UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar 2014-2015
Endogeen voorkomen van anabole steroïden bij paarden door Anneleen Michielsen
Promotoren
Prof. Dr. Ir. Lynn Vanhaecke
Onderzoek uitgevoerdin kader
Anneleen Decloedt
van de Masterproef © 2015 Anneleen Michielsen
VRIJWARINGSCLAUSULE
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar 2014-2015
Endogeen voorkomen van anabole steroïden bij paarden door Anneleen Michielsen
Promotoren
Prof. Dr. Ir. Lynn Vanhaecke
Onderzoek uitgevoerd in kader
Anneleen Decloedt
van de Masterproef © 2015 Anneleen Michielsen
Voorwoord Hier wil ik een moment nemen om iedereen te bedanken die op een directe of indirecte wijze heeft meegewerkt aan het tot stand komen van deze masterproef. Anneleen Decloedt, mijn promotor, wens ik in de eerste plaats te bedanken voor haar begeleiding en advies. Dit heeft een duidelijke meerwaarde betekend voor mijn onderzoeksstage. Daarbij gaat ook mijn dank uit naar Lynn Vanhaecke voor haar finale nazicht en advies, zodat ik mijn onderzoek tot een goed einde kon brengen. Daarnaast wil ik ook mijn ouders, Annick Meurant en Paul Michielsen en mijn oma Helena Van Bulck bedanken voor hun hulp, interesse, steun en voor het nalezen van mijn tekst. Bij verschillende problemen stonden ze klaar met hun advies of om te luisteren. In het bijzonder een woord van dank voor paardeneigenaars waar ik urinestalen mocht gaan verzamelen. Dit was zonder hen nooit gelukt. Tot slot wil ik ook Heidy van Duffel, Dominique Rombouts, Aurelia Van Ransbeeck en Amanda Wens bedanken voor hun steun en interesse.
Inhoudstafel
Samenvatting ........................................................................................................................................... 1 Inleiding ................................................................................................................................................... 2 Literatuurstudie ........................................................................................................................................ 4 1. ANDROGENE-ANABOLE STEROIDEN ........................................................................................ 4 1.1. ALGEMEEN .............................................................................................................................. 4 1.2. CHEMISCHE STRUCTUUR EN SYNTHESE VAN STEROÏDHORMONEN ........................... 7 2. DOPING EN WETGEVING .......................................................................................................... 13 2.1. GESCHIEDENIS ANDROGENE-ANABOLE STEROÏDEN .................................................... 13 2.3. DOPINGCONTROLE ............................................................................................................. 17 3.1. BOLDENONE ......................................................................................................................... 18 3.2. NANDROLONE ...................................................................................................................... 21 Materiaal en methoden .......................................................................................................................... 22 1.
STAALNAME ............................................................................................................................. 22
2.
NORMALISATIE VAN DE DENSITEIT...................................................................................... 23
3.
STAALVOORBEREIDING: EXTRACTIE .................................................................................. 23 3.1. HYDROLYSE VAN GLUCURO-EN SULFO-GECONJUGEERDE COMPONENTEN ........... 23 3.2. VASTE FASE EXTRACTIE (SPE).......................................................................................... 24 3.3. WASSEN ................................................................................................................................ 26 3.4. HEROPLOSSEN VAN HET EXTRACT .................................................................................. 26
4.
UHPLC-MS/MS ANALYSE ........................................................................................................ 27
5.
Data analyse .............................................................................................................................. 29
Resultaten.............................................................................................................................................. 30 Discussie ............................................................................................................................................... 35 Besluit .................................................................................................................................................... 40 Bronnen ................................................................................................................................................. 41
Samenvatting De androgene-anabole steroïden (AAS) of anabolica omvatten alle synthetisch afgeleide producten van het hormoon testosteron: het belangrijkste, mannelijke geslachtshormoon. Deze AAS hebben een sterke anabole activiteit waardoor ze het potentieel bezitten om ingezet te worden als doping om prestaties in de sport te verbeteren. Wegens het potentieel om wedstrijdresultaten te vervalsen, alsook de hieraan gekoppelde gezondheidsrisico’s, verbieden de overkoepelende sportorganisaties zoals IFHA en FEI het gebruik van AAS. Om dit te kunnen handhaven is er een sterke behoefte aan gevoelige analysetechnieken. Dankzij de evolutie van deze technieken kunnen er reeds lage concentraties opgespoord worden (tot 0,2 ng/mL urine). Deze zeer lage concentraties kunnen echter ook endogeen geproduceerd worden. Binnen deze studie werd het voorkomen van endogene AAS in een populatie van 80 onbehandelde paarden onderzocht. De meeste paarden in de studie waren actief in de wedstrijdsport. De urinestalen werden geëxtraheerd en geanalyseerd volgens een vooraf gevalideerde methode voor de detectie van AED, ADD, α-boldenone, β-boldenone, testosteron en progesteron met een triple quadrupole massapectrometer.
De resultaten werden vervolgens
genormaliseerd voor de densiteit, op basis van de specifieke dichtheid bepaald van elk urinestaal. Bij ruinen en merries bleek de individuele variatie groter dan initieel aangenomen. Naast een hogere βtestosteronconcentratie bij hengsten dan bij merries of ruinen, werd ook de aanwezigheid van βboldenone bevestigd bij hengsten. Bij enkele merries of ruinen werden uitzonderingen opgemerkt zoals de aanwezigheid van ADD of AED. ADD werd in deze studie bij 1 merrie waargenomen. AED kwam echter in meer gevallen voor bij ruinen (4) en merries (3). In enkele gevallen werd ook βboldenone waargenomen bij ruinen (3) en merries (2). De aanwezige concentratie aan progesteron in de onderzochte populatie was laag bij alle paarden.
Sleutelwoorden: Anabolica, steroïden, urine, paard, doping
1
Inleiding Om een eerlijke competitie en het welzijn van de deelnemende dieren te garanderen, worden er bij sportpaarden geregeld onaangekondigde dopingcontroles uitgevoerd (Toutain, 2010; Decloedt et al., 2015; Wong en Wan, 2014). De screening naar verboden producten gebeurt aan de hand van urine, bloed of haar (Houghton en Maynard, 2010; Müller, 2010; Strano-Rossi et al., 2013; Decloedt et al., 2015). De lijst met verboden producten voor wedstrijdpaarden wordt opgesteld door regulerende organisaties zoals de International Federation of Horseracing Authorities (IFHA) voor renpaarden en de Fédération Equestre Internationale (FEI) voor de Olympische disciplines (Toutain, 2010). Deze lijst met verboden producten is zeer uitgebreid en omvat zowel β2-agonisten, verdovende middelen, tranquillizers, lokale anesthetica, stimulerende middelen als anabole-androgene steroïden (AAS) (Decloedt et al., 2015; FEI 3, 2015). Rond AAS werd reeds veel wetenschappelijk onderzoek verricht aangezien deze bij racepaarden regelmatig misbruikt worden en omwille van hun rol bij de voortplanting van het paard (Decloedt et al., 2015). Testosteron, het voornaamste mannelijke geslachtshormoon, is het best gekende hormoon binnen de AAS (Evans, 2004). Met de ontrafeling van de chemische structuur van testosteron werd de synthese van afgeleiden mogelijk. Deze derivaten worden de (synthetische) anabole-androgene steroïden (AAS) of anabolica genoemd (Leme de Souza en Hallak, 2011). Deze derivaten beschikken over een meer uitgesproken anabole werking, waardoor deze in de sportwereld illegaal worden ingezet om de prestaties van zowel humane atleten als dieren te verbeteren. De toename van de spiermassa is kenmerkend voor anabolica (Hartgens en Kuipers, 2004; Maravelias et al., 2005; Parr et al., 2010). Andere AAS die nauw verwant zijn aan testosteron qua structuur, zijn β-boldenone (afkorting), androst-1,4diene-3,17dione (ADD) en androst-4-ene-3,17-dione (AED). AED is een intermediair product in de endogene synthese van testosteron, de andere stoffen zijn verkrijgbaar als anabole preparaten op de illegale markt (Decloedt et al., 2015). Aan het gebruik van anabolica kunnen nadelen verbonden zijn onder de vorm van mogelijke gezondheidsrisico’s (Bahrke en Yesalis, 2004; Maravelias et al., 2005). Deze gevaren, gecombineerd met de mogelijkheden voor het vervalsen van prestaties in de sport, hebben geleid tot een ban van de anabolica in de sportwereld. De twee voornaamste regulatorische organen in de paardensport, FEI en IFHA, houden zich bezig met het uitstippelen van het beleid inzake doping en de controleprogramma’s voor de detectie van verboden middelen (Toutain, 2010). Door de routinematige controles die op wedstrijden worden uitgevoerd, is er een noodzaak aan de ontwikkeling van technieken om het gebruik van verboden middelen zoals anabolica op te sporen (Schänzer W.,1996; Müller, 2010). De technieken evolueren over de tijd, waardoor substanties en hun metabolieten die eerder niet gedetecteerd konden worden, nu wel kunnen ontdekt worden dankzij de toegenomen gevoeligheid van de beschikbare testen (Houghton en Maynard, 2010).
2
Anabolica zoals testosteron en boldenone, die via de controle kunnen worden aangetoond, zouden echter ook een endogene oorsprong kunnen kennen vanwege de lage concentraties die waargenomen kunnen worden (Houghton en Maynard, 2010). Ze kunnen ontstaan door vorming vanuit andere endogeen geproduceerde steroïden zoals de vorming van boldenone uit testosteron bij hengsten (Houghton en Maynard, 2014). Daarnaast kunnen endogene anabolica mogelijks ook gevormd worden uit fystosterolen afkomstig uit de voeding. Door de verhoogde gevoeligheid van de nieuwe generatie technieken is het mogelijk om zeer lage concentraties te detecteren (Gray et al., 2013; Houghton en Maynard, 2014). De verbeterde technieken leiden echter mogelijks ook tot vals-positieve resultaten, doordat er eveneens endogene geproduceerde stoffen worden gedetecteerd. De vraag rijst dan of er, met de huidige gevoelige analysemethoden, mogelijk drempelwaarden ontwikkeld moeten worden in plaats van de eerder gehanteerde nultolerantie. Tot op heden konden anabolica, zoals boldenone, onder natuurlijke omstandigheden enkel bij hengsten worden teruggevonden. Voor merries en ruinen geldt echter nog steeds de nultolerantie voor boldenone en voor testosteron werd er bij merries (55 ng/ml) en ruinen (20 ng/ml) wel een drempelwaarde bepaald (Popot et al., 2008). In deze studie werd onderzoek verricht naar het endogeen voorkomen van verschillende AAS bij een populatie van 80 onbehandelde paarden van zowel hengsten, merries als ruinen. Deze stalen werden afgenomen bij zowel paarden die in de sport actief zijn (dressuur, jumping of drafrennen), alsook dekhengsten en recreatiepaarden. Door een grote variatie aan types van paarden, kan een inschatting gemaakt worden van de werkelijke endogene productie aan AAS.
3
Literatuurstudie 1. ANDROGENE-ANABOLE STEROIDEN 1.1. ALGEMEEN 1.1.1 Definitie
Androgene-anabole steroïden (AAS) (kortweg anabolica genoemd) omvatten alle synthetische, afgeleiden van het mannelijke hormoon testosteron (Brower K.J., 2002; Bahrke en Yesalis, 2004; Evans, N.E., 2004) (Figuur 1). AAS werden ontwikkeld om een maximale anabole activiteit te bekomen, met minimale androgene activiteit (Evans, N.E., 2004; Barnard et al., 2010). Onder anabolische activiteit vallen de hypertrofische processen ter hoogte van de spieren, waarbij de verhoogde stikstofretentie, eiwitsynthese en het gebruik van energie voor synthese in plaats van vetopslag de belangrijkste kenmerken zijn (Hartgens en Kuipers, 2004; Maravelias et al., 2005; Parr et al., 2010). De androgene activiteit uit zich in het ontwikkelen en behouden van de mannelijke primaire en secundaire geslachtskenmerken zoals de ontwikkeling van de mannelijke geslachtsorganen en mannelijk gedrag (Brower K.J., 2002; Hartgens en Kuipers, 2004; Parr et al., 2010). Bij vrouwelijke individuen, zowel mens als dier, kan eveneens testosteron teruggevonden worden, weliswaar aan lagere concentraties dan bij mannelijke dieren (Schänzer W.,1996). Waar bij mannelijke dieren de productie van testosteron plaatsvindt in de testes, ter hoogte van de Leydig cellen en in kleine hoeveelheden in de bijnier (Schänzer W., 1996; Parr et al., 2010), zal bij het vrouwelijke individu testosteron geproduceerd worden in het ovarium, de bijnier (Schänzer W., 1996; Parr et al., 2010) en in de placenta (Parr et al., 2010). De rol van testosteron varieert afhankelijk van het levensstadium waarin een individu zich bevindt, maar blijft gedurende het ganse leven aanwezig. Tijdens de embryonale fase zal testosteron belangrijk zijn voor de ontwikkeling van het mannelijke fenotype (Evans, N.E., 2004). In de puberteit is dit hormoon dan weer verantwoordelijk voor de ontwikkeling van secundaire mannelijke geslachtskenmerken (groei van de penis, ontwikkeling van de skeletspieren en de geslachtsdrift en de spermatogenese) (Dence J.B., 1980; Evans, N.E., 2004). Bij volwassen individuen is testosteron verantwoordelijk voor de regulatie van verschillende fysiologische processen zoals erythropoëse, spiereiwitmetabolisme, beenmetabolisme, seksuele en cognitieve functies (Evans, N.E., 2004).
Figuur 1. De chemische structuur van testosteron. Verandering aan de A-ring veranderen de anabole of androgene eigenschappen (Van Rossum J.M., 1988).
4
1.1.2 Werkingsmechanisme AAS
Globaal gezien heeft elke cel receptoren voor AAS (Bahrke en Yesalis 2004). De binding van AAS op de receptoren is afhankelijk van het type cel en de precieze locatie van de cel in het lichaam (Bakrke en Yesalis, 2004; Maravalias et al., 2005; Duntas en Popvic, 2013). De gevoeligheid van de binding of de interactie met enzymen zijn bepalend zijn voor het effect (Hartgens en Kuipers, 2004; Maravalias et al., 2005). Het steroïde zelf bepaalt dus niet het effect (Bahrke en Yesalis, 2004). Zoals eerder aangegeven kan het effect van AAS onderverdeeld worden in een anabool en een androgeen effect (Brower K.J., 2002; Evans N.E., 2004; Parr et al., 2010). Het algemene werkingsmechanisme van AAS dat momenteel aanvaard wordt, wordt weergegeven in figuur 2 (Hartgens en Kuipers, 2004). Wanneer het hormoon diffundeert in de doelcel zijn er twee mogelijke reactiepaden die de steroïden kunnen volgen. Welk reactiepad gevolgd zal worden, is afhankelijk van de aanwezige enzymen (Bahrke en Yesalis, 2004; Hartgens en Kuipers, 2004). Organen zoals de geslachtsklieren, de huid, de longen, de prostaat, de hersenen en bot- en vetweefsel, die een hoge activiteit aan het enzym 5α-reductase hebben, zullen voornamelijk de androgene effecten van de AAS tot uiting brengen. In organen waar dit enzym een lagere activiteit bezit, de hart- en skeletspieren, zullen eerder de anabole effecten van AAS tot uiting komen (Bhasin et al., 2001; Hartgens en Kuipers, 2004).
Figuur 2. Algemeen werkingsmechanisme AAS in de lichaamscel. T = testosteron, DHT = dihydrotestosteron, E= 17-βoestradiol, rec = receptor, DHT-rec= dihydrotestosteronreceptorcomplex, T-rec= testosteronreceptorcomplex, E-rec = oestradiolreceptorcomplex (Naar Hartgens en Kuipers, 2004).
Het 5α-reductase-enzym speelt een belangrijke rol gezien het testosteron (T) omzet naar zijn meer actieve vorm dihydrotestosteron (DHT) (Bhasin et al., 2001; Hartgens en Kuipers, 2004; de Ronde, 2008; Sjöqvist et al., 2008; Duntas en Popovic, 2013). Deze omzetting gebeurt vlak na diffusie in de cel en net voor de binding aan de specifieke receptor in de cel.
5
De binding aan de receptor vindt plaats in het cytoplasma zodat er een specifiek steroidereceptor complex gevormd wordt (Hartgens en Kuipers, 2004; Sjöqvist et al., 2008). Dit complex zal in de celkern de transcriptie van specifieke genen regelen, waardoor de mRNA- en bijgevolg ook de proteïnesynthese beïnvloed zal worden (Bahrke en Yesalis, 2004; Evans N.E., 2004, Hartgens en Kuipers, 2004; Maravelias et al., 2005; Duntas en Popovic, 2013). In skeletspieren zal dit complex de transcriptie van genen moduleren die verantwoordelijk zijn voor de groei van spieren. Daarnaast toonde de studie van Evans (2004) ook aan dat het aantal receptoren kan toenemen bij een verhoogde blootstelling aan AAS. Naast het 5α-reductase-enzym bevindt
ook
het aromatase-enzym zich voornamelijk in de cellen van het vetweefsel en sommige cellen van het centraal zenuwstelsel, Leydig en Sertoli cellen (Bahrke en Yesalis, 2004; Hartgens en Kuipers, 2004; Duntas en Popovic, 2013). Dit enzym is verantwoordelijk voor de omzetting van AAS naar 17-βoestradiol(E).
Dit
vrouwelijke
hormoon
bindt
op
de
receptor
en
vormt
dan
het
oestrogeenreceptorcomplex (E-Rec). De effecten van deze laatste complexen komen voornamelijk tot uiting in het vetweefsel (Hartgens en Kuipers, 2004).
1.1.3 Invloed AAS op fysiologische processen
Het anabole effect van de AAS zal voornamelijk aangrijpen op de skeletspieren (Evans N.E., 2004; Hartgens en Kuipers, 2004; Ros et al., 2007; Duntas en Popovic, 2013). Het artikel van Evans N.E. (2004) geeft aan dat het anabole effect van testosteron op de skeletspieren bij mensen dosisgebonden is, er treedt een dosisafhankelijke hypertrofie of vergroting van de spiervezels op, zonder toename van het aantal cellen van de type I- en type II-vezels. Echter, bij een latere studie van Hartgens en Kuipers bij mensen (2004), wordt er voornamelijk een effect op type II-vezels waargenomen. De studie bij paarden van Hyyppä et al. (1995), waarbij Finse dravers behandeld werden met nandrolone, geeft aan dat er een toename was van het type IIa-vezels, de snelle oxidatieve spiervezels. Er kon echter geen verbetering gevonden worden van de prestaties ten opzichte van de controlegroep. Deze studie geeft naast de toename in type IIa-vezels eveneens een verhoging van het aantal rode bloedcellen weer, want de paarden hadden een verhoogde erythropoëse. Dit effect ontstond door de verhoogde afgifte van erythropoëtine (EPO) in de nier en een verhoogde gevoeligheid voor EPO. Door het verhoogde aantal rode bloedcellen is er een verhoogde capaciteit om zuurstof te transporteren, wat alsnog een invloed kan hebben op de prestaties (Hyyppä et al., 1995). Een andere studie van Hyppä uit 2001 bij paarden toonde aan dat er, naast de toename van het aantal type IIa-vezels, ook een toename was van de diameter van de type I-vezels. Deze studie rapporteerde eveneens dat er een toename van het aantal rode bloedcellen plaatsvond, maar maakte wel
de
bedenking
dat
de
toename
van
het
aantal
rode
bloedcellen
en
dus
de
zuurstoftransportcapaciteit, pas optrad na een langdurige behandeling met een hoge dosis AAS.
6
Tot slot is er niet enkel een anabole invloed op het spierweefsel meetbaar, ook collageen en bot zijn weefsels waarop de anabole activiteit van AAS wordt uitgeoefend. In de zachte weefsels wordt de synthese van collageen gestimuleerd. Deze stimulatie is evenredig met de toegediende dosis. In het botweefsel zal de testosterontoediening werken via een direct onderdrukkend effect van de osteoclasten, waardoor de densiteit van het bot verhoogt (Evans N.E., 2004). 1.1.3.1 Neveneffecten
Bij de mens werden reeds verschillende neveneffecten beschreven ten gevolge van het gebruik van anabolica. Ernstige cardiovasculaire nevenwerkingen zoals thrombose, aritmie, linker ventriculaire hypertrofie en acuut hartfalen kunnen optreden (Evans, 2004, Hartgens en Kuipers, 2004; Maravelias et al., 2005; Ros et al., 2007; Strano-Rossi et al., 2013). Naast de hartgerelateerde aandoeningen kunnen er ook gedragsproblemen zoals agressie, depressie en psychose voorkomen (Bahrke en Yesalis, 2004; Evans, 2004; Hartgens en Kuipers, 2004; Maravelias et al., 2005; Duntas en Popovic, 2013). Huidproblemen zoals acne, striae, alopecie en hirsutisme zijn eveneens vaak terugkomende neveneffecten van anabolicagebruik (Evans, 2004; Hartgens en Kuipers, 2004; Maravelias et al., 2005). Daarnaast werd er een effect op het endocriene en reproductieve systeem vastgesteld. Door de geïnduceerde negatieve feedback op de hypothalamus-hypofyse-gonaden as treedt een daling van het luteïniserend hormoon (LH) en follikelstimulerend hormoon (FSH) op. Uiteindelijk zal dit leiden tot een verminderde endogene testosteronproductie (Bahrke en Yesalis, 2004; Evans, 2004; Maravelias et al., 2005; Kicman, 2010; Fitch, 2012; Duntas en Popovic, 2013). Het effect hiervan zal zich uiten in hypogonadisme, steriliteit, verminderde spermatogenese, verminderde spermamotiliteit, abnormale morfologie van het sperma en mogelijk zelfs infertiliteit (Bahrke en Yesalis, 2004; Evans, 2004; Kicman, 2010). Bij paarden werden ook gedragsproblemen zoals agressie vastgesteld (Hyppä, 2001). Problemen van een andere orde die men bij paarden kan waarnemen, zijn de problemen op endocrinologisch niveau met testikelatrofie en verminderde spermakwaliteit (Squires et al., 1982; Soma et al., 2007).
1.2 CHEMISCHE STRUCTUUR EN SYNTHESE VAN STEROÏDHORMONEN 1.2.1 Klassificatie van de verschillende steroïden Structureel kunnen de steroïdhormonen onderverdeeld worden in twee grote groepen. De eerste grote groep bevat zowel de vrouwelijke geslachtshormonen als de mannelijke geslachtshormonen, met onder andere progesteron en oestrogenen enerzijds en testosteron en androstenedion (AED) anderzijds (Figuur 3) (Montgomery R. et al., 1980). De tweede grote groep bestaat uit de corticosteroïden waartoe onder meer cortisol, aldosteron en corticosteron behoren (Figuur 4).
7
Figuur 3.Mannelijke en vrouwelijke geslachtshormonen (Naar Montgomery et al., 1980).
Figuur 4. Mineralo- en glucocorticoiden (Naar Montgomery et al., 1980).
De basis van alle steroïdhormonen is de perhydrocyclopentanofenantreenstructuur, die enkel uit koolstof- en waterstofatomen bestaat (Dens J.B., 1980; Montgomery R. et al., 1980; Schänzer W., 1996). De ringen A, B en C zijn cyclohexaanringen en ring D is de cyclopentaanring (Figuur 5) (Dens J.B., 1980).
Figuur 5. Eenvoudige basisstructuur van de steroïden, perhydrocyclopentanofenantreenring. De zes stereocentra worden aangegeven met * (Uit Tantuco et al., 2000).
8
Op basis van de zijketens en functionele groepen verbonden aan de basisstructuur, kan nog een andere (op de structuur gebaseerde) indeling van de steroïdhormonen gemaakt worden. De eerste groep (oestrogenen en androgenen) onderscheidt zich van de andere steroïdhormonen, doordat deze geen koolstofatoom hebben op C17 van de D-ring. In deze groep kunnen we de oestrogenen van de androgenen onderscheiden doordat oestrogenen enerzijds een fenolische A-ring hebben en anderzijds de hydroxylgroep op C-3 van de A-ring behouden. Dit staat in contrast met de tweede groep van steroïdhormonen, die in de A groep enkel een dubbele binding hebben tussen C-4 en C-5 en daarnaast ook een ketogroep gebonden hebben op C-3 ( Montgomery et al., 1980) (Figuur 6).
Figuur 6. Indeling van de steroïdhormonen in groepen. De indeling gebeurt op basis van de zijketens en functionele groepen die verschillend zijn voor de verschillende hormonen (Naar Montgomery et al., 1980).
1.2.2 Synthese van de steroïdhormonen
Cholesterol is het meest voorkomende sterol in het lichaam van mensen en dieren. Naast zijn aanwezigheid als structurele component van celmembranen, worden er vanuit cholesterol galzuren en steroïdhormonen geproduceerd (Montgomery R. et al., 1980; Parr et al., 2010). Cholesterol (Figuur 7) kan enerzijds opgenomen worden uit de voeding en zo rechtstreeks gebruikt worden door het lichaam. Anderzijds kan cholesterol ook gesynthetiseerd en opgeslagen worden als estervorm om later gebruikt te worden (Dence, 1980; Montgomery et al., 1980; Kicman, 2010). De synthese van cholesterol in de weefsels gebeurt vanuit acetyl-CoA dat aangevoerd wordt vanuit aminozuren, vetzuren en koolhydraten (Montgomery et al., 1980; Kicman, 2010).
9
Figuur 7. Structuur cholesterol (Uit Carnegie Mellon, 2006).
De lever is de grootste producent van cholesterol, maar ook de darmen leveren een groot aandeel. Cholesterol dat gebruikt wordt voor de synthese van steroïdhormonen, kan lokaal bijkomend geproduceerd worden in de cortex van de bijnier, de ovaria en de testes (Montgomery et al., 1980). De synthese van cholesterol wordt in drie grote fasen onderverdeeld. In de eerste fase zal acetly-CoA omgezet worden naar een intermediair dat bestaat uit 6 C-atomen en het 3-hydroxy-3 methylglutarylCoA (HMG-CoA). In de tweede fase zal het gevormde HMG-CoA omgezet worden naar squaleen, een acyclische molecule met 30 C-atomen. Als laatste en derde fase zal squaleen omgezet worden naar het cyclische cholesterol, wat uit 27 C-atomen bestaat (Dence, 1980; Montgomery et al., 1980). Voor deze verschillende reacties zijn verschillende enzymen nodig die gevormd worden in het endoplasmatisch reticulum van de cel. Om cholesterol te vormen zijn er naast enzymen ook andere substraten nodig. De substraten die de energie voor de reactie voorzien om een molecule cholesterol te vormen zijn 18 mol acetyl-CoA, 36 mol ATP en 16 mol NADPH (Montgomery et al., 1980). Cholesterol zal voornamelijk omgezet worden naar galzuren. Slechts een klein deel van de gesynthetiseerde cholesterol zal omgezet worden naar steroïdhormonen, maar de kleine fractie waaruit de steroïdhormonen gevormd worden, is wel van groot belang voor de fysiologie van het lichaam (Montgomery et al., 1980). De vorming van steroïdhormonen start wanneer cholesterol wordt vrijgegeven uit de hydroxylatiereactie en cholesterol initieel omgevormd wordt naar pregnolon en progesteron. Vanuit deze twee precursoren zullen de andere steroïdhormonen gevormd worden (Dence, 1980; Montgomery et al., 1980; Parr et al., 2010; Baker et al., 2014) (Figuur 8). De enzymen die het proces van cholesterol naar het steroïdhormoon katalyseren, zijn van fundamenteel belang in de regulatie (Baker et al., 2014). De omzetting van cholesterol naar pregnolon wordt gekatalyseerd door het enzym desmolase. In deze reactie wordt een fragment afgeknipt ter hoogte van C20. Vanuit pregnolon vormt zich dan progesteron door migratie van de dubbele binding van ring B (positie 5,6) naar ring A op positie 4,5. Daarnaast wordt de hydroxylgroep op C3 omgevormd naar een ketogroep (Dence, 1980; Montgomery et al., 1980; Baker et al., 2014) (Figuur 8).
10
cholesterol
pregnolon
progesteron
17-α-OH-progesteron
Androstenon
testosteron
17-β-oestradiol
Figuur 8. De omzetting van cholesterol naar AAS (Naar Montgomery et al., 1980).
Progesteron kan vervolgens ter hoogte van C17 gehydroxyleerd worden met de vorming van 17αhydroxyprogesteron. Van hieruit zijn er ook verschillende reactiepaden mogelijk. Ten eerste kan de groep op C17 verwijderd worden wat de vorming van androsteron geeft. Vervolgens kan dit hormoon omgezet worden tot testosteron door de reductie van de ketogroep op C17 naar een hydroxylgroep (Dence, 1980; Montgomery et al., 1980; Kicman, 2010; Baker et al., 2014). Testosteron kan op zijn beurt verder omgezet worden naar 17-β-oestradiol, wat het belangrijkste hormoon van de oestrogenen is (Dence, 1980; Montgomery et al., 1980; Baker et al., 2014). 17-β-Oestradiol speelt een belangrijke functie bij vruchtbaarheid en voortplanting, maar speelt daarnaast ook een belangrijk rol bij het botmetabolisme (NVKC, 2010). Bij deze omzetting wordt de Aring geoxideerd tot een fenolring, waarbij de ketogroep wordt omgezet tot een hydroxylgroep (Dence, 1980; Montgomery et al., 1980; Baker et al., 2014).
11
Een tweede mogelijke reactie is de vorming van cortisol vanuit 17α-hydroxyprogesteron. Hierbij zal 17α-hydroxyprogesteron gehydroxyleerd worden op de positie C21 en C11 (Dence, 1980; Montgomery et al., 1980; Baker et al., 2014). Ten derde kan een geheel ander reactiepad gevolgd worden vanuit progesteron: namelijk de vorming van aldosteron (een mineraloglucocorticoïd), die een belangrijke rol speelt bij het regelen van de bloeddruk (Figuur 4).
1.3.2.
Biotransformatie en excretie van steroïdhormonen
De metabolisatie van steroïdhormonen naar hun excretieproducten vindt plaats in de lever (Montgomery et al., 1980). De biotransformatie van steroïdhormonen kunnen we onderverdelen in twee fasen. In de eerste fase wordt het hormoon enzymatisch getransformeerd naar polaire stoffen om zo de substantie te inactiveren en om te zetten naar substanties die het lichaam makkelijker kunnen verlaten. In deze fase treedt oxidatie, hydrolyse of reductie op en de geproduceerde metabolieten worden aangeduid als fase I-metabolieten (Schänzer, 1996; Buiarelli et al., 2005). In de tweede fase (de conjugatiefase) conjugeert de componenten of fase I metabolieten met stoffen zoals glucuronaat of sulfaat om zo oplosbare geconjugeerde producten te vormen die het lichaam kunnen verlaten via urine of feces, de zogenaamde fase II metabolieten (Schänzer, 1996; Buiarelli et al., 2005). Deze reacties worden enzymatisch gecontroleerd (Schänzer, 1996). Bij dopingcontroles kan gezocht worden naar deze geconjugeerde excretieproducten (Buiarelli et al., 2005). Niet alle AAS conjugeren. In urine kunnen zowel vrije als geconjugeerde excretieproducten onderscheiden worden (Schänzer, 1996). De regelgeving verwijst meestal naar de gedetecteerde som van vrije en geconjugeerde steroïden bij het opleggen van grenswaarden.
12
2. DOPING EN WETGEVING 2.1.GESCHIEDENIS ANDROGENE-ANABOLE STEROÏDEN
Androgene-anabole steroïden worden vaak geassocieerd met dopinggebruik in de sportwereld, maar kennen ook een aantal therapeutische toepassingen (Clark & Henderson, 2003; Evans, 2004; Barnard et al., 2010; Parr et al., 2010; Strano-Rossi et al., 2013). De therapeutische toepassing waarvoor anabolica oorspronkelijk werden ingezet, waren aandoeningen waarbij de patiënt gewicht verloor. Het oorspronkelijke doel van anabolica was immers een verhoogde proteïnesynthese te weeg brengen (Evans, 2004; Barnard et al., 2010; Parr et al., 2010). Deze toepassingen werden echter onvoldoende wetenschappelijk ondersteund, waardoor vele producten niet meer toegestaan zijn voor dergelijk gebruik (Barnard et al., 2010). Naast het therapeutische gebruik werden anabolica ook illegaal gebruikt. In de sportwereld vonden ze hun intrede onder de vorm van doping (Schänzer W., 1996; Toutain P.L., 2010; Strano-Rossi et al., 2013). Het woord doping wordt voor het eerst vernoemd in 1889 in een Engels woordenboek, maar ook daarvoor waren er al pogingen om de sportprestaties te beïnvloeden. Testosteron werd één van de hoofdspelers van de AAS in het dopinggebruik (Müller, 2010). Testosteron werd pas voor het eerst geïsoleerd uit de testes van stieren in 1935 door David et al. De chemische synthese van testosteron uit cholesterol werd datzelfde jaar onafhankelijk van elkaar ontdekt door Butenandt & Hanish en Ruzicka & Wettstein (Schänzer, 1996; Müller, 2010). De identificatie van testosteron gebeurde pas later. Deze opheldering maakte het mogelijk om vanaf dan synthetische producten te ontwikkelen door structurele veranderingen in de ontdekte molecule aan te brengen via verestering en alkylering. Hierdoor ontstaat de mogelijkheid om producten met een hoger potentieel anabool effect dan de natuurlijke producten te ontwikkelen (Schänzer, 1996; Evans, 2004). Ruzicka et al. waren in 1935 voor het eerst in staat het synthetische testosteron te reproduceren (Schänzer, 1996; Müller, 2010). In de jaren ’60 wordt het misbruik van anabole-androgene steroïden bij atleten om hun fysieke prestaties te verbeteren bekend. Het gebruik van medicatie om prestaties te verbeteren was al langer bekend, maar door de introductie van AAS steeg het misbruik exponentieel (Sjövist et al., 2008). Dit leidde in 1974 tot een uitsluiting van alle AAS door het Internationaal Olympisch Comité (IOC). Een maatregel die later ook door nationale en internationale sportfederaties werd overgenomen (Schänzer W., 1996; Ayotte, 2010; Müller, 2010; Fitch, 2012). In 1984 werd testosteron ook verbannen door het IOC en alle andere sportfederaties (Schänzer W., 1996; Ayotte, 2010; Müller, 2010). De ontwikkeling van gevoelige testen om AAS op te sporen werd noodzakelijk (Schänzer W., 1996; Müller, 2010).
13
2.2. DOPING EN REGELS Niet alleen mensen worden aanzien als atleten, maar ook dieren. Paarden worden op regelmatige basis voor sportdoeleinden ingezet (dressuur, jumping, eventing, polo en rensport), maar ook honden (rennen, sledesport, jagen) (Houghton en Maynard, 2010; Toutain P.L., 2010) en kamelen (rensport) zijn dieren waarmee veel gewerkt wordt in de sport (Toutain P.L., 2010). Sportpaarden moeten voldoen aan hoge fysieke eisen en een competitieve instelling hebben om zich te kunnen meten met anderen. Via speciale fok- en trainingsprogramma’s worden dieren met deze eigenschappen geselecteerd en verder gestimuleerd door training. Met behulp van medicatie kan er getracht worden om deze eigenschappen te beïnvloeden (Toutain P.L., 2010). De uitdaging van dopingcontrole bij dieren is groter dan bij humane atleten (Toutain P.L., 2010; Wong en Wan, 2014). Humane atleten zullen hun toevlucht tot doping zoeken om hun prestaties te verbeteren, terwijl er bij dieren soms ook doping wordt gebruikt om net de prestaties te verminderen om zo de resultaten van het dier negatief te beïnvloeden. De doping kan toegediend worden door de eigenaar of trainer van het dier om de uitslag van een wedstrijd te vervalsen (Houghton en Maynard, 2010; Toutain, 2010; Wong en Wan, 2014). Naast de beïnvloeding van de prestaties op een positieve of negatieve manier, kan echter ook accidentele doping plaatsvinden (Ungemach, 1985). Accidentele doping kan optreden door fouten bij het toedienen van medicatie. Er kan immers overdracht van medicatie optreden via de voederemmer of door excretieproducten van een behandeld paard dat op dezelfde weide staat als het paard dat op wedstrijd gaat (Ven, 2015). Los van het misbruik van verboden middelen dient men ook rekening te houden met gebruik van medicatie voor therapeutische doeleinden. Dit laatste houdt diergeneeskundige medicatie in, maar ook ‘off label use’ van humane medicatie bij dieren. Deze producten kunnen ook ingezet worden om de prestaties van de dieren te beïnvloeden, waardoor eveneens screening voor deze producten noodzakelijk is (Wong en Wan, 2014). Bij dieren is er natuurlijk de moeilijke balans tussen behandeling met medicatie wanneer het noodzakelijk is voor het welzijn van het dier en het behoud van de integriteit van de sport (Houghton en Maynard, 2010; Wong en Wan, 2014). Vooral wanneer er gegokt wordt in een sport, zoals bijvoorbeeld bij racepaarden, is het belangrijk dat het beeld en de geloofwaardigheid van de sport niet in het gedrang komen (Houghton en Maynard, 2010; Toutain P.L., 2010; Wong en Wan, 2014). Het primaire doel van de instanties die waken over het gebruik van doping in de paardensport (FEI en IFHA) is het manipuleren van de prestaties van paarden te verhinderen (Toutain P.L., 2010). Daarnaast willen ze de dieren beschermen en waken over hun welzijn (Ungemach, 1985; Toutain P.L., 2010). De IFHA wenst dat de paarden die deelnemen aan wedstrijden moeten kunnen presteren zonder de invloed van enige medicatie (Houghton en Maynard, 2010) en verbiedt net als de FEI naast de verboden substanties en zijn verwanten ook stoffen die de aanwezigheid van verboden substanties kunnen maskeren. Door dit verbod ontstond het anti-doping programma (Kioussi et al., 2013).
14
De standaarden waaraan het anti-doping programma moet voldoen zijn ethiek en eerlijkheid om ervoor te zorgen dat de competities eerlijk verlopen. Daarbij komt bovendien dat dieren beschermd moeten worden (Toutain P.L., 2010). De FEI (2015) vervolledigt zijn prgramma met waarden zoals gezondheid, karakter en opleiding, het plezier en de vreugde van de sport, de uitmuntendheid in de sport, toewijding aan de sport, respect voor de regels, respect voor zichzelf en voor andere sporters, moed en solidariteit. De FEI stelt dat doping rechtstreeks tegen de essentie van de sport in gaat. Wat onder doping valt, werd door de FEI opgelijst en gereglementeerd (FEI, 2015). De FEI deelt de lijst van verboden stoffen op in twee groepen: enerzijds de verboden producten die niet gebruikt mogen worden bij paarden in competitie en dus onder geen enkele omstandigheid teruggevonden mogen worden in het lichaam en anderzijds de tweede groep, de groep van de ‘gecontroleerde substanties’, geneesmiddelen met actieve substanties die gebruikt mogen worden voor therapeutische doeleinden, onder toezicht van een dierenarts. Deze actieve stoffen mogen echter niet teruggevonden worden in de paarden wanneer deze deelnemen aan evenementen georganiseerd door de FEI, omdat ze mogelijk de prestaties van de paarden kunnen beïnvloeden (FEI 2, 2015; Wong en Wan, 2014). Naast deze stoffen worden ook alle chemisch structureel verwante stoffen op de lijst gezet voor verboden gebruik bij paarden in de sport, alsook alle stoffen met een gelijkaardig biologisch effect (Kioussi et al., 2013; FEI 2, 2015). Anabolica bevinden zich op de lijst van verboden stoffen (FEI, 2015) (Tabel 1).
15
Tabel 1. Lijst van anabolica welke op de lijst van verboden substanties 2015 van de FEI staan. De substanties met drempelwaarde* zijn boldenone, nandrolone en testosteron. Voor boldenone bedraagt deze 15 nanogram vrij en geconjugeerd boldenone per milliliter urine bij mannelijke paarden. Ook voor testosteron is er een drempelwaarde ingesteld. Bij ruinen bedraagt deze 20 nanogram vrij en geconjugeerd testosteron per milliliter urine. Bij merries is er een grens van 55,5 nanogram per milliliter (Popot et al., 2008; FEI 3, 2015). Nandrolone heeft een drempelwaarde van een nanogram per milliliter urine bij ruinen en merries. Bij hengsten ligt de toegestane drempelwaarde voor nandrolone hoger, namelijk 45 nanogram per millilter urine. (Jabroski, 2008).
17α-Hydroxy progesterone MALES androstenediol
dromostanolone
Methandriol
normethandrolone
drostanolone
Methandrostenolone
oxabolone
androstenedione
epiternbolone
Methenolone
Oxandrolone
bolandiol
ethinylestradiol
Methyldienolone
oxymesterone
bolasterone
ethylestrenol
Methylnortestosterone
oxymetholone
Boldenone*
fluoxymesterone
Methyltestosterone
paramethadione
boldione
formebolone
Methyltrienolone
Prostanozol
calusterone
fuzazabol
Mibolerone
Stanozolol
clostebol
gestrinone
Nandrolone*
Stenbolone
(AED) (endogene component)
(nortestosterone) danazol
hydroxytestosterone
Norandrostenediol
testosteron*
dehydrochlorometh
mestanolone
Norandrostenedione
tetrahydrogestrinone
yltestosterone dehydrochlorotesto
(THG) mesterolone
Norbolethone
tibolone
methandienone
Norclostebol
trenbolone
sterone desoxymethyltestos terone
Er zijn geen anabolica geregistreerd op de lijst van gecontroleerde substanties voor 2015. Deze lijst wordt elk jaar 90 dagen voorafgaand aan 1 januari, wanneer hij effectief ingaat, bekend gemaakt (FEI 3, 2015). Met de huidige gevoelige technieken kunnen echter zeer lage concentraties gedetecteerd worden. De nultolerantie kwam onder druk te staan. Bij hengsten kan boldenone immers endogeen gevormd worden uit testosterone (Ho et al., 2004; Popot et al., 2008). Deze bedraagt 15 ng vrij en geconjugeerd boldenone per mL urine bij mannelijk intacte paarden (hengsten) (Ho et al., 2004; Popot et al., 2008; FEI 3, 2015). Voor testosteron is er ook een drempelwaarde ingesteld. Bij ruinen bedraagt deze 20 ng vrij en geconjugeerd testosteron per mL urine. Bij merries is er een grens van 55,5 ng/mL (Popot et al., 2008; FEI 3, 2015). Nandrolone of één van zijn metabolieten heeft een drempelwaarde van 1 ng/mL bij ruinen en merries en bij hengsten 45 ng/mL urine (Jabroski, 2008).
16
2.3. DOPINGCONTROLE 2.3.1. Laboratoria
Parallel met het ontstaan van specifieke programma’s om de sport te beschermen, steeg de nood aan goed uitgeruste laboratoria en geavanceerde technieken om verboden substanties te kunnen e
opsporen. Vooral tijdens de 20 eeuw werden de technieken voor het opsporen van dopingmisbruik stelselmatig beter. Hierdoor verbeterde de detectie en controle van doping in de sport (Houghton en Maynard, 2010). De laatste 30 jaar zijn er ook veel ontwikkelingen geweest in de farmaceutische industrie, waardoor er verschillende geneesmiddelen met een verhoogde potentie zijn bijgekomen die ook opgespoord dienen te worden (Houghton en Maynard, 2010; Müller, 2010). Bovendien moet voor goede dopingcontroles het labo geaccrediteerd zijn, ofwel de formele erkenning van het laboratorium waar stalen geanalyseerd wat van fundamenteel belang is (Müller, 2010; Kioussi et al., 2013; Wong en Wan, 2014). 2.3.2. Staalname
Bij een controle van een staal wordt er gezocht naar het terugvinden van de substantie zelf, een metaboliet van de substantie, een isomeer van de substantie zelf of zijn metaboliet (Houghton en Maynard, 2014; FEI 2, 2015). Verschillende matrices zijn geschikt als staal voor dopingcontroles. Testosteron en zijn gerelateerde producten verlaten het lichaam voornamelijk via de urine (Parr et al., 2010), maar ook bloedstalen worden onderzocht. Urine wordt verzameld door opvangen terwijl het paard plast, dus zonder een urinesonde te plaatsen. Opvangen van urine gebeurt bij voorkeur na het werk (FNCF, 2015). Voor het verzamelen van een bloedstaal op serum, wordt wel een handeling uitgevoerd namelijk het aanprikken van de vena jugularis (Houghton en Maynard, 2010; Müller, 2010; Strano-Rossi et al., 2013). Veel substanties worden eveneens in het haar geïncorporeerd, waardoor haar gebruikt kan worden voor dopingcontrole (Müller, 2010; Strano-Rossi et al., 2013). Tijdens de staalvoorbereiding wordt een opzuivering van het staal nagestreefd, alsook de enzymatische hydrolyse van sulfaat- en glucuronideconjugaten (type II metabolieten) (Houghton en Maynard, 2010; Kioussi et al., 2013). Anabolica worden vaak toegediend onder de vorm van een ester (Clark en Henderson, 2003 ; Yuan et al., 2011; Gray et al., 2013). De estervorm vertraagt de degradatie en zorgt voor een langdurige werking na injectie van het steroïde (Clark en Henderson, 2003). Indien een intact ester kan gedetecteerd worden tijdens de analyse, dan is per definitie de exogene toediening aangetoond. Maar deze esters metaboliseren snel in het lichaam, waardoor deze zelden teruggevonden worden in urine (Yuan et al., 2011; Gray et al., 2013). De verbetering van de opsporingstechnieken heeft bijgedragen tothet reduceren van het benodigde volume van het te onderzoeken staal (Houghton en Maynard, 2010). Overeenkomstig met de technische ontwikkelingen werden de detectielimieten ook steeds lager. In de jaren ‘80 kwam het besef dat ook endogene steroïden en hun afgeleiden of gevormde steroïden vanuit de voeding gedetecteerd kunnen worden (Houghton en Maynard, 2014).
17
3. ENDOGENE VORMING ANDROGENE-ANABOLE STEROÏDEN De gemeten concentraties endogene AAS in de urine kunnen sterk variëren tussen verschillende individuen. Deze variatie is voornamelijk geslachtsgebonden, maar het kan ook samenhangen met de leeftijd, abnormale fysiologische toestand of trauma (Gray et al., 2013). Aangezien deze endogene producten steeds van nature aanwezig zijn in het lichaam (Müller, 2010; Houghton en Maynard, 2014), moet er een drempelwaarde vastgelegd worden vanaf wanneer men de aangetroffen concentraties als te hoog beschouwd en wanneer er dus met andere woorden sprake is van exogene toediening. Deze drempelwaarden voor endogene AAS werden bepaald door de FEI en IFHA. Deze uitgevoerde studie heeft als doel om een beter inzicht te verwerven over endogene producties van AAS bij paarden, aangezien er een enorme variatie bestaat in de componenten welke teruggevonden kunnen worden in de urine. Hierdoor is het niet altijd eenvoudig om de richtlijn aan te houden. Hoe beter het inzicht in deze producties, hoe beter de drempelwaarden afgestemd kunnen worden op de realiteit. Van drie AAS (nandrolone, boldenone en testosteron) werd reeds aangetoond dat zij endogeen kunnen voorkomen bij het paard. Deze endogene AAS kunnen het aantonen van exogeen toegediende AAS bemoeilijken (Soma et al., 2011; Yuan et al., 2011; Moeller en Stanley, 2012 Gray et al., 2013). Bij hengsten kan er van nature een hoge concentratie aan testosteron in de urine en plasma teruggevonden worden (Soma et al., 2011; Gray et al., 2013). Boldenone is ook detecteerbaar in lage concentraties bij hengsten (Ho et al., 2004; Popot et al., 2008; Gray et al., 2013). Bij ruinen (gecastreerde hengsten) en merries worden soms echter ook lage concentraties teruggevonden hoewel hier nog een nultolerantie geldt (Gray et al., 2013; Houghton en Maynard, 2014). In de jaren ‘80 werd nandrolone voor het eerst gedetecteerd in de urine van onbehandelde hengsten en drachtige merries (Houghton en Maynard, 2014). Bij niet-drachtige merries en ruinen kon tot op heden, nadrolone niet gedetecteerd worden, tenzij het exogeen toegediend wordt (Gray et al., 2013).
3.1. BOLDENONE
De detectie van boldenone (1,4-androstadieen-17β-ol-3-one of dehydrotestosteron) (Sgoifo Rossi et al., 2004; Ros et al., 2007) tijdens een controle bij paarden of runderen werd lang beschouwd als een bewijs van illegale dopingtoediening (Ros et al., 2007). Boldenone wordt voornamelijk toegediend omwille van zijn anabole farmacologische activiteit en zorgt voor een verhoogde stikstofretentie, eiwitsynthese en verhoogde afgifte van erythropoëtine in de nier (Decloedt et al., 2015). Naast het feit dat boldenone exogeen kan worden toegediend als anabool agens, is er echter ook de mogelijkheid van endogene productie (Ros et al., 2007; Cannizzo et al., 2007). Sinds de jaren ‘80 ontstond het besef dat AAS ook uit de voeding (fytosterolen) kunnen ontstaan en dus ook gedetecteerd kunnen worden. Door dit besef kwam er veel onderzoek in de richting van de vorming van endogene AAS uit voeding (Houghton en Maynard, 2014).
18
Deze omzetting van β-sitosterol (fytosterol) (Figuur 9) kan gebeuren door micro-organismen (De Brabander et al., 2004; Ros et al., 2007). De zijketen op C17 van de D-ring van β-sitosterol kan worden afgebroken. De sterolmolecule kan dan vervolgens omgezet worden naar anabole steroïden zoals testosteron en boldenone (Ros et al., 2007).
Figuur 9. Chemische structuur van β-sitosterol (Uit De Brabander et al., 2004).
Naast het feit dat endogene AAS kunnen gevormd worden uit de voeding (fytosterolen), kunnen deze eveneens ontstaan uit andere endogene steroïden. Zo kan boldenone gevormd worden uit testosteron (Gray et al., 2013; Houghton en Maynard, 2014). Endogeen gevormd boldenone wordt voornamelijk waargenomen bij hengsten (niet-gecastreerde paarden) welke dus ook een hogere concentratie aan testosteron bezitten (De Brabander et al., 2004; Popot et al., 2008; Gray et al., 2013). De structuur van boldenone is sterk gelijkend op die van testosteron. Een dubbele binding op C1-C2 is het enige wat boldenone van testosteron onderscheidt (De Brabander et al., 2004; Le Bizec et al., 2006; Ho et al., 2004; Cannizzo et al., 2007). Deze omzetting vormt de voornaamste verklaring voor het endogeen voorkomen van boldenone bij hengsten. Steroïden die eveneens sterk aansluiten bij boldenone en testosteron zijn hun respectievelijke precursoren: androsta-1,4-diene-3,17-dione (ADD) en androst-4ene-3,17-dione (AED) (De Brabander et al., 2004) (Figuur 10). De laatste jaren wordteen stijging waargenomen in de detectie van AAS. Hiervoor kunnen er verschillende verklaringen naar voor geschoven worden. Sinds de jaren ’90 zijn dierlijke vetten in de voeding van dieren volledig vervangen door plantaardige vetten naar aanleiding van de dioxinecrisis en na de crisis van Boviene Spongiforme Encephalopathie (gekkenkoeienziekte). Daarnaast zijn de analytische technieken sterk verbeterd, waardoor lagere concentraties vandaag de dag wel meetbaar zijn, die men vroeger niet kon meten (De Brabander et al., 2004). Het prohormoon ADD kan in het lichaam omgezet worden tot boldenone via het enzym 17βhydroxysteroidedehydrogenase /17-oxo-reductase. Dit enzym bestaat in verschillende iso-vormen die elk een individuele specificiteit hebben (Popot et al., 2008).
19
Figuur 10. Chemische structuur van βboldenone, testosteron, ADD en AED (Naar De Brabander et al., 2004).
Het is van essentieel belang om de endogene productie van boldenone grondig te bestuderen, omdat boldenone ook misbruikt kan worden als doping (De Brabander et al.,2004). Ho et al. (2004) geeft aan dat boldenone voornamelijk als zijn fase II metaboliet, het 17β-geconjugeerde sulfaat, in de urine het lichaam verlaat. (Ho et al., 2004; Pu et al., 2004). Boldenone is dan ook één van de cruciale componenten die gedetecteerd zal worden in deze studie. Naast boldenone wordt ADD ook vaak gebruikt als doping als prohormoon. De Brabander et al. (2004) geven in hun artikel aan dat ADD een groter anabool potentieel heeft dan boldenone zelf. De Brabander et al. (2004) voegt daaraan toe dat het onderscheid tussen de vrije vorm van 17β-boldenone en de geconjugeerde vorm het eerste punt is waar men het verschil kan maken tussen endogeen gevormde boldenone en exogeen toegediend, waarbij deze laatste geëxcreteerd worden onder de vrije vorm van 17β-boldenone. Dit kan mogelijk een methode zijn om gedopeerde paarden te identificeren. Dit wordt ook aangegeven door Cannizzo et al. (2007) en Le Bizec et al. (2006). Boldenone wordt geëxcreteerd als 17β-conjugaat door de hydrolyse met 17β-glucuronidase. De voornaamste metabolieten van boldenone die kunnen worden teruggevonden
zijn:
17β-hydroxy-5β-androst-1-en-3-one,
5β-androst-1-ene-3α,17β-diol
en
3α-
hydroxy-5β-androst-1-en-17-one (Figuur 11)(Schänzer, 1996).
Figuur 11. Metabolisme van Boldenone. 1. Boldenone 2. 17β-hydroxy- 5βandrost-1-en-3-one 3. Androsta-1,4-diene-3,17-dione 4. 5β-androst-1-ene-3α,17βdiol 5. 5β-androst-1-ene-3,17-dione 6. 3α-hydroxy-5β-androst-1-en 17-one 3 en 5 zijn slechts intermediaire structuren en worden niet geëxcreteerd in de urine (Uit Schänzer, 1996).
20
3.2. NANDROLONE
De structuur van het anabole-androgene steroïde nandrolone of 19-nortestosteron werd voor het eerst gesynthetiseerd in 1950 (Balssa et al., 2011). Nandrolone is een zeer potent AAS wat de reden is voor zijn misbruik en deze component werd dan ook door de IFHA en FEI verbannen uit de sport (Balssa et al., 2011). In de jaren ‘80 werden nandrolone en zijn metabolieten voor het eerst gedetecteerd in de urine van gezonde, niet-behandelde hengsten (Houghton en Maynard, 2010; Guan et al., 2012) en later ook in de urine van drachtige merries (Houghton en Maynard, 2014). Bij niet-drachtige merries en ruinen kan nandrolone tot op heden niet gedetecteerd worden, tenzij het exogeen toegediend werd (Gray et al., 2013). Net als voor boldenone werden er drempelwaardes vastgelegd, aangezien zowel nandrolonesulfaat als boldenonesulfaat in de urine van onbehandelde paarden aangetoond konden worden (Yamada et al., 2007; Kicman, 2010 Guan et al., 2012; Gray et al., 2013; FEI 3, 2015). De drempelwaarde bedraagt de verhouding van beide metabolieten. Deze ratio moet 1/1 zijn. Helaas is er veel individuele variatie mogelijk (Yamada et al., 2007). Nandrolone of 19-nortestosteron volgt voornamelijk het metabolische reactiepad van testostosteron. De voornaamste metabolieten van nandrolone zijn: 3α-hydroxy-5α-estran-17-one en 3α-hydroxy-5βestran-17-one (Schänzer, 1996). Deze laatste is het belangrijkste metaboliet van nandrolone (Balssa et al., 2011). Daarnaast is er ook het isomeer 3β-hydroxy-5α-estran-17-one, dat als 3β-sulfaat kan gedetecteerd worden in urine (Schänzer, 1996) (Figuur 12) (Yamada et al., 2007).
Figuur 12. Metabolisme van Nandrolone. 1. Nandrolone, 2. 3α-hydroxy-5αestran-17-one 3. 3α-hydroxy-5β-estran-17-one 4. 3β-hydroxy-5α-estran-17-one (Uit Schänzer, 1996).
21
Materiaal en methoden 1. STAALNAME
Midstream urine van 80 onbehandelde paarden werd opgevangen in steriele 50 ml buizen tijdens het spontaan urineren. De verzamelde stalen werden ingevroren bij -18 °C in afwachting van extractie en analyse. Het invriezen voorkomt transformaties die kunnen optreden in de opgevangen urine. Deze transformaties kunnen optreden door contaminatie met micro-organismen uit de omgeving (Decloedt et al., 2015). De paardenpopulatie uit de studie (80) bestond uit hengsten (16), merries (25) en ruinen (39) (Tabel 2). De leeftijden varieerden van veulens van een paar dagen oud tot paarden/pony’s van 32 jaar oud. De gemiddelde leeftijd bedroeg voor de hengsten (8,2 jaar ± 6), ruinen (11,4 jaar ± 6,9 ), merries (8,8 jaar ± 6,4). Aan deze studie namen paarden deel uit verschillende disciplines (dressuur, springen, drafsport, endurance en recreatie). De omstandigheden waarin de paarden werden gehouden, werden niet gestandardiseerd tijdens de staalname. Er is vanuit gegaan dat de paarden onder normale omstandigheden onderhouden werden, normale voeding kregen en op een normaal ontwormings- en vaccinatieschema stonden. Tabel 2. Ras- en geslachtsverdeling populatie paarden in deze studie
Ras
Totaal
Aantal merries
Aantal ruinen
Aantal hengsten
Franse Draver
24
4
14
6
BWP
17
5
12
0
Oldenburger
1
0
1
0
PRE
14
3
2
9
Fries
1
1
0
0
Shetland pony
1
0
1
0
KWPN
6
4
1
1
Pony’s
2
1
1
0
Welsh
3
0
3
0
Arabier
2
0
2
0
Stamboekloze paarden
9
7
2
0
Totaal
80
25
39
16
22
2. NORMALISATIE VAN DE DENSITEIT
De dichtheid van de urine kan verschillen tussen verschillende paarden door een verschil in vochtopname. Overmatig drinken geeft aanleiding tot een verdunning van de urine, wat kan leiden tot vals negatieve resultaten. Uitdroging kan leiden tot het sterk concentreren van de urine met mogelijk een overschatting van de gedetecteerde stoffen tot gevolg. In deze studie is hiervoor gecorrigeerd door de densiteit van de urinestalen in rekening te brengen, volgens onderstaande formule (Decloedt et al., 2015). De specifieke dichtheid (SG) werd gemeten met behulp van een refractometer (PALUSG(CAT); Atago, Tokoyo, Japan). Alle weergegeven concentraties zijn SG genormaliseerde concentraties. Concentratiegenormaliseerd = Concentratiestaal x ((SGreferentie -1) / (SGstaal -1)) SG referentie = 1,024 SG staal = gemeten SG
3. STAALVOORBEREIDING: EXTRACTIE 3.1. HYDROLYSE VAN GLUCURO-EN SULFO-GECONJUGEERDE COMPONENTEN
De stalen werden bij kamertemperatuur ontdooid. Na het ontdooien werden de stalen welke zich in de buizen van 50 mL bevinden, gecentrifugeerd (1500 rpm, 5 min) om overtollige eiwitten te verwijderen. Van elk urinestaal wordt twee keer 3 mL substaal overgebracht in een buisje van 15 mL (A en B reeks) en geëxtraheerd. De methode voor extractie die toegepast werd in deze studie is gevalideerd (Decloedt et al. 2015) en wordt op routinematige basis gebruikt in het Franse Laboratoire des Courses Hippiques voor dopingcontrole. De hydrolysestap wordt toegepast om de gevoeligheid bij detectie te verhogen. Via deze hydrolysestap
worden
twee
geconjugeerde fracties
bekomen, namelijk
de glucuro-
geconjugeerde en de sulfo-geconjugeerde fractie. Deze twee fracties worden in een stap verder geëlueerd via vaste fase extractie (SPE). Aan elk substaal werden volgende stoffen toegevoegd: -
1 mL fosfaatbuffer (pH 6,1, 1M KH2PO4), deze oplossing wordt aangemaakt door 27,2g op 200 mL KH2PO4 op te lossen. Daarna wordt de pH gecontroleerd en gecorrigeerd met NaOH (33%) tot de pH van 6,1 bereikt is.
-
10 ng/mL urine methyltestosteron. Methyltestosteron is de interne standaard welke als referentiecomponent zal dienen gedurende de analyse. Deze stof komt immers van nature niet voor in de urine van paarden waardoor deze kan corrigeren voor variaties in de extractieefficiëntie en analyse (Decloedt et al., 2015).
23
-
50 µL proteaseoplossing (P4032, Sigma Aldrich) (150 mg/mL 1:10 fosfaatbuffer, pH 6,1, 1M) om de eiwitgebonden componenten vrij te stellen.
-
25 µL glucuronidase (Helix Pomatia gezuiverd, Sigma). Dit β-glucuronidase is een enzyme van de glucuronidase familie dat de deconjugatie van glucoro-geconjugeerde steroïden katalyseert.
-
Een gekende concentratie (10 ng/mL) van de verschillende AAS (ADD, AED, α- en βboldenone, α- en β-testosteron, progesteron) voor de kwantificatie (zie: standaardadditiemethode).
Vervolgens wordt de pH van elk buisje gecontroleerd na calibratie van het toestel. Indien nodig wordt de pH met 1 M HCl gecorrigeerd tot 6,1 ± 0,1 (Figuur 13) wat de optimale pH van β-glucuronidase is.
Figuur 13. pH-meter
De stalen worden vervolgens een uur in de reeds op temperatuur gebrachte broedstoof (55 °C) geplaatst zodat de enzymatische hydrolyse kan plaatsvinden. Na een uur worden de stalen uit de broedstoof genomen en wordt aan elk staal 3 mL gedemineraliseerd water toegevoegd. Vervolgens worden de stalen gecentrifugeerd (4000 rpm, 15 min). Deze laatste stap heeft als doel om overblijvende grote, niet-gehydrolyseerde molecules te verwijderen, zodat deze onderaan het buisje agglutineren. 3.2. VASTE FASE EXTRACTIE (SPE)
De SPE wordt uitgevoerd op basis van kolommetjes (6 mL, 500mg C18 Bond Elut, Isolute). Deze moeten eerst geconditioneerd worden voor ze geladen kunnen worden met het gecentrifugeerde staal (supernatans) dat bekomen werd op het einde van de hydrolysestap (Figuur 14).
24
Figuur 14. het conditioneren van de kolommetjes met methanol en vervolgens water tijdens de SPE.
Door het aanbrengen van 4 mL methanol gevolgd door 4 mL water op de kolommetjes worden deze geconditioneerd. Het conditioneren stelt de C18-ketens vrij. Het supernatans wat overblijft uit de hydrolysestap wordt over een wattenfilter op de SPE kolom gebracht.
Figuur 15. Het laden van de gehydrolyseerde urinestalen over de trechters met een wattenfilter tijdens de SPE.
Na het laden worden de SPE kolommen gewassen met achtereenvolgens 6,5 mL water en 6,5 mL hexaan. Vervolgens worden de kolommetjes gedroogd onder vacuüm (-0,5 bar). Met hexaan worden de apolaire residuen (vetten) weggewassen. De polaire residuen worden via water weggewassen. De volgende stap in de SPE procedure is de elutie van de kolommetjes. Deze worden op twee verschillende manieren geëlueerd. De eerste elutie gebeurt met diëthylether (6,5 mL). Hierbij elueert zowel de vrije- als de glucuro-geconjugeerde fractie. De elutie van de sulfo-geconjugeerde fractie vindt plaats met behulp van solvolysesolvent (6,5 mL).
25
Eén liter solvolysesolvent is
samengesteld uit 900 mL ethylacetaat, 95 mL methanolhydroxide
(MeOH) en 5 mL zwavelzuur (H2SO4). Deze opgevangen fractie wordt eerst in de broedstoof (55 °C) gebracht gedurende 2 uur voor de deconjugatie van de sulfaten vooraleer ze gewassen zal worden. 3.3. WASSEN
Terwijl de sulfo-geconjugeerde fractie zich in de broedstoof bevindt, wordt de glucuro-geconjugeerde en vrije etherfractie gewassen met 5 mL NaOH van 1,5 N (60 g/L NaOH). Daarna worden deze buisjes gedurende 8 minuten geschud. Hierna worden ze 6 minuten gecentrifugeerd bij 3000 rpm. Na centrifugatie wordt de bovenste fractie, de gewassen diëthylether, afgehaald en overgebracht in nieuwe tubes. Het afhalen gebeurt met een glazen pasteurpipet. Na twee uur in de broedstoof wordt ook de sulfo-geconjugeerde ethylacetaat fractie gewassen met 6 mL NaOH (1,5 N). De gewassen ethylacetaatfractie wordt afgehaald en overgebracht bij de etherfractie (pooling van de twee fracties). De gepoolde stalen worden drooggedampt onder stikstof bij 50°C (zie figuur 16) (45 min). Het poolen van de niet-geconjugeerde en vrije fractie sulfaat- en glucuronideconjugaat laat toe om de detectie van vrije componenten te doen toenemen.
Figuur 16. Stikstofindamper. Stikstofgas wordt over de stalen gebracht waardoor deze zullen indampen.
3.4. HEROPLOSSEN VAN HET EXTRACT
Wanneer de stalen volledig ingedampt zijn, worden ze opnieuw opgelost in 100 µL ultrapuur methanol. Hierna worden ze gevortext (30 s) en in een ultrasoonbad geplaatst (3 min). Vervolgens wordt er 100 µL ultrapuur water toegevoegd, nogmaals ‘gevortext’ en nog eens 3 minuten in het ultrasoonbad geplaatst. Na de laatste ultrasonicatie worden de stalen nog bijkomend gecentrifugeerd (10 min, 9000 rpm). Hierna wordt er 150 à 200 µL overgebracht naar doorschijnende LC vials. Indien analyse (UHPLC-MS/MS) niet onmiddelijk kan gebeuren, kunnen de extracten opnieuw ingevroren worden (-18°C).
26
4. UHPLC-MS/MS ANALYSE
De Accela
TM
autosampler’ en ‘Accela
USA) met ‘Nucleodur
TM
TM
High Speed LC (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA,
Sphinx RP kolom’ (1,8 μm, 50 x 2,1mm, Macherey-Nagel) werden gebruikt
voor chromatografische scheiding van de analyten. De mobiele fase waarmee de stalen over de kolom werden gestuurd, bestond uit ultrapuur water als solvent A en methanol optima als solvent B. Beide solventen werden aangezuurd met 0,1% mierenzuur (26,5 mM). Er werd gestart met 58% van het solvent B dat geleidelijk over enkele minuten (0 tot 5,5 min) opgevoerd werd naar 100%. Nadien werd de kolom gekalibreerd op de initiële condities van 58% van solvent B en 42% van het solvent A. Hierbij kunnen dan chromotagrammen en fragmentatiespectra van een standaardoplossing van de gemeten steroïde, waargenomen worden (Figuur 17).
Figuur 17. Chromatogram en fragmentatiespectra van een standaardoplossing van de verschillende steroïden (0,1ng ADD, AED, boldenone, α-testosteron, β-testosteron, progesteron en de interne standaard methyltestosteron. De detectie gebeurd via TSQ Vantage Triple Stage Quadrupole Mass Spectrometer (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA) welke uitgerust is met een verwarmde electrospray ioniserende prober (HESI-II) (Decloedt et al., 2015).
27
De detectie van de steroïden in de stalen werd in deze studie uitgevoerd via de TSQ Vantage Triple Stage Quadrupole massaspectrometer (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA) welke uitgerust is met een verwarmde electrospray ioniserende probe (HESI-II). Er werd telkens 10 μL geinjecteerd in het toestel en de HESI bevindt zich in de multiple reactie monitoring positieve ionmodus. Deze positieve ionmodus is belangrijk aangezien vastgesteld werd dat de gevoeligheid dan beter is (Pu et al. 2004; Decloedt et al., 2015). Er werd een voltage van 3kV van de HESI ion spray toegepast. Gas om de ionen weg te spoelen werd ingesteld op 2 au of ‘arbitrary units’. De sheat en auxiliary gasdrukken stonden op 45 en 15 au. De temperatuur voor het vullen van de capillair stond op 310°C. De verdampingstemperatuur werd ingesteld op 370°C (Tabel 3).
Tabel 3. Karakteristieken van de gebruikte methode. Per component zijn er speciefieke SRM kenmerken. Deze kenmerken zijn het precursorion, productionen, de retentietijd, S-Lens RF amplitude en de corresponderende collisieenergie (Naar Decloedt et al., 2015).
Component
Precursorion (m/z)
ADD
285,2
AED
287,2
Bol
287,2
Α-T
289,2
Β-T
289,2
P
315,2
MeT
303,2
Production (m/z)
77 91 121 147 79 81 97 109 77 121 135 79 97 109 253 79 97 109 253 79 97 109 297 97 109 285
Relatieve retentietijd (min)
S-lens voltage
2,45 (0,61)
(V) 54
3,39 (0,85)
70
2,85 (0,71)
56
4,06 (1,01)
70
3,59 (0,90)
70
4,64 (1,16)
75
4,01 (1,00)
73
Collisieenergie (V) 51 39 22 15 36 37 21 25 51 26 17 40 23 27 16 39 22 27 15 38 23 28 13 30 28 15
28
5. Data analyse
De stalen verschillen individueel met betrekking tot hun biochemische samenstelling gaande van een verschil
in kleur, pH, densiteit
tot
de hoeveelheid aanwezige
eiwitten. Een individuele
kwantificatiemethode wordt gekozen (standaardadditiemethode) om de oppervlakte onder de curve voor de verschillende componenten te kunnen bepalen. De specifieke retentietijd van de componenten is de basis voor hun identificatie bij analyse. Deze retentietijd wordt vergeleken met de retentietijd van de standaardoplossing van de component (Decloedt et al., 2015). Het extract van staal A werd opnieuw opgelost in methanol en water (50/50). De injectie van het staal over het UHPLC-MS/MS systeem zal resulteren in een oppervlakte onder de curve. Deze oppervlakte is relevant voor de concentratie aanwezig in het blanco staal. Deze oppervlakte wordt onderverdeeld in een oppervlakte voor de concentratie van de interne standaard (10 ng/mL methyltestosteron) die toegevoegd werd en een oppervlakte onder de curve welke staat voor de concentratie van de component aanwezig in het blanco staal A (ArA). In het staal B waar de spike aan toegevoegd is, wordt op dezelfde manier de oppervlakte onder de curve (ArB) voor de component bepaald als gedaan werd bij staal A (Decloedt et al.,2015). Via de volgende formule kan de onbekende concentratie per component in het staal A berekend worden (Decloedt et al, 2015). CA= ArA/(ArB-ArA) x ρ CA = concentratie in het staal A (ng/mL) ArA/ArB = oppervlakteverhouding van het A-staal ten opzichte van het B-staal ρ = concentratie van de toegevoegde interne standaard (10 ng/mL) De data werd geinterpreteerd met behulp van de Xcalibur 2.1 kwalitatieve en kwantitatieve software (Foundation 1.0.2 Rev B; Thermo Fisher Scienfific, San Jose, USA).
29
Resultaten De screening in urine naar AAS in deze studie, vond plaats bij een populatie van 80 paarden waarvan 16 hengsten, 25 merries en 39 ruinen. Deze paarden stonden niet onder medische behandeling op moment van de staalname. Om de resultaten van de verschillende paarden onderling te kunnen vergelijken, werd er rekening gehouden met de densiteit van de urine. Zoals aangegeven in ‘Materiaal en Methode, 1. Staal name’, werd de specifieke densiteit van de urine bepaald met behulp van een refractometer. De gedetecteerde concentraties van de urinemonsters werden vervolgens genormaliseerd om deze onderling te kunnen vergelijken. Alle weergegeven concentraties in deze studie zijn dan ook genormaliseerde concentraties. De gemeten concentraties werden vervolgens via Excel verwerkt (Tabel 4). Voor de verschillende componenten werd per geslachtsgroep een gemiddelde van de ‘positief bevonden’ paarden genomen alsook van de hele groep. Daarnaast werd ook telkens een standaarddeviatie genomen om een zicht op de verdeling te krijgen en de individuele variabelen beter te kunnen beoordelen. Bij 93% uit de groep van 64 merries en ruinen werden steroïden in de urine aangetroffen, weliswaar aan lage concentraties. Voornamelijk α-testosteron, β-testosteron en progesteron komen in lage concentraties voor. De gevonden concentraties bevonden zich allemaal onder de drempelwaarden van testosteron zowel voor merries (< 55 ng/mL) als ruinen (< 20 ng/mL). Deze concentraties vielen dan ook binnen het verwachtingspatroon voor testosteron. De urine van de hengsten in deze studie bevatte een hogere endogene concentratie aan AAS. De concentratie van β-testosteron (53 ng/mL ± 90) bij hengsten lag hoger dan de gemiddelde concentratie bij ruinen (4,6 ng/mL ± 9,8) en merries (2,1 ng/mL ± 2,7).
30
Tabel 4. Detectie van ADD, AED, α-boldenone, β-boldenone, α-testosteron en β-testosteron in de urine van paarden (merries, n=25; ruinen, n=39; hengsten, n=16). In de tabel wordt, per component, het aantal paarden waarbij de component gedetecteerd werd aangegeven. In deze groep wordt zowel de gemiddelde concentratie en standaarddeviatie van de component als de gemiddelde concentratie en standaarddeviatie in de hele groep waargenomen.
Component
Geslacht
Aantal
Gemiddelde
Gemiddelde
positieve
concentratie
concentratie van de
paarden
(ng/mL)
groep (ng/mL)
Androsta-1,4-
Merries
1/25
1,9
0,1 ± 0,4
diene-3,17-dione
Ruinen
0/39
Niet detecteerbaar
Niet detecteerbaar
(ADD)
Hengsten
2/16
2,7 ± 1,0
0,2 ± 0,5
Androst-4-ene-
Merries
4/25
0,3 ± 0,1
0,1 ± 0,1
3,17-dione
Ruinen
3/39
0,3 ± 0,1
0,02 ± 0,1
(AED)
Hengsten
2/16
1,3 ± 0,6
0,1 ± 0,3
α-Boldenone
Merries
0/25
Niet detecteerbaar
Niet detecteerbaar
Ruinen
0/39
Niet detecteerbaar
Niet detecteerbaar
hengsten
0/16
Niet detecteerbaar
Niet detecteerbaar
Merries
2/25
0,3 ± 0,1
0,02 ± 0,1
Ruinen
3/39
1,0 ± 0,6
0,10 ± 0,4
Hengsten
7/16
2,5 ± 1,5
1,0 ± 1,4
α-Testosteron
Merries
22/25
2,0 ± 1,7
1,7 ± 1,7
(α-T)
Ruinen
34/39
2,7 ± 3,1
2,3 ± 3,0
Hengsten
10/16
1,7 ± 1,3
1,0 ± 1,3
β-Testosteron
Merries
21/25
2,1 ± 2,8
1,8 ± 2,7
(β-T)
Ruinen
24/39
4,6 ± 12,2
2,8 ± 9,8
Hengsten
13/16
65 ± 96
53 ± 90
Merries
25/25
2,4 ± 2,3
2,4 ± 2,3
Ruinen
33/39
2,2 ± 2,0
1,9 ± 2,0
Hengsten
13/16
3,6 ± 5,4
2,9 ± 5,1
β-Boldenone
Progesteron
31
Bij 3 paarden, 2 hengsten en 1 merrie uit de onderzochte populatie van 80 paarden werd ADD gedetecteerd (4%). Bij deze 3 paarden kon er bij 1 merrie ADD teruggevonden worden (1,9 ng/mL). Deze betrokken merrie was een jong paard van 1,5 jaar oud. De andere componenten waren wel normaal bij dit paard: afwezigheid van AED, α-Boldenone, β-Boldenone, 1,06 ng/mL α-testosteron, 1,30 ng/mL β-testosteron en 6,16 ng/mL progesteron. De populatiegemiddelden voor deze componenten bij merries bedroegen 0,1 ± 0,4 ng/mL voor ADD, 0,1 ng/mL ± 0,1 voor AED, 0,02 ng/mL ± 0,1 aan β-boldenone, 1,7 ng/mL ± 1,7 aan α-testosteron, 1,8 ng/mL ± 2,7 aan β-testosteron en 2,4 ng/mL ± 2,3 aan progesteron. De component AED werd gemeten bij 9 paarden of 11 % van de populatie: bij 2 hengsten gemiddeld 1,3 ng/mL ± 0,6, bij 4 ruinen gemiddeld 0,3 ng/mL ± 0,1 en bij 3 merries tenslotte 0,3 ng/mL ± 0,1. In het geval van een andere merrie van 1,5 jaar oud, kon ook boldenone (0,2 ng/mL) gedetecteerd worden. De testosteronwaarden van deze merrie lagen echter ver onder het populatiegemiddelde uit deze studie: de concentratie α-testosteron bedroeg 0,3 ng/mL t.o.v. 1,7 ng/mL ± 1,7 en β testosteron 0,4 ng/mL t.o.v. 1,8 ng/mL ± 2,7. In de urine van een andere, oudere merrie (16 jaar) waar een lage concentratie AED (0,4 ng/mL) kon gedetecteerd worden, werd eveneens een lage concentratie aan boldenone (0,3 ng/mL) ontdekt (Figuur 18 en Figuur 19). De β-testosteronwaarde bij deze merrie lag met 11,6 ng/mL ver bovende gemiddelde concentraties voor β-testosteron bij merries (1,8 ng/mL ± 2,7). Boldenone wordt normaal alleen bij hengsten verwacht. In de hengstenpopulatie (n=16) kon bij 7 paarden boldenone aangetoond worden (2,5 ng/mL ± 1,5). In de studie viel op dat in enkele gevallen ook bij ruinen en merries boldenone opgespoord kon worden. Bij 3 ruinen uit deze studie was de gedetecteerde β-Boldenone concentratie respectievelijk 1,7 ng/mL bij ruin 1 (franse draver, 6 jaar), 1,4 ng/mL bij ruin 2 (arabier, 14 jaar) en 0,6 ng/mL bij ruin 3 (KWPN, 12 jaar). Daarnaast werd bij 2 merries ook een lage concentratie aan boldenone opgespoord in de urine. De concentratie boldenone bij 1 merrie bedroeg 0,3 ng/mL, naast de reeds eerder vermelde aanwezigheid van AED (0,4 ng/mL). In de urine van de andere merrie werd een concentratie van 0,2 ng/mL boldenone en 0,4 ng/mL AED opgespoord. Testosteron kwam frequent voor in de urinemonsters van de paarden uit de bestudeerde steekproef. Bij 82,5% van de dieren kwam α-testosteron voor, bij 72,5% β-testosteron. De vastgestelde concentraties van α-testosteron lagen bij alle groepen lager dan deze van β-testosteron: hengsten (1,0 ± 1,3), merries (1,7 ± 1,7) en ruinen (2,3 ± 3,0). Voor β-testosteron was dit verschil bij hengsten duidelijk waar te nemen (53 ng/mL ± 90) ten opzichte van ruinen ( 2,8 ng/mL ± 10) en merries (1,8 ng/mL ± 2,7). Progesteron werd waargenomen in 89% van de urinestalen. Bij de bestudeerde merries was dit in 100% (2,4 ng/mL ± 2,3).
32
ADD
methyl-testosteron
AED
β-testosteron
β-boldenone
progesteron
α-testosteron
Figuur 18. Chromatogrammen A-staal merrie (16jaar) met verhoogde testosteronwaarde (11,6 ng/mL), aanwezigheid AED (0,4ng/mL) en boldenone (0,3 ng/mL).
33
ADD
methyl-testosteron
AED
β-testosteron
β-Boldenone
progesteron
α-testosteron
Figuur 19. Chromatogrammen B-staal merrie (16jaar) met verhoogde testosteronwaarde (11,6 ng/mL), aanwezigheid AED (0,4ng/mL) en boldenone (0,3 ng/mL).
34
Discussie Het doel van deze studie bestond erin om van 100 gezonde, onbehandelde paarden een urinestaal te verzamelen en het endogene voorkomen van AAS en dicht verwante steroïdprecursoren te bepalen. Uiteindelijk kon er van 80 verschillende paarden een staal genomen worden voor analyse. De verdeling van de geslachten, mannelijk of vrouwelijk, werd niet vooraf vastgelegd. Verhoudingsgewijs werden meer hengsten en ruinen (n=55) bemonsterd dan merries (n=25). Twee factoren speelden hierbij een belangrijke rol. Enerzijds worden er meer mannelijke paarden in de sport ingezet. Vooral in de drafsport nemen mannelijke paarden deel aan de competitie. In de populatie Franse dravers (n=24 ) uit deze studie was slechts 17% een merrie. Dit heeft vooral met het strenge fokkerijbeleid te maken waarbij merries zelf het veulen moeten baren, vermits embryotransfer niet toegestaan is. Bij volbloeden is dit beleid nog strenger wegens verbod op kunstmatige inseminatie, wat bij Franse dravers wel toegestaan is (Brinsko et al., 2011). Merries moeten dus volledig uit de sport om nakomelingen te produceren. Dit verklaart waarom zo weinig merries in de rensport zitten. In andere disciplines zijn meer voortplantingstechnieken toegestaan waardoor merries hun bloedlijn kunnen doorgeven en tegelijk sportprestaties kunnen leveren. Daarnaast vinden we voornamelijk ruinen terug in de diverse sporttakken, omwille van hun meer gematigde karakter. In deze studie zijn daarom de ruinen het hoogst vertegenwoordigd en maken bijna de helft van de bemonsterde populatie uit (49%). Gezien de omgang met hengsten meer uitdagend is omwille van hun hormonaal gedrag, vormen zij de minderheid voor sport en recreatiedoeleinden. Anderzijds is het nemen van urinemonsters bij ruinen en hengsten eenvoudiger dan bij merries. Bij merries dient men hiervoor immers in de gevaarzone ter hoogte van de achterbenen te komen. De
ongelijke
verdeling
tussen
de
geslachten
bemoeilijkt
de
besluitvorming
over
een
minderheidspopulatie. De marges van endogene AAS-productie verschillen bovendien sterk tussen individuele paarden. Tijdens het extractieprotocol werd er gebruik gemaakt van methyltestosteron (10 ng/mL) als interne standaard. Bij een aantal stalen kon de interne standaard niet gedetecteerd worden. De berekening van de onbekende concentratie van de verschillende componenten werd voor deze stalen dan ook niet gedaan aan de hand van de piekoppervlakteverhouding van de component zelf en de interne standaard, maar via vergelijking van de oppervlakte onder de curve in het “gespikete” staal en het blanco staal. De bekomen concentraties zijn dan ook benaderingen. Ter bevestiging zou het noodzakelijk zijn om de extractie van de betrokken stalen opnieuw uit te voeren met een nieuwe standaardoplossing van methyltestosteron. Wegens tijdsgebrek was een heranalyse van de stalen binnen het kader van deze studie niet mogelijk.
35
Bij 10 stalen werd alleen de ethylfractie onderzocht. Tijdens de wasstap van de sulfo-geconjugeerde fractie trad er een probleem op, waardoor er geen scheiding van vloeistof/vloeistof mogelijk was omwille van een probleem met de solvolyse-oplossing. Daardoor werd bij deze stalen alleen de glucuro-geconjugeerde fractie onderzocht die de meeste van de te onderzoeken componenten bevat. Om dit probleem bij de extratie van de resterende stalen te voorkomen, werd er een nieuwe solvolyseoplossing aangemaakt. De resterende extracties verliepen zonder problemen. Bij het verwerken en interpreteren van de analyseresultaten werd bij 93 % van de 64 merries en ruinen een spoor van steroïden gevonden. Bij dopingcontrole zouden deze paarden echter allemaal negatief testen wegens de zeer lage concentraties van steroïden, die bij deze nieuwere, meer gevoelige analysemethode wel gedetecteerd konden worden. Voor boldenone, ADD en AED geldt in principe een nultolerantie bij merries en ruinen in tegenstelling tot hengsten waar de drempelwaarde op 15 ng/mL ligt (Ho et al., 2004; Popot et al., 2008; FEI 3, 2015). De vastgestelde zeer lage waarden geven aanleiding tot discussie of het handhaven van de nultolerantie bij merries en ruinen wel correct is. Het leveren van dit bewijs is het doel van deze studie. Deze studie onderzocht specifiek de volgende AAS-componenten: ADD, AED, boldenone (α en β), testosteron (α en β) en progesteron. De structuren van ADD en AED zijn chemisch verwant met de structuren van testosteron en boldenone (De Brabander et al., 2004). De structuren van boldenone en testosteron zijn chemisch ook sterk gelijkend (Figuur 1 en Figuur 10) (De Brabander et al., 2004). Een dubbele binding op C1-C2 is het enige dat boldenone van testosteron onderscheidt (De Brabander et al., 2004; Le Bizec et al., 2006; Ho et al., 2004; Cannizzo et al., 2007). De componenten ADD en AED werden in de urine van sommige paarden teruggevonden. Bij 3 paarden, waarvan 2 hengsten en 1 merrie werd ADD gedetecteerd. Bij hengsten wordt de aanwezigheid van ADD en boldenone getolereerd, indien deze onder de drempelwaarde blijft (De Brabander et al., 2004; Popot et al., 2008; Gray et al., 2013). In deze studie werd een gemiddelde concentratie van 0,2 ng/mL ± 0,5 gedetecteerd bij de deelnemende hengsten wat onder de grenswaarde bleef. Hierdoor zouden deze paarden niet positief testen bij een dopingcontrole. Het voorkomen van ADD bij een merrie wordt niet frequent gerapporteerd. Binnen deze studie werd bij één merrieveulen van 1.5 jaar oud ADD aangetroffen. De andere componenten waren wel normaal. Deze merrie was niet in behandeling geweest. De eigenaar van dit paard gaf aan dat de merrie een dominant karakter had wat mogelijk verklaard kan worden door het voorkomen van ADD. Het kan echter ook toe te schrijven zijnaan het individuele karakter van dit paard. Hiervoor zou verder onderzoek nodig zijn, wat in deze studie niet gebeurd is. In deze studie werd meer AED gedetecteerd (11%) dan ADD (3%). De studie van Decloedt et al. (2015) had een analoog resultaat, waarbij in 8% van de bestudeerde paarden (n=105) AED gedetecteerd kon worden. De vastgestelde concentraties bij alle paarden binnen deze studie bleven ruim binnen de norm.
36
In de urine van een merrie kon ook boldenone (0,2 ng/ml) gedetecteerd worden. Hierbij viel op dat deze merrie (1,5 jaar) samen op de zelfde weide stond als de merrie (1,5 jaar) met de gedetecteerde ADD-concentratie. Deze merrie was ook niet behandeld geweest voor en tijdens de staalafname. De eigenaar had geen opmerkingen over het gedrag van het paard. Bij controle van het management van deze 2 jonge merries bleek dat beide overdag op de weide stonden en ’s avonds op stal met stro en hooi. Ze werden elk op stal bijgevoerd met 1,4 kg per dag PAVO Podo Grow. Van deze stal werd er naast deze 2 jonge paarden ook nog van twee oudere paarden een urinestaal verzameld, een 15 jarige merrie en 19 jarige ruin. Het management van deze was gelijkaardig aan dat van de jonge paarden met uitzondering van de hoeveelheid krachtvoer. De oudere paarden kregen elk 1 kg/dag PAVO Condition. Opvallend was dat bij deze ouderemerrie ook AED (0,3 ng/mL t.o.v. 0,1 ng/mL ± 0,1 in de hele populatie) gedetecteerd werd. Bij de ruin was niets bijzonders te melden. Bij de andere merrie (Figuur 18 en Figuur 19) waarbij AED gedetecteerd werd (0,4 ng/mL) in de urine werd eveneens boldenone (0,3 ng/mL) gedetecteerd. Dit bevestigt een mogelijk verband tussen AED en boldenone. De β-testosteron waarde bij dit paard (11,6 ng/ml) was echter beduidend hoger dan bij de andere merries uit de studie waarbij 1,8 ng/mL ± 2,7 als gemiddelde concentratie genoteerd werd. Een verhoogde testosteronwaarde bij merries kan een indicatie zijn voor de aanwezigheid van ovariatumoren zoals granulosacel tumor. Symptomen die aangetaste merries vertonen zijn: hengstengedrag en anoestrus (McCue et al., 2006; Brinsko et al., 2011; Leung et al., 2011; Decloedt et al., 2015). Een andere mogelijke verklaring is de behandeling van de merrie die eindigde anderhalve maand voor de staalafname. Deze merrie werdgedurende een maand behandeld voor een onsteking aan het ligamentum anulare met dexamethasone (glucocorticoïd) en fenylbutazole (NSAID) (Skrabalak en Maylin, 1981; Blikslager, 2002). De gedetecteerde concentraties in de urine van dit paard bleven echter nog onder de drempelwaarde bij een dopingcontrole. Het paard in kwestie was een recreatiepaard en nam nog nooit deel aan een wedstrijd. Een follow-up staal zou in dit geval interessant kunnen zijn om op te volgen of de concentraties afnemen wanneer er meer tijd zit tussen het einde van de behandeling en de staalafname en om te bepalen welke component van de medicatie het effect op de steroïdeconcentraties veroorzaakt. In de studie van Decloedt et al. (2015) werd een merrie beschreven waar ADD (5,2 ng/ mL), een voorloper van boldenone, gedetecteerd kon worden in de urine. Naast de detectie van ADD werd ook een hogere α-testosteron concentratie (12 ng/mL) gedetecteerd. In deze studie werd bij 4 merries van de 53 (gemiddeld 0,1 ng/mL ± 0,5) en 4 ruinen van de 47 (gemiddeld 0,1 ng/mL ± 0,3) AED waargenomen worden. Boldenone wordt normaal alleen bij hengsten verwacht. In de hengstenpopulatie van deze studie werd boldenone bij 7 (2,50 ng/mL ± 1,50) van de 16 paarden gedetecteerd. Voor boldenone geldt een drempelwaarde, vastgelegd door de IFHA en FEI. Deze bedraagt 15 ng vrij en geconjugeerd boldenone per mL urine bij mannelijk intacte paarden (hengsten) (Ho et al., 2004; Popot et al., 2008; FEI 3, 2015). Alle paarden uit deze studie bleven goed onder deze norm (1,0 ng/mL ± 1,4). De gedetecteerde concentraties uit deze studie waren echter hoger dan de concentraties uit de studie van Dehennin et al.(2003) (0,34 ng/mL) en Decloedt et al. (2015) (0,4 ng/mL ± 0,5).
37
In deze studie kon er echter bij enkele ruinen en merries ook boldenone opgespoord worden. Bij drie ruinen werd een β-boldenone concentratie van respectievelijk 1,74 ng/mL bij ruin 1 (Franse draver, 6 jaar), 1,44 ng/mL bij ruin 2 (arabier, 14 jaar) en 0,64 ng/mL bij ruin 3 (KWPN, 12 jaar) gemeten. Ruin 1 werd 3 weken voor staalafname behandeld. De medicatie waarmee dit paard behandeld werd, werd niet bekend gemaakt door de eigenaar en behandelende dierenarts aan de onderzoeker van deze studie. Het tweede paard werd niet behandeld voor en tijdens de staalafname. De concentratie van endogene β-testosteron was echter ook verhoogd (60 ng/mL). Dit paard vertoont, ondanks castratie, hengstenstreken en is dominant van karakter (na navraag bij de huidige eigenaar). De vorige eigenaar liet het paard op 4-jarige leeftijd castreren wegens zijn zeer sterke hengstengedrag. Het is echter niet duidelijk of dit paard mogelijks aan cryptorchisme leed (Leung et al. 2011). Indien bij castratie eventueel een restant testesweefsel achterbleef, zou dit een verklaring kunnen zijn voor het blijvende hengstengedrag en de verhoogde endogene waarden. Op basis van de in deze studie bekomen resultaten en de door de eigenaar beschreven karaktereigenschappen zou het zeker het overwegen waard zijn om dit te controleren. Een andere mogelijkheid zou een bijnierafwijking kunnen zijn. Ter hoogte van de bijnier kan er ook testosteron geproduceerd worden (Schänzer, 1996; Parr et al., 2010). De derde ruin was een 12-jarig recreatiepaard waarbij ook een spoor boldenone (0,6 ng/mL) teruggevonden werd. Dit paard stond in de maanden voor staalafname niet onder geneeskundige behandeling. Waarschijnlijk zijn deze gedetecteerde concentraties boldenone van endogene oorsprong. Ter bevestiging zou er best een tweede analyse van het eerste staal gebeuren en een tweede staalafname. Bij twee merries was er ook een lage concentratie boldenone terug te vinden in het urinestaal. Daarnaastkon ook één van zijn voorlopers (AED) gedetecteerd worden. Dit is eerder uitgebreid besproken. Bij de eerste merrie (16 jaar) kon 0,3 ng/mL boldenone waargenomen worden naast AED (0,4 ng/mL), α-testosteron (2,8 ng/mL) en β-testosteron (11,6 ng/mL). Bij de tweede merrie (1,5 jaar) kon er 0,2 ng/mL boldenone en 0,4 ng/mL AED gedetecteerd worden. Beide vormen van testosteron (α en β) werden zeer frequent gedetecteerd in de urine van de paarden uit deze proef. Hierbij komt α-testosteron (82,5%) het meest voor ten opzichte van β-testosteron (72,5%). Bij de verschillende geslachten werden volgende concentraties van α-testosteron waargenomen: bij ruinen (2,3 ng/mL ± 3), bij merries (1,7 ng/mL ± 1,7) en bij hengsten (1 ng/mL ± 1,3). De gemeten concentraties van β-testosteron bij hengsten liggen veel hoger dan die van αtestosteron, namelijk(53 ng/mL ± 90. De gevonden concentraties bij ruinen(2,8 ng/mL ± 9,8) en merries (1,8 ng/mL ± 2,7) zijn vergelijkbaar. Bij enkele hengsten (3/16) kon er geen testosteron gedetecteerd worden, wat eigenlijk vreemd is gezien studies zoals Ho et al. (2004), Popot et al. (2008) en Decloedt et al. (2015) wel testosteronconcentraties bij alle hengsten waarnamen tijdens hun onderzoek.
38
Uitgezonderd de meetresultaten van deze 3 paarden, varieërden de concentraties bij de 13 overblijvende hengsten gemiddeld rond 65 ± 96 ng/mL. In de eerder aangehaalde onderzoeken bleek de concentratie aan β-testosteron 100 keer hoger dan de concentratie aan boldenone. Dit 100 keer hogere verschil kon in deze studie niet bevestigd worden, maar er werd eveneens een duidelijk hogere concentratie aan β-testosteron aangetoond . Progesteron is eveneens bij de meeste paarden uit de studie aanwezig (89%). De concentraties die gedetecteerd werden zijn laag (merries (2,4 ng/mL ± 2,3), ruinen (1,9 ng/mL ± 2,0), hengsten (2,9 ng/mL ± 5,1). De studie van Decloedt et al. (2015) bevestigt het voorkomen van lage concentraties bij hun onderzochte paardenpopulatie (n=105). Uit deze studie kan besloten worden dat de natuurlijke marge waarin de endogene AAS variëren zeer ruim is, vooral bij ruinen en merries. Dit werd ook eerder vermeld in de studie van Decloedt et al. (2015). Waar testosteron en progesteron in de urine van de meeste paarden gedetecteerd kunnen worden aan een lage concentratie, is dit echter niet zo voor ADD en AED (De Brabander et al, 2004; Decloedt et al., 2015). Deze stoffen worden omwille van hun nauwverwante chemische structuur beschouwd als (eventueel verboden) precursoren van boldenone (Figuur 10) (De Brabander et al, 2004). Bij hengsten werd eerder al vastgesteld dat boldenone endogeen voorkomt en gedetecteerd kan worden in de urine (De Brabander et al., 2004; Popot et al., 2008; Gray et al., 2013). Door EFHA en FEI is hier een drempelwaarde van 15 ng/ml vastgesteld (Popot et al., 2002, FEI 3, 2015). In deze studie zijn echter ook lage concentraties ADD, AED en boldenone vastgesteld bij onbehandelde merries (0,1 ng/mL ± 0,4 ; 0,1 ng/mL ± 0,1; 0,02 ng/mL ± 0,1) en ruinen (afwezig; 0,02 ng/mL ± 0,1; 0,10 ng/mL ± 0,4). In deze studie werd er net als in de studie van Decloedt et al. (2015) opgemerkt dat ADD en AED samen met boldenone en testosteron kunnen voorkomen. Dit kan de omzetting van ADD naar boldenone en AED naar testosteron bevestigen. Deze omzetting gebeurt via het enzyme 17βhydroxysteroïddehydrogenase (Popot et al., 2008). Bij mensen komt dit enzyme in het hoogste aantal cellen in het lichaam voor (Labrie et al.; 1997) in tegenstelling tot bij paarden, waar het enkel in de testes en epididymis van hengsten kan teruggevonden worden. Bij merries kan dit enzyme ook teruggevonden worden ter hoogte van de baarmoeder en ovaria (Lemazurier en Seralini, 2002). Verder onderzoek naar de exacte oorsprong van boldenone en zijn voorlopers is echter nog nodig (De Branbander et al., 2004; Popot et al., 2008; Decloedt et al., 2015). Mogelijks zou er ook een link bestaan tussen verhoogde concentraties aan AAS en glucocorticoïden. In deze studie werd er bij een merrie een verhoogde concentratie aan testosteron, maar ook boldenone en AED gedetecteerd een maand na behandeling met glucocorticoïden en NSAID’s. Verder onderzoek en opvolging van behandelde patiënten met hun detecteerbare letsels is hiervoor noodzakelijk.
39
Besluit Deze studie had als doel een beter beeld te krijgen van het endogeen voorkomen van lage concentraties AAS. Deze lage concentraties kunnen met de huidige gevoelige technieken gedetecteerd worden, waardoor dit mogelijks foutief geïnterpreteerd kan worden als dopinggebruik. Om deze reden werden er door de IHFA en FEI reeds drempelwaarden ingesteld voor boldenone voor hengsten (15 ng/mL), maar niet voor ruinen en merries (Ho et al., 2004; Popot et al.,2008). Deze studie bevestigtdat boldenone op enkele uitzonderingen na vooral bij hengsten voorkomt. Ook voor testosteron werden er drempelwaarden opgesteld. Bij merries mag testosteron niet boven 55,5 ng/mL gaan terwijl bij ruinen de grens op 20 ng/mL ligt (Popot et al., 2004). Deze studie toont echter aan dat de marge waarin de endogene levels variëren zeer sterk uiteenloopt,vooral bij merries en ruinen. Verdere vaststellingen zijn het voorkomen lage concentraties testosteron en progesteron bij alle geslachten. Ook de concentraties aan ADD, AED en boldenone blijven laag. Enkel β-testosteron blijkt hoog bij hengsten. Daarnaast is er ook mogelijk een rol van microbiële omzetting van fytosterolen naar anabole steroïden, waardoor lage concentraties AAS mogelijk zijn bij alle geslachten zonder dopinggebruik. In deze richting is bijkomend onderzoek noodzakelijk.
40
Bronnen 1. Ayotte C. (2010) ) Doping in sports: biochemical principles, effects and analysis handbook of experimental pharmacology, Vol 195, hoofdstuk 4: Detecting the administration of endogenous anabolic androgenic steroids, Springer, München, e-book: ISBN: 978-3-540-79088-4 , p 78-99. 2. Bahrke, M.S. and Yesalis C.E. (2004) Abuse of anabolic androgenic steroids and related substances in sport and excercise, Curr. Opin. Pharmacol., Vol 4, no 6, p 614-620. 3. Baker M.E., Nelson D.R., Studer R.A. (2014) Origin of the response to adrenal and seks steroids: roles of promiscuity and co-evulution of enzymes and steroid receptors, Journal of steroid biochemistry & molecular biology, p 1-13. 4. Balssa F., Fischer M., Bonnaire Y. (2011) Easy steroselective synthesis of 5α-estrane-3β, 17αdiol, the major metaolite of nandrolone in the horse, Steroids, Vol 76, p 667-668. 5. Barnard G., Bradlow H.L., Budensinsky M., Calverley M.J., Fraser R., Görög S., Goto J., Gower D.B., Griffiths W.J., Holder G., Honour J.W., Houghton E.,Ingram M.C.; Jones G., Krasal A., Kaufmann M.,
Kicman A.T.,Makin H.I.J., Mano N., Middle J.G., Setchell K.D.R., Shackleton
C.H.I., Sjövall J., Stewart P., Wheeler M.J., Wood P.J., (2010) Steroïd Analysis Springer, tweede druk, hoofdstuk 9: Anabolic steroids: Metabolism, doping and detection in human and equestrian sports, p 743-836, ISBN 978-1-4020-9775-1, e-book. 6. Bhasin S., Woodhouse L., Storer T.W. (2001) Hormones and Sport: proof of the effect of testosterone on skeletal muscle, Journal of Endocrinology, Vol 170, p 27-38. 7. Blikslager A.T. (2002) Consider human NSAIDs to nurse pain in horses. Geconsulteerd op 23/4/2015 http://veterinarynews.dvm360.com/consider-human-nsaids-nurse-pain-horses 8. Brinsko S.P., Blanchard T.L., Varner D.V., Schumacher J., Love C.C., Hinrichs K., Hartman D.(2011) Manuel of Equine Reproduction, Moby Inc Elsevier, USA, Missouri, p42-43. 9. Brower, K.J. (2002) Anabolic steroid abuse and dependence, Current Psychiatry Reports, Vol 4, p 377-387. 10. Buiarelli F., Cartoni G.P., Coccioli F., Giannetti L., Merolle M., Neri B., Terracciano A. (2005) Detection of boldenone and its major metabolites by liquid chromatography – tandem mss spectrometry in urine samples, Analytica Chimica Acta, Vol 552, p 116-126. 11. Cannizzo F.T., Zancanaro G., Spada F., Mulasso C., Biolatti B. (2007) Pathology of the testicle and seks accessory glands following the administration of boldenone and boldione as growth promotors in veal calves, Journal of Veterinary Medical Science, Vol 69; No 11, p 1109-1116. 12. Carnegie Mellon University(2006) Department of biological sciences: interactive animations, geconsulteerd op 24 februari 2015 (http://telstar.ote.cmu.edu/biology/MembranePage/index2.html) 13. Clark A.S., Henderson L.P. (2003) Behavioral and phsiological responses tot anabolic-androgenic steroids, Neuroscience and biobehavioral reviews, Vol 27, p413-436.
41
14. De Brabander H.F., Poelmans S., Schilt R., Stephany R.W., Le Bizec B., Draisci R., Sterk S.S., van Ginkel L.A., Courtheyn D., Van Hoof N., Marcrì A., De Wash K. (2004) Presence and metabolism of the anabolic steroid boldenone in various animal species: a revieuw, Food Additives and Contaminants, Vol 21, No 6, p515-525. 15. Decloedt A., Vanden Bussche J., Popot M.-A., Bonnaire Y., Vanhaecke L. (2015) A validated UHPLC-MS/MS method to quantify low levels of anabolic-androgenic steroids naturally present in urine of untreated horses, Analytical Bioanal Chem, 16. Dence J.B. (1980) Steroids and peptides, John Wiley & Sons Inc, Toronto, p 1- 157. 17. De Ronde W. (2008) Gebruik van androgene anabole steroïden voor en tijdens de Olympische Spelen; verminderd maar niet verdwenen, Nederlands Tijdschrift Geneeskunde, Vol 152, p 18201824. 18. Duntas L.H., Popovic V. (2013) Hormones as doping in sports, Endocrine, Vol 43, p 303-313. 19. Evans, N.A. (2004) Current concepts in anabolic-androgenic steroids, The American Journal of Sports Medicine, Vol 32, p 534-542. e
20. FEI (2014) Equine Anti-Doping and controlled medication regulations, 2 editie welk in gaat op 1/1/2015. Geconsulteerd op 28/12/2014. http://d2ig246cioy4di.cloudfront.net/cdn/farfuture/Xfvtp8SadxRMIr7OSNJ4Mf6VtekNi6VsK00qQST YjhA/mtime:1418917611/sites/default/files/2015%20EADCMRs%20%20Mark%20Up%20Version%20%20Showing%20Changes%20from%202014%20EADCMRs.pdf 21. FEI 2 (2015) Anti-dopung & controlled medication. (Geconsulteerd op 28/12/2014) http://www.fei.org/fei/horse-health-and-welfare/doping-controlled-medication
22. FEI 3 (2015) 2015 Equine Prohibited substance list, geconsulteerd op 28/12/2015. https://www.fei.org/system/files/2015%20Equine%20Prohibited%20S...nces%20List.pdf 23. Fitch K. (2012) Proscribed drugs at the olympic games: permitted use and misuse (doping) by athletes, Clinical Medicine, Vol 12, no 3, p 257-260. 24. FNCF (2015) Le contrôle antidopage: des moyens à la hauteur des enjeux, geconsulteerd op 28 april 2015 online, http://www.fncf.fr 25. Gray B.P., Viljanto M., Bright J., Pearce C., Maynard S. (2013) Investigations into the feasibility of routine ultra high performace liquid chromotagraphy-tandem mass spectrometry analysis of equine hair samples for detecting the misuse of anabolic steroids, anabolic steroid esters and related compounds, Analytica chimica acta, Vol 787, p 163-172. 26. Guan F., Uboh C.E., Soma L.R., You Y., Li X., McDonnell S. (2012) Ex vivo spontaneous generation of 19-norandrostenedione and nandrolone detected in equine plasma and urine, Journal of steroid biochemistry & molecular biology, Vol 128, p1-11. 27. Hartgens F., Kuipers H. (2004) Effects of Androgenic-Anabolic steroids in athletes, Sports Med., Vol 34, no 8, p513-554. 28. Ho E.N.M., Yiu K.C.H., Tang F.P.W., Dehennin L., Plou P., Bonnaire Y., Wan T.S.M. (2004) Detection of endogenous boldenone in the entire male horse, Journal of Chromatography B, Vol 808, p 287-294.
42
29. Houghton E., Maynard S. (2010) Doping in sports: biochemical principles, effects and analysis handbook of experimental pharmacology, Vol 195, hoofdstuk 17: Some aspects of doping and medication control in equine sports, Springer, München, e-book: ISBN: 978-3-540-79088-4 , p 369-409. 30. Hyyppä S., Räsänen L.A., Persson S.G.B., Reeta Pösö A. (1995) Excersis performance indices in normal and anabolic steroid treated trotters, Equin vet. Suppl., Vol 18, p443-447. 31. Hyyppä (2001) Effects of nandrolone treatment on recovery in horses after strenuous physical excercise, J. Vet. Med., Vol 48, p 343-352. 32. Jabroski J.M. (2008) Reining in the horse racing industry: a proposal for federal regulation of steroid
use
in
racinghorses,
geconsulteerd
op
12
maart
2015,
Heinonline:
(http://heinonline.org/HOL/Page?handle=hein.journals/kjequinan1&div=7&g_sent=1&collection=jo urnals) 33. Kicman A.T. (2010) Doping in sports: biochemical principles, effects and analysis handbook of experimental pharmacology, Vol 195, hoofdstuk 2: Biochemical and physiological aspects of endogenous androgens, Springer, München, e-book: ISBN: 978-3-540-79088-4 , p 26-64. 34. Kioussi M.K., Lyris E.M., Angelis Y.S., Tsivou M., Koupparis M.A., Georgakopoulos C.G. (2013) A generic screening methodology for horse doping control by LC-TOF-MS, GC-HRMS and GS-MS, Journal of Chromatography B, Vol 941, p69-80. 35. Kohler R.M.N., Lambert M.I. (2002) Urine nandrolone metabolites: fals positive doping test?, bjsportmed, Vol 36, p325- 329. 36. Labrie F., LuuThe V., Lin S.X., Labrie C., Simard J., Breton R., Bélanger A. (1997) The key role of 17-β-hydroxysteroid dehydrogenase in sex steroid biology, Steroids, Vol 62, p 148-158. 37. Le Bizec B., Monteau F., Gaudin I., André F. (1999) Evidence for the presence of endogenous 19norandrosterone in humane urine, Journal of Chromatography B, Vol 723, p157-172. 38. Le Bizec B., Courant F., Gaudin I., Bichon E., Destrez B., Schilt R., Draisci R., Monteau F., André F. (2006) Criteria to distinguish between natural situations and illegal use of boldenone, boldenone esters and boldione in cattle. Metabolite profiles of boldenone, boldenone esters and boldione in cattle urine, Steroids, Vol 71, No 13, p 1078-1087. 39. Lemazurier E., Seralini G.E. (2002) Evidence for sulfatase and 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 activities in equine epididymis and uterus, Theriogenology, Vol 58, p113121. 40. Leme de Souza G., Hallak J. (2011) Anabolic steroids and male infertility: a comprehensive revieuw, BJU internationale, Vol 108, p1860-1865. 41. Leung D.K.K., Tang F.P.W., Wan T.S.M., Wong J.K.Y. (2011) Identification of cryptorchidism in horses by analysing urine samples with gas chromatography/mass spectrometry, The Veterinary Journal, Vol 187,p60-64. 42. Maravelias C., Dona A., Stefanidou M., Spiliopoulou C. (2005) Adverse effects of anabolic steroids in athletes: a constant threat, Toxicology Letters, Vol 158, p167-175. 43. McCue P.M., Roser J.F., Munro C.J., Liu I.K.M., Lasley B.L. (2006) Granulosa cell tumors of the equine ovary, Vet Clin N Am-Equine Vol 22, p 799-817.
43
44. Moeller B.C., Stanley S.D. (2012) The development and validation of a turbulent flow chromatography-tandem mass spectrometry method for the endogenous steroid profiling of equine serum, Journal of Chromatography, Vol 905, p1-9. 45. Montgomery R., Dryer R.L., Conway T.W. Spector A.A. (1980) Biochemistry: A case-oriented apprach, London, p439-486. 46. Muller R.K. (2010) Doping in sports: biochemical principles, effects and analysis handbook of experimental pharmacology, Vol 195, hoofdstuk 1: History of doping and doping control, Springer, München, e-book: ISBN: 978-3-540-79088-4 , p 1-19. 47. Nederlands Vereniging voor Klinische Chemie en Laboratoriumgeneeskunde – NKVC (2010) Oestradiol, geconsulteerd op 24 februari 2015 (http://www.uwbloedserieus.nl/aanvraagformulier.php?id=265) . 48. Parr M.K., Flenker U., Schänzer W. (2010) Sport-Related issues and biochemistry of natural and systhetic anabolic substances, Endocrinol Metab Clin N Am, Vol 39, 45-57. 49. Popot M.A., Boyer S., Menaut L., Garcia P., Bonnaire Y., Lesage D. (2008) Boldenone, testosterone and 1,4-androstadiene-3,17-dione determination in feces form horses, untreated and after administration of androsta-1,4-diene-3,17-dione (boldione), Biomedical Chromatography, Vol 22, p 662-670. 50. Pu F., McKinney A.R., Stenhouse A.M., Suann C.J., McLeod M.D. (2004) Direct detection of boldenone sulfaat and glucuronide conjugates in horse urine by ion trap liquid chromatographymass spectrometry, Journal of Chromatography B- Vol 813, p 241-246. 51. Ros M.M., Sterk S.S., Verhagen H., Stalenhoef A.F.H., De Jong N. (2007) Phytosterol consumptie and the anabolic steroid boldenone in humans: a hypothesis piloted, Food Additives and contaminants, Vol 24, No 7, p 679-684. 52. Schänzer, W., (1996) Metabolism of anabolic androgenic steroids, Clinical Chemistry, Vol 42, p1001-1020. 53. Sgoifo Rossi C.A., Arioli F., Bassini A., Chiesa L.M., Dell’Orto V., Montana M., Pompa G. (2004) Evidence for false-positive results for boldenone testing of veal urine due to faecal crosscontamination during sampling, Food Additives and contaminants, Vol 21, No 8, p 756-762. 54. Sjöqvist F., Garle M., Rane A. (2008) Use of doping agents, particalary anabolic steroids, in sports and society, Lancet, Vol 371, p1871-1882. 55. Skrabalak D.S. en Maylin G.A. (1981) Dexamethasone metabolisme in the horse, Equine drug testing and research program, p233-244. 56. Soma L.R., Uboh C.E., Guan F., McDonnell, Pack J. (2007) Pharmacokinetics of boldenone and stanozolo and the results of quanticifatcion of anabolic and androgenic steroids in race horses and nonrace horses, Journal of Veterinary Pharmalogical Therapy, Vol 30, No 2, p101-108. 57. Soma L.R., Uboh C.E., You Y., Guan F., McDonnell S. (2011) Plasma concentrations of testosterone en nandrolone in racing and non racing intact male horses, Journal of veterinary pharmacology and therapeutics, Vol 35, p 132-138. 58. Squires E.L., Todter G.E., Berndtson W.E., Pickett B.A. (1982) Effect of anabolic steroids on reporductive function of young stallions, Journal of Animal Science, Vol 54, No 3, p 576 – 582.
44
59. Strano-Rossi S., Castrigano E., Anzillotti L., Odoardi S., De-Giorgio F., Bermejo A., Pascali V.L. (2013) Screening for exogenous androgen anabolic steroids in human hair by liquid chromatography/ orbitrap-high resolution mass spectrometry, Analytica chimica Acta., Vol 793, p61-71. 60. Tantuco K., Deretey E., Csizmadia I.G. (2000) Stabilities for the eight isometric forms of the steroid skeleton (perhydrocyclopentanophenanthrene, Vol 53, p97-111. 61. Toutain P-L. (2010) Handbook of experimental pharmacology 199: Comparative and Veterinary Pharmacolgy, Hoofdstuk 11: Drug residues deel Veterinary medicines and compitition animals: the question of medication versus doping control, Springer-Verlag, Berlijn, p 315-339, e-book: ISBN 978-3-642-10324-7. 62. Ungemach F.R. (1985) Doping control in race horses, Tieranztl. Prax., Vol 13, no 1, p35-53. 63. Van Rossum J.M. (1988) Anabolica voor mensen, p1-80. 64. Ven S. (2015) Les 2/4/2015 optie paard 2014-2015: Medicatie en doping bij wedstrijd paarden, Universiteit Gent dienst inwendige ziekten. Les bijgewoond op 2/4/2015. 65. Wong J.K.Y, Wan T.S.M. (2014) Doping control analyses in horseracing: a clinician’s guide, The veterinary journal, vol 200, p8-16. 66. Wright F., Bricout V., Doukani A., Bongini M. (2000) Nandrolone et norstéroïds: substance endogènes ou xenobiotiques?, Science @Sports, Vol 15, p111-124. 67. Yamada M., Kinoshita K., Kurosawa M., Saito K., Nakazawa H. (2007) Analysis of exogenous nandrolone metabolite in horse urine by gas chromatography/ combustion/carbon isotope ratio mass spectrometry, Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, vol 45, p 654-658. 68. You Y., Uboh C.E., Soma L.R., Guan F., Liu Y., Rudy J.A., Chen J., Tsang D. (2011) Simultaneous separation and determination of 16 testosterone and nandrolone esters in equine plasma using ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for doping control, Journal of chromatrography A, Vol 1218, p 3982-3993.
45
