A modern immunoassay módszerek érzékenysége I.
A hypophysis daganatok biomarkereinek módszertani nehézségei
• Néhány ng/L mennyiségű molekulát felismer olyan környezetben, ahol az anyagkoncentráció 1011 ng/L ARÁNYAZONOSSÁG À
T ld Erzsébet Toldy E éb
• A föld teljes (6 x 10 9) népességéből 1-et azonosítani
Vas Megye és Szombathely MJV Markusovszky Kórháza Központi Laboratórium, PTE ETK Gyakorlati Diagnosztikai Tanszék, Szombathelyi Képzési Központ
Szeged, Szakorvos továbbképzés 2009. november Diamandos EP.: Clin Biochem, 2004. 37.
GH/IGF-1 és PRL fiziológiás koncentráció viszonyai felnőttekben 1/5
A módszerek mérési tartománya véges II.
1/200 1/2000
Kontroll Acromegalia aktív Acromegal remis.
Minimum
Maximum
25
500
20
400
15 10
GH-hiány
519
600
23,3
ng/ml
ng/ml
30
700
30x
300
Az assay mérési tartománya
200
6,9
5
1,3
100 0,25
Életkor:
0
0 GH
PRL
Szabad IGF-1
Nyál-IGF-1
<30 év
>50 év
Totál IGF-1 PAOLO MARZULLO P et al.: Usefulness of Different Biochemical Markers of the Insulin-Like Growth Factor (IGF) Family in Diagnosing Growth Hormone Excess and Deficiency in Adults, J. Clin Endocrin & Metab, 2001; 86: 3001-5.
Assay design kiindulási pontja
Rendkívül magas hormonszint: "High Dose Hook" jelenség
Endogén antitest interferenciák III. • Specifikus antitestek az analit ellen • Heterophyl antitestek • Reuma faktor
Captures antitest
2.
1.
Jelölt antitest
3.
Jel nagysága
Antigén
Szilárd fázis
Tévesen leolvasott alacsony koncentráció
Valós magas koncentráció
• Human anti-animal-antitestek • Human-antihuman-antitestek (HAHA) ?
1
Az állati antitestek ellen keletkező IgG interakciók
Human antiidiotípiás antitest
Állati antitest
)
Y Y Y
Tévesen magas
Y
Állati antitestek ellen keletkező további antitestek
*
Human anti-anti idiotípiás antitest
Tévesen alacsony
YY Y
Human anti-izotípiás antibody
)
*
Kricka: Clin. Chem. 1999.
Az analitika kivitelezése IV.: alternatív jelölés, automatizáció
Szilárd fázishoz kötött specifikus Ab
Anti idiotípiás p Ab *Jelet adó Ab
Anti-anti idiotípiás Ab vagy
Anti izotípiás Ab
Analit specifikus interakciók : GH Kémia: 191 aminosav (22 Kd) nem glikált, két disulfid híd.
• Jelölési technika: alternatív v. izotóp?
Homologia: PRL, Placentális fehérjék: pl. HPL, GH-V ÆStandardizáció:
-fluoreszcens, kemilumineszcens módszerek jobban ki vannak téve a matrix effektusból adódó interakcióknak
rhGH (IS 88/624; IS 98/574) 22 Kd H Hypophysis h i kivonat: ki t IS 80/505-GH 80/505 GH iizoformok f k keveréke
• Kivitelezés: automata, vagy manuális?
ÆSpecificitás: módszerfüggő antitestek ÆSzenzitivitás: immunkémiai elv (RIA, IRMA)
- az extrakciós módszerek nem kompatibilisek az automatizációval - kinetikus jeljel-detektálás
Ø Hamis eredmény
IGF-1: normál Egészséges önkéntesek Acromegal-remissioban N=213
N=18
Acromegal-aktív N=28
Arafat A. M. et al: Growth Hormone Response during Oral Glucose Tolerance Test: The Impact of Assay Method on the Estimation of Reference Values in Patients with Acromegaly and in Healthy Controls, and the Role of Gender, Age, and Body Mass Index J Clin Endocrinol Metab, April 2008, 93(4):1254–1262
Legalacsonyabb GH szintek az OGTT során, különböző módszerrel mérve
Arafat A. M. et al: Growth Hormone Response during Oral Glucose Tolerance mation of Reference Values in Test: The Impact of Assay Method on the Estim Patients with Acromegaly and in Healthy Controols, and the Role of Gender, Age, and Body Mass Index J Clin Endocrinol Metab b, April 2008, 93(4):1254–1262
GH-szintek az OGT-teszt során három GH módszerrel mérve: mindegyik az IS 98/574 WHO preparátumra standardizált
GH ng/ml
2
Mátrix hatás és antitest specificitás Mátrix hatás
Antitest specificitása a
22 KDa GH detektálhatóság
20KDa GH izoform iránt
Analit specifikus interakciók: IGF-1 Korlátok: Æ Specificitás S ifi itá Æ Transzport protein interakciók – biológiailag aktív frakció mérése? Æ Lelet-értelmezés
22 KDa
20 KDa Várt GH szintek ng/ml
Arafat A. M. et al: Growth Hormone Response during Oral Glucose Tolerance Test: The Impact of Assay Method on the Estimation of Reference Values in Patients with Acromegaly and in Healthy Controls, and the Role of Gender, Age, and Body Mass Index J Clin Endocrinol Metab, April 2008, 93(4):1254–1262
IGF--1 és a kötőfehérjék: BP1 IGF BP1--6
IGF-1: in vivo interakciók DBiokémia: - 70 aminosavból álló egyszálú polipeptid: 7,5 KDa
DHomológia: - proinzulin: 50 % - IGF-2 : 70 % - Insulin: 1% - TSH, LH: 0,05-0,24 %
BP 1-2
BP 4-6
2.) Savas-etanolos extrakció: - ha követi a BP-ék precipitációja, akkor jól használható
3.) IGF-1-et felszabadító disszociációs eljárás: egyéb „szétkapcsoló” reagensek gyártó specifikusak. - túlsúlyban IGF-2-t adnak a mintához, aminek következtében az IGF-1 felszabadul a fehérjekötésből, mert az IGF-2-nek nagyobb az affinitása.
+ BP3 IGF--1 IGF
IGF--1 IGF
β-subunit
IGF--1 IGF
BP3
+ IGF--1 IGF
β-subunit
Ezért is a totál IGF-1 szintek a megbízhatóbbak!
Kompetitív IGF IGF--1 módszer: Szilárd fázishozz kötött antitest
- aranystandard: Sephadex G-75 savas gélfiltráció
IGF--1 IGF
- a szérum proteolitikus enzim aktivitása változik, - pH viszonyok - farmakonok
- 6 izotípus , összes keringő mennyiség >95%-a kötött,
MÓDSZEREK: 1.) Kromatográfiás módszer:
α-subunit
Az összes keringő IGFIGF-1 mennyiségének: < 5% szabad, szintje változik
D Kötőfehérjék:
A totál IGF-1 mérés előtt a kötőfehérjékből az IGF-1-et fel kell szabadítani
α-subunit IGF--1 IGF
BP3
BP3
+
BP3
BP3 BP3
BP3
BP3
BP3 BP3
Jel :
IGF-1 szint:
A mintában lévő összes IGF-1
Jelölt IGF-1
3
Szilárd fázishozz kötött antitest
Telítő (szendvics) IGFIGF-1 módszer: savas hidrolízis után totál - , előkezelés nélkül szabad szintek IGF-1 IGF-1
BP3
Csekélyy veszteség
IGF-1
BP3
IGF-1
Szenzitívebb módszer, pontosabban mér az alacsony tartományban
IGF-1
IGF-1 Referencia tartom mányok (ng/ml)
Eltérő módszerek, eltérő referencia tartományok: hiba a tankönyvi referencia értékek figyelembevétele a módszer ismerete nélkül RIA
CLMA
IRMA
ELISA
Holland tapasztalat: IGF-1 külső kontroll 40 35 30 25 20 15 10 5 0
Immulite 2000
IGF-1 nmol/l
▲ Advantage LMA ▲ RIA+Eigen 8 RIA Biosource + RIA + Overig
0
10
20
30
40
- Hazánkban egy labor sem használ külső kontrollt, mert nem elérhető!
• Tápláltság:
protein, zsír ↑ magas szénhidrát bevitel ↓ pozitív korreláció az IGF-1 és a Ca, Fe, K, Mg, Niacin, P, Zn, Riboflavin (B2 vit.) + thiamin (B1 vit.)
• Malnutrició:
IGF-1 ↓ hGH ↑ Divatos fogyókúrák!
400
• Obesitas: GH ↓ - a pulsatilitás foka csökken, amely inverzül korrelál a
300
zsírtömeggel (BMI). Alkalmazkodási mechanizmus (leptin). A GH- IGF-1 axis megváltozása reverzibilis, ha testsúlycsökkenés van. Totál IGF-1 ↓, szabad IgF-1 ↑
200 100 0
IRMA DSL
Leletértelmezés: IGF-1 szinteket befolyásoló fiziológiás faktorok
600 500
◙ IRMA Overig
Célérték
• Menstruáció, terhesség, ösztrogén: 0- 2
0- 5
6 -8
9 - 11
12 - 14
15 - 17
ösztrogén hatásra ↑ hGH ↑ placenta: somatotropin hatása
Korcsoportok (év)
IGF-1 szinteket befolyásoló afiziológiás faktorok
A prolactin frakciók :hypophysaer forma I.
• Diabetes: I-es típus: rosszul kezelt diabetesben IGF-1 ↓
• 199 aminosav
II-es típus IGF-1 normál: inverz kapcsolat IGF-1– glükóz szintek
• három diszulfid-híd
• Máj: IGF-1 ↓ Se IGF-1 szint már 4 nap alkoholmegvonás után 40 %-al nő. • Krónikus vesebetegség: ellenére,
• a monomer forma : free PRL
az IGF-1 biológiai aktivitása (bioavailability) csökkent, annak
-bioaktivitása a legnagyobb
hogy normál v. emelkedett az IGF-1 –szint.
• Pajzsmirigy és adrenális betegségek: Hypothyreosisban IGF-1 ↓ Hyperthyregsisban norm. v. ↑ Nagy dózisú glucocorticoid: Total IGF-1 ↑ , Biológiailag aktív ↓ Cushing s.: GH ↓ szupprimált, de az IGF-1 nem mindig alacsony
-a keringésben ez a domináns: 85% Prehormon:
proteolysis
23 KDa
26 KDa
S
S
postranslatiós
Glycosilatio (25%), phosphorilatio S
• Súlyos betegségek: immunrendszer aktiváció ⇒ IGF-1 ↓ Férfiaknál kifejezettebb, mint nőknél.
További 14, 16, 22 Kda-os proteolizált formák a keringésben
4
A cirkuláló PRL molekulaformák aránya megváltozik, PRL frakciók %--os aránya
SZINONIMÁK
módszerek eltérő fokban mérik be a bbPRL molekulát Monomer PRL szint: 270 mU/L Roche Elecsys 1.gen
85
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
Analitikai probléma: probléma: a rutinban alkalmazott immunoassay
78
Abbott Imx ABBOTT AxSYM
Ábra a Kempinski előadásból
J & J Amerlite
hyperprolactinaemia
Bayer Immuno-1
20
Wallac DELFIA
10
2
DPC Immulite and 2000 Roche Elecsys 2. gen.
5
J & J Vitros ECI Roche Cobas Core Bayer (Chiron Centaur, ACS:180) Beckman Access Fahie-Wilson Clin. Chem. 2000.
0
PRL mU/L 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Macroprolactinaemia prevalenciája
A bbPRL eliminálásának módszerei:
• Normál populációban - Nők:
¾ Gél diffúziós kromatográfia
~2,00 %
- Férfiak: ~0,02 % (Ichihara 1990 (Japán), Bjoro 1995 (Skandinávia))
• Hyperprolactinaemiában (reproduktív korú nők: 3%, sec. am. 15%)
21-26 % (Fahie-Wilson, Leslie, Bjoro, Smith, Strachan 1995-2003.) 36-46 % (Viera 1998, Hauche 2002)- válogatott minták. • Terhességben: 3- 8 % (Pascoe-Lira, 2001)
¾ Ultrafiltrációs módszer rutinban jól alkalmazható, 100%-os hatásfok, drága
d t
169 PEG kezelt minta PRL lelete három módszerrel mérve
• nem specifikus precipitáció
normal
I g G
S I g G
I g G
H2O
PE G
PE G
S
• nem minden módszerhez használható • csak az Ab-PRL komplexet csapja ki • nem tudjuk pontosan, a monomer PRL szintek referencia értékét
MPRL
tHPRL
100%
25
90%
20 15 10 5
80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10%
0
0% EC LMA-I ECLMA-II
C LMA
N= =71
S
S
S S
Distribution of cases %
S
I g G
S
Fequency of MPRL L (%)
30 S S S
S
N=42
• nem quantitatív
Nincs definiálva a PRL ref. tartománya a bbPRL meghatározása után:
ECMA-I
ECLMA-II
N=55
PEG módszer korlátai : H2O
rutinban jól alkalmazható, megfelelő cut-off mellett 100%-os hatásfok
N=129
k é
¾ Polyethylene glycol (PEG) precipitáció
12 27
b tá k b
rutinban alkalmazható, 90%-os hatásfok
N=153
ké
¾ Protein A precipitációs módszer
15
G
referencia módszer, de nem rutin
CLMA
Nincs meghatározva a PEG kezelt mintákból mért PRL referencia tartománya
5
Miként eliminálhatnánk az analitika korlátait? NEM LEHET, de …..együtt kell élni vele munkában:
team
- tudatosítani kell a klinikusokban az immunanalitikai módszerek korlátait, - klinikai összefüggéseket ismertté kell tenni a labor felé.
Köszönet a megtisztelő figyelemért!
Jelenleg nagyon kevés döntési határérték van megbízhatóan megerősítve! OK: a szakmai irányelvek nem definiálják pontosan az analitikai módszerrel támasztott követelményeiket.
6
