BIOTECHNOLÓGIAI FEJLESZTÉSI POLITIKA, KUTATÁSI IRÁNYOK Enzimek vizsgálata és előállítása genetikai szelekcióval Tárgyszavak: enzim; enzimkatalízis; genetikai szelekció; irányított evolúció; fehérjetervezés; fehérjeszerkezet. A természetes enzimek évmilliók alatt jöttek létre a darwini evolúció során, amelynek alapelemei: a mutáció, a szelekció és a sokszorozódás. Ezek egymást váltó és ismétlődő ciklusai alakítják ki a fajok alkalmazkodás, túlélés vagy egy új fejlődési irány szempontjából kívánatos tulajdonságait. Újabban biológusok és vegyészek is az evolúció mintájára szabott eljárásokkal élnek, ha módosítani kívánják az egész organizmus helyett egy-egy molekula kiszemelt tulajdonságait. A molekulapopulációknak ezt a mutagenezisét – degenerált oligonukleotiddal irányított vagy – hibás (error-prone) DNS-szintézissel, – mutált DNS-szakaszok összekeverésével vagy – vegyületkönyvtárak kombinatorikai szintézisével idézik elő. A molekulák így létrejött sokaságából – a szelekció (kiválasztás) vagy – a screening (szűrés) módszerével keresik meg és azonosítják a célnak megfelelőket, majd sokszorosítják (amplifikálják) azokat – vegyi szintézissel vagy – nukleinsavak esetében kihasználva azok önreplikálódó képességét. A kiválasztás a laboratóriumi evolúciós kísérletek kritikus lépése. Ez kémiai úton az összetett biológiai molekulák esetében igen hosszú, fáradságos feladat, akár reménytelen is lehet. Helyette fejlesztették ki a genetikai szelekció számos módszerét, amelyek az un. mechanisztikus enzimológiának és fehérjék tervezésének (proteindesign) nélkülözhetetlen eszközei. Screening és szelekció A screening és a szelekció gyakran felcserélve használt fogalmai között elvi különbség van:
– a screening egymástól nehezen megkülönböztethető változatok közül a kívánt tulajdonságokkal bírók egyedi, véletlenszerű sorrendben végzett kiválogatása (kiszűrése), – a szelekció válogatás olyan feltételek alkalmazásával, amelyek kizárólag a kívánt tulajdonságú változatok „túlélésének” kedveznek, ezáltal utánozzák a darwini evolúciót meghatározó kiválasztási folyamatot. Néha „könnyített screeningre” is mód van, ha a kedvező változat megkülönböztethető mint speciális fenotípus, de a nem kívánt variánsok ilyenkor is rontják a jel/zaj viszonyt, mintegy versenyben az alkalmazott eljárás materiális technikai erőforrásaival. A szelekció fő előnye a screeninggel szemben az, hogy mivel az érdektelen variánsok meg sem jelennek, sokkal többnek az egyidejű elemzését teszi lehetővé, így az adott sokaság gyorsabban átvizsgálható. A ma ismert (2000. évi közlés) leggyorsabb, legnagyobb áteresztőképességű, fluoreszkáló vagy kromogén anyagokkal végzett screening-módszerrel legfeljebb 105 könyvtárelemet lehet „megszűrni”, ezzel szemben genetikai szelekció 1010 klón elemzéséig is elmehet egyetlen in-vivo kísérletben. A genetikai szelekció elve Szelekciós módszereket kiterjedten használnak a molekuláris biológiában, főként klónozáskor, ill. DNS-szakaszok vagy gének beépítésekor cirkuláris DNS-molekulába, a vektorokba, amelyek baktériumokban a DNS-szintézis mechanizmusa útján megsokszorozódnak. A klónozás folyamán a beillesztendő szakasz végeit enzim segítségével egy megfelelően „szabott” vektor végeihez kötik, azaz körkörössé zárják (ligáció), majd az így létrejött molekulát, a plazmidot beültetik egy baktériumba (rendszerint Escherichia coliba). Ez utóbbi transzformálásnak nevezett folyamat a szelektálható változatok számának felső korlátja, mivel a baktériumsejteknek csak egy kis részébe épül be a DNS. Az így transzformáltak kiválogatása céljából a baktériumokat szuszpenzió formájában antibiotikumot tartalmazó agar táptalajhoz keverik. Mivel a beépült vektornak van egy ezen antibiotikumnak ellenálló génje, a baktériumsejtek közül is csak azok képesek túlélni és azonos DNS-ű klónokból álló tenyészetté szaporodni, amelyek felvették genetikai állományukba az eredeti vektort vagy az új plazmidot. Ezt az igen hatékony első szelekciós lépést követi azoknak a klónoknak az azonosítása, amelyek a kívánt plazmidot (nemcsak az eredeti, beépített gén nélküli vektormolekulát) tartalmazzák. A klónozási technikától és a ligáció eredményességétől függően csak kevés antibiotikum-rezisztens klón tartalmazza a DNS-szakaszt.
Korizmátmutázok genetikai szelekciója A laboratóriumban alkalmazott evolúciós stratégiák jól szemléltethetők fehérjékkel katalizált egyszerű anyagcsere-reakciókon, pl. a korizmát prefenáttá való átalakulásán (1. ábra), amely a növényekben és alacsonyabb rendű szervezetekben végbemenő, sikimáton át vezető aminosav-bioszintézis alapvető reakciója. Az ezt katalizáló korizmátmutázokról kimutatták, hogy milliószorosan gyorsítják (3,3)-szigmatrop átrendeződést.
(–)-sikimát
D-eritóz-4P
foszfo-enolpiruvát
L-tirozin
korizmát
L-triptofán
prefenát
L-fenilalanin
1. ábra Aromás aminosavak sikimáton kersztüli bioszintézise növényekben és alacsonyabb rendű szervezetekben A különféle mutázok, lényegi szekvenciális, valamint szekunder, tercier és kvaterner strukturális eltéréseik ellenére, kinetikai tulajdonságaik tekintetében hasonlók. A leggyakrabban vizsgált korizmátmutázok – a Bacillus subtilisban, BsCM, – Escherichia coliban, EcCM és – az élesztőgombában (Saccharomyces cervisiae), ScCM
találhatók. A BsCM három azonos „aktív zsebbel” rendelkező szimmetrikus homotrimer (2. ábra), az EcCM és az ScCM spirális szerkezetű homodimerek.
A
B
A – Bacillus subtilis monofunkciós korizmátmutázok, FcCM, B – Escherichia coli difunkciós korizmátmutáz/prefenátdehidratázának korizmátmutáz-tartománya, EcCM
2. ábra Korizmátmutázok szalagmodelljei Ezzel kapcsolatban felvetődik a kérdés, vajon miért alkotott a természet ugyanazon, kémiailag egyszerűnek látszó átalakításra annyi, különböző szerkezetekhez kötött katalitikus megoldást, és vajon a természetes enzimek miért 104-szer hatásosabbak, mint az 1994-ben ismertetett, 1F7 jelű korizmátmutázaktivitású antitest. Az elmúlt években (1992–1996) a szerkezet és a funkció összefüggéseinek vizsgálata céljából a kódoló gének eltávolításával előállítottak olyan élesztő- és E. coli törzseket, amelyekből hiányzott a korizmátmutáz-aktivitás, ezért a sejtek csak tirozin és fenilalanin táptalajba adagolásával tudtak szaporodni. A hiány pótolható a természetes mutázt kódoló plazmiddal, de alternatív módon az enzim mutánsával, esetleg egy másik polipeptiddel is, amelyek birtokában a sejt maga termelheti a két aminosavat. Ha a polipeptid (vagy fehérje) katalizálni tudja a korizmát → prefenát átalakulást, akkor a sejtek önállóan szintetizálhatnák saját tirozinjukat és fenilalaninjukat, következésképpen a szelekció körülményei között növekednének (azaz aminosav-adagolás nélkül). Amennyiben a polipeptid nem katalizálja az átrendeződést, a sejtek nem szaporodnak, így a figyelmet közvetlenül a funkcióképes klónoknak lehet szentelni, ezenkívül ebben a rendszerben automatikusan adva van a kapcsolat – a kívánt fenotípus (egy a növekedést szelekciós feltételek mellett megengedő katalizátor) és a hozzá tartozó – genotípus (a katlizátort kódoló gén)
között, ami lehetővé teszi a génbank kiemelt változatainak egyszerű izolálását, diverzifikálását és további evolúcióját. Mivel a katalitikus csoportok eltolódása csupán néhány tized Å-mel már a teljes vagy a nem létező aktivitás különbségét jelentheti, az enzimfunkció a sikeres tervezés rendkívül szigorú kritériuma. Ennek alapján a jól felépített fehérjekönyvtárakban aktív korizmátmutánsok keresése értékes információkkal szolgálhat, amit érdemes példákon bemutatni. Mechanisztikus vizsgálatok – katalitikus aminosav-maradékok A korizmátátrendeződésről megszerzett ismeretek nagyrészt – a nem katalizált reakció mechanisztikus vizsgálatán és – számítógépes szimuláláson alapulnak. 2
3
4
-
5 1
1 – az oldatban előnyben részesített pszeudo-diequatoriális, 2 – a kedvezőtlenebb, de az átmenetihez szükséges pszeudo-diaxiális, 3 – az átmeneti periciklusos, 4 – átalakult ciklusos, 5 – gátló hatásu, az átmenetet utánzó oxabiciklusos dikarbonsav
3. ábra A korizmát konfigurációi A mechanisztikus vizsgálatok a molekulaszerkezet térgeometriáját, illeszkedési lehetőségeit, szubsztitúciós csoportjaik „férőhelyeit” veszik figyelembe. Valamelyik reakciópartner, enzim vagy szubsztrátum, átmeneti struktúraállapotával analóg szerkezetű molekula gátolhatja a reakciót, pl. a korizmát pszeudodiaxiális átmeneti konfigurációjához hasonló oxabiciklusos dikarbon
sav esetében (3. ábra). Az e vegyület származékaiként előállított 1F7 antitestek ugyancsak katalizálják a reakciót, de 100–10 000-szer gyengébben, mint természetes analogonjaik. A szerkezeti geometriában, az atomok közelsége–távolsága felveti oxigén- és hidrogénhidak – esetleg szintén átmeneti – képződésének, a molekulán belüli polarizálódásnak és szerkezeti elemek elektrosztatikus stabilizálódásának a lehetőségét. A korizmátmutáz ún. „aktív zsebében” így felmerül a guanidiniumion más kationra való kicserélésének vagy egy pozitív töltés megszüntetésének hatása. Egy jó szelekciós rendszerben ezt ki lehet próbálni ugyanabban a pozícióban valamennyi természetes aminosavval. Az aktív enzimet adó aminosavak gyorsan kiválaszthatók azon gének szekvenálásával, amelyek meg tudják szüntetni a korizmátmutáz hiányát. A zürichi Szövetségi Műszaki Egyetem (ETH) Szerves Kémiai Laboratóriumában végrehajtott kísérlet során egyedül az arginin beépítésével sikerült teljes értékű enzimet előállítani, még a szintén pozitív töltésű lizin savmaradéka is inaktív enzimet eredményezett. Ennek valószínűleg az a magyarázata, hogy az enzim aktív zsebe mintegy strukturális kényszert gyakorol a lehetséges helyettesítőkre. Elképzelhető ugyanis, hogy az argininnél rövidebb lizin oldallánc bizonyos, elektrosztatikailag meghatározó alakzatok létrejöttéhez nem ér bele eléggé ebbe az aktív zsebbe. Véletlenszerűen megrövidült fehérjevariánsok A BsCM enzimaktivitását befolyásoló 17C-terminális aminosavak hatásának tanulmányozására kiválóan alkalmasnak bizonyult az ún. véletlen mutagenezis, szelekcióval kombinálva. A 127 aminosavat tartalmazó BsCM 115 aminosavból „hajtogatott” belső magja jól definiált kristályszerkezetű, amelyből rövid spirálban végződő, Cterminális ágak nyúlnak az aktív zsebig. Feltételezték, hogy ezek az IRspektroszkópos és Fourier-transzformációs vizsgálatok alapján rugalmas szerkezetváltozásokra képes részek fontos szerepet játszanak az enzimfunkcióban, esetleg hozzájárulnak az átmeneti állapot stabilizálásához, vagy lefedik az aktív zsebet, elárnyékolva a szubsztrátumot a környező oldattól. E kérdések tisztázására kidolgoztak egy stratégiát, amely az enzim C-végződését a véletlenszerűség (random principle) elve alapján megrövidíti, és ezt összehasonlítja funkcionális klónok szelektálásával. Ehhez a polimerázláncreakció (PCR) módszerét alkalmazták két részlegesen randomizált oligonukleotidra: az enzim 116–127 és 111–127 szakaszára. Ezáltal mutagén átalakulásokkal különbözőképpen megrövidült fehérjék sorozata képződött, amelynek csaknem minden tagja in-vivo aktivitásról tanúskodott. Ebből következően a 12 C-terminális savmaradékok egyike sem nélkülözhetetlen az enzim működéséhez, amelyet nem befolyásol ezek mutációja, de még a 11 utolsó maradék távolsága sem. Ezzel szemben a tagoknak csak kb. 25%-a szaporodott a szelekciós lemezeken, ha az utolsó 17 maradék is
mutagenézisen esett át. Ugyanis a többi öt aminosav az említett jól definiált spirált alkotja, amely a fehérje többi részével való kölcsönhatásokat irányítja. További kísérletek is arra utalnak, hogy az öt aminosavból álló hármas „csavar” nem távolítható el (cserélhető ki) az egész enzim elroncsolása nélkül. Szerkezetvizsgálatok A fehérjék aminosavainak sorrendje, a szekvencia nem hordoz egységes információtartalmat. Számos savmaradék „jól tűri” a széles skálájú helyettesítést, mások nem cserélhetők ki a molekulalánc hajtogatásának és a fehérje funkciójának jelentős megváltozása nélkül. Ezért a szekvencia és a szerkezet összefüggése fehérjéknél kombinatorikai probléma, amely sok különböző szekvencia egyidejű értékelésére alkalmas, nagy teljesítőképességű módszereket igényel. Egy 100 aminosavból álló polipeptid 10130 lehetőségéhez képest a kísérletileg megvalósítható 1010 molekulaszámú populáció elenyészően kicsi ugyan, mégis már ekkora génbank is statisztikailag értékes betekintést enged a fehérjék által előnyben részesített másodrendű szerkezetbe, különös tekintettel a szekunder szerkezeti elemek összekötő szakaszait érintő korlátokra és a savmaradékok optimális tömörülésére a fehérje belsejében. A fehérjeszerkezetben gyakori hosszabb-rövidebb spirálok funkcionális változataiban az egyes hurkokat többen tanulmányozták és megállapították, hogy a spirálszakaszok mutagén cseréje stabil, a természeteshez hasonló másodlagos fehérjeszerkezeteket eredményezett, tehát a hurkokra kevés hosszúsági és sorrendi korlátozás érvényes. A fenti következtetés általánosíthatóságát a szerkezeti épségre a screeningnél érzékenyebb teszttel a katalitikus aktivitás szerinti szelektálással ellenőrizték az EcCM enzim példáján. Az enzimfehérje két azonos polipeptidje három spirálból áll, amelyeket két hurok köt össze (4. ábra). Ezek közül a H2 és H3 hélixet (spirált) összekötő L2 hurok van a legtávolabb az aktív zsebtől. A hurok három oldószernek kitett savmaradékának az ismertetett módon történt randomizálása után in-vivo szelekcióval kiválasztották az aktív változatokat: 8000-ből több mint 63%-ról mutatták ki, hogy pótolja a bakteriális gazdatörzsből hiányzó korizmátmutázt, bár a baktériumok erősen eltérő sebességgel szaporodtak. A hiánypótló klónoknak ez a nagy aránya ebben a szakaszban csekély szubsztitúciós korlátozásra vall ugyan, az egyes klónok különböző növekedéséből mégis arra lehet következtetni, hogy a helyettesítések befolyásolják – a fehérje termelését, – stabilitását vagy – katalitikus tevékenységét.
A C
H1’ L2
H2 H3 N H1
L1
C hisztamin67
leucin 68
alanin65 hisztamin66
4. ábra Az EcCM szalagmodellje (A) és L2 hurokrésze (B) A leggyorsabban szaporodó klónok pontos szekvenciaelemzése valóban igazolta hidrofil savmaradékok statisztikusan releváns előnyben részesítését ezen az oldószernek kitett helyen, pl. prolintartalmú hurok esetében mindig gyenge volt a klón aktivitása. Azt a kérdést, vajon megváltoztatják-e szomszédos szekunder szerkezeti elemek a hurokban az aminosav-maradékok megengedett cseremintáját a hu
rok hármas peptidjének (alanin/hisztamin/hisztamin, 4. ábra) randomizálásával vizsgálták a határos H2 spirál részét képező lizinhez kapcsolódva. Ez esetben 160 000 tagú génbankot lehetett felépíteni. A tagoknak több mint a fele most is alkalmas volt a természetes szekvencia funkcionális helyettesítésére. Ez azt jelenti, hogy a másodlagos szerkezet ebben a pozícióban nem szűkíti az elfogadható oldalláncok választékát, a beépült savmaradék pedig nem befolyásolja bizonyos maradékok preferálását a szomszédos hurokrégióban. Az EcCM vizsgálatok meggyőzően mutatják be a genetikai szelekció előnyét a screening-módszerhez képest. Egyrészt sokkal nagyobb génbankok vizsgálhatók csekély többletráfordítással, a keverék egyszerűen elkülöníthető aktív, kevésbé aktív és inaktív enzimekre, másrészt a katalitikus aktivitás sokkal szigorúbb szelekciós kritériumával felismerhetők olyan nem nyilvánvaló sajátságok, mint a kedvezés hidrofil aminosav-maradékoknak az oldószerrel érintkező helyeken. A fehérjetipológia megváltoztatása A fehérjékben a szekunder szerkezeti elemek jól definiált tercier és kvaterner struktúrákká szerveződésének ma még csak kezdeti fokán levő megismerését és majdani utánzását szintén támogathatják az evolúciós stratégiák, amelyek megengedik számtalan alternatíva megítélését egy szelektálható fenotípus, pl. a katalitikus aktivitás alapján. E vonatkozásban különös figyelmet érdemelnek a monomerek multimerekké alakításáról és megfordítva, multimerek monomerekké való lebontásáról 1994 óta beszámoló közlemények, elsősorban amerikai laboratóriumokból. De a zürichi kutatócsoportnak is sikerült az EcCM-molekula egymásba hurkolt spiráljait úgy szétválasztani egy „csuklós hurok” közbeiktatásával, hogy megőrződjék bizonyos fokú enzimműködés (5. ábra) annak ellenére, hogy mindkét polipeptidlánc az enzim aktív zsebéhez tartozik. Azt is megvizsgálták, hogy mennyire befolyásolja az eredményt a csukló négytől hét aminosavig terjedő hossza (L4-L7). A korizmátmutáz-hiányos baktériumok transzformációja mindegyikre 107 klónt tartalmazó génbankot eredményezett. A genetikai hiány az egyes populációkban a szelekció feltételei mellett L4–0,005 L5–0,002 L6–0 L7–0,5%-os arányban szűnt meg. A szelekcióval nyert, biokémiailag jellemzett aktív enzimtípusok közül (6. ábra) az L5 csukló bevitelével kialakult hexamer nemcsak – a természetesnél ugyan 200-szor kevésbé – aktívnak, hanem stabilnak is bizonyult. Ez a körülmény azt sejteti, hogy a stabilitás az oligomer fehérjék evolúciójának egyik hajtóereje lehet.
H1 C
N
C
5. ábra Az EcCM dimer átalakítása monomerré rugalmas (csuklós) taggal
hurokhosz (aminosavmaradékok száma)
0
4
5
6
7
dimer
monomer
hexamer
_
monomer
kvarter szerkezet tömörülés
tömörülés
modell
a katalízist jellemző kinetikai 56 000 állandó kkat/KM ⋅ [1/M ⋅ s]
8100
270
_
42 000
6. ábra Csuklós taggal rendelkező EcCM-variánsok szerkezeti modelljei A kísérletek a spirálokat összekötő hurok eddig feltételezettnél nagyobb jelentőségére is utalnak. Az aktív változatok igen csekély szelekciós aránya
pedig azt jelzi, hogy ezúttal csak kevés hurokszekvencia engedi meg a negyedleges szerkezet olyan megváltozását, amely nem befolyásolja az aktív zseb struktúráját. Az enzimtevékenység javítása Laboratóriumban az enzimtulajdonságok optimálása céljából utánozni lehet a természetes evolúció egymást követő mutációs és szelekciós ciklusait. (irányított evolúció). Ezen az elven sikerült a svájci kutatóknak fokozniuk a fent leírt hexamer korizmátmutáz aktivitását. Az ivaros genetikai rekombinálást in vitro utánzó módszerrel (shuffling = becsúszás) mutációkat iktattak be a hexamer alegységeit kódoló génbe, és kiválogatták a javított változatokat, az előzőkhöz hasonlóan, a baktériumok korizmátmutáz-anyagcseréjét helyreállító képességük alapján. A leggyorsabban szaporodó sejtekből ezután izolálták a plazmid-DNS-t, majd az egész műveletet megismételték. A ciklusok kétszeri ismétlése után ki tudtak választani a „vad” típushoz hasonlóan szaporodó klónokat. Közülük egy három mutációt (szerin/aszparagin, leucin/fenilalanin, treonin/izoleucin) tartalmazó variánsnak a természetesnél 35-ször nagyobb volt a tömegre vonatkoztatott katalitikus sebessége. Az eljárás elvileg folytatható a kívánt aktivitás eléréséig, a valóságban, elérve azt a katalitikus aktivitást, amelynél a gazdasejt ugyanúgy szaporodik, mint az eredetiek, igen nehézzé válik a javított változatok szelektálása. Mivel az összaktivitást a fajlagos aktivitás és a katalizátor koncentrációja szabja meg, ez utóbbinak a csökkentésével fokozni lehet a szelekciós hatást. A gyakorlatban a sejt fehérjekoncentrációja csökkenthető – kis másolatszámú plazmidok és – gyenge promoterek használatával, valamint – kevéssé hatékony riboszómamegkötő helyekkel. Fehérjék tervezése Funkcióképes fehérje megtervezése és felépítése (de-novo design), vagyis olyan molekuláé, amely szelektív módon ismer fel más molekulákat vagy katalizál kémiai reakciókat, ma még rendkívüli kihívás, még ha néhány kisebb proteinvázat sikerült is létrehozni elemi módszerekkel, olykor számítógépes algoritmusok segítségével. Közvetlen szelektálás randomizált fehérjebankokból a tagok szinte végtelen száma miatt lehetetlen, de a konstruálás és a célzott válogatás közötti kompromisszumként reális volna – szűkebb génbankok létrehozásához felhasználni olyan szerkezeti alapinformációkat, mint a spirálok sorrendi preferációi vagy a hidrofób savmaradékok hajlama arra, hogy a fehérje belsejének „védelme alá helyezzék magukat”, majd – ezekből kiválogatni a funkcionális katalizátorokat.
A fehérjetervezés általánosan alkalmazható, nem az aminosavak hajtogatott szerkezetekben való véletlen előfordulásán alapuló stratégiája pl. a poláros és nem poláros aminosavakat pozicionálisan megkülönböztető mintázat (binary patterning). Ezen az úton már készültek spirálkötegek a természtes fehérjékéihez hasonló tulajdonságokkal, pl. proteáz enzimmel szembeni ellenállással (1998–2000). A zürichi kutatók aktív katalizátorok ilyen kiindulású tervezésének lehetőségét tanulmányozták egy homodimer korizmátmutáz valamennyi szekunder szerkezeti elemének módszeres helyettesítése útján véletlen szekvenciájú, biner válogatású egységekkel. Az így keletkezett génbankok fehérjéinek katalitikus tulajdonságait ismét genetikai szelekció segítségével értékelve, menynyiségi információkhoz jutottak az itt szereplő fehérjeváz stabilitásáról és megismerték az aktív zseb képzéséhez szükséges kölcsönhatásokat. A binary patterning (kettős mintázat) és két evolúciós ciklus kombinálásával egyszerűsített építőelemekből új spirálnyaláb-fehérjét nyertek, amelynek biofizikai és funkcionális tulajdonságai hasonlók a természetes korizmátmutázokéihoz. Az optimálás további mutációs/szelekciós ciklusok útján tárhatja fel a magasabb rendű struktúrákat és a stabilitást befolyásoló finom kölcsönhatásokat. Aktív enzimek ritka előfordulása ezekben a génbankokban kiemeli katalitikus tulajdonságú váz felépítésének nehézségét, még ha előzőleg sikerült is pontosan meghatározni az aktív zseb minden kritikus savmaradékát, a pozíciójukkal együtt. Legalább 1024 tagúra becsülhető az a génbank, amelyből randomizált körülmények közt, biner válogatással teljes értékű katalizátorra lehet bukkanni. Az eddigi tapasztalatok arra vallanak, hogy más rendszerben még nehezebben konstruálhatók hajtogatott és csavart katalizátorfehérjék. Mivel ilyen méretű génbankok nem készíthetők, új enzimek felépítése csak lépésenként képzelhető el, egy stabil vázhoz funkciós csoportokat csatolva, végül a kívánt működésre optimálva. Hatékony szelekciós rendszer itt is nélkülözhetetlen lesz. Az in-vivo szelekció más alkalmazásai A szelektivitás megváltoztatása Az enyhe reakciókörülmények között, rendkívül hatékonyan működő enzimek értékes katalizátorok, de szélesebb körű alkalmazásukat kémiai szintézisekben korlátozza harmadik kiemelkedő – olykor szintén páratlan – tulajdonságuk, a nagy szelektivitás. Az enzimek aktív helyének „művi” átalakítása szerény eredménnyel járt, viszont a screening vagy szelekciós módszerek, randomizálással kombinálva a specifikusság módosítására (általában kibővítésére) is beváltak. Jó példa erre egy homodimer aszpartát-aminotranszferáz (AspAT)
amerikai kutatók által 1998-ban közölt átalakítása igen hatékony valin-aminotranszferázzá (7. ábra), in-vivo szelekció felhasználásával. A természetes („vad”) AspAT katalizálja oxál-acetát transzaminálását Laszpartáttá, miközben a piridoxamin-foszfát (PMP) kofaktor piridoxál-foszfáttá (PLP) alakul át, tökéletesen megfordítható reakcióval. Az AspAT gyakorlatilag hatástalan β-elágazású hidrofób aminosavakra. A szubsztrátumspecifikusság módosítása céljából az eredeti gént a DNS-shuffling módszerével mutagenizálták, majd kiválogatták azokat a variánsokat, amelyek pótolni tudták egy auxotróf (bizonyos anyagcsere-elégtelenség miatt táptalajigényes) E. coli törzsben a β-láncelágazású szubsztrátumok speciális aminotranszferázát kódoló gén hiányát. Ez a gén szükséges három esszenciális aminosav: a valin, a leucin és az izoleucin szintéziséhez. Így a mutáns baktériumtörzs valin távollétében csak akkor növekedhet, ha az AspAT működése kiterjedt a β-elágazó 2-oxovalin valinná történő alakulására is. O
A
PMP -
02C
B
-
02C
CO2oxál-acetát
NH3+
PLP
AspAT
CO2L-aszpartát
NH3+
O
CO2-
CO22-oxovalin
AspAT-mutánsok
L-valin
7. ábra Oxálacetát transzaminálása L-aszpartáttá AspAT katalízisével, a piridoxamin-foszfát (PMP) piridoxál-foszfáttá (PLP) való átalakulása közben (A), mutagenezis és szelekció auxotróf E. coli törzsben (B) Öt mutagenezis/szelekciós ciklus folyamán egyre szigorították azon AspAT-mutánsok szelekciós kritériumait, amelyek szubsztrátumként használni tudják a 2-oxovalint: először csökkentették az inkubációs időt a szelekciós közegben, majd kihagyták a szaporítóközegből a 2-oxovalint, ami által csökkent ennek sejten belüli koncentrációja. Ebben a kísérletben találtak egy mutánst 13 aminosav helyettesítésével és a 2-oxovalinra érvényes 105-szörös aktivitással, egy második háromszoros helyettesítésű AspAT-változatból kiinduló evolúciós kísérletben pedig képző
dött egy 17-szeres szubsztitúciójú mutáns, amelynek 2 · 106-szorosra nőtt az aktivitása β-elágazású 2-oxosavak átalakítására a „vad” enziméhez képest. Ez utóbbi mutáns kristályszerkezetének vizsgálata arra az érdekes eredményre vezetett, hogy a 17 mutált aminosav közül csak egy lép kölcsönhatásba a szubsztrátummal, és némelyik több mint 10 Å távolságra van az aktív zsebtől. Ez utóbbinak és az alegységek közötti határfelületeknek ennek ellenére bekövetkező átalakulása, amelyek végeredményben előidézik a szubsztrátumfajlagosság megváltozását, a számos helyettesítés összeadódó finomszerkezeti hatásaira vezethető vissza. Efféle módosulások előrejelzéseinek nehézsége ismét felhívja a figyelmet az irányított evolúció hasznára. Néhány példa enzimek szubsztrátumspecifikusságának megváltoztatásáról szóló, újabban (1997–1999) megszaporodott híradásokra: – β-laktamáz, – timidinkináz, – preniltranszferázok, – aminoacil-tRNS-szintetázok. A hőstabilitás fokozása A mezofil szervezetekből izolált bakteriális enzimek mérsékelt hőstabilitása ugyancsak a felhasználást korlátozó tényező, ezért irányul a figyelem szélsőséges körülmények között élő mikroorganizmusokra mint enzimforrásokra, de evolúciós kísérletekkel is lehet izolálni extrém feltételek mellett működő, elsősorban nagy hőstabilitású biokatalizátorokat. Ennek az a módja, hogy egy mezofil szervezetből kiválasztott nagy hatású enzim kódoló génjét beültetik egy termofil baktériumba, majd kiválogatják a megemelt hőmérsékleten is működőképes egyedeket. Ezt az eljárást már egy 1986-os amerikai közlemény ismerteti kanamicin-nukleotidiltranszferázra (KNTáz), amelyet a mérsékelten termofil Bacillus stearothermophilus termel. A sejtek csak 55 °C-ig ellenállók a kanamicin nevű antibiotikummal szemben, de mutagenezissel létrehoztak és izoláltak 60 °C felett is rezisztens változatokat. Kiderült, hogy az enzim nagyobb hőtűrését egyetlen, aszparagin/tirozinmutáció idézi elő, de további szelekciós kísérletekkel, még egy mutációval (treonin/lizin) ezt fokozni tudták 70 °C-ig. Legújabban (1999) 84 °C-ig hőstabil KNTázt nyertek ismételt ciklusok eredményeképpen. Funkcióváltoztatás Meglevő fehérjék funkcionalitásának kibővítésére a divergens (széttartó) evolúciót utánzó stratégia kínálkozik. A természet a legkülönbözőbb feladatokhoz „megelégszik” korlátozott számú fehérjeszerkezettel, pl. az immunglobulin vázra épült ágensek csekély változtatásokkal, végtelenül sok idegen antigén felismerésére képesek. Ennek mintájára különösen sokoldalúan lehetne
alkalmazni az α/β-hordószerkezetet, amely az ismert felépítésű fehérjék kb. 10%-ának alapváza (8. ábra). Ilyen fehérjék a triptofán bioszintézisének egy-egy lépését katalizáló – indol-3-glicerinfoszfátszintáz (IGPS) és – foszforibozil-antranilát-izomeráz (PRA) enzimek, amelyek az E. coliban egymással kovalensen kapcsolódva találhatók. Az IGPS átalakításához a rendkívül aktív PRAI enzimmé szintén a sokoldalúan bevált – célzott tervezést, – véletlenszerű mutagenezist és – genetikai szelekciót alkalmazták. A design-műveletek célja az IGPS kristályszerkezetének közelítése volt a PRAI-éhoz, egy N-végződésű szakasz eltávolításával, egy 15 részes hurok helyettesítésével 4–7 aminosav-maradékból álló hurkokkal. E változó hurokhosszakból és -szekvenciákból különböző variánsok származtak, köztük kiválasztható katalizátorokkal.
PRAI
IGPS
8. ábra Foszforibozil-antranilát-izomeráz, PRAI és indol-3-glicerinfoszfátszintáz, IGPS: két α/β hordószerkezetű fehérje Az aktív változatok genetikai szelekcióját triptofán bioszintézisére nem képes, PRAI-hiányos E. coli törzs segítségével hajtották végre. Többszöri egymást követő mutáció és szelektálás után megjelent néhány triptofán nélkül is szaporodó egyed. Ezek egyike „ivePRAi” olyan fehérjét kódolt, amelynek szekvenciája – jelentős PRAI- és hiányzó IGPS-aktivitása ellenére – csak 28%-ban egyezett meg a PRAI-enzimével, viszont 90%-ban az IGPS-ével. Az „ive PRAI”-nak a természetes enziméhez képest hatszoros specifikussági ál
landója is jelzi a PRA (foszforibozil-antranilát) iránti megnövekedett katalitikus aktivitását. A sikeres laboratóriumi IGPS → PRAI átalakulás alátámasztja azt a feltételezést, hogy a triptofán-bioszintézis természetes enzimei divergens evolúció során keletkeztek. A kísérlet eredménye azt az ígéretet is hordozza, hogy a gyakran előforduló α/β-hordómotívum új enzimtervezetek általánosan használható alapszerkezete lehet. Többlépcsős folyamatok optimálása Ismét a darwini evolúció mintájára a bioszintetikus folyamatoknak – olykor egész organizmusok kifejlődésének – több lépése is optimálható egyidejűleg, laboratóriumi körülmények között, feltéve, hogy rendelkezésre áll egy mutagenezissel vagy a kromoszómagének eltávolításával kialakított, megfelelő szelekciós törzs. Az optimálás másik lehetősége meglevő organizmust idegen gént igénylő szelektálási feltételeknek alávetni. Ezen az elven fejlesztették ki az elérhető legnagyobb hatékonyságú arzenátméregtelenítő eljárást, amely hátrahagyott talajszennyezések felszámolására is bevethető. A Staphylococcus aureust az arsA, arsB és arsC géneket tartalmazó operonja teszi ellenálóvá arzenát- és arzenitionnal szemben. A DNS-shuffling útján mutagenizált operont beültették egy E. coli törzsbe, és azt arzenátrezisztens baktériumok kiválasztása céljából növekedő arzenátkoncentrációjú (16-400 mM) táptalajra helyezték. A három mutogenezis/szelekció ciklus után még mindig növekedő klónok közt találták egy 500 mM-os arzenátoldatban is életképeset. A részt vevő operongének elemzése összesen 13 mutációt mutatott ki, amelyek 12-szeresre növelték az arzenátredukálás sebességét, ami a génexpresszió emelt szintjével magyarázható. In-vitro szelekciós rendszerek Számos fehérjefunkció összekapcsolható genetikai szelektálásra alkalmas fenotípussal, de ez a kapcsolás nem minden hasznot ígérő alkalmazáshoz járható út. Sőt teljesen ki is zárható pl., ha a szelekcióhoz nem fiziológiás feltételeknek kellene teljesülniük. Ilyenkor az in-vitro szelekció a gyakorlati megoldás, de ehhez is szükség van a genetikai információ és a fehérjeműködés valamilyen kapcsolódására. Fág- és sejtfelületi megjelenítés A fenotípus és a genotípus összekötésének hatékony módszere fehérjék és peptidek megjelenítése sejtek felületén vagy bakteriofágokon. Ehhez a vizsgálandó fehérjék és egy membránfehérje vagy egy szálas fág egyik külső
fehérjekönyvtár fágakon bemutatva
szelekció
meg nem kötött variánsok elválasztása
a kiválasztott variánsok leválasztása a hordozóról
a gén izolálása
sokszorozás, diverzifikálás, ismételt szelekció
9. ábra Szelektálás fág-display módszerrel Egy antitestet vagy más fehérjét kódoló gén fúziója a bakteriofág burokfehérjéjének génjével lehetővé teszi fehérjevariánsok előállítását vírusfelületen
kapszid fehérjéje között fúziót létesítenek. Az így létrejött fágkönyvtárat „felajánlják” egy immobilizált (vagy immobilizálható) ligandnak, így in-vitro szelektálhatók specifikus receptorok affinitási alapon (9. ábra). Mivel az izolált sejtek vagy bakteriofágok a kiválasztott receptorok mellett a kódoló géneket is hordozzák, ez a lépés egyben a kívánt gén szelekciója is. A gén a szilárd fázisról leválasztva in-vivo megsokszorozható, majd alávethető az ismert műveleteknek az általa kódolt enzim tulajdonságainak megváltoztatása céljából. Ilyen „display” módszereket kiterjedten használnak különböző kapcsolódási tulajdonságú fehérjék válogatására. Említésre méltó ebben az összefüggésben – DNS-t megkötő fehérjék optimálása minden kívánt DNS-szakasz specifikus felismerésére, – az A-fehérje Z-immunglobulin-tartományának minimálása és – antigén-affinitású antitestszakaszok evolúciója. Fehérjék közvetlen kiválasztása katalitikus tulajdonságaik alapján sokkal nehezebbnek bizonyult, de vannak ígéretes kísérletek. Ilyen pl. a reaktív ligandokat és mechanisztikus felismerésen nyugvó inhibitorokat alkalmazó módszer, amely szerint enzimeket és katalitikus antitesteket feldúsítanak fágbankok olyan tagjaival, amelyek a gátló vegyülettel, ill. a liganddal közvetlenül vagy kémiai aktiválás hatására kovalens kötéssel reagálnak. Ezáltal az aktív fágok szilárd fázison immobilizálódnak. Ugyanazon fehérjecsoportok, amelyeknek az inhibitor aktiválása tulajdonítható, ezután felhasználhatók egy szubsztrátum katalitikus átalakítására. Ezen az úton új katalizátorokat lehet – igaz, közvetve – felfedezni. Katalizátorok szelektálásának egy másik lehetősége a katalizátor és a szubsztrátum vagy termék együttes lokalizálásán alapszik. Így immobilizált szubsztrátum összekapcsolható enzimet „prezentáló” fággal. Amennyiben az enzim aktív, a szubsztrátum molekulán belüli elhasítása szelektíven leválasztja a fágrészecskét a szilárd fázisról, így a kódoló gén izolálható és szaporítható. Hasonló rendszereket terveztek kémiai reakciókhoz, amelyek a fágon jelzést vagy jelzett terméket hoznak létre, és ez a termék reagál a fágrészecskével, mielőtt az eldiffundál. Egy 2000-ben megjelent cikk merőben más eljárást ismertet fehérjekönyvtárból olyan proteázok azonosítására, amelyeket baktériumsejtek felületére rögzítenek. Az eljárás azokon az elektrosztatikus kölcsönhatásokon alapszik, amelyek pozitív töltésű peptidszubsztrátumokat és -termékeket negatív töltésű sejtfelülethez kötnek. A fluoreszkáló FRET-csoporthoz (fluorescence-resonance-energy-transfer) kovalensen kötött szubsztrátum elhasítása felszabadítja a fluoreszcencia kioltóját, ami jelzést vált ki. Ezáltal a fluoreszcenciásan aktivált sejtek kiválogatása útján izolálhatók az aktív katalizátorvariánsok.
Ilyen módon izolálták 6 · 105 randomizált változatot tartalmazó könyvtárból egy szerinproteináz mutánsait, amelyek 60-szorosra növelt hatással bontják el az arginin–valin kötést. Ez az inkább nagy áteresztésű screeningnek, mint valódi darwini szelekciónak nevezhető eljárás alkalmazható számos, baktériumok vagy élesztőgombák felületére kihelyezett fehérjére. Kompartmentizálás A fág-display módszerrel funkcionálisan egyenértékűek a sejt nélküli, invitro transzkripciós/transzlációs rendszerek, amelyek magukba foglalják a gén transzkripciójához és fehérjévé való „lefordításához” szükséges RNS-t, fehérjéket és kismolekulájú vegyületeket. E komponensek kompartmentizálása, azaz betokolása a sejtekhez hasonló, zárt mesterséges reakciótérbe, lehetővé teszi a genotípus és a fenotípus helyi összekapcsolását. Pl. egy transzlációt végző enzimnek azt a képességét, hogy módosítsa saját, vele összezárt kódoló génjét, fel lehet használni a szelektálás eszközeként. Így mehet végbe egyedi gének genetikai szelekciója egy víz/olaj emulzió elszigetelt vízcseppjében (10. ábra). A szelekció alapját a génnek a kolokalizált enzim általi módosítása képezi, amennyiben az inaktív fehérjét kódoló gének változatlanul maradnak, és a szelekciós folyamat során eltávolíthatók. A
B
gén
szubsztrátum
gén
átírás
szubsztrátum
enzim
mRNS lefordítás enzim gén
termék
10. ábra Genetikai szelekció kompartmentizálással A módszer gyakorlati alkalmazhatóságát olyan gének keverékével igazolták, amelyek egy metiltranszferázt, ill. egy másik hatású enzimet kódoltak.
A metiltranszferáz metilezés útján rezisztenssé teszi a DNS-t endonukleáz általi elhasítással szemben. A keveréket emulzióba helyezve a cseppekben lejátszódott a transzkripció és a transzláció, a metilezéssel védett, a metiltranszferázt kódoló géneket pedig PCR-eljárással megsokszorozták, miközben a másik fehérjét kódoló géneket az endonukleáz lebontotta. Ilyen módon különítették el a metiltranszferáz-géneket a másik enzimet kódoló gén 107-szeres fölöslegéből. Általánosan alkalmazható szelekciós stratégia kidolgozása lehetővé tenné ilyen zárt, a baktériumokéhoz hasonló térfogatú reakciós terek széles körű használatát molekuláris evolúciós kísérletekhez, élő sejtek nélkül. Így az invivo kísérletek génbankjainál nagyobb méretűekkel lehetne dolgozni. mRNS és fehérje kapcsolása transzláció közben Fehérjék in-vitro szelekciós evolúciója a fág- és sejtfelületi display technikákéhoz hasonló előnyökkel valósítható meg – riboszóma- (poliszóma-) display és – mRNS-fehérje-fúzió segítségével. Mindkettő mRNS-minták sejt nélküli tanszlációjára épül, fehérjék riboszómákon való előállítása céljából. A természetes fehérjeszintézis során az üzenet (fehérje) és annak „továbbítója” (messenger-, mRNS) elválik egymástól, ezt azonban meg lehet gátolni olyan beavatkozással, amely nem engedi leválni a képződött fehérjét a riboszómáról, sőt a kettő között stabil kovalens kötés is létrejöhet. A disszociáció megakadályozására szolgál az ún. stopkodon eltávolítása, amely normálisan „figyelmezteti” a polipeptidet felszabadító termináló tényezőket, vagyis jelet ad a fehérjeszintézis befejezésére. Ezáltal erősen lelassul a riboszómához kötött peptidil-RNS hidrolízise. Amennyiben a „prezentált” fehérje hajtogatott szerkezete helyesen alakul ki, affinitáson alapuló szelekciós módszerekkel kiválaszthatók a kis molekulájú vegyületeket, oligonukleotidokat vagy más fehérjéket felismerő variánsok. Az in-vitro transzkripciós/transzlációs módszerek az irányított evolúció kísérleteiben előnyösen vehetnek részt, mivel – a szelekciós lépés feltételei széles „palettáról” választhatók, – a fehérjébe szuppresszorkodonok útján beépíthetők nem természetes aminosavak is, – az in-vivo technikához képest sokkal nagyobb és összetettebb, akár 1015 különböző tagból álló génbankok hozhatók létre. RNS-evolúciós kísérletek A nagy tagszámú génbankok elengedhetetlenek receptor- és katalizátorfunkciójú RNS- és DNS-molekulák közvetlen szelektálásához. Mivel a nuk
leinsavak egyetlen molekulában egyesítenek szerkezetet, funkciót és genetikai információt, kívánt fenotípus ritka génjeinek in-vitro előállítása és szaporítása viszonylag egyszerű és igen hatékony. Ezért a nukleinsav-populációkat könnyen lehet alávetni sok szelekciós és dúsításos ciklusnak. RNS-katalizátor in-vitro evolúciójához a kombinatorikusan előállított RNSgénbankban ligandkötés és katalízis szerinti szelekciót hajtanak végre. Az így nyert, funkcionális szekvenciákban feldúsult RNS-készletet, megforítva átírják cDNS-sé, majd PCR-módszerrel sokszorosítják, hogy elegendő anyag legyen a következő szelekcióhoz. Az egészet addig ismétlik, amíg együtt van az aktív szekvenciák klónozás segítségével való jellemzéséhez szükséges száma. Hibás PCR-módszer alkalmazása esetén minden ismétlés valódi darwini evolúciós ciklust képvisel (11. ábra).
11. ábra RNS-katalizátorok in-vitro evolúciója A jövő kutatási feladatai, ill. kilátásai Az evolúciós kísérletek bizonyos javításaival jelentősen lehetne fokozni gyakorlati hasznukat, így
– mikroorganizmusok mutagenezisének és átalakításának jobb módszereivel célszerűbben felépített és még nagyobb fehérjebankokhoz lehetne jutni, – értékesek lennének általánosabban alkalmazható, tetszés szerinti funkció alapján válogató szelekciós módszerek, – nagy távlatokat nyitna az evolúció elveinek kiterjesztése, a fehérjékből és nukleinsavakból kiindulva, a vegyületek széles skálájára. Az utóbbi cél megkívánná újszerű, kódolt kombinatorikai könyvtárak, továbbá olyan stratégiák kifejlesztését, amelyekkel ebből a sokaságból izolálni lehet a kívánt vegyületeket, és egyidejűleg tájékozódni felépítésükről is. Ebben az összefüggésben szükség van új eljárásokra – a „legjobb” molekulák szelektív megsokszorozásához és – az „autokatalitikus” kimutatásához minden evolúciós ciklus után. Az evolúciós módszerek azonban sohasem fogják kiszorítani a makromolekulák vizsgálatából a „racionális” megközelítést, inkább kiegészítik az elemzés és a design klasszikus módszereit. Az irányított evolúció valóban akkor bizonyul legsikeresebbnek fehérjék, nukleinsavak és más kódolt vegyületek tulajdonságainak felderítésében és kifejlesztésében, amikor részletes szerkezeti és mechanisztikus adatokkal kombinálva alkalmazzák. A „posztgenomika” korszakában ezek a módszerek valószínűleg fel fognak értékelődni a számos biológiai rendszer vizsgálatával nyert információáradat elemzésekor és megítélésekor. Az evolúciós módszerek intelligens alkalmazása a jövőben várhatóan segíti majd feltárni – a szekvencia és a szerkezet, – a szerkezet és a funkció közötti összefüggéseket, valamint – a sejtek makromolekuláinak kölcsönhatásait, és ezt bizonyára hamarosan követik a gyógyászati és ipari alkalmazások. (Dr. Boros Tiborné) Taylor, S. V.; Kast, P.; Hilvert, D.: Genetische Selektion – eine Strategie zur Untersuchung und Herstellung von Enzymen. = Angewandte Chemie, 113. k. 18. sz. 2001. szept. p. 3408– 3436. Losick, R.; Sonenschein, A.: Turning gene regulation on its head. = Science, 293. k. 5537. sz. 2001. szept. 14. p. 2018–2019.
