

De digesten vertonen het goede scheidingspatroon, zodat kon worden besloten om de constructen in MC1061 en JCB7123 te transformeren. 6. Overexpressieëxperimenten met de verschillende constructen Algemeen toegepast protocol voor het bekomen van culturen voor de expressie van cytochroom c-551, en voor de bereiding van periplasmatische eiwitextracten: • • • •

5 ml cultuur werden geënt in een erlenmeyer van 250 ml. Na een korte groeiperiode werd de synthese van de cytochromen geïnduceerd met 1 mM IPTG. De culturen worden overnacht geïncubeerd bij 37°C. ’s Anderendaags werd de O.D. bepaald door middel van een spectrofotometer van 2 ml gegroeide cultuur. De volledige cultuur werd vervolgens gecentrifugeerd gedurende 10 min bij 5000 tpm 4°C, waarna het supernatans werd afgegoten en de recipiënt werd afgeschud tot ongeveer een droge pellet werd bekomen. De pellet werd geresuspendeerd in een sucrosebuffer tot een O.D. van 200. Te bekomen OD: 200 Verdunningsfactor = OD200 / oorspronkelijke OD Aantal ml nodig aan shockbuffer om OD 200 te krijgen = oorspronkelijk volume (= 250ml ) 200 OD van 2ml IJskoude shockbuffer (om de periplasmatische membraan te stabiliseren): 100 mM Tris-HCl, pH 7.4 20% sucrose 10 mM EDTA

141

•

• • •

De suspensie werd op ijs geïncubeerd gedurende 10 min, waarna de cellen gecollecteerd werden door centrifugatie gedurende 2 min bij 14000tpm. De pellet werd snel geresuspendeerd in 2 ml ijskoud dH2O door te vortexen. Deze waterige suspensie werd op ijs geïncubeerd gedurende 10 min, waarna het gedurende 2 min gecentrifugeerd werd. Het bekomen supernatans komt overeen met de periplasmatische fractie. Door de ijskoude shock breekt de outer membraan, zodat de periplasmatische eiwitten vrij in het medium komen, terwijl de cytoplasmatische eiwitten binnenin het cytoplasma behouden worden. De pellet werd gewassen met 1 ml 0.1 X TE ( = 1mM Tris-HCl, pH 7.4 + 0.1 mM EDTA). De pellet werd op ijs gesoniceerd gedurende 2 min. Centrifugeren gedurende 2 min, 14000 tpm. Supernatans komt overeen met de oplosbare fractie. Pellet wassen en resuspenderen in 1 ml dH2O. Dit is de onoplosbare fractie.

6.1. Overexpressie met het pQE-60 + sign.chr. + cyt c-551 construct. De plasmiden werden getransformeerd in M15 competente E. coli cellen, en geïncubeerd in LB met NO2-, Cb en Km, in anaërobe omstandigheden. Na centrifugatie van de gegroeide cultuur, werd de pellet geresuspendeerd in de sucrosebuffer, en op ijs geïncubeerd. De eiwitten die reeds uit de cellen in deze sucrosefase terecht kwamen, werden met behulp van SDS-PAGE geanalyseerd (zie figuur 3.2.28a.), evenals de eiwitten die later in de waterige fase geëxtraheerd werden (figuur 3.2.28b.),.

Figuur 3.2.28. SDS-PAGE gel met expressie van cyt c-551 uit het pQE-60 construct a. in.de sucrosefase, b. in de waterige fase Laan 1: cyt c-551, met haemstaining Laan 2: Lengtemerker.

Zowel in de sucrosefase als in de waterige fase kon het het monomeer (30kDa), gerevelleerd worden met haemstaining. 142

6.2. Overexpressie met het pKK233-3 + sign.chr. + cyt c-551 construct De plasmiden werden getransformeerd in M15 competente E. coli cellen, en opgegroeid in LB medium. Centrifugatie van de gegroeide kolonies gaf heel bleke pellets. Na extractie van de periplamatische eiwitten, en laden op SDS-PAGE gels, kon vastgesteld worden dat enkel het apoproteïne aanwezig is, zonder de haemgroep van de cytochromen. 6.3. Overexpressie met het pLPP + sOmpA + cyt c-551 construct De plasmiden werden getransformeerd in MC1061 en JCB7123 competente E. coli cellen. Drie verschillende expressieomstandigheden werden gehanteerd: 1. LB; 2. LB + KNO3; 3. Minimaal Medium Elk van de drie opstellingen werd op de volgende manier opgezet: Inductie met IPTG: aërobe incubatie bij 28°C en 37°C. Inductie zonder IPTG: aërobe incubatie bij 28°C en 37°C. Inductie met IPTG: anaërobe incubatie bij 28°C en 37°C. Inductie zonder IPTG: anaërobe incubatie bij 28°C en 37°C Sommige bacteriën maken inclusion bodies bij hogere temperaturen. Daarom werd een deel van de cultuur bij een lagere temperatuur (28°C) gegroeid, waarbij geen inclusion bodies worden gevormd. Cytochromen worden voornamelijk in anaërobe omstandigheden aangemaakt door de bacteriën die ze aanmaken. In tegenstelling hiermee expresseert E. coli het merendeel aan eiwitten in aërobe omstandigheden. Daarom werd geopteerd om deels in aërobe en deels in anaërobe omstandigheden te induceren. Na centrifugatie van de gegroeide cultuur, werd de pellet geresuspendeerd in de sucrosebuffer, en op ijs geïncubeerd. De eiwitten die reeds uit de cellen in deze sucrosefase terecht kwamen, werden met behulp van SDS-PAGE geanalyseerd, evenals de eiwitten in de waterige fase (zie figuur 3.2.29.).

143

Figuur 3.2.29. SDS-PAGE gel met expressie van cyt c-551 uit het pLPP + sOmpA + cyt c-551 construct a. met Coomassie kleuring, b. met haemstaining. Laan 1: cyt c-551 Laan 2: Lengtemerker.

Een zwak bandje nabij 30 kDa werd zichtbaar met haemstaining, overeenkomend met het moleculair gewicht van het monomeer van het cyt c-551 proteïne.

144

6.4. Overexpressie met het pLPP + sign.chr. + cyt c-551 construct De plasmiden werden getransformeerd in MC1061 en JCB7123 competente E. coli cellen. Voor de incubatie van de JCB7123 cellijn werden de volgende opstellingen uitgetest: LB + KNO3, en NO2-. De volgroeide culturen werden gecentrifugeerd, nadat de O.D. waarde gemeten werd. Vervolgens werden de culturen in een sucrose buffer geresuspendeerd tot een O.D. van 200. De bekomen eiwitextracten werden geanalyseerd op SDS-PAGE (zie figuur 3.2.30.).

Figuur 3.2.30. SDS-PAGE gel met expressie van cyt c-551 uit het pLPP + sign.chr + cyt c-551 construct, met haemstaining Laan 1: cyt c-551 Laan 2: Lengtemerker.

Het expressiebandje overeenkomend met het moleculair gewicht van het monomeer eiwit werd zichtbaar (30kDa).

145

III. Inactivatie (knock out) van het cyt c-551 gen 1. Principe en doel: Inactivatie (knock out) door interposon mutagenese van het cyt c-551 van Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum om na te gaan of het gen al dan niet noodzakelijk is voor thiosulfaatoxidatie. Hiervoor werd een Km-resistentiebox (Ω Km) in het gen geïnsereerd zodat het cyt c-551 gen onderbroken werd. Het resulterend Km-resistente fenotype waarborgt inaktivatie van het gen. Een Ω Km uit pUC-4K en/of pHP42 werd getransfereerd naar pRVS2-suicide vector. Door conjugatie wordt de suicide vector overgebracht m.b.v. het helperplasmide pKK2013 naar Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum zodat door homologe recombinatie het geïnactiveerde gen het wild type gen zal verdrijven. Gerecombineerde cellen kunnen geselecteerd worden op basis van het Km-resistente fenotype, en eveneens op basis van hun onvermogen om op thiosulfaat te groeien. 2. Klonering van het B2400 fragment (welke het cyt c-551 gen bevat) in de pRVS2 suicide vector. 2.1. Controledigest van pUC18+B2400 Digesten: BamHI BamHI-HindIII HindIII SacII

5 µl pDNA 3 µl reactiebuffer 1 µl enzym 21 µl dH2O 30 µl totaal, incuberen bij 37°C gedurende 3 uur. Het digest werd op 1% agarosegel geladen (zie figuur 3.3.1.)

1

2

3

4

Figuur 3.3.1. Controle digest van pUC-18 + B2400. Laan 1: BamHI Laan 2: BamHI-HindIII Laan 3: HindIII Laan 4: SacII Laan 5: 3 µl λ PstI

146

5

2.2. Digest van genomische kloon pUC18+B2400 met SacI-SalI (geeft 2 bandjes: 2650 en 2400 bp), laden op gel (zie figuur 3.3.2.) Digest: in tienvoud uitgevoerd 5 µl pDNA 3 µl reactiebuffer 1 µl enzym (SacI-SalI) 1 µl RNase 20 µl dH2O 30 µl totaal. Het digest werd gedurende 3 uur bij 37°C geïncubeerd. De digesten werden op gel geladen. Het B2400 fragment werd preparatief uitgesneden, en uit de agarose geëxtraheerd met QIAEX II.

1

2

3

4

Figuur 3.3.2. pUC-18 + B2400 gedigereerd met SacI-SalI Laan 1,3,4: digesten Laan 2: 3 µl λ PstI

2.3. QIAquick zuivering van pRVS2 suicide vector (die reeds geknipt is met SacI). QIAquick zuivering van B2400 fragment. 2.4. Digestie van pRVS2 met SalI 10 µl DNA (pRVS2 en B2400) 1 µl SalI 3 µl buffer 26 µl dH2O 30 µl totaal. Incuberen gedurende 3 uur bij 37°C.

147

Zowel B2400 als PRVS2 (5.6kb) vertonen enerzijds een SalI uiteinde, en anderzijds een SacI uiteinde. 2.5. Bepalen van de concentratie van de fragmenten Beide fragmenten worden op 1% agarosegel geladen om er de concentatie uit te bepalen (zie figuur 3.3.3.).

1

2

3

Figuur 3.3.3. Concentratiebepaling van B2400 en pRVS2 Laan 1: 3 µl λ PstI Laan 2: B2400 (SacI-SalI) Laan 3: pRVS2 (SacI-SalI)

ng (vector ) × kb(insert ) 3 × = ng insert berekende men: kb(vector ) 1 50ng (vector ) × 2.4kb(insert ) 3 × = 72 ng insert die nodig waren voor de ligatiereactie. 5kb(vector ) 1

Via de formule

2.6. Ligatie pRVS2 en B2400 15 µl insert (B2400) 2 µl vector (pRVS2) 2 µl ligasebuffer 1 µl ligase De ligatie (zie figuur 3.3.4.) werd overnacht geïncubeerd bij 4°C.

148

Figuur 3.3.4. Plasmidemap van het construct pRVS2 + B24000-fragment.

2.7. Digestie van het ligatieprodukt met PstI Het ligatiemengsel wordt gedigereerd met PstI om zelfgeligeerde pRVS2 vectoren open te knippen. 2.8. Transformatie in MC1061 E. coli cellen, en Birnboim pDNA isolatie van 24 kolonies. 2.9. Digest van het construct pRVS2 + B2400 met BamHI en HindIII. 3 µl buffer 2 1 µl RNase 1 µl BamHI 1 µl HindIII 4 µl dH2O 30 µl totaal. Digestie gedurende 3 uur bij 37°C (figuur 3.3.4.).

149

18

3µl λ PstI

20

21

22

23

24

Figuur 3.3.4. pRVS2 + B2400 gedigereerd met BamHI-HindIII

1 kolonie (kolonie 22) werd afgezonderd voor QIAgen pDNA bereiding. 2.10. Digest van het pDNA 1. 2. 3. 4. 5.

BamHI: BamHI buffer BamHI-HindIII: buffer 2 SacII: buffer 4 PvuII: buffer 2 PvuI: buffer 3

2400 + 5011 bp 5011 + 883 + 1517 bp 866 + 6210 bp 2848 + 4563 bp

Digest: 2 µl pDNA 3 µl reactiebuffer 1 µl enzym 24 µl dH2O 30 µl totaal. Incuberen gedurende 3 uur bij 37°C (zie figuur 3.3.5.).

150

1

2

3

4

5

6

Figuur 3.3.5. Digesties van pRVS2. Laan 1: 3µl λ PstI Laan 2: BamHI Laan 3: BamHI-HindIII Laan 4: SacII Laan 5: PvuII Laan 6: PvuI

De fragmenten stemmen overeen met de berekeningen. 3. Insertie van de KmΩ resistentiebox in het pRVS2+B2400 construct. 3.1. Klonering van de KmΩ resistentiebox uit pUC4K/BamHI en pHP42ΩKm/HindIII naar pRVS2+B2400/HindIII. 3.1.1. QIAgen pDNA bereiding van pUC-4K (figuur 3.3.6.)

Figuur 3.3.6. De pUC-4K vector, waaruit de KmΩ resistentiebox overgekloneerd zal worden naar het pRVS2+B2400 construct.

151

Digesties op pUC-4K met BamHI. 5 µl pDNA 3 µl reactiebuffer 1 µl enzym 21 µl dH2O 30 µl totaal. Het digest werd gedurende 3 uur geïncubeerd bij 37°C. 3.1.2. Digestie van pRVS2+B2400 met HindIII 5 µl pDNA 3 µl reactiebuffer 1 µl enzym 21 µl dH2O 30 µl totaal. Het digest werd 3 uur geïncubeerd bij 37°C. 3.1.3. Digestie van pHP42 ΩKm met HindIII 5 µl pDNA 3 µl reactiebuffer 1 µl enzym 21 µl dH2O 30 µl totaal. Het digest werd 3 uur geïncubeerd bij 37°C. De KmΩ resistentiebox uit pHP42ΩKm werd naar pRVS2+B2400/HindIII overgebracht (ligatie). De KmΩ resistentiebox uit pUC4K werd eveneens met pRVS2+B2400/HindIII geligeerd (zie figuren 3.3.7. en 3.3.8.).

1

2

3

Figuur 3.3.7. Preparatief gel voor pUC4K en pRVS2 + B2400 Laan 1: pUC4K vector / BamHI Laan 2: pRVS2 + B2400 Laan 3: 3 µl λ PstI

152

De fragmenten werden met QIAEX II uit de agarose geëxtraheerd. 2 µl van elk werd ter concentratiebepaling op 1% agarosegel geladen (figuur 3.3.8.)

1

2

3

4

5

Figuur 3.3.8. Concentratiebepaling van ΩKm en de suicide vector. Laan 1: 2 µl Km resistentiebox Laan 2: 2 µl Km resistentiebox Laan 3: 2 µl pUC4K Laan 4: 2µl pRVS2 Laan 5: 3 µl λ PstI

De pRVS2 + B2400 constructen werden geblunt, waarna de terminale fosfaatgroepen werden verwijderd met CIP: Blunten: 1 µl BSA (50µg/ml) 7.5 X verdund, 1 µl dNTP’s 1 µl T4-DNA polymerase x µl construct Het mengsel werd bij 12°C geïncubeerd gedurende 20 min. T4-DNA polymerase wordt geïnactiveerd bij 75°C. CIP: 1 unit per pmol eindjes, 10 units per µl. Reaktie 1 uur incuberen bij 37°C, waarna het fosfatase geïnactiveerd werd door incubatie gedurende 10 min bij 75°C. De Km resistentiebox werd in het construkt pRVS2 + B2400 geligeerd. Echter tot nog toe werden er geen positieve kandidaten gevonden. 153

BESLUIT Het doel van dit eindwerk bestond erin het cytochroom c-551 dat verantwoordelijk is voor de elektronenshuffling bij de oxidatie van thiosulfaat in Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum te overexpresseren. Anderzijds werd getracht de flankerende genen van cytochroom c-551 te identificeren en aldus uit te maken of het cytochroom c-551 deel uitmaakt van een thiosulfaatverbruikend operon. In een latere fase werd getracht het gen coderend voor het cyt c551 te inactiveren (knock out), om de functie van het cyt c-551 in de oxidatie van thiosulfaat te bepalen. Voorafgaand aan deze studie werd een BamHI subgenomische bank aangelegd waaruit reeds kon worden afgeleid dat het cyt c-551 gen wel degelijk tot een thiosulfaatverbruikend operon behoort. Doch de BamHI kloon bevatte niet alle informatie omtrent het operon zodat verdere screening noodzakelijk was. Een HindIII genbank in de grootteorde van 4000 baseparen werd gescreend naar fragmenten welke meer sequentie-informatie konden verstrekken. Een aantal klones van het 4000 bp insert die met de cyt c-551 probe hybridiseerden, werden opgespoord, en werden uiteindelijk gesequeneerd. Deze kloon leverde ons informatie op omtrent de genen stroomafwaarts van het cyt c-551 gen in het operon. Vervolgens werd getracht een nog grotere EcoRI subgenomische bank van 8000 bp te kloneren in de pUC18-vector, en te screenen met de cyt c-551 probe. Er bleek echter dat een genbank van deze grootteorde te groot is om efficiënt gekloneerd te worden. Daarom werd besloten het gedeelte van thiosulfaat-gencluster dat stroomopwaarts gelegen is van de thiosulfaatverbruikende gencluster te bepalen met een heteroloog gen, nl. met het flavoproteïne van Chlorobium tepidum. Er moest worden nagegaan of Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum, zoals Chlorobium tepidum over een dergelijk flavoproteïne beschikte. Daartoe werd dit flavoproteïne via PCR geamplificeerd, en werd het chromosomaal DNA van Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum onderworpen aan een Southernhybridisatie met het flavoproteïne als probe. Er werd een duidelijk signaal waargenomen bij 3000 bp wanneer het chromosomaal DNA gedigereerd werd met HindIII. In het tweede luik in deze studie, het overexpresseren van het cyt c-551, moest ervoor gezorgd worden dat het gen van het cyt c-551 gefusioneerd werd met een signaalsequentie welke het proteïne efficiënt naar de periplasma exporteert. Het cyt c-551 genproduct is een periplasmatisch proteïne. De signaalsequentie van het organisme zelf bezit echter geen duidelijke klievingssite omdat het proteïne waarschijnlijk membraangebonden blijft na zijn translocatie uit het cytoplasma. In deze studie werd export van het matuur eiwit vergemakkelijkt door gebruik te maken van de signaalsequentie van de cytochroomsubeenheid van het Chromatium vinosum flavocytochroom c sulfide dehydrogenase (FCSD), dat wel duidelijk afgesplitst wordt na export, zodat het proteïne vrij in de periplasma terecht komt. Het gen van het cyt c-551 werd d.m.v. een tweestaps recombinante PCR-methode gefusioneerd met de signaalsequentie van Chromatium vinosum. Dit chimeer construct werd uiteindelijk gekloneerd in de pQE-60 expressievector. Na transformatie in MC1061 en JCB7123 competente E. coli cellen vertoont dit construct een duidelijke haemstaining verkregen, alhoewel geen expressieband werd verkregen bij Coomassiekleuring. Dit houdt in dat er wel degelijk een holoproteïne wordt gevormd in E. coli, maar dat het proteïne niet in voldoende mate wordt aangemaakt, om gedetecteerd te worden met Coomassiekleuring. 154

Bij het maken van de andere expressieconstructen werd het gen van cyt c-551 gekloneerd in de pLPPsOmpArPDI vector, enerzijds met de signaalsequentie van Chromatium vinosum en anderzijds met de OmpA signaalsequentie van E. coli. In geen van beide gevallen echter werd het holoproteïne gedetecteerd, noch met haemstaining, noch met Coomassiekleuring. In een laatste deel van het studiewerk werd getracht het gen van het cyt c-551 te inactiveren via homologe recombinatie. Een suicide vector, pRVS2, werd gebruikt waarbij een Kanamycineresistentiemerker wordt ingebouwd in de sequentie van het cyt c-551, zodat bij conjugatief transfer van het plasmide door homologe recombinatie het gen coderend voor cyt c-551 in het operon wordt vervangen door het inactieve homoloog. De Km-resistentiebox is afgeleid van de pUC-4K vector welke de resistentiemerker van transposon Tn903 bevat. Op deze manier kan aangetoond worden of het cyt c-551 gen al dan niet noodzakelijk is voor fotolithotrofe groei op thiosulfaat. Het BamHI fragment van 2400 bp werd hierbij in de suicide vector geïntegreerd, waarna de ΩKm in de interne HindIII restrictiesite van het cyt c-551 gen zal gekloneerd worden.

155

REFERENTIELIJST. • • •

• • • • • •

• • • • • • • • • • • •

Amann, E.; Brosius, J. and Ptashne, M. (1983) Vectors bearing a hybrid trp-lac promotor useful for regulated expression of cloned genes in Escherichia coli. Gene 25, 167-178. Ambler, R.P. (1980) The structure and classification of cytochromes c. In: Robinson, A.B.; Kaplan, N.O. (eds). From cyclotrons to cytochromes. Academic Press, London New York, pp 263-279. Avery, O.T.; Mc Leod, C.M. & Mc Carthy, M. (1944). Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. Induction of transformation by a deoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus Type III. Journal of Experimental Medicin, 79, 137-145. Bartsch, Robert G. (1978) Cytochromes. In: The Photosynthetic Bacteria. Clayton, R.K. and Sistrom, W.R., eds. Beckman, D.L.; Trawick, D.R. and Kranz, R.G. (1992) Bacterial cytochromes c biogenesis. Genes Dev. 6: 268-283. Bertram-J; Stratz-M; Durre-P (1991) Natural transfer of conjugative transposon Tn916 between gram-positive and gram-negative bacteria. J-Bacteriol. 1991 Jan; 173(2): 443-8 Biebl, H.; and Pfennig, N. 1978. Growth yields of green sulfur bacteria in mixed cultures with sulfur and sulfate reducing bacteria. Archives of Microbiology 117, 9-16. Birnboim, H.C. and Doly, J. (1979). A rapid alkaline lysis procedure for screening recombinant pDNA. Nucl. Acids res. 7, 1513-1522. Blankenship, R.E.; Trost, J.T. and Mancino, L.J. (1988) Properties of reaction centers from the green photosynthetic bacterium Chloroflexus aurantiacus. In the Photosynthetic bacterial Reaction center. Edited by Breton, J. and Verméglio, A. pp. 119-127. Plenum Press, New York. Brock, T.D.; Madigan, M .T.; Martinko, J.M.; Parker, J. (1994) In Biology of Microorganisms, seventh edition, Prentice-Hall International, Inc. Englewood Cliffs, New Jersey. Brosius, J. and Holy, A. (1984) Regulation of ribosomal RNA promotors with a synthetic lac operator. Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 81, pp. 6929-6933. Brown, J.W.; Haas, E.S.; James, B.D.; Hunt, D.A. and Pace, N.R. (1991) Phylogenetic Analysis and Evolution of Rnase P RNA in Proteobacteria. J. Bacteriol. 173, 3855-3863. Brune, Daniel C. (1989) Sulfur oxidation by phototrophic bacteria. Biochimica et Biophysica Acta, 975 p.189-221. Carlson, C.A.; Pierson, L.S.; Rosen, J.J. and Ingraham, J.L. (1983) Pseudomonas stutzeri and related species undergo natural transformation. J. Bacteriol., 153: 93. Carlson, C.A.; Steenbergen, S.M. and Ingraham, J.L. (1984) Natural transformation of Pseudomonas stutzeri by plasmids that contain cloned fragments of chromosomal deoxyribonucleic acid. Arch. Microbiol., 140: 134. Catalogus Boehringer Mannheim (1997) Catalogus Pharmacia (1998) Contreras, R. (1998) Cursus moleculaire biologie II. Davidson, Michael W.; Meyer, Terrance E.; Cusanovich, Michael A. and Knaff, David B. (1986). Complex formation between Chlorobium limicola f. thiosulphatophylum c-type cytochromes. Biochimica et Biophysica Acta 850, 396-401. Davis, K.A.; Hatefi, Y.; Salemme, F.R. & Kamen, M.D. (1972) Enzymic redox reaction of cytochromes c. Biochem. Biophys. Res. Commun. 49, 1329-1335. De Sutter, K.; Hostens, K.; Vandekerckhove, J. and Fiers, W. (1994) Production of enzymatically active rat protein disulfide isomerase in Escherichia coli. Gene, 141, 163-170. 156

• • • • • • • • •

• • • •

•

• • •

Dower, W.J.; Miller, J.F. and Geigsdale, C.W. (1988) High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucl. Acid Res. 16: 6127-6145. Dumont, M.E.; Ernst, J.F. and Sherman, F. (1988) Coupling of heme attachment to import of cytochrome c into yeast mitochondria. J. Biol. Chem 263: 15928-15937. Fellay, Rémy; Frey, Joachim and Krisch (1987). Interposon mutagenesis of soil and water bacteria: a family of DNA fragments designed for in vitro insertional mutagenesis of Gramnegative bacteria. Gene 52, 147-154. Fischer, U. (1984) In Sulfur, Its Significance for Chemistry, for the Geo-, Bio- and Cosmosphere and Technology (Müller), A. and Krebs, B. (eds), pp. 383-407, Elsevier, Amsterdam. Fitzgerald, G.F. & Gasson, M.J. (1988). In vivo gene transfer systems and transposons. Biochemie, 70, 489-502. Frost, J.W.; Bender, J.L.; Dadonaga, J.T. and Knowles, J.R. (1984). Dehydroquinate Synthase from Escherichia coli: purification, cloning, and construction of overpruducers of the enzyme. Biochemistry 23, 4470-4475. Gray, G.O.; Knaff, D.B. (1982) The role of cytochrome c-552 – cytochrome c complex in the oxidation of sulfide in Chromatium vinosum. Biochim. Biophys. Acta 680: 290-296. Harbury, H. A.; Cronin, J. R.; Fanger, M.W.; Hettinger, T. P.; Murphy, A. J.; Myer, Y.P.; Vinogradov, S.N. (1965) Complex formation between methionine and a heme peptide from cytochrome c. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 54: 1658-64. Hyde, S.C.; Emsley, P.; Hartshorn, M.J.; Mimmack, M.M.; Gileadi, U.; Pearce, S.R.; Gallagher, M.P.; Gill, D.R.; Hubbard, R.E. and Higgins, C.F. (1990). Structural model of ATP-binding proteins associated with cystic fibrosis, multidrug resistance and bacterial transport. Nature Vol 346: 362-365. Irgens, R.L. (1983) Thioacetamide as a source of hydrogen sulfide for colony growth of purple sulfur bacteria. Curr. Microbiol. 8, 183-186. Kämpf, C.; Pfennig, N. (1980) Capacity of Chromatiaceae for chemotrophic growth. Specific respiration rates of Thiocystis violaceae and Chromatium vinosum. Arch. Microbiol. 127: 125-135. Kassner, R.J. (1972) Effects of Nonpolar environments on the redox potentials of heme complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2263-2267. Kj rulff, S.; Dzung, Bao Diep; Okkels, J.S.; Scheller H.V. and Ormerod, J.G. (1994) Highly efficient integration of foreign DNA into the genome of the green sulfur bacterium, Chlorobium vibrioforme by homologous recombination. Photosynthesis Research 41: 277283. Klarskov, K.; Verté, F.; Van-Driessche, G.; Meyer, T.E.; Cusanovich, M.A.; Van Beeumen, J. (1998). The primary structure of soluble cytochrome c-551 from the phototrophic green sulfur bacterium Chlorobium limicola, strain Tassajara, reveals a novel c-type cytochrome. Biochemistry. Jul 28; 37(30): 10555-62. Korszun, Z.R. and Salemme, F.R. (1977). Structure of cytochrome c-555 of Chlorobium thiosulfatophilum: primitive low-potential cytochrome c. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol 74, No. 12 pp. 5244-5247. Kranz, R.; Lill, R.; Goldman, B.; Bonnard, G. and Merchant, S. (1998) Molecular mechanisms of cytochrome c biogenesis: three distinct systems. Molecular Biology 29 (2), 383-396. Kusai, K. and Yamanaka, T. (1973) The oxidation mechanisms of thiosulphate and sulphur in Chlorobium thiosulphatophilum: roles of cytochrome c-551 and cytochrome c-553. Biochimica et Biohpysica Acta, 325 304-314.

157

• • • • • • • • • • • • • • • •

•

•

• •

Larsen, H.; Van Niel, C.B. and Yocum, C.S. (1952) On the energetics of the photosyntheses in green sulfur bacteria. J. Gen. Physiol. 36, 161-171. Lodish, H.; Baltimore, D.; Berk, A.; Zipussky, S.L.; Matsudaira, P.; Darnell, J. Molecular Cell Biology, 3rd edition 1995. Mandel, M. & Higa, A. (1970). Calcium dependent bacteriophage DNA infection. J. Mol. Biol. 53, 159-162. Mendez-Alvarez, Sebastian; Pavon, Victoria; Esteve, Isabel; Guerrero, Ricardo; and Gaju, Nuria (1994) Transformation of Chlorobium limicola by a plasmid that confers the ability to utilize thiosulfate. Journal of Bacteriology, Vol. 176, No. 23, p. 7395-7397. Mendez-Alvarez, Sebastian; Pavon, Victoria; Esteve, Isabel; Guerrero, Ricardo and Gaju, Nuria (1995) Genomic heterogeneity in Chlorobium limicola: chromosomic and plasmidic differences among strains. FEMS Microbiology letters 134 279-285. Mercenier, A. & Chassy, B.M. (1987) Strategies for the development of bacterial transformation systems. Biochimie, 70, 503-517. Meyer, T.E. (1991). Evolution of cytochromes and photosynthesis. Biochimica et Biophysica Acta, 1058, 31-34. Meyer, T.E.; Bartsch, R.G.; Cusanovich, M.A. and Matthewson, J.H. (1968) The cytochromes of Chlorobium thiosulfatophylum. Biochim. et Biophys. Acta, 153, 854-861. Meyer, T.E.; Bartsch, R.G.; Cusanovitch, M.A. and Mathewson, J.H. (1968). The cytochromes of Chlorobium thiosulfatophilum. Biochim. Biophys. Acta 153: 854-861. Monika, E.M.; Goldman, B.S.; Beckman, D.L.; and Kranz, R.G. (1997) A thioreduction pathway tethered to the membrane for periplasmic cytochromes c biogenesis; in vitro and in vivo studies. J. Mol. Biol. 272: 679-692. Fornari, C.S., and Kaplan, S. (1982) Genetic transformation of Rhodospeudomonas sphaeroides by plasmid DNA. J. Bacteriol., 152, 89. Neutzling, O.; Pfleiderer, C. and Trüper, H.G. (1985) Dissimilatory Sulphur metabolism in Phototrophic “non-sulphur” Bacteria. J. Gen Microbiol. 131, 791-798. New Enland Biolabs cataloog 1998/99 (http://www.neb.com) Nicholson, D.W.; Hergersberg, C. and Neupert, W. (1988) Role of cytochrome c heme lyase in the import of cytochrome c into mitochondria. J. Biol. Chem. 263: 19034-19042. Nitschke, Wolfgang and Rutherford, A. William (1991, july) Photosynthetic reaction centres: variations on a common structural theme ? TIBS 16, 241-245 Oh-Oka, H.; Kakutani, S.; Matsubara, H.; Malkin, R.; and Itoh, S. (1993) Isolation of the photoactive reaction center complex that contains three types of Fe-S centers and a cytochrome c subunit form the green sulfur bacterium Chlorobium limicola f. thiosulfatophylum. Plant Cell Physiol. 34, 93-100. Oh-oka, Hiroza; Kakutani, Saki; Kamei, Shoichiro; Matsubara, Hiroshi; Iwaki, Masayo and Itoh, Shigeru (1995). Highly purified photosynthetic reaction center (PscA/Cytochrome c551)2 complex of the green suflur bacterium Chlorobium limicola. Biochemistry 1995, 34, 13091-13097. Okkels, J.C.; Kjaer, B.; Hansson, .; Svendsen, I.; Moller, B.L. and Scheller, H.V. (1992) A membrane-bound monoheme cytochrome c-551 of a novel type is the immediate electron donor to P840 of the Chlorobium vibrioforme photosynthetic reaction center complex. J. Biol. Chem. 267, 21139-21145. Ormerod, J.G. (1988) Natural genetic transformation in Chlorobium. In: Olson, J.M.; Ormerod, J.G.; Amesz, J.; Stackebrandt, E. and Trüper, H.G. (eds) Green Photosynthetic Bacteria, pp 315-319 Plenum Press, New York. Overmann, J. and Tuschak, C. (1997) Phylogeny and molecular fingerprinting of green sulfur bacteria. Arch. Microbiol. 167, 302-309. 158

• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •

Parker, K.C. and Wiley, D.C. (1989) Overexpression of native human β2-microglobulin in Escherichia coli and its purification. Gene 83: 117-124. Paschinger, H.; Paschinger, J. and Gaffron, H. (1974) Photochemical Disproportionation of Sulfur into Sulfide and Sulfate by Chlorobium limicola forma thiosulfatophilum. Archives of Microbiology, 96, 1974, p. 341-351. Pattaragulwanit, K.; and Dahl, C. (1995) Development of a genetic system for a purple sulfur bacterium: conjugative plasmid transfer in Chromatium vinosum. Archives of Microbiology, 164, pp. 217-222. Pettigrew, G.W. and Moore, G.R. (1987). Cytochromes c: Biological aspects. Springer, Berlin. Pfennig, N. (1980). Syntrophic mixed cultures and symbiotic consortia with phototrophic bacteria: A review, p. 127-137. In Gottschalk, G.; Pfennig, N.; and Werner, H. (ed.), Anaerobes and anaerobic infections. G.Fischer Verlag, Stuttgart, Germany. Pfennig, N. (1989). Ecology of phototrophic purple and green sulfur bacteria, p. 97-116. In Schlegel, H.G. and Bowien, B. (ed.), Autotrophic bacteria. Science Tech, Madison, WI. and Springer-Verlag, NY. Pierson, B.K. and Castenholz, R.W. (1978) Photosynthetic apparatus and cell membranes of the green bacteria. In: The Photosynthetic Bacteria. Edited by Clayton, R.K. and Sistrom, W.R. pp 179-197. Plenum Press New York. Pont-Kingdon, G. (1994) Construction of chimeric molecules by a two-step recombination PCR method. Bio Techniques 16, 1010-1011. Prenti, Pierre and Krisch, Henry M. (1984). In vitro insertional mutagenesis with a selectable DNA fragment. Gene, 29 (1984) 303-313. Promega Technical Bulletin (1992), Madison, V.S. Pugsley, A.P. (1993) The Complete General Secretory Pathway in Gram-Negative Bacteria. Microbiol. Rev. 57(1), 1993, p. 50-108. QIAEX II Purification Handbook (1997), QIAGEN Inc., Chatsworth, V.S. QIAGEN plasmid purification handbook (1997), QIAGEN Inc, Chatsworth, V.S. QIAquick Spin Handbook (1997), QIAGEN Inc, Chatsworth, V.S. Rabbiloud, T. (1990) Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis. Electrophoresis 11: 785-794. Ramseier, T.M.; Winteler, H.V. and Hennecke, H. (1991) Discovery and sequence analysis of bacterial genes involved in the biogenesis of c-type cytochromes. J. Biol. Chem 266: 7793-7803. Salemme, F.R. (1977) Structure and function of cytochromes c. Ann. Rev. Biochem. 46, 299329. Sambrook, J.; Fritsch E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Scolnik, Pablo A. and Marrs, Barry L. (1987). Genetic research with photosynthetic bacteria. Ann. Rev. Microbiol. 41, 703-26. Sigma, Technical Bulletin, July 1987. Smith, A.J. (1966) The role of tetrathionate in the oxidation of thiosulphate bij Chromatium sp. strain D. J. Gen. Microbiol. 42, 371-380. Smith, A.J. and Lascelles, J. (1966) Thiosulphate metabolism and Rhodanese in Chromatium sp. strain D. J. Gen Microbiol. 42, 357-370. Steiner, H.; Kispal, G.; Zollner, A.; Haid, A.; Neupert, W.; and Lill, R. (1996) Heme binding to a conserved Cys-Pro-Val motif is crucial for the catalytic function of mitochondrial heme lyases. J. Biol. Chem 271: 32605-32611.

159

• • • • • • • • • • • • • • •

•

• • • • • •

Steinmetz, M.A. and Fischer, U. (1982) Cytochromes of the Green Sulfur Bacterium Chlorobium vibrioforme f. thiosulfatophilum. Purification, Characterization ans Sulfur Metabolism. Arch. Microbiol. 131, 19-26. The QIA expressionist, 3rd edition, july 1997, QIAGEN). Then, J. and Trüper, H.G. (1984) Utilization of sulfide and elemental sulfur by Ectothiorhodospira halochloris. Arch. Microbiol. 139, 295-298. Thomas, C.M.; Smith, C.A. (1987) Incompatibility group P plasmids: genetics, evolution and use in genetic manipulation. Ann. Rev. Microbiol. 41: 77-101. Thomas, P.E.; Ryan, D. & Levin, W. (1976) An improved Staining procedure for the detection of the peroxidase activity of cytochrome P-450 on Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 75, 168-176. Thöny-Meyer, L.; Ritz, D. and Hennecke, H. (1994) Cytochrome c biogenesis in bacteria: a possible pathway begins to emerge, Mol. Microbiol. 12, 1-9. Thöny-Meyer, Linda; Künzler, Peter and Hennecke, Hauke (1996). Requirements for maturation of Bradyrhizobium japonicum cytochrome c-550 in Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 235, 754-761 Trüper, H.G. (1968) Ectothiorhodospira mobilis Pelsh, a photosynthetic Sulfur Bacterium depositing Sulfur outside the cells. J. Bacteriol. 95, 1910-1920. Trüper, H.G. (1978) In The Photosynthetic Bacteria (Clayton, R.K. and Sistrom, W.R., eds), pp. 677-690, Plenum, New York. Trüper, H.G. and Fischer, U. (1982) Anaerobic oxidation of sulfur compounds as electron donors for bacterial photosynthesis. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 298, 529-542. Trüper, Hans G. en Pfennig, N. (1966) Antonie van Leeuwenhoek 32, 261-276. Trüper, Hans G. en Pfennig, N. (1978) The family Chlorobiaceae. In The photosynthetic Bacteria (Clayton R.K. and Sistrom, W.R) Van Beeumen, J.; Ambler, R.P.; Meyer, T.E.; Kamen, M.D.; Olson, J.M. and Shaw, E.K. (1976) Biochem. J. 159, 757-774. Van Beeumen, J.; Van Bun, S.; Meyer, T.E.; Bartsch, R.G. and Cusanovich, M.A. (1990) J. Biol. Chem. 265, 9793-9799. Van Grondelle, R.; Duysens, L.N.M.; Van der Wel, J.A. and Van der Wal, H.N. (1977) Function and properties of a soluble c-type cytochrome c-551 in secondary photosynthetic electron transport in whole cells of Chromatium vinosum as studied with flash spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta 461, 188-201. Van Spanningen, R.J.M.; Wansell, C.W.; Reijnders, W.N.M; Harms, N.; Ras, J.; Oltmann, L.F. and Stouthamer A.H. (1991) A method for introduction of unmarked mutations in the genome of Paracoccus denitrificans: construction of strains with multiple mutations in the genes encoding periplasmic cytochromes c550, c551i, and c553i. Van Spanningen, R.J.M.; Wansell, C.W.; Reijnders, W.N.M; Oltmann, L.F. and Stouthamer A.H. (1990) Mutagenesis of the gene encoding amicyanin of Paracoccus denitrificans and the resulting effect on methylamine oxidation. FEBS Letters, Vol. 275, nr. 1,2, 217-220. Voet, D. and Voet, J.G. (1996) Biochemistry. John Wiley & Sons. von Wachenfeldt, C. and Hederstedt, L. (1990) Bacillus subtilis holo-cytochrome c-550 can be synthesised in aerobic Escherichia coli. FEBS Lett. 270, 147-151. Wahlund, Thomas M. and Madigan, Michael T. (1995) Genetic transfer by conjugation in the thermophilic green sulfur bacterium Chlorobium tepidum. J. Bacteriol. Vol. 177, No. 9, p. 2583-2588. Wood, P.M. (1983) Why do c-type cytochromes exist ? FEBS Lett. 164, 223-226 Yaffe, B. M.; Levison, B.S.; Szasz, J. and Sternlicht, H. (1988). Expression of a human αtubulin: Properties of the isolated subunit. Biochemistry 27, 1869-1880. 160