PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK METANOL DAUN LADA (Piper nigrum L.)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK METANOL DAUN LADA (Piper nigrum L.)

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh:

Yuliana Rati Kamara Dewi NIM: 128114017

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2016


PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK METANOL DAUN LADA (Piper nigrum L.)

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh:

Yuliana Rati Kamara Dewi NIM: 128114017

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2016

i


Persetujuan Pembimbing

PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS

ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL-ASETAT EKSTRAK METANOL DAUN LADA (Piper nigrumL.)

Skripsi yang diajukan oleh:

Yuliana Ratih Kamara Dewi

NIM:

128114017

Telah disetujui oleh:

Pembimbing Utama

"/-/11{r I

Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si.. Apt.

tarrggal

)7 lu h, ,D jL ....'.....J...


Pengesahan Skripsi Berjudul

PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTNTTAS

ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK METANOL DAUN LADA (Piper nigrumL;1

Oleh:

Yuliana Rati Kamara Dewi

NIM: lz81l4}n Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma pada tanggal: 20 Juli 2016

Mengetahui

'p

Eil

T, U; '7^ Y.'i' r

\

-b#

(Aris

;M.Si., Ph.D., Apt.)

Panitia Penguji:

L

Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt.

2. Yohsnes Dwiatmaka, M.Si. 3. Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt.

rll


PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya rnc'rr1'lLtakan ilengrin sesunggr-rhnya bahrva skripsi vang sa\a 1r-rlis ini

ticlak rnemuat kar,va atau bagian dalj karya

()riu-r-s

lain- kccuali

van-rr tclah

disebr-rtlian dalan-r kr-rtipan rian clatir"u-trustaka, seba-qaimana layakn.,'a kar-y'a rlrniah.

Apabila di kemudian hari ciiternukan inclikasi plagiarisme dalanr

nasl.:alr

ini, rnaka saya berseclia rnenanggung segala sanksi peraturan pcrunclang-uurlarrgan vzrng berlaku.

Yogyakaria. 27 Juni 20I(r Penr-rlis

\''uiiana Riiti Kamara Dcui

iv


LEi\'IB;\R PERNI'A]-AAN PERSETUJUi\N I'}LjBLIK'\S! KARYA II,NIIAH TINTTIK KEPENTINGAI\ AKADE} I IS Yang berrancia tangan cli bawah ini. siiya rtrahasisu,a L,nivcrsitas Siutata DhiLn-na: Nau-rii

:

Yuliana Rati Karnat'a Dcw,i

Norror N,lahasisu,a : 1281

14011

l)enti ircngerrbangan ihnu ncngetahuan.

siiy;a rnerrberikan kcpacia Pcrpustakaan

Ljniversitir*s Saniita f)hanna kary,'a ilrniah sa-va vang beriutlul:

PENETAPAN KA]\T,UNGAN FENOLIK TOTAT- DAN T].II AKTI\IITAS

,{NTI0KSID.\N FIIAKSI ETIL ASETAI- EKSTR..\K }tE'I\NOL

DATJN

LADA (Piper nigrum L.). Besefia peratrgltat y'ang diperiukan (bila ada). Deng_ran cletrikiair sa\ r tnentbcrikan

keparia Petpustlrkaan Universitas Sanata Dhai'nra hak Llntrlk

nrelvir-r-rpiir-r.

rnengalihkatt clalam bentuk meclia lain. mengcloian\a cialarn hentuk pangkalan clata" tnenclistribusikan scoaril terbatas, c'ian mcutpr-rbliiiasikai-lt_r'a

media lain rurtuk kepentrngan akadenris tanpa perlu ntentirrta lllallpuil rnen-,berikan royalti kepada

Dcngiur clernikian pcnrr,irtaan ini saya buat clengan sebenarnva.

Pacla tan ugal

2

7 jLili 20 I (r

Yang nrer-ivatakait

(\'Lrliana Rali l(antar-a Deu'i)

ataur

ijin dari sa1,a

saYa selarna tctap rnenclrntLu.nkan

sebagai penulis.

DibLrat di Yog,vakarla

ili iitiernet

narla saya


HALAMAN PERSEMBAHAN Dear God, Thank you for creating such a magical piece Known as a “smile”. It’s indescribable, the feeling when someone smiles at you sincerely, and their eyes sparkle as they do so. No matter how close, no matter how much of a stranger, a sincere smile just melts the heart. Dear God, Thank you for creating another magical piece known as a “cry”. The feeling of seeing someone cry warms my heart, because it simply shows how fragile and connected we all are. And, the feeling when i my self cry, it brings relief and appreciation to life. Dear God, I enjoy talking to You ~Dian Rikasari~

He has made everything beautiful in it’s time. Ecclesiastes 3 : 11 Ku persembahkan karya ini untuk: Tuhan Yesus Kristus, Bunda Maria Papa Kolai, Mama Emma, dan Kakak ku tercinta Maria Semua keluarga besar serta para sahabat yang selalu mendukung & medoakan ku

vi


PRAKATA Puji dan syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas berkat dan rahmatNya serta segenap kasih-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan baik yang berjudul “Penetapan Kandungan Fenolik Total dan Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat Ekstrak Metanol Daun Lada (Piper nigrum L.)”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Strata Satu (S1) Program Studi Farmasi (S.Farm) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Dalam proses penyusunan skripsi ini penulis banyak mendapat bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak, sehingga penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada: 1. Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt. sebagai Dosen Pembimbing yang telah memberikan bimbingan, pengarahan, serta ilmu dalam penelitian dan penyusunan skripsi ini. 2. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. sebagai Dosen Penguji atas masukan, kritik, saran dan kesediaannya menguji skripsi ini. 3. Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt. sebagai Dosen Penguji atas masukan, kritik, saran dan kesediaannya menguji skripsi ini. 4. Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. sebagai Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. 5. Agustina Setiawati, M.Sc., Apt. sebagai Kepala Penanggung Jawab Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma atas izin penggunaan laboratorium yang diberikan kepada penulis. 6. Segenap laboran dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, khususnya Pak Wagiran, Mas Bimo, Pak Parlan, Mas Sigit, Mas Agung, dan Pak Ketul atas bantuan dan kerjasamanya selama ini. 7. Mama, Papa, Kak Maria, atas dukungan, doa, kasih sayang dan semangat yang diberikan, yang selalu mengingatkan penulis untuk tidak mudah

vii


menyerah dan selalu menyertakan Tuhan Yesus Kristus dan Bunda Maria dalam menjalani segala sesuatu. 8. Sepupu-sepupuku tercinta Gita, Andri, Kori, Tuti,Yuyun, Titin, Sari, Fran dan segenap keluarga besar yang tidak bisa saya sebutkan satu per satu atas dukungan dan doanya. 9. Teman-teman skripsi payung piperaceae, Violeta Jesmile, Maria Indah Rosari, Agatha Herny Sekar Natalia, dan Clementia Nova, terimakasih atas suka, duka dan kerjasmanya yang telah dilewati bersama selama penelitian ini. 10. Sahabat penulis: Violeta, Hossianna Yosi Agustina, Elisabeth Sarci Fitriwati Enny, Fransisca Melani, Monika Meitasari Astuti, Dewi Anugrah Fitriani, Indah, Agtha yang selalu menjadi tempat berbagi suka dan duka, selalu memberikan dukungan dan semangat. Terima kasih atas kebersamannnya selama ini, senang bisa mengenal kalian. 11. Teman-teman KKN reguler kelompok 32: Agustinus Bambang Satria Utama, Lucia Ida Ayu Kristiana, Kurnia Novariany, terima kasih atas dinamika, tawa, canda dan persahabatannya selama KKN sampai KKN berakhir. Bisa bertemu dan mengenal kalian adalah salah satu anugerah terindah dalam hidupku. 12. Teman-teman kost Amakus: Kak Ita, Kak seruni, Kak Herta, Kak Nita, Kak Intan, Kak Dewi, Kak Geka, Eni, Esthy, Friesca, Ratri, Indah, Herlina, Karina, Penina, Chyntia, Valent terima kasih atas kebersamaannya selama ini. 13. Teman-teman angkatan 2012 yang luar biasa, khususnya FSM A dan FKK A 2012 yang telah memberikan semangat dan dukungan bagi penulis, terima kasih atas kebersamaannya. 14. Semua pihak yang turut membantu dalam penyusunan skripsi ini yang tidak dapat disebutkan satu persatu. Penulis menyadari masih banyak kekurangan baik dari segi penelitian maupun penyusunan skrips. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun. Semoga penulisan skripsi ini dapat memberikan manfaat bagi seluru pihak serta mendukung perkembangan ilmu pengetahuan.

viii


Yogyakarta, ……Juni 2016

Penulis

ix


DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL ...................................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................... ii HALAMAN PENGESAHAN ....................................................................... iii PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ...................................................... iv PERSETUJUAN PUBLIKASI .................................................................... v HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................... vi PRAKATA .................................................................................................. vii DAFTAR ISI ................................................................................................. x DAFTAR TABEL ........................................................................................ xi DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xii DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xii ABSTRAK ................................................................................................. xiv ABSTRACT ................................................................................................. xv PENDAHULUAN ....................................................................................... 1 METODE PENELITIAN .............................................................................. 2 HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................................... 6 KESEMPULAN DAN SARAN .................................................................. 13 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 14 LAMPIRAN ................................................................................................ 16

x


Daftar Tabel Halaman Tabel I. Hasil pengukuran absorbansi kurva baku asam galat replikasi 3 ..................................... ....................................

8

Tabel II. Hasil penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat daun Lada .......................................................................................

9

Tabel III. Perhitungan persen inhibisi berdasarkan absorbansi hari ke-6 .......................................................................

11

Tabel IV. Aktivitas antioksidan sampel (Fraksi Etil Asetat Ekstrak Metanol Daun Lada) dengan metode TBA ........................................... 13

xi


Daftar Gambar Halaman

Gambar 1. Reaksi Reagen Folin-Ciocalteu Dengan ....................................... Senyawa Fenol ............................................................................. 8 Gambar 2. Reaksi Pembentukan Kompleks Fe3+-Tiosianat dari Kompleks Fe2+ Tiosianat oleh Hiperoksida ................................ 9 Gambar 3. Profil Kenaikan Rata-Rata Absorbansi Kontrol Negatif Kontrol Positif, dan Sampel Fraksi Etil Asetat Ekstrak Metanol Daun lada ................................................................... 11 Gambar 4. Reaksi Pembentukan Kompleks MDA-TBA ............................ 12

xii


Daftar Lampiran Halaman Lampiran 1.

Surat Determinasi Tanaman ................................................. 17

Lampiran 2.

Klasifikasi Tanaman Lada ................................................... 18

Lampiran 3.

Perhitungan Penetapan Kadar Air ........................................ 18

Lampiran 4.

Perhitungan Rendemen Ekstrak dan Fraksi ......................... 19

Lampiran 5.

Data Penimbangan Untuk Kandungan Fenolik Total .......... 19

Lampiran 6.

Data Perhitungan Konsentrasi Asam GalatDan Fraksi Etil Asetat Untuk Penetapan Kandungan Fenolik Total ...... 20

Lampiran 7.

Hasil Optimasi Operating Time Untuk Penetapan Kandungan Fenolik Total .................................................... 22

Lampiran 8.

Optimasi Panjang Gelombang Maksimum Untuk Kandungan Fenolik Total .................................................... 23

Lampiran 9.

Hasil Pengukuran Kurva Baku Untuk Penetapan Kandungan Fenolik Total .................................................... 26

Lampiran 10. Perhitungan Kandungan Fenolik Total Fraksi Etil Asetat ................................................................. 27 Lampiran 11. Data Penimbangan untuk Uji Aktivitas Antioksidan Metode FTC-TBA ............................................................... 28 Lampiran 12. Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan FTC-TBA ...... 29 Lampiran 13. Perhitungan Persen Inhibisi Uji Aktivitas Antioksidan Metode FTC-TBA ............................................................... 33 Lampiran 14. Hasil Pengukuran Uji Aktivitas Antioksidan Dengan Metode TBA ........................................................... 35 Lampiran 15. Gambar Proses Penelitian .................................................... 37

xiii


ABSTRAK Tanaman Lada (Piper nigrum L.) termasuk dalam famili Piperaceae yang diketahui memiliki kandungang kimia yaitu Flavonoid yang termasuk dalam golongan senyawa polifenol. Polifenol merupakan senyawa utama yang paling banyak terdapat pada tanaman, yang memiliki potensi sebagai antioksidan. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui seberapa besar kandungan fenolik total dan aktivitas antioksidan yang terdapat dalam fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada (Piper nigrum L.). Penetapan kangungan fenolik total dilakukan dengan metode Folin-Ciocalteu, sedangkan untuk pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode Ferric Thiocyanate (FTC) dan Thiobarbituric Acid (TBA) dengan menggunakan BHT (butylated hydroxy toluene). Jumlah peroksida pada tahap awal peroksidasi lemak diukur dengan metode FTC, sedangkan jumlah peroksida pada tahap kedua diukur dengan metode TBA. Hasil penelitian menunjukan bahwa fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada mempunyai kandungan fenolik total sebesar 133,83 ± 5,4365 mg ekivalen asam galat. Aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada dengan metode FTC dan TBA secara berturut-turut sebesar (5,061 ± 0,598)%, dan (93,19 ± 2,245)%.

Kata kunci: Lada, Piper nigrum L. Fenolik Total, Metode Folin-Ciocalteu, Antioksidan, Metode Ferric Thiocyanate (FTC), Metode Thiobarbituric Acid (TBA).

xiv


ABSTRACT Pepper is a plant in piperaceae family which has been known to have phytochemical content such as flavonoid included in the polyphenol group. Polyphenol is the most numerous main compound in plant which have a potential as antioxdant. The aim of this research were to measure total phenolic content and antioxidant activity in ethyl acetate fraction of methanol exstract of pepper leaves (Piper nigrum L.) total phenolic content were measured by Folin-Ciocalteu method mean while antioxidant activity were measured by ferric thiocyanat (FTC) method and thiobarbituric acid (TBA) using BHT (butylated hydroxy toluene. Peroxide amount in the first stage of lipid peroxidation were measured by FTC method, meanwhile ferric-thiocyanate complex reaction and to measure peroxide amount in the secound stage of lipid peroxidation were measured by TBA metho. The result showed that ethyl acetate fraction of methanol exstract of pepper leaves has a total phenolic content of 133,83 ± 5,4365 mg gallic acid equivalents (GAE). Antioxidant activity of ethyl acetate fraction of methanol exstract of pepper leaves showed as percent inhibition value was (5,061 ± 0,598)%, and (93,19 ± 2,245)% for FTC and TBA method respectively.

Keywords: Piper nigrum L., Phenolic Content, Antioxidant, Folin-Ciocalteu Method, Ferric Thiocyanat (FTC) Method, Thiobarbituric Acid (TBA).

xv


1. Pendahuluan Berbagai penyakit dalam tubuh disebabkan oleh adanya radikal bebas. Radikal bebas merupakan molekul berbasis oksigen atau nitrogen dengan elektron tidak berpasangan yang umumnya dihasilkan di dalam tubuh pada saat proses metabolisme. Radikal bebas yang berlebihan dapat mengakibatkan penyakitpenyakit degeneratif seperti diabetes, penyakit jantung dan kanker (Winarsi, 2011). Antioksidan merupakan suatu senyawa yang dapat melindungi kerusakan sel karena mampu menetralkan radikal bebas dengan mekanisme mendonorkan atom hidrogen ke atom yang tidak memiliki pasangan elektron (Muhtadi, 2014.) Senyawa fenolik dari tanaman obat memiliki berbagai bioaktivitas yang memainkan peran penting dalam pencegahan kanker. Bioaktvitas dari senyawa fenolik memiliki efek misalnya, antioksidan, anti kanker, antimutagenik dan anti inflamasi (Huang dan Cai, 2010). Senyawa fenolik berfungsi sebagai antioksidan karena senyawa fenolik dapat bereaksi dengan reactive oxygen species (ROS) dan menghilangkan aktivitas radikalnya sehingga tidak berbahaya lagi terhadap sel tubuh manusia (Sochor et al., 2010). Rempah-rempah dan tanaman herbal merupakan salah satu sumber antioksidan alami dan memiliki peran penting dalam pencegahan penyakit kanker dan penuaan dini. Salah satu famili tanaman yang telah diketahui menunjukkan potensi yang besar sebagai antioksidan adalah Piperaceae (Dodson, et al., 2000). Piper nigrum atau biasa disebut lada merupakan salah satu tanaman dalam famili piperaceae. . Pada penelitian yang dilakukan oleh Nahak dan Sahu (2011) daun lada diketahui memiliki kandungan kimia seperti: alkaloid, glikosida, terpenoid, steroid, flavonoid, tanin, gula pereduksi, dan antrakuinon. Flavonoid termasuk dalam golongan senyawa polifenol. Polifenol merupakan senyawa utama yang paling banyak terdapat pada tanaman, yang memiliki aktivitas antioksidan. Pemilihan fraksi etil asetat didasarkan pada kemampuannya dalam menarik senyawa-senyawa yang bersifat kurang polar. Flavonoid yang terkandung dalam daun lada merupakan senyawa fenolik yang bersifat kurang polar, sehingga dengan pelarut etil asetat diharapkan senyawa flavonoid yang terdapat dalam daun

1


lada dapat terambil secara optimal (Andersen dan Markham, 2006). Sedangkan pemilihan ekstrak metanol didasarkan pada penelitian Cowan (1999) yang menyatakan bahwa metanol dapat menarik lebih banyak senyawa metabolit dibandingkan dengan air, etanol, klorofrom, diklorometanol, eter dan aseton. Berdasarkan latar belakang tersebut, maka dalam penelitian ini ingin mengetahui seberapa besar aktivitas antioksidan dari daun lada (Piper nigrum L.) dengan menggunakan metode Ferric Thiocyanate (FTC) dan Thiobarbituric Acid (TBA). Untuk mendukung hasil aktivitas antioksidan yang didapat maka pada penelitian ini dilakukan penentuan jumlah fenolik total untuk mempresentasikan jumlah fenolik yang menyebabkan aktivitas antioksidan.

2. Metode penelitian A. Alat dan Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: Daun lada segar yang diperoleh dari kebun obat “MERAPI FARMA” daerah KM 21,5, Kaliurang, Cangkringan, Sleman, Yogyakarta. Akuades, metanol teknis,metanol p.a 99,6%, etanol p.a 99,6 %, etanol 75%, etil asetat p.a, buffer fosfat 0,05m (pH7), asam galat p.a (sigma), reagen Folin-Ciocalteu, larutan Na2CO3 1 M, amonium tiosianat 30%, FeCl3 0,02 M, asam linoleat 2,5% (sigma), larutan asam trikloroasetat (TCA 10%), larutan tiobarbitarat 0,67%, dan BHT (butylated hydroxy toluene) p.a (Sigma). Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: neraca analitik (Scalec SBC 22, BP 160P), vacuum rotary evaporator (Junke & Kunkel), waterbath (labo-tech, Heraeus), vortex (Janke & Kunkel), spektrofotometer UV-VIS (Shimadzu UV mini), blender, corong Buchner, oven, mikropipet 10-1000µL; 110 mL (Acura 825, Socorex), tabung reaksi bertutup, dan alat-alat gelas yang lazim digunakan dilaboratorium analisis (Pyrex-Germany dan Iwaki).

2


B. Persiapan sampel 1. Pembuatan simplisa Tanaman lada diperoleh dari kebun obat “MERAPI FARMA” daerah KM 21,5, Kaliurang, Cangkringan, Sleman, Yogyakarta. Pengumpulan dilakukan pada bulan maret 2016. Determinasi tanaman Lada dilakukan di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Determinasi tanaman lada ini untuk memastikan bahwa tumbuhan yang digunakan untuk penelitian benar-benar tumbuhan lada. Daun lada dicuci dengan cara dialiri dengan air mengalir sambil dibersihkan kotoran yang melekat pada daun. Pencucian dilakukan sebanyak tiga kali, agar daun lada bersih dari pengotor. Daun lada dirajang dengan ukuran seragam kurang lebih 1 cm. Daun lada yang masih basah kemudian dikeringkan menggunakan oven dengan suhu 60o C. Daun lada yang telah kering ditunjukan dengan mudah hancurnya daun ketika diremas. Setelah itu, daun lada kering dipisahkan dari bahan-bahan pengotor yang ikut serta selama proses pengeringan. Daun lada dibuat menjadi serbuk dengan blender, kemudian dilakukan pengayakan dengan ayakan nomor mesh 50, kemudian dilakukan uji kadar air dan dilakukan perhitungan rendemen ekstrak. Serbuk daun lada yang telah diperoleh kemudian disimpan dengan cara membungkus serbuk menggunakan wadah kedap udara. Penyimpanan serbuk daun lada dilakukan pada suhu ruangan. 2. Pembutan ekstrak metanol daun lada (Piper nigrum L.) Pembuatan ekstrak metanol lada mengacu pada jurnal penelitian Artini et al., (2013) sebanyak 31,509 g serbuk simplisia daun Lada ditimbang, kemudian dimaserasi dengan pelarut metanol sebanyak 100 mL hingga simplisia terendam sempurna. Maserasi dilakukan selama 24 jam pada suhu ruangan dan terlindung dari sinar matahari langsung, dilakukan pengojokan secara otomatis dengan menggunakan shaker setelah 24 jam dimaserasi, filtrat disaring dengan menggunakan corong Buchner dan ampasnya diremaserasi dengan metanol selama 24 jam lalu disaring, proses maserasi dihentikan ketika sudah diperoleh filtrat yang bening, yang menandakan bahwa senyawa aktif dalam sampel telah terekstrak secara sempurna. Pelarut pada filtrat dihilangkan dengan cara diuapkan

3


menggunakan vacuum rotary evaporator pada suhu 400C. Kemudian diuapkan kembali dengan menggunakan water bath ada suhu 40 0C untuk diperoleh ekstrak kental yang bebas dari penyari yang diketahui melalui selisih antar penimbangan ekstrak pertama dan penimbangan kedua sebesar 0,0005. 3. Pembuatan fraksi etil asetat ekstrak metanol Daun Lada Ekstrak kental yang diperoleh difraksinasi menggunakan metode cair-cair. Ekstrak kental dilarutkan dalam akuades hangat, kemudian difraksinasi menggunakan etil asetat dengan perbandingan akuades : etil asetat 1:1 v/v didalam corong pisah. Terbentuk dua lapisan, yaitu lapisan air dan lapisan etil asetat. Lapisan etil asetat (bagian atas) kemudian diambil dan ditampung dalam wadah. Lapisan air (bagian bawah) difraksinasi kembali menggunakan etil asetat dengan perbandingan yang sama. Tahapan ini diulang hingga fraksi jernih. Fraksi etil asetat kemudian dipekatkan menggunakan vaccum rotary evaporator pada suhu 770C yang merupakan titik didih dari etil asetat. Fraksi etil asetat pekat kemudian dikeringkan menggunakan waterbath. Fraksi etil asetat yang diperoleh kemudian di simpan dalam desikator. C. Penetapan kandungan fenolik total. Larutan sampel dibuat dengan menimbang fraksi eti asetat ekstrak metanol daun lada sebanyak 10 mg kemudian dilarutkan dalam 10 mL metanol:air (1:1) sehingga didapatkan konsentrasi larutan stok 1 mg/mL. Kemudian dibuat larutan intermedietdengan konsentrasi 200 µg/mL. Sebanyak 0,5 mL larutan intermediet dengan konsentrasi 200 µg/mL. Sebanyak 0,5 mL larutan intermediet dicampur dengan 2 mL reagen Folin-Ciocalteu dan diinkubasi selama 5 menit. Selanjutnya ditambahkan 4 ml larutan Na2CO3 1 M kemudian didiamkan selama operating time yang telah ditentukan sebelumnya yaitu 30 menit dan dibaca pada panjang gelombang 753 nm,yang merupakan hasil dari penentuan panjang gelombang maksimum. Replikasi dilkukan sebanyak 3 kali. Kurva baku asam galat dibuat dengan konsentrasi 40; 50; 60; 70; 80 µg/mL. Hasil dinyatakan sebagai GAE (gallic acid equivalent)/g ekstrak.

4


D. Uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC-TBA a. Pembuatan larutan A Larutan A dibuat dengan menimbang fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada sebanyak 4 mg, dilarutkan dengan etanol pada tabung raksi bertutup, kemudian ditambahkan 4,1 mL asam linoleat 2,5 % , 8 mL buffer fosfat (pH 7) 0,05 m, 3,9 mL aquadest kemudian diinkubasi didalam oven dengan suhu 37-40oC selama 24 jam. Dibuat replikasi sebanyak 3 kali. b. Pembuatan larutan B Preparasi larutan B dibuat dengan cara menambahkan 9,7 mL etanol 75% dengan 0,1 mL ammonium thiocyanate 30% dalam tabung flakon, selanjutnya ditambahkan 100µL sampel larutan A yang sudah diinkubasi selama 24 jam, 100µL FeCl3 0,02 m ditunggu selama operating time yaitu 5 menit dan diukur ada panjang gelombang 488,5 nm. E. Penegasan aktivitas antioksidan dengan metode TBA Larutan sampel dan larutan standar yang digunakan pada metode FTC pada hari terakhir diambil sebanyak 2 mL dan ditambahkan 1 mL larutan trikloroasetat 20%, 2 mL larutan asam tiobarbiturat 0,67%. Setelah didihkan selama 10 menit, sampel didinginkan, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3.000 rpm selama 30 menit. Absorbansi supernatan dibaca pada panjang gelombang 532 dengan spektrofotometer visibel. F. Analisis data 1. Penetapan kandungan fenolik total Kandungan fenolik total dinyatakan dalam nilai mg ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat. Nilai tersebut didapatkan dari analisis regresi linier dengan data kurva baku asam galat, sehingga diperoleh kandungan fenolik total dengan perhitungan menggunakan rumus: Kandungan fenolik total = X X = kadar fenolik yang diperoleh dari persamaan kurva baku (mg/ml) v = volume akhir larutan dikali faktor pengenceran (ml) m = bobot fraksi (gram) 2. Uji aktivitas antioksidan 5


Aktivitas antioksidan dengan metode FTC-TBA dinyatakan dalam persen inhibisi yang dapat dihitung dengan rumus: Persentase inhibisi = 100 – [(

)

]

A1 = absorbansi maksimum sampel A0 = absorbansi maksimum kontrol negatif 3. Analisis statistik Analisis statistik dilakukan dengan One Sampel T-Test menggunakan program PSPP untuk persen inhibisi antar kelompok kontrol positif dan sampel (fraksi etil asetat ekstrak metanol daun Lada) pada FTC dan TBA untuk melihat perbedaan keduanya. 3. Hasil dan Pembahasan Senyawa fenolik termasuk fenol sederhana, asam fenolik, kumarin, flavonoid, stilbenes, hydrolysabl, tanin terkondensasi, lignan, dan lignin. Senyawa fenolik merupakan metabolit sekunder yang paling banyak terkandung dalam tanaman. Senyawa tersebut berfungsi sebagai pencegahan proses pigmentasi, antioksidan dan agen pelindung terhadap sinar UV (Kambojo et al., 2015). Banyak metode yang digunakan untuk mengkuantifikasi senyawa fenolik. Salah satu metode yang sering digunakan adalah kuantifikasi dengan sektrofotometri,

karena

mudah

dilakukan,

cepat

dan

dapat

diterapkan

dilaboratorium secara rutin, dan murah. Reaksi kolorimetri banyak digunakan dalam metode spektrofotometri UV-VIS. Metode ini akan mengukur konsentrasi senyawa fenolik secara total dalam ekstrak tumbuhan (Blainski, et al., 2013). Prinsip metode kolorimetri Folin Ciocalteu adalah reaksi oksidasi yang cepat dengan menggunakan alkali (biasanya natrium karbonat), dimana nilai yang didapat signifikan dengan ion fenolat (Cicco dan Latanzio, 2011) Penentuan operating time dilakukan dengan tujuan agar reaksi antara gugus hidroksi dari senyawa fenolik dan reagen Folin-Ciocalteu dapat berjalan maksimal. Keadaan reaksi yang optimum ditunjukan dengan nilai absorbansi yang relatif stabil. Pada saat terjadi reaksi, absorbansi senyawa yang berwarna akan terus meningkat hingga pada waktu tertentu akan diperoleh absorbansi yang stabil. Namun semakin lama waktu pengukuran, ada kemungkinan senyawa

6


berwarna tersebut akan mengalami kerusakan sehingga menyebabkan intensitas warnanya menurun dan absorbansinya juga menurun (Gandjar dan Rohman, 2007). Penentuan operating time pada metode Folin-Ciocalteu untuk penetapan kandungan fenolik total ini dilakukan selama 60 menit. Absorbansi larutan diukur setiap 5 menit pada panjang gelombang teoritis (750 nm). Absorbansi yang diperoleh selama 60 menit kemudian dilihat pada menit keberapa menghasilkan absorbansi yang cenderung stabil atau selisihnya kecil. Operating time yang didapat untuk penetapan kandungan fenolik total adalah 30 menit. Pada waktu tersebut diperoleh nilai absorbansi yang stabil. Penentuan panjang gelombang maksimum bertujuan untuk mendapatkan nilai serapan maksimum dari hasil reaksi antara asam galat dengan reagen FolinCiocalteu. Pengukuran suatu analit harus pada panjang gelombang maksimum karena pada panjang gelombang maksimum kepekaannya tinggi, sehingga perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi adalah paling besar (Gandjar dan Rohman, 2007). Pada panjang gelombang maksimum digunakan tiga tingkat konsentrasi yaitu rendah (40 µg/mL), sedang (60 µg/mL), tinggi (80 µg/mL). Tujuan dilakukan scanning pada tiga tingkat konsentrasi yang berbeda adalah untuk mempresentasikan panjang gelombang maksimum pada tiap konsentrasi. Pengukuran lambda maksimum dilakukan pada rentang panjang gelombang 600-800 nm. Panjang gelombang maksimum yang digunakan adalah 735 nm. Hasil yang diperoleh dari scanning panjang gelombang maksimum menunjukan hasil yang berbeda dengan lambda maksimum teoritis. Hal ini dapat disebabkan oleh beberapa hal antara lain jenis pelarut, pH larutan, suhu, konsentrasi tinggi, dan zat-zat penganggu (Gandjar dan Rohman, 2007). Penetapan kandungan fenolik total dimulai dengan membuat kurva baku asam galat. Asam galat digunakan sebagai standar kurva baku karena asam galat merupakan senyawa polifenol yang dapat menggambarkan senyawa fenolik dalam suatu sampel. Tidak semua persamaan regresi linier digunakan dalam menentukan kandungan fenolik total. Persamaan regresi dengan linearitas terbaik (nilai R

7


mendekati 1) akan digunakan untuk menentukan kandungan fenolik total. Tabel I berikut ini menunjukkan hasil pengukuran absorbansi kurva baku asam galat yang digunakan. Tabel I. Hasil pengukuran absorbansi kurva baku asam galat replikasi 3 Konsentrasi

Absorbansi

40,4 µg/Ml

0,369

50,5 µg/mL

0,424

60,6 µg/mL

0,492

70,7 µg/mL

0,587

80,8 µg/mL

0,622

Persamaan regresi A = 0,0974 B = 0,00662 r = 0,9924 y = 0,00662x 0,0974

Persamaan yang digunakan dalam menentukan kandungan fenolik total adalah persamaan regresi dari replikasi ketiga, yaitu y = 0,00624x + 0,0974 dengan linearitas sebesar 0,9924. Nilai linearitas menunjukan korelasi antara konsentrasi dan absorbansi yang dihasilkan. Semakin baik nilai linearitas (nilai R sama dengan 1 atau mendekati 1) maka korelasinya juga semakin baik. Uji kandungan fenolik total bertujuan untuk mengetahui jumlah fenol yang terdapat pada sampel. Uji kandungan fenolik total dilakukan dengan menggunakan metode Folin-Ciocalteu. Kompleks biru yang terbentuk terjadi karena reaksi oksidasi reduksi dari fenolat senyawa uji dengan pereaksi fenol Folin-Ciocalteu. Dimana oksidasi dari senyawa fenol oleh reagen molibdotungstat akan membentuk kompleks berwarna biru di sekitar panjang gelombang 745-750 nm (Ronald, et al., 2005). Adapun reaksi yang terjadi sebagai berikut:

Gambar 1. Reaksi reagen Folin-Ciocalteu dengan senyawa fenol

8


Tabel II. Hasil penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada Kandungan

Rata-rata

Fenolik total

SD

Konsentrasi

Absorbansi

Replikasi 1

200 µg/mL

0,270

130,5

Replikasi 2

200 µg/mL

0,269

129,5

Replikasi 3

200 µg/mL

0,285

141,5

133,83 ± 5,4365

% CV

4,0622 %

Tabel II menunjukan hasil pengukuran sampel uji pada penetapan kandungan fenolik total. Absorbansi sampel yang diperoleh kemudian dimasukkan ke dalam persamaan regresi linier yang telah didapatkan. Hasil perhitungan menunjukan bahwa fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada memiliki nilai kandungan fenolik total sebesar 133,83 ± 5,4365 mg ekivalen asam galat. Radikal bebas dan peroksidasi lemak dalam tubuh dapat menyebabkan penyakit degeneratif seperti kanker, atherosklerosis dan inflamasi, dengan adanya senyawa antioksidan kecepatan peroksidasi lemak dapat dikurangi (Thitilertdecha, et al.,1999). Salah satu metode penentuan aktivitas antioksidan adalah metode FTC (Ferri-tiosianat) yang mengukur jumlah peroksida pada tahap awal peroksidasi lemak (Aris, et al., 2009). Pada metode FTC, asam linoleat yang digunakan sebagai sumber peroksida. Peroksida yang terbentuk akan bereaksi dengan FeCl2 untuk membentuk ion Fe3+ yang kemudian bereaksi dengan ammonium tiosianat (SCN) membentuk kompleks ferri-tiosianat (Fe(SCN)3) berwarna merah yang dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang teoritis 500 nm. Adapun reaksi yang terjadi sebagai berikut

Gambar 2. Reaksi pembentukan kompleks Fe3+-tiosianat dari kompleks Fe2+ tiosianat oleh hidroperoksida (Moon dan Shibamoto, 2009) Beberapa penelitian umumnya menggunakan metode FTC untuk mengukur jumlah peroksida pada tahap awal peroksidasi lipid dilanjutkan dengan penggunaan metode TBA (thiobarbituric acid) untuk mengukur jumlah peroksida

9


pada tahap kedua peroksidasi lipid dan mengukur radikal bebas yang ada setelah oksidasi peroksida (Aqil, et al., 2006; Rezaeizadeh, et al., 2011). Penentuan operating time pada uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC dilakukan dengan menggunakan antioksidan sintesis yaitu Butylated hydroxyrotoluene (BHT) sebagai kontrol positif yang diukur selama 10 menit, dengan waktu pengukuran pada menit ke- 1,3, 5, 7, dan 10 secara triplo. Pengukuran

dilakukan menggunakan spektrofotometri UV-Vis pada panjang

gelombang teoritis yaitu 500 nm (Aris, et al., 2009). Dari pengukuran diperoleh operating time untuk metode FTC adalah 5 menit, yang ditunjukkan dengan nilai absorbansi yang stabil. Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan bertujuan untuk mendapatkan daerah serapan maksimum. Pada uji aktivitas antioksidan metode FTC dilakukan dengan menggunakan tiga kali pengukuran yang diukur pada rentang 400-600 nm.

Lambda yang dipilih adalah pengukuran ketiga yang

absorbansinya paling besar yaitu 488,5 nm dengan absorbansi sebesar 1,222. Uji aktivitas antioksidan dengan metode FTC (Ferric Thiocyanate) dilakukan pengukuran selama beberapa hari hingga kontrol negatif menunjukkan absorbansi maksimum yang ditunjukan dengan larutan berwarna merah yang diakibatkan oleh pembentukan kompleks ferri-tiosianat yang semakin pekat. Hal ini menunjukan bahwa proses peroksidasi lipid asam linoleat sudah berjalan secara maksimal. Pengukuran absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan sampel dilakukan selama 7 hari dengan rentang waktu pembacaan sampel setiap 24 jam. Absorbansi maksimal kontrol negatif dicapai pada hari keenam yang menandakan semakin banyak peroksida atau radikal bebas yang terbentuk.

10


2,4

Absorbansi

2,2 2,0 1,8

kontrol negatif

1,6

kontrol positif

1,4

sampel

1,2 1,0 1

2

3

4

5

6

7

Hari keGambar 3. Profil kenaikan rata-rata absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada.

Hasil yang diperoleh menunjukkan kesesuaian dengan mekanisme reaksi di mana nilai absorbansi kontrol negatif lebih tinggi dibandingkan nilai absorbansi kontrol positif dan sampel. Hal tersebut disebabkan karena tidak ada senyawa antioksidan pada kontrol negatif yang dapat menghambat proses peroksidasi lipid, sehingga ion Fe3+ yang terbentuk semakin banyak dan menyebabkan warna merah akibat pembentukan kompleks ferri-tiosianat lebih pekat dibandingkan kontrol positif yang berisi BHT (kontrol positif) dan sampel yang berisi fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada. Pengukuran dilakukan pada hari keenam, saat proses proksidasi lipid sudah berjalan secara maksimal. Tabel III. Perhitungan % inhbisi berdasarkan absobansi hari ke-6

Kontrol positif

Sampel

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

Absorbansi

% inhibisi

1,952 1,965 1,955 2,094 2,068 2,084

10,989 10,397 10,853 4,514 5,699 4,970

Rata-rata ± SD % inhibisi

% CV

10,746 ± 0,310

2,885

5,061 ± 0,598

11,816

Dari hasil perhitungan persen inhibisi diketahui bahwa kontrol positif, menunjukan nilai % inhibisi yang lebih besar dibandingkan fraksi etil asetat ekstrak metanol daun Lada, yaitu sebesar (10,746 ± 0,310) % , sementara fraksi etil asetat ekstrak metanol daun Lada sebesar (5,061 ± 0,598)%. Secara statistik

11


nilai persen inhibisi kedua sampel tersebut berbeda bermakna (P<0,05). Hal ini menunjukan bahwa fraksi etil asetat ekstrak metanol daun Lada kurang mampu menghambat peroksidasi yang terbentuk jika dibandingkan dengan kontrol positif (BHT). Meskipun demikian ekstrak metanol daun Lada tetap memiliki akivitas antioksidan yang ditunjukan dengan nilai absorbansi yang lebih kecil dibandingkan kontrol negatif. Pada hari kedelapan setelah pengujian aktivitas antioksidan dengan metode FTC dilakukan penegasan dengan menggunakan metode TBA (Thiobarbituric Acid) untuk mengukur nilai MDA, yang merupakan produk oksidasi sekunder yang terbentuk setelah tahap pertama peroksidasi lipid. Pada tahap kedua peroksidasi lipid, asam linoleat yang sudah banyak terbentuk menjadi radikal terkomposis menjadi senyawa yang lebih sederhana dan relatif stabil, yaitu MDA (malondialdehida). Malondialdehida digunakan sebagai biomarker untuk mengetahui tahap akhir peroksida lipid. Prinsip metode ini adalah pengukuran serapan dengan spektrofotometer dari reaksi MDA dengan asam tiobarbiturat yang berwarna merah muda pada panjang gelombang 532 nm. Adapun reaksi yang terjadi sebagai berikut:

Gambar 4. Reaksi pembentukan kompleks MDA-TBA (Moon dan Shimbamoto, 2009)

Pada hari ketujuh, jumlah peroksida yang terbentuk sudan menurun yang ditunjukan dengan menurunnya nilai absorbansi kontrol positif. Hal ini disebabkan karena sudah mulai terbentuknya senyawa MDA dari asam linoleat sehingga pengukuran TBA dilakukan pada hari kedelapan.

12


Tabel IV. Aktivitas antioksidan sampel (fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada) dengan metode TBA Absorbansi

% Inhibisi

Kontro negatif

1,001 ± 0,004

0

Kontrol positif

0,168 ± 0,009

83,217 ± 0,888

0,069 ± 0,022

93,19 ± 2,245

Fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada

Tabel IV menunjukan bahwa nilai absorbansi persen inhibisi fraksi etil asetat ekstrak metanol daun Lada terhadap MDA lebih besar dibandingkan kontrol positif (BHT). Nilai persen inhibisi fraksi etil asetat ekstrak metanol daun Lada sebesar (93,19 ± 2,245) %, sedangkan nilai persen inhibisi kontrol positif (BHT) sebesar (83,217 ± 0,888) %. Hal tersebut menunjukan bahwa pada tahap kedua peroksidasi lipid, aktivitas penghambatan radikal bebas oleh fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada lebih besar dibandingkan pada tahap pertama peroksidasi lipid. 4. Kesimpulan dan Saran Kandungan fenolik total per gram sampel pada fraksi etil asetat ekstrak metanol daun Lada sebesar 133,83 ± 5,4365 mg ekivalen asam galat. Aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada yang dinyatakan dalam persen inhibisi untuk metode FTC dan metode TBA berturut-turut sebesar (5,061 ± 0,598)%, (93,19 ± 2,245)%. Saran untuk penelitian selanjutnya perlu dilakukan penambahan jumlah replikasi sampel untuk mengatasi masalah ketidakakuratan pembacaan absorbansi dengan metode FTC akibat kelemahan dalam pembentukan kompleks warna. Selain itu perlu dilakukan penelitian lain dengaan menggunakan metode DPPH untuk mengatahui senyawa yang terkandung dalam daun lada, yang berperan dalam penghambatan lipid peroksida.

13


Daftar Pustaka Andersen, O.M., Markham, K.R., 2006, Flavonoids: Chemistry, Biochemistry, and Application, Taylor & Francis Group, London, P.2. Aris, S. R. S., Mustafa,S., Ahmat, N., Jaafar, F.Moh. & Ahmad, R, 2009, Phenolic Content and Antioxidant Activity of Fruit Ficus dettoidea var, Angustifolis sp., The Malaysian Journal of Analytical Sciences, 13 (2), Pp. 146-150. Artini, P. E. U. D., Astuti, K. W., Warditiani, N. K., 2013, Uji Fitokimia Ekstrak Etil Asetat Rimpang Bangle (Zingiber purpureum Roxb.) Jurnal Farmasi Udayana, Indonesia. Blanski, A., Lopes,G.C., and De Mello, J. C. P., 2013, Application and Analysis of the Follin Ciocalteu Method for Determination of the Total Phenolic Content from Limonium brasiliense L., Molecules,18, Pp. 6852-6865. Cicco, N., and Lattanzio, V., 2011, The Influence of Initial Carbonate Concentration on the Folin-Ciocalteu Micro-Method for the Determination of Phenolic with Low Concentration in the Presence of Methanol: A Comparative Study of Real-Time Monitored Reactions, Am. J. Anal. Chem., Pp.840-845. Cowan, M.M., 1999, Plant Products as Antimicrobial Agents, Clinical Microbiology Review,Vol.12, No. 4, Pp.564-582. Dodson, C. D., Dyer, L. A., Searcy, J., Wright, Z., and Letoumeau, D. K., Cenocladamide: A Diydropyridone Alkaloid from Piper Cenocladum, Phytochemistry, Vo. 53, pp. 51-54.

2000,

Gandjar, I. G., Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, Hal.220-265. Huang, Y. W., Cai, Z. Y., 2010, Natural Phenolic Compounds From Medicina Herbs and Ditary Plants: Potenttial Use for Cancer Prevention, Nutrion and Cancer, Pp. 1-2. Kamboj, A., Rana, A., Kaur, R., Jain, U., 2015, Application and Analysis of the Follin Ciocalteu Method for the Determination of the Total Phenolic Content from Leaves, Stems and Seeds of Cucumis sativus L., Journal of Pharmacy Research, Pp.323-329. Moon, J.K., Shibamoto, T., 2009, Antioxidant Assays for Plant and Food Components, J. Agric. Chem., Vol. 57, Pp.1655-1666. Muhtadi, Hidayati, A.L., Suhendi, A., Sudjono, T.A., Haryanto., 2014, Pengujian Daya Antioksidan Dari Beberapa Ekstrak Kulit Buah Asli Indonesia dengan Metode FTC, Simposium Nasional RAPI XIII, Hal.1-9. Nahak dan Sahu, 2011, Phytochemical Evaluation and Antioxidant Activity Piper nigrum, Journal of Applide Pharmaceutical Science, pp. 153-157.

14

of


Prakash, A., 2001, Antioxidant Activity, Takes you into the Heart of a Vol 19, No.2, Pp. 1-2.

Giant Resource,

Ronald, L., Piror, Wu, X., and Schaica, K., 2005, Standardized Methods for the Determination of Antioxidant Capacity and Phenolics in Food and Dietary Supplemnts, J. Agr. Food Chem., Pp. 4290-4302 Sochor, J., Zitaka, O., Skutkova, H., Pavlik, D., Babula, P., Krska, B., Homan, A., Adam, V., Provaznik, I., and Kizek, R., 2010, Content of phenolic Compounds and Antioxidant Capacity in Fruits of Apricot Genotypes, Molecule, pp. 62856305. Thitilertdecha, N., Teerawutgulrag, A., and Rakariyatham, N., 2010, Identification of Major Phenolic Compound from Nephelium lappaceum L. and Their Antioxidant Activities, Molecules, 15, Pp. 1453-1465. Winasari, H., 2011, Antioksidan alami & radikal bebas, Penerbit Kanisius, Yogyakarta, hal.71-76.

15


LAMPIRAN

16


Lampiran 1. Surat Determinasi Tanaman

17


Lampiran 2. Klasifikasi Tanaman Lada (Piper nigrum L.) Menurut United States Departement of Agriculture klasifikasi dari tanaman lada, yaitu: Kerajaan

: Plantae

Sub kerajaan

: Tracheobionta

Super divisi

: Spermatophyta

Divisi

: Magnoliophyta

Kelas

: Magnoliopsida

Sub kelas

: Magnoliidae

Ordo

: Piperales

Suku

: Piperaceae

Genus

: Piper L.

Spesies

: Piper nigrum L.

Lampiran 3. Perhitungan Pentapan Kadar Air Daun Lada Kadar Air Simplisia =

Keterangan Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

Berat Simplisia (g) Awal Akhir 5.019 4.659 5.020 4.643 5.018 4.638

Replikasi 1 Kadar Air Simplisia = =

7,173%


7,509 %

18

Kadar Air (%)

Rata-Rata

7,173 7,509 7,573

7,418



7,573 %

Lampiran 4. Perhitungan rendemen ekstrak dan fraksi a. Ekstrak metanol daun lada Bobot simplisia yang digunakan Bobot cawan kosong Bobot cawan + ekstrak Bobot ekstrak

Bobot (gram) 31,509 80,3737 81,5782 1,2247

% rendemen ekstrak = % rendemen ekstrak =

x 100 = 3,886%

b. Fraksi etil asetat daun lada Bobot simplisia yang digunakan Bobot cawan kosong Bobot cawan + fraksi etil asetat Bobot fraksi etil asetat

Bobot (gram) 31,509 22,3606 22,5707 0,2101

% rendemen fraksi = % rendemen fraksi =

Lampiran 5. Data penimbangan untuk penetapan kandungan fenolik total a. Penimbangan asam galat 1. Asam galat untuk operating time Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 (gram) (gram) (gram) Bobot bekker 63,7284 61,4635 62,1535 Bobot bekker + zat 63,7385 61,4735 62,1636 Bobot zat 0,0101 0,0100 0,0101 b. Penimbangan fraksi etil asetat Replikasi 1 (gram) 19

Replikasi 2 (gram)

Replikasi 3 (gram)


Bobot bekker 61,7794 Bobot bekker 61,7894 + zat Bobot fraksi 0,01

61,5234 61,5334

61,6027 61,6127

0,01

0,01

Lampiran 6. Data perhitungan konsentrasi asam galat dan fraksi etil asetat untuk penetapan kandungan fenolik total a. Contoh perhitungan konsentrasi asam galat Bobot asam galat replikasi 1 = 0,0101g = 10,1 mL Konsentrasi larutan stok asam galat =

= 1010 µg/mL

Perhitungan seri konsentrasi replikasi 1 Seri 1 : V1 . C1 = V2 . C2 0,4 mL . 1010 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 40,4 µg/mL

Seri 2 : V1 . C1 = V2 . C2 0,5 mL . 1010 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 50,5 µg/mL Seri 3 : V1 . C1 = V2 . C2 0,6 mL . 1010 µg/mL = 10mL . C2 C2 = 60,6 µg/m Seri 4 : V1 . C1 = V2 . C2 0,7 mL . 1010 µg/mL = 10mL . C2 C2 = 70,7 µg/mL

20


Seri 5 : V1 . C1 = V2 . C2 0,8 mL . 1010 µg/mL = 10 mL . C2 C2 = 80,8 µg/mL Seri 1 Seri 2 Seri 3 Seri 4 Seri 5

Replikasi 2 40 µg/mL 50 µg/mL 60 µg/mL 70 µg/mL 80 µg/mL

Replikasi 3 40,4 µg/mL 50,5 µg/mL 60,6 µg/mL 70,7 µg/mL 80,8 µg/mL

b. Contoh perhitungan konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada. Bobot fraksi etil asetat replikasi 1 = 0,0100 gram = 1000 µg/mL Pengenceran fraksi etil asetat replikasi 1 V1 . C1 = V2 . C2 2 mL . 1000 µg/mL = 10mL . C2 C2 = 200 µg/mL Replikasi 2 200 µg/mL

Konsentrasi fraksi

21

Replikasi 3 200 µg/mL


Lampiran 7. Hasil optimasi operating time untuk penetapan kandungan fenolik total a.

Replikasi 1

Menit ke-

Absorbansi pada panjang gelombang 750 nm 40 µg/mL 60 µg/mL 80 µg/mL 5 0,341 0,401 0,574 10 0,366 0,482 0,607 15 0,376 0,528 0,626 20 0,382 0,545 0,635 25 0,385 0,549 0,640 30 0,386 0,551 0,640 35 0,386 0,550 0,640 40 0,386 0,551 0,639 45 0,386 0,549 0,639 50 0,386 0,552 0,639 55 0,385 0,533 0,638 60 0,385 0,533 0,638 Pada replikasi 1, operating time yang didapat menit ke 30 b. Replikasi 2

Absorbansi pada panjang gelombang 750 nm Menit ke 40 µg/ml 60 µg/ml 80 µg/ml 5 0.344 0.408 0.581 10 0.368 0.490 0.610 15 0.377 0.532 0.627 20 0.384 0.544 0.636 25 0.386 0.549 0.640 30 0.386 0.548 0.641 35 0.387 0.548 0.640 40 0.386 0.549 0.640 45 0.386 0.549 0.640 50 0.386 0.550 0.639 55 0.385 0.537 0.638 60 0.385 0.546 0.638 Pada replikasi 2 operating time yang didapat menit ke 30

22


c. Replikasi 3 Absoorbansi pada panjang gelombang 750 nm Menit ke 40 µg/mL 60 µg/mL 80 µg/mL 5 0.345 0.406 0.581 10 0.362 0.487 0.606 15 0.379 0.529 0.633 20 0.387 0.535 0.650 25 0.399 0.538 0.653 30 0.402 0.544 0.664 35 0.404 0.543 0.664 40 0.414 0.543 0.661 45 0.418 0.544 0.659 50 0.420 0.543 0.665 55 0.423 0.544 0.667 60 0.425 0.544 0.665 Pada replikasi 3 operating time yang didapat menit 30 Lampiran 8. Optimasi panjang gelombang maksimum untuk penetapan kandungan fenolik total a. Konsentrasi 40 µg/m

23


b. Konsentrasi 60 µg/m

24


c. Konsentrasi 80 µg/mL

25


Lampiran 9. Hasil pengukuran kurva baku untuk penetapan kandungan fenolik total a. Replikasi 1 Seri 1 2 3 4 5

Konsentrasi 40,4 µg/mL 50,5 µg/mL 60,6 µg/mL 70,7 µg/mL 80,8 µg/mL

Absorbansi 0,349 0,430 0,499 0,606 0,620

Persamaan kurva baku A = 0,07 B = 0,00711 r = 0,9831 y = 0,00711x + 0,07

b. Replikasi 2 Seri 1 2 3 4 5


Absorbansi 0,390 0,419 0,484 0,569 0,624

26



b. Replikasi 3 Seri 1 2 3 4 5


Absorbansi 0,369 0,424 0,492 0,587 0,622


Lampiran 10. Perhitungan kandungan fenolik total fraksi etil asetat

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

Konsentrasi

Absorbansi

200 µg/mL 200 µg/mL 200 µg/mL

0,270 0,269 0,285

Kandungan Rata-rata Fenolik total 130,5 133,83 ± 5,4365 129,5 141,5

Contoh perhitungan kandungan fenolik total: a. Replikasi 1 y = 0,00662x + 0,0974 0, 270 = 0,00662x + 0,0974 x = 0, 270- 0,0974/0,00662 = 26,0725 µg/mL x = 0,0260725 mg/mL  0,0261mg/mL bobot fraksi = 0,0100 gram b. Replikasi 2 y = 0,00662x + 0,0974 0,269 = 0,00662x + 0,0974 x = 0, 269- 0,0974/0,00662 = 25,9214 µg/mL = 0,0259214 mg/mL  0,0259 mg/mL Bobot fraksi = 0,0100 gram

c. Replikasi 3 y = 0,00662x + 0,0974 0,285 = 0,00662x + 0,0974x x = 0, 285- 0,0974/0,00662

27

% CV 4,0622 %


= 28,3384 µg/mL = 0,0283384 mg/mL  0,0283 mg/mL Bobot fraksi = 0,0100 gram Rumus perhitungan kandungan fenolik total Kandungan fenolik total = x

a. Replikasi 1 Kandungan fenolik total

= 0,0261 x 50/0,0100 = 130,5 mg/gram Jadi, kandungan fenolik total dalam sampel replikasi 1 sebesar 130,5 mg asam galat ekuivalen per gram fraksi etil asetat.

b. Replikasi 2 Kandungan fenolik total

= 0,0259 x 50/0,0100 = 129,5 mg/gram Jadi, kandungan fenolik total dalam sampel replikasi 1 sebesar 129,5 mg asam galat ekuivalen per gram fraksi etil asetat.

c. Replikasi 3 Kandungan fenolik total

= 0,0283 x 50/0,0100 = 141,5 mg/gram Jadi, kandungan fenolik total dalam sampel replikasi 1 sebesar 141,5mg asam galat ekuivalen per gram fraksi etil asetat.

Lamiran 11. Data Penimbangan untuk Uji Aktivitas Antioksidan Metode FTC-TBA a. Penimbangan BHT untuk Optimasi Metode OT (gram)

Lamda (gram) Replikasi 1

Replikasi 2

Replikasi 3

Berat Cawan Kosong

63.0377

61.5081

61.7617

63.6569

Berat Cawan + sampel

63.0418

61.5122

61.7657

63.6609

Berat Sampel

0.0041

0.0040

0.0040

0.0040

28


b. Penimbangan Sampel Uji BHT

Replikasi 1

Replikasi 2

Replikasi 3

(gram)

(gram)

(gram)

(gram)

Berat Cawan Kosong

62.4275

27,9617

27,2143

20,6965

Berat Cawan + sampel

62.4316

27,9657

27,2183

20,7005

0.0041

0,0040

0.0040

0.0040

Berat Sampel

Lampiran 12. Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan FTC-TBA a. Penentuan Operating Time (OT) Hasil OT, CBHT = 4 mg Absorbansi (Triplo)

OT (Menit ke)

Pengukuran 1

Pengukuran 2

Pengukuran 3

1

0.985

0.959

0.948

3

0.918

0.907

0.899

5

0.875

0.875

0.874

7

0.864

0.862

0.860

10

0.855

0.853

0.853

29


b. Penentuan Lamda max Replikasi 1

30


Replikasi 2

31


Replikasi 3

32


Lampiran 13. Perhitungan Persen Inhibisi Uji Aktivitas Antioksidan FTCTBA a. Nilai absorbansi kontrol negatif, kontrol positif dan sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada Hari ke1 2 3 4 5 6 7

R1 1,604 1,729 2,081 2,135 2,157 2,157 1,959

Kontrol (-) R2 R3 1,587 1,599 1,716 1,722 2,057 2,065 2,145 2,168 2,194 2,208 2,159 2,263 1,946 1,945

R1 1,457 1,474 1,927 1,933 1,955 1,952 1,749

Kontrol (+) R2 R3 1,426 1,466 1,495 1,470 1,930 1,939 1,935 1,949 1,942 1,954 1,965 1,955 1,889 1,885

R1 1,381 1,560 1,764 1,901 1,950 2,094 1,853

Sampel R2 1,372 1,545 1,750 1,931 1,936 2,068 1,860

R3 1,364 1,556 1,773 1,931 1,959 2,084 1,878

Berdasarkan hasil pengukuran absorbansi kontrol negatif dengan spektrofotometer UV/Vis maka dapat disimpulkan bahwa pada hari ke-6 reaksi peroksidasi lipid telah mencapai batas maksimum. b. Profil absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan asetat ekstrak metanol daun lada Hari Rata-rata ± SD Rata-rata ± SD %CV %CV keKontrol (-) Kontrol (+) 1 1,597 ± 0,009 0,563 1,450 ± 0,021 1,488 2 1,722 ± 0,007 0,406 1,480 ± 0,013 0,878 3 2,068 ± 0,012 0,580 1,932 ± 0,006 0,310 4 2,149 ± 0,017 0,791 1,939 ± 0,009 0,464 5 2,186 ± 0,026 1,189 1,950 ± 0,007 0,359 6 2,193 ± 0,061 2,781 1,957 ± 0,007 0,357 7 1,950 ± 0,008 0,410 1,841 ± 0,080 4,345

33

sampel fraksi etil Rata-rata ± SD Sampel 1,372 ± 0,009 1,554 ± 0,008 1,762 ± 0,012 1,921 ± 0,017 1,948 ± 0,012 2,082 ± 0,013 1,864 ± 0,013

%CV 0,678 0,515 0,681 0,885 0,616 0,624 0,697


c.

Grafik rata-rata absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada selama 7 hari Grafik Rata-rata Absorbansi Kontrol Negatif, Kontrol Positif, dan Sampel

Absorbansi

2,500 2,000 1,500 kontrol negatif 1,000

kontrol positif

0,500

sampel

0,000 1

2

3

4

5

6

7

Hari ked. Perhitungan % inhibisi berdasarkan data absorbansi hari ke-6 Rata-rata absorbansi kontrol negatif hari ke-6 = 2,193 Rumus Perhitungan: Persen Inhibisi

=

( A0 – A1 / A0 ) x 100% Absorbansi

Kontrol positif

Sampel

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

1,952 1,965 1,955 2,094 2,068 2,084

% inhibisi

Rata-rata ± SD % inhibisi

% CV

10,746 ± 0,310

2,885

5,061 ± 0,598

11,816

10,989 10,397 10,853 4,514 5,699 4,970

Contoh perhitungan nilai % inhibisi sampel replikasi 1 hari ke-6 1. Kontrol positif Persen inhibisi

= =

10,895 %

2. Sampel

34


Persen inhibisi

=

= 4,514 %

e. Grafik rata-rata nilai % inhibisi kontrol positif dan sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada Nilai % Inhibisi Kontrol Positif dan Sampel

Rata-rata % inhibisi sampel Rata-rata % inhibisi kontrol positif

0

2

4

6

8

10

12

% Inhibisi Lampiran 14. Hasil pengukuran uji aktivitas antioksidan dengan metode TBA a. Nilai absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan sampel fraksi etil asetat daun lada. Absorbansi kontrol (-) R.1 R.2 R.3 1,000 1,005 0,998

Absorbansi kontrol (+) R.1 R.2 R.3 0,178 0,165 0,161

Absorbansi Sampel R.1 R.2 R.3 0,074 0,088 0,044

b. Profil absorbansi kontrol negatif, kontrol positif, dan sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada Rata-rata ± SD Kontrol negatif Kontrol positif Sampel 1,001 ± 0,004 0,168 ± 0,009 0,069 ± 0,022 c. Perhitungan nilai % inhibisi dengan metode TBA % inhibisi = (A0-A1/A0) x 100% d. Contoh perhitungan nilai % inhibisi sampel replikasi 1: Persen inhibisi

=

(

)

35

= 83,217 %


Absorbansi Kontrol Abs Negatif Rep 1 1,001

0,178

% inhibisi

Kontrol positif Abs % Rep 2 inhibisi

Abs Rep 2

% inhibisi

82,218

0,165

0,161

83,916

83,516

Absorbansi Sampel fraksi etil asetat ekstrak metanol daun lada Kontrol Abs % Abs % Abs % Negatif Rep 1 inhibisi Rep 2 inhibisi Rep 2 inhibisi 1,001

0,074

92,607

0,088

91,209

36

0,044

95,604

Ratarata ± SD % Inhibisi 83,217 ± 0,888 Ratarata ± SD % Inhibisi 93,19 ± 2,245


Lampiran 15. Gambar-gambar Proses Penelitian Lampiran 1. Proses Pembuatan Simplisia Daun Lada a. Proses pencucian daun lada

b.

Proses penyerbukan daun lada

37


c. Proses pengayakan daun Lada

d. Uji kadar air

38


Lampiran 2. Proses pembuatan fraksi etil-asetat ekstrak metanol daun Lada 1. Proses penguapan dengan menggunakan vacuum rotary evaporator

2. Ekstrak metanol daun Lada

39


3. Pemisahan antara air dan etil asetat

Lapisan etil asetat

Lapisan air

4. Uji pendahuluan penetapan kandungan fenolik total dengan metode folin-ciocalteu.

A

B

C

40


Keterangan A = kontrol negatif (metanol : air (1:1) + reagen Folin-Ciocalteau + Na2CO3) B = Kontrol positif (asam galat + reagen Folin-Ciocalteau + Na2CO3) C = Sampel (fraksi etil asetat ekstrak metanol daun Lada + reagen Folin-Ciocalteau + Na2CO3) 5. Asam galat

6. Hasil penetapan kandungan fenolik total replikasi

Replikasi 1

Replikasi 2

41

Replik


Lampiran 3. Uji Aktivitas Antioksidan Dengan Metode FTC-TBA 1. Pengukuran menggunakan metode FTC selama 7 hari



Relikasi 1

Replikasi 2

Replikasi

42





43


Replikasi 1 Replikasi 2

Replikasi 3

2. Pengukuran TBA pada hari ke delapan

Sampel replikasi 1

Sampel replikasi 2 Sampel replikasi 3


44


BIOGRAFI PENULIS Penulis lahir di Tanjung Kerja pada tanggal 21 Juni 1994. Penulis memiliki seorang ayah bernama Kolenius Kolai dan seorang ibu bernama Emma, serta seorang kakak bernama Maria Magdalena. Penulis menyelesaikan pendidikan dasar di SDN. 09 Banua Tengah pada tahun

2006. Setelah itu, penulis

melanjutkan pendidikan menengah di SMP Karya Budi Putussibau pada tahun 2006 hingga 2009, SMA Karya Budi Putussibau pada tahun 2009 hingga 2012. Penulis kemudian melanjutkan di Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta dari tahun 2012 hingga 2016. Selama menjadi mahasiswa, penulis terlibat dalam beberapa kegiatan kemahasiswaan dan keorganisasian antara lain, kepengurusan UKM Komunitas Jalinan Kasih Mahasiswa Katolik (JKMK) periode 2013-2014 sebagai Co-Humas, penulis aktif sebagai anggota UKF voli Fakultas Farmasi dari tahun 21012-2014. Disamping itu penulis juga aktif dalam berbagai kegiatan kemahasiswaan diantaranya sebagai anggota seksi konsumsi pada Kampanye Informasi Obat tahun 2012, divisi medis pada Festival Sanata Dharma tahun 2015.

45

PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK METANOL DAUN LADA (Piper nigrum L.)

Recommend Documents