EU O OCHRANĚ ZVÍŘAT POUŽÍVANÝCH PRO VĚDECKÉ ÚČELY

Starost o zvířata, snaha o lepší vědu

© Novo Nordisk

SMĚRNICE 2010/63/EU O OCHRANĚ ZVÍŘAT POUŽÍVANÝCH PRO VĚDECKÉ ÚČELY

RÁMEC POSUZOVÁNÍ ZÁVAŽNOSTI Životní prostředí 1

Obsah

Pracovní dokument k rámci posuzování závažnosti

Příklady popisující postup klasifikace závažnosti postupů, každodenního hodnocení a posouzení skutečné závažnosti

1-20

22-93

Vnitrostátní orgány příslušné k provádění směrnice 2010/63/EU o ochraně zvířat používaných pro vědecké účely Pracovní dokument k rámci posuzování závažnosti V Bruselu dne 11.–12. července 2012 Komise ustavila pracovní skupinu odborníků pro posouzení závažnosti postupů k usnadnění provedení směrnice 2010/63/EU o ochraně zvířat používaných pro vědecké účely. Všechny členské státy a hlavní zúčastněné organizace byly přizvány ke jmenování odborníků, kteří by se měli na práci podílet. Pracovní skupina odborníků pro posouzení závažnosti se setkala dvakrát – setkání v prosinci 2011 bylo zaměřeno na geneticky modifikovaná zvířata a na setkání v květnu 2012 byl diskutován obecný rámec pro posuzování skutečné závažnosti, jíž jsou zvířata při postupech vystavena. Tento dokument je výsledkem práce obou setkání pracovní skupiny odborníků, rozhovorů s členskými státy i právní iniciativy Komise ohledně porozumění rámci posuzování závažnosti, jeho složkám, účastníkům a pracovním nástrojům a metodám. Byl schválen vnitrostátními orgány příslušnými pro provádění směrnice 2010/63/EU na jejich setkání ve dnech 11.–12. července 2012.

Prohlášení: Smyslem dále uvedených informací je pomoci členským státům a dalším subjektům, kterých se tato směrnice týká, dosáhnout společného chápání ustanovení obsažených v této směrnici. Veškeré komentáře by měly být chápány v souvislostech směrnice 2010/63/EU o ochraně zvířat používaných pro vědecké účely. Právně závazný výklad práva EU je oprávněn podávat pouze Soudní dvůr Evropské unie.

1

Obsah: Související články směrnice 2010/63/EU ..................................................................................3 Obecný kontext ..........................................................................................................................3 Obecná kritéria pro posuzování závažnosti ...............................................................................4 Kritéria ke zvážení před provedením studie ..............................................................................5 Ukazatele závažnosti..................................................................................................................6 Nadřazené kategorie ..............................................................................................................6 Faktory, které mají být zohledněny při posuzování skutečné závažnosti ...............................7 Zajištění konzistentnosti při posuzování a přiřazování skutečné závažnosti...........................10 Vytvoření hodnotícího listu přizpůsobeného konkrétnímu postupu .....................................10 Konzistentnost posuzování skutečné závažnosti...................................................................11 Kdo by měl poskytovat vstupní údaje pro posuzování skutečné závažnosti? .........................12 Nástroje sledování, média a další faktory ................................................................................12 Dodatek I - Glosář z oblasti klinického pozorování ...............................................................14 Dodatek II - Základní literatura, pokyny a další zdroje dostupné na internetu týkající se posuzování životních podmínek zvířat účastnících se vědeckých postupů .............................17

2

Související články směrnice 2010/63/EU − Čl. 4 odst. 3: „Členské státy zajistí šetrné zacházení se zvířaty při jejich chovu, umístění a péči o ně, jakož i šetrné metody používané k postupům, přičemž se odstraní nebo na nejnižší možnou míru sníží případná bolest, utrpení, strach nebo trvalé poškození zvířat.“ − Čl. 15 odst. 1: „Členské státy zajistí, aby byly všechny postupy případ od případu klasifikovány jako „postupy, při nichž již zvíře nenabude vědomí“, „mírné“, „střední“ nebo „závažné“ za použití kritérií přiřazování uvedených v příloze VIII.“ − Čl. 16 odst. 1 písm. d): „je to [opětovné použití] v souladu s doporučením veterinárního lékaře s ohledem na životní zkušenosti zvířete.“ − Čl. 54 odst. 2: „Členské státy každoročně shromažďují a zveřejňují statistické informace o používání zvířat při postupech včetně informací o skutečné závažnosti postupů a původu a druzích subhumánních primátů, kteří byli k pokusům použiti. …“ Obecný kontext Směrnice 2010/63/EU o ochraně zvířat používaných pro vědecké účely vyžaduje předběžné posouzení závažnosti každého postupu, který je součástí příslušného projektu (článek 15) a přiřazení třídy závažnosti v rámci klasifikace obsahující „postupy, při nichž již zvíře nenabude vědomí“, „mírné“, „střední“ a „závažné“. Příloha VIII obsahuje pokyny týkající se faktorů, které mají být zohledněny při předběžném posuzování závažnosti a pro každou kategorii závažnosti uvádí několik příkladů. Článek 54 týkající se podávání zpráv požaduje zasílání statistických informací o skutečné závažnosti bolesti, utrpení, strachu nebo trvalého poškození pociťovaného nebo utrpěného zvířetem (oproti předběžnému posouzení či prognóze závažnosti, které byly provedeny v okamžiku posuzování projektu). Při stanovení toho, zda zvíře smí či nesmí být opětovně použito k novým postupům, má skutečná závažnost předchozích postupů rovněž klíčový význam (článek 16). Tato opatření poskytují příležitost ke zlepšení kvality vědeckých výsledků a životních podmínek zvířat pomocí předběžného posouzení navrhovaných projektů a tím, že zahrnují skutečné utrpení zvířete, by měla zajistit větší transparentnost i porozumění dopadům vědeckých postupů na životní podmínky zvířat. Mezi hlavní přednosti předběžného posuzování, sledování, hodnocení a oznamování skutečné závažnosti patří •

•

zejména příležitosti k uplatnění zásady šetrného zacházení a omezení utrpení, ačkoli předběžné posuzování může rovněž představovat příležitost ke zvážení toho, zda je použití zvířete nezbytné (zásada nahrazení) a zda návrh studie odpovídá požadavku minimalizace používání zvířat (zásada omezení); zlepšení životních podmínek zvířat, např. v případě časnějšího zjištění utrpení a jeho ulehčení;

3

• • • • •

• •

zvýšená transparentnost díky tomu, že statistiky by měly lépe vyjadřovat skutečné náklady na dobré životní podmínky zvířat; zlepšená komunikace mezi osobami odpovědnými za používání zvířat, péči o ně a jejich sledování; poskytnutí vstupních údajů pro zpětné posouzení projektu, je-li prováděno (článek 39); zvýšení kvality vědeckých dat zásluhou lepších životních podmínek zvířat; rozšíření znalostí o posuzování závažnosti a o klinických příznacích, jejichž přínosem bude větší konzistentnost v posuzování – za předpokladu, že tyto přístupy a výsledky budou dále šířeny např. prostřednictvím vědeckých časopisů, diskusních skupin a setkání; poskytnutí vstupních údajů pro školení výzkumníků, zootechniků a veterinárních lékařů laboratorních zvířat, jestliže budou výsledky využity jako zdroj příkladů; informace založené na důkazech, které mohou být použity v předběžném posuzování obdobných budoucích projektů z hlediska jejich vlivu na životní podmínky zvířat.

Obecná kritéria pro posuzování závažnosti Posuzování závažnosti daného postupu by mělo představovat nepřetržitý proces začínající výchozím návrhem studie, pokračující přes každodenní sledování zvířat v průběhu projektu odpovídající konkrétní studii a sahající až k posouzení skutečné závažnosti po dokončení studie, což poskytne příležitosti ke zjištění možností šetrnějšího zacházení při budoucích studiích.

POSUZOVÁNÍ ZÁVAŽNOSTI – NEPŘETRŽITÝ PROCES PLÁNOVÁNÍ PROJEKTU Vyvinout projektově, druhově Dodatek I a kmenově specifické Kategorie vyšší úrovně posuzování jako základ pro vytváření závažnosti listů bodového hodnocení přizpůsobených konkrétnímu projektu a postupu

Dodatek II Referenční materiály pro vytváření listů bodového hodnocení přizpůsobených konkrétnímu projektu a postupu

Vybrat nástroje pro sledování, četnost, druh hodnocení Dohodout, jak jednat při příznacích bolesti, strachu nebo utrpení

Zajistit pro celý postup pracovníky se všemi nezbytnými dovednostmi

V PRŮBĚHU PROJEKTU

PO SKONČENÍ PROJEKTU analýza a zpětná vazba

Konzistentnost pozorování/ Posuzování a školení pracovníci hodnocení skutečné závažnosti Efektivní každodenní sledování Dobrá komunikace všech zúčastněných

ÎStatistické informace

Dodatek II Referenční materiály pro posuzování a hodnocení

Î Zpětné posouzení projektu

Î Zpětná vazba pro budoucí studie

Průběžný přezkum postupu posuzování podle potřeby

ÎZvážení dalších možností prohloubení zásad tří R ÎVstupní údaje pro tematický přezkum

Příklad/y posuzování závažnosti přizpůsobeného konkrétnímu projektu/postupu včetně listů bodového hodnocení pro každodenní posuzování, nástrojů hodnocení, výběru metod sledování a závěrečného posouzení.

4

Tento přístup umožňuje lépe zajistit trvalé zohledňování a provádění zásad „tří R“ (Replacement, Reduction, Refinement – tj. nahrazení a omezení používání zvířat a šetrné zacházení s nimi), zdokonalení komunikace mezi všemi účastníky a zlepšení ucelenosti postupů. Účinné posouzení závažnosti vyžaduje • týmový přístup zahrnující příspěvky osob s různými odbornými znalostmi, zkušenostmi a prioritami, např. výzkumníků, zootechniků a ošetřovatelů či ošetřujícího zvěrolékaře; • řádné plánování; • vhodné trvalé vzdělávání a školení všech zúčastněných pracovníků; • systémy každodenního sledování závažnosti, které jsou vhodně přizpůsobené biologickému druhu, kmenu a projektu, včetně poučeného a strukturovaného pozorování zvířat ve vhodných intervalech (např. se zvýšenou četností v průběhu a po skončení postupů); • řádně poučené a účinné klinické postupy pro hodnocení chování a příznaků; • analýzu pozorování umožňující informovaně posoudit povahu a míru utrpení; • povědomí o míře závažnosti každého postupu a o tom, jak je třeba jednat při jejím dosažení nebo překročení; • důsledný přístup k hodnocení skutečného utrpení (mírné, střední nebo závažné) za účelem sestavení statistických zpráv; • zvažování účinnosti uplatnění zásad „tří R“ a možných zlepšení v budoucích studiích. Kritéria ke zvážení před provedením studie Proces zajišťující minimalizaci závažnosti v průběhu vědeckých postupů začíná ve fázi návrhu, kdy je zvažována nutnost a oprávněnost použití živých zvířat k dosažení vědeckých cílů. • Tam, kde je použití živých zvířat nutné a oprávněné, je důležité zajistit výběr vhodného modelu a robustnost návrhu studie. • Všechny aspekty studie, které by mohly být příčinou bolesti, utrpení, strachu nebo trvalého poškození, by měly být identifikovány a měly by být zváženy možnosti minimalizace jejich dopadů, v příslušných případech například pomocí nahlédnutí do literatury, konzultací s kolegy, zootechniky, zvěrolékařem a orgány zabývajícími se životními podmínkami zvířat. • Doporučená předběžná klasifikace závažnosti přiřazená postupům by měla vycházet z nejvyšší závažnosti očekávané pro kterékoli jedno zvíře účastnící se studie. • Měl by být vypracován plán pozorování zvířat vhodný a přizpůsobený studii; standardizovaná terminologie srozumitelná všem účastníkům studie zvýší konzistentnost výkladů výsledků a podávaných zpráv. • Je důležité zajistit dostatek kvalifikovaných a vyškolených pracovníků pro provedení studie a sledování zvířat a péči o ně.

5

Ukazatele závažnosti K posouzení závažnosti postupů „v prostředí klece“ (kotce, nádrže apod.) lze použít určitých symptomatických chování a klinických příznaků. Terminologie používaná k jejich popisu by měla být srozumitelná všem, kteří se podílejí na používání a sledování zvířat a péči o ně. Pro každý systém posuzování závažnosti je nezbytné spolehlivé porozumění normálnímu stavu zdraví, chování a životních podmínek daného pozorovaného druhu (případně kmene). Cílem by mělo být: • dosáhnout nejvyšší možné kvality života zvířete; • zajistit, aby bylo každé utrpení způsobené vědeckými postupy rozeznáno a • minimalizováno, avšak zůstalo v souladu s vědeckými cíli. Každý systém posuzování by měl být schopen účinně zjistit odchýlení od normálního stavu zdraví a životních podmínek a umožnit pozorovateli zaznamenat a podat jasné a konzistentní posouzení stavu každého zvířete. Ke stanovení postupu hodnocení závažnosti, který je vhodně přizpůsoben druhu, kmeni, jedinci a výzkumnému postupu, je možné použít jednoduchý hierarchizovaný přístup. Postup pro stanovení postupu hodnocení stavu „v prostředí klece“ by měl identifikovat jakékoli nepříznivé účinky, k nimž může dojít v souvislosti se životními zkušenostmi zvířete, včetně jeho umístění, chovatelských postupů, péče a zacházení, a rovněž nepříznivé účinky vyplývající z vědeckých postupů a jejich důsledků. Zvážení všech těchto nepříznivých účinků by mělo odhalit ukazatele, jichž lze použít k účinnému posouzení životních podmínek zvířete v laboratorních podmínkách. Tyto ukazatele by měly být uzpůsobeny daným druhům, kmenům a použitým zkušebním postupům. Měly by být rovněž snadno srozumitelné a zjistitelné a konzistentním způsobem zaznamenatelné. Je přitom rovněž důležité zajistit možnosti pro zjištění a záznam všech neočekávaných nepříznivých účinků, například volným textovým zápisem. Nadřazené kategorie Níže je uveden soupis nadřazených kategorií platných pro všechny druhy, který může posloužit jako základ pro vytvoření vyčerpávajícího seznamu konkrétních ukazatelů pro každý zkušební postup nebo program péče o zvířata. Cílem je vytvořit seznam postačujících ukazatelů přizpůsobených konkrétní studii, který by minimalizoval nebezpečí, že by nebyly zřejmé příznaky utrpení, a zároveň by nepředstavoval nadměrně komplikovaný, zbytečně byrokratický a časově náročný systém. Nadřazenými kategoriemi jsou: • •

vzhled tělesné funkce

6

• • • •

prostředí chování ukazatele související s konkrétním postupem volné pozorování (další významná pozorování).

Ukazatele v těchto kategoriích mohou být přizpůsobeny jakémukoli živočišnému druhu. Na jejich základě by měl být vytvořen soupis pozorovatelných charakteristik, které může posoudit odpovídajícím způsobem školená osoba a vyjít z nich při hodnocení celkového zdravotního stavu a životních podmínek zvířete. Tyto ukazatele by měly být diskutovány a voleny ve spolupráci s osobami odpovědnými za dozor nad životními podmínkami zvířat a v příslušných případech s orgánem dohlížejícím na životní podmínky zvířat. Následně by měly být využity k vytvoření systémů pro vedení evidence každodenního pozorování, sledování a hodnocení stavu zvířat v laboratorních podmínkách přizpůsobených konkrétním studiím. Dodatek I nabízí příklad dalšího možného dělení těchto kategorií vyšší úrovně a jejich využití ke stanovení vhodných kritérií pro pozorování za použití sdílené terminologie popisu. Dodatek II obsahuje informace o pokynech a online zdrojích, které mohou pomoci při rozvoji vhodných způsobů posuzování životních podmínek zvířat používaných při vědeckých postupech. Faktory, které mají být zohledněny při posuzování skutečné závažnosti Je důležité poznamenat, že některé prvky mohou mít na závažnost v závislosti na konkrétní situaci pozitivní nebo negativní dopad a že musejí být rovněž zohledněny rozdíly mezi jednotlivými biologickými druhy. Posouzení skutečné závažnosti má být provedeno na individuálním základě a případ od případu, s využitím poznatků získaných z každodenního sledování zvířat. Tam, kde je to vhodné a kde jsou takové parametry dostupné, mohou být využity rovněž další parametry vyžadované za účelem studie. Ke studii mohou být například zapotřebí ukazatele, které nejsou přímo pozorovatelné (jako je tělesná teplota, tělesná hmotnost, biochemické parametry nebo biotelemetrické údaje, jako je například tepová frekvence), a tyto údaje by měly být v případě, že poskytují dodatečné relevantní informace, při posuzování závažnosti zohledněny. Skutečnou závažností, která bude pro jednotlivé zvíře hlášena, je nejvyšší úroveň pociťovaná nebo utrpěná v průběhu postupu, a nikoli závažnost zakoušená na konci postupu. Hodnocení rovněž nemá vycházet z prostého součtu, tzn. např. z rovnice „několik mírných postupů = mírná závažnost“. Mělo by být založeno na celkovém posouzení zkušenosti zvířete od počátku postupu po jeho konec. Níže uvedený seznam uvádí příklady typů hledisek, která by měla být při posuzování skutečné závažnosti posouzena a zvážena.

7

Postup, technika: • • • • • • • •

chirurgický/nechirurgický, míra a trvání omezení, neposkytnutí analgezie a anestezie, jestliže by jedna z nich nebo obě byly v jiných případech nezbytné, nový model nebo postup, hlediska prostředí (včetně umístění a omezení poskytování vody/potravy), stres/pocit ohrožení, opakované postupy a intervaly mezi nimi (rovněž je třeba zohlednit četnost a kombinaci zákroků nedosahujících prahových hodnot), opakované nebo trvalé použití.

Druh, kmen, vývojová fáze, předchozí zkušenosti: •

• • • • •

•

• • •

toto hledisko je nutné pečlivě zvážit – aby bylo možné účinně předpovědět a posoudit závažnost, je nezbytné porozumět biologickým vlastnostem a chování příslušného druhu a kmene (v některých případech jedince), druh a kmen, původ zvířete, např. účelový chov, volně žijící nebo nešlechtěný, zdroj (včetně předchozích podmínek umístění) a převoz, genotyp, fenotyp, pohlaví, věk, imunitní stav, přirozené chování a biologické hledisko (např. relativní význam jednotlivých smyslů, jako např. zraku u primátů a čichu u hlodavců, a jejich možné ovlivnění v laboratorním prostředí), umístění jedinců samostatně / ve skupinách – oprávněnost samostatného umístění sociálních zvířat nebo jejich krátkodobé nebo dlouhodobé odloučení od zavedených skupin, denní rytmy, např. důsledky provádění vědeckých nebo chovných postupů na nočních zvířatech ve fázi denního světla, odloučení od matky u všech druhů včetně hlodavců, kognitivní schopnosti, vědomí, paměť, vnímání účinků postupů.

Četnost, intenzita: •

•

mezi četností a závažností neexistuje přímý vztah, zvýšená četnost tedy neznamená nezbytně vyšší závažnost. To z toho důvodu, že dopad opakovaných postupů nebo technik na závažnost závisí na řadě faktorů, mezi jinými na intenzitě každého zákroku, jeho trvání, druhu a zkušenosti jedince; v případě, že jsou zákroky opakované, vzniká možnost akomodace, která může snížit závažnost postupu, např. u subhumánních primátů procházejících mírným postupem. V jiných případech může naopak opakování závažnost zvýšit, např. očekáváním

8

• •

stresujícího postupu nebo vznikem hyperalgezie v případě použití chirurgických postupů; potenciál pozitivního posilujícího tréninku nebo „odměn“ následujících po provedeném postupu; namísto závažnosti ve „fázi zotavení“ by měla být zaznamenána nejvyšší dosažená úroveň závažnosti.

Trvání účinků: • •

trvání souvisí s intenzitou (a tedy se závažností), zvážení možnosti včasného použití včasného humánního nebo vědeckého ukončení postupu.

Účinnost šetrného zacházení: • • •

• •

vhodná analgetika, anestetika a pooperační péče, obohacení – obohacení prostředí i skupinové umístění sociálních zvířat, umístění, chov a péče – zvážení možnosti jejich šetrného provádění v souladu s aktuálními zásadami správné praxe a nezbytnosti omezení vyžadovaných postupem, jako např. uzavření v malých prostorách (např. metabolická klec), roštová podlaha nebo vystavení okolním podmínkám, které mohou způsobit stres, trénink zvířete ke spolupráci nebo podpora přivykání výzkumným postupům, účinnost postupů pro hodnocení stavu zvířete v laboratorních podmínkách.

Kumulativní závažnost: •

• •

v postupu, který zahrnuje řadu kroků/zákroků, musejí být zohledněny celkové životní zkušenosti každého zvířete, v souvislosti s nimiž může omezení možnosti šetrnějšího umístění nebo nutnost častého odchytu, manipulace a omezování apod. mít vliv na závažnost, předchozí postupy v případě opakovaného použití, při zvažování opětovného použití zvířat musejí být zohledněny životní zkušenosti včetně hledisek, jaká představuje zdroj zvířat (a např. jejich rané „odstavení“) a jejich přeprava.

Zajištění konzistentnosti při posuzování a přiřazování skutečné závažnosti K zajištění dostatečných údajů umožňujících informované stanovení skutečné závažnosti na konci postupu jsou ve fázi návrhu studie obvykle nezbytné informace od příslušných vědeckých pracovníků, zootechniků, zvěrolékařů a ošetřovatelů. Konečné přiřazení skutečné kategorie závažnosti bude výsledkem analýzy záznamů pozorování chování, klinických příznaků a dalších parametrů u držených zvířat.

9

Mezi hlediska přispívající ke konzistentnosti patří: – začlenění různých odborných znalostí, zkušeností a priorit – „týmový přístup“, – školení v používání každodenních hodnotících postupů (včetně sdílené terminologie používané pro popis pozorování), – odborné znalosti ohledně zdraví, životních podmínek a chování zvířat, – pravidelný přezkum výsledků, – komunikace mezi všemi osobami odpovědnými za provádění studie a sledování zvířat (vertikální shora dolů a zdola nahoru, mezi subjekty i uvnitř subjektů), – dozor (na úrovni místní – např. orgán dohlížející na životní podmínky zvířat, regionální, státní, EU). Za účelem zajištění konzistentnosti posuzování skutečné závažnosti by měla být zohledněna následující klíčová hlediska: Vytvoření hodnotícího listu přizpůsobeného konkrétnímu postupu • •

• •

•

•

Před započetím projektu by měly být vytvořeny a schváleny hodnotící listy uzpůsobené druhu, kmeni a studii. Při vytváření hodnotících listů uzpůsobených konkrétní studii by měly být účinně využity všechny dostupné relevantní informace, například předchozí zkušenosti, výsledky studií in vitro a in silico, rešerše literatury, informace z pilotních studií a pozorované klinické příznaky u lidí nebo dalších zvířat. V blízkosti klece by měly být dostupné informace o tom, které parametry je třeba sledovat a jakým způsobem má být pozorování prováděno. Předběžná klasifikace úrovně závažnosti bude částečně určovat míru účasti požadovanou na úrovni obsluhy, případnou nezbytnost využití týmového přístupu v průběhu sledování a osoby, které se mají účastnit vlastního postupu pozorování a záznamu. Autoři postupu hodnocení přizpůsobeného konkrétní studii by měli provést nebo potvrdit konečnou klasifikaci skutečné závažnosti. V závislosti na složitosti studie může být vhodné vytvořit samostatné hodnotící listy pro jednotlivé součásti, např. list pro standardní chirurgickou/perioperativní péči v kombinaci s uzpůsobeným hodnotícím protokolem studie. V některých případech mohou listy hodnocení uzpůsobené konkrétní studii obsahovat informace týkající se správy kolonií organismů, např. údaje o chovu a růstu geneticky modifikovaných zvířat.

Konzistentnost posuzování skutečné závažnosti Skutečná závažnost se posuzuje na konci postupu a vyžaduje posouzení celkové závažnosti, kterou zvíře skutečně zažilo, na základě každodenního hodnocení a s ohledem na provedené postupy.

10

•

•

•

Jedním z běžně používaných postupů je stanovení „mírných“, „středních“ a „závažných“ úrovní u každého z ukazatelů použitých v každodenním hodnocení a následné posouzení jejich závažnosti případ od případu. Stejně jako u každodenního sledování je nezbytné skutečně použitá kritéria hodnocení přizpůsobit postupu, druhu a kmeni zvířat; například 10% ztráta tělesné hmotnosti bude mít zásadně odlišné důsledky pro zdraví a životní pohodu mladého rostoucího potkana, dospělé myši s rychle rostoucím nádorem nebo dospělého psa. Zásadní faktor představuje rovněž zohlednění časového období, v němž dochází k objevení některých ukazatelů, a to zejména s ohledem na ztrátu hmotnosti a spotřebu potravy/vody.

Posouzení bude provedeno na základě denních hodnotících záznamů a po zohlednění postupu provedeného na zvířeti, délky trvání nepříznivých účinků a případného opětovného použití zvířete. Navzdory tomu, že posuzování bude vždy obsahovat určitou dávku subjektivity, správné školení pozorujícího by mělo směřovat k omezení této subjektivity. Určení skutečné závažnosti v případě zjištění úhynu zvířete • •

•

•

Jestliže je zvíře nalezeno mrtvé, tj. nebylo utraceno, může to být následkem zkušebního postupu nebo jiných nesouvisejících příčin1. Skutečná závažnost u zvířat, která byla nalezena mrtvá, by měla být zaznamenána jako „závažná“, pokud nelze učinit informované rozhodnutí o tom, že zvíře před smrtí nezakoušelo závažné utrpení. Jestliže je nepravděpodobné, že smrti předcházelo závažné utrpení, měla by klasifikace skutečné závažnosti odrážet zjištěné zkušenosti před okamžikem smrti. Faktory, jako je četnost sledování, použití analgezie apod., musejí být odpovídajícím způsobem zváženy. „(Trvalé) poškození“ může utrpět pouze žijící zvíře.

Měly by být vytvořeny příklady popisující postup klasifikace závažnosti, každodenního hodnocení a konečného posouzení skutečné závažnosti a být poskytnuty vědecké komunitě.

1

Pro účely statistických zpráv by se skutečná závažnost měla přednostně vztahovat k závažnosti zkušebních postupů, a nikoli k nesouvisejícím událostem, jakými je např. vypuknutí nakažlivých chorob nebo zatopení klecí. Události tohoto druhu, související se zdravotními problémy nebo s postupy chovu a péče, nikoli s poškozením způsobeným vlastními postupy, by však přesto měly být zaznamenány, dále vyšetřeny a následovány příslušnými opatřeními na předcházení jejich opakovanému výskytu.

11

Kdo by měl poskytovat vstupní údaje pro posuzování skutečné závažnosti? • • • •

• •

Pozorování a záznam účinků často přestavují samostatné postupy oddělené od vlastního posouzení skutečné závažnosti. K zajištění účinného každodenního sledování zvířat by měly být vymezeny jasné sféry odpovědnosti, spolu s odpovídající podporou a dozorem. Měl by být zaveden postup ověřování přispívající ke konzistentnosti závěrů, např. pomocí srovnání hodnot stanovených při posuzování různými osobami. Role týkající se pozorování a sledování zvířat a posuzování skutečné závažnosti by měly být flexibilní a přizpůsobitelné na základě složitosti a závažnosti příslušné studie – přestože právní odpovědnost za zajištění toho, že bude případné utrpení zjištěno a minimalizováno, zůstává na osobě, která je uvedena ve schvalovacím dokumentu projektu. K zajištění konsistentnosti by měly na úrovni prováděcí instituce rovněž přispívat orgány pro dobré životní podmínky zvířat. K podpoře konzistentnosti mohou rovněž přispět vnitrostátní výbory a příslušné orgány.

Nástroje sledování, média a další faktory • •

• • • • •

•

•

•

Využití listů bodového hodnocení by mělo být připraveno již ve fázi plánování projektu. Listy bodového hodnocení by měly být co nejjednodušší, přitom by však měly obsahovat všechny potřebné detaily a být přizpůsobeny příslušnému typu studie. Lze využít dříve vytvořených hodnotících listů, jestliže jsou vhodné pro studii, druh a kmen. Elektronické uchovávání záznamů může přispět k zajištění konzistentnosti a snadné přístupnosti veškerých souvisejících informací. Doporučuje se používat standardizovaný jazyk a terminologii. Zaznamenaná data by měla být maximálně objektivní. Výhody a nevýhody systémů pozorování obsahujících i) číselné nebo ii) „binární“ hodnocení (posuzující pouze přítomnost či nepřítomnost ukazatelů) by měly být zváženy případ od případu. Záznamy pozorování jakéhokoli druhu by měly spolu s předem určenými ukazateli obsahovat možnost zápisu volného textu, aby tak bylo možné zaznamenat i neočekávaná pozorování. Účinné školení všech příslušných pracovníků je nezbytností a mělo by se týkat konkrétních způsobů posuzování závažnosti a životních podmínek stejně jako technik sledování. Měl by být zaveden plán komunikace zahrnující všechny příslušné pracovníky, který by obsahoval mechanismus okamžitého sdělování

12

•

•

neočekávaných výsledků všem příslušným osobám a v odpovídajících případech i příslušnému orgánu. Sledování by mělo odpovídat očekávaným účinkům – postupy, které mohou způsobit „vážné“ utrpení budou obvykle vyžadovat častější a podrobnější sledování. Měla by být stanovena jasná kritéria pro zásah – například jestliže jsou pozorovány určité parametry nebo je dosažena předem určená úroveň utrpení. Všichni příslušní pracovníci by měli být s těmito kritérii obeznámeni a vědět, jak postupovat a koho kontaktovat, kdyby se vyskytla.

Jestliže bude postup posuzování závažnosti proveden efektivně, lepší životní podmínky zvířat, zvýšená validita vědeckých výsledků a transparentnost budou přínosem pro zvířata i pro všechny pracovníky podílející se na péči o ně i na jejich využívání. Další výhody přinese dobrá interní i externí komunikace týkající se postupu posuzování závažnosti a uplatňování zásad „tří R“.

13

Dodatek I Glosář z oblasti klinického pozorování Úspěch každého programu posuzování závažnosti závisí na výběru ukazatelů dobrých životních podmínek, které: • jsou snadno a spolehlivě rozpoznatelné, • jsou účinné a zaručují dobrou úroveň životních podmínek, • odpovídají příslušné vědecké studii, druhu a kmeni zvířat (v odpovídajícím případě), • jsou prakticky proveditelné a nepředstavují přílišnou zátěž pro zvíře a • mohou být konzistentním způsobem měřeny, vykládány a analyzovány. Je proto žádoucí společný přístup k záznamu klinických pozorování, neboť přispívá k rozvoji konzistentních přístupů ke klasifikování závažnosti. Usnadňuje srovnání klinických zjištění jednotlivých studií a poskytuje údaje pro všechny zúčastněné při posuzování závažnosti. Pozorování jsou strukturována v následujících šesti nadřazených kategoriích: Vzhled / tělesné funkce / prostředí / chování / ukazatele odpovídající konkrétnímu postupu / volné pozorování Nadřazené kategorie Vzhled

Oblasti, na něž by mělo být pozorování zaměřeno Tělesný stav

Stav srsti a pokožky

Zvláštní ukazatele, které mají být monitorovány Úbytek/nárůst hmotnosti Obezita Podváha Bodové hodnocení tělesného stavu (pokud je dostupné) Piloerekce Zanedbaná/nedostatečná péče Mastná srst Ztráta ochlupení

14

Tělesné funkce

Prostředí

Chování

Dehydratace – nízký turgor kůže Kožní léze – otoky, strupy, vředy, poranění Znečištění výkaly/močí Oční, nosní, urogenitální, znečištění porfyrinem u některých druhů, např. Výtok u potkanů Propadlé nebo „otupělé“ Oči Zavřené/pootevřené Poškození/zranění oka (např. vředovitost rohovky) Slinění Ústa Malokluze/přerostlé zuby „Bolestný obličej“ – např. polozavřené oči a nateklý nos u myší Ostatní Konstrikce v oblasti břicha Zvětšená tělesná část, např. nafouknutá břišní dutina Zrychlené dýchání (tachypnoe) Dýchání Ztížené dýchání (hyperpnoe) Silně ztížené dýchání (dyspnoe) Sípání nebo jiný zvuk při dýchání Zvýšený/snížený Příjem potravy/vody Zvýšená/snížená, naměřená tělesná teplota, je-li měření dostupné (např. Tělesná teplota mikročipem nebo telemetrickým zařízením, kontaktní nebo bezkontaktní termometrií), barva končetin u hlodavců Zhoršený zrak, sluch nebo rovnováha Smysly Prostředí klece/kotce, včetně Přítomnost a konzistence výkalů znečištění, materiálu pro tvorbu hnízd, Vlhká podestýlka, např. důsledkem polyurie prvků obohacení Přítomnost zvratků nebo krve Využití prvků obohacení, jako např. materiálu pro tvorbu hnízd, prvků pro hryzání Změna oproti běžnému chování – úzkostné/agresivní interakce s dalšími Sociální interakce zvířaty, strach (např. zřetelné útěkové reakce, skrývání)

15

Izolace nebo odejmutí od ostatních zvířat ze sociální skupiny Repetitivní/stereotypní chování Nežádoucí chování Vytrhávání chlupů (hlodavci), trichotilomanie Zvýšená agresivita vůči lidem nebo ostatním zvířatům Abnormální postoj Postoj a mobilita Abnormální způsob chůze, ochromenost, nepřítomnost pohybu/letargie/neochota k pohybu při stimulaci Nekoordinované pohyby Skrčené břicho, nakloněná hlava Třes Ostatní Záchvaty/křeče Vokalizace – spontánní nebo evokovaná. (Pozn. – některé druhy, např. hlodavci, obvykle vokalizují v pásmu ultrazvuku, proto jsou slyšitelné vokalizace obzvláště závažné. Vokalizace králíků jsou rovněž obvykle lidskému uchu neslyšitelné, pokud není zvíře ohroženo.) Ukazatele související Tyto ukazatele jsou stanoveny na základě Například u modelu EAE mohou zahrnovat: ztrátu tonu ocasu, slabost s konkrétním jednotlivého projektu, jeho možných zadních končetin, slabost předních končetin, ochrnutí, ztrátu funkce postupem nepříznivých účinků a jejich močového měchýře. očekávaných ukazatelů. Každý program posuzování závažnosti by měl obsahovat možnost záznamu pozorování neočekávaných negativních Volné pozorování dopadů na životní podmínky zvířat.

16

Dodatek II Základní literatura, pokyny a další zdroje dostupné na internetu týkající se posuzování životních podmínek zvířat účastnících se vědeckých postupů American College of Laboratory Animal Medicine (ACLAM) (2006) Guidelines for the Assessment and Management of Pain in Rodents and Rabbits, dostupné na http://www.tinyurl.com/65ez5vh Assessing the Health and Welfare of Laboratory Animals (AHWLA) training resource. Viz http://www.ahwla.org.uk/index.html Canadian Council on Animal Care (CCAC) Welfare assessment. Viz http://www.ccac.ca/, klikněte na dílčí stránky zásady tří R „Three Rs“ a hledejte „welfare assessment“ (v angličtině a francouzštině) Categorising the severity of scientific procedures on animals - Summary and reports from three round-table discussions, ed. Jane A. Smith a Maggy Jennings v zastoupení Boyd Group a RSPCA, červenec 2004 Vydalo oddělení pro výzkumná zvířata RSPCA FELASA Working Group on the Reporting of Clinical Signs in Laboratory Animals (2012) – (v tisku) Institute for Laboratory Animal Research (ILAR) (2008) Recognition and Alleviation of Distress in Laboratory Animals. Washington, DC: National Academies Press Institute for Laboratory Animal Research (ILAR) (2009) Recognition and Alleviation of Pain in Laboratory Animals. Washington, DC: National Academies Press. Viz http://dels.nas.edu/animal_pain/ Johansen R, Needham JR, Colquhoun DJ, et al. (2006) Guidelines for health and welfare monitoring of fish used in research. Laboratory Animals 40: 323–340 Joint Working Group on Refinement (2011) A guide to defining and implementing protocols for the welfare assessment of laboratory animals. Laboratory Animals 45: 1–13 Leach MC et al. (2008) Identification of appropriate measures for the assessment of laboratory mouse welfare. Animal Welfare 17: 161–170 National Centre for the Three Rs http://www.nc3rs.org.uk/welfareassessment

17

(NC3Rs)

Welfare

assessment.

Viz

National Health and Medical Research Council (2008) Guidelines to Promote the Wellbeing of Animals Used for Scientific Purposes: The Assessment and Alleviation of Pain and Distress in Research Animals. Canberra: Australian Government. Viz http://www.nhmrc.gov.au a hledejte výraz „pain and distress“ Organizace pro ekonomickou spolupráci a rozvoj (OECD) (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 19. Paříž: OECD Wells DJ, Playle LC, Enser WEJ, et al. Assessing the welfare of genetically altered mice. Úplná verze dostupná na http://www.nc3rs.org.uk/gamice. Shrnutí v Laboratory Animals 40: 111–114 Workman P et al. (2010) Guidelines for the welfare and use of animals in cancer research. British Journal of Cancer 102: 1555–1577, dostupné na http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2883160/?tool=pubmed 1.2

Doporučené odborné časopisy vhodné pro další čtení

Applied Animal Behaviour Science

http://www.appliedethology.org/applied_animal_behaviour_science.html

Animal Technology and Welfare

http://www.iat.org.uk/publications/atw.htm

Animal Welfare

http://www.ufaw.org.uk/animal.php

Contemporary Topics in

http://www.aalas.org/publications/index.aspx#ct

Laboratory Animal Science a Journal of the American Association for Laboratory Animal Science Lab Animal and Lab Animal

http://www.labanimal.com/laban/index.html

Europe

http://www.labanimaleurope.eu/

Laboratory Animals

http://la.rsmjournals.com/

18

1.3 Doporučená klíčová slova pro vyhledávání v literatuře Následující klíčová slova jsou vhodná pro vyhledávání informací k posuzování závažnosti:

affect (ovlivnění)

harm benefit assessment (posouzení přínosů a škod)

positive indicators (pozitivní indikátory)

severity scale (škála závažnosti)

animal welfare (životní podmínky zvířat)

humane endpoints (humánní ukončení postupu)

positive welfare (dobré životní podmínky)

sickness behavio(u)r (chování při onemocnění)

animal suffering (utrpení zvířat)

needs (potřeby)

qualitative behavio(u)r assessment stress (stres) (kvantitativní hodnocení chování)

assessment (posouzení)

objective assessment (objektivní posouzení)

quality of life (kvalita života)

suffering (utrpení)

discomfort (obtíže)

pain (bolest)

refinement (šetrné zacházení)

welfare assessment (posouzení životních podmínek)

distress (strach/pocit ohrožení)

pain assessment (hodnocení bolesti)

score sheets (listy bodového hodnocení)

welfare indicator (ukazatel životních podmínek)

harm assessment (posouzení poškození)

pain measurement (měření bolesti)

scoring system (bodový systém hodnocení)

welfare outcomes (důsledky pro životní podmínky)

19

Odkazy týkající se klasifikace skutečné závažnosti CCAC (1998) Guidelines on: Choosing an Appropriate Endpoint in Experiments Using Animals for Research, Teaching and Testing. Canadian Council on Animal Care, dostupné na: http://www.ccac.ca/en_/standards/guidelines (v angličtině) a na http://www.ccac.ca/fr_/normes/lignes_directrices (ve francouzštině) FELASA Working Group on Pain and Distress (1994) Pain and distress in laboratory rodents and lagomorphs. Laboratory Animals 28: 97–112 Jones HRP, Oates J and Trussell BA (1999) An applied approach to the assessment of severity. In: Hendriksen CFM. & Morton DB (eds), Humane Endpoints in Animal Experiments for Biomedical Research. Proceedings of the International Conference, 22–25 November 1998, Zeist, Nizozemsko. Royal Society for Medicine Press Ltd., Londýn, s. 40– 47 LASA /APC (2008) Final Report of a LASA/APC Working Group to Examine the Feasibility of Reporting Data on the Severity of Scientific Procedures on Animals. Dostupné na: http://www.lasa.co.uk/publications.html Morton, DB a Hau, J (2011), kapitola 18: Welfare assessment and humane endpoints. In Handbook of Laboratory Animal Science, 3. vydání, svazek 1: Essential Principles and Practices. Hau, J a Schapiro, SJ (eds), CRC Press LLC, USA, s. 535–572 Prescott MJ, Morton DB, Anderson D, Buckwell A, Heath S, Hubrecht R, Jennings M, Robb D, Ruane B, Swallow J and Thompson P (2004) Refining dog husbandry and care, Eighth report of the BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Laboratory Animals 38, příloha 1: S1:1–S1:94 Wolfensohn S and Lloyd M (2003) Handbook of Laboratory Animal Management and Welfare, 3. vydání. Blackwell Publishing Ltd, Oxford (4. vydání v přípravě) (Všechny internetové odkazy byly naposledy ověřeny dne 24. května 2012.)

20

21

Příklady popisující postup klasifikace závažnosti postupů, každodenního hodnocení a posouzení skutečné závažnosti V Bruselu dne 11. ledna 2013 V pracovním dokumentu k rámci posuzování závažnosti vytvořeném pracovní skupinou odborníků Evropské komise a schváleném vnitrostátními orgány příslušnými pro provádění směrnice 2010/63/EU o ochraně zvířat používaných pro vědecké účely na jejich setkání v červenci 2012 se doporučuje vytvořit příklady popisující „postup klasifikace závažnosti postupů, každodenního hodnocení a posouzení skutečné závažnosti“ a zpřístupnit je vědecké komunitě. Na tomto základě připravila pracovní skupina odborníků řadu příkladů dokládajících možné způsoby uplatnění metod popsaných v tomto pracovním dokumentu na různé postupy. Účelem těchto příkladů je pomoci příslušným orgánům, uživatelům, zootechnikům, zvěrolékařům a dalším zúčastněným pracovníkům zajistit, že bolest, utrpení a strach budou účinně předvídány, rozpoznány a, je-li to možné, zmenšeny a v průběhu postupů konzistentně hodnoceny. Tento dokument byl schválen vnitrostátními orgány příslušnými pro provádění směrnice 2010/63/EU na jejich setkání konaném ve dnech 23.–24. ledna 2013. Při využívání těchto příkladů je nezbytné zvážit několik významných faktorů: •

Uplatňování zásad správné praxe během celého postupu s ohledem na umístění zvířat, jejich chov a ošetřování, na postupy šetrného zacházení, na vzdělávání a školení, na hodnocení způsobilosti, na zjišťování a uplatňování aktuálních informací týkajících se nahrazení a omezení používání zvířat a šetrného zacházení s nimi a na návrh pokusů.

f

22

•

Hodnotící listy obsažené v příkladech jsou zamýšleny jako doplněk, nikoli jako náhrada, úsudku školených, způsobilých a empatických pracovníků. Cílem je umožnit systematičtější a objektivnější pozorování, udržování záznamů a posuzování utrpení, nikoli nahradit odborný úsudek.

•

Každý z příkladů se vztahuje k hypotetické, avšak realistické situaci. Nebylo by přiměřené zahrnovat všechny podrobnosti, které by mohly být dostupné v praxi, zahrnuty jsou však dostatečné podrobnosti k tomu, aby bylo možné vysvětlit, jak je způsob uplatňován.

•

Jak uvádí pracovní dokument, posouzení závažnosti je nezbytné promyslet a přizpůsobit druhu, kmeni a postupu prováděnému v zařízení příslušného uživatele. Na tomto základě skupina odborníků silně nedoporučuje používat tabulky a systémy bodového hodnocení obsažené v příkladech beze změny, a to ani pro totožné postupy. Všechny metody posouzení závažnosti by měly být pravidelně přezkoumávány z hlediska své účinnosti a podle potřeby upravovány.

•

Uvedené příklady jsou rovněž předmětem přezkumu v souvislosti s tím, jak se rozšiřují vědomosti o ukazatelích bolesti, utrpení a strachu a mění přístupy k posuzování a klasifikaci závažnosti. Každý příklad je označen datem – aktualizace vyhledejte na internetových stránkách EK http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/interpretation_en.htm.

•

Zpětná vazba k využitelnosti příkladů a návrhy na zahrnutí dalších postupů budou vítány; komentáře laskavě posílejte na [email protected]

23

Obsah:

Model 1 – Onkologické studie ....................................................................................................................................................................... 25 Model 1a) – Udržování lidských nádorových buněčných linií na imunokompromitovaných bezsrstých myších ........................ 26 Model 1b) Účinnost nových farmaceutických přípravků na růst nádorů – postup ve více krocích.............................................. 32 Model 2 – Experimentální autoimunitní encefalitida (EAE) u myší .............................................................................................................. 41 Model 3 – Artritida ........................................................................................................................................................................................ 51 Model 4 – Cévní mozková příhoda ................................................................................................................................................................ 62 Model 5 – Produkce polyklonálních protilátek u králíků .............................................................................................................................. 74 Model 6 - Tvorba geneticky modifikovaných (GM) zvířat a péče o ně ........................................................................................................ 81 Model – GeneAtm1a(Funding)Lab ......................................................................................................................................................................................................................................... 83 Model –Tg(GeneB)Labcode ................................................................................................................................................................................................................................................. 89 Model – GeneCtm1a(Funding)Lab ......................................................................................................................................................................................................................................... 91

24

Ilustrativní příklady posuzování závažnosti Model 1 – Onkologické studie (1a a 1b) Poslední aktualizace: 05/02/2013 1. Zvířecí modely v onkologických studiích (1a a 1b) Obecné souvislosti: Hodnocení nových protirakovinných účinných látek in vivo Rakovina je významnou příčinou úmrtí v rozvinutém světě, přičemž stárnutí lidské populace nevyhnutelně povede ke zvýšení zasažení tímto onemocněním. V roce 2010 byla v EU pravděpodobnost úmrtí souvisejícího s rakovinou před dosažením věku sedmdesáti let jedna ku sedmi. Je proto nezbytné vyvíjet nová a účinnější léčiva pro léčení rakoviny. Mezi jejich přínosy bude snížení úmrtnosti na rakovinu a zvýšení kvality života těch, u nichž se rakovina v budoucnosti rozvine. Při vývoji nových přípravků pro léčbu rakoviny jsou v současnosti vedle počítačového modelování a technik in vitro, jako jsou zkoušky na buněčných kulturách, využívány zvířecí modely. Po potvrzení selektivity a aktivity sloučenin in vitro jsou na zvířatech testovány pouze ty sloučeniny, které vykázaly příznivé vlastnosti. Studie snášenlivosti látek jsou prováděny na malých skupinách zvířat s cílem stanovení maximální tolerované dávky (MTD) a vhodného dávkování ještě před provedením rozsáhlejších studií účinnosti. Závažnost účinků na zvířata bude záviset na modelech a účelu studie. Například udržování nádorových buněčných linií by nemělo mít na životní podmínky významný dopad za předpokladu, že jsou dodržovány zásady správné praxe po celou dobu provádění, včetně odpovídajícího sledování zvířat a využití včasného humánního ukončení postupu. Oproti tomu studie hodnotící nový způsob léčby na metastatických modelech budou mít pravděpodobně závažnější dopady na životní podmínky z důvodu rozvoje vícečetných nádorů a pravděpodobných nepříznivých účinků cytotoxických léčiv. Byla zveřejněna řada pokynů pro životní podmínky zvířat a jejich využití při výzkumu rakoviny, například v British Journal of Cancer (Workman et al., 2010). Uveden v nich je podrobný přehled různých dostupných zvířecích nádorových modelů, jejich dopadu na zvířata a možností minimalizace utrpení.

25

Zde uvádíme dva příklady, které popisují zvířecí onkologické modely klasifikované v různých stupních závažnosti. Odkazy Workman et al. (2010) Guidelines for the welfare and use of animals in cancer research. British Journal of Cancer (2010) 102(11), 1555–1577; volně dostupné na http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2883160/pdf/6605642a.pdf 1a) – Udržování lidských nádorových buněčných linií na imunokompromitovaných bezsrstých myších Některé lidské nádorové buněčné linie se při umělém pěstování spolehlivě nereplikují a v některých případech je potřeba charakterizovat a udržovat lidské buněčné linie na xenogenním in vivo modelu. Studie 30 samčím bezsrstým BALB/C myším bude do levého boku subkutánně vstříknut buněčný roztok 10³ HCT 116 v 0,1 ml solného roztoku. Zvířata budou umístěna ve skupinách v individuálně větraných klecích (IVC) obsahujících stelivo a materiál na stavbu hnízda. Životní podmínky zvířat budou denně hodnoceny a zvířata budou každé čtyři dny vážena. Jedinci budou vyšetřeni pohmatem na přítomnost nádorů každý druhý den a všechny zjistitelné nádory budou rovněž každý druhý den měřeny posuvným měřítkem. Zvířata budou utracena 15. den za účelem vyjmutí nádorů.

26

Úvodní předběžné posouzení a zvážení konkrétních možností zvýšení šetrnosti zacházení a humánního ukončení postupu Jaké jsou dopady této Co při ní budou zvířata zakoušet? Jakým způsobem bude utrpení minimalizováno? studie na zvířata? Jak velké utrpení může způsobit? Co by ho mohlo zhoršit? Nepříznivé účinky

Postupy a zákroky

Zvířata jsou náchylná k infekci. Ošetřování imunokompromitovaných myší

Ukončení postupu

Jsou umístěna v individuálně Každé zvíře vykazující známky větraných klecích a postupy chovu onemocnění bude utraceno. jsou přizpůsobeny minimalizaci nebezpečí kontaminace. Zvířata jsou umístěna ve skupinách a je jim poskytnuto obohacení prostředí omezující stres. Způsoby chovu a ošetřování budou upraveny, jestliže budou zjištěny známky strachu, agrese nebo abnormálního chování.

Subkutánní injekce Přechodná injekci. nádorových buněk

bolest

následující

po Injekce aplikována pouze jednou.

V případě, že budou následkem injekce pozorovány větší než mírné Vstříknuto bude vhodné množství bolesti nebo strach, které rychle (nejvýše 0,2 ml). neodezní (velmi vzácné případy), Zvířata budou v období budou zvířata humánně utracena. bezprostředně navazujícím na

27

injekci bedlivě sledována. Růst nádoru

Může být příčinou bolesti ovlivnit normální chování lokomoci. Nádor může být infikován zvředovatět (neměl by metastázovat).

nebo Růst nádoru bude měřena každý Jestliže dojde k zvředovatění nebo druhý den. nádoru nebo jestliže má nádor vliv na normální chování, postoj nebo Program sledování bude zahrnovat lokomoci nebo přesáhne 1,2 cm nebo pečlivé pozorování postoje a průměru, bude zvíře utraceno však způsobu chůze a velikosti a stavu (Workman et al., 2010). nádoru.

Analýza Očekávají se pouze MÍRNÉ obtíže a v případě, že zvířata budou mít zdravotní problémy nebo budou jejich životní podmínky narušeny nad tuto úroveň, budou utracena. Předběžná klasifikace závažnosti jako „MÍRNÉ“ je proto přiměřená. Příklad úplného záznamového listu pozorování je uveden na závěr tohoto modelu. Poznatky z klinického pozorování Byl navržen základní list bodového hodnocení zaměřený na velikost nádoru, tělesnou hmotnost, postoj a způsob chůze, neboť není očekáváno mnoho dalších klinických projevů. Na listu byl ponechán prostor pro volný záznam neočekávaných klinických projevů. Záznam NAD (no abnormality detected – nezjištěna abnormalita) stvrzuje, že byla zvířata zkontrolována a nebyly zjištěny žádné abnormality. Příklad je uveden níže.

28

Výsledky • • • •

U žádného ze zvířat nebyl zaznamenán podstatný úbytek váhy. U 5 zvířat nebyl zaznamenán rozvoj nádoru. U 25 zvířat se rozvinuly nádory na boku. Tyto nádory nenarušily normální chování a měřily nejvýše 1 cm ve 14. dni, kdy byla zvířata utracena v souladu s postupem studie za účelem vyjmutí nádorů. V jedné kleci došlo k agresivnímu chování a soubojům; jedno zvíře mělo rány po pokousání na ocasu a na zádech a bylo separováno v samostatné kleci; rány byly denně lokálně dezinfikovány až do zahojení a zvíře bylo uchováno až do konce postupu.

Posouzení skutečné závažnosti •

Studii dokončilo 29 zvířat, aniž by došlo k více než mírnému utrpení souvisejícímu s injekcí a růstem nádoru. Skutečná závažnost byla u těchto myší zhodnocena jako MÍRNÁ. 1 zvíře mělo rány následkem pokousání, a ty byly účinně ošetřeny. U tohoto zvířete došlo k dalšímu utrpení následkem agrese, které však nesouviselo se samotným postupem. Tyto události byly účinně řešeny a utrpení bylo minimalizováno. Ačkoli byla míra utrpení zakoušeného tímto zvířetem zhodnocena jako střední, jelikož tato událost neměla souvislost se samotným postupem, byla skutečná zaznamenaná závažnost související s postupem zhodnocena jako MÍRNÁ.

Příklad záznamového listu pozorování (vyplněného pro hypotetický případ) Růst nádoru u bezsrstých myší – postup a záznamový list pozorování Klec 1 – myši číslo 1–5 Datum

Postup

Velikost nádoru (cm)

Hmotnost (g)

Klinické pozorování – pečlivě zkontrolujte postoj a způsob chůze

29

28.2

subkut. injekce

1)21 2) 22

Bez známek narušení životních podmínek následně po injekci

3) 21 4) 22 5) 22 1.3. 2.3.

Nezjištěna abnormalita (NAD) Pohmat

NAD

3.3. 4.3.

NAD Pohmat

1) 21

NAD

2) 22 3) 21 4) 22 5) 22 5.3. 6.3. 7.3.

NAD Pohmat

NAD Přítomnost agresivního chování; zranění nezjištěno

30

8.3.

Měření nádoru

1) 0,1

1) 21

2) 0,1

2) 22

3) 0,1

3) 21

Myš 1 měla rány z pokousání na ocasu a zádech – lokální ošetření; přemístěna do samostatné klece. Poskytnut hnízdní box pro samostatně umístěné zvíře, avšak odstraněn z klece s ostatními čtyřmi myšmi z obavy před možným spuštěním agrese

4) bez nádoru 4) 22 5) 0,2

5) 22

9.3.

10.3.

Rány u myši 1 dezinfikovány, dobře probíhající hojení; bez známky agrese mezi zbývajícími zvířaty Měření nádoru

1) 0,2

Rány u myši 1 dezinfikovány

2) 0,1 3) 0,1 4) bez nádoru 5) 0,2

11.3. 12.3.

Rány u myši 1 dezinfikovány Měření nádoru

1) 0,4

1) 22

2) 0,3

2) 22

3) 0,3

3) 21

Rány u myši 1 zahojeny, ukončení dezinfekce

31

4) bez nádoru 4) 21 5) 0,5 13.3. 14.3.

5) 23 NAD

Utracení a vyjmutí nádorů

1b) Účinnost nových farmaceutických přípravků na růst nádorů – postup ve více krocích Záměrem studie je posoudit účinnost nových účinných látek pro zpomalení nebo zastavení růstu nádorových buněk. Před započetím léčby musí být nádor dostatečně rozvinut (průměr 0,5 cm je obvykle dostatečný) – z důvodu délky trvání studie se některé nádory mohou rozvinout až do průměru 1,2 cm, především v kontrolní skupině s vehikulem. U cytotoxických léčiv je pravděpodobný výskyt nepříznivých účinků na dobré životní podmínky. 30 samčím bezsrstým BALB/C myším budou vstříknuty pomalu rostoucí nádorové buňky (0,1 ml). Životní podmínky budou hodnoceny denně a zvířata budou jednou týdně vážena po dobu tří po sobě jdoucích týdnů. Růst nádoru bude měřen posuvným měřítkem 7. a 14. dne; 20. dne budou nádory opětovně měřeny, zvířata budou randomizována a bude zahájena léčba v podobě intraperitoneální injekce dvakrát denně po dobu 7 dnů.

32

Úvodní předběžné posouzení a zvážení konkrétních možností zvýšení šetrnosti zacházení a humánního utracení Jaké jsou dopady této Co při ní budou zvířata zakoušet? Jakým způsobem bude utrpení minimalizováno? studie na zvířata? Jak velké utrpení může způsobit? Co by ho mohlo zhoršit? Nepříznivé účinky

Postupy a zákroky

Zvířata jsou náchylná k infekci. Ošetřování imunokompromitovaných myší

Ukončení postupu

Jsou umístěna v individuálně Každé zvíře vykazující známky větraných klecích a postupy chovu přidruženého onemocnění bude jsou přizpůsobeny minimalizaci utraceno. nebezpečí kontaminace. Zvířata jsou umístěna ve skupinách a je jim poskytnuto obohacení prostředí omezující stres. Způsoby chovu a ošetřování budou upraveny, jestliže budou zjištěny známky strachu, agrese nebo abnormálního chování.

Subkutánní injekce Přechodná injekci. nádorových buněk

bolest

následující

po Injekce aplikována pouze jednou.

V případě, že budou následkem injekce pozorovány větší než mírné Vstříknuto bude vhodné množství bolesti nebo strach, které rychle (nejvýše 0,2 ml). neodezní (velmi vzácné případy), Zvířata budou v období budou zvířata humánně utracena. bezprostředně navazujícím na injekci bedlivě sledována.

33

Růst nádoru

Může být příčinou bolesti ovlivnit normální chování lokomoci.

nebo Každodenní pozorování zvířat, Jestliže dojde k zvředovatění nebo pravidelné sledování celkového nádoru nebo jestliže má nádor vliv zdravotního stavu a růstu nádoru. na normální chování, postoj nebo lokomoci nebo přesáhne 1,2 cm Nádor může být infikován nebo Program sledování bude zahrnovat průměru, bude zvíře utraceno zvředovatět (neměl by však pečlivé pozorování postoje, (Workman et al., 2010). metastázovat). způsobu chůze a velikosti a stavu nádoru. Farmaceutické zákroky budou zahájeny, jakmile nádor dosáhne průměru 0,5 cm (měřeno posuvným měřítkem).

Intraperitoneální injekce Přechodná bolest následující injekci; nového farmaceutického Cytotoxická léčiva mohou způsobit přípravku průjem, úbytek váhy, anorexii nebo netečnost.

Zvířata budou v období Zvířata budou utracena, jestliže bezprostředně po aplikaci injekce úbytek váhy přesáhne 20 % bedlivě sledována počáteční tělesné hmotnosti. Zvířata nepřijímající potravu nebo Nejvyšší objem 10 ml/kg denně po postižená průjmem po dobu delší dobu 7 dnů. než 48 hodin budou utracena. Budou použity minimální velikosti Horní mez klinického bodového dávek (stanovené na základě studií hodnocení bude odpovídat dávkování). humánnímu ukončení postupu. K posouzení životních podmínek bude použit systém klinického bodového hodnocení.

34

Analýza Na základě velikosti nádoru, zvýšeného potenciálu zvředovatění, četnosti injekcí a nepříznivých účinků podávaných léčiv je v tomto případě přiměřená předběžná klasifikace závažnosti označena jako STŘEDNÍ. Mohla by mez závažnosti být stanovena jako MÍRNÁ? To by bylo možné pouze v případě, že by se vědeckých cílů studie dalo dosáhnout při použití ranějšího ukončení postupu, například omezením maximální velikosti nádoru. Obnášelo by to rovněž injekci léčiv v dávkách, u nichž je známo, že nemají žádné nepříznivé klinické účinky. Za těchto předpokladů by hodnocení závažnosti jako MÍRNÉ mohlo být považováno za přiměřené. Poznatky z klinického pozorování Příklad záznamového listu pozorování a vzorový list bodového hodnocení jsou uvedeny na závěr tohoto modelu. Výsledky Ze 30 samčích BALB/C myší jich 25 bylo použito pro posouzení účinnosti; 10 zvířat obdrželo přípravek B v dávce H, 10 přípravek B v dávce X a 5 přípravek C v dávce Y. Posouzení skutečné závažnosti • • • •

U 3 zvířat se nerozvinuly nádory a byla utracena jako nepoužitelná pro experiment – MÍRNÁ. U 2 zvířat se rozvinulo zvředovatění v místě vpichu nádorových buněk před zahájením léčby a byla utracena – STŘEDNÍ. U 10 zvířat, kterým byl podáván přípravek B v dávce H, byly přítomny nádory, které zůstaly relativně malé, nedošlo k významnému úbytku tělesné hmotnosti a nebyly zaznamenány klinické příznaky – MÍRNÁ. U 7 zvířat, kterým byl podáván přípravek B v dávce X, došlo ke zmenšení nádoru, 15% úbytku tělesné hmotnosti a výskytu nepevné stolice, byla však udržena až do skončení pokusu – STŘEDNÍ.

35

• •

U 3 zvířat, kterým byl podáván přípravek B v dávce X, došlo ke zmenšení nádoru, 15% úbytku tělesné hmotnosti, výskytu nepevné stolice, anorexii a výrazné netečnosti; tato zvířata byla humánně utracena v 25. dni – ZÁVAŽNÁ. U 5 zvířat, kterým byl podáván přípravek C v dávce Y, se vyskytoval setrvalý nárůst velikosti nádoru, došlo ke zvýšení tělesné hmotnosti a nebyly zaznamenány klinické příznaky mimo růst nádoru. Tato zvířata byla utracena, jakmile velikost nádoru překročila 1,2 cm – STŘEDNÍ.

Příklad listu bodového hodnocení Zvíře č. Datum

1.6.

2.6.

3.6.

4.6.

Vzhled Tělesná hmotnost Stav srsti Tělesné funkce Dyspnoe nebo tachypnoe Příjem potravy Prostředí Nepevná stolice nebo diarea Krvavá diarea

36

Chování Manipulace Agrese Abnormální chůze Abnormální postoj Neochota k pohybu Ukazatele související s konkrétním postupem Velikost nádoru Zvředovatění nádoru Nádor zabraňující pohybu Celkové hodnocení Další poznámky

37

Příklady klinického bodového hodnocení Vzhled

Hodnocení Činnosti

Tělesná hmotnost 5–10% úbytek hmotnosti

1

11–15% úbytek hmotnosti

2


3

20% a vyšší úbytek hmotnosti

Humánní ukončení postupu

Hodnocení Revidujte četnost sledování. 1

Stav srsti Mírně zanedbaná srst

1

Mírná piloerekce

2

Výrazná piloerekce

3

Tělesné funkce Tachypnoe (zrychlené dýchání)

1

Dyspnoe (ztížené dýchání)

3

Prostředí

38

2

Zvažte doplňkovou péči, např. doplnění tekutin.

4

Konzultujte zvěrolékaře.

6

Uplatněte humánní ukončení postupu.

Nepevná stolice nebo diarea

1

Krvavá diarea


Chování Úzkostné a nervózní při manipulaci

1

Dokládající výrazný pocit ohrožení při manipulaci, např. třesem, vokalizací, agresí

3

Lokomoce Mírně abnormální postoj/chůze

1

Výrazně abnormální postoj/chůze

2

Významné obtíže s pohyblivostí/neochota k pohybu

3

Imobilita > 24 h


Ukazatele související s konkrétním postupem Velikost nádoru > 1,2 cm

Humánní ukončení

39

postupu Zvředovatění nádoru


Nádor zabraňující pohybu


40

Ilustrativní příklady posuzování závažnosti Model 2 – Experimentální autoimunitní encefalitida (EAE) u myší Poslední aktualizace: 05/02/2013 Obecné souvislosti Experimentální autoimunitní encefalitida (EAE) se používá k modelování řady aspektů roztroušené sklerózy (RS) u hlodavců a primátů. RS je komplexní mnohotvárná neurologická porucha, která se rozvíjí v časné dospělosti. Mezi její příznaky patří záněty, demyelinizace a axonální ztráta. K výzkumu fyziopatologie tohoto onemocnění a k hodnocení potenciálních ochranných a léčebných strategií, včetně imunomodulace, imunoprotekce, axonální regenerace a obnovy myelinu jsou používány zvířecí modely. Mnohotvárné vlastnosti RS s proměnlivým časovým průběhem vyžadují použití odpovídajících modelů pro konkrétní otázky týkající se jednotlivých fází onemocnění. EAE ovlivňuje spuštění činnosti imunitního systému cílené na myelin, která vyvolává zánět centrálního nervového systému a otevření hematoencefalické bariéry. Následkem může být závažný neurologický syndrom zvířecího modelu, jenž by měl být následován částečným zotavením v průběhu první chronické relaps-remitentní fáze. Tato fáze je spojena se zánětem a reverzibilní demyelinizací. Po 9–10 týdnech zvíře vstoupí do progresivní fáze, která je spojena s chronickou demyelinizací a axonální ztrátou. V průběhu této fáze je možné hodnotit různé terapeutické strategie. Je třeba pečlivě zvolit humánní a vědecká ukončení postupu a zároveň zohlednit cíle studie. Odkazy Emerson MR et al. (2009) Enhancing the ability of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis to serve as a more rigorous model of Multiple Sclerosis through refinement of the experimental design. Comparative Medicine 59: 112–128 Miller SD et al. (2010) Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. 88: 15.1.1 – 15.1.20 Weissert R (ed) (2012) Experimental Autoimmune Encephalomyelitis - Models, Disease Biology and Experimental Therapy. Vydal In Tech, DOI: 10.5772/1190, http://www.intechopen.com Wolfensohn S et al. (připravováno) Reducing suffering in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.

41

Studie V tomto příkladu bude indukována EAE u čtyř samců a čtyř samic myší Biozzi ABH (často používaný kmen s předpokládanou vysokou úrovní přenositelnosti) za účelem posouzení možné terapie RS. Po skončení počáteční fáze plánování uživatel zváží všechny události, které mohou na zvířata nepříznivý dopad, a identifikuje potenciální příčiny utrpení ve spolupráci se zootechnikem, ošetřovateli a ošetřujícím zvěrolékařem. Prozkoumají možnosti zvýšení šetrnosti a začlení je do projektu. Myši budou umístěny ve čtyřčlenných jednopohlavních sociálních skupinách. Zvláštní pozornost bude věnována místnímu prostředí, neboť zvířata s EAE budou výrazně motoricky deficientní. Klece budou vybaveny pevnou podlážkou, podestýlkou z pilin, odpovídajícími úkryty a materiálem pro stavbu hnízd a prvky na hryzání. Zvířata budou ošetřena podpůrnou látkou zvyšující zánětlivost vyvolávající EAE a sledována v průběhu zotavování a chronické relaps-remitentní fáze (9 až 10 týdnů). Po rozvinutí progresivní formy budou na myších hodnoceny zkoušené léčebné sloučeniny v průběhu třítýdenní studie. Úvodní předběžné posouzení a zvážení konkrétních možností zvýšení šetrnosti zacházení a humánního ukončení postupu Jaké jsou dopady této Co při ní budou zvířata zakoušet? Jakým způsobem bude utrpení minimalizováno? studie na zvířata? Jak velké utrpení může způsobit? Co by ho mohlo zhoršit? Nepříznivé účinky

Postupy a zákroky

Vícenásobné injekce Obtíže nebo bolest způsobené V několika subkutánních bodech adjuvans podporující vstřikováním. budou vstříknuty malé dávky zánětlivost (nikoli na chodidlových polštářcích Možná reakce v místě vpichu, vznik a na spodní části ocasu). iritace nebo nepříjemných pocitů. Složení adjuvans a vehikula je vytvořeno tak, aby byla minimalizována iritace. Zvířata budou po injekci sledována.

42

Ukončení postupu Zvířata budou humánně utracena, jestliže bude po injekci pozorována větší než přechodná bolest nebo pocit ohrožení.

Vyvolání EAE – počáteční závažný neurologický syndrom následovaný fází zotavení

Ochrnutí, které může být příčinou strachu nebo úzkosti: ztráta tonu ocasu, slabost zadních končetin, hypomotilita, ochrnutí končetin, urinární dysfunkce (inkontinence nebo retence).

Urinární funkce bude sledována prostřednictvím každodenní kontroly močového měchýře. Jestliže to bude nutné, bude obsah močového měchýře v případech retence vytlačen manuálně (za pozorného sledování známek bolesti nebo strachu po vyprazdňování měchýře). V případech inkontinence bude u zvířat opakovaně kontrolována přítomnost vlhké podestýlky a hnízdního materiálu v kleci; podle nutnosti budou nahrazeny čerstvým materiálem. Klece budou vybaveny přiměřenými úkryty a materiálem pro stavbu hnízd.

Významný úbytek váhy (např. až 35 %)

Bude zaručen trvalý přístup k vodě a potravě umístěným v nádobách na podlaze klece. Tělesná hmotnost a stav budou sledovány denně a po nástupu úbytku hmotnosti budou hodnoceny

43

Humánní ukončení postupu ve všech následujících případech: • • • •

• • • • •

oboustranné ochrnutí předních končetin po dobu > 24 h, oboustranné ochrnutí zadních končetin po dobu až 5 dnů, jakékoli sebepoškozování, vytrvalá urinární retence/neschopnost vyprázdnění močového měchýře, paréza (ztráta pohyblivosti; částečné ochrnutí), úbytek hmotnosti dosahující 35 %*, zastavení příjmu potravy nebo vody po dobu > 24 h po vzniku onemocnění, nezotavení z EAE tři týdny po vzniku klinického onemocnění, klinické příznaky přidruženého onemocnění, např. shrbenost.

častěji (podle potřeby).

Bude poskytována namáčená potrava a tekutiny, v případě potřeby s doplňkovým subkutánním přísunem. Relaps-remitentní klinický průběh

Chronický neurologický deficit

Omezeny budou všechny stresory včetně hladiny hluku. Teplota prostředí bude podle potřeby zvyšována pomocí vyhřívacích polštářků, doplňkové podestýlky a hnízdního materiálu.

Podání nové léčebné látky (v průběhu progresivní fáze)

Obtíže způsobené injekcí. Vedlejší účinky nebo nedostatečná účinnost látky

Po injekci zkoušené látky budou zvířata pozorně sledována.

Při zjištění kteréhokoli z výše uvedených ukazatelů nebo v případě jakýchkoli závažných vedlejších účinků způsobených novou léčebnou látkou budou zvířata humánně utracena.

* 35% úbytek hmotnosti představuje krajní hranici pro ukončení postupu vyžadující důkladné vědecké odůvodnění. V tomto případě je významný úbytek hmotnosti nevyhnutelný a zvířata jsou schopna se z něj s odpovídající pomocí zotavit, např. zvýšením tepla a krmení, včetně v případě potřeby ručního krmení. Hranice pro ukončení postupu je u této konkrétní studie nastavena na 35 % za účelem omezení nutnosti

44

vyvolávat EAE u dalších nepoznamenaných zvířat, která by byla v případně „běžnější“ úrovně pro ukončení postupu (např. 20 %) podstatně vyšší. Analýza Předběžné hodnocení závažnosti jako ZÁVAŽNÉ je považováno za přiměřené, neboť se očekává, že postup bude příčinou závažného narušení celkových životních podmínek zvířete. Mohla by být závažnost stanovena jako STŘEDNÍ? Přestože by z výše uvedených důvodů měla předběžná závažnost tohoto modelu být vždy hodnocena jako ZÁVAŽNÁ, zpětná klasifikace závažnosti může být STŘEDNÍ v závislosti na délce trvání studie a uplatnění raného ukočení postupu, jak již zde bylo uvedeno. Poznatky z klinického pozorování V průběhu studie byly myši sledovány zootechniky a ošetřovateli za použití systému listu bodového klinického hodnocení, který byl po diskuzi s uživateli, zootechniky, ošetřovateli a zvěrolékařem přizpůsoben postupu. Systém obsahoval parametry týkající se hmotnosti, stavu srsti, tonu ocasu, kontroly močového měchýře, vzpřímenosti, způsobu chůze, parézy a pokročilých známek (klidová poloha na boku; téměř úplné ochrnutí; zrychlené, zpomalené nebo hluboké dýchání). Projekt zahrnoval řadu postupů, při nichž byla zvířata pozorně sledována a uživatel prováděl průběžné a pravidelné přezkoumávání závažnosti ve spolupráci s orgánem pro dobré životní podmínky zvířat, zootechnikem a ošetřujícím zvěrolékařem. Ilustrativní příklad listu bodového hodnocení je uveden níže.

45

Příklad listu bodového hodnocení Tabulka. List klinického bodového hodnocení používaný pro myši s EAE Datum: Vzhled Tělesná hmotnost Stav srsti Tělesné funkce Ovládání močového měchýře Tonus ocasu Dýchání Prostředí Stav hnízda Chování Sociální chování Způsob chůze

46

Ukazatele související s konkrétním postupem Klidová poloha na boku Doba vzpřímení Paréza Ochrnutí Další pozorování (volný text)

Poznámky: Každý ukazatel byl hodnocen podle systému uvedeného v následující tabulce, podle níž by (například) byla do tabulky zanesena hodnota 1 u ukazatele „tonus ocasu“, jestliže by bylo pozorováno omezené napřimování, nebo 2 u ukazatele „stav hnízda“, pokud by byl v hnízdě narušen pořádek. Tabulka. Systém hodnocení pro ukazatele v listu bodového klinického hodnocení EAE Hodnocení:

1 = Mírné

2 = Střední

3 = Závažné

Úbytek hmotnosti

Do 10 %

10 až 20 %

20 až 35 %

Stav srsti

Mírně zanedbaná

Nepřítomnost péče o srst

Výrazná/prodloužená piloerekce

Ovládání močového měchýře – inkontinence

Průkazná určitá ztráta ovládání, např. nízká míra močení v hnízdě

Výraznější „únik“ moči

Inkontinence

47

Ovládání močového měchýře – retence

Močový měchýř je hmatný, ale při K vyprázdnění měchýře je nutná manipulaci se vyprázdní mírně zvýšená síla

Neschopnost močení bez asistence; známky bolesti/strachu v průběhu nebo po manuálním vyprázdnění

Tonus ocasu

Omezené napřimování nebo stáčení ocasu

Ztráta tonu v distální polovině ocasu

Ztráta tonu v celém ocasu

Dýchání: zrychlené, zpomalené nebo hluboké dýchání

Mírné

Střední

Výrazné

Stav hnízda

Mírně snížený pořádek

Snaha o tvorbu hnízda, hnízdo je však neuspořádané

Nepřítomnost hnízda

Sociální chování

U mírného utrpení se neočekává žádná změna – bodové hodnocení začíná u 2

Omezená interakce s ostatními zvířaty

Výrazně snížená interakce; pasivita

Způsob chůze

Těžkopádný

Vláčení jedné zadní končetiny

Vláčení obou zadních končetin

Klidová poloha na boku

U mírného a středního utrpení se neočekává žádná změna – bodové hodnocení začíná u 3


Přítomna

Doba vzpřímení

Pomalé vzpřimování při položení na záda

Výrazné obtíže při vzpřimování

Neschopnost vzpřímení do 5 sekund po položení na záda

Paréza

Pomalá abdukce přední končetiny

Omezený rozsah abdukce přední

Nepřítomnost abdukce přední

48

Téměř úplné nebo úplné ochrnutí

při položení na záda

končetiny při položení na záda

končetiny



Přítomno

Posouzení skutečné závažnosti Po skončení každého z postupů byl list hodnocení prohlédnut u každého jedince a zkontrolovány dosažené hodnoty ukazatelů a jejich změny v průběhu času. • • • •

U dvou myší byl zaznamenán 8% úbytek tělesné hmotnosti po vyvolání EAE, měly mírně neudržovanou srst a pomalou abdukci přední končetiny, u dalších ukazatelů však po prvních 5 dnů projektu dosahovaly úrovně 2 hodnocení. V relaps-remitentní fázi se pak hodnoty všech jejich ukazatelů navrátily na 1 nebo 0, kde zůstaly po dobu zkoušky přípravku. Závažnost = STŘEDNÍ. Tři z myší ztratily 22 až 32 % své tělesné hmotnosti a v relaps-remitentní fázi, a po dobu zkoušky přípravku pak dosahovaly kombinace hodnocení 3, 2 a 1. Závažnost = ZÁVAŽNÁ. Jedna z myší ztratila 37 % své tělesné hmotnosti ve fázi navazující na indukování a byla humánně usmrcena. Závažnost = ZÁVAŽNÁ. Dvě z myší ztratily jedna 15 % a druhá 18 % své tělesné hmotnosti a u všech ostatních ukazatelů dosahovaly úrovně hodnocení 2 a 3 po první čtyři dny studie. V relaps-remitentní fázi a po dobu zkoušky přípravku pak dosahovaly kombinace hodnocení 1 a 2. Závažnost = ZÁVAŽNÁ.

Ochrnutí nebylo pozorováno a dýchání se v prostředí klece ukázalo být obtížně hodnotitelné, oba ukazatele tedy byly odstraněny ze záznamových listů. V polích pro volný zápis byl často zaznamenáván prodloužený pobyt v úkrytu jako raný ukazatel utrpení, byl proto doplněn do listů pro použití v dalších projektech. U 6 zvířat bylo dosaženo ZÁVAŽNÝCH hodnot, u 2 zvířat STŘEDNÍCH.

49

Možnosti dalšího uplatnění zásad „tří R“ Po posouzení skutečné závažnosti uživatelé konzultovali kolegy a literaturu za účelem nalezení dalších možností zvýšení šetrnosti. Byly identifikovány následující doplňkové možnosti zvýšení šetrnosti: • • •

předcházející krmení zvířat doplňkovou potravou s vysokým energetickým obsahem, například kaší a kondenzovaným mlékem, před podáním adjuvans, použití nižší dávky adjuvans, použití alternativního postupu studie umožňujícího zkrátit dobu trvání projektu.

Tyto možnosti byly doplněny do protokolu pro využití při dalších studiích s cílem srovnat dosažené úrovně skutečné závažnosti a posoudit, zda bylo zvýšení šetrnosti účinné.

50

Ilustrativní příklady posuzování závažnosti Model 3 – Artritida Poslední aktualizace: 05/02/2013 Obecné souvislosti Zvířecí modely artritidy se používají ke studiu patogeneze tohoto onemocnění a k posouzení potenciálu antiartritických léčiv pro klinické užití. Důležitá kritéria pro výběr modelu proto zahrnují morfologické podobnosti s onemocněním u člověka a schopnost modelu předvídat účinnost zkoušených terapeutických sloučenin u člověka. Běžně užívané zvířecí modely revmatoidní artritidy zahrnují: adjuvantní artritidu indukovanou u potkanů, artritidu kolagenu typu II u potkanů, artritidu kolagenu typu II u myší a artritidu u různých druhů indukovanou antigenem (Bendele, 2001). Obvykle je používána injekce na kořeni ocasu, neboť poskytuje dobrou imunitní odpověď, ačkoli literatura popisuje i další místa vpichu injekce. Jednotlivé kmeny se rovněž velice liší z hlediska jejich citlivosti, závažnosti a latence nástupu artritidy. Například citlivost geneticky modifikovaných linií k rozvoji artritidy může být pozměněna (zvýšena nebo potlačena) v závislosti na účincích genové modifikace. U zvířecích modelů artritidy, které byly často využívány a jsou proto dostatečně potvrzeny, bude nástup onemocnění předvídatelný a techniky posuzování mohou být dobře definovány a charakterizovány. U těchto modelů mohou být oproti jednoduchým pozorováním použita vícečetná hodnocení, včetně analýzy způsobu chůze a využití von Freyových filament. Dostupné kmeny, postupy a způsoby zvyšování šetrnosti by měly být pravidelně revidovány a případ od případu by měly být voleny ty, které jsou pro danou vědeckou otázku nejvhodnější (Joe et al, 1999). Modelem uvedeným v tomto příkladu je artritida kolagenu typu II u potkanů, která může být příčinou závažného utrpení. Přesvědčivé vědecké odůvodnění jeho využití je proto zcela nepominutelné. Potkani jsou imunizováni vůči heterolognímu kolagenu typu II, což vede je vzniku lézí obdobných těm, které se vyskytují při revmatoidní artritidě člověka (Bendele, 2001). Výsledná polyartritida je charakterizována výraznou destrukcí chrupavky spojenou s ukládáním imunokomplexů v kloubech, resorpcí kosti a periostální proliferací a střední až závažnou synovitidou a periartikulárním zánětem.

51

Odkazy Bendele, A.M. Animal models of rheumatoid arthritis, J Musculoskel Neuron Interact 2001; 1(4):377–385 Jasemian Y et al. (2011) Refinement of the collagen induced arthritis model in rats by infrared thermography. Br. J. Med. & Med. Res.1(4): 469– 477 Joe, B., Griffiths, M.M., Remmers, E.F., Wilder,R.L. Animal models of rheumatoid arthritis, Current Rheumatology Reports 1999 ; 1 139–149 Studie V tomto příkladu bude artritida indukována u 18 samců a 18 samic potkana kmene Lewis opakovanou injekcí FIA (nekompletního Freundova adjuvans) a kolagenu. Místo vstříknutí se bude nacházet na kořeni ocasu. Každodenní léčba bude zahájena o deset dní později (D10), kdy již dojde k rozvinutí artritidy, a bude pokračovat denně během dalších 14 dnů (do dne D24). Cílem studie je zkouška domnělých léčebných přípravků. Byla přezkoumána dříve publikovaná data o příbuzných sloučeninách s cílem zjistit, zda by poskytnutí analgezie mohlo ovlivnit vědecké cíle, a bylo stanoveno, že by v takovém případě mohl být experiment narušen. Analgezie proto nebude v průběhu rozvoje artritidy ani při kontrolách poskytnuta a zvláštní pozornost bude věnována nefarmakologickým metodám úlevy od bolesti (např. zvýšení šetrnosti chovu), aby bylo utrpení zmírněno. Všechna zvířata budou denně pozorována a vážena, přičemž výsledky budou zaznamenány na list obecného klinického bodového hodnocení, a zkoumána v den D0 (před první injekcí), v den D10 (před zahájením léčby) a ve dny D13, D16, D20 a D24. Testy budou zahrnovat nepřímé měření postižení fyzických funkcí, jako např. průměru kloubů (měřeno posuvným měřítkem), a klinické hodnocení podle systému bodového hodnocení artritidy. Podle získaných klinických hodnot (viz níže) se přistoupí k humánnímu ukončení postupu.

52

Hodnocení nových léčebných farmaceutických přípravků na modelu artritidy u potkana (kolagen typu II) Závažnost ZÁVAŽNÁ Co při ní budou zvířata zakoušet? Jak velké utrpení může způsobit? Co by ho mohlo zhoršit?

Jakým způsobem bude utrpení minimalizováno?

Nepříznivé účinky

Postupy a zákroky

Ukončení postupu

Subkutánní vstříknutí bovinního kolagenu typu II v nekompletním Freundově adjuvans (FIA) na kořeni ocasu až třikrát

Omezený stres.

Empatický přístup a poučená manipulace po celou dobu postupu.

Jestliže zvředovatění kůže přetrvává nebo je infikováno, budou zvířata humánně usmrcena.

Rozvoj artritidy (D0D10)

Nepohodlí, bolest, ochromení a pocit ohrožení; zvíře může vykazovat známky špatného zdravotního stavu včetně ochablého zjevu, nechutenství, neochoty k pohybu, úbytku váhy, otoku kloubů, slyšitelné vokalizace při manipulaci.

Jaké jsou dopady této studie na zvířata?

Přechodná bolest, střední otok v místě vpichu a obtíže po dobu jednoho až dvou dnů.

Standardizovaná dávka a složení zvolené s cílem minimalizovat otoky a bolest.

Zvředovatění kůže je při použití FIA možné, avšak velmi málo pravděpodobné. Pozorné klinické sledování pomocí listu obecného klinického bodového hodnocení se zvýšenou četností sledování při nástupu klinických příznaků (obvykle přibližně ode dne D8-D10). Po celou dobu studie poskytnuta dodatečná měkká podestýlka a materiál pro stavbu hnízda.

53

Při dosažení předem stanovených klinických hodnot pro přistoupení k ukončení postupu (viz tabulku níže) budou zvířata humánně usmrcena.

Snadný přístup k vodě a potravě (např. na podlaze klece) po celou dobu studie. Bude použit systém klinického hodnocení artritidy, který hodnotí stupeň otoku a počet postižených kloubů. Podání farmakologických přípravků (testy a kontroly dvakrát denně) subkutánní nebo intraperitoneální cestou

Přechodná bolest následující po injekci. Na základě předchozích údajů se u zvířat neočekávají nepříznivé účinky farmakologických přípravků.

Každodenní pozorné klinické sledování s využitím listu obecného klinického bodového hodnocení.

Při výskytu významných nepříznivých účinků bude uplatněno humánní ukončení postupu.

Pozorné klinické sledování.

Viz tabulku níže

(od dne D10 do dne D24) Hodnocení účinků farmakologických přípravků na závažnost artritidy (dny D0, D10, D13, D16, D20 a D24)

V závislosti na použitých metodách se může vyskytovat další přechodná bolest nebo nepohodlí, např. kvůli použití von Freyových filament, posuvného měřítka, nutnosti manipulace.

Snížení četnosti sledování (na minimum, které je v souladu s vědeckými cíli) až do zotavení zvířete.

54

Poznámka Systém bodového hodnocení klinických projevů a artritidy by měl být před zahájením studie prozkoumán a schválen v diskuzi mezi výzkumníkem, veterinárním chirurgem, zootechniky a ošetřovateli. Analýza Na základě pravděpodobnosti výrazných klinických dopadů na zvíře, které mohou být přítomny po dobu několika týdnů, je za přiměřené předběžné posouzení závažnosti považována klasifikace ZÁVAŽNÉ. Mohla by být závažnost stanovena jako STŘEDNÍ? To, zda by bylo možné závažnost omezit na střední, závisí na účelu studie. Například jestliže bude zavedeno časté a podrobné sledování zvířat a jestliže existuje možnost použití včasného ukončení postupu (např. při nástupu ochrnutí nebo po období mírného ochrnutí jedné končetiny nebo při použití in vivo zobrazovacích metod ke zjišťování raných změn v patologii kloubů), může být možné závažnost postupu klasifikovat jako STŘEDNÍ. Tato včasná ukončení postupu (např. ukončení studie 6. den po zobrazování) mohou být proveditelná u projektů zkoumajících rané zánětlivé změny. Profylaktická léčba (zahajovaná před plným rozvinutím artritidy) novými farmaceutickými přípravky se silnými protizánětlivými účinky a potlačujícími plný rozvoj artritidy může rovněž vést ke snížení závažnosti na STŘEDNÍ míru. Cílem zde předkládaného typu studie je však hodnocení léčby plně rozvinuté artritidy, závažnost tedy zůstává klasifikována jako ZÁVAŽNÁ. Mohla by závažnost překročit horní mez? Podle článku 15 odst. 2 směrnice „členské státy zajistí, aby postup nebyl prováděn, pokud je jeho součástí způsobení značné bolesti, utrpení nebo strachu, u nichž je pravděpodobné, že budou dlouhodobé a nezmírnitelné.“ Tato studie může způsobit závažné utrpení po dobu několika týdnů, což by mělo být považováno za dlouhodobé. Jestliže by se artritida rozvinula na všech čtyřech končetinách a utrpení zvířete by se nemírnilo, studie by překročila horní mez závažnosti a bylo by nezbytné významně zvýšit její šetrnost nebo využít „ochranné doložky“ (článek 55 směrnice) a požádat Komisi o schválení. V tomto případě jsou však zavedena opatření snižující utrpení – a současně zohledňující vědecký cíl – včetně zvýšení šetrnosti složení, dávkování a výběru adjuvans, které umožňuje rozvinutí artritidy pouze u zadních končetin, poskytnutí komfortního prostředí a snadného

55

přístupu k potravě a vodě a komplexního systému sledování a humánního ukončení postupu. Tento projekt by tedy nebyl považován za přesahující horní mez a může být schválen za předpokladu pozitivního posouzení dalších aspektů projektu včetně hodnocení škod a přínosů. Dále je uveden příklad listu klinického bodového hodnocení pro každodenní pozorování artritických potkanů. Datum:

Den 1

Den 2

Vzhled Tělesná hmotnost Nepřítomnost péče o srst Dehydratace Tělesné funkce Dyspnoe Tachypnoe Chování Neochota k pohybu Otupělost/netečnost Nepohyblivost Vokalizace Ukazatel související s konkrétním postupem

56

Den 3

Den 4

Hodnocení artritické tlapky (viz tabulku 2) Další pozorování (volný text) Celkové hodnocení

Poznámka: Každý z ukazatelů byl posouzen podle systému uvedeného v tabulkách 1 a 2 níže. Do listu bodového hodnocení by například byla zanesena hodnota 1 u ukazatele „nepřítomnost péče o srst“ (tabulka 1) nebo 5 u „ukazatelů souvisejících s konkrétním postupem“, jestliže zadní končetiny dosáhly hodnot 3, respektive 2 (tabulka 2). Dále stanovené činnosti a ukončení postupu zohledňují požadavek předcházení závažnému utrpení vždy, kdy je to možné, nikoli však humánním usmrcením zvířat před získáním dostatečných dat, čímž by vznikla nutnost použití nových, dosud nepoznamenaných zvířat.

57

Tabulka 1. Systém hodnocení pro ukazatele použité v klinickém listu bodovéhoTabulka 2. Ukazatel související s konkrétním postupem – hodnocení hodnocení artritické tlapky Bodové ohodnocení Vzhled Normální < 5% úbytek hmotnosti

0


1

11–15 % úbytek hmotnosti

2


3


úroveň pro humánní ukončení postupu

Nepřítomnost péče o srst

1

Snížený turgor kůže/dehydratace

1

Normální

1

Erytém a otok jednoho kotníku

2

Erytém a otok kotníku a proximální poloviny tarzálních kloubů

3

Erytém a otok kotníku a všech tarzálních kloubů až k metatarzálním kloubům

4

Erytém a otok celé tlapky, včetně prstů

Tento systém hodnocení artritidy použitý jako ukazatel pro konkrétní postup je založen na zvyšující se míře otoku a periartikulárního erytému. Hodnocení je založeno na fyzickém vyšetření a vizuální inspekci a je využíváno ke stanovení „artritického koeficientu“, jenž je definován jako součet hodnot dosažených u obou zadních končetin.

Tělesné funkce Dyspnoe

0

2

58

Tachypnoe

1

Chování Neochota k pohybu

1

Otupělost/netečnost

2

Přetrvávající imobilita < 24 h

3

Imobilita > 24 h

úroveň pro humánní ukončení postupu

Vokalizace při manipulaci

1

Vokalizace, úzkost a nervozita při manipulaci

2

Vokalizace při pohybu/spontánní

3

Ukazatel pro konkrétní postup Hodnocení artritické tlapky (tabulka 2)

0-8

59

Humánní ukončení postupu: uplatněno bez ohledu na přítomnost nebo nepřítomnost dalších klinických projevů. Příklady vhodných zákroků v reakci na celkově dosažené klinické hodnocení Vhodné navazující činnosti

Celkové hodnocení

Zvýšení četnosti sledování; zvážení zvýšení množství poskytovaných tekutin/péče

≥4

Přezkoumání pokroku spolu se zvěrolékařem

5–15


≥16

Poznámka: Celkové hodnocení je převzato z listů klinického hodnocení vyplněných podle systémů bodového hodnocení uvedených v tabulkách 1 a 2. Například zvíře s 12% úbytkem tělesné hmotnosti, známkami snížené péče o srst a otoky obou kotníků zadních končetin by mělo celkové hodnocení 5. Zpětné posouzení: 36 potkanů bylo imunizováno bovinním kolagenem typu II v nekompletním Freundově adjuvans (FIA). U všech zvířat se rozvinula artritida: hodnocení artritické tlapky dosáhlo 6 bodů do dne D10. Všechna zvířata vykazovala úbytek tělesné hmotnosti ve výši 5–10 %. Měření průměru kloubů poukazovala na významné změny oproti výchozím údajům. Každodenní klinická pozorování obsahovala nedostatek péče o srst, neochotu k pohybu, netečnost, vokalizaci při manipulaci (v průběhu pozorování a výměny klece), snížený příjem potravy a období nepohyblivosti. •

12 zvířat bylo použito ve skupině, jež byla ošetřena solným roztokem. Nejvyšší hodnocení artritické tlapky dosáhlo 6 až 8 bodů u všech měření (dny D13, D16, D20 a D24). Měření průměru kloubů poukazovala rovněž na významný nárůst oproti výchozím údajům ve všech časových bodech. Klinická bodová hodnocení se pohybovala mezi 4 a 8, úbytek tělesné hmotnosti dosahoval 5 až 15 %, s výjimkou jednoho zvířete, u nějž úbytek hmotnosti dosáhl 21 % v den D17 a které bylo následně humánně usmrceno. Zpětné posouzení: ZÁVAŽNÉ

•

12 zvířatům byl aplikován PŘÍPRAVEK A v nízké dávce. Hodnocení artritické tlapky se u žádného ze zvířat nelišilo od zvířat, jimž byl aplikován solný roztok, až do dne D16.

60

V den D20 jedno zvíře dosáhlo 8 bodů při hodnocení tlapky, hodnocení ostatních se pohybovala mezi 6 a 7. V den D24 pět zvířat vykazovalo poněkud snížené hodnocení artritické tlapky (5 až 7). Klinické známky u těchto pěti zvířat vykazovaly jisté zlepšení, tělesná hmotnost byla stále snížená o 5 až 10 %, mobilita v kleci zůstávala rovněž snížená. Ostatních sedm zvířat nevykazovalo snížené artritické a klinické projevy ve srovnání se skupinou, jíž byl aplikován solný roztok. Zpětné posouzení: ZÁVAŽNÉ •

12 zvířatům byl aplikován PŘÍPRAVEK A ve vysoké dávce. V den D13 dosahovalo hodnocení artritické tlapky 4 až 6 bodů; průměry kloubů vykazovaly rovněž nevýznamné zvětšení. Klinické známky zahrnovaly nedostatek péče o srst a úbytek tělesné hmotnosti menší než 10 %. V den D16 se hodnocení artritické tlapky snížilo na 4 body a průměry kloubů vykazovaly významné zmenšení. V den D16 se tělesná hmotnost stabilizovala. U některých zvířat byla stále pozorována neochota k pohybu. Od dne D20 dále se hodnocení otoku kloubů snížilo na 2 až 4. V kleci bylo pozorováno normální chování. Tělesná hmotnost se navrátila na úroveň před postupem. Zpětné posouzení: ZÁVAŽNÉ

Poznámka: Do ukončení studie se u třetí skupiny dvanácti zvířat prokázala účinnost testovaného PŘÍPRAVKU A podávaného ve vysoké dávce snížením skutečné závažnosti na střední. Protože však model vyžadoval plné rozvinutí artritidy u všech zvířat před zahájením léčby, kdy zvířata vykazovala klinické známky odpovídající klasifikaci „závažné“, zůstalo posouzení skutečné závažnosti pro tato zvířata na závažné úrovni. Jelikož projekt zahrnoval řadu postupů, byla uživatelem průběžně a pravidelně přezkoumávána závažnost ve spolupráci s orgánem pro dobré životní podmínky zvířat, zootechnikem a ošetřujícím zvěrolékařem s cílem zajistit setrvalé uplatňování tří zásad zvyšování šetrnosti.

61

Ilustrativní příklady posuzování závažnosti Model 4 – Cévní mozková příhoda Poslední aktualizace: 05/02/2013 Obecné souvislosti Cévní mozková příhoda je definována jako ztráta nebo změna normální tělesné funkce, která vzniká nedostatečným prokrvením části mozku. Navzdory lepšímu porozumění patofyziologii cévní mozkové příhody zůstává její účinná léčba významným, dosud nedosaženým cílem lékařství a výzkum zaměřený na nalezení vhodných preventivních a léčebných opatření stále probíhá. U lidských pacientů se vyskytují tři rozdílné typy cévní mozkové příhody: ischemie, intracerebrální hemoragie a subarachnoidální hemoragie, avšak většina v současnosti dostupných zvířecích modelů je založena na typu ischemickém. Modely cévní mozkové příhody představují již ze své podstaty značnou výzvu z hlediska dobrých životních podmínek zvířat. K zajištění odpovídající rovnováhy mezi dosahováním validního modelu a minimalizací utrpení zvířat je klíčová dobrá interakce a komunikace mezi všemi osobami účastnícími se vědeckých postupů (zvěrolékaři, výzkumníci, zootechnici a ošetřovatelé). Cévní mozková příhoda je u hlodavců obvykle indukována dočasným nebo trvalým uzavřením střední mozkové tepny (model okluze střední mozkové tepny – MCAO). Cílem tohoto modelu je experimentální reprodukce fokální mozkové ischemie, k níž dochází při cévní mozkové příhodě. Model byl široce využíván ke studiu mechanismů postižení, k identifikaci potenciálních cílů a k testování domnělých neuroprotektivních látek. Byly identifikovány kmenové odlišnosti u myší a potkanů, spolu s významným komplexním vlivem věku, pohlaví a komorbidity s diabetes, hypertenzí a arterosklerózou. Zatímco předklinický výzkum cévní mozkové příhody často používá zdravé a mladé samčí hlodavce, vliv faktorů, z nichž některé byly zmíněny výše, může být zkoumán za použití modelů s komorbiditou (např. spontánně hypertenzních potkanů, potkanů s diabetes vyvolaným streptozotocinem (STZ)). V těchto komorbidních případech může být nezbytné pečlivější pozorování klinických příznaků a ranější humánní ukončení postupu. Podle standardního návrhu studie jsou potkani trénováni k provádění určitých behaviorálních testů před zahájením postupu MCAO. V průběhu terapeutického časového okna stanoveného na základě mechanismů působení léčiva a cíle studie je zvířatům podávána zkoušená sloučenina. Analýza výsledků by měla obsahovat informace o velikosti infarktu, míře mortality, četnosti komplikací (např. subarachnoidní hemoragie) spolu s funkčním a neurologickým posouzením umožňujícím sledování postupu. Sériové použití zobrazování magnetickou rezonancí (MRI) se ukázalo

62

být významným nástrojem získávání informace o proměnlivosti velikosti infarktu v čase, může však také poskytovat další informace týkající se průtoku krve nebo metabolického stavu. Zahrnuty mohou být také histologické, biochemické a molekulární koncové body. K dispozici jsou různé behaviorální testy, které lze aplikovat na modely cévní mozkové příhody. Nejjednodušší testy obsahují systémy bodového neurologického hodnocení, jimiž je posuzován celkový neurologický stav, a testy umísťování končetin, jimiž jsou měřeny motorické reflexy. Obvykle jsou používány k posuzování zvířat v akutní fázi po cévní mozkové příhodě. V dlouhodobých studiích mohou být použity komplexnější testy k posuzování senzorických a motorických funkcí (např. oboustranný test s lepicí páskou, chůze po kladině, rotarod nebo schodiště) a kognitivních funkcí, jako je paměť (např. testy pasivního vyhýbání nebo hodnocení strategií učení). Osvědčeným postupem je provést skupinu behaviorálních testů a současně nejméně jeden test pro každou fázi (akutní a dlouhodobou) s cílem získat dostatečné informace o dopadu na senzorické, motorické a kognitivní funkce. Tyto testy musejí být pečlivě zvoleny tak, aby zachytily všechny účinky zkoušených léčebných strategií. Podrobný popis každého z těchto behaviorálních testů včetně tréninkových postupů zde není uveden, jejich vyčerpávající přehled a diskuzi jejich použití naleznete v Schaar et al. (2010). Odkazy • • • • • • •

Braeuninger S and Kleinschnitz C. Recent models of focal cerebral ischemia: procedural pitfalls and translational problems. Experimental & Translational Stroke Medicine, 2009 Nov; 1:8. Freret T and Bouet V. Improvements of the Stroke Model Guidelines – Animal body weight and long-term functional concerns. Experimental & Translational Stroke Medicine, 2009; 2(2): 28–31 Graham SM et al. Animal models of ischemic stroke: balancing experimental aims and animal care. Comparative Medicine, 2004 Oct; 54(5): 486–496 Yanamoto H et al. Evaluation of MCAo stroke models in normotensive rats: standardized neocortical infarction by the 3VO technique.ExpNeurol, 2003 Aug; 182(2):261–74 Liu S et al. Rodent stroke model guidelines for preclinical stroke trials (1st edition). Journal of experimental stroke and translational medicine, 2009 Jan 1;2(2):2–27. Schaar KL et al. Functional assessments in the rodent stroke model. Experimental &Translatinal Stroke Medicine, 2010; 2: 13; volný přístup na http://www.etsmjournal.com/content/2/1/13 Virley et al. A temporal MRI assessment of neuropathology after transient middle cerebral artery occlusion in the rat: correlations with behaviour. J Cereb Blood Flow Metab, 2000;20: 563–582.

63

Studie Účinnost nového léčebného přípravku na modelu okluze střední mozkové tepny (MCAO) s intraluminálním filamentem V tomto příkladě bude na 40 mladých potkaních samcích kmene Sprague-Dawley (300–350 g) proveden trvalý MCAO za použití techniky intraluminálního filamentu pod celkovou anestezií. Potkani budou randomizováni (n=10/skupina) a obdrží buď vehikulum (10 ml/kg) nebo nový zkoušený přípravek (sloučenina A) v dávce 1, 3 nebo 10 mg/kg, zavedený intravenózně do ocasní žíly v průběhu jedné hodiny s počátkem 30 min po provedení MCAO. Následující dávky (buď vehikulum nebo sloučenina A v dávce 1, 3 nebo 10 mg/kg) budou podávány intraperitoneálně po 6 a 24 hodinách po provedení MCAO. Potkani budou zpočátku umístěni po dvojicích v klecích s pevnou podlahou s hlubokou podestýlkou a materiálem pro budování hnízd. Potrava bude v průběhu předběžné tréninkové fáze omezena s cílem podpořit výkon na schodišťovém testu, jenž je motivován apetencí. Zvířatům bude poskytnuta potrava ad libitum od 6 hodin před operací do 6 dnů po provedení MCAO s cílem zvýšení pooperační hmotnosti a zotavení. Funkční výsledky budou hodnoceny denně pomocí systému neurologického bodového hodnocení (Bedersonova škála; viz Schaar et al. 2010) a behaviorálních testů (oboustranný test s lepicí páskou a chůze po kladině). Schodišťový test bude rovněž prováděn denně od 7. dne po provedení MCAO, aby mohl být před omezením potravy poskytnut dostatečný čas k pooperačnímu zotavení. U žádného z behaviorálních testů se neočekává vznik významného pocitu ohrožení. Anestetizovaní potkani budou podrobeni zobrazování magnetickou rezonancí (MRI) za účelem posouzení objemu lézí ve dnech 1, 7, 14 a 28. Všechna zvířata budou usmrcena 28 dní od provedení MCAO.

64

Úvodní předběžné posouzení a zvážení konkrétních možností zvýšení šetrnosti zacházení a humánního ukončení postupu Co při ní budou zvířata zakoušet? Jak velké utrpení může způsobit? Co by ho mohlo zhoršit?



Postupy a zákroky

Předoperační trénink behaviorálních testů v období 2–3 týdnů – oboustranný test s lepicí páskou (testující druhostranné opomíjení), chůze po kladině (testující koordinaci zadních končetin) a schodišťový test (testující zručnost dosahování tlapkou přední končetiny)

Před dosažením habituace zvířat na testy může být způsobován minimální stres/úzkost, neboť součástí testování je přemísťování zvířat do nových prostředí/herních prostor.

Graduální habituace na testovací Odnětí z procesu vybavení. testování, jestliže jsou pozorovány známky Klid, empatická manipulace. strachu.

Omezení potravy (85–90 % hmotnosti při volném krmení) před operací a od 7. dne po provedení MCAO na podporu výkonnosti ve schodišťovém testu

Mírné hladovění; možná frustrace a úzkost.

Úbytek hmotnosti nepřekročí 10 %; v opačném případě bude omezení potravy pozastaveno.

Jestliže budou pozorovány behaviorální problémy způsobené nedostatečným příjmem potravy, budou zvířata ze studie odejmuta.

Přechodná (90 min) okluze střední

Bolest a nepříjemné pocity

Použití vhodných anestetik s

Jestliže nastane kterákoli

Jaké jsou dopady této studie na zvířata?

65

Ukončení postupu

Zvířata, která nedosahují výkonnosti na výchozí úrovni do předem stanoveného časového limitu, budou ze studie vyloučena.

mozkové tepny pomocí intraluminálního filamentu zavedeného do společné karotické tepny za celkové anestezie

související s operací. Možnost nepředvídaných chirurgických komplikací, např. subarachnoidní hemoragie, ipsilaterálního poškození sítnice, formování intraluminálního trombu, poškození hypotalamu mozkovým edémem s následnou hypertermií nebo dočasnou svalovou nekrózou. Tyto komplikace se mohou projevovat řadou různých způsobů, například náhlým kolapsem, ochrnutím, závažným náklonem hlavy, křečemi. Nesnášenlivost a možné účinky anestézie na fyziologické proměnné (jako je hypotermie, hypotenze, hypoxie). Nízký příjem živin vyplývající z omezeného stavu vědomí, postižená schopnost přežvykování a slabá motilita, obvykle v prvních 48 h po

66

minimální nesnášenlivostí a vhodných analgetik (tzn. účinných, avšak majících minimální neuroprotektivní vlastnosti). Řádně vyškolený chirurg používající vhodnou aseptickou chirurgickou techniku (s pravidelným přezkoumáváním míry úspěšnosti). Udržování homeostáze v průběhu anestezie. Použití standardizovaných monofilamentů a chirurgické techniky s cílem omezení variability a komplikací způsobených rozsáhlými lézemi. Intenzivní pooperační péče po prvních 3 až 5 dnů, včetně externích zdrojů tepla. Pravidelné kontroly tělesné hmotnosti; každodenní pozorování a ošetřování rány.

z následujících situací, budou zvířata humánně usmrcena:

•

• •

•

výrazné technické problémy v průběhu chirurgického zákroku, selhání úplného zotavení z anestezie, známky nepředvídaných chirurgických komplikací, jestliže úbytek tělesné hmotnosti zvířat přesáhne 20 % oproti hmotnosti před zákrokem i navzdory doplňkovému krmení nebo rehydrataci nebo jestliže zvířata zůstanou nehybná po dobu více než

provedení MCAO. Stupeň lokomotorického deficitu, který může být příčinou stresu nebo frustrace.

Behaviorální testy (oboustranný test s lepicí páskou a chůze po kladině) prováděny denně od 1. do 28. dne po provedení MCAO; schodišťový test prováděný denně od 7. dne po provedení MCAO

V případě, že jsou jejich motorické schopnosti narušeny, mohou zvířata tyto úkoly vnímat jako stresující.

Poskytování snadno dostupných zdrojů vody a potravy po dobu zotavování, případně doplňková potrava (kaše, tekutiny) a v případě potřeby asistence s krmením; v případě potřeby rehydratace (např. injekcí solného roztoku). Sledování behaviorálních ukazatelů úzkosti a strachu. Zvířata budou trvale sledována zkušenými pracovníky.

24 hodin.

Typicky je stanoven maximální (mezní) čas k provedení požadovaného úkolu a zaznamenán je koncový výkon.

Analýza Tento model je hodnocen jako ZÁVAŽNÝ z důvodu použitého chirurgického postupu, nepříznivých (ačkoli obvykle přechodných) účinků MCAO na životní pohodu zvířat a možnosti významných perioperačních komplikací. Negativní dopad na zvířata však může být oslaben intenzivní pooperační péčí nejméně po dobu prvních 48 hodin a pozorným sledováním následné fáze – a přijetím neodkladných reakcí na zaznamenané problémy. Z hlediska experimentu může pozornost věnovaná zvyšování šetrnosti a standardizace všech dílčích postupů vést ke snížené incidenci komplikací a variabilitě, a následkem toho k lepší kvalitě získaných údajů a snížení počtu použitých zvířat. Předběžná klasifikace závažnosti jako ZÁVAŽNÁ je proto přiměřená. Mohla by být závažnost stanovena jako STŘEDNÍ?

67

Přestože by z výše uvedených důvodů měla být předběžná závažnost tohoto modelu vždy hodnocena jako ZÁVAŽNÁ, incidence závažných účinků může být omezena zásluhou zkušených operatérů spolu s odborným dozorem zvěrolékaře a péčí o zvířata a na základě dohodnutých raných zákroků v případě vzniku komplikací. V některých případech by potenciálně mohla být schválena STŘEDNÍ závažnost, výhradně však případ od případu a individuálním výzkumným skupinám, u nichž je prokázána zkušenost s tímto konkrétním modelem a o nichž je prokázáno, že jsou schopny model používat bez způsobení většího než středního utrpení. Poznatky z klinického pozorování Zvířata jsou v pooperačním období velice pozorně sledována. Podle potřeby je poskytována analgezie a lokální podpůrná léčba. Příklad kombinovaného systému neurologického/klinického bodového hodnocení, který je používán k podpoře sledování klinických podmínek zvířat po celou dobu postupu, je uveden závěrem tohoto příkladu. Výsledky Všechny zvířata s výjimkou jednoho ve skupině s podaným vehikulem se z chirurgického zákroku zotavilo bez neočekávaných komplikací zásluhou poskytnuté intenzivní perioperativní péče. -

Všech 10 zvířat s podaným vehikulem vykazovalo nejnižší neurologické bodové hodnocení po celou dobu studie a slabou výkonnost v behaviorálních testech ve srovnání s léčenými zvířaty. Klinické bodové hodnocení bylo obdobné s léčenými zvířaty v období bezprostředně (prvních 48 h) po provedení MCAO, následně se mezi zvířaty ve skupině s podaným vehikulem výrazně zvýšily rozdíly: • 1/10 muselo být utraceno ve 2. den po chirurgickém zákroku z důvodu úbytku tělesné hmotnosti > 20 % (i přes doplňkové krmení a rehydrataci). Posouzení: ZÁVAŽNÉ •

U 6/10 se rozvinul střední neurologický deficit, ale v klinickém hodnocení v průběhu času vykazovala minimální zlepšení. Posouzení: ZÁVAŽNÉ

•

U 3/10 zvířat se rozvinul střední neurologický deficit a v klinickém hodnocení v průběhu času vykazovala postupné snižování, pravděpodobně následkem své schopnosti kompenzace a adaptace na dlouhodobý neurologický deficit. Posouzení: STŘEDNÍ

68

-

Všech 20 zvířat ošetřených sloučeninou A v nízkých dávkách (1 a 3 mg/kg) vykazovalo po 48 h po provedení MCAO zlepšení v neurologickém bodovém hodnocení, spolu se zlepšením klinického hodnocení. Posouzení: STŘEDNÍ

-

Všech 10 zvířat ošetřených sloučeninou A v nejvyšší dávce (10 mg/kg) vykazovalo 24 h po provedení MCAO zlepšení v neurologickém bodovém hodnocení ve srovnání se skupinou s podaným vehikulem, pouze minimální (5%) úbytek tělesné hmotnosti 24 hodin po chirurgickém zákroku a výrazné zlepšení klinického hodnocení od 48 h po provedení MCAO. Posouzení: STŘEDNÍ

Posouzení skutečné závažnosti U 7 zvířat bylo dosaženo ZÁVAŽNÝCH hodnot, u 33 zvířat STŘEDNÍCH. Bodový systém hodnocení Posouzení závažnosti se provádí kombinací obecných klinických pozorování (tělesná hmotnost, vzhled, chování, prostředí v kleci) a neurologického hodnocení souvisejícího s konkrétním postupem. Bedersonova škála je nástrojem celkového neurologického hodnocení, který byl vyvinut k měření neurologického postižení po cévní mozkové příhodě. Využívá hodnotící škálu v rozsahu 0–3, kde 0 = normální a 3 = nejvyšší úroveň postižení. Testy zahrnují flexi přední končetiny, odpor vůči laterálnímu tlaku a pohyb v kruhu. stupeň 0: bez pozorovatelného postižení stupeň 1: flexe přední končetiny stupeň 2: snížený odpor vůči laterálnímu tlaku (a flexe přední končetiny) bez pohybu v kruhu stupeň 3: stejné chování jako u stupně 2, navíc s pohybem v kruhu 5–10% úbytek hmotnosti Vzhled

Bodové ohodnocení 1

HEP: humánní ukončení postupu 11–15 % úbytek hmotnosti

69

2


3


HEP

Mírně zanedbaná srst

1

Mírná piloerekce

2

Výrazná piloerekce

3

Chování Mírně abnormální chůze

1

Výrazně abnormální chůze

2

Výrazné potíže s pohyblivostí

3

Imobilita > 24 h

HEP

Úzkost a nervozita při manipulaci

2

Projevy výrazného ohrožení při manipulaci, např. třes, vokalizace, agrese

3

Prostředí Mírně neuspořádané hnízdo

1

Stěží rozpoznatelné hnízdo

2

70

Nepřítomnost hnízda

3

Neurologické bodové hodnocení Flexe přední končetiny

1

Činnosti

Snížený odpor vůči laterálnímu tlaku (a flexe přední končetiny) bez pohybu v kruhu

2

Hodnocení Revidujte četnost sledování 1

Stejné chování jako u stupně 2, navíc s pohybem v kruhu

3

4

Poskytněte dodatečnou péči, např. doplňkový přísun tekutin a vlhkou kaši

5

Přezkoumejte další postup se zvěrolékařem

12

Uplatněte humánní ukončení postupu

Činnosti – povšimněte si, že na základě toho, že chirurgické komplikace jsou obvykle zaznamenány v bezprostředním pooperačním období zotavování, je pozorné sledování a odborné empatické posuzování po dobu prvních 24 hodin nezbytností zajišťující identifikaci nepříznivých účinků a přijetí opatření k jejich nápravě, a že jsou zvířata humánně usmrcena, jestliže jejich utrpení přesáhne kategorii závažnosti.

71

Příklad individuálního záznamového listu pozorování (dny 0–4) Den

0

1

2

3

4

320 (0)

292 (1)

285 (2)

287 (1)

292 (1)

1

1

0

1

0

Způsob chůze

3

2

2

2

1

Reakce na manipulaci

0

0

2

0

0

Stav hnízda

3

2

1

0

0

Neurologické bodové hodnocení odpovídající konkrétnímu postupu

2

2

1

1

1

Celkové hodnocení

9

8

8

5

3

Vzhled Tělesná hmotnost (g) (bodové hodnocení) Stav srsti Neudržovaná srst/piloerekce Chování

Prostředí

Objem léze (hodnocení MRI)*

11 %

72

Další pozorování

Plné zotavení z chirurgického zákroku bez komplikací Dávkování v 30. minutě a 6. hodině

Pohyb po kleci, Behaviorální snaha o testy, nejprve vytvoření hnízda úzkostný, později vše splněno, hnízdo lépe strukturováno

Dnes méně upravená srst, váha stabilní, dobré hnízdo

Dokončeny behaviorální testy, méně úzkostný, chůze výrazně zlepšená

* „objem léze“ (hodnocen pomocí MRI) je uváděn proto, aby jej výzkumník vyplnil po skončení studie. Tyto údaje mohou být korelovány s klinickým a behaviorálním pozorováním s cílem umožnit další zvýšení šetrnosti sledování, péče o zvířata a postupů.

73

Ilustrativní příklady posuzování závažnosti Model 5 – Produkce polyklonálních protilátek u králíků Poslední aktualizace: 05/02/2013 Obecné souvislosti Primárním účelem produkce protilátek u laboratorních zvířat je získání antiséra s vysokým titrem a vysokou afinitou pro použití při experimentech nebo diagnostických testech. Značná část moderní biologie a biochemie spoléhá na dostupnost vysoce specifických protilátek pro použití v řadě technik, jakými je imunohistochemie, ELISA, imunoprecipitace a imunobloting. Generování velkých množství specifických protilátek zaměřených na konkrétní proteiny nebo peptidy je proto nezbytné pro úspěšnost mnoha základních i aplikovaných výzkumných programů. V tomto příkladu bude králík použit k vytvoření protilátek proti malým peptidům, kterým je přikládána důležitost při regulaci buněčného dělení, a bude se jednat o součást výzkumného programu týkajícího se biochemického výzkumu dělení savčích buněk. Odkazy • • • • • •

Canadian Council on Animal Care guidelines on; antibody production (2002). Ke stažení na http://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Antibody_production.pdf EFPIA/ECVAM (Diehl K-H et al.) (2001) A good practice guide to the administration of substances and the removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21: 15–23 JWGR (2001) Refining procedures for the administration of substances. Laboratory Animals35: 1–41 Keating SCJ, Thomas AA, Flecknell PA & Leach MC (2012) Evaluation of EMLA cream for preventing pain during tattooing of rabbits: changes in physiological, behavioural and facial expression responses. PLOS ONE7(9): e44437 (volný přístup, http://www.plosone.org) Leenars M, Hendriksen CFM (2005) Critical steps in the production of polyclonal and monoclonal antibodies: evaluation and recommendation. ILAR Journal46: 269–279 Stills HF (2005) Adjuvants and antibody production: Dispelling the myths associated with Freund’s complete and other adjuvants. ILAR Journal46: 280–293

74

•

UFAW/RSPCA (2008) Refining Rabbit Care: A Resource for Those Working With Rabbits in Research.Southwater, UK: RSPCA (volně ke stažení na http://www.rspca.org.uk/researchrabbits)

Studie Na základě předchozích zkušeností bylo stanoveno, že jeden králičí jedinec by měl být poskytnout dostatečný materiál pro každý ze zkoumaných peptidů. Králík bude umístěn v kotci s podlážkou ve stabilní skupině kompatibilních králíků (rovněž využívaných k produkci protilátek), bude mu poskytnut dostatečný prostor pro obohacení, cvičení a normální sociální chování (UFAW/RSPCA 2008). Zvíře bude imunizováno směsí antigenu a adjuvans. V předem určených časových bodech budou odebrány krevní vzorky malého objemu za účelem zjištění úspěšnosti imunizace. Jakmile budou získány protilátky s vhodným titrem, bude králík v hluboké anestezii vykrven bez opětovného nabytí vědomí s cílem shromáždění protilátek obsažených v krvi. Manipulace s králíky může být stresující a měla by být prováděna výhradně kvalifikovanými a empatickými pracovníky. Chování králíků může být obtížně interpretovatelné; zásady správné praxe vyžadují udržování znalosti literatury o chování králíků a jejich životních podmínkách. Nedávno publikovaná literatura například dokládá, že za některých podmínek mohou králíci vykazovat „bolestný obličej“ (Keating et al. 2012); potenciál využití tohoto poznatku jako nástroje k posuzování životních podmínek králíků by měl být případ od případu zvažován. Z důvodu slabé imunogenicity peptidů vyznačujících se krátkým řetězcem bude nezbytné podávat je v kombinaci s adjuvans. Dříve bylo využíváno kompletní Freundovo adjuvans (FCA), nyní jsou však dostupná syntetická adjuvans, která jsou v tomto postupu rovněž účinná a jsou minimálně dráždivá.

75

Úvodní předběžné posouzení a zvážení konkrétních možností zvýšení šetrnosti zacházení a humánního ukončení postupu Jaké jsou dopady této studie na zvířata?

Imunizace antigenem a adjuvans; tři subkutánní injekce v 8., 22. a 37. dni

Co při ní budou zvířata zakoušet? Jak velké utrpení může způsobit? Co by ho mohlo zhoršit?



Postupy a zákroky

Ukončení postupu

Bolest následující po injekci.

Vstřikovaný objem, složení a četnost budou v souladu s pokyny pro správnou praxi (např. EFPIA/ECVAM nebo JWGR), typicky nejvýše na čtyřech místech a v objemu 0,25 ml na jedno místo.

Při zaznamenání známek prodloužených nepříjemných stavů, bolesti nebo strachu (např. vytrvalé věnování pozornosti místům vpichu nebo zduřeninám) a při výskytu nehojících se vředů bude zvíře humánně usmrceno.

V reakci na adjuvans se může rozvinout nebolestivé zduření. Potenciál (vzácně) zvředovatění v místě vpichu.

Jakékoli vzniklé vředy budou okamžitě odpovídajícím způsobem veterinárně ošetřeny. Exsangvinace v celkové anestezii

Slabší nepříjemný pocit a možná nesnášenlivost k anestetiku v průběhu provádění anestezie.

Použito anestetikum s minimální nesnášenlivostí.

Zvíře zůstane anestetizováno až do okamžiku smrti.

Analýza Je očekávána pouze mírná závažnost zásluhou šetrnosti chovu a ošetřování, dodržování zásad správné praxe při podávání látek a odebírání vzorků a volby minimálně dráždivého adjuvans.

76

Předběžná klasifikace závažnosti jako MÍRNÁ je proto přiměřená. Je možné dále zvýšit šetrnost postupu? Možnost použití adjuvans s minimální dráždivostí a anestetik s menší nesnášenlivostí by měla být pravidelně přezkoumávána sledováním literatury a diskuzí mezi kolegy o této problematice. Bylo by možné ustavit program habituace mladých králíků na manipulaci, s cílem dále snížit zakoušený stres (UFAW/RSPCA, 2008). Poznatky z klinického pozorování V této studii byly očekávány pouze slabší nepříznivé účinky, proto byl použit pouze základní systém sledování; zvířata byla denně kontrolována a pozorování byla zaznamenávána, použití strukturovaného záznamového listu však nebylo považováno za nutné. Ilustrativní příklad záznamového listu pozorování je uveden na závěr tohoto modelu. Posouzení skutečné závažnosti Byl zaznamenán určitý mírný přechodný otok v jednom místě vpichu, nevyžadoval však žádné ošetření. Králík po krátkou dobu věnoval jistou pozornost místům vpichu, což bylo zhodnoceno pouze jako projev slabého nepříjemného pocitu. „Bolestný obličej“ nebyl pozorován. Nebyly zaznamenány žádné nepříznivé účinky vlastního odběru krve z ušní žíly. Posouzení skutečné závažnosti u tohoto zvířete jako MÍRNÉ bylo považováno za přiměřené.

77

Příklad záznamového listu pozorování Produkce protilátek u králíka – postup a záznamový list pozorování Datum

Tělesná hmotnost (kg)

Poznámky

1.3.

3,5

Předběžný odběr – 5 ml z ušní žíly; nezaznamenány nepříznivé účinky

2.3.

Nezjištěna abnormalita (NAD)

6.3.

NAD

7.3.

NAD

8.3.

3,6

Imunizace – 0,25 ml x 2 místa subkut., mírná pozornost místům vpichu (péče) po několik minut, poté návrat k normálu

9.3.

NAD

10.3.

NAD

11.3.

NAD

12.3.

Slabý nebolestivý otok v místě vpichu na levé straně

13.3.

Stále přítomný otok v místě vpichu na levé straně, nehoršící se

78

14.3. 15.3.

Otok v místě vpichu na levé straně stále přítomný, avšak při pohmatu nebolestivý 3,6

21.3. 22.3.

NAD 3,6

28.9. 29.3.

Vymizení otoku, normální stav

Imunizace – 0,25 ml x 2 místa subkut., krátká pozornost místům vpichu

NAD 3,7

NAD

30.3.

Odběr pro testování – 2ml z ušní žíly; nezaznamenány nepříznivé účinky

5.4.

NAD

6.4.

3,6

Imunizace – 0,25 ml x 2 místa

14.4.

3,6

NAD

79

15.4.

Odběr pro testování – 2ml z ušní žíly; nezaznamenány nepříznivé účinky

26.4.

NAD

27.4.

3,6

Exsangvinace v celkové anestezii, bez nepříznivých účinků

Měly by být udržovány záznamy potvrzující nejméně každodenní kontrolu zvířete – např. na individuálním záznamovém listu zvířete (viz výše) nebo na záznamovém listu místnosti.

80

Ilustrativní příklady posuzování závažnosti Model 6 – Tvorba geneticky modifikovaných (GM) zvířat a péče o ně Poslední aktualizace: 05/02/2013

1.

Obecné souvislosti

Využití geneticky modifikovaných (GM) zvířat ve výzkumu přispívá k porozumění funkce genů a jim odpovídajících proteinů. Různé fenotypy mohou mít na životní podmínky zvířat řadu odlišných účinků, některé jsou schopny způsobit bolest, utrpení nebo pocit ohrožení. Zatímco některé fenotypy a jejich výstupy jsou předvídatelné, při vytváření GM linií se mohou objevovat mnohé neočekávané nebo druhotné rysy, celkovou závažnost proto není vždy možné přesně předvídat. V praxi není fenotyp v mnoha GM liniích ovlivněn a lze ustavit postupy posouzení, které zajišťují zjištění všech nepříznivých fenotypů. V jiných případech může být očekávaný fenotyp často spojen s neočekávanými druhotnými fenotypy, které se objevují v různých časových bodech a mohou být ovlivněny různými faktory souvisejícími s prostředím. Při posuzování skutečného poškození zvířete je třeba zohlednit řadu faktorů, jako je např. druh mutace, genotyp, fenotyp a strategie chovu (např. vyhýbání se škodlivým homozygotním fenotypům křížením homozygotních a nešlechtěných typů), a také povahu všech dalších vědeckých postupů nebo postupů odchovu a jejich potenciální účinky. Systematické a vhodně načasované pozorování v průběhu vývoje kolonie i po celou experimentální fázi kolonie je pro účinné posouzení stavu životních podmínek zvířete nezbytné. Nové linie by měly být pozorně sledovány a měly by být předmětem standardního posuzování životních podmínek. Všechny linie by měly být samostatně posuzovány vhodně školenými kvalifikovanými zaměstnanci v průběhu vývoje kolonie a péče o ni, poznatky o konkrétních pozorovaných nepříznivých účincích by měly shromažďovány a měly by o nich být podávány zprávy. Certifikovaní pracovníci by měli provádět všechny související vědecké postupy a ve spolupráci s ošetřovateli by měli sledovat a zaznamenávat všechny účinky na zvířata. Předběžně by měly být stanoveny úrovně pro humánní ukončení postupu s ohledem na parametry, jakými je úbytek hmotnosti, tělesný stav a znepokojivé chování, spolu s konkrétními charakteristikami vývoje. Naživu by neměla být ponechána žádná zvířata, u nichž byla překročena očekávaná mez závažnosti, pokud nejsou z přesvědčivých důvodů předmětem zvláštního vědeckého zájmu, a i v tomto případě výhradně po schválení příslušným orgánem.

81

Druh, načasování a trvání pozorování budou vedle aplikované mutace záviset na řadě dalších faktorů. Například genetické pozadí a podmínky prostředí, ve kterém jsou zvířata chována, mohou výrazně pozměnit expresi fenotypu. Všechny tyto zvláštní faktory by měly být řádně zaznamenány, aby bylo usnadněno srovnání mezi různými zařízeními a obecné sledování GM zvířat. Zohledněna by měla být rovněž délka dožití každé linie v konkrétním zařízení, neboť některé fenotypy nastupují později, a mohou být tedy pozorovány pouze tehdy, jestliže jsou zvířata uchovávána po delší období. Odkazy RSPCA GA Passport Working Group (2010) GA Passports: The Key to Consistent Animal Care. Southwater, UK: RSPCA (ke stažení na http://www.rspca.org.uk/sciencegroup/researchanimals/implementing3rs/gapassport) Wells DJ et al (2006) Assessing the welfare of genetically altered miceLaboratory Animals 40(2): 111–114 (ke stažení na http://www.nc3rs.org.uk/downloaddoc.asp?id=356&page=231&skin=0) 2

Příklady

Tři příklady uvedené níže v oddílech 2.1 až 2.3 ilustrují možné způsoby posouzení závažnosti u GM myší včetně prozkoumání vývojových předělů, dopadů na postupy a vývoje kolonií. Každý z příkladů se zaměřuje spíše na principy posuzování závažnosti, než aby zohledňoval veškeré možné scénáře vyskytující se v celém vývoji kolonie. Vytvoření každého modelu se bude řídit standardizovanými postupy vyžadujícími chirurgickou přípravu samčích myších mláďat s provedenou vasektomií, manipulaci s embryi a jejich chirurgické implantování do přijímajících pseudogravidních samic. Předpokladem je dodržování zásad správné praxe s ohledem na aseptičnost, řízení bolesti a způsobilost chirurga. Potvrzení přítomnosti potomka pocházejícího ze zakladatelské nebo zárodečné linie bude stanoveno na základě tkáňového vzorku získaného jako vedlejší produkt identifikace (značky na uchu) nebo nejméně invazivní metodou, která poskytuje dostatečné množství tkáně pro určení genotypu. Fenotypizační strategie každé linie budou záviset na genu, oblasti výzkumu a předpokládaných účincích. Posouzení závažnosti bude stanoveno na základě řady standardizovaných pozorování.

82

2.1 2.1.1

Model geneticky pozměněné myši – GeneAtm1a(Funding)Lab

Obecný kontext

Byla vytvořena kolonie myší s novou genovou mutací v GeneA zaměřenou na linii embryonálních kmenových buněk vycházející z pozadí C57BL/6N s neznámým fenotypovým potenciálem. Model byl udržován na vymezeném pozadí (C57BL/6N). Po stanovení přenosu zárodečné linie u myší G1 byl proveden základní screening posuzující životní podmínky 30 mláďat z 3–5 vrhů z nezávislých páření. Potomci byli sledováni v předem stanovených bodech předělu ve vývoji kolonie – při narození, 14 dnů po narození (současně se značením mláďat a odběrem tkáně pro stanovení genotypu) a při odstavení. Na základě plánu pro posouzení životních podmínek GM zvířat byl vytvořen vhodný list bodového hodnocení (Wells et al. 2006). Pozorování mláďat prováděli zootechnici v prostředí klece, zatímco správci kolonií sledovali genotypové poměry. Myši byly poté, kdy bylo možné odstavení od kojící matky, umístěny ve skupinách v individuálně větraných klecích obsahujících v přiměřeném množství podestýlku, materiál pro budování hnízd a pro obohacení prostředí. Posuzování v prostředí klece prováděli zootechnici v průběhu svých každodenních činností, dokud myši nedosáhly pohlavní zralosti. U původních kmenů zvířat a budoucích chovných jedinců bylo prováděno a zaznamenáváno dlouhodobější posuzování nepříznivých vlivů na životní podmínky souvisejících s věkem. Všechna pozorování byla srovnána s výchozím kmenem a byla posouzen jejich význam. 2.1.2

Předběžné posouzení

Jaké jsou dopady této Co při ní budou zvířata zakoušet? Jakým způsobem bude utrpení minimalizováno? studie na zvířata? Jak velké utrpení může způsobit? Co by ho mohlo zhoršit? Nepříznivé účinky Základní

účinky Genetické modifikace mohou být příčinou nepříznivých klinických

Postupy a zákroky

Ukončení postupu

Průběžné sledování v prostředí

Při překročení střední závažnosti

83

genetických modifikací

Odebírání tkáně pro genotypu

účinků.

klece.

V případech, kdy jsou tyto účinky nepředvídatelné, může každá známka toho, že se zvíře s příslušnou mutací odchýlilo od normálních fyzických nebo behaviorálních parametrů (tzn. těch, jejichž výskyt je znám u fenotypů souvisejících s genetickým pozadím nebo u kontrolních nešlechtěných typů), znamenat narušení životních podmínek.

Posouzení životních podmínek v předem stanovených časových bodech vývoje: narození, odstavení a pohlavní zralost.

vzorků Možnost bolesti nebo strachu stanovení způsobených metodou odebírání vzorku tkáně, např. propíchnutím/zářezem v uchu nebo zkrácením špičky ocasu. Biopsie ocasu je běžně používána, jestliže jsou vyžadována větší množství DNA, může však být příčinou krátkodobé i dlouhodobé bolesti (dlouhodobé v případě tvorby

budou zvířata usmrcena.

V závislosti na povaze zjištěných nepříznivých účinků mohou být tam, kde je to možné, uplatněna odpovídající opatření zvyšující šetrnost, např. pozměněné chovné strategie nebo zvýšení šetrnosti chovu (např. navýšení množství hnízdního materiálu na podporu narušené schopnosti termoregulace). Při značení jednotlivých zvířat zářezem v uchu patří k zásadám správné praxe využít k určení genotypu v rámci možností tkáň ucha. V případě zkracování ocasu by měla být odebrána minimální část ocasu (současně však s ohledem na to, že opakované odebírání vzorku je

84

Neuplatňuje se, neboť postup by měl být jednorázový a způsobení bolesti nebo ohrožení na úrovni, kdy by bylo nezbytné humánní usmrcení, je nepravděpodobné.

neuromu).

vysoce nežádoucí), vhodným způsobem by měla být použita anestezie a analgezie a nadměrné krvácení by mělo být bezodkladně ošetřeno. Měl by být sledován vývoj méně invazivních technik, které by měly být lokálně posuzovány a uplatňovány, kdekoli je to možné.

Stanovení fenotypu

Stres navozený manipulací nebo prováděním fenotypové zkoušky, např. stres z umístění v neznámém prostředí, podání zkoušených sloučenin za účelem vyvolání odpovědi, sledování infekcí, anestezie a znehybnění za účelem zobrazování atd.

Školení pracovníků stanovujících fenotyp, pokud jde o kvalifikovanou, empatickou a standardizovanou manipulaci a pozorování. Použití anestezie při zobrazovacích technikách nebo při bolestivých postupech. Strukturování fenotypových testů tak, aby probíhaly od nejméně invazivních (např. pozorování chování v otevřeném prostoru) k nejvíce invazivním (např. postupům vyžadujícím anestezii).

85

Jestliže mutace vyvolává závažnou odpověď na fenotypovou zkoušku, bude dosaženo úrovně pro humánní ukončení postupu a zvířata budou humánně usmrcena.

Zkoumaný gen představuje novou mutaci s neznámými nepříznivými účinky. Zkušenosti v tomto zařízení ukazují, že velká většina obdobných modelů obvykle vykazuje mírné fenotypy. Příležitostně a nepředvídatelně však bude model vykazovat i střední klinické projevy, a na tomto základě by byl tento příklad předběžně klasifikován na STŘEDNÍ úrovni. 2.1.3

Výsledky

Výchozí hodnocení novorozených zvířat (při narození): Barva mláďat

Normální

(pouze u novorozenců) Aktivita mláďat

Normální

(pouze u novorozenců) Mléčná skvrna

Přítomná

(pouze u novorozenců) Vrh

Všechna mláďata odpovídají parametrům kmene pozadí z hlediska velikosti vrhu, homogenity vrhu a růstu mláďat

Následující ukazatele byly pozorovány 14 dnů po narození a při odstavení:

86

Celkový vzhled

Všechna mláďata byla morfologicky normální; Nebyly pozorovány řádné známky malformací.

Velikost, vývoj stavby těla a růst

Normální růst odpovídající standardní růstové křivce kmene pozadí

Stav srsti

Normální

Chování – postoj, chůze, aktivita a interakce s prostředím Klinické projevy

Normální chování a interakce mezi všemi jedinci v kleci; nepozorována hyperaktivita ani agresivita

Relativní velikost

Normální ve srovnání s kmenem pozadí

Počet

Míra mortality před odstavením normální ve srovnání s kmenem pozadím

Nezaznamenány

Poznatky z klinického pozorování Všechna pozorování a poměry novorozených mláďat až do odstavení byly posouzeny jako normální vzhledem ke genetickému pozadí (C57BL/6N), přičemž k narození homozygotních, heterozygotních a nešlechtěných typů myší docházelo v normálních mendelovských poměrech. Ve věku 4 týdnů prošly homozygotní a kontrolní myši nešlechtěného typu (7+7) sérií pozorování a mírných testů, jakými jsou SHIRPA, dysmorfologie, otevřený prostor, klinický rozbor krve, DEXA a faxitronové zobrazování v průběhu 16 týdnů. Po skončení tohoto experimentu odhalila fenotypová analýza redukci odbourávání glukózy u homozygotních myší po intraperitoneálním testu tolerance glukózy (ipGTT). Ačkoli

87

bylo odbourávání glukózy v průběhu zátěžového období sníženo, po postupu se všechna zvířata navrátila na výchozí úroveň a nebyly zaznamenány žádné další nepříznivé účinky. 2.1.4

Analýza výsledků

Posouzení skutečné závažnosti Po ustálení kolonie byly k zachování a pokračování kolonie využívány heterozygotní myši a potomci nešlechtěného typu. U žádné z myší používaných k odchovu a zachování kolonie nebyly pozorovány žádné škodlivé fenotypy, mělo se tedy za to, že nevykazují žádné nepříznivé účinky. Jelikož se neočekává žádný škodlivý fenotyp, může být tato linie přeměněna na homozygotní a udržována bez schválení projektu. Výše uvedené páření heterozygotních x heterozygotních myší vytvořilo homozygotní myši. Skupina těchto myší byla použita ve standardním fenotypovém screeningu spočívajícím v řadě mírných postupů včetně zavedení jehly pro odebrání krevního vzorku při ip testu tolerance glukózy. Kontrolní nešlechtěné typy byly testovány současně. Kumulativní účinek na myši je považován za mírný na základě odběru krevních vzorků a následných postupů stanovování fenotypů a ve srovnání s celkovým účinkem genetické modifikace. Shrnutí Odchov a udržování – bez nepříznivých účinků Homozygotní + kontrolní myši – MÍRNÝ – na základě screeningových testů (nikoli následkem genetické modifikace) Celkově lze fenotyp této linie GM myší považovat za neškodný. Páření ustálených linií by podle směrnice nevyžadovalo schválení projektu.

88

2.2 2.2.1

Model geneticky modifikované myši – Tg(GeneB)Labcode

Obecný kontext

Jako model pro studium určité formy rakoviny bude vytvořena kolonie myší s mutací se zvýšenou expresí transgenu. Linie bude vytvořena na pozadí C57BL/6N. Nástup a rychlost rozvoje nádoru však nemohou být definovány a budou vyžadovat posouzení jako součást charakterizace modelu. Jakmile budou ustáleny zakladatelské linie, bude proveden základní screening posuzující životní podmínky, jak bylo popsáno v oddílu 2.1. Nejpřínosnější linie budou propagovány za účelem studia tohoto typu leukemie. 2.2.2


Jaké jsou dopady této Co při ní budou zvířata zakoušet? Jakým způsobem bude utrpení minimalizováno? studie na zvířata? Jaké množství utrpení může způsobit? Co by ho mohlo zhoršit? Nepříznivé účinky

Postupy a zákroky

budou vycházet Posouzení a Spolu s rozvojem rakoviny bude Zákroky charakterizace rozvoje pokračovat úbytek hmotnosti a z každodenního pozorování kritérií, zhoršování stavu. jako je úbytek váhy, zhoršení nádoru tělesného stavu, netečnost atd. Subkutánní otoky mohou být příčinou bolesti, ovlivňovat normální chování, Každodenní pozorování a sledování postoj nebo lokomoci. celkového zdravotního stavu a růstu nádoru. Zvířata mohou být náchylnější k onemocnění z důvodu narušeného

89

Ukončení postupu Jedinci původních kmenů a chovní jedinci vykazující klinické známky, které nejsou předmětem experimentu, jako např. úbytek hmotnosti přesahující 15 %, špatný stav srsti nebo netečnost, budou humánně usmrceni. Jestliže dojde k zvředovatění nádoru nebo jestliže nádor postihuje

imunitního systému.

normální chování, postoj nebo lokomoci nebo přesáhne 1,2 cm průměru, bude zvíře humánně usmrceno. Zvířata vykazující známky přidruženého onemocnění budou humánně usmrcena.

Zkoumaný model bude mutován za účelem vytvoření očekávané genetické poruchy. Nástup onemocnění nelze snadno předvídat, mohou však být předem stanoveny klinické známky umožňující nástup charakterizovat. Jakmile bude model charakterizován, bude jej třeba udržovat, aby mohl být využit při následných experimentálních studiích možné léčby studovaného typu rakoviny. Na tomto základě by byl tento příklad předběžně klasifikován jako STŘEDNÍ. 2.2.3

Výsledky

Posouzení životních podmínek bylo provedeno stejným způsobem jako ve výše uvedeném oddílu 2.2. Nebyly zaznamenány žádné abnormality v přelomových bodech vývoje a růstu až do pohlavní zralosti. Kolonie byla rozšířena o původní kmeny a budoucí chovné jedince pářené od 10 měsíců věku za účelem zachování kolonie a produkce nových zkušebních zvířat. Zvířata byla po celou tuto dobu sledována, rozvoj nádorů byl zaznamenán od 18 týdnů věku u 60 % zvířat nesoucích mutaci. Klinický průběh nemoci dosáhl 4 až 6 týdnů, kdy bylo nezbytné zvířata utratit. 2.2.4

Analýza výsledků

Posouzení skutečné závažnosti U zvířat nesoucích mutaci byl zaznamenán rozvoj nádorů u 60 % zvířat od 18 týdnů věku. Chovná strategie určovala zahájení páření zvířat od 10 týdnů věku. Potenciál rozvoje nádoru u chovných párů byl považován za dostatečný, aby bylo možné pozměnit strategii odchovu a uchovávání.

90

Páření chovných párů bylo poté zahajováno v 6 týdnech věku a páry byly odděleny ve 12 týdnech věku, kdy byl chovný samec usmrcen. Původní a chovné samice byly denně sledovány s cílem odhalení raných známek rozvoje nádoru. Zvířata, která nebyla použita nebo z jiného důvodu žádoucí, byla humánně usmrcena před nástupem klinických příznaků. Shrnutí Zvířata pod 18 týdnů věku – bez nepříznivých účinků; Zvířata od 18 týdnů věku, u nichž se rozvinuly nádory – MÍRNÁ závažnost díky včasnému užití humánního ukončení postupu; Zvířata od 18 týdnů věku, u nichž se rozvinuly nádory, zachované k použití – MÍRNÁ nebo STŘEDNÍ závažnost v závislosti na uplatnění klinických úrovní pro ukončení postupu. 2.3 2.3.1

Model geneticky pozměněné myši – GeneCtm1a(Funding)Lab

Obecný kontext

Byla vytvořena kolonie myší s genovou mutací v GeneC zaměřenou na linii embryonálních kmenových buněk vycházející z pozadí C57BL/6N se známým fenotypovým potenciálem za účelem testování chování a paměti. Model byl udržován na vymezeném pozadí (C57BL/6N). Po stanovení přenosu zárodečné linie u myší G1 byl proveden základní screening posuzující životní podmínky. 2.3.2


Zkoumaný gen představuje stejně jako v oddílu 2.1 výše novou mutaci. Záměrem je využít tento model v budoucích studiích chování testujících účinnost nových farmaceutických sloučenin. Zkušenosti v tomto zařízení ukazují, že značná většina obdobných modelů obvykle vykazuje mírné fenotypy. Příležitostně a nepředvídatelně však bude model vykazovat i střední klinické projevy, a na tomto základě by byl tento příklad předběžně klasifikován na STŘEDNÍ úrovni.

91

2.3.3

Výsledky

Všechna pozorování a poměry byly posouzeny vzhledem ke genetickému pozadí tohoto modelu (C57BL/6N) jako normální, přičemž k narození homozygotních, heterozygotních a nešlechtěných typů myší docházelo v normálních mendelovských poměrech. Ve čtyřech týdnech věku byla na homozygotních a kontrolních nešlechtěných typech myší provedena řada pozorování a testy posuzující paměť a učení. Testy byly prováděny v průběhu 10 týdnů. Na konci této fenotypové analýzy nebyly pozorovány žádné škodlivé fenotypy. Tento model byl následně použit k testování účinnosti nových farmaceutických sloučenin. Pářením heterozygotních myší vznikla zdravá homozygotní zvířata, která vykazovala podobnou reprodukční úspěšnost jako kmen pozadí. Jako strategie na snížení počtu jedinců byla zvolena reprodukční strategie homozygotního páření. Oproti původnímu odchovu, kdy homozygotní myši pocházely z páření heterozygotní x heterozygotní, nová skupina homozygotních zvířat pocházející z páření homozygotních rodičů se rodila zakrslá a ve srovnání se svými sourozenci již nenabyla řádné velikosti a hmotnosti. Ačkoli bylo původním záměrem této linie vytvoření modelu pro studium chování a paměti, byly provedeny další analýzy tkání a krve získaných z těchto zvířat. V průběhu analýzy biochemického rozboru krve a následného studia literatury bylo zjištěno, že GeneC je významným transportním proteinem vázajícím se na vitamín B12. Odstranění GeneC mělo za následek narušení mimobuněčného transportního mechanismu, což vedlo k porušení syntézy DNA a metabolismu tuků a bílkovin. Účinek této mutace by u myší narozených z heterozygotní samice nebyl zjištěn, neboť mateřský zdroj B12 je přenášen in utero prostřednictvím placenty do rozvíjejícího se fetu. Původní jedinci s blokací tohoto genu tedy měli dostatečné zásoby B12, které umožňovaly jejich přežití a prospívání nejméně do 16 týdnů věku, a zajišťovaly tak normální schopnost páření a plodnost srovnatelnou s kmenem pozadí. 2.3.4

Analýza výsledků

Posouzení skutečné závažnosti Tento příklad dokládá, jaký může mít udržování kolonie zásadní a často nepředvídatelný účinek na myší populaci. Na základě dosud dostupných informací a výsledků primárního odchovu a stanovení fenotypů by se tato kolonie nejevila jako hodná pozornosti. Udržování kolonie

92

homozygotní strategií páření by za běžných okolností logicky určovalo produkci minimálního počtu jedinců, což je z hlediska minimalizace počtu použitých zvířat žádoucí. Nepředvídané škodlivé fenotypy se mohou objevit v liniích, které byly dosud udržovány jako normální zvířata bez projektového schválení. Následkem nepříznivých účinků na životní podmínky zvířat v tomto příkladu by tento model, pokud by měl být uplatňován tento typ odchovu, musel být vrácen do procesu schvalování projektu. Shrnutí Odchov a udržování heterozygotních párů – bez nepříznivých účinků; Odchov a udržování homozygotních párů – STŘEDNÍ závažnost u potomků této generace na základě zakrslého vzrůstu a neschopnosti prospívat. Příklad 2.3 – Tento příklad podtrhuje nutnost předávání přesných a přínosných údajů o životních podmínkách mezi institucemi, jelikož se mohou vyskytnout škodlivé fenotypy, například v podobě „myšího pasu“i.

i

RSPCA GA Passport Working Group (2010) GA Passports: The Key to Consistent Animal Care. Southwater, UK: RSPCA (ke stažení na http://www.rspca.org.uk/sciencegroup/researchanimals/implementing3rs/gapassport)

93

EU O OCHRANĚ ZVÍŘAT POUŽÍVANÝCH PRO VĚDECKÉ ÚČELY

Recommend Documents