PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK METANOL DAUN KEMUKUS (Piper cubeba L

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK METANOL DAUN KEMUKUS (Piper cubeba L.)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh: Maria Indah Rosari NIM: 128114037

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2016


PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK METANOL DAUN KEMUKUS (Piper cubeba L.)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh: Maria Indah Rosari NIM: 128114037

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2016

i


Persetujuan Pembimbing

PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS

ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK METANOL DAUN KEMUI(U

S ( Piper cubeba

L.)

Skripsi yang diajukan oleli:

Maria Indrh Rosari

NIM:

128114037

telah disetujui oleh

Pernbirnbing Utarna

1lv

(Dr. Yustina Sri Harlini, M.Si.,

Apt.)

tanggal .::.7..,,1.'.'.0:....t:.{(.


Pengesahan Skripsi Berjudul

PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTTWTAS ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK METANOL DAUN KEMUKUS (Piper cubeba L.)

Oleh:

Maria Indah Rosari

NIM: I28II4A37 Dipertahankan di hadapan Panitia penguji Skripsi Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma pada tanggal: 18 Juli 2016

Mengetahui Fakultas Farmasi Dharma

r/ *\

,f, >/: -h'

vu

*%l .Si., Ph.D., Apt.)

Apt.

lll


PERNYATAAN KEASLIAN I({RYA

-sa1,a

rnenyatakan dengan sesungguhn),a bahu a sliripsi yang saya tr-rlis ini

tidak mcmuat kary'a iitau bagian klir_.ia orang lain. kecuali yang telah disebutkan rlalam kr-rtipan rian datlar pusrlaka. scbagaimana iar,akn-va kar-va ilr"niah. Apaibila di kcrnr:clian hari cliternukan indikasi piagiarisme dalarn naskah ini,

maka salla bersedia rnenan-qglrng segaia siiinksi sesuai peraturan Ltnclan gatr 1,ang

pcruncian-u-

berlaku.

Yogyakana. 27 i ttii 2fii 6 Pcnulis

N4K

(Nlaria Indah Rosari)

1V


LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS \-ang bcrtarrda tangan di bawah ini, saya mahasislva Ur-riversitas Sanata Dharma:

Maria Indah Rosari

-\trrlui'

,Vltrlll'rsisri

a

:

12Et14037

Derni pengeilbangan iirnu pcn.qetahuan. sa-va rncmbcriktin kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharrna karya ihniah sa-va

ber-f

uclul:

PENE.I.APAN KAN.DUT\GAN FENOLIK TOTAI, DAT\ UJI AKTIVITAS ANI'IOKSTDA:{ FRAKSI ETIL ASETAT EKSTR.AK NIBTANOL D,\UN KEN{UKUS (Piper cubebu L.) Bcsert:i pcrarigkat yang ciiperlukan (bila acia). Dengan clcmikian saya mcmbcrikan

kcpacla Perpustakaan [Jniversitas Sanatti Dhanna hak untuk menyirnpan. inengalihkan cialam bentuk meclia lain, mcngelolanrr.a clalam bentuk pangkalan data. r-t-rcr-tciistribusikarl secara terbatas, rlan rnempublikasikannya di internet atau

meciiti lair-r untuk kepentingan akademis tanpn perlu mcrninta

ijin ciari sa)'a

rnaupLrn n'rcnrberikan ro1,alti kepada saya selarla tetarp mencautumkan nama saya

sebagai pcnulrs.

Dcngair iicrnrkian pemyataan

Dibuat cii Yogyakarta Pada tanggal 27

itrli

Yang rlenvatakan

(Maria Inclah Rosari)

201(r

ini

saya buat clengan scbcnantva.


HALAMAN PERSEMBAHAN

“Sakèhing prakara bisa daksangga ana ing Panjenenganè kang paring kakuwatan marang aku.” -Filipi 4:13“Success is falling nine times and getting up ten.” -Jon Bon Jovi-

Kupersembahkan skripsi ini untuk: Tuhan Yesus Kristus, Penyelamatku, yang kasihnya tak pernah berkesudahan, yang selalu menguatkan dan menolongku dalam segala perkara apapun, Papa dan Mama yang kusayangi, yang telah membesarkan, merawat, mendidik, dan menyayangiku hingga sekarang, keluarga besar, sahabat, teman, dan almamaterku tercinta.

vi


PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Kuasa atas berkat dan bimbingan-Nya penulis dapat menyelesaikan Skripsi yang berjudul “Penetapan Kandungan Fenolik Total dan Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat Ekstrak Metanol Daun Kemukus (Piper cubeba L.)” ini dengan bbaik. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Strata Satu Program Studi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma. Penulis mengalami berbagai macam kesulitan dan masalah dalam proses pengerjaan Skripsi ini. Kesulitan dan masalah ini dapat diatasi penulis dengan bantuan dari segala pihak. Oleh karena itu penulis hendak mengucapkan terima kasih kepada: 1.

Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

2.

Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt., selaku Dosen Pembimbing dan Dosen Penguji Skripsi atas segala kesabaran dan masukan sehingga skripsi ini dapat diselesaikan dengan baik

3.

Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku Dosen Penguji Skripsi atas masukan, kritik, dan saran kepada penulis dalam penyusunan skripsi ini

4.

Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt., selaku Dosen Penguji Skripsi atas masukan, kritik, dan saran kepada penulis dalam penyusunan skripsi ini

5.

Agustina Setiawati, M.Sc., Apt., selaku Kepala Laboratorium Fakultas Farmasi yang telah memberikan izin dalam penggunaan laboratorium

6.

Pak Wagiran selaku Laboran Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Pak Suparlan selaku Laboran Laboratorium Kimia Organik, Mas Kunto selaku Laboran Laboratorium Kimia Analisis, Mas Bimo selaku Laboran Laboratorium Kimia Instrumen, Pak Heru selaku Laboran Laboratorium Biofarmasetika, Pak Kayat selaku Laboran Laboratorium Biokimia, Mas Agung selaku Laboran Laboratorium Kimia-Fisika, Pak Mus selaku Laboran Laboratorium FTS-Solid, Mas Sigit selaku Laboran Kebun Tanaman Obat atas segala bantuan dan kerjasamanya selama proses penelitian

vii


7.

Keluarga (Papa dan Mama) atas kasih sayang, pengorbanan, dukungan, doa, dan bantuan yang telah diberikan kepada Penulis, baik secara moral maupun materiil

8.

Rekan-rekan seperjuangan skripsi sekaligus sahabat-sahabatku, Agatha Herny S. N., Yuliana Ratih Kamara Dewi, Violeta Jesmile, dan Clementia Nova, yang telah berjuang bersama dengan Penulis menyelesaikan skripsi ini. Terima kasih atas segala bantuan, kerjasama, dan semangat dalam penelitian ini dari awal hingga akhir

9.

Sahabat-sahabatku (Monik, Dewi Anugerah, dan Melani) atas dukungan, semangat, canda tawa, dan persabatan selama empat tahun ini

10. Teman-teman Kos Putri Palantai (Elisa, Ridha, dan Irest) atas semangat, dukungan, masukan, dan canda tawanya 11. Seluruh dosen, teman-teman FSM A, teman-teman FKK A 2012, serta seluruh angkatan 2012 Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma 12. Semua pihak yang tidak dapat Penulis sebutkan satu per satu sehingga Penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan baik Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih memiliki kekurangan dalam berbagai macam hal. Untuk itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari segala pihak. Semoga skripsi ini dapat berguna bagi seluruh pembaca.

Yogyakarta, 23 Juni 2016

Penulis

viii


DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL....................................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................... ii HALAMAN PENGESAHAN ...................................................................... iii PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ....................................................... iv PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI .......................................... v HALAMAN PERSEMBAHAN .................................................................. vi PRAKATA ................................................................................................... vii DAFTAR ISI ................................................................................................. ix DAFTAR TABEL ......................................................................................... xi DAFTAR GAMBAR ................................................................................... xii DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xiii ABSTRAK .................................................................................................. xiv ABSTRACT ................................................................................................... xv PENDAHULUAN ......................................................................................... 1 METODE PENELITIAN .............................................................................. 3 HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................................... 6 KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................... 14 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 15 LAMPIRAN ................................................................................................ 17 BIOGRAFI PENULIS ................................................................................ 37

ix


DAFTAR TABEL Halaman Tabel I.

Hasil penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanol daun Kemukus .................................................... 9

Tabel II. Nilai persen inhibisi sampel dengan metode FTC ...................... 12 Tabel III. Aktivitas antioksidan sampel dengan metode TBA ................... 13

x


DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1.

Kurva baku asam galat untuk penetapan kandungan fenolik total .............................................................................. 8

Gambar 2.

Pembentukan kompleks Fe3+-tiosianat dari kompleks Fe2+-tiosianat oleh hidroperoksida .......................................... 10

Gambar 3.

Profil kenaikan rata-rata absorbansi sampel dengan metode FTC selama tujuh hari ................................................ 11

Gambar 4.

Pembentukan kompleks MDA-TBA ..................................... 13

xi


DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1.

Surat determinasi tanaman ................................................... 18

Lampiran 2.

Gambar daun Kemukus ....................................................... 19

Lampiran 3.

Perhitungan pengujian kadar air serbuk simpllisia daun Kemukus ..................................................................... 20

Lampiran 4.

Uji pendahuluan penetapan kandungan fenolik total dengan metode Folin-Ciocalteu .......................................... 20

Lampiran 5.

Perhitungan rendemen ekstrak dan fraksi ............................ 20

Lampiran 6.

Data penimbangan untuk penetapan kandungan fenolik total ......................................................................... 21

Lampiran 7.

Data perhitungan konsentrasi asam galat dan fraksi etil asetat untuk penetapan kandungan fenolik total............. 22

Lampiran 8.

Hasil optimasi operating time untuk penetapan kandungan fenolik total ....................................................... 23

Lampiran 9.

Optimasi panjang gelombang maksimum untuk penetapan kandungan fenolik total ....................................................... 25

Lampiran 10.

Hasil pengukuran kurva baku untuk penetapan kandungan fenolik total ...................................................... 27

Lampiran 11. Perhitungan kandungan fenolik total fraksi etil asetat......... 27 Lampiran 12. Data penimbangan untuk optimasi operating time uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC .......................... 28 Lampiran 13. Hasil optimasi operating time untuk uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC (triplo) ............................. 28 Lampiran 14. Data penimbangan untuk optimasi panjang gelombang maksimum untuk uji antioksidan dengan metode FTC ......................................................................... 28 xii


Lampiran 15. Hasil optimasi panjang gelombang untuk uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC ......................................... 29 Lampiran 16. Data penimbangan untuk uji antioksidan dengan metode FTC-TBA ................................................................ 32 Lampiran 17. Hasil pengukuran uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC ......................................................................... 32 Lampiran 18. Hasil pengukuran uji aktivitas antioksidan dengan metode TBA ........................................................................ 33 Lampiran 19. Gambar larutan sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus pada metode FTC setelah penambahan FeCl3 selama 7 hari (tiga kali replikasi) ........ 35 Lampiran 20. Gambar larutan uji pada metode TBA ................................. 36

xiii


ABSTRAK Senyawa fenolik yang terkandung dalam tanaman, khususnya asam fenolat dan flavonoid, telah diketahui memiliki aktivitas antioksidan yang dapat menghambat radikal bebas dan peroksidasi lipid. Kemukus (Piper cubeba L.) merupakan salah satu tanaman dari famili Piperaceae yang telah diketahui memiliki berbagai kandungan fitokimia yang memiliki potensi sebagai antioksidan. Menurut hasil penelitian Nahak dan Sahu (2011), daun kemukus memiliki kandungan fitokimia berupa alkaloid, glikosida, steroid, flavonoid, tanin, dan antrakuinon. Flavonoid merupakan salah satu senyawa fenolik utama yang bersifat kurang polar. Etil asetat dapat menarik senyawa yang bersifat kurang polar sehingga dapat digunakan sebagai penyari untuk mengambil kandungan flavonoid yang ada dalam daun kemukus secara optimal. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui kandungan fenolik total dan aktivitas antioksidan daun kemukus yang diekstrak dengan metanol dan difraksinasi dengan etil asetat. Kandungan fenolik total diukur dengan metode Folin-Ciocalteu, sedangkan aktivitas antioksidan diukur dengan metode FTC (Ferric Thiocyanate) dan TBA (Thiobarbituric Acid) untuk mengetahui kemampuan penghambatan peroksida pada tahap pertama dan kedua peroksidasi lipid. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kandungan fenolik total yang terdapat dalam fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus sebesar 155,157 ± 5,642 mg ekivalen asam galat per gram sampel. Aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus yang ditunjukkan dalam persen penghambatan peroksidasi lipid diukur dengan metode FTC dan TBA secara berturut-turut sebesar (9,378 ± 0,263)% dan (90,942 ± 0,750)%. Kata kunci: Piper cubeba L., Antioksidan, Fenolik Total, Metode FolinCiocalteu, Metode FTC (Ferric Thiocyanate), Metode TBA (Thiobarbituric Acid).

xiv


ABSTRACT Phenolic compound contained in plants, especially phenolic acid and flavonoid, has been known to have antioxidant activity which can inhibit free radical and lipid peroxidation. Cubeb (Piper cubeba L.) is a plant in Piperaceae family which has been known to have some phytochemical content that can exhibit potential antioxidant activity. According to the research by Nahak and Sahu (2011), Cubeb leaves have some phytochemical compounds such as alkaloid, glycoside, steroid, flavonoid, tannin, and anthraquinon. Flavonoid is one of major phenolic compound which is less polar. Ethyl acetate can extract less polar compound, therefore ethyl acetate can be used as an extractor to extract flavonoid contained in cubeb leaves optimally. The aim of this research were to measure total phenolic content and antioxidant activity from cubeb leaves extracted by methanol and fractionated by ethyl acetate. Total phenolic content were measured by Folin-Ciocalteu method, meanwhile antioxidant activity were measured by FTC (Ferric Thiocyanate) method and TBA (Thiobarbituric Acid) method to evaluate the percent inhibition of peroxide in the first and second stage of lipid peroxidation. The results showed that total phenolic content in ethyl acetate fraction of methanol extract of cubeb leaves was 155.157 ± 5.642 mg Gallic Acid Equivalents (GAE). Antioxidant activity of ethyl acetate fraction of methanol extract of Cubeb leaves showed as percent inhibition value was (9.378 ± 0.263)% and (90.942 ± 0.750)% for FTC and TBA method respectively. Keyword: Piper cubeba L., Antioxidant, Total Phenolic Content, Folin-Ciocalteu Method, FTC (Ferric Thiocyanate) Method, TBA (Thiobarbituric Acid) Method.

xv


PENDAHULUAN Radikal bebas merupakan jenis molekul yang tidak stabil dengan elektron yang tidak berpasangan dan terdapat pada berbagai sistem biologi dan makanan. Senyawa oksigen reaktif seperti hidrogen peroksida, hidroksil radikal, oksida nitrat, peroksinitrit, oksigen tunggal, peroksil radikal, dan anion superoksida termasuk ke dalam contoh radikal bebas (Halliwell, 2001). Produksi berlebihan dari senyawa reaktif tersebut dapat menghasilkan stres oksidatif yang disebabkan oleh ketidakseimbangan sistem pertahanan antioksidan dengan pembentukan radikal bebas dalam tubuh (Mayne, 2003). Stres oksidatif terlibat dalam patogenesis berbagai gangguan dan penyakit termasuk penyakit kronis yang berhubungan dengan usia, seperti atherosklerosis, rheumatoid arthritis, opthalmologi, dan penyakit neurodegeneratif. Stres oksidatif juga dapat memicu kanker. Di antara semua molekul biologi, lipid paling rentan terhadap serangan reactive oxygen species (ROS) dan reactive nitrogen species (RNS) (Niki, et al., 2005). Lipid yang mengandung asam lemak tak jenuh teroksidasi

oleh molekul oksigen dan oksidasi tersebut dilakukan

dengan mekanisme rantai radikal bebas (Aruoma, 1998). Peroksidasi lipid dapat mengakibatkan penuaan, penyakit jantung koroner, diabetes mellitus, penyakit rematik, gangguan hati, multiple sclerosis, penyakit Parkinson, penyakit autoimun, Alzheimer, dan karsinogenesis (Lin, et al., 2003; Loliger, 1991). Antioksidan merupakan senyawa yang dapat menghambat kerusakan yang disebabkan oleh radikal bebas. Antioksidan memiliki kemampuan dalam menstabilkan atau menon-aktifkan radikal bebas sebelum menyerang komponen seluler. Antioksidan bekerja dengan cara memberikan sebagian elektronnya dan mengurangi energi radikal bebas reaktif, sehingga membentuk radikal bebas yang lebih stabil (El-Missiry, 2012). Beberapa tanaman telah diketahui dapat menjadi sumber antioksidan alami dan memiliki peran penting dalam pencegahan penyakit kanker dan penuaan. Salah satu famili tanaman yang telah diketahui menunjukkan potensi yang besar sebagai antioksidan adalah Piperaceae (Dodson et al., 2000). Piper cubeba atau kemukus merupakan salah satu tanaman dalam famili Piperaceae.

1


Menurut hasil penelitian Nahak dan Sahu (2011), daun kemukus memiliki kandungan fitokimia berupa alkaloid, glikosida, steroid, flavonoid, tannin, dan antrakuinon. Flavonoid merupakan salah satu senyawa fenolik utama yang dapat berfungsi sebagai antioksidan karena kemampuannya dalam meniadakan radikal bebas dan radikal peroksida sehingga efektif dalam menghambat oksidasi lipid (Kinsella, et al., 1993). Pemilihan fraksi etil asetat didasarkan pada kemampuannya dalam menarik senyawa-senyawa yang bersifat kurang polar. Flavonoid yang terkandung dalam daun kemukus merupakan senyawa fenolik yang bersifat kurang polar sehingga dengan penyari etil asetat diharapkan senyawa flavonoid yang terkandung dapat terambil secara optimal (Andersen dan Markham, 2006). Sedangkan pemilihan ekstrak metanol didasarkan pada jurnal Cowan (1999), yang menyatakan bahwa metanol dapat menarik lebih banyak senyawa metabolit dibandingkan air, etanol, kloroform, diklorometanol, eter, dan aseton. Metode yang banyak digunakan untuk penetapan kandungan fenolik total adalah metode Folin-Ciocalteu. Metode ini dapat mengukur kandungan fenolik total dan substrat oksidasi lainnya. Selain itu metode ini dikenal sebagai metode yang sederhana dan mampu memberikan hasil yang sama atau reprodusibel (Ainsworth, 2007). Pengukuran aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan metode Ferric Thiocyanate (FTC) dan Thiobarbituric Acid (TBA) yang mampu mengukur jumlah peroksida yang terbentuk akibat proses peroksidasi lipid. Metode FTC digunakan untuk mengukur jumlah peroksida pada tahap awal peroksidasi lipid, sedangkan metode TBA digunakan untuk mengukur jumlah peroksida pada tahap kedua peroksidasi lipid dan mengukur radikal bebas yang terbentuk setelah oksidasi peroksida (Aqil, et al., 2006; Rezaeizadeh, et al., 2011). Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui kandungan fenolik total dan aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus (Piper cubeba L.). Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai manfaat daun kemukus di masyarakat sebagai antioksidan.

2


METODE PENELITIAN Bahan penelitian yang digunakan adalah daun kemukus segar yang diperoleh dari kebun obat Merapi Farma, akuades, methanol teknis, metanol p.a. 99,6%, etanol p.a. 99,6%, etanol 75%, etil asetat p.a., buffer fosfat 0,05M (pH 7), asam galat p.a. (Sigma), reagen Folin-Ciocalteu, larutan natrium karbonat (Na2CO3) 1M, amonium tiosianat 30%, besi klorida (FeCl3) 0,02M, asam linoleat 2,5%, larutan asam trikloroasetat (TCA) 10%, larutan tiobarbiturat 0,67%, dan BHT (Butylated hydroxytoluene) p.a. (Sigma). Alat penelitian yang digunakan adalah pisau stainless steel, blender, oven, neraca analitik, orbital shaker, corong Buchner, pompa vakum, kertas saring, vacuum rotary evaporator, waterbath, vortex, spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu UV-1240), mikropipet, desikator, tabung sentrifuge, dan alat-alat gelas (Pyrex).

Tata Cara Penelitian: 1. Determinasi tanaman Determinasi tanaman kemukus dilakukan di Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. 2. Preparasi daun kemukus Daun kemukus dilakukan sortasi basah untuk membersihkan kotorankotoran atau bahan asing lainnya yang terbawa pada waktu panen, kemudian dicuci dengan cara dialiri air sambil dibersihkan kotoran yang melekat pada daun. Pencucian dilakukan hingga daun bersih. Daun kemukus dirajang kemudian dikeringkan di dalam oven pada suhu 60oC. Posisi daun kemukus tidak boleh saling menumpuk dan harus sering dibalik agar pengeringan merata. Pengeringan dianggap selesai apabila daun sudah dapat pecah atau patah apabila diremas. Setelah itu, daun kemukus kering dipisahkan dari bahanbahan pengganggu yang ikut serta selama proses pengeringan. Daun kemukus dibuat menjadi serbuk dengan blender, kemudian dilakukan pengayakan dengan ayakan nomor mesh 50.

3


3. Pembuatan ekstrak daun kemukus Serbuk simplisia daun kemukus dimaserasi dengan metanol teknis hingga simplisia terendam sempurna. Maserasi dilakukan selama 24 jam pada suhu ruangan sambil dilakukan penggojogan secara otomatis dengan menggunakan orbital shaker. Setelah 3 hari dimaserasi, filtrat disaring dengan corong Buchner dibantu oleh pompa vakum dan ampasnya diremaserasi dengan metanol teknis selama 2 hari lalu disaring. Remaserasi dilakukan satu kali karena filtrat sudah terlihat jernih. Penyari pada filtrat dihilangkan dengan cara diuapkan dengan menggunakan vacuum rotary evaporator pada suhu 60oC. Kemudian diuapkan kembali dengan menggunakan waterbath untuk diperoleh ekstrak kental. Setelah itu dilakukan penimbangan bobot tetap untuk memastikan ekstrak bebas dari penyari. 4. Fraksinasi Ekstrak kental yang diperoleh difraksinasi menggunakan metode ekstraksi cair-cair. Ekstrak kental dilarutkan dalam akuades hangat, kemudian difraksinasi menggunakan etil asetat dengan perbandingan akuades : etil asetat 1:1 v/v di dalam corong pisah. Terbentuk dua lapisan, yaitu lapisan air dan lapisan etil asetat. Lapisan etil asetat (bagian atas) diambil dan ditampung dalam wadah sedangkan lapisan air (bagian bawah) difraksinasi kembali menggunakan etil asetat dengan perbandingan yang sama. Tahapan ini diulang hingga fraksi jernih. Fraksi etil asetat kemudian dipekatkan menggunakan vacuum rotary evaporator pada suhu 77oC. Fraksi etil asetat pekat kemudian diuapkan menggunakan waterbath untuk menghilangkan sisa penyari, dilanjutkan dengan penimbangan bobot tetap. Fraksi etil asetat yang sudah bebas dari penyari tersebut kemudian disimpan dalam desikator. 5. Penetapan kandungan fenolik total Larutan sampel dibuat dengan menimbang fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus sebanyak 10 mg kemudian dilarutkan dalam 10 mL metanol:air (1:1) sehingga didapatkan konsentrasi larutan stok 1 mg/mL. Kemudian dibuat larutan intermediet dengan konsentrasi 200 µg/mL. Sebanyak

4


0,5 mL larutan intermediet dicampur dengan 2 mL reagen Folin-Ciocalteu dan diinkubasi selama 5 menit. Selanjutnya ditambahkan 4 mL larutan Na2CO3 1M kemudian didiamkan selama operating time yang telah ditentukan sebelumnya, yaitu 30 menit dan dibaca pada panjang gelombang 735 nm, yang merupakan hasil dari penentuan panjang gelombang maksimum. Replikasi dilakukan sebanyak tiga kali. Kurva baku asam galat dibuat dengan konsentrasi 40; 50; 60; 70; dan 80 µg/mL. Hasil dinyatakan sebagai mg ekivalen asam galat per gram ekstrak. 6. Uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC (Ferri-Tiosianat) a. Pembuatan larutan A kontrol positif dan kontrol negatif Kontrol positif yang digunakan adalah BHT. Sebanyak 4 mg BHT ditimbang kemudian dilarutkan dalam 4 mL etanol absolut dalam tabung reaksi bertutup. Kemudian ditambahkan 4,1 mL asam linoleat 2,5%, 8 mL buffer fosfat pH 7 0,05M, dan 3,9 mL akuades. Larutan tersebut diinkubasi dalam oven dengan suhu 40oC selama 24 jam. Pembuatan kontrol negatif sama seperti pembuatan kontrol positif tanpa penambahan BHT. b. Pembuatan larutan A sampel Larutan sampel dibuat dengan menimbang fraksi etil asetat daun kemukus sebanyak 4 mg kemudian dilarutkan dalam 4 mL etanol absolut dalam tabung reaksi bertutup. Kemudian ditambahkan 4,1 mL asam linoleat 2,5%, 8 mL buffer fosfat pH 7 0,05M, dan 3,9 mL akuades. Larutan tersebut diberi label larutan A dan dilakukan replikasi sebanyak 3 kali. Larutan tersebut diinkubasi dalam oven dengan suhu 40oC selama 24 jam. c. Pengujian antioksidan Dibuat larutan B untuk masing-masing larutan A kontrol positif, kontrol negatif, dan sampel untuk pengujian antioksidan dengan mencampur 9,7 mL etanol 75% dan 0,1 mL ammonium tiosianat 30% dalam tabung sentrifuge. Masing-masing larutan A kontrol positif, kontrol negatif, dan sampel yang telah diinkubasi selama 24 jam diambil sebanyak 100µL dan ditambahkan ke dalam larutan B. Larutan tersebut divortex kemudian ditambahkan 100µL FeCl3 0,02 M dalam HCl

5

3,5% dan divortex kembali sampai


homogen. Larutan tersebut didiamkan selama operating time yang telah ditentukan sebelumnya,

yaitu

5 menit,

kemudian diukur dengan

spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 488,5 nm, yang merupakan

hasil

dari

penentuan

panjang

gelombang

maksimum.

Pengukuran dilakukan setiap 24 jam selama beberapa hari hingga larutan kontrol negatif jenuh yang ditunjukkan dengan menurunnya nilai absorbansi (dalam penelitian ini, inkubasi dilakukan selama 8 hari). 7. Penegasan aktivitas antioksidan dengan metode TBA (asam tiobarbiturat) Larutan sampel dan larutan standar yang digunakan pada metode FTC pada hari terakhir diambil sebanyak 2 mL dan ditambahkan 1 mL larutan asam trikloroasetat 20% dan 2 mL larutan asam tiobarbiturat 0,67%. Setelah didihkan selama 10 menit, sampel didinginkan. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi pada kecepatan 3.000 rpm selama 30 menit. Absorbansi supernatan dibaca pada panjang gelombang 532 nm dengan spektrofotometer visibel. 6. Analisis statistik Hasil dari tiga kali replikasi sampel ditampilkan sebagai rata-rata ± SD. Data dihitung dengan metode One Sample T-Test menggunakan program PSPP untuk menentukan signifikansi perbedaan pada level p<0,05.

HASIL DAN PEMBAHASAN Senyawa fenolik merupakan penangkal radikal oksigen yang baik dikarenakan potensi reduksi elektron dari radikal fenolik lebih rendah daripada potensi reduksi elektron dari radikal oksigen (Grace, 2005; Bors, et al., 1990). Selain itu radikal fenolik bersifat kurang reaktif dibandingkan radikal oksigen (Bors, et al., 1990) sehingga senyawa fenolik dapat menghambat radikal oksigen. Berbagai metode penetapan kandungan fenolik total pada produk makanan atau sampel biologis didasarkan pada reaksi senyawa fenolik dengan reagen kolorimetri, salah satunya adalah reagen Folin-Ciocalteu. Metode FolinCiocalteu merupakan salah satu metode yang sering digunakan dalam pengukuran kapasitas antioksidan pada produk dan suplemen makanan. Metode Folin-

6


Ciocalteu diketahui sebagai metode yang cepat dan sederhana untuk mengukur kandungan fenolik total dan senyawa oksidasi dalam ekstrak tanaman. Prinsip metode Folin-Ciocalteu didasarkan pada transfer elektron dalam medium alkali, akibat penambahan Na2CO3, dari senyawa fenolik ke dalam kompleks asam fosfomolibdat dan asam fosfotungstat untuk membentuk kompleks biru yang dapat dideteksi secara spektroskopis pada panjang gelombang sekitar 760 nm (Singleton, et al., 1999). Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut: (fenol-MoW11O4)-4 (biru)

Na2WO4/Na2MoO4 (kuning) Mo+6 (kuning) + e-1

Mo+5 (biru)

Mo+5 + e-1

Mo+4 (biru) (Agbor, et al., 2014)

Penetapan kandungan fenolik total dimulai dengan penetapan operating time dan panjang gelombang maksimum. Penentuan operating time bertujuan untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil, di mana pada waktu tersebut tercapai reaksi yang optimal dan diperoleh absorbansi yang stabil. Pada saat awal terjadi reaksi, absorbansi senyawa yang berwarna ini meningkat sampai waktu tertentu hingga diperoleh absorbansi yang stabil. Semakin lama waktu pengukuran maka ada kemungkinan senyawa yang berwarna tersebut menjadi rusak atau terurai sehingga intensitas warnanya turun akibatnya absorbansinya juga turun. Maka pengukuran senyawa berwarna (hasil suatu reaksi kimia) harus dilakukan pada saat operating time (Gandjar dan Rohman, 2007). Penentuan operating time dilakukan dengan menggunakan asam galat sebagai senyawa pembanding selama 60 menit dengan selang waktu pengukuran 5 menit. Pengukuran dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer UV-visibel pada panjang gelombang teoritis 760 nm. Operating time yang diperoleh untuk penetapan kandungan fenolik total adalah 30 menit. Pada waktu tersebut diperoleh absorbansi yang stabil, terlihat dari selisih yang kecil antar absorbansinya. Setelah diperoleh operating time, selanjutnya dilakukan penentuan panjang gelombang maksimum untuk penetapan kandungan fenolik total. Tujuan dari penetapan panjang gelombang maksimum adalah untuk mengetahui panjang

7


gelombang yang mempunyai nilai absorbansi maksimal. Pengukuran panjang gelombang maksimum dilakukan pada rentang panjang gelombang 600-800 nm. Pada penentuan panjang gelombang untuk penetapan fenolik total didapatkan panjang gelombang maksimum 735 nm. Pada panjang gelombang tersebut nilai absorbansi yang diperoleh menunjukkan nilai yang maksimal. Pembuatan kurva baku dilakukan dengan asam galat sebagai standar karena asam galat merupakan salah satu jenis asam fenolat yang masuk ke dalam golongan senyawa fenolik utama. Larutan standar asam galat dibuat dalam lima tingkat konsentrasi, yaitu 40, 50, 60, 70, dan 80 µg/mL dengan tiga kali replikasi. Kurva baku asam galat dibuat dengan memplotkan nilai absorbansi versus konsentrasi. 0.700 y = 0.006x + 0.097 R² = 0.984

0.600 absorbansi

0.500 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000 0

20

40 60 Konsentrasi (µg/mL)

80

100

Gambar 1. Kurva baku asam galat untuk penetapan kandungan fenolik total

Persamaan yang digunakan dalam menentukan kandungan fenolik total adalah persamaan regresi linier replikasi ketiga, yaitu y = 0,00624x + 0,0974 dengan linearitas r = 0,9924. Absorbansi sampel yang didapat kemudian dimasukkan ke dalam persamaan tersebut untuk memperoleh nilai kandungan fenolik total sampel ditunjukkan dengan satuan mg ekivalen asam galat per gram sampel. Hasil perhitungan menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus memiliki nilai kandungan fenolik total sebesar 155,157 ± 5,642 mg ekivalen asam galat per gram sampel. Penelitian Aqil et al. (2006) menyatakan kandungan senyawa fenolik pada ekstrak metanol biji kemukus sebesar 42,83 ±

8


3,75 mg ekivalen asam galat per gram sampel. Hasil kandungan senyawa fenolik pada penelitian ini lebih tinggi dibandingkan dengan penelitian yang dilakukan oleh Aqil et al. (2006). Hal ini dikarenakan senyawa fenolik, khususnya flavonoid, umumnya banyak terkandung di dalam daun.

Tabel I. Hasil penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

Konsentrasi

Absorbansi

200 µg/mL 200 µg/mL 200 µg/mL

0,298 0,304 0,313

Kandungan fenolik total 149,925 154,410 161,135

Rata-rata

% CV

155,157 ± 5,642

3,636%

Pada penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus, larutan menunjukkan warna biru setelah ditambahkan reagen Folin-Ciocalteu dan larutan Na2CO3. Hal tersebut menunjukkan bahwa terdapat senyawa fenolik yang terkandung di dalam fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus. Polifenol merupakan senyawa utama pada tanaman yang menghasikan aktivitas antioksidan. Senyawa fenolik utama yang memiliki aktivitas antioksidan adalah asam fenolat dan flavonoid (Demiray, et al., 2009). Menurut hasil penelitian Nahak dan Sahu (2011), tanaman kemukus memiliki kandungan fitokimia berupa alkaloid, glikosida, steroid, flavonoid, tanin, dan antrakuinon. Flavonoid merupakan salah satu jenis senyawa fenolik utama di dalam tanaman. Kandungan senyawa fenolik berupa flavonoid yang dimiliki tanaman kemukus menghasilkan aktivitas antioksidan yang dapat menghambat radikal bebas. Pengujian aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus dilakukan dengan metode FTC dan TBA dengan mekanisme asam lionoleat. Asam linoleat merupakan salah satu asam lemak tak jenuh yang rentan mengalami auto-oksidasi. Faktor-faktor yang mempengaruhi proses oksidasi asam linoleat adalah panas, cahaya, oksigen, dan ion logam. Peroksidasi lipid diawali oleh ROS (Reactive Oxygen Species) atau senyawa oksigen reaktif. Beberapa jenis ROS di antaranya adalah superoksida

9


(O2+), oksigen tunggal (O2), oksigen triplet (3O2), ozon (O3), radikal hidroksil (+OH), radikal alkoksil (RO+), dan radikal peroksil (ROO+). ROS mengambil atom hidrogen dari gugus metil asam lemak tak jenuh dan membentuk radikal bebas seperti radikal peroksil. Saat radikal bebas ini terbentuk, peroksidasi lipid berkembang sehingga lipid memproduksi bebagai produk oksidasi sekunder. Beberapa produk oksidasi sekunder yang dibentuk dari lipid digunakan sebagai biomarker untuk mengetahui peran produk oksidasi sekunder dalam penyakit kanker dan neurodegeneratif (Matsuo, 1985). Keberadaan antioksidan (A˙) dapat memecah reaksi berantai dengan bereaksi dengan lipid peroksida (LOO˙) yang membentuk radikal yang stabil yang bersifat relatif tidak reaktif atau produk non-radikal. LOO˙ + AH

LOOH + A˙

A˙ + LOO˙

Produk non-radikal

A˙ + A˙

Produk non-radikal (Halliwel dan Chirico, 1993)

Metode FTC digunakan untuk menentukan tingkat hidroperoksida lipid dalam suatu sistem biologis. Pada metode ini, asam linoleat digunakan sebagai sumber peroksida. Peroksida yang terbentuk bereaksi dengan FeCl2 untuk membentuk ion Fe3+ yang kemudian bereaksi dengan ammonium tiosianat (SCN-) membentuk kompleks ferri-tiosianat (Fe(SCN)3) berwarna merah yang dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang teoritis 500 nm.

Gambar 2. Pembentukan kompleks Fe3+-tiosianat dari kompleks Fe2+-tiosianat oleh hidroperoksida (Moon dan Shibamoto, 2009)

Kontrol positif yang digunakan adalah BHT (Butyl hydroxytoluene) yang merupakan salah satu antioksidan sintetis. Kontrol positif digunakan sebagai pembanding aktivitas antioksidan dengan fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus. Sementara kontrol negatif tanpa penambahan senyawa antioksidan

10


berperan sebagai acuan untuk melihat kenaikan jumlah peroksida yang terbentuk setiap harinya selama waktu pengukuran. Sebelum dilakukan pengujian aktivitas antioksidan dengan metode FTC, dilakukan optimasi metode berupa penentuan operating time dan panjang gelombang maksimum. Operating time yang diperoleh adalah 5 menit, sementara panjang gelombang yang mampu menunjukkan absorbansi maksimum adalah 488,5 nm. Uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC dilakukan selama beberapa hari hingga kontrol negatif menunjukkan absorbansi maksimum dan warna merah larutan akibat pembentukan kompleks ferri-tiosianat terlihat semakin pekat. Hal tersebut menandakan bahwa proses peroksidasi lipid asam linoleat sudah berjalan secara maksimal. Pengukuran absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan sampel dilakukan selama tujuh hari dengan rentang waktu pembacaan sampel setiap 24 jam. Absorbansi maksimal kontrol negatif dicapai pada hari keenam, menandakan proses peroksidasi telah berjalan maksimal dan semakin banyak peroksida atau radikal bebas yang terbentuk.

2.4

Kontrol (-)

Absorbansi

2.2 2.0 1.8

Kontrol (+)

1.6 1.4 1.2 1.0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

Fraksi etil asetat ekstrak metanol daun Kemukus

Hari ke-

Gambar 3. Profil kenaikan rata-rata absorbansi sampel dengan metode FTC selama tujuh hari

Hasil yang diperoleh menunjukkan kesesuaian dengan mekanisme reaksi di mana nilai absorbansi kontrol negatif lebih tinggi dibandingkan nilai absorbansi kontrol positif dan sampel. Hal ini disebabkan tidak adanya senyawa antioksidan

11


pada kontrol negatif yang dapat menghambat proses peroksidasi lipid, sehingga ion Fe3+ yang terbentuk semakin banyak dan warna merah akibat pembentukan kompleks ferri-tiosianat lebih pekat dibandingkan kontrol positif yang berisi BHT dan sampel yang berisi fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus. Pada pengukuran hari keenam, saat proses peroksidasi lipid sudah berjalan secara maksimal, kontrol positif yang berisi BHT menunjukkan nilai persen inhibisi yang lebih besar dibandingkan fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus, yaitu sebesar (10,306 ± 0,734)%, sementara fraksi etil asetat ekstrak metanol memiliki nilai persen inhibisi sebesar (9,378 ± 0,263)%. Secara statistik nilai persen inhibisi kedua sampel tersebut berbeda bermakna (p<0,05). Hal tersebut menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus kurang mampu menghambat peroksidasi yang terbentuk dibandingkan BHT yang merupakan antioksidan sintetis. Namun fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus tetap memiliki aktivitas antioksidan yang mampu menghambat proses peroksidasi lipid, ditunjukkan dengan nilai absorbansi yang lebih kecil dibandingkan kontrol negatif.

Tabel II. Nilai persen inhibisi sampel dengan metode FTC % Inhibisi kontrol (+) (%) R1 10,990

R2 10,397

R3 9,530

Ratarata ± SD 10,306 ± 0,734

% CV

7,122

% Inhibisi fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus (%) R1 R2 R3 9,530 9,074 9,530

Ratarata ± SD 9,378 ± 0,263

% CV

2,804

Keterangan: R1 = Replikasi 1; R2 = Replikasi 2; Replikasi 3

Potensi fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus dapat dikaitkan dengan kandungan senyawa fenolik yang dimilikinya. Gugus hidroksil yang terdapat dalam senyawa fenolik berkontribusi secara langsung pada aktivitas antioksidan dan kemampuan penghambatan radikal bebas dan peroksidasi lipid. Senyawa fenolik dapat berperan sebagai antioksidan dengan menon-aktifkan radikal bebas lipid atau mencegah dekomposisi hidroperoksida ke dalam radikal bebas (Pitchaon, et al., 2007).

12


Setelah dilakukan pengujian aktivitas antioksidan dengan metode FTC, dilakukan pengujian aktivitas antioksidan dengan metode TBA. Metode TBA digunakan untuk mengukur jumlah peroksida pada tahap kedua peroksidasi lipid dan mengukur radikal bebas yang ada setelah oksidasi peroksida. Pada tahap kedua peroksidasi lipid, asam linoleat yang sudah banyak terbentuk menjadi radikal terdekomposisi menjadi senyawa yang lebih sederhana dan relatif stabil, yaitu MDA (malonaldehida). MDA digunakan sebagai biomarker untuk mengetahui tahap akhir peroksidasi lipid. Prinsip metode ini adalah pengukuran serapan dengan spektrofotometer dari reaksi MDA dengan asam tiobarbiturat yang berwarna merah muda pada panjang gelombang 532 nm.

Gambar 4. Pembentukan kompleks MDA-TBA (Moon dan Shibamoto, 2009)

Pada hari kedelapan setelah pengujian dengan metode FTC, dilakukan pengujian aktivitas antioksidan dengan metode TBA untuk mengukur nilai penghambatan MDA, produk oksidasi sekunder yang terbentuk setelah tahap pertama peroksidasi lipid. Pada hari ketujuh, jumlah peroksida yang terbentuk sudah mulai menurun, ditunjukkan dengan menurunnya nilai aborbansi kontrol negatif. Hal tersebut disebabkan mulai terbentuknya senyawa MDA dari asam linoleat sehingga pengukuran dengan metode TBA dilakukan pada hari kedelapan.

Tabel III. Aktivitas antioksidan sampel dengan metode TBA Kontrol negatif BHT Fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus

Absorbansi 1,001 ± 0,004 0,168 ± 0,009 1,358 ± 0,008

13

% Inhibisi (%) 0 83,916 ± 0,888 90,942 ± 0,750


Tabel III menunjukkan bahwa nilai absorbansi dan persen inhibisi fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus terhadap MDA lebih besar dibandingkan BHT dengan nilai persen inhibisi fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus sebesar (90,942 ± 0,750)%, sementara nilai persen inhibisi BHT sebesar (83,916 ± 0,888)%. Secara statistik, nilai persen inhibisi kedua sampel tersebut berbeda bermakna (p<0,05). Hal tersebut menunjukkan bahwa pada tahap kedua peroksidasi lipid, aktivitas penghambatan MDA oleh fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus lebih besar dibandingkan penghambatan peroksida pada tahap pertama peroksidasi lipid. Metode FTC dan TBA memiliki kelemahan yaitu hanya mampu menunjukkan aktivitas antioksidan dengan hasil persen penghambatan peroksida. Kedua metode ini tidak dapat menunjukkan pada konsentrasi berapa sampel yang diuji mampu menghambat radikal bebas secara efektif. Selain itu metode FTC memiliki kelemahan pada pembentukan kompleks warna, di mana semakin lama operating time kompleks warna akan semakin memudar sehingga dapat mempengaruhi akurasi.

KESIMPULAN DAN SARAN Kandungan fenolik total yang dinyatakan dalam mg ekivalen asam galat per gram sampel pada fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus sebesar 155,157 ± 5,642 mg ekivalen asam galat per gram sampel. Aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus yang dinyatakan dalam persen inhibisi dengan metode FTC dan TBA berturut-turut adalah (9,378 ± 0,263)% dan (90,942 ± 0,750)%. Hasil tersebut menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus memiliki potensi sebagai antioksidan. Saran untuk penelitian selanjutnya perlu dilakukan pembuatan sampel dalam berbagai tingkat konsentrasi untuk mengetahui konsentrasi sampel yang mampu menghambat lipid peroksidasi secara efektif. Perlu dilakukan juga penambahan jumlah replikasi sampel untuk mengatasi masalah ketidakakuratan pembacaan absorbansi dengan metode FTC akibat kelemahan dalam pembentukan kompleks warna. Selain itu perlu dilakukan juga penelitian lain untuk mengetahui

14


senyawa dalam daun kemukus yang berperan dalam penghambatan lipid peroksida.

DAFTAR PUSTAKA Agbor, G.A., Vinston, J.A., Donnelly, P.E., 2014, Folin-Ciocalteau Reagent for Polyphenolic Assay, International Journal of Food Science, Nutrition and Dietetics, Vol. 3, Issue 8, pp. 147-156. Ainsworth, E.A., Gillespie, K.M., 2007, Estimation of Total Phenolic Content and Other Oxidation Substrate in Plant Tissues Using Folin-Ciocalteu Reagent, Nature Publishing Group, Vol. 2, No. 4, pp. 875-877. Andersen, O.M., Markham, K.R., 2006, Flavonoids: Chemistry, Biochemistry, and Applications, Taylor & Francis Group, London, p. 2. Aqil, F., Ahmad, I., Mehmood, Z., 2006, Antioxidant and Free Radical Scavenging Properties of Twelve Traditionally Used Indian Medicinal Plants, Turk. J. Biol., Vol. 30, pp. 177-183. Aruoma, O.I., 1998, Free Radicals, Oxidative Stress, and Antioxidants in Human Health and Disease, J. Am. Oil Chem. Soc., Vol. 75, pp. 199-212. Bors, W., Heller, W., Michel, C. & Saran, M., 1990, Flavonoids as Antioxidants: Determination of Radical-Scavenging Efficiencies, Methods Enzymol, Vol. 186, pp. 343–355. Cowan, M.M., 1999, Plant Products as Antimicrobial Agents, Clinical Microbiology Review, Vol. 12, No. 4, pp. 564-582. Demiray, S., Pintado, M.E., Castro, P.M.L., 2009, Evaluation of Phenolic Profiles and Antioxidant Activities of Turkish Medicinal Plants: Tilia argentea, Crataegi folium leaves and Polygonum bistorta roots, World Acad, Sci. Eng. Technol., Vol. 54, pp. 312-317. Dodson, C.D., Dyer, L.A., Searcy, J., Wright, Z., Letourneau, D.K., 2000, Cenocladamide: A Dihydropyridone Alkaloid from Piper cenocladum, Phytochemistry, Vol. 53, pp. 51-54. El-Missiry, M.A., 2012, Antioxidant Enzyme, InTech, Croatia, pp. 3-15. Gandjar, I. G., Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, hal. 220-265. Grace, S.C., 2005, Phenolics as Antioxidants in Antioxidants and Reactive Oxygen Species in Plants (ed. Smirnoff, N.), Blackwell Publishing, Oxford, UK, pp. 141–168. Halliwel, B., 2001, Vitamin C and Genomic Stability, Mutat. Res., Vol. 45 (1-2), pp. 29-35. Halliwel, B., Chirico, S., 1993, Lipid Peroxidation: Its Mechanism, Measurements, and Significance, Am. J. Clin. Nutr., Vol. 57, pp. 715S-725S. Kinsella, J.E., Frankel, E., German, B., Kanner, J., 1993, Possible Mechanism for The Protective Antioxidants in Wine and Plants Food, J. Food Technology, Vol. 4, Issue 5, p. 89. Lin, C.C., Wu, S.J., Chang, C.H., Ng, L.T., 2003, Antioxidant Activity of Cinnamomum cassia, Phytoter Res, Vol. 17, p. 726.

15


Loliger, J., 1991, Free Radicals and Food Additives, Taylor and Francis, London, p. 121. Matsuo, M., 1985, Synthesis and Degradation of Lipid Peroxides in Bodies, Center for Academic Publications Japan, pp.13-44. Mayne, S.T., 2003, Antioxidant Nutrition and Chronic Disease: Use of Biomarkers of Exposure and Oxidative Stress Status in Epidemiological Research, J. Nutr., Vol. 133, p. 933. Moon, J.K., Shibamoto, T., 2009, Antioxidant Assays for Plant and Food Components, J. Agric. Food. Chem., Vol. 57, pp. 1655-1666 Nahak, G., Sahu, R.K., 2011, Phytochemical Evaluation and Antioxidant Activity of Piper cubeba and Piper nigrum, Journal of Applied Pharmaceutical Science, Vol. 01 (08), pp. 153-157. Niki, E., Yoshida, Y., Saito, Y., Noguchi, N., 2005, Lipid Peroxidation: Mechanisms, Inhibition, and Biological Effects, Biochem Biophys. Res. Commun., Vol. 388, pp. 668-676. Pitchaon, M., Suttajit, M., Pongsawatmani, R., 2007, Assesment of Phenolic Content and Free Radical Scavenging Capacity of Some Thai Indigenous Plants, Food Chem, Vol. 100, pp. 1409-1418. Rezaeizadeh, A., Zuki, A.B.S., Abdollahi, M., Goh, Y.M., Noordin, M.M., Hamid, M., Azmi, T. I., 2011, Determination of Antioxidant Activity in Methanolic Extract and Chloroformic Extract of Momordica charantia, African Journal of Biotechnology, Vol. 10, Issue 24, pp. 4392-4940. Singleton, V.L., Orthofer, R., Lamuela-Ravento´s, R.M, 1999, Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent, Methods Enzymol, Vol. 299, pp. 152–178.

16


LAMPIRAN

17


Lampiran 1. Surat determinasi tanaman

18


Lampiran 2. Gambar daun kemukus

Lampiran 3. Perhitungan pengujian kadar air serbuk simplisia daun kemukus % Kadar air

=

𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑎𝑤𝑎𝑙 −𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑎𝑘 ℎ𝑖𝑟 𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑎𝑤𝑎𝑙

a. Replikasi 1 Bobot awal

= 5,013 gram

Bobot akhir

= 4,596 gram

% Kadar air

= 8,318%

b. Replikasi 2 Bobot awal

= 5,016 gram

Bobot akhir

= 4,571 gram

% Kadar air

= 8,872%

c. Replikasi 3 Bobot awal

= 5,019 gram

Bobot akhir

= 4,588 gram

% Kadar air

= 8,587%

19

× 100%


Lampiran 4. Uji pendahuluan penetapan kandungan fenolik total dengan metode Folin-Ciocalteau

A

B

C

Keterangan: A = Kontrol positif (asam galat + reagen Folin-Ciocalteau + Na2CO3) B = Kontrol negatif (metanol : air (1:1) + reagen Folin-Ciocalteau + Na2CO3) C = Sampel (fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus + reagen FolinCiocalteau + Na2CO3)

Lampiran 5. Perhitungan rendemen ekstrak dan fraksi a. Ekstrak metanol daun kemukus Bobot simplisia yang digunakan Bobot cawan kosong

Bobot (gram) 41,840 73, 3275

20


Bobot cawan + ekstrak Bobot ekstrak

% rendemen ekstrak = % rendemen ekstrak =

75, 3560 2,0285 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘

𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑠𝑖𝑚𝑝𝑙𝑖𝑠𝑖𝑎 2,0285 41,84

× 100%

× 100% = 4,8482%

b. Fraksi etil asetat daun kemukus Bobot (gram) 41,8400

Bobot simplisia yang digunakan Bobot cawan kosong Bobot cawan + fraksi etil asetat Bobot fraksi etil asetat

% rendemen fraksi = % rendemen fraksi =

70,6085 72,6300 2,0215

𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑠𝑖𝑚𝑝𝑙𝑖𝑠𝑖𝑎 2,0215 41,84

× 100%

× 100% = 4,8315%

Lampiran 6. Data penimbangan untuk penetapan kandungan fenolik total a. Penimbangan asam galat (larutan stok) Bobot gelas beker Bobot gelas beker + isi Bobot zat

Replikasi 1 (gram) 63,7284 63,7385

Replikasi 2 (gram) 61,4635 61,4735

Replikasi 3 (gram) 62,1535 62,1636

0,0101

0,0100

0,0101

Replikasi 1 (gram) 61,0840 61,0940

Replikasi 2 (gram) 61,5200 61,5300

Replikasi 3 (gram) 61,6020 61,6120

0,0100

0,0100

0,0100

b. Penimbangan fraksi etil asetat Bobot gelas beker Bobot gelas beker + isi Bobot zat

21


Lampiran 7. Data perhitungan konsentrasi asam galat dan fraksi etil asetat untuk penetapan kandungan fenolik total a. Contoh perhitungan konsentrasi asam galat replikasi 1 Bobot asam galat replikasi 1 = 0,0101 g = 10,1 mg Konsentrasi larutan stok asam galat =

10,1 𝑚𝑔 10 𝑚𝐿

Perhitungan seri konsentrasi replikasi 1 Seri 1 : V1 . C1 = V2 . C2 0,4 mL . 1010 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 40,4 µg/mL Seri 2 : V1 . C1 = V2 . C2 0,5 mL . 1010 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 50,5 µg/mL Seri 3 : V1 . C1 = V2 . C2 0,6 mL . 1010 µg/mL = 10mL . C2 C2 = 60,6 µg/mL Seri 4 : V1 . C1 = V2 . C2 0,7 mL . 1010 µg/mL = 10mL . C2 C2 = 70,7 µg/mL Seri 5 : V1 . C1 = V2 . C2 0,8 mL . 1010 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 80,8 µg/mL

22

= 1010 µg/mL


Seri 1 Seri 2 Seri 3 Seri 4 Seri 5

Replikasi 1 40,4 µg/mL 50,5 µg/mL 60,6 µg/mL 70,7 µg/mL 80,8 µg/mL

Replikasi 2 40 µg/mL 50 µg/mL 60 µg/mL 70 µg/mL 80 µg/mL

Replikasi 3 40,4 µg/mL 50,5 µg/mL 60,6 µg/mL 70,7 µg/mL 80,8 µg/mL

b. Contoh perhitungan konsentrasi fraksi etil asetat Bobot fraksi etil asetat replikasi 1 = 0,0100 gram = 1000 µg/mL Pengenceran fraksi etil asetat replikasi 1 V1 . C1 = V2 . C2 2 mL . 1000 µg/mL = 10mL . C2 C2 = 200 µg/mL

Konsentrasi fraksi

Replikasi 1 200 µg/mL



Lampiran 8. Hasil optimasi operating time untuk penetapan kandungan fenolik total a. Replikasi 1 Menit ke-

Absorbansi pada panjang gelombang 750 nm 40 µg/mL 60 µg/mL 80 µg/mL 5 0,341 0,401 0,574 10 0,366 0,482 0,607 15 0,376 0,528 0,626 20 0,382 0,545 0,635 25 0,385 0,549 0,640 30 0,386 0,551 0,640 35 0,386 0,550 0,640 40 0,386 0,551 0,639 45 0,386 0,549 0,639 50 0,386 0,552 0,639 55 0,385 0,533 0,638 60 0,385 0,533 0,638 Pada replikasi 1, operating time yang didapat adalah 30 menit

23


b. Replikasi 2 Absorbansi pada panjang gelombang 750 nm Menit ke40 µg/mL 60 µg/mL 80 µg/mL 5 0.344 0.408 0.581 10 0.368 0.490 0.610 15 0.377 0.532 0.627 20 0.384 0.544 0.636 25 0.386 0.549 0.640 30 0.386 0.548 0.641 35 0.387 0.548 0.640 40 0.386 0.549 0.640 45 0.386 0.549 0.640 50 0.386 0.550 0.639 55 0.385 0.537 0.638 60 0.385 0.546 0.638 Pada replikasi 2, operating time yang didapat adalah 30 menit

c. Replikasi 3 Absorbansi pada panjang gelombang 750 nm Menit ke40 µg/mL 60 µg/mL 80 µg/mL 5 0.345 0.406 0.581 10 0.362 0.487 0.606 15 0.379 0.529 0.633 20 0.387 0.535 0.650 25 0.399 0.538 0.653 30 0.402 0.544 0.664 35 0.404 0.543 0.664 40 0.414 0.543 0.661 45 0.418 0.544 0.659 50 0.420 0.543 0.665 55 0.423 0.544 0.667 60 0.425 0.544 0.665 Pada replikasi 3, operating time yang didapat adalah 30 menit

24


Lampiran 9. Optimasi panjang gelombang maksimum untuk penetapan kandungan fenolik total a. Konsentrasi 40 µg/mL

b. Konsentrasi 60 µg/mL

25


c. Konsentrasi 80 µg/mL

26


Lampiran 10. Hasil pengukuran kurva baku untuk penetapan kandungan fenolik total a. Replikasi 1 Seri 1 2 3 4 5

Konsentrasi 40,4 µg/mL 50,5 µg/mL 60,6 µg/mL 70,7 µg/mL 80,8 µg/mL

Absorbansi 0,349 0,430 0,499 0,606 0,620

Persamaan kurva baku A = 0,0700 B = 0,0071 r = 0,9831

Absorbansi 0,390 0,419 0,484 0,569 0,624


Absorbansi 0,369 0,424 0,492 0,587 0,622


y = 0,0071x + 0,0700

b. Replikasi 2 Seri 1 2 3 4 5


y = 0,0062x + 0,1264

c. Replikasi 3 Seri 1 2 3 4 5


y = 0,0062x + 0,0974

Lampiran 11. Perhitungan kandungan fenolik total fraksi etil asetat

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

Konsentrasi

Absorbansi

200 µg/mL 200 µg/mL 200 µg/mL

0,298 0,304 0,313

Kandungan fenolik total 149,925 154,410 161,135

Contoh perhitungan kandungan fenolik total replikasi 1 : y = 0,0062x + 0,0974 0,298 = 0,0062x + 0,0974 x = 29,985 µg/mL = 0,029985 mg/mL Bobot fraksi = 0,0100 gram

27

Rata-rata

%CV

155,157 ± 5,642

3,636%


Kandungan fenolik total = X

𝑣 𝑚

= 0,029985 .

50 0,0100

= 149,925

Maka kandungan fenolik total dalam sampel replikasi 1 sebesar 149,925 mg ekivalen asam galat per gram sampel.

Lampiran 12. Data penimbangan untuk optimasi operating time uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC a. Penimbangan BHT (kontrol positif) Bobot gelas beker

= 63,0377 gram

Bobot gelas beker + isi = 63,0418 gram Bobot zat

= 0,0041 gram

Lampiran 13. Hasil optimasi operating time untuk uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC (triplo) Absorbansi pada panjang gelombang 500 nm Menit ke Pengukuran 1 Pengukuran 2 Pengukuran 3 1 0,985 0,959 0,948 3 0,918 0,907 0,899 5 0,875 0,875 0,874 7 0,864 0,862 0,860 10 0,855 0,853 0,853 Operating time yang didapat adalah 5 menit

Lampiran 14. Data penimbangan untuk optimasi panjang gelombang maksimum uji antioksidan dengan metode FTC a. Penimbangan BHT (kontrol positif) Bobot gelas beker Bobot gelas beker + isi Bobot zat

Replikasi 1 (gram) 61,5081 61,5122

Replikasi 2 (gram) 61,7617 61,7657

Replikasi 3 (gram) 63,6569 63,6609

0,0041

0,0040

0,0040

28


Lampiran 15. Hasil optimasi panjang gelombang untuk uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC a. Replikasi 1

29


b. Replikasi 2

30


c. Replikasi 3

Lampiran 16. Data penimbangan untuk uji antioksidan metode dengan FTCTBA a. Penimbangan BHT (kontrol positif) Bobot beker Bobot beker + isi Bobot zat

Replikasi 1 (gram) 62,4275 62,4316 0,0041

Replikasi 2 (gram) 61,0764 61,0805 0,0041

31

Replikasi 3 (gram) 61,4654 61,4695 0,0041


b. Penimbangan sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus Replikasi 1 (gram) 27,9630 27,9670 0,0040

Bobot cawan Bobot cawan + isi Bobot zat

Replikasi 2 (gram) 20,6332 20,6372 0,0040

Replikasi 3 (gram) 27,1955 27,1995 0,0040

Lampiran 17. Hasil pengukuran uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC a. Nilai absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan sampel Ha ri ke1 2 3 4 5 6 7

Kontrol (-) R1 R2 R3 1,604 1,729 2,081 2,135 2,157 2,157 1,959

1,587 1,716 2,057 2,145 2,194 2,159 1,946

Kontrol (+) R1 R2 R3

1,599 1,722 2,065 2,168 2,208 2,263 1,945

1,457 1,474 1,927 1,933 1,955 1,952 1,749

1,426 1,495 1,930 1,935 1,942 1,965 1,889

1,466 1,470 1,939 1,949 1,954 1,955 1,885

R1

Sampel R2

R3

1,208 1,390 1,649 1,823 1,888 1,984 1,786

1,412 1,462 1,615 1,884 1,896 1,994 1,767

1,454 1,490 1,612 1,786 1,896 1,984 1,770

b. Rata-rata nilai absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan sampel Hari ke1 2 3 4 5 6 7

Kontrol (-) Rata-rata ± SD % CV 1,597 ± 0,009 0,563 1,722 ± 0,007 0,406 2,068 ± 0,012 0,580 2,149 ± 0,017 0,791 2,186 ± 0,026 1,189 2,193 ± 0,061 2,781 1.950 ± 0,008 0,410

Kontrol (+) Rata-rata ± SD % CV 1,450 ± 0,021 1,448 1,480 ± 0,013 0,878 1,932 ± 0,006 0,310 1,939 ± 0,009 0,464 1,950 ± 0,007 0,359 1,957 ± 0,007 0,358 1,841 ± 0,080 4,345

Sampel Rata-rata ± SD 1,358 ± 0,132 1,447 ± 0,052 1,625 ± 0,021 1,831 ± 0,049 1,893 ± 0,005 1,987 ± 0,006 1,774 ± 0,010

% CV 9,720 3,594 1,292 2,676 0,264 0,302 0,564

b. Perhitungan nilai % inhibisi dengan metode FTC (hari keenam) Persen inhibisi

Abs Kontrol (-) 2,193

=

Kontrol (+) (%) R1 R2 R3 10,990

10,397

9,530

(A0 – A1/A0) x 100%

Ratarata ± SD 10,306 ± 0,734

32

% CV 7,122

Sampel (%) R1 R2 R3 9,530

9,074

9,530

Ratarata ± SD 9,378 ± 0,263

% CV 2,804


Contoh perhitungan nilai % inhibisi sampel replikasi 1 hari ke- 1: Persen inhibisi

2,193−1,984

=

2,193

=

× 100%

9,530%

c. Grafik absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan sampel selama tujuh hari Profil Kenaikan Rata-rata Absorbansi Kontrol Negatif, Kontrol Positif, dan Sampel 2.500

Absorbansi

2.000 1.500 Kontrol (-)

1.000

Kontrol (+)

0.500

Sampel

0.000 0

1

2

3

4

5

6

7

8

Hari ke-

Lampiran 18. Hasil pengukuran uji aktivitas antioksidan dengan metode TBA a. Nilai absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan sampel Kontrol (-) R1 R2 1,000

1,005

R3 0,998

Kontrol (-) Rata-rata ± SD % CV 1,001 ± 0,004 0,400

Kontrol (+) R1 R2 R3 0,178

0,165

0,161

Kontrol (+) Rata-rata ± SD % CV 0,168 ± 0,009 5,357

R1

Sampel R2

R3

0,083

0,098

0,091

Sampel Rata-rata ± SD % CV 1,358 ± 0,008 0,589

b. Perhitungan nilai % inhibisi dengan metode TBA Persen inhibisi

=

(A0 – A1/A0) x 100%

33


Kontrol (+) (%) R1 R2 R3 82,218

83,516

83,916

Ratarata ± SD 83,916 ± 0,888

% CV 1,058

R1

Sampel (%) R2

R3

91,708

90,210

90,909

Contoh perhitungan nilai % inhibisi sampel replikasi 1: Persen inhibisi

= =

1,000−0,083 1,000

91,708%

34

× 100%

Ratarata ± SD 90,942 ± 0,750

% CV 0,825


Lampiran 18. Gambar larutan sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemmukus pada metode FTC setelah penambahan FeCl3 selama 7 hari (tiga kali replikasi) 1

5

2

3

6

7

4

Keterangan gambar: Gambar 1: Sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus hari ke-1 Gambar 2: Sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus hari ke-2 Gambar 3: Sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus hari ke-3 Gambar 4: Sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus hari ke-4 Gambar 5: Sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus hari ke-5 Gambar 6: Sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus hari ke-6 Gambar 7: Sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus hari ke-7

35


Lampiran 20. Gambar larutan uji pada metode TBA a. Larutan kontrol positif dan kontrol negatif

Keterangan gambar: A: Sampel berisi kontrol negatif (ethanol 96%) B: Sampel berisi kontrol positif (BHT)

b. Larutan uji berisi fraksi etil asetat ekstrak metanol daun kemukus (tiga kali replikasi)

36


BIOGRAFI PENULIS Penulis Kandungan

skripsi

Fenolik

berjudul

Total

dan

“Penetapan Uji

Aktivitas

Antioksidan Fraksi Etil Asetat Ekstrak Metanol Daun Kemukus (Piper cubeba L.)” ini memiliki nama lengkap Maria Indah Rosari. Dilahirkan di kota Cirebon pada tanggal 3 Januari 1994 dari pasangan Bapak Antonius Suroso dan Ibu Yulia Sugiartini. Penulis telah menyelesaikan pendidikan di TK Santa Maria Cirebon pada tahun 1998 hingga 2000, kemudian melanjutkan pendidikan dasar di SD Santa Maria Cirebon pada tahun 2000 hingga 2006, pendidikan menengah di SMP Santa Maria Cirebon pada tahun 2006 hingga 2009, dan SMA Santa Maria Cirebon pada tahun 2009 hingga 2012. Penulis kemudian melanjutkan pendidikan perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2012 hingga 2016. Selama menjadi mahasiswa di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, penulis cukup aktif dalam kegiatan kemahasiswaan, kepanitiaan, dan kegiatan lain. Penulis cukup aktif dalam Tim Redaksi Majalah Pharmaholic sebagai Anggota Divisi Design dan Layout periode 2013-2014. Penulis juga aktif sebagai asisten dosen mata kuliah praktikum Biofarmasetika pada tahun 2016. Penulis aktif dalam kegiatan kepanitiaan, antara lain: Panitia Pelepasan Wisuda (2012), Panitia Perayaan Pekan Suci (2013), Panitia Seminar Nasional JMKI (2013), Panitia Titrasi (2013), Panitia Donor Darah JMKI (2014), Panitia Pharmacy Road To School (2014), dan Panitia Pharmacy Performance (2014).

37

PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK METANOL DAUN KEMUKUS (Piper cubeba L

Recommend Documents