Seminar Nasional Sains & Teknologi V Lembaga Penelitian Universitas Lampung 19-20 November 2013 EVALUASI KADAR FENOLIK DAN AKTIVITAS ANTIRADIKAL FRAKSI FENOLIK MADU DANAU SENTARUM Abdi Redha dan Iwan Rusiardy Program Studi Teknologi Pengolahan Hasil Perkebunan Politeknik Negeri Pontianak Jl. Akhmad Yani Pontianak 78124 Surel :
[email protected]
ABSTRACT Multifloral honey which harvested by people around Sentarum Lake National Park (SLNP), West Kalimantan, constitutes organic forest honey. The objectives of study were to evaluate total phenolic content and DPPH (2,2-diphenil-1-picrilhydrazil) antiradical activity of varying SLNP honey fraction. The honey fractionation used Seppak C18. The study showed methanolic fraction having the highest total phenolic content and DPPH antiradical activity, those were 36.43 mg GAE/g and 31.91 mg/mL respestively. Moreover, this text is the first publication which reports antioxidative activity of Sentarum lake honey. Keywords: antioxidant, DPPH, honey, phenolic, Sentarum lake
PENDAHULUAN Madu dan produk olahannya digunakan sebagai pangan fungsional karena potensi antioksidan alaminya yang tinggi (Viuda-Martos et al., 2008). Berbeda dengan gula, madu mengandung banyak komponen minor yang memiliki aktivitas antioksidan (Gheldof et al., 2002), diantaranya asam amino dan protein, karoten, senyawa fenolik/flavonoid, asam askorbat, asam-asam organik, dan produk reaksi Maillard (AlMamary et al., 2002; Schramm et al., 2003; Aljadi dan Kamaruddin, 2004). Menurut Aljadi dan Kamaruddin (2004), kapasitas antioksidan madu terutama disebabkan oleh senyawa fenolik dan flavonoid yang terkandung didalamnya dan terdapat derajat korelasi yang tinggi antara senyawa-senyawa ini dengan kapasitas antioksidan madu, walaupun mekanisme sinergi diantara senyawa-senyawa tersebut belum begitu dipahami (Johnston et al., 2005; Kucuk et al., 2007). Madu mengandung senyawa fenolik yang sebagian besar terdiri dari quercetin, kaempherol, galangin, fisetin, pinocembrin, naringin, hesperidin, apigenin, acacetin, chrysin, dan luteolin (Cushnie dan Lamb, 2005; Fiorani et al., 2006). Berdasarkan penelitiannya terhadap 2
1173
Seminar Nasional Sains & Teknologi V Lembaga Penelitian Universitas Lampung 19-20 November 2013 jenis madu di Malaysia, Aljadi dan Kamaruddin (2004) melaporkan kadar total fenolik untuk madu Gelam dan Kelapa berturut-turut adalah 0,0214 dan 0,015,6 mg/g madu. Ekstraksi cair-cair dilakukan dengan menggunakan etil asetat. Hasil pengujian kadar fenolik total dan antiradikal DPPH dari madu Tualang menunjukkan nilai lebih besar dari jenis madu lainnya di Malaysia yaitu berturut 839,6 mg GAE/g dan IC50 5,80 mg/mL (Kishore et al., 2011). Beberapa peneliti lainnya (Cowan, 1999; Chen et al., 2000; Al-Mamary et al., 2002) melaporkan bahwa komposisi madu dan kapasitas antioksidannya tergantung pada beberapa faktor seperti sumber nektar bunga, musim serta faktor lingkungan antara lain jenis tanah dan iklim, faktor genetik, dan metode pengolahan. Banyak penelitian telah menunjukkan bahwa madu memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi, namun sebelumnya tidak ada satu studipun yang melaporkan mengenai aktivitas antioksidan madu yang berasal dari Taman Nasional Danau Sentarum, khususnya mengenai kadar fenolik dan aktivitas antiradikalnya. Madu yang berasal dari Taman Nasional Danau Sentarum merupakan produk madu hutan pertama di Indonesia yang mendapatkan sertifikasi organik dari BioCert (Prawoto, 2007). Produk madu organik ini telah secara turun temurun digunakan oleh masyarakat Kalimantan Barat baik dalam bentuk murni untuk pengobatan maupun diformulasikan dalam bentuk pangan olahan sebagai komsumsi. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi (1) kadar fenolik dari berbagai fraksi madu dengan menggunakan reagen Folin-Ciocalteao dan (2) aktivitas antiradikal fraksi fenolik madu terhadap DPPH (2,2difenil-1-pikrilhidrazil).
METODE Preparasi Sampel Madu Madu diperoleh dari Lanjak yaitu kota di sekitar Danau Sentarum Kabupaten Kapuas Hulu Kalimantan Barat. Madu yang baru dipanen segera dimasukkan dalam botol dan diangkut langsung ke Pontianak dengan menggunakan angkutan udara dari Putus Sibau (ibukota Kapuas Hulu). Setelah sampai di Pontianak, kemudian madu segera disimpan dalam inkubator bersuhu 4 ºC.
1174
Seminar Nasional Sains & Teknologi V Lembaga Penelitian Universitas Lampung 19-20 November 2013 Reagen dan Larutan Standar Reagen dan larutan standar yang digunakan dalam penelitian ini adalah DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil), reagen Folin-Ciocalteau, buffer posfat pH 7, metanol, etil asetat, kalium klorida, kloroform, amilum, natrium tiosulfat, feri klorida, heksan, silika gel, asam klorida, asam galat, natrium karbonat, air deionisasi, dan kertas saring Whatman No. 41.
Ekstraksi dan Fraksinasi Madu dimaserasi pada suhu kamar selama 24 jam dengan metanol. Ekstrak disaring dan filtratnya dikumpulkan, dimaserasi kembali dengan cara menambahkan metanol yang baru (sampai jernih). Seluruh filtrat dikumpulkan dan dipekatkan dengan evaporator. Ekstrak metanol kemudian difraksinasi menggunakan Sep-Pak C18 dengan pelarut n-heksan, etil asetat, metanol dan metanol-air (60:40, 70:30, 80:20, 90:10 vol/vol) sebagai eluen. Hasil fraksinasi selanjutnya dipekatkan dengan evaporator vakum.
Kadar Fenolik Kadar fenolik berbagai fraksi madu dianalisis menggunakan metode yang dilakukan oleh Hossain dan Rahman (2011). Sampel diambil sebanyak 0,1 g dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang sudah berisi 0,5 mL akuades. Setelah itu ditambahkan 0,51 mL reagen Folin- Ciocalteou. Kemudian setelah 3 menit ditambahkan 2 mL natrium karbonat 2 % dan dibiarkan 30 menit. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 750 nm. Konsentrasi sampel ditentukan berdasarkan kurva larutan standar asam galat.
Aktivitas Antiradikal DPPH Aktivitas antiradikal DPPH dianalisis menggunakan metode yang dilakukan oleh Hossain dan Rahman (2011). Sampel dilarutkan dalam metanol dan dibuat dalam berbagai konsentrasi. Masing-masing sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 500 µL larutan DPPH 1 mM dalam metanol. Volume dicukupkan sampai 5,0 mL, kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit. Selanjutnya absorbansi
1175
Seminar Nasional Sains & Teknologi V Lembaga Penelitian Universitas Lampung 19-20 November 2013 diukur pada panjang gelombang 515 nm. Nilai IC50 dihitung masing-masing dengan menggunakan rumus persamaan regresi, sedangkan nilai aktivitas antiradikal DPPH dihitung dengan rumus berikut : Aktivitas Antiradikal DPPH (%) =
Analisis Statistik Pengujian menggunakan 3 (tiga) ulangan dan hasilnya disajikan dalam bentuk rerata dan deviasi standar. Perbedaan secara statitistik dinyatakan dengan huruf yang mengikuti hasil rerata pengujian dan didapatkan dari analisis varian (anava) satu arah kemudian dilanjutkan dengan uji beda nyata jujur Tukey pada taraf α = 0,05.
HASIL DAN PEMBAHASAN Kadar Fenolik Total Madu dan Fraksinya Kadar fenolik total bahan madu dan fraksinya disajikan pada Tabel 1. Kadar fenolik total madu dan fraksinya bervariasi berdasarkan jenis eluen yang digunakan pada proses fraksinasi. Kadar fenolik total tertinggi terdapat pada fraksi metanol:air (60:40) dan fraksi metanol yaitu berturut-turut sebesar 37,50 dan 36,43 mg GAE/g. Kadar fenolik kedua fraksi ini berbeda nyata dengan kadar fenolik bahan madu dan ekstrak metanolnya (Tabel 1). Sebaliknya, fraksi n-heksana merupakan fraksi madu yang memiliki kadar fenolik total paling kecil. Tabel 1. Kadar Fenolik Total Fraksi Madu Danau Sentarum
No. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
Sampel Madu Ekstrak Metanol Fraksi Metanol Fraksi Metanol:Air (60:40) Fraksi Metanol:Air (70:30) Fraksi Metanol:Air (80:20) Fraksi Metanol:Air (90:10) Fraksi Etil Asetat Fraksi n-Heksana
*GAE : Gallic Acid Equivalent
1176
Kadar Fenolik Total (mg GAE*/g) 22.98 ± 1,40 bcd 20,88 ± 0,54 cd 36,43 ± 11,7 ab 37,50 ± 4,11 a 19,66 ± 3,26 cd 12,81 ± 0,65 d 14,71 ± 0,73 cd 26,76 ± 4,89 abc 13,98 ± 3,84 cd
Seminar Nasional Sains & Teknologi V Lembaga Penelitian Universitas Lampung 19-20 November 2013 Berdasarkan Tabel 1, tampak bahwa fraksinasi menggunakan Sep-pak C18 dapat menghasilkan fraksi dengan kadar fenolik total yang lebih besar ataupun lebih kecil dibandingkan dengan kadar fenolik total bahan madu aslinya. Hal ini menunjukan bahwa eluen yang digunakan dalam proses fraksinasi memiliki kontribusi penting dalam mempengaruhi kadar fenolik bahan yang sekaligus akan menentukan aktivitas antioksidannya. Senyawa fenolik mencakup banyak sub-kelompok yang berbeda (flavonoid, asam fenolik, stilbene, lignan, tannin, polifenol teroksidasi) dan menampilkan keragaman
struktur yang besar sehingga komponen-komponen yang
terelusi selama proses fraksinasi sangat dipengaruhi oleh polaritas sistem pelarut organik yang digunakan.
Aktivitas Antiradikal DPPH Madu dan Fraksinya Aktivitas antiradikal pada madu diduga terkait kandungan fenolik totalnya, sehingga pada tahap selanjutnya akan dievaluasi aktivitas antiradikal DPPH dari berbagai fraksi fenolik madu. Gambar 1 menunjukkan grafik perubahan aktivitas antiradikal DPPH fraksi fenolik madu pada berbagai konsentrasi (10 – 50 mg/mL). Secara umum bahan madu asalnya danau Sentarum, ekstrak metanol dan semua fraksinya memiliki aktivitas antiradikal yang cenderung meningkat sejalan dengan meningkatnya konsentrasi fraksi (Gambar 1). Fraksi metanol-air (70:30) pada konsentrasi 50 mg/mL mempunyai aktivitas penghambatan radikal DPPH tertinggi, walaupun tidak berbeda nyata dengan aktivitas antiradikal pada hampir semua fraksi, kecuali fraksi etil asetat (Tabel 2). Tabel 2 menyajikan pula koefisien determinasi (R2) untuk menilai derajat korelasi antara konsentrasi sampel dan aktivitas antiradikalnya dalam bentuk persamaan linier serta nilai IC50 yaitu konsentrasi sampel (mg/mL) yang menunjukkan aktivitas antiradikal DPPH sebesar 50%. Efektivitas penghambatan radikal DPPH tertinggi dimiliki oleh fraksi metanol (IC50 = 31,91 mg/mL) dengan koefisien determinasi yang tinggi. Hal ini menyatakan bahwa untuk menghambat radikal DPPH sebesar 50%, fraksi metanol hanya membutuhkan konsentrasi sampel sebanyak 31,91 mg/mL (Tabel 2). Sebaliknya, fraksi n-heksana memiliki IC50 yang terkecil diantara semua sampel (262,42 mg/mL), namun derajat korelasi persamaan liniernya yang kecil (R2 = 0,61), menunjukkan bahwa model ini tidak dapat digunakan untuk menggambarkan nilai IC50-nya. Secara umum, bahan
1177
Seminar Nasional Sains & Teknologi V Lembaga Penelitian Universitas Lampung 19-20 November 2013 madu, ekstrak metanol dan fraksi madu lainnya memiliki nilai IC50 yang relatif tinggi jika dibandingkan dengan fraksi metanol (Tabel 1).
Gambar 1. Aktivitas Antiradikal Fraksi Madu Danau Sentarum
Tabel 2. Aktivitas Antiradikal DPPH (%) dan IC50 (mg/mL) Fraksi Madu Danau Sentarum
No.
Sampel
Antiradikal DPPH (%)
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
Madu Ekstrak Metanol Fraksi Metanol Fraksi Metanol:Air (60:40) Fraksi Metanol:Air (70:30) Fraksi Metanol:Air (80:20) Fraksi Metanol:Air (90:10) Fraksi Etil Asetat Fraksi n-Heksana
13.38 ± 0,38 ab 12,58 ± 0,89 ab 21,35 ± 6,97 ab 16,63 ± 2,97 ab 24,74 ± 3,91 a 18,77 ± 4,08 ab 12,98 ± 3,67 ab 10,71 ± 5,76 b 12,40 ± 8,79 ab
*IC : Inhibition Concentration
1178
Koefisien Determinasi (R2) 0.99 0.98 0.99 0.93 0.98 0.98 0.92 0.88 0.61
IC* 50 (mg/mL) 179,91 175,02 31,91 168,76 96,05 140,26 155,76 240,67 262,42
Seminar Nasional Sains & Teknologi V Lembaga Penelitian Universitas Lampung 19-20 November 2013 KESIMPULAN Penggunaan Sep-pak C18 pada fraksinasi madu danau Sentarum mampu menghasilkan fraksi yang memiliki kadar fenolik total dan aktivitas antiradikal yang lebih tinggi dibandingkan dengan bahan madu asalnya yaitu fraksi metanol. Hal ini antara lain diduga
pada proses fraksinasi, sub-kelompok senyawa fenolik yang
memiliki aktivitas antiradikal yang tinggi mengalami elusi dengan baik oleh pelarut metanol.
UCAPAN TERIMA KASIH Penulis menyampaikan terima kasih kepada Ditlitabmas Dikti melalui DIPA Politeknik Negeri Pontianak yang telah mendukung finansial penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA Aljadi A, Kamaruddin MY. 2004. Evaluation of the phenolic contents and antioxidant capacities of two Malaysian floral honeys. Food Chem. 85: 513–518. Al-Mamary M, Al-Meeri A, Al-Habori, M. 2002. Antioxidant activities and total phenolics of different types of honey. Nutr Res. 22: 1041–1047. Chen L, Mehta A, Berenvaum M, Zangerl AR, Engeseth, J. 2000. Honeys from different floral sources as inhibitors of enzymatic browning in fruit and vegetable homogenates. J Agric Food Chem. 48: 4997–5000. Cowan MM. 1999. Plant products as antimicrobial agents. Clin Microbiol Rev. 12: 564– 582. Cushnie TPT, Lamb AJ. 2005. Detection of galangin-induced cytoplasmic membrane damage in Staphylococcus aureus by measuring potassium loss. J Ethnopharmacol. 101: 243–248. Fiorani M, Accorsi A, Blasa M, Diamantini G, Piatti E. 2006. Flavonoids from Italian multfloral honeys reduce the extracellular ferricyanide in human red blood cells. J Agric Food Chem. 54: 8328–8334. Gheldof N, Wang XH, Engeseth NJ. 2002. Identification and quantification of antioxidant components of honeys from various floral sources. J Agric Food Chem. 50: 5870–5877. Hossain MA, Rahman SMM. 2011. Total phenolics, flavonoids and antioxidant activity of tropical fruit pineapple. Food Research International. 44(3): 672–676.
1179
Seminar Nasional Sains & Teknologi V Lembaga Penelitian Universitas Lampung 19-20 November 2013 Johnston JE, Sepe HA, Miano CL, Brannan RG, Alderton AL. 2005. Honey inhibits lipid oxidation in ready-to-eat ground beef patties. Meat Sci. 70: 627–631. Kishore RK, Halima AS, Syazanaa MSN, Sirajudeenb KNS. 2011. Tualang honey has higher phenolic content and greater radical scavenging activity compared with other honey sources. Nutrition Research. 31: 322–325. Kucuk M, Kolayl S, Karaoglu S, Ulusoy E, Baltac C, Candan F. 2007. Biological activities and chemical composition of three honeys of different types from Anatolia. Food Chem. 100: 526–534. Prawoto A. 2007. Sertifikasi Madu Hutan Organik Pertama di Indonesia. Buletin Organis. 4(16): 13-14. Schramm DD, Karim M, Schrader HR, Holt RR, Cardeti M, Keen CL. 2003. Honey with high levels of antioxidants can provide protection to healthy human subjects. Journal of Agricultural and Food Chem. 51: 1732–1735. Viuda-Martos M, Ruiz-Navajas Y, Fernandez-Lopez J, Perez-Alvarez JA. 2008. Functional Properties of Honey, Propolis, and Royal Jelly. J Food Sci. 73(9): R117-R124.
1180
