DE OEC Debreceni Klinikai Genomikai Központ
Fehérje és antitest termelési core facility
Keresztessy Zsolt, PhD MBA K+F projektvezető
1. Küldetés • Funkcionális genomika: antitestek/citokinek • Minden nagyobb egyetemen van antitest/citokin/rekombináns protein core facility • Baross Gábor pályázat – pilot projekt • Egyetemünkön sokan rendelkeznek hasonló tudással, de • Szükség van egy koncentrált szolgáltató kapacitásra • Küldetés: technológia és kapacitás kiépítése • Belső igények, nemzetközi piacok • Spin-off vállalkozás
2. Háttér Baross Gábor Program (REG_EA_KFI_09-INNANTet) Innovatív antitest és citokin előállítási technológiák fejlesztése Futamidő: 2010.05.-2012.04.
Támogatás: 78 MFt
Projektvezetés: Prof. Dr. Nagy László, akadémikus, BMBI, igazgató, Genomika Központ Dr. Bálint Bálint László, egyet. adjunkt., BMBI, laborigazgató, Genomika Dr. Zahuczky Gábor, tud.mnkts., BMBI, ügyvezető igazgató, UD-Genomed Kft. Dr. Vámosi György, tud.főmnk., Biofizikai Int. Tanácsadók: Prof. Kurucz István, Prof. Rajnavölgyi Éva, Prof. John Scwabe Executive projektvezető: Dr. Keresztessy Zsolt, tud. mnkts, BMBI, ügyvezető, INDEVION Biotech Kft. Laboratóriumi analítikus: Szabó Ibolya, BSc lab. anal.
Baross Gábor Program (REG_EA_KFI_09-INNANTet) Innovatív antitest és citokin előállítási technológiák fejlesztése •
A projekt célja olyan szerkezeti információkon alapuló antitest tervezési algoritmus kidolgozása, optimalizálása és általa olyan antitest prototípusok előállítása, amelyek natív antigén fehérjék felismerésére képesek, így alkalmazhatóságuk szélesebb körű, hatékonyságuk és megbízhatóságuk pedig sokkal jobb a jelenleg piaci forgalomban lévő készítményekénél. Génexpresszió, kromatin immunoprecipitáció (ChIP), ChIP-seq, ChIP-on-Chip
•
A mai orvos-biológia egyre szélesebb körben használ rekombináns fehérjéket. A fehérje munkák egyik legfontosabb eszköze az antitest. Mára az antitesteket kiterjedten használják a kutatásban, patológiai diagnosztikában, terápiában és a személyre szabott orvoslásban is. Az antitestek mellett a citokinek tekinthetőek az egyik legfontosabb reagens-családnak az immunológiai és az őssejetkutatásban, de terápiás felhasználásuk is kiterjedt.
Biogyógyszer piac 2008 • Global Pharma market: $735 billion • Biopharmaceuticals: $80-100 billion • Recomb. proteins, mAbs: $40-50 billion • Cytokine drugs: $20 billion Current Drug Development Market for Cytokines, Chemokines and Growth Factors, Current Drug Development Market for Cytokines, Chemokines and Growth Factors Drug and Market Development Publishing, Jan 2007
Baross Gábor Program (REG_EA_KFI_09-INNANTet) Innovatív antitest és citokin előállítási technológiák fejlesztése Céljaink: •
A Debreceni Egyetemen egy olyan kutatólaboratóriumi facilitást létrehozni, amelyik képes gyorsan, magas minőségben és a szükséges mennyiségben előállítani a kutatás terén helyi és nemzetközi szinten igényelt antitesteket és citokineket.
•
Olyan új, szerkezetbiológiai információkra épülő epitóp tervezési algoritmust meghonosítani az antitest fejlesztésben, melynek segítségével innovatív módon, nagy affinitású antitestek hozhatók létre.
•
Olyan jelölt citokineket létrehozni, amelyeknek az útja nyomon követhető biológiai rendszerekben, ezáltal egy új altípusát létrehozni ennek a reagens családnak.
Antitest termelési workflow Upstream
Midstream
TARGET SELECTION
EPITOPE DESIGN
PEPTIDE SYNTHESIS
SMRT
Conventiona l
Companies
RXR
Innovative
Peptides
IMMUNISE
HYBRIDOM A
Downstream
TESTING
Myeloma
SDS/PAGE
Spleen
Western blot
PEG fusion
RAR VDR
PPAR
MONOCLO NAL Mouse
Conjugation
AR ACTR
PURIFY
MSA ChIP
Kits
Desalting
ChIP-Seq
Controls
Storage
ChIP-onChip
Control regions
PROFINIA
IHC
Protein A
IP
Dot blot
FERMENTATI ON
TECAN
ELISA
Mouse ascites
Q ionexchange CHT ionexch
Screen1 ELISA
Titers Control lysates
Bleed
Control Abs
AGILENT MS CD
Rabbits
PRODUCTS POLYCLON AL, MONOCLO AL ANTIBODIE S Protocols
Grow/Freeze
POLYCLON AL Rabbit
CHARACT.
CELLCULT URE CHO, HEK
Freeze/Clon e Monoclonal c. Screen2 ELISA
ER
PRODUCE
Serum proteins Peptide affinity
Antitest pipeline TARGET SELECTIO N SMRT
EPITOPE DESIGN
Anti-SMRTc pAb SMRT mAb
PPAR
Anti-PPAR pAb
RXR
RXR mAb
RAR VDR ER AR ACTR
PEPTIDE SYNTHESI S
IMMUNISE
HYBRIDOM A
TESTING
PRODUCE
PURIFY
CHARACT.
PRODUCT S
Anti-SMRT antitest helyzete TARGET SELECTIO N
EPITOPE DESIGN
SMRT
Conventiona l
PEPTIDE SYNTHESI S
Recombinan t
IMMUNISE POLYCLON AL: Rabbit
HYBRIDOM A
PURIFY
CHARACT.
PRODUCT S
PROFINIA
IHC
ANTIBODIE S
Protein A
IP
Protocols
Dot blot
Q ionexchange
MSA
Kits
ELISA
CHT ionexch
ChIP
Controls
Titers
Desalting
ChIP-Seq
Control regions
Control lysates
Storage
ChIP-onChip
TESTING
PRODUCE
SDS/PAGE Bleed
Western blot
Rabbits
Control Abs
AGILENT MS CD
Ready In progress Next step
Serum proteins Peptide affinity
3. Infrastruktúra LOCATION Klinika Telep, Elméleti Tömb, 3. emelet, 315. labor
EQUIPMENT Általános molekuláris biológiai háttér Sejtkultúrás labor Small-scale bakteriális és emlőssejt fermentáció Protein tisztítás BIO-RAD PROFINIA automated protein affinity purification system
Protein karakterizálás SDS/PAGE, Western, ELISA, Multiscreen, biológiai aktivitás …
3. Infrastruktúra
PROFINIA
3. Infrastruktúra
PROFINIA
3. Infrastruktúra STAFF Dr. Keresztessy Zsolt, MSc Biol-Biotech, PhD CelMolBiol, MBA - protein engineering, design, rekombináns DNS tehnológia, protein expresszió, tisztítás, biokémia, szerkezet, folding, karakterizálás
www.zkeresztessy.wordpress.com
Szabó Ibolya, BSc laboratóriumi analítikus, MSc MolBiol hallgató - hibridóma technológia, sejtkultúra
4. Távlati fejlesztések
• Sejtkultúrás fermentációs kapacitás • Hibridóma screening – robotok • Large scale protein tisztítás • Cloning kapacitás • Humán erőforrás fejlesztés
5. Mintaprojekt Futó alprojektek • Anti-SMRT antitest tisztítás és karakterizálás • Epitóp tervezési algoritmus • mAb fejlesztés (2) • Rekombináns protein termelés fejlesztés (2) • Rekombináns IL-4 termelés
Citokin termelési workflow
TARGET SELECTION
IL-4 GM-CSF
CLONING
EXPRESSIO N
Human cDNA Gene Design
E. COLI Rosetta
LIF
Gene synthesis
FLT3LIGAND
Constructs
IL-2 IL-9 IL-15
INSECT Sf9 MAMMALIA N HEK, CHO
TESTING
PRODUCTIO N
PURIFY
CHARACTER .
LABELLING
PRODUCTS
SDS/PAGE
Transfection
PROFINIA
SDS/PAGE
Fluorescent
CYTOKINES
Western Blot
Selection
IMAC
Western blot
Q-Dot
FACS sorting Stable celllines Cell supernat.
Q ionexchange CHT ionexch
LABELLED CYTOKINE S
Biological act.
Desalting
MS
Storage
CD
ELISA Biological act.
FERMENTATI ON
ELISA
Rekombináns humán IL-4 termelési alprojekt
TARGET SELECTION
IL-4
CLONING
EXPRESSIO N
Human cDNA Gene Design
E. COLI Rosetta
Gene synthesis Constructs
INSECT Sf9 MAMMALIA N HEK, CHO
TESTING
PRODUCTIO N
PURIFY
CHARACTER .
LABELLING
PRODUCTS
SDS/PAGE
Transfection
PROFINIA
SDS/PAGE
Fluorescent
CYTOKINES
Western Blot
Selection
IMAC
Western blot
Q-Dot
FACS sorting Stable celllines Cell supernat.
Q ionexchange CHT ionexch
LABELLED CYTOKINE S
Biological act.
Desalting
MS
Storage
CD
ELISA Biological act.
FERMENTATI ON
ELISA
Rekombináns humán IL-4 termelési alprojekt 1. Gene design, optimisation, sythesis
2. Subcloning into expression vector
Rekombináns humán IL-4 termelési alprojekt 3. Production in Rosetta 2…, (HEK293T) slow induction lower temperature extended expression soluble protein.
4. Purification: IMAC, Desalting
5. Testing: SDS/PAGE, Western, ELISA 6. Biological activity TF-I proliferation assay THP-1 cells, STAT6 phosforilation 7. Expression optimisation
8. Large scale production
Rekombináns humán IL-4 termelési alprojekt Purification: IMAC + Desalting
Rekombináns humán IL-4 termelési alprojekt Testing: ELISA
6. Szolgáltatások, Termékek, Kollaboráció Kollaboráció Pályázatok Konzultáció Szolgáltatások Termékek ELÉRHETŐSÉGEK: E-mail:
[email protected] Tel: +36 52 411-717 /54616, 56772 Mobil: +36 30 371 6208
6. Szolgáltatások, Termékek, Kollaboráció 1. ANTITESTEK „from target sequence to antibody service” • epitóp tervezés
6. Szolgáltatások, Termékek, Kollaboráció 1. ANTITESTEK „from target sequence to antibody service” • epitóp tervezés • hibridóma könyvtárak, sejtvonalak • termelés CHO sejtekben • antitest tisztítás (SMRT) • Monoklonális antitestek • Poliklonális szérumok és tisztított antitestek (SMRT)
6. Szolgáltatások, Termékek, Kollaboráció
2. CITOKINEK • citokin tartalmú tápfolyadék (IL-4) • citokintermelő stabil sejtvonalak (IL-4) • tisztított citokinek (IL-4) • jelzett citokinek
6. Szolgáltatások, Termékek, Kollaboráció 3. REKOMBINÁNS FEHÉRJÉK „production to characterisation” • Termelés (bakteriális, rovarsejt, emlőssejt expresszió) • Tisztítás (LC, FPLC, HPLC – affinitás, gélszűrés, ioncserés kromatogr. stb.) • Karakterizálás (SDS/PAGE, WESTERN, ELISA, CE, CD, MS, biológiai aktivitás) Expression vectors:
pET, pTriEX, pGex …
Hosts:
Rosetta 2, Rosetta –Gami B, BL21, DH5α ...
Cell lines:
HEK293, CHO, Sf9 …
Purification/tags:
His-tag, GST, Fc …
Cartridges:
IMAC, GST, SUPrA, UNOsp.Q, CHT I, Desalting …
6. Szolgáltatások, Termékek, Kollaboráció Speciális szolgáltatások, konzultáció 4. PROTEIN ENGINEERING (mutagenesis, IVE, structure-based design) 5. PHAGE DISPLAY TECHNOLOGY (peptide and protein display) 6. HIGH THROUGHPUT SCREENING (Tecan) 7. LARGE SCALE FERMENTATION (2-100 L bakteriális, 2-10 L emlőssejt)
6. Szolgáltatások – Termékek - Kollaboráció Tervezett szolgáltatások - kapacitásnövelés függvényében GENE TO PROTEIN Services „from custom DNA to engineered proteins” 1. Géntervezés és optimalizálás 2. Génszintézis GÉNEXPRESSZIÓ 3. Szubklónozás Paraméter
Optimális
4. Plazmid preparálás Kodon minőség: - adaptált kódonhasználat 5. expresszió optimalizálás GCFehérje tartalom: - kiegyensúlyozott 6. Rekombináns tisztítás, karakterizálás DNS motívumok:fehérje termelés, - szekvencia ismétlődések kizárása Piaci árak - példák - más motívumok kizárása Gene-to-protein: mRNS szerkezet: Recombinant IL-4 (mg):
5000-10000 Euro - másodlagos szerkezet kizárása 35 000 USD
Stable cell lines:
15 000 Euro
6. Szolgáltatások – Termékek - Kollaboráció Tervezett szolgáltatások - kapacitásnövelés függvényében GENE TO PROTEIN Services „from custom DNA to engineered proteins” 1. Géntervezés és optimalizálás 2. Génszintézis 3. Szubklónozás 4. Plazmid preparálás 5. Fehérje expresszió optimalizálás 6. Rekombináns fehérje termelés, tisztítás, karakterizálás Piaci árak - példák Gene-to-protein:
5000-10000 Euro
Recombinant IL-4 (mg):
35 000 USD
Stable cell lines:
15 000 Euro
Futó kollaborációk Funkcionális genomika
Epigenetika
Antitest fejlesztés
Rekombináns fehérje termelés
DE OEC KBMPI
