Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2013 – 2014
Evaluatie van het effect van koudestress op de jeugdgroei van Miscanthus
Evelien Mortaignie Promotor: Prof. dr. ir. Dirk Reheul Tutor: dr. ir. Peter Lootens
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: Landbouwkunde
2
Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2013 – 2014
Evaluatie van het effect van koudestress op de jeugdgroei van Miscanthus
Evelien Mortaignie Promotor: Prof. dr. ir. Dirk Reheul Tutor: dr. ir. Peter Lootens
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: Landbouwkunde
Woord vooraf Met deze masterproef is mijn vijfjarige opleiding tot bio-ingenieur bijna afgerond. Ik heb onderweg veel geleerd, zo weet ik dat dit geen solowerk is geweest. Zonder de hulp en de morele en andere steun van vele anderen zou ik dit nooit bereikt kunnen hebben. Daarom houd ik eraan iedereen te danken die mij tijdens deze masterproef en elders gesteund of geholpen heeft. Daarbij wil ik een aantal personen ook bij name danken. Zo bijvoorbeeld Prof. dr. ir. Dirk Reheul, die mij de kans aanbood om deze masterproef uit te werken bij het ILVO. Speciale dank ook voor dr. ir. Peter Lootens, mijn tutor. Hij stond steeds klaar met goede raad en stuurde bij waar nodig zodat ik het pad naar het gewenste resultaat bleef bewandelen. Verder wil ik ir. Simon Fonteyne bedanken voor zijn hulp bij de praktische uitwerking van de experimenten van mijn masterproef. Een bijzonder woord van dank ook voor alle medewerkers van ILVO Plant en in het bijzonder deze van de onderzoeksgroep Groei en Ontwikkeling. Ze hebben mij zeer goed ontvangen, stonden altijd open voor vragen en hielpen waar nodig. Tot slot wil ik ook mijn ouders en familie danken. Zonder hen was dit alles nooit mogelijk geweest. Kortom duizendmaal dank en veel appreciatie voor al diegenen die de weg getoond hebben tijdens mijn academische opleiding en bij mijn eerste stapjes in de wetenschappelijke wereld met deze masterproef.
Inhoudsopgave 1.
Literatuur ......................................................................................................................................... 1 1.1.
1.1.
Miscanthus en bio-energy ....................................................................................................... 1 Teelt bij suboptimale groeiomstandigheden .............................................................................. 3
1.1.1.
Marginale gronden .......................................................................................................... 3
1.1.2.
Abiotische stress ( kilte, vorst, droogte, zout)................................................................. 4
1.2.
Kiltestress en vorststress ....................................................................................................... 12
1.2.1.
Kiltetolerantie ................................................................................................................ 12
1.2.2.
Vorsttolerantie .............................................................................................................. 18
2.
Doelstelling .................................................................................................................................... 20
3.
Materiaal en methoden ................................................................................................................ 21 3.1.
Experiment 1 ......................................................................................................................... 22
3.1.1.
Experiment 1.1 .............................................................................................................. 22
3.1.2.
Experiment 1.2 .............................................................................................................. 23
3.2.
Experiment 2 ......................................................................................................................... 24
3.2.1.
Experiment 2.1 .............................................................................................................. 24
3.2.2.Experiment 2.2 ..................................................................................................................... 25
4.
3.3.
Experiment 3 ......................................................................................................................... 26
3.4.
Experiment 4 ......................................................................................................................... 26
3.5.
Experiment 5 ......................................................................................................................... 28
3.6.
Experiment 6 ......................................................................................................................... 28
3.7.
Statistische verwerking ......................................................................................................... 29
Resultaten...................................................................................................................................... 30 4.1.
Experiment 1 ......................................................................................................................... 30
4.1.1.
Experiment 1.1 .............................................................................................................. 30
4.1.2.
Experiment 1.2 .............................................................................................................. 31
4.2.
Experiment 2 ......................................................................................................................... 33
4.2.1.
Experiment 2.1 .............................................................................................................. 33
4.2.2.
Experiment 2.2 .............................................................................................................. 37
4.3.
Experiment 3 ......................................................................................................................... 37
4.4.
Experiment 4 ......................................................................................................................... 39
4.5.
Experiment 5 ......................................................................................................................... 48
4.6.
Experiment 6 ......................................................................................................................... 49
i
5.
Discussie ........................................................................................................................................ 52 5.1.
Experiment 1: Vorststress ..................................................................................................... 52
5.2.
Experiment 2: Kiltestress ....................................................................................................... 54
5.3.
Experiment 3: Maximale fotosynthese ................................................................................. 55
5.4.
Experiment 4: Suikerconcentraties ....................................................................................... 55
5.5.
Experiment 5: Maximale fotosynthese ................................................................................. 57
5.6.
Experiment 6: Chlorofylfluorescentie ................................................................................... 57
6.
Conclusie ....................................................................................................................................... 59
7.
Literatuurlijst ................................................................................................................................. 60
ii
Lijst van afkortingen CAT CBF/DREB DS ETR HPAEC-PAD LAI LERmax Lm LT50 NAD NADP NPQ NPQ OPTIMISC PEP PEPCK PGA Pmax PPDK qP qP ROS Rubisco SE SOD te tm WUE ΦPSII
Katalase C-repeat binding factors / dehydratation responsive element binding Droge stof Electron transfer rate, snelheid van het elektronentransport High performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection Leaf area index Maximal leaf expansion rate Lengte van het volgroeide blad Lethal temperature 50% Nicotinamide adenine dinucleotide Nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat Non-photochemical quenching, niet-fotochemische quenching Niet-fotochemische quenching Optimizing bioenergy production from miscanthus Fosfoënolpyruvaat Fosfoënolpyruvaatcarboxykinase 3-fosfoglycerinezuur Maximale fotosynthese Pyruvaat orthofosfaat dikinase Photochemical quenching, fotochemische quenching Fotochemische quenching Radical oxygen species Ribulosebifosfaatcarboxylase Standard error, standaardfout Superoxidedismutase Tijdstip waarop het blad volgroeid is Tijdstip waarop de groeisnelheid van het blad maximaal is Water use efficiency Fotochemische efficiëntie van fotosysteem II
Samenvatting Miscanthus (Poaceae) heeft een groot potentieel als energiegewas. Opdat miscanthus dit potentieel beter zou kunnen benutten, speelt veredeling een uiterst belangrijke rol. Bij de teelt wordt immers in bijna alle gevallen gebruik gemaakt van M. x giganteus. De laatste jaren is de interesse voor het telen van miscanthus in de meest diverse streken en klimaten erg toegenomen. Ook wordt het telen van miscanthus als een optie gezien om marginale gronden nuttig aan te wenden. Een zoektocht naar nieuwe genotypen moet helpen om voor alle omstandigheden het geschikte genotype te vinden. Om deze zoektocht in goede banen te leiden werd het OPTIMISC project opgestart. Binnen deze masterproef werden methoden uitgeprobeerd die het uitzoeken van genotypen met een goede koudetolerantie eventueel kunnen vergemakkelijken. Genotypen met een goede koudetolerantie zijn zeker voorhanden aangezien het groeigebied van miscanthus zich uitstrekt tot de subarctische streken. De moeilijkheid bestaat er echter in om tolerante genotypen te vinden die tegelijkertijd gekenmerkt worden door hoge opbrengsten zonder de rendabiliteit in gevaar te brengen. Koudestress bij miscanthus behelst verschillende aspecten. Ten eerste is het belangrijk dat de rizomen de wintervorst overleven. Plantmateriaal is immers erg duur. Op dit moment worden vooral overlevingstesten gebruikt om de vorsttolerantie van de rizomen in kaart te brengen. Het probleem is echter dat het uitvoeren van deze methode meerdere weken in beslag neemt. Daarom werd onderzocht of het meten van de ionenlekkage als alternatieve methode aangewend kan worden. Deze methode is gebaseerd op het principe dat het aantal ionen dat uit de cellen lekt recht evenredig is met de beschadiging van de cellen. Optimalisatie van het protocol moest deze methode op punt stellen. Na wintervorst vormt kiltestress tijdens het voorjaar het tweede belangrijke obstakel voor miscanthus. Kiltestress veroorzaakt immers grote groeivertraging bij de bladeren. Veredelaars zijn overtuigd dat een vlottere groei in het voorjaar tot hogere opbrengsten leidt. Daarom werd de groei van het vierde blad opgevolgd. Daarnaast werd een experiment opgezet om de suikerconcentratie in bladeren van planten die blootgesteld werden aan kiltestress te bepalen. Een hogere suikerconcentratie in de cel is gerelateerd aan de verstoring van de werking van de fotosynthese. De bedoeling was uit te zoeken of meer kiltetolerante miscanthus-genotypen een hogere suikerconcentratie vertoonden bij kiltestress.
Inleiding Deze masterproef maakt deel uit van onderzoek uitgevoerd binnen het OPTIMISC-project. OPTIMISC (Optimizing bioenergy production from miscanthus) is een Europees project met als doel de beperkingen die de verdere ontwikkeling van miscanthus als bio-energiegewas tegenhouden, weg te werken. Het project gaat in op alle stappen van het productieproces tot en met optimalisatie van de verwerking van de biomassa tot energie. Een belangrijke plaats wordt ingenomen door onderzoek rond abiotische stress. Het belang van abiotische stress neemt toe doordat de interesse voor het telen van energiegewassen op marginalen gronden stijgt om competitie met voedselgewassen te vermijden. Op marginale gronden is de kans dat het gewas te lijden heeft onder abiotische stress groter. Daarnaast is het ook de bedoeling dat een grotere tolerantie voor abiotische stress het teeltgebied van miscanthus voor energiewinning uitbreidt. Het ILVO (Instituut voor Landbouw en Visserij Onderzoek) is een belangrijke partner binnen het project. Het onderzoek van het ILVO en deze masterproef focussen zich op koudestress. De experimenten uitgevoerd binnen deze masterproef hadden steeds een verkennende functie. De bedoeling was uit te zoeken of verder onderzoek naar een aspect of methode zinvol was. Om deze reden werden de experimenten niet uitgevoerd met het statistisch verantwoorde aantal herhalingen.
1. Literatuur 1.1. Miscanthus en bio-energy Het geslacht Miscanthus behoort tot de Poaceae en bestaat uit 14 à 20 soorten waaronder M. sacchariflorus, M. sinensis, M. floridulus en M. x giganteus. Miscanthus is oorspronkelijk afkomstig van Oost-Azië (Stewart et al., 2009) en heeft zich verspreid naar Noord-India en Afrika (Heaton et al., 2010). Het gewas heeft diverse toepassingen. In China wordt miscanthus bijvoorbeeld aangewend in de papierindustrie en in Japan worden de schijnstengels gebruikt als dakbedekking (Jørgensen, 2011). In Europa dient de plant regelmatig als sierplant in tuinen. Sinds de jaren tachtig, maar meer intensief sinds begin jaren negentig, wordt er in Europa onderzoek verricht naar de potentiële toepassingen van miscanthus als energiegewas (Heaton et al., 2010). De verschillende soorten binnen het geslacht vertonen sterk uiteenlopende eigenschappen. Een voorbeeld van deze verscheidenheid is de expansiedrang van de rizomen. De rizomen van de meeste soorten groeien enkele cm’s per jaar. De rizomen van M. sacchariflorus daarentegen winnen elk jaar verschillende meters aan lengte (Jørgensen, 2011). Binnen het geslacht miscanthus vervult M. x giganteus een speciale rol. De productie van biomassa voor energiewinning vindt in Europa bijna uitsluitend plaats met behulp van deze soort. Miscanthus x giganteus wordt algemeen gezien als een triploïde kruising van M. sacchariflorus en M. sinensis (Heaton et al., 2010), hoewel hierover en over de rest van de taxonomie binnen het geslacht miscanthus af en toe nog twijfel rijst (Jones & Walsh, 2001). De productie van miscanthus-biomassa in Europa steunt bijna volledig op één genotype, de Aksel Olsen-kloon (Vonwuhlisch et al., 1994). Af en toe wordt gebruik gemaakt van de Hervey-kloon (Greef et al., 1997). Miscanthus x giganteus is triploïd en steriel, wat voor- en nadelen met zich meebrengt. Vermeerdering moet noodzakelijkerwijs gebeuren door middel van stekken of in vitro (Heaton et al., 2010). Deze methoden zijn substantieel duurder dan zaadvermeerdering. Het stekken of in vitro vermeerderen is namelijk een zeer arbeidsintensief proces. Hierdoor wordt de prijs voor de aanleg vqan een hectare miscanthus gevoelig opgedreven. De kostprijs per rizoom varieert in België tussen €0,16 en €0,35. Het plantmateriaal kost dus ongeveer €2000-4000 ha-1 (plantdichtheid van 12000 rizomen ha-1) (www.enerpedia.be). Een steriel gewas heeft als voordeel dat er geen of veel minder ongewenste verspreiding van het gewas is. Vegetatieve vermeerdering gaat ook gepaard met velden die volledig uit identieke planten bestaan. Genetische uniforme bestanden vergemakkelijken de mechanische verwerking van het gewas, maar staan ook bekend om hun verhoogde gevoeligheid voor ziekten en plagen. Hoewel er in 2001 volgens Christian & Haase (2001) nog geen ziekten bekend waren die miscanthus sterk aantastten, wordt aangenomen dat de ziektedruk zal toenemen als er grote uniforme gebieden met miscanthus beteeld zouden worden (Heaton et al., 2010). Naast steriliteit, is vegetatieve vermeerdering van miscanthus in Europa vaak een noodzaak doordat veel soorten niet tot bloei komen of er in niet in slagen om rijpe zaden te vormen. Het niet tot bloei komen in Europa is een gevolg van het korter zijn van het groeiseizoen ten opzichte van het oorsprongsgebied.
1
Miscanthus wordt laat in het voorjaar aangeplant met de bedoeling om vorstschade aan de nieuwe aanplantingen te vermijden. De gewenste plantdensiteit is 2 planten m-2. De plantdensiteit kan eventueel opgedreven worden tot 5 planten m-2 (Lewandowski et al., 2000). Eenmaal het gewas geïnstalleerd is, biedt het rendabele opbrengsten gedurende 20 tot 25 jaar (Lewandowski et al., 2003). Het eerste jaar na aanplanten wordt er niet geoogst omdat de biomassa nog niet groot genoeg is. Hierdoor verhogen ook de overlevingskansen van de planten tijdens de eerste winter wanneer ze de hoogste gevoeligheid aan vorst vertonen. Tijdens het tweede jaar bereikt miscanthus zijn maximale LAI (Leaf Area Index). Deze bedraagt 6 tot 10 afhankelijk van de groeiomstandigheden (Zub et al., 2010). Miscanthus heeft een zeer hoge potentiële opbrengst, 15 à 20 DS ton/ha zonder bemesting of irrigatie (Clifton-Brown et al., 2004), die natuurlijk sterk afhankelijk is van onder andere soort, genotype, bodemvruchtbaarheid en beschikbaarheid van water. Deze hoge opbrengsten zouden onder meer gerelateerd zijn aan het C4-metabolisme van miscanthus dat in tegenstelling tot andere C4-gewassen zoals maïs wel in staat is om hoge rendementen te behalen bij lage temperaturen (minder dan 20°C). De hoge opbrengst wordt niet zozeer bepaald door de fotosynthesesnelheid maar vooral door het lange groeiseizoen van maart tot oktober (www.enerpedia.be). De oogst van miscanthus vindt laat in de herfst of in het voorjaar plaats. De oogst gebeurt in de V.S. met behulp van “traditionele” hooimachines. In Europa wordt voornamelijk gebruik gemaakt van maïshakselaars. Deze machines zijn echter slecht aangepast aan het verwerken van de taaie schijnstengels (Heaton et al., 2010). Om de efficiëntie van het proces te vergroten, moeten er aanpassingen gebeuren aan de bestaande machines.. Oogstmachines die slecht afgesteld zijn op het oogsten van miscanthus kunnen er immers voor zorgen dat veel biomassa onnodig achter blijft op het veld. Voor een veld in Illionois werd bepaald dat de slechte afstelling van het materiaal verantwoordelijk was voor het achterblijven van 2 ton extra DS per ha (Heaton et al., 2010). Miscanthus wordt ingedeeld bij de tweede generatie energiegewassen. Het onderscheid tussen de eerste en de tweede generatie bestaat erin dat de gewassen van de tweede generatie niet kunnen worden aangewend als voedsel en dat er dus geen competitie bestaat tussen de teelt van het gewas voor voedsel en de teelt voor energievoorziening, wat meteen ook een belangrijk verschil is tussen miscanthus en maïs. Na de oogst kan de biomassa op verschillende manieren verwerkt worden. Een eerste manier is verbranding. Miscanthus kan als zuivere stof, als een mengsel met een ander energiegewas of met een klassieke energiebron zoals steenkool verwerkt worden. Daarnaast kan de biomassa ook vergast worden. Hierbij wordt stoom onder grote druk op de biomassa losgelaten, waardoor de biomassa gefragmenteerd wordt in verschillende chemische verbindingen die nadien gescheiden worden. Naargelang de verdere verwerking worden er verschillende eisen gesteld aan het startmateriaal. Eén van de belangrijkste parameters hierbij is het vochtgehalte. Een vochtgehalte lager dan 25% is aangewezen voor de verbranding van miscanthus (Le Ngoc Huyen et al., 2010). Het is dus beter om de oogst van het gewas uit te stellen tot na de winter zodat het gewas de tijd krijgt om te drogen (Meehan et al., 2013; Hayes, 2013). Oogsten na de winter heeft als bijkomend voordeel dat de biomassa minder chloor, kalium en as bevat. Deze elementen hebben immers een negatieve invloed op de verbranding (Jørgensen & Sander, 1997; Lewandowski & Kicherer, 1997; Boelke et al., 1998).
2
Om de kosten voor de aanpassing van infrastructuur specifiek voor de verbranding van miscanthus te drukken is het misschien een optie om in afwachting van infrastructuuraanpassingen gebruikt te maken van de aanwezige infrastructuur en bijvoorbeeld miscanthus simultaan met steenkool te verbranden in de bestaande verbrandingsovens (Thomas et al., 2013). De productie van broeikasgassen is een element dat vandaag weinig in overweging genomen wordt wanneer de rendabiliteit van miscanthus ten opzichte van fossiele brandstoffen bekeken wordt. Bij de verbranding van 14 ton DS miscanthus (17,95 MJ kg-1 DS) komt 22 ton CO2-equivalenten minder vrij dan bij de verbranding van olie met dezelfde energie-inhoud. Om dit positieve beeld te bekomen werd wel het volledige productieproces van miscanthus in rekening gebracht, dus ook bijvoorbeeld de CO2-fixatie door het gewas (Felten et al., 2013). Miscanthus telen staat natuurlijk niet garant voor een complete eliminatie van de uitstoot van broeikasgassen. De broeikasgassen worden daarbij voornamelijk geproduceerd bij de machinale bewerking van de akkers. Murphy et al. (2013) bepaalden via Life Cycle Analysis dat miscanthus gepaard gaat met de productie van 20,23 kg CO2equivalenten per GJ energie in de pellets.
1.1.
Teelt bij suboptimale groeiomstandigheden
1.1.1. Marginale gronden Zoals eerder vermeld is een belangrijk aspect bij het overwegen van het telen van miscanthus en andere energiegewassen het zoveel mogelijk vermijden van competitie tussen voedsel- en energieproductie. Een van de mogelijkheden om dit te realsieren is door de teelt van miscanthus te concentreren op grond die niet geschikt is voor de productie van voedsel. Deze grond is meestal marginale grond. Daarnaast is het van belang om bij de teelt het aanwenden van nutriënten en het brandstofverbruik binnen de perken te houden. Biobrandstoffen gaan immers hand in hand met het streven naar een meer duurzame energieproductie. Het opzet is dus om bij deze teelt op marginale gronden en een minimum aan inputs toch relatief goede opbrengsten te halen. Gelukkig is dit in vele gevallen mogelijk door de lage nutriëntenbehoeften van miscanthus. Deze lage behoeften worden deels bekomen door de samenwerking met micro-organismen. Volgens Davis et al. (2010) kan tot 250 kg stikstof ha-1 jaar-1 afkomstig van stikstof-fixerende micro-organismen door miscanthus opgenomen worden. Deze uitermate hoge meetresultaten zijn gebaseerd op experimenten die uitgevoerd werden in de VS. Hierbij werd een N-balans opgesteld voor miscanthus. Om de balans te laten kloppen werd de onbekende bron van N toegewezen aan N-fixatie. Enkele voorbeelden van deze stikstof fixerende micro-organismen zijn Azospirillium, Clostridium en AM fungi (arbuscular mycorrhiza fungi) (Zub et al., 2010). Naast stikstof-fixerende micro-organismen slaagt miscanthus erin om zijn behoeften te verlagen door efficiënt nutriënten te recycleren. Ieder najaar wordt een aanzienlijk deel van de nutriënten uit de bladeren en de schijnstengels overgebracht naar de rizomen. Hierdoor worden deze nutriënten niet afgevoerd bij de oogst van het bovengrondse plantmateriaal waardoor ze het volgende voorjaar kunnen aangewend worden voor de groei van nieuwe bladeren. In dit opzicht, is het van belang om op te merken dat deze beweging minder efficiënt plaatsvindt voor kalium, toch wanneer vergeleken wordt met stikstof en fosfor (Heaton et al., 2010). Het is dus nodig om bij het bepalen van eventuele nutriëntendeficiënties extra oog te hebben voor kalium. Verder is het wortelvolume na enkele jaren ook zodanig toegenomen dat deze een goede barrière vormt tegen het uitlogen van nutriënten (Scurlock, 1999). 3
De eisen die miscanthus stelt op het vlak van bodemkarakteristieken zijn voornamelijk afhankelijk van de beschikbaarheid van water. Indien er voldoende water voorhanden is, is het bodemtype van ondergeschikt belang. Wanneer dit niet het geval is, geeft miscanthus de voorkeur aan klei boven zand omdat klei meer water vasthoudt (Heaton et al., 2010). 1.1.2. Abiotische stress ( kilte, vorst, droogte, zout) Abiotische stress kan, net als bij andere gewassen, de opbrengst van miscanthus negatief beïnvloeden. Hier zullen vier soorten abiotische stress aan bod komen, namelijk kiltestress, vorststress, droogtestress en zoutstress. Abiotische stress is op dit moment één van de grootste limiterende factoren voor een uitbreiding van de teelt van miscanthus in Europa. De opbrengstdaling die gepaard gaat met abiotische stress, zal immers de rendabiliteit van de teelt sterk verlagen. Bij teelt op marginale gronden is de kans groter dat de planten te lijden hebben onder abiotische stress. 1.1.2.1.
Kiltestress
Kiltestress wordt omschreven als stress veroorzaakt door temperaturen die lager zijn dan de optimale groeitemperatuur van het gewas maar boven het vriespunt. Temperaturen van 14°C en minder worden beschouwd als suboptimale temperaturen. Een symptoom van kiltestress is de overgang van de membraanstructuren van de cel naar een meer vaste vorm (Uemara et al., 1999; Matteucci et al., 2011). De hoeveelheid onverzadigde vetzuren in de membranen zal afnemen doordat ze met behulp van desaturases worden omgevormd tot verzadigde vetzuren. Verzadigde vetzuren hebben een hoger stolpunt dan hun onverzadigde tegenhangers en bevriezen dus minder snel. De toename van de hoeveelheid verzadigde vetzuren zorgt er echter ook voor dat de structuur van het membraan wijzigt. In combinatie met verhoogde radicaalvorming leidt dit tot het lekken van ionen en aminozuren uit de cel. Door de toegenomen viscositeit van de membranen zal ook de diffusie van moleculen zoals plastoquinon, die instaan voor het transport van de elektronen bemoeilijkt worden (Griffith et al., 1984). Het elektronentransport van de cel wordt daarbij verstoord. Daarnaast zal onder andere ook de activiteit van de enzymen beïnvloed worden (Ruelland et al., 2010) doordat de lagere temperaturen het redox-evenwicht uit balans brengen. Hierdoor zou dan de activatie van de fotosynthese-enzymen verstoord worden (Hutchison et al., 2000). Zowel C4als C3-planten zijn onderhevig aan de gevolgen van kiltestress. Omdat C3-planten in hun natuurlijke groei-omgeving meer in aanraking komen met kiltestress hebben zij echter in grotere mate dan C4planten mechanismen ontwikkeld om de gevolgen van kiltestress binnen de perken te houden. Fotosynthese zal negatief beïnvloed worden door kiltestress. Miscanthus heeft een C4fotosynthesemetabolisme. Het C4-metabolisme wordt vaak geassocieerd met planten uit warmere, meer tropische streken. Het C4-metabolisme is in optimale omstandigheden met veel licht in staat tot hogere maximale fotosynthesesnelheden dan het C3-metabolisme. Bij C3-planten worden CO2 en ribulosebifosfaat gekoppeld met behulp van Rubisco (ribulosebifosfaatcarboxylase) wat aanleiding geeft tot de vorming van 2 moleculen 3-fosfoglycerinezuur (PGA), die verder verwerkt worden tot suikers in de Calvin-cyclus. De cyclus van C4-planten verloopt analoog behalve dat er bij de start van het proces nog enkele extra stappen zijn. CO2 wordt gebonden aan fosfoënolpyruvaat (PEP) door PEP-carboxylase en omgezet in malonzuur of asparaginezuur. Deze molecule wordt getransporteerd naar de bundelschedecellen waar, nadat CO2 opnieuw vrijgesteld werd met behulp van pyruvaat orthofosfaat dikinase (PPDK), de rest van het proces zoals beschreven voor het C3-metabolisme plaatsvindt. 4
Het C4-metabolisme heeft twee ATP-moleculen meer nodig dan het C3-metabolisme (5 in plaats van 3) voor het verwerken van 1 CO2-molecule. Toch verloopt het C4-metabolisme efficiënter bij hoge lichtintensiteiten en hoge temperaturen omdat het erin slaagt om energieverlies door fotorespiratie grotendeels te vermijden. Fotorespiratie is het proces waarbij ribulosebifosfaat door toedoen van Rubisco reageert met O2 in plaats van met CO2. De energie die aangewend wordt voor deze binding is niet langer beschikbaar voor het binden van CO2, dit remt de efficiëntie van het proces. De werking van Rubisco als oxygenase wordt gestimuleerd door hoge temperaturen, lage CO2-concentratie en hoge O2-concentratie (Heaton et al., 2010). Bij C4-planten wordt fotorespiratie tegengegaan doordat de CO2-fixatie gescheiden plaatsvindt van de andere processen. Hierdoor wordt de O2-concentratie in de bundelschedecellen laag gehouden, is er minder kans dat Rubisco in contact komt met O2 en zal er (bijna) geen fotorespiratie plaatsvinden. Bij lage temperaturen, en dus minder fotorespiratie, moet de C4-planten echter de prijs betalen: in dit geval zijn ze minder efficiënt dan de C3-planten door hun hogere nood aan ATP per gefixeerde CO2-molecule. Als de bovenstaande redenering gevolgd wordt, is het niet opportuun om gewassen met een C4metabolisme te telen in koudere streken. Toch heeft miscanthus een verspreidingsgebied dat zich uitstrekt van de tropen tot de subarctische streken (Papoea-Nieuw-Guinea tot Sachalin, OostRusland). Het wijst erop dat miscanthus ondanks zijn C4-metabolisme erin slaagt om zijn fotosyntheseapparaat toch goed te laten functioneren in koudere streken. Bij kilte worden meer zuurstofradicalen gevormd doordat de energie die opgevangen wordt door de fotosystemen moeilijker en trager verwerkt wordt in de elektronentransportketen. Overtollige elektronen kunnen aanleiding geven tot de vorming van zuurstofradicalen (ROS, reactive oxygen species) die essentiële moleculen, zoals chlorofyl, sterk kunnen beschadigen. Om schade zoveel mogelijk te vermijden, is een goede kiltebestendigheid van de fotosynthese-enzymen van belang. Op deze manier kunnen ze ook bij kilte veel elektronen blijven verwerken. Onder andere Naidu et al. (2003) probeerden uit te zoeken of deze aanpassing aan kilte gerelateerd is aan een goede kiltebestendigheid van de fotosynthese-enzymen, zoals PPDK en Rubisco. Zowel bij 25°C als 14°C was er eenzelfde hoeveelheid van deze enzymen aanwezig, wat erop wijst dat deze enzymen inderdaad kiltebestendig zijn. Daarnaast zijn er ook moleculen die radicalen onschadelijk maken. Ten eerste zijn er de enzymen, bijvoorbeeld superoxide dismutase (SOD) en katalase (CAT). Daarnaast zijn er ook niet-enzymatische moleculen met een antioxiderende functie zoals vitamine E en carotenoïden (Keunen et al, 2013). Ook van suikers, onder meer disacchariden en fructanen, is een antioxiderende werking aangetoond (Nishizawa et al., 2008; Hernandez-Marin & Martinez, 2012; Peshev et al., 2013). Naast de antioxiderende werking, bestaat de hypothese dat suikers ook een functie als osmoprotectants zouden vervullen. De suikerconcentraties binnen de cel wijzigen wanneer de plant suboptimale temperaturen ervaart. Purdy et al. (2013) onderzochten 4 miscanthus-genotypen. Deze genotypen vertoonden allen een toename in glucose-, fructose- en sucroseconcentratie bij kilte. De stijging in suikerconcentratie kan mogelijks ook verklaard worden doordat het inbouwen van de suikers in celcomponenten vertraging oploopt. De lage temperaturen remmen immers de groei van de plant. Ook de hoeveelheid zetmeel en andere osmoprotectants zoals proline namen toe (Theocharis et al., 2012). 5
Er zijn ook aanwijzingen dat kiltestress door de plant kan waargenomen worden als fysiologische droogte. De geleidbaarheid van het xyleem zal afnemen door de lagere temperatuur (Allen & Ort, 2001). Daarnaast kan een verminderde activiteit van het wortelstelsel een rol spelen (Rinaldelli & Mancuso, 1994). Volgens McWilliam et al. (1982) zal kilte de werking van de stomata verstoren. Er zal overmatige verdamping zijn door het slecht sluiten van de stomata. Meer kiltetolerante soorten zouden er daarentegen beter in slagen om een goede werking van de stomata te garanderen. De genexpressie wijzigt indien de plant kilte detecteert. De link tussen de transcriptiefactor MsCBF3, die behoort tot de CBF/DREB familie, en miscanthus-genotypen die een sterke daling in fotosynthesecapaciteit vertonen bij kilte, werd bijvoorbeeld blootgelegd door Purdy et al. (2013). Het is niet geweten of deze verandering in MsCBF3-expressie wijzigingen in suikerconcentratie veroorzaakt. Het is ook mogelijk dat de veranderende suikerconcentratie aan de basis ligt van aanpassingen in de genexpressie. Tenslotte is het mogelijk dat beide fenomenen volledig los van elkaar voorkomen. Belangrijk om in het oog te houden bij al deze aanpassingsprocessen is het feit dat de voorgeschiedenis van de plant een belangrijke rol speelt. Als de plant voldoende tijd krijgt om te acclimatiseren, zal ze zich sneller en gemakkelijker aanpassen aan lagere temperaturen. Wanneer de omstandigheden opnieuw gunstig zijn, slaagt de plant er soms in om deze verhoogde toestand van paraatheid ten opzichte van kilte tijdelijk te behouden. De-acclimatisatie treedt in veel gevallen sneller op dan acclimatisatie (Kalberer et al., 2006). Acclimatisatie bij 12°C onder hoge lichtintensiteit van M. sinensis cv. Goliath zorgt bijvoorbeeld voor een verhoogde vorsttolerantie (Zub et al., 2012). Domon et al. (2013) constateerden veranderingen in de celwandsamenstelling, onder andere een stijging van het β-D-glucaan-gehalte, bij de drie onderzochte miscanthus-genotypen na acclimatisatie bij 12°C gedurende acht dagen. β-D-glucaan is een polymeer dat een belangrijke rol speelt bij het opbouwen van celwanden. De hypothese is dat planten als ze geconfronteerd worden met kiltestress hun celwanden verstevigen. Een dikkere celwand zorgt dat de cellen beter beschermd zijn tegen vorstschade. Met al deze kennis rond kiltestress bij miscanthus wordt geprobeerd om een groeimodel op te stellen. Het model moet helpen om de invloed van kilte op de opbrengst te evalueren en de kiltebestendigheid van verschillende genotypen te vergelijken. Daarbij mag niet uit het oog verloren worden dat kiltestress en kiltetolerantie niet in alle groeiomstandigheden van belang zijn. Enkel wanneer de opbrengst van het gewas ten gevolge van kiltestress substantieel lager uitvalt dan in optimale omstandigheden loont het de moeite om te investeren in de zoektocht naar meer kiltetolerante genotypen. Een verlaagde opbrengst door kiltestress zal immers een rem vormen op de rendabiliteit van de teelt.
6
Onderzoekers, zoals Zub et al. (2012), zijn overtuigd dat de veredelaars op dit moment op zoek zouden moeten gaan naar genotypen die laat opkomen en vervolgens een snelle groeifase vertonen. Deze genotypen zouden een duidelijke correlatie hebben met hoge opbrengsten. De late opkomst zou immers vermijden dat de plant wordt blootgesteld aan kiltestress (lage temperaturen komen gewoonlijk in het vroege voorjaar voor). De snelle groei nadien is noodzakelijk om het inkorten van het groeiseizoen door de late opkomst te compenseren en toch een goede opbrengst te bekomen bij de oogst. Het groeiseizoen verlengen door genotypen te selecteren die op het einde van het groeiseizoen langer doorgroeien is volgens Zub et al. (2012) geen interessante optie om de opbrengst te verhogen. Bij deze resultaten moet opgemerkt worden dat er voornamelijk M. sinensis-genotypen uit de sierteelt onderzocht werden. Deze genotypen werden niet geselecteerd voor hoge biomassaproductie. De M. sinensis werden vergeleken met enkele M. x giganteus-klonen, die wel geselecteerd werden voor een hoge opbrengst en typisch gekenmerkt worden door een late opkomst. De M. sinensis zijn fertiel en zullen op het einde van het groeiseizoen bloeien. De lengte van het groeiseizoen, en dus biomassaproductie, wordt dus begrensd door het bloeitijdstip. De grote aanwezigheid van M. sinensis stuurde mee de beslissing van Zub et al. (2012) dat langer doorgroeien op het einde van het groeiseizoen geen belangrijke factor is bij het verhogen van de opbrengst. Andere publicaties tonen inderdaad een correlatie aan tussen de lengte van het groeiseizoen en de opbrengst (Robson et al., 2013). Een verlengd groeiseizoen biedt de plant immers de kans om meer straling op te vangen en dus meer fotosynthese te verrichten. Een vroegere opkomst en uitgestelde senescentie zijn twee opties om het groeiseizoen te verlengen. In dit geval zou een vroege opkomst dus wel een positieve factor zijn bij de selectie. Een vroegere opkomst verhoogt wel de kans dat de plant geconfronteerd wordt met kille periodes en zorgt dat het belang van kiltetolerantie toeneemt. Robson et al. (2013) merken echter op dat niet alle genotypen met een lang groeiseizoen ook een hoge biomassaproductie hebben en dat dus enige voorzichtigheid geboden is bij het trekken van conclusies omtrent de heilzaamheid van een langer groeiseizoen. Kiltetolerante genotypen worden echter actueel nog steeds gekenmerkt door een slechtere groei en opbrengst dan de niet-kiltetolerante genotypen bij optimale groeiomstandigheden. De combinatie van kiltetolerantie en hoge opbrengsten is een probleem waar de veredeling al jarenlang mee worstelt. Ondertussen werd met behulp van modelleerwerk al aangetoond dat een verhoogde kiltetolerantie effectief een goede optie is om (via een langer groeiseizoen) een verhoogde opbrengst te bekomen. Berekeningen uitgevoerd met MISCANFOR, een model om de groei en de opbrengst van miscanthus in kaart te brengen en voorspellingen te doen, wijzen uit dat de lengte van het groeiseizoen, en hieraan gerelateerd de kiltetolerantie, een belangrijke factor is bij de optimalisatie van de Miscanthus-teelt (Hastings et al., 2009). Ook Long et al. (2006) beweren dat een verbetering van de fotosynthese tot een stijging van de opbrengst zou leiden. Het artikel van Long et al. (2006) handelt wel over het verbeteren van fotosynthese in het algemeen en niet specifiek over het verhogen van de fotosynthese bij kiltestress. Deze beweringen bieden een aanwijzing dat een verbetering van de kiltetolerantie zou kunnen samengaan met een verhoogde opbrengst. Theoretisch, want in de praktijk blijkt het nog steeds moeilijk om goede kiltetolerantie en hoge biomassaproductie te combineren.
7
1.1.2.2.
Vorststress
Er is sprake van vorststress wanneer de plant geconfronteerd wordt met temperaturen lager dan het vriespunt. Vorststress gaat gepaard met de vorming van ijskristallen, extra- en /of intracellulair. Extracellulaire ijskristallen zuigen tijdens hun expansie water aan uit de cel waardoor de cel dehydrateert en krimpt (Ruelland et al., 2009). Bij het opnieuw ontdooien is er een snelle aanvoer van water naar de cel. Soms is de cel echter de capaciteit voor het (snel) zwellen verloren. In dat geval zal de cel barsten. Bij het dehydrateren mag het celoppervlak niet te klein worden anders zullen het plasmamembraan en de interne membranen met elkaar in contact komen. Als dit gebeurt, gaat de osmotische capaciteit van de cel verloren, celdood is het gevolg (Uemara et al., 2006; Ruelland et al., 2009). Intracellulaire ijskristallen zullen ook de cel dehydrateren. Daarnaast zal de mechanische druk van de kristallen de membranen en de celorganellen beschadigen (Burke et al. 1976). De uitwendige vorstsymptomen zijn bruine, geelachtige vlekken met een zacht en waterig uitzicht (Howell & Weiser, 1970b). Bij het evalueren van vorststress is het belangrijk om een onderscheid te maken tussen de bovengrondse en de ondergrondse plantendelen. De ondergrondse delen bevinden zich immers in de bodem, die een isolerende werking heeft, terwijl de bovengrondse delen rechtstreeks blootgesteld worden aan de vriestemperaturen. 1.1.2.2.1.
De ondergrondse plantendelen
De rizomen zijn de houtige overwinteringsstructuren van miscanthus. Deze zijn relatief goed aangepast aan vorststress. Nieuw aangelegde percelen met minder ontwikkelde rizomen zijn vatbaarder voor vorststress dan oudere aanplantingen. Tijdens de eerste winter is de minimale bodemtemperatuur die de rizomen aankunnen 3,5°C (www.enerpedia.be). Om deze reden is het belangrijk dat bij de aanplanting van miscanthus de rizoomstekken voldoende groot (20 cm lengte) zijn en dat ze voldoende diep geplant (20 cm onder het bodemoppervlak) worden (Eppel-Hotz et al., 1997). Nadat de planten de eerste winter succesvol doorgekomen zijn, zijn ze beter bestand tegen vorst. Afharden tijdens de eerste winter zorgt er immers voor dat het afharden tijdens de volgende winters beter en sneller verloopt (Plazek et al., 2011), wat weerspiegeld wordt in een grotere capaciteit om nieuwe scheuten te vormen na de tweede winter dan na de eerste winter (Plazek et al., 2011). Vanaf het tweede jaar zijn er ook voldoende bladeren die na afvallen een isolerende laag op de bodem vormen waardoor de temperatuur in de bodem niet te sterk daalt (www.enerpedia.be). Tijdens de eerste jaar is de opbrengst nog te laag waardoor de rizomen niet kunnen genieten van de isolerende werking van de afgevallen bladeren. Deze isolerende laag kan natuurlijk niet gevormd worden indien geoogst wordt in de herfst.
8
Aangezien het vervangen van doodgevroren planten een grote kost met zich meebrengt, wordt geprobeerd om de schade aan de rizomen te minimaliseren door het selecteren van genotypen met meer vorstbestendige rizomen. Het selecteren van genotypen gebeurt onder meer door rizomen aan een vorstbehandeling te onderwerpen waarna de capaciteit om nieuwe scheuten te vormen wordt geobserveerd. Op basis van deze gegevens kan de LT50 berekend worden. De LT50 (lethal temperature 50%) is de temperatuur waarbij 50% van de rizomen de vorstbehandeling niet overleefde en geen nieuwe scheuten konden vormen. Clifton-Brown & Lewandowski (2000) onderzochten de vorstbestendigheid van enkele genotypen aan de hand van deze methode. Voor M. x giganteus en M. sacchariflorus werd een LT50 van -3,4°C gevonden, voor een M. sinensis-hybride (sin-H6) was de LT50 -6,5°C. Deze resultaten werden bevestigd door de overlevingscijfers van deze genotypen bij veldproeven. Rizomen beschermen zich op meerdere manieren tegen vorstschade. De rizoomcellen zullen onder andere osmotisch actieve stoffen opstapelen om de inhoud van de cel te beschermen tegen de koude. Opstapeling van osmotisch actieve moleculen zorgt immers voor een meer negatieve osmotische potentiaal waardoor het vriespunt van de waterige celoplossing daalt. Deze redenering volgend, valt er te verwachten dat meer vorsttolerante genotypen in staat zijn tot grotere osmotische aanpassingen dan minder vorsttolerante genotypen. De resultaten van Clifton-Brown & Lewandowski (2000) weerspiegelen echter het tegengestelde, namelijk een hogere osmotische potentiaal (minder negatieve waarden) in de rizomen van het meer vorstbestendige genotype, M. sinensis, dan bij de twee minder vorstbestendige genotypen, M. x giganteus en M. sacchariflorus. Ook de vochtinhoud van de cellen zou een rol spelen bij de vorsttolerantie. Een verlaagde vochtinhoud van M. sinensis-rizomen ging samen met een verhoogde weerstand (Clifton-Brown & Lewandowski, 2000). Het principe van osmotische aanpassing en verlaagde vochtinhoud van de rizoomcellen bij vorststress dient nog verder onderzocht te worden om volledige duidelijkheid te scheppen. Vorststress stimuleert ook de activiteit van enzymen die radicalen onschadelijk maken zoals katalase en peroxidase (Plazek et al., 2011). De gevoeligheid van rizomen voor vorststress is geen constante doorheen de tijd. Afgeharde rizomen zijn vorsttoleranter dan niet-afgeharde. Plazek et al. (2009) toonden dit aan met behulp van ionenlekkage. Indien de celmembranen door vorst beschadigd worden, lekken de ionen uit de cellen. Het percentage ionen dat uit de cellen gelekt is wordt relatief gemeten ten opzichte van de totale hoeveelheid ionen in de cellen. Hoe hoger het percentage ionenlekkage, hoe sterker de cellen beschadigd zijn. Plazek et al. (2009) constateerden dat de ionenlekkage opmerkelijk lager was bij afgeharde rizomen. 1.1.2.2.2.
De bovengrondse plantendelen
Bij de bovengrondse delen dient een onderscheid gemaakt te worden tussen schade ten gevolge van wintervorst en schade ten gevolge van een late lenteprik. Tijdens de winter bevinden de meeste levende plantendelen, waaronder de stengelapex, zich onder de grond in een goed beschermde positie. Indien zich tijdens de winter een warmere periode zou voordoen, kunnen nieuwe scheuten zich beginnen vormen. Eens deze warmere periode voorbij is, kunnen de scheuten sterk te leiden hebben onder de vorststress. Daarnaast kan zich een vorstperiode voor doen tijdens het voorjaar. Hoe verder de planten op dat moment al ontwikkeld zijn, hoe groter de schade die ze kunnen oplopen.
9
De positie van de apex biedt een verklaring voor het verband tussen het ontwikkelingsstadium en de omvang van vorstschade (Zub et al., 2012). Naarmate de plant verder ontwikkelt, zal de apex zich minder diep in de bodem bevinden. In het 7-blad stadium bevindt de apex zich ter hoogte van het bodemoppervlak. Hier kan de apex minder van de isolerende werking van de bodem genieten en loopt de apex sneller vorstschade op. Zub et al. (2012) vergeleken de vorstgevoeligheid van planten in het 6/7-blad stadium met die in het 3/5-blad stadium. De schijnstengels met een verder gevorderde ontwikkeling waren gevoeliger voor vorst en hierin zagen Zub et al. (2012) een bevestiging van hun hypothese rond de positie van de apex. Net als bij de rizomen, bestaat er bij de bovengrondse plantendelen een relatie tussen een lager vochtgehalte en een verhoogde tolerantie. Een M. sinensis-genotype, sin-H9, dat als meest vorsttolerante genotype uit de testen van Farell et al. (2006) kwam, had een lager vochtgehalte in de bladeren dan de andere onderzochte genotypen. Acclimatisatie kan het vochtgehalte in de bladeren zowel verhogen als verlagen, afhankelijk van het genotype (Plazek et al., 2011). 1.1.2.3.
Droogtestress
Droogtestress wordt omschreven als de situatie waarbij de plant gedwongen moet omgaan met een tekort aan water. Symptomen van droogtestress zijn onder andere groeivertraging of -stop en verwelking. De basis voor het vermijden van droogtestress is efficiënt omgaan met het beschikbare water. Om deze efficiëntie te kwantificeren wordt de water use efficiency (WUE) gebruikt. Miscanthus heeft een goede WUE, namelijk 6-10 g droge stof per l water (Cadoux et al., 2008). De harvest WUE, waarbij de opbrengst wordt gedeeld door de jaarlijkse evapotranspiratie, is 20–28 kg droge stof ha-1 mm H20-1 (Van Loocke et al., 2012). Bij Panicum virgatum (switchgrass) is dit slechts 10 kg droge stof ha-1 mm H20-1 (Beale et al., 1999; Clifton-Brown & Lewandowski, 2000a; Hickman et al., 2010; Lewandowski et al., 1995). Bij maïs bedraagt de harvest WUE ongeveer 18 kg droge stof ha-1 mm H20-1 (Zwart & Bastiaanssen, 2004). De harvest WUE van miscanthus is duidelijk hoger dan deze van P. virgatum en maïs. Ondanks de goede WUE kan de totale watervraag van een hectare miscanthus hoog oplopen. Het totale waterverbruik is namelijk niet enkel gerelateerd is aan de WUE maar ook aan de biomassaproductie (Jørgensen, 2011). Een opbrengst van 25 ton DS gecombineerd met een verbruik van 200 l water per kg droge stof leidt tot een behoefte van 500 mm regen tijdens het groeiseizoen (Heaton et al., 2010). In Zuid-Europa bestaat de vrees dat uitbreiding van de miscanthus-teelt zou kunnen leiden tot uitputting van de grondwatervoorraden. In Vlaanderen valt er ongeveer 436 mm van april tot september. Aangevuld met 131 mm in september-oktober, geeft dit 567 mm regen tijdens het groeiseizoen van miscanthus (Tits et al., 2010). De planten kunnen ongeveer 70%, 397 mm, gebruiken. Aangezien miscanthus een behoefte heeft van 500 mm water en er slechts 397 mm beschikbaar is uit neerslag, is ook in Vlaanderen de vrees voor uitputting van de grondwatervoorraden door het telen van miscanthus niet onbestaand.
10
Droogtestress kan grote gevolgen hebben voor de biomassaproductie van miscanthus. Mann et al. (2013) deden een experiment waarbij de planten gedurende acht weken in de groeikamer aan milde (-0,5 MPa) of zware droogtestress (-4,2 MPa) werden blootgesteld. De percentages die gegeven worden zijn het gemiddelde voor miscanthus en pijlriet samen (Arundo donax), maar de reductie van de biomassaproductie met respectievelijk 56% en 66% maakt toch duidelijk dat de biomassaproductie van miscanthus sterk te leiden had onder het watertekort. Indien de rizoomfragmenten na planten niet eerst acht weken de kans kregen om zich te ontwikkelen in ideale omstandigheden maar onmiddellijk droogtestress ondergingen (dus 16 weken droogtestress in plaats van 8) was de reductie in biomassa nog veel groter. Ook op vlak van droogtestress zijn er duidelijke verschillen waar te nemen tussen de soorten. Miscanthus sinensis vertoont een verlaging van de stomatale geleidbaarheid bij droogtestress, deze is afwezig bij M. sacchariflorus en M. x giganteus. Miscanthus sinensis zal ook minder snel symptomen van senescentie vertonen dan de andere twee genotypen (Clifton-Brown en al., 2000). Een verlaging van de stomatale geleidbaarheid zou de plant beter in staat stellen om vochtverlies tegen te gaan. Ook aanpassingen van de osmotische potentiaal in reactie op droogtestress werden bestudeerd, maar op dit vlak werden geen verschillen waargenomen tussen M. sinensis, M. sacchariflorus en M. x giganteus (Clifton-Brown et al., 2002). Een lichte daling van de waterbeschikbaarheid heeft ook positieve effecten. Zo zal bijvoorbeeld de invloed van extra stikstofbemesting op de opbrengst stijgen. Zub & Brancourt-Hulmel (2010) vermelden dat onder water limiterende omstandigheden in het derde jaar na aanplanten de planten 53% hoger waren wanneer er stikstof werd toegediend dan wanneer dit niet het geval was. Als het gewas het jaar voordien overvloedig van water was voorzien, bedroeg het verschil tussen beide situaties slechts 22% (Cosentino et al., 2007). Naast een verhoogde NUE (nitrogen use efficiency) bij een lagere waterbeschikbaarheid is nog een tweede verklaring voor dit verschil mogelijk. Als het tijdens het tweede jaar veel regende, spoelde veel stikstof uit. Daardoor diende een deel van de stikstof die in jaar 3 toegediend werd om de bodemvoorraad opnieuw op peil te brengen. Het gevolg was dat er minder stikstof ter beschikking van de planten was en de opbrengst minder sterk toenam. Waterstress leidt dus tot efficiëntere benutting van de meststoffen. Uiteraard is dit principe niet langer geldig wanneer de waterstress te ernstig wordt. 1.1.2.4.
Zoutstress
Rond zoutstress bij miscanthus is er op dit moment weinig literatuur voorhanden. Daar kan weldra verandering in komen want zoutstress vormt een belangrijke pijler binnen het OPTIMISC-project. Vooral de universiteit van Wageningen zal binnen dit project focussen op zoutstress (onderzoeksgroep Abiotische stress, Gerard van der Linden, Wageningen UR). Zoutstress zal door de plant ervaren worden als fysiologische droogte. Waarschijnlijk zijn er dus overeenkomsten tussen de gevolgen van droogte- en zoutstress. De gevoeligheid van een plant voor zoutstress is afhankelijk van vele factoren. Zo is er mogelijk ook een link tussen verbeterde zouttolerantie en symbiose met stikstof-fixerende micro-organismen. Inoculatie van miscanthus met Clostridium en Enterobacter had immers een positieve invloed op de zouttolerantie (Ye et al., 2005).
11
Recent toonden Plazek et al. (2014) aan dat de zouttolerantie van M. x giganteus gerelateerd is aan het gewicht van de rizomen. Daarnaast zouden ook hoge kalium- en proline-concentraties bescherming bieden tegen zoutstress.
1.2. Kiltestress en vorststress De hoogste biomassaproductie die in Europa bij miscanthus werd gemeten, vond plaats in Frankrijk. In Lusignan registreerden Clifton-Brown et al. (2004) een opbrengst van 49 ton DS ha-1 bij oogst in de herfst. Deze cijfers werden verkregen op een perceel dat geïrrigeerd en bemest werd. Zonder irrigatie of bemesting, situeert de opbrengst van miscanthus zich rond 15 à 20 ton DS ha-1. De opbrengst is in optimale omstandigheden ongeveer twee maal hoger dan bij Panicum virgatum (switchgrass) (Dohleman et al.,2009) en 59% hoger dan bij korrelmaïs (Dohleman en Long, 2009). Deze cijfers schetsen een positief beeld van het potentieel van miscanthus maar hoe verhoudt miscanthus zich tot de andere gewassen wanneer kilte- en vorststress voorkomen? In het volgende gedeelte wordt geprobeerd om de kilte- en vorsttolerantie te evalueren ten opzichte van andere gewassen. Deze gewassen zijn enerzijds verwante gewassen, bijvoorbeeld suikerriet, en anderzijds concurrerende energiegewassen, bijvoorbeeld maïs. Belangrijk bij deze vergelijking is dat de grote verscheidenheid op vlak van tolerantie tussen de verschillende genotypen van een gewas niet uit het oog verloren wordt. De bedoeling is een beter inzicht te verkrijgen in het potentieel van miscanthus bij teelt in gebieden waar kilte- en of vorststress regelmatig voorkomen. 1.2.1. Kiltetolerantie 1.2.1.1.
Teeltgebied
Wanneer de kiltetolerantie van een gewas bestudeerd wordt, biedt het teeltgebied een goede aanwijzing voor de mate waarin dit gewas beschikt over kiltetolerante genen. Miscanthus komt voor van subarctische tot tropische streken. Suikerriet (Saccharum officinarum) wordt omwille van de koudegevoeligheid enkel geteeld in (sub)tropische streken (Bellintani et al., 2012) waardoor het moeilijker is om koudebestendige genen te ontdekken. Sorghum (Sorghum bicolor L. Moench) is afkomstig van Noord-Oost-Afrika (www.cgiar.org) maar heeft zich van daaruit verspreid naar de Afrikaanse hooglanden en meer gematigde gebieden. De genotypen in die streken zijn vrij goed bestand tegen koude (Maulana & Tesso, 2011) en vormen dus een goede bron van kiltetolerante genen. 1.2.1.2.
Duur van het groeiseizoen
De lengte van het groeiseizoen heeft een grote invloed op de biomassaproductie van een gewas. Een vergelijking van het groeiseizoen tussen twee gewassen kan dus de verhouding van hun biomassaproducties reflecteren. Een goed voorbeeld om dit aspect toe te lichten is de vergelijking tussen maïs en miscanthus. Miscanthus x giganteus geteeld in Illinois in 2007 en 2008 was tot 59% productiever dan maïs (Dohleman & Long, 2009). De verklaring zou liggen in de combinatie van het langere groeiseizoen en een grotere bladoppervlakte bij miscanthus. Het groeiseizoen van miscanthus duurde 203 dagen in 2007 en 195 dagen in 2008. Voor maïs was dit respectievelijk 125 en 126 dagen (figuur 1). In België duurt het groeiseizoen van miscanthus van maart-april tot oktober. Maïs groeit van eind april tot september (www.enerpedia.be). 12
Figuur 1 Accumulatie van bovengrondse droge biomassa (Wb) van miscanthus (zwarte bolletjes) en maïs (open bolletjes) in 2007 en 2008. Wb = 0 (intercept) duidt steeds de opkomst van het gewas aan. (Dohleman & Long, 2009)
Kiltestress heeft gewoonlijk weinig invloed op de opbrengst van maïs (Leipner et al., 2008), deze wordt immers voldoende laat gezaaid om in de meeste jaren niet of weinig blootgesteld te worden aan kiltestress. Deze experimenten werden uitgevoerd in Zwitserland. In België wordt maïs regelmatig geconfronteerd met kiltestress in het voorjaar. Miscanthus die als meerjarige plant jaarlijks aan kiltestress wordt onderworpen, heeft zich beter aangepast en zal minder groeivertraging oplopen dan maïs. Het verschil in groeisnelheid ten gevolge van kiltestress wordt geïllustreerd in figuur 2, waar miscanthus duidelijk minder last heeft ondervonden van de kiltestress en al een heel stuk groter is dan maïs. 2013 was wel een uitzonderlijk koud voorjaar, waardoor de verschillen tussen beide soorten veel meer uitgesproken waren dan andere jaren.
13
Figuur 2 Invloed van een koud voorjaar op maïs (vooraan) en verschillende miscanthus-genotypen (achteraan), veldproeven ILVO, Melle, 18/06/2013
Bij gewassen waarvan de generatieve delen van de plant geoogst worden, zijn niet enkel koudere perioden tijdens de jeugdgroei van belang, maar ook die tijdens de bloei. Kilte tijdens de bloei kan immers de graanopbrengst van het gewas sterk negatief beïnvloeden. Een voorbeeld waarbij kilte tijdens de bloei een grote daling van de graanopbrengst kan veroorzaken is sorghum (Maulana & Tesso, 2011). Bij miscanthus is kilte op het einde van het groeiseizoen relatief minder belangrijk omdat de grootste groeiperiode op dat moment voorbij is en enkel de vegetatieve delen van het gewas geoogst worden. Bij genotypen die wel generatief worden is verstoring van de bloei door kilte misschien zelfs een positief punt, want op deze manier wordt ongewenste verspreiding van het gewas tegengegaan. 1.2.1.3.
Aanpassingen aan fotosynthese
Zowel miscanthus, maïs, P. virgatum, suikerriet als sorghum hebben een C4fotosynthesemetabolisme. Er zijn meerdere varianten bekend van het C4-metabolisme. Deze varianten verschillen op het vlak van het C4-intermediair dat van de mesofyl- naar de bundelschedecellen getransporteerd wordt. Het intermediair kan malaat of aspartaat zijn. Daarnaast kan ook het enzym dat verantwoordelijk is voor de decarboxylatie in de bundelschedecellen zowel NADP (nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat ) malic enzyme, NAD (nicotinamide adenine dinucleotide ) malic enzyme als PEPCK (fosfoënolpyruvaatcarboxykinase) zijn. Deze enzymen hebben tot de indeling van het C4-metabolisme volgens 3 types geleid: het NADP-ME-type, het NAD-ME-type en het PEPCK-type. Figuur 3 toont deze drie varianten samen met hun intermediairen en enzymen.
14
Figuur 3 Drie varianten van het C4-metabolisme: het NADP-ME-type (A), het NAD-ME-type (B) en het PEPCK-type (Calsa & Figueira, 2007)
Elk van de varianten zou in elke C4-plant voorkomen maar het zou mogelijk zijn om een onderscheid te maken tussen dominante en minder dominante pathways binnen de plant. Het belang van een pathway is ook afhankelijk van het ontwikkelingsstadium en het orgaan van de plant dat bestudeerd wordt. Bij suikerriet konden Calsa & Figueira (2007) aantonen dat in volgroeide suikerrietbladeren niet, zoals vooraf verondersteld werd, het NADP-ME-type maar het PEPCK-type de overhand heeft in tegenstelling tot maïs en miscanthus, die voornamelijk gebruik maken van het NADP-ME-type (Naidu et al., 2003). Eventueel vormt dit verschil een gedeeltelijke verklaring voor de lagere kiltetolerantie van suikerriet vergeleken met maïs en miscanthus. Er is actueel weinig informatie rond de kiltegevoeligheid van deze enzymen voorhanden.
15
De enzymatische basis van het fotosynthesesysteem is identiek bij maïs en miscanthus. Toch zullen beide soorten erg verschillend reageren wanneer ze blootgesteld worden aan kiltestress. De ideale temperatuur voor de teelt van maïs en miscanthus is 25°C. Wanneer de temperatuur gewijzigd wordt naar 14°C, zal bij beide soorten de fotosynthesesnelheid afnemen. Na twee dagen zal de fotosynthese bij miscanthus zich herstellen en opnieuw het oorspronkelijke niveau, dat bij 25°C gemeten werd, aannemen. Maïs zal zich niet herstellen, de fotosynthesesnelheid blijft op een lager niveau (Heaton et al., 2010). Figuur 4 geeft de CO2-opname van de bladeren weer in functie van de bladtemperatuur. Bij maïs die groeit bij 14°C, zal de fotosynthesecapaciteit nauwelijks nog door de temperatuur beïnvloed worden (Long & Spence, 2013). Bij miscanthus is het temperatuurverloop min of meer gelijk bij 25°C en 14°C.
Figuur 4 CO2-opname van de bladeren in functie van de bladtemperatuur tijdens de metingen voor vier grassoorten. M. x giganteus groeide bij 25°C of bij 14°C in groeikamers. Zea mays groeide bij 14°C (groeikamer) of bij warme veldomstandigheden. Spartina anglica, een tropisch C4-gras, en Seslaria albicans, een C3 grass uit koude streken, werden door de auteur toegevoegd ter vergelijking. Er werden echter geen extra gegevens verstrekt over de omstandigheden waarin deze twee soorten geteeld werden. (Naidu et al., 2003)
16
De oorzaak voor dit verschil moet onder andere gezocht worden bij de enzymen PPDK en Rubisco. PPDK bestaat uit 2 eenheden en interactie tussen deze onderdelen is noodzakelijk voor de werking van het enzym. Een suboptimale temperatuur zal ervoor zorgen dat de interactie bemoeilijkt wordt. Naidu et al. (2003) teelden miscanthus en maïs in groeikamers. De helft van de planten van beide soorten groeide bij 25°C/20°C, de andere helft bij 14°C/11°C. Ze stelden vast dat de hoeveelheid PPDK bij maïs de helft lager was bij 14°C/11°C dan bij 25°C/20°C Bij miscanthus waren de hoeveelheden PPDK bij beide temperatuurregimes gelijk. Het verschil in kiltegevoeligheid tussen PPDK van maïs en miscanthus kan te wijten zijn aan kleine verschillen in het gen dat voor PPDK codeert. Naidu et al. (2003) slaagden er echter niet in om door middel van DNA-sequentieanalyse te bepalen wat exact het verschil tussen beide PPDK-enzymen veroorzaakt. Ook zijn de functionele gedeelten van dit enzym sterk geconserveerd en is het dus waarschijnlijker dat beide enzymvarianten op dezelfde wijze functioneren. In dit geval moet de oorzaak voor het verschil in kiltebestendigheid van PPDK dus elders gezocht worden. Gelijkaardig aan PPDK, blijkt Rubisco in maïs gevoeliger te zijn voor koude de-activatie. Bij 14°C werd een daling van ruim 30% van de hoeveelheid Rubsico waargenomen ten opzichte van 25°C (Naidu et al., 2003). 1.2.1.4.
Energie-absorberende moleculen en radicaalvangers
Bij kiltestress zal heel wat energie die opgevangen werd door de antennecomplexen niet verder verwerkt kunnen worden in de donkerreacties. Het is belangrijk dat in dit geval moleculen voorhanden zijn die deze overtollige energie kunnen absorberen. De absorptie voorkomt dat deze energie aanleiding geeft tot de vorming van radicalen die de cel ernstig kunnen beschadigen. Een voorbeeld van zo’n absorberende molecule is zeaxanthine. Zeaxanthine is een xanthofyl. Zowel bij maïs (Ke et al., 2004) als bij miscanthus (Farage et al., 2006) is er bij kiltestress een stijging van de hoeveelheid zeaxanthine in de cellen. De hoeveelheden vallen moeilijk te vergelijken tussen beide soorten maar het is mogelijk dat het vermijden van ROS-vorming efficiënter plaatsvindt bij miscanthus. Niet alleen het vermijden van ROS-vorming is belangrijk, maar ook het verwijderen van ROS die al gevormd werden. Deze functie wordt vervuld door enzymen zoals katalase (CAT). Hoge CAT-activiteit werd in maïs vastgesteld bij planten die minder onder de gevolgen van kilte leden (Baczek-Kwinta & Koscielniak, 2009). Ook bij het afharden van Miscanthus bij 12°C, nam de CAT-activiteit in de wortelstokken gevoelig toe (Plazek et al., 2009). Als maat voor de beschadiging van fotosysteem II (PS II) in de bladeren door de ROS, kan de quantumefficiëntie van PS II bepaald worden met behulp van chlorofylfluorescentie. Hoe sterk deze efficiëntie daalt bij kilte, geeft een weerspiegeling van de beschadiging van het fotosysteem. De daling in quantumefficiëntie is ongeveer 4 maal kleiner bij miscanthus dan bij maïs (Naidu & Long, 2004), een resultaat gebaseerd op miscanthus en maïs geteeld in groeikamers. De omstandigheden waarin beide soorten geteeld werden waren identiek (de lichtintensiteit was 500 µmol m-2 s-1, 70% relatieve vochtigheid, de temperatuurregimes waren 25°C/20°C en 14°C/11°C). Miscanthus slaagt er dus beter in zijn fotosyntheseapparaat te beschermen tegen ROS.
17
1.2.1.5.
Suikerconcentratie
De suikerconcentratie in de plantencellen en het verloop hiervan doorheen de dag zijn kenmerken die typerend zijn voor de soort. Aan de hand van overeenkomsten tussen verschillende soorten is het misschien mogelijk om gelijklopende patronen te vinden in de opstapeling van suikers bij kiltestress. De sucroseconcentratie bij M. sacchariflorus (Sac-5) kent een piek rond de middag en neemt daarna geleidelijk af. Het verloop van de sucroseconcentratie doorheen de dag is vergelijkbaar met suikerriet. De piekconcentratie die gemeten werd door Purdy et al. (2013) bedroeg 40 mg g-1 droog gewicht voor M. sacchariflorus en 48 mg g-1 droog gewicht voor suikerriet (Iskandar et al., 2011). Andere miscanthus-soorten, zoals M. sinensis, vertonen veel lagere sucroseconcentraties. EMI-11 bijvoorbeeld had een sucroseconcentratie van 7 mg g-1 droog gewicht. De sucroseconcentratie had ook een continu stijgend verloop tijdens de dag (Purdy et al., 2013). Deze miscanthus-soorten met een lagere sucroseconcentratie en een stijgend verloop van de sucroseconcentratie tijdens de dag, vertonen meer overeenkomsten met maïs. Het zou interessant zijn om deze patronen ook bij kiltestress te vergelijken. Bij blootstelling aan koude zal bij miscanthus de hoeveelheid oplosbare suikers, onder andere glucose, fructose en sucrose, stijgen. Deze stijging is groter bij meer kiltetolerante dan bij minder kiltetolerante genotypen (Purdy et al., 2013). Ook bij suikerriet zijn de aanpassingen aan de suikerconcentratie groter bij de meer kiltetolerante genotypen. Du & Nose (2002) constateerden een toename in sucroseconcentratie met een factor 2,5 à 3,5 bij de kiltetolerante genotypen. De glucoseen fructoseconcentratie namen af bij kortstondige kilteblootstelling. Wanneer de kilte langer dan 52 uur werd aangehouden, stegen de hoeveelheden opnieuw tot een niveau dat boven het oorspronkelijke niveau lag. Bij het kiltegevoelige genotype werd geen toename in sucroseconcentratie waargenomen. De glucose- en fructoseconcentratie bleven verder dalen bij het voortzetten van de kiltebehandeling. 1.2.2. Vorsttolerantie 1.2.2.1.
De ondergrondse plantendelen
De vorsttolerantie van miscanthus-rizomen wordt vooral onderzocht met behulp van ionenlekkage en het bestuderen van de hergroei van rizomen die in labo-omstandigheden aan vorststress werden blootgesteld. Ionenlekkage is een methode die in 1932 voor het eerst toegepast werd bij bomen (Dexter et al., 1932). Na 1932 werd de methode verder op punt gesteld. Er werd onder meer overgegaan van een absolute naar een relatieve meting omdat dit een betere garantie bood op een goede interpretatie van de resultaten (Stuart,1939). Er zijn weinig onderzoeken waarbij vorststress van rizomen in situ gekwantificeerd werd. Een methode voor het in situ onderzoeken van vorststress is het meten van wortelrespiratie. De verandering in wortelrespiratie is een maat voor de vorstschade aan de wortels aangezien de respiratie stijgt naarmate de stress die de wortels ondervinden oploopt. Deze methode werd toegepast door Zhao et al. (2011) bij het bestuderen van vorststress in een bos met Populus euphratica. Het is misschien opportuun om voor de miscanthus-rizomen ook een goede methode te ontwikkelen die in situ aangewend kan worden.
18
De LT50 van miscanthus-rizomen bedraagt tussen -3°C en -7°C (Clifton-Brown & Lewandowski, 2000). Deze temperatuur is vergelijkbaar met de LT50 van veelvoorkomende akkerbouwgewassen. De LT50 van de wortels van tarwe is bijvoorbeeld ongeveer -5°C (Perras & Sarhan, 1989). Deze temperatuur is niet uitzonderlijk laag maar is in onze streken gewoonlijk wel voldoende door de goede isolerende werking van de bodem. Bovendien is bekend dat de LT50 daalt bij het afharden. Een aspect om niet uit het oog te verliezen is dat de vorsttolerantie van ondergrondse plantendelen geen constante is doorheen het jaar. De vorstbestendigheid van de wortels van de grove den (Pinus sylvestris) is bijvoorbeeld beduidend groter tijdens de winter- dan tijdens de zomermaanden (Sutinen et al., 1998). Bij miscanthus-rizomen werd nog niet veel aandacht besteed aan het seizoenverloop van de vorsttolerantie hoewel het seizoenverloop een belangrijke factor kan zijn bij schade door een late winterprik. Bij zoysia-grassen (Zoysia spp.) wordt bij vorststress een toename vastgesteld van de prolineconcentratie in de rizomen en de stolonen. Deze stijging is groter na acclimatisatie (Patton et al., 2007). Ook bij miscanthus speelt proline een rol als cryoprotectant maar er zijn weinig gegevens beschikbaar omtrent de grootte van de aanpassingen in proline-concentratie ten gevolge van vorststress. Daarnaast vermelden Patton et al. (2007) dat de meer vorsttolerante genotypen van de zoysia-grassen meer reducerende suikers in hun rizomen en stolonen hadden dan de minder tolerante genotypen. Daar tegenover staat dat Clifton-Brown & Lewandowski (2000) bij miscanthus vaststelden dat de rizomen van minder vorsttolerante genotypen een lagere osmotische potentiaal hadden dan de meer tolerante genotypen. Er spelen dus waarschijnlijk ook andere factoren een rol bij de vorsttolerantie van miscanthus-rizomen. 1.2.2.2.
De bovengrondse plantendelen
De LT50 van miscanthus-bladeren situeert zich rond -6°C à -9°C. De laagste waarde (-9°C) van de vier genotypen die door Farrell et al. (2006) onderzocht werden, hoorde bij een M. sinensis (Sin-H9). De LT50 van het meest geteelde miscanthus-genotype, M. x giganteus, is -8°C. Bij triticale ligt deze waarde tussen -11°C en -13°C (Nezami et al., 2010), bij wintertarwe tussen -8°C en -12°C (Clement & Van Hasselt, 1996). Na afharden ligt de LT50 bij triticale en wintertarwe nog een heel stuk lager. Bij maïs werd geen waarde voor de LT50 van de bladeren gevonden. De bladeren van miscanthus zijn dus gevoeliger voor vorststress dan de bladeren van triticale en wintertarwe.
19
2. Doelstelling Tabel 1 geeft een overzicht van de hypothesen die centraal staan in deze masterproef. Tabel 1 Hypothesen van deze masterproef
Hypothese 1
Hypothese 2 Hypothese 3
Er bestaat variatie in vorsttolerantie tussen de rizomen van miscanthus-soorten. Is ionenlekkage een goede methode om op een snelle en efficiënte manier de vorsttolerantie van miscanthus-rizomen te evalueren? Binnen het geslacht Miscanthus is er variatie in de kiltetolerantie van de bladeren. Hoe beïnvloedt kiltestress de groeicurve van de bladeren? Meer kiltetolerante genotypen hebben een hogere suikerconcentratie in de bladeren. Neemt de suikerconcentratie in de bladeren toe bij kiltestress?
De eerste hypothese is dat er variatie in vorsttolerantie bestaat tussen de rizomen van de verschillende miscanthus-soorten. Bij deze hypothese is het ook van belang om te evalueren of ionenlekkage een goede methode is om de vorsttolerantie van rizomen te bepalen. Ionenlekkage is immers een methode die nog maar zelden werd toegepast voor het vergelijken van de vorsttolerantie van miscanthus-rizomen. De tweede hypothese is dat er variatie in kiltetolerantie van de bladeren bestaat. Het is de bedoeling om deze variatie in kaart te brengen. Hiervoor werden onder andere lengtemetingen gebruikt om groeicurves op te stellen. Het bestuderen van de parameters van deze groeicurves moet voor een beter begrip van de invloed van kiltestress op de groei zorgen. De derde hypothese is dat meer kiltetolerantie genotypen een hogere suikerconcentratie in de bladeren hebben. Niet alleen de totale suikerconcentratie is belangrijk, maar ook concentratieverschillen in afzonderlijke suikers, bijvoorbeeld glucose, fructose, sucrose en raffinose. Hierbij is het van belang te bevestigen dat de suikerconcentratie in de bladeren stijgt bij kiltestress.
20
3. Materiaal en methoden M. x gig: M. x giganteus
Overzicht experimenten
M. sin.: M. sinensis M. sac.: M. sacchariflorus
DEEL PLANT
PLANTMATERIAAL
HERKOMST
BEHANDELING
STADIUM
Veldproeven ILVO
Rizomen
MENT
Exp. 1.1 Overlevings -testen Cryostatisch bad
Ionenlekkage
M. x gig., M. sin., M. sac., 12 rizomen/ soort
EXPERI-
Ionenlekkage
M. x gig., M. sin., 20 rizomen/ soort
GEMETEN PARAMETERS
Exp. 1.2 Overlevings -testen
Veredelaar
33 OPTIMISC genotypen, M. sin., M. sac., M. sin. x M. sac., 10 planten/ genotype
Lengtegroei
Exp. 2.1
Fotosynthese
Exp. 3
Lengtegroei
Exp. 2.2
Suikeranalyse
Exp. 4
Fotosynthese
Exp. 5
Chlorofylfluorescentie
Exp. 6
vierde blad
Bladeren
22 OPTIMISC genotypen, M. sin., M. sac., M. sin. x M. sac., 10 planten/ genotype
In vitro vermeerdering
Groeikamer
6 OPTIMISC genotypen, M. sac., 6 planten/ genotype
verschillende bladstadia
21
3.1. Experiment 1 3.1.1. Experiment 1.1 De vorsttolerantie van de rizomen werd getest bij twee soorten, namelijk M. x giganteus en M. sinensis Goliath. De rizomen waren afkomstig van veldproeven op het ILVO. Tot aan de start van dit experiment werden de rizomen in substraat bewaard in de koelcel (3°C). Bij aanvang van de proef werden de rizomen in kleinere stukken van ongeveer 10 cm verdeeld. De vorstomstandigheden werden gesimuleerd met een cryostatisch bad. Het cryostatisch bad (PC200A25B, Haake, Duitsland) bevatte een oplossing van 33% ethyleenglycol. Om een goede geleiding van de koude te verzekeren, maar de rizomen toch niet bloot te stellen aan de ethyleenglycol oplossing in het cryostatisch bad, werden de rizoomstukken gewikkeld in nat keukenpapier alvorens ze vacuüm in plastiek te verpakken. Nadat de rizomen in de ethyleenglycol ondergedompeld waren, werd het koelproces geactiveerd. De vorstbehandeling was gebaseerd op het protocol dat beschreven wordt door Clifton-Brown en Lewandowski (2000). Eerst werd het bad gedurende één uur snel gekoeld van kamertemperatuur tot 0°C. Vanaf 0°C daalde de temperatuur elke 20 minuten met 1°C. Wanneer 1°C boven de gewenste temperatuur bereikt was, werd deze gedurende drie uur lineair verlaagd tot aan de behandelingstemperatuur (figuur 5). Hierna werden de rizomen uit het bad verwijderd en ontdooiden ze bij kamertemperatuur. Vervolgens werden de rizomen gebruikt voor de ionenlekkage of de overlevingstesten. 25
Temperatuur (°C)
20 15 10 5 0 0 -5
50
100
150
200
250
300
Tijd (minuten)
Figuur 5 Verloop van de koelvloeistoftemperatuur bij de behandeling van -4°C
De behandelingstemperaturen waren 0°C (geen vorstbehandeling), -2°C, -4°C, -6°C en -8°C. Deze temperaturen werden gekozen op basis van Clifton-Brown en Lewandowski (2000). Zij vonden een LT50 van -3,4°C voor M. x giganteus en M. sacchariflorus en een LT50 van -6,5°C voor een M. sinensis hybride. Per soort werden voor elke behandelingstemperatuur twintig rizomen gebruikt. Ionenlekkage Tien van de twintig rizomen per behandelingstemperatuur werden gebruikt voor het meten van de ionenlekkage. 22
Uit deze rizomen werden drie stukjes van 0,5 cm bij 0,5 cm gesneden. Deze stukjes werden afgespoeld met gedeïoniseerd water (MQ water) om alle ionen die het oppervlak van de stukjes bedekten te verwijderen. Vervolgens werden de stukjes in een proefbuis gebracht samen met 7,5 ml MQ water. De proefbuizen met de stukjes werden 18 uur geschud (Orbital Shaker SSL1, Stuart, Verenigd Koninkrijk). Daarna werd de geleidbaarheid van de oplossingen in de proefbuizen gemeten (C388 Benchtop meter, Consort, België) (meting 1). Na het meten van de geleidbaarheid, werden de proefbuizen geautoclaveerd (15 minuten, 1 bar, 120°C). Door het autoclaveren werden alle cellen gedood. De ionen uit de cellen kwamen in de oplossing terecht. De proefbuizen werden opnieuw 18 uur geschud en de geleidbaarheid werd een tweede maal gemeten (meting 2). Door de verhouding van deze twee metingen te bepalen, kon de relatieve ionenlekkage ten gevolge van de vorstbehandeling berekend worden. =
ℎ ℎ
ℎ
( (
1) 2)
Aan de hand van de relatieve ionenlekkage kon de vorstbestendigheid van de rizomen ingeschat worden. De relatieve ionenlekkage wordt immers verondersteld omgekeerd evenredig te zijn met de vorstbestendigheid van het rizoom. Om eventuele correlaties tussen de relatieve ionenlekkage, de diameter van het rizoom en de massa van de geselecteerde stukjes te kunnen incalculeren, werden de diameter van de rizomen en de massa van de stukjes bepaald. De diameter van de rizomen werd gemeten voordat de rizomen in stukjes gesneden werden. Het wegen van de stukjes vond plaats na de tweede meting van de geleidbaarheid. De massa varieerde tussen 0,1 en 0,3 g. Uitplanten Ionenlekkage is actueel een methode die niet frequent gebruikt wordt voor het evalueren van de vorsttolerantie van rizomen. Om deze reden, werden de resterende tien rizomen per genotype uitgeplant in zand. De resultaten van het uitplanten diende als referentie. Overlevingstesten, waarbij de rizomen uitgeplant worden om het aantal rizomen te bepalen dat nog de capaciteit heeft om nieuwe scheuten te vormen, is immers een erkende methode voor het evalueren van vorstbestendigheid (Clifton-Brown & Lewandowski, 2000). De bakken waarin de rizomen geplant werden, werden in een groeikamer bij 20°C geplaatst. Ze werden regelmatig bevochtigd. Indien een nieuwe scheut een lengte van 5 cm bereikte (gemeten vanaf de bovenkant van het rizoom), werd geconcludeerd dat het rizoom de vorstbehandeling had overleefd. Het aantal overlevende rizomen was een maat voor de vorstbestendigheid van het genotype. 3.1.2. Experiment 1.2 Miscanthus x giganteus (Mb311-36546), M. sacchariflorus (Mb148-36044) en M. sinensis Goliath (Mb99-36177) waren de drie soorten waarbij de vorsttolerantie getest werden. De rizomen werden verkregen bij een veredelaar en werden bewaard in de koelcel bewaard bij 3°C. De behandelingstemperaturen waren 0°C (geen vorstbehandeling), -2°C, -3°C, -4°C en -5°C. Deze temperaturen werden geselecteerd omdat de verschillen in ionenlekkage in experiment 1.1 zich vooral rond -3°C à -4°C situeerden. Ook waren er bij -6°C en -8°C geen rizomen die de vorstbehandeling overleefden waardoor de testen bij deze behandelingstemperaturen weinig interessante gegevens bevatten.
23
Het protocol was analoog aan het protocol van experiment 1.1 behalve de aanpassingen die hier vermeld worden. Per soort werden twaalf rizomen gebruikt. Het aantal rizomen was lager dan bij experiment 1.1 omdat er minder rizomen beschikbaar waren. De stukjes voor het bepalen van de ionenlekkage werden gewogen tijdens het snijden. Op deze manier konden zware stukjes nog bijgesneden worden. De massa varieerde hierdoor nog slechts tussen 0,05 en 0,20 g. Een extra stap was het bepalen van het vochtgehalte van de rizomen. De bedoeling was te onderzoeken of er een relatie bestaat tussen het vochtgehalte en de vorstbestendigheid. Het vochtgehalte werd bepaald door een extra stukje (zelfde grootte en massa als stukjes voor de ionenlekkage) uit de rizomen te snijden. Ieder stukje werd 24 uur gedroogd bij 70°C. Het vochtgehalte werd berekend via het verschil in massa voor en na het drogen. Eerdere resultaten wijzen erop dat er inderdaad een verband tussen vochtgehalte en vorstbestendigheid bestaat. Meer vorsttolerante genotypen hebben volgens Farell et al. (2006) een lager vochtgehalte in de rizomen.
3.2. Experiment 2 3.2.1. Experiment 2.1 De bladontwikkeling werd opgevolgd bij 33 OPTIMISC genotypen. De planten werden bekomen via in vitro vermeerdering. Tabel 2 toont tot welke soort de genotypen behoren. Tabel 2 De 33 OPTIMISC genotypen die gebruikt werden bij experiment 2.1, onderverdeeld volgens soort
Soort M. sacchariflorus M. sinensis x M. sacchariflorus M. sinensis
Genotype OPM1, OPM4, OPM22, OPM26, OPM34 OPM5, OPM8 OPM30, OPM31, OPM36, OPM39, OPM40, OPM41, OPM48, OPM50, OPM56, OPM60, OPM66, OPM67, OPM69, OPM75, OPM76, OPM85, OPM88, OPM90, OPM91, OPM97, OPM100, OPM103, OPM104, OPM106, OPM110
De planten groeiden in de groeikamer (Maïs Automatisering NV, België) bij 20°C, 0,62 kPa dampdrukdeficit (vapor pressure deficit), een lichtintensiteit van 130 µmol m-2 s-1 en een daglengte van 16 uur. Er waren tien planten per genotype, verdeeld over vier blokken. Nieuwe scheuten werden aangeduid met een ringetje. De lengtemetingen bij een nieuwe scheut gingen van start wanneer het vierde blad zichtbaar werd. De afstand van het grondniveau tot de top van het vierde blad werd geregistreerd met een vouwmeter. De metingen vonden elke maandag-, woensdag- en vrijdagvoormiddag plaats. De metingen werden herhaald tot het vierde blad volgroeid was. Het blad werd als volgroeid beschouwd wanneer de lengte bij drie achtereenvolgende metingen gelijk was. Nadat bij alle planten de groei van het vierde blad opgemeten was, werden de planten gesnoeid met een snoeischaar tot op 10 cm lengte. De planten werden kort gesnoeid om het vormen van nieuwe scheuten te stimuleren. Vervolgens kregen de planten een week rust. Na afloop van deze week werd de temperatuur in de groeikamer verlaagd naar 14°C. De metingen bij 14°C gebeurden volgens dezelfde procedure als bij 20°C en vonden plaats op maandag- en vrijdagvoormiddag.
24
Na het verzamelen van alle data, werden de gegevens verwerkt met LEAF-E (Voorend, 2014). De werking van LEAF-E is gebaseerd op het fitten van de meetpunten aan de volgende functie: =
∗ 1+
− −
∗(
− −
)
met ≤t ≤ ≤
<
Y (mm) is de lengte van het blad, (mm) de lengte van het volgroeide blad, (°C d) is het tijdspunt waarbij het blad start te groeien, (°C d) is het tijdstip waarop de groeisnelheid van het blad maximaal is, (°C d) is het tijdstip waarop het blad stopt met groeien (figuur 6). Deze functie werd door Auzanneau et al. (2011) aangewend voor het opstellen van een groeimodel voor het derde en vierde blad van Lolium perenne. De functie is gebaseerd op twee experimenten die door Auzanneau et al. (2011) uitgevoerd werden in groeikamers. De temperatuur in de groeikamers werd niet gestuurd, tenzij de temperatuur lager werd dan 10°C. In dat geval werd er bij verwarmd. De lichtintensiteit en de daglengte worden niet vermeld. De functie bleek ook goed bruikbaar voor het modelleren van de lengtegroei van miscanthus-bladeren (Voorend, 2014).
-1
-1
Figuur 6 Het verloop van de bladlengte (mm) en de LER (mm °C d ) in functie van de tijd (°C d), opgesteld voor Lolium perennne (LED = leaf elongation duration) (Auzanneau et al., 2011)
De resultaten die met LEAF-E bekomen werden, werden gebruikt om de groeiparameters van M. sacchariflorus, M. sinensis en M. sacchariflorus x M. sinensis hybriden te vergelijken. 3.2.2. Experiment 2.2 Ook de resultaten van een voorgaand experiment waarbij de bladontwikkeling van twintig OPTIMISC genotypen werd bestudeerd bij 20°C werden verkregen. De planten werden bekomen via in vitro vermeerdering. Tabel 3 toont tot welke soort de genotypen behoren. De proefopzet was volledig analoog.
25
Tabel 3 De 20 OPTIMISC genotypen die gebruikt werden bij experiment 2.2, onderverdeeld volgens soort
Soort M. sacchariflorus M. sinensis x M. sacchariflorus M. sinensis
Genotype OPM2, OPM3, OPM4, OPM18, OPM19, OPM26, OPM28 OPM6, OPM7, OPM9, OPM20, OPM29, OPM35 OPM38, OPM42, OPM47, OPM62, OPM68, OPM76, OPM77
3.3. Experiment 3 De LICOR 6400 (LI-COR Biosciences, Lincoln, USA) (figuur 7) werd gebruikt om de maximale fotosynthesecapaciteit bij 20°C op te meten bij 33 OPTIMISC genotypen. De lengtemetingen gebeurden bij 20°C (zie experiment 2.1) terwijl de planten zich in de groeikamer bevonden. De metingen vonden gelijktijdig plaats met de groeimetingen bij 20°C. Er werden vier planten per genotype opgemeten.
Figuur 7 Het LICOR 6400 draagbaar fotosynthese systeem (links) en een fotosynthesemeting bij miscanthus met de LICOR 6400 (rechts) (De Sutter, 2013)
Het debiet van de inkomende luchtstroom werd ingesteld op 250 µmol s-1. Deze luchtstroom had een CO2-concentratie van 400 µmol mol-1. De relatieve vochtigheid was 70 %. Deze werd geregeld door de LI-610 Portable dew point generator (LICOR Biosciences, Lincoln, USA). De ingestelde dauwpunttemperatuur was 14,5°C. Deze temperatuur werd bepaald met behulp van het Mollier diagram. De lichtintensiteit was 1000 µmol m-2 s-1. Omdat veel bladeren te smal waren om de opening van de cuvette volledig te bedekken, werd ook steeds de breedte van het blad opgemeten. Met behulp van de breedte van het blad werd de oppervlakte van het stukje blad dat zich in de cuvette bevindt berekend. Deze oppervlakte kon vervolgens gebruikt worden om het meetresultaat te herrekenen.
3.4. Experiment 4 In dit experiment werden zes OPTIMISC genotypen onderzocht. Deze genotypen behoren allen tot de soort M. sacchariflorus. Tabel 4 toont extra gegevens over de herkomst van de gekozen genotypen. Deze genotypen werden gekozen omwille van de variatie in jaarlijkse daggraden boven 10°C in hun herkomstgebied. Er waren drie genotypen met een hoge waarde (OPM2, OPM18 en OPM25), één genotype met een intermediaire waarde (OPM34) en één genotype met een lage waarde (OPM4).
26
Tabel 4 Extra info over de herkomst van de genotypen (M. sacchariflorus) die gebruikt werden in experiment 4
Genotype Breedteligging
OPM2 OPM3 OPM4 OPM18 OPM25 OPM34
31 34 37 28 32 35
Hoogte Neerslag tijdens de zomer (mm) 139 1695 22 1465 -1 550 21 1129 3 845 50 1209
Gemiddelde maximale maandtemperatuur (°C) 27.6 24.8 26.3 28.5 28.1 23.7
Gemiddelde minimale maandtemperatuur (°C) 8.5 3.3 -2.3 5.7 2.9 -3.1
Jaarlijkse daggraden boven 10°C (°Cd) 1801 1798 480 1793 1712 1393
De planten werden bekomen via in vitro vermeerdering. De planten groeiden bij 28°C in twee groeikamers (Weiss Technik, Nederland) tot bij de start van het experiment. Op dat moment werd in één van de twee groeikamers de temperatuur verlaagd naar 14°C. De relatieve vochtigheid bedroeg 70 %, de lichtintensiteit was 155 µmol m-2 s-1. Er was 16 uur licht per dag. De planten werden gedurende tien dagen gevolgd. Er waren zes planten per genotype, drie in elke groeikamer. Het ontwikkelingsstadium van de planten varieerde wegens een gebrek aan planten. Deze afwijking van het optimale proefdesign werd toegestaan omdat dit experiment oriënterend bedoeld was. Het doel was aan te tonen of verder onderzoek naar het verband tussen suikeropstapeling in de bladeren en kiltetolerantie zinvol is. De bladstalen voor de suikeranalyse werden 0, 10, 34, 58, 108 en 180 uur na het begin van het experiment genomen. Het was niet mogelijk om steeds hetzelfde blad te selecteren door een gebrek aan plantmateriaal. Daarbovenop werden stalen genomen van de schijnstengels na 10 en 34 uur. Er werden bij elk tijdstip in beide groeikamers drie stalen per genotype genomen van drie verschillende planten. De stalen werden onmiddellijk in vloeibare stikstof gebracht. Later werden de stalen gevriesdroogd. De gevriesdroogde stalen werden vermalen met behulp van de Retsch Tissuelyser II (Retsch, Haan, Duitsland). 40 mg poeder van de gemalen stalen werd afgewogen en samen met 1,6 ml water in een epje van 2 ml gebracht. Vervolgens werden de stalen 15 minuten verwarmd in de oven (Mini-oven MKII, Biozym, Nederland) bij 90°C. Daarna werden de epjes gedurende 15 minuten gecentrifugeerd (20°C, 14000 rpm) (Eppendorf Centrifuge 5417R, Eppendorf, Duitsland). De volgende stap was het pipetteren van 200 µl van het extract op een Dowex-kolom. De Dowex-kolom werd gemaakt door een propje glaswol, 1 cm Dowex Ac- en 1 cm Dowex H+ achtereenvolgens in een 15 cm pasteurpipet te brengen. De kolommen werd zes maal gespoeld met water voor gebruik. Na het toevoegen van het extract werden de kolommen zes maal nagespoeld met 200 µl water. Deze methode werd aangeleerd in het Lab Moleculaire Plantenbiologie van de KULeuven (Prof. Dr. Wim Van den Ende). De stalen werden in de diepvries bewaard tot ze geanalyseerd konden worden met HPAEC-PAD. Deze analyse vond ook plaats in het Lab Moleculaire Plantenbiologie.
27
Met behulp van de chromatogrammen, die als resultaat van de analyse met de HPAEC-PAD verkregen werden, werd de concentratie glucose, fructose, sucrose en raffinose in elk staal bepaald. Eerst werden daarvoor de pieken op het chromatogram die bij deze suikers horen geïdentificeerd. Vervolgens werd de oppervlakte onder deze pieken bepaald. De grootte van deze oppervlakte was evenredig met de concentratie in het staal. Het verband tussen oppervlakte en concentratie werd bepaald met behulp van een referentiestaal. Het referentiestaal bevatte 10 µM glucose, 10 µM fructose, 10 µM sucrose en 10 µM raffinose.
3.5. Experiment 5 De maximale fotosynthese werd opgevolgd bij OPM2, OPM3, OPM4, OPM18 en OPM34 voor telkens zes planten per genotype. Van deze zes planten bevonden drie planten zich in de groeikamer bij 28°C en drie planten in de groeikamer bij 14°C. Deze planten bevonden zich in dezelfde groeikamers als de planten uit experiment 4. Beide experimenten vonden immers gelijktijdig plaats. Omdat alle beschikbare planten van OPM25 nodig waren voor het experiment, kon de maximale fotosynthese niet gemeten worden bij OPM25. Op dag 1 en dag 2 werden alle geselecteerde planten opgemeten. Op dag 8 werden enkel de planten uit de groeikamer van 14°C opgemeten. Op dag 9 volgden de planten uit de groeikamer van 28°C. Op de andere dagen kon er niet gemeten worden door een defect aan de LICOR 6400. Oorspronkelijk was het de bedoeling om de metingen gedurende de 10 dagen na de start van het experiment dagelijks uit te voeren. Het protocol, waaronder de instellingen van de LICOR 6400, was analoog aan deze in experiment 3. De LI-610 Portable dew point generator werd ingesteld op 22 °C voor de metingen bij 28°C en op 8,5 °C voor de metingen bij 14°C.
3.6. Experiment 6 De CFImager (Technologica, Verenigd Koninkrijk) werd gebruikt om op dag 10 de chlorofylfluorescentie te meten bij de planten uit experiment 5 met de bedoeling om ondanks de defecte LICOR 6400 extra data te verzamelen omtrent de invloed van kiltestress op de fotosynthese. Chlorofylfluorescentie wordt immers als een goede indicator voor de toestand van het fotosynthesesysteem beschouwd. De stalen werden steeds in tweevoud genomen zodat zowel bij 28°C als bij 14°C de chlorofylfluorescentie kon gemeten worden. Voor het genotype OPM2 uit de groeikamer bij 14°C werden bijvoorbeeld 3 stalen genomen voor analyse bij 14°C en 3 stalen voor analyse bij 28°C. Soms werden noodgedwongen minder stalen per genotype genomen wegens gebrek aan bladmateriaal. Om dezelfde reden werden ook geen stalen genomen van het genotype OPM34. De metingen met de CFImager verliepen volgens een vast proces. Eerst werden de bladeren gedurende 30 minuten aan het donker geadapteerd waarna de minimale fluorescentie werd bepaald. Vervolgens werd een saturatiepuls gegeven om de maximale fluorescentie te meten. Daarna werden verscheidene parameters bepaald bij een lichtintensiteit van 1000, 750, 500, 250 en 100 µmol m-2 s-1. Deze parameters waren de fotochemische quenching (qP), de niet-fotochemische quenching (NPQ) en de fotochemische efficiëntie van PSII (ΦPSII).
28
De volgende vergelijkingen werden gebruikt om deze parameters te bepalen − −
=
=
=
− −
∗
=
−
met F0 = minimale fluorescentieniveau, FM = maximale fluorescentieniveau, FM’ = fluorescentieniveau na het geven van een saturatiepuls, FT = terminale fluorescentieniveau, FV’ = maximale variabele chlorofylfluorescentie (Rohaçek en Bartak, 1999). ΦPSII werd gebruikt om de snelheid van het elektronentransport (electron transfer rate, ETR) te berekenen met behulp van de volgende vergelijking: =
∗ 0.84 ∗
∗ 0.5
met PAR de intensiteit van de fotosynthetisch actieve straling in µmol m-2 s-1 (Rohaçek en Bartak, 1999).
3.7. Statistische verwerking Bij de statistische verwerking van de resultaten werd gebruik gemaakt van S-PLUS versie 8.2 (Tibco Software Inc, V.S.). De t-test en ANOVA gevolgd door post hoc Tukey waren de testen die toegepast werden bij de data-analyse. Het significantieniveau was 5%.
29
4. Resultaten 4.1.Experiment 1 4.1.1. Experiment 1.1 Figuur 8 toont de ionenlekkage in functie van de toegepaste vorstbehandeling voor M. x giganteus en M. sinensis Goliath.
Relatieve ionenlekkage
0,6 0,5 0,4 0,3 0,2
M. x giganteus
0,1
M. sinensis Goliath
0,0 -8
-6
-4 Temperatuur (°C)
-2
0
Figuur 8 Verloop van de ionenlekkage in functie van de vorstbehandeling voor M. x giganteus en M. sinensis Goliath, met 2 aanduiding van de standaardfout. Lineaire regressie, M. x giganteus: y = -0,021 x + 0,314 (R = 0,83), M. sinenis Goliath: y 2 = -0,026 x + 0,312 (R = 0,98).
De statistische analyse wees uit dat er een significant effect was van de temperatuur, de diameter en de massa op de ionenlekkage. De correlatie tussen de ionenlekkage en de diameter van het rizoom was -0,21 (p = 5,0 * 10-6), de correlatie tussen de ionenlekkage en het de massa van het stukje rizoom was -0,45 (p = 9,7 * 10-6). De ionenlekkage van M. x giganteus en M. sinensis Goliath was enkel significant verschillend bij -4°C. Figuur 9 geeft het percentage overlevende rizomen bij het uitplanten in functie van de temperatuur van de vorstbehandeling bij M. x giganteus en M. sinensis Goliath. Op basis van de resultaten van het uitplanten konden geen significant effect van de soort op het overlevingspercentage vastgesteld worden (p = 0,74). Opmerkelijk was de grote sterfte bij de rizomen die geen vorstbehandeling hadden ondergaan, wat een gevolg kan zijn van de lange bewaarperiode. Bij het bepalen van de LT50 met behulp van lineaire regressie werd het overlevingspercentage bij 0°C weggelaten. De LT50 van M. x giganteus was -3,2°C (y = 0,20x+1,13, R2 = 0,92), de LT50 van M. sinensis was -2,5°C (y = 0,15x+0,87, R2 = 0,96).
30
Overlevende rizomen ( %)
100% 80% 60% 40%
M. x giganteus M. sinensis Goliath
20% 0% -6
-5
-4
-3
-2
-1
0
Temperatuur (°C) Figuur 9 Percentage overlevende rizomen bij het uitplanten in functie van de temperatuur van de vorstbehandeling bij M. x giganteus en M. sinensis Goliath.
4.1.2. Experiment 1.2 Figuur 10 toont de ionenlekkage in functie van de toegepaste vorstbehandeling voor M. x giganteus, M. sacchariflorus en M. sinensis Goliath. 0,6
Relatieve ionenlekkage
0,5 0,4 0,3 M. x giganteus
0,2
M. sacchariflorus
0,1
M. sinensis Goliath 0 -5
-4
-3 -2 Temperatuur (°C)
-1
0
Figuur 10 Verloop van de ionenlekkage in functie van de temperatuur voor M. x giganteus, M. sacchariflorus en M. 2 sinensis Goliath met aanduiding van de standaardfouten. Lineaire regressie, M. x giganteus: y = 0.006 x + 0.297 (R = 2 2 0.50) , M. sacchariflorus: y = -0.023 x + 0.267 (R = 0.82), M. sinensis Goliath: y = -0.001 x + 0.278 (R = 0.01).
De statistische analyse toonde aan dat de temperatuur en de diameter een significant effect hadden op de ionenlekkage. De massa van het stukje rizoom had geen significant effect (p = 0,83). De correlatie tussen de ionenlekkage en de diameter van het rizoom was 0,13 (p = 0,03). Bij -4°C en -5°C was de ionenlekkage van M. x giganteus significant verschillend van de ionenlekkage bij M. sacchariflorus. Er waren geen andere significante verschillen in ionenlekkage tussen de soorten.
31
Figuur 11 toont het percentage overlevende rizomen bij het uitplanten in functie van de temperatuur van de vorstbehandeling bij M. x giganteus, M. sacchariflorus en M. sinensis Goliath. Er was geen significant effect van de soort op het overlevingspercentage (p = 0,64). Net als bij experiment 1.1 was er veel sterfte onder de rizomen die geen vorstbehandeling ondergingen. Bij het bepalen van de LT50 met behulp van lineaire regressie werd het overlevingspercentage bij 0°C weggelaten. De LT50 was -3,0°C bij M. x giganteus (y = 0,5x+2, R2 = 1), -2.4°C bij M. sacchariflorus (y = 0,33x+1,28, R2 = 0,92) en -3,1°C bij M. sinensis (y = 0,25x+1,28, R2 = 0,52) .
Overlevende rizomen (%)
100% 80% 60% 40%
M. x giganteus M. sacchariflorus
20%
M. sinensis Goliath 0% -5
-4
-3
-2
-1
0
Temperatuur (°C)
Figuur 11 Percentage overlevende rizomen bij het uitplanten in functie van de temperatuur van de vorstbehandeling bij M. x giganteus, M. sacchariflorus en M. sinensis Goliath
Tabel 5 toont de gemiddelde vochtinhoud van de rizomen die gebruikt werden voor het bepalen van de ionenlekkage bij M. x giganteus, M. sacchariflorus en M. sinensis. Het effect van het genotype op het vochtgehalte was significant (p = 0,008). Wanneer de genotypen onderling vergeleken werden, verschilden enkel M. x giganteus en M. sacchariflorus significant. Tabel 5 Gemiddelde vochtinhoud (%) van de rizomen in functie van de soort, met aanduiding van de standaardfout en de significante verschillen.
Soort M. x giganteus (311) M. sacchariflorus (148) M. sinensis Goliath (99)
Vochtinhoud (%) 39.6 ± 0.03 a 49.0 ± 0.02 b 43.4 ± 0.02 ab
32
4.2.Experiment 2 4.2.1. Experiment 2.1 Bij 14°C moet opgemerkt worden dat er gemiddeld slechts drie groeicurves per genotype gemaakt konden worden. De reden is dat heel wat planten geen nieuwe scheuten hadden gevormd en dat er bij sommige planten te weinig datapunten voorhanden waren om de groeicurve op te stellen. Niet alle planten konden immers opgevolgd worden tot het vierde blad volgroeid was doordat de planten door een technisch defect aan de groeikamer blootgesteld werden aan zeer hoge temperaturen. Hierdoor moesten de metingen stopgezet worden. Figuur 12 toont de resultaten van de lengtemetingen voor de hybriden van M. sacchariflorus en M. sinensis. Bij zowel 14°C als 20°C werd voor één plant ook de groeicurve en de LER-curve weergegeven. 700
0,9 0,8
600
0,7 0,6 400
0,5
300
0,4
LER (mm (°Cd-1)
Bladlengte (mm)
500
0,3 200 0,2 100
0,1
0
0 0
200
400
600
800
1000
1200
Tijd (uur)
Figuur 12 Bladlengtemetingen bij M. sacchariflorus x M. sinensis hybriden bij 20°C en 14°C (20°C: rode ruitjes, 14°C: blauwe ruitjes). Op basis van de gemiddelde waarden van de parameters die bepaald werden voor de individuele groeicurven van de bladeren werd de gemiddelde groeicurve gereconstrueerd (20°C: rode lijn, 14°C: blauwe lijn). Op dezelfde wijze werd ook de LER-curve opgesteld (20°C: rode stippellijn, 14°C: blauwe stippellijn).
33
Volgens hetzelfde principe als bij figuur 12, worden in figuur 13 en figuur 14 de resultaten en een voorbeeld van de gefitte curves weergegeven voor M. sacchariflorus en M. sinensis. 700
0,9 0,8
600
0,7 0,6 400
0,5
300
0,4
LER (mm (°Cd-1)
Bladlengte (mm)
500
0,3 200 0,2 100
0,1
0 0
200
400
600
800
1000
1200
1400
0 1600
Tijd (uur)
Figuur 13 Bladlengtemetingen bij M. sacchariflorus bij 20°C en 14°C (20°C: rode ruitjes, 14°C: blauwe ruitjes). Op basis van de gemiddelde waarden van de parameters die bepaald werden voor de individuele groeicurven van de bladeren werd de gemiddelde groeicurve gereconstrueerd (20°C: rode lijn, 14°C: blauwe lijn). Op dezelfde wijze werd ook de LERcurve opgesteld (20°C: rode stippellijn, 14°C: blauwe stippellijn).
34
700
0,9 0,8
600
0,7 0,6 400
0,5
300
0,4
LER (mm (°Cd-1)
Bladlengte (mm)
500
0,3 200 0,2 100
0,1
0 0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
0 2000
Tijd (uur)
Figuur 14 Bladlengtemetingen bij M. sinensis bij 20°C en 14°C (20°C: rode ruitjes, 14°C: blauwe ruitjes). Op basis van de gemiddelde waarden van de parameters die bepaald werden voor de individuele groeicurven van de bladeren werd de gemiddelde groeicurve gereconstrueerd (20°C: rode lijn, 14°C: blauwe lijn). Op dezelfde wijze werd ook de LER-curve opgesteld (20°C: rode stippellijn, 14°C: blauwe stippellijn).
Tabel 6 toont per soort de gemiddelde waarde van de belangrijkste groeiparameters bij 20°C. Hieruit blijkt dat M. sinensis en de hybriden significant langere bladeren hadden dan M. sacchariflorus. De maximale groeisnelheid was significant lager bij M. sinensis dan bij M. sacchariflorus. Ook tm, te en t50% waren significant lager bij M. sinensis. Miscanthus sacchariflorus, M. sinensis en de hybriden hadden respectievelijk 642, 965 en 839 uren nodig voor het vierde blad volgroeid was. Het vierde blad van M. sinensis groeide gemiddeld 0,51 mm uur-1. Bij M. sacchariflorus groeide het vierde blad gemiddeld 0,43 mm uur-1, bij de hybriden 0,51 mm uur-1. Tabel 6 Vergelijking van de groeiparameters tussen M. sacchariflorus, M. sinensis en M. sacchariflorus x M. sinensis bij 20°C, met aanduiding van de standaardfout. Lm: lengte van het volgroeide blad, : tijdstip waarop de groeisnelheid van het blad maximaal is, : tijdstip waarop het blad stopt met groeien, t10%: tijdstip waarop het blad 10% van zijn totale lengte bereikt, t50%: tijdstip waarop het blad 50% van zijn totale lengte bereikt. De tijdstippen zijn uitgedrukt in uren.
Groeiparameter
(Gemiddelde ± SE) M. sacchariflorus
(Gemiddelde ± SE) M. sinensis
Lm (mm) LERmax (mm uur-1) tm (uur) te (uur) t10% (uur) t50% (uur)
328 ± 11 a 0.91 ± 0.05 a 346 ± 30 a 642 ± 33 a 218 ± 35 a 456 ± 35 a
414 ± 7 b 0.78 ± 0.02 b 563 ± 18 b 965 ± 21 b 304 ± 15 a 621 ± 18 b
35
(Gemiddelde ± SE) M. sacchariflorus x M. sinensis 431 ± 22 b 0.92 ± 0.06 ab 503 ± 53 ab 839 ± 51 b 324 ± 66 a 610 ± 61 ab
Tabel 7 is analoog opgesteld aan tabel 6 maar dan voor de lengtemetingen bij 14°C. Bij geen enkele van de parameters die hier beschouwd worden zijn de verschillen tussen de soorten significant. Bij 14°C was het vierde blad minder lang en was de maximale groeisnelheid lager. Het vierde blad van M. sacchariflorus, M. sinensis en de hybriden groeide respectievelijk 0,25 mm, 0,21 mm en 0,22 mm per uur. Het duurde langer voor het vierde blad volgroeid was, namelijk 1045 uur bij M. sacchariflorus, 1347 uur bij M. sinensis en 871 uur bij de hybriden. Tabel 7 Vergelijking van de groeiparameters tussen M. sacchariflorus, M. sinensis en M. sacchariflorus x M. sinensis bij 14°C, met aanduiding van de standaardfout. Lm: lengte van het volgroeide blad, : tijdstip waarop de groeisnelheid van het blad maximaal is, : tijdstip waarop het blad stopt met groeien, t10%: tijdstip waarop het blad 10% van zijn totale lengte bereikt, t50%: tijdstip waarop het blad 50% van zijn totale lengte bereikt. De tijdstippen zijn uitgedrukt in uren. Bij geen enkele parameter waren de verschillen tussen de soorten significant.
Groeiparameter
(Gemiddelde ± SE) M. sacchariflorus
(Gemiddelde ± SE) M. sinensis
Lm (mm) LERmax (mm uur-1) tm (uur) te (uur) t10% (uur) t50% (uur)
258 ± 24 0.41 ± 0.04 497 ± 118 1045 ± 106 224 ± 66 537 ± 92
287 ± 14 0.37 ± 0.02 413 ± 48 1347 ± 54 206 ± 25 585 ± 40
(Gemiddelde ± SE) M. sacchariflorus x M. sinensis 189 ± 9 0.35 ± 0.04 131 ± 69 871 ± 99 59 ± 26 468 ± 144
Tabel 8 geeft een overzicht van het verschil tussen de groeiparameters tussen beide temperaturen. Bij M. sacchariflorus was het vierde blad bij 14°C 21% korter dan bij 20°C. Bij M. sinensis was het vierde blad 31% korter, bij de hybriden 56%. De maximale groeisnelheid was 55%, 53% en 62% lager bij 14°C bij respectievelijk M. sacchariflorus, M. sinensis en de hybriden. Bij 14°C had het vierde blad bij M. sacchariflorus 63% meer tijd nodig voor het volgroeid was. Het vierde blad van M. sinensis had 40% meer tijd nodig, dat van de hybriden 4% meer tijd. Tabel 8 Absoluut verschil in groeiparameters tussen 14°C en 20°C bij M. sacchariflorus, M. sinensis en M. sacchariflorus x M. sinensis, met aanduiding van de standaardfout. Lm: lengte van het volgroeide blad, : tijdstip waarop de groeisnelheid van het blad maximaal is, : tijdstip waarop het blad stopt met groeien, t10%: tijdstip waarop het blad 10% van zijn totale lengte bereikt, t50%: tijdstip waarop het blad 50% van zijn totale lengte bereikt. De tijdstippen zijn uitgedrukt in uren. Significante verschillen werden aangeduid met een ster.
Groeiparameter
(Gemiddelde ± SE) M. sacchariflorus
(Gemiddelde ± SE) M. sinensis
Lm (mm) LERmax (mm uur-1) tm (uur) te (uur) t10% (uur) t50% (uur)
-75 ± 27 * -0.52 ± 0.11 * 143 ± 86 394 ± 87 * 3 ± 81 79 ± 87
-127 ± 15 * -0.42 ± 0.03 * -150 ± 42 * 382 ± 48 * -99 ± 30 * -36 ± 38 *
36
(Gemiddelde ± SE) M. sacchariflorus x M. sinensis -242 ± 46 * -0.57 ± 0.13 * -370 ± 114 * 31 ± 115 -267 ± 137 -140 ± 144
4.2.2. Experiment 2.2 Tabel 9 toont per soort de gemiddelde waarde van de belangrijkste groeiparameters. Hieruit blijkt dat M. sinensis en de hybriden significant langere bladeren hadden dan M. sacchariflorus. De maximale groeisnelheid was bij M. sacchariflorus en M. sinensis significant lager dan bij de hybriden. tm, te en t50% waren significant hoger bij M. sinensis. Miscanthus sinensis, M. sacchariflorus en de hybriden hadden respectievelijk 860, 1016 en 821 uren nodig voor het vierde blad volgroeid was. Het vierde blad van M. sinensis groeide gemiddeld 0,40 mm uur-1. Bij M. sacchariflorus groeide het vierde blad gemiddeld 0,39 mm uur-1, bij de hybriden 0,54 mm uur-1. Tabel 9 Vergelijking van de groeiparameters tussen M. sacchariflorus, M. sinensis en M. sacchariflorus x M. sinensis bij 20°C, met aanduiding van de standaardfout. Lm: lengte van het volgroeide blad, : tijdstip waarop de groeisnelheid van het blad maximaal is, : tijdstip waarop het blad stopt met groeien, t10%: tijdstip waarop het blad 10% van zijn totale lengte bereikt, t50%: tijdstip waarop het blad 50% van zijn totale lengte bereikt. De tijdstippen zijn uitgedrukt in uren.
Groeiparameter
(Gemiddelde ± SE) M. sacchariflorus
(Gemiddelde ± SE) M. sinensis
340 ± 11 a 0.80 ± 0.03 a 590 ± 30 a 860 ± 30 a 337 ± 29 ab 561 ± 28 a
396 ± 12 b 0.84 ± 0.04 a 732 ± 31 b 1016 ± 30 b 397 ± 26 a 681 ± 30 b
Lm (mm) LERmax (mm uur-1) tm (uur) te (uur) t10% (uur) t50% (uur)
(Gemiddelde ± SE) M. sacchariflorus x M. sinensis 444 ± 17 c 1.03 ± 0.04 b 545 ± 27 a 821 ± 28 a 278 ± 22 b 520 ± 28 a
4.3. Experiment 3 Figuur 15 toont de maximale fotosynthese in functie van het genotype. M. sinensis, M. sacchariflorus en M. sacchariflorus x M. sinensis zijn van elkaar te onderscheiden door de kleuraanduiding.
37
25
Pmax (µmol CO2 m-2 s-1)
20
15
10
5
OPM34 OPM91 OPM103 OPM26 OPM66 OPM104 OPM48 OPM100 OPM76 OPM75 OPM36 OPM67 OPM41 OPM5 OPM50 OPM22 OPM4 OPM39 OPM106 OPM30 OPM1 OPM90 OPM88 OPM69 OPM85 OPM110 OPM56 OPM8 OPM31 OPM97 OPM40 OPM60 OPM32
0
Genotype Figuur 15 Maximale fotosynthese bij 20°C in functie van het genotype met aanduiding van de standaardfout. M. sinensis: rood, M. sacchariflorus: blauw, M. sacchariflorus x M. sinensis: zwart.
38
Tabel 10 toont de gemiddelde maximale fotosynthese per soort. De maximale fotosynthese van M. sacchariflorus was significant lager dan de maximale fotosynthese van M. sinensis en de hybriden. Tabel 10 Gemiddelde maximale fotosynthese (Pmax) per soort, met aanduiding van de standaardfout en de significante verschillen.
Soort M. sacchariflorus M. sinensis M. sacchariflorus x M. sinensis
Pmax (µmol CO2 m-2 s-1) 12.5 ± 0.5 (a) 15.1 ± 0.2 (b) 15.0 ± 0.8 (b)
In tabel 11 zijn de correlaties weergegeven tussen de maximale fotosynthese en de groeiparameters die bepaald werden in experiment 2.1. De maximale fotosynthese en de groeiparameters werden immers bepaald met behulp van dezelfde planten. De correlaties tussen de maximale fotosynthese en de groeiparameters waren niet significant en hadden lage waarden. Tabel 11 Correlatie tussen maximale fotosynthese en de groeiparameters die bepaald werden in experiment 2.1.
Groeiparameter Lm tm te LERmax
Correlatie met maximale fotosynthese -0.08 -0.12 -0.13 0.09
4.4. Experiment 4 Figuur 16 toont de hoeveelheden glucose, fructose, sucrose en raffinose die per genotype aanwezig waren in de schijnstengels. De verschillen tussen de genotypen waren meestal niet significant, er waren wel enkele trends. Na 10 uur waren de hoeveelheden fructose en glucose in schijnstengels van planten die groeiden bij 14°C vergelijkbaar met deze in planten die groeiden bij 28°C. Na 34 uur was de hoeveelheid glucose en fructose bij alle genotypen hoger in de planten die groeiden bij 14°C. Het is mogelijk dat de planten tijd nodig hebben om de suikerconcentratie in de schijnstengels aan te passen en dat de stalen na 10 uur te vroeg genomen werden om veranderingen van de glucose- en fructoseconcentratie waar te nemen. Bij sucrose en raffinose waren de resultaten minder eenduidig. Bij sommige genotypen was er bijvoorbeeld na 34 uur minder raffinose aanwezig in de schijnstengels van planten die groeiden bij 28°C dan van planten die groeiden bij 14°C (OPM3, OPM34), bij andere genotypen was het omgekeerde het geval (OPM2, OPM4, OPM18). Bijlage 1 toont de hoeveelheid glucose in de bladeren bij 28°C. De standaardfouten werden niet weergegeven omwille van de overzichtelijkheid van de figuren. Indien de intervallen wel weergegeven worden overlappen ze veelvuldig. De hoeveelheid glucose was voor elk genotype erg variabel in de tijd (tot 10 mg g-1 verschil) hoewel de stalen steeds op hetzelfde moment van de dag genomen werden. Deze variabiliteit zou beter gecontroleerd worden indien er meer dan drie stalen per genotype genomen werden. Ook bij de andere suikers waren de metingen bij 28°C erg variabel.
39
Figuur 17 tot en met 20 geven de hoeveelheid glucose, fructose, sucrose en raffinose in de bladeren bij 14°C. Figuur 21 geeft een overzicht van de som van deze vier suikers. De standaardfouten werden opnieuw niet weergegeven omwille van de overzichtelijkheid van de figuren. Indien de intervallen wel weergegeven worden overlappen ze veelvuldig. Er waren dus geen significante verschillen waar te nemen tussen de genotypen maar er konden wel enkele trends bij 14°C geobserveerd worden. Deze genotypen werden gekozen op basis van hun variatie in het aantal daggraden boven 10°C per jaar in hun oorsprongsgebied. Het is echter moeilijk om op basis van deze indeling verschillen tussen de genotypen te observeren. Vanaf de start van het experiment tot 58 uur erna neemt de hoeveelheid glucose, sucrose en fructose in de bladeren toe. Daarna daalt de hoeveelheid opnieuw tot het oorspronkelijke niveau of lager. Bij raffinose is het patroon minder duidelijk. Volgens Purdy te al. (2013) vindt er geen accumulatie van sucrose plaats bij M. sacchariflorus. In een poging te testen of deze stelling ook opging voor de resultaten die hier bekomen werden, toont figuur 22 in detail de evolutie van de sucroseconcentratie per genotype. De planten van OPM3 hadden bladeren met verrassend lage hoeveelheden glucose tijdens het hele experiment. Het bekomen resultaat werd bevestigd bij de “totale” suikers omdat glucose in grotere hoeveelheden aanwezig was dan de andere drie suikers en de “totale” hoeveelheid suiker dus vooral beïnvloed werd door glucose. Deze lagere hoeveelheid suikers bij 14°C kan wijzen op een verminderde temperatuurrespons bij OPM3.
40
Glucose (mg g-1)
60 50
60
A
B
50
40
40
30
30
20
20
10
10
0
0 OPM2 OPM3 OPM4 OPM18 OPM34
Fructose (mg g-1)
40
OPM2 OPM3 OPM4 OPM18 OPM34
40
C
30
30
20
20
10
10
0
D
0 OPM2 OPM3 OPM4 OPM18 OPM34
Sucrose (mg g-1)
7
OPM2 OPM3 OPM4 OPM18 OPM34
7
E
6
F
6
5
5
4
4
3
3
2
2
1
1
0
0 OPM2 OPM3 OPM4 OPM18 OPM34
Raffinose (mg g-1)
1,8
OPM2 OPM3 OPM4 OPM18 OPM34
1,8
G
1,5
1,5
1,2
1,2
0,9
0,9
0,6
0,6
0,3
0,3
0
0
H
OPM2 OPM3 OPM4 OPM18 OPM34
OPM2 OPM3 OPM4 OPM18 OPM34 Genotype -1
Figuur 16 Suikerconcentratie in de droge stof van de schijnstengel (mg g ) in functie van het genotype, met aanduiding van de standaardfout. Rood: 28°C, blauw: 14°C. A: glucose, tijdstip = 10 uur, B: glucose, tijdstip = 34 uur, C: fructose, tijdstip = 10 uur, D: fructose, tijdstip = 34 uur, E: sucrose, tijdstip = 10 uur, F: sucrose, tijdstip = 34 uur, G: raffinose, tijdstip = 10 uur, H: raffinose, tijdstip = 34 uur.
41
50
OPM2 OPM3
45
OPM4 OPM18
40
OPM25 OPM34
Glucose (mg g-1)
35 30 25 20 15 10 5 0 0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Tijd (uur) -1
Figuur 17 Glucoseconcentratie in de droge stof van de bladeren (mg g ) in functie van de tijd bij 14°C. Rood: genotypen met minimum 1700 °Cd boven 10 °C per jaar (OPM2, OPM3, OPM18, OPM25), zwart: genotype met 1393 °Cd boven 10 °C per jaar (OPM34), blauw: genotype met 480 °Cd boven 10°C per jaar (OPM4).
42
35 OPM2 OPM3 OPM4
30
OPM18 OPM25
Fructose (mg g-1)
25
OPM34
20
15
10
5
0 0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Tijd (uur) -1
Figuur 18 Fructoseconcentratie in de droge stof van de bladeren (mg g ) in functie van de tijd bij 14°C. Rood: genotypen met minimum 1700 °Cd boven 10 °C per jaar (OPM2, OPM3, OPM18, OPM25), zwart: genotype met 1393 °Cd boven 10 °C per jaar (OPM34), blauw: genotype met 480 °Cd boven 10°C per jaar (OPM4).
43
4,5 OPM2 OPM3
4
OPM4 OPM18
3,5
OPM25 OPM34
Sucrose (mg g-1)
3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Tijd (uur) -1
Figuur 19 Sucroseconcentratie in de droge stof van de bladeren (mg g ) in functie van de tijd bij 14°C. Rood: genotypen met minimum 1700 °Cd boven 10 °C per jaar (OPM2, OPM3, OPM18, OPM25), zwart: genotype met 1393 °Cd boven 10 °C per jaar (OPM34), blauw: genotype met 480 °Cd boven 10°C per jaar (OPM4).
44
2,5 OPM2 OPM3 OPM4 2
OPM18 OPM25
Raffinose (mg g-1)
OPM34 1,5
1
0,5
0 0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Tijd (uur) -1
Figuur 20 Raffinoseconcentratie in de droge stof van de bladeren (mg g ) in functie van de tijd bij 14°C. Rood: genotypen met minimum 1700 °Cd boven 10 °C per jaar (OPM2, OPM3, OPM18, OPM25), zwart: genotype met 1393 °Cd boven 10 °C per jaar (OPM34), blauw: genotype met 480 °Cd boven 10°C per jaar (OPM4).
45
90
OPM2
Som van glucose, fructose, sucrose, raffinose (mg g-1)
OPM3 80
OPM4 OPM18
70
OPM25 OPM34
60 50 40 30 20 10 0 0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Tijd (uur) -1
Figuur 21 Concentratie van de som van glucose, fructose, sucrose en raffinose in de droge stof van de bladeren (mg g ) in functie van de tijd bij 14°C. Rood: genotypen met minimum 1700 °Cd boven 10 °C per jaar (OPM2, OPM3, OPM18, OPM25), zwart: genotype met 1393 °Cd boven 10 °C per jaar (OPM34), blauw: genotype met 480 °Cd boven 10°C per jaar (OPM4).
46
7
7
A
6 5
5
4
4
3
3
2
2
1
1
0
0 0
50
100
150
7
0
50
100
150
7
C
6
Sucrose (mg g-1)
B
6
D
6
5
5
4
4
3
3
2
2
1
1
0
0 0
50
100
150
0
7
50
100
150
7
E
6
F
6
5
5
4
4
3
3
2
2
1
1
0
0 0
50
100
150
0
50
100
150
Tijd (uren)
Figuur 22 Sucroseconcentratie in functie van de tijd, met aanduiding van de standaardfout. Blauw: 14°C, rood: 28°C. A: OPM2, B: OPM3, C: OPM4, D: OPM18, E: OPM25, F: OPM34.
47
4.5. Experiment 5 Figuur 23 toont de maximale fotosynthese in functie van de tijd. De resultaten zijn weergegeven per genotype en per temperatuur.
A
15 10
10
5
5
0
0 dag 1
Pmax (µmol CO2m-2s-1)
B
15
dag 2
dag 8
dag 9
dag 1
C
15
dag 8
10
5
5
dag 9
D
15
10
0
dag 2
0 dag 1
dag 2
dag 8
dag 9
dag 1
dag 2
dag 8
dag 9
E
15 10 5 0 dag 1
dag 2
dag 8
dag 9
Tijd (dagen) Figuur 23 Maximale fotosynthese (Pmax) in functie van de tijd. Rood: 28°C, blauw: 14°C. A: OPM2, B: OPM3, C: OPM4, D: OPM18, E: OPM34.
Opmerkelijk bij deze resultaten is dat er een grote variabiliteit was in de maximale fotosynthese bij 28°C. Er kon geen trend waargenomen worden voor de maximale fotosynthese bij 14°C.
48
Tabel 12 toont de gemiddelde maximale fotosynthese bij 14°C en 28°C. De maximale fotosynthese bij 14°C was 65% tot 80% lager dan de maximale fotosynthese bij 28°C. De maximale fotosynthese bij 14°C was voor ieder genotype significant verschillend van de maximale fotosynthese bij 28°C. Per temperatuur konden geen significante verschillen tussen de genotypen waargenomen worden. Tabel 12 (Gemiddelde maximale fotosynthese ± SE) per genotype bij 14°C en 28°C. De laatste kolom toont het relatieve verschil tussen de meetwaarden bij 28°C en de meet waarden bij 14°C.
Genotype OPM2 OPM3 OPM4 OPM18 OPM34
Maximale fotosynthese Maximale fotosynthese Relatief verschil in bij 28°C (µmol m-2 s-1) bij 14°C (µmol m-2 s-1) maximale fotosynthese (%) 11.8 ± 2.3 2.2 ± 0.4 -81% 11.4 ± 0.8 3.0 ± 0.8 -74% 10.5 ± 0.4 3.4 ± 0.4 -68% 9.4 ± 2.7 3.3 ± 0.8 -65% 7.4 ± 0.4 1.8 ± 0.7 -76%
4.6. Experiment 6 Figuur 24 toont de snelheid van het elektronentransport (ETR) in functie van de lichtintensiteit voor vier verschillende genotypen. De bespreking bestaat uit het bestuderen van trends en niet uit het evalueren van significante verschillen omdat de metingen voor dit experiment zeer beperkt waren. De standaardfouten werden niet aangegeven op de figuur om de leesbaarheid niet te verminderen. Indien deze wel weergegeven worden, overlappen deze meermaals voor de verschillende genotypen. De gemiddelde standaardfout was 5,47 µmol m-2 s-1. Wanneer de metingen bij 28°C gebeurden, lag de ETR van planten die groeiden bij 28°C steeds boven de ETR van planten die groeiden bij 14°C en dit was het geval voor alle genotypen. Wanneer de metingen bij 14°C plaatsvonden was het beeld anders. Bij OPM2 was de ETR veel hoger als de planten groeiden bij 28°C dan als ze groeiden bij 14°C. Bij OPM3 was de ETR ongeveer gelijk voor beide groeitemperaturen. Bij OPM4 lag de ETR voor planten die bij 28°C groeiden lager dan voor planten die bij 14°C groeiden, wat opmerkelijk is en misschien valt te verklaren door de herkomst van dit genotype. Het oorsprongsgebied van dit genotype ligt namelijk ongeveer 480 daggraden boven 10°C per jaar en dit is slechts een vierde van de daggraden boven 10°C per jaar bij de drie andere genotypen waarvoor in dit experiment metingen uitgevoerd werden. De lage beschikbaarheid van daggraden is geassocieerd met aanpassingen van de fotosynthese aan lagere temperaturen. Deze aanpassing aan lagere temperaturen ging ten koste van optimale fotosynthese bij hoge temperaturen. Het betreft hier slechts een hypothese, die gestaafd moet worden met extra diepgaandere experimenten. De fotochemische en niet-fotochemische quenching worden weergegeven in bijlage 2 en bijlage 3. Om optimaal verschillen in quenching tussen de genotypen te evalueren was dit experiment niet uitgebreid genoeg.
49
80
A
70
ETR (µmol m-2 s-1)
60 50 40
OPM2 - 14°C OPM2 - 28°C OPM3 - 14°C OPM3 - 28°C OPM4 - 14 °C OPM4 - 28°C OPM18 - 14°C
30 20 10 0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
Lichtintensiteit (µmol m-2 s-1)
110
B
100 90
ETR (µmol m-2 s-1)
80 70 60 50
OPM2 - 14°C OPM2 - 28°C OPM3 - 14°C OPM3 - 28°C OPM4 -14°C OPM4 - 28°C OPM18 - 14°C OPM18 - 28°C
40 30 20 10 0
100
200
300
400
500
600
Lichtintensiteit (µmol
700
800
900
1000
m-2 s-1)
Figuur 24 Electron transfer rate in functie van de lichtintensiteit voor OPM2, OPM3, OPM4 en OPM18. Blauw: planten groeien bij 14°C, rood: planten groeien bij 28°C. A: metingen bij 14°C, B: metingen bij 28°C.
50
De maximale fotochemische efficiëntie van fotosysteem II (ΦPSII, max ) in functie van het genotype en de temperatuur waarbij de planten groeiden staat in tabel 13 (metingen bij 14°C) en tabel 14 (metingen bij 28°C). Ook hier worden enkel trends besproken. Bij tabel 13 was er bij OPM2 en OPM4 een significant verschil tussen de maximale fotochemische efficiëntie van PSII bij 14°C en 28°C. Als bij 14°C de fotochemische efficiëntie van PSII van de genotypen vergeleken werd, was er een significant verschil tussen OPM 2 en de andere drie genotypen. Bij 28°C waren er geen significante verschillen tussen de genotypen. Tabel 13 Maximale fotochemische efficiëntie van PSII voor de genotypen OPM2, OPM3, OPM4 en OPM18. De planten groeiden bij 14°C of bij 28°C. De metingen gebeurden bij 14°C.
Genotype OPM 2 OPM 3 OPM 4 OPM 18
14°C 0,60 0,74 0,73 0,75
28°C 0,79 0,78 0,79
Bij tabel 14 was er enkel bij OPM2 een significant verschil tussen de maximale fotochemische efficiëntie van PSII bij 14°C en 28°C. Zowel bij 14°C als bij 28°C waren er geen significante verschillen in maximale fotochemische efficiëntie van PSII tussen de genotypen. Tabel 14 Maximale fotochemische efficiëntie van PSII voor de genotypen OPM2, OPM3, OPM4 en OPM18. De planten groeiden bij 14°C of bij 28°C. De metingen gebeurden bij 28°C.
Genotype OPM 2 OPM 3 OPM 4 OPM 18
14°C 0,60 0,68 0,71 0,76
28°C 0,78 0,78 0,77 0,78
ΦPSII, max was steeds groter wanneer de planten bij 28°C groeiden dan wanneer ze bij 14°C groeiden. Bij OPM2 was dit verschil in ΦPSII, max erg groot vergeleken met de andere genotypen. Ook bij de ETR van OPM2 (figuur 24) was het verschil tussen planten die groeiden bij 28°C en planten die groeiden bij 14°C groot. Beide feiten geven een indicatie dat OPM2 temperatuurgevoeliger is dan de andere drie genotypen.
51
5. Discussie 5.1. Experiment 1: Vorststress Naast inzicht verkrijgen in de variatie in vorsttolerantie van miscanthus-soorten, was de bedoeling van dit experiment het protocol voor het testen van ionenlekkage te optimaliseren. Er is immers een zoektocht bezig naar een snelle en efficiënte methode om de vorstbestendigheid van rizomen te testen. Aan de actueel gangbare methoden zijn immers nadelen verbonden. Bij veldwaarnemingen kunnen heel wat factoren ongewenst interageren met de waarnemingen waardoor de betrouwbaarheid van de resultaten daalt. Bij de overlevingstesten moeten grote aantallen rizomen uitgeplant worden na het toepassen van de vorstbehandeling. Daarna moet weken gewacht worden om met zekerheid alle nieuwe scheuten te kunnen observeren. Ionenlekkage biedt een oplossing om in één klap de nadelen die samengaan met de twee bestaande methoden uit de wereld te helpen. Deze methode kan immers uitgevoerd worden in gecontroleerde omstandigheden en neemt relatief weinig tijd in beslag. Helaas is het bestaande protocol niet optimaal wat een belemmering vormt voor het aanwenden van ionenlekkage bij het evalueren van vorsttolerantie. Een eerste punt dat uitgeklaard moest worden, was de temperatuur van de opgelegde vorstbehandeling. Een optimale keuze van de temperatuur is van groot belang om de verschillen tussen de soorten te kunnen observeren. De temperaturen in experiment 1.1 werden gekozen op basis van het artikel van Clifton-Brown en Lewandowski (2000). Zij vonden een LT50 van -3,4°C voor M. x giganteus en M. sacchariflorus en een LT50 van -6,5°C voor een M. sinensis-hybride. Deze LT50 werden bepaald op basis van een overlevingstest na het toepassen van een drie uur durende vorstbehandeling. Temperaturen tot -14°C werden gebruikt. Er waren geen overlevende rizomen bij temperaturen lager dan -8°C. Het temperatuurbereik werd in experiment 1.1 dus vastgelegd op 0°C tot -8°C. Omdat bij -6°C en -8°C geen van de uitgeplante rizomen nieuwe scheuten vormde werd het temperatuurbereik in experiment 1.2 vernauwd tot 0°C/-5°C. De temperaturen die de rizomen in experiment 1 konden verdragen waren minder laag dan bij Clifton-Brown en Lewandowski (2000), een verschil dat waarschijnlijk gerelateerd is aan het gebruikte plantmateriaal. Er werden immers andere genotypen gebruikt. De correlatie tussen de ionenlekkage en de massa van het geteste stukje rizoom, en tussen de ionenlekkage en de diameter van het rizoom vormen een probleem voor de interpretatie van de ionenlekkage. De correlatie met de massa van het stukje rizoom kon vermeden worden door de variatie in massa te verkleinen. De correlatie met de diameter van het rizoom kon niet vermeden worden, ook niet als de rizomen in stukjes gesneden werden vooraleer de vorstbehandeling werd toegepast. De vraag is of het een goed idee is om de correlatie met de diameter te willen vermijden en de rizomen al te versnijden voor de vorstbehandeling. Misschien zijn de morfologie en de diameter van de rizomen essentiële aspecten bij het bepalen van de vorstbestendigheid. Hoe en in welke mate deze aspecten de vorstbestendigheid beïnvloeden is niet geweten.
52
Een minpunt bij de resultaten van de overlevingstesten was dat het overlevingscijfer bij 0°C erg laag lag, vaak lager dan dat bij -2°C. Naast de lange bewaarperiode, in de koelcel, is er geen andere voor de hand liggende reden waarom de overlevingscijfers zo laag liggen wanneer er geen vorstbehandeling is toegepast. Een mogelijke reden is dat de rizomen aangetast werden door bacteriën. Deze bacteriën vroren dood wanneer er een vorstbehandeling werd toegepast. Zonder vorstbehandeling konden de bacteriën echter de rizomen aantasten. Er is geen bewijs voor deze redenering. De lage overlevingscijfers bij 0°C roepen vragen op bij het aantal rizomen dat geen nieuwe scheuten vormde bij de andere temperaturen: was de oorzaak de vorstbehandeling of de lange bewaring? Dit had opgevangen kunnen worden in experiment 1.2 door een groter aantal rizomen uit te planten maar dit was helaas niet mogelijk door een gebrek aan rizomen. Vervolgens was het niet duidelijk of de relatieve ionenlekkage een lineair verband heeft met de temperatuur of niet. In de literatuur werden geen aanduidingen gevonden voor een al dan niet lineair verband. Sommige curves in experiment 1 waren lineair, andere vertoonden een knik in de curve. Bij de curves met een knik lijkt het alsof op het moment van de knik een grens overschreden wordt. Bij deze grens neemt de relatieve ionenlekkage plots sterk toe. Daarna is de ionenlekkage opnieuw vrij constant. Het is ook mogelijk dat dit beeld veroorzaakt werd door een te beperkt aantal stalen per temperatuur. De duur van de vorstbehandeling werd in het begin van het experiment arbitrair vastgelegd op drie uur naar analogie met Clifton-Brown en Lewandowski (2000). Er moet overwogen worden of deze tijdspanne wel representatief is voor veldomstandigheden. Het is mogelijk dat er een verband bestaat tussen de resultaten van een drie uur durende vorsttest en een langere periode van vorst in veldomstandigheden. Clifton-Brown en Lewandowski (2000) geven echter geen verklaring voor hun keuze voor een drie uur durende behandeling. Plazek et al. (2009) gaven de rizomen bijvoorbeeld een vorstbehandeling die 1, 3 of 5 dagen duurde. Om een volledig representatief experiment uit te voeren, moet uitgezocht worden hoe lang een periode van vorst in België gemiddeld duurt. De gemiddelde vochtinhoud die per soort bepaald werd in experiment 1.2 biedt slechts deels een bevestiging van het principe van Clifton-Brown en Lewandowski (2000) dat minder vorsttolerante rizomen een hoger vochtgehalte hebben. Miscanthus sacchariflorus was het minst vorsttolerant en had het hoogste vochtgehalte in de rizomen, hoewel het vochtgehalte niet significant verschilde van het vochtgehalte van M. sinensis. Het vochtgehalte van M. x giganteus en M. sinensis was niet verschillend. Deze resultaten konden dus niet helpen bij het bevestigen of ontkrachten van de stelling van Clifton-Brown en Lewandowski (2000). Algemeen kan besloten worden dat deze methode zeker nog niet op punt staat om toegepast te worden bij het evalueren van vorsttolerantie. Vooral het ontbreken van een duidelijk verband tussen ionenlekkage en de temperatuur van de vorstbehandeling doet twijfelen of deze methode ooit wel geschikt zal zijn voor dit doel. De vaststelling dat in experiment 1 de soorten niet significant van elkaar te onderscheiden waren op vlak van ionenlekkage doet deze twijfel toenemen. Het uitbreiden van het aantal stalen kan hiervoor deels een uitweg bieden. Vaak zal er echter niet genoeg plantmateriaal voorhanden zijn om dit te doen. Daarnaast zal dit ervoor zorgen dat de hoeveelheid werk toeneemt waardoor de veel minder arbeidsintensieve overlevingstesten weer aan belang zullen winnen.
53
5.2. Experiment 2: Kiltestress Dit experiment had tot doel om de invloed van kiltestress op de groei van het vierde blad te bestuderen. De resultaten die bij 14°C bekomen werden zijn echter eerder beperkt. Bij veel planten kon de groeicurve immers niet opgesteld worden omdat het experiment door een technisch defect aan de groeikamer moest onderbroken worden. Deze planten hadden nog geen nieuwe scheuten gekregen of er waren slechts enkele metingen gebeurd bij het vierde blad waardoor er te weinig meetpunten waren om de groeicurve op te stellen. Er konden bij 14°C geen significante verschillen tussen M. sacchariflorus, M. sinensis en M. sacchariflorus x M. sinensis vastgesteld worden. Om betere resultaten te bekomen bij 14°C zou het experiment herhaald moeten worden wat zeker zal gebeuren aangezien dit slechts 1 experiment was in een reeks van experimenten. Experiment 2.2 was bijvoorbeeld een experiment dat al vroeger uitgevoerd was. Bij dit experiment was de temperatuur waarbij de kiltestress geobserveerd werd 12°C. Deze temperatuur werd in experiment 2.1 verhoogd naar 14°C omdat de planten bij 12°C te veel te lijden hadden onder de kiltestress en de groei van de planten heel erg traag verliep. Deze erg trage groei bij 12°C wordt bevestigd door Purdy et al. (2013). Purdy et al. (2013) stelden een daling van de LER met 97% vast bij M. sacchariforus (Sac-5) en 86% bij M. sinensis Goliath bij planten die zich 4 dagen bij 12°C bevonden. Er was wel een duidelijk verschil tussen de groeiparameters bij 20°C en deze bij 14°C. Bij 14°C waren Lm (de bladlengte van het volgroeide blad) en LERmax (de maximale groeisnelheid van het blad) lager dan bij 20°C. De LERmax was ongeveer de helft van de LERmax bij 20°C. De invloed van de kiltestress op tm (het tijdstip waarop LERmax bereikt wordt) was minder duidelijk. Soms nam tm toe, soms daalde tm. Het duurde ook langer voor het blad volgroeid was (te was hoger). De correlatie tussen deze groei in het jeugdstadium, meer specifiek het vierde blad, en de opbrengst van de volledige plant moet wel nog verder uitgezocht worden door middel van veldproeven. Clifton-Brown & Jones (1997) en Jørgensen & Muhs (2001) stellen immers dat genotypen met een lagere basistemperatuur voor bladexpansie niet gekenmerkt worden door een hogere opbrengst dan genotypen die een hogere basistemperatuur hebben maar tegelijk hogere groeisnelheden bij hogere temperaturen. Volgens deze redenering is het weinig zinvol om naar genotypen te zoeken die in het jeugdstadium hoge groeisnelheden hebben bij lage temperaturen. De resultaten die in dit experiment bekomen werden, zijn niet voldoende om deze redenering al dan niet te bevestigen. Bij 20°C waren de groeiparameters beter te onderscheiden tussen de drie soorten dan bij 14°C. Deze gegevens zijn ook interessant aangezien ze een idee geven van het opbrengstpotentieel bij optimale groeitemperaturen. De correlatie tussen deze groei in het jeugdstadium en de opbrengst van de volledige plant moet opnieuw nog nader bepaald worden. Bij experiment 2.1 waren de parameters significant verschillend voor M. sacchariflorus en M. sinensis. De parameters van de hybriden van M. sacchariflorus x M. sinensis waren significant verschillend van M. sacchariflorus of niet significant verschillend van de twee andere genotypen. t10% (het tijdstip waarbij 10% van de totale lengte bereikt wordt) was in dit experiment geen goede parameter om verschillen tussen de soorten waar te nemen. De verschillen tussen de parameters die bepaald werden in experiment 2.1 en experiment 2.2 waren soms vrij groot wat kan verklaard worden doordat bij beide experimenten andere genotypen gebruikt werden. Hieruit volgt de noodzaak enige voorzichtigheid aan de dag te leggen bij het trekken van conclusies bij het vergelijken van de drie soorten.
54
Het is de bedoeling om in de toekomt niet alleen in staat te zijn om de kiltetolerantie van de soorten te vergelijken maar dieper te gaan zodat ook onderscheid gemaakt kan worden tussen genotypen binnen een soort. De beperkte hoeveelheid data maakte het echter niet opportuun om dit te doen. Een onderscheid maken tussen alle OPTIMISC genotypen zal nog veel werk vergen. De metingen bij 20°C van experiment 2.1 waren gespreid over 1848 uur of 77 dagen. Indien de metingen bij 14°C niet stopgezet hadden moeten worden door het technisch defect aan de groeikamer hadden de metingen bij 14°C minstens even lang geduurd. Waarschijnlijk was er voor deze metingen zelfs meer tijd nodig geweest door de tragere groeisnelheid van de planten bij 14°C. Wanneer de week rust voor de planten tussen de metingen bij 20°C en 14°C wordt toegevoegd, geeft dit samen 161 dagen of ongeveer 5 en een halve maand voor één experiment. Deze experimenten zijn dus erg langdurig.
5.3. Experiment 3: Maximale fotosynthese In experiment 3 werd de maximale fotosynthese bij 20°C gemeten bij een selectie van de planten uit experiment 2. Oorspronkelijk was het opzet om deze metingen te herhalen bij 14°C om zo de maximale fotosynthese bij 20°C en 14°C te kunnen vergelijken. Door het technisch defect aan de groeikamer maakte dit onmogelijk. M. sacchariflorus (12,5 µmol CO2 m-2 s-1) had een lagere maximale fotosynthese dan M. sinensis (15,1 µmol CO2 m-2 s-1) en M. sacchariflorus x M. sinensis (15,0 µmol CO2 m-2 s-1). Purdy et al. (2013) bekwamen vergelijkbare waarden voor de maximale fotosynthese bij M. sinensis, M. sacchariflorus en M. x giganteus. Bij Purdy et al. (2013) was Pmax iets hoger dan in experiment 3, waarschijnlijk doordat de planten groeiden bij 28°C in plaats van bij 20°C. Ook de lichtintensiteit waarbij de planten groeiden, 500 µmol m-2 s-1, was hoger dan in experiment 3. Bij Naidu en Long (2004) was de maximale fotosynthese 28,2 µmol m-2 s-1 bij M. x giganteus, wat opnieuw iets hoger is dan de waarden die gemeten werden bij experiment 3. Deze metingen werden uitgevoerd bij 25°C. De lichtintensiteit was 500 µmol m-2 s-1. De correlatie tussen de resultaten uit dit experiment en de groeiparameters die bepaald werden in experiment 2 was eerder klein. Er kon dus geen sterk verband waargenomen worden tussen bijvoorbeeld de totale bladlengte of de LERmax en de maximale fotosynthese.
5.4. Experiment 4: Suikerconcentraties Een eerste zaak die opviel bij de resultaten van de suikeranalyse was dat de suikerconcentratie per genotype bij 28°C erg variabel was doorheen de tijd. Er was bijvoorbeeld tot 10 mg g-1 verschil in glucoseconcentratie. Bij een gelijkaardig experiment uitgevoerd door Purdy et al. (2013) was deze variatie een stuk lager. De verschillen in glucoseconcentratie bedroegen maximum 2 mg g-1. Hierbij moet wel opgemerkt worden dat de glucoseconcentraties veel lager lagen bij dit experiment. Purdy et al. (2013) namen zoals in experiment 4 bij elk tijdspunt 3 stalen van 3 verschillende planten. In experiment 4 moest door een tekort aan planten bij sommige tijdspunten een staal genomen worden van een plant die al bij een eerder tijdspunt bemonsterd was. Bij het experiment van Purdy et al. (2013) was dit niet nodig. Het herhaald nemen van stalen bij dezelfde plant kan een extra bron van stress gevormd hebben voor de planten waardoor de variatie in suikerconcentratie toenam.
55
Er was nog een tweede groot verschil tussen de resultaten van beide experimenten. Bij experiment 4 lagen de glucoseconcentraties in de grootteorde van 10 tot 40 mg g-1. In het experiment van Purdy et al. (2013) was de glucoseconcentratie bij M. sacchariflorus steeds lager dan 12 mg g-1. Er mag hierbij natuurlijk niet uit het oog verloren worden dat het hierbij ging om metingen bij een ander genotype (Sac-5), dat de stalen genomen werden bij 12°C en niet bij 14°C en dat de stalen over een periode van 12 uur in plaats van 180 uur genomen werden. Er was voor de meeste genotypen een duidelijk patroon waar te nemen in de glucose- en fructoseconcentratie bij 14°C. Purdy et al. (2013) namen ditzelfde patroon waar. Eerst vond er een stijging van de concentratie plaats. Deze werd gevolgd door een daling van de concentratie tot ongeveer het oorspronkelijke niveau opnieuw bereikt werd. Purdy et al. (2013) namen enkel het inzetten van deze daling in suikerconcentratie waar doordat er slechts metingen verricht werden gedurende 12 uur. Ook deed de piek in suikerconcentratie zich veel sneller voor bij Purdy et al. (2013), namelijk na 10 uur. In experiment 4 werden de pieken in de concentratie meestal vastgesteld na 58 uur. Het verschil kan verklaard worden doordat de metingen bij Purdy et al. (2013) bij 12°C gebeurden waardoor de respons van de plant sneller optrad dan bij 14°C. Vervolgens stelden Purdy et al. (2013) dat er bij M. sacchariflorus geen accumulatie van sucrose plaatsvindt bij kiltestress door een defect enzym. De resultaten uit experiment 4 wijzen op het tegendeel. Bij sucrose werd hetzelfde patroon vastgesteld als bij glucose en fructose met eerst een stijging en dan opnieuw een daling in de concentratie. De sucroseconcentratie bij zowel 14°C als 28°C (maximum rond 5 mg g-1) was wel een stuk lager dan bij Purdy et al. (2013) (gemiddeld 25 mg g-1). Het aspect kilterespons van M. sacchariflorus moet dus verder uitgezocht worden. Om een onderscheid te maken tussen de suikerconcentratie bij 14°C en bij 28°C waren 3 stalen per tijdspunt en per behandeling voldoende. Daarnaast was het bij dit experiment de bedoeling om een onderscheid te maken tussen de respons bij de verschillende genotypen. Hiervoor waren de resultaten echter niet nauwkeurig genoeg. Het was dan ook niet mogelijk om een conclusie te trekken omtrent de link tussen suikeraccumulatie en het aantal daggraden boven 10°C per jaar in het herkomstgebied van genotypen binnen de soort M. sacchariflorus. De hypothese was dat genotypen met minder daggraden boven 10°C per jaar beter aangepast zijn aan het omgaan met kiltestress en dus gekenmerkt worden door hogere suikerconcentraties wanneer ze aan kiltestress blootgesteld worden. Er kan dus op basis van experiment 4 geen conclusie getrokken omtrent deze stelling. De eerste resultaten van een meerjarige veldproef aan het ILVO toonden aan dat genotypen met minder daggraden boven 10°C per jaar geen betere kiltetolerantie hebben dan genotypen met een groter aantal daggraden. Uit de meetresultaten bleek dat de genotypen van M. sacchariflorus met ongeveer 1800 daggraden boven 10°C per jaar (OPM2, OPM18 en OPM25) in het oorsprongsgebied gekenmerkt worden door een vroegere opkomst en een snellere groei dan de genotypen met minder daggraden. OPM3 heeft ook ongeveer 1800 daggraden boven 10°C per jaar in het herkomstgebied maar vertoonde deze kenmerken niet. Deze resultaten wijzen erop dat het aantal daggraden boven 10°C per jaar waarschijnlijk geen al te beste indicator is voor kiltetolerantie.
56
5.5. Experiment 5: Maximale fotosynthese Opmerkelijk bij de resultaten van experiment 5 was dat er een grote variabiliteit was in de maximale fotosynthese bij 28°C. Normaal wordt verwacht dat, voor een bepaald genotype, de maximale fotosynthese bij 28°C vrij constant is omdat de planten bij optimale temperaturen groeien. Waarschijnlijk werd deze variabiliteit veroorzaakt doordat de fotosynthese slechts bij drie planten per genotype gemeten werd. Bij een herhaling van dit experiment zal een groter aantal planten gebruikt moeten worden. Bij een power van 80% en een significantieniveau van 5% moeten 20 planten per genotype bij 28°C opgevolgd worden om de variatie in maximale fotosynthese terug te brengen tot 1,25 µmol CO2 m-2 s-1. Samen met de planten bij 14°C geeft dit 40 planten per genotype. Bij 14°C is de variabiliteit in maximale fotosynthese ten gevolge van de kiltestress normaal groter dan bij 28°C. 20 planten per genotype zal dus niet voldoende zijn om resultaten met een voldoende hoge power te bekomen bij 14°C. Het opstarten van de LICOR 6400 en het stabiliseren van de ingestelde temperatuur en vochtigheidsgraad nemen een half uur in beslag. Na het opmeten van de maximale fotosynthese bij de helft van de planten, worden de instellingen van de LICOR 6400 aangepast aan de andere temperatuur. Hiervoor wordt opnieuw een half uur gerekend. Bij één plant de maximale fotosynthese meten duurt ongeveer tien minuten. Voor het opmeten van de maximale fotosynthese bij 40 planten zal in totaal dus bijna 8 uur nodig zijn. Indien het experiment volledig en met voldoende planten uitgevoerd wordt, is de verwachting dat de maximale fotosynthese de eerste dagen zal dalen voordat ze zich zal stabiliseren en eventueel opnieuw iets zal stijgen. De fotosynthese herstelt zich echter niet op hetzelfde niveau als voorheen, ze blijft lager dan voor de stress begon (Purdy et al., 2013). Tijdens het experiment van Purdy et al. (2013) daalde de fotosynthese met ongeveer 65% vergeleken met de fotosynthese bij 28°C. Hierbij werden wel andere genotypen getest.
5.6. Experiment 6: Chlorofylfluorescentie Wang et al. (2008) stelden een curve op voor het verloop van de CO2-assimilatie en de ΦPSII in functie van het aantal dagen nadat de temperatuur in de groeikamer verlaagd werd van 25°C naar 14°C (figuur 25). Deze curve werd opgesteld aan de hand van metingen bij M. x giganteus. De planten groeiden in groeikamers bij 14°C/12°C met 14 uur licht. De lichtintensiteit was 500 µmol m-2 s-1. Indien ervan uitgegaan wordt dat deze curven een analoog verloop hebben bij M. sacchariflorus dan vonden de metingen in experiment 6 plaats op het moment dat de fotosynthese zich gestabiliseerd had bij 14°C.
57
Figuur 25 Verandering in CO2-assimilatie en ΦPSII in functie van de tijd. Tijdstip 0 is het moment waarop de temperatuur verlaagd wordt van 25°C naar 14°C. De gemiddelde CO2-assimilatie (±SE) werd bepaald voor 5 planten en relatief uitgedrukt ten opzichte van de CO2-assimilatie gemeten op tijdstip 0. Op dat moment bedroeg de CO2-assimilatie 14.8 ± -2 -1 -2 -1 0.6 µmol m s bij maïs en 16.2 ± 0.9 µmol m s bij M. x giganteus. Bij de ΦPSII werd dezelfde procedure toegepast. De startwaarden voor ΦPSII waren 0.12 ± 0.02 bij maïs en 0.14 ± 0.03 bij M. x giganteus. (Wang et al., 2008)
Naidu en Long (2004) stelden voor M. x giganteus een curve op voor de ETR bij 25°C en bij 14°C. De waarden die door Naidu en Long (2004) gemeten werden komen in grootteorde goed overeen met de waarden die bekomen werden in experiment 6 (meting bij 28°C). Ondanks het lage aantal metingen bij experiment 6 sluiten de resultaten dus toch goed aan bij eerdere metingen zoals deze van Naidu en Long (2004). Om dit experiment te verbeteren kan het voorstel voor een verbeterd proefdesign voor experiment 5 gevolgd worden. Hierdoor zal het niet enkel mogelijk zijn om de verschillen in ETR tussen de genotypen beter te observeren maar ook om betere resultaten voor de fotochemische en nietfotochemische quenching te verkrijgen. Daarnaast vonden de metingen enkel plaats op dag 10. Deze meting was dan ook een poging om te compenseren voor het gebrek aan data over de fotosynthese ten gevolge van het defect aan de LICOR 6400. Het is interessant om dit experiment over te doen terwijl de chlorofylfluorescentie gedurende 10 dagen opgevolgd wordt.
58
6. Conclusie Hypothese 1: De eerste hypothese van deze masterproef was of er variatie bestaat in vorsttolerantie bij de rizomen van de verschillende miscanthus-soorten. Volgens de literatuur bestaat er inderdaad variatie in vorstbestendigheid tussen de rizomen (Clifton-Brown en Lewandowski, 2000). Het was echter niet mogelijk om deze hypothese te bevestigen met behulp van experiment 1. De oorzaak is waarschijnlijk de methoden die gebruikt werd om de vorsttolerantie te onderzoeken. Bij de overlevingstesten was het aantal rizomen dat getest werd te klein om significante verschillen tussen de soorten aan te tonen. Ondanks een beloftevol begin bood ook ionenlekkage geen hulp bij het onderscheiden van de soorten. Een duidelijke beperking van deze methode is dat er geen duidelijk verband kon aangetoond worden tussen de relatieve ionenlekkage en de temperatuur van de vorstbehandeling. Verschillen in ionenlekkage tussen de soorten waren zelden significant. Misschien kan dit opgevangen worden door het verhogen van het aantal stalen. Meer stalen zorgen er echter voor dat de tijd die nodig is voor het uitvoeren van de test toeneemt. Hierdoor gaat het grote voordeel van deze methode, namelijk de korte tijd die nodig is voor het uitvoeren van de test, verloren. Er blijven dan weinig argumenten om ionenlekkage boven overlevingstesten te verkiezen. Hypothese 2: In experiment 2 had kiltestress een uitgesproken invloed op de groeicurve van de bladeren. Kiltestress zorgt ervoor dat de lengte van de volgroeide bladeren en de maximale groeisnelheid van de bladeren dalen. De groeiperiode duurt ook langer. Er werd variatie in kiltetolerantie tussen M. sinensis, M. sacchariflorus en M. sinensis x M. sacchariflorus vastgesteld: hypothese 2 wordt dus bevestigd. Deze variatie kon echter nog niet significant aangetoond worden. Er moeten bijkomende experimenten uitgevoerd worden om deze verschillen tussen de soorten significant te kunnen bepalen en om beter de verschillen in kiltetolerantie tussen de genotypen binnen een soort in kaart te kunnen brengen. Hypothese 3: Kiltestress veroorzaakte veranderingen in de suikerconcentratie in de bladeren (experiment 4). De hoeveelheden glucose, fructose en sucrose namen toe als de planten blootgesteld werden aan kiltestress. Wanneer de kiltestress aangehouden werd nam de suikerconcentratie opnieuw af. Bij raffinose kon geen duidelijke invloed van de kiltestress waargenomen worden. Er was variatie in de suikerconcentratie tussen de genotypen van M. sacchariflorus. Er was ook variatie in de snelheid waarmee de veranderingen in suikerconcentratie optraden. Het antwoord op hypothese 3 is dus afhankelijk van het meettijdstip. Een ander meettijdstip ging samen met andere verhoudingen in suikerconcentratie tussen de genotypen. Desondanks kon geen verband aangetoond worden tussen de suikerconcentratie en de kiltetolerantie van de genotypen uitgedrukt onder de vorm het aantal daggraden boven 10°C per jaar. Ook bleek dat het aantal daggraden boven 10°C per jaar geen goede indicator is voor de kiltetolerantie. De conclusie is dan ook dat er wel degelijk variatie bestaat in koudetolerantie bij miscanthus.
59
7. Literatuurlijst Allen, D.J., Ort, D.R. (2001). Impacts of chilling temperatures on photosynthesis in warm-climate plants. Trends in Plant Science 6, 36-42. Baczek, R., Koscielnial, J. (2009). The mitigating role of environmental factors in seedling injury and chill-dependent depression of catalase activity in maize leaves. Biologia Plantarum 53(2), 278-284. Beale, C.V., Morison, J.I.L., Long, S.P. (1999). Water use efficiency of C4 perennial grasses in a temperate climate. Agricultural and Forest Meteorology 96, 103–115. Belintani, N.G., Guerzoni, J.T.S., Moreira, R.M.P., Vieira, L.G.E. (2012). Improving low-temperature tolerance in sugarcane by expressing the ipt gene under a cold inducible promoter. Biologia Plantarum 56(1), 71-77. Boelke, B., Beuch, S., Zacharias, S., Kahle, P., Belan, L., Amelung, D. (1998). Bewertung der Umweltwirkungen des Anbaus von Miscanthus als nachwachsenden Rohstoff. Landesforschungsanstalt für Landwirtschaft und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern, p 184. Burke, M.J., Gusta, L.V., Quamme, H.A., Weiser, C.J., Li, P.H. (1976). Freezing and injury in plants. Annual Reviews in Plant Physiology 27, 507-528. Cadoux, S., Vanderdriessche, V., Machet, J.M., Mary, B., Beaudouin, N., Lemaire, G., Gosse, G. (2008). Potential yield and main limiting factors of Miscanthus x giganteus in France. Identification of the needs for further research. In: 16th European Biomass Conference and Exhibition, Valence. Calsa, T., Figueira, A. (2007). Serial analysis of gene expression in sugarcane (Saccharum spp.) leaves revealed alternative C4 metabolism and putative antisense transcripts. Plant Molecular Biology 63, 745-762. Cgiar. Sorghum. http://www.cgiar.org/our-research/crop-factsheets/sorghum/ (14/04/2014) Christian, D.G. & Haase, E. (2001). Agronomy of Miscanthus. In Miscanthus for energy and fibre, (M.B. Jones and M. Walsh, eds.), pp 21-45. James and James, Londen. Clement, J.M., Van Hasselt, P.R. (1996). Chlorofyll fluorescence as a parameter for frost hardiness in winter wheat. A comparison with other hardiness parameters. Phyton-Annakes Rei Botanicae 36, 2941. Clifton-Brown, J.C., Lewandowski, I. (2000). Overwintering problems of newly established Miscanthus plantations can be overcome by identifying genotypes with improved rhizome cold tolerance. New Phytologist 148, 287-294. Clifton-Brown, J.C., Lewandowski, I. (2000). Water use efficiency and biomass partitioning of three different Miscanthus genotypes with limited and unlimited water supply. Annals of Botany 86, 191– 200. Clifton-Brown, J.C., Lewandowski, I., Bangerth, F., Jones, M.B. (2002). Comparative responses to water stress in stay-green, rapid- and slow senescing genotypes of the biomass crop Miscanthus. New Phytologist 154, 335-345.
60
Clifton-Brown, J.C., Stampfl, P.F., Jones, M.B. (2004). Miscanthus biomass production for energy in Europe and its potential contribution to decreasing fossil fuel carbon emissions. Global change Biology 10, 509-518. Cosentino, S.L., Patane, C., Sanzone, E., Copani, V., Foti, S. (2007). Effects of soil water content and nitrogen supply on the productivity of Miscanthus x giganteus Greef et Deu. in a Mediterranean environment. Industrial Crops and Products 25, 75-88. Davis, S.C., Parton, W.J., Dohleman, F.G., Smith, C.M., Del Grosso, S., Kent, A.D., De Lucia, E..H. (2010). Comparative biogeochemical cycles of bioenergy crops reveal nitrogen-fixation and low greenhouse gas emissions in a Miscanthus x giganteus agro-ecosystem. Ecosystems 13, 144-156. De Sutter, E. (2013). Koudetolerantie bij Miscanthus genotypen. (stageverslag) Katholieke Universiteit Leuven, België. Dexter, S.T., Tottingham, W.E., Graber, L.F. (1930). Investigations of the hardiness of plants by measurement of electrical conductivity. Plant Physiology 5, 215-223. Dohleman, F.G., Heaton, E.A., Leakey, A.D.B., Long, S.P. (2009). Does greater leaf-level photosynthesis explain the larger solar energy conversion efficiency of Miscanthus relative to switchgrass? Plant, Cell and Environment 32, 1525-1537. Dohleman, F.G., Long, S.P. (2009). More productive than maize in the Midwest: How does Miscanthus do it? Plant Physiology 150, 2104-2115. Domon, J., Baldwin, L., Acket, S., Caudeville, E., Arnoult, S., Zub, H., Gillet, F., Lejeune-Hénaut, I., Brancout-Hulmel, M., Pelloux, J., Rayon, C. (2013). Cell wall compositional modifications of Miscanthus ecotypes in response to cold acclimation. Phytochemistry 85, 51-61. Du, Y., Nose, A. (2002). Effects of chilling temperature on the activity of enzymes of sucrose synthesis and the accumulation of saccharides in leaves of three sugarcane cultivars differing in cold sensitivity. Photosynthetica 40(3), 389-395. Enerpedia. Teelttechniek. http://www.enerpedia.be/nl/energiegewassen/miscanthus/teelttechniek (14/04/2014). Eppel-Hotz, A., Jodl, S. (1997). Comparative faunistic examination in miscanthus (Miscanthus x giganteus), corn (Zea Mays) and reed (Phragmites australis) expanses. Summary of the study: Muschketat, L.F. and Otte, J. (1996) Vergleichende faunistische Untersuchung in Beständen hochwüchsiger Sü (gräser (Poaceae). Unpublished. Farage, P.K., Blowers, D., Long, S.P., Baker, N.R. (2006). Low growth temperatures modify the efficiency of light use by photosystem II for CO2 assimilation in leaves of two chilling-tolerant C4species Cyperus longus L. and Miscanthus x giganteus. Plant, Cell and Environment 29, 720-728. Farrell, A.D., Clifton-Brown, J.C., Lewandowski, I., Jones, M.B. (2006). Genotypic variation in cold tolerance influences the yield of Miscanthus. Annals of Applied Biology 149, 337-345. Felten, D., Fröba, N., Fries, J., Emmerling, C. (2013). Energy balances and greenhouse gas-mitigation potentials of bioenergy cropping systems (Miscanthus, rapeseed, and maize) based on farming conditions in Western Germany. Renewable Energy 55, 160-174.
61
FP7 Optimisc (2012). Evaluation of abiotic stress tolerance of miscanthus genotypes under controlled conditions. http://optimisc.anna-consult.de/images/stories/Newsletter /Dokumente/WP3_abiotic %20 stress%20tolerance.pdf (14/04/2014). Greef, J.M., Deuter, M., Jung C., Schondelmaier, J. (1997). Genetic diversity of European Miscanthus species revealed by AFLP fingerprinting. Genetic Resources and Crop Evolution 44, 185-195. Griffith, M., Elfman, B., Camm, E.L. (1984). Accumulation of plastoquinone A during low temperature growth of winter rye. Plant Physiology 74, 727-729. Hastings, A., Clifton-Brown, J.C., Wattenbach, M., Mitchell, C.P., Smith, P. (2009). The development of MISCANFOR, a new Miscanthus crop growth model: towards more robust yield predictions under different climatic and soil conditions. GCB Bioenergy 1(2), 154-170. Hayes, D.J.M. (2013). Mass and compositional changes, relevant to biorefining, in Miscanthus x giganteus plants over the harvest window. Bioresource Technology 142, 591-602. Heaton, E.A., Dohleman, F.G., Miguez, A.F., Juvik, J.A., Lozovaya, V., Kader, J., Delseny, M. (2010). Miscanthus: a promising biomass crop. Advances in Botanical Research, http://dx.doi.org/ 10.1016/ S0065-2296(10)56003-8. Hernandez-Marin & Martinez (2012). Carbohydrates and their free radical scavenging capability: a theorethical study. Journal of Physical Chemistry 116, 9668-9675. Howell, G.S. & Weiser, C.J. (1970). Fluctuations in the cold resistance of apple twigs during spring dehardening. Journal of the American Society for Horticultural Science 95, 190-192. Hutchison, R.S., Groom, Q., Ort, D.R. (2000). Differential effects of chilling-induced photooxidation on the redox regulation of photosynthetic enzymes. Biochemistry 39, 6679-6688. Iskandar, H.M., Casu, R.E., Fletcher, A.T., Schmidt, S., Xu, J.S., Maclean, D.J., Manners, J.M., Bonnett, G.D. (2011). Identification of drought-response genes and a study of their expression during sucrose accumulation and water deficit in sugarcane culms. BMC Plant Biology 11, 10.1186/1471-2229-11-12. Jones, M.B., Walsh, M. (2001). Miscanthus for energy and fibre. James and James Ltd., Londen, 192 p. Jørgensen, U. (2011). Benefits versus risks of growing biofuel crops: the case of Miscanthus. Current Opinion in Environmental Sustainability 3; 24-30. Jørgensen, U., Sander, B. (1997). Biomass requirements for power production: how to optimise the quality by agricultural management. Biomass and Bioenergy 12, 145-147. Kalberer, S.R., Wisniewski, M., Arora, R. (2006). Deacclimation and reacclimation of cold-hardy plants: Current understanding and emerging concepts. Plant Science 171, 3-16. Ke, D., Sun, G., Jiang, Y. (2004). Dual role of superoxide radicals in the chilling-induced photoinhibition in maize seedlings. Photosynthetica 42(1), 147-152. Keunen, E., Peshev, D., Vangronsveld, J., Van de Ende, W., Cuypers, A. (2013). Plant sugars are crucial players in oxidative challenge during abiotic stress: extending the traditional concept. Plant, Cell and Environment 36, 1242-1255. KMI, Karakteristieken van enkele klimatologische parameters. http://www.meteo.be/meteo/view/ nl/360361-Parameters.html (14/04/2014). 62
Le Ngoc Huyen, T., Rémond, C., Dheilly, R., Chabbert, B.(2010).Effect of harvesting date on the composition and saccharification of Miscanthus x giganteus. Bioresource Technology 101, 82248231. Leipner, J., Jompuk, C., Camp, K., Stamp, P., Fracheboud, Y. (2008). QTL studies reveal little relevance of chilling-related seedling traits for yield in maize. Theoretical and Applied Genetics 116, 555-562. Lewandowski, I., Clifton-Brown, J.C., Scurlock, J.M.O., Huisman, W. (2000). Miscanthus: European experience with a novel energy crop. Biomass and Bioenergy 19, 209-227. Lewandowski, I., Kicherer, A. (1997). Combustion quality of biomass: practical relevance and experiments to modify the biomass quality of Miscanthus x giganteus. European Journal of Agronomy 6, 163-177. Lewandowski, I., Kicherer, A., Vonier, P. (1995). CO2-balance for the cultivation and combustion of Miscanthus. Biomass and Bioenergy 8, 81–90. Lewandowski, I., Scurlock, J.M.O., Lindvall, E., Christou, M. (2003). The development and current status of perennial grasses as energy crops in the US and Europe. Biomass and Bioenergy 25, 335361. Long, S.P., Spence, A.K. (2013). Toward cool C4 crops. Annual Review of Plant Biology 64, 701-722. Long, S.P., Zhu, X., Naidu, S.L., Ort, D.R. (2006). Can improvement in photosynthesis increase crop yields? Plant, Cell and Environment 29, 315-330. Mann, J.J., Barney, J.N., Kyser, G.B., Ditomaso, J.M. (2013). Miscanthus x giganteus and Arundo donax shoot and rhizome tolerance of extreme moisture stress. GCB Bioenergy 5, 693-700. Matteucci, M., D’Angeli, S., Errico, S., Lamanna, R., Perrotta, G., Altamura, M.M. (2011). Cold affects the transcription of fatty acid desaturases and oil quality in the fruit of Olea europaea L. genotypes with different cold hardiness. Journal of Experimental Botany 62, 3403-3420. Maulana, F., Tesso, T.T. (2013). Cold temperature episode at seedling and flowering stages reduces growth and yield components in sorghum. Crop Science 53, 564-574. McWilliam, J.R., Kramer, J.R., Musser, R.L. (1982). Temperature-induced water stress in chillingsensitive plants. Australian Journal of Plant Physiology 9, 343-352. Meehan, P.G., Finnan, J.M., McDonnell, K.P. (2013). The effect of harvest date and harvest method on the combustion characteristics of Miscanthus x giganteus. GCB Bioenergy 5, 487-496. Murphy, F., Devlin, G., McDonnell, K. (2013). Miscanthus production and processing in Ireland: An analysis of energy requirements and environmental impacts. Renewable and Sustainable Energy Reviews 23, 412-420. Naidu, S.L., Long, S.P. (2004). Potential mechanisms of low-temperature tolerance of C4 photosynthesis in Miscanthus x giganteus: an in vivo analysis. Planta 220, 145-155. Naidu, S.L., Moose, S.P., Al-Shoaibi, A.K., Raines, C.A., Long, S.P. (2003). Cold tolerance of C4 photosynthesis in Miscanthus × giganteus: adaptation in amounts and sequence of C4 photosynthetic enzymes. Plant Physiology 132, 1688–1697.
63
Naidu, S.L., Moose, S.P., Al-Shoaibi, A.K., Raines, C.A., Long, S.P. (2003). Cold tolerance of C4 photosynthesis in Miscanthus x giganteus: Adaptation in amounts and sequence of C4 photosynthetic enzymes. Plant Physiology 132, 1688-1697. Nezami, A., Soleiman, M.R., Ziaee, M., Ghodsi, M., Bannayan Aval, M. (2010). Evaluation of freezing tolerance of hexaploid triticale genotypes under controlled conditions. Notulae Scientia Biologicae 2(2), 114-120. Nishizawa, A., Yabuta, Y., Shigeoka, S. (2008). Galactinol and raffinose constitute a novel function to protect plants from oxidative damage. Plant Physiology 147, 1251-1263. Patton, A.J., Cunningham, S.M., Volenec, J.J., Reicher, Z.J. (2007). Differences in freeze tolerance of Zoysiagrasses: II. Carbohydrate and proline accumulation. Crop Science 47, 2170-2181. Perras, M., Sarhan, F. (1989). Synthesis of freezing tolerance proteins in leaves, crown, and roots during cold acclimation of wheat. Plant Physiology 89, 577-585. Peshev, D., Vergauwen, R., Moglia, A., Hideg, E., Van den Ende, W. (2013). Towards understanding vacuolar antioxidant mechanisms: A role for fructans? Journal of Experimental Botany.64(4), 10251038. Plazek, A., Dubert, F., Janowiak, F., Krepski, T., Tatrzanska, M. (2011). Plant age and in vitro or in vivo propagation considerably affect cold tolerance of Miscantheus x giganteus. European Journal of Agronomy 34, 163,171. Plazek, A., Dubert, F., Koscielniak, J., Tatrzanska, M., Maciejewski, M., Gondek, K., Zurek, G. (2014). Tolerance of Miscanthus x giganteus to salinity depends on initial weight of rhizomes as well as high accumulation of potassium and proline in leaves. Industrial Crops and Products 52, 278, 285. Plazek, A., Dubert, F., Marzec, K. (2009). Cell membrane permeability and antioxidant activities in the rootstocks of Miscanthus x giganteus as an effect of cold and frost treatment. Journal of Applied Botany and Food Quality 82, 158-162. Purdy, S.J., Maddison, A.L., Jones, L.E., Webster, R.J., Andralojc, J., Donnison, I., Clifton-Brown, J.C. (2013). Characterization of chilling-shock responses in four genotypes of Miscanthus reveals the superior tolerance of M. × giganteus compared with M. sinensis and M. sacchariflorus . Annals of Botany 111, 999–1013. Purdy, S.J., Maddison, A.L., Jones, L.E., Webster, R.J., Andralojc, J., Donnison, I., Clifton-Brown, J. (2013). Characterization of chilling-shock responses in four genotypes of Miscanthus reveals the superior tolerance of M. x giganteus compared with M. sinensis and M. sacchariflorus. Annals of Botany 111(5), 999-1013. Rinaldelli, E., Mancuso, S. (1994). Cell transmembrane electropotential in adventitious of Olea europaea L. cv Frantoio as related to temperature, respiration, external potassium, anoxia and 2.4dinitrophenol treatments. Advances in Horticultural Science 8, 299-234. Robson, P.R.H., Farrar, K., Gay, A.P., Jensen, E.F., Clifton-Brown, J.C., Donnison, I.S. (2013). Variation in canopy duration in the perennial biofuel crop Miscanthus reveals complex associations with yield. Journal of Experimental Botany 64(8), 2373-2383. Ruelland E, Vaultier MN, Zachowski A, Hurry V. (2009). Cold signalling and cold acclimation in plants. Advances in Botanical Research 49, 35–150. 64
Ruelland, E., Zachowski, A. (2010). How plants sense temperature. Environmental and Experimental Botany 69, 225-232. Rohaçek, K., Bartak, M. (1999). Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters, and some applications. Photosynthetica 37, 339-363. Scurlock, J. M. O. (1999). Miscanthus: a review of European experience with a novel energy crop. ORNL/TM-13732. Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, Tennessee. 26 pp. Stewart, J. R., Toma, Y., Fernandez, F. G., Nishiwaki, A., Yamada, T., Bollero, G. (2009). The ecology and agronomy of Miscanthus sinensis, a species important to bioenergy crop development, in its native range in Japan: a review. GCB Bioenergy 1,126–153. Stuart, N.W. (1939). Comparative cold hardiness of scion roots from fifty apple varieties. Proceedings of the American Society for Horticultural Science 37, 330-334. Sutinen, M., Ritari, A., Holappa, T., Kujala, K. (1998). Seasonal changes in soil temperature and in the frost hardiness of Scots pine (Pinus sylvestris) roots under subartic conditions. Canadian Journal of Forest Research 28, 946-950. Theocharis, A., Clément, C., Barka, E.A. (2012). Physiological and molecular changes in plants grown at low temperatures. Planta 235, 1091-1105. Thomas, A., Bond, A., Hiscock, K. (2013). A GIS based assessment of bioenergy potential in England within existing energy systems. Biomass and Bioenergy 55, 107-121. Tits, M., Van Overtveld, K., Van De Vreken, P., Vandervelpen, D., Peeters, L., Batelaan, O., Van Orshoven, J., Vanderborght, J., Elsen, A., Bries, J., Vandendriessche, H., Kuhr, P., Wendland, F., Diels, J.(2010). Bepalen van procesfactoren voor oppervlaktewater en grondwater ter evaluatie van de nitraatstikstofresidu-norm. Eindrapport fase 1, studie uitgevoerd in opdracht van de Vlaamse Landmaatschappij door het Departement Aard- en Omgevingswetenschappen (K.U. Leuven), de Bodemkundige Dienst van België en het Agrosphere Institute, Forschungszentrum Jülich. 157 pp. Uemara, M., Tominaga, Y., Nakagawara, C., Shigematsu, S.,Minami, A., Kawamura, Y. (2006). Responses of the plasma membrane to low temperatures. Physiologia Plantarum 126, 81-89. Uemura, M., Steponkus, P.L. (1999). Cold acclimation in plants: relationship between the lipid composition and the cryostability of the plasma membrane. Journal of Plant Research 112, 245-254. Van Loocke, A., Twine, T.E., Zeri, M., Bernacchi, C.J. (2012). A regional comparison of water use efficiency for miscanthus, switchgrass and maize. Agricultural and Forest Meteorology 164, 82-95. Vonwulisch, G., Deuter, M., Muhs, H.J. (1994). Identification of Miscanthus varieties by their isozymes. Journal of Agronomy and Crop Science 172, 247-254. Voorend, W. (2014). Enhancement of biomass production and accessibility of the cell wall for fermentation, in Brachypodium distachyon as a model and Zea mays as a crop. (doctoraatsthesis) Universiteit Gent, België. Wang, D., Portis, A.R., Moose, S.P., Long, S.P. (2008). Cool C4 photosynthesis: pyruvate Pi dikinase expression and activity corresponds to the exceptional col tolerance of carbon assimilation in Miscanthus x giganteus. Plant Physiology 148, 557-567.
65
Ye, B., Saito, A., Minamisawa, K. (2005). Effect of inoculation with anaerobic nitrogen-fixing consortium on salt tolerance of Miscanthus sinensis. Soil Science and Plant Nutrition 51(2), 243-249. Zhao, Z., Zhao, C., Mu, Y., Yu, S., Li, J. (2011). Contributions of root respiration to total soil respiration before and after frost in Populus euphratica forests. Journal of Plant Nutrition and Soil Science 174, 884-890. Zub, H.W. & Brancourt-Hulmel, M. (2010). Agronomic and physiological performances of different species of Miscanthus, a major energy crop. A review. Agronomy for Sustainable Development 30:2, 201-214. Zub, H.W., Arnoult, S., Younous, J., Lejeune-Hénaut, I., Brancourt-Hulmel, M. (2012). The frost tolerance of Miscanthus at the juvenile stage: Differences between clones are influenced by leafstage and acclimation. European Journal of Agronomy 36, 32-40. Zub, H.W., Rambaud, C., Béthencourt, L. (2012). Late emergence and rapid growth maximize the plant development of Miscanthus clones. Bioenergy Research 5, 841-854. Zwart, S.J., Bastiaanssen, W.G.M. (2004). Review of measured crop water productivity values for irrigated wheat, rice, cotton, and maize. Agricultural Water Management 69, 115–133.
66
50 OPM2 OPM3 OPM4 40
OPM18 OPM25
Glucose (mg g-1)
OPM34 30
20
10
0 0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Tijd (uur)
Bijlage 1 Glucoseconcentratie in de droge stof van de bladeren (mg g-1) in functie van de tijd bij 28°C. Rood: genotypen met minimum 1700 °Cd boven 10 °C per jaar (OPM2, OPM3, OPM18, OPM25), zwart: genotype met 1393 °Cd boven 10 °C per jaar (OPM34), blauw: genotype met 480 °Cd boven 10°C per jaar (OPM4).
67
0,9
A
OPM2 - 14°C OPM2 - 28°C
0,8
OPM3 - 14°C OPM3 - 28°C
0,7
qP (-)
OPM4 - 14°C 0,6
OPM4 - 28°C OPM18 - 14°C
0,5 0,4 0,3 0,2 0
200
400
600
800
1000
Lichtintensiteit (µmol m-2 s-1)
0,9
OPM2 - 14°C
B
OPM2 - 28°C 0,8
OPM3 - 14°C OPM3 -28°C OPM4 - 14°C
0,7 qP (-)
OPM4 -28°C OPM18 - 14°C
0,6
OPM18 - 28°C 0,5
0,4
0,3 0
200
400
600
Lichtintensiteit (µmol
800
1000
m-2 s-1)
Bijlage 2 Fotochemische quenching in functie van de lichtintensiteit voor OPM2, OPM3, OPM4 en OPM18. Blauw: planten groeien bij 14°C, rood: planten groeien bij 28°C. A: metingen bij 14°C, B: metingen bij 28°C.
68
A
2300 2100
NPQ (-)
1900 1700 OPM2 - 14°C OPM2 - 28°C OPM3 - 14°C OPM3 - 28°C OPM4- 14°C OPM4 - 28°C OPM18 - 14°C
1500 1300 1100 900 0
200
400
600
800
1000
Lichtintensiteit (µmol m-2 s-1)
2900
B
2700 2500 2300
NPQ (-)
2100 1900 1700
OPM2 - 14°C OPM2 - 28°C OPM3 - 14°C OPM3 - 28°C OPM4 - 14°C OPM4 - 28°C OPM18 - 14°C OPM18 - 28°C
1500 1300 1100 900 700 0
200
400
600
Lichtintensiteit (µmol
800
1000
m-2 s-1)
Bijlage 3 Niet-fotochemische quenching in functie van de lichtintensiteit voor OPM2, OPM3, OPM4 en OPM18. Blauw: planten groeien bij 14°C, rood: planten groeien bij 28°C. A: metingen bij 14°C, B: metingen bij 28°C.
69
