PENETAPAN KADAR FLAVONOID DAN FENOLIK EKSTRAK AIR JINTEN HITAM (Nigella sativa L.) DAN UJI SITOTOKSIK PADA SEL KANKER PAYUDARA MCF-7 DARI TIGA DAERAH : HABASYAH, INDIA DAN INDONESIA
NASKAH PUBLIKASI
Oleh :
Apriliana Dwi Sejati K 100 080 070
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA SURAKARTA 2012
1
2
PENETAPAN KADAR FLAVONOID DAN FENOLIK EKSTRAK AIR JINTEN HITAM (Nigella sativa L.) DAN UJI SITOTOKSIK PADA SEL KANKER PAYUDARA MCF-7 DARI TIGA DAERAH : HABASYAH, INDIA DAN INDONESIA
CONCENTRATION OF FLAVONOIDS AND PHENOLIC COMPOUNDS IN AQUEOUS EXTRACT OF BLACK CUMIN (Nigella sativa L.) AND CYTOTOXIC TEST IN BREAST CANCER MCF-7 CELL FROM THREE AREAS : HABASYAH, INDIA AND INDONESIA Apriliana Dwi Sejati, Ika Trisharyanti dan Andi Suhendi Fakultas Farmasi, Universitas Muhammadiyah Surakarta ABSTRAK Jinten hitam (Nigella sativa L.), merupakan tanaman obat yang mengandung senyawa flavonoid dan fenolik yang mempunyai aktivitas antioksidan dan antikanker. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kadar flavonoid dan fenolik ekstrak air Nigella sativa Habasyah, India dan Indonesia dan aktivitas sitotoksik terhadap sel MCF-7. Penetapan kadar flavonoid ekstrak air jinten hitam ditentukan dengan metode Chang. Penetapan kadar fenolik dilakukan dengan metode Folin-Ciocalteu. Uji sitotoksik pada sel MCF-7 dilakukan dengan metode MTT assay. Hasil penelitian menunjukkan ekstrak air jinten hitam Habasyah, India, dan Indonesia mempunyai kadar flavonoid berturut-turut 58,30±1,97 mg/100 gram; 12,90±0,50 mg/100 gram; 3,10±0,15 mg/100 gram. Kadar fenolik hitam 552,10±20,40 mg/100 gram (Habbsyah); 432,50±29,30 mg/100 gram (India); 49,50±2,50 mg/100 gram (Indonesia). Nilai IC50 ekstrak air jinten hitam Habasyah dan India >100 µg/mL. Nilai IC50 ekstrak air jinten hitam Indonesia < 100 µg/mL. Nilai korelasi (R2) kadar flavonoid dan fenolik dengan % sel hidup pada konsentrasi 100 µg/mL dari ekstrak air jinten hitam adalah 0,004; 0,432. Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa ekstrak air jinten hitam Habasyah dan India tidak poten digunakan sebagai agen sitotoksik dan kandungan flavonoid dan fenolik mempengaruhi aktivitas sitotoksik sebesar 0,4% dan 43%. Kata kunci : Nigella sativa L., flavonoid total, fenolik total, aktivitas sitotoksik, sel MCF-7. ABSTRACT Black cumin (Nigella sativa L.), is a medicinal plant that has antifungal activity antimicrobial, analgesic, antipyretic, antioxidant and anticancer. This relates to the content of a variety of compounds including, flavonoid and phenolic. This research was conducted to examine the concentration of flavonoid and phenolic compound in aqeuos extrac of Nigella sativa from three regional Habasyah, India and Indnesia and cytotoxic actvity in MCF-7 cell. Concentration of flavonoid compound were determineted by colorimetri Chang method. Concentration if phenolic compound were determineted by Folin-Ciocalteu method. Cytotoxic test determinated by MTT method. The results showed that the aqeuos extrac of Nigella sativa from three regional Habasyah, India and Indnesia have concentraton of flavonoid 58,30 ± 1,97 mg/100 gram; 12,90 ± 0,500 mg/100 gram; 3,10 ± 0,15 mg/100 gram. 1
Concentration of phenolic 552,10 ± 20,40 mg/100 gram (Habbsyah); 432,50 ± 29,30 mg/100 gram (India); 49,50 ± 2,50 mg/100 gram (Indonesia). Aqeuos extrac of Nigella sativa from Habasyah and India showed no cytotoxic activity because IC50 value >100 µg/mL. Aqeuos extrac of Nigella sativa from Indonesia showed IC50 value < 100 µg/mL. Corelatin value (R2) between concentration of flavonoid and phenolic with for aqeuos extrac from three areas Habasyah, India and Indonesia is 0,004; 0,432. Based on the research results can be concluded that water extract of black cumin Habashah and India are not used as a potent cytotoxic agent and the content of flavonoids and phenolic affect the cytotoxic activity of 0.4% and 43%. Key word : Nigella sativa Linn., flavonoid, phenolic, cytotoxic test, MCF-7 cell PENDAHULUAN Jinten hitam (Nigella sativa L.) merupakan salah satu tanaman obat yang digunakan untuk mengobati berbagai penyakit. Bijinya dapat digunakan sebagai obat peluruh kentut, abses, rematik, sakit kepala, pencegah muntah, pencahar, pelancar ASI, infeksi saluran kemih, antibiotik, dan lain-lain (Depkes RI, 1995), sebagai sitotoksik dan imunostimulan (Swamy dan Tan, 2000). Jinten hitam mengandung zat berkhasiat diantaranya adalah triglikosida flavonol yang merupakan senyawa flavonoid golongan kuersetin (Merfort et al., 1997) dan senyawa fenolik yaitu asam vanilat, spektra senyawa diidentifikasi dengan menggunakan RP-HPLC (Bourgaou et al., 2007). Senyawa flavonoid dan fenolik merupakan senyawa yang bertanggung jawab atas aktivitas dari suatu tanaman. Senyawa flavonoid mempunyai beberapa aktivitas antara lain antivirus, antiplatelet, anti-alergi, anti-inflamasi, anti-tumor dan antioksidan (Buhler dan Miranda, 2000). Senyawa flavonoid dapat menghambat pertumbuhan sel kanker melalui penghambatan daur sel, pemacuan apoptosis, penghambatan angiogenesis, antiproliferatif, atau kombinasi dari beberapa mekanisme tersebut (Ren et al., 2003). Hasil penelitian menunjukan efek sitotoksik Nigella sativa pada mascytoma cell line (D815), dan sel karsinoma dari hati domba (IC01) (Mbarek et al., 2007), serta pada sel kanker tulang (Shoieb et al., 2002). Senyawa Timokuinon dalam Nigella sativa mempunyai aktivitas sitotoksik pada sel Hela (Yazan et al, 2009). Penelitian Farah dan Begum (2003) menunjukkan ekstrak air jinten hitam mempunyai nilai IC50 940,5 µg/mL terhadap sel kanker MCF-7. Dalam Farmakope, metode spektrofotometri UV-Vis digunakan untuk menetapkan kadar senyawa obat dalam jumlah yang cukup banyak (Gandjar dan Rohman, 2008). Spektroskopi serapan ultraviolet dan serapan sinar tampak merupakan cara tunggal yang paling berguna 2
untuk menganalisis flavonoid dan fenolik (Markham, 1988). Sel MCF-7 merupakan salah satu model sel kanker payudara yang banyak digunakan dalam penelitian. Nigella sativa L. dapat diperoleh dari beberapa daerah diantaranya Habasyah, India dan Indonesia. Perbedaan daerah dari suatu tanaman dapat mempengaruhi kandungan senyawa yang terdapat dalam tanaman tersebut. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kadar flavonoid dan fenolik yang terkandung didalam ekstrak air jinten hitam dari ketiga daerah (Habbsyah, India dan Indonesia) dan melakukan uji sitotoksik terhadap sel MCF-7 untuk mengetahui efek sitotoksik yang dapat dikembangkan sebagai pengobatan.
METODE PENELITIAN Bahan Biji Nigella sativa L. (Habasyah, India dan Indonesia), sel kanker payudara MCF-7 yang diperoleh dari koleksi Laboratorium Patologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada, metanol pro analisis (p.a) (E.Merck), aquadest, AlCl3, asam galat, Reagen Folin-Ciocalteu, sodium carbonat, kuersetin, potasium asetat, kertas saring, alumunium foil, media penumbuh RPMI (Gibcobrl), PBS (Phosphate buffer Saline), Tripsin-EDTA 2,5%, Pelarut DMSO dan larutan MTT. Alat Seperangkat alat-alat gelas (Pyrex), neraca analitik (A&D Co.Ltd.), tangas air, Spektrofotometri UV-Vis (UV Mini SHIMADZU), vaccum rotary evaporator (Heidolph), kuvet kuarsa, vortex, mikropipet (Socorex), yellow tips dan blue tips, oven, inkubator (Binder, tipe inkubator CO2), sentrifuge, Laminar air flow cabinet, autoklaf, hemositometer, handtally counter (Kenko, model HT-302), Tissue culture flask (nunclone), tabung conical (nunclone), mikroskop inverted, ELISA reader (Biotek, tipe Elx800), 96-well plate (nunclone), eppendorf steril (plasti brand) dan kamera digital (Canon). Pengumpulan biji Nigella sativa Sampel yang digunakan dalam penelitian adalah biji Nigella sativa Habasyah dan India yang diperoleh dari importir, dan biji Nigella sativa Indonesia yang didapat dari pasar Gede Solo. Pembuatan ekstrak air biji Nigella sativa Biji Nigella sativa sebanyak 1 kg yang sudah kering diserbuk, ditambah 500 ml air suling diaduk terus menerus selama 30 menit, kemudian disaring dan dipekatkan pada 3
tekanan 400C. 100 gram ekstrak ditambah air suling sebanyak 100 ml didiamkan pada suhu kamar selama 30 menit kemudian ekstrak disaring (Boskabady et al., 2010). Pemeriksaan organoleptis ekstrak air Nigella sativa Pemeriksaan organoleptis pada ekstrak air jinten hitam meliputi warna, rasa dan bau. Penetapan kadar flavonoid Penetapan kadar total senyawa flavonoid dalam sampel ekstrak air Nigella sativa L dengan metode kolorimetri alumunium klorida dengan pengukuran absorbansi secara spektrofotometri (Chang et al., 2002) dengan beberapa modifikasi. Ditimbang 500,0 mg ekstrak air jinten Habasyah, 1 gram ekstrak air jinten India dan 2 gram ekstrak air jinten Indonesia. Masing-masing sampel dilarutkan dengan metanol ad 5 mL, kemudian disaring 2x dengan kertas saring dan filter penyaring ukuran 0,45 µL. Larutan uji diambil 0,800 mL (Habasyah), 0,500 mL (India) dan 2 mL (Indonesia) kemudian direaksikan dengan AlCl3 0,1 mL dan 0,1 mL kalium asetat, sampel disentrifuse selama 10 menit dan didiamkan selama OT 35 menit. Larutan dibaca nilai absorbansinya pada λmaks percobaan 432,5 nm. Masing-masing ekstrak ditetapkan kadarnya sebanyak 3 kali replikasi. Absorbansi rata-rata dimasukkan dalam persamaan kurva baku kuersetin sebagai nilai y, dimana nilai x yang diperoleh merupakan ekuivalensi miligram kuersetin dalam setiap 100 gram sampel (Quercetin Equivalen/ QE). Blangko: 1,4 mL metanol + 0,1 mL AlCl3 10% + 0,1 mL potasium asetat 1 M + aquabidest ad 10,0 mL. Kurva baku kuersetin dibuat dengan melarutkan kuersetin dalam metanol dengan konsetrasi 2,0 µg/mL, 4,0 µg/mL, 6,0 µg/mL, 8,0 µg/mL dan 10,0 µg/mL. Penetapan kadar fenolik Penetapan kadar fenolik dalam sampel ekstrak air Nigella sativa L. menggunakan metode yang dipakai oleh (Chun et al., 2003) dengan beberapa modifikasi. Ketiga ekstrak air jinten hitam, ditimbang masing-masing 100,0 mg ekstrak air jinten Habasyah, 200,0 mg ekstrak air jinten India dan 400,0 mg ekstrak air jinten Indonesia. Masing-masing ekstrak dilarutkan dengan aquabidest ad 10,0 mL, kemudian disaring 2x dengan menggunakan kertas saring dan filter penyaring ukuran 0,45 µl. Sampel yang telah dibuat diambil 0,450 mL (Habasyah), 0,200 mL (India), 0,700 mL (Indonesia) kemudian direaksikan dengan reagen 0,200 mL Folin-Ciocalteu dan 2,0 mL Na2CO3. Diamati absorbansinya pada OT 10 menit dan λ maks percobaan 747,5 nm. Setiap ekstrak ditetapkan kadarnya sebanyak 3 kali replikasi. Absorbansi rata-rata dimasukkan dalam persamaan kurva baku asam galat sebagai nilai y, dimana nilai x yang diperoleh merupakan ekuivalensi miligram asam galat dalam
4
setiap 100 gram sampel (Gallic Acid Equivalen/ GAE). Kurva baku asam galat dibuat pada seri konsentrasi 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, dan 6,0 µg/ml. Uji sitotoksik pada sel MCF-7 Sel didistribusikan ke dalam 96 sumuran dengan jumlah 5000 sel per sumuran dan diinkubasi bersama sampel uji dengan seri kadar 50,0, 100,0, 200,0, 300,0, 400,0, 500,0 µg/mL (ekstrak air Nigella sativa dari tiga daerah Habasyah, India, Indonesia) menggunakan pelarut DMSO selama 24 jam. Ditambahkan 100 µL MTT dalam media RPMI kedalam masing-masing sumuran pada akhir inkubasi. Kemudian diinkubasi lagi selama 4 jam pada suhu 37°C hingga terbentuk kristal formazan. Sel yang hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk kompleks berwarna ungu. Setelah 4 jam reaksi MTT dihentikan dengan menambahkan reagen stopper SDS 10%, 100 µL pada masing-masing sumuran lalu diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam. Serapan dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm. Analisis data Kandungan flavonoid total diperoleh dengan cara memasukkan data absorbansi sampel ke dalam persamaan kurva baku kuersetin, absorbansi digunakan sebagai nilai y dan nilai x sebagai miligram ekuivalensi kuersetin tiap 100 gram sampel (QE/ Quercetin Equivalen). Kandungan fenolik total diperoleh dengan cara memasukkan data absorbansi sampel ke dalam persamaan kurva baku asam galat, absorbansi digunakan sebagai nilai y dan nilai x sebagai miligram ekuivalensi asam galat tiap 100 gram sampel (GAE/ Gallic Acid Equivalen). Analisis data pada uji sitotoksik dilakukan dengan uji sitotoksisitas aplikasi tunggal, dimana data yang didapat dari ELISA Reader berupa hasil absorbansi masing-masing sumuran dikonversikan dalam persen kehidupan sel. Persen kehidupan sel dihitung dengan menggunakan persamaan : % sel hidup = Abs sel dgn perlakuan - Abs kontrol sel Abs kontrol media Abs sel dgn perlakuan Abs kontrol media abs : absorbansi Data yang berupa persen sel hidup kemudian digunakan untuk menghitung IC50 dengan program Microsoft Excel 2007 untuk mendapatkan linearitas antara log konsentrasi dengan persen sel hidup (Untung, 2008). IC50 dihitung dengan cara memasukkan nilai 50 sebagai Y kemudian dihitung konsentrasi ekstrak.
5
Hasil Dan Pembahasan Hasil ekstraksi berupa ekstrak kering berwarna coklat kehitaman. Rendemen ekstrak air jinten hitam dari tiga daerah berturut-turut Habasyah, India, Indonesia 6,52 %, 6,47 %, 2,45 % (tabel 1). Pemeriksaan organoleptis pada ekstrak air jinten hitam dilakukan melalui uji warna, rasa dan bau. Berikut hasil pemeriksaan organoleptis ekstrak air jinten hitam (Tabel 2). Tabel 1. Hasil Ekstraksi Biji Jinten Hitam Daerah
Bobot ekstrak (kilogram ) 5 5 1
Habasyah India Indonesia
Bobot ekstrak (gram) 325,9780 323,6940 122,4850
Rendemen (%) 6,52 6,47 2,45
Tabel 2. Perbedaan Organoleptis Ekstrak Air Jinten Hitam Daerah Habasyah India Indonesia
Warna Coklat kehitaman Coklat kehitaman Coklat
Bau Aromatis Aromatis Aromatis
Rasa Pahit Pahit Pahit
Penetapan kadar flavonoid Analisis kuantitatif senyawa flavonoid total pada ekstrak air jinten hitam dilakukan dengan metode kolorimetri alumunium klorida (Chang et al., 2002). Operating time hasil reaksi antara kuersetin dan AlCl3 pada panjang gelombang referen 415 nm menunjukkan absorbansi yang stabil pada waktu 35 menit. Panjang gelombang maksimal pada penelitian penentuan senyawa flavonoid dalam ekstrak air jinten hitam adalah 432,5 nm. Penentuan kurva baku kuersetin digunakan sebagai standar pada penentuan flavonoid total. Hasil analisis terhadap larutan kuersetin didapatkan kurva baku
dengan persamaan 2
regresi linear Y = 0, 07385x + 0,0159 dan harga koefisen korelasi (R ) 0,996. Persamaan regresi linear menyatakan hubungan antara konsentrasi kuersetin dan absorbansi pada pengukuran menggunakan spektrofotometri UV-Vis. Hasil analisis total kandungan senyawa flavonoid dihitung sebagai ekuivalen kuersetin mg/100 gram sampel. Penelitian menunjukkan kadar flavonoid total rata-rata dari ekstrak air jinten hitam Habasyah mempunyai kadar yang lebih banyak yaitu 58,30 ± 1,97 mg/100 gram, untuk ekstrak air jinten hitam dari India mempunyai kadar rata-rata sebesar 12,90 ± 0,50 mg/100 gram. Ekstrak air jinten hitam Indonesia mempunyai kadar rata-rata 3,10 ± 0,15 mg/100 gram. Penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Samarakoon et al (2010) dengan metode yang sama, menunjukkan kadar flavonoid total ekstrak air jinten sebesar 4,566 ± 6
1,0004 mg QE/100 gram, dari hasil tersebut menunjukkan bahwa ekstrak air jinten hitam mengandung senyawa flavonoid yang dihitung sebagai kuersetin. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak air jnten hitam Habasyah dan India mempunyai kadar flavonoid yang lebih besar dari penelitian Samarakoon et al (2010), sedangkan kadar flavonoid ekstrak air jinten hitam Indonesia mempunyai kadar yang mendekati hasil penelitian Samarakoon et al (2010) yaitu 3,10 ± 0,15 mg/100 gram. Penetapan kadar flavonoid ditetapkan kadarnya dengan menggunakan metode kolorimetri AlCl3 (Chang et al., 2002). Kelemahan dari metode ini adalah tidak dapat mendeteksi semua jenis flavonoid serta tidak dapat digunakan dalam contoh dengan matriks yang kompleks (Chang et al., 2002) sehingga metode ini tidak dapat digunakan untuk menetapkan semua flavonoid yang terdapat dalam ekstrak air jinten hitam. Penelitan Tubesha et al (2011) mengemukakan bahwa ekstrak metanol dari jinten hitam mengandung flavonoid yang dihitung sebagai rutin ekuivalen sebesar 96 ± 0,452 mg/100 gram, dari penelitian tersebut menunjukkan bahwa didalam jinten hitam terdapat flavonoid yang dihitung sebagai rutin. Flavonoid yang terkandung dalam jinten hitam adalah triglikosida flavonol yang merupakan senyawa flavonoid golongan kuersetin (Merfort et al., 1997) dan rutin. Flavonoid yang terkandung dalam tempuyung yang diambil dari tiga daerah (Cimanggu, Tawangmangu dan Leuwiliang) menunjukkan perbedaan kadar. Perbedaan kadar flavonoid dalam tanaman dapat disebabkan karena perbedaan kondisi lingkungan tempat tumbuh, suhu, sinar ultraviolet, hara, ketersediaan air dan kadar CO2 dalam atmosfer (Darusman dkk, 2011). Tabel 3. Kadar Flavonoid Dalam Sampel Ekstrak Air Jinten Hitam Dari Tiga Daerah yang Berbeda Habasyah, India, dan Indonesia. Daerah
Absorbansi
Kadar rata –rata mg/100 gram
Habasyah
0,679 0,691 0,720
Kadar flavonoid (QE) (mg/100 gram 56,1 59,1 59,8
India
0,2220 0,2035 0,2110
13,4 12,4 12,9
12,9 ± 0,500
Indonesia
0,4080 0,4180 0,3915
3,3 3,4 3,1
3,1± 0,153
58,3 ± 1,965
Penetapan kadar fenolik Penentuan kandungan senyawa fenolik ekstrak air jinten hitam menggunakan metode Folin-ciocalteu (Chun et al., 2003). Pereaksi Folin-Ciocalteu digunakan sebagai pengkompleks warna karena reaksi antara asam galat dan Folin-Ciocalteu dapat membentuk 7
suatu kompleks yang stabil berwarna biru. Semakin pekat warna yang terbentuk berarti semakin banyak kandungan ion fenolat yang terdapat dalam larutan. Operating time (OT) pada penentuan kandungan senyawa fenolik yaitu 10 menit, dengan panjang gelombang maksimum 747,5 nm. Kurva baku yang digunakan untuk pembanding adalah asam galat. Dari analisis pada asam galat didapatkan kurva baku dengan persamaan regresi linear Y = 0,0872x + 0,248 dengan harga koefisien korelasi (R2) 0,979. Hasil analisis total kandungan senyawa fenolik dihitung sebagai ekuivalen asam galat mg/100 gram sampel. Tabel 4. Kadar Fenolik Dalam Sampel Ekstrak Air Jinten Hitam Dari Tiga Daerah yang Berbeda Habasyah, India, dan Indonesia.
Kadar rata –rata mg/100 gram (GAE)
Daerah
mg Ekstrak
Abs
Kadar mg/100 gram
Habasyah
0,1022 0,1060 0,0977
0,676 0,723 0,667
538,2 575,5 542,5
552,1 ± 20,400
India
0,2009 0,2005 0,1997
0,5465 0,5725 0,5290
428,0 463,8 405,6
432,5 ± 29,300
Indonesia
0,4053 0,4041 0,4028
0,4895 0,4780 0,5015
49,3 47,0 52,1
49,5 ± 2,500
Hasil penelitian menunjukkan bahwa kadar fenolik total dalam ekstrak air jinten hitam paling banyak terdapat pada ekstrak air jinten hitam Habasyah, dari kadar fenolik total ratarata sebesar 552,1 mg/100 gram ± 20,400. Kadar rata-rata fenolik total yang terdapat dalam ekstrak air jinten hitam India yaitu 432,5 mg/100 gram ± 29,300, kadar ini lebih besar dibandingkan dalam ekstrak air jinten hitam Indonesia 49,5 mg/100 gram ± 2,500 (tabel 4). Penelitian Samarakoon et al (2010) menunjukkan kadar fenolik total ekstrak air jinten hitam adalah 23,8 ± 4,563 mg GAE/100 gram. Hasil penelitian yang didapatkan dibandingkan dengan penelitian Samarakoon et al (2010) ekstrak air jinten Habasyah dan India mempunyai kadar fenolik yang lebih tinggi, sedangkan ekstrak air jinten hitam Indonesia mempunyai kadar fenolik yang mendekati yaitu 49,5 mg/100 gram ± 0,0025. Perbedaan kadar fenolik dari ekstrak air jinten hitam dalam penelitian dan ekstrak air jinten hitam pada penelitian sebelumnya kemungkinan disebabkan karena perbedaan metode ekstraksi yang dilakukan. Ekstrak metanol jinten hitam juga mengandung senyawa fenolik yang dihitung sebagai ekuivalensi asam galat sebanyak 67 mg/100 gram ± 0,201 (Tubesha et al., 2011). Senyawa fenolik yang terdapat dalam jinten hitam yaitu asam vanilat (Bourgaou et al., 2007 ), asam 8
galat dan carvacrol. Secara umum perbedaan kandungan fenolik dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya varietas buah, penanaman, bagian buah, musim tumbuh, kondisi lingkungan, asal geografi, penyimpanan pascapanen dan prosedur pemprosesan (Rahmawati, 2009). Mengacu dari penelitian tersebut perbedaan kadar fenolik ekstrak air jinten hitam dari ketiga daerah dapat disebabkan karena asal geografi dari biji jinten hitam. Uji Sitotoksik Uji sitotoksik ekstrak air jinten hitam dilakukan untuk mengetahui aktivitas ekstrak air jinten hitam dari tiga daerah yang berbeda terhadap sel kanker MCF-7. Metode yang digunakan dalam uji sitotoksik ini adalah metode MTT. Prinsip dari metode MTT adalah terjadinya
reduksi
garam
kuning
tetrazolium
MTT
(3-4,5dimetiltiazol-2-il)-2,5-
difeniltetrazolium bromid) oleh sistem reduktase. Suksinat tetrazolium yang termasuk dalam rantai respirasi dalam mitokondria sel-sel yang hidup membentuk kristal formazan berwarna ungu dan tidak larut air (CCRC, 2009). Sel kanker yang digunakan dalam penelitian adalah sel MCF-7. Sel MCF-7 merupakan sel epitel yang berbentuk seperti daun dan bergerombol yang dapat tumbuh pada media RPMI.
Gambar 5. Sel MCF-7 yang ditumbuhkan dalam media RPMI menempel pada dasar plate. Sel mempunyai morfologi seperti daun dan berinti gelap.
Penentuan aktivitas sitotoksik dilakukan pada ekstrak air jinten hitam dari tiga daerah yang berbeda, yaitu Habasyah, India, dan Indonesia. DMSO digunakan sebagai pelarut dari ekstrak, karena DMSO tidak berpengaruh pada poliferasi sel (Maryati dan Sutrisna, 2007). Peningkatan konsentrasi pada ekstrak air jinten hitam Habasyah, India dan Indonesia menunjukkan penurunan % sel hidup dari sel MCF-7 hal ini ditunjukkan dengan grafik yang menurun (Gambar 6). Persentase sel hidup dari ketiga daerah ditunjukkan pada konsentrasi 100 µg/mL. Konsentrasi 100 µg/mL pada masing-masing ekstrak menunjukkan jumlah % sel hidup sebesar 65 % (Habasyah), 102,1 % (India), 38,9 % (Indonesia) (Tabel 5). Hasil 9
penelitian menunjukkan korelasi yang tidak linier karena hasil % sel hidup dari masingmasing konsentrasi dari ketiga ekstrak mengalami fluktuasi. Kelemahan dari penelitian ini adalah doubling time sel MCF-7 dalam penelitian melebihi doubling time sel yang sebenarnya yaitu 29 jam (ATCC, 2008). Hal ini kemungkinan merupakan faktor yang mempengaruhi fluktuasi viabilitas sel pada berbagai konsentrasi. Hasil uji sitotoksik setelah perlakuan dengan ekstrak air jinten dihitung dengan cara menentukan nilai IC50. Nilai IC50 dihitung dengan cara membuat persamaan regresi linier antara % sel hidup dan konsentrasi (Gambar 6). Ekstrak air jinten hitam Habasyah dan India menunjukkan nilai IC50 > 100 µg/mL, sedangkan ekstrak air jinten hitam Indonesia mempunyai nilai IC50 < 100 µg/mL. Nilai IC50 dapat menunjukkan potensi suatu senyawa sebagai agen sitotoksik, semakin besar nilai IC50 maka senyawa tersebut semakin tidak toksik (Melannisa, 2004). Suatu senyawa dapat dikatakan mempunyai aktivitas sitotoksik apabila mempunyai nilai IC50 < 100 µg/mL (Meiyanto dkk, 2008). Hasil peneliian menunujukkan ekstrak air jinten hitam Indonesia menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap sel MCF-7. Ekstrak air jinten hitam Habasyah dan India pada konsentrasi 100 µg/mL tidak menunjukkan aktivitas penghambatan sel. Menurut Farah dan Begum (2003) ekstrak air jinten hitam mempunyai nilai IC50 940,5 µg/mL terhadap sel MCF-7. Nilai IC50 pada penelitian Farah dan Begum (2003) tidak poten digunakan sebagai agen sitotoksik karena nilai IC50 > 100 µg/mL. Hasil penelitian ini memperkuat penelitian sebelumnya bahwa ekstrak air jinten hitam tidak poten digunakan sebagai agen kemoterapi pada sel kanker MCF-7. A.
Habasyah
B. India
C. Indonesia
Gambar 6. Grafik Hubungan Konsentrasi Dengan % Sel Hidup A-C Secara Berurutan pada Berbagai Seri Kadar Ekstrak Air Jinten Hitam Habasyah, India dan Indonesia.
10
Tabel 5. Persentase Sel Hidup Dengan Perlakuan Ekstrak Air Jinten Hitam Habasyah, India, Dan Indonesia. (Habasyah) Konsentrasi µg/mL 50 100 200 300 500
Rata-rata % sel hidup 150,427 65,000 0 0 0
IC50 µg/mL
(India) Konsentrasi µg/mL 50 100 200 400 500
Rata-rata % sel hidup 94,935 102,124 85,131 87,418 76,961
IC50 µg/mL
(Indonesia) Konsentrasi µg/mL 50 100 200 400 500
>100
> 100
Rata-rata % sel hidup 40,523 38,889 34,967 24,673 32,026
IC50 µg/mL < 100
Korelasi Kandungan Flavonoid Fenolik dan Aktivitas Sitotoksik Sel MCF-7 Kandungan total flavonoid dan fenolik ekstrak air jinten hitam dari tiga daerah dikorelasikan dengan aktivitas sitotoksik terhadap sel MCF-7. Hal ini dilakukan untuk mengetahui apakah kadar flavonoid dan fenolik dalam ekstrak air jinten hitam berpengaruh langsung terhadap aktivitas sitotoksik terhadap sel MCF-7. Hubungan antara kadar flavonoid fenolik dengan aktivitas sitotoksik diketahui dengan membuat persamaan regresi linier antara kadar flavonoid fenolik dan % sel hidup MCF-7 pada konsentrasi 100 µg/mL. Tabel 6. Kadar Flavonoid, Fenolik Dan % Sel Hidup MCF-7 Pada Konsentrasi 100 µg /mL Ekstrak Air Jinten Hitam Habasyah, India, Indonesia Daerah Habbsyah
Kadar mg/100 gram flavonoid 58,3 ± 1,965
Kadar mg/100 gram fenolik 552,1 ± 20,4
% sel hidup (100 µg/mL) 65
India
12,9 ± 0,500
432,5 ± 29,3
102,1
Indonesia
3,1± 0,153
49,5 ± 2,5
38,9
11
Gambar 7. Grafik Korelasi Antara Kadar Flavonoid Dan Fenolik Ekstrak Air Jinten Hitam Dan % Sel Hidup Sel MCF-7 Pada Konsentrasi 100 µg/mL
Hasil penelitian menunjukkan nilai R2 flavonoid dan % sel hidup konsentrasi 100 µg/mL yaitu 0,004. Hal ini menunjukkan bahwa kemungkinan kandungan flavonoid mempengaruhi aktivitas sitotoksik sebesar 0,4%. Dilihat dari nilai R2 fenolik dan % sel hidup konsentrasi 100 µg/mL
yaitu 0,432, menunjukkan kemungkinan kandungan fenolik mempengaruhi
aktivitas sitotoksik sebesar 43%. Dilihat dari nilai tersebut menunjukkan kadar flavonoid fenolik tidak berpengaruh langsung pada uji sitotoksik, hal ini mungkin disebabkan karena sel kanker MCF-7 mempunyai sifat resisten terhadap beberapa agen kemoterapi (Zamperi et al., 2002). Ekstrak air jinten hitam Indonesia mempunyai nilai % sel hidup yang lebih baik dari kedua ekstrak air yang lain sehingga mempunyai potensi untuk dikembangkan sebagai agen sitotoksik. Senyawa dalam ekstrak air jinten hitam Indonesia yang diduga berpengaruh terhadap % sel hidup adalah senyawa fenolik. Senyawa yang bertanggung jawab atas aktivitas sitotoksik pada jinten hitam adalah senyawa fenolik. Senyawa fenolik yang terdapat dalam jinten hitam yaitu karvakrol, asam galat dan asam vanilat. Asam galat mempunyai aktivias antiproliferatif dan sitotoksik pada sel MCF-7 (Indap et al., 2006). Penelitian Mehdi et al (2011) mengemukakan bahwa senyawa karvakrol memberikan aktivitas sitotoksik terhadap sel Hela dan sel Siha dengan nilai IC50 50 mg L-1. Penelitian Irlya (2012) menunujukkan bahwa dari hasil analisis fitokimia dengan KLT ekstrak air jinten hitam mengandung senyawa flavonoid, fenolik dan terpenoid. Sehingga senyawa fenolik dalam ekstrak air jinten hitam diduga mempengaruhi % sel hidup sel MCF-7. KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Dari hasil penelitian,dapat disimpulkan bahwa : 1.
Kadar flavonoid ekstrak air jinten hitam Habbsyah, India dan Indonesia berturut-turut 58,30 ± 1,97 mg/100 gram; 12,90 ± 0,500 mg/100 gram; 3,10 ± 0,15 mg/100 gram.
12
2.
Kadar fenolik ekstrak air jinten hitam 552,10 ± 20,40 mg/100 gram (Habbsyah); 432,50 ± 29,30 mg/100 gram (India); 49,50 ± 2,50 mg/100 gram (Indonesia).
3.
Ekstrak air jinten hitam Habbsyah dan India menunjukkan nilai IC50 > 100 µg/ml. Ekstrak air jinten hitam Indonesia mempunyai IC50 sebesar < 100 µg/ml, senyawa yang diduga berpengaruh terhadap aktivitas tersebut adalah senyawa fenolik.
Saran 1. Pembuatan fraksinasi terhadap ekstrak air jinten hitam Indonesia. 2. Perlu dilakukan pembuatan ekstrak dengan pelarut dan metode yang lain pada jinten hitam Habasyah, India dan Indonesia dan uji sitotoksik terhadap sel kanker yang lain. Ucapan Terima Kasih DP2M DIKTI yang telah membantu mendanai penelitian ini melalui PKM tahun 2011.
DAFTAR ACUAN Adina, A.B., Handoko, F.F., Setyarini, I.I., Septisetyani, E.P., Riyanto, S., Meiyanto, E., 2009, Ekstrak etanolik kulit jeruk nipis (Citrus aurantifolia (cristm.) Swingle) meningkatkan sensitivitas sel MCF-7 terhadap doxorubicin, Cancer Chemoprevention Research Center (CCRC), Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada. Andayani., R Lisawati,Y., dan Maimunah, 2008, Penentuan aktivitas Antioksidan Kadar Fenolat dan Likopen pada Buah Tomat, Jurnal Sains dan Teknologi Farmasi, 13, 1-9. Boskabady, M.H., Kiani, P and Jandaghi, P., 2010, Antiasmathic effeect of Nigella sativa in airways of asmathic patient, Medical Journal of the Islamic Republic of Iran. Buhler, D.R and Miranda, C., 2000, Antioxidant Activities of Flavonoid, Department of Environmental and Molecular Toxicology Oregon State University, Linung Pauling Institute’s Micronutrient information Center. CCRC, 2009., Protokol In Vitro, Cancer Chemoprevention Research Center, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta . Darusman, L.K., Heryanto, R., Rafi, M., Rohaeti, E., Wahyuningrum, A., 2011, Prediksi Kadar Flavonoid Total Tempuyung (Sonchus arvensis L.) Menggunakan Kombinasi Spektroskopi IR Dengan Regresi Kuadrat Terkecil Parsial, Jurnal kimia 5,101-108. Depkes, 1979, Materia Medika Indonesia, Jilid III, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, hal 20-21. Depkes, 1986, Sediaan Galenik, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, hal 1013.
13
Ebrahimzadeh, Mohammad Ali., Ghasemsi, Kamran., Ghasemsi , Yosef., 2009, Antioxidant activity, phenol and flavonoid contents of 13 citrus species peels and tissues, Pak. J. Pharm. Sci., Vol.22. Farah, IO and Begum, RA., 2003, Abstract Effect of Nigella sativa (N.sativa L.) and oxidative stress on the survival pattern of MCF-7 breast cancer cels, Jackson State University, Jackson, MS 39217, USA National Library of Medicine National Institutes of Health. Gandjar, I.G., dan Rohman, A., 2008, Kimia Analisis Farmasi, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, hal 224-225. Irya, Nita., 2012, Perbandingan Profil Kromatogram Ekstrak Air Jinten Hitam (Nigella sativa L.) Dari Daerah Habasyah, India, Dan Indonesia Dengan HPLC, Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Muhammadiyah Surakarta. Maryati., Sutrisna, E.M., 2007, Potensi Sitotoksik Tanaman Ceplukan (Physalis angulata L.) Terhadap Sel Hela, Pharmacon, Vol 8, 1-6. Markham K.R., 1988, Cara Mengidentifikasi Flavonoid, diterjemahkan oleh kosasih, Padmawinata, Penerbit ITB, Bandung, hal 1-39. Mbarek, L.A., Mouse, H.A., Elabadi., Bensakah, M., Gamouh, A., Aboufatima, R., Benharref, A., Chait, A., Kamal, M., 2007, Anti-tumor Properties of Blackseed (Nigella sativa .L) Extract, Brazilian Journal of Medical and Biological Research 40 : 839-847. Meiyanto, Edy., Susidiarti, R A., Handayani, Sri., Rahmi, Fitria., 2008, Ekstrak Etanolik Biji Buah Pinang (Areca catechu L.) mampu menghambat proliferasi dan memacu apoptosis sel MCF-7, Majalah Farmasi Indonesia, 19(1), 12 – 19. Melannisa, R ., 2004., Pengaruh PGV-1 Pada Kanker Payudara T47D yang diInduksi βestradiol, Kajian Antipoliferatif, Pemacuan Apoptosis dan Antiangioogenesis, Tesis, 50-55, Program Pasca Sarjana Universitas Gajah Mada Yogyakarta, Yogyakarta. Merfort, I., Wray, V., Barakat, H. H., Hussein, S. A. M., Nawwar, M. A. M., & Willuhn, G., 1997. Abstrac Flavonol triglycosides from seeds of Nigella sativa. Phytochemistry, 46(2), 359-363. Rahmawati, Anita., 2009, Kandungan Fenol Total Ekstrak Buah Mengkudu (Morinda citrifolia), Skripsi, Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia, Jakarta. Ren, W., Qiao, Z., Wang, H., Zhu, L. and Zhang, L., 2003, Flavonoids: Promising Anticancer Agents, Medical Research Reviews, 23(4):519-534. Samarakoon, Sameera R., Thabrew, Ira., Galhena, Prasanna B., Silva Dilip P., Tennekoon, Kamani H., 2010. A comparison of the cytotoxic potential of standardized aqueous and ethanolic extracts of a polyherbal mixture comprised of Nigella sativa (seeds), Hemidesmus indicus (roots) and Smilax glabra (rhizome). Pharmacognosy Research, 2 (6), 335-342. 14
Shoieb, A.M., Elgayyar, M., Dudrick, P.S., Bell, J.L., Tithof, P.K., 2003. Invitro Inhibition on Growth and Induction of Apoptosis In Cancer Cell lines by Thymoquinone. Int. J of Oncol. 22 : 107-113. Swamy S,M.K. and Tan B.K.H., 2000, Cytotoxic And Immunopotentiating Effects Of Ethanolic Extract Of Nigella sativa L. Seeds. J. Ethnopharmacol. Yazan, L.S., WeiKeat, Ng., Al-Naqeeb, Ghanya., Ismail, Maznah, 2009, Abstract Cytotoxicity of thymoquinone (TQ) from Nigella sativa towards human cervical carcinoma cells (HeLa), Journal of Pharmacy Research Vol. 2 No. 4 pp. 585-589. Zampieri, L., Bianchi, P., Ruff, P., dan Arbuthnot, P., 2002, Abstract Differential Modulation by Estradiol of P-glycoprotein Drug Resistance Protein Expression in Cultured MCF7 and T47D Breast Cancer Cells, Anticancer Res., 22 (4): 2253-9
15
