Élelmiszer-mikrobiológia Deák, Tibor Kiskó, Gabriella Maráz, Anna Mohácsiné Farkas, Csilla
Élelmiszer-mikrobiológia Deák, Tibor Kiskó, Gabriella Maráz, Anna Mohácsiné Farkas, Csilla
Publication date 2006 Szerzői jog © 2006 Deák Tibor, Kiskó Gabriella, Maráz Anna, Mohácsiné Farkas Csilla
Tartalom Tudományos nevek rövidítései ....................................................................................................................................................................... xviii Egyéb rövidítések .................................................................................................................................................................................. xix Bevezető ....................................................................................................................................................................................................... xx Az élelmiszer-mikrobiológia tárgya és feladata ........................................................................................................................................... xx Az élelmiszer-mikrobiológia története ....................................................................................................................................................... xxi 1. Élelmiszerek mikrobiális ökológiája ................................................................................................................................................................ 1 A mikrobiális ökológia fogalmai és elvei ..................................................................................................................................................... 1 Ökológiai tényezők .................................................................................................................................................................................. 5 A szennyeződés forrásai és közvetítői, a mikroorganizmusok megtelepedése .............................................................................................. 5 A mikroorganizmusok tulajdonságai .................................................................................................................................................... 6 Az élelmiszer belső tulajdonságai ..................................................................................................................................................... 11 Külső környezeti tényezők ............................................................................................................................................................... 15 Az ökológiai tényezők kölcsönhatásai ................................................................................................................................................ 18 2. A mikroorganizmusok szaporodása és pusztulása ............................................................................................................................................. 19 Mikroorganizmusok szaporodása .............................................................................................................................................................. 19 A szaporodás kinetikai törvényszerűségei ........................................................................................................................................... 19 A szakaszos szaporodási görbe ......................................................................................................................................................... 21 Szaporodást befolyásoló tényezők ..................................................................................................................................................... 25 Fonalas mikroorganizmusok szaporodása ........................................................................................................................................... 29 Mikroorganizmusok pusztulása ................................................................................................................................................................. 29 Pusztulási kinetika .......................................................................................................................................................................... 30 Nem exponenciális pusztulási kinetika ............................................................................................................................................... 33 A pusztulást befolyásoló tényezők .................................................................................................................................................... 35 Mikroorganizmusok rezisztenciája ............................................................................................................................................................. 35 Stresszválaszok .............................................................................................................................................................................. 36 Sejtek sérülése, kijavítása és túlélése ................................................................................................................................................. 37 3. A mikroorganizmusok áttekintése .................................................................................................................................................................. 39 A mikroorganizmusok helye az élővilágban ................................................................................................................................................ 39 Baktériumok .......................................................................................................................................................................................... 42 Proteobaktériumok .......................................................................................................................................................................... 44 Aerob Gram-negatív baktériumok ..................................................................................................................................................... 46 Fakultatív anaerob Gram-negatív baktériumok .................................................................................................................................... 50 Gram-pozitív baktériumok Firmicutes törzse ....................................................................................................................................... 54 Tejsavbaktériumok ......................................................................................................................................................................... 55 Bacillus és rokon nemzetségek ......................................................................................................................................................... 61 iii
Élelmiszer-mikrobiológia Clostridium és rokon nemzetségek .................................................................................................................................................... 65 Az endospóra ................................................................................................................................................................................ 72 Gram-pozitív baktériumok Actinobacteria törzse ................................................................................................................................. 75 Gombák ................................................................................................................................................................................................ 77 Élesztőgombák ............................................................................................................................................................................... 79 Penészgombák ............................................................................................................................................................................... 86 4. Élelmiszerrel terjedő kórokozók .................................................................................................................................................................... 95 Alapfogalmak ........................................................................................................................................................................................ 95 A patogenitás tényezői .................................................................................................................................................................... 95 A gazdaszervezet védekezése ........................................................................................................................................................... 98 Környezeti tényezők ....................................................................................................................................................................... 99 Élelmiszer okozta megbetegedések .......................................................................................................................................................... 100 Salmonella enterica ....................................................................................................................................................................... 103 Escherichia coli ............................................................................................................................................................................ 105 Shigella dysenteriae ...................................................................................................................................................................... 106 Yersinia enterocolitica ................................................................................................................................................................... 107 Vibrio cholerae ............................................................................................................................................................................ 107 Campylobacter jejuni .................................................................................................................................................................... 107 Staphylococcus aureus ................................................................................................................................................................... 108 Listeria monocytogenes ................................................................................................................................................................. 108 Bacillus cereus ............................................................................................................................................................................. 109 Clostridium botulinum ................................................................................................................................................................... 109 Clostridium perfringens ................................................................................................................................................................. 110 Mikotoxinogén penészgombák ................................................................................................................................................................ 110 Mikotoxinogén Aspergillus fajok ..................................................................................................................................................... 115 Mikotoxinogén Penicillium fajok .................................................................................................................................................... 116 Mikotoxinogén Fusarium fajok ....................................................................................................................................................... 117 Egyéb mikotoxintermelő penészgombák ........................................................................................................................................... 118 Vírusok ............................................................................................................................................................................................... 118 Paraziták ............................................................................................................................................................................................. 119 5. Tartósítási módszerek mikrobiológiája .......................................................................................................................................................... 121 Hőkezelés ............................................................................................................................................................................................ 122 A mikroorganizmusok hőtűrése ....................................................................................................................................................... 123 A hőtűrést befolyásoló tényezők ..................................................................................................................................................... 124 A hőkezelés méretezése ................................................................................................................................................................. 125 Hőelvonás ........................................................................................................................................................................................... 130 A mikroorganizmusok hidegtűrése ................................................................................................................................................... 130
iv
Élelmiszer-mikrobiológia A hűtés hatásai ............................................................................................................................................................................ A fagyasztás hatásai ...................................................................................................................................................................... Fagyasztva szárítás ....................................................................................................................................................................... Vízelvonás .......................................................................................................................................................................................... A mikroorganizmusok vízigénye ..................................................................................................................................................... A vízelvonásos tartósítás ............................................................................................................................................................... Besugárzás .......................................................................................................................................................................................... Ultraibolya sugárzás ...................................................................................................................................................................... Ionizáló sugárzás .......................................................................................................................................................................... Kémiai tartósítási módszerek .................................................................................................................................................................. Hatásmechanizmus ........................................................................................................................................................................ Szerves sav tartósítószerek ............................................................................................................................................................. Szervetlen tartósítószerek ............................................................................................................................................................... Természetes antimikrobás anyagok .................................................................................................................................................. Kombinált tartósítás .............................................................................................................................................................................. A „gát elv” .................................................................................................................................................................................. Szabályozott légterű tárolás ............................................................................................................................................................ Módosított légterű csomagolás ........................................................................................................................................................ Kombinált módszerrel tartósított, újszerű termékek ............................................................................................................................ Új technológiák .................................................................................................................................................................................... Hőelektromos eljárások ................................................................................................................................................................. Pulzáló energiájú módszerek .......................................................................................................................................................... Nagy hidrosztatikus nyomás ........................................................................................................................................................... 6. Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek ....................................................................................................................................... Az élelmiszer-ipari erjesztések típusai ...................................................................................................................................................... Tejsavasan erjesztett élelmiszerek ............................................................................................................................................................ A tejsavas erjedés mikrobiológiája .................................................................................................................................................. Erjesztett tejtermékek .................................................................................................................................................................... Fermentált húskészítmények ........................................................................................................................................................... Fermentált zöldségek ..................................................................................................................................................................... Probiotikumok és prebiotikumok ..................................................................................................................................................... Biogén aminok és eredetük tejsavasan erjesztett termékeknél ............................................................................................................... Alkoholosan erjesztett termékek .............................................................................................................................................................. A sörgyártás technológiája ............................................................................................................................................................. A borkészítés technológiája ............................................................................................................................................................ Egyéb, nem szőlőből készült alkoholosan erjesztett italok .................................................................................................................... Desztillált szeszes italok ................................................................................................................................................................
v
133 134 136 136 137 138 140 140 141 144 145 146 148 150 155 155 157 157 158 158 159 160 161 163 164 165 165 167 175 180 186 186 187 189 198 205 206
Élelmiszer-mikrobiológia Szeszgyártás (etanolgyártás) ........................................................................................................................................................... Borecetkészítés ............................................................................................................................................................................. Sütőélesztő-gyártás ............................................................................................................................................................................... Kenyérgyártás .............................................................................................................................................................................. Vegyes mikrobás erjesztési folyamatokkal készített termékek ....................................................................................................................... Koji alapú termékek ...................................................................................................................................................................... Tempe ........................................................................................................................................................................................ Vegyes erjesztésű italok ................................................................................................................................................................ Kávé, kakaó ................................................................................................................................................................................ 7. Az élelmiszer-feldolgozás mikrobiológiája .................................................................................................................................................... Növényi nyersanyagok betakarítása, szállítása ........................................................................................................................................... Növényi termékek feldolgozó műveletei ................................................................................................................................................... A szennyeződést csökkentő feldolgozóműveletek ............................................................................................................................... A szennyeződést növelő feldolgozóműveletek ................................................................................................................................... Állatok vágása, előfeldolgozása .............................................................................................................................................................. Sertés vágása ............................................................................................................................................................................... Szarvasmarha vágása ..................................................................................................................................................................... Baromfi-feldolgozás ...................................................................................................................................................................... A technológiai vonalak mikrobiológiája ................................................................................................................................................... Higiéniai követelmények ........................................................................................................................................................................ Üzemtelepítés .............................................................................................................................................................................. Vízminőség ................................................................................................................................................................................. Takarítás, tisztítás, fertőtlenítés ....................................................................................................................................................... Tisztító- és fertőtlenítőszerek .......................................................................................................................................................... Biofilmek .................................................................................................................................................................................... Hulladékkezelés, szennyvíztisztítás .................................................................................................................................................. Csomagolás, szállítás, raktározás ............................................................................................................................................................. Csomagolás ................................................................................................................................................................................. Szállítás ...................................................................................................................................................................................... Tárolás, raktározás ........................................................................................................................................................................ Kereskedelem, vendéglátóipar, házi ételkészítés ......................................................................................................................................... 8. Termékek mikrobiológiája, romlása ............................................................................................................................................................. Húsféleségek mikrobiotája és romlása ...................................................................................................................................................... A hús érése ................................................................................................................................................................................. A hús romlása ............................................................................................................................................................................. Az elsődleges húsfeldolgozás mikrobiológiája ................................................................................................................................... Tartósítási eljárások a húsiparban ....................................................................................................................................................
vi
206 207 207 208 208 209 209 209 210 211 211 213 213 214 215 216 218 218 218 220 220 221 221 223 226 227 228 228 229 229 230 233 234 234 234 237 238
Élelmiszer-mikrobiológia Húskészítmények mikrobiológiája ................................................................................................................................................... Baromfihús .................................................................................................................................................................................. Halak .......................................................................................................................................................................................... Vadhús ....................................................................................................................................................................................... Tej, tejtermékek, tojás ........................................................................................................................................................................... Tej ............................................................................................................................................................................................. Tejtermékek ................................................................................................................................................................................. Sajtok ......................................................................................................................................................................................... Tojás .......................................................................................................................................................................................... Zöldség- és gyümölcsfélék ..................................................................................................................................................................... Növényi nyersanyagok romlása ....................................................................................................................................................... Szárítmányok ............................................................................................................................................................................... Fagyasztott zöldség- és gyümölcsfélék ............................................................................................................................................. Gyümölcslevek, üdítőitalok .................................................................................................................................................................... A mikrobás szennyeződés forrásai ................................................................................................................................................... Gabona-, malom- és sütőipari termékek ................................................................................................................................................... Gabonatárolás .............................................................................................................................................................................. Malomipari termékek .................................................................................................................................................................... Sütő- és tésztaipari termékek .......................................................................................................................................................... Cukor- és édesipari termékek ................................................................................................................................................................. Cukorgyártás ................................................................................................................................................................................ Édesipari termékek ....................................................................................................................................................................... Méz ............................................................................................................................................................................................ Ízesítők, fűszerek .................................................................................................................................................................................. Növényolaj, margarin ............................................................................................................................................................................ Kávé, tea ............................................................................................................................................................................................. Palackozott vizek .................................................................................................................................................................................. Tartósított termékek .............................................................................................................................................................................. Teljes konzervek .......................................................................................................................................................................... Fél- és háromnegyed konzervek ...................................................................................................................................................... Gyorsfagyasztott termékek ............................................................................................................................................................. Vendéglátó-ipari és hidegkonyhai készítmények ........................................................................................................................................ 9. Élelmiszerek biztonsága és minősége ........................................................................................................................................................... Az élelmiszer-biztonság általános kérdései ................................................................................................................................................ Minőségirányítási rendszerek .................................................................................................................................................................. A HACCP módszer ...................................................................................................................................................................... Kockázatelemzés ..........................................................................................................................................................................
vii
241 244 245 246 246 247 248 249 250 251 252 255 256 257 258 259 259 260 261 262 262 262 263 263 264 264 265 267 267 270 270 271 273 273 274 275 276
Élelmiszer-mikrobiológia Prediktív mikrobiológia ......................................................................................................................................................................... Mikrobiológiai minőségellenőrzés ........................................................................................................................................................... Fázisvizsgálatok ........................................................................................................................................................................... Késztermék-minősítés .................................................................................................................................................................... 10. Mikrobiológiai vizsgálati módszerek ........................................................................................................................................................... A mikrobiológiai módszerek alapjai ......................................................................................................................................................... Mintavétel és előkészítés ............................................................................................................................................................... Tápközegek ................................................................................................................................................................................. Tenyésztés, izolálás, fenntartás ....................................................................................................................................................... Mennyiségi meghatározási módszerek ...................................................................................................................................................... Lemezöntés és szélesztés ............................................................................................................................................................... A legvalószínűbb sejtszám módszere ............................................................................................................................................... A mikrobaszámbecslés közvetett módszerei ...................................................................................................................................... Összes sejtszám meghatározása ....................................................................................................................................................... A mikroorganizmusok meghatározása, azonosítása ..................................................................................................................................... Alaktani és mikroszkópos módszerek ............................................................................................................................................... Élettani vizsgálati módszerek .......................................................................................................................................................... Biokémiai vizsgálati módszerek ...................................................................................................................................................... Szerológiai vizsgálatok .................................................................................................................................................................. Mikrobiológiai gyors módszerek ............................................................................................................................................................. Hagyományos módszerek gyorsítása és automatizálása ....................................................................................................................... A direkt sejtszámlálás újabb módszerei ............................................................................................................................................ Kémiai módszerek ........................................................................................................................................................................ Fizikai módszerek ......................................................................................................................................................................... Immunológiai módszerek ....................................................................................................................................................................... Molekuláris módszerek .......................................................................................................................................................................... Izolált DNS közvetlen vizsgálata: az RFLP analízis ........................................................................................................................... Molekuláris hibridizációs módszerek ............................................................................................................................................... PCR alapú technikák ..................................................................................................................................................................... A PCR alapú módszer változatai ..................................................................................................................................................... Nukleinsavak szekvenálása ............................................................................................................................................................. Újabb korszerű molekuláris módszerek ............................................................................................................................................ Rekombináns DNS technológia ............................................................................................................................................................... A génsebészet gyakorlati alkalmazásai ............................................................................................................................................. A géntechnológiai tevékenység szabályozása ..................................................................................................................................... Genomika az élelmiszeriparban ............................................................................................................................................................... A genomika kialakulása .................................................................................................................................................................
viii
278 279 280 281 285 285 286 286 287 290 290 290 291 291 291 293 294 295 296 296 297 300 301 303 307 313 314 316 318 324 329 330 331 332 334 336 337
Élelmiszer-mikrobiológia Mikroorganizmusok és többsejtű szervezetek genomjai ....................................................................................................................... Funkcionális genomika .................................................................................................................................................................. A genomika alkalmazásai .............................................................................................................................................................. 11. Forrásmunkák és ajánlott irodalom .............................................................................................................................................................
ix
338 342 345 349
Az ábrák listája 1.1. Természetes és mesterséges ökoszisztémák .................................................................................................................................................... 2 1.2. Élelmiszerek mikroökológiájának elvei .......................................................................................................................................................... 4 2.1. Az egysejtű mikroorganizmusok szakaszos szaporodási görbéje. ––– sejtkoncentráció, - - - log sejtkoncentráció, I. lappangási (lag), II. gyorsulási, III. exponenciális (logaritmusos), IV. lassulási, V. állandósult (stacionárius), VI. hanyatlási, VII. pusztulási szakasz ............................................................. 21 2.2. A szaporodási sebességi együttható meghatározása a szakaszos szaporodási görbéből I. lappangási (lag), II. gyorsulási, III. exponenciális (logaritmusos), IV. lassulási, V. állandósult (stacionárius) ..................................................................................................................................... 22 2.3. A szakaszos szaporodási sebességi görbe I. lappangási (lag), II. gyorsulási, III. exponenciális (logaritmusos), IV. lassulási, V. állandósult (stacionárius) ................................................................................................................................................................................................. 23 2.4. A logisztikus egyenlet szerinti szaporodási görbe X: sejtkoncentráció, X0: kezdeti, XV: végső sejtkoncentráció, t: idő ................................................ 24 2.5. A szigmoid alakú túlélési görbét leíró Gompertz-egyenlet N: sejtszám, t: idő; A, B, C, L, M jelentését lásd a szövegben ............................................. 25 2.6. A szaporodási sebesség és a tápanyag-koncentráció összefüggése µ: fajlagos szaporodási sebesség, µm: maximális fajlagos szaporodási sebesség, KS: telítési állandó, S: szubsztrátkoncentráció ........................................................................................................................................................... 26 2.7. A szaporodási sebesség hőmérséklet-függésének Arrhenius-görbéje .................................................................................................................. 28 2.8. A túlélési görbe és a tizedelődési idő (D) .................................................................................................................................................... 31 2.9. Mikrobapopulációk pusztulási görbéi z: rezisztencia jellemző, a tizedelődési időt (D) tizedére csökkentő pusztító hatás mértéke; a növekvő rezisztenciájú populációk: 1 < 2 < 3 ................................................................................................................................................................. 32 2.10. A hőpusztulási görbe és a z-érték .............................................................................................................................................................. 32 2.11. A hőpusztulási görbe egyenlete ................................................................................................................................................................ 33 2.12. Nem exponenciális jellegű túlélési görbék .................................................................................................................................................. 34 2.13. A mikrobasejtek válaszreakciói stresszhatásokra .......................................................................................................................................... 37 3.1. Az élővilág három birodalmának törzsfája a riboszóma kis alegység ribonukleinsavának szekvenciái alapján. A tenyészetekben ismert szervezetek nevein kívül a betű és számjelzések a természeti mintákból izolált nukleinsavval jellemzett, még nem tenyésztett szervezeteket jelölik ................................ 41 3.2. Baktériumok filogenetikai törzsfája a 16S rRNS szekvenciák alapján ................................................................................................................ 43 3.3. A pszeudomonászok energiatermelő anyagcsereútjai ...................................................................................................................................... 47 3.4. Az ecetsavbaktériumok energiatermelő anyagcsereútjai ................................................................................................................................... 49 3.5. A vegyes savas és a butándiolos erjedés vázlata ............................................................................................................................................ 51 3.6. A homo- (A) és a heterofermentatív (B) tejsavas erjedés vázlata ...................................................................................................................... 56 3.7. A tejsavbaktériumok almasavbontásának lehetőségei 1. almasav-dehidrogenáz, 2. almasav-oxidáz, 3. almasav-dekarboxiláz, 4. oxálecetsavdekarboxiláz, 5. tejsav-dehidrogenáz ................................................................................................................................................................. 61 3.8. A bacilusok szénhidráterjesztésének változatai. Végtermékek: 1, B. coagulans; 2+3+4, B. licheniformis, B. cereus; 2+6+8, Paenibacillus polymyxa; 5+6+7+9, P. macerans .................................................................................................................................................................................... 63 3.9. A vajsavas és az aceton-butanolos erjedés vázlata ......................................................................................................................................... 70 3.10. Egyes aminosavak erjesztése a klosztridiumoknál ........................................................................................................................................ 71 3.11. A spórázás és a círázás szakaszai. 1. a kromoszóma (kr) középen helyezkedik el a mezoszomához (ms) kapcsolódva; 2. a válaszfalmembrán (vm) szintézise megindul, a kromoszoma két részre válik; 3. a membrán bekebelezi a citoplazma és a magállomány egy részét, kialakul a kettősmembránú x
Élelmiszer-mikrobiológia előspóra (km: külső, bm: belső membrán); 4. a kortex (k) szintézise; 5. a spórafal (sf) szintézise; 6. a külső (kb) és a belső (bb) spóraburok szintézise; 7. a vegetatív sejt lízise és a spóraérés folyamatai; a) aktiválódás, a spóraállapot megszűnése; b) csírázás, vízfelvétel és duzzadás; c) kihajtás ............................. 73 3.12. A spóraérést jellemző változások. 1. fénytörő képesség, 2. Ca2+-tartalom, 3. dipikolinsav-tartalom, 4. hőrezisztencia, 5. vízaktivitás ............................ 74 3.13. Az élesztő- és a penészgombák helye a gombák rendszerében ........................................................................................................................ 79 3.14. Az élesztőgombák cukor-, aminosav- és kénanyagcseréjéből származó melléktermékek ...................................................................................... 81 3.15. Élesztőgombák vegetatív alakjai. A) egysejtű sarjadzó sejtek (pl. Candida), B) hífafonál sarjadzó sejtekkel (pl. Yarrowia), C) artrokonidiumokra hasadó hífafonál (pl. Galactomyces) .................................................................................................................................................................. 85 3.16. Zigospórás gombák ivartalan szaporítóképletei. A) Mucor spp., B) Rhizopus spp., C) Rhizopus micélium részlete .................................................... 89 3.17. A penicilliumok és az aspergillusok jellegzetes konidiumfejének szerkezete. A) P. chrysogenum (többszörösen elágazó ecset), B) A. parasiticus (egysoros fej), C) A. niger (kétsoros fej) ............................................................................................................................................................ 92 4.1. A baktériumsejt néhány patogenitási faktora ................................................................................................................................................. 96 4.2. Baktériumok fő antigénjei ........................................................................................................................................................................ 104 4.3. Néhány jelentős mikotoxin kémiai szerkezete .............................................................................................................................................. 112 5.1. A hőmérséklet változása a hőkezelés folyamán. A hőközlő közeg ––– és a tartály hidegpontjának - - - hőmérséklete ................................................ 126 5.2. Különböző z értékű, de azonos F értékű hőpusztulási görbék. z = 8, 12 (vagy más) °C-nál az időegyenérték Fi, z = 10 °C-nál Fo (sterilezési egyenérték) .................................................................................................................................................................................................. 127 5.3. A sterilezési egyenérték számítása. A hőbehatolási görbe (---) hőmérsékleteihez tartozó F/τ értékeket felvéve a sterilezési görbéhez (–––) jutunk; e görbe alatti terület egyenlő a sterilezési egyenértékkel (F0, min) ........................................................................................................................... 129 5.4. Termofil (□), mezofil (○) és pszichrofil (∆) mikroorganizmus szaporodásának Arrhenius-görbéje ......................................................................... 132 5.5. A fagyasztási sebesség hatása az Escherichia coli (–––) és a Saccharomyces cerevisiae (- - - -) túlélésére .............................................................. 135 5.6. Szorpciós izoterma és hiszterézis. k: a kritikus vízaktivitáshoz (0,7) tartozó víztartalom ...................................................................................... 139 5.7. A szén-dioxid, a karbonát- és a bikarbonátionok aránya vizes oldatban a pH függvényében ................................................................................. 148 5.8. A kén-dioxid, a biszulfit- és a szulfitionok aránya a pH függvényében ............................................................................................................ 149 5.9. A fűszerek főbb antimikrobás vegyületei .................................................................................................................................................... 153 5.10. A kombinált tartósítás „gát-elve”. F: nagy hőmérséklet, t: hűtés, aw: vízaktivitás, pH: savasság, Eh: redoxpotenciál, Pr: tartósítószer, Km: vetélkedő mikrobiota; az 1–6. esetek leírását lásd a szövegben ........................................................................................................................................... 156 5.11. A nagy hidrosztatikus nyomás hatásai ...................................................................................................................................................... 162 6.1. A savanyú tejkészítmények (joghurt, kefir) gyártási folyamata ....................................................................................................................... 170 6.2. A trappista (félkemény) sajt gyártási folyamata ........................................................................................................................................... 172 6.3. Tejsavasan erjesztett (fermentált) kolbász gyártási folyamata ......................................................................................................................... 178 6.4. A jellemző mikrobacsoportok számának változása a pH függvényében uborka tejsavas erjesztése során ................................................................. 185 6.5. Az alkoholos erjedés főbb biokémiai lépései ............................................................................................................................................... 188 6.6. A sörgyártási technológia műveleti lépései ................................................................................................................................................. 191 6.7. A vörösborkészítés technológiájának főbb lépései és jellemzői ....................................................................................................................... 200 7.1. Hústermékek élelmiszerbiztonsági láncolata az „istállótól az asztalig” ............................................................................................................. 216 7.2. A sertés (A) és a marha (B) vágásának és előfeldolgozásának főbb műveletei ................................................................................................... 217 7.3. Az élelmiszer-forgalmazás általános folyamatábrája ..................................................................................................................................... 230
xi
Élelmiszer-mikrobiológia 7.4. Élelmezési üzem technológiai folyamatábrája .............................................................................................................................................. 231 8.1. A sertéshús kezdeti sejtszámának hatása az eltarthatóságra 4 °C-on ................................................................................................................ 236 8.2. A sertéshús mikrobaszámának változása a tárolási hőmérséklet függvényében ................................................................................................... 237 8.3. A hús mikrobiotájának összetétele hűtött, levegős tároláskor .......................................................................................................................... 239 8.4. A hús mikrobiotájának összetétele vákuumcsomagolt, hűtött húson ................................................................................................................. 240 8.5. A tojás mikrobák elleni védelmi mechanizmusai .......................................................................................................................................... 250 9.1. A minőségirányítási piramis ..................................................................................................................................................................... 275 9.2. A kvantitatív kockázatelemzés elemei ........................................................................................................................................................ 277 9.3. A kockázatkezelés és a HACCP kapcsolata ................................................................................................................................................ 278 9.4. A jó gyártási gyakorlat (GMP) hatása a mikrobás szennyeződés szintjére és hullámzására ................................................................................... 280 9.5. A mikrobiológiai minősítés elve. A minőségjelző mikroorganizmus gyakorisági eloszlása (- - -) és a mintavételi terv alapján meghatározzuk a mintavételi jelleggörbét (–––). Az elfogadási határértéket (m) általában nagyobbra választjuk annál a mikrobaszámnál, amelyet a tétel egységeinek 95%a nem halad meg (ϕ). A tűrési érték (c) az m határnál több mikrobát tartalmazó mintaelemek száma. Kéthatáros minősítésnél M az a legnagyobb mikrobaszám, amelyet egy mintaelem sem léphet túl. Ez az érték egy vagy több nagyságrenddel kisebb, mint a minimális fertőzési vagy romlási mikrobaszám (FR). A mintavételi jelleggörbén (==) V a 95%-ban elutasított, E a 95%-ban elfogadott minőségi szinthez tartozó mikrobaszám ..................... 283 10.1. Lemezöntési és szélesztési módszerek. A: vegyes tenyészet lemezöntéssel, B: izolált telepek szélesztése oltókaccsal, C: izolált telepek készítése hígítással és felületi szélesztéssel .................................................................................................................................................................... 288 10.2. Telepszámlálás hígítási sorral és lemezöntéssel. A 3. hígításból kapott telepszámból számítva (159 × 1000) a mintaszuszpenzió sejtszáma mintegy 1,6 × 105 volt cm3-ként ...................................................................................................................................................................................... 289 10.3. Higiéniai vizsgálat Hygicult lemezzel ....................................................................................................................................................... 298 10.4. Spirál lemez leoltás Petri-csészében ......................................................................................................................................................... 299 10.5. Enterobaktériumok azonosítása API teszttel .............................................................................................................................................. 300 10.6. Az áramlásos citometria működési elve .................................................................................................................................................... 301 10.7. Luminométer ATP kimutatására .............................................................................................................................................................. 302 10.8. A konduktometriás mérés elve ................................................................................................................................................................ 304 10.9. Direkt impedimetriás görbék és a TTD és a sejtszám közötti összefüggés ....................................................................................................... 305 10.10. Saccharomyces cerevisiae indirekt impedimetriás szaporodási görbéje .......................................................................................................... 306 10.11. Az IgG ellenanyag szerkezete ............................................................................................................................................................... 308 10.12. Az ELISA módszer vázlata .................................................................................................................................................................. 311 10.13. A pulzáló gélelektroforézis (PFGE) alkalmazása baktériumok molekuláris tipizálására. Az RFLP mintázatok molekuláris ujjlenyomatnak tekinthetők .................................................................................................................................................................................................. 315 10.14. A polimeráz láncreakció (PCR) lépései ................................................................................................................................................... 320 10.15. A PCR reakciósorozat hőmérsékleti profilja ............................................................................................................................................ 321 10.16. E. coli törzs és O157:H7 szerotípus (A), valamint Yersinia enterocolitica európai szerotípus (B) detektálása specifikus PCR primerpárok segítségével. A: 1. és 2. oszlop: E. coli O157:H7 törzs cél DNS, 3. és 4. oszlop: nem patogén E. coli törzs cél DNS; 1. és 3. oszlop: E. coli faj-specifikus primer párral kapott PCR termékek; 2. és 4.: O157:H7-specifikus primer párral kapott PCR termékek; B: Ye. enterocolitica törzseknél (1. és 2. oszlop) kapott PCR temékek európai szerotípusra specifikus primer pár alkalmazásával; M: DNS molekula méret marker .......................................................................... 324
xii
Élelmiszer-mikrobiológia 10.17. A Sacharomyces bayanus fajon belüli diverzitásának vizsgálata RAPD analízissel. Aszúbor erjesztéséből származó S. bayanus izolátumok RAPD analízise OPA 10 primerrel ............................................................................................................................................................................ 10.18. Campylobacter törzsek flaA génjeinek PCR-RFLP analízise 8: Cb. jejuni típustörzs, 11: Cb. coli típustörzs, a többi Campylobacter izolátum, M: molekulaméret jelző ...................................................................................................................................................................................... 10.19. A fukcionális genomika ....................................................................................................................................................................... 10.20. A genomika alkalmazása a táplálkozás- és élelmiszer-tudományban: a nutrigenomika .....................................................................................
xiii
325 326 342 347
A táblázatok listája 1. A mikrobiológia (biokémia, molekuláris biológia) történetének jelentős eseményei .............................................................................................. xxiii 1.1. Stressztűrő mikroorganizmusok néhány példája .............................................................................................................................................. 3 1.2. Az élelmiszerek mikroökológiai tényezői ....................................................................................................................................................... 4 1.3. Mikroorganizmusok közti kölcsönhatások .................................................................................................................................................... 10 1.4. Mikroorganizmusok szaporodásának minimális vízigénye ............................................................................................................................... 12 1.5. Mikroorganizmusok szaporodásának pH-tartományai ..................................................................................................................................... 13 1.6. A mikroorganizmusok élettani csoportjai szaporodási hőmérséklet szerint* ........................................................................................................ 16 3.1. Baktériumok, archeák és eukarioták közti fő különbségek ............................................................................................................................... 39 3.2. Élelmiszerekben jelentős proteobaktériumok áttekintése .................................................................................................................................. 45 3.3. Fakultatív anaerob proteobaktériumok és a pszeudomonászok főbb jellemzői ..................................................................................................... 50 3.4. A fakultatív anaerob proteobaktériumok erjesztési jellemzői ............................................................................................................................ 51 3.5. Gram-pozitív baktériumnemzetségek összehasonlító tulajdonságai .................................................................................................................... 55 3.6. A tejsavbaktériumok rendszerezésének áttekintése a családok és nemzetségek szintjén ......................................................................................... 57 3.7. Tejsavbaktérium nemzetségekre jellemző alaki és élettani tulajdonságok ........................................................................................................... 58 3.8. A Lactobacillus fajok filogenetikai csoportjai és erjesztési módozatai ............................................................................................................... 59 3.9. Más nemzetségekbe átsorolt Bacillusok és új nemzetségek .............................................................................................................................. 61 3.10. Bacillusok és rokonnemzetségek fajainak különleges tulajdonságai ................................................................................................................. 64 3.11. Élelmiszerek romlását okozó gyakoribb Bacillus és rokonfajok ...................................................................................................................... 64 3.12. Klosztridiumok átsorolása más nemzetségekbe ............................................................................................................................................ 66 3.13. A klosztrídiumok és rokon anaerob spórátlan baktériumok főbb filogenetikai vonalai ......................................................................................... 66 3.14. Klosztrídiumok jellemző élettani tulajdonságai* .......................................................................................................................................... 68 3.15. A vegetatív sejt és az endospóra közti különbségek ...................................................................................................................................... 74 3.16. A gombák országai és osztályozása ........................................................................................................................................................... 77 3.17. Az élesztőgombák gyakorlati jelentősége .................................................................................................................................................... 79 3.18. Természetes élőhelyek néhány gyakori élesztőgomba faja ............................................................................................................................. 82 3.19. Az aszkomicéta és a bazidiomicéta jellegű élesztők közötti alaki és kemotaxonómiai különbségek ........................................................................ 82 3.20. Az élesztőgombák osztályozása (fontosabb családok és példanemzetségek) ...................................................................................................... 83 3.21. Élelmiszerekben gyakori élesztők teleomorf és anamorf alakjai ...................................................................................................................... 85 3.22. Példák a penészgombák gyakorlati jelentőségére .......................................................................................................................................... 87 3.23. A fonalas tömlősgombák (Euascomycotina, Pezizomycotina) osztályainak fő morfológiai jellemzői (Eriksson és Winka rendszere szerint, 2001) ............ 91 3.24. Példák a penészgombák teleomorf és anamorf kapcsolataira .......................................................................................................................... 92 4.1. Az endo- és az exotoxinok tulajdonságai ..................................................................................................................................................... 97 4.2. Élelmiszer által okozott megbetegedések típusai .......................................................................................................................................... 100 4.3. Élelmiszerrel terjedő betegségek áttekintése ................................................................................................................................................ 101 4.4. Magyarországi élelmiszer eredetű mikrobás megbetegedések adatai, 2004 ........................................................................................................ 102 xiv
Élelmiszer-mikrobiológia 4.5. A szalmonellák rendszerezése és elnevezése* .............................................................................................................................................. 4.6. Történeti visszatekintés a mikotoxinokról ................................................................................................................................................... 4.7. A mikotoxinok okozta megbetegedések áttekintése ...................................................................................................................................... 4.8. Fontosabb mikotoxintermelő gombák és előfordulásuk ................................................................................................................................. 4.9. A fontosabb mikotoxinok és gyakoribb termelőik ........................................................................................................................................ 4.10. Humán enterális vírusok csoportjai .......................................................................................................................................................... 4.11. Fontosabb protozoon paraziták ................................................................................................................................................................ 5.1. Stresszhatásokat tűrő mikroorganizmusok példái .......................................................................................................................................... 5.2. Tartósítási módszerek és azok ökológiai tényezőinek áttekintése ..................................................................................................................... 5.3. A mikroorganizmusok átlagos hőtűrése ...................................................................................................................................................... 5.4. Baktérium endospórák hőtűrése ................................................................................................................................................................ 5.5. A hőellenállás fokozódása a vízaktivitás függvényében ................................................................................................................................. 5.6. Spórás baktériumok hőpusztulási jellemzői száraz és nedves hővel való kezeléseknél ......................................................................................... 5.7. Relatív pusztulási sebesség (F/t) különböző hőmérsékleteken, z = 10 °C értéknél .............................................................................................. 5.8. Néhány konzervipari termék Fo sterilezési egyenértéke ................................................................................................................................. 5.9. Élesztőfajok zsírsav-összetételének változása a szaporodási hőmérséklettel ....................................................................................................... 5.10. Élelmiszerekkel terjedő kórokozó baktériumok szaporodási hőmérsékletei (°C) ............................................................................................... 5.11. A hőmérséklet csökkentésének hatása a generációs időre és a lappangási szakaszra .......................................................................................... 5.12. Néhány pszichrofil baktérium generációs ideje .......................................................................................................................................... 5.13. Penészgombák szaporodását gátló vízaktivitás-értékek ................................................................................................................................ 5.14. A penészgombák mikotoxin termelését és szaporodását megengedő vízaktivitások ........................................................................................... 5.15. Különböző száraz élelmiszerek 0,70 aw-hez tartozó százalékos víztartalma ..................................................................................................... 5.16. Mikroorganizmusok 4 log nagyságrendű pusztuláshoz szükséges mértékű sugárzás (254 nm-es) UV sugárzás ....................................................... 5.17. A különböző fejlettségű szervezeteket elpusztító sugárdózisok mértéke .......................................................................................................... 5.18. Élelmiszerek ionizáló sugárkezelésére alkalmazott dózisok .......................................................................................................................... 5.19. Mikroorganizmusok sugártűrése .............................................................................................................................................................. 5.20. Élelmiszerekben alkalmazott kémiai antimikrobás anyagok .......................................................................................................................... 5.21. Gyenge savtermészetű tartósítószerek disszociációja ................................................................................................................................... 5.22. Magyarországon engedélyezett tartósítószerek ........................................................................................................................................... 5.23. Tartósítószerek élelmiszer-ipari alkalmazásai ............................................................................................................................................. 5.24. A természetben előforduló főbb antimikrobás rendszerek ............................................................................................................................. 5.25. Új, alternatív tartósító technológiák előnyei és alkalmazási lehetőségei .......................................................................................................... 5.26. Mikroorganizmusok pusztulási mértéke pulzáló elektromos mező hatására ...................................................................................................... 5.27. Néhány kórokozó baktérium pusztulása nagy hidrosztatikai nyomásra ............................................................................................................ 6.1. A tejsavasan erjesztett élelmiszerek típusai és a jellemző mikroorganizmusok ................................................................................................... 6.2. Erjesztett tejtermékek és az előállításukhoz alkalmazott mikroorganizmusok ..................................................................................................... 6.3. Zöldségek erjesztését befolyásoló ökológiai tényezők ...................................................................................................................................
xv
104 110 112 113 114 118 119 121 122 123 123 124 125 128 129 131 132 133 134 137 138 139 141 141 142 143 144 146 147 147 150 158 160 162 165 167 181
Élelmiszer-mikrobiológia 6.4. Növényeken élő tejsavbaktériumok ............................................................................................................................................................ 182 6.5. A baktériumpopulációk változása a savanyú káposzta erjesztése során ............................................................................................................. 182 6.6. A legfontosabb biogén aminok és a prekurzoraik ......................................................................................................................................... 187 6.7. Alkoholtartalmú italok erjesztésében jelentős élesztőgomba fajok ................................................................................................................... 188 6.8. A legfontosabb alkoholosan erjesztett italok előállításának jellemzői ............................................................................................................... 189 6.9. Az alsóerjesztésű (lager) és felsőerjesztésű (ale) sörélesztő törzsek fiziológiai és genetikai jellemzői ..................................................................... 193 6.10. Sörökben előforduló kozmaolajok ............................................................................................................................................................ 194 6.11. Sörélesztő törzsek nemesítésének céljai és lehetőségei ................................................................................................................................ 196 7.1. A gyümölcs- és zöldségfélék gyakoribb kórokozó és romlást okozó gombakártevői ........................................................................................... 212 7.2. A takarítás, tisztítás és fertőtlenítés folyamatai ............................................................................................................................................ 222 7.3. Az élelmiszeriparban alkalmazott tisztítószerek fajtái és jellemzői .................................................................................................................. 223 7.4. Néhány élelmiszer-ipari fertőtlenítőszer hatásmechanizmusa .......................................................................................................................... 224 7.5. Fertőtlenítő módszerek mikrobiológiai hatékonysága .................................................................................................................................... 225 7.6. Fertőtlenítőszerek tulajdonságainak összehasonlítása ..................................................................................................................................... 225 7.7. Élelmiszer-ipari ágazatokban keletkező szennyvizek jellemzői ....................................................................................................................... 227 7.8. Élelmiszer-ipari üzemekben képződő szennyvíz mennyisége .......................................................................................................................... 228 7.9. A biztonságos ételkészítés öt aranyszabálya ................................................................................................................................................ 231 8.1. Az élelmiszerek főbb termékcsoportjai ....................................................................................................................................................... 233 8.2. A baromfihús mikrobiotájának változása tárolás során .................................................................................................................................. 245 8.3. Tejtermékekben és tojásban gyakran előforduló patogén baktériumok .............................................................................................................. 246 8.4. Tejtermékekben előforduló, mikrobák okozta ízhibák ................................................................................................................................... 247 8.5. Néhány fontosabb zöldség- és gyümölcsféle átlagos pH-értéke ....................................................................................................................... 252 8.6. Friss zöldség- és gyümölcsfélékből, valamint levekből izolált patogén baktériumok ........................................................................................... 253 8.7. Fűszerek antimikrobás hatóanyagainak néhány példája ................................................................................................................................. 263 8.8. Ivóvíz eredetű humán megbetegedések kórokozói ........................................................................................................................................ 266 8.9. A konzervekben előforduló fontosabb spórás baktériumok és az általuk okozott romlás jellege ............................................................................. 268 8.10. A gyorsfagyasztott termékek fő típusai ..................................................................................................................................................... 271 9.1. Az élelmiszer okozta megbetegedések és halálozások fő tényezői (2000. évi franciaországi adatok) ...................................................................... 273 9.2. Élelmiszerellenőrző hatósági szervek ......................................................................................................................................................... 281 9.3. Az élelmiszerek előállítására, forgalmazására és ellenőrzésére vonatkozó fontosabb jogszabályok ......................................................................... 282 10.1. A mikroorganizmusok jellemzésére használt módszerek áttekintése ............................................................................................................... 292 10.2. Mikroorganizmusok vizsgálatára szolgáló fenotípusos jellemzők ................................................................................................................... 292 10.3. Bélbaktériumok meghatározására gyakran alkalmazott vizsgálatok ................................................................................................................ 294 10.4. Immunológiai vizsgálatok ...................................................................................................................................................................... 296 10.5. A hagyományos és az alternatív, illetve gyors módszerek összehasonlítása ..................................................................................................... 297 10.6. A szerológiai reakciók típusai és jellemzői ................................................................................................................................................ 309 10.7. Kereskedelmi forgalomban lévő immunológiai tesztek az élelmiszer eredetű és higiéniai szempontból fontos patogének és toxinok kimutatására .......... 312
xvi
Élelmiszer-mikrobiológia 10.8. Élelmiszer eredetű patogén baktériumok kimutatására alkalmas génpróbák ..................................................................................................... 317 10.9. Élelmiszer eredetű patogén baktériumok kimutatása PCR technikával ............................................................................................................ 322 10.10. Kereskedelmi forgalomban lévő, hibridizáláson és PCR-es amplifikáláson alapuló módszerek élelmiszer eredetű patogének kimutatására .................. 328 10.11. Molekuláris jellemzők alapján leírt, élelmiszerekből izolált, új Candida fajok néhány példája ........................................................................... 329 10.12. Néhány példa heterológ fehérjék előállítására rekombináns élesztőkkel ......................................................................................................... 335 10.13. A molekuláris biológia mérföldkövei ...................................................................................................................................................... 337 10.14. Prokariota kromoszómák teljes genomszekvenciái .................................................................................................................................... 338 10.15. Az élesztő (Sacharomyces cerevisiae) genomjának áttekintése .................................................................................................................... 339 10.16. Teljes eukariota genom szekvenciák ....................................................................................................................................................... 340 10.17. Az emberi genom szekvenciájának áttekintése ......................................................................................................................................... 341 10.18. Jelentősebb genom és fehérje adatbázisok ............................................................................................................................................... 344 10.19. Génfunkciók megoszlása (%) baktérium és élesztőgomba genomokban ........................................................................................................ 346
xvii
Tudományos nevek rövidítései A.
Aspergillus
B.
Bacillus
Br.
Brettanomyces
C.
Candida
Cb.
Campylobacter
Cl.
Clostridium
Deb.
Debaryomyces
E.
Escherichia
Eb.
Enterobacter
Ec.
Enterococcus
F.
Fusarium
Hp.
Hanseniaspora
Kl.
Kloeckera
Lb.
Lactobacillus
Lc.
Lactococcus
Li.
Listeria
Ln.
Leuconostoc
P.
Penicillium
Pc.
Pediococcus
Pi.
Pichia
Ps.
Pseudomonas
S.
Saccharomyces
Sa.
Salmonella
Sch.
Schizosaccharomyces
Si.
Shigella
Sta.
Staphylococcus xviii
Tudományos nevek rövidítései Str.
Streptococcus
Tp.
Torulaspora
Vi.
Vibrio
Ye.
Yersinia
Zyg.
Zygosaccharomyces
Egyéb rövidítések am.
anamorf
Kb
103 nukleotid
tke
telepképző egység
tm.
teleomorf
Mb
106 nukleotid
spp.
fajok
xix
Bevezető Az élelmiszer-mikrobiológia tárgya és feladata Nyers és feldolgozott élelmiszereink túlnyomó többsége a mikroorganizmusok részére is kiváló tápanyag. Kedvező körülmények között bennük vagy rajtuk a mikroorganizmusok elszaporodhatnak és anyagcsere-tevékenységük révén az élelmiszer összetevő anyagait lebontják, átalakítják és az élelmiszer érzékszervi tulajdonságait megváltoztatják. Ez az élelmiszer minőségének csökkenését, gyakran teljes megromlását okozza, azt fogyasztásra alkalmatlanná teszi. Bizonyos mikroorganizmusok vagy mérgező anyagcsere-termékeik az élelmiszerrel az emberi szervezetbe jutva egészségártalmat, megbetegedést okozhatnak. Nem minden, az élelmiszerben előforduló mikroorganizmus káros, romlást okozó vagy kórokozó. Számos mikroorganizmus tevékenysége hasznos, hozzájárul az élelmiszer érzékszervi tulajdonságainak és eltarthatóságának kialakításához. Az ilyen hasznos mikroorganizmusok kivételével e szervezetek előfordulása, elszaporodása és tevékenysége az élelmiszereinkben nem kívánatos, sőt, káros. Az élelmiszer-nyersanyagok azonban mindig szennyezettek velük és a feldolgozás, tartósítás, csomagolás, tárolás, forgalmazás folyamatai is rengeteg lehetőséget adnak a mikrobiológiai szennyeződésre. Az élelmiszerek feldolgozásának, előállításának, tartósításának mindig célja és feladata – a termékek minőségi tulajdonságainak kialakításán kívül – a mikroorganizmusok elleni védekezés is. Ezt a célt a különböző élelmiszer-ipari ágazatok sokféle módszert alkalmazva érik el. Az élelmiszer-mikrobiológiai ismeretek ezért alapvetően fontosak az élelmiszer-ipari szaktechnológiák elsajátításához. Az élelmiszer-mérnök és -technológus nem nélkülözheti a mikrobiológiai szemléletet mindazokban az élelmiszer-ipari tevékenységekben, amelyek feladata a jó minőségű, romlásmentes és biztonságos termékek előállítása. Az élelmiszer-biztonság napjainkban fokozott figyelmet kap, és a fogyasztók egészségének védelme érdekében elsősorban a mikrobiológiai kockázatok csökkentése és kiküszöbölése a legfontosabb feladat. Az élelmiszerekkel terjedő, „hagyományos” és tömeges megbetegedéseket okozó mikrobiológiai fertőzéseken (pl. szalmonellózis, enterotoxikózis) kívül újabb kórokozók kerülnek előtérbe (pl. Campylobacter, Listeria), és ezek veszélyét a változó fogyasztói szokások és igények csak növelik, mint amilyenek az enyhébb tartósítási módokkal kezelt, a természetes biológiai eljárásokkal készült élelmiszerek, a fokozott táplálkozás-élettani hatású félkész- és készételek. Ebbe a keretbe illesztve egy korszerű élelmiszer-mikrobiológiai tankönyv elsődleges célja, hogy bemutassa a mikroorganizmusok jelentőségét, hasznos és káros szerepét az élelmiszerek előállításában és a táplálkozásban, megalapozva ezzel az élelmiszer-technológiai ismereteket. A könyv tárgykörei átfogó ismereteket nyújtanak az élelmiszerekben jelentős mikrobacsoportokról, a szaporodásukat és pusztulásukat meghatározó tényezőkről, a feldolgozási és tartósítási eljárások mikrobiológiai vonatkozásairól, a termékek romlását okozó, az azokkal terjedő kórokozó és az élelmiszerek előállításában hasznosított mikroorganizmusokról, továbbá azokról az ellenőrző módszerekről és vizsgálati rendszerekről, amelyek az élelmiszerek biztonságát és minőségét szolgálják. Mindezeket az ismereteket a tankönyv újszerű szemléletben, az élelmiszerek mikrobiális ökológiájának alapján mutatja be. A könyv fejezetei átfogják nemcsak az élelmiszer-mikrobiológia minden hagyományos területét, hanem kitérnek és bemutatnak olyan új részleteket is, mint a korszerű kombinált és az ígéretes új tartósítási módszerek, a veszélyelemzés és a megelőző minőségszabályozás eljárásai, a gyors, automatizált és molekuláris vizsgálati módszerek, és a genomika élelmiszer-mikrobiológiai vonatkozásai. xx
Bevezető
Az élelmiszer-mikrobiológia története Az élelmiszer-mikrobiológia mint az élelmiszertudomány egyik ága, mindössze 150 évre tekinthet vissza, kezdetei azonban egybeesnek a mikrobiológiának a kialakulásával. Ezt, bár bizonyos előzményei korábbról datálhatók, Pasteur munkásságától, az 1850-es évektől számíthatjuk. Az élelmiszer az ember mindennapos szükséglete. A bennük előforduló hasznos (erjesztő) vagy káros (romlás- és kórokozó) mikroorganizmusokkal kapcsolatba kerültünk anélkül, hogy tudomást szereztünk volna róluk. A gyűjtögető ősembernek fő tevékenysége volt a táplálékszerzés, a kőkorszak vadászó hordáinak pedig már feladatot jelentett az elejtett állat húsának időleges tárolása. Több mint tízezer évre nyúlik vissza az ősközösségek megtelepedése, a növénytermesztés és az állattenyésztés kialakulása. A nagy folyók mentén Mezopotámiában, Egyiptomban, Indiában és Kínában kialakuló civilizációk már fejlett mezőgazdaságra támaszkodtak. 3000–4000 éves eszközök és feljegyzések tanúskodnak a kenyér és az erjesztett italok (aludttej, sör) készítéséről, a hal és hús szárításáról, sózásáról, füstöléséről. Minden bizonnyal gyakran előfordult, hogy a romlott táplálék betegséget okozott; az ilyen tapasztalatok, olykor vallási köntösbe ágyazva, óvtak a tisztátlan élelmiszer elfogyasztásától. Az élelmiszer okozta megbetegedések nyomai messzire nyúlnak az emberiség történelmében. Valószínűleg mikrobiológiai eredetű ételmérgezésre utal VI. Leo bizánci császár 900-ban hozott törvénye, amellyel megtiltotta, hogy füstöléssel tartósított véres hurkát egyenek. A gombával fertőzött gabona okozta ergotizmus a középkorban pusztított. A nagy létszámú hadseregek soraiban kitört járványos betegségek a hadjáratok, háborúk kimenetelét befolyásolták és döntő befolyást gyakoroltak a történelemre. Ezek között a súlyos tünetekkel és halállal járó gyomor- és bélmegbetegedések fő szerepet játszottak. Így pl. i. e. 500-ban az I. Xerxész perzsa uralkodó másfélmilliós hadseregét megtizedelő járvány, valószínűsíthetően vérhas, meghiúsította a görög városállamok lerombolását. Hippokratésztől származik a dizentéria megnevezés. A középkorban Kínától Európáig gyakran söpörtek végig a lakosság harmadát-felét is kipusztító járványok, a rettegett pestis, a feketehimlő, a vérhas, a hastífusz és a kolera. Ez utóbbiaknak még az 1800-as években is az emberek tízezrei estek áldozatul. Hastífuszban pusztult el 1812-ben Napoleon Moszkvából visszatérő seregének jó része. 1848–49-ben a honvédseregben kitört kolerajárvány szedett súlyos áldozatokat; egyes vélemények szerint ez hatott a szabadságharc bukására is. A 19. század második felére esnek a jelentős mikrobiológiai felfedezések, alakul ki a mikrobiológia mint tudomány, bár mikroorganizmusokat már korábban is észleltek. Robert Hooke 1665-ben kezdetleges mikroszkópján nemcsak növényi (parafa) sejteket, hanem penészgombákat is látott, amint erről rajzai tanúskodnak. A holland Antonie van Leeuwenhoek kiválóan csiszolt, nagy nagyítású lencsén át már 1690 táján kétségkívül látott baktériumokat és gombákat. Megfigyeléseiről írásban és rajzokban is beszámolt az angol királyi tudományos társaságnak. Ezek a felfedezések még több mint 150 évig homályban maradtak. Edward Jenner 1796 táján védőoltást dolgozott ki a himlő ellen, anélkül, hogy a betegség kórokozójáról tudomása lett volna. 1805-ben Nicholas Appert párizsi cukrászmester üvegedénybe zárt élelmiszert forralással tartósított és ezzel elnyerte Napoleon kitűzött díját. 1810-ben P. Durand Angliában szabadalmaztatta a bádogdobozt élelmiszerek hőkezelésére, azonban sem ő, sem Appert nem tudta, miért marad romlásmentes a hőkezelt élelmiszer. Egészen a 19. század derekáig a romlás, rothadás, erjedés mibenlétéről és okairól csak különböző elképzelések voltak, olykor fantasztikus magyarázatok misztikus erőkről vagy lényekről, amelyek ősnemzés útján keletkeztek az anyagban. Spallanzani ugyan 1765-ben kimutatta, hogy a felforralt húsleves romlásmentes maradt, az ősnemzés híveit ez nem győzte meg. Bár Jacques Thenard 1809-ben élesztőfermentről írt, és Christian Persoon (1822) ’Mycoderma cerevisiae’-nek nevezte a sör felszínén kialakult hártyát, Desmazieres 1827-ben az élesztőt még ázalékállatkának tartotta. Az élesztőgombákat, mint az alkoholos erjedés okozóit csak ezt követően azonosította közel egy időben (1836–37), de egymástól függetlenül, a francia Charles Cagniard de Latour és a német Theodore Schwann és Friedrich Kützing. Pasteur kísérletei igazolták egyértelműen, hogy az erjedés okai mikroorganizmusok, ezzel megcáfolta mind az ősnemzés tanát, mind pedig az erjedés kémiai xxi
Bevezető elméletét, amit a kor nagy vegyészei, Liebig és Wöhler hirdettek. Mit sem von le Pasteur érdeméből, hogy Eduard Buchner 1897-ben kimutatta, hogy sejtmentes élesztőszűrlet („zimáz”) is okoz alkoholos erjedést – az enzimek felfedezése és azonosítása csak ezt követően indult el. Louis Pasteur (1822–1895) tekinthető a mikrobiológia atyjának, aki széleskörű munkássága folyamán zseniális kísérletekkel és nagy gyakorlati érzékkel igazolta a szabad szemmel láthatatlan mikroorganizmusok létezését és tevékenységét. 1850 és 1860 között bizonyította, hogy a baktériumok az okai a bor és a sör „betegségeinek” és hogy a bor, melegítés után romlásmentesen eltartható (a ma pasztőrözésnek nevezett eljárás). Sikeresen küzdött meg az emberi, állati életeket veszélyeztető fertőzésekkel is. Védőoltást, vakcinálást dolgozott ki a juhok lépfenéje, a baromfipestis, a selyemhernyó-kór, a veszettség elleni védekezésre, anélkül, hogy a kórokozókat minden esetben egyértelműen azonosítani tudta volna. Az 1850-es éveket követően sorra felismerték a különböző fertőző betegségek kórokozóit. Robert Koch a lépfene (1876), a tuberkulózis (1882), a kolera (1884) baktériumait, Daniel Salmon a tífuszbaktériumot (1885), Theodor von Escherich a kolibaktériumot (1885), Kiyoshi Shiga a baktériumos dizenteria (1898), Alexandre Yersin a pestis (1894) kórokozóját. Őket tisztelhetjük e baktériumok mai neveiben: Salmonella typhi, Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Yersinia pestis. A 20. század fordulóját megelőző és követő 25 év volt a bakteriológia aranykora. Számos emberi betegség kórokozójának izolálása és azonosítása megvetette az ellenük való védekezés alapjait is. Semmelweis Ignác (1847), majd Robert Lister (1867) javasolta a fenolos fertőtlenítést a sebészi gyakorlatban; R. Koch védőoltást dolgozott ki a lépfene és a veszettség ellen (1881, 1885), Paul Ehrlich alkalmazta az első kemoterapeutikumot 1906-ban (a salvarsant a szifilisz ellen). A leírt baktériumok nagy változatossága azt a gyanút keltette, hogy ezek fajai nem állandók (pleomorfok). Ferdinand Cohn azonban igazolta, hogy a mikrobák alakjuk és működésük szerint azonosíthatók. Ő mutatta ki a baktérium-endospóra rendkívüli ellenálló képességét, és alkotta meg a baktériumok első áttekintő rendszerét. Ebben nagy segítséget jelentett a Christian Gram dán orvos által kifejlesztett festési eljárás is (1884), amellyel a baktériumok két nagy csoportra voltak különíthetők. Mint később kiderült, a sejtfalszerkezet alapvető különbségeit tükröző festési módszer máig érvényes az ún. Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok megkülönböztetésében. Az orvosi bakteriológia fejlődésével párhuzamosan felismerték a baktériumok jelentőségét a talajban és a természetben. Az orosz Szergej Vinogradszkij (1856– 1953) mutatta ki a baktériumok alapvető szerepét a talaj anyagkörforgalmában és igazolta, hogy abban kemolitotróf és autotróf anyagcserére képes szervezetek szerepelnek. Kortársa, a holland Martinus Beijerinck (1851–1931) dolgozta ki a szelektív és dúsító tenyésztési módszert és izolált számos baktériumot a talajból és vizekből, köztük a nitrogénkötő baktériumokat. Beijerinck felismerte, hogy bizonyos növénybetegségeket nem a baktériumok, hanem azoknál kisebb fertőző részecskék okozzák; a baktériumszűrőkön átjutó dohánymozaik-vírus létezését Dmitrij Ivanovszkij mutatta ki 1892-ben. Anton de Bary, Oskar Brefeld és mások munkássága révén előrehaladt a gombák megismerése és rendszerezése is. M. J. Berkeley mutatta ki (1845), hogy gomba volt az Írországban szörnyű éhínséget okozó burgonyavész okozója. J. L. Schönlein és Gruby Dávid az elsők közt vizsgálták az emberi betegségeket okozó gombákat. A kórokozók felfedezése nem mindig jelentette közvetlen szerepük felismerését a vízzel, élelmiszerrel terjedő megbetegedésekben. Már Pasteur látott sztafilokokkuszokat gennyben, de csak 1894-ben hozta őket összefüggésbe élelmiszer-mérgezéssel T. Dennys. E. Klein 1885-ben leírta a Clostridium welchiit (ma Cl. perfringens), amely a gázgangréna okozójaként az I. világháborúban a sebesültek tízezreinek életét követelte, de csak 1943-ban mutatták ki kapcsolatát ételmérgezéssel is. A Cl. botulinumot 1896-ban írta le Emile van Ermengen, de csak 1921–1928 között dolgozta ki W. D. Bigelow és C. O. Ball, a spórák hőpusztulására alapozva, a konzervek hőkezelés-szükségletének elméletét. A 19. század folyamán alakultak ki az alapvető élelmiszer-ipari tartósítási módszerek, mint a tej pasztőrözése, a hús fagyasztása, a zöldségek és gyümölcsök szárítása. A nátrium-benzoátot, első kémiai tartósítószerként, 1908-ban engedélyezték, ezt a szorbinsav csak 1955-ben követte. Az ipari technológiák fejlődését a műszaki ismeretek, a gépgyártás, műszerezés, automatizálás előrehaladása tette lehetővé. A 20. század első felét a biokémia fejlődése jellemzi, az enzimek, koenzimek, vitaminok, anyagcsereutak megismerése, míg a század második felében alakult ki a modern genetika, majd abból a század végén a molekuláris biológia. A tudományos fejlődés mérföldköveit az 1. táblázat foglalja össze. A mai élelmiszerxxii
Bevezető mikrobiológiában komplex módon összegeződik mindaz, amit a névtelen elődök tapasztalatai, a neves tudósok felismerései, a fáradhatatlan kutatók eredményei az emberiség javára és hasznára ezen a téren hoztak.
1. táblázat - A mikrobiológia (biokémia, molekuláris biológia) történetének jelentős eseményei 1674
Antonie van Leeuwenhoek
Baktériumok felfedezése mikroszkóppal
1798
Edward Jenner
Himlő elleni védőoltás
1810
Nicholaus Appert
Élelmiszerek hőkezeléses tartósítása
1857
Louis Pasteur
Tejsavas erjedés baktériumai
1860
Louis Pasteur
Élesztőgombák és a bor betegségei
1865
Gregor Mendel
Öröklődés törvényszerűségei
1881
Robert Koch
Baktériumok tiszta tenyészetben
1882
Robert Koch
Tuberkulózis baktériuma
1884
Christian Gram
Festési módszer
1889
Szergej Vinogradszkij
Kemolitotrófia
1900
Emil Fischer
Peptidkötés felfezése
1901
Martinus Beijerinck
Dohánymozaik vírus
1909
Wilhelm Johannsen
Öröklődés egységei a gének
1908
Paul Ehrlich
Kemoterápiás szerek
1915
Friedrick Twort
Bakteriofágok felfedezése
1928
Frederick Griffith
Pneumococcus transzformáció
1929
Alexander Fleming
Penicillin felfedezése
1937
Hans Krebs
Citromsav kör
1944
Oswald Avery és munkatársai
A genetikai anyag DNS
1944
Selman Waksman
Streptomicin felfedezése
1953
James Watson, Francis Crick
DNS szerkezete
1959
Francois Jacob, Jacques Monod
Genetikai szabályozás
1961
W. P. Blount
Aflatoxin kimutatása gombából xxiii
Bevezető 1961
M. Nierenberg, S. Ochoa
Genetikai kód megfejtése
1975
Georges Kohler, Cesar Milstein
Monoklonális antitestek
1977
Fred Sanger és munkatársai
DNS szekvenálás módszere
1978
Peter Mitchell
Kemiozmózisos energiatranszfer
1983
Luc Montagnier
AIDS vírus (HIV) felfedezése
1993
Cary B. Mullis
Polimeráz láncreakció
2000
F. Collins, C. Venter és munkatársaik Humán genom szekvencia
xxiv
1. fejezet - Élelmiszerek mikrobiális ökológiája A magasabbrendű élőlények között, a növény- és állatvilágban érvényesülő ökológiai viszonyok kevésbé vonatkoztathatók a mikroorganizmusokra azok kis mérete, óriási egyedszáma és a rájuk ható rendkívül változatos környezeti körülmények és kölcsönhatások miatt. Az ökológiai fogalmak is csak részben alkalmazhatók a mikrobiológiában. Még inkább igaz ez az élelmiszer-mikrobiológiában, mivel az élelmiszereket általában nem tekintik biológiai ökoszisztémának, hiszen nem természetesen létrejövő, hanem mesterségesen kialakított környezetet képviselnek. Mégis, az élelmiszerek tényleges élőhelyei a bennük vagy rajtuk megtelepedő és elszaporodó mikrobáknak, a megtermelt élelmiszerek hatalmas mennyiségét tekintve pedig ez a környezet földi méretekben is számottevő. A mikrobiális ökológiai felfogás csak alig 50 éve kezdett kibontakozni, de máig alapvető szemléletváltozást hozott az élelmiszer-mikrobiológiában. Ez gyümölcsözőnek bizonyult az élelmiszerek tartósítása, mikrobiológiai biztonsága, valamint a mikrobiológiai minőségellenőrzés területén. Az ökológiai felfogás szerint az élelmiszer a mikroorganizmusok élőhelyének tekinthető, annak mikrobiotája pedig a mikroorganizmusok olyan társulása, amelynek tevékenységét az ökológiai tényezők irányítják. E tényezők megismerésében és szabályozásában rejlenek a tartósító módszerek mikrobiológiai alapjai, valamint a biztonságos, jó minőségű és tartós élelmiszerek előállításának biztosítékai.
A mikrobiális ökológia fogalmai és elvei Az élelmiszerekben végbemenő hasznos vagy káros mikrobiológiai folyamat soha nem egyetlen mikrobasejt tevékenysége, hanem a sejtek (egyedek) többnyire igen nagy számú csoportja működésének eredménye. Egy élőhelyen az azonos fajhoz tartozó egyedek összességét populációnak nevezzük. Többnyire a populációk sem egymagukban fordulnak elő, hanem más fajok populációival együtt. Ezek összessége a mikrobaközösség, amelyet társulásnak is nevezünk, ha azonos élőhelyre jellemzően mindig közel ugyanolyan fajok populációiból tevődik össze. Az ökológiailag meghatározható legfontosabb természeti egység az ökoszisztéma, amelyen az élőlények és élettelen környezetük teljes kapcsolatrendszerét értjük. Az ökoszisztémában a különböző élettevékenységet folytató közösségek fizikai környezetükkel együtt meghatározott szerkezetű és működésű egységgé kapcsolódnak össze. Ezen belül megkülönböztethetők eltérő viszonylatok és kisebb egységek. Ilyen az élőhely és az élettér, amelyben egy-egy faj előfordul, és amelyet elfoglal, más fajokkal megosztva is, illetve amelyre működése és hatása kiterjed. Az élőhely (habitat), mint ökológiai fogalom, azt a környezetet jelenti, amelynek jellemző fizikai, kémiai, biológiai tulajdonságai – mint környezeti tényezők – meghatározzák a benne előforduló mikrobapopulációk tevékenységét, szaporodását. Az élettér (niche) a környezetnek az a része, amelyre a mikrobaközösség tevékenysége térben és időben kihat, vagyis az élettér a mikrobák élőhelyének és működésének együttese. Azonos élőhelyen előforduló populációk élettere különböző lehet (pl. a felhasznált tápanyag, a kibocsájtott anyagcseretermék, a szaporodás sebessége tekintetében). Ökológiai szempontból lényeges az a szerep (funkció), amelyet a különböző fajok az élőhelyen és a magasabb ökoszisztémában betöltenek. A producens (szervesanyag-termelő) és a reducens (lebontó) szervezetek összefüggő táplálékláncot alkothatnak, amelyhez parazita és ragadozó fajok is tartozhatnak. Egy vagy néhány faj tevékenysége meghatározó lehet az ökoszisztéma fenntartásában, ezek a kulcsfajok, amelyek megteremtik sok más faj életfeltételeit. A kulcsfajok többnyire, bár nem mindig, nagy számban fordulnak elő (domináns fajok). Egy élőhelynek rendszeresen előforduló, eredeti, jellemző tagjai az autochton (bennszülött) fajok, míg más, allochton fajok csak alkalmilag, átmenetileg társulnak hozzá. Egyes szervezetek élőhelye széles, ezek a többféle ökoszisztémában előforduló, generális fajok, másoké szűk, ezek csak bizonyos élőhelyekre korlátozódó, specialista fajok. Mindezek az ökológiai fogalmak (amelyeket a növény- és állatvilágra dolgoztak ki) jól és egyszerűen vonatkoztathatók a mikroorganizmusokra is, még akkor is, ha az élőhelyük mindössze egy morzsányi talajszemcse. A talaj, az édesvizek, a tengerek természetes ökoszisztémáiban 1
Élelmiszerek mikrobiális ökológiája mindenütt megtalálhatók mikroorganizmusok, sőt azoknak meghatározó, alapvető, fenntartó részei. Ugyancsak részesei a mikroorganizmusok az emberi tevékenység által befolyásolt, megváltoztatott, vagy létrehozott és fenntartott agro-ökoszisztémáknak is, és mikrobiológiai szempontból annak tekinthetők még a teljességgel mesterséges élelmiszerek is (1.1. ábra).
1.1. ábra - Természetes és mesterséges ökoszisztémák
Az ökoszisztémákban és az élőhelyeken érvényesülő környezeti hatások lehetnek előnyösek vagy hátrányosak. Más élőlényekhez hasonlóan a mikrobákra káros környezeti tényezők két fő típusa a stressz és a zavaró hatás. A stresszhatás (pl. korlátozott tápanyag, víz, oxigén, vagy szélsőséges hőmérséklet) csökkenti az élőhely populációját, míg a megzavarás (diszturbancia) olyan drasztikus változás, ami az élő szervezetek részleges vagy teljes pusztulását okozza. E kétféle tényező kisebb vagy nagyobb mértéke szerint együttes hatásuknak négy lehetséges kimenetele lehet, de csak három nyújt elviselhető életfeltételeket, mivel az erős stresszt és a durva zavarást az élőlények nem élik túl. A másik három esetre az élőlények különböző módon válaszolnak vagy alkalmazkodnak. Mérsékelt stressz és zavarás esetén a fajok közt vetélkedés lép fel az élőhelyen rendelkezésre álló forrásokért. A más fajokkal jobban vetélkedő szervezeteknek (C-szelektált fajoknak) olyan mikroorganizmusok tekinthetők, amelyek sokoldalú anyagcsere-képességük révén a tápanyagokat jobban tudják felhasználni, vagy amelyek antimikrobás hatású anyagokat termelnek. Kis zavarás és nagyobb stressz esetén a hatást jobban tűrők érvényesülnek. A stresszhatásokat tűrők (S-szelektált fajok) a mikrobák közt is szép számban találhatók (1.1. táblázat). Végül a környezetet hirtelen, nagymértékben megzavaró, de kis stresszhatású változásokra jobban reagálni képes (R2
Élelmiszerek mikrobiális ökológiája szelektált) fajok általában valamilyen védelemmel rendelkeznek (pl. spóra, kitartó képlet), amelyek révén túlélnek, majd gyors alkalmazkodóképességgel és nagy szaporodási sebességgel reagálnak az új környezeti feltételekre. Ezek a szelektáló helyzetek szélsőséges eseteket tükröznek, a valóságban többnyire a szelektáló tényezők átmenetei érvényesülnek.
1.1. táblázat - Stressztűrő mikroorganizmusok néhány példája Mikroba
Stressz
Élelmiszer
Geobacillus stearothermophilus
Nagy hőmérséklet
Konzervek
Alicyclobacillus acidoterrestris
Kis pH
Gyümölcslevek
Leuconostoc mesenteroides
Nagy cukorkoncentráció Cukorlé, szirup
Deinococcus radiodurans
Ionizáló sugárzás
Besugárzott termék
Zygosaccharomyces bailii
Tartósítószerek
Üdítőitalok, borok
Zygosaccharomyces rouxii
Nagy cukorkoncentráció Dzsemek, méz
Dekkera anomala
Nagy CO2-nyomás
Szénsavas italok
Penicillium expansum
Kis hőmérséklet
Hűtőházi gyümölcsök
Penicillium italicum
Kis pH
Citrom, narancs
Eurotium chevalieri
Kis vízaktivitás
Szárítmányok
A környezeti hatásokra adott reagálásuk, válaszreakcióik szerint különböző ökológiai stratégiájú fajokat lehet megkülönböztetni. Ezeket a magasabbrendű szervezetekre érvényes ökológiai fogalmakat már nehezebb a mikroorganizmusokra illeszteni. Az ún. K-stratégisták lassan de hosszasan növekednek, szaporodnak, a szaporodás sebességét és a populáció sűrűségét az élőhely befogadó kapacitása szabályozza. Ezzel szemben az r-stratégistákat a nagy szaporodási sebesség jellemzi, de populációjuk erősen fluktuál. Ezek olyankor érvényesülnek, ha megváltozott feltételeket nyújtó új környezetbe kerülnek. Az élelmiszer-feldolgozás műveletei (pl. héjeltávolítás, darabolás, cukrozás, stb.) gyakran teremtenek kedvező feltételeket az r-stratégista fajoknak. Egy mikrobaközösségben a különböző fajok populációi egymásra is hatást gyakorolnak. A mikrobaközösségek nem állandók sem a populációk faji összetételét, sem számarányát tekintve. Azonos élőhelyen, az időben egymást követő közösségek, társulások váltakozását, sorrendjét az ökológiában szukcessziónak nevezik. A folyamat végül egy állandósult, ún. klimax társulás kialakulásáig tarthat. Az élelmiszerekben bekövetkező romlási folyamat a mikrobaközösségek ilyen szukcessziójának tekinthető. A fentieket összefoglalva, az élelmiszerekben végbemenő ökológiai folyamatok a következőkben vázolhatók fel (1.2. ábra). A környezetből minden élelmiszer szennyeződik mikroorganizmusokkal, amelyek közül azonban csak azok szaporodhatnak el és válnak a termék specifikus mikrobatársulásának részévé, majd 3
Élelmiszerek mikrobiális ökológiája alakítják ki a romlási társulást, amelyek élettani tulajdonságai megfelelnek a környezeti tényezők adta lehetőségeknek. Erre a folyamatra döntő hatást gyakorolnak a szelektáló ökológiai tényezők, mint az élelmiszer belső tulajdonságai, a külső körülmények és a feldolgozás hatásai (1.2. táblázat).
1.2. ábra - Élelmiszerek mikroökológiájának elvei
1.2. táblázat - Az élelmiszerek mikroökológiai tényezői 1. A szennyeződés forrásai és közvetítői a. Általános források: talaj, víz, levegő b. Specifikus források: nyersanyagok, adalékok, szállító és feldolgozó eszközök c. Közvetítők: rovarok, rágcsálók, ember 2. Mikroorganizmusok tulajdonságai a. Tápanyagigény, anyagcsere-képesség b. Szaporodási sebesség c. Túlélési képesség, rezisztencia d. Kölcsönhatás: szimbiózis, antibiózis 3. Az élelmiszer tulajdonságai (belső tényezők) a. Fizikai-kémiai jellemzők: vízaktivitás, pH, redox viszonyok b. Kémiai összetétel: tápanyagok, gátló anyagok c. Biológiai szerkezet 4. Külső tényezők a. Környezeti körülmények: hőmérséklet, légtér összetétele, páratartalma b. Feldolgozás körülményei: előkészítő műveletek, tartósító eljárások, csomagolás c. Higiéniai körülmények: tisztítás, fertőtlenítés
4
Élelmiszerek mikrobiális ökológiája
Ökológiai tényezők Az élelmiszer elsődleges, vegyes mikrobiotája csak átmeneti jellegű. A különböző külső és belső, élő és élettelen ökológiai tényezők szelektáló hatása elősegíti bizonyos fajok elszaporodását, míg mások visszaszorulnak, vagy elpusztulnak. Az élelmiszer feldolgozása folyamán a mikrobiota folytonosan változik, míg kialakul egy olyan mikrobatársulás, amely az ökológiai viszonyokhoz legjobban alkalmazkodott mikroorganizmusokból áll és az adott termékre jellemző. Az élelmiszertartósítás lényegében a környezeti tényezők olyan megváltoztatásán alapul, ami a mikrobák tevékenységét lassítja, szaporodását gátolja vagy elpusztítja őket, illetve az élelmiszerbe jutásukat eleve megakadályozza. Az ökológiai tényezők ismerete lehetővé teszi, hogy hatásaikat tudatosan szabályozzuk mind a káros, romlást okozó vagy a fogyasztó egészségét veszélyeztető mikroorganizmusok kiküszöbölésére, mind pedig az élelmiszer érzékszervi tulajdonságait és eltarthatóságát kedvezően befolyásoló mikroorganizmusok tevékenységének elősegítésére.
A szennyeződés forrásai és közvetítői, a mikroorganizmusok megtelepedése Az élelmiszereket szennyező mikroorganizmusok részben természetes élőhelyeikről és általános szennyezési forrásokból, a talajból, vízből, levegőből származnak, részben specifikus eredetűek, a romlott hulladékokból, tisztátlan szállító és feldolgozó eszközökről, berendezésekről, az élelmiszerrel foglalkozó emberről vagy más sajátos forrásokból kerülnek az élelmiszerre. Saját mozgásuk, ha van, alig játszik szerepet a szennyeződésben, az közvetlen érintkezéssel vagy közvetítőkkel, a szennyeződést átvivők útján történik. A szennyeződés eredménye a mikroorganizmusok megtelepedése (kolonizációja) az élelmiszeren.
Általános szennyezési források A mikroorganizmusok egyetemes természetes élőhelye a talaj; néhány obligát parazita növényi vagy állati kórokozó kivételével csaknem mindenfajta baktérium, élesztő- és penészgomba a talajban él vagy talaj eredetű, innen kerülnek a felszíni vizekbe és a porral a levegőbe. A növények és az állatok vagy közvetlenül a talajjal, vízzel, vagy közvetve a levegőből a porral, csapadékkal szennyeződhetnek. Bár ezek az általános szennyezési források mindenféle mikroorganizmus hordozói lehetnek, soknak, mint néhány emberi, állati kórokozónak, csak átmeneti tartózkodási helyei, míg másoknak valódi élőhelyei. A talajnak és a vizeknek jellegzetes mikrobaközösségei, társulásai vannak, és bennük megtalálhatók mindazok a mikroorganizmusok is, amelyek az élelmiszerek romlásában fő szerepet játszanak. Ilyenek a Gram-negatív baktériumok közül a Pseudomonas, az Acinetobacter, az Enterobacter és más nemzetségek fajai, a Gram-pozitívak közül pedig a korineform baktériumok (pl. Arthrobacter), az aerob és anaerob spórások (Bacillus, Clostridium), valamint a micéliumos baktériumok, főleg a Streptomyces fajok. Az aszkomiceta penészgombák és a bazídiumos gombák szintén nagyon elterjedtek a talajban. Ezek ivartalan szaporítóképletei (spórák, konídiumok), valamint a baktériumspórák, továbbá a mikrokokkuszok jellemzők a levegő mikrobiotájára. Az általános szennyezési forrásokban előforduló mikroorganizmusok gyakran rákerülnek az élelmiszerek növényi és állati nyersanyagaira. Számos mikroorganizmus azonban jellemző lakója a növényi, illetve állati szervezetnek, egyaránt megtalálhatók mind a külső, mind a belső szövetekben. Az egészséges növény levelének, virágjának, termésének felszínén mindig találhatók baktériumok és gombák (élesztők és fonalasgombák), amelyek együttese az ún. epifita társulást alkotja. A baktériumok közül gyakoriak a Gram-negatív aerob nemzetségek (pl. Pseudomonas, Flavobacterium) fajai, a Gram-pozitív tejsavbaktériumok és korineform baktériumok, az élesztőgombák közül főként a bazidiomikota jellegűek (pl. Rhodotorula, Cryptococcus), továbbá számos sporangiospórás és konídiumos penészgomba (jellemzők pl. a Cladosporium, Aureobasidium fajok).
5
Élelmiszerek mikrobiális ökológiája Ezek a mikroorganizmusok általában szaprobionták, az élő növényt nem károsítják, a leszedés, begyűjtés után azonban a tárolt növényi nyersanyagok ún. raktári romlását okozhatják. A növényt a termőhelyen megtámadó és károsító kórokozókkal szintén találkozhatunk a terméseken és más növényi részeken (pl. alternáriafoltos gyümölcsök, varas zöldségek); ezeket a darabokat a válogatás, tisztítás folyamán el kell távolítani. Az állatok kültakarója (szőrzete, bőre) mindig szennyezett mikroorganizmusokkal, amelyek egy része a normál mikrobiota jellegzetes tagja (pl. Micrococcus, Staphylococcus fajok), és az élő állatra általában nem ártalmasak. A vágóhídi feldolgozás során azonban a kültakaró mikroorganizmusai szennyezik a húst. Az állati szervezet testüregeit borító nyálkahártyák és különösen a bélcsatorna speciális mikrobiotának adnak otthont. A száj- és garatüregben jellemzőek pl. a sztreptokokkuszok, a bélcsatornában az anaerob Bacteroides, Eubacterium és Clostridium fajok, valamint a fakultatív anaerob enterobaktérium nemzetségek. A bélből a mikroorganizmusok az ürülékkel a talajba, a vizekbe kerülnek, ez a kórokozó bélbaktériumok terjedési útja is. A vágóhídi feldolgozáskor a béltartalom kenődése veszélyes fertőzési forrás. Az állati kórokozó mikroorganizmusok az állattartó telepeken egyedről egyedre terjedhetnek, gyakran a takarmány útján fertőznek. Nemcsak a kórokozó baktériumok (pl. szalmonellák) terjednek ezen az úton, hanem a mikotoxinok fő forrása és közvetítője is a takarmány.
Specifikus szennyezési források és közvetítők Az élő növényről eltávolított nyersanyagok a feldolgozásig eltelő rövidebb-hosszabb idejű tárolás alatt a lassú elhalás, szeneszcencia állapotába kerülnek. Az anyagcsere-folyamatok rendezettsége megbomlik, a lebontó enzimek aktivitása fokozódik, ezért és a vízveszteség miatt, a növényi szövetek, szervek természetes védelme elvész. A szedés, betakarítás, rakodás, szállítás kisebb-nagyobb mechanikai sérülést okoz a növényi részeken. Ez elősegíti a mikroorganizmusok behatolását a mélyebb szövetekbe, és utat nyit a romlásnak. Kialakul a termék sajátosságaihoz alkalmazkodó mikrobatársulás, amely a legaktívabb romlást okozó mikrobákat tartalmazza. A legnagyobb szennyezési forrássá az ilyen romlott darabok, részek válnak. Az állatok leölése nyilvánvalóan megszünteti az élő szervezet ellenálló képességét, a vágóhídi feldolgozás pedig feltárja a belső szerveket, szöveteket és utat nyit a szennyeződésnek. Az élelmiszerek szállítására, feldolgozására szolgáló edényzet, eszközök, gépek, berendezések, valamint az üzemi és tároló helyiségek fala, padozata állandó szennyezési forrás. Az eszközökön, berendezéseken, gyártó vonalakon kialakuló mikrobiota összetétele és nagyságrendje sok tényezőtől függ, és általában az üzemi higiénia fokmérője. A felületes, nem rendszeres, vagy nem megfelelő tisztítást, fertőtlenítést sok mikroorganizmus túléli. A szokásos fertőtlenítésnek ellenálló mikroorganizmusokból alakul ki az az üzemi mikrobiota, amely a gyártott termékféleség szerint többnyire jellegzetes összetételű és a körülményekhez legjobban alkalmazkodott fajokból áll. Ez igen veszélyes specifikus szennyezési forrás. A tárolás, raktározás alatt a rovarok, rágcsálók a mikrobás szennyezést átviszik, terjesztik. A muslicák, legyek, méhek, darazsak a feldolgozás folyamán is a szennyezés közvetítői lehetnek. A szennyezés, sőt fertőzés legveszélyesebb közvetítője azonban az élelmiszer-termeléssel foglalatoskodó ember, akinek keze és ruházata a munka során a termékkel érintkezésbe jut. A bőrről, a száj- és orrüregből mikroorganizmusok kerülhetnek az élelmiszerre. Az egészségügyi és higiéniai rendszabályok durva megsértése esetén az ember a kórokozó bélbaktériumok terjesztője is lehet. A személyi higiénia elsődleges fontosságú a megelőzésben.
A mikroorganizmusok tulajdonságai Az élelmiszerre szennyeződésként kerülő mikroorganizmusok közül azok kerülnek előnybe és válnak dominánssá, amelyek biológiai tulajdonságai az adott belső és külső ökológiai körülményeknek a legjobban megfelelnek. A mikroorganizmusok adott, belső tulajdonságai közül meghatározó jelentőségű az anyagcsereképesség és a szaporodási sebesség. Szaporodásuk folyamán a mikroorganizmusok egyrészt felhasználják az élelmiszer összetevőit, másrészt anyagcsere-termékeket 6
Élelmiszerek mikrobiális ökológiája választanak ki. Biokémiai tevékenységük révén megváltoztatják az élelmiszer fizikai, kémiai és érzékszervi tulajdonságait. A változások az élelmiszer romlásában jelentkeznek. E káros tevékenységgel szemben bizonyos mikroorganizmusok szaporodásának és anyagcsere-tevékenységének elősegítése az élelmiszer-tartósítás célja. Ezekkel részletesebben foglalkozunk a következő fejezetekben, itt a mikroorganizmusok anyagcseréjének és szaporodásának főbb vonásait ökológiai szempontból tekintjük át.
Tápanyagigény, anyagcsere-képesség A mikroorganizmusok szaporodása, a mikrobapopuláció sejtszámának növekedése az egyes sejtekben végbemenő összehangolt anyagcsere-folyamatok eredménye. E folyamatok első lépése a szubsztrátok: a tápanyagok és energiaforrások felvétele, transzportja a környezetből a sejtbe. A sejtfal, amely a mikrobasejteket határolja, általában szabadon átjárható a tápanyagok kisebb molekulái számára, amelyek bejutásának a plazmamembrán szab határt. A víz és bizonyos kis molekulák részére a membrán szabadon átjárható, az oldott molekulák többségének átjutását a membránon specifikus fehérjék (karrierek, átvivők) segítik elő. Ezekhez kapcsolódva az átjutáshoz elegendő lehet az oldott anyag koncentrációkülönbsége a környezet és a citoplazma között (a transzportnak ez a típusa a közvetített diffúzió), máskor viszont a mozgató erőt a sejt anyagcsere-energiája szolgáltatja (aktív transzport), aminek felhasználásával a sejt számára szükséges anyagok a külső koncentrációt meghaladó mértékben akkumulálódhatnak a citoplazmában. A citoplazmamembrán nemcsak az anyagfelvételben szerepel, hanem fontos tényező a sejtet érő külső tényezők (pl. stresszhatások) érzékelésében és közvetítésében is. Ez nemcsak az általános mikrobiológiai kutatások jelentős új témája, hanem érdeklődésre tarthat számot az élelmiszer-tartósító műveletek hatásmechanizmusának értelmezésében is. A sejtbe jutott tápanyag sorozatos reakciókban átalakul, metabolizálódik. Az átalakításban különböző anyagcsereutak vesznek részt, amelyek a szubsztrátokat köztestermékekké (intermedierekké) alakítják, míg végül az anyagcsere végtermékei képződnek belőlük. Azokat az anyagcsereutakat, amelyek a tápanyagok lebontásához vezetnek, katabolikus utaknak nevezzük, míg a sejt összetevő anyagainak szintézisét, felépítését végző anyagcsere-folyamatok az anabolikus utak. Ez a megkülönböztetés csak mesterséges, a sejtben ezek a folyamatok szorosan összefüggnek, és szabályozottan mennek végbe. A katabolizmus köztestermékeket és energiát szolgáltat (ATP és redukált koenzimek formájában) az anabolizmus részére. Mind a katabolizmus, mind az anabolizmus eredményeként olyan termékek távoznak a sejtből, amelyek élelmiszeripari, biotechnológiai és egyéb szempontból nagy jelentőségűek. Ezek lehetnek ún. elsődleges metabolitok (pl. tejsav, ecetsav, citromsav, etilalkohol), illetve másodlagos anyagcsere-termékek (pl. antibiotikumok vagy toxinok). Azt, hogy a különböző mikroorganizmusok milyen tápanyagokat és milyen anyagcsereutakon tudnak hasznosítani, a mikrobafajok genetikai tulajdonságai szabják meg, amelyek kifejeződését a környezeti tényezők bizonyos mértékig képesek befolyásolni. Szénhidrátok, szerves savak, lipidek, fehérjék egyaránt lehetnek a mikroorganizmusok tápanyagai. A természetben (talajban, vizekben) sokféle mikroorganizmus él, amelyek szervetlen vegyületeket képesek szén- és/vagy energiaforrásul felhasználni, és többük számára a napfény energiája is hasznosítható (ezek a kemolitotróf, illetve fototróf szervezetek). Bár ezek alapvető szerepet játszanak a bioszféra anyagainak körforgásában, élelmiszerekben alig találkozunk velük. A szerves anyagokban gazdag élelmiszerek a heterotróf anyagcseréjű mikroorganizmusok szaporodásához nyújtanak kedvező feltételeket. A mono- és diszacharidokat a legtöbb mikroba képes közvetlenül felhasználni, míg az összetett szénhidrátokat előbb extracelluláris enzimekkel hasítják egyszerűbb összetevőikre. Keményítőbontó enzimeket sok baktérium és gomba termel, főként az utóbbiak közt vannak pektinázokat, xilanázokat és cellulázokat is kibocsájtó fajok; ezek a növényi alapú élelmiszerek elsődleges romlást okozó mikroorganizmusai. Úgyszintén extracelluláris enzimek szerepelnek a lipidek és a fehérjék 7
Élelmiszerek mikrobiális ökológiája lebontásában; a hidrolízis termékei (zsírsavak, illetve aminosavak) számtalan mikroorganizmusnak szolgálnak további tápanyagul. Ezek lebontási termékei, továbbá az aromás nitrogénvegyületek (purinok, pirimidinek) anyagcseretermékei közt gyakran képződnek az élelmiszerek érzékszervi tulajdonságait erősen befolyásoló vegyületek, amelyek a mikrobiológiai romlás egyértelmű jelzői. A tápanyagok, különösen a makromolekulák lebontásában szereplő extracelluláris enzimek képződését gyakran a környezeti körülmények indukálják, illetve, ha könnyen felvehető és hasznosítható vegyületek rendelkezésre állnak, azok szintézise visszaszorul vagy megszűnik. A környezeti feltételek befolyásolhatják az anyagcsereutak működését is. E tekintetben elsősorban az oxigén jelenléte vagy hiánya, az aerob vagy anaerob viszonyok azok, amelyek az anyagcsere módjára hatást gyakorolnak. Azok a mikroorganizmusok, amelyek fakultatív anyagcserére képesek, aerob körülmények közt légzést, anaerob körülmények között pedig erjesztést folytatnak. Ilyenek pl. a bélbaktériumok, és az élesztőgombák egy része. A szénhidrátok erjesztésének és aerob légzésének bevezető reakciósorozata, a glikolízis, közös; a központi intermedier, a piroszőlősav, vagy erjedési végtemékekké (pl. tejsav, ecetsav, vajsav, etilalkohol) alakul, vagy – aerob esetben – acetil-koenzim A-n keresztül a citromsavkörbe lép, ahol teljesen eloxidálódik szén-dioxiddá és vízzé. Az aerob légzés végső elektronakceptora a molekuláris oxigén. Megemlítjük, hogy több baktérium anaerob légzésre is képes, ahol nitrát vagy szulfát helyettesíti az oxigént. Ilyenek ritkán élelmiszerekben is előfordulnak, mint pl. a konzervek szulfidos romlását okozó Desulfotomaculum. Az erjedés biokémiai útjai, szubsztrátjai és végtermékei nagyon változatosak lehetnek; ennek különböző példáit a mikroorganizmusok áttekintésénél fogjuk látni (3. fejezet). A mikroorganizmusok körében mind az anyagcseremódok, mind a hasznosítható tápanyagok tekintetében sokféle változattal találkozunk. Egyesek anyagcsere képessége szűkebb, csak aerob, vagy csak anaerob anyagcserére képesek, és tápanyagaik csak szénhidrátok lehetnek, azok közül is csak néhány monoszacharid. Mások szénhidrátokat nem, viszont szerves savakat, aminosavakat, vagy más, nagyon sokféle és különös vegyületet tudnak hasznosítani. A tejsavbaktériumok nevezetesek arról, hogy bioszintetizáló képességük szűk, ezért tápanyagigényük összetett. Sok Pseudomonas fajnál viszont a felhasználható szubsztrátok köre több mint százféle vegyületre terjed ki. A mikroorganizmusok azonosítására szolgáló élettani és biokémiai vizsgálatok jó része azokon a sajátosságokon alapul, hogy a különböző fajok által hasznosított tápanyagok nagyon sokfélék lehetnek, és a belőlük képződő anyagcsere-termékek is jellegzetesen különbözőek.
Szaporodási képesség Az egysejtű mikroorganizmusok szaporodása a sejtszám növekedésében nyilvánul meg. A hasadással szaporodó baktériumok vagy a sarjadzással szaporodó élesztők esetében bizonyos idő alatt egy sejtből kettő, majd kettőből négy sejt lesz és így tovább. Természetes körülmények között azonban a populációt alkotó sejtek nem egyszerre, hanem különböző időben (aszinkron) szaporodnak, és a sejtszám megkettőződéséhez szükséges idő a populáció átlagára vonatkoztatható. A fonalas sejtszerveződésű penészgombák növekedése a hífa csúcsára korlátozódik, és nem jár a sejtszám változásával. A növekedésben az elágazó hífák számos csúcsa vesz részt. A szubsztrátum felületén kialakuló korongszerű (közelítőleg kétdimenziós) penésztelep növekedése a telepátmérővel jellemezhető, ami azonban bizonyos méret eléréséig tart. A gyakorlatban, így az élelmiszer-mikrobiológiában is nagyon lényeges a szaporodási tulajdonságok vizsgálata. Különböző módszerek szolgálnak a szaporodás jellemzésére és mérésére, valamint törvényszerűségeinek leírására. Ezekkel, továbbá a szaporodást befolyásoló tényezők áttekintésével a következő fejezetben részletesen foglalkozunk. Ökológiai szempontból itt csak azt emeljük ki, hogy egy adott mikroorganizmus szaporodási képessége a fajra jellemző, örökletes tulajdonság, ami csak optimális körülmények között éri el a lehető legnagyobb sebességet, és a legtöbb esetben, a korlátozó tényezők következtében, annál kisebb. Mivel azonos körülmények között is eltér a különböző mikroorganizmusok szaporodása, egy adott élőhelyen együtt szaporodó fajok közül azok kerülnek előtérbe, amelyek az ökológiai tényezők szabta feltételek közt a legnagyobb szaporodási sebességre képesek. Élelmiszerekre vonatkoztatva a legtöbb esetben ez azt jelenti, hogy a baktériumok kerülnek előtérbe a romlási mikrobatársulásban, mivel általában gyorsabban szaporodnak, mint az élesztő- vagy penészgombák. Ez utóbbiak 8
Élelmiszerek mikrobiális ökológiája azonban a baktériumok számára kedvezőtlen körülmények közt meghatározóvá válhatnak. A szaporodást befolyásoló ökológiai tényezők, mint az élelmiszer belső tulajdonságai (tápanyagok, pH, vízaktivitás stb.) és a külső környezet (pl. hőmérséklet, légtér összetétel) a mikroorganizmusok tevékenységére nagy hatást gyakorolnak és ismeretük elsőrendű fontosságú az élelmiszer-mikrobiológiában.
Ellenálló és túlélési képesség Minél távolabbi egy környezeti tényező értéke az optimálistól, annál lassúbb a szaporodás. A szélső értékeken túl a mikrobasejtek még életben maradhatnak, de szaporodni már nem tudnak, sőt, a sejtek sérülnek, károsodnak, és túlélésük attól függ, hogy módjuk van-e a sérülést helyrehozni. Az ökológiai tényezők még szélsőségesebb értékeinél előbb-utóbb bekövetkezik a sejtek pusztulása. Az élelmiszer-tartósító eljárások lényege az, hogy egy vagy több ökológiai tényezőt úgy szabályozzanak, hogy az a mikroorganizmusok szaporodását korlátozza (sztatikus hatás), vagy az élelmiszerben található mikroorganizmusokat elpusztítsa (cid hatás). Ellenkezőleg, ha valamely hasznos mikroorganizmus elszaporítása a cél, akkor a legkedvezőbb környezeti tényezőket igyekszünk létrehozni. A mikroorganizmusok nem teljesen védtelenek a környezeti hatásokkal szemben. Eltekintve azoktól a módosult kitartó formáktól, amelyeket bizonyos mikroorganizmusok képesek létrehozni (endospórák, ciszták, klamidospórák), és amelyek közül a baktérium-endospórák kiemelkedő élelmiszeripari jelentőségűek (a könyv több fejezetében visszatérünk rájuk), a vegetatív sejtek is arra törekszenek, hogy fenntartsák az egyensúlyt (homeosztázist) a normális anyagcserefolyamatok és a sejtet érő stresszhatások által kiváltott túlélési reakciók közt. Mint már említettük, a kedvezőtlen környezeti hatásokat, mint stressztényezőket a sejtmembrán receptorai érzékelik és molekuláris jelzőkön át továbbítják a genetikai információs rendszeréhez, amely ezekre új gének kifejeződésével és mások repressziójával reagál. A molekuláris szintű kutatások egyre jobban feltárják a részleteket (2.3. fejezet). Itt elegendő annyit előrebocsájtani, hogy a sejtek stresszválaszaiban szerepe van az energiatartalékok mobilizálásának (baktériumoknál glikogén, poli-β-hidroxivajsav, gombáknál trehalóz), a ribonukleinsavak és a fehérjék lebomlásának, egyúttal új, ún. sokkfehérjék szintézisének. Bár a sejteket többféle stresszhatás éri (pl. éhezés, hőmérséklet, savasság, antimikrobás vegyületek), az ezekre adott válaszreakcióknak csak egy része specifikus, más része azonos. Különösen jelentősek azok a biokémiai folyamatok, amelyek a DNS és a riboszómák szerkezetében bekövetkezett sérülések kijavítását teszik lehetővé. A környezeti hatások elsőként a sejtmembránt érik (a sejtfal szerkezeténél fogva jóval ellenállóbb), a „folyékony mozaik” szerkezetű membrán átrendeződése rövid úton gyorsan végbemegy, hosszabb távon a sejtek a membránlipidek összetételbeli változásával tudnak a környezethez alkalmazkodni. A szaporodásgátló és pusztító tartósító eljárások értelmezésében lényeges annak figyelembe vétele, hogy az egyes sejteket érő stresszhatásokat csak populáció szinten tudjuk mérni és értékelni. A populáció sejtjeinek érzékenysége, illetve ellenálló képessége heterogén, az észlelhető szaporodási és túlélési görbékben ezeknek a különbségeknek az eloszlása tükröződhet. További gyakorlati vonatkozás, hogy a túlélő, de sérült sejtek kimutatása a szokásos módszerekkel (pl. szelektív táptalajokon) nem mindig lehetséges, ami tévedésre vezethet, pl. az élelmiszer-biztonság megítélésében a kórokozók előfordulásának vizsgálatánál.
Mikroorganizmusok kölcsönhatásai Csak különleges, ritka esetekben fordul elő, hogy egy természetes élőhelyet vagy élelmiszert egyetlen mikrobafaj foglal el. Általában többféle mikroorganizmus különböző nagyságú populációi alkotják a mikrobiotát. Bár ezek többé-kevésbé alkalmazkodtak az adott élőhely ökológiai viszonyaihoz, élettani tulajdonságaik, és anyagcsere-képességük jelentősen különbözhet. Ebből következik, hogy a mikrobatársulás tagjai egymással kölcsönhatásba kerülnek. Az élelmiszerek mikrobiotájának tagjai közti kölcsönhatások jelentősen befolyásolhatják a mikrobatársulás változását, egymásra következő fejlődését (szukcesszióját), a végső, termékspecifikus és a romlási asszociáció kialakulását. 9
Élelmiszerek mikrobiális ökológiája A mikroorganizmusok közti kölcsönhatások lehetnek egymásra nézve közömbösek (neutrálisak), kedvezőek vagy kedvezőtlenek (1.3. táblázat). Az ökológiában szokásos fogalmak szerint ezeket kommenzalista, mutualista és amenzalista nevekkel illetik, és a hatás mértéke vagy kölcsönössége szerint ezeken belül megkülönböztetik a kompetíciót, szimbiózist, antagonizmust, parazitizmust, predációt. Élelmiszerek mikrobatársulásaiban mindegyik előfordul, talán az utóbbi kivételével, amely a természetben is főleg csak a protozoonokra jellemző.
1.3. táblázat - Mikroorganizmusok közti kölcsönhatások Típus
Kölcsönhatás*
Következmény
Kompetíció
––
Populációk nagysága mérsékelődik, mivel egyaránt az azonos korlátozó tápanyagtól függenek
Amenzalizmus
–0
Az egyik populáció korlátozódik, a másik nem; az utóbbi dominánssá válik
Parazitizmus
+–
Az egyik mikroorganizmus a másikon élősködik, azt károsítja
Kommenzalizmus
+0
Az egyik populációra előnyös hatás a másikat nem érinti
Mutualizmus
++
A populációkra kölcsönösen előnyös hatás; a laza kapcsolattól a szoros szimbiózisig terjedhet
* – káros, + előnyös, 0 közömbös kölcsönhatás A mikroorganizmusok egymásra gyakorolt hatása a tápanyagok hasznosításban és az anyagcsere-termékek kibocsájtásában jelentkezik, és hat a populációk nagyságára, de legalábbis azok élettani tevékenységére. Az egyik gyakori eset a vetélkedés a tápanyagokért, azonban lehetséges az is, hogy egy mikroorganizmus elősegíti mások szaporodását azzal, hogy számukra felhasználható tápanyagokat alakít ki. A makromolekulákat hidrolizáló (keményítő-, vagy pektinbontó) penészgombák lehetővé teszik az egyszerűbb szénhidrátokat felhasználó élesztők szaporodását. Gyümölcsök romlásakor megfigyelhető, hogy az élesztők elszaporodását követik a tejsav- és az ecetsav baktériumok. Előbbiek az élesztők által szintetizált B-vitaminokat, az utóbbiak az etilalkoholt hasznosítják szaporodásukhoz. A tápanyagokon kívül egyéb ökológiai tényezők is szerepelhetnek a kölcsönhatásokban. A redox viszonyok helyi megváltoztatása (pl. az oxigén felhasználása) elősegíti az anaerobok szaporodását. A szerves savakat felhasználó szervezetek növelik a pH-t, csökkentve annak gátló hatását más mikrobákra. Az aerob mikroorganizmusok légzése következtében keletkező víz növeli a vízaktivitást, és lehetővé válhat a nem szárazságtűrő fajok szaporodása. Gyakori kölcsönhatás, hogy az egyik mikroorganizmus tevékenysége hátrányos vagy gátló mások számára. A savtermelő mikrobák elszaporodásának következtében a nem savtűrők visszaszorulnak, sőt elpusztulnak. Ezt hasznosítjuk a tejsavas erjedéssel tartósított tejtermékek, zöldségfélék gyártásánál, egyes húskészítmények érlelésénél. A tejsavon kívül más anyagcsere-termékek is szerepet játszhatnak a mikrobák kölcsönhatásaiban (pl. etanol, ecetsav, CO2). Több baktérium- és gombafaj 10
Élelmiszerek mikrobiális ökológiája antimikrobás anyagokat is képez (pl. a bakteriocinek és a zimocinek az élesztők ún. killer toxinjai), de valódi antibiotikumok termelésére ritkán akad példa élelmiszerekben. A Lc. lactis termelte nizint a gyakorlatban is hasznosítják a klosztrídiumok elleni védekezésre a sajtok érlelésénél. Több, pontosan meg nem határozott tényező játszik szerepet abban, hogy a szaprobionta mikrobák fejlődése hátráltatja bizonyos kórokozók szaporodását. Számos ilyen megfigyelés keltette fel a kutatók érdeklődését, azonban a gyakorlati alkalmazásra még nem került sor.
Az élelmiszer belső tulajdonságai Az élelmiszer fizikokémiai jellemzői, kémiai összetétele és biológiai szerkezete lényeges, a mikroorganizmusok tevékenységét meghatározó belső ökológiai tényezők. Ezeket itt általánosságban tekintjük át, alkalmazásukat az élelmiszerek tartósítására a későbbi fejezetekben tárgyaljuk.
Szabad víztartalom Az élelmiszerek általában nagy százalékban tartalmaznak vizet (húsok > 60%, gyümölcs- és zöldségfélék > 90%), a mikroorganizmusok számára azonban nem az összes, hanem csak a szabad, fizikailag, kémiailag nem kötött víz hozzáférhető. A szabad víztartalom kifejezésére az élelmiszer-mikrobiológiában általában a vízaktivitás (aw) fogalmát használják, amely az oldatok fizikokémiai tulajdonságával van összefüggésben. Egy oldat gőznyomása (po) mindig kisebb, mint a tiszta oldószeré (p) azonos hőmérsékleten. Ezt a viszonyt fejezi ki a vízaktivitás: aw = p/po Ugyanezt fejezi ki %-ban az egyensúlyi relatív páratartalom (ERP) is: ERP% = 100 · aw, ami azonban szigorúan véve nem az oldatra vagy az élelmiszerre, hanem a vele egyensúlyban lévő levegő páratartalmára vonatkozik. Újabban a vízaktivitás helyett előnyben részesítik a vízpotenciál (ψ) alkalmazását, mivel az előbbi nem fejezi ki a hőmérséklet hatását és nem SI egység. A vízpotenciál a víz szabad energiája egy rendszerben, a tiszta vízhez viszonyítva; az utóbbi potenciálja nulla, az oldatoké ennél kisebb, negatív értékű. A vízpotenciál képletesen az a nyomás (MPa egységben), amellyel víz vonható ki egy szubsztrátumból. Élelmiszerekben a vízpotenciál két fő összetevője az ozmózisos (oldat) potenciál és a matrix (szilárd anyag) potenciál; a vízaktivitás főként az előbbivel áll összefüggésben a következő szerint: ψ = –RT/Vw log aw, ahol: R – az ideális gázállandó (8,314 Jk–1mol–1), T – az abszolút hőmérséklet (K), Vw – a víz parciális móltérfogata. 11
Élelmiszerek mikrobiális ökológiája A mikroorganizmusok szaporodása csak a hozzáférhető víz bizonyos határai közt lehetséges (1.4. táblázat). Többségük optimális szaporodásához nagy vízaktivitás (kis vízpotenciál) szükséges 0,980–0,995 között (–0,7...–2,8 MPa). Általában a baktériumok vízigénye a legnagyobb, szaporodásukat, kevés kivétellel, a 0,91-nél kisebb aw (–13,0 MPa) gátolja. A baktériumok közt kivételt képeznek a halofil fajok, amelyek szaporodásukhoz nagy sókoncentrációt igényelnek, vízaktivitástűrésük 0,75 aw-ig (–39,6 MPa) terjed.
1.4. táblázat - Mikroorganizmusok szaporodásának minimális vízigénye Mikrobacsoport
Vízaktivitás (aw)
Vízpotenciál (MPa)
Baktériumok általában
0,91
–13,0
Halofil baktériumok
0,75
–39,6
Élesztőgombák általában
0,88
–17,6
Xerotróf élesztők
0,79
–32,4
Penészgombák általában
0,80
–30,7
Xerotróf penészek
0,70
–49,1
Xerofil penészek
0,61
–69,0
Az élesztőgombák szaporodásának minimális vízigénye kisebb, mint a baktériumoké. A szárazságkedvelő (xerofil) élesztőket korábban ozmofil névvel illették és 0,62 aw értéket is megadtak szaporodásuk minimális határaként. Újabb vizsgálatok ezt nem igazolták, és laboratóriumi körülmények között sem találtak 0,67-nél kisebb vízaktivitásnál szaporodni képes törzset. A penészgombák általában kis vízigényűek. Sok faj szárazságtűrő, néhány kifejezetten szárazságkedvelő (xerofil), ezek nem szaporodnak 0,97-nél nagyobb (–4,2 MPa) vízaktivitású híg vizes oldatokban, viszont képesek (bár lassan) szaporodni 0,70 aw (–49,1 MPa) alatt is. A vízaktivitás hatása függ a mikrobák szaporodására ható más tényezőktől (hőmérséklet, pH, az oldott anyag minősége stb.), továbbá különbözik azonos faj törzsei közt és változik azok élettani állapota szerint is.
pH, savasság Az élelmiszer hidrogénion-koncentrációja, amelyet a pH-érték fejez ki (–log[H+] = pH), a mikroorganizmusok tevékenységét és szaporodását lényegesen befolyásoló ökológiai tényező. A mikroorganizmusokra mind a szabad hidrogénionok, mind az élelmiszerek öszszetevői között található gyenge szerves savak disszociálatlan molekulái hatnak. Amennyiben a rendszer pH-ját az utóbbiak határozzák meg, a köztük lévő viszonyt a Henderson-Hasselbach egyenlet fejezi ki: pH = pKa + log [A–]/[HA], ahol: pKa – a gyenge sav disszociációs állandójának negatív logaritmusa, 12
Élelmiszerek mikrobiális ökológiája [A–] – a disszociált anion, [HA] – a disszociálatlan molekula aktivitása. Amikor a sav 50%-a van disszociálva, pKa = pH. Az élelmiszerek pH-ja általában neutrális vagy gyengén savas, ami megfelel a legtöbb mikroorganizmus szaporodási igényeinek (1.5. táblázat). A baktériumok többségét pH < 4,0 gátolja, élelmiszerek esetén fontos kivételek a tejsav- és az ecetsav baktériumok, amelyek kisebb pH-értékeket is elviselnek. A baktériumokhoz képest az élesztő- és a penészgombák a közepesen savas pH-t kedvelik, azonban szaporodásuk pH-tartománya általában szélesebb, mind a savas, mind a lúgos tartományban.
1.5. táblázat - Mikroorganizmusok szaporodásának pH-tartományai Mikrobacsoport
Minimális
Optimális
Maximális
Baktériumok többsége
4,0
6,5
8,5
Tejsavbaktériumok
3,2
5,0
7,8
Ecetsav-baktériumok
2,8
4,0
5,5
Élesztőgombák
2,2
5,0
8,5
Penészgombák
2,0
5,0
9,0
Mivel a disszociálatlan savmolekulának specifikus antimikrobás hatása is van, a mikroorganizmusok pH-tűrését befolyásolja a sav kémiai természete. Kis pHjú élelmiszerekben a gyenge szerves savak (mint az étkezési savak és a tartósítószerek) disszociációja visszaszorul, és antimikrobás hatásuk kerül előtérbe. Disszociációs állandójuk és a pH függvényében ezeknek a gyenge szerves savaknak a specifikus antimikrobás hatása a citromsav < tejsav < ecetsav sorrendben fokozódik. A savtermészetű tartósítószerek (benzoesav, szorbinsav) pH 3,0-nál 93–95%-ban disszociálatlanok, ezért már néhány század %-os koncentrációban hatékonyak.
Oxidációs-redukciós viszonyok Mint már tárgyaltuk (1.2.2.1.), a mikroorganizmusok szaporodását alapvetően meghatározza anyagcseréjük, amelynek hatékonyságát az oxigénhez való viszonyuk szabja meg. Aerob légzéssel több energiára tesznek szert, mint az anaerob erjesztési folyamatokkal, ami bioszintézisüket és szaporodásukat fokozza. Valójában nem az oxigén (levegő) jelenléte vagy hiánya, hanem a közeg redoxpotenciálja gyakorol közvetlen hatást a mikrobasejtekre, ezért az élelmiszerek oxidációs-redukciós viszonyait a redoxpotenciállal lehet kifejezni. Egy megfordítható oxidációs-redukciós reakcióban a redoxpotenciált (Eh) a Nernst-egyenlet fejezi ki:
13
Élelmiszerek mikrobiális ökológiája ahol: EO – a standard redoxpotenciál, amikor pH = 0 és az oxidált [ox] és redukált [red] reagensek koncentrációja megegyezik, R – az egyetemes gázállandó, T – az abszolút hőmérséklet, F – a Faraday-féle töltésmennyiség és n – a reakcióban átvitt elektronok száma. 25 oC-on és a biológiai rendszerekben gyakori két elektron átvitelénél a 2,303 RT/nF tag értéke közelítőleg 0,03, és az összefüggés:
A mV-ban mért negatív Eh-értékek redukáló, a pozitív értékek oxidáló körülményeknek felelnek meg. A redoxpotenciál erősen függ a pH-tól, ezért bevezették az rH fogalmát: Eh = 0,03 (rH – 2 pH), vagy rH = Eh/0,03 + 2 pH, ahol: rH – a mért elektródpotenciálnak megfelelő hidrogéngáz parciális nyomásának negatív logaritmusa (rH = log p H2, pl. rH 10 = p H2 10–10). Az rH skála 0-tól 42-ig terjed, 0–15 érték erősen redukáló, 25–42 érték pedig erősen oxidáló rendszert jelez. Az aerob mikroorganizmusok pozitív, 300 mV-ot elérő, vagy meghaladó redoxpotenciál-értékeket igényelnek, míg az anaerobok negatív, –300 mV-nál kisebb értéknél tudnak szaporodni. A növényi termékek redoxpotenciálja általában pozitív (Eh = 300–400 mV), míg a húsoké, sajtoké negatív (–20 ... –200 mV). Az élelmiszer redoxpotenciálját elsődlegesen az oxidált és redukált vegyületek koncentrációja határozza meg, ezek arányát azonban befolyásolja, hogy a levegő milyen mértékben járja át a terméket, továbbá mekkora annak redoxfékező kapacitása, vagyis ellenállása a redoxpotenciál változásával szemben. Így pl. ha a darált húst a levegő átjárja és a redox kapacitás már nem elegendő a kis Eh-érték fenntartására, az –200 mV-ról akár + 200 mV-ra növekszik. Az élelmiszer összetevői közül a szulfhidril-csoportokat tartalmazó vegyületek, a redukáló cukrok és más anyagok elősegítik a redukált viszonyok fenntartását. A nagy redoxfékező kapacitású termékben, még levegő jelenlétében is, az Eh –200 mV körül marad, és lehetővé válik az obligát anaerobok szaporodása.
Kémiai összetétel A mikroorganizmusoknak a szaporodáshoz szükségük van energia-, szén- és nitrogénforrásként szolgáló tápanyagokra, valamint vitaminokra és ásványi sókra. Az élelmiszerek általában tartalmazzák ezeket a tápanyagokat, összetételük szerint azonban nagyon különböző mértékben. Az élelmiszerben kialakuló mikrobiotára a tápanyagok megléte, korlátozott volta vagy hiánya lényeges szelektív ökológiai tényezőként hat. 14
Élelmiszerek mikrobiális ökológiája Egyes élelmiszerek olyan összetevőket tartalmaznak, amelyeknek bizonyos mértékű antimikrobás hatásuk van és gátolják a mikrobás romlást. Ilyen gátló anyagok vannak pl. a friss tejben (laktenin, laktoperoxidáz), a tojásfehérjében (lizozim). Sok növényi nyersanyag is tartalmaz olyan illóolajokat, zsírsavakat, vagy más, komplex összetételű vegyületeket, amelyek mikrobagátlók. Különösen a fűszerek fenolos jellegű, ún. fitoncidjai említhetők, pl. paprikában a kapszaicin. A berkenye szorbinsavat, a vörös áfonya benzoesavat tartalmaz.
Fizikai és biológiai szerkezet Az élelmiszerek nyersanyagául szolgáló termések és más növényi részek biológiai szerkezete természetes akadály a mikroorganizmusok behatolásával szemben. A termések héja, burka, a gyümölcsök viaszbevonata és általában a növények epidermisze és kutikulája jelentős védelmet nyújt a mikrobák behatolása ellen a belsőbb szövetekbe. A növényekhez hasonlóan biológiai felépítésük védi az állati eredetű nyersanyagokat is (pl. a tojás héja, húsokon az izompólya, kötőszöveti hártya). Ez a természetes védelem azonban jórészt csak addig tart, amíg a biológiai szerkezet ép és sértetlen. Az élő növényen a sebzett, elhalt szöveti részek körül másodlagosan fejlődő sejtekből heg, var képződik, a leszedett gyümölcsön, zöldségen azonban már nem. A szedés, szállítás, tárolás során megsérült növényi anyag ezért gyors romlásnak van kitéve. Elősegíti ezt a növényi részek kényszerérése is, amelynek folyamán a keményítőt, pektint lebontó enzimek aktiválódnak. A gyors szöveti légzés csökkenti nemcsak az oldható szénhidrátokat, hanem a szerves savakat is. A szövetekben végbemenő bomlási folyamatok miatt nő a pH és az Eh, ezzel a helyzet kedvezőbbé válik a baktériumok és a penészek tevékenysége számára. Az élelmiszerek állati nyersanyagainak előkészítése (az állatok levágása és vágóhídi feldolgozása) szintén gyökeres változásokat idéz elő az élő állapothoz képest. Az elhalt sejtek membránjai permeabilissá válnak, a sejtekből tápanyagok jutnak ki. Szöveti enzimes lebontó folyamatok indulnak meg, amelyek a hús érése folyamán növelik a redoxpotenciált és ezzel az aerob mikrobás tevékenységet. A glikogén tejsavas lebomlása a pH-t csökkenti ugyan, de nem olyan mértékben, hogy az a romlást okozó, proteolitikus baktériumok szaporodását lényegesen akadályozná. Az állati test darabolása, csontozása, a bőr lefejtése, a belső szervek eltávolítása új felületeket tár fel a mikrobák megtelepedésére. A feldolgozott, folyadék állapotú élelmiszerek közege homogén a szilárd, darabos, vegyes összetételű termékekhez képest. Folyékony élelmiszerekben csak a felszín és a folyadék belseje közt mutatkozik különbség a mikrobatevékenység szempontjából, különösen az oxigén behatolását illetően. A penészgombák vagy az ecetsav-baktériumok felületi hártyát képeznek az üdítőitalokban, illetve borokban, az élesztők, a tejsav és egyéb baktériumok egyenletesen eloszlanak a folyadékban, üledék főleg az elhalt sejtekből képződik. Szilárd halmazállapotú élelmiszerek esetében azonban, még ha azok látszólag homogénezettek is, a fizikai szerkezetben olyan mikroheterogenitás áll fenn, ami ökológiailag jelentős különbségeket okoz. Ez lehetővé teszi az eltérő élettani tulajdonságú és anyagcsere-képességű mikroorganizmusok egyidejű tevékenységét a termék különböző részeiben. Mikroméretekben oxigén- és pH-gradiensek alakulnak ki, jórészt a mikrobás anyagcserefolyamatok következtében is. A 0,05–0,25 mm méretű szemcsék közt óriási dimenzióbeli különbségek mutatkoznak a μm nagyságrendű mikroorganizmusokhoz viszonyítva. A mikroszerkezet fontos ökológiai tényező a víz-olaj típusú élelmiszerek (pl. margarin, krémek) esetén is.
Külső környezeti tényezők Mikroökológiai szempontból ezeknek a tényezőknek két nagy csoportját különböztethetjük meg. Az egyikbe tartoznak az olyan külső környezeti tényezők (hőmérséklet, a légkör relatív páratartalma és gázösszetétele), amelyek egyaránt hatnak az élelmiszerre és a benne lévő mikroorganizmusokra. E tényezők hatása főleg az élelmiszerek tárolásakor válik jelentőssé. A külső tényezők másik csoportjába azokat a feldolgozó és tartósító műveleteket sorolhatjuk, amelyek döntő 15
Élelmiszerek mikrobiális ökológiája mértékben megváltoztatják az élelmiszer belső tulajdonságait, az eredeti, szennyező mikrobiotát, és a túlélő vagy másodlagosan szennyező mikroorganizmusok számára gyökeresen új, a fizikai tényezőkben, a kémiai összetételben megváltozott ökológiai feltételeket hoznak létre. A külső tényezők ez utóbbi csoportját a könyv külön fejezeteiben részletesen tárgyaljuk.
Hőmérséklet A mikroorganizmusok szaporodását, életképességét és pusztulását meghatározó legfontosabb környezeti tényező a hőmérséklet. Az optimális szaporodási hőmérséklet-tartományban, amely sok mikrobánál mintegy 20–25 °C-ra terjed ki, a hőmérséklet változása befolyásolja az anyagcsere-folyamatok és a szaporodás sebességét, a mikrobapopulációk sejtszámát. A minimális hőmérséklet alatt a mikroorganizmusok túlélhetnek ugyan, de szaporodásuk megáll, a maximális szaporodási hőmérséklet felett pedig elpusztulnak. Szaporodásuk hőmérséklet határai szerint a mikroorganizmusok között több csoportot lehet megkülönböztetni (1.6. táblázat). A mezofilok közé tartozik a legtöbb mikroba, köztük az élelmiszerekben előforduló kórokozók is. Az élelmiszerek romlásában különös jelentőségük van a nagy hőmérsékleteken is szaporodni képes termofil baktériumoknak. Számos romlást okozó mikroorganizmus tartozik a pszichrotróf csoportba; ezek a hidegtűrő mikrobák egyaránt szaporodnak a közepes hőmérsékleteken és a fagypont közelében is.
1.6. táblázat - A mikroorganizmusok élettani csoportjai szaporodási hőmérséklet szerint* Csoport
Hőmérséklet (°C) Minimális
Optimális
Maximális
Termofil
40
50
80
Termotróf
20
35
50
Mezofil
5
30
45
Pszichrotróf
–5
20
35
Pszichrofil
–10
15
20
* Közelítő átlagértékek, a gyakorlatban 5–10 °C széles hőmérsékleti sávok Velük szemben a hidegkedvelő, pszichrofil mikroorganizmusok azok, amelyek maximális szaporodási hőmérséklete nem haladja meg a 20 °C-ot, de képesek szaporodni néhány fokkal 0 °C alatt is. A szaporodás hőmérsékleti határai csak közelítőleg adhatók meg, mert nemcsak fajonként, hanem azonos faj különböző törzsei közt is eltérnek, továbbá változnak az egyéb környezeti tényezők (pl. aw, pH, oxigén- és tápanyag-koncentráció) hatására. A baktériumok közt hőmérsékleti igény szerint minden típus megtalálható. Sok pszichrotróf és pszichrofil faj van a Pseudomonas, Alcaligenes, Flavobacterium, Arthrobacter nemzetségekben, a termofilok legfontosabb képviselői a Bacillus és a Clostridium fajok. Az élelmiszerrel terjedő kórokozó baktériumok kevés kivétellel mezofilok és nem szaporodnak 5 °C-nál kisebb hőmérsékleten. Ez utóbbi alól fontos kivétel a Listeria monocytogenes. 16
Élelmiszerek mikrobiális ökológiája Az élesztők és penészek közt is sok pszichrotróf található (pl. egyes Candida és Cryptococcus, illetve Cladosporium és Penicillium fajok), viszont kevés termotróf akad és valódi termofil nincs is. Mind a kis, mind a nagy hőmérsékletek alkalmazása az élelmiszeripar fontos tartósítási eljárása. A hűtés és a fagyasztás hatása nem csak szaporodásgátlás lehet. A mikroorganizmusok fokozatosan elpusztulnak, ha huzamosabb ideig a szaporodási minimumnál kisebb hőmérsékletnek vannak kitéve. Ez a pusztulás azonban igen lassú, és a fagyasztástól nem várható teljes sterilizáló hatás. A hőmérséklet növelésével viszont gyakorlatilag teljes pusztulást lehet elérni, a vegetatív sejtek esetében általában már 70–80 °C-on, a hőmérsékletnek ellenálló baktérium endospórák elpusztítása azonban jóval nagyobb, 100 °C feletti hőmérsékleteket igényel, amint azt a következő fejezetben részletesen tárgyaljuk.
Relatív páratartalom A levegő nedvességtartalma zárt térben bizonyos idő után egyensúlyba kerül az élelmiszer szabad víztartalmával (1.2.3.1.), amit a vízpotenciál, illetve a vízaktivitás fejez ki. A termék vízaktivitása számszerűen megegyezik a levegő egyensúlyi relatív páratartalmának századrészével (aw = ERP/100). A friss élelmiszer párolgás révén vizet veszít, ha a tárolótér relatív páratartalma kisebb, mint a termék vízaktivitása. Ha viszont kis vízaktivitású élelmiszert (pl. szárítmányt) nagy páratartalmú légtérbe helyezünk, a termék vizet vesz fel. Az ERP-t erősen befolyásolja a hőmérséklet. Adott hőmérsékleten a termék nedvességtartalma és az ERP közti összefüggést a szorpciós izoterma írja le. Mivel 0,75 aw-nél kisebb vízaktivitásnál a mikroorganizmusok többsége nem tud szaporodni, az ezzel összefüggő víztartalomértékeket az élelmiszer kritikus víztartalmának tekintjük. Az olyan összetett rendszerekben, mint az élelmiszerek, a nedvesség eloszlása, a helyi vízaktivitás-különbségek, a víz terméken belüli vándorlása befolyásolja a mikrobák szaporodását. Olykor kedvező feltételeket teremt. Előfordul, hogy a termék felületén lecsapódó pára teszi lehetővé a penészek elszaporodását. A gyümölcsök, zöldségek tárolásakor a szöveti légzés következtében képződik víz. Raktárakban, hűtőházakban a hőmérséklet kismértékű ingadozása is befolyásolja az ERP-t. A csomagolt élelmiszereknél a gyors mikrobás romlást a csomagban lecsapódó nedvesség segíti elő.
A légtér összetétele Nem mindig a levegő képezi az élelmiszereket körülvevő légteret. A levegő összetételének változtatása, az oxigéntartalom csökkentése, a szén-dioxid-koncentráció növelése előnyös tárolási módszert tesz lehetővé. Az ún. szabályozott légterű tárolás, amelyet gyakran hűtéssel kombinálnak, két szempontból is előnyös. Egyrészt gátolja a gyümölcs vagy zöldség légzését, ezáltal lassítja az érést, másrészt gátolja a romlást okozó mikrobák, különösen az aerob penészgombák szaporodását. Hasonló viszonyok alakulhatnak ki a vákuumcsomagolt élelmiszereknél is, ha az aerob mikrobák légzése miatt az oxigén csökken és CO2 képződik. Ilyen körülmények közt a tejsavbaktériumok okozta romlás lehetősége nő meg.
Feldolgozó és tartósító műveletek A feldolgozandó nyersanyag mikrobiológiailag mindig szennyezett és ezt a szennyeződést sokféle belső és külső ökológiai tényező alakítja ki és módosítja. Ilyen külső tényezők azok a különféle műveletek is, amelyek az élelmiszerek feldolgozásában szerepelnek. Ezek mindegyike befolyásolja, vagy döntően meghatározza a végső mikrobatársulás létrejöttét, illetve pusztulását. A feldolgozó műveletek egy része (pl. válogatás, mosás, hámozás) hathatósan csökkenti az élelmiszer 17
Élelmiszerek mikrobiális ökológiája szennyezettségét, más részük azonban elkerülhetetlenül növeli (pl. aprítás, darabolás, fűszerek, adalékok). A berendezések is szerepelhetnek szennyezési forrásként, ha felületükön, vagy az anyagáramlásból félreeső zugokban mikrobatenyészet alakul ki. Ebből a szempontból is hangsúlyozni kell a technológiai eljárások szerves részét képező higiéniai műveletek (tisztítás, takarítás, fertőtlenítés) meghatározó jelentőségét, a jó gyártási gyakorlat folyamatos fenntartásának jelentőségét, a jó mikrobiológiai minőségű, tartós, a fogyasztóra biztonságos élelmiszer előállításában. Az élelmiszerek előállításának ezekre a mikrobiológiai szempontból lényeges vonatkozásaira a továbbiakban részletesen visszatérünk.
Az ökológiai tényezők kölcsönhatásai A gyakorlatban ritkán, talán soha nem fordul elő, hogy valamely ökológiai tényező hatása önmagában érvényesül, más környezeti tényező befolyása nélkül. Mind a mikroorganizmusok szaporodását, mind pusztulását több tényező együttesen határozza meg. Még a látszólag döntő hatású hőkezelés eredményességét is jelentősen befolyásolja pl. a termék pH-ja, vagy vízaktivitása. A jobb minőség elérésére az élelmiszerek tartósítására két vagy több ökológiai tényezőt lehet kombinálni, olyan mérsékelt dózisokban alkalmazva, amelyek különkülön csak részlegesen lennének elegendők. Az ilyen kombinált tartósítást az akadályfutás szemléletes példájára utalva „gát-technológiának” nevezik, mivel a mikroorganizmusnak több ökológiai tényező gátján kell átjutnia ahhoz, hogy szaporodni tudjon, vagy életben maradjon. Ez a példa azonban két szempontból is félrevezető. Egyrészt, az ökológiai tényezők „gátjai” nem egymás után, hanem egyidejűleg érvényesülnek, másrészt, hatásuk nem csak egyszerűen összegeződik, hanem egymást gyakran erősítik (szinergisták). Ennek tudatában a kombinált tartósítás nemcsak az élelmiszer-technológia ígéretes lehetősége, hanem már a gyakorlatban is széles körben alkalmazott, és mikrobiológiai szempontból részletesen vizsgált és elemzett módszer. A továbbiakban ennek a területnek számos vonatkozásával fogunk foglalkozni.
18
2. fejezet - A mikroorganizmusok szaporodása és pusztulása A szaporodás és a pusztulás a mikroorganizmusok létfontosságú élettani folyamatai, amelyeket jellemző belső tulajdonságaik és a rájuk ható külső ökológiai tényezők határoznak meg. Ezek hatása mindig együttesen és egymással kölcsönviszonyban érvényesül, ami rendkívül összetett folyamatok eredőjeként szabja meg a szaporodás és a pusztulás kimenetelét. Az élelmiszerek fermentációjához, a starter tenyészetek elszaporításához a maximális élet- és szaporodási képesség elérése a célunk, míg a kórokozó vagy romlást okozó mikroorganizmusok lehető legteljesebb mértékű elpusztítására törekszünk. Tartós és jó minőségű termékek előállításához alapvető fontosságú azoknak a törvényszerűségeknek a megismerése és megértése, amelyek meghatározzák a mikroorganizmusok szaporodását, túlélését és pusztulását az élelmiszerekben.
Mikroorganizmusok szaporodása Az egysejtű baktériumok többsége kettéosztódással szaporodik, ami a populációt alkotó sejtek számának növekedését okozza. Módszertanilag ezt tenyésztési eljárásokkal lehet követni, ami többnyire a táptalajokon képződő, szabad szemmel is látható telepek számának meghatározása. A mikrobaszám helyett ezért gyakran használják a telepképző egységek számát (tke, a szakirodalomban cfu, colony forming units). A szaporodás kifejezhető az egységnyi térfogatban található sejtek koncentrációjának növekedésével is; ez meghatározható a sejtek tömegének közvetlen (pl. szárazsúly mérés) vagy közvetett (pl. turbidimetriás) vizsgálatával. Egy adott populáció sejtjeinek száma, koncentrációja vagy tömege nem feltétlenül azonos. Tenyésztéssel csak az élő sejtek számát határozzuk meg, más módszerek az összes sejt tömegére vonatkoznak. A hífafonalas penészgombák ivaros vagy ivartalan szaporítóképletek (spórák, konídiumok) útján szaporodnak, a gyakran tömeges telepképző egységek számának meghatározása nem alkalmas a szaporodás követésére. Fonalas mikroorganizmusoknál csak a teleptömeg növekedése hozható analógiába az egysejtű mikroorganizmusok kettéosztódásos szaporodásával. A szaporodás vizsgálati módszereivel a 10. fejezetben foglalkozunk. A sejtpopulációk szaporodásának tanulmányozására többféle módszer egyaránt alkalmas, és ezekkel a szaporodás alapvető törvényszerűségei megismerhetők.
A szaporodás kinetikai törvényszerűségei Ideális körülmények között (tápanyagok korlátlanul és a tenyészetben egyenletesen eloszolva rendelkezésre állnak, gátló anyagok nem képződnek) egy mikrobapopuláció minden sejtje bizonyos idejű növekedés után kettéosztódik, majd erre ugyanennyi idő elteltével ismét és ismét sor kerül. Az osztódások közti időt generációs időnek nevezik és tg-vel jelölik. Ha a kezdeti sejtszám N0 és a generációs idő állandó, akkor a populáció sejtszámának növekedése N0 → 2 N0 → 4 N0 → 8N0 és így tovább, 19
A mikroorganizmusok szaporodása és pusztulása vagyis 2o N0 → 21 N0 → 22 N0 → 23 N0 … és n generáció után: Nn = 2n N0, ami azt mutatja, hogy a populáció exponenciálisan szaporodik optimális, nem korlátozott körülmények között. Ha az n generációig eltelt idő t és ezt elosztjuk a generációs idővel, kapjuk: Nt = 2t/tg N0, vagy: ln (Nt/N0) = t/tg ln2. Legyen ln 2/tg = μ, akkor ln (Nt/N0) = μt ln Nt = ln N0 + μt és Nt = N0eμt. Ez a populációszaporodást leíró alapegyenlet, amelyben μ a populáció specifikus szaporodási sebessége. Ha az egyetlen generációig eltelt időt vesszük, akkor t = tg és Nt = 2N0, valamint ln 2N0 = ln N0 + μtg, μ = ln2/tg = 0,693/tg, tehát a specifikus szaporodási sebesség fordítva arányos a populáció generációs idejével. Egyik kiindulási feltételünk szerint a populáció sejtjei azonos időben (szinkron) osztódnak. Természetes körülmények között azonban a populáció heterogén, a sejtek az életciklus különböző állapotában vannak (még növekednek vagy éppen osztódnak) benne. Ilyenkor, bármely időpillanatban, a sejtkoncentráció növekedése, vagyis a populáció szaporodási sebessége arányos az éppen jelenlévő sejtek koncentrációjával (X): dX/dt = μX, integrálva 0 és t időhatárok közt: Xt = X0 eμt és ln Xt = ln X0 + μt, ami analóg a szaporodást leíró alapegyenlettel. További kiindulási feltételezés volt, hogy a sejtek szaporodása korlátlan és a generációs idejük állandó. Ha ez így lenne, és a sejtek 20 percenként osztódnának, akkor egyetlen sejtből kiindulva 48 óra alatt mintegy 1043 sejt képződne. A sejtek átlagos súlyát 10–12 g-nak véve, a populáció összes tömege meghaladna 1028 kg-ot, vagyis a Föld tömegének 4000-szeresét. Ez nyilvánvalóan nem történik meg, mivel a szaporodás korlátozódik és nem állandó sebességgel folyik, vagyis a kiinduló feltételezések nem helytállók. A szaporodást korlátozzák egyrészt az ökológiai tényezők (a tápanyagok mennyisége, a pH, az aw, a hőmérséklet), másrészt 20
A mikroorganizmusok szaporodása és pusztulása a képződő anyagcsere-termékek, továbbá a sejtek életkora is – csak bizonyos ideig képesek szaporodni. (Egy élesztősejt pl. legfeljebb csak 10–15-ször sarjadzik, amint azt a sejten képződő összes sarjhegek száma mutatja.) Általános tapasztalat szerint a mikroorganizmusok populációinak szaporodási sebessége jellegzetes szakaszok szerint változik.
A szakaszos szaporodási görbe Ha a populáció sejtszámát vagy koncentrációját az idő függvényében ábrázoljuk, jellegzetes, S alakú szaporodási görbét kapunk, ami szakaszokra tagolható (2.1. ábra). A környezethez való alkalmazkodás idején a sejtek még nem szaporodnak, ez a lappangási (lag) szakasz. Az anyagcsere-folyamatok felgyorsulását követően indul meg a szaporodás, ami rövid átmeneti gyorsulási szakasz után az exponenciális szaporodási szakaszba jut, amelyben állandó fajlagos sebességgel folytatódik. Ez a szakasz optimális feltételek közt is csak néhány óráig tart, majd az említett korlátozó tényezők miatt a szaporodási sebesség csökken (lassulási szakasz), amíg a keletkező új sejtek és az elpusztuló sejtek száma kiegyenlítődik és a sejtpopuláció az állandósult (stacionárius) szakaszba jut. Hosszabb idő után az elpusztult sejtek száma már meghaladja a szaporodókét, és a sejtszám fokozatosan csökken (pusztulási szakasz).
2.1. ábra - Az egysejtű mikroorganizmusok szakaszos szaporodási görbéje. ––– sejtkoncentráció, - - - log sejtkoncentráció, I. lappangási (lag), II. gyorsulási, III. exponenciális (logaritmusos), IV. lassulási, V. állandósult (stacionárius), VI. hanyatlási, VII. pusztulási szakasz
21
A mikroorganizmusok szaporodása és pusztulása A szaporodási görbe szakaszait a változó szaporodási sebesség jellemzi. Adott körülmények között a szaporodási sebesség az exponenciális szakaszban éri el a legnagyobb és állandó értéket. Az exponenciális szaporodást leíró összefüggés csak erre a szakaszra érvényes. Az egyenlet logaritmusos alakja az exponenciális szakaszra egyenes vonalat ad, amelynek hajlásszöge arányos a szaporodási sebességgel (2.2. ábra).
2.2. ábra - A szaporodási sebességi együttható meghatározása a szakaszos szaporodási görbéből I. lappangási (lag), II. gyorsulási, III. exponenciális (logaritmusos), IV. lassulási, V. állandósult (stacionárius)
Az ábrából a μ értéke könnyen kiszámítható. A szakaszos szaporodási görbén kívül szokásos a szaporodási sebességi görbét is ábrázolni (2.3. ábra). Ha a szaporodási sebességet a sejtkoncentráció függvényében vesszük fel, az exponenciális szakasz meredeksége (hajlásszöge) közvetlenül a μ értékét adja, az alapegyenletből ugyanis:
22
A mikroorganizmusok szaporodása és pusztulása
2.3. ábra - A szakaszos szaporodási sebességi görbe I. lappangási (lag), II. gyorsulási, III. exponenciális (logaritmusos), IV. lassulási, V. állandósult (stacionárius)
A populáció sejtszáma és a szaporodási sebesség közti összefüggés leírására az ún. logisztikus egyenlet szolgál, ami azon a felismerésen alapul, hogy a szaporodási sebesség csökken, amint a populáció sejtkoncentrációja nő:
ahol: μmax – a fajlagos szaporodási sebesség maximális értéke, Xv – pedig az elért végső sejtkoncentráció. Az egyenlet a valós tapasztalattal egyező, szigmoid alakú görbét ír le (2.4. ábra), ami a maximális szaporodási sebesség elérése után egy állandósuló, maximális sejtkoncentrációhoz közelít.
23
A mikroorganizmusok szaporodása és pusztulása
2.4. ábra - A logisztikus egyenlet szerinti szaporodási görbe X: sejtkoncentráció, X0: kezdeti, XV: végső sejtkoncentráció, t: idő
Több más matematikai megközelítés is igyekszik leírni a populáció és a szaporodási sebesség viszonyát. Ezek közül a Gompertz-egyenletet és annak módosított változatait gyakran használják az élelmiszer-mikrobiológiában, különösen az ún. prediktív modellek kidolgozásánál (9. fejezet). Az egyenlet három egymásra épülő exponenciális tagot tartalmaz és négy paramétert (A, B, C, M), amelyekből az exponenciális szaporodási sebesség (μ), a generációs idő (tg), a lappangási szakasz ideje (L) és a maximális sejtkoncentráció (Nv) kiszámítható: Nt = A + C · e[–e{–B(t – M)}], ahol: Nt – a t időben mért sejtszám logaritmusa, A – a kezdeti sejtszám, C – a kezdeti és a maximális sejtszám különbsége, B – a maximális szaporodási sebesség és M –a maximális szaporodási sebesség elérésének ideje (2.5. ábra).
24
A mikroorganizmusok szaporodása és pusztulása
2.5. ábra - A szigmoid alakú túlélési görbét leíró Gompertz-egyenlet N: sejtszám, t: idő; A, B, C, L, M jelentését lásd a szövegben
Az egyenletből: μ = BC/e; L = M – (1/B); tg = log2 e/BC; Nv = A + C. A Gompertz-egyenlet jobban illeszkedik az S alakú szaporodási görbéhez, mint a logisztikus egyenlet, azonban nagyon érzékeny a paraméterek pontosságára, ezért nagyszámú mért adatra van szükség a számításhoz.
Szaporodást befolyásoló tényezők Mint arra az 1. fejezetben rámutattunk, a mikroorganizmusok szaporodását számos ökológiai tényező befolyásolja, így a tápanyagok, a hőmérséklet, a vízaktivitás, a pH, az Eh és mások. E tényezők hatásának számításához és értékeléséhez azok matematikai leírása szükséges. A szaporodást korlátozó tápanyag-koncentráció hatását a szaporodási sebességre a Monod-egyenlet írja le:
ahol: μmax – a maximális szaporodási sebesség, 25
A mikroorganizmusok szaporodása és pusztulása S – a szubsztrátkoncentráció és KS – a telítési állandó, az a koncentrációérték, amelynél a szaporodási sebesség a maximális fele (2.6. ábra).
2.6. ábra - A szaporodási sebesség és a tápanyag-koncentráció összefüggése µ: fajlagos szaporodási sebesség, µm: maximális fajlagos szaporodási sebesség, KS: telítési állandó, S: szubsztrátkoncentráció
Természetes élőhelyeken gyakran előfordul tápanyagszegénység, az élelmiszerekben azonban általában nem ez a helyzet, hanem éppen az ellenkezője, hogy valamely tápanyag (pl. cukor) túl nagy koncentrációban van jelen, ami a szaporodási sebességet gátolja. Ezt veszi figyelembe a Haldane által módosított egyenlet, a Ki gátlási állandó bevezetésével:
Az összefüggés alkalmazható gátlóanyagok (pl. NaCl, benzoesav) koncentrációja hatásának értékelésére is. A tápanyag-koncentráció nemcsak a szaporodás sebességét, hanem a szaporodás eredményét, hozamát, a populáció gyarapodását is meghatározza. Ez különösen jelentős a mikrobasejttömeg előállítására irányuló folyamatokban (pl. sütőélesztő gyártása, ipari fermentációk). A sejthozamot az állandósult szakaszig elért sejtkoncentráció (Xv) és a kezdeti sejtkoncentráció (X0) közti különbség mutatja, amit a felhasznált tápanyag mennyiségére vonatkoztatva a hozamállandót (Y) kapjuk: Y = (Xv – X0)/S, 26
A mikroorganizmusok szaporodása és pusztulása ami azt fejezi ki, hogy egységnyi tápanyag-mennyiségből mekkora sejttömeg keletkezett. Abban az esetben, ha a szaporodást valamely tápanyag koncentrációja korlátozza, akkor a populáció koncentrációjának pillanatnyi növekedése arányos a felhasznált tápanyaggal: dX/dS = – Y és a tápanyag-koncentráció változásának sebessége (dX-et a szaporodási alapegyenletből behelyettesítve és átrendezve): – dS/dt = μ X/Y, ahol: a negatív előjel arra utal, hogy a felhasználás miatt a tápanyag-koncentráció csökken. A szaporodást lényegesen befolyásoló környezeti tényező a hőmérséklet. Ennek a szaporodási sebességre gyakorolt hatását az Arrhenius-egyenlettel szokás kifejezni: μ = A · e–E/RT, ahol: A – empirikus állandó, E – az aktivációs energia, R – az egyetemes gázállandó (8,314 J mol–1 K–1), T – az abszolút hőmérséklet (K), Az egyenlet eredetileg a kémiai reakciók sebességének hőmérséklet-függésére vonatkozott, biológiai rendszerekre általánosítva. E a szaporodást korlátozó reakció aktivációs energiája, amelyet a folyamat hőmérsékleti jellemzőjének lehet tekinteni. Az egyenlet logaritmusos alakja: log μ = log A – E /2,303R · 1/T mutatja, hogy a szaporodási együttható logaritmusát az abszolút hőmérséklet reciprokának függvényében ábrázolva olyan egyenest kapunk, amelynek tengelymetszete az A állandó logaritmusával, meredeksége pedig a – E/2,303R kifejezéssel egyenlő. Ez utóbbiból az E hőmérsékleti jellemző kiszámítható (2.7. ábra). A nagy hőmérsékleti jellemzőjű folyamatok sebessége gyorsan nő a hőmérséklettel, míg a kisebb E-értékűeké lassabban.
27
A mikroorganizmusok szaporodása és pusztulása
2.7. ábra - A szaporodási sebesség hőmérséklet-függésének Arrhenius-görbéje
A pszichrofil mikroorganizmusok szaporodásának hőmérsékleti jellemzője általában 45 kJ/mol · K-nál kisebb, a mezofileké 50–60 kJ/mol · K közötti, a termofileké pedig meghaladja a 85 kJ/mol · K-t. A 2.7. ábra mutatja azonban, hogy az Arrhenius-egyenlet a mikroorganizmusok szaporodására csak szűk határok közt érvényes; a görbe a szaporodás alsó és felső hőmérsékleti határainál már nem lineáris és meredeken letörik. Az optimálistól eltérő hőmérsékletek és a szaporodási sebesség viszonyára Ratkowsky vezetett be egy egyszerű képletet:
miszerint a szaporodási sebesség négyzetgyöke arányos (b) az adott hőmérséklet (T) és a minimális szaporodási hőmérséklet (Tmin) különbségével. Ez az összefüggés kiterjeszthető a maximális szaporodási hőmérséklet (Tmax) irányába is:
ahol: c – egy további, mérésekkel meghatározható együttható. A négyzetgyökmodellel jellemezhető más környezeti tényezőknek a szaporodási sebességre gyakorolt hatása, így pl. a vízaktivitásra, vagy a pH-ra, sőt, ezeknek a hőmérséklettel együtt kifejtett hatására is:
28
A mikroorganizmusok szaporodása és pusztulása
Fonalas mikroorganizmusok szaporodása Az eddig tárgyalt, a szaporodást és az azt befolyásoló tényezők hatását leíró összefüggések az egysejtű, kettéosztódással szaporodó baktériumokra vonatkoznak, de érvényesek a sarjadzással szaporodó élesztőgombákra is, amelyek szaporodása a sejtszám vagy sejtkoncentráció növekedésében nyilvánul meg. A fonalas mikroorganizmusok (a penészgombákon kívül bizonyos baktériumok, pl. a sztreptomiceszek) szaporodásának sajátossága, hogy nem jár a sejtszám (a telepképző egységek számának) gyarapodásával, hanem a spórák vagy konídiumok kicsírázása után a gombafonál növekedésével, ami a hífa csúcsára szorítkozik, vagy elágazásokkal fokozódik. A szaporodás követése a sejttömeg mérésével, vagy a gombákra jellemző valamely sejtalkotó (kitin, ergoszterin) meghatározásával nem eléggé megbízható módszer, és nagyon munkaigényes is (10.4.3.). Mivel a gombatenyészetek leggyakrabban a felületeken alakulnak ki, és növekedésük sugárirányban terjed, a szaporodás legegyszerűbb vizsgálati módszere a telepátmérő mérése, ha feltételezzük, hogy a sejttömeg arányos a hífahosszal és a kialakuló telepet lényegében kétdimenziósnak tekintjük (elhanyagolva a légmicéliumot vagy a szubsztrátumba hatoló hífákat). A kicsírázás utáni lappangási fázist követően a telepátmérő növekedése rövid ideig és kis méret (~ 100 μm) eléréséig exponenciális, majd bizonyos méret után a hífa hosszúsága (a tápanyagok szállítása miatt) korlátozóvá válik, a csúcsi növekedés sebessége állandósul és a telepátmérővel (2r) arányossá válik: d 2r/dt = a. Egy idő után a telep közepén a növekedés megszűnik, és csak a telep szélének szűk gyűrűjére korlátozódik. Ilyenkor a sugárirányú növekedés már nem fejezi ki a teleptömeg növekedését. Felszíni telepek esetén általában igaz, hogy a növekedés arányos a mindenkori teleptömeg négyzetgyökével, míg folyadékokba merült, háromdimenziós (pelyhes) telepek növekedése a micéliumtömeg 2/3 hatványával arányos (b és c állandók): dX/dt = b · X½, illetve dX/dt = c · X2/3. Fiatal telepeknél a telepátmérő növekedési sebessége alkalmas a szaporodás jellemzésére és behelyettesíthető az egysejtű mikroorganizmusok fajlagos szaporodási sebességének helyére a szaporodást befolyásoló tényezők hatását leíró összefüggésekbe.
Mikroorganizmusok pusztulása A mikroorganizmusok szaporodásuk utolsó szakaszában természetes körülmények közt is pusztulni kezdenek, ami felülmúlja a keletkező új sejtek számát, és a populáció élősejt-koncentrációja csökken. A környezeti tényezők szabályozásával, túl azok maximális tűrési értékén, szándékosan is kiválthatjuk a mikrobapopulációk pusztulását. Ez az élelmiszer-tartósítás alapja. A mikroorganizmusok elpusztítására az élet sok más területén is szükség van, az orvosi műtőktől és eszközöktől az űrhajók sterilezéséig. Az élelmiszeriparban a mikrobapusztulás kinetikai törvényszerűségeinek és a befolyásoló tényezőknek az ismerete nélkülözhetetlen a biztonságos és a tartós termékek gazdaságos előállításához, a tényezők kölcsönhatásának kihasználása pedig kíméletesebb tartósítást és jobb minőségű termékek gyártását teszi lehetővé. A mikroorganizmusokat elpusztító tényezők közül a legfontosabb a hőkezelés, amihez az utóbbi években egyre újabb, nem hagyományos és nem hőkezelésen alapuló 29
A mikroorganizmusok szaporodása és pusztulása technológiák (pl. besugárzás, nagy nyomás és mások) csatlakoztak. Alkalmazásukhoz elengedhetetlen a mikrobapusztító hatás alapjainak ismerete, amivel ebben a fejezetben foglalkozunk. A tartósító technológiák gyakorlati alkalmazásának mikrobiológiáját a 6. fejezetben tárgyaljuk.
Pusztulási kinetika A mikroorganizmusok pusztulásának vizsgálatánál az a módszertani probléma merül fel, hogy az elpusztult, halott sejteket biztonsággal nem lehet kimutatni. Egy mikrobasejt akkor tekinthető halottnak, ha többé nem képes szaporodni, ezért a mikroorganizmusok pusztulását a cid hatás után még életben maradt, szaporodásra képes, túlélő sejtek kimutatásával vizsgáljuk. Bár egyetlen sejt pusztulása pillanatszerű, azonban a sejtpopuláció pusztulása időben lejátszódó folyamat, ami – hasonlóan az egysejtű mikroorganizmusok szaporodásához – az elsőrendű kémiai reakciók analógiájára írható le: dN/dt = – k · N, vagyis a túlélő sejtek számának (N) változása t idő alatt arányos a mindenkori sejtszámmal, ahol a k arányossági tényező a pusztulási sebességi együttható (előjele negatív, mert a sejtszám csökken). Az egyenletet N0 (kezdeti sejtszám) és Nt (túlélő sejtszám t időben) határok közt integrálva a mikrobapopulációk pusztulásának alapegyenletét kapjuk: Nt = N0e–kt Az egyenletet logaritmálva a túlélési görbe egyenletéhez jutunk: log Nt/N0 = – kt, amelyből a pusztulási sebességi együttható (k) kifejezhető: k = 2,303/t · log (N0/Nt). A túlélő sejtek logaritmusát az idővel szemben ábrázolva egyenest kapunk, amelynek meredeksége a pusztulási sebességi együtthatóval arányos (2.8. ábra).
30
A mikroorganizmusok szaporodása és pusztulása
2.8. ábra - A túlélési görbe és a tizedelődési idő (D)
Ha t idő az az időtartam, amely alatt a túlélő sejtek száma tizedére csökken, akkor a tizedelődési idő (D) fogalmához jutunk. Ha tehát Nt = 0,1N0 és t = D, akkor k = 2,303/D, vagy D = 2,303/k. Tehát a pusztulási sebességi együttható és a tizedelődési idő egymással fordítottan arányos. Minél gyorsabb egy populáció pusztulása, annál rövidebb a tizedelődési idő, és fordítva. A D érték dimenziója idő (perc vagy óra), a pusztulási sebességé idő–1, így az előbbi szemléletesebb. A tizedelődési idő a mikrobapopuláció ellenálló képességének, rezisztenciájának mértéke is, minél nagyobb a D érték, annál ellenállóbb a mikroba az adott cid hatással szemben. A D (vagy k) érték csak akkor egyértelmű, ha megadjuk a behatásnak azt a mértékét (dózisát), amelyre vonatkozik, pl. D65 a tizedelődési idő 65 °C-on. A lineáris túlélési görbe szerint minden D időtartam alatt a sejtek 90%-a pusztul el (10%-a marad életben), 2D alatt 99,9%, 3D alatt 99,99% és így tovább. Ez azt jelenti, hogy a pusztulási sebesség állandó, továbbá független a kezdeti sejtszámtól. A gyakorlatban természetesen nem elegendő a populáció 90 vagy akár 99,99%át elpusztítani, hanem a biztonság érdekében ennél jóval nagyobb pusztulási arányt kell elérni; bár a túlélési görbéből látható, hogy teljes sterilezést elvileg nem lehet megvalósítani. A túlélő sejtek számát 8–10 nagyságrenddel csökkentve azonban már olyan mértékű pusztulás érhető el, hogy az életben maradt sejtek száma a kezdeti populáció elenyésző hányadára csökken. Bármely kezdeti sejtszám esetén a többségi pusztulási idő (τ): τ = D (log N0 – Nt). Ha a többségi pusztulási idő (vagy a D érték) logaritmusát a pusztító hatás különböző erősségű dózisainak függvényében ábrázoljuk (pl. hőkezelésnél több hőfok, vegyszeres kezelésnél több koncentráció), akkor a pusztulási görbét kapjuk (2.9. ábra). A görbe meredeksége jelzi a mikroorganizmus rezisztenciájának változását a pusztító hatás erősségének függvényében. Ennek a rezisztenciának jellemzője a z-érték, a pusztító dózis növelésének az a mértéke, amely a pusztulási vagy tizedelődési időt 1 log nagyságrenddel (vagyis tizedére) csökkenti. A z-érték nem más, mint a pusztulási görbe meredekségének (iránytangensének) negatív reciproka (2.10. ábra).
31
A mikroorganizmusok szaporodása és pusztulása
2.9. ábra - Mikrobapopulációk pusztulási görbéi z: rezisztencia jellemző, a tizedelődési időt (D) tizedére csökkentő pusztító hatás mértéke; a növekvő rezisztenciájú populációk: 1 < 2 < 3
2.10. ábra - A hőpusztulási görbe és a z-érték
A pusztulási görbe alkalmazásának legfontosabb területe a hőkezeléses tartósítás. A hőpusztulási görbe a különböző hőmérsékletekhez tartozó tizedelődési vagy többségi pusztulási idők logaritmusát ábrázolja (2.11. ábra). A hőrezisztencia jellemzője, a z érték, az a hőmérséklet-növekedés, amely a pusztulási időt egytizedére csökkenti. A z értéket mindig az adott pusztító hatás valamely referenciaértékéhez viszonyítják, hőkezelés esetén 121,1 °C-hoz, amely a sterilezési gyakorlatban fontos hőmérséklet (az angol nyelvterületen eredetileg 250 F); az ehhez tartozó többségi pusztulási időt F értéknek nevezik: log (D – Dr) = – (T – Tr)/z, 32
A mikroorganizmusok szaporodása és pusztulása log (τ – F) = – (T – 121,1)/z.
2.11. ábra - A hőpusztulási görbe egyenlete
Ezt az összefüggést használják átalakítva a hőkezelés-szükségleti számításokhoz, a sterilezési folyamatok méretezésénél (5.1.3.): log F/τ = (T – 121,1)/z. A z-érték, mint rezisztenciajellemző, általánosítható más pusztító dózisra vagy a pusztulást befolyásoló tényezőre, pl. log (D – Dr) = – (P – Pr)/zP, ahol: Dr – a tizedelődési idő a Pr referencia nyomáson, zP – az a nyomásnövekedés, amely a D-értékét egy log egységgel csökkenti. Hasonlóan zaw az a vízaktivitás-csökkenés a referenciaértékhez (aw = 1) viszonyítva, amely a tizedelődési időt tizedére csökkenti.
Nem exponenciális pusztulási kinetika A gyakorlatban kapott túlélési görbék alakja (féllogaritmusos ábrázolásban) nem mindig egyenes, hanem görbült (domború, konvex vagy homorú, konkáv), az elején vállasodó, vagy a végén ellaposodó (2.12. ábra). Az ilyen nem exponenciális jellegű pusztulási folyamat valószínű magyarázata a mikrobapopuláció sejtjeinek eltérő rezisztenciája. 33
A mikroorganizmusok szaporodása és pusztulása
2.12. ábra - Nem exponenciális jellegű túlélési görbék
Ez mind elméleti, mind gyakorlati szempontból igen jelentős. Ha a pusztulás nem exponenciális (a log túlélési görbe nem lineáris), akkor a pusztulási sebesség, illetve a tizedelődési idő nem állandó, és nem lehet a többségi pusztulási időt a D többszörösével számolni, pl. a hőkezelés-szükségletet ennek alapján méretezni. A nem exponenciális túlélési görbék leírására többféle modell született. Ezek egyik formája a Weibull-féle rezisztenciamegoszláson alapul: log N = log N0 – (t/δ)p ahol: log N – a t időben mért túlélő sejtszám logaritmusa, log N0 – a kezdeti sejtszám logaritmusa, δ – a pusztulási arány (analóg a D-értékkel) és p – a görbe alakjára jellemző paraméter. p = 1 esetén a görbe lineáris, ha p > 1, a görbe lefelé hajló (konvex), ha p < 1, a görbe felfelé hajló (konkáv). A sejtpusztulást az eltérő rezisztenciájú sejtek valószínűségi megoszlásával értelmező elképzelés szerint az egyik esetben (p < 1) a behatást túlélő sejtek pusztulásának valószínűsége kisebb, mivel a rezisztensebb vagy a stresszhez alkalmazkodni képes sejtek tovább maradnak életben, míg a másik esetben (p > 1) a még életben maradt sejtek érzékenysége fokozódik, károsodásuk mértéke túlélésük valószínűségét csökkenti. Ami a δ paramétert illeti, annak értéke állandó, ha p = 1, más esetben azonban erősen függ a p paramétertől (a görbe alakjától). Növekszik, ha p < 1 és csökken, ha p > 1. Mivel δ értéke változik a pusztító kezelés (pl. hőmérséklet) nagyságával (dózisával) is, jelentése csak a túlélők első tizedelődési idejére korlátozódik és nem extrapolálható a D-értékhez hasonlóan. 34
A mikroorganizmusok szaporodása és pusztulása
A pusztulást befolyásoló tényezők A mikroorganizmusok pusztulását sokféle ökológiai tényező szélsőséges értéke kiválthatja. A gyakorlatban főként a nagy hőmérsékletet alkalmazzák, újabban az ionizáló sugárzás, a nagy nyomás, az elektromos erőtér és egyéb, nem a hőmérséklet növelésén alapuló mikrobapusztító hatások alkalmazási lehetősége is szóba jön. Valójában egyik kitüntetett pusztító tényező hatása sem egymagában érvényesül, hanem más környezeti tényezők befolyásolják, módosítják. Az önmagukban nem elégséges pusztító dózisok egymást erősítő, kombinált alkalmazása különösen jelentős lehetőség a kíméletesebb, az élelmiszer minőségét jobban megőrző, de biztonságos tartósító eljárások kialakítása céljából. A pusztító tényezők kölcsönhatásának ismerete és értelmezése ezért alapvetően fontos. Számtalan összefüggést dolgoztak ki és alkalmaztak a különböző tényezők (hőmérséklet, pH, aw, vegyszer-koncentráció) kölcsönhatásának leírására. Ezek egyike annak az egyenletnek a módosítása, amelyet még Bigelow dolgozott ki 1920-ban a logaritmusos jellegű hőpusztulási folyamatra. A módosítással az egyenlet kiterjed a hőmérséklet, a pH és a vízaktivitás együttes hatásának leírására:
ahol: zT, zpH , zaw – rendre a Tr, pHr és aw a referencia hőmérséklet (121,1 °C), pH (7) és vízaktivitás (1) értékekhez viszonyított különbségek, amelyek a D érték tizedre csökkenését okozzák, míg Dm – a különböző tényezők referenciaértékén mért tizedelődési időnek az élelmiszermatrixtól (összetételétől) függő változása.
Mikroorganizmusok rezisztenciája A mikroorganizmusok ellenálló képességét a különböző ökológiai tényezőkkel szemben a 2. fejezetben általánosságban áttekintettük, részleteiben pedig a tartósító eljárások mikrobiológiájával kapcsolatban a 6. fejezetben tárgyaljuk. A továbbiakban a rezisztenciát meghatározó és az azt befolyásoló tényezőkről a mikrobasejtek reakciómechanizmusainak vonatkozásában lesz szó. A mikroorganizmusok életkörülményei mind természetes élőhelyeiken, mind élelmiszerekben gyakran változnak. Válaszreakcióikat, amelyekkel a körülményekhez igyekeznek alkalmazkodni, bonyolult genetikai és biokémiai mechanizmusok irányítják. E mechanizmusok molekuláris részleteit csak az utóbbi években kezdték feltárni; megismerésük nemcsak elméleti, hanem gyakorlati szempontból is jelentős. A mikroorganizmusokat érő kedvezőtlen környezeti tényezőket általánosságban stresszhatásoknak nevezzük. Mértéküket tekintve lehetnek szaporodásgátlók (optimálistól eltérő hőmérséklet, tápanyaghiány, savas pH stb.), vagy lehetnek halálosak (hőkezelés, fagyasztás, szárítás, mérgező vegyi anyagok stb.). A sejtek még az optimális határok között bekövetkező, de hirtelen változást (pl. a hőmérséklet 20-ról 40 °C-ra növelését) is stresszhatásként érzékelik. A stresszhatás kivédésére a mikroorganizmusok csak bizonyos határok közt képesek, azokon túl a sejtek sérülnek, károsodnak. A túlélő sejtek a hatás elmúltával, kedvező körülmények között 35
A mikroorganizmusok szaporodása és pusztulása képesek lehetnek a sérülés kijavítására, helyrehozatalára, de lehetséges az is, hogy bár életben maradnak, szaporodni már nem tudnak. Ez az élő, de nem szaporodó állapot (rövidítése VNC) különösen fontos az élelmiszer-mikrobiológiában a kórokozó mikroorganizmusok megítélése szempontjából.
Stresszválaszok A mikroorganizmusok a stresszhatásokra különböző túlélési válaszokkal reagálnak. Bizonyos baktériumokban (pl. Bacillusok, Clostridiumok) összetett differenciálódási program indul meg, ami a rezisztens endospórák képződését eredményezi. A baktérium endospórák általános jellemzője, hogy a vegetatív sejteknél jóval ellenállóbbak a különböző környezeti tényezőkkel szemben (hőmérséklet, ionizáló sugárzás, toxikus kémiai anyagok stb.). A spórák nagy ellenálló képessége a képződésükkor kialakuló sajátos szerkezetnek és kémiai összetevőknek tulajdonítható, amelyek következtében a spóraplazma víztelenedik (3.2.8. fejezet). A baktériumok vegetatív sejtjeinek és endospóráinak rezisztenciája között lényeges különbség van. A gombák bizonyos kitartó képletei (pl. klamidospórák) ellenállóbbak, mint a vegetatív sejtjei, azok rezisztenciáját viszont az ivaros vagy ivartalan spóraalakoké lényegesen nem haladja meg. A vegetatív sejtek (baktériumok, gombák és más mikroorganizmusok egyaránt) általános stresszreakciója az aktív (exponenciális) szaporodás megszűnése. Baktériumok a stacionárius szakaszba kerülnek, míg a gombák sejtciklusában az ún. G1 fázis áll be, amelyből a szaporodást időlegesen felfüggesztő G0 fázisba is átléphetnek. A szaporodás leállását további védekező válaszreakciók követik (sejtmembránok összetételének változása, a citoplazma tartalékanyagainak felhalmozódása és az ún. hősokk fehérjék szintézise). Mindezek növelik a sejt ellenállását a hőmérsékleti, ozmózisos, oxidatív és más tényezőkkel szemben. Érdekes jelenség, hogy míg a válaszok egy része specifikus változás a kiváltó stresszhatással szemben, más részük általános reakció és nemcsak egyféle, hanem többirányú rezisztenciát okoz. A tápanyaghiány pl. egyaránt megnöveli az ellenálló képességet a hőmérséklettel, besugárzással, egyes kémiai anyagokkal szemben. A hőmérséklet az egyik legfontosabb és a legrészletesebben vizsgált stresszhatás. A hőmérsékletre adott válaszreakcióknál ismerték fel, hogy a sejtek különböző fehérjék szintézisével reagálnak, amelyeket hősokk proteineknek (hsp) neveztek el. A továbbiakban ezt a nevet alkalmazták az egyéb stresszhatásokra képződő fehérjékre is; egy részük valóban közös a hőhatásra indukálódó fehérjékkel, más részük a kiváltó tényezőre specifikus. A sejtekben 50–60, olykor még többféle hsp képződik. Köztük lebontó enzimek (proteázok, RN-ázok), a fehérjeszerkezetet stabilizáló, ún. chaperonok vannak, és különösen jelentősek azok a szigma faktorok, amelyek az RNS-polimeráz alegységeként a gének átírásában szerepelnek. A hsp-k között jelennek meg olyan szintetizáló enzimek, amelyek a membránok lipidösszetételét változtatják meg; így pl. hideg hatásra jelentősen megnő a telítetlen zsírsavak aránya. A sejt egyensúlyi állapotának (ún. homeosztázisának) fenntartása érdekében a citoplazma oldott anyagaival összeférő, kompatibilis vegyületek képződnek (trehalóz, betain, karnitin), nemcsak az ozmózisos sokk kivédésére, hanem a hőellenállás vagy a fagytűrés növelésére is. Sok ismeret gyűlt össze a stressz jelzésének és válaszreakcióinak molekuláris mechanizmusáról, különösen a genetikailag legjobban feltárt baktérium, az E. coli, valamint az eukariota sejtű élesztőgomba, a S. cerevisiae különböző mutánsainak példáin. Az utóbbi években, mind több mikroorganizmus teljes genomjának feltárása is lendületet adott az ilyen irányú kutatásoknak. A baktériumokban kéttagú foszfo-jelfogó működik: a membránban elhelyezkedő stresszérzékelő fehérje hisztidin aminosava foszforileződik, majd átadja a foszfátcsoportot a citoplazmában található jeltovábbító fehérje aszparaginjának, miáltal ennek DNS-kötődése aktiválódik, és az eddig néma génekről megindul az átírás. Az eukariotákban jóval összetettebb jelzősorozat, a „mitogén aktivált foszfokináz” (MAPK) rendszer működik. Ennek funkciója széleskörű: a stressz válaszreakciókon kívül az ivaros párosodásban, meiózisban és spóraképzésben, a fonalas növekedésben egyaránt szerepel. A hsp-szintézis csak időleges, a stresszhatás után néhány órával megszűnik. Ennek szabályozásában összetett aktiváló és inaktiváló (induktor és represszor) fehérjék vesznek részt, így pl. a szigma faktorok aktivitása csak igen rövid ideig (néhány percig) tart. A stresszhatást szabályozó molekuláris mechanizmus feltárása fontos információkat ad ahhoz, hogy alkalmazását elősegítse az ipari folyamatokban. 36
A mikroorganizmusok szaporodása és pusztulása
Sejtek sérülése, kijavítása és túlélése A mikroorganizmusok rezisztenciájával és az őket érő stresszhatásokkal összefüggő kérdések a sejtek sérülése, az azt kijavító, helyrehozó mechanizmus és a túlélő sejtek állapota. A pusztulást közvetlenül vagy azonnal nem okozó (szubletális) stresszhatások miatt a sejtek különböző sérüléseket szenvednek. Ez a szaporodóképesség elvesztésével jár, ami azonban nem végleges, ha a sérüléseit a sejt ki tudja javítani (2.13. ábra).
2.13. ábra - A mikrobasejtek válaszreakciói stresszhatásokra
A sérülés oka sokféle lehet, a stressz fajtája és mértéke szerint. A sérülés általában először a sejt külső részeit, a sejtfalat és az alatta lévő sejtmembránt éri. A Gram-negatív baktériumok sejtfalának külső, membránszerű lipopoliszacharid-rétege érzékenyebb a sérülésre, mint a Gram-pozitív sejtfal. A plazmamembrán sérülése mind szerkezeti változásokat (pl. pórusok képződését), mind működésbeli zavarokat okozhat (pl. permeabilitási gát elvesztése, transzport megszűnése). A membrán sérülései hatnak a citoplazmára is, az anyagcserében fontos tényezők, ionok, kofaktorok kiáramlanak a sejtből, a pH csökken, az anyagcsere egyensúlya, a homeosztázis állapota megbomlik. A Mg2+ leadása miatt a nukleinsavak és a riboszómák szerkezete is fellazul, az alapvető információs folyamatok (transzkripció, transzláció), valamint a DNS replikációja és kijavítása megszűnik. Az ultraibolya és ionizáló sugárzás közvetlenül is károsítja a DNS-t (pirimidin dimerek képződnek, az egyik vagy mindkét szál elszakad). A vegetatív sejtekhez képest a spórák jóval védettebbek a többszörös burkok, a spóraplazma víztelen állapota és a szünetelő anyagcsere miatt, azonban sérülés bekövetkezhet mind a burkolatban, a kortexben, a membránban, sőt, a DNS-ben is. A szubletális sérülés többféle következményben nyilvánul meg. A sérült sejtek lappangási szakasza meghosszabbodik, tápanyagigénye megnő, a környezeti tényezőkre érzékenyebbé válnak, a szaporodás optimális feltételei megváltoznak. A sérült sejteket néhány órás életre keltő kezelésben részesítve a szaporodás normálissá válik. Ez a kezelés optimális körülmények között (kedvező hőmérséklet, pH, aw, tápanyagok) lehetőséget ad a sérülések helyrehozatalára, kijavítására. Módszertanilag a sejtek sérülése tehát úgy mutatható ki, hogy elvesztik szaporodási képességüket szelektív táptalajokon, de képesek szaporodni, ha lassabban is, nem szelektív táptalajokon, életre keltés után pedig mindkettőn. A sejtek élő, de nem szaporodó (VNC) állapotban életre keltés után sem szaporodnak nem 37
A mikroorganizmusok szaporodása és pusztulása szelektív táptalajokon, ezért ennek az állapotnak a kimutatása meglehetősen bizonytalan, bár különböző fizikai vagy biokémiai módszerekkel anyagcsere-képességük igazolható, ezért élőnek tekinthetők. Ha hosszabb és körülményesebb életre keltés után mégis tenyészthetőkké válnak, akkor a különbség a VNC és a sérült állapot között csak abban mutatkozik, hogy az utóbbit szubletális stresszhatások váltják ki, az előbbi pedig enélkül bekövetkezik. A sérült sejtek jelentősége kettős. Egyrészt a patogének sérült sejtjei visszanyerhetik virulenciájukat és fertőzőképességüket, ezért kimutatásuk élelmiszer-biztonsági szempontból igen fontos. Másrészt, ha az élelmiszert kíméletesebb kombinált tartósítás után olyan körülmények közt tárolják, ami a mikrobasejtek sérülésének kijavítását és életre kelését gátolja, akkor a jobb érzékszervi minőség megtartása mellett a termék biztonsága és tartóssága garantálható.
38
3. fejezet - A mikroorganizmusok áttekintése Ebben a fejezetben az élelmiszer-ipari szempontból jelentős mikroorganizmusok főbb csoportjait vesszük szemügyre. Az élelmiszerek vonatkozásában a mikroorganizmusoknak három szempontból van jelentősége, ezek: 1. az élelmiszerrel terjedő kórokozók, 2. az élelmiszerek romlását okozók, és 3. az élelmiszerek elkészítéséhez használt mikroorganizmusok. A nagy mikrobacsoportok közül a baktériumok és a gombák mindhárom szempontból, a vírusok és a protozoonok csak mint kórokozók jönnek számításba.
A mikroorganizmusok helye az élővilágban Az élővilág megismerésében döntő felismeréseket hozott az elektronmikroszkóp kifejlesztése az 1960-as években. A sejtszerkezet szubmikroszkópos szintű különbségei szerint két alaptípus vált ismertté: a valódi sejtmaggal nem rendelkező prokariota sejt és a citoplazmától maghártyával elválasztott sejtmagot tartalmazó eukariota sejt. A baktériumok prokariota sejtű mikroorganizmusok, minden más élőlény, a zömében mikroszkópikus méretű és egysejtű algák, a protozoonok és a gombák, valamint a soksejtű makroorganizmusok: a növények és az állatok eukariota sejtűek. A nem sejtes szerkezetű, önálló anyagcserére képtelen vírusok az élővilág külön csoportját képezik. A két sejttípus között mind a sejtszerkezetben, mind a genetikai és élettani tulajdonságokban számtalan, további különbség mutatkozik. A genetikai információt hordozó dezoxiribonukleinsav (DNS) a prokariotákban egyetlen kromoszómát alkot, míg az eukariotákban több kromoszóma közt oszlik meg. A fehérjeszintézisben szereplő riboszómák a prokariotákban kisebbek (ún. 70 S méretűek), az eukariotákban nagyobbak (80 S méretűek). A prokariota sejt citoplazmájában általában nincsenek membránnal elkülönülő sejtszervecskék, az eukariotákban több ilyen is lehet, pl. a sejtlégzésben szereplő mitokondriumok, vagy a fotoszintézist végző kloroplasztiszok. Számos jel arra utal, hogy az élővilág evolúciója során az eukariota sejt két (vagy több) prokariota sejt szimbiózisából alakult ki; ennek egyik döntő bizonyítéka, hogy az eukariota sejtszervecskék megőrizték a prokariota jellegű, 70 S riboszómákat. Az élővilágról alkotott képet alapvetően megváltoztatták az 1980-as években kibontakozott molekuláris vizsgálatok, amelyek elsősorban a riboszóma ribonukleinsavra (rRNS) alapozódtak. Az ezeket alkotó nukleotidok sorrendjét (szekvenciáját) összehasonlítva, Carl Woese és munkatársainak az Illinois Egyetemen végzett vizsgálataiból kiderült, hogy az egységesnek vélt prokariota baktériumok két csoportra különíthetők: az ősbaktériumokra és a valódi baktériumokra, amelyek egymástól éppannyira kölönböznek, mint bármelyikük az eukariotáktól. Az rRNS szekvenciákon túl is alapvető különbségek vannak a kétféle prokariota és az eukariota sejttípus között (3.1. táblázat). Ennek alapján az élőlények három főcsoportra különíthetők el, amelyeket Archaea, Bacteria és Eukarya nevekkel illetnek (3.1. ábra).
3.1. táblázat - Baktériumok, archeák és eukarioták közti fő különbségek Jellemző
Baktériumok
Archeák
Eukarioták
Prokariota sejt
+
+
–
Maghártya
–
–
+
70 S riboszómák a citoplazmában
+
+
–
Sejtszerkezet
39
A mikroorganizmusok áttekintése Egyetlen kromoszóma
+
+
–
Észterkötésű lipidek
+
–
+
Murein sejtfal
+
–
–
DNS + hisztonfehérjék
–
+
+
Gének operonban
+
+
–
Plazmidok
+
+
–
RNS polimeráz sok alegységű
–
+
+
Kezdő metionin tRNS
–
+
+
Streptomicin gátlás
+
–
–
Kemolitotrófia
+
+
–
Nitrogénkötés
+
+
–
Metanogenezis
–
+
–
Anaerob fotoszintézis
+
–
–
Genetikai szerkezet
Anyagcsere
40
A mikroorganizmusok áttekintése
3.1. ábra - Az élővilág három birodalmának törzsfája a riboszóma kis alegység ribonukleinsavának szekvenciái alapján. A tenyészetekben ismert szervezetek nevein kívül a betű és számjelzések a természeti mintákból izolált nukleinsavval jellemzett, még nem tenyésztett szervezeteket jelölik
Az ősbaktériumok (Archaea) sajátos jellemzője, hogy sejtmembránjukat éterkötéssel kapcsolódó lipidek alkotják, szemben a baktériumokra és az eukariotákra egyaránt jellemző, észterkötésű lipidekkel. Ezzel szemben a valódi baktériumok (Bacteria) jellemzője a sejtfalat alkotó mureinváz, ami nem található a másik két 41
A mikroorganizmusok áttekintése csoportban. Érdekes, hogy sok molekuláris jellegzetesség közös az ősbaktériumok és az eukarioták között. Ilyenek főként a genetikai információt átíró és átfordító rendszerekben találhatók (pl. hisztonfehérjék, antibiotikum-érzékenység, RNS-polimeráz és mások). Az rRNS szekvenciák nemcsak az élőlények közti különbségekre világítanak rá, hanem tükrözik azok leszármazási kapcsolatait, filogenezisét is. Minél nagyobb a különbség két szervezet rRNS szekvenciája között, annál régebben szétvált a fejlődési útjuk. Amint egyre több szervezet rRNS-ének szekvenciáját feltárták (ma már sok ezer ismert), mind jobban kirajzolódott a filogenetikai törzsfa. Mint a 3.1. ábra mutatja, a törzsfa fő elágazásait a különböző mikroorganizmusok leszármazási vonalai alkotják, míg a többsejtű növények és állatok csak a törzsfa rövid, csúcsi ágait képezik, a közéjük illeszkedő gombák önálló csoportjával. Az élővilág sokféleségét, biodiverzitását, döntő részben a mikroorganizmusok hatalmas változatossága jellemzi, annak ellenére, hogy a faji gazdagság jobban feltárt a növények és állatok közt. Míg ezek többségét (85–90%-át) már megismertük, addig a valószínűleg létező gombáknak csak kevesebb, mint 5%-a, a baktériumoknak csak 0,4%-a ismert. Bár egyetlen makromolekula-féleségre, az rRNS-re alapozva a filogenetikai törzsfa nem minden részlete tárható fel pontosan, főbb vonásait különböző fehérjék génjeinek elemzése lényegében megerősíti. Mind több szervezet teljes genetikai állományának (genomjának) szekvenciáját tárják fel. Ez is alátámasztja, hogy a genom egy részlete, az rRNS-szekvencia, jól tükrözi a filogenetikai viszonyokat. Napjainkra így kialakulóban van a molekuláris taxonómia, ami az élőlények rendszerezésében a genotipust és az evolúciós viszonyt részesíti előnyben, a gyakran változékony fenotípusos jellemvonásokkal szemben. Az utóbbiak azonban, mint a genetikai tulajdonságok, a genotípus kifejeződései, továbbra is fontos szerepet játszanak az egyes fajok és nagyobb rendszertani csoportok jellemzésében és meghatározásában. Az élővilág három nagy csoportjának felismerése óriási jelentőségű a biológiai tudományban. Az ősbaktériumok döntő szerepet játszottak a földi élet fejlődésében, az eukariota sejt kialakulásában. Mai képviselőik, amelyek többnyire különleges, szélsőséges viszonyok közt élnek (nagy hőmérsékletű, erősen savas, nagy sókoncentrációjú, vagy anaerob élőhelyeken) tanúsítják az élet lehetőségeinek határait, utalnak azokra a körülményekre, amelyek közt a földi élet kialakulhatott. Ökológiai szerepük ma is számottevő, élelmiszer-ipari vonatkozásaik azonban elhanyagolhatók. A továbbiakban csak a baktériumok és a gombák főbb csoportjainak áttekintésére szorítkozunk. A tárgyalás alapjául a molekuláris taxonómia és filogenezis új eredményei szolgálnak, azonban az élelmiszer-ipari jelentőségük hangsúlyozásához a hagyományos, fenotípusos csoportosítást is figyelembe vesszük. Ezek bemutatásához szükséges a lényeges alaktani, élettani és anyagcseretulajdonságaik ismertetése.
Baktériumok Az rRNS összehasonlító elemzés szerint a valódi baktériumok (Bacteria) közt mintegy 25 fő filogenetikai vonal különböztethető meg. Ezek rendszertani szintje törzsnek (phylum) felel meg. A természetes mintákból közvetlenül kimutatható nukleinsavak vizsgálatával még jóval több (legalább további 50) filogenetikai vonal vonható meg; ezek képviselői azonban tenyészetekben nem ismertek, ezért fenotípusos tulajdonságaik sem tanulmányozhatók. A 3.2. ábra egyszerűsített filogenetikai törzsfája csupán 14 főbb csoportot mutat be. A törzsfa alsó ágait olyan kis csoportok alkotják, amelyek ősi és különleges tulajdonságokat képviselnek, hipertermofil vagy termofil anaerob, hidrogént vagy kénvegyületeket hasznosító kemolitotróf, anaerob fotoszintetizáló vagy anaerob légzést végző baktériumok. Önálló filogenetikai vonalat képviselnek a cianobaktériumok, amelyek a földtörténet folyamán elsőként valósították meg az oxigénfejlődéssel járó fotoszintézist, ezzel döntő befolyást gyakoroltak a földi élet fejlődésére. Mind morfológiailag, mind filogenetikailag jól elkülönülő törzset képeznek a spirochéták, közéjük tartoznak a szifilisz és a váltóláz kórokozói.
42
A mikroorganizmusok áttekintése
3.2. ábra - Baktériumok filogenetikai törzsfája a 16S rRNS szekvenciák alapján
43
A mikroorganizmusok áttekintése Máig a leírt baktériumnemzetségek száma meghaladja az ezret, a fajoké pedig több mint 5500. A nagyszámú nemzetség létjogosultságát a szekvenciakülönbségek indokolják ugyan, mégis többségük csak néhány fajt, sőt olykor csak egyetlenegyet tartalmaz. A négy legnagyobb törzsbe tartozik a nemzetségek 90%-a. Ezeket a Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria, Flavobacteria és rokonaik nevekkel illetik, és közéjük tartozik azoknak a baktériumoknak a többsége, amelyeket a mindennapok gyakorlatából, mint kórokozókat, romlást okozókat ismerünk, vagy éppen a gyógyszerek, élelmiszerek termelésére, lebontó folyamatok végzésére hasznosítunk. A továbbiakban csak ezek vázlatos áttekintésére szorítkozunk, különös tekintettel az élelmiszerekben jelentős baktériumokra. A molekuláris vizsgálatok eredményeként alaposan átalakult ezeknek a baktériumoknak a rendszere is. A baktériumok osztályozásában és vizsgálatában hagyományosan nagy jelentősége van egy festési eljárásnak, amelyet még 1884-ben Christian Gram dán orvos dolgozott ki a kórokozó baktériumok kimutatására szövetekben; csak jóval később derült ki, hogy a Gram-féle festés a baktériumok alapvető sejtfalszerkezet-beli különbségeit fedi fel. A pozitívan festődő baktériumok sejtfalát murein (peptidoglikán) és teichonsavak homogén együttese alkotja, míg a Gram-negatívoknál a murein csak a sejtfal alapvázát képezi, amelyhez lipoproteinekből és lipopoliszacharidokból álló rétegek csatlakoznak. Ez utóbbiak az ún. O-antigének, amelyek a Gram-negatív baktériumok lényeges szerológiai sajátosságait határozzák meg. A Gram-pozitív sejtfalúak osztályozásában a murein oldalláncát képező tetrapeptid összetételének van szerepe. A Gram-negatív és a Gram-pozitív sejtfalú, valamint a sejtfal nélküli baktériumokat sokáig külön osztályozták. A sejtfal-összetételbeli jellemzők bizonyos mértékig egybeesnek az rRNS szekvenciák szerinti filogenetikai csoportokkal. A Gram-pozitív baktériumok két nagy tagozatát a DNS összetételében szereplő guanin és citozin 50%-nál kisebb, illetve nagyobb aránya szerint különböztetik meg; ezek a Firmicutes és az Actinobacteria törzsek. (Érdekes módon, a molekuláris bélyegek szerint, a sejtfal nélküli mikoplazmák is az előbbiekhez tartoznak.) Minden más filogenetikai vonalba Gram-negatív sejtfalú baktériumok tartoznak. Közülük a legnagyobb, filogenetikailag összefüggő csoport a proteobaktériumoké (Proteobacteria), amelyek között élelmiszerekkel terjedő kórokozók, romlást okozók, illetve hasznos baktériumok egyaránt nagy számban vannak. A Gram-negatív sejtfalú baktériumok egy további törzsi rangú filogenetikai vonalába (Bacteroidetes) tartoznak az élelmiszer-ipari vonatkozású flavobaktériumok. A továbbiakban a rendszertani szempontokat nem követjük szigorúan, hanem a gyakorlatilag jelentős anyagcsere és élettani tulajdonságokat részesítjük előnyben. Ezek alapján a Gram-negatív baktériumoknak két nagy csoportját tárgyaljuk, az aerob és a fakultatív anaerob baktériumokat; az előbbiek között említjük a külön törzsbe tartozó flavobaktériumokat is.
Proteobaktériumok A baktériumok legnagyobb filogenetikai ága (Proteobacteria), amelybe több mint 460 nemzetség és 2100 faj tartozik. Gram-negatív sejtfalúak, és mind alaki, mind élettani tulajdonságaikban nagyon sokfélék, ezért kapták nevüket, amely a különféle alakot öltő mitológiai istenre, Proteuszra utal. Morfológiailag a pálcán és kokkuszon kívül görbült, csavaros, fonalas, függelékes, sarjadzó, nyeles alakok sokfélesége található köztük. A proteobaktériumok élettani tulajdonságai is változatosak. Energianyerő anyagcseréjük lehet fototróf, kemolitotróf vagy kemoorganotróf, lehetnek aerobok vagy anaerobok, obligát vagy fakultatív módon. Szaporodási hőmérséklet-igény szerint vannak köztük termofilok, mezofilok és pszichrofilok, lehetnek (sókedvelő) halofilek, szimbionta vagy szabadon élő nitrogénkötők, továbbá növényi és állati patogének vagy obligát intracelluláris paraziták. A proteobaktériumok törzse öt osztályra tagolódik, amelyeket a görög abc első betűivel jelölnek. Az alfa-, béta- és gamma-proteobaktériumok filogenetikai ágainak gyökerét fotoszintetikus bíborbaktériumok képezik, a litotróf vagy organotróf anyagcseréjű csoportok ezekkel együtt találhatók. Az élelmiszerekben 44
A mikroorganizmusok áttekintése jelentős proteobaktériumok mind heterotrófok, aerob oxidációt vagy fakultatív anaerob erjesztést végeznek. A delta-proteobaktériumoknak nincs élelmiszer-ipari vonatkozása, az epszilon-proteobaktériumok közé egy lényeges élelmiszerrel terjedő kórokozó tartozik. Áttekintésüket a 3.2. táblázat tartalmazza.
3.2. táblázat - Élelmiszerekben jelentős proteobaktériumok áttekintése Alfa-proteobaktériumok
Gamma-proteobaktériumok
Acetobacteriaceae család
Xanthomonadaceae
Acetobacter
Xanthomonas
Gluconobacter
Pseudomonadaceae
Sphingomonadaceae
Pseudomonas
Zymomonas
Moraxellaceae
Caulobacteraceae
Moraxella
Brevundimonas
Acinetobacter
Beta-proteobaktériumok
Alteromonadaceae
Burkholderiaceae
Alteromonas
Burkholderia
Shewanella
Ralstoniaceae
Vibrionaceae
Ralstonia
Vibrio
Oxalobacteraceae
Aeromonadaceae
Janthinobacterium
Aeromonas
Alcaligenaceae
Plesiomonas
Alcaligenes
Enterobacteriaceae
Achromobacter
Escherichia
Comamonadaceae
Enterobacter
Comamonas
Erwinia
Acidovorax
Klebsiella
Epszilon-proteobaktériumok
Proteus
Campylobacteraceae
Salmonella
Campylobacter
Shigella 45
A mikroorganizmusok áttekintése Yersinia
Aerob Gram-negatív baktériumok Az aerob heterotróf Gram-negatív proteobaktériumok biológiai spektruma nagyon tág. A közéjük sorolható nemzetségek megoszlanak az alfa-, béta- és gammaproteobaktériumok közt, igazolva, hogy a fenotípusosan hasonló csoportok közt gyakran kevés genetikai hasonlóság, filogenetikai rokonság van. E baktériumok többsége obligát aerob, energiatermelő anyagcseréjük aerob légzés. Kivételként egyes denitrifikálásra képes fajoknál az oxigént nitrát helyettesíti, ezek anaerob légzést végeznek. A légzési láncban (akár oxigén, akár nitrát redukciójánál) általában megtalálható a citokróm-c típusú elektronátvivő, amelynek kimutatása oxidázpróbával lehetséges. Ezek a baktériumok tehát, kevés kivétellel, oxidáz-pozitívok, ami fontos megkülönböztető bélyeg a citokróm-c-t nem tartalmazó, oxidáz-negatív baktériumokkal szemben, mint amilyenek pl. a bélbaktériumok. Az aerob anyagcserében központi szerepet játszik a citromsavkör, amelybe torkolva végbemegy a különféle szerves vegyületek teljes oxidációja, szén-dioxiddá. A tápanyagként hasznosított vegyületek köre rendkívül változatos. Gyakorlatilag minden természetes, sőt, sok szintetikus terméket is képes lebontani az aerob proteobaktériumok valamelyik faja. Ezek a vegyületek néhány különleges lebontási úton alakulnak olyan köztestermékké, amely a citromsavkörbe csatlakozhat. A szénhidrátok oxidációja többnyire nem glikolízissel történik, hanem glükonsavon keresztül, az ún. Entner-Doudoroff úton. Az aromás gyűrűs vegyületek lebontásának különleges módja a β-ketoadipinsav-út. Ezeknek az anyagcsere-folyamatoknak az összefoglaló vázlatát a 3.3. ábra mutatja.
46
A mikroorganizmusok áttekintése
3.3. ábra - A pszeudomonászok energiatermelő anyagcsereútjai
Pseudomonas és rokonnemzetségek Az aerob proteobaktériumok jellegzetes, legnagyobb és élettanilag legsokoldalúbb nemzetsége a Pseudomonas. Sok fajuk 60–80-féle szerves vegyületet is képes tápanyagként hasznosítani. Ezek között az egyszerű szénhidrátokon és aminosavakon kívül sok olyan vegyület van (pl. szénhidrogének, szteroidok, kondenzált gyűrűs heterociklusos vegyületek), amelyet kevés más mikroorganizmus tud lebontani. Ezért a mineralizációban, a szénkörforgalomban aktív szerepet töltenek be. Csak kevés pszeudomonász igényel növekedési anyagokat, vitaminokat. Egyik-másik fajuk még desztillált vízben is megél. Mint szaprobionták, sok természetes élőhelyen, talajban, vizekben gyakran előfordulnak, sok növényi és állati kórokozó is van köztük. Élelmiszereket is gyakran szennyeznek, főleg zöldségféléket, húsokat, húskészítményeket. A Pseudomonas nemzetség egy időben a Gram-negatív, aerob, oxidáz-pozitív, pálca alakú, poláris ostorral mozgó baktériumok gyűjtőhelye volt, több mint száz fajjal. A nemzetség heterogenitását csak molekuláris vizsgálatokkal sikerült feloldani. Az 1970-es években, a kaliforniai egyetemen Norberto Palleroni munkacsoportja az elsők közt végzett olyan nukleinsav-hibridizációs vizsgálatokat, amelyekkel a pszeudomonászokat öt RNS-hasonlósági csoportra osztották. Máig ezek közül négyet más nemzetségekbe soroltak át, ezzel a Pseudomonas filogenetikailag homogénné vált, noha élettanilag még mindig sokféle, mintegy 90 fajt számlál.
47
A mikroorganizmusok áttekintése A Pseudomonas nemzetség (1. RNS-csoport) magját a fluoreszcens pszeudomonászok képezik, mint a Ps. aeruginosa, Ps. fluorescens, Ps. putida. Ezek egy sárgászöld, vízben oldható festékanyagot termelnek, amely UV-fényben fluoreszkál. Mindhárom faj gyakran okoz élelmiszerromlást, különösen a Ps. fluorescens, amely pszichrotróf, hűtött termékeken is elszaporodik. A Ps. aeruginosa alkalmi patogén, feltételesen élelmiszerfertőzést okoz, főleg csecsemőkre, legyengült, beteg szervezetre veszélyes, az ún. nozokómiás (kórházi) fertőzések gyakori okozója. A Ps. syringae egyike a néhány oxidáz-negatív pszeudomonasz fajnak; növényi kórokozó, számos patovarietása van, amelyek csak gazdaspecifitásukban különböznek. A nem fluoreszcens fajok közül gyakori a Ps. stutzeri, Ps. fragi, Ps. alcaligenes. A korábbi 2. RNS-csoport fajai most a Burkholderia és a Ralstonia nemzetségekbe tartoznak. Növényi, illetve állati kórokozók; korábban nevezetes zoonózist okozott a Burkholderia mallei, amely a lovakról emberre is átterjedt; növényi élelmiszerekben gyakori a Burkholderia cepacia és a Ralstonia solanaceorum. A 3. RNS-csoport fajai ma a Comamonas és a Delftia nemzetségek tagjai. Talajban, vizekben, szennyvízben, és élelmiszerekben sőt klinikai esetekben is előfordulnak, mint pl. a Comamonas testosterini, illetve a Delftia acidovorans. A 4. RNS-csoportot mindössze két faj alkotta, ezek mai besorolása Brevundimonas diminuta és B. vesicularis. A Xanthomonas nemzetség és a Ps. (ma Stenotrophomonas) maltophilia képezték az 5. RNS-csoportot. A xantomonászok mind növényi kórokozók; egyedül a X. campestris patovarietásai 125 növény betegségeit okozzák, más fajok inkább specialisták, mint pl. szamócán a X. fragariae, szőlőn a X. ampelina.
Achromobacter, Alcaligenes, Shewanella, Acinetobacter A Gram-negatív aerob proteobaktériumok e nemzetségeinek fajai általánosan elterjedtek a természetes környezetben, talajban, vizekben, és gyakran rákerülnek élelmiszerekre is. A heterotróf aerob anyagcserén kívül sokuk anaerob légzést, denitrifikálást, szulfátredukciót is végez. Romlott élelmiszerekben ismert a kénhidrogént termelő Shewanella putrefaciens, fekáliás szennyezettségre utal az Alcaligenes faecalis, amely a bélcsatorna normál biotájának tagja. A régebben Achromobacter néven leírt fajok egy részét az Alcaligenes, más részét az Acinetobacter nemzetségbe sorolták. Az utóbiak anyagcseréje a többi aerob proteobaktériumhoz hasonlóan sokoldalú, viszont nem mozognak és oxidáz-negatívak, mint a bélbaktériumok, de nem erjesztenek. Az Acinetobacter-ek az emberi bőr normális lakói, innen, vagy természeti forrásokból kerülnek az élelmiszerekbe. Baromfihús, tej, zöldségek romlását okozzák, hűtött vagy besugárzott termékeknek is (Acinetobacter lwoffii, Acinetobacter radiodurans). A szintén pszichrotróf Janthinobacterium lividummal ritkán találkozunk élelmiszerekben, bár feltűnő, ibolyaszínű festéket képez.
Acetobacter, Gluconobacter Az aerob proteobaktériumok közül kitűnnek jellegzetes élettani tulajdonságaikkal az ecetsav baktériumok. Különlegességük a részleges oxidációs képesség, pl. az etanolt ecetsavvá, a cukoralkoholokat ketózokká oxidálják. Az általuk végzett ecetsavas „erjedés” régebben ipari méretekben alkalmazott ecetgyártási folyamat volt, ma inkább a különleges ételecet (borecet) készítésére korlátozódik. Jelentőssé vált viszont a szorbit → szorbóz átalakítás, amit az aszkorbinsav- (C-vitamin-) gyártásban alkalmaznak. A Gluconobacter suboxydans az etilalkoholt csak ecetsavvá tudja oxidálni, mivel a citromsavköre nem teljes. Az Acetobacter fajokban (pl. A. aceti) viszont teljes citromsavkör működik, ezek az ecetsavat „túloxidálják”, szén-dioxidig. Az ecetsav baktériumok az egyszerű szénhidrátokat, cukrokat a pentózfoszfát-úton hasznosítják. Az Entner-Doudoroff-út, amely sok más aerob proteobaktériumban megvan, belőlük hiányzik, vagy csak részlegesen működik (3.4. ábra). 48
A mikroorganizmusok áttekintése
3.4. ábra - Az ecetsavbaktériumok energiatermelő anyagcsereútjai
Anyagcsere-képességüknek megfelelően az ecetsavbaktériumok egyrészt szigorúan aerobok, másrészt erősen savtűrők, jól szaporodnak még pH 4,5-nél is. Természetes élőhelyeik a bomló növényi anyagok, különösen a gyümölcsök. Ezek cukortartalmú nedvében, ha az alkoholosan erjedni kezd, az élesztőgombákkal együtt az ecetsav baktériumok is mindig megtalálhatók. Gyakran találkozunk velük az erjesztett alkoholos italok (bor, sör, cider) romlásának okozóiként.
Flavobaktériumok A Flavobacterium nemzetség egyike annak a mintegy harminc nemzetségnek, amely a hasonló nevet viselő család, rend és osztály tagja, és amely a Bacteroidetes törzset képezi, két másik osztállyal együtt. Ezek képviselőiként csak az anaerob Bacteroides és a cellulózbontó Cytophaga nemzetségeket említjük. Az előbbiek az állatok és ember bélcsatornája normál biotájának tagjai, de kórokozók is lehetnek. A székletben rendkívül nagy számban, milliárdos nagyságrendben találhatók grammonként, de a környezetbe kerülve nem szaporodnak, sőt gyorsan elpusztulnak. A Cytophaga és rokon baktériumok bomló növényi anyagokon, kérődzők trágyájában, parti vizekben élnek, döntő részük van a cellulóz lebontásában. A Bacteroidetes törzs, amely filogenetikailag összetartozó csoportot képez, élettani és egyéb fenotípusos tulajdonságaikban rendkívül különböző és sokféle szervezetet fog össze. Tulajdonságaikat tekintve a flavobaktériumok az Achromobacter-Alcaligenes-Acinetobacter csoporthoz hasonlók, amennyiben aerob, Gram-negatív, spórátlan pálcák, amelyek a szénhidrátokat többnyire nem bontják. Azoktól eltérően azonban jellegzetes, sárgás, olykor élénk narancsszínű telepeket képeznek, ostoruk 49
A mikroorganizmusok áttekintése nincs, de csúszó mozgást végeznek. A környezetben, talajban, édes- és tengervízben, növényeken elterjedt szaprobionták, élelmiszer- és tejtermékeken, feldolgozó vonalakon igen gyakoriak.
Fakultatív anaerob Gram-negatív baktériumok A fakultatív anaerob proteobaktériumoknak közegészségügyi és élelmiszer-biztonsági szempontból kiemelkedően fontos két családja a bélbaktériumok (Enterobacteriaceae) és a vibriók (Vibrionaceae). Jelentőségüket a gyomor-bél megbetegedéseket okozó veszélyes patogén baktériumok (Salmonella enterica, Shigella dysenteriae, Vibrio cholerae és mások) határozzák meg. Ezekre, más élelmiszerrel közvetített kórokozókkal együtt, külön fejezetben visszatérünk, itt általános tulajdonságaikat és rendszertani csoportjaikat tekintjük át. A bélbaktériumok rövid pálcaalakúak, a vibriók hajlottak. Előbbiek, ha mozognak, peritrich csillósok, utóbbiak polárisan ostorosok. A két család különbözik az oxidáz-reakcióban is, viszont közös tulajdonságuk a heterotróf, fakultatív anaerob anyagcsere, a szénhidrátok erjesztése. A bélbaktériumok és a vibriók közti átmeneti sajátosságokat mutatnak az Aeromonadaceae család tagjai (3.3. táblázat).
3.3. táblázat - Fakultatív anaerob proteobaktériumok és a pszeudomonászok főbb jellemzői Jellemző
Enterobacteriaceae
Vibrionaceae
Aeromonadaceae
Pseudomonadaceae
Glükózbontás
erjesztés
erjesztés
erjesztés
oxidáció
Alak
pálca
hajlott
pálca
pálca
Ostor
peritrich
poláris
poláris
poláris
Anaerob szaporodás
+
+
+
–
Oxidáz reakció
–
+
+
+
A bélbaktériumok és a hozzájuk hasonló fakultatív anaerob proteobaktériumok mind aerob, mind anaerob körülmények között képesek anyagcserét folytatni és szaporodni. Táplálkozási igényük egyszerű. Aerob légzéssel a vegyületek széles sorát (szénhidrátokat, szerves savakat, aminosavakat) fel tudják használni, gyakran összetettebb vegyületek (keményítő, pektin, fehérjék) lebontására is képesek. Nitrogénforrásként szerves vegyületek, ammónium- és nitrátsók egyaránt szolgálnak. Anaerob körülmények között sokféle mono- és diszacharidot, cukoralkoholt tudnak erjeszteni, mind a glikolízises, mind a pentózfoszfát úton. Jellemző erjesztési módjuk a vegyes savas erjedés (3.5. ábra).
50
A mikroorganizmusok áttekintése
3.5. ábra - A vegyes savas és a butándiolos erjedés vázlata
A vegyes savas erjedés a glikolízis útját követi a piroszőlősavig. Az idáig közös úttól már többféle reakció vezet tovább, így az erjedés végtermékei változnak a különböző nemzetségek és fajok szerint. Jellemző végtermékek a tejsav, a borostyánkősav, az ecetsav, az etanol és a hangyasav. Ez utóbbi csak bizonyos fajoknál marad meg a végtermékek között, másoknál szén-dioxidra és hidrogénre bomlik; ez utóbbiak erjesztése ezért gázfejlődéssel jár. Több bélbaktériumnál a piroszőlősav átalakulásának egy további útja is lehetséges, ami butándiol végtermékhez vezet, és jelentősen csökkenti a savas végtermékek arányát. A vegyes savas és butándiolos erjedés változatai jellemzők a csoport különböző tagjaira (3.4. táblázat).
3.4. táblázat - A fakultatív anaerob proteobaktériumok erjesztési jellemzői Vegyes savas erjedés Hangyasavhasítás (CO2 + H2)
Escherichia
Butándiolos erjedés Enterobacter
51
A mikroorganizmusok áttekintése
Hangyasav végtermék
Salmonella
Klebsiella
Proteus
Aeromonas
Shigella
Serratia
Yersinia
Erwinia
Vibrio
Plesiomonas
A bélbaktériumok egy részének sajátossága, hogy erjesztik a laktózt; ilyenek az ún. kóliform-baktériumok (pl. Escherichia, Enterobacter, Klebsiella), szemben a laktóz-negatívokkal (pl. Salmonella, Shigella, Proteus). A szénhidrátok erjesztésén kívül jellemző faji tulajdonság az aminosavak hasznosítása is, a fajok és törzsek azonosításánál nagy fontosságúak továbbá a szerológiai tulajdonságok. A felületi antigéneknek három fő csoportja van: az O antigének (a sejtfal lipopoliszacharidjai), a K antigének (tokanyagok) és a H antigének (az ostorok fehérjéi). A szerológiai tulajdonságok alapján a bélbaktériumok közt igen sok szerotípust különböztetnek meg; ezek meghatározása különösen fontos a klinikai diagnosztikában.
Enterobacteriaceae A bélbaktériumok családja – és annak jellegzetes faja, az Escherichia coli –, valamennyi mikroorganizmus közül a legtöbbet és legrészletesebben tanulmányozott baktériumok. A biokémiai, genetikai, molekuláris biológiai kutatásnak egyaránt fontos alanyai, míg vizsgálatuk nélkülözhetetlen a klinikai gyakorlatban, az élelmiszer-higiéniában, az állategészségügyben és a növénykórtanban. Jelentőségüknek megfelelően rendszerezésük is rendkívül részletes, a családot több mint 40 nemzetségre taglalták, amelyekben mintegy 70 fajt írtak le. Rendszerezésük azonban még nem végleges; a molekuláris vizsgálatok szerint több nemzetség polifiletikus, több faj közelebbi rokonságot mutat más nemzetségekkel, mint sajátjának más fajaival, továbbá nemzetség-szintű besorolást nyertek olyan bélbaktériumok, amelyek valójában faji szinten azonosak (pl a Shigella négy fajának rRNS szekvenciája azonos az E. coliéval). Gyakorlati szempontok azonban indokolják az elkülönítés fenntartását, illetve gátolják a feltárt filogenetikai kapcsolatok érvényesítését. A bélbaktériumok jó része az emberi és állati bélcsatorna lakója, és ott megtelepedve veszélyes kórokozó. A gasztroenteritisz (gyomor-bélmegbetegedések) elsődleges közvetítője az élelmiszer és az ivóvíz. A bélbaktériumok sokféle más betegséget is okoznak, és – nevükkel ellentétben – a bélcsatornán kívül is találhatók, sőt szaprobiontaként csak természetes élőhelyeken fordulnak elő vagy növényi kórokozók. Az Escherichia fajok többsége, a Shigella és Salmonella fajok mindegyike az emberi és állati bélcsatornában él. Filogenetikai rokonságuk annyira szoros, hogy egyetlen nemzetségbe foglalásuk indokolt lenne, ennek ellenére még az átmeneti tulajdonságú, köztes fajokat is külön nemzetségekbe sorolták (pl. Edwardsiella, Levinea, Citrobacter). A kólibaktérium (E. coli) az ember vastagbelének normális lakója, fontos szimbiontának tekinthető: szerepet játszik az emberi szervezet K-vitamin-ellátásában, más bélbaktériumokkal szemben antagonista hatású kolicineket termel. Az E. coli bizonyos szerotípusai azonban fertőző betegségeket okoznak. A Salmonella és Shigella fajok mind kórokozók, emlősőkben, madarakban, hüllőkben egyaránt különböző megbetegedéseket váltanak ki, egyes fajok, illetve szerotípusok az 52
A mikroorganizmusok áttekintése ember specifikus kórokozói, a hastífusz, paratífusz, vérhas jellegzetes kórképeivel. Más szalmonellák az élelmiszerrel a szervezetbe kerülve a bélcsatorna fertőzését okozzák (gasztroenteritisz, „szalmonellózis”). Ugyancsak szoros rokonság fűzi össze az Enterobacter és a Klebsiella fajokat. Többségük a természetben (talajban, vizekben, növényeken) és az állati szervezetben élő szaprobionta, élelmiszerekben is gyakoriak. Csak néhány fajuk kórokozó, sokuk azonban alkalmi patogén, amelyek elsődlegesen nem a bélcsatornát, hanem a szervezet más részeit (légzőrendszert, húgyutakat) fertőzik. Hozzájuk közeli nemzetség a Serratia, amelynek több faja piros festékanyagot termel. A heterogén nemzetségből választották le a Hafnia és az Obesumbacterium fajokat, ezek élelmiszerekben, illetve sörökben okoznak romlást. A család növényi kórokozó tagjait az Erwinia nemzetségbe foglalták, azonban ez is polifiletikusnak bizonyult. A pektinbontó képességű, növényekben lágyrothadást okozó Erwinia carotovorát és hasonló fajokat a Pectobacterium, a hajtásszáradást és más betegségeket okozó egyéb fajokat a Bremeria és Pantoea nemzetségekbe sorolták át. Ezekkel olykor élelmiszerek növényi nyersanyagain találkozhatunk. A Proteus nemzetséget az erős mozgási képesség és a karbamidbontás jellemzi, csaknem mindegyik fajt más-más nemzetségbe osztották (Morganella, Providencia). Fehérjebontó képességük miatt főleg rothadó anyagokban, szennyvízben találhatók, húskészítményeken is előfordulnak, alkalmi kórokozók is lehetnek. A régebben Pasteurella néven leírt baktériumok egy részét a bélbaktériumok közé sorolták, a Yersinia nemzetségbe. Így került ide az emberiség történelmének egyik legrettegettebb betegségét, a pestist okozó baktérium (Y. pestis). Tüneteit (a nyirokcsomók gyulladását) és terjedési módját (légúton vagy a patkánybolhával közvetítve) tekintve lényegesen különbözik a többi kórokozó bélbaktériumtól. Egy másik faj, a Y. enterocolitica azonban élelmiszer-fertőzés okozója lehet. Az egyéb bélbaktérium-nemzetségek között találunk rovarpatogéneket és intracelluláris szimbiontákat (pl. Buchnera, Xenorhabdus), puhatestűek kórokozóit (Buttiauxella), csak vizekben előfordulókat (Budvicia, Pragia), továbbá humánpatogéneket, amelyek sorában, a molekuláris módszereknek is köszönhetően, egyre újabbakat írnak le (pl. Ewingella, Leminorella, Moellerella, Tatumella), többnyire csak egy-egy faj alapján. Néhány nemzetség tagjait élelmiszerekből, tejből, zöldségekből, sörből is izolálták (pl. Cedecea, Kluyvera, Leclercia, Rahnella).
Vibrionaceae A bélbaktériumokkal rokon, fakultatív anaerob, erjesztő, de poláris ostorú és oxidáz-pozitív baktériumokat felölelő család, számos nemzetséggel. A Vibrio nemzetségnek több mint 30 faja ismert, közülük kiemelkedő jelentőségű a Vibrio cholerae, amely súlyos bélbetegséget okoz. Fertőzött ivóvízzel terjed, több fejlődő országban, a rossz higiéniai viszonyok közt élő népességben ma is tömegesen szedi áldozatait. A vibriók általában vizekben, tengerekben, víziállatokban élnek. A rákokat, kagylókat, halakat többnyire nyersen fogyasztók körében bélfertőzést okozhat a Vi. parahaemolyticus és a Vi. vulnificus.
Alteromonadaceae Újabban elkülönített család, amelybe mások mellett a bélbaktériumok és a vibriók közti sajátosságokat mutató két nemzetséget is beosztottak, ezek az Aeromonas és a Plesiomonas. Főleg a vizekben élő baktériumok, amelyek patogének lehetnek hideg- és melegvérű állatokra egyaránt. Emberben alkalmi patogének, élelmiszerekkel közvetítve bélfertőzést okozhatnak. Előfordulnak fagylaltban, zöldségeken, halakban. 53
A mikroorganizmusok áttekintése
Zymomonas A gamma-proteobaktériumokhoz tartozó előző három családdal szemben ez a nemzetség a béta-proteobaktériumok közé tartozik. A Zy. mobilis Gram-negatív, poláris ostorú és fakultatív anaerob baktérium, amely inkább az aerob Gluconobacter-Acetobacter nemzetséggel áll rokonságban. Különleges erjesztési módja, amely az Entner-Doudoroff-úton folyik, megkülönbözteti a bélbaktériumoktól. Csak a glükózt, a fruktózt és a szacharózt erjeszti etanollá és szén-dioxiddá. Erjedő növényekben, sörben fordul elő, egyes országokban alkoholos italok készítésére is használják (pulque, cider).
Campylobacter Ezeket a hajlott, gyakran spirális és csavar alakú baktériumokat eredetileg a vibriók közé sorolták, a molekuláris vizsgálatok szerint különálló filogenetikai vonalat képeznek az epszilon-proteobaktériumok osztályában. Bár poláris ostorral mozognak, a vibrióktól eltérően mikroaerofilek és a szénhidrátokat nem erjesztik. 15 fajuk többsége az emlősállatok és madarak kórokozója, a Cb. fetus a kérődzők elvetélését okozza. Emberre leginkább veszélyes a Cb. jejuni, amely élelmiszerekkel, igen gyakran szárnyasok húsával a bélcsatornát fertőzve, a kolerához hasonló súlyos megbetegedést okoz.
Gram-pozitív baktériumok Firmicutes törzse A Gram-pozitív baktériumok filogenetikailag határozottan elkülönülő törzse, amelyet jellemez a DNS guanin és citozin kis mólarányú összetétele (G + C < 50%). Igen nagy törzs, amelybe közel 160 nemzetség és mintegy 1500 faj tartozik. Az élelmiszer-ipari szempontból érdektelen sejtfal nélküli baktériumoktól (Mollicutes osztály) eltekintve, a másik két osztály (Clostridia és Bacilli) kiemelkedően fontos élelmiszer-vonatkozású baktériumok rendjeit foglalja magába, mint a klosztridiumok (Clostridiales), illetve a bacillusok (Bacillales) és a tejsavbaktériumok (Lactobacillales). Mind a klosztridiumok, mind a bacillusok jellemző tulajdonsága, hogy nyugvó állapotú kitartó képletet, endospórát hoznak létre, amely a hőmérsékletnek és más kedvezőtlen hatásoknak ellenáll. E különleges sajátosság rendszertanilag mégsem meghatározó bélyeg, mivel egyrészt endospórát más baktériumcsoportoknál is találunk, másrészt mind a klosztridiumok, mind a bacillusok több olyan családra oszlanak, amelyek spórás és spórátlan nemzetségeket egyaránt tartalmaznak. A rendszerezés ebből eredő problémáit nem taglalva, a következőkben előbb a Firmicutes törzsbe tartozó jelentős spórátlan nemzetségeket, majd a spórásokat tekintjük át, végül az endospóra szerkezetét és tulajdonságait.
Staphylococcus Gram-pozitív kokkuszok, osztódás után szabálytalan sejtcsomókat alkotnak. Fakultatív anaerobok, glükózból és más cukrokból savat képeznek, de gázt nem. Ez és oxidáz-negatív voltuk különbözteti meg őket a Micrococcusoktól, amelyek szigorúan aerobok és oxidáz-pozitívok. Korábban a két nemzetséget közeli rokonoknak tartották, az rRNS filogenezis szerint még ugyanabba a törzsbe sem tartoznak (a Micrococcus a nagy G + C mol%-ú Actinomyceteshez került). A Staphylococcus nemzetség igen nagy, 35 faja és 18 alfaja van. A környezetben, talajban, vizekben, növényeken elterjedt szaprobionták, sok faj az emberi, állati szervezet ártalmatlan lakója, de alkalmi kórokozóvá válhat. A bőr és nyálkahártyák mikrobiotájának jellegzetes tagjai a Sta. epidermidis, Sta. hominis, Sta. saprophyticus és mások, még a leginkább patogén hajlamú Sta. aureust is az emberek 10–40 %-a normálisan hordozza. A patogenitás nem egyértelmű faji tulajdonság, a fajon belül egyes törzsek patogenitása változó. A hemolizáló képesség és bizonyos enzimek (koaguláz, termonukleáz) megléte 80–90%-ban jelzi a 54
A mikroorganizmusok áttekintése kórokozó tulajdonságú törzseket, pl. a Sta. aureus, Sta. hyicus, Sta. intermedius, Sta. sciuri esetében. A megbetegedés a kültakaró, súlyosabb esetben belső szervek gyulladásával, gennyesedésével jár. A koaguláz-pozitív S. aureus törzsek többsége hőálló enterotoxint is képez, amely az élelmiszerekkel a szervezetbe jutva akut tünetekkel járó ételmérgezést okoz. Néhány koaguláz-negatív sztafilokokkusz faj (pl. S. vitulinus, S. carnosus) gyakran előfordul érlelt hús- és tejtermékekben, az utóbbi oltótenyészetként is hasznosítható kolbászfélék gyártásához. A Staphylococcus nemzetségből újabban választották le az oxidáz-pozitív fajokat Macrococcus néven; a M. caseolyticus húsokon fordul elő.
Kurthia, Brochothrix, Listeria Pálcaalakú spórátlan baktériumok, a Kurthia aerob, a másik kettő fakultatív és tejsavas erjedést végez. Egyéb jellemzőiket a 3.5. táblázat foglalja össze. A Grampozitív baktériumok, különösen az aktinomiceták rendszerezésében lényeges ismérv a sejtfal összetétele, különösen a muraminsavhoz csatlakozó tetrapeptid lánc diaminosavának fajtája, amely lehet L,L-, vagy mezo-diaminopimelinsav, lizin, ornitin, olykor egyéb.
3.5. táblázat - Gram-pozitív baktériumnemzetségek összehasonlító tulajdonságai Jellemző
Kurthia
Listeria
Brochothrix
Bacillus
Lactobacillus
Aerob
+
–
–
v×
–
Fakultatív
–
+
+
+
+*
Erjesztés
–
+
+
v
+
Mozgás
+
+
–
+
–
35 °C szaporodás
+
+
–
+
+
Kataláz
+
+
+
+
–
lizin
mDAP
mDAP
mDAP
mDAP, lizin, ornitin
Diaminosav
× változó; * aerotoleráns anaerob Mindhárom nemzetségben pszichrotróf tulajdonságú fajok vannak, amelyek gyakran megtalálhatók hűtött élelmiszereken, tej- és hústermékeken. A Brochothrix thermosphacta és a Kurthia zopfii érlelt kolbászféléken gyakori. A Listeria fajok állatok opportunista patogén baktériumai, közülük a Li. monocytogenes emberben súlyos tünetekkel járó élelmiszer-fertőzést tud okozni.
Tejsavbaktériumok A Gram-pozitív baktériumok Firmicutes törzsébe, az endospórás bacillusok és klosztridiumok társaságába tartoznak a szintén nagy gyakorlati jelentőségű spórátlan laktobacillusok vagy tejsavbaktériumok. A már Pasteur ideje óta ismert baktériumok, amelyek fontos szerepet játszanak az élelmiszerek fermentációjában, ártalmatlan, sőt hasznos lakói az ember és az emlősállatok testüregeinek, kis részük azonban kórokozó. 55
A mikroorganizmusok áttekintése A tejsavbaktériumok általános jellemző tulajdonsága a tejsavas erjedés, amely energiatermelő anyagcseréjük egyedüli módja, mivel működőképes teljes citromsavkörük nincs. Következésképp egyrészt savtűrők (szaporodásuk optimális pH-ja 5,5 körül van, de elviselik a jóval kisebb, 3,0–3,5 pH-t is), másrészt tápanyagigényük összetett, saját szintézis hiányában különböző aminosavakra és vitaminokra van szükségük a szaporodáshoz. A tejsavas erjedés két lényegesen különböző biokémiai úton folyhat (3.6. ábra). A glükóz homofermentatív erjesztése a glikolízis szerint történik, a piroszőlősav közvetlenül tejsavvá redukálódik. A glikolízist folytató sejtekben működik a fruktóz-difoszfát aldoláz. A heterofermentatív erjedés első szakasza más módon zajlik, a pentózfoszfát utat követi. A sejtekből hiányzik a glikolízis kulcsenzime, de működik a foszfoketoláz, ami a glükonsavból képződő pentózokat hasítja.
3.6. ábra - A homo- (A) és a heterofermentatív (B) tejsavas erjedés vázlata
A heterofermentatív erjedés ezért egyrészt mindig gázképződéssel jár (CO2), másrészt végtermékei vegyesek és a fajok szerint változók, köztük tejsav, ecetsav, etanol különböző arányban keletkezhet. Bár a tejsavas erjedésnek alapvetően kétféle mechanizmusa van, a tejsavbaktériumok erjesztési típusa háromféle lehet: 56
A mikroorganizmusok áttekintése obligát homofermentálók, obligát heterofermentálók, valamint fakultatív heterofermentálók, amelyek a glükózból csak tejsavat képeznek, de erjesztik a glükonsavat és a pentózokat is. A tejsavbaktériumok csoportjának magját a Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus és Streptococcus nemzetségek alkotják. Az újabb, molekuláris filogenetikai osztályozás nem mindenben egyezik a hagyományos rendszertani csoportosításukkal, és új nemzetségek létrehozásával járt a korábbi nemzetségekbe sorolt fajokból, amelyekhez újabbakat is leírtak (3.6. táblázat). Ilyenek a Carnobacterium (korábban atípusos Lactobacillus fajok), az Enterococcus, Lactococcus és Vagococcus (korábban Streptococcus), az Oenococcus (korábban Leuconostoc), a Tetragenococcus (korábban Pediococcus), és a Weisella (korábban Leuconostoc és Lactobacillus).
3.6. táblázat - A tejsavbaktériumok rendszerezésének áttekintése a családok és nemzetségek szintjén 1. Lactobacillaceae
3. Carnobacteriaceae
5. Leuconostocaceae
Lactobacillus (80)
Carnobacterium (8)
Leuconostoc (10)
Pediococcus (6)
Agitococcus (1)
Oenococcus (1)
2. Aerococcaceae
Alloicoccus (1)
Weisella (9)
Aerococcus (5)
Desemzia (1)
6. Streptococcaceae
Abiotrophia (1)
Dolosigranulum (1)
Streptococcus (60)
Dolosicoccus (1)
Trichococcus (3)
Lactococcus (5)
Granulicatella (3)
4. Enterococcaceae
Helicococcus (1)
Enterococcus (30)
Alloicoccus (1)
Melissococcus (1)
Eremococcus (1)
Tetragenococcus (2)
Facklamia (5)
Vagococcus (5)
Globicatella (2) Ignavigranum (1) Zárójelben a nemzetségekhez tartozó fajok száma. A molekuláris szempontok szerint alkotott nemzetségeket csak részben jellemzik közös alaktani és élettani bélyegek, amelyeket a tejsavbaktériumok osztályozásánál hagyományosan figyelembe vettek. Ezeket a 3.7. táblázat foglalja össze. Mint látható, pálca alakú sejtek csak a Lactobacillus és a Carnobacterium nemzetségbe tartoznak, a többi mind kokkusz alakú; egy részük láncokban (Streptococcus) vagy négyes alakzatokban (Pediococcus, Tetragenococcus). A tejsavas erjedés módja lényeges jellemző. A heterofermentatív változattal járó szén-dioxid gázfejlődés jellemzi a Leuconostoc, Oenococcus és Weisella nemzetségeket, míg a Lactobacillus fajok közt az erjedés különböző módozatai találhatók. Az optikai forgatóképesség szerint D-konfigurációjú tejsavat képeznek a Leuconostoc és a 57
A mikroorganizmusok áttekintése Weisella fajok, DL-tejsavat a Pediococcus és a Weisella, a Lactobacillusok közt mindhárom változat (D, L, DL) lehetséges, a többi nemzetség fajai L-tejsavat termelnek. A szaporodási körülmények közül a hőmérséklet, a pH és a sókoncentráció szolgál a nemzetségek hagyományos megkülönböztetésére. 10 °C-on nem szaporodnak a Streptococcusok, 45 °C-on a Carnobacterium, Lactococcus és Leuconostoc fajok. Nem szaporodnak 6,5%-os sókoncentrációnál a Streptococcus és a Lactococcus nemzetségek tagjai, a Tetragenococcus elvisel még 18%-ot is. Csak a Streptococcusok nem tudnak szaporodni 4,4 pH-nál, viszont az Enterococcus és a Tetragenococcus nemzetségek fajai szaporodnak 9,6-os pH-értéknél.
3.7. táblázat - Tejsavbaktérium nemzetségekre jellemző alaki és élettani tulajdonságok Nemzetség
Alak
CO2-
Tejsav képzés típus
Szaporodás 10 °C
45 °C
6,5% NaCl
pH 4,4
pH 9,6
±
D, L, DL
±
±
±
±
–
Carnobacterium pálca
–
L
+
–
±
–
–
Enterococcus
kokkusz
–
L
+
+
+
+
+
1
kokkusz
–
L
+
–
–
±
–
2
Leuconostoc
kokkusz
+
D
+
–
±
±
–
Pediococcus
tetrád
–
L, DL
±
±
±
+
–
Streptococcus
lánc
–
L
–
±
–
–
–
Tetragenococcus tetrád
–
L
+
–
+
–
+
Weisella
+
D, DL
+
–
±
±
–
Lactobacillus
Lactococcus
1
pálca
kokkusz
Vagococcus is; 2 Oenococcus is.
Lactobacillus nemzetség A tejsavbaktériumok legnagyobb fajszámú nemzetsége. A 2004. év végéig leírt fajok száma 80, hét faj esetében 15 alfajjal. A fajok száma az utóbbi tíz évben 26 fajjal gyarapodott. Nyilvánvaló, hogy ez a nagy fajszámú nemzetség nem homogén, mind élettani, mind molekuláris tulajdonságok alapján több csoportja különböztethető meg. Az erre vonatkozó javaslatok ellenére a nemzetség formális rendszertani felosztása még nem történt meg. Az erjesztési mód szerint a Lactobacillusok lehetnek obligát homofermentatívok (pl. a Lb. delbrueckii, Lb. acidophilus, Lb. helveticus) vagy obligát heterofermentatívok (pl. a Lb. brevis, Lb. buchneri, Lb. fermentum), ha a glükózból csak tejsav, illetve azon kívül szén-dioxid és egyéb termék is képződik. A harmadik változatot, a fakultatív heterofermentációt végzi pl. a Lb. plantarum, Lb. casei, Lb. pentosus. A molekuláris bélyegek alapján kialakítható filogenetikai csoportok és az erjesztési módok közt átfedések mutatkoznak. Filogenetikailag nyolc csoportot különböztetnek meg, ezeket egy-egy jellemző fajról nevezték el (3.8. táblázat). A táblázat feltünteti az erjedési módot is; mint látható, csak két filogenetikai csoportba tartoznak tisztán egyféle erjedési módozatot folytató fajok. 58
A mikroorganizmusok áttekintése
3.8. táblázat - A Lactobacillus fajok filogenetikai csoportjai és erjesztési módozatai Filogenetikai csoport
Egyéb faj (példa)
A fajok száma erjedési mód szerinti Homo
Fakultatív
Hetero
Lb. buchneri
fructivorans, hilgardii, lindneri
0
1
11
Lb. casei
rhamnosus, sharpeae, paracasei
3
4
0
Lb. delbrueckii
acidophilus, crispatus, helveticus
14
5
0
Lb. plantarum
alimentarius, farciminis, pentosus
1
7
2
Lb. reuteri
fermentum, vaginalis
0
0
12
Lb. sakei
curvatus, graminis
0
4
0
Lb. salivarius
mali, murinus, agilis
7
5
0
Lb. coryniformis
brevis, bifermentans
0
3
1
A laktobacilluszok természetes élőhelyei az emberi és állati szervezet, valamint a növényzet. Többségük az emberben és állatokban ártalmatlan együttélő, kommenzalista. Több, a bélcsatornában élő fajnak, emésztést elősegítő szerepet tulajdonítanak és tenyészeteiket probiotikumként forgalmazzák (pl. Lb. acidophilus). A háziállatokról a feldolgozás folyamán a húsokra, húskészítményekre sokféle tejsavbaktérium kerül. Ezek a termékek normális mikrobiotáját képezik, de alkalmas körülmények közt elszaporodva a romlás elsődleges okozóivá válnak (pl. Lb. plantarum, Lb. brevis, Lb. buchneri). Többüket viszont oltótenyészetként hasznosítják a húsiparban, a tejiparban (pl. Lb. sakei, Lc. lactis), a kenyérgyártásban (pl. Lb. sanfrancisco), sőt, a borászatban is (Lb. hilgardii). A növényzeten, a termesztett zöldség- és gyömölcsféléken is élő tejsavbaktériumok a silót, illetve a savanyúságokat erjesztik (pl. Lb. plantarum, Lb. brevis).
Carnobacterium, Pediococcus 1987-ben választották el a Lactobacillus nemzetségtől, több különbség alapján; azoktól eltérően a Carnobacteriumok jellegzetesen nem savtűrők, nem szaporodnak pH 5,4 alatt. Hét faj tartozik ide, egyikük halakra patogén. A pediokokkuszok jellegzetes, kettős és négyes kokkuszalakzataik miatt alakilag különböznek mind a pálca alakú Lactobacillusoktól és Carnobacteriumoktól, mind pedig a gyakran láncokat formáló, megnyúlt kokkusz alakú Leuconostoctól és rokon nemzetségektől. Filogenetikailag azonban mégis az előbbiekkel állnak közelebbi kapcsolatban, mint az egyéb kokkusz alakú tejsavbaktériumokkal (Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus), amelyek viszont egymással alkotnak egy filogenetikai csoportot. A pediokokkuszok fakultatív heterofermentációt végeznek, glükózból nem képeznek gázt. Hat jól jellemzett fajuk van, egy további, nem savtűrő, fakultatatív anaerob faj filogenetikailag is távol áll ezektől, és Tetragenococcus halophilus néven külön nemzetségbe nyert besorolást. Filogenetikailag szintén távol áll nemcsak a pediokokkuszoktól, hanem más tejsavbaktériumoktól is a mikroaerofil természetű Aerococcus viridans, amelynek szinonimjai közt szerepel a Pc. homari és a Gaffkya homari neve is. 59
A mikroorganizmusok áttekintése
Enterococcus, Lactococcus és Vagococcus Régóta ismert baktériumok, a sztreptokokkuszok külön, ún. fekál csoportját képezik. Három fajukra (Ec. faecalis, Ec. faecium, Ec. hirae) jellemző a környezeti tényezőkkel szembeni ellenálló képesség; a 3.7. táblázatban jelzetteken (hőmérséklet, pH, sókoncentráció) kívül túlélnek 60 °C-os hőkezelést 30 percig. A nemzetség számos faja azonban nem mindenben tanúsítja ezeket a tulajdonságokat. Amikor 1984-ben az Enterococcus nemzetséget létrehozták, kilenc sztreptokokkusz fajt soroltak át, és azóta sok új faj csatlakozott hozzájuk; ma a nemzetség mintegy 30 fajt számol. A Lactococcus nemzetséget a korábbi N szerológiai csoportbeli sztreptokokkuszok, a Vagococcust pedig a mozgó sztreptokokkuszok elkülönítésére hozták létre. A laktokokkuszoknak öt faja ismert, élelmiszerekben mindegyik előfordul. A Lc. lactisnak három alfaját különböztetik meg, közülük a subsp. lactis és a subsp. cremoris a tejben és tejtermékekben közönséges. Előbbit izolálták beteg állatokból, így tőgygyulladásos tehénből is, az utóbbi viszont a tejipari színtenyészetekben oltókultúraként használatos. A fontos aromaképző oltótenyészet, a Lc. lactis var. diacetylactis csak változat rangján különül el. A Lc. lactishoz tartozó törzseket növényekről, zöldségfélékről is izolálták, hasonlóan a Lc. plantarumhoz. A Lc. garviae, Lc. raffinolactis és a Lc. piscium a szarvasmarhák, illetve a halak kórokozója, de az előbbiek tejtermékekből, az utóbbi húskészítményekből is előkerültek. A Vagococcus nemzetségben az ostorral mozgó sztreptokokkuszokat különítették el. Az eredetileg ide sorolt két fajhoz az utóbbi években három újat csatoltak.
Leuconostoc, Oenococcus, Weisella Alakjuk szerint kissé megnyúlt kokkuszok, sőt néhány Weisella kifejezetten pálca alakú. A Leuconostoc nemzetségbe ma tíz fajt, az 1990-ben létrehozott Weisellába kilenc fajt sorolnak. Utóbbihoz került a korábbi Ln. paramesenteroides és öt korábbi atípusos Lactobacillus, valamint három új faj. 1995-ben sorolták külön nemzetségbe, egyetlen fajként az Oenococcus oenost, ami eredetileg szintén a Leuconostoc nemzetségbe tartozott. Közös tulajdonságuk az obligát heterofermentatív tejsavas erjesztés, egyéb jellemvonásaiban a Leuconostoc és a Weisella fajok kevéssé különböznek. Hozzájuk képest az Oenococcus lényegesen szigorúbb környezeti feltételeket elvisel, mint a kis pH-t (4,8) és a nagy etanolkoncentrációt (10%), ami jellemző sajátos élőhelyére, a borra. Az Oenococcus oenos és több más tejsavbaktérium a borokban ún. biológiai almasavbontást végez, ami lényegében malolaktátos erjedés, az almasav tejsavvá dekarboxilezésével jár (3.7. ábra). Ez a vörösboroknak lágyabb ízt kölcsönöz, lényeges folyamat az almabor (cider) gyártásban is.
60
A mikroorganizmusok áttekintése
3.7. ábra - A tejsavbaktériumok almasavbontásának lehetőségei 1. almasav-dehidrogenáz, 2. almasav-oxidáz, 3. almasavdekarboxiláz, 4. oxálecetsav-dekarboxiláz, 5. tejsav-dehidrogenáz
Streptococcus nemzetség A tejsavbaktériumok egyetlen nemzetsége, amely csaknem kizárólag az állati szervezethez alkalmazkodott fajokat ölel fel, köztük súlyos kórokozókat, mint az embert is veszélyeztető Str. pyogenes és Str. pneumoniae. Számos más faj házi- és vadállatok kórokozója. Sok nem patogén fajt, egyéb tulajdonságai alapján, más nemzetségekbe soroltak át (pl. Lactococcus, Enterococcus). A Streptococcus nemzetség fajainak száma meghaladja a 60-at. Ezeket hagyományosan egy-egy fajról elnevezett csoportokba sorolják (mutans, salivarius, anginosus, mitis, bovis és pyogenes). A kórokozók főleg az utóbbi négybe tartoznak, az emberi megbetegedést okozókon kívül jelentősek a háziállatok kórokozói (pl. a tehenek tőgygyulladása), ezek közvetlenül vagy élelmiszerrel átterjedhetnek az emberre. A szájüreg jórészt ártalmatlan lakói a mutans csoport tagjai, amelyeknek azonban szerepe van a fogszúvasodás kialakításában. Különleges kivételt képez a salivarius csoport egyik tagja, a Str. thermophilus, amelyet a tejiparban oltótenyészetként alkalmaznak.
Bacillus és rokon nemzetségek Bacillus fogalmon általában a spórás, aerob, kataláz-pozitív, pálcika alakú baktériumokat értjük, amit azonban a megismert számos új faj és a molekuláris vizsgálati eredmények miatt módosítani, bővíteni szükséges. A Bacillales rendbe olyan spórás baktériumnemzetségek is tartoznak, mint a kataláz-negatív Sporolactobacillus, a gömb alakú Sporosarcina és a micéliumos Thermoactinomyces. Sőt, melléjük sorolták a különféle endospórás baktériumokkal közeli rokonságot mutató, spórátlan pálca és gömb alakú baktériumok családjait és nemzetségeit (pl. Staphylococcus, Listeria, Brochothrix). A szűkebb értelemben vett Bacillus nemzetségből 1990 után filogenetikai alapon választottak le több olyan nemzetséget, amelyekbe jól ismert fajok tartoznak, és több új nemzetséget is leírtak (3.9. táblázat).
3.9. táblázat - Más nemzetségekbe átsorolt Bacillusok és új nemzetségek Korábbi Bacillus fajokat tartalmazó nemzetségek Alicyclobacillus (1992) 9 faj 61
A mikroorganizmusok áttekintése Aneurinibacillus (1996) 4 faj Brevibacillus (1996) 12 faj Geobacillus (2001) 16 faj Paenibacillus (1994) 59 faj Virgibacillus (1998) 8 faj Új, aerob spórás baktériumnemzetségek Amphibacillus (1990) 3 faj Gracilibacillus (1999) 2 faj Halobacillus (1996) 5 faj Marinibacillus (2001) 2 faj Sulfobacillus (1991) 3 faj Thermobacillus (2000) 1 faj Ureibacillus (2001) 2 faj A mai Bacillus nemzetség a sorozatos átsorolások után is még mindig több mint száz fajt tartalmaz, és mind élettani, mind ökológiai szempontból heterogén. Vannak köztük heterotrófok és kemolitotrófok, acidofilek és alkalofilek, pszichrofilek és termofilek egyaránt. Anyagcsere képességük sokoldalú. Sokféle szerves vegyület oxidációjára képesek, több faj a szénhidrátokat is erjeszti. Az erjesztés a glikolízises út változatain történik, és a végtermékek között vegyesen savak és alkoholok, CO2 és H2 található (3.8. ábra). A fajok lebontóképessége széleskörű, a keményítőtől a pektinig és a cellulózig terjed, oxidálni tudják a szervetlen vas- és mangánvegyületeket éppúgy, mint a szénhidrogéneket, lehetnek nitrifikálók, denitrifikálók és nitrogénkötők. Ily módon a természet, különösen a talaj, anyagkörforgalmában alapvető szerepet játszanak. Több fajuk a növényi és az állati szervezethez alkalmazkodott, és patogénné vált. A Bacillus és rokonnemzetségek jellegzetes képviselőit a 3.10. táblázat mutatja be.
62
A mikroorganizmusok áttekintése
3.8. ábra - A bacilusok szénhidráterjesztésének változatai. Végtermékek: 1, B. coagulans; 2+3+4, B. licheniformis, B. cereus; 2+6+8, Paenibacillus polymyxa; 5+6+7+9, P. macerans
63
A mikroorganizmusok áttekintése
3.10. táblázat - Bacillusok és rokonnemzetségek fajainak különleges tulajdonságai Termofil
Geobacillus stearothermophilus
Termofil, acidofil
Bacillus coagulans
Pszichrofil
Sporosarcina globispora
Alkalifil
Bacillus alcalophilus
Acidofil
Alicyclobacillus acidoterrestris
Keményítőbontó
Bacillus amyloliquefaciens
Cellulózbontó
Bacillus circulans
Pektinbontó
Bacillus macerans
Kitinbontó
Paenibacillus chitinolyticus
Aromás vegyületeket bont
Bacillus benzoevorans
Szénhidrogéneket bont
Geobacillus thermoleovorans
Nitrogénkötő
Paenibacillus polymyxa
Denitrifikál
Bacillus licheniformis
Fakultatív kemolitotróf
Bacillus schlegelii
Antibiotikumot képez
Bacillus subtilis
Rovarpatogén
Bacillus thuringiensis
Humán- és állatpatogén
Bacillus anthracis
Ételmérgezést okoz
Bacillus cereus
Sokoldalú anyagcsere képességük és élettani tulajdonságaik következtében, különösen a környezeti tényezőknek ellenálló endospórának köszönhetően, sok bacillusfaj általánosan előfordul nyers és feldolgozott élelmiszerekben, gyakran okozva romlásukat. Néhány példájukat a 3.11. táblázat tekinti át. Figyelmet érdemel több ismert faj megváltozott neve, valamint néhány, az élelmiszerekből újabban leírt faj. Ilyenek pl. az Alicyclobacillus nemzetség képviselői, amelyek elsősorban gyümölcslevekben találhatók. Számos különlegesen hőtűrő spórájú faj ismert. Nevezetes a zöldségkonzervek simasavanyodását okozó Geobacillus stearothermophilus, hozzá hasonló hőtűrésű fajokat találtak újabban ultrapasztőrözött tejben (Aneurinibacillus thermoaerophilus) és cukorrépalében (B. sporothermodurans).
3.11. táblázat - Élelmiszerek romlását okozó gyakoribb Bacillus és rokonfajok Alicyclobacillus acidoterrestris
gyümölcslevek 64
A mikroorganizmusok áttekintése Bacillus badius
pasztőrözött tej
Bacillus cereus
baromfihús, sajt, rizs, csírák, zöldségek
Bacillus coagulans
paradicsomkonzervek, tejpor
Bacillus lentus
fűszerek
Bacillus licheniformis
élelmiszerek általában
Bacillus pumilus
élelmiszerek általában, igen gyakori
Bacillus simplex
zöldségpüré
Bacillus subtilis
élelmiszerek általában, gyakori
Brevibacillus brevis
tészta, rizs
Geobacillus stearothermophilus
zöldségkonzervek
Paenibacillus macerans
gyümölcskonzervek
Élelmiszerekkel kapcsolatban különleges jelentőségű a B. cereus, amely élelmiszer-mérgezési tünetekkel, gyomor- és bélbántalmakkal járó toxint termel, az esetek többségében az élelmiszerben, ritkán a bélcsatornában megtelepedve. A B. cereus szoros rokonságába tartozó fajok közül erősen patogén, de nem élelmiszerekkel terjed a B. anthracis, míg a B. thuringiensis rovarpatogén, a B. mycoides pedig ártalmatlan szaprobionta. A B. cereuson kívül néhány más faj (pl. B. lentus, B. pumilus, Brevibacillus brevis) egyes törzseit is izolálták élelmiszer-mérgezés okozóiként, de csak kivételes esetekben. Az érdekesség kedvéért említhető a bacillusok rendjéhez tartozó további két nemzetség, a Sporosarcina és a Sporolactobacillus. Előbbi gömb alakú sejtjei négyes csoportokat alkotnak, hasonlóan a klosztridiumok közé tartozó Sarcinához. Attól eltérően nem anaerob, hanem aerob, a talajban élő, aktív karbamidbontó szervezet. Szintén a talajban fordul elő a homofermentatív, kataláz-negatív, pálca alakú, de mozgó Sporolactobacillus, amelynek tulajdonságai átmenetet mutatnak a laktobacillusok és a bacillusok között.
Clostridium és rokon nemzetségek A bacillusokról mondottak fokozottan érvényesek a klosztridiumok fogalmának módosulására. A Clostridium nemzetségbe általában az endospórát képző, Grampozitív, anaerob, pálca alakú baktériumok tartoznak. A Clostridium néven leírt mintegy 200 faj között a heterogenitás rendkívül nagyfokú és osztályozásuk kevésbé megoldott. Néhányuk fakultatív aerobnak bizonyult, ezeket átsorolták a bacillusok közé (Paenibacillus, Oxalophagus). Mások aerotoleránsak, bár spórázni csak anaerob viszonyok közt képesek (pl. Cl. histolyticum). Sejtenként általában csak egy spóra képződik, amely gyakran szélesebb a sejtnél és azt kidomborítja. Külön nemzetségbe helyezték az akár öt spórát is képző fajt (Anaerobacter). Egyesek festődése Gram-negatív, bár sejtfalszerkezetük Gram-pozitív jellegű (Sporomusa, Sporohalobacter). Csak egy faj gömb alakú (Cl. coccoides), viszont filogenetikailag nagyon közeli rokonság mutatkozik a régről ismert, osztódás után jellegzetes nyolcas sejtcsoportokat képző Sarcinákkal. Utóbb megismertek olyan tulajdonságú, anaerob, spórás baktériumokat is, amelyek nem illettek a heterotróf klosztridiumok közé, mint pl. a fototróf Heliobacterium nemzetség. Desulfotomaculum néven leválasztották a klosztridiumok közül a szulfátredukáló fajokat. A klosztridiumok közt az utóbbi években végrehajtott átsorolásokat a 3.12. táblázat foglalja össze. 65
A mikroorganizmusok áttekintése
3.12. táblázat - Klosztridiumok átsorolása más nemzetségekbe Korábban elfogadott nemzetségekbe került fajok C. barkeri
Eubacterium barkeri
C. bryantii
Syntrophospora bryantii
C. thermohydrosulfuricum
Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricum
C. thermosaccharolyticum
Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum
C. durum
Paenibacterium durum
Klosztridiumokból létesített új nemzetségek C. thermoaceticum
Moorella thermoacetica
C. villosum
Filifactor villosus
C. pfennigii
Oxobacter pfennigii
C. oxalicum
Oxalophagus oxalicus
C. fervidus
Caloramator fervidus
C. lortetii
Sporohalobacter lortetii
C. quercicolum
Dendrosporobacter quercicola
Az 1990-es évek óta végzett nukleinsav-szekvencia és egyéb molekuláris vizsgálatok feltárták, hogy az átsorolások ellenére a klosztridiumok filogenetikailag nem egységesek, köztük szerteágazó rokonsági vonalakat lehet meghatározni. A filogenetikai vonalak azonban nem esnek egybe a klosztridiumok közt mutatkozó jellegzetes élettani tulajdonságokkal. A leginkább zavartkeltő megállapítások szerint olyan csoportok körvonalazódnak, amelyekbe endospórás és spórátlan fajok és nemzetségek egyaránt tartoznak. Ráadásul sok Clostridium faj szorosabb rokonságot mutat távolálló baktériumokkal, mint más klosztridiumokkal; így pl. egyesek még a sejtfal nélküli mikoplazmákhoz is közelebb állnak, sőt, mások nem is a Firmicutes, hanem a Fusobacteria törzsbe illenek (3.13. táblázat).
3.13. táblázat - A klosztrídiumok és rokon anaerob spórátlan baktériumok főbb filogenetikai vonalai Clostridiaceae 1.Szűk értelemben vett Clostridium nemzetség 66
A mikroorganizmusok áttekintése C. butyricum, C, acetobutylicum, C. pasteurianum, C. botulinum, Sarcina ventriculi és mások 2. C. hystoliticum, C. proteolyticum, Caloramator, Oxobacter 3. C. cellobioparum, C.cellulolyticum 4. C. bifermentans, C. sordellii, C. felsineum Lachnospiraceae-Ruminococcaceae C. oroticum, C. propionicum Peptostreptococcaceae Filifactor Eubacteriaceae C. acidiurici, C. purinolyticum Acidaminococcaceae-Selenomonadaceae Sporomusa Syntrophomonadaceae Syntrophospora Thermoanaerobacteriaceae Thermoanaerobacter, Moorella Haloanaerobacteriaceae Sporohalobacter Mycoplasmatales C. ramosum, C.innocuum Fusobacteria C. rectum
67
A mikroorganizmusok áttekintése A még közel sem végleges vizsgálatok szerint a klosztridiumok közt nem kevesebb, mint 20 filogenetikai vonal körvonalazható. Közülük csak négy tartalmaz többségükben anaerob spórás fajokat, a többiekben viszont több-kevesebb Clostridium faj kerül a zömében spórátlan anaerob baktériumok közé. A szűkebb értelemben vett Clostridium nemzetségbe legalább 60 faj tartozik, a gömb alakú Sarcina fajokkal együtt. További klosztridiumok külön csoportot alkotnak a közülük létrehozott új nemzetségekkel (Caloramator, Oxobacter). Egy további, jól körülhatárolható csoportot képeznek a többségükben termofil és cellulózbontó klosztridiumok. Nagyon sok Clostridium faj más nemzetségekkel vegyesen alkot egy filogenetikai vonalat, köztük számos spórátlannal is (Ruminococcus, Coprococcus, Butyrivibrio, Lachnospira). Érdekességként ide illeszkedik egy óriási méretű, különleges, sokspórás baktérium, amelyet Epulopiscium néven először halakban élősködő protisztaként írtak le 1988-ban; csak később derült ki, hogy valójában az eddig ismert legnagyobb prokariota szervezet. A további filogenetikai vonalakat túlnyomórészt spórátlan anaerob baktériumok alkotják, a közéjük sorolható klosztridiumokkal. Ilyen csoportok rajzolódnak ki az Eubacterium, a Peptostreptococcus, illetve a Selenomonas-Acidaminococcus nemzetségek körül. Az utóbbihoz tartozik néhány Gram-negatív nemzetség is, mint az endospórás Sporomusa, a spórátlan Megasphaera és Pectinatus is. Ez a két nemzetség jól ismert a sörök romlását okozó baktériumok között. A klosztridiumok rendjével távolabbi rokonságot mutató fajok kerültek a Thermoanaerobacteriumok és a Haloanaerobacteriumok közé (Moorella, illetve Sporohalobacter); míg teljesen bizonytalan a mikoplazákkal, illetve a fuzobaktériumokkal filogenetikai affinitást tanúsító néhány faj helyzete (Cl. ramosum, Cl. innocuum, illetve Cl. rectum). A klosztridiumok mindenütt megtalálhatók a természetben, talajban, vízi üledékekben, nemcsak anaerob környezetben, hanem olyan körülmények között is, amelyek látszólag aerobok, azonban mikroméretekben az élőhely mégis oxigénmentes. Spóráik túlélik az oxigén hatását, a kiszáradást és a nagy hőmérsékletet, majd kedvező feltételek közt, alkalmas tápanyagok jelenlétében, kicsíráznak, és elszaporodnak. A klosztridiumok által felhasználható tápanyagok köre rendkívül széles. E tekintetben négy táplálkozási típust lehet megkülönböztetni: szénhidrátbontók (szacharolítikusak), fehérjebontók (proteolítikusak), szénhidrát- és fehérjebontók, valamint különleges, specializált tápanyag-hasznosítók (3.14. táblázat). A szénhidrátbontók hexóz- és pentózcukrokat, poliszacharidokat egyaránt felhasználnak. Ez utóbbiakat különféle extracelluláris enzimekkel hidrolizálják, köztük az összetett, ellenálló polimereket (cellulózt, kitint) is. A klosztridiumokra jellemző lebontó anyagcsere a vajsavas erjedés (3.9. ábra). Ez a glikolízises út egyik változata. A piroszőlősav részben közvetlenül szén-dioxidra és hidrogénre hasad, részben ecetsavvá alakul, illetve egy másik acetil-csopottal kondenzálva végül a jellegzetes végtermékké, vajsavvá redukálódik. Számos faj a vajsavon kívül ecetsavat, tejsavat, hangyasavat, etanolt is képez, amelyek főtermékek is lehetnek. Egyes fajok propionsavat, kapronsavat képeznek. A főként savas erjedési mód sok fajnál úgy módosul, hogy a neutrális végtermékek (butanol, etanol, aceton, izopropanol) aránya megnő. Az erjedést, megfelelő törzsekkel és iparilag is megvalósított eljárásokkal, a butanol és aceton képződésének javára lehet irányítani. Az eljárásokat az teszi gazdaságossá, hogy a keményítő- és pektinbontó klosztridiumok (pl. Cl. acetobutylicum) mezőgazdasági hulladékon is jól szaporíthatók. A proteolitikus fajok a fehérjéket proteázokkal lebontják és az aminosavakat hasznosítják. Az aminosavak erjesztése, egyenként vagy párokban, szintén jellegzetes tulajdonság (3.10. ábra). Sok klosztridium különleges tápanyagok használatára specializálódott (aromás gyűrűs vegyületek, purinok, szerves savak, alkoholok).
3.14. táblázat - Klosztrídiumok jellemző élettani tulajdonságai* Szacharolitikusak
C. butyricum
Keményítőbontó
C. cellobioparum
Cellulózbontó
C. felsineum 68
A mikroorganizmusok áttekintése Pektinbontó
C. sporogenes
Kitinbontó Erjedési főtermék vajsav
C. butyricum
Ecetsav
C. thermoaceticum
Etanol, ecetsav
C. kluyveri
Butanol, aceton
C. acetobutylicum
Proteolitikusak
C. putrefaciens
Proteo- és szacharolitikusak
C. perfringens
Különleges anyagcseréjű
C. kluyveri
Etanolt erjeszt
C. acidiurici
Purinokat hasznosít
C. propionicum
Egyes aminosavakat erjeszt
C. sticklandii
Aminosavpárokat erjeszt Aerotoleráns
C. histolyticum
Nitrogénkötő
C. pasteurianum
Termofil
C. thermocellum
Pszichrofil
C. putrefaciens
Patogén
C. tetani
Ételmérgezést okoz
C. botulinum
* Egy-egy faj csak példaként szolgál.
69
A mikroorganizmusok áttekintése
3.9. ábra - A vajsavas és az aceton-butanolos erjedés vázlata
70
A mikroorganizmusok áttekintése
3.10. ábra - Egyes aminosavak erjesztése a klosztridiumoknál
Széleskörű és változatos lebontóképességükön kívül a klosztridiumok élettani tulajdonságai is sokfélék. Számosuk termofil, mások pszichrofilok. Mindebből következik, hogy ezek az anaerob spórás baktériumok, ellenállva a feldolgozó és tartósító műveleteknek, az élelmiszerek jelentős romlást okozó tényezői. Konzervekben a hőkezelést túlélő spórák kihajtva többnyire gázos puffadást okoznak. Egyes termofil fajoknál (pl. Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum) ez csak nagyobb hőmérsékleten jelentkezik (pl. a terméket meleg éghajlatú országokba szállítva). Jellegzetes az ónozott dobozok feketedése, amit a szulfitredukáló fajok (pl. Desulfotomaculum nigrificans) okoznak. Húskészítményekben a Cl. sporogenes, sajtokban a Cl. tyrobutyricum, gyümölcskonzervekben a savtűrő Cl. pasteurianum okoz gyakran romlást. Számos klosztridium patogén. Ezek főként a proteolitikus fajok, amelyek az emberi, állati szervezetbe jutva toxinokat termelnek és különféle megbetegedéseket okoznak. Ilyenek a Cl. tetani, Cl. septicum, Cl. haemolyticum, Cl. novyi, Cl. chauvoei, és még több mint 20 faj. Élelmiszer vonatkozásban kiemelkedő jelentőségű a Cl. perfringens és a Cl. botulinum. Az előbbi, mély sebekbe jutva, üszkösödést (gázgangrénát) okoz, élelmiszerekben elszaporodva enterotoxint és még tucatnyi más toxint termel. A Cl. perfringenshez képest a Cl. botulinum ritkábban okoz ételmérgezést, viszont az általa termelt neurotoxinok miatt a tünetek súlyosabbak, olykor halálosak. Neurotoxint képez a Cl. barati és a Cl. butyricum néhány törzse is. Tulajdonságai szerint (toxinok típusa, proteolitikus vagy nem proteolitikus természete, szaporodási hőmérséklete) szerint a Cl. botulinumnak több típusát különböztetik meg; ezek a különbségek indokolnák a fajszintű szétválasztást is.
71
A mikroorganizmusok áttekintése
Az endospóra Az endospóra különleges szerkezetű, inaktív állapotúvá alakult sejt, amely így ellenáll a kedvezőtlen környezeti tényezőknek (nagy hőmérséklet, kiszáradás, kémiai hatások). Az élelmiszeriparban különösen nagy jelentőségű a tartósító műveleteknek ellenálló spórák leküzdése. Az endospóra képződése összetett morfológiai, biokémiai, genetikai differenciálódási folyamat, amelynek eredményeként a vegetatív sejttől lényeges tulajdonságokban különböző képlet jön létre. Hasonló, de ellentétes irányú folyamat a spóra kicsírázása és ismét aktív vegetatív sejtté alakulása. A spórázást kedvezőtlen körülmények (pl. tápanyaghiány) váltják ki, és a spóra hosszú ideig, évekig is, lappangó állapotban marad. (1995-ben egy 25–40 millió évesre becsült, borostyánba zárt méhből spórákat keltettek életre!) A spórázás morfológiai és biokémiai eseményeit hét szakaszra tagolják, a csírázásnak három szakaszát különböztetik meg (3.11. ábra). Az első szakaszban a sejtosztódás aszimmetrikusan megy végbe, majd a nagyobb sejtrész körülnövi, mintegy bekebelezi a leendő spórát. Az így kialakult, kettős membránburok között kialakul a spórafal és a kortex, amely a spóra sajátos része. A spóra külsején, fajoktól változóan, további spóraburkok és exospórium is képződhet. A spóraérés befejeztével a spóraplazma anyagcseréje megszűnik, az anyasejt pedig szétesik (autolizál), a spóra kiszabadul. A spóra képződése 6–8 óra alatt végbemegy, míg a csírázás gyorsabb, egy-két óra alatt lezajlik. Elsőként a spóra aktiválódik (kémiai vagy hőmérsékleti hatásokra), vizet vesz fel, megduzzad, megindul az anyagcsere, a spóraszerkezet lebomlik, a jellegzetes spóratulajdonságok elvesznek. Az erőteljes szintetikus folyamatok révén a sejt növekszik, majd kihajt, amit hamarosan követ az első sejtosztódás.
72
A mikroorganizmusok áttekintése
3.11. ábra - A spórázás és a círázás szakaszai. 1. a kromoszóma (kr) középen helyezkedik el a mezoszomához (ms) kapcsolódva; 2. a válaszfalmembrán (vm) szintézise megindul, a kromoszoma két részre válik; 3. a membrán bekebelezi a citoplazma és a magállomány egy részét, kialakul a kettősmembránú előspóra (km: külső, bm: belső membrán); 4. a kortex (k) szintézise; 5. a spórafal (sf) szintézise; 6. a külső (kb) és a belső (bb) spóraburok szintézise; 7. a vegetatív sejt lízise és a spóraérés folyamatai; a) aktiválódás, a spóraállapot megszűnése; b) csírázás, vízfelvétel és duzzadás; c) kihajtás
73
A mikroorganizmusok áttekintése A spórázás alaktani szakaszait jellegzetes biokémiai folyamatok kísérik, és genetikai változások idézik elő. Az utóbbiakról a genomika és transzkriptomika időszakában egyre több ismeret gyűlik össze. A spórázásban mintegy 200-féle gén vesz részt. Köztük új, a fehérjeszintézisben szereplő ún. szigma faktorok, amelyek a vegetatív sejtben nem találhatók. A spóramagban különleges, kis, saválló fehérjék kötődnek a DNS-hez és azt védik a továbbiakban. Az anyagcsere gyökeres átalakulását jelzi a másodlagos anyagcseretermékek megjelenése is, mint amilyenek a polipeptid antibiotikumok (polimixin, gramicidin, bacitracin). A kortexet felépítő murein szerkezete lényegesen különbözik a vegetatív sejtfalétól, ennek majd a kicsírázásban, a spóraburkok lebontásában lesz jelentősége. A murein képződése után megindul a spórákra különösen jellemző, sajátos vegyület, a dipikolinsav szintézise. Ennek és más kétértékű savaknak (szulfotejsav, glutaminsav) a felhalmozódása együtt jár a spóra nagymértékű Ca2+-felvételével, ezek az ionok a savakkal kelátokat képeznek. Ezzel veszi kezdetét a spóraérés szakasza, amelyben a spóra jellegzetes tulajdonságai kialakulnak (3.12. ábra). Jelentős vízveszteség történik, a fénytörő képesség növekszik, kialakul az ellenálló képesség. A szerkezeti tulajdonságokon kívül a spórarezisztencia fő tényezője a spóraplazma dehidratált állapota; az érett spóra vízaktivitás-értéke csupán 0,2–0,3. A vízleadást a kitáguló kortex magyarázza. A dipikolinsav elvonja a kortexből a Ca2+-ot, amelyek a murein negatív töltésű csoportjait semlegesítenék. A mureinhálózatban emiatt fellépő elektrosztatikus taszítás a kortexet kitágítja, ez viszont a merev spóraburkokkal szemben mintegy kipréseli a plazmából a vizet, amelyet részben a kortex vesz fel, nagyobbrészt a spóra ad le. Az érett és nyugvó spóra tulajdonságai nagymértékben különböznek a vegetatív sejtétől (3.15. táblázat).
3.12. ábra - A spóraérést jellemző változások. 1. fénytörő képesség, 2. Ca2+-tartalom, 3. dipikolinsav-tartalom, 4. hőrezisztencia, 5. vízaktivitás
3.15. táblázat - A vegetatív sejt és az endospóra közti különbségek Jellemző Szerkezet
Vegetatív sejt Gram-pozitív sejtfal
Endospóra kortex, spóraburkok, exospórium 74
A mikroorganizmusok áttekintése Mikroszkópos kép
nem fénytörő, festődő
fénytörő, nehezen festődő
Dipikolinsav
nincs
sok
2+ Ca
kevés
sok
Anyagcsere
aktív
szünetel
Ellenállóképesség
kis
nagy
Víztartalom
90%
10–20%
Citoplazma pH
7
5,5
Saválló fehérjék
nincs
van
A spóracsírázás aktiválása gyors enzimes reakciók sokaságát indítja el. Amint a spóraplazma rehidrálódik, számos lebontó enzim (hidrolázok, proteázok) kezdi meg a kortex és a spóraburkok eltávolítását, miközben a spórafal ép marad. Az RNS átírásával megindul az új enzimek szintézise, majd működése, megkezdődik az anyagcsere. A DNS replikálódását a kijavító enzimek tevékenysége előzi meg, amelyek helyrehozzák a lappangó állapotban a DNS szerkezetét ért károsodásokat. Végül a kihajtott sejtben végbemegy a sejtosztódás és megkezdődik a vegetatív sejtciklus. A spórázás folyamatának vizsgálata nemcsak a rendkívül összetett biológiai differenciálódási folyamat megértése miatt fontos, hanem gyakorlati szempontból is, az ellenálló képességet befolyásoló tényezők megismerése és alkalmazása végett.
Gram-pozitív baktériumok Actinobacteria törzse A baktériumok közt a második legnagyobb fajszámú törzs, amelynek mintegy 1600 faja 120 nemzetség közt oszlik meg. Osztályozásukban a sejtalak és a sejtfal összetétele fontos bélyeg. A kokkusz vagy a szabályos pálca csak kevés fajra és nemzetségre jellemző, annál inkább az, hogy a sejtek osztódás után szabálytalan formákat, elágazásokat, gyakran V alakzatot öltenek, illetve, hogy az életciklus folyamán a pálca és gömb alak váltakozik, vagy a hosszabb, fonál alakú pálca rövid sejtekre tagolódik. A törzs egyik fontos és jelentős nemzetségéről ezeket a szabálytalan alakú baktériumokat összefoglalóan korineform csoportnak nevezik, ami azonban nem rendszertani értékű kategória. A korineform baktériumoktól a csökevényes és átmeneti fonalas alakokkal fokozatos az átmenetet az állandósult fonalas, elágazó micéliumot képező sztreptomiceszekhez, amelyek az aktinobaktériumok morfológiailag legváltozatosabb képviselői. A fonalak jól fejlett szövedéke többnyire szubsztrátmicéliumra és az ebből kiágazó fonalak laza vagy tömör rétegét alkotó légmicéliumra differenciálódik. Szaporodáskor a fonalak feldarabolódnak és spórák láncaivá alakulnak, ez azonban a különböző nemzetségekben rendkívül változatos lehet; az is előfordul, hogy a fonalak megduzzadnak és sporangiummá alakulnak, amelyben a spórák képződnek. Ezek a spórák nem az endospórához hasonló kitartóképletek, hanem a szaporodást szolgálják; van azonban egy valódi, ellenálló tulajdonságú endospórát képező nemzetség is, a Thermoactinomyces, amelyet ezért rendszertanilag a bacillusok közé sorolnak. Az aktinobaktériumok élettanilag is sokfélék, bár közel sem annyira, mint a másik két nagy baktériumtörzs (Proteobacteria, Firmicutes). Túlnyomórészt aerob heterotrófok, fő élőhelyük a talaj, ahol alapvető ökológiai szerepet játszanak a különböző szerves anyagok, ellenálló, komplex polimer vegyületek lebontásával. Különös jelentőségre tettek szert az antibiotikumot termelő Streptomyces fajok. Az antibiotikumok utáni kutatás következményeként nem kevesebb, mint 500 fajukat írták le. Az aktinobaktériumok számos tagja az állati szervezetek mindennapos lakója, a bőrön és a nyálkahártyákon, sokuk patogén (pl. Actinomyces bovis, Corynebacterium diphtheriae, Mycobacterium leprae, Mycob. tuberculosis). Élelmiszerekben is gyakran előforduló szaprobionták, romlást okozók, vagy 75
A mikroorganizmusok áttekintése hasznos, különösen a tejtermékek gyártásában alkalmazott baktériumok. Élettani tulajdonságaik szerint három csoportjuk, az aerob, a fakultatív és az anaerob aktinobaktériumok érdemelnek figyelmet.
Micrococcus, Arthrobacter A mikrokokkuszok közé korábban nagyon sokféle baktériumot soroltak, amelyek jó része különféle más nemzetségekbe került. A nemzetség ma az aerob, egyes, kettes vagy négyes gömb alakú sejtekből álló, krém-, sárga, narancs, vagy piros színű telepeket képző kilenc fajt tartalmazza (pl. Micrococcus luteus, Mc. roseus). Ezek az esetek 75–90%-ában megtalálhatók az emberi bőr biotájában, és mindig izolálhatók a levegőből, porból. Egy faj (Mc. varians) közreműködik a kolbászfélék érlelésében, egy másik (Mc. kristinae), amely fakultatív aerob és savat is képez, sörben okoz romlást. Különleges tulajdonsága miatt figyelmet érdemel a Deinococcus radiodurans, amit korábban mikrokokkusznak tekintettek. Azokhoz hasonlóan Gram-pozitív, aerob, piros színű. Sejtfalszerkezete azonban igen komplex, és rendkívül aktív, DNS-károsodást helyrehozó enzimrendszere van. Ennek tulajdonítható, hogy az ultraibolya és a radioaktív sugárzás hatalmas dózisainak ellenáll. Filogenetikailag a Deinococcusokat a baktériumok külön törzsébe sorolják, a különlegesen hőtűrő Thermus nemzetséggel együtt (a Thermus aquaticusból származik a polimeráz láncreakcióban használt hőálló DNS-polimeráz enzim). A mikrokokkuszok közeli rokonai az arthrobakterek (Arthrobacter globiformis és további 14 faj). Jellemző rájuk, hogy életciklusuk alatt mind a sejtalak, mind a festődési mód változik, a pálca kokkusszá, a Gram-negatív jelleg Gram-pozitívvá. A talaj leggyakoribb mikroorganizmusai közé tartoznak, többnyire pszichrotrófok, 5–35 °C közötti hőmérsékleten szaporodnak. Aerobok, cukrokból nem képeznek savat. Élelmiszerek szennyező baktériumai, főleg fagyasztott zöldségféléken fordulnak elő.
Brevibacterium, Microbacterium, Curtobacterium Az első nemzetség fajai korineformok, a pálca-kokkusz átmenetet mutatják, a többiek inkább rövid pálcák. A Brevibacterium aerob, a Microbacterium aerob, de savat termel, a Curtobacterium mikroaerofil, erjeszt. A természetben elterjedtek, főleg növényi anyagokon, azok filloszférájában fordulnak elő, növényi kórokozók is lehetnek (Curtob. flaccumfaciens). Feltünnek telepeik sárgás, vagy narancs színéről. A murein peptidláncában mezo-diaminopimelinsav, lizin, illetve ornitin található, a három nemzetség fenti sorrendjében. A Brevib. linens és méginkább a sótűrő Brevi. casei tejtermékek, sajtok gyártásában hasznos. A M. lacticum a pasztőrözött tej romlását okozhatja, mivel spórátlan létére igen hőtűrő, 72 °C-on 15 perces hőkezelést is túlél.
Corynebacterium, Mycobacterium Jellegzetes korineform alakok. A sejtfalukban arabinogalaktán poliszacharid van, amelyet mikolsav észteresít; ennek tulajdonítható a rájuk jellemző saválló festés. Fakultatív anaerobok, glükózból savat képeznek. Nagy fajszámú nemzetségek, 50–60 fajuk van. A szaprobionták talajszervezetek, növényeken, tejtermékekben is előfordulnak. Sajtok érlelésében vesz részt a Corynebacterium casei, Coryneb. ammoniagenes, Coryneb. variable. A fajok fele orvosi jelentőségű. Az emberi szervezetben a bőr és a nyálkahártyák lakói (pl. Corybeb. durum), a védőoltás bevezetéséig hírhedt kórokozó volt a Coryneb. diphtheriae. Biotechnológiai alkalmazást nyert a Coryneb. glutamicum a lizin és a Na-glutamát ízesítőszer gyártásában. Hasonló gazdasági jelentőségű a Mycobacterium fortuitum a szteroidok átalakításban. A nemzetség két patogén fajnak köszönheti jelentőségét, ezek a Mycob. leprae és a Mycob. tuberculosis. Az előbbit már sikerült földi méretekben visszaszorítani, az utóbbi azonban, a tuberkulózis kórokozója, napjainkban is az emberiség 1/3-át 76
A mikroorganizmusok áttekintése veszélyezteti. A teheneket megbetegítő rokonfajból (Mycob. bovis) sikerült ellene vakcinát kidolgozni (BCG oltás). A nemzetség szaprobionta fajai szárnyasokból és ivóvízzel kerülhetnek élelmiszerekre (Mycob. avium, Mycob. gordonae).
Propionibacterium, Eubacterium, Bifidobacterium Az aktinobaktériumok távolabbi rokonságában álló, fakultatív és obligát anaerob baktériumok. Erjesztési módjaik jellemzők a nemzetségekre. Az eubaktériumok vajsavat és hidrogéngázt képeznek, etanol és butanol is lehet a termékek közt. Talajban anaerob élőhelyeken, a kérődzők bendőjében, az állati bélcsatornában találhatók. Az ember vastagbelében a Gram-negatív Bacteroides mellett a leggyakoribb baktériumok. A propionsavbaktériumok különleges erjesztési útjának végtermékei az ecetsav és a propionsav, jelentős szén-dioxid-fejlődés mellett. A tejiparban különleges sajtok érlelésében oltótenyészetként alkalmaznak több fajt, pl. Propionibacterium freudenreichii, Propionib. jensenii. A bifidobaktériumok sok tekintetben hasonlítanak a tejsavbaktériumokhoz, de filogenetikailag az aktinobaktériumok külön rendjét alkotják. Ecetsavat és tejsavat termelnek, gázfejlődés nélkül. Az erjedés a foszfoketolázos biokémiai úton folyik. Születés után a csecsemők bélcsatornájában elsőként megtelepedő baktériumok, származási helyük a vagina, de a szájüreg biotájához is hozzá tartoznak. Tejtermékek erjesztésére is használják egyes fajaikat (pl. Bifidobacterium lactis).
Gombák A gombák sajátos világa az eukariota sejtű élőlények végső differenciálódásának és fejlődésének részeként jött létre a növényvilággal és az állatvilággal együtt. A molekuláris vizsgálatok tanúsága szerint a gombák inkább az állatvilághoz állnak közelebb és azokkal együtt a növények testvér-törzsfejlődési ágát képezik. A hagyományos felfogás mind a plazmódiumos, mind a sejtes nyálkagombákat (Myxomycetes, Acrasiomycetes) gombáknak tekintette. A többi gomba közül az ún. alsóbbrendű gombákhoz sorolták a vízigombákat, a petespórás és a járomspórás gombákat (Chytridiomycetes, Oomycetes, Zygomycetes), amelyeket együttesen moszatgombák (Phycomycota), később, csak részben, mozgóspórás gombák (Mastigomycota) néven vontak össze, megkülönböztetve őket az ún. magasabbrendű gombáktól, nevezetesen a tömlős és a bazidiumos gombáktól (Ascomycetes, Basidiomycetes). E hagyományos rendszertani felosztás az ivaros szaporodási mód különbözőségein alapult, ebből következően az ilyennel nem rendelkező (vagy nem ismert) és csak ivartalanul szaporodó gombákat egy további csoportba gyűjtötték, tökéletlenül ismert gombák (Fungi imperfecti vagy Deuteromycetes) néven. A sejtszerkezeti, biokémiai és molekuláris biológiai vizsgálatok egybehangzó eredményei szerint a gombák fejlődéstörténetileg annyira különböznek, hogy egységes taxonba sorolásuk nem indokolt. A mai elképzelések szerint az egykor gombáknak tekintett szervezetek akár az élővilág három országába is tartozhatnak. A nyálkagombák a protozoához, a vízigombák egy része és a petespórás gombák a Protistától elkülönített csoportba sorolhatók, amelyet Chromista, illetve újabban Straminopila névvel illetnek. A megmaradó többi csoport alkotja a valódi gombák országát (Eumycota vagy Fungi). A vízigombák Chytridiomycetes osztálya, noha ostoros zoospórákat fejleszt, kitines sejtfala alapján és a molekuláris törzsfa szerint is valódi gomba, a Zygomycetes, az Ascomycetes és a Basidiomycetes osztályokkal együtt (3.16. táblázat).
3.16. táblázat - A gombák országai és osztályozása Ország
Törzs
Osztály 77
A mikroorganizmusok áttekintése Eumycota
Chytridiomycota Zygomycota Ascomycota
Archiascomycetes Hemiascomycetes Euascomycetes
Basidiomycota
Ustilaginomycetes Urediniomycetes Hymenomycetes
Chromista
Heteroconta
Hyphochytridiomycetes Oomycetes
Protozoa
Myxomycota Plasmodiophoromycota
Anélkül, hogy a rendszertan további részleteit tagolnánk (bizonyos kérdésekre visszatérünk), a továbbiakban a gombák két, gyakorlati szempontból lényeges csoportját, az élesztő- és a penészgombákat vesszük közelebbről szemügyre. Egyik név sem fed egységes rendszertani kategóriát. Mind az élesztőgombák, mind a penészgombák fogalma történetileg alakult ki. Az előbbi az egysejtű, sarjadzással szaporodó, a cukrokat alkoholosan erjesztő mikrobák körül jött létre, az utóbbi hífát és micéliumot képző, spórákkal vagy konídiumokkal szaporodó, vatta-, vagy nemezszerű bevonatot gomba. Mindkét csoport tagjai a gombarendszer különböző törzseihez, vagy osztályaihoz tartozhatnak (3.13. ábra).
78
A mikroorganizmusok áttekintése
3.13. ábra - Az élesztő- és a penészgombák helye a gombák rendszerében
Mielőtt e csoportok tárgyalásába kezdünk, szükséges kitérni a gombákra (élesztőkre és penészekre) egyaránt vonatkozó nevezéktani sajátosságra. A korszerű gombarendszer a filogenetikai kapcsolatokon túl, a szervezetek ivaros szaporodási módjainak jellegzetességeire épül. Mint említettük, számos gombának nincs, vagy nem ismert az ivaros szaporodási alakja, vagy az csak az ivartalan alak leírása és elnevezése után vált ismertté. Ebből következik, hogy sok gomba két néven szerepel, az ivaros (ún. teleomorf) és az ivartalan (anamorf) alak nevén. Pl. a borok erjesztését kezdő, jól ismert, citrom alakú élesztőgomba teleomorfja a Hanseniaspora uvarum, anamorfja a Kloeckera apiculata nevet viseli. Hasonlóképpen, a gabonát súlyosan károsító Gibberella zeae anamorf alakja a sarló alakú konidiumokat képző Fusarium graminearum. A helyzetet tovább bonyolítja, hogy a rendszertani változások miatt sok gombának több, ún. szinonim neve is van, közülük a rendszertanilag nem hivatalos név olykor jobban ismeretes (ilyen pl. az A. glaucus).
Élesztőgombák Az élesztők az ismert gombafajok mintegy 1%-át teszik ki. Jelentőségük azonban számarányukat messze meghaladja. Az élesztőknek köszönhető a kenyér kelesztése, a sör és a bor erjesztése, sok más anyagcseretermék ipari méretű termelése. A nagy gazdasági haszon mellett azonban az élesztők jelentős kárt okoznak az élelmiszerek romlásával; kórokozó csak kevés van köztük (3.17. táblázat).
3.17. táblázat - Az élesztőgombák gyakorlati jelentősége Iparilag hasznosított élesztőgombák
Saccharomyces cerevisiae 79
A mikroorganizmusok áttekintése Sütőélesztő
Saccharomyces cerevisiae
Bor-, sör-, szeszélesztő
Kluyveromyces lactis
Kefir
Pichia jadinii, Candida tropicalis, Kluyveromyces marxianus
Takarmányélesztő
Candida tropicalis, Pichia pastoris
Egysejt fehérje
Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis
Enzimek
Eremothecium ashbyi
Vitaminok
Phaffia rhodozyma, Rhodotorula mucilaginosa
Színanyag Élelmiszerromlást okozó élesztőgombák
Dekkera anomala, Candida vini, Pichia membranifaciens
Bor, sör
Hanseniaspora uvarum, Pichia kluyveri, Saccharomyces cerevisiae
Gyümölcslevek, üdítőitalok
Zygosaccharomyces rouxii, Torulaspora delbrueckii
Dzsemek, szörpök
Yarrowia lipolytica, Candida zeylanoides, Debaryomyces hansenii
Húsok, húskészítmények Tejtermékek Friss gyümölcsök Savanyúságok, sózott termékek
Kluyveromyces lactis, Galactomyces geotrichum Pichia guilliermondii, Hanseniaspora uvarum Issatchenkia oriebtalis, Pichia membranifaciens, Debaryomyces hansenii
Emberi kórokozók
Candida albicans, Cryptococcus neoformans
Belső szervi mikózisok
Trichosporon cutaneum
Bőrgombásodás Az élesztőgombák heterotróf aerob szervezetek, a fajok mintegy fele fakultatív anaerob és jellegzetes alkoholos erjesztést végez. A glikolízis útján képződött piroszőlősav acetaldehiddé dekarboxileződik, majd etil-alkohollá redukálódik (3.14. ábra). Az erjedés másodlagos termékei (glicerin, diacetil, etil-acetát) fontosak
80
A mikroorganizmusok áttekintése az erjesztett italok aromájának kialakításában. Az élesztők csak az egyszerű szénhidrátokat tudják erjeszteni, a poliszacharidok erjesztése nagyon ritka. Aerob módon sokféle vegyületet hasznosítanak, összetett szénhidrátokat is, szerves savakat, alkoholokat, egyes fajok még szénhidrogéneket is.
3.14. ábra - Az élesztőgombák cukor-, aminosav- és kénanyagcseréjéből származó melléktermékek
Mint heterotróf szaprobionták, az élesztők a természetben elterjedtek, főként növényeken (virágokon, gyümölcsökön, leveleken), néhány fajuk jellegzetes talajszervezet, mások az állati szervezetekben, rovarokkal társulva is él (3.18. táblázat). Csak kevés növényi vagy állati kórokozó van köztük. Élelmiszerekben általánosan előfordulnak, különösen a cukortartalmú termékekben és olyan élelmiszerekben, amelyek a baktériumok szaporodásának nem kedveznek (kis pH, kis aw). Tejtermékekben és húskészítményekben is találkozunk néhány jellemző élesztőgomba fajjal.
81
A mikroorganizmusok áttekintése
3.18. táblázat - Természetes élőhelyek néhány gyakori élesztőgomba faja Élőhely
Élesztőfaj
Talaj
Lipomyces lipofer, Debaryomyces occidentalis, Cryptococcus terreus
Édesvíz
Rhodotorula glutinis, Pichia anomala, Issatchenkia orientalis
Növényzet
Metschnikowia pulcherrima, Sporobolomyces roseus, Cryptococcus laurentii
Levegő, por
Rhodotorula mucilaginosa, Cryptococcus albidus, Debaryomyces hansenii
Filogenetikailag az élesztőgombák heterogének, és egyaránt tartoznak a tömlősgombákhoz (pl. Saccharomyces, Candida), valamint a bazidiumosgombákhoz (pl. Rhodotorula, Cryptococcus). A két nagy gombatörzs közti különbségek az élesztősejtek számos alaktani és biokémiai jellemzőjében megnyilvánulnak (3.19. táblázat). Igy pl. a tömlősgomba-jellegű (aszkomicéta) élesztőknél a sarjadzásban a sejtfal minden rétege részt vesz (holoblasztos), a bazidiomicéta-jellegűeknél a belső falréteggel burkolt sarj kibújik a fal többi rétegén át (enteroblasztos). Sok élesztő, bár többnyire egysejtű, hífát is fejleszthet; a hífa válaszfal pórusa egyszerű nyílás, vagy membránokkal fedett (dolipórus). Ezek a jellemzők nem könnyen határozhatók meg, az ureáz-reakció viszont egyszerű vizsgálat az élesztők hovatartozásának gyors megállapítására.
3.19. táblázat - Az aszkomicéta és a bazidiomicéta jellegű élesztők közötti alaki és kemotaxonómiai különbségek Jellemző
Aszkomicéta
Bazidiomiceta
Alaktani
kétrétegű
többrétegű
Sejtfalszerkezet
holoblasztos
enteroblasztos
Sarjadzás
–
v
Ballisztokonidium
egyszerű
dolipórus
Válaszfal pórus
–
+
Karotinoid színanyag
–
+
Biokémiai
glukán, mannán
glukán, mannán, kitin
Setfal összetétel
–
+
Diazonium B reakció
–
+
Nyálkás telep
82
A mikroorganizmusok áttekintése Ureáz reakció
–
+
Keményítőszerű tokanyag
6,7,8,(9)
(8), 9,10, 10-H2
Koenzim Q típus
< 50
> 50
G + C mol% A tömlősgombákhoz tartozó élesztők ivarosan spórákkal szaporodnak, amelyek az anyasejtben keletkeznek; ezt analógnak lehet tekinteni a gombafonalas tömlősgombák aszkuszával. Lényeges különbség azonban, hogy az élesztőknél nem fordul elő termőtest. Ezért sorolják őket a tömlősgombák között külön osztályba, Hemiascomycetes néven (3.20. táblázat). Egy kis élesztőnemzetség (Schizosaccharomyces) nem sarjadzással, hanem hasadással (a sejtek kettéosztódásával) szaporodik ivartalanul, ivarosan pedig spórákat képez. Ezért őket az őstömlősgombák osztályába (Archiascomycetes) különítik el. Sok bazidiumosgomba is ölthet sarjadzó élesztőalakot. Ezek a bazidiomiceták mindhárom törzsfejlődési ágához tartozhatnak. Ivaros szaporodásuk, ha van, bizonyos mértékig tükrözi a bazidiumképződés jellemvonásait. Sok élesztőgomba ivaros szaporodása nem ismert. Míg ezeket korábban egy mesterséges csoportba sorolták, imperfekt élesztők néven, és a hasonlóan ivartalanul szaporodó penészekkel együtt tárgyalták (Deuteromycetes osztály), ma már a molekuláris jegyek alapján lehetőség van ezeket is a megfelelő rokonsági körbe sorolni, függetlenül attól, hogy anamorf alakok.
3.20. táblázat - Az élesztőgombák osztályozása (fontosabb családok és példanemzetségek) Törzs, osztály Ascomycota
Család
Nemzetség
Schizosaccharomycetaceae Schizosaccharomyces
Archiascomycetes Hemiascomycetes
Dipodascaceae
Galactomyces, Yarrowia Debaryomyces, Pichia, Lipomycetaceae Lipomyces Saccharomyces Hanseniaspora Candida Saccharomycetaceae Saccharomycodaceae Candidaceae*
Basidiomycota
Filobasidiaceae
Filobasidiella
Hymenomycetes
Cryptococcaceae*
Cryptococcus, Trichosporon
Urediniomycetes
Sporidiobolaceae
Sporidiobolus, Rhodosporidium Rhodotorula, Sporobolomyces
Sporobolomycetaceae*
83
A mikroorganizmusok áttekintése * Anamorf taxonok Az élesztőgombák rendszerezése meglehetősen bonyolult és még korántsem végleges. Az aszkomiceta élesztőknek több mint tíz családját különböztetik meg, a bazidiomiceta élesztőket pedig a bazidiumos gombák közt még több különböző családba osztják. A 3.20. táblázat áttekintést nyújt ezekről, a teljesség igénye nélkül. A továbbiakban a rendszertani taglalást nem követjük, hanem az élesztőket gyakorlati szempontok szerint összefoglalt csoportokban fogjuk tárgyalni.
Erősen erjesztő élesztők A Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Torulaspora és Kluyveromyces nemzetségekbe tartozó több mint 60 faj között szoros rokonság mutatkozik, és azokat a nemzetségek között ismételten átcsoportosítják és új, külön nemzetségekbe sorolják (pl. Zygotorulaspora, Tetrapisispora és mások). A klasszikus élesztőt, a S. cerevisiae-t is egy időben összeolvasztották tucatnyi Saccharomycessel, majd leválasztottak belőle önálló fajokat. A rendszertani buktatóktól eltekintve, a legtöbb ipari törzs, a sör-, bor-, szesz-, és sütőélesztő a S. cerevisiae-hez tartozik. Ugyanakkor élelmiszerekben ez a leggyakoribb romlást okozók egyike is. A Zyg. bailiit az ecetsav és más tartósítószerekkel szembeni nagy ellenálló képessége jellemzi; a Zyg. rouxii nagy cukor- és sókoncentrációt is elvisel. Sokféle termékben gyakori romlást okozó faj a Tp. delbrueckii, míg a Kluyv. lactis viszonylag nagy hőtürése és laktózerjesztő képessége miatt tejtermékek romlásának okozója.
Gyengén erjesztő élesztők Számos jellegzetes egysejtű, sarjadzó és spórás élesztő csak gyengén vagy egyáltalán nem erjeszt, ennek ellenére sokoldalú élettani tulajdonságaik révén gyakoriak sokféle élelmiszerben, és azok romlását is okozzák. Ilyen pl. a nagy sótűrésű Deb. hansenii. Az aerob anyagcseréjű élesztők gyakran fejlesztenek hífákat, amelyekből a folyadékok felszínén hártyás bevonat képződik. Ilyen pl. az Issatchenkia orientalis és a Pi. membranifaciens. A Pichia nagyszámú, közel száz fajt felölelő nemzetség és szintén sok rendszertani átrendeződésen, változáson ment át. Jellemző faj élelmiszerekben a P. anomala (korábbi nevén, Hansenula anomala, jobban ismert).
Apikulátus élesztők A sejtek a két póluson sarjadzanak, ennek köszönhetően citrom alakúak, innen kapták a nevüket. Cukortartalmú gyümölcsökön mindig megtalálhatók, a must erjesztését kezdik, de alkoholtűrésük kicsi. Jellegzetes fajuk a Hp. uvarum (am. Kl. apiculata).
Ecetsavképző élesztők A Dekkera nemzetség (anamorf nevük Brettanomyces) különleges anyagcsere-tulajdonsága, hogy erjesztésük aerob körülmények közt fokozódik, és nagymennyiségű ecetsavat képeznek. Borokban, sörökben és alkoholmentes italokban okoznak romlást.
Hífafonalas élesztők Sok élesztőgomba a penészekhez hasonlóan hífafonalat fejleszt, a sarjsejtek erről válnak le. Ilyen pl. a Yarrowia lipolytica, ami lipid- és fehérjebontó, ezért húsok és tejtermékek romlásában szerepel. Az élesztők egy csoportja nem is képez sarjadzó sejteket, hanem a hífa válaszfalakkal kis részekre (artrokonidiumokra) töredezik (3.15. ábra). Ilyen pl. a Galactomyces geotrichum. Hasonló ehhez a Schizosaccharomyces fajok sejtjeinek kettéosztódása, bár ezek közül csak egy hífafonalas. 84
A mikroorganizmusok áttekintése
3.15. ábra - Élesztőgombák vegetatív alakjai. A) egysejtű sarjadzó sejtek (pl. Candida), B) hífafonál sarjadzó sejtekkel (pl. Yarrowia), C) artrokonidiumokra hasadó hífafonál (pl. Galactomyces)
Anamorf élesztők Mint már említettük, sok élesztőnek nincs vagy nem ismert az ivaros spóraképző alakja. Ezek sarjadzással szaporodnak, anamorf vagy más néven imperfekt alakok. Mind az aszkomicéta, mind a bazidiomicéta élesztők között számos ilyen faj van; az előbbieket az igen nagy létszámú Candida nemzetségbe gyűjtötték össze. Sok faj élelmiszerekben nagyon közönséges és gyakori romlást okozó tényező, ilyenek a C. tropicalis, C. stellata, C. zeylanoides stb. Ezeknek és a korábban említett élesztőknek a teleomorf-anamorf kapcsolatait a 3.21. táblázatba foglaltuk össze.
3.21. táblázat - Élelmiszerekben gyakori élesztők teleomorf és anamorf alakjai Teleomorf
Anamorf
Debaryomyces hansenii
Candida famata
Dekkera anomala
Brettanomyces anomalus
Galactomyces geotrichum
Geotrichum candidum
Hanseniaspora uvarum
Kloeckera apiculata
Ismertebb szinonim név Torulopsis candida Oospora lactis
85
A mikroorganizmusok áttekintése Issatchenkia orientalis
Candida krusei
Kluyveromyces marxianus
Candida kefyr
Saccharomyces fragilis
Pichia anomala
Candida pelliculosa
Hansenula anomala
Pichia membranifaciens
Candida valida
Candida mycoderma
Rhodosporidium toruloides Rhodotorula glutinis Saccharomyces cerevisiae
Candida robusta
Saccharomyces ellipsoideus
Torulaspora delbrueckii
Candida colliculosa
Saccharomyces fermentati
Yarrowia lipolytica
Candida lipolytica
Saccharomycopsis lipolytica
Zygosaccharomyces rouxii
Candida mogii
Saccharomyces rouxii
Színes élesztők A bazidiomicéta élesztők általában színes telepeket képeznek, ezek élénk narancs vagy piros színűek (pl. Rh.glutinis, Sporobolomyces salmonicolor), mások csak krém- vagy fehér színűek, mint pl. a Cryptococcus albidus és a Crypto. laurentii. Ezek a leggyakoribb fajok természetes anyagokon, növényeken, élelmiszerekben is. A bazidiumosgomba-jellegű élesztők között is vannak hífás alakok, mint pl. a Trichosporon fajok. Ezek az élesztők, ritka kivételektől eltekintve, nem erjesztenek. Élelmiszerromlásban azok szerepelnek, amelyeknek erős hidrolízises enzimei vannak vagy pszichrotrófok.
Penészgombák A penészgomba név, hasonlóan az élesztőgombákéhoz, nem rendszertani fogalom, hanem csak a hasonló megjelenésű és tulajdonságú gombák gyűjtőneve. Az elnevezés nagyon különböző mikroszkopikus alakú, szaporodás- és életmódú hífafonalas gombákra vonatkozik, amelyek rendszertani rokonsága olykor nagyon távoli. A köztudatban a penészgombák fogalmához többnyire azok káros tevékenysége társul: az élelmiszerek romlása, a használati eszközök, tárolt anyagok (papír-, bőr-, textilnemű) penészedése. Valóban, gyakorlati jelentőségük nem kis mértékben ennek tulajdonítható, az élelmiszereket illetően különösen. A romlást okozó penészgombák a természetben, környezetünkben nagyrészt szaprobiontaként élnek, bár néhányuk élő anyagot, növényi, állati, emberi szervezetet is meg tud támadni. Az elsősorban parazita és növénykórokozó, illetve állatpatogén gombákat azonban nem szoktuk penészeknek tekinteni. Élelmiszerek vonatkozásában különös jelentőségre tettek viszont szert a mikotoxinokat képző és a fogyasztók egészségét súlyosan veszélyeztető penészgombák. Ezért az élelmiszer-tartósításnak mindig célja a penészgombák elleni védekezés is. A romlást okozó és toxintermelő penészekkel szemben sok faj értékes anyagokat képez, iparilag hasznosított biokémiai átalakításokat végez. Termékeik közt vannak antibiotikumok, alkaloidák, más gyógyszer-alapanyagok, szerves savak, enzimek. Ezeknek a gombáknak a biotechnológiai alkalmazása, mesterséges tenyésztése, a termékek kinyerése, feldolgozása igen nagy gazdasági jelentőségű. A penészgombák egy része még az élelmiszeriparban is hasznot hajt a fermentált, erjesztett, érlelt készítmények előállításával (3.22. táblázat). 86
A mikroorganizmusok áttekintése
3.22. táblázat - Példák a penészgombák gyakorlati jelentőségére Biotechnológia
Élelmiszer-fermentáció
Antibiotikumok, gyógyszerek
Sajtok (P. roqueforti, P. camemberti)
Penicillin (P. chrysogenum)
Szalámi (P. nalgiovense)
Cephalosporin (C. acremonium)
Szójaszósz (A. oryzae)
Griseofulvin (P. griseofulvum)
Orientális termékek (Rhizopus oligo- sporus, Monascus ruber, Neurospora)
Ciklosporin (Tolypocladium inflatum)
Élelmiszer romlás
Mevalonin (A. terreus)
Szárítmányok, fűszerek (Eurotium repens, A. glaucus, A. restrictus, Chrysospo- rium spp.)
Enzimek Rennin (Rhizomucor miehei)
Hűtött termékek, húsok (P. expansum, Thamnidium spp)
Amiláz (A. niger)
Gyümölcsbefőttek (Neosartorya fisheri, Talaromyces macrosporus, Byssochlamys fulva)
Proteáz (A. oryzae)
Biodeterioráció, farontás
Pektináz (A. niger)
(Alternaria alternata, A versicolor, A. repens, Trichoderma viride)
Lipáz (P. roqueforti) Celluláz (Trichoderma viride) Glukoamiláz (Rhizopus oryzae) Szerves savak Citromsav (A. oryzae) Glukonsav (A. niger) Fumársav (Rhizopus spp.) Mikotoxinképzők
Humán kórokozók 87
A mikroorganizmusok áttekintése Aflatoxin (A. flavus)
Tüdőmikózis, allergia (A. fumigatus)
Patulin (P. patulum)
Dermatomikózis (Trichophyton mentagrophytes)
Trichotecén (F. graminearum) Ochratoxin (A. ochraceus) A: Aspergillus, P: Penicillium, C: Cephalosporium, F: Fusarium A penészgombák általában aerob, heterotróf szervezetek. A tápanyagok oxidatív lebontásának fő módjai a hexózmonofoszfát út és a citromsavkör, a glikolízis jelentősége kisebb és csak kivételesen torkollik erjedésbe. Az elsődleges és másodlagos anyagcseretermékek közt azonban sokféle szerves sav lehet (pl. citromsav, fumársav). Szénforrásként a legkülönbözőbb szerves vegyületeket tudják hasznosítani, köztük a cellulózt és más összetett szénhidrátokat, valamint a fehérjéket is, mivel sokféle extracelluláris enzimet termelnek. A környezeti tényezők széles határai közt tudnak szaporodni. Az oxigénen kívül leginkább a nedvességet igénylik, de többségüknek a szubsztrátum néhány százalékos víztartalma, a levegő szokásos páratartalma elegendő. A penészgombák között számos igen kis vízaktivitást elviselő fajt találunk. A hőmérsékleti igény szerint általában mezofilek, sokuk azonban pszichrotróf, szaporodik még 0 °C körül is. Kedvelik a savas pH-t, de széles pH-tartományban tudnak szaporodni, egyes fajok 1,6–9,3 pH-határok közt. Anyagcsere- és élettani tulajdonságaik így alkalmassá teszik a penészgombákat arra, hogy közülük kerüljenek ki a tárolt élelmiszeripari nyersanyagok (gabonafélék, zöldségek, gyümölcsök, húsok), valamint a raktározott ipari termékek leghatékonyabb károsítói. A gombák rendszerében a penészek a zigospórás, a tömlős és az imperfekt gombák közé egyaránt tartozhatnak. Azok a penészgombák, amelyeknek az ivaros szaporodása ismert, a gombarendszer megfelelő helyeire orolhatók, túlnyomó részük azonban csak ivartalanul szaporodik, vagy az ivaros alak csak ritkán fordul elő (vagy nem is ismert). A penészgombákat az ivartalan szaporodásuk szerinti két csoportban fogjuk tárgyalni.
Sporangiospórás penészgombák Ezek ivaros szaporodásuk alapján is a gombák jól elkülöníthető törzséhez, a zigospórás gombákhoz (Zygomycota) tartoznak. Ivaros spóraalakjuk, a zigospóra, két hífanyúlvány közt képződő gametangiumok összeolvadásából jön létre, többnyire színes, vastag falú képződmény. Kihajtva micéliumot vagy közvetlenül ivartalan szaporítóképletet (sporangiumot) hoz létre. A sporangiumot tartó hífa (a sporangiofor) lehet egyszerű vagy elágazó, a sporangiumba nyúló vége kiöblösödik (kolumella, pl. Mucor), vagy a sporangium alatt kiszélesedik (apofizis, pl. Rhizopus). A sporangiumban nagyszámú sporangiospóra képződik (3.16. ábra). Mivel ezek a zigospórás gombák többnyire heterotallikusak, ivaros spóraképzésük ritkán figyelhető meg. Sporangiumok viszont ivartalanul is gyakran képződnek a dús, laza, vattaszerű micéliumban. A hífákban általában nincs válaszfal; sejtfalukra a kitin és a kitozán jellemző.
88
A mikroorganizmusok áttekintése
3.16. ábra - Zigospórás gombák ivartalan szaporítóképletei. A) Mucor spp., B) Rhizopus spp., C) Rhizopus micélium részlete
Néhány faj hífái, főleg oxigénszegény környezetben, pl. folyadékokban, élesztőszerű sarjadzó sejtekre esnek szét, erjeszteni is képesek. A hífafonalak vastag falú kitartósejtekké is tömörülhetnek, ezek a klamidospórák vagy gemmák. A sporangiospórás penészgombákra általában jellemző, hogy micéliumuk gyorsan növekszik, telepük szétterjed. Többségük szaprotróf, a természetben (talajban, bomló növényi anyagokon) mindenütt megtalálhatók. Spóráik a levegőbe kerülve a széllel terjednek, így környezetünkben is a leggyakoribb penészgombák közé tartoznak. A Zygomycota törzs mintegy 800 fajt ölel fel, ezeket tíz rendbe osztják, amelyek közül a legnépesebb a Mucorales. A legnagyobb fajszámú nemzetségek a Mucor, a Rhizopus és az Absidia. Élelmiszereken ezekkel a fajokkal leggyakrabban a tárolt gyümölcsökön és zöldségeken találkozunk, mint raktári penészekkel. A hűtött húsok penészedését a Thamnidium fajok okozzák.
89
A mikroorganizmusok áttekintése
Konidiumos penészgombák Ezekre a penészgombákra általában az jellemző, hogy hífáikat válaszfalak tagolják és ivartalan szaporítóképleteik, a konidiumok, külsőleg keletkeznek a hífákról lefűződve. A konidiumokat létrehozó hífarészek (a konidiogén sejtek) gyakran specializált hífafonalak (a konidiumtartók) végén, sajátos alakzatokat képezve találhatók. A konidiumos gombáknak több mint tízezer faja ismert; ezeknél a konídiumok alakja, színe, a konidiumtartók elhelyezkedése, csoportosulása rendkívül változatos képet mutat, ami a köztük való eligazodást nagyon megnehezíti. Csak kis részük szaporodik ivarosan is, aszkospórákat képezve, mint a tömlősgombák (Ascomycota) törzsének tagjai. Túlnyomó részük csak konidiumokat képez, és bár molekuláris és egyéb jegyek alapján szintén a tömlősgombákkal állnak rokonságban, ezeket hagyományosan az imperfekt gombák formális törzsébe (Fungi imperfecti vagy Deuteromycota) sorolják. E mesterséges törzs egyik osztálya (Coelomycetes) azokat a gombákat foglalja magába, amelyek konidiumtartói termőrétegbe, termőtestszerű alakzatokba csoportosulnak, míg egy másik osztályban (Hyphomycetes) szabadon fejlődnek ki a konidiumok a micéliumban. Ezek többsége jellegzetesen penészgomba küllemű, amelyeket a Moniliales formális rendbe foglaltak. A konidiumos gombákat a konidiumok morfológiája szerint is csoportosíthatjuk. A konidiumok lehetnek egy-, két-, vagy többsejtűek, világos vagy sötét színűek, alakjuk pedig lehet gömb, henger, egyenes, hajlott, spirálisan csavarodott vagy szabálytalan. Az 1880-as években Pier Andrea Saccardo olasz botanikus dolgozta ki a konidiumok alakjára épülő mesterséges rendszert, ami azonban merevnek bizonyult és nem állta ki az idők próbáját. A sajátosságok megkülönböztetése ugyanis sokszor nem volt könnyű és egyértelmű, mivel a fajokon belül is gyakran változtak. Sok gomba nemcsak egyféle konidiumot képez, ezért többféleképpen is besorolható. A gombák egy részénél, amelyeknek az ivaros alakja is ismertté vált, kiderült, hogy ugyanaz a konidiumtípus többféle ivaros gombánál megtalálható; és ez fordítva is beigazolódott: közeli rokon ivaros fajoknak más-más konidiumos alakjuk lehet. E problémák miatt az 1950-es évek utáni rendszerezési törekvések nem a már kialakult ivartalan szaporítóképletek felszínes hasonlóságát, hanem a konidiumok kifejlődésének, a konidiogenezisnek a módját vették alapul, ami állandóbb bélyeg és a fajok rokonságának természetesebb ismérve. Így pl. legegyszerűbb esetben a konidiumok a hífa vagy a konidiogén sejt feldarabolódásából keletkeznek; az ilyen, ún. artrokonidiumok láncából mindig a legalsó a legfiatalabb (pl. Oidium). A blasztokonidiumok a konidiogén sejtből sarjadzással jönnek létre; az így képződő konidiumláncnak a legfelső tagja a legfiatalabb (pl. Monilia). A leggyakoribb képződési mód a fialokonidiumoké; ezeknél a sarjadzásban csak a konidiogén sejt belső fala vesz részt (enteroblasztikus). A konidiumok a konidiogén sejt csúcsán bújnak ki, és ha láncokat alkotnak, mindig a legalsó konidium a legfiatalabb. Így képződnek az Aspergillus, a Penicillium, a Fusarium és sok más penészgomba konidiumai. Az annellokonidiumok annyiban különböznek az előbbitől, hogy képződésük közben a konidiogén sejt kissé növekszik, így a lefűződés helyén gyűrűk képződnek (pl. Scopulariopsis). A konidiogenezisnek még több más módja lehetséges, aminek részletezésétől eltekintünk. Az átmeneti és módosult típusok miatt az imperfekt gombák konidiogenezisén alapuló rendszer sem problémamentes. A rendszerezés modern törekvése az ivaros fajok mind fokozottabb mértékű figyelembe vétele és az ivartalan alakok besorolása közéjük. Így pl. a konidiumos penészgombák két legfontosabb és legnagyobb fajszámú nemzetsége, az Aspergillus és a Penicillium a tömlősgombák Plectomycetes osztályába kerül. A tömlősgombákat hagyományosan a termőtest szerkezete alapján rendszerezik. E gombák ivaros szaporodásakor a rájuk jellemző tömlő (aszkusz), amelyben az aszkospórák képződnek, az ún. aszkogén hífákból alakul ki. Ezeket steril hífák veszik körül, és együttesen alkotják a termőtestet (aszkomát), amelynek alakja és szerkezete jellegzetes. Egyik típusa a kleisztotécium, ami zárt, vastag falú termőtest, benne a hífák szövedékében elszórtan találhatók az aszkuszok; a spórák a termőtest felszakadása után szabadulnak ki. A peritécium palack alakú, csaknem zárt termőtest, az aszkuszok termőréteget alkotnak, a spórák a termőtest nyílásán jutnak ki. Az apotécium nyitott, csésze alakú termőtest, amelynek belső felületét képezi az aszkuszokat tartalmazó termőréteg. Ismert még az aszkololuláris termőtest is, amelynek steril hífák alkotta üregeibe utólag nőnek bele az aszkuszok. A tömlősgombák osztályozásának további lényeges ismérve az aszkusz 90
A mikroorganizmusok áttekintése szerkezete, amelynek fala lehet egy- vagy kétrétegű, éréskor széteső csúcsán pórussal vagy fedővel nyíló. Mindezek a jellemzők fontosak a tömlősgombák korszerű rendszerezésében, amit a hagyományossal összehasonlítva a 3.23. táblázat mutat be.
3.23. táblázat - A fonalas tömlősgombák (Euascomycotina, Pezizomycotina) osztályainak fő morfológiai jellemzői (Eriksson és Winka rendszere szerint, 2001) Osztály
Termőtest
Termőtest keletkezése
Aszkusz*
Hagyományos beosztás
Arthoniomycetes
Apotécium
AszkohiméniumBitunikás
Loculomycetes
Chaetothyriomycetes
PszeudotéciumAszkolokulusz Bitunikás
Loculomycetes
Dothideomycetes
PszeudotéciumAszkolokulusz Bitunikás
Loculomycetes
Eurotiomycetes
KleisztotéciumAszkohiméniumPrototunikás
Plectomycetes
Lecanoromycetes
Apotécium
AszkohiméniumUni/proto.inop. Discomycetes
Leotiomycetes
Apo-/ kleiszto.
AszkohiméniumUnitunikás,inop. Discomycetes
Pezizomycetes
Apotécium
AszkohiméniumUnitunikás,operk.Discomycetes
Sordariomycetes
Peritécium
AszkohiméniumUnitunikás
Pyrenomycetes
* Aszkuszfal széteső (prototunikás), egyrétegű (unitunikás) vagy kétrétegű (bitunukás), nincs fedele (inoperkulatus) vagy fedővel zárul (operkulatus)
Szövedékes gombák A szövedékes gombák (Plectomycetes, az új rendszer szerint Eurotiomycetes) osztályát tehát a zárt termőtest (kleisztotécium) jellemzi, az ivartalan szaporodás artrokonidiumokkal vagy fialokonidiumokkal történik. Az Eurotiales rendbe tartoznak a leggyakoribb penészgombák, amelyeket főként anamorf alakban ismerünk, mint Aspergillus vagy Penicillium (3.17. ábra). A két nemzetség közt lényeges alaki különbség van. Az Aspergillus konidiumtartóinak vége kiöblösödik (ún. vezikulumot képez), a konidiogén fialidok ezt borítják be egy vagy két rétegben. A Penicillium fajok konidiumtartói ezzel szemben egyszeresen vagy többszörösen, szimmetrikusan vagy aszimmetrikusan elágaznak; az ágak végén ülnek a fialidok, amelyek a konidiumláncokkal együtt alkotják a jellegzetes „ecsetet”.
91
A mikroorganizmusok áttekintése
3.17. ábra - A penicilliumok és az aspergillusok jellegzetes konidiumfejének szerkezete. A) P. chrysogenum (többszörösen elágazó ecset), B) A. parasiticus (egysoros fej), C) A. niger (kétsoros fej)
Ezeknek a penészgombáknak a telepe is jellemző küllemű lehet. Ha a micélium jórészt a szubsztrátumban fejlődik ki és belőle sűrűn erednek a konidiumtartók, ez a telepnek bársonyos kinézetet kölcsönöz. A bőséges légmicéliumtól viszont a telep gyapjas szerkezetű lesz, máskor viszont a légmicélium fonalakba, a konidiumtartók pedig kötegekbe csoportosulhatnak. Mindehhez járul a konidiumtömeg színe, ami az aszpergilluszoknál lehet egyebek közt sárgás vagy fekete, a penicilliumoknál gyakran kékeszöld. A nagyszámú faj (kb. 100 Aspergillus, 80 Penicillium) meghatározása nagy gyakorlatot igényel. A fajok teleomorf kapcsolatai sokfélék. A kétsoros ecsetű (biverticillata) penicilliumok a Talaromyces, más penicilliumok az Eupenicillium és Hemicarpenteles, míg az aszpergilluszok az Emericella, Eurotium, Neosartorya és más teleomorf alakoknak felelnek meg (3.24. táblázat).
3.24. táblázat - Példák a penészgombák teleomorf és anamorf kapcsolataira Teleomorf
Anamorf
Byssochlamys fulva
Paecilomyces fulvus
Emericella nidulans
Aspergillus nidulans
Eurotium herbariorum
Aspergillus glaucus
Neosartorya fischeri
Aspergillus fischerianus
Eupenicillium javanicum
Penicillium indonesiae
Talaromyces macrosporus
Penicillium macrosporum 92
A mikroorganizmusok áttekintése Gibberella zeae
Fusarium moniliforme
Élelmiszer-ipari jelentőségük igen nagy. Bizonyos törzseket a sajtok, szalámik érlelésében, a szójaszósz erjesztésében alkalmaznak. A rengeteg szárazság- és hidegtűrő faj sokféle élelmiszer romlását okozza. Veszélyes mikotoxintermelők vannak köztük (aflatoxin, ochratoxin, patulin), az A. fumigatus jelentős kórokozó (tüdőmikózis). Több fajt ipari méretekben hasznosítanak antibiotikumok (penicillin: P. chrysogenum), enzimek (amiláz, proteáz, pektináz: A. oryzae, A. niger) és szerves savak (citromsav: A. niger) termelésére.
Maggombák, csészegombák, termőtestüreges tömlősgombák A tömlősgombák további hagyományos osztályait is a termőtestek típusai jellemzik. A maggombáké (Pyrenomycetes) peritécium, a csészegombáké (Discomycetes) apotécium, a termőtestüregesekét (Loculoascomycetes) a nevük jelzi. A szövedékes gombákhoz képest kevesebb penészszerű alak tartozik közéjük, viszont növénykórtani jelentőségük kiemelkedő. Ilyenek a maggombák közt pl. a gabonafélék kórokozói, a Gibberella (anamorf Fusarium) fajok. Nemcsak jelentős kórokozó, hanem a gombagenetikai vizsgálatok nevezetes alanya is a Neurospora (am. Monilia). A csészegombák sok ezer faja közül csak példaként említhetők az élelmiszerek növényi nyersanyagainak károsítói, gyümölcsökön a Monilinia fructicola, zöldségeken a Sclerotinia sclerotiorum, valamint a lisztharmat-félék (szőlőn Uncinula necator, almán Podosphaera leucotricha). Sok jelentős növénypatogén gomba tartozik a termőtestüreges tömlősgombák közé is, mint pl. a Pleospora (am. Alternaria). Gyakori szaprobionta penészgomba az élesztőszerű Aureobasidium és a Cladosporium.
A penészgombák jelentősége élelmiszerekben A penészgombák megjelenése mindennapi életünkben többnyire káros tevékenységként jelentkezik. Jelentős gazdasági és egészségügyi probléma a növénytermesztésben, az állattenyésztésben és az élelmiszeriparban. Növényi nyersanyagokon elszaporodva és azok tápanyagait felhasználva, egyrészt élelmiszerként emberi fogyasztásra alkalmatlanná teszik őket, másrészt takarmányként csökkentik energia- és tápértéküket. Az állattenyésztésben a takarmányfelvétel csökkenése, a szaporodásbiológiai zavarok megjelenése lehet a penészes takarmány elfogyasztásának következménye (ld. még mikotoxinok 4.3. fejezet). Élelmiszereinken tevékenységük többnyire káros folyamatként, romlásként jelentkezik. A jelentős gazdasági veszteségen túl számos penészgomba élelmiszer-egészségügyi veszélyt is jelent, toxikus anyagcseretermékeik, a mikotoxinok képzése miatt. A penészgombáknak azonban nem csak káros szerepét ismerjük élelmiszereinkben. Számos példát találhatunk az élelmiszer-technológiában és a biotechnológiában, ahol gazdasági hasznot hozó tevékenységet fejtenek ki. Gondoljunk csak a különböző sajtok (pl. rokfort, camembert) érleléséhez felhasznált penészgombákra és a szalámikon található „nemes penészekre” vagy az antibiotikumok és enzimek termeléséhez felhasznált penészgombákra. A penészgombák konidiumai, spórái a levegővel terjednek, így könnyen szennyezhetik az élelmiszerek nyersanyagait, a csomagolatlan késztermékeket. Bár általában mindenféle szerves tápanyagon jól szaporodnak, egyes fajok bizonyos élelmiszerekre jellemzőek. A P. expansum például az alma jellegzetes romlásokozója. A citrusféléken a P. italicum, a hűtött húsokon Thamnidium elegans szaporodása figyelhető meg gyakran. Gyümölcs- és esetenként zöldségfélék jellegzetes romlási jelenségeit a pektin-, cellulóz- és fehérjebontásra képes parazita és szaprobionta penészgombák, köztük számos Aspergillus és Penicillium faj okozza. Ezeken a 93
A mikroorganizmusok áttekintése termékeken szaporodásukat az is segíti, hogy a penészgombák képesek a legtöbb gyümölcsből hiányzó B-vitamin szintetizálására. Kenyér és más sütőipari termékek romlása elsősorban a Mucor, Rhizopus és Neurospora nemzetségbe tartozó penészgombák szaporodásának következménye. Szaporodásukhoz általában a savas közeget (pH < 6), a 20–25 °C-os hőmérsékletet és a 0,9 körüli vízaktivitást kedvelik. Mivel obligát aerobok, oxigén hiányában a spórák nem képesek kicsírázni, de egy ideig életképesek maradnak. A penészgombák szaporodására főleg akkor kerülhet sor, ha a baktériumok, illetve az élesztőgombák szaporodása valamilyen okból (pl. kis aw, pH, hőmérséklet, vagy ezek kombinációi) gátlódik, mivel ezek kedvezőbb körülmények közt, gyorsabb szaporodásuk miatt túlnövik a penészgombákat. Így elsősorban gyümölcsök, sütőipari termékek, fűszerek, szárítmányok, szárított gyümölcsök, liszt, cereáliák, dzsemek, mogyoró, egyes tejtermékek (sajtok, édesített sűrített tej) és hústermékek (száraz és fermentált szalámi, szárított marhahús, nyers sonka) esetében kell penészedéssel számolni. Az élelmiszerek romlásában különösen három jellegzetes élettani csoport játszik szerepet: a szárazságtűrő, a hidegtűrő és a hőtűrő penészgombák. A penészgombák szaporodásának minimális vízaktivitás-igénye általában sokkal kisebb, mint az élelmiszereken előforduló más mikroorganizmusoké; általában 0,8as vízaktivitás minimummal jellemezhető. A xerotrófok és xerofilek 0,7-es vízaktivitás-érték alatt szaporodnak. Számos szárazságtűrő penészgomba fajt ismerünk. Jellegzetes az A. glaucus csoport, amelynek tagjai 0,75-ös av-érték alatt is képesek szaporodni. Az igazi xerofil gombák, mint pl. a Monascus bisporus nem szaporodik 0,97-nél nagyobb vízaktivitás-értéknél; optimuma aw = 0,75–0,65. Ezt a fajt tekintik a legkisebb vízaktivitási-értéken (aw 0,61) szaporodni képes mikroorganizmusnak. Bár a penészgombák általában mezofilek (szaporodási hőmérsékletük a 8–35 °C-os tartományba esik, 20–25 °C-os optimummal), de találunk közöttük pszichrofil fajokat is, amelyek a hűtőházban tárolt élelmiszereinken is elszaporodnak (pl. P. expansum, Cladosporium herbarum). Hűtött húsok felületén, ha az gyorsan kiszárad, szembetűnő penészes romlás következhet be. A Cladosporium elszaporodása pl. fekete, a Penicillium fajok zöld és a Sporotrichum és Crysosporium fajok fehér foltokat hozhatnak létre a hús felszínén. A hőrezisztens penészgombák sokszor okozzák a hőkezelt gyömölcsök és gyümölcskészítmények romlását. Közöttük a Byssochlamys fulva, Bysso. nivea, Neosartorya fischeri, Talaromyces macrosporus, Talaro. bacillisporus, Eupenicillium brefeldianum fordul elő a leggyakrabban. Jellemzőjük, hogy hőrezisztens aszkospórákat, illetve szaporítószerveket képeznek. Ezek teszik lehetővé, hogy a gyümölcstermékek hőkezelését túléljék. Néhány Byssochlamys faj és a Neosartorya fischeri mikotoxinokat termel (patulint, illetve fumitremorgint és verrukulogént), így nemcsak romlást okoznak, hanem egészségkárosító hatásuk is lehet. A penészgombáknak ezekre a csoportjaira visszatérünk a tartósítási módszerek mikrobiológiájának tárgyalásakor (5.1., 5.2., 5.3. fejezetek).
94
4. fejezet - Élelmiszerrel terjedő kórokozók Az embert életében sokféle betegség fenyegeti. Ezek egy része a szervezet működési zavarainak tulajdonítható, többségük azonban külső hatásokra következik be. Ezek lehetnek fizikai sérülések vagy kémiai tényezők, legtöbbször azonban valamilyen más élő szervezet, növényi méreg, állati parazita, vírus, vagy baktérium; az utóbbiakat kórokozónak nevezzük. Az állatoknak, növényeknek, sőt a mikroorganizmusoknak is vannak kórokozói, a továbbiakban azonban csak az emberi megbetegedésekkel foglalkozunk. A megbetegedés a szervezet különböző részeire, szerveire, szervrendszereire terjedhet ki; tárgyunk szempontjából az emésztőtraktus, a gyomor- és bélrendszer megbetegedéseit vesszük szemügyre. Ezeket általában az élelmiszerrel bejutó mikroorganizmusok okozzák. Az élelmiszerrel terjedő kórokozók ismertetése előtt tekintsünk át néhány alapfogalmat, amelyekre az egyes kórokozó mikroorganizmusok és az általuk okozott betegségek megismerésében szükségünk lesz.
Alapfogalmak A megbetegítés képessége a patogenitás, a betegséget okozó élőlény patogén, a kórokozó gazdája pedig az a szervezet, amelyet megbetegít. A betegség kialakulásában tehát két tényező kölcsönhatása játszik szerepet: a patogén és a gazda, amit egy harmadik tényező befolyásol, a környezet, amelyben egymásra hatnak. Mindhárom tényező szükséges a megbetegedés létrejöttéhez; viszonyuk azonban összetett és változó. Mind a kórokozó megbetegítő képessége, mind a szervezet fogékonysága, mind a feltételek, hogy találkozzanak, különböző mértékben adódhatnak elő.
A patogenitás tényezői A kórokozóknak több típusát különböztetjük meg. Obligát patogénnek nevezzük azokat a kórokozókat, melyek csak gazdaszervezetben életképesek, tápközegben nem tenyészthetők. Fakultatív kórokozónak tekintjük azokat a mikroorganizmusokat, amelyek tápközegben is tenyészthetők, de kórokozóként viselkednek megfelelő gazdaszervezetben. Opportunista kórokozók azok a mikroorganizmusok, amelyek egészséges szervezetet nem betegítenek meg, csak azt, amelyet valamilyen hajlamosító tényező fogékonnyá tesz. Ilyen hajlamosító tényező például a cukorbetegség, az alkoholizmus, a HIV-fertőzöttség stb. Lehetséges, hogy ugyanaz a kórokozó egy másik szervezetben nem tud betegséget kialakítani, vagyis arra nézve apatogén. Így pl. a Sa. Typhi patogén az emberre és az emberszabású főemlősökre, de apatogén más emlősállatokra. A kórokozó patogenitása több tényező függvénye. Ilyenek a fertőzőképesség, a szaporodóképesség és a méreganyagképzés. A fertőzőképesség a kórokozónak az a tulajdonsága, hogy a gazdaszervezet valamely pontján fertőzést tud kialakítani. Az inváziós képesség arra a képességre utal, hogy a kórokozó elszaporodva tovább tud terjedni a fertőződés környezetében levő sejtekbe, valamint távolabbi szövetekbe. A toxicitás a betegséget okozó méreg termelésének képességét jelenti. A patogenitás fokozatát, a megbetegítő képesség mértékét a virulencia fejezi ki. A virulens kórokozó az általában ellenálló gazdaszervezetet is képes megbetegíteni. Ehhez az erősen virulens kórokozónak a szervezetbe jutott, kis számú sejtje is elegendő (pl. az E. coli O157 szerotípusának infekciós dózisa kevesebb, mint 10 sejt, míg más E. coli törzsekből milliószor több sejt szükséges a betegség kialakulásához). A virulencia mértékét mikrobáknál az LD50 értékkel adják meg. Ez azt a sejtszámot jelenti, amely a kísérleti állatok 50%-át elpusztítja (LD50 = 50%-os letális dózis).
95
Élelmiszerrel terjedő kórokozók A patogenitási tényezők (virulencia faktorok) a mikroorganizmusok azon „fegyvertárát” foglalják magukban, amelyek alkalmassá teszik őket más szervezetek megtámadására, azokban betegségek kialakítására. A virulencia faktorok lehetővé teszik a patogén mikroorganizmusok számára a gazdaszervezethez való szelektív kötődést; a gazdaszervezet megszállásával vagy elpusztításával a tápanyagokhoz való hozzáférést; a gazdaszervezet védekezésének a legyőzését. A legfontosabb virulenciatényezők az adhezinek, amelyek a patogénnek a gazdaszervezethez való kötődését segítik elő; az invazinok, amelyek a sejtekbe hatolást előmozdító molekulák; továbbá a toxinok, a mikrobák által kiválasztott és a sejteket mérgező, működésüket bénító anyagok. A legtöbb patogénnek számtalan virulenciafaktora van, amelyek meghatározzák, hogy milyen gazdaszervezetet tud megtámadni, milyen szövetekbe hatol be és a betegségnek milyen tüneteit váltja ki. Ha valamelyik tényező hiányzik, a patogén csökkent virulenciájú, vagy avirulens. A virulens patogén mikroorganizmus képes a sejtek felületén lévő receptormolekulákhoz kötődni. Ezt segítik elő a baktériumok fimbriái és pilusai; pl. az urogenitális rendszert megtámadni képes baktériumok a fimbriákkal tudnak a rendszer hámszövetéhez (epitéliumához) kapcsolódni. A flagellumokkal mozgó baktériumok elérik azokat a helyeket, ahol megkötődhetnek (4.1. ábra). A behatolást teszik lehetővé az invazinok, amelyek átrendezik a sejtek citoszkeletonját és a baktériumot a gazdasejtbe juttatják. Az inváziós képesség különösen fontos a bélcsatornát kolonizáló patogén mikrobák számára. A specifikus kapcsolódási és behatolási faktorok közé tartoznak az invazív enzimek. Sok baktérium rendelkezik olyan enzimekkel, amelyek segítségével képes a szövetekbe hatolni. Invazív enzim pl. a Cl. perfringens által termelt kollagenáz. Ez az enzim lebontja a kollagént, a kötőszövet egyik alapelemét, lehetővé téve, hogy a baktérium mélyen a szövetekbe hatoljon. Ez a folyamat szigorúan anaerob körülmények között zajlik, csak akkor történik meg, ha a szövet károsodott és a vér nem tud oxigént szállítani (pl. súlyos sérülések, elfagyás esetén). A hialuronidáz enzim feloldja a hialuronsavat. Sztafilo- és sztreptokokkuszok, valamint klosztridiumok termelik. A sztreptokináz a vérrögöket bontja le, így a baktérium könnyebben terjed tovább a szervezetben. Jellemző a sztreptokokkuszokra, de kis mértékben sztafilokokkuszok is termelik. A Str. pyogenes, a Li. monocytogenes hemolizin enzime szintén az invazív tényezők közé tartozik, feloldja a szövetek sejtmembránját. Ilyen hatású a Cl. perfringens alfa-toxinja is.
4.1. ábra - A baktériumsejt néhány patogenitási faktora
A gazdaszervezet megtámadásának és védekezése leküzdésének is hatásos eszközei az enzimek. A leukocidinek a leukocitákat (fagocitákat) károsítják. Néhány kórokozó olyan kémiai anyagokat választ ki, amelyek specifikusan a fehérvérsejteket pusztítják el. Ilyen kórokozó például a Sta. aureus. A genny felhalmozódása 96
Élelmiszerrel terjedő kórokozók a fertőzött területen a fehérvérsejtek pusztulásának következménye. A Sta. aureus egy másik enzime a koaguláz, a vérplazma kicsapódását váltja ki. Ennek eredményeként a fehérvérsejtek és az immunrendszer más védekezői nem jutnak el a fertőzés helyére. A sztreptokokkuszokra jellemző a dezoxiribonukleáz termelése, ez szintén részt vesz a genny kialakításában. A baktériumok többféle módon képesek legyőzni az immunrendszer védekező működését. Egyes kórokozók vastag extracelluláris poliszacharid bevonattal, tokkal rendelkeznek (pl. Str. pneumoniae, B. anthracis), amely a fagocitózissal szembeni ellenállást biztosítja és elvesztése a fertőzőképesség elvesztésével jár. Hasonló célt szolgál a glikokalix réteg (Ps. aeruginosa), a Mycobacterium tuberculosis viaszos bevonata, a Str. pyogenes M-proteinje a sejtfalban és a pilusban, az E. coli K-antigénje, valamint a Sa. Typhi ezzel analóg Vi-antigénje. A vasnak speciális szerepe van a bakteriális fertőzésekben. A vas az emberi szervezetben szorosan kötött, a baktériumok számára nem hozzáférhető állapotban van, pl. a vérsejtek hemoglobinjában. Bizonyos baktériumoknak (pl. sztreptokokkuszoknak) nincs szüksége vasra (anyagcseréjük szigorúan fermentatív), de a legtöbb baktérium vasat igényel a citokrómok szintéziséhez, a szaporodáshoz. A sziderofórok vaskötő faktorok, melyek lehetővé teszik néhány baktérium számára a gazdaszervezettel való versengést a vasért. Ilyen sziderofór pl. a szalmonellák és más enterobaktériumok termelte enterokelin. Azok a mutánsok, amelyek nem tudnak enterokelint szintetizálni, virulenciájukat is elveszítik. Az E. coli néhány törzse is azért okoz megbetegedést, mert a vasat megkötő sziderofór anyagot, aerobaktint képez. A kórokozó baktériumok talán leghatásosabb virulenciatényezői a toxinok. Két csoportjukat különböztetjük meg, az exo- és az endotoxinokat (4.1. táblázat). Az exotoxinok további három csoportba sorolhatók: a neurotoxinok (pl. botulin toxin) az idegrendszert, a citotoxinok (pl. Str. pyogenes toxinja) a gazdasejtet, az enterotoxinok (pl. kolera toxin) a bélrendszert támadják meg. A legtöbb exotoxin fehérje, amelyet a sejt kiválaszt (a tenyészet sejtmentes szűrletében megtalálhatók). Nagyon hatásosak, már kis mennyiségben károsítják a szöveteket. Velük szemben antitoxinok termelődnek. Gyakran plazmid DNS-en (pl. E. coli) vagy lizogén fág DNS-en kódoltak (pl. botulizmus, diftéria toxin). Többségük hőhatásra inaktiválódik, fontos kivétel a Sta. aureus enterotoxinja. Erős antigének, inaktivált állapotban toxoiddá alakíthatók (antigén tulajdonságuk megmarad, mérgező hatás nélkül). Az exotoxinok tipikus példája a Cl. botulinum által termelt botulin toxin. A legerősebb ismert toxin (1 gramm képes megölni 1 millió embert). A toxint a gyomorsav nem pusztítja el, sőt aktiválja. A toxin az ingerületátvitelt zavarja az ideg–izom kapcsolatoknál. A Vi. cholerae kolera toxinja szintén exotoxin, a bélsejtek receptoraihoz kapcsolódva a ciklikus AMP (cAMP) termelésben résztvevő molekulákat megváltoztatja, a cAMP molekulákat „bekapcsolt” állapotban hagyva, ezáltal a bélrendszert hatalmas mennyiségű víz, valamint Na+- és Cl–kiáramlásra készteti. Az E. colinak is ismertek olyan törzsei, amelyek enterotoxint termelnek (enterotoxin termelő E. coli, ETEC). Ezek is a vastagbél hámsejtjeinek elektrolit kibocsátását fokozva okoznak erős hasmenést, de nem a cAMP, hanem a cGMP szintjének növelésével. A Shigella dysenteriae által termelt shiga toxin a vastagbél hámsejtjeit pusztítja el (enterotoxin, verotoxin), a bélben fekélyeket, s ezzel véres hasmenést okoz.
4.1. táblázat - Az endo- és az exotoxinok tulajdonságai Tulajdonság Termelő baktérium
Exotoxinok Gram-pozitív és
Endotoxinok Gram-negatív baktériumok
Gram-negatív baktériumok Elhelyezkedés a citoplazmában baktérumsejten belül szintetizálódnak, a sejtből kiválasztódnak
a külső membrán komponensei
97
Élelmiszerrel terjedő kórokozók Kémiai szerkezet
fehérjék
lipopoliszacharidok
Toxoidképzés
toxoiddá alakíthatók
nem alakíthatók toxoiddá
Hőstabilitás
hőlabilisak, hőhatásra inaktiválódnak
hőstabilok
Hatásmechanizmus
toxinonként eltérő
lázat, hirtelen vérnyomáscsökkenést és véredényen belüli koagulációt okoz
Toxicitás
általában nagyon toxikusak, nem nagyon toxikusak, alacsony néhányuk a legismertebb dózsuk segít a fertőzések toxikus anyagok közé legyőzésében tartozik
Az endotoxinok a Gram-negatív baktériumok külső membránjának lipopoliszacharid komponensei. Ellentétben az exotoxinokkal, az endotoxinok hőtűrők, csak nagy mennyiségben aktívak és a sejthez kötve maradnak. Hőtűrésük révén a Gram-negatív baktériumokkal szennyezett élelmiszerek utólagos sterilezése nem mentesít az endotoxinoktól. Ellenállnak a proteolitikus emésztőnedveknek, toxoidokká nem alakíthatók. Tüneteik hasonlók és toxicitásuk gyenge. Általános hatásuk lehet lázkeltő, haemorrágiás (kapilláris károsodást okozó), gyulladás, véralvadás, vérnyomáscsökkentés stb. A legfontosabb klinikai tünetek a láz és a sokk. Műtéti eljárások során, vagy a nem megfelelően sterilizált vesedialízis-cső és katéterek révén a szervezetbe jutó Gram-negatív baktériumok (pl. E. coli, Ps. aeruginosa) kórházban szerzett, ún. nozokómiás fertőzést okoznak. Ez hirtelen vérnyomáscsökkenéssel járó szeptikus sokk, ami halálos lehet. A mikroorganizmusok antigénjeik megváltoztatásával is be tudják csapni a szervezet védekező rendszerét. Ha a patogén mikroorganizmus antigénjei megváltoznak, az immunrendszer „memóriája” nem működik. Erre képes pl. az influenzavírus, a HIV-vírus, a kolerabaktérium O139 törzse. A vírusok az antigének változtatásán kívül a gazdasejtben is elrejtőzhetnek az immunrendszer elől, ha a kromoszóma-DNS-be integrálódnak, mint lizogén vírusok. A penészgombák patogenitási faktorai között találjuk a mikotoxinokat (pl. aflatoxin, patulin; 4.3. fejezet). Az élesztőgombák „fegyverei” pl. a proteázok (C. albicans). Bizonyos parazita protozoonok is képesek antigénjeik megváltoztatására (Giardia, Trypanosoma). A különböző neurotoxinokat termelő algák (főleg tengervíziek) közt számos humánpatogén van.
A gazdaszervezet védekezése Ellenálló a gazdaszervezet, ha a kórokozó nem tud benne betegséget kialakítani. Fogékonynak tekintjük azt a szervezetet, melyet a kórokozó képes megbetegíteni. Abszolút fogékony az a szervezet, amelyben kifejlődik a betegség és megjelennek a tünetek; tünetmentes (toleráns) a szervezet, ha a kórokozó megfertőzte a gazdát, de a betegségnek semmi látható jele nincs. A tünetmentes gazdaszervezet is hordozója a kórokozónak és képes más egyedeket is megfertőzni. Amikor a hordozón még nem jelennek meg a betegség tünetei, azaz a betegség még lappangási stádiumban van, inkubációs hordozónak hívjuk. Konvaleszcens (lábadozó) hordozóról beszélünk akkor, amikor a hordozó már tünetmentes, de szervezetében még fertőzőképes kórokozók vannak. Krónikus hordozóról akkor beszélünk, ha a betegségből való felgyógyulást követően, hosszú idő elteltével még mindig tartalmaz fertőzőképes mikroorganizmusokat. Az előbbire példa a szalmonellák ürítése a széklettel, a Mycobacterium tuberculosis viszont a szervezet megfertőzése után egész életünkre a szervezetünkben marad. 98
Élelmiszerrel terjedő kórokozók A gazdaszervezetnek a mikrobás megbetegedések előfordulását befolyásoló tényezői az életkor, a nem, az etnikai hovatartozás, az életmód és a táplálkozási mód; a csecsemő vagy az idős, legyengült ember, valamilyen idült betegség, különösen az immunrendszert befolyásoló kezelés (HIV, rákos daganat ellen), valamint a terhes állapot szintén fogékonyabbá teszi a szervezetet a kórokozókkal szemben. Az emberi szervezet védelmét a kórokozókkal szemben a veleszületett (öröklött), nem specifikus és a szerzett, specifikus ellenálló rendszer sokféle módon látja el. Ha ezek megfelelően működnek, a megbetegedés esélye csökken. A nem specifikus immunvédelem része a bőr és a légző-, valamint emésztőrendszert burkoló epitélium csillangós hámsejtjei, amelyek fizikai gátat képeznek a kórokozók behatolása ellen. A bőr faggyú- és verejtékmirigyeinek váladéka, a bélcsatorna emésztőnedvei kémiai védelmet nyújtanak. Az erősen savas gyomornedv, a pepszin és más enzimek, az epesav a gyomor- és béltraktusba jutó baktériumok jórészét elpusztítja. Az epitélium sejtjeit egy fehérjenyálka (mucus) védi ezektől, továbbá megakadályozza a mikrobák megtapadását. A vékony- és vastagbél körülményeihez alkalmazkodott normál mikrobiota kommenzális tagjai erős vetélkedéssel, szelektív gátlóanyagokkal (bakteriocinekkel) szorítják vissza a kórokozókat. A bélhámon mégis átjutott idegen mikroorganizmusok az elsődleges sejtes védekezőrendszer sejtjeivel találkoznak (fagociták, makrofágok, granulociták), amelyek megtámadják és elpusztítják a behatolókat. Tevékenységüket segítik a vér bizonyos fehérjéi (lizozim, interferon, komplementek). A másik tényező a specifikus immunválasz, amely a szervezetbe került idegen anyagokkal, mint antigénekkel szemben ellenanyagok termelését jelenti. Az immunválasz lehet természetes (a fertőzés hatására kiváltott vagy az anyától kapott) és mesterséges (elölt vagy gyengített kórokozók szervezetbe juttatásával létrehozott).
Környezeti tényezők A környezeti tényezők nyilvánvalóan befolyásolják a kórokozók tulajdonságait, a gazdaszervezet kitettségének mértékét. Azok az ökológiai tényezők, amelyeket élelmiszer-mikrobiológiai szempontból az 1. fejezetben részletesen elemeztünk, számottevően meghatározzák az élelmiszerrel közvetített megbetegedések veszélyét, előfordulásának mértékét. A hőmérsékletnek csak kismértékű növekedése is jelentősen fokozza az élelmiszer mikrobás szennyezettségét. A fogyasztói igények kielégítésére alkalmazott kíméletesebb tartósító eljárások szintén növelik a kórokozók túlélésének kockázatát az élelmiszerben. Egyre több ismeret gyűlik össze a genetikai tulajdonságok kifejeződésének és megváltozásának molekuláris hátteréről. Ezek ismeretében értelmezhetővé válnak a virulenciatényezők változásai, az antimikrobás rezisztencia kialakulása és fokozódása, új patogén mikrobák megjelenése. A környezetnek a genetikai mutánsokra gyakorolt szelektív hatása kézenfekvő magyarázat a kórokozók evolúciójára. A mikroorganizmusokban azonban további lehetőségek is nyílnak a genetikai változásokra, a virulenciafaktorok génjeinek átadására. Ezek gyakran plazmidokon helyezkednek el, vagy a genom ún. patogenitási szigetein halmozódnak fel, és képesek egyik sejtből átjutni a másikba. A vírusok, bakteriofágok szintén közvetítik ezeket a virulenciagéneket. Az E. coli több törzse teljes genomszekvenciájának összehasonlítása feltárta, hogy az ártalmatlan és a kórokozóvá vált törzsek közt jelentős különbségek vannak, a virulens törzsben a genetikai állomány számottevő többlete mutatkozik. A természetes szelekciót fokozzák az élelmiszer-feldolgozás és -tartósítás folyamán a mikrobákra gyakorolt stresszhatások. Az utóbbi években váltak ismertté azok a genetikai elemek, amelyek az általános stresszválaszt szabályozzák a baktériumsejtekben, és azok a fehérjék (szigmafaktorok), amelyek a hő-, ozmózisos, pH-, és oxidatív stresszhatásokat, a tápanyaghiányt érzékelik és a rájuk adott válaszban szerepelnek. A túlélő sejtek fokozottan alkalmazkodnak a stresszhatásokhoz, amelyek mind az élelmiszerben, mind a gazdaszervezetben érik őket. A genomszintű módszerek elterjedése a jövőben új lehetőségeket nyit a kórokozó–gazdaszervezet– környezet bonyolult kölcsönhatásainak megértésére és alkalmazására az élelmiszerek mikrobiológiai biztonságának növelése érdekében.
99
Élelmiszerrel terjedő kórokozók
Élelmiszer okozta megbetegedések Kórokozó mikroorganizmusokat vagy azok toxinjait tartalmazó élelmiszerek elfogyasztása megbetegedést okozhat. Ennek kiváltói lehetnek baktériumok, gombák, vírusok, paraziták, és lehetnek élettelen tényezők is, mint a prionok, nehézfémek, szerves peszticidek stb.; ez utóbbiakkal nem foglalkozunk. A mikroorganizmusok okozta, élelmiszerrel közvetített megbetegedéseknek két fő típusa a fertőzés és a mérgezés. Élelmiszer-fertőzésről (infekcióról) beszélünk, amikor a kórokozó a szervezetbe jut, a bélcsatornában megtelepszik, azt kolonizálja, és elszaporodva megtámadja a bélnyálkahártyát és néha más szöveteket is. Ilyen megbetegedések a szalmonellózis, a vírusos gasztroenteritisz, a toxoplazmózis. Élelmiszer-mérgezés (toxikózis vagy intoxikáció) esetén a kórokozó az élelmiszerben szaporodik el, toxint vagy más káros anyagcsereterméket képez, amely az étellel a szervezetbe jutva azt megbetegíti (pl. botulizmus, sztafilo-enterotoxikózis, mikotoxikózis; 4.2. táblázat). Átmeneti típust képvisel az ún. toxikoinfekció, ebben az estben az élelmiszerrel elfogyasztott kórokozó a bélcsatornában elszaporodva toxint termel és ez váltja ki a megbetegedést. Ilyet okoz a Cl. perfringens és sebfertőzés esetén a Cl. botulinum is.
4.2. táblázat - Élelmiszer által okozott megbetegedések típusai Kórokozó
Példa
Gyakoriság
Baktériumos infekció
Campylobacter jejuni
közönséges
Vírusos infekció
Calicivírus
nagyon gyakori
Parazitás infekció
Toxoplasma gondii
gyakori
Baktériumos intoxikáció
Staphylococcus aureus
gyakori
Baktériumos toxikoinfekció
Clostridium perfringens
kevéssé gyakori
Mikotoxikózis
Aspergillus flavus
kevéssé gyakori
Prionok
BSE
ritka
A legtöbb mikrobás eredetű élelmiszer-megbetegedés a gyomor- és bélrendszerben jelentkező heveny (akut) tünetekkel jár (rosszullét, hányás, hasmenés, olykor láz). Fertőzés esetén ezek a tünetek általában néhány nap alatt jelentkeznek, a kórokozótól, a gazdaszervezet állapotától függően. Az élelmiszer-mérgezés akut tünetei sokkal gyorsabban, órák alatt jelentkeznek. Több élelmiszer-megbetegedés következménye idült (krónikus) tünetekben is megnyilvánul. Számos baktériumos fertőzés ízületi gyulladással, veseműködés zavarával, véres vizelettel, vagy más, komolyabb szervi tünetekkel jár. A vírusos hepatitisz a bélbántalmak után májgyulladásba torkollik, a toxoplazmózis következménye agyhártyagyulladás, születési rendellenesség lehet. Különleges esetet képvisel a botulizmus, amelynek tünetei a központi idegrendszerben jelentkeznek, valamint a Li. monocytogenes okozta megbetegedés, ami szintén az emésztőrendszeren kívüli tüneteket vált ki, gyakran vetélést is okoz. A megbetegedések súlyossága különböző. A baktériumos és vírusos fertőzések többnyire néhány nap, egy hét alatt lezajlanak, komplikációk és végzetes következmény nélkül. E tekintetben is kivétel a liszteriózis, amely 90%-ban kórházi kezelést igényel és 20%-ban halálos kimenetelű. Az élelmiszerek több mint százféle betegséget közvetíthetnek, azonban a kórokozók más úton, vízzel, levegővel vagy közvetlen érintkezéssel (emberről, állatról) is terjednek. Ezért a kimondottan élelmiszerrel terjedő betegségek körét nehéz meghatározni. Az egészségügyi, járványügyi statisztikák sem pontosak e tekintetben, mivel enyhébb tünetekkel a betegek nem mindig fordulnak orvoshoz, a megbetegedések a jelentésekben nem szerepelnek, vagy azok kiváltó oka ismeretlen marad. 100
Élelmiszerrel terjedő kórokozók Pl. az USÁ-ban a becsült, évenkénti 1,5 milliónyi szalmonellózisból csak 40–50 ezer válik ismertté. A 4.3. táblázat áttekintést nyújt azokról a kórokozókról és betegségekről, amelyek terjesztésében élelmiszerek leggyakrabban szerepelnek.
4.3. táblázat - Élelmiszerrel terjedő betegségek áttekintése Kórokozó
Megbetegedés, tünetek
Jelentkezés
Gyakoribb közvetítő élelmiszer
Baktériumok Bacillus cereus
Brucella spp
ételmérgezés, hasmenés
6–15 h
hús, hal, tej, zöldségek
ételmérgezés, hányás 1–6 h
rizs, burgonya, tészta, sajt
brucellózis
napok– hetek
nyers, kezeletlen hús-, tejtermék
2–5 nap
nyers csirkehús, más húsok
Campylobacter jejuni kampilobakteriózis Clostridium botulinum
botulizmus, mérgezés 18–36 h
Escherichia coli
fertőzés
Enterotoxigén
vizes hasmenés
24 h
fekáliás szennyezés
Enteropatogén
vizes hasmenés
1–3 nap
nyers hús, csirke
Enterohemorrágiás
véres hasmenés
1–2 nap
hamburger, csírák, friss levek
Enteroinvazív
hasgörcsök, láz
1–3 nap
fekáliás szennyezés
Listeria monocytogenes
szisztémás fertőzések napok– hetek
tejtermék, nyers zöldség
Salmonella enterica
szalmonellózis, hasmenés
6–48 h
mindenféle élelmiszer
Salmonella Typhi
hastífusz, láz
1–4 hét
ember, állat
Shigella dysenteriae
véres hasmenés
12–48 h
víz, saláták, szendvicsek
1–7 h
hús-, tejtermék, krémek
Staphylococcus aureus ételmérgezés Streptococcus pyogenes
torokgyulladás,vörheny1–3 nap
elégtelen hőkezelésű termék
tej, fagylalt, saláták
101
Élelmiszerrel terjedő kórokozók Viridáns sztreptokokkuszok
hasgörcs, hányás, láz 2–36 h
kolbász, sajt, tej
Vibrio cholerae
heves hasmenés, kolera
6 h–napok
rákok, halak
Vibrio parahaemolyticus
hasmenés, hányás
1–4 nap
rákok, halak
1–2 nap
hús, tej, hal, kagyló
Yersinia enterocolitica hasmenés, láz Protozoonok Cryptosporidium parvum
vizes hasmenés
1–12 nap
szennyezett víz, élelmiszer
Cyclospora cayetanensis
hasmenés, görcsök
1 hét
szennyezett víz, élelmiszer
Giardia lamblia
hasmenés, görcsök
1 hét
szennyezett víz, élelmiszer
Toxoplasma gondii
nyirokgyulladás, láz
10–23 nap
főtlen sertés-, vadhús
Hepatitis A
láz, rosszullét, sárgaság
10–50 nap
fekáliás víz, saláták, rákok
Norwalk vírus
hányás, hasmenés
1–2 nap
fekáliás víz, saláták, rákok
Rotavírus
vizes hasmenés, hányás
1–3 nap
szennyezett élelmiszer
Vírusok
A hazai élelmiszer-fertőzési és -mérgezési adatok általában hasonló képet mutatnak, mint a fejlett egészségügyi rendszerrel rendelkező országok statisztikái, Európában vagy Észak-Amerikában (4.4. táblázat). A hazai élelmiszer eredetű megbetegedések statisztikáját a szalmonellák vezetik. Az 1990-es évek végétől kezdve vannak adatok a vírusos gasztroenteritisz esetekről, és ezek aránya újabban már eléri, sőt meghaladja a szalmonellák okozta megbetegedésekét. Az ételfertőzési, ételmérgezési esetek 2/3-a a háztartásokban fordul elő, következésképpen ezek csak kevés beteget érintenek (az esetek 56–72%-ával szemben a betegek számaránya csak 27–47%). A közétkeztetésben részt vevők között, bár ezek száma jelentősen visszaesett, az esetek 6–10%-os arányával szemben a megbetegedettek aránya 25–60%-ot ér el; a nagy ingadozás az olykor járványos méreteket öltő, tömeges megbetegedéseknek tulajdonítható (az utóbbi évek emlékezetes eseményei voltak a szalmonellás eperleves és a calicivírusos túrós tészta okozta ételfertőzések, ezret meghaladó megbetegedésekkel). Megnyugtató viszont, hogy az élelmiszer-ipari termékek okozta megbetegedések csak 2–5%-ban szerepelnek a statisztikákban.
4.4. táblázat - Magyarországi élelmiszer eredetű mikrobás megbetegedések adatai, 2004 Kórokozó
Események száma
Esetek (betegek) száma és aránya
102
Élelmiszerrel terjedő kórokozók db
db
%
Calicivírus
7
722
40,6
Salmonella enterica
76
681
38,3
Enterococcus faecalis
1
145
8,1
Clostridium perfringens
3
118
6,6
Clostridium botulinum
8
8
0,3
Staphylococcus aureus
4
80
4,5
Campylobacter jejuni
9
23
1,3
Pseudomonas aeruginosa
1
6
0,3
109
1783
100,0
Összes
Salmonella enterica Még a bakteriológia kezdetei előtt ismerték a tífuszos lázat és annak fertőző természetét. A kórokozó baktériumot elsőként Eberth észlelte 1880-ban, hasonló kórokozókat izolált beteg állatokból Salmon is 1885-ben, akiről a nemzetséget elnevezték. Általános jellemzését, mint a bélbaktériumok családjának (Enterobacteriaceae) tagját, a 3.2.3. fejezetben ismertettük. A szalmonellák klinikai diagnosztizálásában, mint más patogén bélbaktériumoknál is, jelentős szerepet játszik az antigének szerológiai vizsgálata. A három fő antigén szerint a szalmonelláknak már több mint 2500 szerotípusát különböztetik meg (a WHO 2004-es adata). A szomatikus O-antigének a sejtfal külső membránrétegének lipopoliszacharidjai, a H-antigének az ostorok fehérjéi, amelyek genetikai meghatározottsága változhat két fázis közt; felületi vagy tok-antigénje (Vi) csak a hastífuszt okozó humánpatogén törzseknek van (4.2. ábra). A közel 70-féle O-antigén száma és a kétfázisú H-antigén betűvel, illetve számmal jelölt típusai szerint képezik a szerotípus formulát. Például az 1,4,5,12:i:1,2 szerotípus (Sa. Typhimurium) jelölése a következőt jelenti: O-antigének: 1, 4, 5 és 12; H-antigének, 1. fázis: i; 2. fázis: 1 és 2; míg a Sa. Enteritidis H-antigénje egyfázisú és formulája: 1, 9, 12: g, m: –. A szerotípusok többségét a faji elnevezéshez hasonlóan kettős latin névvel is ellátták (pl. Sa. Typhimurium, Sa. Enteritidis), nagyon gyakran a szerotipus előfordulási helye szerint elnevezve (pl. Sa. London, Sa. Szolnok). Biokémiai alapon viszont a szalmonellákat négy alnemzetségre osztották; az I-be tartoznak a típusos, a II.-be az atípusos szalmonellák, a III. alnemzetséget Arizona névvel látták el, ennek atípusos törzseit osztották a IV. alnemzetségbe. Mindez nagy zavart és vitát okozott a klinikusok és a taxonómusok között, annál inkább, mivel a későbbi molekuláris vizsgálatok sem a szerológiai, sem a biokémiai csoporosítással nem egyeztek meg. Mint a DNS-hibridizáció nagyon hasonló mértéke szerint kiderült, valamennyi szalmonella csak egyetlen fajba tartozik.
103
Élelmiszerrel terjedő kórokozók
4.2. ábra - Baktériumok fő antigénjei
A szakértők sokéves vita után csak 2002-ben állapodtak meg, miszerint csak egyetlen fajt ismertek el Sa. enterica néven. Ezt hét csoportba, alfajba osztották és nevekkel látták el (4.5. táblázat). A szerotípusok korábbi neveit csak az I. alfaj törzseinél tartották meg (ide tartozik a szerotípusok 99,5%-a), a többit, nevek nélkül, az antigén formulával jelzik. Annak érdekében, hogy a szerotípusok nevei ne legyenek összetéveszthetők a binomiális faji nevekkel, azokat nagybetűvel kezdve, de nem dőlt betűvel írják; pl. Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium, vagy röviden Salmonella Typhimurium.
4.5. táblázat - A szalmonellák rendszerezése és elnevezése* Faj S. enterica
Alfaj
Szerotípusok száma
Fontosabb példák
(I) enterica
1454
Typhi, Paratyphi A, Enteritidis, Typhimurium, Choleraesuis stb.
(II) salamae
489
Daressalaam
(IIIa) arizonae
94
nincs név
(IIIb) diarizonae
324
nincs név
(IV) houtenae
70
nincs név
(V) bongori
20
nincs név
(VI) indica
12
nincs név
* A Nemzetközi Taxonómiai Bizottság 2002. évi állásfoglalása szerint. Utólag az alfajt S. bongori néven faji rangra emelték A szalmonellák az emberi és állati bélcsatorna lakói. Egyes szerotípusok előfordulása általános (pl. Sa. Typhimurium, Sa. Enteritidis), másoké csak meghatározott gazdaszervezetre korlátozódik. A Sa. Typhi, Sa. Paratyphi csak emberben, a Sa. Gallinarum madarakban, a Sa. Abortiusovis juhokban, a Sa. Typhisuis sertésben él és okoz megbetegedést. A szalmonellák ürülékkel kerülnek a környezetbe (vízbe, talajba, növényzetre), ahol hosszú ideig túlélhetnek, bár nem szaporodnak. 104
Élelmiszerrel terjedő kórokozók A fekáliás szennyeződés a szennyvízkezelés és a higiénia hiányosságai miatt kerül a vízbe és az élelmiszerekbe. A húsok szennyeződése közvetlenül az állatok szalmonellózisától származik, de többnyire a feldolgozás során kenődik a béltartalom a húsfelületekre. Darált húsban, tojásos, majonézes termékekben a szalmonellák szaporodni tudnak, ha a hőmérséklet 4 °C-nál nagyobb. Emberben a szalmonellák kétféle megbetegedést okoznak: a hastífuszt (enterális lázat), valamint a tulajdonképpeni szalmonellózist (gasztroenteritiszt); az előbbi emberről emberre, az utóbbi élelmiszer-fertőzés útján terjed. Bár a betegségek súlyossága változó, a hastífusz kimenetele 10%-os halálozással, a szalmonellózisé csak kevesebb, mint 1%-kal jár, főleg csak legyengült szervezetek esetén. A betegség általában egy hét alatt gyógyul, de a tünetmentes ember vagy állat még hetekig ürít szalmonella baktériumokat. A tífuszos megbetegedéshez szájon át történő fertőzéskor több mint 105 sejt szükséges. A szalmonellák nagyszámú virulenciatényezővel győzik le a szervezet ellenállását, ezek génjei a kromoszómán csoportokban és plazmidokon helyezkednek el. A Sa. Typhit a tok is védi a fagocitáktól, mi több, egyéb virulenciafaktorai segítségével pedig betör a fagocita sejtek vakuólumaiba és azokban osztódik. Az elszaporodott sejtek a nyirokutakon át a vérkeringésbe jutnak és kialakul a bakteriémia. Így fertőződik a lép, a máj, ritkábban a vese, a tüdő, az ízületek is. A betegség lezajlása után az esetek 5%-ában kórokozó-ürítés marad vissza; a tartós ürítőknél („bacilusgazdáknál”) ez egy évig is eltart. A járványveszély miatt fontos, hogy ezeket kizárják az egészségüggyel, élelmiszerekkel kapcsolatos tevékenységből. A szalmonellózis kialakulásához, élelmiszert fogyasztva, szintén nagy dózisú fertőzés (103–105 sejt) vezet. Az epitéliumon át a bél lumenébe kerülve a sejtekből hőlabilis enterotoxin és egy citotoxin válik szabaddá, amelyek a gasztroenteritisz hasmenéses és egyéb tüneteit okozzák. Ezek az étel elfogyasztása után 6–8 órával jelentkezhetnek, de a betegség 5–7 nap alatt lezajlik. A baktériumürítés átmeneti, 1–2 hétig tart. Többnyire állati eredetű élelmiszer lehet fertőzött, főleg a töltelékes hústermékek, továbbá a tojással készült hidegkonyhai készítmények, de gyakorlatilag bármilyen élelmiszer tartalmazhat szalmonellákat, ha az elkészítés, tárolás, felszolgálás higiéniai szabályait áthágják. A tojás héja már a tyúkban fertőződik, azonban a szalmonellák kevésbé tudnak bejutni a tyúktojásba, mert annak héját kutikula védi. Ezzel szemben a kacsatojásba, még a kloákában, a porózus héjon keresztül bejut a Salmonella, ezért azt élelmiszer készítésére nem szabad használni. Ennek ellenére, hazai statisztikák szerint, a szalmonellózisos esetek mintegy 50%-át, tojásos ételek okozzák. A baromfi, sertéshús, húskészítmény 3–8%ban szerepel. Az évenkénti esetszám 10–15 ezer körül mozog, a megbetegedésekben vezető két szerotípus a Sa. Enteritidis és a Sa. Typhimurium. Az évtizedekkel ezelőtt még járványos méretű hastífusz ma évente csak néhány esetre korlátozódik. A Sa. Typhi ellen hatékony vakcina létezik, a védekezésnek ezt a módját a gasztroenteritiszt okozó, jórészt az állatállományt fertőző változatos szerotípusok miatt nem lehet sikerrel alkalmazni. A megelőző védekezés lehetőségei az állattartás körülményeiben, a tápok, takarmányok tisztaságában, az élelmiszer-feldolgozás higiéniájában rejlenek.
Escherichia coli Rendszertanilag az Escherichia coli az Enterobacteriaceae család tipikus képviselője (4.2.4.). Bár DNS-homológia szerint az E. coli és a négy Shigella faj egyetlen fajnak felel meg, külön státuszukat fenntartják a biokémiai és az epidemiológiai különbségek miatt. Az E. colit Theodor von Escherich izolálta székletből, 1885-ben, mint Bacterium coli communét. A baktériumot sokáig a vastagbél jellegzetes kommenzális tagjának tekintették, és első patogén törzseit 1935-ben írták le. A kólibaktérium az ember, a melegvérű állatok és a kétéltűek bélcsatornájának normál lakója. Az emberi székletben 109 sejt/g számban található, így a fekáliás szennyeződés fő indikátora. A víz és élelmiszerek vizsgálatában fontos megkülönböztetni az egyéb, rokon, ún. kóliform bélbaktériumoktól, és erre sokféle módszert dolgoztak ki. Kimutatása különféle differenciáló táptalajokon és a laktóz erjesztés alapján történik, elkülönítése pedig az IMViC próbákkal (indol-, metilvörös-, Voges-Proskauer- és citrátreakciók; az első kettő pozitív az E. coli esetén). A laktózt késve vagy gázképzés nélkül 105
Élelmiszerrel terjedő kórokozók erjesztő, nem mozgó törzsek könnyen összetéveszthetők a shigellákkal. Az E. coli izolátumokat szerológiailag három fő felületi antigén, az O(szomatikus)-antigén, H(flagelláris)- és K(kapszuláris)-antigének alapján különítik el. A shigella szerotipusok O-antigénjei csaknem azonosak az E. coliéval, szintén igazolva a közeli rokonságot. Az E. coli törzsek nagy része ártalmatlan, de néhány törzs patogén és hasmenéses megbetegedést okoz. Ezeket a törzseket speciális csoportokba sorolják virulencia tulajdonságaik, patogenitásuk mechanizmusa, az okozott klinikai tünetek és O:H szerocsoportjaik alapján. Az enteropatogén E. coli (EPEC) törzsek csak fiatal csecsemők nagy vízveszteséggel járó hasmenését okozzák. A fejlett országokban az 1960-as évek óta nem jelentős. Az enteroinvazív E. coli (EIEC) fenotípusa hasonló a shigellákéhoz, és a vizes, majd véres hasmenés is dizentériaszerű. A baktériumok a vastagbelet támadják meg. Az enterotoxigén E. coli (ETEC) törzsekben kétféle enterotoxin van, egy hőlabilis (LT) toxin, ami a koleratoxinhoz hasonló, valamint egy hőstabil (ST) toxin, amik a vékonybél hámsejtekhez kötődve okoznak vizes hasmenést. Az enterohemorrágiás E. coli (EHEC) törzsek vérzéses bélgyulladást (hemorrágiás kolitiszt) okoznak, ami gyakran vesegyulladással, vérzéses húgyúti fertőzéssel komplikálódik. A tünetekért két citotoxin felelős; ezeket verotoxinnak nevezik (VT1 és VT2, mivel hatásukat egy afrikai zöldmajom vese sejtvonalán mutatták ki). A VT1 azonos a Shiga toxinnal, és feltételezik, hogy a toxinképződésért felelős gén a Shigellából került át az E. coliba. A csoport nevezetes képviselője az O157:H7 szerotípus, amit 1982-ben azonosítottak egy hamburger okozta járványból, Kaliforniában. Más, nem kellően hőkezelt hús- és tejtermékekkel, salátákkal világszerte terjed. A legtöbb O157:H7-es törzs az E. colira nem jellemző tulajdonságokkal rendelkezik, így pl. nem fermentálja a szorbitolt, és nem képez β-glükuronidázt (ezért nem bontja a 4-metil-umberrifenil-D-glükuronidot, aminek képessége a normál E. coli kimutatására szolgáló gyorsteszt). Míg az EPEC, ETEC, EIEC és EHEC csoportok kórokozó tulajdonságai általánosan ismertek, néhány további törzs (szerotípus) is jelentkezik hasmenéses megbetegedések okozóiként. Ezek különböző megtapadási képességet mutatnak az epitéliális sejtekhez, és lokálisan tapadó, enteroadhezív E. coli (EAEC), diffúzan tapadó (DAEC), valamint agglutinálódó, enteroaggregativ E. coli (EaggEC) típusokra különíthetők. A fejlődő országokban, Indiától Brazíliáig, főleg az utóbbiak okoznak tartós hasmenést kisgyermekekben. A bélcsatorna megbetegedésein kívül két jellegzetes kórképet okozhatnak még a patogén E. coli törzsek. Újszülöttekben, csecsemőkben súlyos, gyakran halálos agyhártyagyulladás tényezői bizonyos tokos (K-antigént hordozó) törzsek. Felnőttekben viszont az E. coli okozta húgyúti fertőzések száma tízszeresen is nagyobb lehet, mint az enterális megbetegedéseké.
Shigella dysenteriae A Shigella nemzetségben négy fajt különítenek el a szomatikus O-antigének szerinti szerológiai csoportokba: Si. dysenteriae (A csoport), Si. flexneri (B csoport), Si. boydii (C csoport) és Si. sonnei (D csoport). A bélbaktériumok többségétől eltérően nem mozgók. Mint már említettük, molekuláris szempontból a négy szerotípus azonos fajt képvisel, amely még az E. colihoz is nagyon közel áll, különösen annak EIEC típusához. A shigellák a vérhas (dizentéria) kórokozói; az egyes szerotípusok (fajok) előfordulása a különböző régiókban eltérő. A fejlődő országokban járványos méreteket öltő vérhast a Si. dysenteriae okozza, míg nálunk a szórványos esetek 80%-át a Si. sonnei. A megbetegedés a fertőzés után néhány nappal jelentkezik heves, vizes 106
Élelmiszerrel terjedő kórokozók hasmenéssel, amit véres székletürítés és végbélgyulladás követ. Bár jó állapotú szervezet 3–5 nap alatt spontán gyógyul, csecsemőknél és alultáplált felnőtteknél a dizentéria halálos végű lehet. Ezeket a baktériumokat csak az ember és a főmajmok hordozzák, más állatokat nem betegítenek meg. Mivel a külvilágban sokáig nem élnek túl, a fertőzés forrása mindig a beteg ember, ritkán víz vagy élelmiszer. Ez utóbbiak fekáliával vagy tisztátlan kézzel szennyeződnek.
Yersinia enterocolitica A bélbaktériumok családjának Yersinia nemzetségéhez három elsődleges humán patogén faj tartozik. A Ye. pestis, a bubópestis és tüdőgyulladásos pestis (fekete halál) kórokozója, a Ye. pseudotuberculosis, amely – nevével ellentétben – bélgyulladást okoz, főleg a rágcsálófélékben, valamint a Ye. enterocolitica, amely élelmiszer-fertőzést okoz. A továbbiakban ez utóbbiról lesz szó. A Ye. enterocoliticát az 1930-as években írták le először emberi kórokozóként. Jóval később, 1978-ban tisztázták ételfertőzésekhez fűződő szerepét. Ez azért vált jelentőssé, mivel az enterobaktériumok között szokatlan módon pszichrotróf, szaporodik még 4 °C-on és túléli a fagyasztást. Gyakori tejtermékekben, fagylaltokban, és közvetítői a húsok, hústermékek is. Hasmenéses fertőzést leginkább gyermekekben okoz, idősebbekben gyakran vakbélgyulladásszerű tünetekkel. Számos vadés háziállatban tünetmentesen él, vagy bennük gasztroenteritiszt okoz. Az emberi megbetegedést ezek közvetítik. Az állatok olyan fertőző betegségeit, amelyek olykor emberre is átterjedhetnek, zoonózisnak nevezik.
Vibrio cholerae A Vi. cholerae okozta súlyos járványokban milliók pusztultak el a múltban, azonban a fertőzés még ma is gyakori a Távol- és Közel-Keleten, Afrikában, DélAmerika egyes országaiban, ahol a baktérium endemikus. Nemzetségébe rajta kívül több mint 30 faj tartozik, közülük 6–10 okoz emberi megbetegedést, gasztroenteritiszt (pl. Vi. parahaemolyticus), vagy sebfertőzést, vérmérgezést (pl. Vi. vulnificus). A Vi. cholerae-nak csak az ún. O1 szerotípusa felelős a nagyméretű járványokért, a többi, ’nem-O1’ törzs apatogén. A vibriók általában a folyótorkolati tengervizek domináns baktériumai, sok tengeri élelmiszerben megtalálhatók. A fertőzés forrása a fekáliával szennyezett ivóvíz, az ezzel öntözött, mosott élelmiszer. A koleravibrió a legrégebben ismert baktériumok közé tartozik, neve 1854-ből származik, és Robert Koch tenyésztette ki 1882-ben. A kolera az egyik leggyorsabban kifejlődő betegség. A baktérium enterotoxint termel, amely tönkreteszi az iontranszportot a bélhámsejtekben. Az ezt követő víz- és elektrolitveszteség okozza a súlyos, dehidratáló hasmenést. A halálozási arány megfelelő terápia nélkül nagyon nagy, 20–60%, míg folyadék- és elektrolitpótlással 1% alá csökkenthető. Az egyéb vibriók közül csak 1950 után vált ismertté a Vi. parahaemolyticus, mint ételfertőzés okozója. Japánban az ilyen megbetegedések 50–70%-a neki tulajdonítható, más országokban (pl. Hollandiában), ahol sok tengeri halat, rákot, kagylót (főleg osztrigát) fogyasztanak, ritkább.
Campylobacter jejuni A kampilobaktereket eredetileg a vibriók közé sorolták, ma a gamma-proteobaktériumok külön családja. Számos Campylobacter faj az orr- és szájüreg normális lakója, néhány azonban, főként a Cb. jejuni és a Cb. coli, az élelmiszer-fertőzés fő okozójává vált világszerte. Ez azért különös, mivel 1972 előtt ezek a baktériumok, 107
Élelmiszerrel terjedő kórokozók mint a Cb. fetus, csak a háziállatok (juh, szarvasmarha) vetélésének és enteritiszének kórokozóiként voltak ismertek. A magyarázat abban rejlik, hogy csak ezt követően fejlődtek ki azok a módszerek, amelyekkel a kampilobakterek élelmiszerből, székletből kitenyészthetők. Ezek a baktériumok ugyanis mikroaerofil és termofil jellegűek; szaporodásukhoz 3–5% oxigént és 2–10% szén-dioxidot, valamint 42 °C-ot igényelnek. A Cb. jejuni jelen lehet az állati vagy emberi szervezetben anélkül, hogy megbetegedést váltana ki. A baktérium az ürülékkel kerül a környezetbe. Az állatról emberre történő átvitelben legnagyobb szerepe az állatgondozóknak vagy állati eredetű termékkel foglalkozó dolgozóknak van. A fertőzést sok esetben a nem megfelelően hőkezelt baromfi és egyéb húsok, valamint nyers tej fogyasztása okozza. Statisztikai adatok szerint a fertőzés legfőbb forrása a nyers baromfi; a csirkehús 20– 100%-a szennyezett Cb. jejunival. A Cb. jejuni infekciós dózisa kicsiny, már 10–100 sejt megbetegedést okozhat. A jellemző tünetek hasmenés (lehet véres is), láz, hasüregi görcsök. A betegség 5– 8 nap alatt lezajlik, gyulladásos szövődmények előfordulnak.
Staphylococcus aureus A Staphylococcus nemzetség és közelebbről a Sta. aureus főbb jellemvonásait a 3.2.4.1. pontban ismertettük. Mint kórokozó, gennykeltő baktériumot, a S. aureust már 1883-ban leírták; nevét alakjáról, a szőlőfürtszerűen csoportosuló kokkuszokról kapta, megkülönböztetésül a láncokat képező Streptococcusoktól. A Sta. aureus általánosan elterjedt a környezetben, megtalálható a talajban, vízben, levegőben, porban. Legtöbb háziállatunk is hordozója. Az egészséges embereknek legalább 50%-án megtalálható; előfordul a bőrfelszínen, az orrüreg nyálkahártyáján, többnyire mint ártalmatlan szaprobionta. A baktérium azonban opportunista patogén. Igen ellenálló tulajdonságain kívül (széles szaporodási hőmérséklet és a kis vízaktivitás-tűrés), számos virulenciafaktorral rendelkezik, köztük fehérje-, lipid-, szénhidrát-, nukleinsav-bontó enzimek, sejtoldó hatású toxinok, fagocitákat pusztító tényezők vannak. A patogén törzsekre jellemző a vérplazmát alvasztó koaguláz és a hőálló nukleáz enzim. A szervezet védekező rendszerét áttörve, elsősorban a bőrön okoz gennyesedéseket, szőrtüszőgyulladást, furunkulust, a torokban mandulagyulladást, a különböző belső szervekben egyéb gyulladásokat, általános vérmérgezést, szepszist. A gyógykezelést nehezíti, hogy a törzsek nagy részében széleskörű antibiotikum-rezisztencia alakult ki. Élelmiszer-biztonsági tekintetben kiemelkedő fontosságú a Sta. aureus hőálló enterotoxinja, amelyet az élelmiszerben nagy számban (> 105/g) elszaporodva termel. Az ilyen élelmiszer elfogyasztása néhány órán belül heveny tüneteket, hányást, hasmenést okoz. Az enterotoxinnak hét típusa van, a leggyakoribb toxikózist az A és D típusok okozzák. A baktérium sokféle élelmiszerben képes elszaporodni, kis vízaktivitású termékekben is. A szaporodás minimális aw-értéke 0,83, az enterotoxin képzésé 0,86. Az enterotoxin különleges polipeptid, ami nemcsak ellenáll a bél proteázainak, hanem hőtűrő is, csak hosszas főzés inaktiválja (D100 = 1–3 óra, D120 = 10–40 perc). Kimutatható számtalan élelmiszerből (pl. tojás, szendvicsek, tej, sajt, jégkrém, krémek, habok, nyers hús, baromfi, főtt tésztafélék), de előfordult megbetegedés gombakonzerv fogyasztásától is. Az élelmiszer szennyeződését főként az emberi kéz okozza, ezért a személyi higiénia különösen jelentős tényező a megelőzésben. A fogyasztók védelme érdekében fontos továbbá, hogy a termékeket 7 °C alatt tárolják, hogy megelőzzék a sztafilokokkuszok szaporodását és enterotoxin képzését.
Listeria monocytogenes 1926 óta ismert, a tejsavbaktériumokkal rokon, Gram-pozitív baktérium (nevét az angol orvos, Joseph Lister tiszteletére kapta, akinek a fertőzéseket megelőző antiszepszises gyakorlat felismerését tulajdonítják, a magyar Semmelweis Ignáccal szemben). A ma ismert hét Listeria faj közül csak a Li. monocytogenesnek van 108
Élelmiszerrel terjedő kórokozók élelmiszer-egészségügyi jelentősége. A fajnév arra utal, hogy fertőzéskor a vérben felszaporodnak a monociták (a fehérvérsejtek egy típusa). Bár a liszteriózis enterális úton kapott fertőzés, tünetei a bélcsatornán kívül jelentkeznek. A bélhámsejteken áttörve a fagocitákban is elszaporodik, a vérrel általános szepszist, agyhártyagyulladást, a magzatot a méhben fertőzve elvetélést okoz. A liszteriózis súlyosságát jelzi, hogy a halálozási arány átlagosan 25–30%, a megbetegedés azonban nem túl gyakori. A Li. monocytogenes a természetben általánosan elterjedt baktérium, meglehetősen ellenálló, 3-4 °C-on is szaporodik, élelmiszerekben a fagyasztást, szárítást túléli. Az első élelmiszer-eredetű liszteriózist csak 1981-ben igazolták. A baktérium mindenféle élelmiszerrel, mosatlan zöldségfélékkel, szennyezett tejjel, tejtermékkel, hússal juthat a szervezetbe. Mivel a lappangási idő több hét is lehet, a betegséget okozó élelmiszer gyakran már nem lelhető fel a tünetek megjelenésekor.
Bacillus cereus A B. cereus közönséges talajlakó baktérium, spórái élelmiszerekben és adalékanyagokban kis számban gyakran megtalálhatók. Előfordul cereáliákban, szárítmányokban, fűszerekben, tejtermékekben (a pasztőrözést túléli), keményítőtartalmú termékekben (pl. rizs). Mint élelmiszer-mérgező tényező, az 1950-es évek óta érdemel figyelmet. Feltételesen kórokozó, az infektív dózis 105 sejt vagy spóra/g. Kétféle megbetegedést okoz: hányásos vagy hasmenéses típusú tünetekkel; az előbbi a Sta. aureus, az utóbbi a Cl. perfringens okozta ételmérgezéshez hasonló. A hányásos típus esetén a megbetegedést a B. cereus által termelt, az élelmiszerben található hánytató hatású toxin váltja ki. A betegség lappangási ideje 1–5 óra. Ez az ételmérgezés leggyakrabban rizses ételek fogyasztását követően jelentkezik. A hasmenéses megbetegedés lappangási ideje 10–16 óra, tünetei láz, hányás nélküli hasgörcs, híg széklet; legtöbbször húsételek, tésztafélék és mártások okozzák.
Clostridium botulinum A botulizmus vagy kolbászmérgezés az ételmérgezés klasszikus esete volt mindaddig, amíg a sterilezés méretezését a Cl. botulinum spóráinak hőtűrésére nem alapozták. Miután ezt az 1920 évek derekát követően bevezették (12D elv, 5.1.3.), a konzervekben túlélő spórák okozta mérgezés gyakorlatilag megszűnt, és ma csak a házilag készített, nem kellően átfőtt élelmiszerekkel (házi disznóvágás termékei, füstölt, pácolt sonka, zöldség- és gombakészítmények stb.) fordul elő. A mikroba és spórái széles körben előfordulnak a természetben, ahol anaerob körülmények közt szaporodhatnak (pl. talajban, iszapban, halak és emlősök béltraktusában). A spórák hőre ellenállók (D121 °C = 0,1–0,2 perc), a toxin azonban nem, 80 °C-on néhány perc alatt inaktiválódik. A toxinok szerológiai jellege szerint a baktériumot több típusra osztják, emberi megbetegedést leggyakrabban az A, B és F típus okoz; az E típus hidegtűrő, halakban, kagylókban él, és ezek fogyasztása okozhat megbetegedést. A botulizmus ételmérgezés, a toxin azonban idegméreg, a perifériás idegvégződésekhez kötődik. A megbetegedés tünetei látási zavarokban, beszéd és nyelési nehézségekben, koordinálatlan mozgásban jelentkeznek, végső esetben a légzés teljes bénulása halált okoz. Ételmérgezéses tünetek (hányás, hasmenés) is előfordulnak. A botulizmus klasszikus, élelmiszer okozta formáján kívül ritkán sebfertőzést, a csecsemőkben pedig toxikoinfekciót okoz. Csecsemő botulizmus esetén a kórokozó a béltraktusban fel tud szaporodni és ott toxint termelni.
109
Élelmiszerrel terjedő kórokozók
Clostridium perfringens Ez a spórás baktérium kitűnik nagyszámú invazív faktorával és exotoxinjaival, amelyek révén sebek és sebészeti beavatkozások sérülési helyeit fertőzve szövetelhalásokat, nagyfokú vizenyőt és gázképződést (gázgangrénát) okoz. Ismertek olyan kórfolyamatai is, amelyek bélelhalással járnak, illetve az anyaméh fertőzését okozzák. A természetben, a vad- és háziállatokban általánosan elterjedt baktérium gyakran rákerül az élelmiszerekre, és általuk megbetegedést okoz. A betegség valójában toxikoinfekció, mivel a tüneteket egyrészt az élelmiszerben nagy számban (> 106/g) elszaporodott baktériumok exotoxinja (egy enterotoxin) váltja ki, másrészt a mikroba a vékonybélbe jutva spórázik és eközben is toxint termel. A betegség átlagosan félnapos lappangási idő után viszonylag enyhe és gyors lefolyású, hasmenéssel, olykor hányással, lázzal is jár; de 1–2 nap alatt elmúlik. A Cl. perfringensnek a többféle toxin előfordulása szerint öt típusát különböztetik meg. Az emberi megbetegedéseket, köztük az ételmérgezést is, az A típus okozza. Bár többnyire húsok, húsos ételek közvetítik, nincs kitüntetett terméktípus; bármilyen élelmiszer, amelyben a spórák túlélhetnek, és nem megfelelő tárolás alatt kifejlődhetnek, okozhat megbetegedést.
Mikotoxinogén penészgombák Régóta ismert, hogy bizonyos „kalaposgombák” fogyasztása veszélyes lehet, de a penészes élelmiszereket sokáig csak esztétikailag kifogásolták, nem tekintették élelmiszer-biztonsági veszélynek. A mai ismeretek alapján visszatekintve, a mikroszkopikus gombák okozta mérgezések története a középkorig vezethető vissza, hiszen az anyarozs (Claviceps purpurea) alkaloidjai, köztük a mai kábítószerek anyagát is képező lizergsav-származékok okozta bódulat és öntudatvesztés már akkor ismert jelenség volt (4.6. táblázat). A szívbetegséget okozó beriberiről, a fehérvérsejtek pusztulását okozó táplálékmérgezésről (alimentáriás toxikus aleukia), a balkáni országokban elterjedt vesebetegségről utólag derült ki, hogy gombamérgeknek tulajdoníthatók. Az A. flavus fajt már az 1800-as évek elején leírták, de toxikussága csak 1960-ban vált ismertté, a híres angliai pulykavész kapcsán, amelyben százezernyi szárnyas pusztult el az etetésükre használt penészes földimogyoróliszttől. Ez indította el a mikotoxinok kutatását, ami egyre több penészgombáról és az általuk képzett mind több termékekről mutatta ki veszélyes, mérgező voltukat; újabbakat még napjainkban is találnak.
4.6. táblázat - Történeti visszatekintés a mikotoxinokról Év
Toxikózis
Toxin
Gomba
1000 előtt
„szent Antal tűze”
lizergsav
Claviceps purpurea
1240
lovak elhullása (Batu kán)
satratoxin
Stachybotrys chartarum
1890
kardiális beri-beri
citreoviridin
Penicillium citreonigrum
1913, 1940
alimentáriás toxikus aleukia
trichotecének
Fusarium sporotrichoides
1952
balkáni endemikus nefropátia ochratoxin
Penicillium verrucosum 110
Élelmiszerrel terjedő kórokozók 1960
pulyka X betegség
aflatoxin
Aspergillus flavus
1989
agyvelő elfolyósodás
fumonizin
Fusarium moniliforme
Mikroszkopikus penészgombák a természetben nagy számban fordulnak elő. Közülük már több mint 350 fajról vált ismeretté, hogy mérgező anyagokat, mikotoxinokat képeznek, ezeket nevezzük mikotoxinogéneknek. Az általuk termelt mikotoxinok száma is meghaladja a 300-at. Szerencsére a gyakori gombák és a komoly veszélyt jelentő mikotoxinok száma jóval kevesebb, mintegy tízre korlátozható. A mikotoxinok másodlagos anyagcseretermékek, azaz nincs szerepük a gombák normál anyagcseréjében, azonban szerepet játszanak a gombafajok egymás közti és a baktériumokkal szembeni vetélkedésében. Ezek a másodlagos anyagcseretermékek általában sejtmérgek (citotoxikumok), amelyek az egyes sejtalkotókra (pl. membránokra) vagy sejtfunkciókra (pl. fehérje- vagy nukleinsav-szintézis) hatnak. Ezek a hatások természetesen a növényi és állati sejtekre, így az emberre is toxikusak. A mikotoxinok rendkívül változatos kémiai szerkezetű vegyületek (néhány példát a 4.3. ábra mutat be); ennek megfelelően az általuk kiváltott tünetek és megbetegedések is sokfélék. Az ember egészségére ható leggyakoribb tényezők között a rákkeltő, a fejlődési rendellenességet okozó, a szaporodóképességet csökkentő, az ellenálló képességet korlátozó (immunszuppresszív) és az idegrendszert károsító hatások említhetők (4.7. táblázat). Ezek a megbetegedések általában krónikus jellegűek, amelyek a mikotoxin huzamosabb fogyasztásának következményei, bár bizonyos esetekben akut tünetek, hányás, hasmenés, remegés, bőrkiütések is jelentkeznek. Az ember a mikotoxinokkal többnyire nem közvetlenül, hanem a növényi vagy állati táplálék szennyezettsége révén találkozik; újabban fokozottabb jelentőséget tulajdonítanak a helyiségek levegőjével történő közvetlen gombás fertőződésnek is. A mikotoxinok különös veszélyessége annak tulajdonítható, hogy rendkívül hatékony mérgek, igen kis koncentrációban hatnak és a kis dózisok hatása kumulálódik. A mikotoxinok azonban emberről emberre nem terjednek, a mikotoxikózis nem járványos, viszont antibiotikumokkal, gyógyszerekkel alig kezelhető, a védekezés legjobb módja a megelőzés. Ehhez a mikotoxinok kimutatására alkalmas érzékeny műszeres analitikai módszerek kidolgozására volt szükség, mivel a mikotoxinok általában kis mennyiségben fordulnak elő az élelmiszerekben.
111
Élelmiszerrel terjedő kórokozók
4.3. ábra - Néhány jelentős mikotoxin kémiai szerkezete
4.7. táblázat - A mikotoxinok okozta megbetegedések áttekintése Szervrendszer
Tünetek
Mikotoxin
Keringési rendszer
érfal törékenység, vérzések
aflatoxin, satratoxin, roridin
Emésztőrendszer
hasmenés, hányás, májelhalás
T-2 toxin, vomitoxin, aflatoxin
Légzőrendszer
tüdővizenyő, vérzés
trichotecének
Idegrendszer
remegés, mozgáskoordináció
trichotecének
Bőrrendszer
kiütés, hámlás, viszketés
trichotecének
Kiválasztórendszer
vesegyulladás
ochratoxin, citrinin
Szaporítórendszer
terméketlenség, cikluszavarok
zearalenon, T-2 toxin 112
Élelmiszerrel terjedő kórokozók Immunrendszer
szupresszió, rákos következmények
sok mikotoxin
A megelőzés már a növénytermesztésben, az állattenyésztésben kezdődik. A penészgombák, illetve az általuk termelt mikotoxinok részben már a termőterületen (szántóföldi penészek), részben pedig a tárolás során (raktári penészek) fertőzhetik a takarmánynövényeket, a takarmány-alapanyagokat, tápokat, illetve az alomanyagként alkalmazott szalmát. Az így keletkezett mikotoxinok a növényi eredetű élelmiszerekkel (gabonamagvak), élvezeti cikkekkel (kávé, sör) közvetlenül, az állati eredetű termékek révén (vese, máj, tej, tojás) pedig közvetve kerülhetnek az ember szervezetébe (4.8. táblázat).
4.8. táblázat - Fontosabb mikotoxintermelő gombák és előfordulásuk Mikotoxintermelő gomba
Termelt főbb mikotoxin
Előfordulás
Aspergillus flavus
Aflatoxinok, ciklopiazonsav
Gabonafélék, kukorica, olajos magvak, gyümölcsök
Aspergillus parasiticus
Aflatoxinok
Gabonafélék, kukorica, olajos magvak, gyümölcsök
Aspergillus ochraceus
Ochratoxin, penicillinsav Szárított élelmiszereken, kávébab, kakaóbab, szárított gyümölcsökön, sózott halakon
Aspergillus versicolor
Szterigmatocisztin
Tárolt gabonafélék, gabona, dió- félék, fűszerek, szárított hústermékek
Penicillium expansum
Patulin
Gyümölcs, gyümölcslé
Penicillium verrucosum
Ochratoxin
Gabonafélék
Penicillium citrinum
Citrinin
Gabonafélék, élelmiszerek
Fusarium graminearum
Deoxinivalenol, zearalenon
Gabonafélék, kukorica
Fusarium poae
Diacetoxyszkirpenol
Gabonafélék, kukorica
Fusarium sporotrichioides
T-2 toxin, HT-2 toxin
Gabonafélék, kukorica
Fusarium moniliforme
Fumonizinek
Kukorica, rizs
113
Élelmiszerrel terjedő kórokozók Sok mikotoxinogén gomba ubikviter, a környezetben mindenütt előfordul. Az élelmiszerek természetes mikrobiotájának és romlást okozó gombapopulációjának leggyakoribb nemzetségei az Aspergillus, a Penicillium és a Fusarium. Mindhárom név az anamorf alakokra vonatkozik; ivartalan szaporító képleteik a konídiumok. Rendszertani helyüket és jelentőségüket a 3.3. és 3.4. pontokban tárgyaltuk. Ugyanez a három nemzetség a mikotoxinok legfőbb termelője; közülük élen járnak a Fusarium fajok, amelyek a különféle mikotoxinok mintegy harmadát képezik. A következőkben e nemzetségek legfontosabb mikotoxinképző fajait tekintjük át. A 4.9. táblázat a mikotoxinok szerint nyújt áttekintést a termelő törzsekről; többségüket több különböző faj anyagcseretermékei közt megtaláljuk.
4.9. táblázat - A fontosabb mikotoxinok és gyakoribb termelőik Mikotoxin
Penészgomba fajok
Aflatoxin
A. flavus, A. parasiticus
Alternariol
Alternaria alternata
Citrinin
A. terreus, P. citrinum, P. verrucosum, P. hirsutum
Citreoviridin
A. terreus, P. citreoviride
Ciklopiezonsav
A. versicolor
Deoxinivanelol (DON)
F. moniliforme, F. culmorum, F. avenaceum, F. nivale, F. roseum
Diacetoxiscirpenol
F. moniliforme, F. equiseti
Fumonizin
F. moniliforme, F. culmorum, F. avenaceum, F. nivale
HT-2 toxin
F. moniliforme, F. culmorum, F. avenaceum, F. nivale
Nivalenol
F. moniliforme, F. oxisporum, F. culmorum, F. avenaceum, F. nivale
Ochratoxin
A. ochraceus, P. viridicatum
Patulin
A. clavatus, P. expansum, P. roqueforti, P. griseofulvum
Penicillinsav
A. ochraceus
Penitrem
P. crustosum
Roridin
Myrothecium roridum, Stachybotrys spp, Cylindrocarpon spp.
Satratoxin
Stachybotrys chartarum, Trichoderma viride
Sterigmatocisztin
A. flavus, A. nidulans, A. versicolor, P. rugulosum
T-2 toxin
F. moniliforme, F. culmorum, F. avenaceum, F. nivale, F. roseum
114
Élelmiszerrel terjedő kórokozók Trichodermin
Trichoderma viride
Trichotecin
Trichothecium roseum
Verruculogen
A. fumigatus, Stachybotrys chartarum
Zearalenon (F-2)
F. graminearum, F. moniliforme, F. culmorum, F. avenaceum, F. nivale
Mikotoxinogén Aspergillus fajok Az Aspergillus fajok nagyon gyakoriak a környezetben, a talajban és a növényzeten, elsősorban, mint szaprobionták és mint másodlagos növényi kórokozók. A legtöbb Aspergillus élelmiszereinkben romlást okozóként van jelen. Számos fajuk xerofil. Általában tárolt termékeken fordulnak elő, pl. gabonaféléken, magvakon, fűszereken. Sok olyan teleomorf (aszkospórás) nemzetség van, amelynek Aspergillus konídiumos (anamorf) formája ismert; ezek közül élelmiszerekben jelentős az Eurotium nemzetség, amelynek tagjai xerofilek (korábban A. glaucus csoportként említették őket) és a Neosartorya fajok, amelyek hőrezisztens aszkospórákat képeznek, és főként hőkezelt gyümölcstermékek romlását okozzák. Mintegy 50 mikotoxinképző Aspergillus faj ismert, de a legfontosabb élelmiszerekben és takarmányokban található Aspergillus toxinok az aflatoxinok (termelői az A. flavus, A. parasiticus és A. nomius), az ochratoxin A (A. ochraceus termeli), szterigmatocisztin (elsősorban A. versicolor termeli) és a ciklopiazonsav (A. flavus termeli). Aspergillus fajok szintén termelnek citrinint, patulint és penicillinsavat. Ezeket a Penicilliumok által termelt mikotoxinoknál ismertetjük. Az Aspergillus fajok termelte mikotoxinok toxicitása széleskörű, az aflatoxin B1 talán az egyik leghatásosabb májrák-keltő anyag. Az aflatoxin egyike a legveszélyesebb mikotoxinoknak. Élelmiszerben megengedhető koncentrációja mindössze 20 μg/kg, tejben csak 0,5 μg/kg; takarmányban 100 μg/kg. Az ochratoxin A és a citrinin a veseműködést károsítja. A mikotoxint termelő aszpergilluszok közül legjelentősebbek az aflatoxint képző fajok. Az A. flavus aflatoxin B1, B2, valamint ciklopiazonsav termelésére képes. Az A. parasiticus és A. nomius aflatoxin B1, B2, G1, G2-t termel, de nem képez ciklopiazonsavat. Az A. flavus és A. parasiticus közeli rokonságban áll az A. oryzae és az A. sojae-val, amelyeket fermentált élelmiszerek előállítására használnak és nem termelnek mikotoxinokat. A további fontosabb mikotoxin termelők az A. ochraceus (ochratoxint és penicillinsavat termel), és az A. versiclor (szterigmatocisztint termel). Az A. flavus széles körben elterjedt a természetben, kedvelt élőhelyei az olajos magvak. Leggyakrabban a mogyorót, a kukoricát és a gyapotmagot támadja meg. A gabonaféléken, valamint fűszereken is gyakran megtelepszik, de bennük általában nem jelentős az aflatoxinszint. A toxinképződés ezeken a terményeken szinte mindig a rossz szárítási, kezelési vagy tárolási körülmények következménye. Az A. flavus telepei jellegzetes sárgászöld színűek. Xerofil gomba lévén kis vízaktivitásértékeknél is szaporodni képes, 0,8 körüli minimummal. Széles pH-tartományban (2,1–11,2) szaporodik. Az aflatoxinképződés optimális hőmérséklete 15–37 °C. A ciklopiazonsav szintén erősen toxikus anyag, idegrendszeri zavarokat okoz. Az A. flavuson kívül fő termelője a P. commune. Az A. parasiticus kevésbé gyakori, mint az A. flavus. Jellemzően megtalálható dióféléken és olajos magvakon. Tulajdonságait tekintve nagyon hasonlít az A. flavus-ra. Az A. ochraceus az ochratoxin fő termelője, emellett penicillinsavat is termel. Xerofil gomba, igen kis vízaktivitásnál is szaporodik, a minimális érték 0,79. Természetes élőhelye a száradó és romló növényzet, gyakran előfordul szárított élelmiszereken, különféle babokon (pl. kávébab, kakaóbab), szárított gyümölcsökön, sózott halakon. Gabonákról is izolálható, de ritkábban. Világosbarna-sárgásbarna telepeket képez. Háromféle ochratoxin ismert, az ochratoxin A és a kevésbé toxikus 115
Élelmiszerrel terjedő kórokozók ochratoxin B és C. Ochratoxin A (OTA)-szennyezettség szempontjából leginkább a skandináv és a balti államok érintettek, ahol a toxin forrása nem az A. ochraceus, hanem a P. verrucosum. Az A. ochraceus által termelt ochratoxin A leginkább melegebb éghajlati körülmények között jellemző. Az A. versicolor xerofil gomba, 0,74–0,78-as vízaktivitási minimummal. Nagyon gyakori élelmiszerekben, különösen tárolt gabonaféléken, gabonatermékeken, dióféléken, fűszereken és szárított hústermékeken. Fermentált és füstölt húsfélékről, valamint sajtokról szintén izolálták. Pirosas, narancssárga vagy pirosasbarna színű telepeket képez. Az A. versicolor a szterigmatocisztin fő termelője, de ezt más Aspergillus fajok is termelik, pl. az A. nidulans és az Emericella fajok. A szterigmatocisztin az aflatoxin prekurzora. Legfontosabb biológiai hatása a májkárosítás és a tumorképzés.
Mikotoxinogén Penicillium fajok A Penicillium nemzetség mintegy 150 fajt tartalmaz, amelyek közül kb. 50 gyakran előfordul környezetünkben. A penicillin felfedezése indította el a kutatást a penészgombák anyagcseretermékeinek izolálására, azonosítására. Így fedezték fel a „toxikus antibiotikumokat” (citrinin, patulin, griseofulvin), amiket később mikotoxinoknak neveztek el. A Penicilliumokban számos toxint találtak, a legfontosabbak a citrinin (P. citrinum, P. verrucosum és P. expansum termeli), a patulin (P. expansum termeli), a citreoviridin (P. citreonigrum a fő forrása) és a penitrem A (P. crustosum termeli). A Penicillium fajok általában kisebb hőmérsékleten növekednek, mint az Aspergillusok. Ubikviterek a talajban, a gabonákon és az élelmiszereken. Hűtött raktárakban, valamint fagyasztott élelmiszereken is világszerte előfordulnak. Néhány fajuk xerofil, de általában kevésbé gyakoriak a kis vízaktivitású termékeken, mint az Aspergillusok. A P. verrucosum xerofil penészgomba, minimális vízaktivitás-igénye 0,8. Legjobban viszonylag kis hőmérsékleten, 0 °C-hoz közel növekszik, 31 °C-os maximummal. A maximális ochratoxintermelés 20 °C körül fordul elő, 0,85-ös vízaktivitás minimumig. Elsősorban a mérsékelt égövben termesztett gabonákban található (árpa, búza), de hústermékekből is izolálták. A P. citrinum faj is ubikviter penészgomba, szinte mindenféle élelmiszerből izolálták már. Leggyakoribb forrásai a gabonafélék, a rizs, a búza, a kukorica és a belőlük őrölt lisztek. 5 és 40 °C között szaporodik 30 °C körüli optimummal. Xerofil penészgomba, 0,82 minimális aw-értékkel. A citrinin fő forrása, amelyet eredetileg antibiotikumként azonosítottak. Elsősorban vesekárosító (nefrotoxikus) hatása jelentős. A P. citrinum csak citrinint képez, amely több más penészgomba terméke is (pl. P. expansum, P. verrucosum, A. niveus, A. terreus). A citrinint termelő gombák főként gabonaféléken és húsipari termékeken fordulnak elő. A P. expansum széles spektrumú növénypatogén gomba, fő forrása a rothadó alma, körte. Kevésbé gyakori gabonaféléken vagy gabonatermékeken. Pszichrotróf penészgomba, –2 és 35 °C között szaporodik, 25 °C körüli optimum hőmérséklettel. Minimális vízaktivitás-igénye 0,82. A patulin fő termelője; emberi fogyasztásra szánt termékben e mikotoxin maximális koncentrációja 50 mg/kg lehet. Elsősorban az emésztőszerveket károsítja, de károsan befolyásolja az immunrendszer működését is. Biológiai hatásai közé tartozik az erek permeábilitásának növelése, haemorrágia kialakítása (fekélyt, vérzést előidéző hatás). A P. citreonigrum által termelt mikotoxin a citreoviridin, főleg rizsen és más gabonafélén képződik. A P. citreonigrum 5 és 38 °C között szaporodó xerofil penészgomba. A citreoviridin neurotoxin: görcsöket, növekvő paralízist és légzésbénulást okoz. A P. commune világszerte gyakori okozója a sajtok romlásának. 0 és 37 °C között szaporodik, 30 °C körüli optimummal, 0,85 aw minimum értékkel. A P. commune a ciklopiazonsav egyik jelentős termelője. A P. commune a P. camemberti vad őse. Laboratóriumi körülmények közt a P. camemberti izolátumok is termelnek ciklopiazonsavat, azonban a sajtgyártás folyamán nem. 116
Élelmiszerrel terjedő kórokozók P. crustosum a cereáliák nagy részében megtalálható. Izolálták feldolgozott húsokból, diókból, sajtokból is; gyümölcslevek romlását okozza. Gyenge patogén almafélékre. Csak nagyobb vízaktivitási értékeknél termel penitrem A-t, amely penészes sajtokkal okozott toxikózist. A P. roqueforti mikotoxinjai közt szerepel az ún. PR toxin és a roquefortin. Ez utóbbit a P. crustosum és a P. chrysogenum is termeli. Pszichrotróf penészgomba, jól növekszik hűtési hőmérsékleten. A legkisebb oxigénigényű a Penicilliumok között, kevesebb, mint 0,5% O2-koncentráció és 20% CO2-koncentráció jelenlétében is növekszik. Gyenge szerves sav tartósítószerekkel (szorbinsav, ecetsav) szemben eléggé toleráns. Gyakori okozója hűtött húsok, sajtok és más termékek romlásának. A sajtgyártás során hasznos, a termék jellegét meghatározó mikrobaként használják. Sajt fogyasztását követő megbetegedésről nem számoltak be, de előfordult mérgezés P. crustosummal szennyezett árpából készült sör fogyasztását követően.
Mikotoxinogén Fusarium fajok A növények kórokozó gombáinak egyik legjelentősebb csoportja a Fusariumok. Számos Fusarium faj növénypatogén, mások szaprobionták. Legtöbbjük megtalálható a talajban. A Fusarium fajok leggyakrabban gabonaféléken és olajos magvakon fordulnak elő. Kukorica, búza és az ezekből készített termékek gyakran fertőzöttek. Fusarium fajok termelik az ismert mikotoxinok mintegy harmadát, köztük a zearalenont (F–2 toxint), a különböző trichotecéneket és a fumonizineket. A Fusarium fajok fontosabb toxinjai a trichotecének, mint a T–2 toxin, a HT–2 toxin, a dezoxinivalenol (DON) és diacetoxiscirpenol (DAS), továbbá a fumonizinek (FB1 – FB6). Toxicitás szempontjából, állatkísérletek alapján, a T–2 toxin, HT–2 toxin, DAS, DON sorrend állítható fel. Veszélyességüket jelzi, hogy a trichotecénekből emberi fogyasztásra szánt élelmiszerben legfeljebb 1 mg/kg, a fumonizinekből 2–4 mg/kg engedhető meg, míg takarmányokban a maximális koncentrációk 5–10 mg/kg, illetve 5–60 mg/kg. A F. graminearum világszerte egyike a leggyakoribb növénypatogén penészgombáknak. Különböző növényi betegségeket okoz (pl. a búza és más gabonák fuzáriumos kalászbetegsége). Az általa termelt fő toxinok a dezoxinivalenol és a zearalenon. Ezen túl más mikotoxinokat, pl. diacetoxiscirpenolt, T–2 toxint is termel. A zearalenon ösztrogén (nemi hormon) hatású, állatokban szaporodásbiológiai, valamint ivarzási problémákat okoz. A trichotecének erős hatású sejtmérgek, citosztatikus és fehérjeszintézist gátló hatással rendelkeznek, károsítják az idegrendszert, továbbá immunotoxikus hatásuk is van. A F. poae széles körben elterjedt a mérsékelt égövi talajokban, valamint búzán, kukoricán és árpán. Optimális szaporodási hőmérséklete 22–27 °C. Áttelelt gabonákból is kitenyészthető. A múltban számos trichotecén mikotoxin termelését tulajdonították a F. poae-nak, de bizonyítottan diacetoxiscirpenolt termel. A gombával összefüggő betegségek az alimentáriás toxikus aleukia, a haemorrágiás szindróma és a nyelőcsőrák. A F. sporotrichioides megtalálható talajban és növényi anyagokon, különösen árpán és zabon. Mérsékelt és hidegebb éghajlaton tenyészik; optimális hőmérséklete 25 °C körüli, de egészen kis (2 °C) hőmérsékletig szaporodik. A F. sporotrichioides számos mikotoxint termel (pl. T–2 toxint, HT–2 toxint és nem trichotecén mikotoxinokat is, mint a moniliformin és a fuzarin C). F. sporotrichioidesszel összefüggő betegségek az alimentáriás toxikus aleukia, a haemorrágiás szindróma. A F. equiseti gyakori penészgomba talajban. Különösen trópusi, szubtrópusi éghajlaton, de mérsékelt égövön is előfordul. Zömében szaprobionta, de trópusi gyümölcsökre (pl. banánra, avokádóra) patogén is lehet. A F. poae-hoz hasonlóan kitenyészthető áttelelt gabonából. Feltételezik, hogy az immunrendszer elnyomása révén szerepe lehet a leukémia kialakulásában. Leggyakrabban diacetoxiscirpenolt, néhány törzs T–2 toxint is termel.
117
Élelmiszerrel terjedő kórokozók A F. moniliforme talajban található növénypatogén gomba, a kukoricát világszerte fertőzi. Cirokon és rizsen szintén megtalálható. Egyebek közt izolálták még yamgyökérről, mogyoróról, pekándióról és sajtokról is. 2 és 37 °C között szaporodik, 22–27 °C körüli optimummal, 0,87 aw-érték felett. Fumonizinen kívül több más mikotoxint is termel. Állatokban szívszélhűdést és májzsugort (cirrózist) okoz. A fumonizin által okozott legfőbb emberi megbetegedés a nyelőcsőrák.
Egyéb mikotoxintermelő penészgombák A tárgyalt nemzetségeken kívül számtalan más toxinogén penészgomba nemzetség vagy faj ismert; a jelentősebbeket a 4.9. táblázat felsorolja. Némelyek a három fő nemzetség valamely fajával azonos mikotoxint képeznek, mások sajátos, más jellegűeket. Jelentős toxintermelő az Alternaria nemzetség. Az alternáriák széles körben megtalálhatók a környezetben, a talajban és növényi anyagokon. Mind növénypatogén, mind szaprobionta fajaik vannak. Nevezetes a Stachybotrys nemzetség is; a sztachibotriotoxikózis különösen a lovak megbetegedését okozza. A történelmi múltban ennek volt tulajdonítható Batu kán európai hódításának kudarca, lovai tömeges elhullása miatt.
Vírusok 1972-ben az Egyesült Államok Norwalk városában kitört járványos gyomor-bél megbetegedés okozója egy vírus volt. Azóta az ún. humán enterovírusok köre nagymértékben bővült és több mint tízféle víruseredetű enterális megbetegedést írtak le. Ezek a vírusok különböző típusaiba tartoznak, vannak köztük RNS és DNS vírusok egyaránt (4.10. táblázat). Többségük csak szórványosan és ritkán okoz megbetegedést, viszont a calicivírusok és a hepatitisz A vírus gyakorisága igen nagy. Statisztikák szerint a calicivírusok közé tartozó norovírusok (Norwalk- és Norwalk-szerű vírusok) okozta megbetegedések a nátha után a második leggyakoribb vírusos fertőzések, és az élelmiszerekkel terjedő vírusos gyomor-bél megbetegedések száma kétszeresen meghaladja a baktériumos eredetűekét. Magyarországon az első norovírusos élelmiszer-fertőzést 1998-ban mutatták ki; azóta előfordulásuk aránya az éves összes fertőzéses események közt 0,7-ről 6,0%ra nőtt, a megbetegedések számaránya pedig 30–50%.
4.10. táblázat - Humán enterális vírusok csoportjai Méret (nm) 25–35
Nukleinsav egyszálú
RNS astro-
DNS parvo-
calicipicornakétszálú
reo-
adeno-
rotaA vírusos enterális megbetegedések tünetei egy-két hetes lappangás után heves hányással, hasmenéssel jelentkeznek. Míg a norovírusok támadási helye a bélcsatorna, a hepatitisz A vírus a májat támadja meg. A hepatitisz vírusoknak 5–6 típusa ismert, közülük csak az A típus terjed élelmiszerrel (ritkán az E típus is). A vírusok, mint obligát sejtparaziták, az élelmiszerben nem szaporodnak. Kizárólag a beteg ember székletével kerülhetnek az élelmiszerbe, vízbe, ahonnan szájon át jutnak a tápcsatornába. Bár személyről személyre terjedő közvetlen fertőzés is előfordul, az élelmiszerrel terjedő vírusos megbetegedések legfőbb oka a személyi higiénia 118
Élelmiszerrel terjedő kórokozók súlyos hiánya! Erre utal, hogy azokban az esetekben, amikor a kiváltó tényezőt sikerült azonosítani, gyakran a kézzel készített élelmiszerek (pl. szendvicsek, készételek, saláták) szerepeltek. Mosatlan gyümölcsök (szamóca, málna) a szennyezett öntözővíz révén váltak terjesztővé. (Szintén szennyvíz eredetű a kagylók fertőzöttsége, ami a vírusos enterális betegségek fő oka azokban az országokban, amelyekben ezek fogyasztása számottevő.) Vizekben, élelmiszerekben a vírusok hosszú ideig (3–10 hónapig) életben maradnak, és túlélhetik a tartósító eljárásokat is, mint a fagyasztást vagy az enyhébb hőkezelést (pl. 60 °C-on 30 percet). Erős fertőtlenítőszerek (pl. nátriumhipoklorit) inaktiválják őket. A vírusok kimutatása élelmiszerekből nem könnyű feladat, mivel számuk általában kicsi. Tenyésztésük csak emlőssejtekben lehetséges (pl. majom veseszövet-tenyészetben). Kimutatásukra immunológiai módszerek vannak, újabban, a nukleinsav kinyerése után, molekuláris módszerekkel is diagnosztizálhatók; a leggyakoribb RNS vírusok RT-PCR-rel (10. fejezet). Itt kell megemlíteni a vírusokhoz hasonló jellegű fertőzést okozó prionokat, amelyek azonban nem vírusok, hanem fehérjemolekulák (kis móltömegű peptidek). Az 1980-as években a szarvasmarhák szivacsos agyvelőgyulladása (BSE) az állatok tömeges elhullását, illetve kényszervágását okozta, mivel félő volt, hogy a megbetegedés emberre is átterjed (hasonló tünetek ismertek embernél is). A megbetegedés főleg Angliában vált tömegessé, de átterjedt számos európai országra, majd kimutatták az USA-ban, Kanadában, Japánban is. Angliában több mint 180 ezer megbetegedett szarvasmarha pusztult el, és 150 esetet regisztráltak emberben. A szigorú karantén intézkedések ellenére BSE megbetegedések szórványosan mindmáig előfordulnak.
Paraziták Élelmiszerrel és vízzel számtalan élősködő kerülhet az emberi szervezetbe, amelyek olykor súlyos, járványos betegséget okoznak. Képviselőik az egysejtű protozoonok és a soksejtű férgek közül kerülnek ki. Ez utóbbiakhoz tartoznak a régóta ismert, elsősorban az állatok közvetítésével és a húsok fogyasztásával fertőző paraziták, mint a fonalféreg (Trichinella), az orsóféreg (Ascaris) és a galandféreg (Taenia), amelyek terjedését az állat-egészségügyi ellenőrzés, a személyi higiénia betartása, valamint az élelmiszerek megfelelő elkészítése nagymértékben korlátozza. Jelentős mértékű előfordulásuk a szubtrópusi, trópusi országokra jellemző. A protozoonok közé világszerte elterjedt paraziták tartoznak, és egyre újabbakat ismernek fel. Öt-hat fajuk jelentős kórokozó, amelyek a protozoonok különböző osztályaiba tartoznak (4.11. táblázat).
4.11. táblázat - Fontosabb protozoon paraziták Apicomplexa
Cryptosporidium parvum Cyclospora cayetanensis Toxoplasma gondii Sarcocystis hominis
Ciliophora
Balantidium coli
Sarcomastigophora
Entamoeba histolytica Giardia lamblia
Microsporidia*
Encephalitozoon intestinalis 119
Élelmiszerrel terjedő kórokozók * Újabban nem protozoon, hanem gomba-törzs A protozoonoknak gyakran összetett életciklusuk van, amelyben két vagy több gazdaszervezet szerepel és az életciklus része olyan ciszta vagy kitartóképlet is, ami a gazdaszervezeten kívüli túlélést szolgálja. Terjedésük vízzel (ivóvíz, uszodai víz, természetes vizek) gyakoribb, mint élelmiszerekkel, az utóbbi módon többnyire a megtámadott háziállatok húsa fertőz. Gyakori fő gazdaszervezetek a macska, kutya, sertés és más háziállatok, és az ember csak köztesgazda, viszont több esetben az ember a parazita elsődleges élőhelye. Bár főleg csak a gyomor-bél betegségeket okozó protozoonokat tárgyaljuk, említést érdemel, hogy az emberiség egyik legnagyobb ellensége, a százmilliókat megbetegítő Plasmodium malariae szintén protozoon. Az amőbás dizentéria régóta ismert betegség, amelyet az Entamoeba histolytica okoz. A baktériumos vérhasnál enyhébb lefolyású, de sok esetben tünetmentes vagy hosszantartó, krónikus betegség. Szintén jól ismert és gyakori kórokozó a bélcsatornát támadó flagelláta a Giardia lamblia. Különleges, a legegyszerűbb eukarioták között nyilvántartott szervezet, nincs mitokondriuma, de lehetséges, hogy leegyszerűsődése a parazita életmód következménye. Csecsemők és kisgyermekek közt a fertőzöttség mértéke 35%-os is lehet, az immunhiányos HIV betegek is erősen veszélyeztetettek. A túrizmussal járó ún. utashasmenés gyakori okozója. Hozzá képest kevésbé számottevő emberi parazita a csillós Balantidium coli, amelynek fő gazdaállata a sertés. A fejlett országokban, nálunk is, gyakoriságát tekintve a vezető helyet foglalja el a Toxoplasma gondii. Elsődleges gazdaszervezete a macska, ivartalan életszakaszában sok más állatot és az embert is megbetegíti. Az emberi fertőzöttség eléri a népesség 20–40%-át. Sok szervet megtámad, a klinikai tünetek változatosak. Különösen veszélyes, hogy a megbetegített terhes nők magzata is fertőződik. Az izomszöveti sejtekbe ágyazódva a hússal, a székletszennyeződés révén pedig a vízzel terjed. Hozzá hasonlóan komplex csúcsi sejtszerkezet jellemző más Apicomplexa protozoon parazitákra, a Sarcocystis, Cryptosporidium és Cyclospora fajokra. A Sarcocystis hominis fertőzést az ember a háziállatok húsával kapja meg, a megbetegedés Európában gyakoribb, mint a tengerentúli országokban. Fordított a helyzet viszont a csak újabban felismert parazitával, a Cryptosporidium parvummal. Nevezetessé a városi ivóvízzel okozott tömeges megbetegedések miatt vált (1987-ben Georgiában 36 000, 1993-ban Wisconsinban 400 000 ember betegedett meg és halálozás is előfordult). Szintén vízzel fertőz a Cyclospora cayetanensis, amelynek terjedését világszerte csak 1986 óta követik nyomon. Obligát intracelluláris paraziták a Microsporidium félék, amelyek közel ezer faját korábban a protozoonok közé sorolták. Csak újabban tisztázódott, hogy valójában a gombákhoz tartozó, nagyon leegyszerűsödött szervezetek; nincs mitokondriumuk, peroxiszomájuk, Golgi-készülékük. Kölönleges fonálzat segítségével kilökődő spórákkal szaporodnak. Különösen az AIDS betegek között okoznak számos egyéb tünet mellett krónikus hasmenést.
120
5. fejezet - Tartósítási módszerek mikrobiológiája A tartósító műveletek célja az élelmiszerekben található mikroorganizmusok szaporodásának gátlása vagy elpusztítása, illetve a mikrobás szennyeződés kizárása vagy az újraszennyeződés megakadályozása. Mindezek a beavatkozások az ökológiai tényezők szabályozásán alapulnak. Általában minden, a mikroorganizmusok számára kedvezőtlen beavatkozást mikrobaellenes (antimikrobás) hatásnak nevezünk. Ennek mértéke lehet a szaporodást gátló (sztatikus) vagy a sejteket elpusztító (letális, cid). Minél távolabbi egy környezeti tényező értéke a mikrobák számára optimálistól, annál lassabb a szaporodás; a szélső értékeken túl a mikroorganizmusok még életben maradhatnak, de szaporodni már nem tudnak. Az ilyen hatások a sejtek sérüléseit okozzák, és azok túlélése attól függ, hogy módjuk van-e károsodást helyrehozni. A tényezők még szélsőségesebb értékei már egyértelműen irreverzíbilis változásokat okoznak, pusztító, mikrobicid hatásúak. A gátló és a pusztító hatás között a határvonal olykor nem éles, a mikrobasejtek túlélése vagy pusztulása elsősorban az antimikrobás tényező erősségétől, a behatás idejétől függ, és számos további tényező (a sejtek állapota, külső körülmények) befolyásolja. Mint az előző fejezetekben többször rámutattunk, a tartósításra szolgáló külső és belső ökológiai tényezőkkel, pl. mint a stresszhatásokkal szemben a mikroorganizmusok különböző fajai között, sőt gyakran a fajon belül, törzsek közt is, az érzékenység, illetve az ellenálló képesség széles határok közt változik. Ennek néhány példáját, a korábban említettekre is utalva, az 5.1. táblázat foglalja össze.
5.1. táblázat - Stresszhatásokat tűrő mikroorganizmusok példái Mikroba
Stresszhatás
Élelmiszer
Geobacillus stearothermophilus
nagy hőmérséklet
konzervek
Alicyclobacillus acidoterrestris
kis pH, hőmérséklet
gyümölcslevek
Leuconostoc mesenteroides
nagy cukorkoncentráció
szörpök
Zygosaccharomyces bailii
tartósítószerek
bor, üdítőital
Zygosaccharomyces rouxii
nagy cukorkoncentráció
dzsem, üdítőital
Dekkera anomala
nagy CO2-nyomás
szénsavas italok
Penicillium expansum
kis hőmérséklet
hűtőtárolt gyümölcsök
Penicillium italicum
kis pH
citrom
Eurotium chevalieri
kis vízaktivitás
szárítmányok
A tartósító műveleteket fizikai vagy kémiai jellegük szerint szokás csoportosítani (5.2. táblázat). Fizikai hatások a hőmérséklet növelése vagy csökkentése (hőkezelés, illetve hőelvonás), a vízelvonás (szárítás), a besugárzás, és ide sorolhatók a mikroorganizmusok mechanikai (pl. szűréssel való) eltávolításán vagy kizárásán, távoltartásán alapuló módszerek is (pl. aszeptikus csomagolás). A kémiai tartósítási módszerek egy része a fizikokémiai tényezők (pH, aw, Eh) szabályozásán alapul, más részük olyan, antimikrobás hatású vegyületeket alkalmaz, amelyeket közvetlenül az élelmiszerbe juttatunk (tartósítószerek) vagy azokban alakítunk ki bizonyos mikroorganizmusok tevékenysége révén (erjesztések). Az élelmiszer-feldolgozás higiéniai feltételeit biztosító fertőtlenítőszerek is pusztító hatású kémiai anyagok. A tartósítási módszer fizikai vagy kémiai jellege nem mindig egyértelmű, pl. a vízaktivitás csökkenthető a víz fizikai eltávolításával (szárítás, besűrítés) vagy kémiai lekötésével (cukrozás, sózás). Gyakran többféle tartósító módszert együttesen alkalmazunk, és ezek szándékos és tudatos kombinációján kívül a gyakorlatban 121
Tartósítási módszerek mikrobiológiája valójában semmilyen antimikrobás tényező hatása nem egymagában érvényesül, hanem azt az élelmiszerben vagy az élelmiszerre ható egyéb ökológiai tényezők befolyásolják.
5.2. táblázat - Tartósítási módszerek és azok ökológiai tényezőinek áttekintése Ökológiai tényező
Módszer
belső
külső
mikroba
művelet
Fizikai módszerek Pasztőrözés, sterilezés
aw, pH
hőmérséklet növelés
termofil, spóra
szakaszos, folytonos
Hűtés, fagyasztás
aw
tárolás, felengedtetés
pszichrotróf, pszichrofil
gyors, lassú
Vízelvonás
aw
ERP
xerofil
szárítás, besűrítés cukrozás, sózás
Besugárzás
aw
hőmérséklet
spóra
radicidálás, radappertizálás
Tartósítószerek
pH
hőmérséklet
sejttípus
szaporodásgátlás
Erjesztés
aw, pH, Eh hőmérséklet
Kémiai módszerek tejsavbaktérium, tejsavas, alkoholos élesztőgomba
Hőkezelés A mikroorganizmusok elpusztításának leggyakoribb módja a hőkezelés. Az élelmiszerek tartósítására kétféle hőkezelési eljárást használnak: a pasztőrözést és a sterilezést. A pasztőrözés célja, általában 100 °C-nál kisebb hőmérsékletet alkalmazva, a vegetatív (spórátlan) mikrobasejtek elpusztítása vagy legalább számuk nagyarányú csökkentése (milliomod, 10–6 hányadára vagy nagyobb mértékben). A sterilezés minden mikroorganizmust és a baktérium-endospórákat is elpusztító, 100 °C-nál nagyobb, általában 105–130 °C-on való hőkezelés. Mind a pasztőrözés, mind a sterilezés nedves hővel (vízzel telített gőztérben) történik (száraz anyagok hőkezelésére ritkán kerül sor), következéskép a 100 °C-nál nagyobb hőmérsékletek csak nyomás alatt állíthatók elő, alkalmas sterilezőberendezésekben (autoklávokban). A pasztőrözés és a sterilezés technológiai kivitelezésének több változata lehetséges. A hőkezelési eljárásokat a mikroorganizmusok hőpusztulásának ismeretében alakítják ki. Ennek alapjait a 2.2. fejezetben áttekintettük. Mint láttuk, a hőpusztulás jó megközelítéssel elsőrendű kinetikai folyamatként írható le, amelynek sebessége a hőmérséklet növelésével nő, de független a sejtszámtól. A pusztulási sebesség és a vele fordítottan arányos tizedelődési idő (D érték) alkalmas a mikroorganizmusok hőrezisztenciájának jellemzésére, a hőrezisztencia hőmérsékletfüggésének kifejezésére pedig a z érték szolgál. 122
Tartósítási módszerek mikrobiológiája
A mikroorganizmusok hőtűrése A mikroorganizmusok hőtűrése elsődlegesen genetikailag meghatározott faji tulajdonság, ami a környezeti körülmények szerint változhat, módosulhat. Nagy általánosságban a mikroorganizmusok hőtűrése arányos szaporodásuk hőmérsékleti jellemzőivel (lásd 1.2.4.1.). A vegetatív baktériumok közül a pszichrofilok már 40 °C körül pusztulni kezdenek (5.3. táblázat). A mezofilok hőtűrését 55–60 °C-on 1 perc körüli D érték jellemzi, z értékük általában kisebb, mint 5 oC. A vegetatív baktériumok közül kiemelkedő hőtűrésűek az ún. termoduráns fajok (pl. Enterococcus, Microbacterium). Ezek túlélhetnek 60 °C-on 30 perces hőkezelést is, z értékük pedig különlegesen nagy, 15–20 oC. Az élelmiszerekben előforduló spórátlan patogén baktériumok hőtűrése a mezofil csoportba esik; a szokásos pasztőrözési folyamatokkal biztonságosan elpusztíthatók. A Salmonella Senftenberg szerotípus hőtűrése azonban különleges, a termoduránsokéval vetekszik.
5.3. táblázat - A mikroorganizmusok átlagos hőtűrése Mikrobacsoport
D érték (min) 40 °C
50 °C
60 °C
Pszichrofil baktériumok
0,3
–
–
Pszichrotróf baktériumok
–
1–5
–
Mezofil baktériumok
–
5–40
0,2–1
Termoduráns baktériumok
–
–
1–30
Termofil baktériumok
–
–
100
Élesztő- és penészgombák
–
1–5
0,02–0,4
Az élesztő- és a penészgombák többségének hőtűrése a mezofil baktériumokéhoz hasonló. A vegetatív sejtek és az ivartalan konídiumok és az ivaros spórák közti különbség gyakorlatilag nem számottevő. Fontos kivétel a tömlősgombákhoz tartozó néhány penészgomba, mint a Byssochlamys, Neosartorya, Talaromyces fajok, amelyek aszkospórái jelentős hőtűrésűek, túlélnek 90 °C-on 30 perces hőkezelést is, D értékük 88 °C-on 7–22 perc. Ezek a gombák a pasztőrözött gyümölcslevek, befőttek romlását okozhatják. Valamennyi mikroorganizmus közt leghőtűrőbbek a baktériumok endospórái. A spórás baktériumok vegetatív sejtjei éppúgy hőérzékenyek, mint más mikroorganizmusok, a hőellenállás csak a különleges szerkezetű és összetételű spóra tulajdonsága (lásd 3.2.8.), és lényegében a többszörös spóraburkoknak és a spóraplazma dehidratált állapotának tulajdonítható. Az aerob vagy fakultatív anaerob Bacillus és az anaerob Clostridium fajok spóráinak hőtűrése közt nincs különbség, viszont a termofil spórás fajok lényegesen hőtűrőbbek, mint a mezofilok (5.4. táblázat).
5.4. táblázat - Baktérium endospórák hőtűrése Faj
D érték (min) 100 °C
121 °C
z érték (°C)
123
Tartósítási módszerek mikrobiológiája Alicyclobacillus acidoterrestris
3–8
–
6–8
Bacillus cereus
5–10
0,01
10
Bacillus subtilis
5–10
0,3–0,7
7
Clostridium botulinum
15–50
0,1–0,2
10
Clostridium sporogenes
60–190
0,1–1,5
9–13
Bacillus coagulans
–
0,1–3,0
–
Desulfotomaculum nigrificans
–
2,0–3,0
–
Clostridium thermosaccharolyticum
–
3,0–4,0
12–18
300–700
4,0–5,0
7
Geobacillus stearothermophilus
Míg az utóbbiak hőellenállását 0,01–0,1 min közé eső D121 érték jellemzi, a termofilok közt 2–5 min-t elérő tizedelődési időket is mértek. Az élelmezés-egészségügyi szempontból fontos kórokozók közül a leghőtűrőbb a Clostridium botulinum 0,1–0,2 min D121 értékkel (különösen annak A és B szerológiai típusába tartozó törzsek, míg a pszichrotróf E típus hőrezisztenciája lényegesen kisebb, D80 0,3–3 min jellemzi). A romlást okozó spórások közt a C. botulinumnál jóval hőtűrőbbek is vannak, mint pl. a Geobacillus stearothermophilus vagy a Clostridium thermosaccharolyticum, D121 3–5 min értékkel. A spórák hőtűrését a vegetatív sejtekénél kétszer-háromszor nagyobb z érték is jellemzi, ami általában 8–12 oC, de egyes spóráknál elérhet 20–30 °C-ot is.
A hőtűrést befolyásoló tényezők A táblázatokban szereplő D és z értékek csak tájékoztatóak, mivel a hőtűrést számos tényező befolyásolja. Bár az alapvetően faji jellegzetesség, a faj különböző törzseinek hőtűrése eltérhet, és azt a sejtek élettani állapota is befolyásolja. Az élénken szaporodó, exponenciális szakaszban lévő sejtek általában érzékenyebbek a hőhatásra, mint a stacionárius szakaszban lévők. A nagyobb hőmérsékleten képződött spórák hőrezisztenciája is nagyobb. Az élelmiszerek hőkezelése szempontjából a hőtűrésre ható tényezők közül legfontosabb magának az élelmiszernek az összetétele, különösen pedig a vízaktivitása és a pH-ja. A hőellenállást már néhány tizednyi aw-csökkenés is jelentősen fokozza (5.5. táblázat), ami gyakran tapasztalható nagyobb cukorkoncentrációknál, fehérje- vagy zsírtartalomnál. Zsírszemcsébe ágyazódott sejt vagy spóra esetében száraz hőhatás alakulhat ki, amivel szemben a rezisztencia jóval nagyobb, mint nedves hővel (gőzzel) szemben (5.6. táblázat).
5.5. táblázat - A hőellenállás fokozódása a vízaktivitás függvényében Szacharóz (súly%)
aw
15
0,99
D57 (min) pH 6,9-nél E. coli
Salmonella Senftenberg
1,2
1,2
124
Tartósítási módszerek mikrobiológiája 40
0,96
10,1
35,5
51
0,93
33,9
68,7
59
0,90
46,5
80,0
64
0,87
43,7
95,0
5.6. táblázat - Spórás baktériumok hőpusztulási jellemzői száraz és nedves hővel való kezeléseknél Faj
Nedves hő
Száraz hő
D121 (min)
z (°C)
D121 (min)
z (°C)
Bacillus subtilis
0,7
8
1,5
17–23
Geobacillus stearothermophilus
4,0
10
3,5
15–24
Paenibacillus polymyxa
0,05
8
0,1
15
Clostridium botulinum
0,2
9
0,2
33
Clostridium sporogenes
1,5
10
2,4
22–33
Savas közeg és kis pH jelentősen csökkenti a hőellenállást. Ennek igen nagy jelentősége van az élelmiszerek hőkezelésénél. A 4,5-ös pH kitüntetett érték; az ennél savasabb termékek hőkezelésére a pasztőrözés is elegendő, míg a nagyobb pH-nál 100 °C feletti, erőteljes sterilezés szükséges. Ennek az az oka, hogy az egészségügyileg legfontosabb hőtűrő spórás C. botulinum sem szaporodni, sem toxint termelni nem tud 4,5 pH-nál savasabb élelmiszerben, és a hőkezelést túlélő spórák kicsírázásával sem kell számolni. A hőellenállást befolyásoló tényezők hatása nemcsak a hőkezelés előtt és alatt, hanem azt követően is érvényesül. A kezelést túlélő, de károsodott sejtek csak kedvező körülmények között képesek életre kelni, a sérüléseket kijavítani, ezért bizonyos kémiai anyagok (pl. nitrit, tartósítószerek) jelenlétében a túlélő spórák nem tudnak szaporodásnak indulni, és a termék tartós, „kereskedelmileg steril” marad.
A hőkezelés méretezése A gyakorlatban a hőkezelés nem állandó, hanem változó hőmérsékleten történik (felmelegítés, hőntartás, lehűtés), és a mindenkori külső hőmérsékletet a termék különböző pontjai sem egyformán veszik át, hanem attól függően, hogy a hőátadás milyen gyors. A termék leglassabban melegedő pontjának (az ún. termikus középpontnak vagy hidegpontnak) hőmérsékleti változását a hőbehatolási (hőpenetrációs) görbe írja le (5.1. ábra).
125
Tartósítási módszerek mikrobiológiája
5.1. ábra - A hőmérséklet változása a hőkezelés folyamán. A hőközlő közeg ––– és a tartály hidegpontjának - - - hőmérséklete
A hőkezelés-szükséglet számításánál az a feladat, hogy a hőbehatolási görbe által leírt, változó ideig tartó, változó hőmérsékleteknek a mikrobákra gyakorolt pusztító hatását összegezzük. Ehhez arra van szükség, hogy a különböző hőmérsékletek pusztító hatását egységesen fejezzük ki. Megállapodás szerint a 121,1 °C-on mért hőpusztulási sebességhez viszonyítjuk minden más hőmérséklet pusztító hatását. Mint láttuk (3.2.1.), a 121,1 °C-ra vonatkoztatott relatív pusztulási sebesség F/τ, amelynek az egyes T hőmérsékletekhez tartozó értéke a hőpusztulási görbe egyenletéből számítható:
(Legyen pl. T hőmérséklethez tartozó pusztulási idő t, akkor a pusztulási sebesség 1/t, 121,1 °C-on pedig 1/F. Erre vonatkoztatva a relatív pusztulási sebesség 1/t : 1/F, vagyis F/t.) A különböző hőmérsékletek 121,1 °C-hoz viszonyított pusztító hatásának összegezett időegyenértékét (Fi) integrálással kapjuk:
126
Tartósítási módszerek mikrobiológiája Ha pl. egy sterilezési folyamat időegyenértéke Fi = 3 min, ez azt jelenti, hogy a hőkezelés folyamán kialakuló valamennyi összetartozó hőmérséklet- és időérték összesített pusztító hatása megfelel 3 perces hőkezelésnek 121,1 °C-on. Ilyen értelemben az Fi érték nem egy adott mikroorganizmusra, hanem egy adott sterilezési eljárásra vonatkozik, és lehetőséget ad a különböző hőkezelési folyamatok hatékonyságának összehasonlítására. A mikroorganizmusok hőtűrése azonban különböző, és hőpusztulási sebességük (idejük) is változik a hőmérséklettel, amit a z érték fejez ki (5.2. ábra). Ezért az Fi érték önmagában nem egyértelmű. A mérések szerint az egészségügyi szempontból legveszélyesebb hőtűrő spórás C. botulinum z értéke 10 oC, és ennyi az ipari gyakorlatban előforduló spórás baktériumok többségének hőrezisztencia-jellemzője is. Ezért az ilyen z értékű görbét választották a hőkezelés-szükségleti számítások alapjául. Erre vonatkoztatva, a különböző hőmérsékletek 121,1 °C-hoz viszonyított összegezett pusztító hatását Fo jelöléssel különböztetik meg, és sterilezési egyenértéknek nevezik. Az Fi időegyenértékkel szemben tehát az Fo sterilezési egyenérték a hőkezelési folyamat eredményességét a z = 10 °C értékkel jellemezhető mikroorganizmusok 121,1 °C-nak megfelelő pusztulási idejében fejezi ki. Az Fo érték alapján a különböző folyamatok hatékonysága nemcsak összehasonlítható, hanem azok szükséges mértéke is meghatározható. Világszerte elfogadott gyakorlat szerint a 4,5-nél nagyobb pH-jú termékek hőkezelését úgy kell végezni, hogy az a C. botulinum spóráinak számát 10–12 hányadára csökkentse. Ez az ún. 12D elv, amely tehát, mivel a C. botulinum D121 értéke 0,21 min, 12 × 0,21 = 2,52 percnyi hőkezelésnek felel meg 121,1 °C-on, vagyis ennyi a C. botulinumra méretezett Fo érték. Ez az egészségügyi biztonság érdekében megkövetelt minimális sterilezési egyenérték is.
5.2. ábra - Különböző z értékű, de azonos F értékű hőpusztulási görbék. z = 8, 12 (vagy más) °C-nál az időegyenérték Fi, z = 10 °C-nál Fo (sterilezési egyenérték)
A z = 10 °C-ra vonatkozó, különböző hőmérsékletekhez tartozó F/t értékeket a 5.7. táblázat tartalmazza. Ha pl. 100 °C-on a relatív pusztulási sebesség 0,00776, akkor a pusztulási idő 1/0,00776 = 128,8 perc, vagyis közel 130-szor hosszabb idő alatt következik be azonos mértékű pusztulás, mint 121,1 °C-on. A táblázati adatok 127
Tartósítási módszerek mikrobiológiája segítségével a fenti képlet szerinti integrálás grafikusan is megoldható. A hőbehatolási görbe hőfok adataihoz tartozó F/t értékeket a hőkezelési idő függvényében ábrázolva az ún. sterilezési görbéhez jutunk (5.3. ábra). A görbe alatti terület egyenlő a hőkezelési folyamat F0 sterilezési egyenértékével. Több évtizedes tapasztalat alapján a C. botulinum 12D értékű pusztulására alapozott F0 érték, mint minimális sterilezési egyenérték, igen nagy biztonságot nyújt a termékek hőkezelésénél. Bevezetése, az 1920-as évek vége óta a nagyüzemi méretekben gyártott konzervek nem okoztak számottevő egészségügyi problémát. Még ha feltételezzük is, hogy minden egyes dobozba vagy üvegbe bekerül a C. botulinum egy spórája (ami a valóságtól szerencsére távol áll), és legalább az Fo = 2,52 perces hőkezelést alkalmazzuk, akkor F0 = τ = D (log N0 – Nt), 2,52 = 0,21 (log 10o – log Nt), 12 = – log Nt és Nt = 10–12, vagyis csak 10–12 spóra maradhat életben dobozonként, azaz egybillió doboz közül csupán egyetlenegy tartalmazhat hőkezelést túlélő spórát.
5.7. táblázat - Relatív pusztulási sebesség (F/t) különböző hőmérsékleteken, z = 10 °C értéknél T (°C)
F/t
T (°C)
F/t
70
0,000 008
112
0,123 03
80
0,000 078
114
0,194 99
90
0,000 776
116
0,309 03
95
0,002 455
118
0,489 78
100
0,007 762
120
0,776 25
102
0,012 303
121
0,997 24
104
0,019 500
122
1,230
108
0,048 978
124
1,950
110
0,077 63
126
3,090
128
Tartósítási módszerek mikrobiológiája
5.3. ábra - A sterilezési egyenérték számítása. A hőbehatolási görbe (---) hőmérsékleteihez tartozó F/τ értékeket felvéve a sterilezési görbéhez (–––) jutunk; e görbe alatti terület egyenlő a sterilezési egyenértékkel (F0, min)
A 4,5-nél nagyobb pH-jú, gyengén vagy nem savas termékek hőkezelésére általában a minimális egészségügyi sterilezési egyenértéknél nagyobb mértékű hőkezelést alkalmaznak, mivel ezekben a C. botulinumnál hőtűrőbb spórás baktériumok fordulhatnak elő. Bár ezek az egészségre nem veszélyesek, viszont a termékek romlását okozhatják. A gyártás gazdaságossága érdekében legfeljebb 0,1%-os romlási selejtet lehet megengedni. Ezért a mezofil spórás baktériumok sejtszámától függően, és ezek 1 perc körüli D121 idejével számolva, a szükséges hőkezelést F0 = 5–10 értékűre kell méretezni. Ha pl. a spóraszám 105 dobozonként, és a romlási selejt 0,1% (vagyis a sterilezés utáni spóraszám 10–3 /doboz), akkor a fentiek szerint: Fo = 1,0 (log 105 – log10–3) = 8. Ha termofil spórás szennyezettséggel is kell számolni, a hőkezelést még hatásosabbra kell méretezni, mivel azok D121 értéke 3–5 min is lehet. Ilyenkor F0 = 15– 20 egyenértékű hőkezelés is szükséges lehet (5.8. táblázat).
5.8. táblázat - Néhány konzervipari termék Fo sterilezési egyenértéke Termékcsoport Savanyúságok
pH 3,4–4,1
Erősen savas gyümölcsbefőttek 3,2–3,8
F0 (min) 0,0002–0,004 0,002–0,007 129
Tartósítási módszerek mikrobiológiája Paradicsomos készítmények
4,2–4,5
0,01–0,07
Közepesen savas befőttek
3,7–4,5
0,1–0,4
Közepesen savas főzelékek
4,0–4,5
0,1–2,0
Gyengén savas főzelékek
5,0–6,1
4–4
Készételek
4,5–6,5
5–30
A 4,5-nél kisebb pH-jú élelmiszerek hőkezelésére viszont a C. botulinumra vonatkoztatott 12D elvet nem kell alkalmazni. A savas közeg egyébként is jelentősen csökkenti a mikroorganizmusok hőellenállását. Az ilyen termékek tartósítására a 100 °C-nál kisebb hőmérsékletű pasztőrözés is elegendő. A pasztőrözési eljárások egyenértékét nem is a 121 °C pusztító hatásához viszonyítják, hanem kisebb, 100 vagy 80 °C-hoz, amit P100 vagy P80 jelöléssel szoktak megadni. Ez akkor is érvényes, ha ún. ultrapasztőrözést alkalmaznak, azaz igen nagy hőmérsékletű, de rövid idejű hőkezelést. Ez csak folyadékoknál, megfelelő berendezésekben hajtható végre (pl. tejnél 132 °C-on 1 s).
Hőelvonás Az alkalmazott hőmérsékleti tartomány szerint a hőelvonásos tartósításnak két módszerét különböztetjük meg: a hűtést és a fagyasztást. Hűtőtárolásról akkor beszélünk, ha az élelmiszert (fajtájától függően) 0 és 10 °C közötti hőmérsékleten tartjuk, míg fagyasztás a víz fagyáspontjánál jóval kisebb, többnyire –15 °C alatti hőmérsékleten történik. A hűtés és a fagyasztás tartósító hatása azon alapul, hogy a hőmérséklet csökkentésével a mikroorganizmusok szaporodása előbb lelassul, majd megáll, sőt, a kis hőmérséklet, a körülményektől függően, a mikrobasejtek bizonyos mértékű pusztulását is okozza. A mikrobákra gyakorolt hatáson kívül mind a hűtés, mind a fagyasztás lassítja, illetve megállítja az élelmiszerek szöveti enzimeinek működését, biológiai és élettani változását, ezért igen előnyös tartósítási módszer.
A mikroorganizmusok hidegtűrése Mint azt korábban tárgyaltuk (1.2.4.1.), a kis hőmérsékleteken szaporodni képes mikroorganizmusok hőmérsékleti határai szerint megkülönböztethetők a hidegkedvelő és a hidegtűrő (pszichrofil és pszichrotróf) mikrobacsoportok. A kettő közti különbséget – többé-kevésbé mesterségesen – nem annyira a legkisebb szaporodási hőmérsékletben, hanem a szaporodás maximális hőmérsékletében szabták meg, ez utóbbi a pszichrofiloknál legfeljebb 15–20 oC. A mikroorganizmusok hidegtűrésének élettani alapjait még nem ismerjük teljesen. Valószínű, hogy a minimális hőmérséklet alatt az anyagcsere-folyamatok egyensúlya megbomlik, a sejt nem képes fenntartani a homeosztázis állapotát. Az anyagcserében szereplő enzimek hőmérsékleti koefficiensei eltérők, a leginkább hőmérsékletfüggő reakciók sebességének lassulása az anyagcsere zavarát okozza. Ebben közvetlen jelentőséget tulajdonítanak a membrántranszport folyamatoknak, amelyek gátlásában vagy megszűnésében a citoplazmamembrán szerkezetének megváltozása, a membránlipidek dermedése játszhat szerepet. Kimutatták, hogy a hőmérséklet erősen befolyásolja a membránok lipidösszetételét; a pszichrofil fajokban sokkal több telítetlen zsírsav van, és a zsírsavak telítetlensége annál nagyobb, minél kisebb a szaporodási hőmérséklet (5.9. táblázat). Az enzimeken, a transzportfehérjéken és a membránokon kívül más összetettebb sejtszerkezetek, mint pl. a riboszómák hőstabilitása is befolyásolja működőképességüket. 130
Tartósítási módszerek mikrobiológiája
5.9. táblázat - Élesztőfajok zsírsav-összetételének változása a szaporodási hőmérséklettel Zsírsavak aránya (%) Szaporodási Telítetlenségi hőmérséklet C16* C16:1 C18 C18:1 C18:2 C18:3 fok
Faj Candida psychrophila
0
7
1
1
45
8
40
1,81
(pszichrofil)
15
14
1
1
50
18
17
1,40
15
12
1
13
27
27
16
1,42
25
14
1
12
38
29
4
1,22
37
18
5
45
25
–
–
0,70
Candida famata
1
(mezofil) 2
Candida bovina (termofil)
* Zsírsavak jelölése: szénatomszám: telítetlen kötések száma 1
Debaryomyces hansenii
2
Arxiozyma telluris (ivaros alakok)
A mikrobaszaporodás hőmérsékleti jellemzésére kiterjeszthető a kémiai reakciók sebességének hőmérsékletfüggését leíró Arrhenius-egyenlet azzal a megszorítással, hogy míg a kémiai reakciók aktivációs energiája széles hőmérsékleti tartományban állandó, a mikroorganizmusokra ez csak szűk határok közt érvényes. A 2.1.3. pontban láttuk, hogy a szaporodási sebesség hőmérsékletfüggése csak viszonylag rövid szakaszban lineáris, és az optimális szaporodási határokon túl meredeken letörik (lásd előbb, 2.7. ábra). A hőmérsékleti jellemző hirtelen megnövekedése azonban kisebb hőmérsékleten következik be a pszichrofiloknál, mint a mezovagy termofiloknál, és a lineáris szakasz hajlásszöge is kisebb azokénál; ez azt jelenti, hogy a pszichrofilok szaporodási sebessége más mikroorganizmusokhoz képest lassabban csökken a hőmérséklet csökkenésével (5.4. ábra). Mindez annak tulajdonítható, hogy ezek anyagcsere-tevékenysége még kisebb hőmérsékleteken is lehetővé teszi a szaporodást.
131
Tartósítási módszerek mikrobiológiája
5.4. ábra - Termofil (□), mezofil (○) és pszichrofil (∆) mikroorganizmus szaporodásának Arrhenius-görbéje
A pszichrofil baktériumok nagy része Gram-negatív, aerob faj. Élelmiszerekben különösen gyakoriak a Pseudomonas és rokon nemzetségek tagjai (P. fluorescens, P. fragi, Shewanella putrefaciens), Alcaligenes, Acinetobacter, valamint a Flavobacterium fajok. Pszichrotrófok nem ritkán találhatók a bélbaktériumok (pl. Enterobacter, Serratia), valamint más fakultatív anaerobok közt (Vibrio, Aeromonas). A talajból nagy számban kerülhetnek élelmiszerekre pszichrofil, Gram-pozitív baktériumok is (Arthrobacter, továbbá korineformok és spóraképzők). A kórokozó baktériumok többsége mezofil és nem szaporodik 5 °C-nál kisebb hőmérsékleten, azonban fontos kivételek vannak, mint a pszichrotróf Listeria monocytogenes, a Yersinia enterocolitica és a Clostridium botulinum E típusa (5.10. táblázat).
5.10. táblázat - Élelmiszerekkel terjedő kórokozó baktériumok szaporodási hőmérsékletei (°C) Faj
Minimum
Optimum
Maximum
0–4
28–35
42–45
10–15
35–40
50–55
pszichrotróf törzsek
4–5
28–35
30–35
Campylobacter jejunii
32
42
45
Clostridium botulinum A, B
12
35
50
E szerotípus
3,3
30
45
Aeromonas hydrophila Bacillus cereus
132
Tartósítási módszerek mikrobiológiája Escherichia coli
7–8
35–40
44–46
Listeria monocytogenes
0–4
30–37
45
Salmonella enterica
5
35–37
45–47
Staphylococcus aureus
7
35–40
48
Élesztőgombák között leggyakrabban a Candida, Rhodotorula és Cryptococcus nemzetségekben találunk pszichrotróf fajokat. Csak kevés olyan élesztő ismert, amely pszichrofilnak tekinthető, mivel nem szaporodik 22–24 °C-nál nagyobb hőmérsékleten; ezek főleg a sarki tengerek vizében élnek, de néhányuk élelmiszerekben is előfordul (Leucosporidium scottii, Mrakia frigida). A penészgombák közül a legismertebb pszichrofilok a Thamnidium és a Cladosporium fajok, de számos hidegtűrő törzs van a Mucor, Rhizopus, Penicillium, Alternaria, Fusarium és más nemzetségekben.
A hűtés hatásai A hűtés hatására, a hőmérséklet csökkentésével mind a szaporodás lappangási szakasza, mind a generációs idő növekszik. Még ha egy mikroba képes is szaporodásnak indulni kis hőmérsékleten, a lappangási idő rendkívül, több napra is megnyúlik, és a generációs idő is órákkal meghosszabbodik (5.11. táblázat). A minimális hőmérséklet alatt ezek ideje szinte végtelenre nyúlik: a szaporodás gátlódik. Más környezeti tényezők kedvezőtlen értékeinél a minimális szaporodási hőmérséklet megnő, a gátlás fokozódik. Ilyen tényező a vízaktivitás, a pH és a légköri oxigénkoncentráció. A hűtés kombinálása ezekkel, különösen az oxigéntartalom csökkentésével, igen eredményes tárolási módszert tesz lehetővé (lásd az 5.6. pontban, szabályozott és módosított légterű tárolás).
5.11. táblázat - A hőmérséklet csökkentésének hatása a generációs időre és a lappangási szakaszra Mikroba Listeria monocytogenes
Yersinia enterocolitica
Pseudomons fluorescens
Hőmérséklet (°C) Generációs idő (h) Lappangási idő (nap) 0
62–130
3–33
4
10–40
2–8
10
5–9
1–1,5
0
25
4
4
20
2
10
2–4
< 0,1
0
16–20
2,5
4
8–12
1,5
10
3–6
0,5
A hűtés hatása nemcsak szaporodásgátlás lehet, hanem a mikrobasejtek fokozatos pusztulása is, ha huzamosabb ideig vannak kitéve a szaporodási minimumnál kisebb hőmérsékletnek. A termofilok már 30 °C-on pusztulni kezdenek, a mezofilok 0–10 °C között. 0 °C közelében a pszichrofilok is pusztulni kezdenek, ha egyéb 133
Tartósítási módszerek mikrobiológiája körülmények is eltérnek az optimálistól. Ez a pusztulás igen lassú, a tizedelődési idő többnyire csak hetekben mérhető. A folyamat érdekessége, hogy minél távolabb van a hőmérséklet a szaporodási minimumtól, a pusztulás annál lassabb, míg néhány fokkal a minimum alatt a leggyorsabb. Különleges jelenség a gyors hűtés okozta hidegsokk is. A hirtelen hőmérséklet-csökkentés gyors pusztulást okozhat, ilyen sokkoló hatás pl. a gyors lehűtés 30–37 °C-ról 0–5 °C-ra. A hidegsokkra főleg a Gram-negatív baktériumok érzékenyek, de csak a szaporodás exponenciális szakaszában. A pusztulás csak a sejtek bizonyos hányadára terjed ki, a túlélők optimális körülmények között egy-két óra alatt regenerálódnak.
A fagyasztás hatásai A tiszta vízzel szemben az élelmiszerek fagyáspontja nem 0 °C, hanem kisebb, és nem egy meghatározott hőmérséklet, hanem szélesebb zóna. Az élelmiszer összetételétől függően a víz kifagyása –1 és –3 °C között kezdődik. Ez növeli az oldott anyagok koncentrációját a még nem fagyott vizes oldatban, következésképpen annak fagyáspontja csökken. Bizonyos hőmérsékletnél, az ún. eutektikus pontnál azonban az oldott anyagok koncentrációja már nagyobb lesz oldhatóságuknál, és kicsapódnak. Egyidejűleg a még visszamaradt víz is megfagy. A teljesen fagyott állapot, amely a kicsapódott oldott anyagok és a jégkristályok összetett rendszere, egyes élelmiszereknél, pl. gyümölcs- és zöldségféléknél –15 és –20 °C között, másoknál, pl. húsoknál csak –40 °C alatt jön létre. Ezek a jelenségek magyarázzák a fagyasztásnak a mikroorganizmusokra gyakorolt hatását. Nyilvánvaló, hogy az egyik tényező magának a hőmérsékletnek a csökkenése. A víz kifagyásával azonban az oldat töménysége nő, és vízaktivitása csökken. A jéggel egyensúlyban lévő oldat aw értéke –5 °C-on 0,953, –10 °Con 0,907 és –20 °C-on már csak 0,823. Ezért a fagyott élelmiszerben csak azok a mikroorganizmusok tudnak szaporodni, amelyek minimális hőmérséklete elég kicsi, és amelyek egyidejűleg elviselik a kis vízaktivitást is (pszichrofilok és xerotoleránsok egyszerre). Ilyenek azonban vannak, és képesek szaporodni még –5 ... –10 °C-on is, ha az élelmiszerben még folyadék állapotú víz maradt. A szaporodás azonban igen lassú, a generációs idő 2–10 nap, a lappangási idő még hosszabb (5.12. táblázat).
5.12. táblázat - Néhány pszichrofil baktérium generációs ideje Faj
Hőmérséklet (°C)
Generációs idő (h)
Acinetobacter anitratus
–4
31
Pseudomonas fluorescens
–3
57
Bacillus psychrophilus
–2
55
–4,5
168
–2
84
–4,5
156
–7
252
Bacillus globisporus Bacillus insolitus
A fagyasztás a mikroorganizmusokra pusztító hatású is. A fagyasztással szembeni ellenálló képességük különböző. Egyesek gyorsan elpusztulnak, mások a fagyasztási folyamat alatt sejtkárosodást szenvednek, és később, a fagyott tárolás alatt pusztulnak el, ismét mások viszont a fagyasztást károsodás nélkül túlélik. Az utóbbiak közé tartoznak a baktériumspórák és sok Gram-pozitív kokkusz, míg a Gram-negatívok érzékenyebbek a fagyasztásra. 134
Tartósítási módszerek mikrobiológiája A pusztító hatást befolyásolja a fagyasztás hőmérséklete és sebessége, a fagyott tárolás hőmérséklete és ideje, sőt a felengedtetés körülményei is. A pusztulás kiváltó oka a jégkristályok képződése és a vízaktivitás csökkenése. A mikrobasejtek pusztulása elsősorban a fellépő ozmózisos hatásoknak tulajdonítható. A jégkristályképződés mechanikai károsítása a mikrobasejtek esetén nem elsődleges tényező, a növényi és állati sejteknél azonban igen, és hozzájárul a termék állományának gyengüléséhez és a felengedtetési veszteséghez. A fagyasztási sebesség az optimumgörbe szerint hat a sejtek túlélésére (5.5. ábra). Kis fagyasztási sebességnél a kristályképződés extracellulárisan kezdődik, a külső oldatkoncentráció nő, és kivonja a vizet a sejtekből. A lassú fagyás alatt a sejtek huzamosan ki vannak téve az erőteljes ozmózisos hatásoknak, ami a membránokat károsítja és fokozott pusztulást okoz. Nagy fagyasztási sebességnél viszont a kristályképződés intracellulárisan megy végbe, és ez ismét erősen károsítja a sejteket, túlélésük csökken.
5.5. ábra - A fagyasztási sebesség hatása az Escherichia coli (–––) és a Saccharomyces cerevisiae (- - - -) túlélésére
A fagyasztást közvetlenül túlélő sejtek a fagyott tárolás folyamán lassan és fokozatosan tovább pusztulnak. Állandó hőmérsékleten, fagyott állapotban a pusztulás kezdetben gyors, majd fokozatosan lassul, és a túlélő sejtek száma állandósul. A fagyponthoz közeli hőmérsékleten (–2 ... –5 °C-on ) a pusztulás mértéke nagyobb, mint –20 °C körül. A gyors felengedtetés folyamán a sejteket érő ozmózisos hatás ideje rövidebb, ezért a túlélés nagyobb mértékű. Lassú felengedtetés alatt viszont mód nyílik a mikrobaszaporodás megindulására. A fagyasztást túlélő sejtek többnyire sérültek, károsodtak. Erre figyelemmel kell lenni a mikrobiológiai vizsgálatoknál, és célszerű a sejteket néhány órán át regeneráltatni tápanyagban dús körülmények közt, mielőtt a tenyésztésüket megkezdjük. Gátlóanyagokat tartalmazó szelektív vagy differenciáló tápközegekben regeneráltatás nélkül hibás eredményt kapunk. A mikrobák különböző érzékenysége miatt a mikrobiota összetétele a fagyasztás után jelentősen különbözhet a fagyasztás előttihez képest. Általában számolni lehet a Gram-pozitív baktériumok feldúsulásával. A fagyasztás, bár jelentősen csökkentheti a túlélő mikrobák számát, mégsem jelent sterilezést. A pusztulás mértékét 135
Tartósítási módszerek mikrobiológiája az élelmiszerek összetevői, mint védőanyagok, csökkenthetik. Általában azok a fagyasztási körülmények, amelyek a termék minőségére előnyösek, kedvezőek a mikroorganizmusok túlélésére is. A felengedtetett terméken mindig találhatók mikroorganizmusok, amelyek romlást okoznak. Számolni kell a kórokozók túlélésével is. A termék csak addig eltartható, ameddig változatlanul és tartósan fagyott állapotban marad. Ennek feltétele a folyamatos és megszakítás nélküli hűtőlánc. Bár a kórokozó baktériumok szaporodása nem indul meg mindaddig, amíg a hőmérséklet 10 °C fölé nem emelkedik, a hűtőlánc megszakadása miatti felengedés után a terméket a mikrobiológiai és minőségi romlás kockázata miatt nem szabad ismét lefagyasztani.
Fagyasztva szárítás A fagyasztva szárítás (liofilezés) valójában kombinált tartósítási módszer. Lényege, hogy az élelmiszert úgy szárítják ki, hogy a vizet jéggé fagyasztva, szublimáltatással távolítják el. A terméket tehát előbb megfagyasztják, majd vákuumban, enyhe melegítéssel a jeget közvetlenül elpárologtatják. A víz eltávolítása így nagyon kíméletes, ami igen jó minőségű terméket eredményez. Visszanedvesítésekor a liofilezett termék közel az eredeti tulajdonságait nyeri vissza. Mikrobiológiai szempontból a liofilezés mindkét szakaszának antimikrobás hatása azonos: a vízaktivitás csökkenése. A fagyasztás sebessége és hőfoka, illetve a szublimáltatás hőmérséklete szerint a hatás különböző mértékű lehet. A mikroorganizmusok túlélését döntő módon meghatározza a termék összetétele is. A szénhidrátok, fehérjék védő hatásúak. A szárítmányokhoz vagy a fagyott termékekhez hasonlóan a túlélő sejtek lassú pusztulása megy végbe a tárolás alatt, különösen, ha a termék a légköri oxigénnel érintkezik. További mikrobapusztulás történhet a visszanedvesítéskor, a hirtelen fellépő nagy oldatkoncentráció-különbségek miatt. Egészében véve azonban a víz kíméletes eltávolítása nemcsak a termék szerkezetét és minőségét óvja meg, hanem a mikroorganizmusokat is védi az erős pusztító hatásoktól. A fentiek miatt a fagyasztva szárítás a mikroorganizmusok tartósítására is előnyösen alkalmazható. A mikrobatenyészetek gyűjteményeiben a törzseket leggyakrabban liofilezett állapotban tartják fenn. A tenyészetek így 10–20 évig is eltarthatók tulajdonságaik megváltozása vagy kipusztulásuk nélkül, és a szükséges időben ismét életre kelthetők. A mikroorganizmusok tartósításánál a liofilezés körülményeit úgy választják meg, hogy a legnagyobb mértékű túlélést érjék el, ezért kis szárítási hőmérsékletet és hatásos védőanyagot, a tároláskor pedig nitrogénatmoszférát alkalmaznak. Csupán néhány, különösen érzékeny mikrobafaj nem tartósítható ilyen módon. Ezeknél és minden más mikroorganizmusnál is a fagyasztva szárítás helyett egy másik korszerű tartósítási eljárás alkalmazható, a folyékony nitrogénben (–196 °C-on) való fagyasztás és tárolás.
Vízelvonás A mikroorganizmusok élete vízhez kötött, anyagcseréjük, szaporodásuk vizes oldatokban megy végbe. A folyadék állapotú víznek is csak az a része hozzáférhető számukra, amely kémiailag nem kötött. Az élelmiszerek összes víztartalmának jelentős mennyisége kötődik fehérjékhez, szénhidrátokhoz, sókhoz és más összetevőkhöz. Az élelmiszerek többsége azonban elegendő szabad vizet tartalmaz ahhoz, hogy a mikroorganizmusok szaporodását lehetővé tegye. A mikrobiológiai romlás elleni védekezés egyik lehetősége éppen az élelmiszer szabad víztartalmának csökkentésében rejlik a víz fizikai eltávolításával (szárítás, bepárlás, besűrítés), kémiai megkötésével (cukrozás, sózás) vagy – mint az előző pontban láttuk – kifagyasztással.
136
Tartósítási módszerek mikrobiológiája
A mikroorganizmusok vízigénye Az 1.2.3.1. pontban ismertettük a vízaktivitás és a vízpotenciál fogalmát mint olyan tényezőket, amelyek kifejezik a mikroorganizmusok szaporodását meghatározó szabad víztartalmat és ennek függvényében a mikroorganizmusok vízigény szerinti csoportjait. A minimális vízaktivitás érték, amelynél szaporodás még lehetséges, a mikrobák fajai szerint nagyon különböző. Általában a vízaktivitás csökkenésével a lappangási szakasz meghosszabbodik és a szaporodási sebesség csökken. A baktériumok között a Gram-negatív fajok vízaktivitás-igénye a legnagyobb, ezeket, csökkenő vízigényük szerint a Gram-pozitív pálcák, majd a kokkuszok követik. Az élelmiszerekben jelentős kórokozó baktériumok (mint a szalmonellák) szaporodása gátlódik < 0,93 aw (–10,0 MPa) értéknél. A tejsavbaktériumok még szaporodnak 0,90 körüli aw-nél, míg a Staphylococcus aureus aerob szaporodása csak 0,86 aw-nál (–19,2 MPa) gátlódik, de az enterotoxintermelés már 0,93 awnál (–10,0 MPa) megszűnik. Az élesztőgombák szaporodásának vízigénye általában kisebb, mint a baktériumok többségének. Néhány, az élelmiszerekben is gyakori Zygosacharomyces faj nagy cukorkoncentrációjú termékekben (dzsemek, szörpök, méz) is képes szaporodni, mintegy 60%-os cukorkoncentrációnál, amely 0,85 aw (–22,4 MPa) értéknek felel meg. Ezeket ozmofil élesztőknek szokás nevezni, bár csak néhány törzsről igazolódott, hogy szaporodásához igényli a nagy cukorkoncentráció okozta ozmózisos nyomást. Megfelelőbb rájuk a kis vízaktivitást tűrő, xerotoleráns elnevezés. Néhány élesztőgomba (pl. a Debaryomyces faj) sótűrő, és szaporodni tud pácolt húsokon, savanyúságokban, akár 16% NaCl-koncentrációig (aw 0,88, – 17,6 MPa). A penészgombák általában kis vízigényű mikroorganizmusok, közülük a sporangiospórásoké (Mucor, Rhizopus) viszonylag nagyobb (minimális aw 0,93–10,0 MPa), míg az Aspergillus és Penicillium fajok többsége 0,78–0,80 aw-ig (–34,2 ... –30,7 MPa) szaporodik. Az Aspergillus glaucus csoport fajai jellegzetesen szárazságtűrők, szaporodásuk minimális határa 0,71 aw (–47,1 MPa). A Monascus (Xeromyces) bisporus szaporodásának minimális értéke az ismert legkisebb: aw 0,61 (–69,0 MPa). A penészgombák hífáinak növekedéséhez elegendő vízaktivitásnál több szükséges az ivartalan spórák vagy konídiumok létrehozásához, és még nagyobb aw szükséges az ivaros szaporodáshoz (5.13. táblázat). Élelmiszer-biztonsági szempontból lényeges, hogy a szaporodást lehetővé tevő aw értékekhez képest a mikotoxinképzés már viszonylag nagyobb vízaktivitásnál gátlódik; ez fontos tényező a penészérlelt sajtok és szárazáruk (pl. téli szalámi) egészségügyi megítélésében (5.14. táblázat).
5.13. táblázat - Penészgombák szaporodását gátló vízaktivitás-értékek Nemzetség, faj
Gátló vízaktivitás és gátlási idő (nap) hífanövekedés
Mucor, Rhizopus
ivartalan szaporodás
ivaros szaporodás
0,93
Penicillium citrinum
0,89 (5–9)
0,89 (14–24)
Aspergillus flavus
0,90 (10)
0,90 (15)
A. ochraceus
0,80 (23–63)
0,84 (19–80)
A. restrictus
0,71 (8–78)
0,75 (42–87)
0,80–0,84 (20–86)
137
Tartósítási módszerek mikrobiológiája Chrysosporium fastidium
0,68 (37–48)
0,70 (64–80)
Monascus bisporus
0,60 (80–120)
0,66 (80–90)
0,67–0,70 (83–116
5.14. táblázat - A penészgombák mikotoxin termelését és szaporodását megengedő vízaktivitások Mikotoxin
Faj
Aflatoxin
Aspergillus flavus
Ochratoxin
Aspergillus ochraceus Penicillium cyclopium
Minimális aw szaporodás
toxinképzés
0,78–0,84
0,83–0,87
0,77
0,85
0,82–0,85
0,87–0,90
Patulin
Penicillium expansum
0,81
0,95
Stachibotrin
Stachybotrys atra
0,94
0,94
A mikroorganizmusok szaporodásának vízigényét számos tényező befolyásolja. A legkisebb vízaktivitást a mikrobák szaporodásuk optimális hőmérsékletén viselik el, és a minimális érték általában kisebb szacharózzal, mint konyhasóval beállítva. A cukortűrő élesztők még erjeszteni tudnak 0,66 aw-nál 30 °C-on, de csak 0,70 aw-ig 20 °C-on. Az Eurotium amstelodami (Aspergillus restrictus) konídiumai kicsíráznak még 0,71 aw-nál, ivartalanul szaporodik 0,75 aw-nál, de ivaros spóraképzésének minimális határa 0,80 aw. A mikotoxinképzést már gátló vízaktivitás-értékek is nagyobbak, mint az azokat termelő gombák szaporodásának minimális értékei.
A vízelvonásos tartósítás A mikroorganizmusok szaporodásának minimális vízaktivitás-igényét tekintetbe véve az élelmiszerek biztonságos eltarthatóságát csak 0,70 nél kisebb aw értéknél (ψ = –49,1 MPa) várhatjuk. Ilyen vízaktivitásoknál csak néhány xerotróf-xerofil gomba szaporodásával kell számolnunk, de ezek az élelmiszerekben csak ritkán fordulnak elő, másrészt a kis aw-nél szaporodásuk is lassú, csak hónapok múltán számottevő. Az élelmiszerek nedvességtartalma és vízaktivitása közt nincs egyenes arányú összefüggés. Az összetételtől függően azonos vízaktivitáshoz nagyon különböző víztartalom tartozhat. A százalékos víztartalom és az aw közti összefüggést a szorpciós izoterma írja le (5.6. ábra), azonban ennek alapján csak óvatosan lehet az élelmiszer mikrobiológiai stabilitását megjósolni.
138
Tartósítási módszerek mikrobiológiája
5.6. ábra - Szorpciós izoterma és hiszterézis. k: a kritikus vízaktivitáshoz (0,7) tartozó víztartalom
Egyrészt az izoterma lefutását a hőmérséklet erősen befolyásolja, másrészt a hiszterézis jelensége miatt a víz eltávolításakor (deszorpciókor), illetve felvételekor (adszorpciókor) kialakuló izotermák eltérnek. Az erős hiszterézist mutató termékeknél, amelyeket vízelvonással tartósítottak, egy adott aw értékhez nagyobb víztartalom tartozik. A különböző termékeknél a 0,70 aw-hez tartozó kritikus víztartalom 20 °C-on 7–25% között lehet (5.15. táblázat).
5.15. táblázat - Különböző száraz élelmiszerek 0,70 aw-hez tartozó százalékos víztartalma Élelmiszer
Víztartalom (%)
Olajos magvak
4–9
Tejpor
7–10
Rizs, hüvelyesek, liszt
12–15
Zöldségszárítmányok
12–22
Levesporok
13–21
Gyümölcsaszalványok
18–25
139
Tartósítási módszerek mikrobiológiája A szárítás az egyik legrégibb tartósítási módszer. A napon való szárítást, aszalást ma már ritkán alkalmazzák. A mezőgazdasági terményeket (gabona, kukorica) is mesterségesen szárítják 9–14% nedvességtartalomig, hogy a penészedés ellen védve tárolhatók legyenek. A zöldségek, gyümölcsök, fűszerek, levesporok, tészták tartósítására a szárítással való vízelvonást kiterjedten alkalmazzák. Ezek szárítása forró levegővel történő, ún. konvekciós szárítás. Légszárításnál a levegő funkciója kettős: a hő átadása a víz elpárologtatásához és a vízgőz elszállítása. A mikroorganizmusokat is kettős hatás éri: a hőmérséklet növekedése és a vízaktivitás csökkenése; az idő függvényében azonban ezek kombinációja változik. A szárítás kezdetén a páratartalom nagy és a hőmérséklet viszonylag kicsi, mivel a terméket a párolgás hűti, ezért annak hőmérséklete alatta marad a levegőének. A mikroorganizmusokat pusztító, 50 °C-nál magasabb hőmérséklet akkor alakul ki, amikor a nedvességtartalom már kicsi, és így azt a mikrobák már könnyebben túlélik. Ezért a szárítás alatt a mikrobapusztulás csak részleges. Számítani lehet azonban a sérült sejtek további lassú és fokozatos pusztulásával a száraz állapotú termék tárolása folyamán. Az élelmiszeriparban a vízelvonás másik módja a besűrítés. A hőátadás forró felülettel való érintkezés útján történik (kontakt szárítás). Ezt főként gyümölcslevek, paradicsom besűrítéses tartósítására alkalmazzák. A sűrítés vákuumban, 60–90 °C-os páratér hőmérsékleten megy végbe, és a termék hőmérséklete is eléri a mikrobákra pusztító értéket. Mégis a sűrítés sem okoz teljes mikrobapusztulást, de a termékben maradt mikroorganizmusok a kis vízaktivitás miatt nem kezdenek szaporodni. A vízelvonás megvalósítható a szabad víztartalom lekötésével, cukrozással, sózással is. Főként cukrozással készíthetők tartós, közvetlenül fogyasztható termékek (pl. dzsemek, szörpök). Ezek cukortartalma 55–65%-ot ér el, ami mintegy 0,75–0,80 aw értéknek felel meg. Az ilyen, ún. közepes nedvességtartalmú termékek mikrobiológiai stabilitását további tényezők (kis pH, tartósítószer, csomagolás) segíti elő. A dzsemek készítésekor a főzés lényeges pusztító hatást gyakorol. A termék általában tartós marad, amíg részleges hígulás (pl. a felületen lecsapódó nedvesség) miatt penészedés vagy élesztős romlás nem lép fel. Sózással halak, húsok, zöldségek tartósíthatók, a nagy sótartalom miatt ezek közvetlenül nem, csak kiáztatás után fogyaszthatók.
Besugárzás A sugárenergia két típusa alkalmazható élelmiszer-ipari célokra: az ultraibolya (UV) fény és az ionizáló sugárzás. Energiatartalmuk és ebből következően hatásuk és alkalmazásuk lényegesen különbözik.
Ultraibolya sugárzás Az elektromágneses spektrum 100–400 nm tartományába eső sugárzás, amelynek a 200–280 nm-es hullámhosszúságú része különösen mikrobapusztító, ún. germicid hatású. Ez annak tulajdonítható, hogy a dezoxiribonukleinsav abszorpciós maximuma 265 nm, az elnyelt sugarak pedig a DNS szerkezeti módosulását (főként pirimidin-dimerek képződését) és halálos mutációkat okoznak. A pusztulási görbe általában szigmoid alakú, ami részben a pusztuláshoz vezető sérülések felhalmozódásának, illetve a sérüléseket kijavító mechanizmusnak tulajdonítható; az utóbbit a látható fény elősegíti (fotoreaktiváció). Emiatt tizedelődési idő csak a görbe egy szakaszából számítható; ehelyett a meghatározott nagyságrendű pusztuláshoz szükséges dózissal lehet az UV sugárzás hatékonyságát, illetve a sejtek UV-érzékenységét jellemezni (5.16. táblázat). A Gram-negatív baktériumok érzékenyebbek, mint a Gram-pozitívok, valamint a vírusok, a gombakonídiumok és a baktériumspórák. Az UV sugarak behatolóképessége kicsi (vízben kb. 5 cm), ezért csak a levegő, a víz és átlátszó folyadékok, valamint felületek, csomagolóanyagok mikrobamentesítésére használható. A hatékonyságot oxidálószerekkel (pl. hidrogén-peroxid) együtt alkalmazva lehet fokozni.
140
Tartósítási módszerek mikrobiológiája
5.16. táblázat - Mikroorganizmusok 4 log nagyságrendű pusztuláshoz szükséges mértékű sugárzás (254 nm-es) UV sugárzás Mikroorganizmus
Kezelés (J/m2)
Escherichia coli
50–110
Salmonella spp.
130–140
Enterococcus faecium
170
Mycobacterium smegmatis
200
Enterovírusok
290–350
Ionizáló sugárzás Az ionizáló sugárzás lehet nagyenergiájú elektromágneses sugárzás (γ- és X- vagy röntgensugárzás) vagy részecskesugárzás (hélium- vagy α-sugárzás, illetve elektron- vagy β-sugárzás). Az ionizáló sugárzás eredhet természetes radioaktív bomlásból (60Co vagy 137Cs izotopból) vagy elektrongyorsítókból. A radioizotopokból eredő sugárzás energiája 0,6–1,3 MeV lehet, a γ-sugárzásé és az elektrongyorsítókban előállított sugárzásé elérhet jóval nagyobb értéket is, azonban a besugárzásra megengedett energia nem haladhatja meg az 5, illetve 10 MeV-ot, γ-, illetve elektronsugárzás esetén. A behatolóképesség függ a sugárzás természetétől, energiájától és a közeg mibenlététől; az elektromágneses sugárzás energiája vizes közegben 10–25 cm rétegvastagságnál felére csökken, míg az elektronsugárzás 4–5 cm mélységben teljesen elnyelődik. Biológiai hatását tekintve mind az elektromágneses, mind a részecskesugárzás gátolja a sejtek szaporodását, és megfelelő dózisban elpusztítja azokat, ezért alkalmas élelmiszerek tartósítására anélkül, hogy azokban radioaktivitást indukálna vagy káros termékeket képezne. Több mint negyvenéves kutatómunka támasztja alá az ionizáló sugárzás hatékonyságát és alkalmazásának ártalmatlanságát, ennek ellenére a fogyasztói fenntartásokat mindmáig nem sikerült eloszlatni, és a hatósági szabályozás is korlátokat támaszt az élelmiszer-besugárzás elé. Az ionizáló sugárzás hatásmechanizmusa ismert. Részben közvetlenül hat a sejtek életfontosságú alkotóira, a kromoszómákban lévő DNS-re, részben ez a hatás közvetve, a vízmolekulák radiolíziséből keletkező ionok és aktív gyökök (•H, e–, •OH) révén érvényesül. A szervezetek sugárérzékenysége fordítva arányos a genom méretével (DNS-tartalmával), ezért az ember sokkal érzékenyebb, mint a vírusok (5.17. táblázat).
5.17. táblázat - A különböző fejlettségű szervezeteket elpusztító sugárdózisok mértéke Szervezet Ember, emlősállatok
Sugárdózis (kGY)* 0,005–0,1
Rovarok
0,01–1
Vegetatív baktériumok
0,5–10 141
Tartósítási módszerek mikrobiológiája Baktérium-endospórák
10–50
Vírusok
10–200
* Gray (Gy) az abszorbeált sugárdózis SI egysége, 1 J/kg A sugárzás hatékonysága az anyagban elnyelődő (abszorbeált) dózis nagyságától függ. Ennek egysége a Gray (Gy), amely 1 J elnyelt energiát jelent kg-onként (mint SI egység, ez váltotta fel a korábban használt radot, 1 Gy = 100 rad). Az élelmiszer-ipari gyakorlatban használt sugárdózisok nagysága az alkalmazási céltól függ. Termények (pl. burgonya, hagyma) kicsírázásának gátlására mintegy 100 Gy elegendő, néhány száz Gy megfelelő a magvak, fűszerek rovartalanítására és az állati paraziták irtására. A pasztőrözési dózisokat alkalmazó kezelést radurizációnak, a vegetatív mikrobák számát, különösen a patogénekét, lényeges mértékben csökkentő dózisokat radicidációnak, míg a gyakorlatilag steril termékeket eredményező besugárzást radappertizációnak nevezik (5.18. táblázat). A hőkezelés analógiájára az egészségügyi biztonság érdekében megkövetelt sterilező sugárdózis nagyságát a Clostridium botulinum spórák 12 nagyságrendű elpusztításához kell méretezni, ez elérheti az 50 kGy-t is a nem savas (pH > 4,5) termékekben. Mivel a pusztulás nem feltétlenül exponenciális folyamat, a dózis mértéke nem számítható egyszerűen a 12D értékből, hanem a terméktől függően kísérletekkel kell kimérni. A tizedelődési időre azért nem lehet alapozni, mivel a besugárzás hatására bekövetkező exponenciális pusztulást a túlélési görbén általában hosszú „vállszakasz” előzi meg. Az enzimek inaktiválásához is elegendő nagy radappertizáló dózisok a termék érzékszervi (állomány-, íz-) változását okozhatják, amit el lehet kerülni, ha a besugárzást fagyott állapotban végzik és a besugárzást előzetes enyhe hőkezeléssel kombinálják.
5.18. táblázat - Élelmiszerek ionizáló sugárkezelésére alkalmazott dózisok Alkalmazás Csírázásgátlás (magvak, hagymák tárolhatóságának növelése)
Dózis (kGy) 0,05–0,12
Rovartalanítás (magvak, szárítmányok, fűszerek, liszt kezelése)
0,2–0,8
Parazitamentesítés (húsok)
0,15–1,0
Radurizálás (utóérés lassítása, nyers élelmiszerek romlásának gátlása)
0,5–5,0
Radicidálás (vegetatív patogének elpusztítása)
2,0–7,0
(Fűszerek, szárítmányok mikrobaszámának csökkentése)
3,0–10,0
Radappertizálás (kereskedelmileg steril termékek)
25–60
A mikroorganizmusok sugárrezisztenciája a mikroba tulajdonságaitól függően nagyon különböző (5.19. táblázat). Általában a romlást okozó és a patogén Gram-negatív baktériumok érzékenyebbek, mint a Gram-pozitívok, bár kivételek akadnak, mint egyes Moraxella, Acinetobacter és Enterococcus fajok, amelyek megközelítik a baktériumspórák rezisztenciáját. Különösen sugárrezisztensek a Deinococcusok, ami részben sajátos sejtfalszerkezetüknek tulajdonítható, de még inkább annak a rendkívül aktív enzimmechanizmusnak, amely a DNS-töréseket kijavítja. (A DNS egy-egy szálán keletkezett hibákat a Deinococcus radiodurans 3000 törés/s sebességgel tudja kijavítani, ami az E. coliénak százszorosa.) A spórátlan patogén baktériumok közül viszonylag sugártűrők a Listeria és a Salmonellák, tizedelődési idejük kétszer-háromszor nagyobb, mint más kórokozóké. A spórák D értéke általában több mint 1 kGy. Nem látszik összefüggés a hő- és a sugárrezisztencia közt, a hőtűrő G. stearothermophilusnál jóval rezisztensebb a Cl. botulinum A típusa. A gombakonídiumok nem különösebben sugárrezisztensek, 142
Tartósítási módszerek mikrobiológiája bár a többsejtű konídiumok inkább. A Byssochlamys fulva hőrezisztens aszkospórái sugárrezisztensek is. Az élesztők nem tűnnek ki a sugárellenállás tekintetében, D értékük néhány tized kGy, az artrokonídiumos Trichosporon fajoké nagyobb.
5.19. táblázat - Mikroorganizmusok sugártűrése Mikroba
D érték (kGy)
Fagyott húsban
Campylobacter jejunii
0,08–0,16
0,23–0,31
Escherichia coli
0,25–0,38
0,32–0,43
Salmonella enterica
0,45–0,67
0,60–0,80
Moraxella phenolpyruvica
0,62–0,88
Staphylococcus aureus
0,37–0,41
Listeria monocytogenes
0,25–0,64
Enterococcus faecalis
0,65–0,70
Bacillus cereus vegetatív sejtek
0,16–0,21
spórák
1,25–4,0
Clostridium botulinum spórák
1,0–3,2
Clostridium sporogenes spórák
2,8–7,8
Deinococus radiodurans
2,5–3,1
Saccharomyces cerevisiae Trichosporon oryzae Aspergillus niger Alternaria alternata
0,32–0,36 1,2–1,6 0,20–0,25 1,1–2,4
A sugártűrést számos környezeti tényező befolyásolja. Fagypont alatt a rezisztencia jelentősen nő, ami a víz kifagyásával járó aw-csökkenésnek tulajdonítható. A szárítmányok esetében is a kis vízaktivitás miatt kevesebb szabad gyök keletkezhet a vízből, összhangban az ionizáló sugárzás közvetett hatásmechanizmusával. Oxigén és tartósítószerek jelenlétében a besugárzás hatékonysága nő, azonban nem mindegy, hogy ezek a tényezők a besugárzás előtt, alatt vagy után érvényesülnek. A vákuum- vagy módosított légterű csomagolás a besugárzással együtt alkalmazva jelentősen megnöveli az eltarthatósági időt, nem adva lehetőséget a túlélő, de sérült sejtek regenerálódására. A besugárzás eredményesen kombinálható más módszerekkel, mint a hőkezelés, nagy nyomás és mások (lásd az 5.6. fejezetet), amivel a radappertizáló dózisok nagysága csökkenthető, ugyanakkor az egészségügyi biztonság növelhető. 1999-ben számoltak be az ionizáló sugárzás újfajta módjáról, a pulzáló Röntgen-sugarak előállításáról és alkalmazásáról. Lineáris indukciós gyorsítóban létrehozott nagyenergiájú elektronokat nehézfém lemezhez ütköztetve széles spektrumú X-sugárzás keletkezik, amelynek energiája nagyobb, mint a radioaktív γ-sugaraké. Ez 143
Tartósítási módszerek mikrobiológiája a sugárzás rendkívül rövid (nanosec) időtartamú, de sokszorosan, akár ezer pulzus/s ismételhető. Ezzel igen erőteljes mikrobapusztító hatást lehet elérni. A módszer élelmiszer-ipari alkalmazásához további alapozó vizsgálatok szükségesek.
Kémiai tartósítási módszerek Élelmiszerek tartósítására sokféle kémiai anyag szolgál, noha általános tendencia, hogy ezek használatát csökkentik. A kíméletes, minimális és kombinált tartósítási eljárások iránti igény ugyanakkor szükségessé teszi a tartósítószerek, antimikrobás anyagok és egyéb kémiai adalékok további alkalmazását az egészségügyi biztonság és tartósság érdekében. A hagyományos tartósítószerek mellett egyre bővül a természetes antimikrobás anyagok köre, amelyek főként növényekben találhatók vagy mikroorganizmusok termékei. A tartósításra használt vegyületek áttekintését az 5.20. táblázat tartalmazza. Köztük a pH- és a savtartalom beállítására szolgáló erős savakon (sósav, foszforsav) kívül a gyenge szerves savak mind tartósító, mind ízkialakító szerepet játszanak (pl. ecetsav, citromsav), míg mások kifejezetten csak tartósításra szolgálnak (pl. benzoesav, szorbinsav). A gyenge szervetlen savak (kénessav, salétromossav, szénsav) inkább sóik vagy savmaradékok alakjában használatosak. Élelmiszer-tartósításra csak kivételesen használható antibiotikum (natamicin), viszont fokozódik a törekvés a bakteriocinek és más természetes antimikrobás anyagok alkalmazására.
5.20. táblázat - Élelmiszerekben alkalmazott kémiai antimikrobás anyagok Kémiai vegyület
Használat célja
Alkalmazás (példák)
Ecetsav
savasság, pH, ízhatás
savanyúságok,salátaöntetek, majonéz
Citromsav
savasság, ízhatás
üdítőitalok, dzsemek, befőttek
Tejsav
tartósítás
savanyúságok, salátaöntetek
Foszforsav
tartósítás
kóla típusú üdítőitalok
Propionsav
tartósítás
kenyér, sajt
Benzoesav
tartósítás
dzsemek, szószok, gyümölcslevek
Szorbinsav
tartósítás
sajtok, dzsemek, üdítőitalok
Kén-dioxid
antioxidáns, fehérítő
gyümölcspulpok és -levek, borok
Nitrit
színkialakítás, tartósítás
pácolt húsok, sajtok
Szén-dioxid
tartósítás
szabályozott légterű tárolás, csomagolás
Nizin
tartósítás
húskonzervek, sajtok
Natamicin
tartósítás
befőttek
144
Tartósítási módszerek mikrobiológiája
Hatásmechanizmus A kémiai antimikrobás anyagok hatása lehet szaporodásgátló (sztatikus) vagy pusztító (cid). A hatás mértéke sokszor a kémiai anyag koncentrációjától függően változik. Ugyanaz a vegyület kisebb koncentrációban sztatikus, nagyobban cid hatású lehet. A hatékonyság változását a koncentráció függvényében a koncentráció exponens (n) fejezi ki: Cn · t = a, ahol: C – a vegyület koncentrációja, t – pedig az azonos mértékű pusztuláshoz (a) szükséges behatási idő. Ha n = 1, akkor kétszeres koncentráció feleannyi idő alatt hatásos. A koncentráció kitevő értéke gyakran több, mint egy. A nagy koncentrációexponensű vegyületek (pl. alkoholok, fenolok) hatékonysága a hígítással gyorsan csökken. Ha egy adott mértékű pusztuláshoz szükséges időt két koncentrációnál meghatározzuk, akkor a kitevőt meghatározhatjuk:
A tartósítószerként használt különböző vegyületek a mikrobasejtek szerkezetét és működését sokféleképpen befolyásolhatják. Általánosságban a sejtre gyakorolt károsítás helye lehet a sejtfal, a sejtmembrán vagy a citoplazma. A sejtfal kötéseit felszakító hatás következtében a sejtek lízist szenvednek. Egyes fertőtlenítőszerek okozhatnak ilyen erős behatást nagyobb koncentrációkban. A sejtfalszintézis gátlásában rejlik a penicillin baktériumgátló hatása. A tartósítószerként használható enzimek közül a lizozim az, amely a baktériumsejtfal murein kötéseit hidrolizálja; a gombák sejtfalára ható kitináz és glukanáz közvetlen élelmiszer-ipari használatára nincs példa, de az ilyen enzimeket aktívan termelő Trichoderma harzianum gombát más növényi gombaparaziták elleni biológiai védekezésre lehet alkalmazni. A membránszerkezetet támadják meg a fenolos jellegű vegyületek és a felületaktív fertőtlenítőszerek. A szerves sav természetű tartósítószerek hatása részben a membrán alapvető működésének, a transzport folyamatoknak a gátlásával magyarázható, jórészt közvetve, a transzporthoz szükséges energiaforrás, a protongrádiens megszüntetésével. A citoplazmában számos támadáspont jöhet szóba, a különböző anyagcsere-folyamatok és azok enzimeinek gátlásától a riboszómák és a fehérjeszintézis gátlásáig. Számos nagyhatású vegyület, amely pl. mutációt okoz, toxikussága miatt az emberi szervezetre is ártalmas, ezért tartósítószerként nem használható. A hatásmechanizmus felderítésével több korábban használt tartósítószer (pl. szalicilsav, piroszénsav-dietilészter) engedélyezését visszavonták. A mikroorganizmusok nem teljesen védtelenek a tartósítószerekkel szemben. Anyagcseréjük bizonyos mértékig lehetővé teszi a fiziológiai (5,5–6,5 közötti) pHérték fenntartását, a homeosztázis megőrzését, a bejutott protonok aktív kijuttatásával. A különböző stresszhatásokra képződő sokkfehérjék a hirtelen pH-változásra is indukálódnak, és lehetővé teszik a fehérjeszintézis megváltozását a megfelelő válaszreakció kiváltásához. Néhány tartósítószert (benzoesavat, szorbinsavat) egyes mikroorganizmusok képesek lebontani és hatástalanítani. 145
Tartósítási módszerek mikrobiológiája
Szerves sav tartósítószerek Az élelmiszerekben használható tartósítószerek többsége gyenge szerves sav, amelyek általános hatékonysága a pH csökkentésének, specifikus hatása pedig a vegyület kémiai természetének tulajdonítható. A sav természetű vegyületek vizes oldatokban protonokra (H+) és a savnak (HA) megfelelő anionra (A–) disszociálnak. Ennek mértéke a pH-tól és a sav disszociációs állandójától (K) függ (az utóbbit annak negatív logaritmusával, a disszociációs kitevővel – pK – szokás jellemezni). A sav specifikus antimikrobás hatása a disszociálatlan molekulának tulajdonítható, amelynek koncentrációját tehát a közeg pH-ja és a sav disszociációs jellemzője határozza meg. Kis pH-nál a gyenge szerves sav disszociációja visszaszorul, és ezért a tartósítószer gátló hatása erősebb lesz. Azonos pH-nál a kevésbé disszociáló tartósítószer bizonyul erősebb gátló hatásúnak, mivel abból több disszociálatlan molekula marad (5.21. táblázat). A tartósításra használt gyenge szerves savak közül az ecetsav disszociációs állandója a legkisebb, a disszociálatlan vegyületek azonos koncentrációit összevetve viszont a tejsav specifikus hatása miatt erősebb gátlószer.
5.21. táblázat - Gyenge savtermészetű tartósítószerek disszociációja Szerves sav
Disszociációs jellemző K
Ecetsav Tejsav Citromsav Benzoesav Szorbinsav Kén-dioxid
Disszociálatlan rész aránya (%) adott pH-nál
pK
3
4
5
6
7
–5
4,76
98
85
35
5
0,5
–4
3,86
87
39
6
0,6
0,1
–4
3,06
55
18
0,4
0,01
0,001
–5
4,19
94
60
13
2
0,1
–5
4,67
97
82
30
4
0,5
–2
1,77
6
0,6
0,04
0,001
0
1,75·10 1,37·10 8,70·10 6,46·10 1,73·10 1,70·10
Az ecetsavat, tejsavat, citromsavat étkezési savaknak is nevezik, mivel a tartósító hatás mellett használatuk célja az ízkialakítás. Tartósításra egyedül nem is alkalmazhatók, mivel a szükséges koncentrációban (2,5–3,5%) a termék már élvezhetetlenül savanyúvá válik. Széleskörűen használják azonban őket más tartósítószerek és különböző fizikai tartósítási eljárások hatékonyságának növelésére a pH csökkentése révén. A citromsavnak antioxidáns, színjavító tulajdonsága is van. Élesztőgombák (Zygosaccharomyces bailii, Pichia membranifaciens és mások) szaporodnak még több mint 2% savat tartalmazó ecetes készítményekben is; az ecetsavbaktériumok a maguk termelte ecetsavat 10%-os koncentrációban is elviselik. A szerves savak között a tulajdonképpeni tartósítószerek (benzoesav, szorbinsav, hangyasav, propionsav) néhány tized százalékos koncentrációban hatásosak és mentesek az élelmiszerektől idegen íztől, szagtól. Mikrobiológiai hatásspektrumuk nem teljes körű, főleg az élesztő- és penészgombákat gátolják. Oldhatóságuk miatt sóikat alkalmazzák (nátrium-benzoát, kálium-szorbát, kalcium-propionát). Disszociációjuk miatt mikrobagátló hatásuk csak 5-nél kisebb pH-nál erőteljes. A benzoesav származékának, a parahidroxi-benzoesavnak és különösen alkilésztereinek (az ún. parabéneknek) nevezetes tulajdonsága, hogy hatásuk független a pH-tól, nagy disszociációs kitevőjük miatt még pH 7-nél is 97%-ban disszociálatlanok. Hatékonyságuk az alkilcsoport hosszával nő (metil < etil < propil), viszont vízoldhatóságuk csökken. 146
Tartósítási módszerek mikrobiológiája A tartósítószerekkel szembeni elvárások és előírások szigorúak. Az Európai Unió országaiban az alkalmazható koncentrációt a megengedett napi bevitel (ADI) mértékében és a felhasználás lehetősége szerint korlátozzák. Az 5.22. táblázat tartalmazza az ADI értéknek megfelelő maximális koncentrációkat is. Az 5.23. táblázat összefoglalja a tartósítószerek alkalmazási területeit a főbb élelmiszer-féleségek szerint.
5.22. táblázat - Magyarországon engedélyezett tartósítószerek ADI (mg·kg– 1 nap–1)
Koncentráció (%)
Benzoesav sói E210-213
5
0,15
Szorbinsav sói E200-203
25
0,10
Hangyasav
E236
3
0,25
Propionsav
E280
nl*
0,30
Parabének
E214–219
10
0,08
SO2, szulfitok E220–224
0,7
0,20
csak előtartósításra
Nitritek
0,2
0,02
ideiglenesen
Tartósítószer
EU szám
E249,250
Alkalmazhatóság
csak előtartósításra
* nl: nem limitált
5.23. táblázat - Tartósítószerek élelmiszer-ipari alkalmazásai Élelmiszer Húskészítmények
Ecet- HangyaPropionsav Szorbinsav BenzoesavParabén Szulfit Nitrit sav sav –
–
–
+
–
*
*
++
Halak
++
–
–
+
+
+
–
+
Sajtok
–
–
+
++
*
*
–
*
++
+
–
+
++
*
+
–
Gyümölcskészítmények +
+
–
++
++
*
++
–
Üdítőitalok
–
+
–
++
++
*
++
–
Borok
–
–
–
++
–
–
++
–
Pékáruk
–
–
++
++
–
–
–
–
Zöldségkészítmények
147
Tartósítási módszerek mikrobiológiája Sütemények
–
–
–
++
*
+
–
–
+ esetenként használt, ++ gyakran használt, * kivételesen használt, – nem használt
Szervetlen tartósítószerek A szén-dioxidot hatalmas mennyiségben használják üdítőitalok dúsítására és élvezeti értékének növelésére. Tartósító hatása kevésbé kerül előtérbe, pedig a széndioxid általánosan gátolja a mikroorganizmusok szaporodását, megnyújtva a lappangási szakaszt és a generációs időt. Hatását többnyire az oxigén kiszorításának tulajdonítják, és valóban ezt hasznosítják a szabályozott légterű tárolásnál és a módosított légterű csomagolásnál. A pH-csökkentésen kívül a szén-dioxidnak sokféle specifikus hatását is leírták, különösen a dekarboxiláz és más enzimek gátlásával. A bizonytalanság részben abból ered, hogy a szén-dioxid az italokban, élelmiszerekben különböző alakban fordulhat elő, a pH-tól, hőmérséklettől és nyomástól függően. A szén-dioxid-gáz jól oldódik vízben és pH 5 alatt főként így található, szénsav (H2CO3) csak néhány százalékban képződik. Lúgos pH-n megkezdődik a szénsav disszociációja bikarbonátanionra és hidrogénionokra, míg karbonátion csak pH 11 felett jön létre (5.7. ábra). A CO2-gáz-oldhatósága a hőmérséklet csökkenésével és a nyomás növelésével fokozódik.
5.7. ábra - A szén-dioxid, a karbonát- és a bikarbonátionok aránya vizes oldatban a pH függvényében
148
Tartósítási módszerek mikrobiológiája A szén-dioxid kritikus hőmérséklete csak 31 °C, kritikus nyomása pedig 7300 kPa, ezért könnyen cseppfolyósítható, illetve szilárd hóvá alakítható (ennek hőmérséklete –60 °C). Mint szuperkritikus folyadék, kiváló oldószer, ennek tulajdonítható, hogy viszonylag kis nyomáson (10–20 MPa) is jelentős mikrobapusztítást gyakorol. Ez kínálkozó lehetőség a hőérzékeny élelmiszerek kíméletes sterilezésére. A szénsavas üdítőitalokat szén-dioxiddal telítik, dúsítják, a szén-dioxid-gáz fő alkalmazási területe azonban a szabályozott légterű tárolás (lásd az 5.6. pontban). A foszforsav csak kivételesen használható a kóla típusú italokban. A kén-dioxid antimikrobás hatásán kívül antioxidánsként és redukálószerként is használatos. Antimikrobás hatása főként penész- és élesztőgombákra terjed ki. Bár többnyire szulfit-, biszulfit- vagy metabiszulfit sói formájában alkalmazzák, a mikrobagátló hatást főleg csak szabad, nem ionos, vízben oldott molekulái fejtik ki. A különböző alakok aránya erősen függ a pH-tól, szabad kén-dioxid jórészt csak pH 4-nél kisebb értékeknél található (5.8. ábra). Az élelmiszerek különböző összetevői, cukrok, szerves savak, fehérjék, különösen ezek aldehid- és tiol-csoportjai az SO2 jelentős hányadát megkötik. Borok tartósításához 30–70 mgl–1 szabad kén-dioxid-koncentráció szükséges, gyümölcslevek és gyümölcs féltermékek (pulpok, velők) átmeneti tartósításához pedig még több. A gyümölcslevek és pulpok továbbfelfolgozása, besűrítése folyamán a kén-dioxid eltávozik.
5.8. ábra - A kén-dioxid, a biszulfit- és a szulfitionok aránya a pH függvényében
A nitrit alkalmazása ellentmondásos. Miután a nitrátsókat nátrium-kloriddal együtt évszázadok óta használták húsok pácolására (a pácfolyadékban elszaporodott mikrobák a nitrátot nitritté redukálták), az 1960-as években fény derült arra, hogy szekunder aminokkal reagálva a nitrit rákkelető nitrozaminokat képezhet. Mivel ugyanakkor a nitrit a mioglobinnal is reagál és a húsok jellegzetes rózsaszín-vörös színének a megőrzéséhez nélkülözhetetlen, alkalmazását nem lehet kiküszöbölni. A nitritnek továbbá antimikrobás hatása is van, különösen erősen gátolja a Clostridiumok spóráinak kihajtását. Így egyrészt hozzájárul a húskészítmények egészségügyi biztonságához, másrészt esetleges karcinogenitása egészségügyi kockázatot jelent. Amíg a nitrit kiváltására más anyagot nem sikerül találni, használata továbbra is engedélyezett, de szigorú határokhoz között (legfeljebb 200 mg · kg–1). A nitrit csökkentésére irányuló törekvések közül ígéretes együttes alkalmazása 149
Tartósítási módszerek mikrobiológiája aszkorbinsavval vagy a tejsavbaktériumok (pl. Pediococcus acidilactici) által erjeszthető cukorral, amely kombináció gátolni képes a Clostridium botulinum spóráinak kihajtását.
Természetes antimikrobás anyagok A természetben számos olyan antimikrobás anyag vagy tényező fordul elő, amelyek a mikrobák szaporodását gátolják. Ezek közvetlen felhasználása az élelmiszer-tartósításban lehetőséget teremthet az új fogyasztói igények kielégítésére az egészségesebb élelmiszerek iránt, amelyek nem tartalmaznak mesterséges adalékanyagokat, tartósítószereket. Alkalmazásuk az eltarthatósági időt meghosszabbíthatja, ugyanakkor azonban számos nehézséget rejt magában. Problémát okozhat izolálásuk, tisztításuk, stabilizálásuk és használatuk anélkül, hogy az élelmiszer érzékszervi, táplálkozás-élettani vagy biztonsági tulajdonságait hátrányosan befolyásolnák. A természetes biológiai antimikrobás anyagok forrásuk szerint lehetnek: – állati eredetű antimikrobás anyagok, – a magasabb rendű növényekben képződő anyagok, – a mikroorganizmusok által termelt anyagok. A természetes antimikrobás hatású rendszerek (5.24. táblázat) egy része a termelő szervezetek állandóan, aktív állapotban jelen levő alkotója. Mások ún. indukálható anyagok, amelyek a szervezetben bizonyos inger (pl. sérülés, fertőzés) hatására képződnek.
5.24. táblázat - A természetben előforduló főbb antimikrobás rendszerek Kategória
Eredet
Állatok – állandó alkotók
fagoszómák
mieloperoxidáz
szérum
transzferrinek
tej
laktoperoxidáz, laktoferrin
tojás
lizozim, ovotranszferrin (konalbumin), avidin
immunrendszer
antitestek, komplementek
békák
magaininek
rovarok
abaecin, apidaecin, attacinek, cecropinek, coeoptericinek, defenzinek, diptericinek, royalizin
Állatok – indukálható rendszerek
Példa
150
Tartósítási módszerek mikrobiológiája Növények – állandó alkotók
gyógynövények, fűszerek és más növények
Növények – fertőzött vagy indukálható rendszerek sérült növények Mikroorganizmusok
eugenol (szegfűszeg) allicin (fokhagyma), allil-izotiocianát (mustár), oleoeuropein (oliva) kis mol.tömegű fitoalexinek nagy moltömegű polifenolok
tejsavbaktériumok nizin, pediocin és más bakteriocinek más antibiotikumok (natamicin/pimaricin, mikroorganizmusoksubtilin), bakteriofágok, élesző killer toxinok, szerves savak és más kis mol.tömegű metabolitok
Bár számos természetes antimikrobás rendszert ismerünk, eddig csupán nagyon keveset alkalmaznak széles körben. Az állati eredetű antimikrobás anyagok közül a gyakorlati felhasználás szempontjából a legnagyobb jelentőségű a lizozim. Bár ez a fehérje több testfolyadékban is megtalálható, legfőbb forrása (szárazanyagának 3,5%-a) a tojásfehérje. A muramidáz enzimként működő lizozim az (elsősorban Gram-pozitív) baktériumok sejtfalát támadja meg, a peptidoglükán N-acetil muraminsav és N-acetil glükózamin közötti glükozid kötéseinek hidrolízisét katalizálva. Az enzim hőstabil kis pH-jú (< 5,3) közegekben, aktivitását rövid időtartamú főzés után még pH 3-nál is megtartja. Nagyobb pH-jú élelmiszerekben azonban hőérzékennyé válik, könnyen inaktiválódik. A lizozim baktériumgátló hatását először Bacillus fajok, majd Sta. aureus esetében mutatták ki. Irodalmi adatok szerint az enzim gátolja a Cl. botulinum, a Cl. thermosaccharolyticum, a Cl. tyrobutyricum, a Geobacillus stearothermophilus, a B. cereus, a Micrococcus lysodeiktus és a Li. monocytogenes szaporodását. Az enzim hatásspektruma szélesebbé tehető többek között kelátképző anyaggal (pl. EDTA) való előkezeléssel, ami a Gram-negatív baktériumokat érzékenyebbé teszi a lizozim hatásával szemben. A kelátképző anyag Mg2+-vesztést okoz a sejtmembránban. Kombinált kezeléssel tejben vagy baromfi felületén Sa. Typhimurium vagy Ps. fluorescens gátlását mutatták ki. Ipari felhasználása engedélyezett az EU-ban sajtok Cl. tyrobutiricum okozta vajsavas puffadásának megakadályozására. Japánban tengeri halak és kagylók, zöldségek, pástétomok és saláták természetes tartósítására alkalmazzák. A laktoperoxidáz enzim nyers tejben, kolosztrumban (föcstej), nyálban, továbbá más testnedvekben és szövetekben található, ahol a szervezet természetes védekező mechanizmusában játszik szerepet. Az enzim glükoprotein, egy hem csoporttal, amely Fe3+-t tartalmaz. Molekulatömege 78 000 Da, 610 aminosavat tartalmaz. A tehéntejben 10–60 mg laktoperoxidáz található literenként. Az enzim hidrogén-peroxid jelenlétében tiocianáttal (SCN–) reagálva hipotiocianitot (OSCN–) és antimikrobás anyagokat képez. A glükozinolátok lebontásából származó tiocianát általában megtalálható váladékokban. A friss tej 1–10 mg tiocianátot tartalmaz, ami nem mindig elegendő a laktoperoxidáz rendszer (LPS) aktiválásához. Feldolgozott élelmiszerek esetén szükség lehet tiocianát és hidrogén-peroxid mesterséges hozzáadására. A H2O2 és SCN– optimális koncentrációja 8 és 12 mg/l. Ennek alkalmazásával trópusi és szubtrópusi országokban, ahol a hűtőszállítás a farm és a tejüzem között nem oldható meg, a tej eltarthatósági idejének jelentős növelését érték el. Az LPS általában nem hatékony a baktériumspórák, valamint a legtöbb élesztő- és penészgomba ellen. A Gram-negatív baktériumok – beleértve a pseudomonasokat is – eredményesebben gátolhatók, mint a Gram-pozitív baktériumok. Számos fontos, ételmérgezést okozó vegetatív baktérium (Listeria, Staphylococcus, Campylobacter, Salmonella-típusok, B. cereus) és néhány élesztőgomba esetében szaporodásgátló vagy ölő hatást figyeltek meg.
151
Tartósítási módszerek mikrobiológiája Természetes tartósítószerként működő, vaskötő fehérjék találhatók a tejben és a tojásban. A tejben lévő laktoferrin vagy a tojásban lévő ovotranszferrin széles hatásspektrumú, nagy mennyiségben megtalálható vegyület. A Fe3+-iont olyan erősen megkötik, hogy a vasat kis mennyiségben tartalmazó közegekben (vérszérum vagy tojásfehérje) gátolják a mikrobák szaporodását. A tojásból vagy tejből kivont transzferrinek kereskedelmi forgalomban is kaphatók. Gátló hatást mutattak ki B. subtilis, Geobacillus stearothermophilus, Li. monocytogenes, Micrococcus fajok, E. coli és Klebsiella fajok esetében. A Gram-pozitív baktériumok általában érzékenyebbek, mint a Gram-negatív baktériumok. A hatásmechanizmus lényege valószínűleg a vas megkötése, a szaporodásukhoz vasat igénylő mikrobák számára kedvezőtlen körülményeket létrehozva. Olaszországban iparilag alkalmazzák a mozzarella sajtok gyártásánál a Li. monocytogenes szaporodásának gátlására. A kitozán (β-1,4-N-acetilglükózamin polimer) a gombák sejtfalának természetes összetevője. A kereskedelemben kapható készítményeket a kagylófeldolgozás melléktermékeként keletkező kitinből állítják elő lúgos diacetilezéssel. A kitozán a glükózamint és N-acetil glükózamint különböző arányban tartalmazó polimerek általánosan használt elnevezése. A kitozán gátló hatását számos, élelmiszer eredetű penész- és élesztőgombára, valamint baktériumra (A. flavus, S. cerevisiae, Zyg. bailii, Mucor racemosus, Byssochlamys spp., Botrytis cinerea, Rhizopus stolonifer, Salmonella, Sta. aureus, E. coli, Y. enterocolitica, Li. monocytogenes és Lb. fructivorans) kimutatták. A kitozán közvetlenül a mikrobasejtet károsítja oly módon, hogy a pozitív töltésű kitozánmolekulák a negatív töltésű citoplazma membránnal kölcsönhatásba lépve a membrán permeabilitásának megváltozását, a transzportfolyamatok zavarát eredményezik. A kitozán kelátképzőként is működik, amely szelektíven kötődik nyomelemekhez, ezáltal gátolva a mikrobák szaporodását és toxinképzését. A minimális gátló koncentráció nagyon széles tartományban (0,01–5,0%) mozog, a polimer tulajdonságaitól, a pH-tól, hőmérséklettől és a gátló hatást befolyásoló anyagok (fehérjék, zsírok) jelenlététől függően. Természetes eredetű tartósítószerként a gyümölcsök és zöldségek tárolási megbetegedését okozó penészgombák gátlásában értek el ígéretes eredményeket. Kis pHjú élelmiszerekben, gyümölcslevekben (pl. almalé) a romlást okozó élesztőgombák is sikeresen gátolhatók. Irodalmi adatok szerint több mint 1340 növény lehet természetes antimikrobás anyagok forrása. Az élelmiszereink ízesítésére használt fűszerek és illóolajaik antimikrobás hatása ősidők óta ismert. A legkorábbi írásos bizonyíték a fűszerek tartósítószerként való alkalmazására időszámításunk előtt 1550-ből való. Már az ókori egyiptomiak fűszereket használtak az élelmiszerek tartósítására és a halottak balzsamozására. A fűszerek lehetnek gyökerek, kérgek, magvak, rügyek, levelek vagy aromás növények gyümölcsei. A legerősebb antimikrobás hatással rendelkező fűszer a szegfűszeg, a fahéj, az oregano (vadmajoránna) és a kakukkfű, illetve kissé enyhébb hatású a zsálya és a rozmaring. A növények antimikrobás anyagai többnyire az illóolajokban találhatók. Kinyerésük vízgőz-desztillációval, illetve száraz- vagy vákuumdesztillációval történik. Az illóolajok illatos vegyületeket tartalmaznak, alkoholban jól, vízben gyengén oldódnak; észterek, aldehidek, ketonok és terpének keverékei. Fontos megjegyezni, hogy az oldószer (pl. etanol, etilén-klorid) is szerepet játszhat a gátló hatásban. A szegfűszeg és a fahéj fő antimikrobás hatóanyaga az eugenol és a fahéjaldehid (5.9. ábra). Az oregano- és a kakukkfű-illóolaj antimikrobás hatása terpénvegyületeiknek, a karvakrolnak és a timolnak köszönhető. Ezek a komponensek számos baktérium, penész- és élesztőgomba szaporodását gátolják.
152
Tartósítási módszerek mikrobiológiája
5.9. ábra - A fűszerek főbb antimikrobás vegyületei
A Gram-pozitív baktériumok általában érzékenyebbek a fűszerek antimikrobás anyagaival szemben, mint a Gram-negatívak. Az alkalmazott hatóanyagtól függően, a Gram-negatív baktériumok között is eltérő érzékenységet mutattak ki. A Sa. Typhimurium például ellenállóbbnak bizonyult a Ps. aeruginosánál zsályakivonattal kezelve, míg érzékenyebb volt oregano- vagy kakukkfű-illóolaj esetén. A magasabb rendű növényekben található antimikrobás anyagok a fitoncidok. A több százféle vegyület a növények biológiai védelmét szolgálja. Kémiai szerkezete szerint igen sokféle vegyület kapta ezt a gyűjtőnevet, többségük az illóolajokhoz, a mustárolajokhoz és a glikozidokhoz tartozik. A legismertebbek a fokhagymából és a vöröshagymából kimutatott bakteriosztatikus hatású kénvegyületek (allicin, garlicin, allisztatin). Az allicin (diallil-tioszulfinsav) hatásmechanizmusa régóta ismert. Kimutatták, hogy az enzimek szulfhidril csoportjait köti le, ezáltal inaktiválva azokat. Széles hatásspektrumú, számos mikroorganizmus szaporodását és toxinképzését gátolja (B. cereus, Cl. botulinum, E. coli, Lb. plantarum, szalmonellák, sigellák, Sta. aureus, Aspergillus és Penicillium fajok, Saccharomyces és Rhodotorula fajok). A paradicsom tomatinja és tomatidinje (alkaloidok), a sörbe is átkerülő komlókeserűsavak (humulon és lupulon), a retekből izolált rafanin, a fűszerpaprika kapszicidinje szintén fitoncid vegyületek. Egyéb, nem fűszerként használt növényi élelmiszerek vagy kivonatok antimikrobás hatása is ismert. Kísérletekkel bizonyított például a nyers sárgarépalé Li. monocytogenest és más Listeria fajokat gátló hatása. A fitoalexinek olyan vegyületek, amelyeket bizonyos növényi részek a parazita mikroorganizmus behatolásakor képeznek. Ilyenek pl. a burgonyagumók által képzett risitin, lubimin és szolavetivon, a borsó pizatinja. A kémiai szerkezetüket tekintve fenolos vegyületek közé tartozó izoflavonoid fitoalexinek főként gombák ellen hatékonyak. A baktériumok közül a Gram-pozitív baktériumok érzékenyebbek, mint a Gram-negatívak. A zöldségekben és gyümölcsökben előforduló, illetve erjesztésüknél keletkező szerves savak és sóik régóta ismertek az élelmiszer-tartósításban (lásd 5.5.2.). A citromsav elsősorban a citrusfélékben, a borostyánkősav a spárgában, brokkoliban, cukorrépában, rebarbarában fordul elő. Az almasav számos gyümölcs és zöldség 153
Tartósítási módszerek mikrobiológiája alkotórésze, a borkősav szőlőben, ananászban található. A benzoesav, az egyik legrégebben és széleskörűen használt tartósítószer, természetes forrása a tőzegáfonya, a málna, a szilva, a fahéj és a szegfűszeg. A mikroorganizmusok által termelt antibiotikumok élelmiszer-ipari felhasználása erősen korlátozott. Mivel felmerülhet az antibiotikum-rezisztens mikroorganizmusok elszaporodásának, valamint keresztrezisztencia indukálásának veszélye, csak azok az antibiotikumok használhatók fel, amelyeket a gyógyászatban nem alkalmaznak. A natamicin (pimaricin, tennecitin, mycoprozine) gombaellenes hatású, polién vegyület, amely széles pH-tartományban (pH 3–9) hatékony. A Streptomyces natalensis által termelt antimikrobás anyag élelmiszer-ipari felhasználását keménysajtok és szalámifélék felületi penészedésének megakadályozása céljából engedélyezték az EU-ban is. A natamicin a penészgombák szaporodását 1 és 20 ppm közötti koncentrációban gátolja, ezekben az alkalmazásokban a szorbinsav alternatívájaként használható, lényegesen nagyobb hatékonysággal. A bakteriocinek bakteriosztatikus vagy baktericid hatású, fehérje természetű, általában szűk hatásspektrumú vegyületek. Gratia izolálta elsőként 1925-ben az E. coli által termelt antimikrobás hatású anyagot, a colicint. Későbbi kutatások során derült ki, hogy elsősorban a tejsavbaktériumok, de más Gram-pozitív és Gramnegatív baktériumok is termelnek a colicinhez hasonló antimikrobás anyagokat, amelyek közös elnevezése a bakteriocin. Kémiai felépítésük szerint a bakteriocinek három csoportja különböztethető meg: I. a kis méretű, lantionint és ß-metillantionint tartalmazó bakteriocinek (pl. nizin, lactocin S), II. lantionint nem tartalmazó, kis méretű, hőstabil peptidek (pl. sakacin A, lactacin F, lactococcin A és B, pediocin PA–1), III. nagy méretű, hőre érzékeny peptidek (pl. heveticin J). A lantibiotikumok (lantionint tartalmazó módosított peptidek) csoportjába tartozó nizin az EU-ban és az Egyesült Államokban is GRAS (Generally Regarded As Safe, általánosan biztonságosnak tekintett) minősítést kapott, engedélyezett tartósítószer. A Lactococcus lactis által termelt polipeptid 34 aminosav egységből épül fel, végein amino-, illetve karboxil-csoport található, belső szerkezete öt lantionin gyűrűt tartalmaz, amelyet tioéter kötések alakítanak ki. Nagy stabilitást mutat magas hőmérsékleten és alacsony pH-n, különösen pH 3–4 tartományban. A nizin antibakteriális hatását elsősorban a Gram-pozitív baktériumokra fejti ki (Staphylococcus, Streptococcus, Micrococcus és Lactobacillus fajok), különösen a spóraképzőkre (Clostridium és Bacillus fajok spórái), míg a Gram-negatív baktériumokkal, élesztőkkel és fonalasgombákkal szemben csak kevésbé vagy egyáltalán nem hatásos. Az érzékeny sejteknél a hozzáadást követő néhány percen belül a sejt pusztulását okozza úgy, hogy a citoplazmamembránon pórusokat képez, amelyeken keresztül a kismolekulájú anyagok kiáramlanak a sejtből. Bizonyított az is, hogy a nizin az elektrontranszport láncban az oxigén felvételét gátolja, a megtámadott sejt nem képes a makromolekulák szintéziséhez szükséges energia termelésére. A nizint tejtermékekben a Cl. botulinum spórák, valamint a sajtok késői puffadását okozó Cl. butyricum és Cl. tyrobutyricum spórák gátlására világszerte sikeresen alkalmazzák. Gátolja a klosztridiumspórák csírázását mind a kis savtartalmú, mind pedig a 4,5-nél nagyobb pH-jú konzervipari termékekben. Gyakorlati alkalmazásával találkozunk zöldségkonzervek (sárgarépa püré, bébiételek, gomba, zöldbab és zöldborsó), pasztőrözött sonka, kolbászok, spagetti- és makarónikonzervek előállításánál. Bakteriocintermelő tenyészetek hozzáadása a nem fermentált termékekhez, illetve ilyen starterkultúrák felhasználása a fermentált élelmiszereknél elősegíti az élelmiszer-biztonság és -minőség javítását. A húsipari termékeknél fontos patogén baktérium, a Li. monocytogenes szaporodását sikeresen gátolták pediocintermelő starterkultúrákkal fermentált húskészítményekben, valamint sakacin A hozzáadásával pasztőrözött marhahúsban. Az élesztőgombák egy része más élesztőtörzsekre letális hatású anyagot, zimocint (ún. killer toxint) termel. A specifikus, fehérje természetű anyagot először S. cerevisiae esetében mutatták ki 1963-ban, azóta azonban számos más, laboratóriumi vagy ipari körülmények között izolált, esetenként klinikai jelentőségű élesztőfaj 154
Tartósítási módszerek mikrobiológiája killertoxin-képzését is leírták. A killer tulajdonságot egyes törzseknél kettős szálú RNS- (dsRNS-)plazmidok vírusszerű partikulumokhoz (VLP) kötötten, míg másoknál DNS-plazmidok vagy sejtmagi kromoszómák hordozzák. A killer toxinok többnyire instabilak nagy hőmérsékleten és pH-n. Hatásmechanizmusukra jellemző, hogy a citoplazmamembrán protonáteresztő képességét változtatják meg, gátolják a DNS-szintézist, illetve a sejtosztódást. Killer toxinokat nem csupán a sörök és borok erjesztésénél mutattak ki, hanem olyan fermentált élelmiszereknél is, mint a szójaszósz vagy a fermentált zöldségek. Gyakorlati alkalmazásuk söripari, boripari startereknél lehetséges, ahol killer tulajdonságú fajélesztőkkel gátolhatók a romlást okozó vadélesztők. Széles körű élelmiszer-ipari használatuk szűk hatásspekrumuk miatt azonban nem várható. A természetes antimikrobás anyagok hatékonyságának elsősorban kvalitatív vizsgálatára a leggyakrabban az agardiffúziós módszert alkalmazzák. A tesztmikrobával beoltott, lágyagarból készített agarlemezre gátlóanyaggal átitatott korongokat helyeznek, vagy az agarban képzett lyukakba adagolják az antimikrobás anyagot. A gátlóanyag az agarba diffundál, gradienst képezve, ami fordítottan arányos a korongtól, illetve a lyuktól mért távolsággal. A korong (lyuk) körül megjelenő gátlási zóna (nincs mikrobaszaporodás) átmérője az anyag diffúziós tulajdonságainak és a mikrobaszaporodásnak a függvénye. A minimális gátló koncentráció (MIC) meghatározására általában hígításos módszert használnak. MIC-nek tekintjük az antimikrobás anyagnak azt a legkisebb koncentrációját, amely a vizsgált mikroorganizmus szaporodását meghatározott inkubációs ideig gátolja. Számos laboratóriumi kísérletben bizonyították a természetes eredetű antimikrobás anyagok hatékonyságát, gyakorlati alkalmazásukra az élelmiszeriparban eddig azonban kevés példát láthatunk. Ennek egyik oka, hogy a szükséges mikrobagátló koncentráció élelmiszerekben nagyobb, mint laboratóriumi tápközegben. Az élelmiszer fehérjéi megköthetik a hatékony komponenst, vagy az élelmiszer zsír fázisába oldódhatnak, ezzel csökkentve a gátló hatékonyságot. Hátrányos a fenolos anyagok és illóolajok erős illata, ami miatt csak bizonyos élelmiszerekben alkalmazhatók. További kutatásokra van szükség a hatásspektrumuk, mechanizmusuk, a környezeti tényezők és élelmiszer-komponensek kölcsönhatásának pontos felderítésére. Széles körű bevezetésük engedélyezéséhez szükség van veszélytelenségüket bizonyító toxikológiai vizsgálatokra is.
Kombinált tartósítás A gyakorlatban valójában aligha fordul elő, hogy bármely tartósító hatás önmagában, a környezeti tényezők befolyása nélkül érvényesül. Mint láttuk, pl. a hőkezelés eredményességét jelentősen fokozza a kis pH, viszont csökkenti a kis aw. A fagyasztásnál az alacsony hőmérséklet együtt jár a vízaktivitás csökkentésével. Kombinált tartósításnak azokat az eljárásokat tekintjük, amelyeknél két vagy több tényezőt együttesen alkalmazunk olyan koncentrációkban, amelyek külön-külön csak részleges mikrobagátlást fejtenének ki, de együttesen teljesebb gátlást, biztonságosabb tartósságot eredményeznek. A kíméletesebb behatás egyúttal a termék természetes jellemzőinek, érzékszervi tulajdonságainak jobb megőrzését is lehetővé teszi, továbbá gazdaságos, energiát takarít meg. A módszerek kombinálásával nemcsak új tartósítási eljárások alakíthatók ki, hanem új termékek is.
A „gát elv” A kombinált tartósítás ún. gát elvét az 1980-as években Lothar Leistner vezette be, előbb különböző húskészítményekre alkalmazva, később kiterjesztve az élelmiszerek széles körére. A gát hasonlat szerint a mikroorganizmusoknak több tartósító tényező gátján kell átjutni ahhoz, hogy a termékben elszaporodjanak vagy életben maradjanak (5.10. ábra). Ahogy az 1.2.4. pontban már rámutattunk, mint minden hasonlat, ez is sántít annyiban, hogy a gátló tényezők nem egymás után, hanem egyidejűleg érvényesülnek, és kedvező esetben hatásuk nemcsak összegeződik, hanem egymást fel is erősíti, szinergens. 155
Tartósítási módszerek mikrobiológiája
5.10. ábra - A kombinált tartósítás „gát-elve”. F: nagy hőmérséklet, t: hűtés, aw: vízaktivitás, pH: savasság, Eh: redoxpotenciál, Pr: tartósítószer, Km: vetélkedő mikrobiota; az 1–6. esetek leírását lásd a szövegben
Az 5.10. ábra első esete hat, azonos mértékű antimikrobás „gátat” mutat, amelyen a mikrobák végül nem tudnak átjutni. Ezzel az elméleti példával szemben a valóságban az egyik vagy másik gát erőssége jóval nagyobb a többinél (2. példa), és a különböző mikrobák érzékenységük szerint előbb vagy utóbb gátlódnak. Ha valamely tényező a mikrobákban szubletális sérülést okoz, kevesebb vagy gyengébb kombináció is eredményes lehet (3. példa). A gátló tényezők szinergens hatását érzékelteti a 4. példa, míg a valós helyzetet leginkább az 5. példa mutatja be, amikor is az enyhébb antimikrobás hatások együtt építenek fel egy olyan erős gátat, amelyet a mikrobák már nem tudnak áttörni. Ez a helyzet pl. a szalámifélék érlelésénél, amikor a nitritet tartalmazó pácsó gátolja a baktériumok egy részét (klosztridiumokat, szalmonellákat), más mikroorganiumusok tovább szaporodva csökkentik a redoxpotenciált, ami kedvez a vetélkedő mikrobák, különösen a tejsavbaktériumok elszaporodásának, amelyek erjesztése pedig csökkenti a pH-t, miközben a termék száradása közben az aw csökken, és végső eredményként tartós termék jön létre (6. példa). Az előző fejezetekben az ökológiai tényezők kombinált tartósító hatásának számos példáját láthattuk az eddig említetteken túl. A törekvés az erős fizikai behatások mérséklésére és a felhasznált kémiai tartósítószerek csökkentésére irányul. A sterilezést enyhébb hőkezelés, pasztőrözés válthatja fel, ha az kis pH-n történik, ami erősíti a mikrobák pusztulását, a túlélő spórák pedig nem hajtanak ki. A pasztőrözés kombinálható a hőre érzékenyítő antimikrobás vegyülettel (nizin, nitrát) is. 156
Tartósítási módszerek mikrobiológiája A besugárzási dózis csökkenthető, ha a radurizálást enyhe hőkezelés vagy hűtés követi. A kisebb dózisú (< 10 kGy) besugárzás hatására érzékenyített spórák már pasztőrözési hőmérsékleten elpusztíthatók. A tartósítószerek hatékonyságát megsokszorozza, és a szükséges koncentrációt csökkenti, ha alkalmazásukra kis pH-jú vagy kis vízaktivitású termékben kerül sor. Mint a következő fejezetben látni fogjuk, az újabb, nem hőkezeléssel járó fizikai tartósító módszerek is eredményesen kombinálhatók hagyományos eljárásokkal, mint pl. a nagy nyomás enyhe hőkezeléssel vagy ultrahanggal. A módszerek kombinációjából született új tartósítási eljárások klasszikus példája a fagyasztva szárítás (liofilezés). Ilyen kombináció a szabályozott légterű tárolás és a módosított légterű csomagolás is. A módszerek kombinációjával tartósított újfajta termékek pedig a közepes víztartalmú élelmiszerek, a hűtés nélkül tartós húskészítmények és a csomagban hőkezelt, majd hűtött, közvetlenül fogyasztható termékek. Ezeket tekintjük át az alábbiakban.
Szabályozott légterű tárolás Gyümölcsök és zöldségek eltarthatósága jelentősen meghosszabbodik, ha a termékeket csökkentett oxigéntartalmú és/vagy növelt szén-dioxid-tartalmú légtérben, hűtve tárolják. E tényezők kombinálása igen eredményes és két szempontból is előnyös: egyrészt gátolja a betárolt termények szöveti légzését és lassítja a kényszerérésüket, másrészt gátolja a romlást okozó mikrobák szaporodását. A különböző gyümölcsök és zöldségek érzékenysége a tárolás hőmérsékletére és a tárolótér levegőjének összetételére jelentősen eltér. Az almafélék pl. jóval kisebb (1–3 °C) hőmérsékleten tárolhatók, mint sok más gyümölcs. A mikrobaszaporodást a kis hőmérséklet lassítja, ezt a hatást a további külső ökológiai tényezők kedvezőtlen értékei csak fokozzák. A romlást okozó mikroorganizmusok közül a gyümölcsökre és zöldségekre különösen veszélyes aerob baktériumok és penészgombák szaporodása gátlódik a redukált oxigéntartalom következtében.
Módosított légterű csomagolás Friss és minimálisan feldolgozott gyümölcsök és zöldségek, valamint húskészítmények egyaránt tárolhatók módosított légterű csomagolásban, hűtéssel. A csomagon belüli légtér módosítása történhet aktív vagy passzív módon. A levegő nagy része vákuummal eltávolítható, vagy az oxigén gázabszorbensekkel leköthető. A légtér passzív módon a csomagolt termék és a rajta lévő mikroorganizmusok légzése folytán módosul. A zöldségek és gyümölcsök minimális feldolgozása csak válogatást, tisztítást, mosást, esetleg darabolást, szeletelést jelent. A barnulás megakadályozására a mosóvízbe redukáló anyagot (szulfit, citromsav, aszkorbinsav) tesznek, olykor tartósítószert (káliumszorbátot) is alkalmaznak. A csomagolóanyag kis mértékben permeábilis, hogy a gázcserét és a légzést csökkentett mértékben lehetővé tegye. A módosított légtérben csak 2–5% O2 és hasonló arányú, 2–5% CO2 van. A nem teljes anaerobiózis a klosztridiumok szaporodásának elkerülését szolgálja. A módosított légterű csomagolásban, 10–15 °C-os, enyhe hűtéssel a gyümölcsök és zöldségek friss állapotban mintegy két hétig eltarthatók. A vákuumcsomagolást konyhakész friss húsok, vagy többnyire közvetlenül fogyasztható húskészítmények hűtéssel kombinált tárolására használják. A mintegy 40 kPa mértékű vákuumozás után a csomagolóanyagot légmentesen lezárják. A hűtés 4–7 °C-on történik. Zöldségek csomagolása esetén gondoskodni kell a képződő etilén lekötéséről. A csomagon belüli légtér kedvez a fakultatív anaerob baktériumok és az aerotoleráns anaerob tejsavbaktériumok szaporodásának; az utóbbiak tejsavas erjesztése és bakteriocin termelése más mikrobákkal szemben kompetitív gátló hatású. Itt említhető az ehető csomagolóanyagok alkalmazása is. Ezek közül a szacharóz és zsírsavpoliészter, a nátrium-karboximetilcellulóz, a karragén és a kitozán ígérkeznek megfelelőnek. 157
Tartósítási módszerek mikrobiológiája
Kombinált módszerrel tartósított, újszerű termékek Ezek körében a hűtés nélkül eltartható különböző húskészítmények voltak a gáttechnológia alkalmazásának első eredményei. Leistner ezeket „polcálló termékeknek” nevezte, angol nevükből az SSP rövidítés terjedt el. Attól függően, hogy eltarthatóságukat döntő részben a főzés (csak Fo = 0,4 mértékű hőkezelés), a csökkentett vízaktivitás (aw < 0,95), a kis pH (< 4,5) vagy ezek kombinációja biztosítja, amihez terméktípus szerint füstölés, nitrites pácsó és hűtés társul, a különböző töltelékes húsárukat, kolbász- és szalámiféléket, hurkaféléket és egyéb húskészítményeket F-SSP, aw-SSP, pH-SSP vagy combi-SSP típusokba sorolják. Franciaországból indult ki és más európai országokban is eltejedt a vákuumcsomagolt, hőkezelt majd hűtéssel tárolt ún. sous-vide termékek típusa. Ezek közvetlenül fogyasztható húsos készítmények, amelyeket enyhe (12 kPa) vákuum alatt hőálló csomagolásba töltve hőkezelnek (70–95 °C-on), majd 1–8 °C-on tárolnak; összetételtől függően tartósságuk 6–40 nap. A tartóssághoz további gátak járulnak hozzá, mint a pH-csökentés Na-laktáttal, az aw csökentése (1,5% NaCl). A sousvide termékek biztonsága és tartóssága a tényezők nagyon kényes egyensúlyán múlik, és igen gondos és körültekintő gyártási és higiéniai gyakorlatot igényel. A hús, tej és zöldség alapú termékek széles köre esik az ún. közepes nedvességtartalmú élelmiszerek (szokásos rövidítéssel IMF) csoportjába. Ezek vízaktivitása 0,70 és 0,90 közötti, ami gátolja a baktériumok többségét, de nem elegendő a xerotróf élesztő- és penészgombák szaporodásának megakadályozására. Ilyenek az érlelt, fermentált kolbászok, szalámik, sajtok, valamint a gyümölcsaszalványok, amelyek tartósságát további gátló tényezők kombinálásával lehet elérni, mint pHcsökentéssel, szerves tartósítószerek vagy szulfit hozzáadásával, módosított vagy vákuumcsomagolással. Kiváló lehetőség lenne a kis dózisú besugárzás, aminek széles körű elfogadása és engedélyezése még várat magára, továbbá megfelelő kombinációnak ígérkeznek egyes új, nem hagyományos és nem hőkezeléssel járó eljárások, mint a nagy nyomás, a pulzáló elektromos mező és mások.
Új technológiák A hagyományos, évszázadok óta bevált hőkezeléses tartósítótechnológiák teljesítik azokat a fő követelményeket, hogy elpusztítsák az élelmiszerekben a kórokozó és romlást okozó mikroorganizmusokat, valamint inaktiválják az enzimes és kémiai lebontó reakciókat. A változó fogyasztói igények azonban a biztonságos és tápláló élelmiszereken túl egyre növekvő elvárásokat támasztanak az érzékszervi minőség iránt is, és ennek a követelménynek a hőkezeléses technológiák nem mindenben felelnek meg. Ezért, továbbá energiatakarékossági okból is, fokozódó figyelem fordul a kíméletesebb tartósítóeljárások és az alternatív energiaforrások felé. A kialakuló új tartósítótechnológiák egy része szintén hőhatáson alapul, amit azonban elektromos energiával hoznak létre, különböző lehetőségekkel. Az alternatív technológiák másik lehetséges módját viszont a nem termikus módszerek képezik, amelyek különböző fizikai elvek alapján az elektromos, fény-, mágneses, hang-, nyomás- vagy sugárzási energiát folyamatosan vagy pulzusokban közlik az élelmiszerrel. E módszerek többsége még csak olyan lehetőség, amelynek megvalósulása a műveleti alapok kidolgozásán, a technikai és gazdaságossági kivitelezhetőségen kívül a mikrobiológiai hatásosság függvénye. Néhány módszer, mint a besugárzás, a mikrohullámú és a nagynyomású technológia már megalapozott és a gyakorlatban is alkalmazható tartósítóeljárás (5.25. táblázat). Bevezetésüket és széles körű használatba vételüket azonban a fogyasztói fenntartások akadályozhatják, mint pl. a besugárzás esetén. A megoldást és az eredményességet is az alternatív módszer egyedüli használata helyett több eljárás kombinálása kínálja.
5.25. táblázat - Új, alternatív tartósító technológiák előnyei és alkalmazási lehetőségei Technológia
Alkalmazási előnyök, lehetőségek
Gyakorlati alkalmazás 158
Tartósítási módszerek mikrobiológiája Nagy hidrosztatikus nyomás
jobb érzékszervi tulajdonságok
dzsemek
tápérték megőrzése
gyümölcslevek
hőpasztörözésnek megfelelő biztonság
húskészítmények
egyenletes behatás, mindenféle terméknél
gyümölcsjoghurt
Pulzáló elektromos jobb érzékszervi tulajdonságok mező tápérték megőrzése Pulzáló fény Ultrahang
még nincs használatban; gyümölcslevekre,
csomagolatlan termékre használható
italokra alkalmas
tiszta, átlátszó folyadékokra,
nincs gyakorlati
felületek szennyezésmentesítésére
alkalmazásban
hővel és nyomással együtt alkalmazható felületek tisztítására, feldolgozási műveletekben használható
extrahálás, homogenizálás
Hőelektromos eljárások A hőelektromos (elektrotermikus) módszerek előnye a hagyományos hőkezeléssel szemben a gyorsabb hőátadásban rejlik, amivel a túlfőzés miatti érzékszervi minőségcsökkenés és tápértékveszteség mérsékelhető. Elektromos úton a hőközlés mikrohullámú, radiofrekvenciás, indukciós vagy ohmikus hevítéssel lehetséges. A mikrohullámú módszer széleskörűen elterjedt a háztartásokban, de élelmiszer-ipari alkalmazása korlátozott. Pasztőrözésre vagy sterilezésre való alkalmazását az korlátozza, hogy a hőátadás nem egyenletes, a termékben alul- vagy túlmelegített helyek keletkeznek. Csőben áramoltatott folyadéknál (pl. tej) ez elkerülhető. Másik lehetőség a meghatározott, állandó frekvencia helyett változó frekvenciákat alkalmazni, ami azonban igen költséges megoldás. A radiofrekvenciás hevítés a mikrohullámúnál nagyságrendekkel kisebb frekvenciákat használ, következéskép hosszabb hullámokat gerjeszt, amelyek behatolóképessége mélyebb, ezért nagyobb darabok hőkezelésére alkalmas. A termék felmelegítése azonban ez esetben sem homogén. A két említett módszerrel szemben az ohmikus ellenálláson alapuló hevítés teljesen egyenletes hőmérsékleteket hoz létre pontosan szabályozható elektromos térben, továbbá egyaránt és egyidejűleg alkalmazható folyékony és darabos összetevőket tartalmazó termékekre. Nemcsak sterilezésre használható, hanem előmelegítésre (blansírozásra), sőt, mikrobatenyészetek szaporodásának serkentésére (pl. tejsavas fermentációnál a lappangási szakasz csökkentésére) is. A módszer kínálta lehetőségek kihasználása a gazdaságos műszaki megoldások függvénye. Egy vezető körüli tekercsen átbocsátott elektromosság a vezetőben is áramot indukál, ami felmelegíti a vezető körüli csőkígyóban átfolyó terméket. Ez az indukciós hevítés elve, amit azonban élelmiszerekre még csak korlátozottan próbáltak ki. 159
Tartósítási módszerek mikrobiológiája
Pulzáló energiájú módszerek Ezek alapvetően nem hőközléses módszerek. Az energiaforrás nagyon különböző lehet, a közös elv az energia lüktetésszerű, rövid idejű, de nagy energiájú pulzusokban való közlése, ami a mikrobasejtekre erőteljes pusztító hatást gyakorol. A legtöbb vizsgálat a pulzáló elektromos mezők alkalmazhatóságára irányult. Folyadékok (gyümölcslevek, üdítőitalok, folyékony tojás, mártások) mind folytonos, mind szakaszos módon kezelhetők, ha azokat nagy feszültségre (20–40 kV) feltöltött elektródok lemezei között átvezetve pillanatszerű elektromos kisüléseknek vetik alá. 10–100 pulzust alkalmaznak, de egy-egy pulzus időtartama csak a másodperc töredéke (néhány μs). Az elektródok közti távolságtól függően a folyadékban 15–90 kV/cm elektromos térerő keletkezik, ami nemcsak a mikrobasejteket, hanem az enzimeket is inaktiválja. A sejtek pusztulása a membránok roncsolódásának, a bennük keletkező pórusoknak tulajdonítható. A módszer alkalmazását gátolja, hogy a kezeléssel a baktériumspórák nem pusztíthatók el, továbbá az áramló folyadékban keletkező légbuborékok és a nagy vezetőképességű anyagok a hatékonyságot csökkentik, a nem homogén termékek kezelése nehézséget okoz. A pulzáló elektromos mező más, nem termikus módszerrel együtt alkalmazható, így pl. antimikrobás anyagokkal (nizin, lizozim) a hatékonyság fokozható. Néhány kísérleti eredményt az 5.26. táblázat mutat be.
5.26. táblázat - Mikroorganizmusok pusztulási mértéke pulzáló elektromos mező hatására Mikroorganizmus
Vizsgálati anyag és körülmények
Log sejtszámcsökkenés
Listeria innocua
tej; 50 kV/cm, 30 pulzus
2,7–3,4
Salmonella spp.
tej; 75–80 kV/cm, 20–40 pulzus
3,0–5,0
Escherichia coli
tej; 2–5 V/μm, 10–60 pulzus
2,0–6,0
folyékony tojás; 2,6 V/μm, 100 pulzus Saccharomyces cerevisae almalé; 1,2–2,5 V/μm, 5–20 pulzus Zygosaccharomyces bailii
vörös áfonyalé, 3,6 V/μm, 2 pulzus
6,0 3,0–4,0 4,2
Ugyancsak folyékony anyagok pasztőrözésére használható az elektromos ívkisülés, amely a folyadékba merülő elektródok közt löketszerűen lép fel. Többféle fizikai és kémiai hatás következménye a sejtek pusztulása, a keletkező szabad gyökök és atomos oxigén az enzimeket is inaktiválja. Kísérleti szintű vizsgálatok szerint narancslében a sejtszám hat-hét nagyságrenddel csökkent, és a termék megőrizte friss jellegét a száznapos hűtött tárolás alatt. Technológiai alkalmazásra még nem került sor. Az elektromosságon kívül más energiafajta pulzáló közlése is antimikrobás hatású és tartósításra alkalmas lehet. Ilyen a fényenergia is, amelynek intenzitását alkalmas módon a Nap fényének 20 ezerszeresére növelve, a másodperc milliomod részéig tartó villanásokkal számottevő mikrobapusztuás érhető el. A hatás azonban csak a felületre vagy áttetsző anyagokra korlátozódik, viszont a gombakonídiumok, a baktériumspórák éppúgy inaktiválhatók, mint a vegetatív sejtek. A hatás többféle tényezőnek tulajdonítható, hiszen a teljes fénytartomány felöleli az ultraibolya, a látható és az infravörös sugarakat is, amelyeket a sejtanyagok 160
Tartósítási módszerek mikrobiológiája különböző mértékben abszorbeálnak. Összesítésben a DNS szerkezeti változása lehet a döntő halálozási ok. Csomagolóanyagok és felületek mikrobaszámának csökkentésére az UV sugárzás használata egyszerűbb eljárás, mint a pulzáló fény. Ebbe a kategóriába sorolható az oszcilláló mágneses mező is, amelynek antimikrobás hatása van a vegetatív sejtekre, azonban a spórákra nem. A hatás mechanizmusa tisztázatlan; feltételezhető a sejtmembrán permeábilitásának megváltozása. Élelmiszerekkel végzett kísérletekben csak két-három nagyságrendű sejtszámcsökkenést értek el, ami még távol áll a gyakorlati alkalmazás követelményeitől. Itt említhető az ultrahang is, amely hatásmechanizmusát tekintve az anyagban gyorsan változó kompressziós és dekompressziós zónákat kelt, ennek következménye a kavitáció: parányi buborékok képződése és összeomlása. Az intracelluláris kavitáció mechanikusan roncsolja a sejteket. Az ultrahang másodpercenként 20 ezret is meghaladó rezgésszámú hullámai jól alkalmazhatók felületek tisztítására, anyagok homogenizálására, diszpergálására, mivel azonban a spórák teljességgel ellenállnak a roncsolásnak, csírátlanításra nem alkalmas. Az ultrahang a hőmérséklet növelését is okozza, ez azonban a víz forráspontja közelében megszünteti a kavitációt, ami viszont a nyomás fokozásával fenntartható. Ez nyújt lehetőséget egy új alternatív módszerkombináció kialakítására, a nyomás, a hőmérséklet és az ultrahang szinergista hatásának kihasználására, amit manotermoszonikációnak neveznek. Az eljárás csak folyadékok és finom diszperz rendszerek (öntetek, szószok) tartósítására ígérkezik megfelelőnek, de gyakorlati alkalmazására még nem került sor.
Nagy hidrosztatikus nyomás A nagy hidrosztatikus nyomás (angol rövidítéséből HHP) a besugárzáson kívül az egyetlen olyan alternatív, nem termikus módszer, amely már gyakorlati alkalmazást nyert. Japánban, Németországban, az Egyesült Államokban és néhány más országban működnek üzemi méretű berendezések; az első, nagy nyomással tartósított termék egy gyümölcslekvár volt, 1990-ben. A tartósításra használt nyomás mértéke 100–1000 MPa tartományba esik, ami rendkívül nagy (a normál légköri nyomás 0,1 MPa). A kezelőkamrában a nyomást vagy folyadék (általában víz) bepumpálásával fokozzák, vagy a vízzel tele kamra térfogatát dugattyúval nyomják össze. Többnyire 300–600 MPa nyomást alkalmaznak 5–20 percig, ami a hőmérsékletet csak kis mértékben (15–20 °C-ra) növeli. A kezelés alatt a termék térfogata 10–20%kal csökken, azonban a nyomás megszűntével visszanyeri az eredetit, amennyiben jelentős szerkezeti változást (pl. gélesedést) nem szenved. Újabban víz alatti elektromos kisülésekkel is létrehoztak nagynyomású (80–100 MPa) lökéshullámokat; ez az állandó nyomás helyett pulzáló nyomáshullámokat kelt, és a vizsgálatok szerint fokozott mikrobapusztító hatású. A hőkezeléshez viszonyítva a HHP technológiának számos előnye van. A nagy nyomás csak a membránokat és a fehérjéket stabilizáló gyenge kötéseket bontja, a kovalens kötéseket nem, ezért a mikrobasejtek és az enzimek inaktiválódnak, de az élelmiszer érzékszervi és tápértékét meghatározó vegyületek nem. A nagy nyomás a termékben egyenletesen és egy időben érvényesül. Bármilyen összetételű és szerkezetű élelmiszerre egyaránt alkalmazható. A HHP technológia hátránya azonban, hogy többnyire csak szakaszosan alkalmazható, ami növeli a módszer költségeit. Mikrobiológiai hatást tekintve a baktériumok, élesztők és penészek vegetatív sejtjei 300–600 MPa nyomással elpusztíthatók, azonban az endospórák túlélik az 1000 MPa-t meghaladó nyomást is (5.27. táblázat). A nyomás hatása a membránok és más sejtalkotók (riboszómák, mitokondriumok) szerkezetének károsodásával magyarázható (5.11. ábra). Ezek a spóraállapotban védettek a nyomással szemben is, ami nyilvánvalóan gondot okoz a gyakorlati alkalmazásban. A biztonságos sterilezés szükségessé teszi, hogy a nyomást kis pH-val, enyhe hőkezeléssel vagy hűtéssel kombinálják. Érdekes megoldást tesz lehetővé az a felismerés, hogy kisebb nyomás kiváltja a spórák egy részének a csírázását, amelyek így érzékennyé válnak a további nyomáskezelésre. A hőkezeléshez hasonlóan a nyomás hatékonyságát az 161
Tartósítási módszerek mikrobiológiája élelmiszer tulajdonságai befolyásolják; a kis aw csökkenti, a kis pH növeli. A pasztőröző mértékű nyomáskezelést igénylő gyümölcslevek és gyümölcskészítmények kiválóan tartósíthatók HHP technológiával. Közvélemény-kutatás szerint a fogyasztók 70%-a elfogadja az ilyen termékeket.
5.27. táblázat - Néhány kórokozó baktérium pusztulása nagy hidrosztatikai nyomásra Baktériumfaj
Log inaktiváció 15 perces nyomáskezelés után 300 MPa
Salmonella spp.
>6
Campylobacter jejunii
>6
500 MPa
Escherichia coli
2,5
Staphylococcus aureus
1,9
Listeria monocytogenes
>6
5.11. ábra - A nagy hidrosztatikus nyomás hatásai
162
6. fejezet - Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek Ez a fejezet az élelmiszerek készítésére és tartósítására használt mikrobiológiai erjesztési folyamatokat és a fermentált élelmiszereket tárgyalja. E vonatkozásban szöges ellentétben áll az eddig tárgyalt feldolgozási és tartósítási technológiákkal, amelyek fő célja – az élelmiszer élvezeti- és tápértékének kialakításán kívül – a fogyasztó egészségét veszélyeztető és a termék romlását okozó mikroorganizmusok tevékenységének megakadályozása, sőt, azok elpusztítása. Az élelmiszerfermentációkban ezzel szemben arra törekszünk, hogy az említett célok elérése érdekében a mikroorganizmusok bizonyos csoportjainak elszaporodását és tevékenységét elősegítsük. Ilyen értelemben az élelmiszer-fermentációkat biológiai tartósítási módszernek lehet tekinteni. A fermentációs iparokban – tágabb értelemben is – a mikroorganizmusok ipari léptékű elszaporítását valósítják meg aerob, ritkábban anaerob körülmények között. Ennek célja különböző termékek előállítása szabályozott fermentációs körülmények között. Az élelmiszeripar vagy maga állít elő fermentált termékeket élelmezési célra, vagy más fermentációs ipari termékeket használ fel az élelmiszerek előállításához segédanyagként vagy adalékanyagként. A legfontosabb fermentációs ipari termékek: 1. Szerves vegyületek, amelyek hasznosításuk szerint lehetnek élelmiszer-adalékok (pl. színezékek, aromák, szerves savak), enzimek (pl. amilázok, glükanázok, galaktozidáz), antimikrobás anyagok (pl. tartósítószerek, antibiotikumok, vakcinák), vagy pedig motor hajtóanyagok (pl. etanol). 2. Mikroba sejttömeg (biomassza) vagy sejtkivonat (fehérjék, peptidek, aminosavak, nukleotidok). Ilyen a sütőélesztő és a takarmányélesztő vagy az étkezési célra fermentorban elszaporított F. graminearum gomba micéliuma, amit mikoproteinként gyártanak. Az élesztőkivonatot különböző mértékben frakcionálva élelmiszer-adalékanyagként (ízfokozó, aminosav-, mikroelem- és vitaminforrás) vagy mikroba táptalajkomponensként alkalmazzák. 3. Tejsavasan erjesztett (fermentált) élelmiszer-ipari termékek (erjesztett tejtermékek, húskészítmények, zöldség- és gabonafélék). 4. Alkoholosan erjesztett (fermentált) élelmiszer-ipari termékek. Legfontosabbak az alkoholtartalmú italok, de alkoholos erjedés megy végbe a kenyértészta kelesztésekor is. A mikroorganizmusok segítségével lejátszódó erjesztések az élelmiszer-tartósítás, illetve -feldolgozás legősibb eljárásai közé tartoznak. A kenyér, sör, bor, sajt előállítása az emberi kultúrák kezdetéig visszavezethető, és a mai modern élelmiszer-ipari technológiáknak is ezek a mikrobiológiai folyamatok képezik az alapját. Az élelmiszeripar rohamos fejlődése magával hozta a feldolgozási technológiák magas szintű (esetenként a gyógyszeripari fermentációkkal vetekedő) szabályozottságát, amelynek segítségével változatos, jó minőségű és biztonságos élelmiszereket állítanak elő világszerte. A világ kevésbé fejlett részein, elsősorban trópusi területeken még ma is az erjesztés a legfontosabb élelmiszer-feldolgozási technológia, amelynek segítségével hosszabban eltartható, táplálkozási szempontból előnyösebb (pl. természetes toxikus anyagoktól megszabadított, fehérjében, vitaminokban és ásványi anyagokban gazdagabb), biztonságos (kórokozó mikrobáktól mentes) élelmiszereket állítanak elő. Az élelmiszer-ipari fermentációk célja az állati vagy növényi eredetű alapanyagok módosítása a mikroorganizmusok (baktériumok, élesztőgombák, fonalasgombák) anyagcsere-tevékenysége révén. A fermentált élelmiszerek több előnnyel is rendelkeznek a friss élelmiszerekkel, illetve alapanyagokkal szemben. A legfontosabbak: 163
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek • Az élelmiszerek választékának növekedése. Például emberi fogyasztásra néhányféle tejet (többnyire tehéntejet) termelnek, a tejből, mint alapanyagból több mint ezerféle sajtot és más tejterméket állítanak elő. • Élelmiszer-adalékként való alkalmazásukkal változatosabbá tehetők az ételek (pl. szójaszósz, sajtok). • Tápérték és minőség növelése: az élesztő és élesztőkivonat növeli a fehérje- és aminosav-, illetve B-vitamin-tartalmat. Az erjesztés során a mikroorganizmusok számos antinutritív anyagot (pl. fitát, lektinek) lebontanak, valamint növelik az alapanyagokban található ásványi anyagok hozzáférhetőségét. • Eltarthatóság növekedése: a mikrobák anyagcseretermékei növelik az eltarthatóságot, visszaszorítják a patogén mikroorganizmusokat. A tej hűtés nélkül csak néhány óráig tartható el biztonságosan, a tejsavasan erjesztett tejtermékek hetekig, sőt hónapokig is tárolhatók anélkül, hogy megromlanának. A tej a legtöbb baktérium számára kiváló táptalaj, az erjesztett tejtermékekben (a kis pH-értéknek köszönhetően) a patogén mikroorganizmusok nem képesek elszaporodni, sőt a tárolás során el is pusztulnak. A zöldségek frissen csak korlátozott ideig tárolhatók, viszont tejsavasan erjesztve hosszú ideig eltartható, vitaminban és ásványi anyagokban gazdag termékeket állítanak elő belőlük (pl. savanyú káposzta, uborka, olívabogyó). • Egészségesebb termékek előállítása. Sok erjesztett élelmiszer az immunrendszert erősítő, vagy az egészséges bélrendszer mikrobiotájának megőrzését szolgáló összetevőt tartalmaz (pl. kefir, joghurt, probiotikus tejtermékek). • Emészthetőség javítása. Például a joghurt proteinjei könnyebben emészthetők, mint a tejfehérjék, ami különösen a csökkent emésztési funkcióban szenvedő embereknek lényeges. Laktóz intoleranciás egyének az erjesztett tejtermékeket szinte korlátlanul fogyaszthatják, mivel ezek laktóztartalmát a tejsavbaktériumok nagyrészt tejsavvá erjesztették. • Toxikus anyagok lebontása. Sok növényi élelmiszer-alapanyag tartalmaz antinutritív (az emésztőrendszer működését gátló) vagy toxikus összetevőket. Ilyenek különösen nagy mennyiségben fordulnak elő a hüvelyesek magjaiban. A szójában található protein természetű enzim inhibitort a fermentált termékekben (pl. tempeh) a mikroorganizmusok lebontják, ezáltal hatástalanítják. A gabonafélék héjában általában nagy mennyiségben jelenlévő fitinsavat számtalan erjesztő mikroorganizmus bontja.
Az élelmiszer-ipari erjesztések típusai Az élelmezési célra előállított termékek az uralkodó mikrobiota jellemző anyagcsere- termékei alapján három csoportba sorolhatók: 1. Tejsavasan erjesztett termékek. A termék jellegét a tejsavbaktériumok által termelt tejsav határozza meg, az alapanyag lehet tej, hús, zöldség és gabona. Ilyenek: • • tejtermékek: pl. joghurt, kefir, vaj, sajtok, • fermentált hústermékek: pl. szalámi- és kolbászfélék, • erjesztett zöldségfélék: pl. savanyú káposzta, uborka, olívabogyó, • savanyú kovászos kenyér. 164
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek 2. Alkoholosan erjesztett termékek. Az élesztőgombák az alapanyagokban található szénhidrátokat az anaerob alkoholos erjedés során etanollá és CO2-dá alakítják: • alkoholos italok: pl. bor, sör, • sütőipari termékek: pl. kenyér. 3. Vegyes fermentációk. A többnyire szilárd halmazállapotú, egy- vagy többféle nyersanyagot mikrobákkal erjesztik, amelyek között penészgombák, élesztők, tejsavbaktériumok, olykor más baktériumok is szerepelnek. Ilyenek az ún. keleti (orientális) termékek (pl. szójaszósz, tempeh), de sok más, hagyományos fermentált termék készül világszerte, amelyek előállítása még távol áll a szabályozott (beoltással történő) erjesztés szintjétől. Vegyes mikrobás tevékenység megy végbe a kávé és a kakaó erjesztéses érlelésében is.
Tejsavasan erjesztett élelmiszerek A legősibb eredetű, mindmáig a legnagyobb mennyiségben és a legszélesebb termékválasztékban készülő erjesztett élelmiszerek, amelyek közt megtalálhatók mindennapi táplálékaink (fermentált tej, hús, zöldség- és gabonafélék). Döntő mértékben a különböző tejsavbaktériumok termékei, de az erjesztésben gyakran más mikroorganizmusok is közreműködnek.
A tejsavas erjedés mikrobiológiája A tejsavas erjedés a tejsavbaktériumok jellemző anyagcsere-folyamata. A tejsavbaktériumok Gram-pozitív, oxidáz és kataláz negatív, pálcika vagy kokkusz alakú, nem spórázó baktériumok (3.2.5.). A tejsavbaktériumok a különböző szénhidrátokat (elsősorban a glükózt és a laktózt) anaerob úton tejsavvá bontják. A keletkező tejsav a termék pH-ját a savas tartományig csökkenti, amit a tejsavbaktérium fajok is különböző mértékben tolerálnak, viszont sok más baktérium (köztük kórokozók), nem visel el. A tejsavasan erjesztett élelmiszerek esetében a következő nemzetségekhez tartozó fajok játsszák a kulcsszerepet: Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus, Oenococcus és Carnobacterium. Meg kell még említeni a tejsavbaktériumokhoz közelálló, probiotikus hatású Bifidobacterium fajokat is. A legfontosabb tejsavasan erjesztett élelmiszerekről és a jellemző tejsavbaktériumokról ad áttekintést a 6.1. táblázat.
6.1. táblázat - A tejsavasan erjesztett élelmiszerek típusai és a jellemző mikroorganizmusok Termék Tejtermékek Joghurt Kefír
Baktériumok Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis Lactobacillus kefir, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus
165
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek Kemény és félkemény sajtok
Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactobacillus bul- garicus, Lactobacillus helveticus Propionibacterium spp
Lágy sajtok
Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Brevibacterium spp
Vaj
Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis, Lactococcus lac- tis subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides
Húskészítmények
Leuconostoc carnosum, Leuconostoc gelidum, Carnobacterium divergens, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus sakei
Marinált halak
Lactobacillus alimentarius, Carnobacterium piscicola
Fermentált zöldségfélék
Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus sakei, Lactobacillus fermentum, Leuconostoc mesenteroides
Savanyú kovászos kenyér
Lactobacillus fermentum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus sanfrascincensis, Lactobacillus reuteri
Bor malolaktikus fermentációja
Oenococcus oenos
A tejsavbaktériumok energiaforrásai a szénhidrátok, amelyeket mind aerob, mind anaerob körülmények között tejsavasan erjesztenek (obligát erjesztők). Jóllehet kataláz-negatívok, azonban az oxigént elviselik, ún. aerotoleráns baktériumok. Tápanyagigényük összetett, számtalan aminosavat, vitamint és nukleotidokat igényelnek a szaporodásukhoz; csak glükózt és szervetlen sókat tartalmazó, ún. minimál táptalajon nem képesek szaporodni. A fehérjét, mint nitrogénforrást csak azok a fajok tudják lebontani, amelyek sejtfalhoz kötött proteázt termelnek. A hidrolizált fehérjetermékeket azonban a proteáz-negatív tejsavbaktériumok is hasznosítják, ezért ilyen körülmények között (pl. tejben) a tejsavbaktériumok jellegzetes kommenzalista asszociációja alakul ki. A tejsavbaktériumok lebontó anyagcseréjük alapján homofermentatív (homolaktikus) vagy heterofermentatív (heterolaktikus) csoportba tartoznak. Az előbbieknél a glikolízisben keletkező piruvát a laktát-dehidrogenáz enzim segítségével teljes mértékben tejsavvá redukálódik, az utóbbiaknál a tejsav mellett ekvimoláris mennyiségben CO2 és etanol (kisebb mennyiségben acetát, formát és glicerin) keletkezik. A legtöbb Lactobacillus faj és a Lactococcus, Streptococcus és Pediococcus fajok homofermentatívek, néhány Lactobacillus (pl. Lb. brevis, Lb. fermentum, Lb. viridescens) és a Leuconostoc fajok heterofermentatív anyagcserét folytatnak. A tejtermékek fermentációjában különleges szerep jut az aromaképző tejsavbaktériumoknak. Ezek a nem-szénhidrát komponenseket aromaanyagokká alakítják át. Ilyen például a citrát piruváttá, majd pedig diacetillé történő konverziója, amire a Lc. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis, a Str. salivarius subsp. thermophilus és a Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus törzsek képesek. A citromsavbontás végterméke diacetil, ami azonban a citrát elfogyása után tovább redukálódik acetoinná. Ennek következtében az optimálisnál hosszabb erjesztés az aromaképzés csökkenésével jár. A Lb. delbruekii subsp. bulgaricus törzsek treoninból is képesek acetaldehidet létrehozni a treoninaldoláz enzim segítségével. A nyálkaképző tejsavbaktériumok extracelluláris poliszacharidokat termelnek, amelyek a közegben felszaporodva jellegzetes nyálkás konzisztenciát alakítanak ki. Ez különösen a joghurt és a kefir állagának kialakításában fontos. Hőmérsékleti igény szempontjából a tejsavbaktériumok mezofil és termofil csoportjait különítjük el. A mezofil tejsavbaktériumok, amelyeknek a sajtok, erjesztett zöldségek, hústermékek előállításában van nagy jelentőségük, szaporodási optimuma 25–30 °C között van (pl. Lactococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, 166
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek Pediococcus fajok). A termofil tejsavbaktériumok szaporodási optimuma 37–42 °C közötti (pl. Str. salivarius subsp. thermophilus, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. helveticus), ezeket a joghurt és bizonyos sajtok (pl. ementáli) előállításánál használják fel.
Erjesztett tejtermékek A sajtok, a joghurt és a kefir közismerten erjesztett tejtermék, de tejsavas erjesztés szerepel a vaj, a tejföl, a tejszín és más tejtermékek előállításában is. A tej egykor spontán tejsavas erjedését (pl. aludttej) az iparban már régóta felváltotta a szabályozott, irányított erjesztés, amelyhez tejsavbaktériumok tiszta tenyészeteit, ún. starterkultúrákat használnak. Főleg a sajtok érlelésében más baktériumok és gombák is részt vesznek; ezeket is tiszta tenyészetekben alkalmazzák.
Tejipari starterkultúrák Állandóan jó minőségű, biztonságos, erjesztett tejtermékek előállításához jól jellemzett, genetikailag stabil törzseket, ún. oltó- vagy indítótenyészeteket, más néven starterkultúrákat (röviden kultúrákat) használnak. Már az ipari szintű gyártási technológiák kifejlesztése előtt is jellemző gyakorlat volt, hogy a tejet az előző erjesztési folyamatban keletkezett mikrobatömeggel oltották be, amelyet többnyire tejben igyekeztek is fenntartani. A starterkultúrák egy vagy több tejsavbaktérium keverékét tartalmazzák meghatározott arányban. Bizonyos termékek esetében nem-tejsavbaktériumokat is tartalmaz az indító tenyészet. Esetenként az utóbbiakat külön tenyészetként adagolják. A mezofil starterek esetében, ha egyetlen törzsből áll az indítótenyészet, akkor az többnyire a Lc. lactis subsp. cremoris, vagy a Lc. lactis subsp. lactis, illetve utóbbinak az aromaképző változata, a biovar. diacetylactis. Kevert tenyészetek esetében ezekhez legtöbbször a Ln. mesenteroides subsp. cremoris, vagy a Ln. lactis törzseit adagolják. Az egyes tejtermékek jellegének megfelelően fejlesztették ki az ipari starterkultúrákat, amelyek jellemző példáit a 6.2. táblázat tartalmazza.
6.2. táblázat - Erjesztett tejtermékek és az előállításukhoz alkalmazott mikroorganizmusok Termék
Starter
Kísérő mikroba
Joghurt
Streptococcus salivarius subsp. thermophilus Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus
Savanyú („Acidophilus”) tej
Lactobacillus acidophilus
AB típusú probiotikus joghurt
Lactobacillus acidophilus
Bifidobacterium bifidum/ Bif. longum
ABT típusú probiotikus joghurt
Lactobacillus acidophilus
Bifidobacterium bifidum/ Bif. longum
Kefír
Lactococcus lactis,
Streptococcus salivarius subsp. thermophilus
Acetobacter sp. Kluyveromyces 167
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus, Lb. kefiri, Lb. parakefiri,
marxianus Saccharomyces cerevisiae Candida kefir
Lb. kefiranofaciens Vaj, tejföl
Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris
Gomolyasajt
Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris Leuconostoc spp.
Emmentáli típusú (svájci) sajtok
Streptococcus salivarius subsp. thermophilus Lb. bulgaricus
Propionibacterium shermanii
Lb. helveticus
Pr. freundenreichii
Rokfort típusú (kék) Lactococcus lactis subsp. lactis, sajtok Lactococcus lactis subsp. cremoris, Leuconostoc spp. Camembert/brie sajtok
Penicillium rocqueforti Pen. glaucum
Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. Penicillium camemberti Pen. candidum diacetylactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris
Pen. caseicolum
Az erjesztett tejtermékek gyártásának mikrobiológiailag legkritikusabb folyamata a kultúrakészítés. A tenyészetnek csak a starter törzseket szabad tartalmaznia és fontos, hogy a tenyészet életerős legyen, azaz a baktériumok exponenciális szaporodási fázisban legyenek. A starterkultúrákat friss tenyészetként, fagyasztva-szárítva (liofilezve) vagy folyékony nitrogénben tartósítva hozzák forgalomba. A kultúrakészítés a tartósított vagy laboratóriumban fenntartott friss tenyészetekből indul ki. Ezeket lombikban elszaporítva kapják az ún. anyasavanyítót. Ebből léptéknöveléssel kapják a beoltásra használt tömegsavanyítót.
168
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek
Erjesztett tejtermékek gyártásának mikrobiológiai háttere Az erjesztett tejtermékek alapanyaga többnyire tehéntej. Átlagos összetételét tekintve 3,5% fehérjét (főként kazeint), 3,5–5,0% zsírt, 4,9% szénhidrátot (elsősorban laktózt) és 0,7% ásványi anyagot (hamut) tartalmaz. A friss tej pH-ja 6,6 körüli. B-vitaminokban (pantoténsavban és riboflavinban) gazdag. A joghurt kétféle termofil tejsavbaktérium (Str. salivarius subsp. thermophilus és Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus) keverékével készül. Sima joghurtként vagy különböző anyagokkal (pl. gyümölcsök, dzsemek, müzli) kiegészítve gyártják. Az egyes termékek zsírtartalma, állománya, viszkozitása különböző. Joghurt készítéséhez a kétféle baktériumot azonos arányban adagolva oltják be a pasztőrözött tejbe, majd 45 °C-on inkubálják néhány óráig. A laktobacillus proteáz-pozitív, a sztreptokokkusz proteáz-negatív, a kokkusz számára az előbbi képezi az aminosavakat. Ezért „cserébe” a sztreptokokkusz anaerob körülmények között hangyasavat és CO2-ot termel. A kölcsönös stimulálásnak köszönhetően a tejsavtermelés gyors és a termék néhány óra alatt eléri a szükséges savfokot. A sztreptokokkusz kb. 0,5%, a laktobacillus kb. 0,6–0,8% tejsavat termel, így a pH 4,2–4,5 értékre csökken. A sztreptokokkusz érzékenyebb a tejsav okozta pH-csökkenésre, mint a laktobacillus, ezért ennek szaporodása áll le előbb. Mindkét baktérium a laktóznak csak a glükóz részét erjeszti tejsavvá, a galaktóz megmarad, amelyből viszont nyálkás polimer képződik. A joghurt aromája szempontjából lényeges a megfelelő mennyiségű acetaldehid-tartalom is, amelyet a Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus termel treoninból. A friss joghurt mintegy 109 sejt/ml élő tejsavbaktériumot tartalmaz, számuk a tárolás során nagyságrendekkel csökken. A gyártási folyamat legfontosabb lépéseit a 6.1. ábra mutatja.
169
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek
6.1. ábra - A savanyú tejkészítmények (joghurt, kefir) gyártási folyamata
170
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek Az egészségvédő tejtermékek reneszánszukat élik. A joghurt az Enterobacteriaceae család fajainak, köztük az Eb. aerogenes és az E. coli szaporodását bizonyítottan gátolja. A probiotikus joghurtok a Lb. acidophiluson kívül Bifidobacterium bifidum vagy Bif. longum törzset tartalmaznak (ún. AB joghurt), emellett beolthatják még a normál joghurt jellemző tejsavbaktériumának, a Str. salivarius subsp. thermophilus egyik törzsével is (ún. ABT joghurt). Ide tartozik az erősen savtűrő Lb. acidophilus segítségével megsavanyított „acidophilus tej” is, amit a tej lassan növő tejsavbaktériummal való beoltása után 38 °C-on, 18–24 órás inkubálással állítanak elő. A kefir erjesztésében többféle tejsavbaktérium, valamint ecetsav-baktériumok és élesztőgombák is részt vesznek, amelyek sajátságos szimbiózisban élnek a koagulált tejfehérje-gömböcskékhez tapadva. A Lb. kefiranofaciens felelős a kefirgömböcske poliszacharid-tartalmát képező kefiran termeléséért. A gyártását lásd a 6.1 ábrán. A kumisz hasonló a kefirhez, de kancatejből készül, nincsenek benne kefirgömbök, és alkoholtartalma elérheti a 2%-ot is. A legtöbb sajt készítése is tejsavas erjesztésen alapszik. Jóllehet a különféle sajtokhoz sajátos startereket és eljárásokat alkalmaznak, közös bennük, hogy első lépésként a (többnyire pasztőrözött) tejet tejalvasztó enzimmel (renninnel) és starterkultúrával beoltják. Az alkalmazott hőmérsékletet a starterkultúra hőmérsékletigénye határozza meg, termofil tejsavbaktériumok esetében 60 °C-ot is elérhet. Az inkubálás alatt a tejfehérje koagulálódik (kicsapódik) és alvadék keletkezik. Ezt a második lépésben kiszűrik és összepréselik, majd sózzák, így friss oltós sajtokat kapnak. Az érlelt sajtokat meghatározott körülmények között és ideig érlelik (6.2. ábra). Víztartalmuk alapján a sajtokat 3 csoportba osztják: kemény (45–56% víz), félkemény (54–64% víz) és lágy (61–73% víz). Az érlelt sajtok jellegét a kísérő mikrobiota határozza meg.
171
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek
6.2. ábra - A trappista (félkemény) sajt gyártási folyamata
172
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek A kemény sajtokban a mikroorganizmusok eloszolva, a sajt belsejében is tevékenykednek. A fehérjebontás csak kismértékű, 25–35%-os. A svájci (pl. ementáli típusú) sajtok esetében Propionibacterium shermanii és Prop. freundenreichii tenyészetet is adagolnak a tejsavbaktériumokkal együtt, amelyek a sajátságos aroma és a lyukacsosság kialakulásáért felelősek. A propionsav-baktériumok a tejsavat szén-dioxid fejlődése mellett propionsavvá és ecetsavvá alakítják. A lágy sajtoknál a fehérjebontás csaknem teljes. Az erősen fehérjebontó Brevibacterium linens, valamint a nemespenészek a koagulált kazeinből peptideket, aminosavakat, sőt ammóniát képeznek. Az ún. rúzskultúrával érlelt sajtok felületén sárgásvörös bevonat alakul ki, amiben a Brevibacterium fajoknak (elsősorban a B. linensnek) van szerepe. Anyagcsere-termékeik jellegzetes pikáns ízt és aromát adnak a sajtnak. Az ún. kék (rokfort típusú) sajtok esetében az alvadékot P. roqueforti vagy P. glaucum konídiumokkal oltják be, amelyek a sajt belsejében a rendelkezésre álló kevés oxigén felhasználásával elszaporodva jellegzetes kék erezetet alakítanak ki. A camembert és brie sajtok esetében az alvadékot vagy felületét P. camemberti konídiumokkal oltják be, amelyekből dús gombamicélium fejlődik ki a felszínen. A gomba szaporodásához a tejsavat használja fel, ezért a penészréteg kialakulása során a pH kismértékben növekszik. A proteázok a fehérjék, a lipázok pedig a zsírok részleges lebontásával jellegzetes aromaanyagokat hoznak létre (pl. a zsírokból kialakuló kapron-, kapril- és vajsav).
Tejipari starterkultúrák működését gátló hatások Jó minőségű és biztonságos tejtermék-előállítás legfőbb kulcsa az előírt mennyiségű tejsav termelése megfelelő idő alatt. A gyenge, lassú vagy elmaradt tejsavtermelés a termék minőségének romlását, romlást okozó és/vagy patogén mikrobák elszaporodását okozhatja. Ennek ötféle oka lehet. 1. Bakteriofággal való fertőződés. A bakteriofágok a baktériumok vírusai, amelyek a baktériumfajok széles skáláját képesek megfertőzni és a sejtekben elszaporodni. A megfertőzött sejtek anyagcsere-folyamatait visszaszorítják, nem ritkán fel is oldják a sejteket. A bakteriofágok általában fajspecifikusak, de az is előfordul, hogy egy fajon belül csak egyes törzsek érzékenyek a fágokra. Gyors elszaporodásukat elősegítik a nagy tömegben növő gazdasejtek, így a starterkultúrák ideális helyzetet teremtenek számukra. Egy-egy baktériumfajnak többféle fágja is lehet. Különösen érzékenyek a fágfertőzéssel szemben a laktokokkuszok, de a sztreptokokkuszok és lactobacillusok is gyakran hordoznak fágokat. A baktériumokat nemesítéssel ellenállóvá lehet tenni a fágfertőzéssel szemben, ezért a starterkultúrák minőségének megítélésénél fontos szempont a törzsek fágérzékenysége, illetve rezisztenciája a leggyakoribb fertőző fágokkal szemben. A fágfertőzés általában a nyers tejtől ered. Enyhe pasztőrözés nem pusztítja el őket, a biztos fágmentesítéshez legalább 1 perces 95 °C-os pasztőrözés szükséges. Fontos a megfelelő higiéniai rendszabályok betartása a technológiai folyamatokban, valamint a megbízható startertenyészetek alkalmazása. Különböző startertenyészetek váltogatása is eredményes lehet. Sok fertőtlenítőszer inaktiválja a bakteriofágokat is. Ilyenek például a hipoklorit-tartalmú fertőtlenítőszerek, azonban a koncentráció, a hőmérséklet, a hatásidő és a fágérzékenysége is fontos tényező. A fágfertőzés veszélye különösen a folytonos joghurtgyártásnál és a félfolytonos sajtgyártásnál áll fenn. 2. Antibiotikum maradványok a tejben. Elsősorban a masztitisz (tőgygyulladás) kezelésénél használt antibiotikumok jelentenek veszélyt a starterkultúrák szaporodására. Mivel a tőgygyulladást leggyakrabban Streptococcus fajok okozzák (Str. agalactiae, Str. uberis), ezért nem meglepő, hogy főként a Str. salivarius subsp. thermophilus érzékeny az ellenük használt antibiotikumokkal szemben. Ezért is fontos a rendelettel szabályozott várakozási idő betartása az antibiotikumkezelést követően. 3. Fertőtlenítőszer-maradványok a berendezésekben. A fertőtlenítőszerek nem megfelelő eltávolítása vagy a CIP rendszer nem megfelelő működése (pl. vízkimaradás) esetén a nyomokban lévő fertőtlenítőszerek is gátolhatják a starterek tejsavtermelését. 4. Agglutininek (ellenanyagok) jelenléte. A szarvasmarha szervezete a fertőző (patogén) tejsavbaktériumok ellen ellenanyagot termel, amely a tejbe kiválasztódva inaktiválhatja a starter tejsavbaktériumot is. Az ellenanyag a tejsavbaktériumokat összecsapja, agglutinálja. 173
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek 5. Plazmidok elvesztése. A tejsavbaktériumok több olyan gént hordoznak plazmidokon, amelyek a starterkultúrák technológiai szempontból fontos tulajdonságait határozzák meg. Ilyenek a laktóztranszportért, a laktózbontásért, a proteáztermelésért, a fág- és antibiotikum rezisztenciáért felelős gének. A baktériumok szaporodásának kismértékű gátlása is okozhat plazmidvesztést, ami genetikai instabilitásban jelentkezik. Génsebészeti úton genetikailag stabil törzseket állítottak elő a plazmidgének kromoszómába való beépítésével. Ilyen, genetikailag módosított törzseket, azonban jelenleg nem használnak a termelésben.
Erjesztett tejtermékek mikrobiológiai problémái, biztonsága A starterkultúráknál említetteken túl a késztermékeknél mikrobiológia problémákat az alapanyagok mikrobás fertőzöttsége vagy a technológia során történő szennyeződés, fertőződés okozhat. Általánosan elmondható azonban, hogy a savas pH-ból eredően (pH 3,7–4,4) a fermentált tejkészítmények mikrobiológia biztonsága jó. Az egészséges állat teje elméletileg mindenfajta mikroorganizmustól mentes, a valóságban azonban a nyers tejben ml-enként több száz vagy ezer mikroorganizmus is előfordulhat. A tejelő állatok számos olyan baktériumot hordozhatnak, amelyek az emberre nézve patogének, ezért a nyers tejben sok patogén baktérium is előfordulhat. Mivel a tej a baktériumok kiváló táptalaja, ezért fontos a tejkezelés általános és higiéniai szabályainak betartása. A nyers tej különösen veszélyes a Cb. jejuni, Ye. enterocolitica, Li. monocytogenes, Salmonella spp., és az E. coli O157:H7 előfordulása szempontjából, újabban pedig a Mycobacterium avium subsp. paratuberculosisról mutatták ki, hogy nemcsak a kérődzőkre patogén, hanem emberre is veszélyes (ún. Chron-féle betegséget okoz). Ezeket a patogén baktériumokat a megfelelő pasztőrözés elpusztítja, ezért fontos szabály, hogy az erjesztett tejtermékek előállítására csak megfelelően pasztőrözött tejet szabad használni. Egyetlen kivételt jelentenek az érlelt sajtok, ezeket azonban csak 1–2 hónapos tárolás után szabad forgalomba hozni. A Cl. botulinum, Cl. sporogenes és B. cereus endospórákkal szemben azonban hatástalan a pasztőrözés, ezért ezekre külön figyelmet kell fordítani abban az esetben, ha a termék kis redoxpotenciálja lehetővé teszi a szaporodásukat. Mikrobiológiai problémák a joghurt és a kefir esetében: • Gyengébben erjesztett („mild”) joghurtnál, kefirnél a nagyobb pH miatt nő a patogénekkel való fertőződés veszélye. • A joghurtok ízesítése (gyümölcsök, magvak) mikrobiológiai eredetű minőségromlást, esetenként patogénnel való fertőződést okozhat. Az erjeszthető cukortartalom az élesztőgombák, penészgombák elszaporodásához és gázképzéshez vezethet. A botulizmust okozó Cl. botulinum is előfordulhat. A potenciális veszélyek elleni védekezés lehetőségei: • töltőgépek sterilizálása, • csomagolóanyagok megfelelő tárolása, • sterilre szűrt levegő beáramoltatása a töltőhelyiségekbe, • UV lámpák alkalmazása a töltőhelyiségben, • gyümölcsök, szirupok megfelelő kezelése (szulfitadagolás, sterilizálás), • a végtermék hőkezelése vagy konzerválószer alkalmazása. 174
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek Mikrobiológiai problémák sajtoknál: A sajtok mikrobiológiai szempontból több problémát hordoznak, mint a joghurt és a kefir, mivel az első technológiai lépésben keletkező alvadéknak nagy a pufferkapacitása, ezért a pH még megfelelő starterkultúrák esetében is csak lassan és kisebb mértékben csökken. Ami gondot okozhat: • Koliform baktériumokkal való fertőződés, amit a higiénés rendszabályok betartásával lehet kiküszöbölni, gázképzéshez, ürülékszag kialakulásához vezet. • Klosztridiumokkal (pl. Cl. butyricum) való fertőződés, ami nizinadagolással kivédhető, gázképződéshez vezet. • Felületi penészedés. A penészgombák elszaporodása megakadályozható tiszta és kis páratartalmú helyiségben való tárolással, viasz- vagy műanyag burkolat alkalmazásával, illetve tartósítószer (pl. szorbát, pimaricin) adagolással. Bár a felületen elszaporodó élesztő- és élesztőszerű gombák (pl. Candida, Torulaspora, Geotrichum, Trichosporon) savfogyasztása előnyös az 5-nél nagyobb pH-t kedvelő Brevibacteriumok tevékenységéhez, ilyenkor azonban megnő a klosztridiumok okozta romlás veszélye. • Nagy nedvességtartalmú és pH-jú sajtok (pl. túrósajt, gomolyasajt) esetében a Pseudomonas és élesztőgombás szennyeződés, ami elsősorban a gyártás során keletkezhet. A szennyeződés a jó mikrobiológiai minőségű mosóvíz alkalmazásával előzhető meg. A csípős ízt zsírbontó, a keserű ízt fehérjebontó baktériumok elszaporodása okozza. • Bár a sajtok mikrobiológiai szempontból kevésbé kockázatos termékek, néhány patogén baktérium elszaporodásával mégis számolni kell (pl. Salmonella, Listeria, E. coli, Sta. aureus). Ezek elsősorban lágy és félkemény sajtokban fordulnak elő. A védekezés lehetőségei: megfelelő higiéniai gyakorlat, pasztőrözött tej felhasználása és jó minőségű (gyors tejsavtermelő) starterek alkalmazása.
Fermentált húskészítmények A tejsavasan erjesztett hústermékek már az ősi kultúrákban is lényeges szerepet játszottak az egyébként nagyon romlandó hús eltarthatóságának növelésében. Az ókori leírásokban ezek a katonaság legfontosabb élelmiszerei. Bár világszerte többféle fermentált húskészítmény ismert, a legfontosabbak és a legnagyobb mennyiségben készülnek a szalámi- és kolbászfélék. Kiemelkedően előnyös tulajdonságuk, hogy a tejsavas erjesztés következtében megnő az alapanyag tápértéke (proteinben gazdagabb lesz, a hús fehérjetartalma könnyebben emészthetővé válik) és az eltarthatóság lényegesen meghosszabbodik, akár 1–2 évre is. Egyes termékek (pl. száraz szalámi, füstölt kolbász) tárolásához hűtés sem szükséges. Az így készült termékek mikrobiológiai szempontból biztonságosak, sokszor még abban az esetben is, ha az alapanyag patogén baktériummal vagy parazitával volt fertőzött. Lényegesek azonban a fermentált hústermékek gyártásának higiéniai körülményei, valamint a megfelelő mikrobiológiai minőségű hús és adalékanyagok (pl. fűszerek) felhasználása. Ezek a termékek ugyanis hőkezelés nélkül készülnek, és általában főzés nélkül fogyasztják őket, bár néha előfordul a termék pasztőrözése is (pl. német Koch szalámi). Sokféle élvezeti értékű, tápanyagban és aromában gazdag termékeket állítanak így elő világszerte. Legnagyobb termelők és fogyasztók az európaiak és amerikaiak, közülük is kiemelkednek a németek az átlagosan 5 kg/éves fogyasztásukkal.
A fermentált húskészítmények gyártásának mikrobiológiai háttere A fermentált húskészítmények víztartalmuk (vízaktivitásuk) alapján két csoportba sorolhatók: 175
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek 1. Száraz kolbászok és szalámik (levegőn vagy füstöléssel szárítva): 25–40% víztartalommal, vízaktivitásuk kb. 0,91, a pH-érték 4,5–5,2, átlagosan 4,8 körüli. 2. Félszáraz kolbászok és szalámik: 40–60% víztartalommal, vízaktivitásuk kb. 0.95. A pH-érték hasonló mint a száraz áruké. Ezeknél a termékeknél a befejező füstölés során 60–68 °C-os hőkezelést is alkalmaznak. A fermentált húskészítmények jellegét meghatározza • az alkalmazott hús fajtája (sertés, marha, ritkán szárnyas vagy egyéb); • a termék előállításának technológiája (sózás, nitrit/nitrát adagolása, cukortartalom, fűszerek adagolása); • a fermentációt végző természetes mikrobiota vagy starterkultúra jellege és a fermentáció hőmérséklete; • a termék további kezelése: hőkezelés, füstölés, szárítás, vagy penészes érlelés. A termékek előállításához leggyakrabban sertéshúst használnak, nemritkán marhahúst, újabban a szárnyashúsok felhasználása is növekszik. Helyi specialitásként más háziállatokból vagy vadállatokból is készítenek fermentált termékeket. A húshoz a biztonság növelése céljából 2–3% konyhasót (NaCl-ot) és 100–150 mg/kg Na-nitritet vagy Na-nitrátot adnak. Ezek nagymértékben gátolják a romlást okozó és patogén mikroorganizmusokat és hozzájárulnak az íz- és illatanyagok kialakulásához. A nitrit elsősorban a Gram-negatív baktériumokat gátolja, ezért a Gram-pozítív baktériumok (sztreptokokkuszok, mikrokokkuszok, laktobacilluszok, pediokokkuszok) dominálnak az erjesztés során. A nitritnek lényeges szerepe van a hús piros színe megőrzésében is, aszkorbinsav jelenlétében a mélyvörös színt okozó nitrozo-mioglobin alakul ki a pácolás során. A fermentációban a homofermentatív tejsavbaktériumok játsszák a főszerepet. A legtöbb terméknél starterkultúrákat alkalmaznak. Követelmény, hogy a starterek gyors és jó tejsavtermelő képességűek legyenek, ne termeljenek biogén aminokat, és jelentősen járuljanak hozzá a termékek aromájának kialakításához. Egyre fontosabb szelekciós szempont a bakteriocin-termelési képesség is. A leggyakoribb starterek: Lb. plantarum, Lb. sakei, Lb. curvatus, Pc. acidilactici, Pc. pentosaceus, Sta. carnosus és Sta. xylosus. Néhány terméknél Deb. hansenii élesztőgombát is tartalmaz a startertenyészet, amely jellegzetes színt és aromát kölcsönöz a terméknek. A nitritnek bizonyítottan mutagén hatása van, ezért bizonyos termékeknél nitrátot alkalmaznak helyette a pácolásnál. Antimikrobás és nitrozomioglobint kialakító hatása azonban csak a nitritnek van. Egyes baktériumok, főként a Micrococcus fajok képesek a nitrátot nitritté redukálni, ezért nitrát esetében a starterkultúrák valamilyen Micrococcus törzset (pl. Micr. varians, Micr. aurantiacus) is tartalmaznak. A Micrococcus törzsek kataláz enzime a tejsavbaktériumok által termelt hidrogén-peroxid lebontásával elősegíti a tejsavtermelést is. 5,4-nél kisebb pH-érték azonban gátolja a nitrátredukciót, ezért a nitrit csak az ennél nagyobb pH-jú termékeknél helyettesíthető nitráttal, és várt hatása csak az efölötti pH-tartományban érvényesül. A hús természetes cukortartalma 0,1% körüli, ami nem elegendő a tejsavbaktériumok megfelelő tejsavtermeléséhez, ezért 0,3–2% erjeszthető cukrot (glükózt, maltodextrint, szacharózt, laktózt) is adnak az alapanyaghoz. Ahhoz ugyanis, hogy a termék mikrobiológiai szempontból biztonságos legyen, a pH-nak 4,8 körüli értékre kell csökkennie. A tejsav vízmegkötő hatású, ezért fontos szerepe van a hús szöveteiben lévő víz kivonásában, a száradás gyorsításában. A fűszerek jelentős antimikrobás hatást fejtenek ki, emellett gátolják a lipidek oxidációját (az avasodást) is. Mangántartalmuk (főként a borsé) serkenti a tejsavbaktériumok anyagcseréjét. 176
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek Az érlelés alatt a tejsavbaktériumok által termelt proteázok (aminopeptidázok) és lipázok hatására az aromaanyag-termelés nő. A fermentált kolbász gyártástechnológiájának menetét és legfőbb jellemzőit mutatja be a 6.3. ábra.
177
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek
6.3. ábra - Tejsavasan erjesztett (fermentált) kolbász gyártási folyamata
178
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek Számos száraztermék (pl. magyar szalámi) jellegéhez hozzátartozik a felületi penészbevonat kialakulása is. A penészgombák szaporodásuk során a tejsavat asszimilálják, aminek hatására a pH 6,0–6,2 értékre emelkedik a felületen. A penészbevonatot a P. camemberti, P. roquefortii és P. nalgiovensis alakítja ki, amelyeknek jól jellemzett, biztonságos törzseit használják startertenyészetekként. A spontán kialakuló penészbevonatokból potenciális mikotoxin-termelő fajokat is izoláltak, a gyakorlatban azonban nem tudtak kimutatni jelentős mikotoxin mennyiséget a termékekben. Ez a tejsavbaktériumokon kívül a bors, a nitrit és a konyhasó gátló hatásának is tulajdonítható. A nemkívánatos felületi penészedés gátlására pimaricint és szorbátot használnak. Gyakran alkalmazzák a termékek füstölését is, aminek célja egyrészt a jellegzetes aroma kialakítása, másrészt mikrobiológiai szempontból lényeges a füstben lévő fenolok és savak antimikrobás hatása. A fenolok a penészedés gátlása mellett antioxidáns hatást is kifejtenek.
Fermentált hústermékek mikrobiológiai problémái A gyártás során kialakuló megfelelő mértékű pH-csökkenés (pH = 5,2), a víztartalom, illetve vízaktivitás kívánt mértékű csökkenése (aw < 0,95), valamint a romlást okozó patogén mikrobák gátlása (konyhasó, Na-nitrit, fűszerek, fenolok, bakteriocinek) segítségével a termékek alapvetően jó minőségűek és biztonságosak. Fontos azonban, hogy az alapanyagok mikrobiológiai szempontból kifogástalanok legyenek és betartsák a helyes higiéniai és gyártási gyakorlat követelményeit. A problémák általában az utóbbi hiányosságok miatt következnek be (pl. túl nagy, vagy túl kis só- és cukorkoncentráció, nem megfelelő páratartalmú, és hőmérsékletű légtér, nem megfelelő starterkultúra, a gyártási folyamatok során nem megfelelő hűtés stb.). A fermentált húskészítmények romlásának leggyakoribb okai: • felületi nyálkásodás, amit baktériumok, elsősorban Pediococcus fajok elszaporodása okoz, • a hús zöldülése: Lb. viridescens hidrogén-peroxid termelése okozza, • felületi penészesedés: zöld és fekete penészgombák elszaporodása (Penicillium, Aspergillus) a felületen, proteázaik romlást okoznak, • savanyodás, a túlzott mértékű tejsavtermelés miatt, • gázosodás: a heterofermentatív tejsavbaktériumok elszaporodása okozza. Biztonságot veszélyeztető mikroorganizmusok és paraziták, mérgezés, fertőzés fellépése: A leggyakoribb problémát az enterotoxint termelő Sta. aureus elszaporodása okozza, mert képes szaporodni kis vízaktivitású és pH-jú környezetben, valamint anaerob körülmények között is. A tejsavbaktériumok megfelelő sejtkoncentrációja esetén visszaszorul. Legfőbb veszélynek a kevésbé savanyított, nagyobb hőmérsékleten erjesztett készítmények vannak kitéve. Az enterotoxin-képzés gátlódik, ha a tejsavtermelés következtében a pH az első 48 órában 5,3 alá csökken. Kevésbé savanyított termékeknél is jelentősen csökken a baktérium elszaporodásának és toxintermelésének veszélye, ha a fermentálást viszonylag kis hőmérsékleten (< 12 °C) végzik. Salmonella és más enterobaktériumok elszaporodása esetenként előfordulhat, bár ezek sejtszáma lényegesen csökken a fermentáció és a szárítás közben. Nem lehet előre megítélni a patogén E. coli törzsek (pl. O157:H7) és a multidrog rezisztens Salmonella törzsek túlélésének veszélyét, ezért fontos, hogy az alapanyagok mentesek legyenek ezektől. 179
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek Kiemelt figyelmet érdemelnek a zoonózist okozó paraziták, ezek közül is a férgek. A háziállatok egy része, a vadállatoknak pedig nagy része fertőzött ilyenekkel. A paraziták, főként a petéik, túlélhetnek a húsban, és súlyos járvány kitörését okozhatják. A nem hőkezelt húsokból készült, fermentált termékeknél csökkenti a veszélyt, ha a fagyasztott húst legalább két hétig –18 °C-on tárolják. A legtöbb problémát világszerte a Trichinella spiralis okozta trichinellózis jelenti. Ez a parazita inaktiválódik a termék 60 °C-os belső hőmérsékletén (mikrohullámú melegítés esetén 71 °C-os hőmérséklet szükséges). Egyes állati vírusok (pl. sertéspestis vírusa) egy hónapig is fertőzőképes maradhat a fermentált kolbászban, ezért fontos a beteg állatok kiszűrése a feldolgozás előtt.
Fermentált zöldségek A zöldségfélék erjesztése – más tejsavas fermentációkhoz hasonlóan – az őskorig nyúlik vissza. Valószínűleg a kínaiak alkalmazták először, az európai kultúrákban az időszámítás kezdetének idejéről van írásos feljegyzés a káposztának agyagedényekben való savanyításáról. A modern fagyasztásos, hőtartósításos és tárolási módszerek elterjedése előtt az erjesztett termékeknek nagy jelentősége volt a vegetációs időn kívüli időszakban a zöldségfélékkel való ellátásban, így az egészséges táplálkozásban. Mint tartósítási módszer jelenleg is nagy szerepet tölt be nemcsak a gazdaságilag fejletlenebb régiókban, hanem a fejlett élelmiszer-technológiájú országokban is. A fermentált zöldségek népszerűsége annak köszönhető, hogy a tartósításon kívül sok más előnnyel is rendelkeznek. A lényegesebbek: • kedvező érzékszervi tulajdonságok és állomány, • a természetes toxinok és antinutritív anyagok lebomlása, • megnő az emészthetőség, főként a pillangósok esetében, • a tápérték növekedése, • a termékekben táplálkozási szempontból előnyös mikrobás anyagcsere-termékek felhalmozódása (pl. L(+) tejsav, aminosavak, szerves savak), • új típusú termékek előállítása (pl. szójából készült joghurt típusú ital, szójasajt, erjesztett zöldség- és gyümölcsitalok). Világszerte több mint húszféle zöldséget használnak fel az ipari szintű fermentációk alapanyagául, amelyek közül legfontosabbak a káposzta, az uborka, a paprika és az olajbogyó. A zöldségek fermentációja összetett folyamat, amelyben mikrobiológiai, kémiai és fizikai tényezők, biokémiai és enzimes folyamatok kölcsönhatása érvényesül. Pontos technológiai szabályozásuk és az egyenletes jó minőség elérése nehéz, mivel a startertenyészetek használata még elenyésző és a legtöbb terméket spontán erjesztéssel állítják elő, továbbá az alapanyagok fajtája és minősége is nagyon eltérő. Mindezek ellenére gyártástechnológiájuk fő lépései az alábbiakban foglalhatók össze: 1. A zöldségek begyűjtése. 2. Tisztítás, mosás, a sérült és beteg részek eltávolítása. 3. Hámozás, aprítás, szeletelés, előfőzés (blansírozás), esetleg főzés. 180
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek 4. Sózás vagy sós lé adagolása; ennek célja a fermentlé nyerése a zöldség víztartalmának kivonásával. Ennek következtében ozmózis útján és a sejtek plazmolízisével tápanyagok kerülnek a lébe a baktériumok számára. A só továbbá a mikrobiotát szelektálja, előnyös az erjesztést végző tejsavbaktériumok elszaporodásához. 5. Erjesztés homofermentatív és heterofermentatív tejsavbaktériumok segítségével. A legfontosabbak fajok a Ln. mesenteroides, Lb. brevis, Lb. plantarum, Pc. pentosaceus. 6. Csomagolás, pasztőrözés, tárolás.
Az erjesztett zöldségek gyártásának mikrobiológiája Az egyes termékek nagymértékben különböznek egymástól az alapanyagok sokfélesége, a tápanyagok elérhetősége, az erjedő anyag pufferkapacitása, az egymással versengő mikroorganizmusok miatt, ezért a fermentáció során fennálló ökológiai tényezők is különböznek. Ezeket mutatja be a 6.3. táblázat.
6.3. táblázat - Zöldségek erjesztését befolyásoló ökológiai tényezők Ökológiai tényező
Jellemző
Erjesztési szubsztrátum
folyadékban oldva és szilárd
Tápanyag (lé) áramlása
diffúzióval, esetenként pumpával keringetve
Alapanyag erjesztő mikrobiotája
egyenletesen oszlik el a fermentációs közegben
Patogén és romlást okozó mikro- organizmusok
valószínűleg jelen vannak (pl. Salmonella, Clostridium, Listeria, élesztőgombák, penészgombák)
Vízaktivitás
0,95–0,99
pH
savanyú káposzta, uborka: 5,9–6,5, olívabogyó: max. 8,5
Hőmérséklet
savanyú káposzta, uborka: 5–20 °C, zöldséglé: 20–25 °C
Cukortartalom
25–100 g/kg
Pufferkapacitás
0,15–0,90 g tejsav/100 g
NaCl-tartalom
savanyú káposzta: 0,6–2%, uborka: 5–10%
Az erjesztés növényi alapanyagai általában kis mennyiségben tartalmaznak tejsavbaktériumokat (6.4. táblázat), azonban a szaporodásukat elősegítő szelektív körülmények között gyorsan elszaporodnak, majd dominánssá válnak. A spontán erjesztés során megfigyelhető az egyes tejsavbaktérium fajok populációinak 181
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek egymást követő kifejlődése, bizonyos fajok dominánssá válása, majd háttérbe szorulása és más fajok előtérbe kerülése, azaz a mikrobiális szukcesszió. Jól megfigyelhető ez a savanyú káposzta erjedésének példáján, amelynek három szakaszát figyelhetjük meg (6.5. táblázat).
6.4. táblázat - Növényeken élő tejsavbaktériumok Lactobacillus spp.
Leuconostoc mesenteroides
Lb. arabinosus
Pediococcus spp.
Lb. brevis
P. acidilactici
Lb. buchneri
P. pentosaceus (syn.: P. cerevisiae)
Lb. casei
Enterococcus spp.
Lb. curvatus
E. fecalis
Lb. fermentum
E. fecalis var. liquefaciens
Lb. plantarum
E. faecium
Lb. sake
Lactococcus lactis
6.5. táblázat - A baktériumpopulációk változása a savanyú káposzta erjesztése során Aerob baktériumok
Idő (nap)
pH
Redoxpotenciál
0
6,48
NM
1
5,72
23,0
2
5,63
3
Összes (TKE/g)
Összes szám (tke/g)
Anaerob (%)
Bélbaktériumok (%)
Tejsavbaktérimok
Élesztőgobák
95,0
1,5
6,8×102
3,9×104
3,0×105
50,0
50,0
2,8×104
1,1×104
22,6
1,7×106
7,0
93,0
6,6×106
1,2×103
4,38
17,5
6,9×106
100,0
4,4×108
9,5×102
4
4,23
15,5
1,6×105
100,0
9,7×108
1,0×102
5
4,04
14,1
5,0×103
100,0
8,3×108
< 102
7
4,02
14,5
1,5×103
100,0
3,3×108
< 102
9
4,00
15,3
< 102
NM
NM
2,6×107
< 102
11
3,93
15,4
< 102
NM
NM
4,2×107
< 102
14
3,96
15,7
< 102
NM
NM
8,0×106
< 102
182
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek NM: nem mért 1. szakasz. A káposzta erjedése rögtön megkezdődik, amint szorosan összetömörítve, sózva, edényekbe töltik. Az obligát aerob mikrobák háttérbe szorulnak, és rövidesen el is pusztulnak, a fakultatív anaerobok 2–3 napig szaporodnak. Közben elfogy a rendelkezésre álló oxigén, és anaerob viszonyok alakulnak ki. A tejsavbaktériumok anyagcsere-tevékenysége következtében csökken a pH, felszaporodik a tejsav, ecetsav, hangyasav és borostyánkősav. Ugyancsak nagy mennyiségben keletkezik szén-dioxid, amitől a termék felülete habzik. A tejsavas erjedést a Leuconostoc fajok (Ln. mesenteroides és Ln. fallax) indítják el, amelyek – heterofermentatív tejsavbaktériumok lévén – a tejsav mellett etanolt, ecetsavat és szén-dioxidot termelnek. Szerepük és tevékenységük meghatározó a jó minőségű savanyú káposzta előállításához. Fő tevékenységük: • Gyors és intenzív tejsav- és ecetsavtermelésük következtében a pH két nap alatt 4,0 körüli értékre csökken, ami gátolja a rothasztó baktériumokat és a káposzta puhulását előidéző enzimek működését. • A termelt szén-dioxid kiűzi az oxigént a közegből, ami meggyorsítja az anaerob tejsavbaktériumok elszaporodását és gátló hatású több Gram-negatív baktériumra. • Az anaerob körülmények csökkentik a C-vitamin bomlását, ezért a termék C-vitaminban gazdag marad. • A Leuconostoc fajok a szacharóz hidrolízise következtében keletkező glükózt dextránná polimerizálják, a fruktózt pedig mannittá alakítják. Ez meggátolja azt a barnulási folyamatot, amit a glükóznak és fruktóznak a szabad aminosavakkal való reakciója (Maillard-reakció) okoz. A dextrán felhalmozódása (nyálkaképződés) azonban csak időleges, mert ezt és a mannitot a később elszaporodó tejsavbaktériumok szénforrásként felhasználják. • A Leuconostoc fajok a később megjelenő tápanyagigényes tejsavbaktériumok számára növekedési faktorokat termelnek. • Aromatermelésükkel nagyban hozzájárulnak a késztermék jellemző érzékszervi tulajdonságaihoz. Az erjesztés első 15 órájában megfigyelhető bizonyos Gram-negatív baktériumok (elsősorban koliformok) elszaporodása, amelyek elősegítik az oxigén felhasználását, azonban rövidesen (1–2 nap alatt) eltűnnek. 2. szakasz. A pH csökkenésével a Leuconostocok háttérbe szorulnak, az erősebben savtűrő hetrofermentatív Lb. brevis és a homofermentatív Lb. plantarum populációi növekedésnek indulnak, és rövidesen (6–8 nap után) dominánssá válnak. Erőteljes erjesztést végeznek mintegy 10 napon keresztül. 3. szakasz. 16–18 nap elteltével a Lb. brevis sejtszáma csökken, és uralkodóvá válik a Lb. plantarum, mellette pedig a szintén homofermentatív Lb. sake és Lb. curvatus szaporodik fel. Ezek teljesen kierjesztik a terméket, valamennyi szénhidrátot tejsavvá alakítanak. Ezáltal a pH 3,8 körüli értékre és a termék savtartalma 1,7–2,3%-ra áll be, amelyben az ecetsav:tejsav arány 1:4. A jellegzetes aroma- és ízkaraktert az előbbi két savon kívül a diacetil, az acetaldehid és a különböző észterek adják. Amennyiben a terméket nem pasztőrözik, hanem 10–15 °C-on tárolják, egy negyedik szakasz is következik. Ennek során ismét felszaporodik a Lb. brevis, amely a sejtfal hidrolízisével felszabaduló pentózokat használja fel szénforrásként. Így a pH 2,5 értékre csökken. 183
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek A zöldségek savanyításához – kevés kivételtől eltekintve – nem használnak startertenyészeteket, hanem a környezeti körülmények beállításával (sózás, tömörítés) indítják el a mikrobiológiai tevékenységet, és az erjedés okozta további változások alakítják a folyamatot. A fermentált zöldségek starterkultúrás erjesztésének egyik fékje e termékek előállításának alacsony profitja. Próbálkoztak ún. páros starter alkalmazásával, Ln. mesenteroides és Lc. lactis törzsek kombinációjával. A természetes (endogén) tejsavbaktériumok elnyomását a Lc. lactis által termelt nizinnel próbálják megoldani, ezért nizin-rezisztens Ln. mesenteroides törzset alkalmaznak. Kivételt jelent egy újfajta savanyú káposzta és a fermentált zöldséglevek előállítása. Az ún. L(+) savanyú káposztát a homofermentatív Lb. bavaricus starterkultúrával erjesztik, amely többségében L(+) tejsavat termel. Az L(+) tejsav élettani szempontból kedvezőbb, mint a tejsavbaktériumok által termelt másik sztereoizomer, a D(–) tejsav, ugyanis az előbbi gyorsan és teljes mértéken metabolizálódik, míg a másik lassan, és ha túl sok D(–) tejsav kerül a szervezetbe, acidózis alakul ki, ami szöveti károsodást okozhat. Különösen érzékenyek az acidózisra a csecsemők. Mindenféle tejsavasan erjesztett élelmiszer esetében kívánatos a D(–) tejsav mennyiségét minimálisra szorítani. Az L(+) savanyú káposztát Németországban fejlesztették ki és a Lb. bavaricus starterkultúra sikere annak köszönhető, hogy erőteljesen elnyomja a Leuconostoc és más homofermentatív tejsavbaktériumok szaporodását, ezért a termék tejsavtartalmának 90%-a L(+) izomer. A Leuconostoc szaporodásának visszaszorítása következtében a termék aromában szegényebb, mint a szokásos termékek, azonban fokozottan egészséges volta miatt nagy népszerűségnek örvend Németországban. A fermentált zöldségleveket általában pasztőrözött alapanyagokból állítják elő, ezért ezek tejsavas erjesztése starterkultúrák nélkül nem oldható meg. A leggyakoribb starterek: Lb. plantarum vagy Lb. casei, Lc. lactis, Ln. mesenteroides. Az uborka tejsavas erjesztése hasonló a káposzta savanyításához, azonban ebben az esetben a heterofermentatív tejsavbaktériumok (Ln. mesenteroides, Lb. brevis) elszaporodása nem kívánatos, mivel a termelt szén-dioxid az uborka belsejében felszaporodva üregesedést, puhulást okoz. A technológia annyiban tér el a káposzta savanyításától, hogy a darabos uborkát nem sóval keverik, hanem sós lébe helyezik. A só az uborka víztartalmának és szárazanyagainak egy részét extrahálja, ezért a tejsavbaktériumok elszaporodnak. A legtöbb tejsavat a Lb. plantarum termeli, mellette az Ec. faecalis és a Pc. acidilactici játszik szerepet. Az erjedés mikrobiológiai folyamatait a 6.4. ábra mutatja be. A fermentáció irányítására kidolgoztak egy biztonságosabb technológiát is, amelyben 6%-os konyhasó, ecetsav és Na-acetát oldatot használnak a léhez, amelyet Pc. acidilactici és/vagy Lb. plantarum törzsekkel oltanak be.
184
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek
6.4. ábra - A jellemző mikrobacsoportok számának változása a pH függvényében uborka tejsavas erjesztése során
A fermentált olívabogyó spontán erjesztésében különböző baktériumok, élesztőgombák és penészgombák vesznek részt. Erjesztése a savanyú káposztáéhoz hasonló, azzal a különbséggel, hogy az erjesztés előtt az olívabogyót lúggal kezelik, az erjedési folyamat lassú, bár ma már általában starterkultúrát használnak. A zöld olívabogyót szüretelés után 21–25 °C-on, 4–7 óráig 1,6–2%-os lúggal kezelik a benne lévő keserű oleuropein glikozid lebontása céljából. A lúg kimosása és semlegesítés után az olivabogyót 7,5% NaCl-ot tartalmazó lébe teszik és Lb. plantarum színtenyészettel beoltják. Az erjesztés 6–10 hónapig tart, ami alatt kb. 1% tejsav képződik és a pH 3,8–4,0 értékre csökken. Az erjesztésben a starter fajon kívül a Lb. mesenteroides, Lb. plantarum és Pc. pentosaceus is részt vesz.
Erjesztett zöldségek mikrobiológiai problémái és biztonsága A termékek nagy só- és savtartalma és kis pH-ja miatt mikrobiológiai szempontból biztonságosak. A problémát elsősorban a termékek romlása jelenti, amit főként a nagyobb hőmérséklet, a nem megfelelő sókoncentráció és az aerob körülmények okozhatnak. Savanyú káposztánál 32 °C feletti hőmérsékleten a Leuconostoc fajok már nem szaporodnak, ezért a Lb. plantarum és a Pc. pentosaceus válik dominánssá. A Maillard-reakció következtében a termék megbarnul és aromában szegény lesz, valamint nyálkásodás következik be. Aerob körülmények között (ha pl. a fedőlé elpárolog) elszaporodnak az élesztő- és penészgombák, így alkoholos erjedés indul meg, élesztőszagú lesz a termék, és a penészek által termelt pektinázok puhulást okoznak. Gyakori az elszíneződés is, a Rhodotorula élesztőgombák például piros színt okoznak. Kis sókoncentráció esetén a rothasztó baktériumok elszaporodása jelenthet problémát. 185
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek Az uborka fermentációjánál a szén-dioxid-képződés a leggyakoribb romlási tényező. A szén-dioxid elsősorban a heterofermentatív tejsavbaktériumok elszaporodása következtében az uborka belsejében halmozódik fel, és puffadást okoz. A B. nigrificans feketedést, penészgombák és más Bacillus fajok pedig pektináz termelésük miatt, puhulást okoznak. A fermentált olívabogyónál is felléphetnek romlási folyamatok. A propionsav-baktériumok erjedési termékei kellemetlen szagot idéznek elő. Puhulás is gyakran végbemegy, amit elsősorban a poligalakturonázt termelő Rhodotorula fajok okoznak. Sok baktérium (Cellulomonas, Xanthomonas, Enterobacter) termel cellulázt, ami héjleválást és puhulást idéz elő. Zöldség alapanyagokban előfordulhat nagy nitráttartalom, ami a tejsavbaktériumok anyagcsere-tevékenysége következtében az erjedés alatt nitritté redukálódik. A nitritből savas körülmények között nagyon veszélyes karcinogén vegyületek, nitrozaminok jönnek létre. Ezért nagyon fontos, hogy erjesztésre kis nitráttartalmú alapanyagokat használjanak fel.
Probiotikumok és prebiotikumok A probiotikum elnevezést a 60-as években alkalmazták először olyan élő mikroorganizmusokra, amelyek elfogyasztása jótékony hatású az emésztőrendszerre. Jóllehet nincs teljesen egységes felfogás azt illetően, hogy valóban élő mikrobáknak kell-e jelen lenni a probiotikus élelmiszerben a várt hatás kifejtéséhez, ennek ellenére általában az a cél, hogy a probiotikus mikrobának minél több élő sejtje érje el a vastagbelet. Egyértelműen igaz ez a probiotikus joghurtokra. Az ilyen joghurt a tejsavtermelő tejsavbaktérium(ok)on kívül valamilyen humán Bifidobacterium faj (leggyakrabban Bifidobacterium bifidum vagy Bif. longum) törzsét tartalmazza élő állapotban, 106–107 sejt/ml koncentrációban. A Bifidobacterium fajok az egészséges vastagbél mikrobiotájának aktív tagjai, amelyeknek az immunrendszert stimuláló és a patogén baktériumokat gátló antibiotikus hatást tulajdonítanak. A patogén baktériumok gátlásában a tejsavtermelésen kívül egyéb szerves savak, valamint a bakteriocin termelésnek is szerepe van. Kísérletek bizonyítják, hogy a probiotikus joghurt fermentációja során a Ye. enterocolitica koncentrációja 4– 5 nagyságrenddel csökkent, és más patogén baktériumokkal szemben is kimutattak hasonló gátló hatást. A bifidobaktériumok a gyomorsav és az epe mikrobaölő hatásának jól ellenállnak. Obligát anaerob baktériumok, amelyek negatív elektrokémiai potenciált igényelnek a szaporodáshoz és viszonylag érzékenyek a savas közeggel szemben, ezért a probiotikus joghurt tárolása alatt koncentrációjuk gyorsan csökken. A tejsavbaktériumokon és bifidobaktériumokon kívül más baktériumoknál is kimutattak probiotikus hatást. Néhány Bacillus faj (többnyire a B. clausii, B. pumilus, B. cereus) élő spórái az immunrendszert stimuláló hatást fejtenek ki, ami azonban a vegetatív sejtekre nem jellemző. A prebiotikumok olyan vegyületek, amelyek nem bomlanak le az emésztőrendszerben, hanem a vastagbelet elérve a bifidobaktériumoknak és a probiotikus tejsavbaktériumoknak növekedési szubsztrátumként szolgálnak. Ezek többnyire oligoszacharidok (pl. az inulin fruktooligoszacharidjai). A prebiotikumokat közvetlenül az élelmiszerhez adagolják.
Biogén aminok és eredetük tejsavasan erjesztett termékeknél A biogén aminok gyengén toxikus vegyületek, amelyek elsősorban aminosavak dekarboxilezésével keletkeznek. Előfordulásuk különösen a tejsavasan erjesztett termékekben gyakori, mivel képződésüket elősegíti a kis pH- és a nagy NaCl-tartalom. A legfontosabb biogén aminokat és prekurzoraikat a 6.6. táblázat mutatja. Átlagosan 1000 μg/g biogénamin-tartalom vált ki toxikus tüneteket, jó gyártási gyakorlat esetén azonban mennyiségük nem haladja meg a 100–200 μg/g-ot. A 186
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek leggyakoribb biogén aminok esetében a következő értékek tekinthetők elfogadhatónak: hisztamin 50–100 μg/g; tiramin 100–800 μg/g; fenil-etilamin 30 μg/g. Elsősorban sajtokban, fermentált hústermékekben, malolaktikusan erjesztett borban, ritkábban erjesztett zöldségfélékben kell számítani rájuk. Biogén aminokat gyakran képeznek az enterobaktériumok és az enterokokkuszok, míg az erjesztésekben kulcsszerepet játszó tejsavbaktériumok dekarboxiláz-aktivitása általában kicsi. Startertenyészetek szelektálásánál fontos szempont a kis dekarboxiláz-aktivitás. Sajtok közül elsősorban a lágy sajtoknál fordul elő nagy biogénamin-tartalom a baktériumok tevékenysége következtében. Leggyakrabban a brie, a camembert és a kék (pl. rokfort) sajttípusoknál találtak a toxikus határértékhez közeli vagy azt meghaladó biogénamin-tartalmat, sőt mérgezési haláleset is előfordult. Hústermékek biogénamin-tartalmáért elsősorban az Enterobacteriaceae fajok kadaverin- és a heterofermentatív tejsavbaktériumok tiramintermelése felelős.
6.6. táblázat - A legfontosabb biogén aminok és a prekurzoraik Biogén amin
Prekurzorok
Etilamin
alanin
Putreszcin
ornitin
Hisztamin
hisztidin
Kadaverin
lizin
Tiramin
tirozin
Fenil-etilamin
fenilalanin
Triptamin
triptofán
Spermidin
putreszcin + metionin
Néhány fermentált zöldségnél, elsősorban a savanyú káposztánál és az olívabogyónál előfordulhat nagy biogénamin-tartalom, ami a romlást okozó baktériumok és bizonyos tejsavbaktériumok elszaporodásának következménye. Elsősorban putreszcin, kadaverin, hisztamin és tiramin halmozódhat fel. Az előidéző baktériumok az erjedés kezdetén az Enterobacteriaceae egyes fajai, néhány Bacillus faj, az erjedés végén pedig a Lactobacillus, Pediococcus és Streptococcus nemzetségek egyes fajai. Kimutatták, hogy Lb. plantarum straterkultúrával való beoltás csökkenti a biogén amin szintet.
Alkoholosan erjesztett termékek Az élesztőgombák anaerob energianyerő folyamatuk, az alkoholos (etanolos) erjesztés során szénhidrátokból főként etanolt és szén-dioxidot állítanak elő. Ezt a tevékenységüket használja fel több élelmiszer-ipari technológia, amelyek közül legjelentősebb a kenyér, az alkoholos erjesztett italok (sör, bor) és a szesz gyártása. Ezekben a folyamatokban a Saccharomyces nemzetség fajai játsszák a kulcsszerepet, közülük is az ember „háziasítási” tevékenysége következtében kifejlődött, egymással szoros rokonságot mutató, az ún. Saccharomyces sensu stricto csoport fajai (6.7. táblázat).
187
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek
6.7. táblázat - Alkoholtartalmú italok erjesztésében jelentős élesztőgomba fajok Saccharomyces sensu stricto fajok
Termék
S. bayanus
bor, pezsgő
S. cerevisiae
kenyér, sör, bor, pezsgő, etanol
S. paradoxus
bor
S. pastorianus
sör
Az alkoholos erjedés anaerob körülmények között játszódik le, az élesztőgombák azonban szigorúan anaerob körülmények között nem képesek szaporodni. Ennek fő oka az, hogy egyes intracelluláris enzimes folyamatok csak az oxigén legalább nyomokban való jelenlétében mennek végbe. Ilyen például a membránokat felépítő foszfolipidek és ergoszterol bioszintézise. Ezt bizonyítja, hogy a membránba beépülő, annak intakt szerkezetéhez szükséges vegyületek (pl. TWEEN–80, ergoszterol) kiegészítésével az élesztők szigorúan anaerob körülmények között is szaporíthatók a szokásos módon. A Saccharomyces sensu stricto fajokra általánosságban jellemző, hogy aerob körülmények között is csak kis glükózkoncentrációnál (0,1%) képesek a légzésienergianyerésre. Ha a glükózkoncentráció ezt az értéket meghaladja, az élesztő a légzésről az erjesztésre tér át. Ez a jelenség a glükóz- vagy katabolitrepresszió, amelyet az élesztőknél Crabtree-hatásnak neveznek. A Saccharomyces fajok glükózérzékenységének valószínű magyarázata az, hogy ezek az élesztőgombák elsősorban a nagy cukortartalmú gyümölcslevek erjesztéséhez alkalmazkodtak úgy, hogy a légzési kapacitásuk csökkent, ezért a glikolízisben keletkezett felesleges piroszőlősav (piruvát) az alkoholos erjedés irányában halad tovább. A 6.5. ábra összefoglalja az etanolos erjedés biokémiai folyamatának főbb lépéseit.
6.5. ábra - Az alkoholos erjedés főbb biokémiai lépései
Az alkoholos erjedés mellett olyan anyagcsere-folyamatok is lejátszódnak, amelyek az alkoholosan erjesztett italokra jellemző, elsősorban aroma szempontjából fontos termékeket képeznek. A termékek skálája és mennyisége az alapanyag összetételén kívül nagymértékben függ az erjesztő élesztőtörzsektől is. Ilyen íz- és illatanyagok a kozmaolajok (pl. izoamil-alkohol, propanol, butanol), az észterek (pl. etil-acetát), a szerves savak (pl. citromsav, borostyánkősav, ecetsav) és az aldehidek (pl. acetaldehid), amelyek elsősorban szénhidrátokból és aminosavakból keletkeznek. Általánosságban elmondható, hogy aminosavak esetében transzaminálási reakcióval oxosavak jönnek létre, amelyek dekarboxilezésével aldehid, majd ennek enzimes redukálásával alkohol keletkezik. Fontos aromavegyületek az ún. vicinális diketonok (diacetil és pentán-2,3-diol), mennyiségük különösen sörökben fontos. A diacetil (bután-2,3-diol) és a pentán-2,3-diol az elágazó szénláncú aminosavak (valin és izoleucin) lebontásával jönnek létre az élesztőben, amely kiválasztja őket a közegbe. 188
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek A különböző erjesztett alkoholos italok eltérő alapanyagokból, eltérő technológiákkal készülnek, bár van bennük néhány közös vonás is. Legfőbb jellemzőiket a 6.8. táblázat mutatja.
6.8. táblázat - A legfontosabb alkoholosan erjesztett italok előállításának jellemzői Sör
Whisky
Bor
Desztillált szeszes italok
Alapanyag
árpa és árpa segédanyagok (rizs, (malátawhiskynél) búza, kukorica stb.) árpa, búza (gabonawhiskynél)
szőlő
árpa, gabonafélék, melasz, szőlő, savó stb.
Alapanyag kezelése
malátázás, cefrézés malátázás, cefrézés
zúzás, macerálás
alapanyagtól függően változó
Főzés
van
nincs
nincs
nincs
Erjesztés
S. cerevisae
S. cerevisae
S. cerevisae
S. cerevisae
S. bayanus
K. marxianus (savó esetén)
S. pastorianus Élesztő visszatáplálás
van
nincs
nincs
nincs
Desztillálás
nincs
van
nincs
van
Érlelés
van: hetek
van: évek
van: hónapok– évek
változó (pl. vodkánál nincs, konyaknál évek)
40–45
8–14
35–45
Alkohol tartalom (tf. 3–6 %)
A sörgyártás technológiája A sör a gabonafőzetekből alkoholos erjesztéssel előállított ital, készítésének nyomai már az ősi civilizációknál megtalálhatók. A sumérok az i. e. 6000 körüli időszakból fennmaradt agyagtábláikon megjelenítették a sörkészítés műveleteit, az egyiptomi piramisokban is sírfeliratok és rajzok ábrázolják. A jelenleg gyártott sörtípusok készítésének eredete a középkorba nyúlik vissza, fő bölcsői Anglia, Németalföld (főként a mai Belgium) és Csehország egyes vidékei voltak. Lényeges különbség van az angol és a kontinentális sörök között; az előbbiek felsőerjesztésű (ún. ale típusú), az utóbbiak alsóerjesztésű (ún. lager vagy ászok) eljárással készülnek. Mint a nevekből is kitűnik, az ale (ejtsd él) sörök esetében az erjedés vége felé az élesztősejtek „felúsznak” a sör felső részébe és itt folytatják tovább az erjedést. A lager sörökben az élesztők a főerjedés végén kiülepednek az erjesztőkád vagy -tank aljára, és itt folytatják tovább az erjesztést. A kétféle technológia csak kismértékben különbözik egymástól, a továbbiakban a lager típusú sörök előállításának technológiáját ismertetjük, hangsúlyozva a mikrobiológiai folyamatok alapjait, illetve az erjesztés folyamatát. 189
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek Az erjesztéshez használt sörlét viszonylag egyszerű, azonban pontosan vezetett technológiai lépésekkel állítják elő. A legfontosabb cél az, hogy az alapanyagként használt sörárpa keményítőtartalmát annak saját endogén enzimei (amilázai) a sörélesztő számára erjeszthető szénforrásokká, cukrokká bontsák le. Az enzimek indukciója az árpa csíráztatásával történik, a megfelelő mértékű keményítőbontás után azonban hővel (forralással) inaktiválják az enzimeket, amelyek a kész sörlében már nem működnek. A technológiai folyamat hat fő szakaszra bontható: malátázás, cefrézés, sörlé főzés, erjesztés, érlelés (ászokolás) és fejtés. Ezek legfontosabb lépéseit a 6.6. ábra mutatja.
190
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek
6.6. ábra - A sörgyártási technológia műveleti lépései
191
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek 1. Malátázás: a sörárpát áztatják, majd csíráztatják. Ennek során a csírában a keményítőbontó (α- és β-amilázok), valamint a fehérjebontó (proteáz) enzimek aktiválódnak, és a tartalék tápanyagok (keményítő, fehérje) oldatba mennek. A sejtfalglükán széttörik, és részben kioldódik. A malátát szárítják (aszalják), ezáltal a csírát inaktiválják (leáll a légzése). 2. Cefrézés: a megőrölt malátához vizet adnak, és 70 °C körüli hőmérsékletre melegítik. Ekkor az α-amiláz hatására a keményítő elfolyósodik, a β-amiláz pedig maltózra bontja. Kisebb mennyiségben glükóz és maltodextrinek is keletkeznek. A keményítőbontás gyorsítása és fokozása céljából gyakran alkalmaznak penész eredetű glükoamiláz enzimet is. A proteázok a fehérjéket peptidekre és aminosavakra bontják. Lényeges még a foszfatáz enzim tevékenysége is. Az enzimes folyamatok optimális pH-ja 5,4, hőmérsékleti optimuma pedig 67 °C. A folyamat gyors, elméletileg 5 perc alatt lezajlik. Különböző cefrézési eljárásokat dolgoztak ki, amelyek egy- vagy többlépéses hőkezelést alkalmaznak az enzimes folyamatok minél hatékonyabb lejátszódása céljából. Végül a sörlét szűréssel nyerik. A sörlé oldott cukortartalma kb. 10%, amelyben legtöbb a maltóz (kb. 4%), kevesebb a glükóz és a maltotrióz (kb. 2–2%), a maradék pedig maltodextrin. 3. Sörléfőzés: a sörléhez a forralás előtt komlót adnak, amelyből a komlósavak (humolon, kohumulon és adhumulon) kioldódnak és a forralás következtében keserű ízt adó izosavakká alakulnak. A sörlét 1,5–2,5 óráig főzik az enzimek inaktiválása, a fehérjék kicsapása és eltávolítása, valamint a mikrobák elpusztítása céljából. A sörlét szűrik, majd lehűtik. 4. Erjesztés: a sörlét levegővel telítik, majd fajélesztővel beoltják (0,03–0,05%, kb. 107 sejt/ml). Ez a szaporítási fázis, amelynek során az élesztő 3–4 generációt osztódik, a sejtszám kb. egy nagyságrenddel nő. A beoltásra használt élesztőnek jó fiziológiai állapotban kell lennie, amit a membránok épségén kívül a tartalék szénhidrátok (glikogén, trehalóz) megfelelő mennyisége és a holt sejtek kis száma mutat. A főerjedés viszonylag gyorsan, 5–7 nap alatt lezajlik. 5. Érlelés (láger söröknél ászokolás): a főerjedés befejeztével a nyers sör, más néven zöld sör vagy fickósör keletkezik, amelyben még sok a szuszpendált élesztősejt, csekély a szén-dioxid-tartalma és nem fejlődött még ki a jellemző aromakarakter. Különösen nagy a vicinális diketon (diacetil és 2,3-pentándiol) tartalma, amely kellemetlen, kaparó ízt ad a sörnek. Az ászokolás hőmérséklete 0–1 °C, a sejtek azonban még tovább folytatják az erjesztést nagyon kis aktivitással (elsősorban a maradék maltotriózt erjesztik etanollá és szén-dioxiddá). Az ászokolás 3–5 hétig tart, amelynek első hetében kialakul a végleges aromakarakter és a vicinális diketon (elsősorban a diacetil) tartalom megfelelően csökken. Az illóanyagok (elsősorban a H2S és egyéb kénvegyületek, acetaldehid) eltávoznak, míg a diacetil az élesztősejtek segítségével 2,3-butándiollá alakul, de egy része kémiailag is lebomlik. A 2,3-pentándiol bomlása kevésbé kritikus, mivel ennek ízküszöbe kb. hatszor nagyobb, mint a diacetilé. A diacetil egy részét az élesztősejtek metabolizálják, etanollá erjesztik. 6. Fejtés, töltés: a láger söröket szűrik, majd pasztőrözik és szén-dioxid-tartalmát a szükséges szintre emelik. A kiszeparált élesztőt mossák, és többször felhasználják új sörlé erjesztéséhez.
A sörélesztők fontosabb tulajdonságai Mint említettük, az ale és a lager sörök gyártási technológiája csak kismértékben különbözik. A lager sört kisebb (8–12 °C), az ale sört nagyobb (16–20 °C) hőmérsékleten erjesztik, ezért az aromák mennyisége és összetétele is eltér. A kétféle sör közötti különbséget elsősorban az alkalmazott sörélesztő törzsek genetikailag meghatározott tulajdonságai okozzák. A legfontosabb különbség a sejtek összekapcsolódási (csomósodási vagy flokkulációs) képességében keresendő, amit akár egyetlen génben (FLO1) való eltérés is okozhat, a faji hovatartozás nem lényeges. A lager sörélesztő (S. pastorianus) kis hőmérsékleten is jól erjeszt, az ale típusú S. cerevisiae törzsek erjesztési hőmérséklete nagyobb. 192
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek A ma használt sörélesztő törzsek hosszú, valószínűleg több évszázados szelekcióval alakultak ki úgy, hogy a sörkészítők a kedvező erjesztési tulajdonságokkal bíró élesztősejttömeget az erjedés után átvitték egyik erjesztő tartályból a másikba, ezzel beoltva azt és irányítva az erjesztést. A színtenyészetek (starter törzsek) használatát a dán Christian Hansen vezette be az 1880-as években úgy, hogy a sörerjesztést végző élesztőtenyészetekből mikroszkóp alatt izolálva egysejtkultúrákat állított elő, majd ezeket szaporították el és használták a sörlé beoltására. Ma a nagy söripari cégek több száz különböző törzsből álló gyűjteményt tartanak fenn, amelyek egy része fiziológiai, technológiai és nemritkán genetikai szempontból is jól jellemzett, stabil törzs. A molekuláris biológiai, elsősorban a PCR technikák (lásd 10.4.) elterjedésének köszönhetően ezek a törzsek jól azonosíthatók és megkülönböztethetők egymástól; a rendszertani, fiziológiai és technológiai jellemzők mellett jól reprodukálható molekuláris ujjlenyomat alapján. A sörélesztő törzsek faji hovatartozását illetően nem teljesen egységes az álláspont. Valószínű azonban, hogy többségük két különböző fajhoz tartozik; nevezetesen a S. cerevisiae és a S. pastorianus (régebbi nevén S. carlsbergensis) fajokhoz. Az ale törzsek a S. cerevisiae, a lager törzsek többsége a S. pastorianus fajt képviseli, de ez utóbbiak között is előfordulnak S. cerevisiae törzsek. A S. pastorianus fajt a S. cerevisiae faj carlsbergensis változatának (S. cerevisiae var. carlsbergensis) is tekintik, amely valószínűleg a S. cerevisiae és a S. monacensis természetes hibridje. A S. pastorianus és a S. cerevisiae többnyire elkülöníthető egy egyszerű cukorhasznosítási teszttel: az előbbinek általában van melibiáz enzime és a melibiózt erjeszti, míg az utóbbiból hiányzik ez az enzim, ezért melibióz-negatív. A 6.9. táblázat mutatja a lager és az ale törzsek legfontosabb jellemzőit és különbségeit.
6.9. táblázat - Az alsóerjesztésű (lager) és felsőerjesztésű (ale) sörélesztő törzsek fiziológiai és genetikai jellemzői Alsóerjesztésű (láger) sörélesztő
Tulajdonság Faji besorolás
S. pastorianus
Felsőerjesztésű (ale) sörélesztő S. cerevisiae
(syn.: S. carlsbergensis) és S. cerevisiae Szelekció iránya
alkohol tolerancia
alkohol tolerancia
Ploiditás
diploid, poliploid, aneuploid
diploid, aneuploid
Spórázás
gyenge
jó
Spórák életképessége
rossz
rossz
Csomósodás (flokkuláció)
erős
gyenge vagy nincs
Szaporodási ráta
lassú
lassú
Erjesztés
gyors
gyors
Melibióz hasznosítás
pozitív
negatív
Maltóz hasznosítás
kiváló
átlagos 193
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek a maltózfelvételt nem gátolja (represszálja) a glükóz
a maltózfelvétel glükózrepresszió alatt áll
Maltotrióz hasznosítás (transzport)
jó
gyenge
Valintranszport
gyenge
gyenge
Fenolaroma termelése
nincs (ferulasav dekarboxiláz nincs (ferulasav dekarboxiláz aktivitás hiányzik) aktivitás hiányzik)
Erjesztés 8 °C-on
jó
gyenge
Erjesztés 37 °C-on
nincs
igen
A sörélesztő törzsek folytonos szelekciója következtében a diploid törzsekben felszaporodtak a mutációk, ami többek között az ivaros szaporodási képesség elvesztésével járt. Bár számos törzs képes meiózisra és aszkuszképzésre, azonban az aszkospórák többnyire életképtelenek, ezért az ivaros ciklus nem teljes. Ennek következtében a sejtekben gyakoriak a kromoszóma aberrációk, a homológ kromoszómák között nagyfokú a méret polimorfizmus és gyakori az aneuploidia is. A sörlé saját íz- és aromavegyületekben szegény, ezért az erjedési aromák hatása markánsan érvényesül. Tápanyagokban viszont gazdag, ami elősegíti az erjedési melléktermékek és másodlagos anyagcseretermékek képződését. Ezzel magyarázható, hogy a törzsszelekció a gyengébb aromatermelő törzsek felé irányult, és a sörélesztő törzsek aromaspektruma és intenzitása általában elmarad az egyéb erjedésipari Saccharomyces cerevisiae törzsek (pl. borélesztők, szeszélesztők) mögött. Különösen igaz ez az erős ízű, kéntartalmú aromaanyagokra, dekarboxilezett aminosav-származékokra és egyéb lebontási termékekre. A modern sörgyártási technológiában az erjesztést gyakorlatilag steril sörlével indítják, zárt rendszerben, és igyekeznek a mikrobás fertőződést minimálisra csökkenteni. A sör esetében minden mikroorganizmus, ami nem tartozik a színtenyészethez, idegen mikrobának számít. Ilyenek a nem sörélesztő Saccharomyces sensu stricto törzsek is, amelyek különösen azért veszélyesek, mert jó alkoholtűrésük és gyors erjesztésük következtében versenyeznek a sörélesztővel. Ha a nem sörélesztő élesztőgombák aránya (az ún. vadélesztő vagy idegenélesztő szám) az 1–2%-ot meghaladja, hatásuk az aroma romlásában már érezhető. Megnő például a fenolos ízt adó 4-vinil-guajakol mennyisége, amely a sörlében lévő ferulasav dekarboxilezésével keletkezik. Ezt az enzimet minden nem sörélesztő Saccharomyces törzs tartalmazza, míg a sörélesztőknél nem működik az enzimet kódoló POF1 gén. A kis erjesztési hőmérséklet is a megfelelő aromaspektrum és -szint elérése miatt szükséges. Ezt támasztják alá a 6.10. táblázatban bemutatott adatok, amelyek szerint az erjedési melléktermékek mértéke a nagyobb hőmérsékleten erjesztett ale sör esetében meghaladja a kisebb hőmérsékleten erjesztett lager sörét.
6.10. táblázat - Sörökben előforduló kozmaolajok Kozmaolaj (alkohol)
Lager sör (mg/ml)
Ale sör (mg/ml)
Propanol
10
40
Izobutanol
10
30
Amilalkohol
10
15
Izoamil-alkohol
40
50 194
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek 2-fenil-etanol
30
40
A jó sörélesztő törzsek tulajdonságai az alábbiakban foglalhatók össze: • nagy erjesztési sebesség alacsony sejthozam mellett, • jó maltóz- és maltotrióz-erjesztő képesség, • a kéntartalmú vegyületek csökkent metabolizmusa, • jó alkoholtolerancia, • jó erjesztőképesség szuboptimális hőmérsékleten (8–15 °C között), • jó stressztűrő képesség, elsősorban az etanollal, ozmotikus nyomással és gravitációs nyomással szemben, • megfelelő és stabil aromatermelési szint, • az adott technológiának megfelelő flokkulációs képesség, • genetikai stabilitás az erjesztés során, • a jó életképesség megőrzése és genetikai stabilitás a törzsfenntartás során. A genetikailag meghatározott tulajdonságok mellett fontos, hogy az erjesztőképességet befolyásoló tényezőket igyekezzenek az optimálishoz közelíteni. Ezek közül a legfontosabbak: • a beoltásra használt élesztő mennyisége: 0,03–0,05%, • a sejtek jó életképessége, • a fermentáció hőmérséklete (8–15 °C), • a sörlé oxigéntartalma: a szaporítási fázisban levegőztetés, erjesztési fázisban anaerobiózis, • a sörlé erjeszthető szénhidráttartalma: glükóz, maltóz, maltotrióz erjeszthető, maltotetraóz és magasabb maltodextrinek nem (ezek a sör „testességét” adják), • a sörlé nitrogéntartalma: megfelelő malátázási és cefrézési eljárással biztosítható az élesztő igénye, • intracelluláris tartalék szénhidrátok (glikogén, trehalóz) megfelelő szintje. 195
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek Az egyes sörélesztő törzsek, valamint a fertőző „idegen élesztők” megkülönböztetésére a következő vizsgálatokat alkalmazzák a technológiai folyamat során: Mikrobiológiai vizsgálatok 1. Cukrok és egyéb szénhidrátok (glükóz, szacharóz, maltóz, galaktóz, maltotrióz, melibióz, raffinóz, trehalóz, dextrin) erjesztése. 2. Telepmorfológia. 3. Különböző antibiotikum (nisztatin, cikloheximid) koncentrációk gátló hatásának meghatározása. Erjesztési vizsgálatok (laboratóriumi léptékben) 1. Fermentációs ráta vizsgálata. 2. A sörlé teljes kierjesztésének %-os határértéke. 3. Nitrogénforrás felvételének hatékonysága. 4. Habképző képesség. 5. Flokkulációs képesség. 6. Élesztőhozam. 7. Erjedési aromák termelése, a kiérlelt sör zamata. 8. A kész sör pH-ja.
Sörélesztők genetikai javítása A sörerjesztés különleges ökológiai körülményei miatt a jelenleg használt törzsek távol állnak az optimálistól, ezért folyamatos igény jelentkezik a sörélesztő törzsek javítására genetikai úton (nemesítésére). A sörgyártási technológia fejlesztése (pl. szénhidráttartalmú segédanyagok alkalmazása), valamint új termékek előállítása ugyancsak megkövetelné új, nemesített törzsek előállítását. Erre mutat be néhány példát a 6.11. táblázat.
6.11. táblázat - Sörélesztő törzsek nemesítésének céljai és lehetőségei Technológia javítása
Új segédanyagok alkalmazása
Új termékek előállítása
196
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek Erjesztési ráta növelése
keményítő erjesztése
Hőmérsékleti optimumhoz közelítés
cellulóz erjesztése
Szaporodási ráta növelése
laktóz erjesztése
csökkentett szénhidráttartalmú (alacsony kalóriatartalmú) sör előállítása
Ozmózisos tolerancia növelése
alacsony alkoholtartalmú sör előállítása
Alkoholtolerancia növelése
speciális aromájú sörök előállítása
Proteinhidrolízis javítása β-glükán-hidrolízis növelése
tömény sör előállítása
Alacsony diacetiltartalom elérése Íz- és illatanyag-termelés megváltoztatása Flokkuláció szabályozása Fertőzések elleni védelem A törzsek speciális genomszerkezete, ivaros folyamataik hiányossága azonban nehézzé teszik a mutációval és rekombinációval (természetes hibridizációval, protoplasztfúzióval) történő törzsjavítást. Ennek ellenére sikerült néhány olyan törzset kifejleszteni, amelyeknek egyes erjesztési tulajdonságai megjavultak (pl. maltózfelvétel glükóz derepresszáltsága, dextrin-erjesztési képesség a glükoamiláz gén bevitele következtében, flokkulációs képesség javítása, aromaképzés javítása, killer tulajdonság bevitele). Jóval több lehetőséget kínál a rekombináns DNS technika (génsebészet) alkalmazása, mivel ebben az esetben célzottan lehet egy-egy tulajdonság génjét módosítani, valamint teljesen új tulajdonság (pl. enzimtermelő képesség) kialakítására is mód nyílik. Ezzel a módszerrel számos nemesített törzset állítottak elő. Néhány példa ipari technológiában is alkalmazható, genetikailag módosított törzsre: 1. Maltodextrin-erjesztő képesség megszerzése élesztőgombák vagy A. niger glükoamiláz (STA) génjeinek klónozásával. Az ilyen törzsekkel kis szénhidráttartalmú sör állítható elő. 2. A sörlében lévő, szűrési nehézséget és zavarosságot okozó árpahéj eredetű, – glükán lebontása gombából, baktériumból vagy árpából származó – glükanáz gén transzformálásával. 3. A sörlé erjeszthető nitrogén tartalmának növelése és a sör zavarosságának csökkentése élesztő eredetű proteáz gén klónozásával sörélesztőben. 4. Maltózhasznosítási képesség javítása maltóz-permeáz gén (MAL61) transzformálásával. 5. Káros kéntartalmú metabolitok (pl. kénhidrogén) termelésének csökkentése cisztation-szintáz gén klónozásával. 6. Ászokolási idő csökkentése egyrészt a diacetiltermelés csökkentésével (a valin és az izoleucin bioszintézis utakban az enzimaktivitás változtatásával a diacetiltermelés csökkenthető, pl. az ILV5 gén klónozásával); vagy a diacetil lebontásának gyorsításával (α-acetolaktát-dekarboxiláz gén klónozása baktériumból sörélesztőbe). 197
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek 7. Flokkuláció idejének szabályozása: élesztő eredetű FLO1 gén klónozásával a flokkuláció az erjesztés végén indul meg. 8. Sörillatanyagok stabilizálása a SO2-termelés növelésével: sörélesztő szulfit-reduktáz génjének (MET10) kiütésével a SO2-termelés megnő. A géntechnológiával módosított (GM) törzsek ipari alkalmazásának azonban egyelőre számtalan korlátja van, amelyek miatt nem várható, hogy GM törzsekkel erjesztett sörök a közeljövőben forgalomba kerülnek. Legfőbb okokként említhető az egyes országok, illetve az Európai Unió szigorú szabályozása a GM termékek előállítását és alkalmazását illetően, a szabadalmi védelem nehézségei, és nem utolsósorban a fogyasztók ellenérzései a GM termékek iránt. Rekombináns DNS technikával előállított klónozott enzimeket (heterológ fehérjét, pl. β-glükanázt, glükoamilázt, pullulanázt, α-acetolaktát-dekarboxilázt) alkalmaznak egyes zárt fermentációs technológiai folyamatokban, bár lehet, hogy az EU szabályozás változásának következtében ezek is GM termékeknek minősülnek majd a jövőben.
A sörgyártás mikrobiológiai problémái A jó minőségű termék előállítása érdekében fontos szempont a megfelelő mikrobiológiai minőségű alapanyagok felhasználása. Előírás, hogy csak ivóvíz minőségű vizet szabad a technológiában felhasználni, ezért a sörgyárak általában saját vízkezelővel rendelkeznek. A mikrobiológiai biztonság kérdése az árpánál vetődik fel, amely a nem megfelelő tárolás következtében mikotoxinnal (elsősorban ochratoxinnal) lehet szennyezett. A beoltáshoz használt sörélesztő fiziológiai és a mikrobiológiai ellenőrzésen esik át (mikroszkópos morfológia, holt sejtek aránya, szaporodási és erjesztőképesség, tartalékanyagok szintje, flokkulációs képesség). A mikrobiológiai vizsgálat elsősorban a tejsavbaktériumokra és az idegen élesztőkre terjed ki. Ez utóbbiak közül különösen veszélyes a S. cerevisiae biovar. diastaticus, mivel glükoamiláz termelése miatt a sörélesztő számára nem erjeszthető dextrineket alkoholosan erjeszti. A kész sör mikrobiológiai szempontból biztonságosnak tekinthető, mivel alkoholtartalma (3,5–5%), kis pH-ja (4,1–4,2), nagy szén-dioxid-tartalma és a komlóból származó mikrobagátló anyagai miatt a patogén baktériumok elpusztulnak. A romlást okozó mikrobák közül elsősorban a tejsavbaktériumok és az élesztőgombák okoznak gondot, akár az erjesztés során szaporodnak el, akár a késztermékben maradnak meg, vagy fertőzik meg utólag. A romlásnak négy típusát különböztetik meg: nyúlósodás, szarcinás betegség, savanyodás és zavarosodás. Az első hármat baktériumok okozzák. A nyúlósodást elsősorban a Pc. damnosus és a Gluconobacter oxydans, olykor más ecetsav- és tejsavbaktériumok. A szarcinás sörbetegséget a mézre emlékeztető jellegzetes szag jelzi, okozója a Pc. damnosus. A savanyodás oka az Acetobacter fajok ecetsavtermelése. A zavarosodás olyan mikroorganizmusok elszaporodását jelzi, amelyek a sör pH-ján jól erjesztik a maradék szénhidrátokat. Leginkább élesztők felelősek ezért; a sörélesztő is okozhat romlást, de gyakran számos egyéb Saccharomyces és más erjesztő élesztőgomba (Torulaspora, Zygosaccharomyces, Debaryomyces, Dekkera, Pichia) is. A baktériumok közül a Zymomonas mobilis okoz gyakran zavarosodást, és bélbaktériumok (pl. Obesumbacterium proteus) is képesek elszaporodni. A zavarosodás mellett kellemetlen íz- és illatanyagok termelése jelzi a problémát.
A borkészítés technológiája A borerjesztés bölcsője a mediterrán övezet, és a sörkészítéshez hasonlóan itt is az emberi kultúra kezdetéig visszavezethető. Az ókorban a görögök, majd a rómaiak mesteri szintre emelték a borászati technológiát. A mai Magyarország területére, Pannóniába is a rómaiak hozták be a szőlőt. 198
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek A borászat ipari szintű szabályozottságát tekintve messze elmarad a sörgyártási technológiától, aminek magyarázata az erjesztéshez használt alapanyag, a must készítésében és tulajdonságaiban keresendő. A must erjesztésében és a bor minőségében nagy szerepet játszik az alapanyagok (elsősorban a szőlő) minősége, az éghajlat, az időjárás és az alkalmazott technológia. A világ nagy részén még mindig a spontán erjesztést részesítik előnyben, a startertenyészetek (ún. fajélesztők) alkalmazása csak a fejlett borászati technológiát művelő országokra jellemző. Magas szinten szabályozott fermentációs technológiával elsősorban Kaliforniában, Ausztráliában és a Dél-Afrikai Köztársaságban találkozhatunk, ahol zárt erjesztőtartályokban, szabályozott körülmények között vezetik az erjedést és az érlelést. Míg a hagyományos borászati technológiával készült borokra a sokszínűség, a fajtajelleg dominanciája és sok esetben a változó minőség jellemző, addig a zárt fermentorban erjesztett borok választéka szegényebb, de a borok frissebb zamatúak és minőségük is állandóbb. A nagyüzemi borászati technológiák fejlődése az utóbbi irány felé mutat, de igyekeznek a borok sokszínűségét, fajtaválasztékát is megőrizni. A bor alapanyaga a szőlő, de készülhet más gyümölcsből is, ekkor azonban a technológia és főként a termék jellege lényegesen eltérő. A továbbiakban csak a szőlőbor erjesztésével, elsősorban annak mikrobiológiai vonatkozásaival foglalkozunk. A szőlő kémiai összetétele sok tényezőtől függ. Elsősorban a fajtajelleg határozza meg, de lényegesen befolyásolja a talaj összetétele, a klimatikus viszonyok, az alkalmazott termesztési technológia és az aktuális időjárás. Ettől függően eltérhet a cukortartalma, a szerves savak és nitrogéntartalmú vegyületek skálája és koncentrációja, az ásványianyag-tartalom és az egyéb vegyületek mennyisége. A szőlőmust cukortartalma a szüretelés időszakában átlagosan 150–300 g/l, aminek kb. fele glükóz, fele fruktóz, csak elenyésző mennyiségben tartalmaz szacharózt. Nitrogéntartalma ammóniában kifejezve 100 és 1000 mg/l között változik, ami lényeges korlátozó tényező lehet az élesztő 500 mg/liter ammónia-nitrogén igényét tekintve. A must a legtöbb aminosavban gazdag, nukleotidbázisokban viszont szegény. Foszfortartalma a nitrogéntartalomhoz hasonlóan változó, és ez is limitáló tényezője lehet az élesztő erjesztési aktivitásának. Mikroelem-tartalma általában kielégíti az élesztő igényét. A legtöbb ország bortörvénye megengedi, hogy nitrogénforrásban szegény musthoz diammónium-foszfátot adagoljanak, ami egyben foszforforrásként is szolgál. A leszüretelt szőlőt darálják, zúzzák, a további műveletek azonban attól függenek, hogy vörösbort vagy fehérbort, illetve rozébort készítenek-e (6.7. ábra). Vörösborkészítés esetén a megdarált szőlőt néhány napig a mustban hagyják, ezáltal a héjból kioldódnak a kékszőlő színanyagai (antocián vegyületek), a fenolos vegyületek és a csersav. Ennek elősegítésére keverik (macerálják), esetleg kissé fel is melegítik a mustot. A folyamatban nagy szerepük van a szőlőből kiszabadult hidrolitikus enzimeknek is. A szőlőből és a feldolgozó üzemből a mustba került élesztőgombák már ekkor megkezdik az erjesztést, ha pedig starter élesztőtörzset alkalmaznak, akkor azt ebben a fázisban adagolják. Pár nap elteltével az erjedő mustot kipréselik, elválasztják a törkölytől, majd hagyják tovább erjedni. Rozéhoz a kékszőlőt a zúzás után préselik, hasonlóan, mint fehérborok esetében. Ezeknél a fajélesztős beoltás vagy a spontán erjesztés csak ezt követően történik. Mindkét esetben adagolnak kisebb-nagyobb mennyiségben szulfitot (általában kálium-metabiszulfit formájában), ami gátolja az ecetsavbaktériumokat és a penészgombákat, valamint a bor minőségét károsan befolyásoló élesztőgombák (elsősorban a nem-Saccharomyces fajok) szaporodását.
199
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek
6.7. ábra - A vörösborkészítés technológiájának főbb lépései és jellemzői
200
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek A technológiától függően az erjesztést állandó hőmérsékletű pincékben, hordókban vagy zárt fémtartályokban végzik. A fehérbort kisebb hőmérsékleten, hosszabb ideig (10–18 °C-on 10–14 napig), a vörösbort nagyobb hőmérsékleten, rövidebb ideig (20–30 °C-on 5–7 napig) erjesztik.
A borerjesztésben résztvevő élesztőgombák A spontán alkoholos erjesztést a szőlőről, a talajból, a műveletekhez használt eszközökről, a feldolgozó üzem berendezéseiről a mustba kerülő élesztőgombák indítják el. Az érett szőlőszemeken erjesztésre nem képes (csak aerob légzést végző) élesztőfajok is viszonylag nagy számban kimutathatók (pl. Metschnikowia, Rhodotorula, Cryptococcus), ezek azonban gyorsan elpusztulnak. Az erjedés kezdetén a legnagyobb populációt a Hanseniaspora (imperfekt Kloeckera) fajok érik el, mellettük azonban jelentős számban fordulnak elő különböző Candida és Pichia fajok is. Érdekes, hogy kezdetben a must erjedésében főszerepet játszó Saccharomyces fajok sejtjeit csak nagyon kis mennyiségben lehet megtalálni. Ezek az üzem feldolgozó berendezéseiről és a szüreti időszakban gyakori muslicák közvetítésével kerülnek az erjedő mustba, ahol gyorsan átveszik a vezető szerepet. Az erjedés kezdetén a mustban található sokféle élesztőgomba fajhoz képest az etanoltartalom növekedésével a fajok diverzitása és populációja gyorsan csökken. A fő szelekciós tényező a fajok/törzsek etanoltűrése. Általánosságban az etanoltartalom növekedésével a következő faji változások mutathatók ki: • 1–2% etanoltartalomig: Candida és Pichia fajok (pl. C. stellata, Pi. anomala Pi. membranifaciens), • 5–6% etanoltartalomig: Hanseniaspora (am. Kloeckera) fajok (pl. Hp. uvarum (am. Kl. apiculata), • 9% etanoltartalomig: Brettanomyces fajok, • 12–16% etanoltartalomig: Saccharomyces fajok. A nem-Saccharomyces fajok íz- és aromaanyag-termelése nagyon sokféle és markáns, többségük nagy mennyiségben kedvezőtlen ízt, sőt hibás erjedést, borbetegséget okoz. Ezért fontos, hogy a főerjedés gyorsan beinduljon és a must 2–3 nap alatt elérje a 6–8% etanoltartalmat. Ez egyértelműen a Saccharomyces fajok elszaporodásával és gyors erjesztésével érhető el. Mivel azonban az erjedés elején a mustban nagyon kevés a Saccharomyces élesztő, ezért minden olyan körülmény, ami nem kedvez elszaporodásuknak, lényegesen hátráltatja a főerjedés beindulását (pl. kis hőmérséklet, nagy sav- és cukortartalom, gombaellenes növényvédőszermaradványok, nem-Saccharomyces fajok által termelt gátlóanyagok). Ezért a biztonságos erjesztéshez elengedhetetlen a S. cerevisiae és S. bayanus fajélesztők, mint indító tenyészetek alkalmazása. Ma már a kereskedelemben korlátlanul rendelkezésre állnak a fiziológiai, technológiai és genetikai szempontból jól jellemzett, tartósított (általában szárított) borélesztő törzsek, amelyek az ún. irányított erjesztéshez szükségesek. A fajélesztők a világ különböző borvidékeiről izolált, kedvező technológiai tulajdonságú S. cerevisiae és S. bayanus törzsek, amelyekre általánosságban a következő tulajdonságok jellemzők: • cukortűrés (ozmotolerancia), • alkoholtűrés (etanoltolerancia), • SO2-tűrés, • savtűrés, 201
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek • erős erjesztőképesség, • stabil és kedvező erjedésiaroma-termelés (illósavak, észterek, terpének, glicerin, borostyánkősav stb.), • csökkent kéntartalmú aromatermelés (pl. H2S, merkaptánok), • csökkent acetaldehid-termelés, • csökkent ureatermelés, amelyből toxikus etil-karbamát keletkezik, • killer tulajdonság (zimocin termelés). Mivel a bortermelés különböző éghajlati és termőhelyi adottságok között és eltérő technológiákkal folyik, ezért az általánosan elvárt kedvező tulajdonságok mellett fontosak lehetnek a törzsek egyedi tulajdonságai is. Ilyen például a hidegtűrő képesség, a csomósodási (flokkulációs) képesség, vagy éppen ellenkezőleg a flokkuláció hiánya (ún. porosodó, nem-flokkulens törzsek). Sokszor megkülönböztetik a vörösborok és a fehérborok erjesztéséhez javasolt törzseket. A startertenyészetet általában először kisebb mennyiségű musthoz keverve aktiválják („szoktatják”), majd hozzáadják az összezúzott szőlőhöz (vörösborok esetében), illetve a kipréselt musthoz (rozé és fehérborok, de sokszor vörösborok esetében is). A fajélesztő azonban nem teljesen szorítja ki a must saját élesztőbiotáját, a Hanseniaspora törzsek általában jól bírják a versenyt. Ugyancsak versenyeznek a starter fajélesztővel a must saját Saccharomyces törzsei, előfordul az is, hogy az erjedés során túlnövik őket és a kierjedt borban már nem mutatható ki a startertörzs. Egyértelmű azonban, hogy az erjedés elején nagy sejtkoncentrációban adagolt fajélesztő törzs jó ütemben, gyorsan növeli az etanolkoncentrációt, ami kedvező hatással lehet az adott borvidéken endemikus, jobban alkalmazkodó borélesztő törzsek elszaporodásához és túléléséhez. Ez részben magyarázat lehet arra, hogy azonos startertenyészetek alkalmazásával, azonos szőlőfajtából készült borok is jellegzetesen eltérhetnek egymástól. Nem egységes a borászati szakemberek véleménye arra vonatkozóan, hogy szükséges-e a nem-Saccharomyces élesztőfajokat rövid ideig életben hagyni az erjedés kezdetén. Míg korábban egyértelműen a nem-Saccharomyces élesztőfajok mielőbbi visszaszorítására törekedtek, ma kezd elterjedni az a nézet, hogy ezek anyagcsere-aktivitása is szükséges az egyedi zamatú borok készítéséhez, ezért a mikrobiológusok kevert, de stabil startertörzsek kifejlesztésén munkálkodnak. A főerjedés végére a must cukortartalma általában teljes mértékben etanollá és szén-dioxiddá alakul, csak az igen nagy cukortartalmú borok erjedése áll meg a törzsek alkoholtoleranciájának határánál és marad a borban néhány százalék cukor. Az etanoltartalom a must cukortartalmától függően 10–15% közötti, a szén-dioxid azonban eltávozik. A teljes kierjedés szükséges a mikrobiológiai stabilitáshoz; az édes borokat sterilre szűréssel vagy kálium-szorbát adagolással stabilizálják. Az etanol mellett jelentős mennyiségben keletkeznek egyéb primer és szekunder anyagcseretermékek, amelyek fontosak a borok íz- és illatkarakterének kialakításában. Ilyenek a glicerin, a borostyánkősav és egyéb szerves savak, az észterek, aldehidek, ketonok, magasabbrendű alkoholok, kéntartalmú szerves vegyületek, amelyeknek nemcsak fajtái, hanem mennyiségi arányai is fontosak a harmonikus íz- és illatkarakter kialakításában. Az erjedés lezajlása után a bort lefejtik a kiülepedett élesztőről, a kicsapódott anyagokból és a szőlőmaradványokból álló seprőről, és tovább érlelik. Ebben a folyamatban a mikrobás anyagcserének már elenyésző szerepe van. Két eltérő technológiát alkalmaznak az erjesztésben: az egyik a hagyományos, tölgyfahordós érlelés, amelynek során a bor a hordó pórusain keresztül érintkezik a levegővel, ezért oxidatív kémiai folyamatok határozzák meg a bor aromajellegét. A másik technológia a reduktív erjesztés, amelyet acéltartályokban, levegőtől elzártan valósítanak meg. Ezért a bor aromavegyületei nem oxidálódnak, hanem megőrzik friss, a szőlőre emlékeztető jellegüket, ún. gyümölcsaromájúak lesznek. 202
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek Vörösborok és a hidegebb vidékeken készült borok erjedése végén biológiai almasavbontás megy végbe spontán mikrobiológiai folyamatként. Az ún. malo-laktátos anyagcsere-folyamat során a tejsavbaktériumok az L-almasavat tejsavvá és szén-dioxiddá alakítják át. Ebben kulcsszerepe van az Oenococcus oenos (régi nevén Ln. oenos) tejsavbaktériumnak, amely jól szaporodik a bor pH-ján (3,5–3,8) és elvisel 10% etanoltartalmat is. Kénessavtűrése azonban gyengébb, mint a borélesztőé, továbbá speciális növekedési faktorokat is igényel, ezért nem minden borban megy végbe a malo-laktátos erjedés. Ma már az Oenococcus oenosból is rendelkezésre állnak jó technológiai tulajdonságú kereskedelmi színtenyészetek. A folyamat borászati jelentősége abban rejlik, hogy mérsékeli az almasav erős savhatását, ami 5 g/l feletti koncentrációban erősen savas jelleget kölcsönöz a bornak. Az almasav a szőlőből kerül a mustba, főként a nem kellően érett szőlő almasavtartalma magas. A borélesztők nem vagy csak nagyon csekély mértékben képesek lebontani, ezért nagy része benne marad a borban. A tejsav, mint gyenge sav kevésbé kellemetlen, sőt egyes (elsősorban a francia) vörösborok jellegéhez hozzá is tartozik. A borban a másik uralkodó sav a borkősav, az erjedés során ez sem metabolizálódik. A kész borban kikristályosodhat, ezért bizonyos koncentráció feletti mennyiségben nem kívánatos. A borkősavat a Lb. plantarum egyes törzsei tejsavvá, ecetsavvá és szén-dioxiddá bontják.
Borélesztők nemesítése A borerjesztésben kulcsszerepet játszó Saccharomyces sensu stricto törzsek genetikailag sokfélék, ami a fiziológiai és technológiai tulajdonságokon kívül az ivaros életciklusukban is jelentkezik. A sörélesztőkhöz képest jóval könnyebben keresztezhetők ivarosan, ami megkönnyíti a törzsjavítást, de ez a tulajdonságuk jelentősen hozzájárult a borászati szempontból fontos Saccharomyces fajoknál a fajon belüli biodiverzitás kialakulásához is. A klasszikus törzsnemesítési módszerek (mutáció, ivaros hibridizáció, protoplasztfúzió) jól alkalmazhatók új törzsek előállítására, célzott genetikai beavatkozás vagy új tulajdonságot kódoló gén bevitele azonban csak a génsebészet alkalmazásával lehetséges. A genetikailag módosított borélesztők alkalmazásának határt szabnak a szigorú törvényi előírások, de leginkább a fogyasztók ellenérzése, ezért a borászati üzemekben egyenlőre nem alkalmaznak genetikailag módosított borélesztőket. A törzsjavítás célpontjai: 1. Erjesztési tulajdonságok javítása • Stresszhatásoknak (szárítás, szulfit, hidegstressz) való ellenállás: glicerin-, trehalózakkumuláció javítása a génexpresszió növelésével. • Cukorhasznosítás javítása: hexóztranszport és hexokinázaktivitás növelése. • Etanoltolerancia növelése: szterolszintézis, membrán-ATP-áz-aktivitás növelése. • Habzás csökkentése: sejtfelületi fehérjék módosítása. 2. Technológiai tulajdonságok javítása • Fehérje eredetű zavarosság csökkentése: proteázaktivitás növelése. • Poliszacharid eredetű zavarosság csökkentése: glukanáz, pektináz, xilanáz gének klónozása. • Sejtek ülepedésének és flokkulációjának szabályozása: flocculinfehérjék szabályozásával. 3. Bor egészségre ártalmas komponenseinek csökkentése, egészségvédő hatású anyagainak növelése 203
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek • Rezveratroltartalom növelése: sztilbénszintézis és α-glükanáz aktivitás növelése. • Etil-karbamát-termelés csökkentése: aminosav-metabolizmus módosítása, ureatermelés csökkentése. • Biogénamin-termelés csökkentése: bakteriolitikus anyag (pl. lizozim) adagolása, bakteriocinek termelése. • Alkoholtermelés csökkentése: glicerinmetabolizmus, glükózoxidáció módosítása. 4. Bor érzékszervi tulajdonságainak javítása • Szőlő terpénvegyületeinek felszabadítása: glükozidáz-, glükanáz-, arabinofuranozidáz-aktivitás növelése. • Pozitív hatású illó észterek termelésének növelése: észteráz-, alkohol-acetil-transzferáz-aktivitás növelése. • Glicerintermelés növelése: glicerinmetabolizmus módosítása. • Biológiai almasavbontás: maloetanolos és malo-laktátos fermentációs képesség megszerzése. • Illékony tiolvegyületek felszabadítása: liáz enzimek klónozása.
Borbetegségek, borhibák A bornak sok olyan minőségi rendellenessége van, amelyek mögött mikrobiológiai folyamatok húzódnak meg. Ezeket borbetegségeknek hívják és általában erjesztési rendellenességekre vagy hibás borkezelésre vezethetők vissza. A borbetegség jelentkezhet kellemetlen aromák formájában, zavarosodásban, de romlás is előfordulhat. A leggyakoribb borbetegségek: • Virágosodás: „virágélesztők” okozzák – Candida, Pichia fajok. Leggyakoribb a C. valida (teleomorf Pi. membranifaciens). Az etanolt, glicerint acetaldehiddé, ecetsavvá oxidálják. • Zavarosodás, ízhibák: Dekkera fajok, Zyg. bailii. A Z. bailii különösen ellenálló a borban érvényesülő stresszhatásokkal szemben, ezért palackozott borban is képes elszaporodni. • Ecetesedés: ecetsavbaktériumok okozzák, mint az Acetobacter aceti, amelyek az etanolt ecetsavvá oxidálják. • Egéríz: Brettanomyces fajok okozzák. • Tejsavas romlás: „savanyú káposzta szag”, nyúlósodás – tejsavbaktériumok okozzák. • Barnatörés: penészek által termelt enzimek okozzák. • Íz- és szaghibák – dohosság, vegyszer íz, fémíz. 204
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek A borhibákat nem mikroorganizmusok okozzák, hanem valamilyen kémiai folyamat megy végbe. Ilyen például a fémes törés, amit a Fe3+ felszaporodása vált ki. A bor mikrobiológiai szempontból biztonságos termék, nagy alkoholtartalma és kis pH-ja miatt valamennyi patogén baktérium elpusztul benne. A tejsavbaktériumok elszaporodása azonban – különösen vörösborokban – biogén aminok termeléséhez vezethet, ami az arra érzékenyeknél problémát okozhat (6.2.6. fejezet).
Másodlagosan erjesztett borkülönlegességek A kierjedt bor mikrobiológiailag stabil, azaz a borélesztők nem képesek benne tovább szaporodni vagy erjeszteni. Azonban ha cukortartalmát megnövelik, a kiemelkedően jó alkoholtűrő élesztők tovább erjesztik. Így készül a pezsgő és az aszúborok. Ugyancsak tovább szaporodnak a borban egyes borélesztők oxidatív körülmények között, ugyanis az etanol és a glicerin a legtöbb élesztő számára aerob úton jól hasznosítható szénforrás. Olyan körülmények között, amikor az ecetsavbaktériumok nem képesek elszaporodni a bor felületén, egyes erősen alkoholtűrő S. cerevisiae törzsek a felszínen hártyát képezve és az etanolt acetaldehiddé oxidálva jellegzetes boraromát alakítanak ki. Ilyen borkülönlegesség a sherry, és a tokaji száraz szamorodni érlelésében is jelentős szerepe van az élesztőhártya kialakulásának. A pezsgőt kierjedt, könnyű, száraz borból készítik, amelyhez szacharózt adnak és pezsgőélesztővel oltják be, majd 10–12 °C-on tovább erjesztik. A pezsgő készítéshez használt élesztőtörzsek is a S. cerevisiae vagy a S. bayanus fajokhoz tartoznak, azonban a jó borélesztőktől elvárt tulajdonságok mellett még különösen nagy alkoholtűrő és hidegtűrő képességük van, valamint az erjedés végén flokkulálnak. Az erjedés alatt a palackban vagy tankban megnő a nyomás, ezt is jól elviselik. Az erjedés befejeztével a stacioner fázisban autolizálnak, a keletkező vegyületek is lényegesen hozzájárulnak a pezsgő aromájához. A tokaji aszú az ún. botrítiszes borok családjába tartozik, mivel az aszúsodást a szőlő felületén elszaporodó nemespenész, a Botrytis cinerea végzi el. Az aszúsodás során a szőlő cukortartalmának egy részét a nemespenész szerves savakká és glicerinné alakítja, miközben a szőlőbogyó héjának sérülése következtében a víz egy része elpárolog. Az aszúszemeket elkülönítik az ép szőlőszemektől, és a kierjedt borhoz adják meghatározott puttonyszámban. Az aszúszemeket így borral extrahálva kapják a nyers aszúbort, amelyet spontán módon erjesztenek tovább. Az erjesztés nagyon lassan indul meg és a főerjedés is több hónapig tart, azonban az erjedés sohasem áll le teljesen a hordóban a több (legalább három) éves érlelés alatt. A folyamat stabilizálása és az állandó jó minőség fenntartása érdekében folyamatban van a starterkultúrás erjesztés kidolgozása is.
Egyéb, nem szőlőből készült alkoholosan erjesztett italok A cider (leginkább almamurcinak nevezhetjük), az angolszász országokban népszerű, spontán erjesztéssel készült, kis alkoholtartalmú ital. Technológiája viszonylag egyszerű: az almát mossák és péppé darálják, majd kipréselik a levét. A levet szűrik és tartályokba fejtik, majd szobahőmérsékleten 12–36 óráig vagy 5 °C alatti hőmérsékleten néhány napig ülepítik. Az így kapott átlátszó, néhány százalék alkoholt és acetaldehidet tartalmazó ital a cider, amit pasztőröznek vagy nátriumszorbáttal tartósítanak, illetve hűtve vagy fagyasztva tárolnak. A szobahőmérsékleten tartott cider nagyon gyorsan megecetesedik az ecetsavbaktériumok hatására. A fő etanolosan erjesztő Saccharomyces fajok mellett, számtalan etanolosan erjesztő baktériumot is izoláltak ciderből (Zymomonas spp., Saccharobacter fermentatus), és tejsavbaktériumok is közreműködnek az erjesztésben. Pálmabor: a trópusi országokban kókusztejből készült erjesztett ital, amelynek erjesztésében az élesztőgombák mellett kezdetben bélbaktériumok, később pedig tejsavbaktériumok is részt vesznek. 205
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek Szaké (rizsbor): a japánok alkoholosan erjesztett nemzeti itala. A rizst először gőzöléssel megfőzik, majd A. oryzae penészgombával beoltják, amelynek amilázai hidrolizálják a keményítőt. Az így nyert elcukrosított masszát (a kojit) vízzel hígítják és beoltják az előzőleg felszaporított mikrobatenyészettel, amelyben tejsavbaktériumok (Ln. mesenteroides, Lb. sake), nem-Saccharomyces élesztőgombák (C. guillermondii, Pi. anomala) és a szakéélesztő (S. cerevisiae) található. A szakéélesztő különösen alkoholtűrő, 15–20% etanoltartalomig erjeszt. Az erjesztés lassú, több mint egy hónapig tart. A friss szakét szűrik, majd pasztőrözik és palackozzák.
Desztillált szeszes italok Különböző szénhidráttartalmú alapanyagokból, gabonából, gyümölcsökből, cukornádból, kukoricából az alkoholos erjesztést követően desztillálással előállított, nagy (30–50%) alkoholtartalmú italok. Whisky: a skót whiskyk közül (6.8. táblázat) a malátawhisky tulajdonképpen sörpárlat, azonban a sörlét nem forralják és nem komlózzák. A kevert whiskyhez búzát is használnak alapanyagként. A desztillálás után a whiskyt több évig tölgyfahordóban érlelik. Rum: a Karib-tengeri országok tradicionális itala, amelynek alapanyaga cukornád. Ennek szacharóztartalmát (szirup vagy melasz) erjesztik alkoholosan, majd desztillálják. A legtöbb országban nem érlelik. Borpárlatok: szőlőborból desztillálással készül a konyak és a brandy, amelyek jellegét és értékét az alapboron kívül az érlelés határozza meg. Pálinkák: gyümölcsfélék alkoholos erjesztését követő desztillálással készül. Vodka: alapanyaga nagyon változatos, a gabonaféléken kívül burgonyából és melaszból is készítik. Az elcukrosított keményítőt vagy a melaszt alkoholosan erjesztik, majd desztillálják. A hagyományos eljárás szerint faszénen szűrik át, amely megköti a kellemetlen aromaanyagokat. Tequila: mexikói ital, amelyet az agavé kaktusz terméséből erjesztett bor (pulque) lepárlásával nyernek. A bor erjesztésében az élesztőkön kívül részt vesznek tejsavbaktériumok is.
Szeszgyártás (etanolgyártás) Az etanolt az italtechnológia és az élelmiszeripar nagy mennyiségben használja fel, emellett nagy a vegyipar etanoligénye is. A szeszipar a desztillált italok előállításának technológiai alapjaira épült, a XX. század elejétől kezdve azonban igazi nagyiparrá fejlődött. Az irányított etanolos erjesztés, amit üzemi lepárlás követ, nagy fermentorokban zajlik. Alapanyagai cukortartalmú mezőgazdasági termékek vagy melléktermékek (répacukor, cukorrépamelasz, nádcukormelasz), vagy hidrolizált gabona- és kukoricakeményítő. Az étkezési etanolt Európában a legnagyobb mennyiségben cukorrépamelaszból állítják elő, amelyet megfelelően kezelnek, hígítanak, nitrogén- és foszforforrással egészítenek ki, majd szeszélesztővel beoltják. Gyakran használnak pékélesztőt is az erjesztéshez, főként a folytonos fermentációs eljárásokban, ahol az alkoholkoncentráció nem emelkedik 8% fölé. A szeszélesztők nagy alkoholtoleranciájú S. cerevisiae törzsek. 206
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek A kukoricából kiinduló szeszgyártás esetén a kukoricakeményítőt baktérium (B. subtilis, B. amyloliquefaciens) eredetű α-amilázzal elfolyósítják, majd penészgomba (A. niger) eredetű glükoamilázzal elcukrosítják. Az így kapott cukorszirupot megfelelően hígítva és egyéb tápanyagforrásokkal kiegészítve szeszélesztővel beoltják és kierjesztik. A 7–11% alkoholtartalmú cefrét lepárolják és finomítják, így 96%-os finomszeszt állítanak elő. Gyakran használják fel likőrök készítéséhez is.
Borecetkészítés A kierjedt bor levegővel érintkező felületén az ecetsav-baktériumok az etanolt ecetsavvá oxidálva a bor ecetesedését okozzák, ami romlási jelenség. Ez a folyamat azonban alapjául szolgál egy ősi aerob fermentációs eljárásnak, a borecet előállításnak szőlő- vagy egyéb gyümölcsborból. A borecetet általában kisvállalatokban vagy házilag állítják elő. A legrégebbi (legegyszerűbb) technológiája a franciaországi Orleans körzetében honosodott meg, még az ecetsav-baktériumok felfedezése előtt. Jelenleg is használják ezt az orleansi vagy francia eljárásként meghonosodott technológiát. Lényege, hogy fakád aljára bortörkölyt tesznek, amelyre kevés borecetet öntenek, majd a kádat részben feltöltik borral és állni hagyják. A bor felszínén az ecetsav-baktériumok összefüggő hártyát alakítanak ki, amelyet mikodermának hívnak. Ez idővel a kád fenekére süllyed és a borüledékkel, seprővel együtt nyálkás tömeget képezve az ún. ecetágyat adja. 20–25 °C közötti hőmérsékleten a bor alkoholtartalma néhány hét alatt ecetté alakul, amelynek aromája lényegesen függ az alapbortól. Az ecetsavas (aerob) erjesztést főként az Acetobacter aceti végzi. A folyamat lassú, mivel csak a felszínhez közel áll rendelkezésre elegendő oxigén az ecetsav-baktériumok szaporodásához. Az ecetággyal új kádakat beoltva gyorsítható a folyamat. A jó borecetet hosszabb ideig, akár 1–2 évig is érlelik. Az étkezési ecet ipari előállítása az ecetsav-baktériumok faforgácson történő immobilizálásával történik. Ennek egy régebbi változatát még ma is használják egyes helyeken. Ennél egy tartályt lazán megtöltenek bükkfaforgáccsal, ezen átáramoltatják a bort, és ellenáramban levegőztetik. Az ecetsav-baktériumok a faforgács felületén vékony hártyát képezve hatékonyan alakítják át ecetsavvá az etanolt. Így 10% etanoltartalmú folyadék 4–5 nap alatt teljesen megecetesedik. A modern eljárásokban keveréssel levegőztetett fermentorokban állítják elő az ecetsavat, sok esetben bor helyett csak etanolos oldatot használva nyersanyagként.
Sütőélesztő-gyártás A kenyér kelesztéséhez a középkorban használt, a sörerjesztés vagy a borerjesztés melléktermékeként kapott „seprő” alkalmazását váltotta fel a XIX. század végén a sütőélesztő szaporítása fermentorban. Ebből fejlődött ki a jelenleg is használt technológia, amely a S. cerevisiae sejttömeg (biomassza) termelésének optimalizált változata. Az eddig tárgyalt, az élesztők alkoholos erjesztésén alapuló fermentációs technológiákkal szemben az élesztőgyártás biokémiai értelemben nem erjedés, hanem oxidáció, élettanilag aerob légzés, ami csak technológiai értelemben nevezhető fermentációnak. Az élesztőgyártás alapanyaga a cukorrépa (ritkábban cukornád) melasz, amelyet hígítás után hőkezelnek és tisztítanak, majd a szaporodáshoz szükséges makroés mikrotápanyag-forrásokkal egészítenek ki (ammónium-foszfát, biotin, mikroelemek). A baktériumos fertőzés veszélyének csökkentése céljából a pH-t 5,5-re állítják be. A S. cerevisiae sütőélesztő (pékélesztő) törzset folytonos léptéknöveléssel lombiktenyészetből oltóélesztő mennyiségre (kb. 100 literre) felszaporítják steril körülmények között, majd az erősen levegőztetett fermentorba oltják. Mivel a S. cerevisiae érzékeny a katabolit represszióra (Crabtree-hatás, 6.3. fejezet), ezért a melaszt rátáplálásos (ún. fed-batch) eljárással folyamatosan adagolják. Az a cél, hogy az élesztő csak légzéssel nyerje az energiát, ne pedig erjesztéssel, mivel ez utóbbi esetben lényegesen romlik a sejthozam (az egységnyi szubsztrátumból keletkező sejttömeg). A légzésről az erjedésre való áttérésre (a katabolit represszióra) a légzési kvóciens (RQ = egységnyi O2 fogyasztásra eső CO2-termelés) növekedéséből, vagy pedig az etanolnak a fermentor légterében való megjelenéséből 207
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek következtetnek. Ilyen esetben leállítják a melaszadagolást mindaddig, amíg az élesztő a termelt etanolt fel nem használja, és csak ezt követően indítják újra. A fermentációt úgy irányítják, hogy a szaporítás végén az élesztő 15–17% tartalék szénhidrátot (főként trehalózt) raktározzon el a sejtekben, mivel ez szükséges a jó életképesség megőrzéséhez (elsősorban az intakt membránszerkezethez) és a présélesztő tárolási stabilitásához (4 °C-on 1 hónap). Az elszaporított élesztőt dobszűrővel szeparálják, mossák, majd préselik vagy szárítják. Fluidágyas szárítással jó életképességű, aktív szárított élesztőt állítanak elő, amely több mint 80%ban tartalmaz élő sejteket és hosszú ideig (akár 1 évig is) eltartható. Az instant aktív szárított élesztő közvetlenül a liszthez keverhető, nem igényel előzetesen rehidratálást. Az élesztő minőségét (kelesztőképességét) a hajtóerővel mérik, ami adott térfogatú CO2 termeléséhez szükséges idő percekben kifejezve. A sütőélesztőtől a tészta kelesztése során éppen ellentétes aktivitást várnak el, mint a szaporításnál. Az erjesztéshez jó glikolitikus aktivitás, valamint gyors és nagy aktivitású maltózhasznosítás szükséges. A jelenleg alkalmazott termelőtörzsek olyan mutánsok, amelyeknél a maltózerjesztés megkezdésének nincs indukciós periódusa (konstitutív mutánsok). A rekombináns DNS technika segítségével sikerült olyan javított törzseket is előállítani, amelyeknél a maltózhasznosítás nincs glükózrepresszió alatt (derepresszált törzsek), ezért a CO2-termelés megnőtt. Ugyancsak a hajtóerő növekedéséhez vezetett a maltóz permeáz és a maltáz génekbe ún. erős promoterek beépítése.
Kenyérgyártás A kenyér különböző gabonafélék lisztjéből, adalékanyagok és 1–6% élesztő hozzáadásával készül. Leggyakrabban búza-, rozs-, kukorica- és rizslisztet használnak. A kenyértésztát először gyúrják, majd dagasztják, és néhány további technológiai lépés után kelesztik, majd 220–230 °C-on megsütik. A tészta kelesztéséhez sütőélesztőt használnak, ami a tészta belsejében etanolos erjesztést végez. Az élesztő a lisztben lévő erjeszthető cukrokat (kb. 2% glükóz, fruktóz, maltóz) használja fel és az etanolon kívül szén-dioxidot képez. A szén-dioxid a tészta szerkezetét fellazítja, az etanol pedig javítja a reológiai tulajdonságait, majd a sütés során eltávozik. Mikrobiológiai hátterét tekintve a kenyérgyártás technológiája nem sok változáson ment át az elmúlt időszakban, egyedül az instant aktív szárított élesztő alkalmazása hozott újdonságot. Ebben az esetben ugyanis nem szükséges az élesztőből folyadékszuszpenziót készíteni, mielőtt a liszthez keverik, hanem az élesztőport közvetlenül a liszthez adják. Présélesztő vagy szárított élesztő alkalmazásakor ugyanis az élesztőt cukros lében előerjesztik, majd ezzel összegyúrják a lisztet, és később adagolják a vizet. Európa déli országaiban és az USA-ban elterjedt a savanyú kovász alkalmazása, amelyhez ipari szintű technológiáknál startertenyészeteket alkalmaznak. A startertenyészetekben a homo- és heterofermentatív tejsavbaktériumok (Lb. brevis, Lb. sanfransisco, Lb. fermentum) játsszák a fő szerepet, és a S. cerevisiae mellett számos más erjesztő élesztőfaj (S. exiguus, am. C. holmii, Issatchenkia orientalis, am. C. krusei) is megtalálható. A S. exiguus különösen jól szaporodik tejsavbaktériumok jelenlétében. Amennyiben a savanyú kovászos kenyér több mint 20% rizslisztből készül, előzőleg savanyítani kell a lisztet. Ezt vagy az előző tésztából készített kovásszal, vagy pedig a startertenyészet megfelelő szaporításával érik el. A tejsavbaktériumok a liszt fehérjéinek proteázos bontásával állítják elő a számukra és az élesztők gyors erjesztéséhez szükséges aminosavakat.
Vegyes mikrobás erjesztési folyamatokkal készített termékek A gabona-, zöldség- és gyümölcsfélék különböző, de jórészt egyféle nyersanyagból álló erjesztett termékei, amelyeket az ún. nyugati világban ismerünk, vagy tejsavas, vagy alkoholos fermentációval készülnek. Az ún. orientális fermentációkban viszont vegyes mikrobás folyamatok mennek végbe, amiben gyakran a 208
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek penészgombák játszanak meghatározó szerepet. Ezek a fermentált termékek többféle növényi anyagot és gyakran húst, halakat, rákokat, kagylókat is tartalmaznak. Bár főleg a távol-keleti országokban számítanak az alapvető élelmiszerek közé, ahol gyártásuk ipari méreteket is ölt, Afrika, Közép- és Dél-Amerika természeti népei között, házilag is nagyon sokféle és változatos, vegyes fermentált termék készül. Számuk több százra rúg, de csak kevésnek ismert a mikrobiológiai alapja és csak néhány fejlődött technológiai szintre.
Koji alapú termékek A mikrobiológiailag legjobban ismert és szabályozott technológiával gyártott fermentált termékek, a szójaszósz, a miso, a tempe stb. a koji felhasználásával készül. A kojitechnológiát, amelynek lényege a keményítő penészgombával való hidrolízise, a szakékészítésnél már ismertettük (6.3.3.). A szójaszósz készítéséhez szójababot vagy szójabab és búzaliszt keverékét használják a koji előállításához. A gőzöléssel megfőzött alapanyagokat A. oryzae vagy A. soyae penészgombával beoltják, amelyek amilázai hidrolizálják (elcukrosítják) a keményítőt. Ez a lépés három napig tart, amelynek során nagymennyiségű fermentálható cukor, peptidek és aminosavak szabadulnak fel. A második lépésben a kojit 18% NaCl-tartalmú léhez adják és legalább 1 évig inkubálják szobahőmérsékleten. A fermentáció során tejsavbaktériumok (elsősorban a Lb. delbrueckii subsp. delbrueckii) és ozmotoleráns vagy ozmofil élesztők (Deb. hansenii, Zyg. rouxii) szaporodnak el. Az így nyert folyékony ízesítőanyag a szójaszósz, ami sok más keleti élelmiszer nélkülözhetetlen adaléka, különösen Japánban és Kínában.
Tempe A tempe tradicionális indonéz étel, ami szójabab alapanyagból elsősorban a Rhizopus penészgomba fajok fermentációjával készül. A friss tempe főtt szójababból szilárd fermentációval előállított, gombafonalakkal átszőtt, fehér, jó illatú termék, amit további hőkezeléssel (főzéssel vagy olajban való sütéssel) tesznek alkalmassá fogyasztásra. Tempe típusú termékeket nemcsak szójababból, hanem más pillangós babból és gabonából is előállítanak. A tempekészítés első lépése a szójabab héjtalanítása, amit vízben áztatás után manuálisan vagy gépekkel végeznek. A magot ezután gőzölik, főzik vagy autoklávozzák, ezalatt a babíz és a keserű íz is eltűnik, majd kevés ecetet vagy tejsavat hozzáadva a pH-t lecsökkentik a mikrobás romlás megakadályozása céljából. Amennyiben az első lépésben az áztatás során tejsavbaktériumos erjesztés is történt, a pH 5 alá csökken és további savanyításra nincs szükség. A lehűtött alapanyagot ezután banánlevelekre vagy bambusztálcákra terítik, a felületét megszárítják, majd beoltják az előzőleg az alapanyagon gondosan elszaporított Rhizopus oltóanyaggal vagy az előző erjesztésből maradt anyaggal, amelyek a gomba konídiumaiból és kísérő mikrobiotaként baktériumokból, élesztőgombákból állnak. Az így elkészített alapanyagot becsomagolják a levelekbe, és 25–37 °C-on 20–50 óráig inkubálják. Ezalatt a gombaspórák kicsíráznak és a fermentálható szénforrás felhasználásával kifejlődő micélium átszövi az alapanyagot, egymáshoz tapasztva a szójababszemeket és jól szeletelhető, kellemes, a friss gombára emlékeztető terméket hozva létre. A szója alapú tempe elsősorban Rhizopus. oryzae és Rhi. arrhizus, míg a gabona alapú Rhi. oligosporus fermentációval készül. A baktériumok közül a tejsavbaktériumok és az Enterobacteriaceae család tagjai dominálnak, de a B. pumilus és a B. brevis is nagy sejtszámot ér el. Az élesztőgombák közül a C. lusitaniae, C. maltosa és a C. intermedia gyakori.
Vegyes erjesztésű italok Rizsből, kölesből, cukornádból, pálmatermésekből különféle alkoholtartalmú italok készülnek, amelyek erjesztésében az élesztőgombákon kívül tejsav- és ecetsav-baktériumok is részt vesznek. Ilyen termék a kombucha, a fekete tea spontán erjesztésével készített, mintegy 2000 éves múltra visszatekintő, gyengén 209
Élelmiszer-ipari erjesztések, fermentált élelmiszerek szénsavas ital, amelynek őshazája elsősorban Kína és Oroszország, de ma már Németországban is készítik. Az erjesztésben tejsavbaktériumok és élesztőgombák vesznek részt, amelyek szobahőmérsékleten 7–10 nap alatt szerves savakban, vitaminokban, ásványi anyagokban gazdag terméket hoznak létre. Kulcsszerepe az Acetobacter xylinum ecetsavbaktériumnak van, az élesztőgombák közül pedig számos (Brettanomyces, Pichia, Saccharomyces, Zygosaccharomyces) faj részt vesz az erjesztésben. A teának egészségvédő hatást is tulajdonítanak.
Kávé, kakaó A kávé kávébabból erjesztéssel készülő termék, amelynek első lépése a bogyó héjának mechanikai eltávolítása, ami szabaddá teszi a nyálkával borított magot. Ezt a nyálkát szárítás előtt el kell távolítani, ami hagyományosan mikrobás fermentációval történik. A nyálkát legnagyobbrészt pektin alkotja, ezért a pektinbontó mikrobáknak van szerepük az enzimes hidrolízisben. Bár a különböző kávétermő területeken eltérő az erjesztő mikrobiota összetétele, bizonyítottnak tekinthető, hogy az erjesztésben mind baktériumok, mind pedig élesztőgombák részt vesznek. A baktériumok közül a pektinolitikus Erwinia dissolvens a legfontosabb, a tejsavbaktériumok pedig a Leuconostoc és Lactobacillus fajokhoz tartoznak. Az erjesztő élesztőgombák a Kluyveromyces marxianus, a S. uvarum, a S. cerevisiae és a Schizosaccharomyces fajok. A penészgombák a fermentációban nem vesznek részt, azonban a zöld kávébogyó felületérő számos Aspergillus faj (A. ochraceus, A. niger, A. glaucus) izolálható, ami magyarázatot ad a pörkölt kávéban kimutatható, esetenként az elfogadhatósági határértéket is meghaladó ochratoxin szennyezettségre. Más mikotoxin-termelő Aspergillus fajok (A. flavus és A. versicolor) is gyakran kimutathatók, ritkábban toxinogén Penicillum fajok (P. cyclopium, P. citrinum, P. expansum) is. Fontos, hogy a mikrobák anyagcseretermékei nem játszanak szerepet a kávé aromájának kialakításában. A kakaó a kakaócserje, amit Afrika, Ázsia és Dél-Amerika egyes vidékein termesztenek, hüvelyterméséből kiszabadított babból készült por. A kakaóbabot a fajtától függően 2–12 napig erjesztik, amelynek során nagy mennyiségű lé keletkezik és a hőmérséklet 45–50 °C-ra emelkedik. Napon vagy szárítóban történő szárítás után a kakaóbabot megpörkölik, ami a végső állományt és a jellegzetes illat- és aromaanyagokat kialakítja. Az erjesztés két fázisra osztható: az elsőben a kakaóbab erősen savas (pH 3,6) húsos részéből kiszabaduló cukrot az élesztők alkoholosan erjesztik, majd a második fázisban az etanolt az ecetsav-baktériumok ecetsavvá oxidálják. A spontán erjesztésekből több mint 50 különféle élesztőgomba, tejsavbaktérium és ecetsav-baktérium faj izolálható, azonban legfontosabb szerepük a Saccharomyces, Lactobacillus, Acetobacter és Gluconobacter fajoknak van. Az erjesztés során a pH-érték lényeges emelkedése figyelhető meg, ami a változó hőmérsékletnek és a mikrobák hatásának tulajdonítható. Az erjesztés első napjaiban 30 °C alatti hőmérsékleten alkoholos és tejsavas erjesztés folyik, amelynek során a kezdeti pH-érték néhány tizedet emelkedik. Ebben az élesztők citromsav-felhasználásának van szerepe, amelyek az etanolos erjesztés közben különböző szerves savakat is termelnek, ezáltal degradálják a szikleveleket és a termék íz- és aromaanyagainak kialakításában is szerepet játszanak. Az első napok után a hőmérséklet 50 °C körüli értékre nő, ami visszaszorítja az élesztőket, az ecetsav-baktériumok anyagcseréje azonban még rövid ideg tovább folyik. Kb. egy hét után a pH 7 feletti értékre nő és megáll minden anyagcsere-folyamat, sőt a sejtek autolizálnak. Az élesztőkből kiszabaduló enzimek felelősek a csokoládé prekurzor anyagainak felszabadításáért. A végső aroma a kakaóbab pörkölése során alakul ki.
210
7. fejezet - Az élelmiszer-feldolgozás mikrobiológiája Az élelmiszer-feldolgozás alapelve, hogy jó minőségű, teljes értékű, biztonságos és egészségügyi kockázattól mentes élelmiszert csak kifogástalan nyersanyagból, jó gyártási gyakorlattal lehet előállítani. Ebből következik, hogy az élelmiszer mikrobiológiai minőségét és biztonságát már a feldolgozás előtti tényezők (a mezőgazdasági termelés, a növénytermesztés és az állattenyésztés) meghatározzák és befolyásolják. Az élelmiszer-feldolgozás csak egy köztes, bár lényeges része a teljes élelmiszerláncnak, amely folytatódik a feldolgozás utáni forgalmazással, kereskedelemmel egészen a fogyasztóig. Ezt fejezi ki az élelmiszer-biztonság korszerű szemlélete, amely az élelmiszerlánc egészére kiterjed, a „földtől a villáig” vagy az „istállótól az asztalig” (az angol eredetiben a jelszavak különösen jól hangzanak: from farm to fork vagy from stable to table). Az élelmiszer-biztonság kérdéseire a 9. fejezetben részletesen visszatérünk, és a nyersanyagtermelésnek a feldolgozást megelőző lépéseivel az egyes termékek tárgyalásánál is foglalkozunk (8. fejezet). Itt a feldolgozás sajátos mikrobiológiai, higiéniai vonatkozásait vesszük szemügyre. Az élelmiszer-feldolgozó műveletek, a tartósító- és a csomagolóeljárások mikroökológiai szempontból külső tényezőknek tekinthetők, jóllehet lényegesen módosítják a termék belső, összetételbeli és szerkezeti tulajdonságait. Mikrobiológiai hatásukat tekintve a feldolgozási műveletek döntő jelentőségű beavatkozások. Bár az élelmiszer-ipari nyersanyagok mindig szennyezettek mikroorganizmusokkal és romlandók, a feldolgozás folyamán ezeket a mikroorganizmusokat igyekszünk eltávolítani, elpusztítani vagy legalábbis szaporodásukban, tevékenységükben gátolni, korlátozni. A feldolgozás célja tehát az élelmiszer érzékszervi tulajdonságainak és tápértékének kialakításán kívül a rövidebb-hosszabb ideig terjedő tartósítás, romlásmentesség biztosítása is. E tevékenység eredményét elsősorban a következők határozzák meg: a nyersanyag mikrobiológiai minősége, a feldolgozás technológiai műveletei, a higiéniai körülmények, a tartósítási eljárás hatékonysága, a csomagolás és a tárolás módja. Ezért a technológia szerves részei a higiéniai műveletek is, azaz a rendszeres és hatékony takarítás, tisztítás, fertőtlenítés, valamint a feldolgozással foglalkozók személyi higiéniája.
Növényi nyersanyagok betakarítása, szállítása Az élelmiszeripar sokféle növényi részt, gyökeret, szárat, levelet, termést dolgoz fel, amelyeket a szántóföldön, kertészetekben, gyümölcsösökben termesztenek, szintén nagyon sokféle agrotechnikai eljárással és módon. Ezek részletezése nélkül csak két tényezőt emelünk ki, amelyek élelmiszer-biztonsági szempontból különösen jelentősek. Az egyik, hogy a termőföld, vagy közvetlenül a növények állati trágyával való kezelése veszélyes mikrobiológiai fertőzési forrás; a szalmonellák és számos más kórokozó baktérium, parazita és vírus kerül ily módon a talajba, ahol hosszú ideig túlélnek, és a termékre kerülhetnek. Ezért a legelő, a zöldségfélék, a gyümölcsök, a takarmánynövények közvetlenül nem trágyázhatók, csak a trágya komposztálása, silózása után. A kémiai műtrágyák, növényvédő szerek szintén veszélyesek az ember egészségére. A nitrogénműtrágyákból a talaj-mikroorganizmusok hatására nitrát és nitrit képződik, ezek, illetve a mérgező növényvédőszer-maradékok közvetve vagy közvetlenül súlyos egészségkárosodást okoznak. Az 1990-es években a Növény-egészségügyi és Talajvédelmi Állomások vizsgálati eredményei alapján szermaradékok miatt a termények 3–8%-a esett kifogásolás alá. Termesztéskor a növények felülete mindig szennyeződik mikroorganizmusokkal. Az egészséges növényi szervek a belsejükben általában mentesek ezektől. A termesztési időszakban a gazdasági növényeket nagyon sok kórokozó mikroba, főleg gomba támadja meg, amelyek képesek behatolni az ép szövetekbe. A hajtás, gyökér, szár, levél, termés betegségeit okozva ezek nagy veszteségeket idéznek elő, olykor el is pusztítják a növényt. Élelmiszer-ipari vonatkozásban fontosabb, hogy a kóros, hibás növényi részek alkalmatlanná válnak a feldolgozásra, és a szántóföldi, elsődleges kórokozók utat nyitnak a romlásnak. A növénykórokozó (fitopatogén) mikrobákkal szemben a romlást okozók közt alkalmi paraziták és szaprobionta mikroorganizmusok vannak. Ezek a növényt másodlagosan károsítják, 211
Az élelmiszer-feldolgozás mikrobiológiája és raktári kórokozóknak is szokás őket nevezni, mivel a romlás tünetei csak a betakarítás után, a tárolás alatt jelentkeznek. A gyümölcsök és zöldségek néhány fontosabb gomba kártevőjét a 7.1. táblázat foglalja össze. A számos gombás betegséghez képest viszonylag kevesebb növénypatogén baktérium van, mint pl. a Xanthomonas nemzetség és néhány Corynebacterium faj, valamint a lágyrothadást okozó Erwinia és Pectobacterium fajok.
7.1. táblázat - A gyümölcs- és zöldségfélék gyakoribb kórokozó és romlást okozó gombakártevői Nemzetség
Tünetek
Gyümölcsféle
Zöldségféle
Alternaria
feketefoltos rothadás
alma, csonthéjasok
paradicsom, paprika
Aspergillus
feketepenészedés
bogyósok
hagymafélék
Botrytis
szürkerothadás
szőlő
hagyma, gyökérzöldségek
Colletotrichum
keserűrothadás
almafélék
antraknózis (fenésedés)
hüvelyesek, kabakosok
Fusarium
fehérpenészes vagy barna- rothadás
alma
hagyma, burgonya
Mucor, Rhizopus
nedves rothadás
bogyósok, szőlő
paradicsom
Phytopthora
barnafoltosodás
levélzöldségek, burgonya
Sclerotinia
fehérpenészes rothadás
bogyósok
gyökérzöldségek, paradicsom, káposztafélék
Trichothecium
magház vagy lágyrothadás
almafélék
kabakosok
Az elsődleges és másodlagos kórokozókon kívül a romlásban a szaprobionta mikroorganizmusok is lényeges, olykor a romlás jellegét meghatározó szerepet játszanak, baktériumok, penész- és élesztőgombák egyaránt. Ezek elsődlegesen a talajból, az öntöző- és a csapadékvízzel kerülnek a növényzetre, de a szél is szennyezési forrás. Természetesen a talajban fejlődő növényi részek (burgonyagumó, cukorrépa, gyökérzöldségek stb.) szennyezettsége a legnagyobb, de a talaj közelében fejlődő növények (pl. saláta) és termések (pl. szamóca, uborka) szennyeződésének fő forrása is a talaj. A széllel felkavart por, az esővel felvert sárcseppek ezeket közvetlenül érik. A talajszinthez képest magasabban fejlődő levélzet, virágzat, termések sem mentesek a porral és csapadékkal rájuk kerülő mikroorganizmusoktól, ezek többsége azonban más közvetítők, elsősorban a rovarok és madarak révén kerül rájuk. A betakarítás, szedés, szüretelés, majd a rakodás, szállítás kisebb-nagyobb mértékű mechanikai sérülést okoz a növényi termékeken, ami elősegíti a mikroorganizmusok behatolását a mélyebb szövetekbe, és utat nyit a romlásnak. A legnagyobb szennyezési forrássá az ilyen, sérült, romlott darabok válnak, 212
Az élelmiszer-feldolgozás mikrobiológiája különösen a feldolgozás előtti tárolás folyamán. A tárolás nemcsak átmeneti jellegű lehet, hanem hosszabb idejű, meghatározó technológiai műveletet képez, pl. a gabonaiparban. A gabonát ömlesztve, nagy befogadóképességű silókban tárolják, ami közben az átmelegedés elkerülésére a szemek átforgatásáról, szellőztetéséről is gondoskodnak.
Növényi termékek feldolgozó műveletei A növényi termékeket feldolgozó élelmiszer-ipari ágazatok változatosságát tekintve nincs arra lehetőség, hogy azok technológiáit részletesen bemutassuk. Általában az előkészítő és a feldolgozó műveletek egy része hathatósan csökkenti, más része azonban elkerülhetetlenül növeli a termék mikrobiológiai szennyezettségét. A mikrobiológiai tényezőket figyelembe véve a technológia feladata az, hogy a feldolgozó műveletekben rejlő mikrobaszám-csökkentő vagy -pusztító lehetőségeket a legnagyobb mértékben kiaknázza, a szennyeződést növelő hatásokat pedig kizárja vagy a lehető legkisebbre korlátozza.
A szennyeződést csökkentő feldolgozóműveletek A műveletek egy része a mikroorganizmusok fizikai eltávolításával csökkenti a nyersanyagok szennyezettségét. Ilyen előkészítő művelet a válogatás, a mosás, a hámozás, a héjeltávolítás, a derítés, a szűrés, a centrifugálás és több más. A mikrobiológiai szennyeződés legveszélyesebb forrásai a nyersanyagban előforduló romlott darabok, legveszélyesebb közvetítői, terjesztői pedig az ezekkel szennyeződő gyűjtő-, tároló-, szállítóedényzet, berendezések, gépek, eszközök, valamint a velük foglalatoskodó ember. A válogatás mikrobiológiai tekintetben kiemelkedő fontosságú művelet, ami a szennyező gócok, romlott darabok eltávolítására szolgál, és amit úgy kell végezni, hogy eközben a szennyeződés ne kerüljön az egészséges, tiszta nyersanyagra. A válogatószalagot ezért folyamatosan kell tisztítani, mosni. Előnyös a nyersanyag darabjait forgató görgős szalag, ami lehetővé teszi, hogy kézzel csupán a romlott, eltávolítandó darabot kelljen megfogni. A kiválogatott, szennyezett anyag gyűjtésére szolgáló edényzetet más célra nem szabad felhasználni, és kiürítés után gondosan meg kell tisztítani. A malomiparban lényeges művelet a szelektálás, a gabonaszemek elválasztása az idegen anyagoktól, tört szemektől (triőrözés). A jól végzett mosás jelentősen csökkenti a szennyeződést, de amilyen hasznos lehet, olyan kárt is okozhat, ha nem megfelelően végzik. Üzemi körülmények között végzett mérések tanúsága szerint a mosás egy-két nagyságrendnyi mikrobaszám-csökkenést eredményezhet. A mosást mindig meg kell előznie a válogatásnak, mert a mosógép hatékonysága a romlott darabokkal bejutó nagymértékű szennyeződés eltávolítására már elégtelen lesz. A hatékony mosás alapvető feltétele az elegendő mennyiségű tiszta víz, a kellő mértékű vízcsere és a mosógépből távozó anyag öblítése erős, tiszta vízpermettel. A mosógép rendszerének olyannak kell lennie, hogy a szennyeződést eltávolítsa a nyersanyagról, és attól elválassza. A berendezés a nyersanyagot ne sértse, zúzza. Célszerű, hogy a gépen áthaladó nyersanyag több fokozatban egyre tisztább vízzel találkozzék és a gépben csak a szükséges ideig tartózkodjék. Ha a vízellátás, vízcsere nem megfelelő, a szennyleválasztás nem jó, a nyersanyag zúzódik vagy kilúgozódik a gépben, akkor a tisztító hatás helyett csak fokozódik a szennyeződés. A mosógép tisztítása is fontos; a vizet teljesen le kell engedni, a lerakódott szennyeződést erős vízsugárral, súrolással el kell távolítani. Ha a mosógép kefés rendszerű, a kefék tisztítására különösen nagy gondot kell fordítani. A héjeltávolítás, hámozás, dörzsölés a szennyezett felület eltávolításával részben csökkenti a mikrobaszámot, másrészt viszont növeli azt a feltárt és sértett belsőbb részeken. Ezért a dörzsöléses, koptatásos eljárások mikrobiológiai szempontból kedvezőtlenek, és csak erőteljes vízáram, mosás egyidejű alkalmazásával megfelelők. 213
Az élelmiszer-feldolgozás mikrobiológiája A hő- vagy kémiai hatással járó gőz-, illetve lúghámozás mikrobapusztító hatása viszont számottevő. Ismét a malomipar példáját említve, a héjeltávolítással járó őrlés a technológia döntő művelete, amelynek hatásfoka meghatározza a liszt és egyéb őrlemények (derce, dara, korpa) mikrobiológiai minőségét. A létisztítás (centrifugálás, szeparálás, derítés, szűrés) szintén hatásosan csökkenti a mikrobaszámot, ami jórészt annak tulajdonítható, hogy a kiülepedő törmelék, homokszemcsék, rostok magukkal ragadják a jóval kisebb méretű mikrobasejteket is, illetve azok fennakadnak a pórusokon képződő szűrőrétegen. A kémiai derítőeljárásoknál a képződő nagyfelületű csapadék távolítja el a mikrobasejteket is. A hőmérsékletnek legalább 60 °C-ra vagy afölé növelésével járó feldolgozó műveletek mikrobapusztító hatása igen számottevő. Bizonyos termékek gyártásánál az előfőzés, előmelegítés, húzatás jelenti a legnagyobb vagy az egyetlen mikrobapusztító hatású előkészítő műveletet. A zúzást, áttörést (passzírozást) és a lényerést (sajtolást, préselést) is gyakran előfőzött anyaggal végzik. Bár az előfőzés a pasztőrözésnél is enyhébb hatású, mégis két-három nagyságrendnyi mikrobaszámcsökkenést eredményez. A hőkezelt anyag fizikai, kémiai állapota viszont olyan változásokon megy át (pl. fehérjék denaturálódnak, szénhidrátok hidrolizálódnak), ami elősegíti a hőhatást túlélő vagy a továbbiakban a termékbe kerülő mikroorganizmusok szaporodását. Ezért gondot kell fordítani arra, hogy az ilyen műveletet követő további feldolgozó lépések gyorsan és folyamatosan sorra kerüljenek vagy az előfőzést hathatós hűtés, hideg öblítés kövesse. Veszélyes, ha a hűtés csak 30–40 °C-ot ér el, ami a mikrobaszaporodáshoz optimális. Nem szabad megfeledkezni arról sem, hogy az előmelegítő, előfőző berendezésekben (pl. csőkígyók hajlataiban) a termofil mikroorganizmusok, baktériumspórák feldúsulhatnak és folyamatos szennyező góccá válhatnak, ha nem gondoskodunk rendszeres tisztításról. Számottevő mikrobaszám-csökkentés várható a húzatástól, besűrítéstől is. A hőmérséklet pusztító hatását fokozza a koncentrált cukoroldat invertálása céljából beállított kis pH (húzatásnál), illetve a mikrobaszaporodást gátló csökkenő vízaktivitás (húzatásnál, besűrítésnél). A korszerű vákuumos eljárások kedvezőbbek a termékminőségre, de mikrobiológiai hatásuk mérsékeltebb az alacsonyabb (50–60 °C) hőmérséklet miatt. Még ezekben a berendezésekben is gondolni kell a termofil baktériumok túlélésére, illetve felhalmazódására. Mérések szerint a paradicsomlé mezofil aerob mikrobaszáma besűrítés után másfél nagyságrendet csökkent, viszont az aerob spóraszáma közel egy nagyságrenddel nőtt.
A szennyeződést növelő feldolgozóműveletek Általában minden, a nyersanyag eredeti szerkezetét megbontó, fizikai állapotát megváltoztató művelet elősegíti a mikroorganizmusok terjedését, behatolását a mélyebb szövetekbe, és egyúttal a sejtnedvek kiáramlásával elősegíti azok szaporodását. A fejtés, magozás, csumázás, szeletelés, aprítás, darálás, zúzás, préselés stb. mind ilyen hatású művelet. Mivel ezek említett hatásai elkerülhetetlenek, a káros mikrobiológiai következmények mérséklésére nagy figyelmet kell fordítani. A berendezéseket vagy azok olyan részeit, ahol az anyagtörmelék összegyűlhet, felhalmozódhat, rendszeresen és gondosan kell tisztítani, máskülönben szennyező gócok alakulnak ki, amelyekben a mikroorganizmusok elszaporodnak. Gondoskodni kell továbbá arról, hogy a feltáró, roncsoló hatású műveleteken átesett termék gyorsan tovább kerüljön a feldolgozás következő szakaszába. Az előkészítő vonalak kritikus pontjai azok a helyek, ahol az anyag egyneműsítés, keverés céljából vagy a szűkebb áteresztőképeség miatt összegyűlik, várakozik. A gyűjtő-, tároló- és puffertartályokban ismét lehetőség van arra, hogy a mikrobasejtek a lappangási szakaszból átkerüljenek az exponenciális szaporodási szakaszba, amikor számuk igen gyorsan növekszik. Sok feldolgozó folyamatban használnak felöntőlevet. A felöntőlé készítése és adagolása mikrobiológiai szempontból ismét kritikus művelet. A felöntőlé összetevői közt számos olyan adalék szerepel, amelynek mikrobiológiai szennyezettsége jelentős. Ilyenek a különböző fűszerek és a cukor, amelyek spórás szennyezettsége 214
Az élelmiszer-feldolgozás mikrobiológiája veszélyes tényező. A spórák könnyen túlélhetik a felöntőlé készítésekor alkalmazott melegítést. A felöntőlevet adagolásig gyűjtőtartályban tárolják, itt a lé hőmérséklete nem lehet kevesebb, mint 80 °C. A töltés, csomagolás és zárás gyakran a befejező tartósítási eljárást megelőző utolsó műveletek, olykor viszont a tartósítást (pl. szárítást, fagyasztást) követik. A feldolgozóvonal végén a termék már mindazokat a mikrobákat tartalmazza, amelyek a nyersanyag eredeti szennyeződésével vagy bármelyik további szennyező forrásból bekerülhettek és túlélték a különböző előkészítő műveletek mikrobaellenes hatásait. Ezek többsége a feldolgozás folyamán alkalmazkodott a termék sajátos tulajdonságaihoz, belső és külső ökológiai tényezőkhöz. Minden további késedelem csak növeli a mikrobaszámot, ami csökkenti a tartósítási eljárás hatásfokát, a termék eltarthatóságát és minőségét. A csomagolásra használt anyag, edényzet, amelybe a terméket töltik, szintén tartalmaz mikroorganizmusokat. Az edényzet tisztítása olykor nehéz, és a szennyezett dobozokkal, üvegekkel bejutó mikroorganizmusok válnak a romlás okozóivá. A töltéshez, csomagoláshoz, záráshoz használt berendezések, gépek pedig a termékkel szennyeződhetnek, ha tisztításuk nem megfelelő. Különösen a töltőgép tartályai, a töltőfejek szennyeződése veszélyes. Bizonyos esetekben (pl. darabos sorolt, rakott termék készítésekor) a kézi töltés elkerülhetetlen, ilyenkor a személyi tisztaság döntő tényező. A zárás pontossága fontos feltétele a mikrobiológiai romlás elkerülésének. Dobozok zárásánál a zárógép beállításának csak néhány század milliméteres eltérése elegendő lehet az utószennyeződéshez, hőkezelés után a hűtővíz beszívásához.
Állatok vágása, előfeldolgozása A hús- és baromfiipar élelmiszer-mikrobiológiai és -biztonsági szempontból kiemelkedő és elsődleges fontosságú ágazat. A hústermékek élelmiszer-biztonsági láncolata az „istállótól az asztalig” terjed (7.1. ábra). A különböző mértékben feldolgozott húskészítményeken kívül maga a hús (tőkehús) is készterméknek minősül, amelynek előállítására a vágóállatok, illetve szárnyasok (baromfik) sajátos és különleges technológiai műveletei szolgálnak. A húsipar alapvető „nyersanyagai” az élő állatok (pl. sertés, szarvasmarha, juh, illetve csirke és nagyobb szárnyasok) a nagyüzemi állattenyésztésből és a kisüzemi, magángazdasági állattartásból származnak, amelyeket a vágóhidakra, a húsipari és baromfiipari vállalatokhoz szállítanak a vágás céljára. Mielőtt ezek mikrobiológiai vonatkozásait a három legfontosabb termékcsoport példáján bemutatjuk, fel kell hívni a figyelmet a mikrobiológiai minőséget és biztonságot már az állattenyésztés alatt befolyásoló lényeges tényezőre, a takarmányozásra. A takarmány jelentős kórokozók forrása lehet, ezért az Európai Unió előírásai tiltják az elhullott állatok hulláiból, valamint a vágóhídi hulladékokból készült ipari tápok előállítását és használatát, illetve magángazdaságokban a háztartási moslék felhasználását állatok táplálására. Vizsgálatok igazolják, hogy a baromfitenyésztésnél a keveréktakarmány a szalmonellák terjesztője. A penészes alapanyagot tartalmazó takarmánnyal mikotoxinok is kerülnek az állatokba, majd a hússal, a tej és a tojás közvetítésével az emberi szervezetbe. Kimutatták azt is, hogy az utóbbi évtizedek legnagyobb méretű és veszélyességű állatmegbetegedésének, a szarvasmarhák szivacsos agyvelőgyulladásának (BSE) okozója (egy prion) a takarmányból eredt.
215
Az élelmiszer-feldolgozás mikrobiológiája
7.1. ábra - Hústermékek élelmiszerbiztonsági láncolata az „istállótól az asztalig”
Sertés vágása A sertéstartás körülményei közismerten nem higiénikusak. Az alomtól, trágyától az állatok testfelülete erősen szennyeződik, ami a szállítás alatt csak fokozódik, amint az összezsúfolt állatok az ürülékkel egymást szennyezik, fertőzik. Ennek ellenére az egészséges állatok húsa általában mentes a mikroorganizmusoktól, bár a hajszolás, szállítás alatt az állatot érő stresszhatások következtében a bélcsatornából az izomszövetbe is kijuthatnak baktériumok. A stressznek lényegesebb utóhatása és következménye lehet a nem megfelelő húsérés, ezért célszerű az állatok pihentetése a vágás előtt. A külső bőrfelület szennyezettsége kismértékben csökkenthető a vágás előtti zuhanyozással, ami a stresszhatást is mérsékeli. A vágás főbb műveleteit a 7.2. ábra foglalja össze. A vágás többnyire elektromos kábítás után történik, ezt azonnal követi a szúrás és az elvéreztetés. Ez utóbbi helyes végrehajtása igen lényeges, mivel egyrészt a bőrfelület vagy a szúrókés a vért szennyezheti, másrészt a nem tökéletes kivéreztetés a hús minőségét és eltarthatóságát rontja. A sertéstestet ezt követően forrázzák (ami csak 60 °C-os vizet jelent), majd az így fellazított szőröket gépi vagy kézi úton eltávolítják (kopasztás), a szőrmaradványokat perzseléssel leégetik. A 800–1000 °C-os gázláng a bőrfelület mikrobaszámát jelentősen csökkenti, amit fokoz a perzselést követő tisztítás vízzel, kaparókéssel.
216
Az élelmiszer-feldolgozás mikrobiológiája
7.2. ábra - A sertés (A) és a marha (B) vágásának és előfeldolgozásának főbb műveletei
A felsőpályás vonalra felfüggesztett sertéstest bontása a hasüreg megnyitásával kezdődik, majd eltávolítják a belső szerveket (gyomor- és béltraktust, a nyelvvel együtt a tüdőt, szívet). A bontás előtt lényeges higiéniai lépés a végbél körülvágása és elkötése. Végül a sertést a gerinc mentén kettéhasítják, és a féltesteket a további feldolgozás előtt legalább egy napig hűtött helyiségben érlelik. A hús hőmérsékletének gyors csökkentésére 0–2 °C-os előhűtést alkalmaznak, a tárolás 4 °C-on, 90%-os páratartalmú teremben történik. Az érlelés alatt a hús pH-ja az izmok tartalék tápanyagának, a glikogénnek tejsavas lebomlása következtében 5,5–5,7 értékre csökken. Stresszhatásra ez már az állat életében megtörténhet, és nagyobb pH-jú, sötétebb színű (ún. DFD) hús képződik, vagy túl gyorsan és nagyobb mértékben megy végbe, és vizenyős, halvány (PSE) hús keletkezik; mindkettő súlyos minőségi és romlásra vezető hiba. A bontás feltárja a belsőbb szöveteket, a vágások felszakítják a szöveteket, a szerveket, izomkötegeket burkoló pólyákat, hártyákat, és mindezek a mikroorganizmusok szétterjedésével járnak. A bontás higiéniájának szigorú feltételei vannak, a kezet, az eszközöket, az edényzetet, az asztalokat az előírások szerint kell tisztítani, fertőtleníteni. Az egész vágási folyamat irányítása, szabályozása a HACCP rendszerbe illesztve történik (lásd a 9. fejezetet). Az állatorvosi felügyelet már vágás előtt (ante mortem) lehetővé teszi a beteg állatok kiválogatását, a vágás utáni (post mortem) húsvizsgálat eltávolíttatja a kóros elváltozásokat mutató egyedeket.
217
Az élelmiszer-feldolgozás mikrobiológiája A hús további feldolgozásának műveleteit (darabolás, csontozás, csomagolás, fagyasztás), illetve a húskészítmények gyártásának részleteit (aprítás, darálás, adalékok hozzákeverése, töltés, füstölés, pácolás, hőkezelés stb.) a termékeknél ismertetjük (8.1. fejezet), különös tekintettel azok mikrobiológiai vonatkozásaira.
Szarvasmarha vágása A szarvasmarha vágása, bontása lényegében hasonló a sertés vágásához, előfeldolgozásához, bár attól több részletben eltér (7.2. ábra). A kábítás nem elektromos eszközzel, hanem mechanikus módon történik (taglózás vagy lelövés kábítópisztollyal). Az állatot már ezután felfüggesztik, elvéreztetik, levágják a körmöket, szarvakat. Ezt követi a bőrfejtés, kézi erővel vagy gépi berendezéssel. Ez ugyan eltávolítja a szennyezett kültakarót, de feltárja a húsfelületet, tehát higiéniailag nagyon kritikus művelet. A bőrfejtés után levágják és mossák a fejet, majd a testet felbontják, és a belső szervek eltávolítása után négy darabra vágják. A belezés, hasítás higiéniailag szintén kritikus művelet. A húsvizsgálatot követően a marhanegyedek hűtőbe, a bőr, a fej, a belső szervek, a gyomor, bendő, bél külön feldolgozásra kerülnek.
Baromfi-feldolgozás Míg a nagy vágóállatok feldolgozása vágóhídi és húsüzemi műveletekre különül, a baromfi-feldolgozás egy folyamatos és nagymértékben automatizált műveletsor keretében lényegében a végtermékig (bontott, hűtött, fagyasztott egész csirke) vezet, bár nagyobb szárnyasoknál (tyúk, pulyka, kacsa) és baromfi készítményeknél további feldolgozásra is sor kerül. Az élő baromfiszállítmány közvetlenül a feldolgozó gépsorhoz érkezik. Az élő szárnyasokat lábuknál fogva, fejjel lefelé a szállítópályára akasztják, elektromos vízfürdőben kábítják, a nyakat átvágva elvéreztetik, forrázzák, kopasztják, bontják, zsigerelik, előhűtik, és egészben vagy darabolva csomagolják. A felfüggesztett állat szárnya csapdos, a kábítás ellenére a véreztetés alatt még vergődik, ami nagymértékű szennyeződést okoz. A forrázás ugyan 50–60 °C-os vízbe merítve történik, a forrázóvíz azonban a csere ellenére is fokozatosan egyre szennyezettebbé válik. A kopasztás a tollak mechanikus leverését jelenti, ami a szomszédos darabok és a környezet további szennyeződésével jár. Az ezt követő permetező vagy vízsugaras mosás sem enyhíti a következő felbontás, majd pneumatikus zsigerelés, belezés okozta szennyeződést. A zsigerek tisztítása részben kézi (máj, szív), részben gépi (zúza) úton történik, a testet pedig meleg vízzel mossák, zuhanyozzák. A feldolgozás utolsó szakasza a hűtés, amit korábban hűtőkádakban végeztek. A hűtővíz a klórozás ellenére is nagymértékben szennyeződik a tömeges feldolgozás alatt, ezért újabban csak részleges vizes előhűtést (18–20 °C-ig), majd léghűtést alkalmaznak a szükséges 4 °C-os húshőmérséklet elérésére. A korszerű vonalak berendezései rozsdamentes anyagból, sima felületekkel, jól tisztíthatóan készülnek, de minden ügyes technikai megoldás, antibiotikumos kezelés ellenére sem sikerül elkerülni a baromfihús mikrobás szennyeződését, kórokozókkal (szalmonellával, campilobakterrel) is, ami már a szárnyasállomány fertőzöttségéből ered és a tömeges feldolgozás következménye. A feldolgozóvonalak kapacitása több ezer baromfi műszakonként, ami olyan mértékű szennyezési terheléssel jár, amit a vonal néhány szakaszán beiktatott vizes mosás nem képes mérsékelni. A nagyüzemi baromfi-feldolgozás terméke elkerülhetetlenül szennyezett és veszélyes kórokozókkal terhelt fertőzési forrás. Erről a tényről az ételek elkészítésénél nem szabad megfeledkezni!
A technológiai vonalak mikrobiológiája A meghatározott előkészítő és feldolgozó műveletekből álló technológiai folyamatok mikrobiológiai hatását mutatja, hogy a különböző üzemekben, amelyek egy adott terméket többé-kevésbé azonos technológiával állítanak elő, megközelítőleg azonos mikrobiológiai kép alakul ki a mikrobaszám és a mikrobiota 218
Az élelmiszer-feldolgozás mikrobiológiája összetételét illetően. Ez annak következménye, hogy az egyformán érvényesülő mikroökológiai tényezők hatására az adott környezethez a legjobban alkalmazkodó mikroorganizmusok szelektálódnak ki és alkotnak a termékre jellemző mikrobatársulást. Ez a társulás a termék tartósságára leginkább veszélyes mikrobafajokat tartalmazza, és alkalmas körülmények között romlási társulássá alakul. Ha a technológiai berendezések, gépek különböző részein, helyein feldúsul a környezeti hatásoknak legjobban ellenálló fajokból álló mikrobiota, akkor ez meghiúsítja az elfogadható mikrobiológiai minőségű és eltartható termék előállítását. A mikrobatársulás hasonlósága ellenére nagy különbségek lehetnek az azonos technológiai vonalak szennyezettségének mértékében. Ebből a műveletek végrehajtásának módjára, a technológiai előírások betartásának pontosságára vagy lazaságára, a higiéniai tisztaságra, a jó gyártási gyakorlat meglétére vagy hiányára lehet következtetni. A technológiai vonalak összeállításánál a műszaki, üzemszervezési igények kielégítésén kívül három lényeges mikrobiológiai szempontra is tekintettel kell lenni: • a technológiai folyamat a termék szennyeződésére ne vagy csak a lehető legkisebb mértékben adjon módot; • a technológiai vonal folyamatossága és áteresztőképessége olyan legyen, hogy az átfutási idő alatt a mikroorganizmusok ne szaporodjanak; • a technológiai vonal jól tisztítható, takarítható, fertőtleníthető legyen, ami megakadályozza a szennyező gócok kialakulását, a termékspecifikus, ellenálló mikroorganizmusok feldúsulását. A vonal műszaki összeállításakor különös figyelmet kell fordítani az egyes műveletek mikrobaszámot csökkentő vagy növelő hatására. Bár, mint láttuk, vannak a mikrobaszám határozott csökkentésével járó műveletek, általában mégis úgy tekinthető, hogy minden egyes művelet, feldolgozási lépés a mikrobaszámot fél vagy egy nagyságrenddel növeli. Ezért a technológiai vonal a lehető legkevesebb műveletből álljon, a lehető legrövidebb legyen, és a lehető leggyorsabb átfutást tegye lehetővé. Korszerű üzemekben a feldolgozási folyamat jelentős része hűtött térben zajlik, ami bizonyos mértékig lassítja a mikrobaszaporodást. A műveletekhez olyan berendezéseket, gépeket kell választani, amelyek egyszerű felépítésűek, belső felületük sima, rejtett zugaik, az anyagáramlás útjából kieső szögleteik nincsenek, az anyagot gyorsan és egyenletesen átjuttatják, továbbá egymáshoz viszonyított áteresztőképességük arányos. A tisztítás érdekében a berendezés könynyen szétszedhető, részei jól hozzáférhetők legyenek. Csak így kerülhető el, hogy a rendszeres takarítás, fertőtlenítés ellenére a vonal bizonyos pontjai szennyező gócokká váljanak. Szennyeződésre ad lehetőséget az is, ha a gépek, berendezések összeépítése miatt a padozat egyes részei hozzáférhetetlenné, tisztíthatatlanná válnak. Hibás az olyan elrendezés is, ami az egymás fölé kerülő berendezésekből hulladékszóródásra, csöpögés miatti szennyeződésre ad módot. Az anyagmozgatás útjait úgy kell kialakítani, hogy ne keresztezzék egymást. Különösen kerülendő, hogy a technológiai vonal valamely későbbi szakasza a nyersanyag bevezető útjával vagy a hulladék, szemét elszállításának útjával találkozzék. Az anyagmozgatás eszközeinek tisztasága és tisztítása éppolyan fontos, mint a vonal bármely berendezéséé, gépéé. A ládák, tálcák a padozatra vagy egymásra helyezve szennyeződhetnek. Ha a folyamatos szállítóberendezések (elevátorok, szállítószalagok) felülete nem tiszta, akkor azok a terméket is folyamatosan szennyezik. Az anyagmozgatás zárt útjai, a csővezetékek, a hozzájuk tartozó szivattyúk általában nehezen tisztíthatók. Átmosásukra, fertőtlenítésükre különös gondot kell fordítani. Ha a lehetőségek legjobb kihasználásával elértük, hogy a technológiai vonalon a termék szennyeződése ne növekedjék, mikrobiológiai szempontból a következő feladat az, hogy az elkerülhetetlenül meglévő szennyező mikroorganizmusokat ne engedjük tovább szaporodni. Ennek legegyszerűbb módja az átfutási idő csökkentése. A gépek, berendezések kapacitását úgy kell méretezni, hogy az anyagmozgatás folyamatos, az anyag áthaladása egyenletes, átfutási sebessége pedig 219
Az élelmiszer-feldolgozás mikrobiológiája a lehető legnagyobb legyen. Ha a vonal anyaghiány vagy műszaki hiba miatt átmenetileg leáll vagy az anyag valamely berendezésnél feltorlódik, rögtön fellép a mikrobaszám ugrásszerű növekedésének veszélye. A szennyező gócok kialakulását, az ellenálló fajok feldúsulását csak az egész technológiai vonal rendszeres tisztításával, takarításával és fertőtlenítésével lehet elkerülni. Ezt a munkát a gyártástechnológia szerves részének, szakmai tevékenységnek kell tekinteni, aminek feladata az élelmiszer-feldolgozás higiénikus körülményeinek megteremtése és fenntartása. A technológiai előírások és a gyártáshigiéniai követelmények megtartása együttesen garantálják azt a jó gyártási gyakorlatot, ami a biztonságos és jó minőségű késztermék előállításának alapja.
Higiéniai követelmények Az élelmiszerek ipari feldolgozásának és forgalmazásának alapvető higiéniai feltételeit az EU-előírásoknak megfelelő magyar élelmiszertörvény szabályozásainak megfelelően a 17/1999 (II. 10.) sz. FVM–EüM együttes rendelet határozza meg. Általános rendelkezései az élelmiszerüzemre, berendezéseire vonatkoznak, részletes rendelkezései az egyes iparágak sajátosságai szerint az élelmiszer előállítás, raktározás, szállítás és forgalmazás szabályairól szólnak, különös tekintettel a takarítás, fertőtlenítés és az élelmiszerrel foglalkozó személyek higiéniai vonatkozásaira.
Üzemtelepítés Az élelmiszer-feldolgozás higiéniai követelményei már az üzem létesítésével, telepítésével, elrendezésével kapcsolatban felmerülnek. A technológiai vonalak kialakítása, a feldolgozóberendezések kiválasztása, az üzemi helyiségek kialakítása és az üzem egészének elrendezése számos alapvető követelménynek kell, hogy megfeleljen, amelyek közt, élelmiszer-ipari üzemek esetén, a higiéniai szempontok meghatározó fontosságúak. Az egyre szigorodó előírásoknak új üzemek telepítésekor viszonylag könnyebb megfelelni, sajnos azonban a hazai élelmiszer-ipari üzemek többsége évekkel, évtizedekkel korábban létesült, és utólag már nagyon nehéz a korszerű követelményeknek megfelelő átalakításuk. Az élelmiszer-ipari üzem létesítésének higiéniai előírásait különösen nehéz teljesíteni a mezőgazdasági területeken, a termőhelyek közelében kialakított előkészítő telepeken. Itt egyaránt gondot okozhat a szilárd burkolatú utak, a megfelelő vízellátás és a csatornázás hiánya. Mivel az előkészítő telepekről a részben feldolgozott nyersanyagokat az üzembe kell szállítani, ahol a továbbfeldolgozás csak néhány óra múlva folytatódhat, a mikrobiológiai állapot kritikus értéket érhet el. Az üzemtelepítés higiéniai szempontjai nyilvánvalóak, maguktól értetődőek, nem kívánnak sok magyarázatot, indokolást. Így pl. alapvető szempont a közművek helyzete (energia- és vízellátás, csatornázás, szennyvízelvezetés), a szállítási lehetőségek (közút, vasút), a nyersanyagtermelő területek közelsége, illetve a lakóterületek távolsága. Mindezek mellett napjainkban a környezetvédelmi szempontok (zöldterületek helyreállítása, védelme, a károsanyag-kibocsátás mérséklése) is nagy súllyal esnek a latba. Üzemen belül a tiszta és szennyes övezeteket el kell különíteni. A mezőgazdasági nyersanyagok, élő állatok fogadására, a szállítóeszközök mosására, fertőtlenítésére, a szemét, hulladék és melléktermék tárolására szolgáló üzemrészeket, a szennyvíztisztítót elkülönített, zárt területeken kell kialakítani. A feldolgozó részlegek, a raktárak, a szociális létesítmények és az irodák a szennyes övezetektől távolabb legyenek. Az üzemen belül az utak, udvarok burkolata pormentes, tisztítható legyen. Az üzemi helyiségeknél kívánatos, hogy a falak, padozatok, mennyezetek burkolata tisztítható, hézagmentes legyen, megfelelő csatornázással, vízelvezetéssel, szellőzéssel, megvilágítással ellátva. A szociális helyiségek (mosdók, WC-k) higiéniai követelményei magasak: automata kézmosók, fertőtlenítők és szárítók elengedhetetlenek. A megfelelő tárgyi feltételek késztetik a dolgozókat a személyi higiénia betartására. 220
Az élelmiszer-feldolgozás mikrobiológiája A gépek, berendezések, eszközök rozsdamentes, korrózióálló anyagokból készüljenek, jól tisztíthatók, fertőtleníthetők legyenek. Kialakításuknál a technikai szempontokkal egyenrangúak a higiéniai és munka-egészségügyi követelmények.
Vízminőség Az élelmiszer-ipari üzem telepítésénél a fő szempontok egyike, hogy megfelelő mennyiségű és minőségű víz álljon rendelkezésre. Az élelmiszer-feldolgozásra használt víznek ivóvíz minőségűnek kell lennie, akár élelmiszer-összetevőként, akár tisztításra használják vagy bármilyen módon kerül a termékkel érintkezésbe. Csak kivételes esetben és célra engedhető meg, hogy nem ivóvíz minőségű vizet alkalmazzanak, pl. úsztatásra, szállításra, de ilyen esetben is az ilyen vizet zárt rendszerben kell elkülöníteni az általános üzemi vízrendszertől. Az ivóvíz minőség mindenekelőtt mikrobiológiai tisztaságot jelent; ezenkívül a fizikai és kémiai paramétereknek (pl. zavarosság, teljes szerves széntartalom, pH, keménység stb.) is bizonyos követelményeket kell kielégíteniük ahhoz, hogy a víz élelmiszer-technológiai célra felhasználható legyen. Az ivóvíz minőségi követelményeit a (jelenleg hatályos) 201/2001 (X. 25.) korm. rendelet írja elő. Az ivóvíz 100 cm3-e nem tartalmazhat fekáliás szennyeződésre utaló baktériumokat (koliform, fekál koli, enterokokkusz), összes élő mikrobaszáma pedig legfeljebb 100/cm3 lehet 22 °C-os inkubálásnál, de csak 10/cm3 a 37 °C-on kitenyészthető baktériumszámot illetően. A kémiai jellemzők közül technológiai szempontból lényeges a pH, a keménység és a kémiai oxigénigény. A pH-nak 6,5–8,5 határok közt kell lennie. A keménység a vízben oldott sók mennyiségét jelzi, amelyek közül az ún. állandó keménység a Ca- és Mg-ionokra, a változó keménység a karbonátokra utal. A vízkeménységet általában a CaO mg/l koncentrációjában fejezik ki, ennek 1/10-e az ún. német keménységi fok (nk). A lágy víz keménysége kevesebb, mint 10 nk (vagyis < 100 mg/l CaO), a közepesen lágy vízé 10–16 nk, a kemény vízé pedig több, mint 16 nk; az utóbbit többnyire lágyítani kell a hőkezelés okozta kicsapódások elkerülése érdekében. A vízben található szerves anyagok mennyiségét jelzi a kémiai oxigénigény (KOI), amely számszerűen az 1 dm3 vízben lévő szerves anyag oxidálásához szükséges kálium-permanganát (vagy kálium-dikromát) mennyiség. A jó ivóvíz KOI értéke legfeljebb 3 mg/dm3. Természetes vizek szervesanyag-tartalmának kifejezésére szolgál a biológiai (vagy biokémiai) oxigénigény, amely a vízben lévő szerves anyagok öt nap alatt való lebontása során fogy el (BOI5, mg/l). Az élelmiszer-iparban használt víznek mind a mikrobiológiai, mind a fizikai-kémiai paramétereknek meg kell felelnie. A kifogásolható víz minőségét szűréssel, adszorbensekkel és/vagy fertőtlenítéssel lehet javítani. Olykor szükség lehet a pH beállítására vagy a víz lágyítására is. A mikrobiológiai fertőtlenítésre legáltalánosabban a klórozást alkalmazzák, cseppfolyós klórt, klór-dioxidot vagy klóramint használva (lásd a 7.5.4. pontban), a szabad klórtartalmat 0,2–0,5 mg/lre állítva. Ivóvíz fertőtlenítésére ózont vagy UV sugárzást is lehet használni.
Takarítás, tisztítás, fertőtlenítés Alapelv: élelmiszer-ipari üzemben a takarítás, tisztítás, fertőtlenítés a technológia szerves része. Szakmunka, amelynek folyamatait megfelelő sorrendben, rendszeresen és hatásosan kell végrehajtani. Tisztító- és fertőtlenítőszerként csak nem mérgező anyagokat szabad használni, és ügyelni kell arra, hogy ezek az élelmiszerrel sem közvetlenül, sem közvetve ne kerüljenek érintkezésbe. A takarítás, tisztítás és fertőtlenítés együttes célja és feladata, hogy az élelmiszerüzem egészében olyan higiéniai állapot uralkodjon, ami biztosítja a mikrobiológiai romlások és a kórokozókkal való fertőződés elkerülését. Ezért e műveletek alapvetően megelőző jellegűek, fontos részei az élelmiszer-biztonság szabályozására irányuló HACCP rendszer intézkedéseinek (lásd a 9. fejezetet). 221
Az élelmiszer-feldolgozás mikrobiológiája Takarításon az üzem egészének, helyiségeinek, gépeinek, berendezéseinek rendben tartását, a szemét és hulladék eltávolítását értjük. A tisztítás célja a fizikai és kémiai szennyeződés eltávolítása és ezekkel együtt, bizonyos mértékig, a mikrobiológiai szennyeződés csökkentése is. Mikrobiológiai tisztaságot azonban csak fertőtlenítéssel lehet elérni, ami a felületeket szennyező mikroorganizmusok elpusztítását, de legalább számuk jelentős, több nagyságrendnyi csökkentését jelenti. Különösen fontos a kórokozók és a technológiához alkalmazkodott sajátos mikrobiota elpusztítása. E három részfeladat összefüggését a 7.2. táblázat foglalja össze.
7.2. táblázat - A takarítás, tisztítás és fertőtlenítés folyamatai 1. Előkészítés: eszközök, segédanyagok eltávolítása, gépek, berendezések szükséges mértékű szétszedése. 2. Élelmiszer-törmelék, hulladék összesöprése, eltávolítása. 3. Tisztítás folyó vízzel, vízárammal, keféléssel, súrolással, szükség szerint tisztítószerek, detergensek alkalmazásával. 4. Öblítés, alapos vízárammal. 5. A takarítás, tisztítás hatékonyságának ellenőrzése. 6. Fertőtlenítés forró vízzel, gőzzel vagy fertőtlenítőszerrel. 7. A szükséges idő, hőmérséklet, koncentráció betartása. 8. Öblítés tiszta vízzel. 9. Száradás után a gépek, berendezések összeszerelése. 10. A teljes folyamat eredményességének ellenőrzése és dokumentálása. A takarítás, tisztítás és fertőtlenítés végrehajtásának lényeges szempontja a folyamatosság és a rendszeresség. A feldolgozás alatt képződő hulladékokat, tisztátlanságot a műszak közben is folyamatosan el kell távolítani. Minden műszak végén alapos takarítást és tisztítást kell végezni. A padozaton, a berendezések felületén kívül a gépeket, eszközöket is meg kell tisztítani, különös figyelmet fordítva a csak szétszerelés után feltáruló helyekre, ahol a törmelék és a mikroorganizmusok felhalmozódhatnak. A tisztítást naponta egyszer fertőtlenítéssel kell összekötni, a gépeket, berendezéseket a szükséges mértékig szétszedve és belső részeiket hozzáférhetővé téve. Hetenként nagyobb mértékű, az üzem egészére kiterjedő takarítást, tisztítást, fertőtlenítést kell végezni, végül évente, a termelés megkezdése előtt és befejezése után általános takarításra kerüljön sor, célszerűen a karbantartással, nagyjavítással egy időben. A takarítás, tisztítás és fertőtlenítés eredményességének másik feltétele a hatékony végrehajtás. A műveletek elvégzése ebben a sorrendben következzék: a tisztítást célszerű előöblítéssel kezdeni és utóöblítéssel befejezni, erre a fertőtlenítés befejezésekor is szükség van a vegyszermaradványok eltávolítása céljából. A nagyméretű és -mennyiségű szemét, hulladék összeseprését, eltakarítását és elszállítását az elkülönített gyűjtőhelyre külön erre a célra szolgáló eszközökkel és edényzettel kell végezni. Tisztításkor a szennyeződést részben mechanikailag (erős vízsugárral, keféléssel, súrolással), részben kémiailag (forró vízzel, tisztítószerekkel) lehet eltávolítani. A tisztítás eredményességét meghatározza a szennyeződés típusa és mértéke (szervetlen kiválások, zsír, fehérje vagy szénhidrát jellegű szerves anyagok, felületen képződő biofilmek), továbbá a felület állapota (korrodált alumínium, fa, gumi nehezebben tisztítható). A fertőtlenítés a tisztítás után a felületen még megtapadó mikroorganizmusokat pusztítja el. A jó hatású fertőtlenítés a mikrobaszámot 105–106-od hányadára csökkenti. A fertőtlenítőszer koncentrációját célszerű úgy megválasztani, hogy a szükséges behatási idő 10–15 perc legyen. Ez a szer fajtájától, a hőmérséklettől és a mikrobás szennyezettség mértékétől is függ. A fertőtlenítés hatékonyságát a szennyező anyagok csökkentik, ezért azt csak tisztítás után szabad elvégezni, a tisztítószer maradványait jól leöblítve. 222
Az élelmiszer-feldolgozás mikrobiológiája A tisztítás és fertőtlenítés hatékonyságát kézi vagy gépi eszközök fokozzák. A tisztítógépek nagynyomású forró vízzel vagy gőzzel működnek. A korszerű gyártási vonalakat beépített tisztító és fertőtlenítő rendszerekkel is ellátják. Zárt rendszerekbe az egyidejűleg tisztító és fertőtlenítő hatású szereket szivattyúkkal viszik be, a gépeken, csővezetékeken átáramoltatják. Ez a helyben való tisztító rendszer (CIP) egészében automatizált és műszerekkel vezérelt. A takarítás, tisztítás és fertőtlenítés eredményes végrehajtásának harmadik követelménye a szakszerűség. Ezt a tevékenységet szakmunkának kell tekinteni, elvégzéséhez hozzáértés szükséges, az ezzel megbízott személyzetet különleges feladatukra ki kell képezni. Erre munkavédelmi okokból is szükség van, hiszen a használt tisztító- és fertőtlenítőszerek nagy töménységben maró vagy mérgező hatásúak, a nagynyomású gépek kezelése is szakértelmet igényel. A tisztító- és fertőtlenítőszereket külön, zárt helyiségben kell tárolni. A munka irányítása és ellenőrzése szakképzett személy feladata. A hatékonyságot időnként laboratóriumi vizsgálatokkal is ellenőrizni kell. Az általános használati utasítások ellenére szükséges lehet az adott vegyszer hatékonyságának kimérése, a megfelelő koncentráció, idő, hőmérséklet beállítása. A takarítás, tisztítás és fertőtlenítés munkafolyamatát részletes előírásban kell rögzíteni, amely a gyártástechnológiai utasítás része. Ez a tevékenység a gyártástechnológia szükségszerű és nélkülözhetetlen része. Annak tekinti és eszerint jár el minden korszerű szaktudású, mikrobiológiai és higiéniai szemléletű élelmiszer-technológus.
Tisztító- és fertőtlenítőszerek Az élelmiszeriparban sokféle mosó- és tisztítószert, valamint fertőtlenítőszert alkalmaznak, számos olyat is, amely egyidejűleg tisztító és fertőtlenítő hatású. Kémiai tulajdonságaik, hatásmechanizmusuk változatos. A tisztítószertől elvárható, hogy jó felületaktív, a felületi feszültséget csökkentő hatású, következésképp jó emulgeáló-, diszpergáló- és nedvesítőképességű legyen, maga pedig vízben jól oldódjék. Ezek a tulajdonságok elősegítik a zsíros és olajos anyagok oldódását és eltávolítását. A tisztítószer továbbá ne legyen korrozív, veszélyes, költséges, gazdaságtalan. A hagyományos tisztítószerek egy része szervetlen vegyület, a lúgos nátrium-hidroxid karbonát- vagy foszfátsói, mint a szóda (Na2CO3) vagy a trisó (Na3PO4), továbbá nátrium-szilikát (pl. Csepel, Rábapon). Más részük szappan jellegű szerves vegyület (R-COONa) vagy zsíralkoholszulfonát (Ultra). A kereskedelemben egyre újabb, nagyobb hatékonyságú, jobban alkalmazható tisztítószerek jelennek meg; a 7.3. táblázat csak általánosságban nyújt áttekintést az élelmiszeriparban alkalmazható szerek típusairól és tulajdonságairól.
7.3. táblázat - Az élelmiszeriparban alkalmazott tisztítószerek fajtái és jellemzői Típus
Koncentráció Kémiai hatóanyag (%)
Hatékonyság
Tiszta víz
100
H2O; kevés oldott oldószer oxigén és ásványi anyag
Lúgok
1–10
NaOH, Na2CO3, Na3PO4
Korlátozó tényező kemény vízből kicsapódás; vizes felületen mikrobaszaporodás
detergens, vízlágyító korrozív, irritáló
223
Az élelmiszer-feldolgozás mikrobiológiája Ásványi savak
< 0,5
HCl, H3PO4
szervetlen csapadékot fémekre korrozív, irritáló old; pH < 2;
Szerves savak
0,1–2,0
ecet-,citrom-, borkősav stb.
vízkőoldó, antioxdáns
Anionos nedvesítőszerek
< 0,15
szappanok, szulfonátok
detergens, emulgeáló erős habzás
Nem ionos nedvesítőszerek
< 0,15
zsírsavéterek
detergens, emulgeáló savra érzékeny
1–5
polifoszfátok, EDTA
Ca-, Mg-, Fe-sókat oldatba visznek
Oldószerek
enyhén korrozív, jellegzetes íz, illat
oldatban, hőre nem stabil
A fertőtlenítőszereknek is számos követelményt kell kielégíteniük: széles mikrobiológiai hatásspektrum, jó oldhatóság, stabilitás, detergens hatás, de ne legyen toxikus, korrozív, szagos, drága. A sokféle rendelkezésre álló fertőtlenítőszer közül egy sem elégíti ki maradéktalanul az összes követelményt. Kémiai természetük és hatásmechanizmusok sokféle (7.4. táblázat).
7.4. táblázat - Néhány élelmiszer-ipari fertőtlenítőszer hatásmechanizmusa Fertőtlenítőszer
Hatás helye, módja
Formaldehid, hipoklorit
sejtfal
Hidrogén-peroxid, etilén-oxid, hipoklorit
sejtmembránszerkezet
Alkoholok, kvaterner tenzidek
sejtmembránpermeabilitás
Hidrogén-peroxid
riboszómák
Hipoklorit
nukleinsavak
Etilén-oxid, glutáraldehid, hipoklorit
enzimfehérjék
Aldehidek, kvaterner tenzidek
sejtek koagulációja
A kémiai szereken kívül nagyon eredményes fertőtlenítés érhető el forró vízzel vagy gőzzel, továbbá – bizonyos korlátok közt – UV sugárzással is (7.5. táblázat). Az általánosan használt fertőtlenítőszerek kémiailag a következő fő csoportokba sorolhatók: • klór és klórvegyületek, • jodofórok, 224
Az élelmiszer-feldolgozás mikrobiológiája • hidrogén-peroxid és perecetsav, • kvaterner ammóniumvegyületek, • amfoter vegyületek.
7.5. táblázat - Fertőtlenítő módszerek mikrobiológiai hatékonysága Mikrobacsoport
Gőz KlórvgyületJodofór
Kvaterner Amfoter vegy. vegy.
Gram-pozitív baktériumok (vegetatív Bacillus sejtek, Staphylococcus, tejsabaktériumok)
+++
++
++
++
++
Gram-negatív baktériumok (Salmonella,
+++
++
++
(+)
++
++
(+)
+
+
++
++
(+)
(+)
E. coli, aerob pszichrotrófok) Baktériumspórák
++
Bakteriofágok, vírusok
+++
(+) gyenge, + megfelelő, ++ jó, +++ igen jó Főbb tulajdonságaikat a 7.6. táblázat foglalja össze.
7.6. táblázat - Fertőtlenítőszerek tulajdonságainak összehasonlítása Tulajdonság
Klór
Jodofór
Kvaterner Amfoter
Perecetsav
Korrozív
igen
gyengén nem
gyengén
gyengén
Bőrirritáló
igen
nem
nem
gyengén
nem
pH hatáscsökkenés
>7
>7
nem
nem
>7
Szerves anyag hatáscsökkenés
igen
kissé
kissé
kissé
kissé
Vízkeménység hatáscsökkenés
nem
gyengén igen
gyengén
gyengén
225
Az élelmiszer-feldolgozás mikrobiológiája Oldatstabilitás
gyenge
gyenge
stabil
stabil
gyenge
Hőmérséklet
igen
erős
kissé
kissé
nem
Habzás
nem
nem
igen
igen
nem
Maximális koncentráció mg/ 200 l
25
200
100
100
Összeférhetetlen
lúg
anionos sav, lúg detergens
sav
fémion, redukálószer
A hagyományos fertőtlenítőszerek közül a klórvegyületeket ma is széles körben használják, mint a nátrium-hipoklorit (NaOCl), a klórmész, amely [Ca(OCl)2] és Ca(OH)2 keveréke; az előbbit edények, eszközök, az utóbbit inkább padozat, csatorna fertőtlenítésére; továbbá szerves klórvegyületek, klóraminok (pl. neomagnol). A klórgáz és a klór-dioxid használatához különleges eszközök szükségesek. A klórvegyületek erőteljesen reagálnak szerves anyagokkal, emiatt bizonyos hányaduk lekötődik, és antimikrobás hatást csak a szabad klór fejt ki. Ennek figyelembevételével a szabad klór koncentrációját általában 200 mg/l-re kell beállítani. A korrózióvédelem érdekében gyakran csak 50 mg/l koncentrációt alkalmaznak, hosszabb behatási idővel és magasabb (~25 °C) hőmérsékleten. 10 °C hőmérsékletcsökkenés megkétszerezi a behatási időt. A pH csökkentése fokozza a fertőtlenítő hatást, azonban 4-nél kisebb pH-nál mérgező klórgáz szabadul fel. A jodofórok szerves kötésben tartalmazzák a jódot mint hatóanyagot. A klórhoz hasonlóan csak a szabad jód hatékony; ennek minimális koncentrációja 25 mg/l legyen. Hátrányos, hogy használata a műanyag felületeket elszínezi. A hidrogén-peroxid és a perecetsav erőteljes oxidálószer; hatékonyságuk szerves anyagok jelenlétében, stabilitásuk oldatban csökken. A legáltalánosabban használt fertőtlenítőszerek a kvaterner amóniumvegyületek, amelyek kationos jellegűek, valamint az amfoter típusú tenzidek. Ezek erős fertőtlenítő hatásúak, egyúttal igen jó detergensek is (pl. nitrogenol, Bradophen), így előnyös tulajdonságuk, hogy egyfázisú, egyidejűleg tisztító- és fertőtlenítőszerek. A kvaterner ammóniumvegyületek anionos detergensekkel érintkezve kicsapódnak és inaktiválódnak. Fontos szempont, hogy egy fertőtlenítőszer huzamosabb alkalmazása rezisztenciát válthat ki az üzemi mikrobiota tagjai közt, és ezzel hatástalanná válik. Ezért célszerű a különböző hatóanyag-tartalmú fertőtlenítőszereket időnként váltani. A fertőtlenítés hatékonyságát mikrobiológiai módszerekkel ellenőrizni kell. A tenyésztéses mikrobiológiai vizsgálatok csak 24–48 óra után értékelhetők; a rendszeres időközökben végzett fertőtlenítés és ellenőrzés azonban huzamosabb idő alatt megbízható képet ad a higiéniai helyzetről. Az újabb gyors módszerek közül az ATPbiolumineszcenciás próba percek alatt valós időben is értékelhető eredményt szolgáltat (lásd a 10.4. fejezetet).
Biofilmek A fertőtlenítéssel kapcsolatban szükséges kitérni egy jellegzetes mikrobiológiai jelenségre, a biofilmek képződésére. A biofilmek a vízzel és más folyadékokkal érintkező szilárd anyagok felületén keletkező, vegyes összetételű mikrobabevonatok, olyan mikrobatársulások, amelynek tagjai közt bizonyos mértékű anyagcsere és genetikai kapcsolat is kialakul. A megtapadó mikrobasejteket az általuk kiválasztott exopoliszacharid nyálka tartja össze. Ilyen biofilmek alakulnak ki pl. 226
Az élelmiszer-feldolgozás mikrobiológiája leveleken, szennyvíz- és olajvezetékekben, hajók törzsén, fogakon és a szervezetbe beültetett anyagokon, a papír- és az élelmiszer-ipari berendezésekben. Létrejöttük és működésük lehet hasznos, pl. a biológiai ecetgyártásban, szennyvíztisztításban, viszont káros a gyógyászatban és az élelmiszeriparban, mivel védik a mikroorganizmusokat az antibiotikumok, illetve fertőtlenítőszerek hatásától. Az élelmiszer-ipari gépekben, csővezetékekben kialakuló biofilmekben kórokozók is megtapadhatnak, és a leszakadó darabok állandó szennyezési, fertőzési forrást képeznek. A biofilmek kialakulása napokig, hetekig tart, és a rendszeres tisztítás, fertőtlenítés ellenére is létrejönnek a rejtett, nehezen hozzáférhető szögletekben, hajlatokban. Eltávolításuk csak erőteljes detergensekkel és mechanikai úton lehetséges.
Hulladékkezelés, szennyvíztisztítás A hazai élelmiszeriparban évente több millió tonna hulladék keletkezik. Ennek túlnyomó része az állati és növényi nyersanyagok feldolgozása során képződik, de az üzemeltetés, karbantartás is sok szennyező anyagot termel, amelyek közt veszélyes hulladékok (pl. olaj és vegyszermaradékok) vannak. Az élelmiszeripari hulladékok zöme, mintegy 70–80%-a, fele-fele arányban csont-, bőr-, vérmaradványokból, illetve zöldség- és gyümölcstisztítási veszteségéből áll, vagyis nagyrészt olyan biológiai anyag, amely hasznosítható takarmányozásra, alkalmas trágyázásra vagy tovább feldolgozható (pl. csontból enyv, gyümölcshulladékból szesz készíthető). A takarmányozási célú hasznosításhoz bizonyos mértékű előkezelés lehet szükséges, pl. a növényi hulladékok nitrogéntartalmának növelése. A kórokozók ártalmatlanítása komposztálással többnyire megoldható. Az értéktelen hulladékot, fém-, papír-, üveghulladékot szeméttelepeken helyezik el. Az élelmiszer-ipari üzemek vízfelhasználása óriási. A mosásra, úsztatásra, az előkészítő műveletekhez használt víz 80–90%-a ivóvíz, amely szennyeződik, és csak kis része forgatható vissza. A szennyeződés mértéke általában nagymértékű, a kémiai oxigénigény átlagosan 1200–1600 mg/L, olykor lényegesen több. A szennyvízkezelés elsődleges feltétele az olyan csatornázás, amely elkülöníti a technológia során keletkező szennyvizet a kommunális és csapadékvíztől. Az utóbbiak nem hordanak különleges szennyeződést, és a városi, háztartási szennyvízhez hasonlóan kezelhetők, ami ma még sajnos többnyire kezelés nélküli vezetésüket jelenti a közcsatornába, élővízi befogadókba. A keletkező szennyvizek minősége, mennyisége nagymértékben függ a gyártott termékek fajtájától, mennyiségétől, a gyártási technológiáktól. Példaként néhány iparág jellemző adatait a 7.7. táblázat mutatja. A szennyezés a vágóhidak, a hús- és a tejipar esetében döntően zsír (kolloid) jellegű, míg a konzerv- és a söriparban főként oldott szerves anyagként van jelen. Az egyes ágazatokban a kibocsátott szennyvíz mennyisége az adott üzem termelési kapacitása szerint alakul (7.8. táblázat).
7.7. táblázat - Élelmiszer-ipari ágazatokban keletkező szennyvizek jellemzői Tulajdonság KOIkr BOI5 Összes lebegő a. Zsír-olaj tartalom pH
Mértéegység
Vágóhidak és húsipar
Tejipar
Konzervipar
Söripar
g/m3
2500–5000
3500–6000
4000–9000
2500–4500
3
1000–2400
1500–3000
2000–5000
1200–2300
3
1000–2000
400–600
1500–3500
300–800
3
200–600
200–550
50–150
20–50
6,5–8,5
5–10
5,5–10
4,5–12
g/m g/m g/m
227
Az élelmiszer-feldolgozás mikrobiológiája
7.8. táblázat - Élelmiszer-ipari üzemekben képződő szennyvíz mennyisége Kisüzem (m3/d)
Nagyüzem (m3/d)
Húsüzemek
20–40
700–900
Tejüzemek
60–90
1500–2000
Vágóhidak
200–400
5000–7000
20–50
4000–5000
Üzem
Söripar
A jelentős mértékű lebegő és oldott szerves szennyezést tartalmazó ipari szennyvizet mechanikailag, biológiailag és kémiailag, de legalább mechanikailag tisztítani kell. Ez a durva szennyeződés leválasztását jelenti ívszita, rács vagy ülepítő, homokszűrő alkalmazásával. A biológiai tisztítás egy vagy két lépésben mehet végbe, mikroorganizmusok tevékenysége révén. Az első lépés a szennyezések aerob lebontása levegőztető vagy csepegtetőtestes megoldással, a második szakasz az anaerob lebontás, az ún. eleveniszapos rendszerben. Ennek révén metángáz (biogáz) képződik, ami értékes energiaforrás. A teljes tisztítás a kórokozóktól való mentesítés érdekében lehet szükséges, pl. vágóhidak, baromfi-feldolgozók már mechanikailag, biológiailag tisztított szennyvízénél; a fertőtlenítés többnyire klórozással történik. A tisztított szennyvíz és a keletkező szennyvíziszap a mezőgazdaságban öntözésre, a talaj dúsítására használható. A hulladék, a szemét és a szennyvíz nem megfelelő kezelése levegőszennyezéssel, rothadó, bűzös, szagos anyagok képződésével is járhat, ami olykor az élelmiszeripari technológia velejárójaként is fellép (pl. hagymaszárítás, halfeldolgozás). Az élelmiszer-ipari üzemek környezetgazdálkodási tevékenysége egyre inkább előtérbe kerül.
Csomagolás, szállítás, raktározás A csomagolás, szállítás, tárolás, raktározás nagyon sok élelmiszer-feldolgozási technológia része és az élelmiszerlánc eleme. Végrehajtásukban az élelmiszer fajtája, jellege szerint, az élelmiszer-termelés, -feldolgozás, -forgalmazás, -értékesítés folyamatában elfoglalt helyük szerint sokféle, és különböző módok, lehetőségek érvényesülnek. Bizonyos sajátosságokra az egyes termékek mikrobiológiájának tárgyalásakor kitérünk, néhány általános higiéniai, élelmiszer-biztonsági szempontot pedig itt foglalunk össze.
Csomagolás Az élelmiszer-csomagolás általános célja a termék védelme a környezeti ártalmaktól, kedvezőtlen hatásoktól, és ezért az élelmiszer-tartósítási technológiák szerves része. A termékek megőrzésén és védelmén kívül a csomagolás elősegíti szállításukat, tárolásukat és forgalmazásukat. E tekintetben különbségek vannak a nagyobb mennyiségek gyűjtőcsomagolásában és a közvetlen értékesítést szolgáló egységek csomagolásában. Utóbbi esetben a csomagolás feladata tájékoztatást nyújtani a termék minőségi tulajdonságairól, fogyaszthatósági, minőségmegőrzési idejéről, felhasználhatóságáról, továbbá a gyártóról és az árról. Az eladhatóság, reklám szempontjai a tetszetős, kényelmes, a fogyasztói igényeket kiszolgáló csomagolásra irányulnak. Újabban előtérbe kerültek a környezetet kímélő szempontok is, a szemét- és hulladéknövelő, környezetszennyező terhelést fokozó műanyagok helyett a lebontható, újra feldolgozható csomagolóanyagok alkalmazása. 228
Az élelmiszer-feldolgozás mikrobiológiája Az élelmiszerrel érintkező csomagolóanyagra vonatkozó alapkövetelmény, hogy az nem tartalmazhat az egészségre káros anyagokat, amelyek az élelmiszerbe kerülhetnek. Az elterjedt polimer műanyagok közül pl. aggályos lehet a vinilklorid monomerekkel való szennyeződés. A szállításra szolgáló csomagolóanyagok közt a hagyományos faládák és rekeszek mellett az ellenálló és tartós műanyagból (főleg polietilénből) készült eszközök is széles körben elterjedtek mind a szállítás, mind a raktározás céljára. Ezek jól tisztíthatók forró vízzel, gőzzel. A papír-, karton- és hullámpapír dobozok kevésbé tartósak. A kereskedelmi egységek kiszerelésére a parafinbevonatú, vízhatlanított papírgöngyöleg és a formázott műanyag (pl. polisztirol) edényzet, tál, doboz, pohár egyaránt alkalmas, használatuk higiénikus. A csomagolás módját tekintve a kézi munka mellett egyre nagyobb mértékű a csomagolás gépesítése. A csomagolóvonalak a válogatást, osztályozást is elvégzik. A csomagológépek újfajta csomagolási módokat is lehetővé tesznek, pl. a műanyag fólia alatti, módosított légterű csomagolást (MAP). Ez nyers húsok, baromfik, szeletelt húskészítmények, gyümölcsök, zöldségek, hidegkonyhai termékek csomagolására egyaránt alkalmas. A fólia alatti légtér oxigéntartalmának csökkentésével (vákuummal, a lehegesztés előtt szén-dioxid vagy nitrogén befúvásával) és a csomag hűtőtárolásával gátolják a mikroorganizmusok szaporodását és növelik az eltarthatósági időt. Hasonló hatást érnek el a csomagba helyezett vagy a csomagolóanyagba kevert olyan anyagokkal, amelyek a légösszetételt módosítják (az oxigént, az etilént vagy a nedvességet megkötik, a szén-dioxidot, antioxidánst vagy bakteriosztatikumot bocsátanak ki). Az ilyen, ún. aktív csomagolás költségeit csak a különleges, értékes termékek viselik el.
Szállítás Az élelmiszereket a szállítás teljes útján, a be- és kirakodás során a szennyeződéstől meg kell védeni. Ennek érdekében a gépkocsik felépítménye a célnak megfelelően, a konténerek, raklapok elhelyezésére alkalmasan legyen kialakítva, a ládákat, rekeszeket úgy lehessen egymásra helyezni, hogy azok a bennük lévő terméket ne érintsék. A raktér teljesen zárt, de legalább ponyvával fedhető legyen. Romlandó termékek szállítására hűtőkocsikat kell használni, amelyekben a hőmérséklet 5–15 °C között, mélyhűtött termékeknél –15 °C-on tartható. Az alacsony hőmérsékletű termékeken szállításkor pára csapódik le, ami növeli a romlás veszélyét. A szállítási idő nem lépheti át a 6–9 órát, és a termék hőmérséklete nem növekedhet 2–3 °C-nál többel.
Tárolás, raktározás Tároláson rövidebb idejű, átmeneti, a feldolgozásig, tovább felhasználásig, eladásig tartó időszakot értünk, míg a raktározás hosszabb idejű, tartós tárolást jelent. Mikrobiológiai szempontból az időtényező mindig a mikrobaszaporodás lehetőségét rejti magában. A tárolás, raktározás a termékminőség más jellegű, biológiai, kémiai, fizikai romlásával is járhat. A betakarítást követően a zöldségek, gyümölcsök még élő növényi részek, szöveteikben, sejtjeikben utóérési, kényszerérési biokémiai folyamatok mennek végbe, amit az etilénképződés fokoz. A légzés következtében a keményítő és más tartalék tápanyagaik lebomlanak; a polifenoloxidáz enzimek barnulást okoznak, vízveszteség következtében hervadást, apadást szenvednek. Ezeket a folyamatokat szellőztetéssel, hűtéssel, a légtér összetételének és páratartalmának szabályozásával lehet befolyásolni. Nehéz olyan tárolási feltételeket teremteni, amelyek a termények különböző igényeihez alkalmazkodnak. Az uborka, paprika, zöldbab 7–10 °C-on, míg a káposzta, répa, hagyma 0 °C-on, 95%-os relatív páratartalomnál, jelentős veszteség nélkül tárolható egy-két hétig. A gyümölcsök általában kisebb, 85–92%-os páratartalmat igényelnek, 0–1 °C-on az alma hónapokig, a barack, szilva hetekig eltartható, míg a málna, szamóca csak néhány napig, a banán pedig két-három hétig 10–15 °C-on tárolható. 229
Az élelmiszer-feldolgozás mikrobiológiája Friss húsok csak hűtve, 5–7 °C-on, a belsőségek, vágási melléktermékek 3 °C-on tárolhatók. A fagyasztott hús tárolási hőmérséklete –18 °C.
Kereskedelem, vendéglátóipar, házi ételkészítés Az élelmezési lánc utolsó szakaszai, amelyek élelmiszer-higiéniai körülményei általában elmaradnak az ipari élelmiszer-feldolgozásétól, és még sok tennivaló marad javításukra. A hazai élelmiszer-biztonsági statisztikák is azt mutatják, hogy az élelmiszer eredetű megbetegedések 72%-ban a háztartásokban, 23%-ban a vendéglátásban és a közétkeztetésben következik be, és csak 5% tulajdonítható a feldolgozóiparnak. Az utóbbi évtizedekben jelentős változások mentek végbe az élelmiszer-kereskedelemben. Nagykereskedelmi vállalatok, hálózatok, üzletközpontok, „szuper- és hipermarketek” jöttek létre a kiskereskedések és piacok mellett. Az előbbiek élelmiszer-higiéniai és biztonsági helyzete többnyire kielégítő, követik az élelmiszerforgalmazás általános irányelveit, és sokuknak saját élelmiszer-biztonsági (HACCP) rendszere van. A kereskedelmi egységekben a beszállítás, az áruátvétel, a raktározás, az üzlettéri tárolás, a hagyományos és az önkiszolgáló értékesítés tevékenységét pontos előírások szabályozzák a forgalmazás folyamata szerint (7.3. ábra). Ahol további bontás, szeletelés, előkészítés, csomagolás folyik, azt az élelmiszer-feldolgozásra vonatkozó szabályok szerint kell végezni. Ezeknek az előírásoknak a betartása a kiskereskedelemben és a piacokon már távolról sem kielégítő.
7.3. ábra - Az élelmiszer-forgalmazás általános folyamatábrája
Néhány alapvető higiéniai szabály követése jelentősen fokozza az élelmiszer-forgalmazás biztonságát. Ezek közé tartozik, hogy a szennyeződés elkerülésére a közvetlen fogyasztásra szánt élelmiszereket el kell különíteni a nyersanyagoktól. Mikrobiológiai veszélyforrások a nyers húsok, különösen a baromfi, és a zöldségek. 230
Az élelmiszer-feldolgozás mikrobiológiája Lényeges a hűtést igénylő termékek folyamatos hűtőtárolása az előírt hőmérsékleteken. Húskészítményeknél, tejtermékeknél, hidegkonyhai készítményeknél ez általában 5–7 oC, gyorsfagyasztott termékeknél (külön hűtőpultban) legalább –18 oC. A kiszolgáláshoz használt eszközök (vágódeszkák, kések stb.) és edényzet tisztításáról és fertőtlenítéséről, a személyi higiéniáról, az üzlet tisztántartásáról az általános higiéniai szabályok szerint kell gondoskodni. Egyes élelmiszer-, húsés hentesáruboltokban, piaci és utcai büfékben ételkészítés is folyik (főtt kolbász, grillcsirke); ezeknél a sütés-főzés és tárolás külön szabályait kell betartani; a megmaradt ételt másnap nem szabad értékesíteni. A közétkeztetés mind a vendéglátóiparban, mind a munkahelyeken, üzemekben, iskolákban nagymértékben visszaesett. Az élelmezési üzemekben, éttermekben az ételkészítésnek meghatározott technológiája van az áruátvételtől az elkészítésig, a tálalástól a mosogatásig (7.4. ábra), amire részletes utasítások és higiéniai előírások vonatkoznak. Ezek áthágása tömeges megbetegedéseket okozhat, erre kirívó példa volt az 1996-ban előfordult, ötezer emberre kiterjedő, eperleves okozta szalmonellás fertőzés.
7.4. ábra - Élelmezési üzem technológiai folyamatábrája
Az ételkészítés alapvető szabályait leggyakrabban a háztartásokban sértik meg, noha csak öt aranyszabály betartása nagymértékben fokozná az ételek biztonságát (7.9. táblázat): a friss, romlásmentes nyersanyag gondos tisztítása, mosása, a húsok, zöldségek elkülönített kezelése más alapanyagoktól, az eszközök és a kéz tisztántartása, alapos sütés, főzés, a kész étel hűtött tárolása azok az alapvető rendszabályok, amelyeket mindenkinek ismernie és követnie kell.
7.9. táblázat - A biztonságos ételkészítés öt aranyszabálya 1.
Kifogástalan alapanyag, tiszta ivóvíz Csak friss, egészséges nyersanyagokból készülhet jó étel. A nyersanyagot tiszta vízzel, alaposan meg kell mosni. A zöldségek tisztításához mást eszközöket kell használni, mint a húshoz.
2.
Tiszta konyha, tiszta kéz Gyakran mossunk kezet! Az edényeket, késeket, más eszközöket alaposan mossuk el, öblítsük le. Használjunk hatásos tisztító-fertőtlenítő szereket a konyhai felületek tisztántartásához. A hulladékokat fedett tárolóba gyűjtsük.
3.
Nyersanyagok és kész ételek elkülönítése 231
Az élelmiszer-feldolgozás mikrobiológiája A húsokat, különösen a baromfit más élelmiszerektől, főleg a nyersen fogyasztott zöldségektől, gyümölcsöktől elkülönítve kell tárolni, feldolgozni, elkészíteni. Az edények, eszközök keresztfertőzést okozhatnak! 4.
Alapos sütés, főzés A forralás, teljes átsütés, főzés nélkülözhetetlen a biztonsághoz. Az étel teljes mennyisége, minden részének hőmérséklete huzamosan legalább 75 °C legyen. A maradék ételt nem elegendő csak langyosra felmelegíteni.
5.
Hűtött tárolás Az elkészült étel szobahőmérsékleten nem tárolható, azt minél előbb le kell hűteni és 5 °C-os hűtőszekrényben tárolni, a nyersanyagoktól elkülönítve. A fagyasztott termékeket a hűtőszekrény fagyasztó rekeszében kell elhelyezni. Kész étel hűtve sem tárolható két-három napnál tovább; alapos felmelegítés után ellenőrizni kell a szagát, ízét, állagát!
A háztartásokba kerülő élelmiszerek legveszélyesebb fertőzési forrásai a nyers húsok, a mosatlan zöldségek, a tojás, az ételkészítésnél pedig a keresztszennyeződés. A sütés-főzés nagy biztonsággal elpusztítja a kórokozók többségét, ha a hőmérséklet az étel minden részletében legalább 75 °C-ot ér el. A maradék étel tárolásához a háztartási hűtőszekrényben legalább 5 °C-ot kell beállítani, és legfeljebb két-három napig tárolni, fogyasztás előtt pedig az ételt ismételten alaposan át kell forrósítani. A mosogatáshoz korszerű tisztító- és fertőtlenítőszereket kell használni. Ezeket az alapismereteket egy egyetemi tankönyvben sem árt ismételni, helyük azonban már az alap- és középszintű oktatásban van annak érdekében, hogy az élelmiszer-biztonsági és higiéniai ismeretek széles körűvé váljanak.
232
8. fejezet - Termékek mikrobiológiája, romlása Az élelmiszer fogalmát a 2003. évi LXXXII. törvény úgy határozza meg, hogy élelmiszer minden emberi fogyasztásra szánt nyers vagy feldolgozott termék, a takarmányt, a dohányt, a gyógyszert és a kozmetikumot kivéve. A nagyon általános meghatározást a törvény az élelmiszer-biztonság szempontjából korlátozza: az élelmiszer a termelés, előállítás, tárolás, forgalmazás teljes folyamatában nem veszélyeztetheti a fogyasztó egészségét, amennyiben azt a rendeltetésének megfelelően készíti és fogyasztja el. Az élelmiszer-ipari termékek fajtái, típusai és választéka rendkívül nagy. Becslés szerint Magyarországon mintegy 40 000 féle élelmiszert forgalmaznak, még a viszonylag egyöntetű kenyérfélékből is legalább 200 féle, a péksüteményekből kétszer annyiféle létezik. A termékek főbb csoportjait a meghatározó összetevő (pl. állati vagy növényi eredetű), a gyártási mód (pl. konzervek, gyorsfagyasztott termékek) vagy a felhasználási mód (pl. készétel, nyersanyag) szerint lehet meghatározni. A Magyar Élelmiszerkönyv szerinti termékcsoportokat a 8.1. táblázat mutatja be.
8.1. táblázat - Az élelmiszerek főbb termékcsoportjai Hús és húskészítmények (hal, baromfi, tojás is) Tej és tejtermékek Gyümölcs- és zöldségfélék Malomipari termékek Sütőipari termékek (száraztészták is) Cukor- és édesipari termékek Tartósított termékek Gyorsfagyasztott termékek Zsiradékok, olajok Kávé, tea Ízesítők, fűszerek Palackozott italok (bor, sör, szesz, üdítő) Nyilvánvaló, hogy a mikrobiológiai tulajdonságokat (biztonság, minőség, tartósság, romlás) a termékek gyártásának technológiai, műveleti, műszaki körülményei, fizikai, kémiai tulajdonságai, csomagolása, tárolása döntően meghatározzák és befolyásolják; ezek ismerete nélkülözhetetlen a mikrobiológiai tulajdonságok megítéléséhez. A gyártástechnológia és a termékismertetés részleteit csak annyiban érintjük, amennyiben a mikrobiológiai vonatkozások azt elengedhetetlenné teszik.
233
Termékek mikrobiológiája, romlása
Húsféleségek mikrobiotája és romlása Az állati szervezet vázizomzatának különböző részeit, amelyek emberi fogyasztásra alkalmasak, összefoglalóan húsnak nevezzük. A hús többnyire melegvérű, tenyésztett háziállatokból, kisebb részben vadon élő állatokból származik, azonban tág értelemben a húsféleségekhez számíthatók az állati test belső szervei, bőre, vére is, továbbá a hidegvérű állatok (halak, kagylók, rákok stb.) fogyasztható részei is. A színhús izomszövet, amelynek összetételében jelentős arányban szerepelnek a fehérjék, tartalmaz továbbá szénhidrátokat, zsírokat, vitaminokat és ásványi anyagokat, 74–80%-ban pedig kötött és szabad vizet (az utóbbi 0,99 vízaktivitásnak felel meg). A hússzövet a baktériumok és egyéb mikroorganizmusok ideális tápközege, számos tápanyagot (pl. glikogén, peptidek, aminosavak, fémionok, oldott foszfor) tartalmaz, ami kedvező a mikrobák szaporodásához. A hús ennek következtében gyorsan romlik, hacsak nem szorítjuk vissza a mikrobák szaporodását valamilyen feldolgozási és tartósítási módszerrel. A húson előforduló mikroorganizmusok nemcsak romlást okozhatnak, hanem a fogyasztó egészségét is veszélyeztethetik. Ezek a mikroorganizmusok az előállítás, feldolgozás és a forgalmazás teljes láncolatában szennyezhetik, vagy fertőzhetik a húst, az állat tenyésztésétől, a takarmányozásától kezdve a levágáson és az elsődleges feldolgozáson át a nyers hús és a feldolgozott hústermék készítésének különböző műveletei folyamán, egészen a fogyasztó asztaláig. Az elsődleges feldolgozás mikrobiológiai szempontjait a 7.3. fejezetben áttekintettük. A következőkben a húsfeldolgozás további folyamatával foglalkozunk, különös figyelemmel a szerteágazó gyártástechnológia mikrobiológiai vonatkozásaira.
A hús érése Az állatok levágása (a vad elejtése) után az izomszövetben még folytatódnak a biokémiai folyamatok, amelyek következtében a hús tulajdonságai átalakulnak; kedvező esetben a változások a feldolgozhatóság és a tápérték előnyére szolgálnak. Ezeket a folyamatokat a hús érésének nevezzük, és lényegében a hullamerevség (rigor mortis) kialakulásával, majd megszűnésével kapcsolatosak. Az elhalt állatban megszűnik a vérkeringés, ezáltal az izomszövet oxigénellátása, azonban a glikogén (a hús tartalék szénhidrátja) lebontása anaerob módon tovább folyik. Ennek két következménye lesz: egyrészt az anaerob glikolizis végtermékeként tejsav képződik, ami a pH csökkenését okozza, másrészt azonban ez a folyamat nem képes elegendő ATP-t termelni, és az a kreatinfoszfátból sem képződik, az utóbbi készletének elfogyása után. A csökkent ATP-szint nem elegendő az aktin és miozin kapcsolat bontására, az izomrostok nem tudnak elernyedni, bekövetkezik a hullamerevség. Bizonyos idő (általában 24 óra) eltelte után, a fehérjebontó enzimek működése következtében, az izomfehérjék merevsége feloldódik, és kialakulnak az érett húsnak azok a tulajdonságai (állag, szín, duzzadó- és vízmegkötő képesség), amelyek a feldolgozás szempontjából előnyösek. Az érési folyamat, különösen a pH alakulása, befolyásolja továbbá a hús hajlamát a romlásra.
A hús romlása A vágóhídra szállítás, felhajtás következtében túlzott stressznek kitett állatok izmainak glikogénkészlete jelentős mértékben csökken. A csökkent glikogénszint miatt kevesebb tejsav képződik. Ezáltal a hús pH-ja a normálisan érett húséhoz (pH 5,5–5,8) képest nagyobb lesz (pH > 6). A hajszolt állatban kevesebb oxigén jut az izmokba, ezért kisebb lesz az oximioglobin mennyisége, a hús sötétebb színű lesz. Az ilyen minőségű húsokat DFD (dark, firm, dry – sötét, tömött, száraz) húsnak nevezik. Ez a jelenség leggyakrabban marhahúsnál, esetenként sertéshúsnál figyelhető meg. Romlásuk sokkal gyorsabb, mint a normál húsé. Egy másik 234
Termékek mikrobiológiája, romlása rendellenes érési folyamat viszont gyors glikolízissel és ATP-lebomlással jár, a pH a normálisnál jóval kisebbre csökken (közel pH 5-ig). Ha nagy mennyiségű glikogén gyorsan, még a hús kihűlése előtt tejsavvá alakul, az denaturálja az izomrost (szarkoplazma) fehérjéit, a hús világosabb színű marad és vizet veszít. Az ilyen hús halvány, puha, vizenyős (pale, soft, exudative, ún. PSE) lesz. Bár a kis pH bizonyos mértékig gátolja, a nedves felület elősegíti a romlást. Míg az izomszövetben végbemenő enzimes folyamatok elsődlegesen a hús érés alatti változásaihoz járulnak hozzá, és technológiai minőségét határozzák meg, addig az érzékszervileg észlelhető romlás általában mikrobás tevékenység eredménye. Ez jelenthet szín- vagy állományváltozást, mellékszag kialakulását, nyálkaképződést a termék felületén, vagy bármely olyan változást, ami fogyaszthatatlanná teszi a terméket. A romlás jellege a mikrobiota összetételétől, a hús fajtájától, valamint a feldolgozási és tárolási körülményektől függően eltérő lehet. Az egészséges állatok hússzövetének belseje sterilnek tekinthető. A romlási folyamat első lépéseként a mikrobák a felületen telepednek meg, azt kolonizálják. A hús felszínéhez kapcsolódás két lépésből áll. Kezdetben laza, gyenge kölcsönhatásokkal, reverzíbilis kapcsolódás jön létre, ami a továbbiakban irreverzíbilissé válik, amint a baktériumok extracelluláris poliszacharid réteget (EPS vagy glikokalix) képeznek. Más baktériumokkal összehasonlítva a Pseudomonasok igen gyorsan képesek a hús felületéhez tapadni. A hús kezdeti mikrobaszáma és a romlásig eltelt idő között szoros kapcsolat van. A húsok romlását okozó mikrobák képesek proteolitikus és lipolitikus enzimek termelésére. A romlási folyamat során 107 sejt/g sejtszám felett kellemetlen, romlásra utaló szagok jelennek meg. 108 sejt/g sejtszámnál a hús felszíne ragadós, tapadós lesz, nyálkaképződés indul meg. Proteolízis csak 108 nagyobb sejt/g számnál következik be (8.1. ábra). A bakteriális lipázok hozzájárulnak a hús avasodásához. A tárolási időn kívül a tárolás hőmérséklete is döntő befolyást gyakorol a húsok mikrobaszámára (8.2. ábra).
235
Termékek mikrobiológiája, romlása
8.1. ábra - A sertéshús kezdeti sejtszámának hatása az eltarthatóságra 4 °C-on
236
Termékek mikrobiológiája, romlása
8.2. ábra - A sertéshús mikrobaszámának változása a tárolási hőmérséklet függvényében
Az elsődleges húsfeldolgozás mikrobiológiája A húsfeldolgozás elsődleges technológiai lépéseit és mikrobiológiai vonatkozásait a 7.3. fejezetben már ismertettük. Itt néhány további részletre térünk ki. A húst szennyező mikroorganizmusok elsődleges forrásai az állati test kültakarója és béltraktusa; mindkettőn nagyszámú baktérium található. A kültakarón főként Staphylococcus, Micrococcus, Pseudomonas nemzetségekkel, élesztő- és penészgombákkal találkozhatunk, amelyek a bőr normál biotájának tagjai, ezekhez fekáliás és talaj eredetű mikroorganizmusok járulnak. A bőr alatti hús felszíne kezdetben mikrobamentes, de a bőrfejtés során szennyeződik a bőrfelületen található mikroorganizmusokkal. A pörkölés jelentős mértékben csökkentheti a felületi mikrobaszámot, de a mélyebb, nem elegendő mértékben megperzselt bőrfelületen a mikrobák túlélhetnek. Másik jelentős szennyezési forrás a zsigerelési folyamat. További szennyeződés eredhet a vágóhíd és a feldolgozó üzemi környezetből (levegő, falak, padozat), különösen a feldolgozó eszközökről, késekről, edényekről, valamint a dolgozók kezéről, ruházatáról. A feldolgozott hústermékek adalékai (pl. só, fűszerek, pácsók stb.) minősége is nagymértékben befolyásolja a mikrobiológiai állapotot. Az enterális eredetű mikrobák száma általában nagyobb a sertéshúson, mint a marhahúson, nyilvánvalóan azért, mert az utóbbiról a bőrt nem távolítják el. A higiénikusan előkészített húsban a patogén mikrobák száma nagyon alacsony, a mikrobiota zöme szaprobionta fajokból áll. A legnagyobb számban a Gram237
Termékek mikrobiológiája, romlása negatív pálcák és a Gram-pozitív kokkuszok fordulnak elő. Az előbbiek között Acinetobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Flavobacterium, Moraxella nemzetségek, pszeudomonászok, valamint enterobaktériumok találhatók, az utóbbiak főként Micrococcus és Staphylococcus fajok. A tejsavbaktériumok, a Brochothrix thermosphacta, a korinebaktériumok és a különböző Bacillus fajok száma kezdetben kicsi. Mellettük élesztő- és penészgombák is előfordulnak. Az élesztőgombák közül a Candida és Rhodotorula nemzetség, a penészgombák közül a Penicillium, Mucor és Cladosporium nemzetség jelenlétével számolhatunk. A húsok mikrobiotájának patogén baktériumok is részesei lehetnek (Sa. enterica, Ye. enterocolitica, Li. monocytogenes, E. coli patogén törzsei, B. cereus, Cb. jejuni, Cl. botulinum, Sta. aureus). Enterális vírusok szintén jelen lehetnek. A Cl. perfingens, Sa. enterica, Sta. aureus és az enteropatogén E. coli jelenléte enterális szennyeződéssel függ össze. Az, hogy a kezdeti mikrobiotából mi válik dominánssá, a későbbi feldolgozástól, tárolástól függ. A hús redox tulajdonságai nagymértékben befolyásolják a mikrobák szaporodását. A hús redox potenciálja élő állapotban még nagy, a vágás során, elvéreztetés után jelentősen csökken. A hús belsejében anaerob körülmények alakulnak ki a 10 mm-nél vastagabb húsrészek esetében. Következésképpen a húsok felületén aerob, belsejükben anaerob és fakultatív anaerob mikrobák tudnak szaporodni. Daráláskor ugyan sok oxigén keveredik a masszába, de a csomagolást követően fokozatosan visszaállnak az anaerob körülmények. Ha a húst, levegőt kizáró csomagolásban tárolják, Brochothrix thermosphacta és tejsavbaktériumok válnak uralkodóvá. A vákuum-, vagy módosított atmoszférás csomagolású DFD húsok romlása gyorsabb, jellegzetes zöld elszíneződést látunk. A zöld szín kialakításáért a Serratia liquefaciens és a Schewanella putrefaciens felelősek. A DFD hús magasabb pH-ja lehetővé teszi e romlást okozók elszaporodását, a tejsavbaktériumokkal való sikeres versengését. A Schewanella putrefaciens elbontja a ciszteint és a glutationt H2S képezése közben, ami a hús mioglobinjával zöld színű szulfomioglobint képez.
Tartósítási eljárások a húsiparban A húsok és húskészítmények tartósítására az élelmiszeriparban általában szokásos eljárások csak bizonyos megszorításokkal alkalmazhatók, ugyanakkor néhány jellegzetes tartósítási mód (sózás, pácolás, füstölés), a húsiparban kitüntetett szerepet játszik. Az erőteljes hőkezelés, sterilezés a húsfehérjék koagulálódását okozza és jelentős érzékszervi változásokkal jár, ezért nyers húsok tartósítására nyilvánvalóan nem alkalmas; erre a célra a hűtés, fagyasztás kiválóan megfelel, gyakran speciális csomagolási móddal összekötve. A darabolt húsok mikrobaszám csökkentésére több eljárást is kidolgoztak, pl. hideg vagy meleg vízzel, nagynyomású vízzel történő permetezést. A melegvizes kezelés a mikrobaeltávolításon túl mikrobainaktiválást is okoz. Emellett antimikrobás kezeléseket is alkalmaznak, pl. klórral vagy gyenge szerves savakkal. A baromfiiparban korábban 40–60 µg/ml klórtartalmú vízzel permeteztek. Tejsavas, ecetsavas, propionsavas, citromsavas kezeléseket is alkalmaznak, közülük a tejsavas és az ecetsavas a leggyakoribb. A kén-dioxidos kezelés ma már sok országban tilos, mert a SO2 megőrzi a hús színét annak romlása után is, ami a fogyasztók becsapására ad lehetőséget. A hűtés az egyik leggyakoribb módja a húsromlások megakadályozásának. A hűtési hőmérséklet befolyásolja az adott körülmények között szaporodni képes mikroorganizmusok típusát. A szobahőmérsékleten tárolt húsok romlását mezofil baktériumok, főként Cl. perfringens és enterobaktériumok okozzák. Hűtés hatására a kezdeti mezofil baktériumpopuláció gátlódik és pszichrotróf, pszichrofil baktériumok kerülnek előtérbe. Aerob körülmények között Pseudomonas, Alcaligenes, Acinetobacter, Moraxella és Aeromonas fajok dominálnak. A hűtött húsok romlását aerob tárolási körülmények között 20 °C alatt leginkább a Pseudomonasok okozzák (8.3. ábra). Anaerob körülmények között viszont 20 °C alatt a tejsavbaktériumok a romlás fő tényezői. Ha a hús felülete gyorsan kiszárad, penészes romlás következhet be (8.4. ábra). A Thamnidium, Mucor, Rhizopus laza hífatömege szőrszerű megjelenést okoz a marhahúsok felületén. A Cladosporium fajok 238
Termékek mikrobiológiája, romlása fekete foltokként, a Penicilliumok többnyire zöldeskék foltokként, a Sporotrichum és Crysosporium fajok fehér foltokként jelenhetnek meg a hús felszínén. Nagy nedvességtartalmú térben tárolt húsok romlása elsősorban bakteriális romlás. A legtöbb romlást okozó baktérium bontja a glükózt. Amikor a glükóz a hús felső rétegeiben elfogy, a hús alsóbb rétegeiből kell a felszínre diffundálnia. A glükózdiffúzió gyengülésével a mikrobák laktátot és aminosavakat kezdenek el bontani. A bontás eredményeképpen kellemetlen szagú anyagok, NH3, H2S, indol, szkatol és aminok keletkeznek. Ezek okozzák a termék megváltozott érzékszervi tulajdonságait (nem megfelelő íz, szag, szín).
8.3. ábra - A hús mikrobiotájának összetétele hűtött, levegős tároláskor
239
Termékek mikrobiológiája, romlása
8.4. ábra - A hús mikrobiotájának összetétele vákuumcsomagolt, hűtött húson
Fagyasztás során a kezdeti mikrobiota egy része, fagyasztva tárolás során még jelentősebb része elpusztul, de a folyamat lassú. A megfelelően fagyasztott hús mikrobásan nem romlik meg. –5 és –10 °C közötti tárolás lehetővé teszi bizonyos élesztőgombák (Leucosporidium scottii) és penészgombák (Cladosporium herbarum, Penicillium fajok) növekedését, amelyek kis foltokat alkotnak a felületen. Habár a mikrobák fokozatosan kihalnak fagyasztási hőmérsékleten, enzimjeik (lipázok, lipoxidázok) rezisztensek és aktívak maradnak –30 °C-ig. A fagyasztott húsok általában felengedtetés után kezdenek romlani. A módosított atmoszférás csomagolást is elterjedten alkalmazzák a húsfélék tartósítására. Vákuumcsomagolt termékeknél a csomagoláson belül maradó O2 előbb-utóbb elfogy a szöveti légzés miatt, és helyét CO2 tölti ki. Így a Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella populációt a Brochothrix thermosphacta és enterobaktériumok váltják fel. A Brochothrix thermosphacta sokkal gyorsabb romlást okoz, mint a tejsavbaktériumok. Aprított húsok felszínén a PseudomonasAcinetobacter-Moraxella asszociáció jellemző, míg belsejükben, az anaerob viszonyok miatt, a tejsavbaktériumok dominánsak. A pácolás a húskészítmények előállításának jellegzetes művelete. Lényege, hogy a késztermék érzékszervi tulajdonságait és tartósságát konyhasó, kálium-nitrát és/vagy nátrium-nitrit bevitelével érik el. Néhány hagyományos termék (pl. parasztsonka, szalonna) egyszerű száraz sózással készül, a készítmények többségéhez páclevet használnak, amit különböző módszerrel juttatnak a termék belsejébe. Egyszerűen páclével fedve a termék érettsége hetek vagy még hosszabb idő alatt alakul ki. Gyorspácolásnál a páclét befecskendezéssel, ütögetéssel („tumblerezéssel”) vagy más módon juttatják be. A pácolás célja a hústermék színének, ízének, állagának kialakítása, továbbá a tartósítás, a mikroorganizmusok szaporodásának gátlása a pácérett termékben. Mégsem ellentmondás, hogy a pácolás alatt mikrobiológiai folyamatok mennek végbe és hasznosulnak. A páclé nitrittartalma döntő tényező a kórokozó mikroorganizmusok, különösen a Cl. botulinum gátlása céljából, azonban a nitrit koncentrációját kis értéken (<0,2%) kell tartani, mivel rákkeltő hatású nitrozaminok képződhetnek belőle. A nitritet helyettesítő nitrátot a páclé mikroorganizmusai bontják le, elsősorban a sótűrő mikrokokkuszok, vibriók, tejsavbaktériumok. A nitritkoncentráció 240
Termékek mikrobiológiája, romlása szabályozása ebben az esetben bizonytalan. Előfordulhat, hogy túl sok nitrit keletkezik, amely tejsav jelenlétében a hús vörös színét adó mioglobint zöld színű oximioglobinná oxidálja. A zöldülés egy másik formáját olyan tejsavbaktériumok idézik elő (pl. Weisella viridescens), amelyek a termék felszínén, aerob körülmények között, hidrogén-peroxidot képeznek, ez kataláz enzim hiányában nem bomlik el, hanem a húspigmenttel reagál. Jellegzetes húsipari technológiai művelet a füstölés is, amelynek célja nem annyira a tartósítás, mint inkább a szín és íz kialakítása. Ezért a füstölésre használt fa fajtája lényeges az illóanyagok (fenolok, karbonilok, aldehidek stb.) képződése szempontjából, valamint az, hogy a füst előállítása céljából az égés ne menjen tökéletesen végbe, és a füst hőmérséklete ne legyen túl nagy. A melegfüstölés 60–70 °C-on, a forró 75–85 °C-on történik, alkalmaznak azonban hidegfüstölést is (< 20 °C), nyers sonka, kolbász, szalonna készítésénél, a zsírkiválás elkerülésére. A hőkezelés célja a mikrobák elpusztításán kívül a szín-, íz-, és állagkialakítás, és mértéke szerint lehet egyszerű főzés, gőzölés, pasztőrözés vagy sterilezés. A főzéssel és gőzöléssel a termékben csak 70–80 °C maghőmérséklet alakul ki (kenősáruknál még kisebb), ami a vegetatív mikrobasejtek többségét elpusztítja, a húsfehérjéket koagulálja, és nitrit jelenlétében a hús piros színét megőrzi (a mioglobin nitrozomioglobinná alakul). Pasztőrözés után a mikroorganizmusok egy része életben marad, ezért az ilyen termékeket hűtve kell tárolni. A hőkezelést túlélő mikrobiotát Bacillus és Clostridium fajok alkotják, amelyek gyakran az adalékanyagból, fűszerekből származnak. Néhány tejsavbaktérium és enterokokkusz is túlélheti a pasztőrözést. A hőkezelés után oxigént át nem eresztő csomagolást kapott termékekben tejsavbaktériumokat vagy Brochothrix thermosphactát találunk. A patogének közül a Sta. aureusnak lehet szerepe, ami ugyan ritkán éli túl a hőkezelést, de gyakori szennyeződés a dolgozók kezéről. Az ún. ¾ konzervek körébe tartozó termékek hőkezelését a Bacillus és Clostridium spórák túlélhetik. Nem megfelelő hőkezelés és/vagy a pácsók kis koncentrációja miatt romlást okozhatnak a mezofil spórás baktériumok is. A romlás jele a konzerv puffadása a hőkezelést túlélő, gázképző Clostridiumok miatt. A teljes konzerveknek számító húskészítmények közé tartoznak olyan termékek, amelyek kis só- és nitrittartalma csak minimális hatással van a mikrobák növekedésére, ezek lehetnek továbbá csak sóval pácoltak. Mindkét csoport olyan mértékű hőkezelést kap, ami a Cl. botulinum spóráit elpusztítja és a leghőrezisztensebb anaerobokat inaktiválja. Ezek a húskonzervek jól tárolhatók 25–35 °C-on. Különlegesen erős hőkezelést kapnak a trópusi területen forgalmazásra szánt termékek. Az ezekben előforduló és túlélő hőrezisztens és termofil jellegű spóráknak a készítmény 40 °C körüli tárolása esetén sem szabad kicsírázniuk.
Húskészítmények mikrobiológiája A húskészítmények termékcsoportja rendkívül változatos, mind összetételét és technológiáját, következéskép mikrobiológiai tulajdonságait tekintve. A készítmények többsége aprítás, pépesítés után, bélbe vagy fóliába töltve, füstölve, pácolva, érlelve (fermentálva), vagy főzéssel készül, egy részük nagyobb darabos termék, nyersen sózott vagy pácolt, formázott vagy dobozolt, előzetesen vagy utólag hőkezelt készítmény. A készítmények többségének tartósítása érdekében mikrobapusztító vagy szaporodást gátló műveleteket alkalmaznak, ritkábban a mikrobák (elsősorban tejsavbaktériumok) erjesztő tevékenységét hasznosítják a tartósítás elősegítésére.
Vörösáruk és felvágottak Ezeket a termékeket finomra aprított húspépből készítik (pl. párizsi, virsli, krinolin), amelyhez a felvágott-féléknél darabos alkotókat is adnak (pl. zalai, olasz, soproni). A bélbe töltött pépet forrón füstölik, hőkezelik 70 °C maghőmérsékletig, majd 6 °C alá hűtik. Ha a felhasznált alapanyagok, segédanyagok és fűszerek 241
Termékek mikrobiológiája, romlása mikrobiológiai minősége, továbbá a technológia megfelelő volt, e termékek az előírt minőségmegőrzési időn belül romlás nélkül eltarthatók. A romlás leggyakoribb oka a nem megfelelő hűtőtárolás, ami a bélbe töltött termékeken felületi nyálkásodást okoz.
Pácolt termékek A nyers pácolt húsok sótartalma bakteriosztatikus hatású. Egyes fajokat már 2,5% só is gátol, a sótűrő baktériumok között találhatunk mikrokokkuszokat, flavobaktériumokat és tejsavbaktériumokat. A pácolt termékekben a patogén mikrobákat a só, nitrit, pH és az alacsony hőmérséklet kombinációja gátolja. A nitritet (és olykor a nitrátot) a szín- és ízkialakítás, valamint a mikrobiológiai stabilitás érdekében használják. A nitrit specifikusan gátolja a Cl. botulinum spóráinak kicsírázását. A nitrit bakteriosztatikus hatása függ a hús pH-jától. A nitrit pH 5 körüli értéken gátolja a Pseudomonas-Acinetobacter-Moraxella asszociációt, a flavobaktériumokat, az enterobaktériumokat és a mikrokokkuszokat. A pácolt húsokban, hűtött körülmények között, anaerob rothasztó mikroorganizmusok nem szaporodnak el, az NH3 és egyéb anyagcsere-termékek képződése 0,96-os aw-nál gátlódik. Meleg környezetben a rothasztó anaerobok és enterobaktériumok szaporodását csak jóval kisebb, 0,92-es aw gátolja. Ez a vízaktivitás-érték határvonal a pácolt termékek között. A kis vízaktivitású termékek csoportjában az egyedüli mikrobás veszélyt a Sta. aureus okozza, ami 0,86-os vízaktivitás-értékig képes szaporodni, de enterotoxint már nem képez. Szárított, pácolt, sonkatermékek romlását klosztridiumok okozhatják a csont közelében. Háztartásban készített pácolt sonka fogyasztását követően több országban is előfordultak botulizmus esetek. A nagyobb vízaktivitású pácolt termékek közé a szalonnafélék valamint a félszáraz vagy nem fermentált kolbászok tartoznak. A pácolt termékek kezdeti mikrobiotáját Gram-negatív baktériumok alkotják, amit a pácolás és fermentáció során kifejlődő Gram-pozitív baktériumok, Micrococcus, Lactobacillus, Pediococcus fajok és a Brochothrix thermosphacta váltanak fel. A szalonna és sonka feldolgozására használt pácsó nitritet tartalmaz, amit befecskendeznek a termékbe. Így a diffúzió sokkal gyorsabb és a pácolási idő rövidebb. Ezeket a termékeket gyakran szeletelik és vákuumcsomagolják. A szalonna és sonka jellegzetes mikrobiotája Micrococcusokat, koaguláz negatív sztafilokokkuszokat tartalmaz, Gram-negatív pálcákkal és laktobacilluszokkal. A kolbász, szalonna és hasonló termékek romlása három típusba sorolható: nyálkásodás, savanyodás és zöldülés. A felületet bevonó nyálkarétegből élesztőgombákat, Lactobacillus, Enterococcus, Weissela nemzetség fajait és Brochothrix thermosphactát izoláltak. A Weisella viridescens a nyálkaképzésen túl a zöldülésben is részt vesz. A savanyodás általában a burkolóanyagok alatt fordul elő a Lactobacillus, Enterococcus és rokon fajok tevékenysége következtében. A mikrobák a savat laktózból (tej alapú összetevőkből) és más cukrokból képzik. A termék szaga jellegzetesen édes vagy savanyú, jelezve, hogy nem a fehérjékből, hanem a szénhidrátokból és zsírokból indult ki a romlás. Kétféle zöldülési folyamat játszódhat le a romlás során: H2O2 és H2S okozta zöldülés. Az első többnyire akkor történik, ha az anaerob módon tárolt hús aerob körülmények közé kerül. A levegőnek való kitettséget követően H2O2 képződik és reagál a nitrozohemikrómmal, aminek eredményeként zöld színű, oxidált porfirin keletkezik. A zöld szín mikrobás növekedés (Weisella viridescens, Ec. feacalis és Ec. faecium valamint Leuconostocok) következménye is lehet. Az elszíneződés ellenére a termék fogyasztása veszélytelen. A zöldülés másik típusa hűtött, gázt át nem eresztő vagy vákuumcsomagolt húsoknál fordul elő. Általában Ps. mephitica vagy Schewanella putrefaciens elszaporodása következtében jön létre. A keletkező H2S reagál a mioglobinnal és zöld színű szulfomioglobin keletkezik. A szalonnafélék leggyakoribb romlása a penészedés. Aspergillus, Alternaria, Fusarium, Mucor, Rhizopus, Botrytis, Penicillium és más penészgombák okozzák, amelyek a nagy zsírtartalom és kis vízaktivitás ellenére is szaporodni képesek. A baktériumok közül az Enterococcus, Lactobacillus és Micrococcus fajok okozhatnak romlást a különböző szalonnaféléken. A nagy vízaktivitású pácolt termékekben található patogének a Salmonella és a Sta. aureus, ez utóbbi gyakran előfordul nyers sonkában és szalonnában is. Streptococcusok, B. cereus és Cl. perfringens gyakran izolálhatók kolbászfélékből, ha a pácsó koncentrációját túlságosan lecsökkentik.
Fermentált készítmények A kolbászféleségek változatos összetételük miatt az egyik legszélesebb körű mikrobiotával rendelkeznek. Mikrobás szennyezettségük forrása a húson kívül az egyéb összetevőkben keresendő (pl. a fűszerek, ízesítőanyagok mikrobaszáma jelentős lehet). A tejsavbaktériumok és élesztőgombák a tejalapú összetevőkkel juthatnak a 242
Termékek mikrobiológiája, romlása termékbe. A természetes bél is nagy számú baktériumot (Bacillus, Clostridium és Pseudomonas) tartalmazhat. A fermentált kolbászok a terméktől függően óráktól napokig terjedő érlelési időszakon mennek keresztül 10–30 °C-on. Ha a termékhez szénhidrátot is adagolnak, a pH 4,5-re csökken, ami gyorsabban következik be, ha starterkultúrát is használnak. A kolbászféléket lehet spontán módon vagy starterkultúra hozzáadásával fermentálni. A kereskedelmi forgalomban kapható starterkultúrák természetes módon fermentált kolbászokból izolált baktériumokat (Micrococcus, Pediococcus, Leuconostoc, hetero- és homofermentatív Lactobacillus fajokat) valamint élesztőgombákat (Deb. hanseniit) tartalmaznak. Néhány starterkultúrában mikrobakeverékeket alkalmaznak, pl. Micrococcusokat, amelyek a nitrátot nitritté redukálják, valamint Lactobacillusokat vagy Pediococcusokat a tejsavképzéshez. Olyan baktériumokat is használnak, amelyeket nem húsból izoláltak, de kedvező hatásuk van a bél mikrobiotájára (pl. Lb. acidophilus). A pácsó nem gátolja a starterkultúrát. A szénhidrátok erjesztése csökkenti a pH-t. Túl sok sav termelődése nem kedvező az aroma szempontjából. A lipolitikus aktivitás fontosabb – különösen a karbonilok képzése – ami aroma kialakításában játszik szerepet. A romlást okozó (főként Gram-negatív) pálcák gátlódnak a sós, anaerob körülmények között, s a nitrit még jobban növeli a gátlást. Egyes fermentált kolbászokat 50–70 °Cos füstöléssel készítenek. Ezek az érlelést követően hűtést igényelhetnek. Másokat fermentáció után szárítanak és vagy füstölik őket vagy nem. A szárítás véd a felszíni penésznövekedéstől. A kis vízaktivitású fermentált, pácolt termékek közé azok a kolbászféleségek tartoznak, amelyeket sózással, érleléssel, hidegfüstöléssel és szárítással állítanak elő. A végtermék pH-értéke 5,8–6,0, víztartalma 25–28%, sókoncentrációja 3,5–5,5% körüli. A magyar téliszalámi jellegzetesen hosszú, lassú érlelésen megy át, aminek eredményeként a termék víztartalma 28–30% alatti, sókoncentrációja 4,0–4,4% körüli pH-értéke 5,9–6,2 közötti lesz. Külső penészbevonata jellegzetes ízt ad a terméknek. A szárazáru felületén növekedő penészbevonat csökkenti a vízveszteséget, és segíti az egyenletes száradást. A penészek által termelt kataláz antioxidánsként szolgálhat, az oxigénnel reagálva megakadályozza annak bejutását a termékbe. Mindemellett savbontó képességüknek köszönhetően képesek a tejsavat metabolizálni és a termék ízét tompítani. Más, nem penésszel érlelt szalámiféleségeknél a termék víztartalmát 75%-ról 15% alá kell csökkenteni, hogy a penészes romlást megakadályozzuk. Egyes szalámik sótartalma igen nagy; ezek mikrobiológiai stabilitása kitűnő, még trópusi területeken is. Az érlelés alatti fermentáció mesterséges vagy természetes (starteres) lehet. Egy teljesen érlelt, nyers kolbászból laktobacilluszok, sótűrő, nitrátredukáló mikrokokkuszok és enterokokkuszok mutathatók ki. Élesztőgombák (főleg Deb. hansenii) is részesei a normál mikrobiotának, ami szerepet játszik az érésben, az íz- és színkialakításban. A termék felületén esetenként penészgombákat is találunk. Néhányuk részt vesz a jellegzetes íz és állag kialakításában. A kis vízaktivitás miatt a termék romlását penészgombák (A. glaucus csoport) okozhatják. Sta. aureus enterotoxin előfordulhat a kis, de 0,86-nál nagyobb vízaktivitású kolbászfélékben, különösen azokban, amelyeket gyorsan és nagy hőmérsékleten érleltek. A toxinképződés veszélye a fermentáció alatt állhat fenn, amikor a vízaktivitás még viszonylag nagy; ha a termék vízaktivitása már 0,86 alá csökkent, a tárolás során nem képződik toxin.
Hőkezelt hústermékek A főtt, pácolt hústermékeket három csoportra oszthatjuk: pasztőrözött termékek, kereskedelmileg steril vagy ¾ konzervek (pl. löncshús) és teljesen steril, pácolt húskészítmények. A hőkezelés (pasztőrözés) történhet a csomagoló anyagban (pl. kolbász bélben vagy sonka fóliában) és a hőkezelés után még további kezelés lehetséges, pl. szeletelés, csomagolás. A pasztőrözés után a készítmények hűtőben tartandók. A pasztőrözött hústermékek közé soroljuk a főtt kolbászokat, a patékat és a hasonló termékeket. A csomagolás után pasztőrözött termékek (kolbász, paté) romlása a túlélő mikroorganizmusoktól és a tárolási körülményektől, különösen a hőmérséklettől függ. A túlélők leggyakrabban mikrokokkuszok, enterokokkuszok, laktobacilluszok és esetenként a Brochothrix thermosphacta. A főtt hústermékek kitűnő tápközegek mind a baktériumok, mind a gombák számára, ha azok utószennyezéssel a termékre kerülnek. A termék a hőkezelést követő további feldolgozása során Gram-negatív mezofil baktériumokkal, Gram-pozitív 243
Termékek mikrobiológiája, romlása kokkuszokkal és pálcákkal valamint gombákkal szenynyeződhet a munkások kezéről, a termékkel érintkező felületekről. A csomagolás megnöveli az eltarthatóságot. Vákuumcsomagolt termékekben a tejsavbaktériumok dominálnak. Pasztőrözött hústermékeknél legjelentősebb patogén a Cl. perfringens. Mivel a Cl. perfringens eredetű megbetegedéshez nagy számú vegetatív sejt elfogyasztása szükséges, megbetegedés pasztőrözött hústerméktől csak akkor fordulhat elő, ha a húst nem megfelelő hőmérsékleten (35–45 °C) tartják néhány órán át. A húskonzervekben hőkezeléssel elpusztítják a vegetatív sejteket, a Cl. botulinum spóráit és a nála nagyobb hőrezisztenciájú spórások egy részét is. A termékeket lezárt konzervdobozba, üvegbe, fémfóliába vagy műanyagba csomagolják és általában csomagolást követően hőkezelik. A higiénikusan kezelt hús grammonként általában 100 nagyságrendben tartalmaz Clostridiumot és 101 nagyságrendben Bacillust. A fejhús, a sertésbőr spórás szennyezettsége gyakran nagyobb. A spórások fő forrása azonban nem a húsalapanyag, hanem az adalékanyagok (pl. fűszerek, zöldségek). A húskonzervek romlása 3 fő forrásból származik. Az első ok a hőkezelés előtti mikrobás növekedés. Ha a húspasztát nagy hőmérsékleten tartják hőkezelés előtt, a vegetatív baktériumok elszaporodhatnak és károsíthatják a paszta minőségét. Ha a mikrobák zárás és hőkezelés közben szaporodnak, előfordulhat a konzerv puffadása a mikrobák termelte gáztól. A második ok a hőrezisztens spórák túlélése. Néhány mezofil baktérium (pl. Cl. sporogenes) hőrezisztenciája nagyobb, mint a Cl. botulinumé, így ezek túlélhetik a hőkezelést. A harmadik ok a nem megfelelő zárás, ami miatt a hőkezelést követően a hűtéshez használt víz a termékbe szivároghat, így a termék fertőződhet.
Egyéb húskészítmények A kenősáruk, hurkafélék, aszpikos készítmények kevés színhúsból, annál több belsőségből, szalonnából, bőrkéből készülnek, újabban egyre többféle termékhez különböző zöldségeket is adnak. A máj és a vér, mint nyersanyag, mikrobiológiailag kritikus lehet, mivel ezeket előzetesen nem hőkezelik. Az étkezési célra szánt vért már az állat vágóhídi bontásakor különlegesen steril körülmények közt nyerik. Ezeket a készítményeket többnyire bélbe töltve, 80–90 °C-on főzik, hőkezelik, majd gyorsan lehűtik, és hűtve tárolják. Mikrobiológiai romlás tekintetében érzékeny termékek, fogyaszthatósági idejük korlátozott.
Baromfihús Hasonlóan a vöröshúsokhoz, a baromfihús is a mikrobák ideális táptalaja. Átlagos víztartalma 71–85% (aw 0,98–0,99), fehérjékben gazdag, a baromfi fajtájától függően a fehérjetartalom 16–20%-ot tesz ki. A vöröshúsokkal ellentétben azonban a zsír nem az izomszövetben eloszolva, hanem főként a bőr alatt és a hasüregben helyezkedik el. Csakúgy, mint a vágóállatok esetében, az egészséges baromfi húsának belseje is jórészt mikrobamentes, azonban a bőrfelszín, a tollak és a lábak nagy mennyiségű mikroorganizmust hordoznak. Főként pszichrotróf baktériumok, mint pl. Acinetobacter, Moraxella, Pseudomonas, Micrococcus, Staphylococcus és Flavobacterium fajok jellemzők a tollazaton. A kültakaró fekáliával szennyeződhet a tenyésztőhelyen vagy a szállítás alatt. További szennyeződés lehet a függesztés, véreztetés során. Forrázáskor a baromfitestet 60–63 °C-os vízbe merítik, ami a felület mikrobás szennyezettségét nagymértékben csökkenti. A mikrobák részben lemosódnak a felületről, részben elpusztulnak (főként a pszichrotrófok) a forrázó víz hőmérsékletén. Későbbi jelenlétük ezért többnyire utófertőzésre utal. A zsigerelés jelentős fertőzési forrás. A testek zsigerelést követő, hűtést megelőző mosása jelentősen csökkentheti a felületi mikrobaszámot. A zsigerelés után a testeket gyorsan lehűtik, hogy az esetleg rajtuk maradt mikrobák szaporodását megakadályozzák. A vágást követően a baromfihús mikrobiotájában is a Gram-negatív baktériumok (Acinetobacter, Pseudomonas, enterobaktériumok stb.) dominálnak (8.2. táblázat). A Gram-pozitív baktériumok között főként mikrokokkuszokat és vagokokkuszokat, a Brochothrix nemzetség tagjait találjuk. Az élesztőgombák közül a Candida, Rhodotorula, Debaryomyces és Yarrowia nemzetség, a penészgombák közül a Penicillium, Mucor és a Cladosporium nemzetség jelenlétével számolhatunk. A baromfihúsok mikrobiotájába patogén baktériumok is tartozhatnak, mint pl. Salmonella, Campylobacter vagy Listeria. 244
Termékek mikrobiológiája, romlása
8.2. táblázat - A baromfihús mikrobiotájának változása tárolás során Baktériumcsoport
Feldolgozás után közvetlenül 10 napos 1 °C-os tárolás után
Gram-pozitív pálcák
50%
Flavobacterium
14%
Enterobacteriacae
8%
3%
Acinetobacter
2%
7%
Pseudomonas
7%
90%
A baromfihús romlását leggyakrabban a Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella fajok valamint a Schewanella putrefaciens okozza. A romlás főként a bőr felszíni romlására korlátozódik, szag-, nyálkaképződéssel és elszíneződéssel jár. Oxigént át nem eresztő csomagolás esetén a Schewanella putrefaciens és a Brochotrix thermosphacta mellett a tejsavbaktériumok idéznek elő romlást. A fagyasztott termékek (megfelelő tárolás esetén) csak fagyasztás előtt és felengedtetést követően romolhatnak meg mikrobás tevékenység miatt. A felengedtetéskor kicsepegő, elfolyó víz patogén mikrobákat, pl. Salmonellát is tartalmazhat.
Halak A halak mikrobiotájának nagysága és összetétele függ az élőhelyük vízhőmérsékletétől, az évszaktól, a halászás és a feldolgozás körülményeitől. A trópusi és szubtrópusi éghajlatról származó halak mikrobaszáma általában nagyobb. A mérsékelt égövi halak felületén pszichrotróf, a trópusi halakén mezofil baktériumok dominálnak. Az előbbieken az Acinetobacter, Flavobacterium, Moraxella, Pseudomonas, Shewanella és Vibrio nemzetségek dominálnak, az utóbbiakon a Bacillus, Corynebacterium és Micrococcus nemzetségek jellemzőek. Tekintet nélkül az eredetre, a halak mikrobiológiai romlásának fő tényezői a Shewanella putrefaciens és a Pseudomonas nemzetség fajai, mellettük Acinetobacter és Moraxella is számottevő lehet; ezek jégbehűtött halakban is romlást okozhatnak. Módosított légtérben tárolt, mérsékelt égövi vizekből halászott tengeri halakon a CO2-ra rezisztens Photobacterium phosphoreum jellemző, míg trópusi vizekből származókon a Grampozitívok vannak többségben. Hordós, sózott halakon és haltermékeken halofil baktériumok, anaerobok és néhány élesztőfaj található, enyhébben sós haltermékek romlását viszont tejsavbaktériumok, pszichrotróf enterobaktériumok és fotobaktériumok okozzák. Szárított és sózott halak felületén a kis vízaktivitás miatt csak penészekkel találkozunk. A baktériumok elszaporodása következtében hisztamin és más aminok képződhetnek a halhús fehérjéiből; ezek elfogyasztása az ételmérgezéshez hasonló megbetegedést, ún. szkombroid-mérgezést okoz, ami különösen gyakori tonhal és makrélaféle halak esetén, de hering, szardínia fogyasztását követően is. Akkor következik be, ha a kihalászott halakat nem hűtik le elég gyorsan, így a baktériumok elszaporodnak és a hisztidint hisztaminná dekarboxilezik. Tünetei hányás, hasmenés, allergiás reakciók. Magyarországon a halfogyasztás sajnálatosan kismértékű, az egy főre eső fogyasztás mindössze 3 kg/fő/év. Az importált tengeri halakon kívül az édesvízi halak kétharmada halgazdaságokból, a többi természetes vizekből származik, főleg ponty (35–40%) és busa (30%). Jórészük még élő állapotban jut a kereskedelembe. A halak feldolgozásánál szigorú egészségügyi-higiéniai rendszabályokat kell betartani; a rendeletek többek között előírják a HACCP rendszer követését is. A feldolgozó üzemekben előállított termékek között legjelentősebb a csomagolt, fagyasztott és az előhűtött haltörzs. További termékek a halszelet, halfilé friss és fagyasztott formában, halkonzerv, halászlé alap és kocka, pácolt hal, füstölt hal, halpép, valamint hideg konyhai készítmények: pástétomok, halsaláták. 245
Termékek mikrobiológiája, romlása A halhúson valamennyi veszélyes humánpatogén baktérium (Salmonella, E. coli, Cl. botulinum) előfordulhat, de megfelelő feldolgozás, tárolás esetén a gyorsan romlandó halhús sem okoz mikrobás élelmiszer-eredetű megbetegedést. A hidegen és a melegen füstölt haltermékektől egyaránt kapható Li. monocytogenes fertőzés. Nagyobb a valószínűsége a nem, vagy csak közvetetten mikrobás eredetű mérgezéseknek. A hisztamin a romlott halhúsban 50 mg/100 g fölött a Salmonella fertőzéshez hasonló tünetekkel járó megbetegedéseket okoz. A hisztamin endogén úton is képződhet az izomszövetben lévő hisztidin-dekarboxiláz hatására, azonban egyes baktériumok (pl. enterobaktériumok, Morganella morganii) nagyobb száma esetén a képződés sokkal gyorsabb lehet. Hasonló, további mérgező bomlástermékek a putreszcin, a kadaverin, a spermidin és a spermin. A halhúsban a halak tenyésztésére szolgáló vizek ipari, mezőgazdasági, kommunális eredetű szennyeződései (pl. nehézfémek) is felhalmozódhatnak. A halak takarmányában, éppúgy, mint a melegvérű vágóállatokéban, mikotoxinok fordulhatnak elő (pl. a gabona, az olajos magvak és a szója ochratoxin, T–2 és aflatoxin szennyezettsége). Ezek elsősorban a halakra veszélyesek, a tömeggyarapodás csökkenését, esetenként súlyos elhullást is okozva.
Vadhús Az elejtett nagyvadak (szarvas, őz, vaddisznó) és apróvadak (nyúl, vadkacsa, fácán, fürj) húsa országos viszonylatban nem számottevő a húsfogyasztásban, mivel azonban a vadhús különleges mikrobás betegségek (ún. zoonózisok) hordozója lehet, erre tekintettel kell lenni. Az állatorvosi húsvizsgálatot 12 órán belül meg kell tartani; addig a nagyvadak húsát 7 °C-on, az apróvadakét 4 °C-on hűtve kell tartani. Az állatról emberre terjedő zoonózisok közül a vadak húsa a brucellózis, a lépfene, a sertésorbánc kórokozóit hordozhatja. A gondatlanul vagy felelőtlenül feldolgozott, élelmiszerként fogyasztott vadhús szalmonellózist okozhat és paraziták (trichinella, galandféreg) terjesztője lehet.
Tej, tejtermékek, tojás Ezek a termékek tápanyagokban, különösen fehérjékben és lipidekben gazdagok; feldolgozásukban többnyire hőkezelés (pasztőrözés) szerepel, és hűtve tárolandók. Ennek megfelelően a tejtermékek mikrobák okozta romlásában két fő élettani csoport játszik szerepet: a pszichrotrófok, amelyek 5–7 °C-on szaporodnak, valamint a termoduránsak, amelyek túlélik a pasztőrözést. A tejtermékek a romlást okozókon kívül súlyos kórokozók hordozói lehetnek, amelyek jelenlétére, közvetlen kimutatásukon kívül, a laktóz-pozitív (tejcukor erjesztő) koliform baktériumok utalnak (8.3. táblázat).
8.3. táblázat - Tejtermékekben és tojásban gyakran előforduló patogén baktériumok Baktériumfaj
Nyers tej
Campylobacter jejuni
+
Escherichia coli O157
+
Listeria monocytogenes
+
Salmonella enterica
+
Staphylococcus aureus
Sajt
Egyéb tejtermék
+
+
Tojás
+ +
+ 246
Termékek mikrobiológiája, romlása Yersinia enterocolitica
+
Tej A tej kitűnő tápközeg sok mikroorganizmus számára. Nagy vízaktivitása, semleges pH-ja és gazdag tápanyagtartalma kedvező a szaporodásukhoz. A tej azonban nem védtelen a mikrobákkal szemben, mivel számos természetes antimikrobás anyagot (laktoperoxidázt, laktoferrint, lizozimet és specifikus immunglobulinokat) tartalmaz. A laktoperoxidáz enzim a tiocianát oxidációját katalizálja hidrogén-peroxid jelenlétében. A folyamat köztes terméke a hipotiocianát, ami a fehérjék szulfhidril csoportjainak oxidálása és a baktériumok citoplazma membránjának károsítása révén antimikrobás hatású. A hipotiocianát baktericid a Gram-negatív baktériumokra (pl. Pseudomonas, Campylobacter, Salmonella) és bakteriosztatikus a Gram-pozitívokra (pl. Li. monocytogenes, Sta. aureus). A laktoferrin vaskötő glikoprotein, ami több baktérium (pl. enterobaktériumok, Bacillus, Li. monocytogenes) növekedését gátolja a vas megkötése révén. A lizozim enzim, amely a HTST pasztőrözést követően is aktív marad, hidrolizálja a mukopoliszacharidokat a baktériumok sejtfalában. A tejlizozim hatásosabb antimikrobás anyag, mint a tojásból származó. A tehéntej kifejezetten gazdag immunglobulinokban, amelyek specifikus kórokozókkal szemben (pl. az E. coli és a rotavírus) hatékonyak. Az egészséges tehén teje a tőgyben még mikrobamentes, de a frissen fejt tej, ha kis számban is, már tartalmaz mikroorganizmusokat. Mikrobiotáját pszichrofil baktériumok, főként Pseudomonas, Flavobacterium és Alcaligenes alkotja. Bacillus, Micrococcus, Aerococcus, Staphylococcus fajok, valamint enterobaktériumok szintén jelen lehetnek, de többnyire a Pseudomonasok a dominánsak. A mikrobiota 65–70%-át a Pseudomonas nemzetségbe tartozó fajok teszik ki, nagy számban fordulnak elő még a Flavobacterium és az Alcaligenes nemzetségbe tartozó fajok. A tejsavbaktériumok a szarvasmarha bőrének és tőgyének normál biotájához tartoznak, így minden nyers tej, ha kis számban is, tartalmaz tejsavbaktériumokat. A mikrobás szennyeződés forrásai az istálló talaja, a széna, fű, a víz és a levegő, továbbá a tejnyerés eszközei. A pszichrotróf baktériumok fő forrásai a fejőeszközök és a tárolóedények, tankok. A nyers tej patogén mikroorganizmusokat is tartalmazhat (pl. Sa. enterica, Cb. jejuni, Li. monocytogenes, enterohemorrágiás E. coli, Ye. enterocolitica). A leggyakoribb ízhibák okozói a Pseudomonas nemzetségbe tartoznak (Ps. fragi, Ps. putida és Ps. fluorescens). Az ízhibák jelentős része a lassú hűtésből ered, hiszen az lehetővé teszi a pszichrofil baktériumok elszaporodását. A pszichrotrófok általában proteolitikus romlást okoznak. Sok pszichrotróf baktérium képez lipázt, foszfolipázt, lecitinázt és más hidrolitikus enzimeket. A pszichrofil mikrobák pasztőrözéskor elpusztulnak, ezért pasztőrözés utáni jelenlétük mindig utószennyeződés eredménye. Enzimeik azonban megtarthatják aktivitásukat a hőkezelés után is. Az UHT (ultrapasztőrözött) tej keserű ízét a nyers tejben levő pszichrofil baktériumok maradék enzimei okozzák. A tejtermékekben tapasztalható ízhibák közül a keserű vagy rothadt íz proteolízis eredménye, az avas vagy gyümölcsös íz lipolízis következtében alakul ki (8.4. táblázat).
8.4. táblázat - Tejtermékekben előforduló, mikrobák okozta ízhibák Mellékíz, hiba Keserű
Mikroba pszichrotrófok
Anyagcseretermék keserű peptidek
Bacillus cereus Avas
pszichrotrófok
szabad zsírsavak
Gyümölcsös
pszichrotrófok
etil-észterek
247
Termékek mikrobiológiája, romlása Koaguláció
Bacillus spp.
kazein destabilizáció
Savanyú
tejsavbaktériumok
tejsav, ecetsav
Maláta
tejsavbaktériumok
3-metil-butanal
Tejtermékek A tejben található Pseudomonasok általában proteáztermelők. A proteázok az exponenciális és stacioner fázisban termelődnek. „Túlélik” a pasztőrözést, hidrolizálják a kazeint és keserű peptideket termelnek. Hatásuk sajtokban és más savanyított tejtermékekben kicsi, mert a kis pH-érték és hőmérséklet gátolja az enzim aktivitását. A sajtgyártás során a savóval eltávoznak, de ezzel a sajtgyártás kihozatalát csökkentik, mert a proteolízis termékei sem kerülnek a sajtba. Tartós proteolízis eredményeként a termék rothadt szagú lehet különböző kellemetlen anyagok (ammónia, aminok, szulfidok) keletkezése miatt. A tejfeldolgozás során a tejzsír micellák sérülnek (pl. szivattyúzás hatásra), így hozzáférhetővé válnak a lipáz számára. A tej avasodását elsősorban nem a mikrobás lipáz, hanem a tejlipáz okozza. A tejlipáz nem hőtűrő, így a termékek többségében nincs maradék aktivitása. Kivételt azok a termékek képeznek, amelyeket nem hőkezelt tejből, vagy hőkezelés után, hőkezeletlen tej hozzáadásával készítenek. A lipáz általában a hosszú eltarthatósági idejű termékekben (pl. UHT tej, néhány sajtféle, vaj és teljes tejpor) okozhat gondot. Az UHT tejben a mikrobás lipáz maradó aktivitásából eredő ízhibák kialakulása hosszú időt (néhány hetet) igényel. A sajtok nagy zsírtartalmuk miatt jobban ki vannak téve a lipázok hatásának, mint a proteázokénak, mert a lipázok a lipidfrakcióban gyűlnek össze. A tejben található mikroba eredetű lipázokat főként a pszeudomonászok (Ps. fluorescens, Ps. fragi és Ps. aeruginosa) termelik. A mikrobás lipázok az exponenciális és stacioner fázisban termelődnek. Az avas ízt C4 – C8 zsírsavak okozzák, a szappaníz kialakulása a C8-nál hosszabb zsírsavak jelenlétére vezethető vissza. Gyümölcsös íz kialakulását a Ps. fragi okozza. A folyékony tejtermékek romlása leggyakrabban kellemetlen ízű savanyodás, amit kis mennyiségű ecetsav és propionsav képződése okoz. Jellegzetes malátaízt okoz a Lc. lactis subsp. lactis var. maltigenes. A tejsavbaktériumok esetenként nyúlósodást okoznak. A legtöbb tejtermékkel kapcsolatos tejsavbaktérium extracelluláris polimereket képez, amelyek növelik a termék viszkozitását. Néhány törzsüket nagy viszkozitású, fermentált termékek (pl. joghurt, kefir) készítésére használják. Spóraképző baktériumok okozta romlás azokban a termékekben következhet be, amelyek hőkezeltek és kicsi az esélye az utófertőződésnek (pl. aszeptikusan csomagolt tej és tejszín). A nem aszeptikusan csomagolt tej romlását előidézheti pl. B. cereus, a jóval gyorsabban növekedő pszichrotróf baktériumok hiányában. A nyers tejben található spóraképzők között főként a Bacillus nemzetség tagjait találhatjuk meg. Leggyakrabban B. megateriumot, B. licheniformist, B. cereust, és B. subtilist izolálnak. Pszichrotróf B. cereus törzsek a nyers tej 80%-ából izolálhatók. A spórák csírázása gyorsan bekövetkezik a pasztőrözés után, a hőaktiválás miatt. A baktérium tevékenységének eredménye az édes alvadás, mivel a koaguláció jelentősebb savtermelés nélkül megy végbe. A koagulációt egy kimozinszerű fehérje idézi elő. Édes alvadást okoz a B. cereushoz hasonló, csak néhány éve leírt faj, a B. weichenstephanensis is, proteáz és peptidáz termelése révén. A B. cereus foszfolipázt is képez, amellyel lebontja a tejzsír micellák hártyáját és zsírkiválást okoz tejszínben. A B. circulans a laktózból savat termel; az aszeptikusan csomagolt tej savanyodását okozza. A tejben levő legtöbb spóraképző spórája közepes hőtűrésű, az UHT kezelés elpusztítja őket. A tejben található legfőbb hőrezisztens, spórás baktérium a Geobacillus stearothermophilus, valamint a B. sporothermodurans. A fermentált tejtermékek romlását okozhatják „vad” tejsavbaktériumok, a nem kívánatos gázképzés, mellékíz vagy a termék megváltozott állaga révén. Tej és erjesztett tejtermékek romlásában a tejsavbaktériumok széles köre szerepelhet, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Enterococcus, Pediococcus és 248
Termékek mikrobiológiája, romlása Streptococcus fajok egyaránt. Ritkán koliform baktériumok (Enterobacter, Klebsiella) is okozhatnak romlást, de általában a pszichrotrófok vagy a tejsavbaktériumok túlnövik őket. A tejpor kis vízaktivitása kizárja a mikroorganizmusok növekedését, a termék mikrobaszáma általában csökken a tárolás során. Ennek ellenére is történtek járványos megbetegedések tejportól, amelyeket Sa. enterica, Cl. perfringens, Sta. aureus, valamint B. cereus okozott. A tejporban előfordulhat az Eb. sakazakii, ami elsősorban csecsemőket betegít meg. Vajban rothadt szag, sajtszag kialakulásáért a Schewanella putrefaciens okolható, a Carnimonas nigrificans fekete elszíneződést okoz. A vaj avasodását okozhatja a hőstabil mikrobiális lipáz, ami megőrzi aktivitását még –10 °C-os tárolás alatt is. A Ps. fluorescens lipáza hűtési hőmérsékleten is aktív, és jelentős még a fagypont körüli, valamint kis vízaktivitás-értéken is. Mivel a vaj „víz a zsírban” emulzió, pszichrotróf baktériumok akkor képesek szaporodni benne, ha a termékben a só- és nedvesség eloszlása nem egyenletes, így bizonyos helyeken a mikrobák szaporodásához elegendően nagy lesz a vízaktivitás. A csökkentett zsírtartalmú vajkészítmények mikrobiológiai szempontból nem kedvezőek, hiszen ezekben a zsírtartalom csökkentését a vizes fázis növelésével érik el. Ilyen termékekből izolált mikrobák közt Ec. faecium, B. polymyxa, B. firmus, Li. monocytogenes, valamint élesztőgombák (Yarrowia lipolytica, Cryptococcus albidus) is voltak. A termékek eltarthatóságának növelésére gyakran tartósítószereket (pl. szorbinsav, benzoesav vagy sóik) adagolnak. A nem pasztőrözött tejszín tárolása során pszichrotróf Gram-negatív baktériumok (Pseudomonas, Flavobacterium) szaporodhatnak, amelyek proteolitikus és lipolitikus változásokat, valamint mellékízt okozhatnak. A mellékíz átkerülhet a végtermékbe is. A B. cereus spórák túlélik a pasztőrözést, kicsíráznak, és lassan szaporodnak hűtési hőmérsékleten. A jégkrém mikrobiotáját egyaránt befolyásolja a nyersanyagok minősége, a feldolgozás higiéniája és a technológia hatékonysága. A termék meglehetősen viszkózus, ezért gyártása során figyelembe kell venni, hogy a különböző adalékanyagok (pl. stabilizálók) növelik a mikrobák hőtűrését. A termék több patogén mikroba, pl. Li. monocytogenes, Ye. enterocolitica, Sta. aureus forrása is lehet. A tejtermékekben élesztők jelenlétével is számolnunk kell. Azok az élesztők tudnak elszaporodni, amelyek képesek a laktóz, vagy a tejsav bontására, és amelyek elviselik a nagy sótartalmat. Tejtermékekből leggyakrabban izolált élesztőgombák a Kluyveromyces marxianus, Deb. hansenii, Rhodotorula mucilaginosa, Yarrowia lipolytica és a C. parapsilosis.
Sajtok A sajtok összetétele és gyártástechnológiája rendkívül változatos, sok száz sajtféleség létezik. Többségük a tejsavbaktériumok színtenyészeteivel történő beoltással készül és érlelésükben egyéb mikroorganizmusok is közreműködnek (6.1. fejezet). A sajtok aerob, felületi mikrobapopulációjában sokféle, akár 150 különböző mikrobafaj fordul elő, belsejükben azonban jóval kevesebb fajból álló és kisebb mikrobiota található. Néhány tejsavbaktérium íz- és állományhibát okoz. Cheddar sajtban a puffadást sokkal gyakrabban idézik elő tejsavbaktériumok, mint koliformok, élesztők vagy spóraképzők. Egyes sajtféleségeknél rózsaszínű elszíneződés figyelhető meg, amit propionbaktériumok okoznak. Cheddar sajtban gyümölcsös íz lehet a következménye a tejsavbaktériumok észterázai működésének. A koliform baktériumok korai puffadást okozhatnak kemény sajtokban. Ez akkor következik be, ha a lassú tejsavas erjedés miatt a pH-érték nem csökken elég gyorsan, vagy ha erősen szennyezett nyers tejet használnak fel. Késői puffadást okoznak sajtokban a spórás 249
Termékek mikrobiológiája, romlása baktériumok, többnyire a Cl. tyrobutyricum, esetenként a Cl. sporogenes és a Cl. butyricum. Penésszel érlelt lágy sajtokban (pl. Camembert) az érlelés alatti pHérték-növekedés előidézheti a koliformok szaporodását. A különböző sajtféleségeken gyakran fordulnak elő romlást okozó penészgombák. A leggyakoribb, romlást okozó fajok a Penicillium nemzetség tagjai, de előfordulnak sok más nemzetség (Aspergillus, Alternaria, Mucor, Fusarium, Cladosporium és Geotrichum) fajai is. Ömlesztett sajtokról leggyakrabban izolált penészgombák a P. roqueforti, P. cyclopium, P. viridicatum és P. crustosum. Vákuumcsomagolt sajtokról Cladosporium és Penicillium törzseket izoláltak. Az élesztőgombák közül Candida fajok szintén lehetnek a sajtok romlásának okozói. A tejtermékek romlását okozó élesztő- és penészgombák gyakran izolálhatók a sajtgyártás eszközeiről, a helyiségek levegőjéből, porból stb.
Tojás A tojás első védelmi vonala, a tojáshéj, három rétegből áll: külső viaszos réteg, meszes héj és belső héjmembrán. A két külső rész eléggé porózus, de a belső membrán nem, az késlelteti a mikroorganizmusok bejutását. A tojás természetes antimikrobás anyagot, lizozimet is tartalmaz, ami gátolja a baktériumok növekedését. A tojásfehérjében található lizozim enzim elég hatásos a Gram-negatív baktériumok ellen. A tojásfehérje emellett avidint is tartalmaz, ami komplexet képez a biotinnal, így a vitamin nem hozzáférhető a mikroorganizmusok számára. A tojásfehérje proteinjei kelátot alkothatnak a B2- és B6-vitaminnal is. A tárolás során e fehérjék komplexkötő képessége csökken. A tojásfehérje pH-ja elég nagy (pH 9,3) és konalbumint is tartalmaz, ami a vasat komplexben tartva megakadályozza a mikrobák hozzájutását a vashoz. A tojássárgája tápanyagtartalma és pH-ja (6,8) viszont kitűnő növekedési körülményeket nyújt a mikroorganizmusoknak (8.5. ábra). A héjhártyával érintkező tojássárgáját tartalmazó tojások, valamint az élelmiszeriparban sok helyen nyersanyagként használt, ún. létojás (tojásmelanzs) romlékonysága sokkal nagyobb, mint a fehérjével „szigetelt” tojássárgájáé.
8.5. ábra - A tojás mikrobák elleni védelmi mechanizmusai
Az egészséges szárnyas tojása a külvilágra kerüléskor belül rendszerint steril, bár előfordulhat, hogy a tojásba szalmonella kerül már a fertőzött baromfi ováriumában. A tojás külső mikrobás szennyeződése főleg a fészektől, a tyúk ürülékétől származik. A tojók tartási módjától függően igen széles határok, 102–108 sejt/tojás között változhat a tojáshéj baktériumos szennyezettsége. A meszes héj pórusain bejuthatnak baktériumok, miután a külső glikoproteinréteg lepergett (kb. 2–3 hetes tojásnál). A tojás mosása ezért többnyire csak közvetlenül felhasználás előtt célszerű. Erősen szennyezett héjú tojások mielőbbi mosása indokolt, lehetőleg dezinficiálószert tartalmazó mosóvízzel. 250
Termékek mikrobiológiája, romlása A tojásfehérje védelmi mechanizmusai a bejutott Gram-negatív baktériumokat nem ölik el, de gátolják szaporodásukat. A tojás mikrobiotájában találhatunk Pseudomonas, Acinetobacter, Proteus, Aeromonas, Alcaligenes, Escherichia, Micrococcus, Salmonella, Serratia, Enterobacter, Flavobacterium és Staphylococcus baktérium fajokat. A konalbumin és az avidin elsősorban a Pseudomonas nemzetség baktériumait gátolja. A tojással kapcsolatba hozható patogén baktériumok (Sa. enterica, E. coli és Sta. aureus) jól szaporodnak 15 °C felett a létojásban. A légzsákban penészek elszaporodása is megfigyelhető. A penészgombák között elsősorban Mucor, Penicillium, Hormodendron, Cladosporium fajok találhatók. Az élesztőgombák közül Candida fajokat izoláltak. A tojás tisztítható szárazon vagy nedvesen, mosással. Mosni lehet meleg vízzel (min. 42 °C), vagy detergenstartalmú vízzel. Mosáshoz csak lúgos detergensek jók, mert a savas szerek károsítják a héjat. A mosást gyakran kombinálják fertőtlenítéssel. Fontos, hogy a mosott tojást mindig meg kell szárítani. A baktériumok enzimek segítségével bejuthatnak a tojásba, ha a felszíne nedves. Az újrafertőződés megakadályozására és a tojás eltarthatóságának növelésére különböző bevonatokat alakítottak ki. A paraffinolaj például csökkenti a tojás vízvesztését. Más bevonatok (pl. polivinilidén-klorid, hidrolizált cukorszármazékok) hatásosan megakadályozzák a Pseudomonasok és a Salmonellák bejutását. A legtöbb országban nem árusítható tisztítatlan tojás. A tojás tipikus romlási jelensége a rothadás, amit zömmel a Pseudomonas nemzetség fajai okoznak. A Pseudomonasok a belső membránon szaporodnak el. A romlás többnyire jellegzetes színváltozással jár, ami a tojás átvilágításakor észlelhető. A zöldrothadásnál a tojásfehérje zöldes színű, UV fényben fluoreszkál. A fehérjében tapasztalható fluoreszcencia a Ps. putida működésének következménye. Rózsaszínű vagy vörösrothadáskor a tojásfehérjében barna, rózsaszínű vagy vörös pöttyök jelennek meg. Ugyancsak ilyen színű koagulumok jelenhetnek meg a sárgájában is. Ezt a pigmentet termelő Pseudomonas fajok okozzák. Színtelen rothadás esetén a sárgáján nincsenek látható elváltozások, édeskés szag jellemzi. Okozója a Ps. fluorescens, esetleg a Ps. aeruginosa. A világosrózsaszín rothadást a Ps. fluorescens szaporodása okozza. A Ps. fluorescens összetöri a diffúziós gátat a tojássárgájánál, így az világos rózsaszínű lesz a Fe3+ ovotranszferrin kromogén miatt. Dióíz, kérgesedés és FeS csíkok megjelenése a Ps. maltophila jelenlétének tulajdonítható. A Proteus vulgaris, bizonyos Pseudomononas és Aeromonas fajok megemésztik a fehérjét és megfeketítik a sárgáját. Feketerothadásnál a fehérje elfolyósodik, a sárgája koagulál és megfeketedik. Bűzös, általában kénhidrogénszagú. A Pseudomonas fajok elszaporodását követően Proteus fajok okozzák. A penészgombák okozta romlás általában hajszálrepedéses héjú tojásoknál következik be. Dohos, penészes ízzel jár, a fehérje elfolyósodik, a sárgája koagulálhat.
Zöldség- és gyümölcsfélék Zöldségféléknek tekintjük a növények ehető részeit (szár, levél, gyökér, hagyma, rügy, virág és mag). A gyümölcsök a virágos növények magvas termései. Az egészséges növényi szövetek, szervek belseje általában nem tartalmaz mikroorganizmusokat. Egyes esetekben azonban a magházat és a termést megfertőzhetik a virágzáskor behatoló penészgombák. A növényi részek felülete már termesztéskor szennyeződik, a szedés, szállítás, tárolás és feldolgozás további szennyezés forrásai. A növényi nyersanyagok elsődleges mikrobiotája elsősorban a talajból, vízből, levegőből, csapadékból, rovaroktól és állatoktól származik. A szennyezési források hatása függ az időjárástól is. A talajban (gumók, gyökerek) és talaj közelében fejlődő növényi részek erősen szennyezettek, mikrobiotájuk összetétele gyakorlatilag megegyezik a talajéval. A talaj felszínétől távolabb lévő részek főként porral, csapadékkal szennyeződnek. A leveleken és más felszíni részeken a mikrobaszám 103–106 tke/cm2. Ezek aerob, Gram-negatív baktériumok, koliform baktériumok, Gram-pozitív kokkuszok és pálcák, aerob spórás baktériumok, valamint élesztő- és penészgombák. A virágok és termések mikrobiotája elsősorban élesztő- és penészgombákból áll, mivel más közvetítők, főként a rovarok terjesztik. 251
Termékek mikrobiológiája, romlása
Növényi nyersanyagok romlása A növényi nyersanyagok romlásának három fő típusát különböztetjük meg. Az ún. aktív romlást a növénypatogén mikroorganizmusok okozzák, amelyek képesek behatolni az egészséges és ép növényi felületen. Passzív romlás esetén az opportunista mikroorganizmus a sérült bőrszöveten keresztül hatol be a szövetekbe. A sérülést okozhatják rovarok, a szedés, a szállító- vagy feldolgozóeszközök. A passzív romlás másik fajtája, amikor a fertőző mikroorganizmus egy növénypatogén mikroba által okozott seben vagy természetes nyílásokon (lenticellák, gázcserenyílások) keresztül jut a szövetbe. A növény fiziológiai állapota fontos tényező a mikrobás romlással szembeni ellenállásban. A zöldségek-gyümölcsök természetes ellenálló képessége a legerősebb a fiziológiai érettség csúcspontján, majd csökken az érés előrehaladtával. A zöldségek és gyümölcsök romlási mikrobatársulásának kialakításában a külső környezeti tényezők mellett a termékben érvényesülő belső tényezők hatása is jelentős. A belső tényezők közül a termék kémiai összetétele, vízaktivitása, pH-ja, redoxpotenciálja döntő. A zöldségfélék átlagos víztartalma csaknem 90%. A magvak kivételével a növényi szövetek fehérjetartalma alacsony (átlagosan kb. 2%). A szénhidrátok átlagos mennyisége kb. 7%, a zsírok, vitaminok és szervetlen sók összesen kb. 1%-ot tesznek ki. Ez az összetétel megfelelő tápanyagforrás mindenfajta mikroorganizmus szaporodásához. A zöldségfélék nagy vízaktivitása és (a paradicsom kivételével) átlagosan 5–6 körüli pH-ja (8.5. táblázat) megfelel a legtöbb baktérium szaporodásának. A nagy oxidációs-redukciós potenciál (pozitív Eh-érték) következtében elsősorban az aerob és fakultatív anaerob baktériumoknak nyújtanak kedvező szaporodási körülményeket.
8.5. táblázat - Néhány fontosabb zöldség- és gyümölcsféle átlagos pH-értéke Zöldség
pH
Gyümölcs
pH
Bab
5,0–6,0
alma
3,1–3,9
Brokkoli
5,2–6,0
banán
4,5–5,2
Burgonya
5,4–6,0
citrom
2,2–2,6
Karfiol
5,4–5,8
görögdinnye
5,8–6,0
Káposzta
5,2–5,4
grapefruit
2,9–3,4
Paradicsom
4,0–4,7
kajszibarack
3,3–4,4
Rebarbara
2,9–3,3
körte
3,4–4,7
Sárgarépa
5,2–5,8
meggy
3,2–4,0
Spenót
4,8–5,8
narancs
3,0–4,0
Sütőtök
5,0–5,4
őszibarack
3,1–4,2
Torma
5,2–5,6
sárgadinye
6,2–6,5
Tök
4,8–5,5
szamóca
3,0–3,9 252
Termékek mikrobiológiája, romlása Uborka
5,4–5,8
szeder
3,0–4,2
Zöldbab
5,5–6,0
szilva
2,8–4,6
Zöldborsó
5,8–6,5
szőlő
3,0–4,5
A zöldségfélék romlásában elsősorban baktériumok játszanak szerepet. Ennek oka lehet, hogy a baktériumok gyorsabban szaporodnak, mint az élesztő- vagy penészgombák, különösen hűtött körülmények között. A Gram-negatív baktériumok közül gyakran izolálhatók a Pseudomonas, Flavobacterium, Acinetobacter, Alcaligenes, Xanthomonas, Chromobacterium, Enterobacter, Klebsiella, Serratia fajok. A Gram-pozitív baktériumok közül elsősorban a Micrococcus, Lactobacillus, Corynebacterium, valamint Bacillus fajok fordulnak elő. A baktériumokhoz képest a penészgombák és különösen az élesztőgombák számaránya kicsi. Az előforduló élesztőgombák a Cryptococcus, Candida, Rhodotorula és Sporobolomyces nemzetségekhez, a penészgombák a Cladosporium, Aureobasidium, Aspergillus, Penicillium, Botrytis, Fusarium és Geotrichum nemzetségekhez tartoznak. A gyümölcsök vízaktivitása a zöldségekéhez hasonlóan nagy. Kémiai összetételük azonban eltérő, több szénhidrátot és kevesebb fehérjét, zsírt és ásványi anyagot tartalmaznak, mint a zöldségek. Vitamin- és tápanyagtartalmukat tekintve alkalmasak lennének mindenfajta mikroorganizmus szaporodásához. A gyümölcsök pHértéke (8.5. táblázat) azonban általában kisebb, mint ami a baktériumok számára kedvező, ezért a romlást okozó mikrobatársulás tagjai elsősorban élesztő- és penészgombák. A gyümölcsökön átlagosan 103–105 tke/g nagyságrendben találunk mikroorganizmusokat. A baktériumok közül csak a tejsav- és az ecetsavbaktériumok jelentősek. A mikrobiota többségét élesztőgombák alkotják. A leggyakoribbak a Hanseniaspora, Torulaspora, Pichia, Saccharomyces, Candida és Rhodotorula fajok. A penészgombák között a gyümölcsök gyakori kórokozói és romlást okozói az Alternaria, Aspergillus, Botrytis, Fusarium, Geotrichum, Monilia, Mucor, Rhizopus, Sclerotinia, Trichotecium fajok. A nyersen fogyasztott zöldségekkel és gyümölcsökkel közvetített megbetegedések száma világszerte jelentős mértékben megnövekedett az elmúlt évtizedekben. A járványok okozója többnyire olyan enterális patogén baktérium (elsősorban Salmonella és E. coli O157:H7), ami a fogyasztást megelőzően el tudott szaporodni, vagy alacsony az infektív dózisa (8.6. táblázat). Az olyan friss zöldségfélék, amelyek termesztése során nem alkalmaznak állati trágyát, a talajban természetes módon előforduló baktériumok kivételével nem tartalmaznak patogén baktériumokat. Emberi vagy állati eredetű szennyvízzel való öntözés vagy trágyázás esetén gyakran izolálhatók Salmonella szerotípusok, Shigella baktériumok vagy E. coli a zöldségek felületéről. A Li. monocytogenes a talajban és a növényi vegetációkban mindenütt megtalálható és hosszú ideig életképes. Hűtött körülmények között is tud szaporodni, és a módosított atmoszférás tárolás nem befolyásolja szaporodási sebességét, így a nyers zöldségfélék forrásai lehetnek a humán liszteriózisnak. A spóraképző baktériumok közül a B. cereus és a talaj eredetű szennyeződésből származó Cl. botulinum előfordulásával is számolni kell. A nyersen fogyasztott, széklettel szennyeződött zöldségfélékkel vírusfertőzés is közvetíthető, amelyek közül kiemelendő a calicivírusos fertőzés.
8.6. táblázat - Friss zöldség- és gyümölcsfélékből, valamint levekből izolált patogén baktériumok Patogén
Termék
Aeromonas hydrophila lucernacsíra, spárga, brokkoli, karfiol, zeller, saláta, paprika, spenót
253
Termékek mikrobiológiája, romlása Bacillus cereus
lucernacsíra, zsázsacsíra, uborka, mustármagcsíra, szójababcsíra
Campylobacter jejuni
zöldhagyma, saláta, gomba, burgonya, petrezselyem, paprika, spenót
Clostridium botulinum káposzta, gomba, paprika E. coli O157:H7
lucernacsíra, almalé, káposzta, zeller, koriander, zsázsacsíra, saláta, (cilantro)
Listeria monocytogenes
babcsíra, káposzta, cikória, uborka, tojásgyümölcs, saláta, gomba, burgonya, retek, saláta zöldségek, paradicsom
Salmonella enterica szerotípusok
lucernacsíra, articsóka, céklalevél, zeller, káposzta, kantalupdinnye, karfiol, chili, tojásgyümölcs, endívia, ánizskapor, zöldhagyma, saláta, babcsíra, mustár, narancslé, petrezselyem, paprika, saláta zöldségek, spenót, eper, paradicsom, görögdinnye
Shigella spp.
zeller, kantalupdinnye, saláta, petrezselyem, mogyoróhagyma
Staphylococcus aureus lucernacsíra, sárgarépa, saláta, hagymacsíra, petrezselyem, retek Vibrio cholerae
káposzta, kókusztej, saláta
A gyümölcsök pH-ja jelentős szervessav-tartalmuk miatt alacsony. Patogén baktériumok csak széklet eredetű szennyeződés révén kerülhetnek a felületükre. Az enterális patogén baktériumok túlélése a gyümölcs pH-jától és a tárolási hőmérséklettől függ. Salmonella baktériumot izoláltak paradicsom, valamint dinnyefélék által okozott megbetegedéseknél. Szennyvízzel öntözött és nyersen fogyasztott zöldségek és gyümölcsök paraziták (Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum) fertőző forrásai is lehetnek. Az állati eredetű nyersanyagokhoz képest a zöldségek és gyümölcsök mikrobiológiai állapotáról viszonylag kevés adat áll rendelkezésre. A zöldségeken és gyümölcsökön előforduló patogének kimutatására kevesebb fejlett vizsgálati módszert dolgoztak ki, a fertőzések sporadikussága pedig tovább nehezíti a felmérést. 1999-ben budapesti nagy élelmiszerláncokban végeztek felmérő vizsgálatot, a salátakészítés körülményei kifogásolhatók voltak. A kifogásoltság oka a megengedettnél nagyobb koliform és összes mikrobaszám, valamint az E. coli jelenléte volt. A nem megfelelő mikrobiológiai állapot különösen aggályosnak tekinthető olyan termékek esetén, amelyeknél további hőkezelés vagy más mikrobaszám-csökkentő művelet nincs, és az otthoni tárolás alatt mikrobiológiai állapotuk tovább romlik. A zöldségek és gyümölcsök a penészgombák – amelyek között sok mikotoxintermelő van – kiváló táptalajai. A nyersanyag szennyezettsége és a tárolási körülmények gyakran lehetővé is teszik a mérgező anyagcseretermékek képződését. Penészes gyümölcsökből, zöldségekből (elsősorban almából és körtéből), mutatható ki a patulin. A szüretet követő tárolás során az alma patulinszennyezettsége jelentősen növekszik. A toxinképzés optimális hőmérséklet-tartománya 20–30 °C, de
254
Termékek mikrobiológiája, romlása hűtött körülmények között (4 °C) is jelentős patulintermeléssel kell számolni. A mikotoxin a feldolgozási műveletek közben sem inaktiválódik, és a levekben, sűrítményekben is megtalálható. Magyarországon a gyümölcs- és zöldségkészítményekre előírt határérték 50 mg/kg. A mikotoxinok elleni védekezés leghatékonyabb eszköze a megelőzés, a mikrogombák bekerülésének, illetve toxintermelő életműködésének megakadályozása. A termesztés során fontos a régi termés maradékának eltávolítása, gombaölő szerek (megengedett mértékű) alkalmazása, gombarezisztens növényfajták nemesítése. A tárolás alatt egyenletesen kis páratartalmat kell fenntartani, a feldolgozás során gondoskodni kell a penészes darabok eltávolításáról. Az élelmiszer-biztonságot veszélyeztető jelentős tényező az igazán hatékony antimikrobás kezelés hiánya. A termesztés-előállítás bármely pontján bekövetkező fertőzés a végtermékben is jelen lehet. A gyümölcsök vizes mosása csupán kis mértékben csökkenti a mikrobaszámot. A mosóvíz klórozása (30–100 mg/l aktív klór) elősegíti ugyan a patogén baktériumok számának csökkenését, teljes mértékben azonban még így sem mentesíthetők a felületek. A klórozás továbbá toxikológiai problémákat is felvet. Különleges figyelmet érdemel a „minimálisan feldolgozott”, fogyasztásra előkészített (mosott, hámozott, szeletelt, csomagolt stb.) módon forgalomba kerülő termékek köre, ahol a feldolgozás és a személyi higiénia szabályainak betartása fokozott fontosságú.
Szárítmányok A szárítmányokat mikrobiológiai szempontból általában nem tekintjük romlékonynak, azonban ezek is tartalmaznak élő mikroorganizmusokat, amelyek az élelmiszer romlásán túl akár egészségártalmat is okozhatnak. A szárított élelmiszerek mikrobiológiai állapotát a nyersanyag minősége, az előkészítési és feldolgozási műveletek, a csomagolás és a tárolás módja, valamint a fogyasztásra való előkészítés befolyásolja.
Zöldségszárítmányok A zöldségszárítmányok gyártásának előkészítő műveletei a válogatás, a mosás és esetenként az előfőzés. A mikrobiota összetétele és nagysága a nyersanyagokéhoz hasonló. Az előfőzés (blansírozás) célja elsősorban az enzimek inaktiválása, azonban akár két nagyságrendnyi sejtszámcsökkentő hatása is lehet. Mikroorganizmusok szaporodásával (elsősorban a Lactobacillus és Lactococcus fajok okozta tejsavas erjedéssel) kell számolni, ha az előfőzött nyersanyag túl sokáig szobahőmérsékleten marad, illetve a szárítás előtt a berendezésekről utószennyeződés következik be. Egyes szárított zöldségféle barnulásának és elszíneződésének megakadályozására kénezést alkalmaznak (a hagymát, fokhagymát például nem blansírozzák szárítás előtt). A zöldségféléket rendszerint forró levegővel szárítják. A víz párolgása következtében a termék belsejének hőmérséklete 45 °C alatt marad annak ellenére, hogy a szárítólevegő 80–100 °C-os. Ennek következtében a szárítás alatt jelentős mikrobaszám-csökkenéssel nem lehet számolni, sőt akár valódi vagy látszólagos növekedés (ugyanaz a mikrobaszám kisebb tömegű mintában) is tapasztalható. A termék elhelyezése a szárítótálcákon vagy szállítószalagon kritikus lehet, mert az egyenetlen rétegvastagság helyi, „nedvesebb pontokat” hoz létre, ami kedvez a mikrobaszaporodásnak. A zöldségszárítmányok mikrobaszáma nagyon változó. A mezofil aerob baktériumszám 103–108 tke/g tartományban változik, a legtöbb esetben 104–106 tke/ g. A koliform baktériumok, valamint az élesztő- és penészgombák száma szintén változó. A nyers zöldségeken és a nem előfőzött termékeken található mikroorganizmusok gyakorlatilag megegyeznek. Az előfőzés nem pusztítja el a spórákat, ezért bacilluszok, termofil spóraképzők és szulfitredukáló klosztridiumok gyakran izolálhatók a zöldségszárítmányokról. A penészes szennyezettség esetenként nagyon nagy (106–108 tke/g), mikotoxinképzők előfordulásával is számolni kell. A patogének közül az E. coli, a Sta. aureus vagy a Salmonella szerotípusok az előfőzés nélkül készített szárítmányokból viszonylag gyakran izolálhatók. B. cereus, Cl. botulinum vagy Cl. perfringens spórái talaj eredetű szennyeződésként jelen lehetnek a terméken. 255
Termékek mikrobiológiája, romlása A zöldségszárítmányok kis vízaktivitásuknak (aw < 0,7) köszönhetően biztonságos, romlásmentesen eltartható termékeknek tekinthetők. Tárolás közben azonban a csomagolt termékben a hőmérsékletingadozás hatására vízvándorlás és kondenzvízképződés mehet végbe, ami a túlélő mikroorganizmusok számára kedvező életfeltételt teremthet. A szárítmányok visszanedvesítése, vagy nagy vízaktivitású készételekhez való felhasználása mikrobiológiailag kedvezőtlen. A levesporok egyik potenciális veszélyforrása is a komponensként felhasznált zöldségszárítmány.
Gyümölcsszárítmányok A gyümölcsszárítmányok kis vízaktivitása (0,60–0,70) és savassága nem kedvez a mikroorganizmusok szaporodásának. A napon szárított termék víztartalma 25%-ra csökkenthető, az egyéb módon készített aszalványok víztartalma 1–5%. Egyes gyümölcsféléknél (alma, körte, banán, őszibarack) kén-dioxidos kezelést is alkalmaznak, elsősorban a szín megőrzése céljából, de csökkenti a mikrobaszámot is. A napon végzett szárításnál a napsugárzás ultraibolya részének mikrobapusztító hatása is érvényesül a felszíni rétegben. A gyümölcsszárítmányok mikrobaszáma 102–103 tke/g körüli, ami nagymértékben függ a helyesen végzett technológiától. A szárítási folyamat közben a hő hatására az élesztők, és a vegetatív baktériumsejtek jelentős része elpusztul, a mikrobiota főként baktérium- és penészspórákból áll. Datolya és füge savanyodását ozmotoleráns élesztőgombák (többek között Zyg. rouxii, Hp. valbyensis) okozhatják, ha a víztartalom meghaladja a 22%-ot. Nagyobb nedvességtartalmú termékekben (pl. aszalt szilva) Eurotium fajok, az A. glaucus csoport tagjai és a Xeromyces bisporus fordulnak elő romlásokozóként. Megakadályozásuk tartósítószer (K-szorbát, Na-benzoát) adagolásával lehetséges. Patogén mikroorganizmusok közül a mikotoxinképző penészgombákkal kell számolni. A. flavus és aflatoxin gyakran kimutatható szárított zöldségekből.
Fagyasztott zöldség- és gyümölcsfélék A fagyasztás általános mikrobiológiai hatása ellenére lényeges különbség mutatkozik a zöldségek, illetve a gyümölcsök fagyasztást követő mikrobiológiai állapotában, ami annak tulajdonítható, hogy a zöldségeket fagyasztás előtt általában előfőzik, a gyümölcsöket többnyire nem. A növényi termények összetételbeli különbségei fagyott állapotban nem érvényesülnek, azonban felengedtetés után igen.
Fagyasztott zöldségek A zöldségféléket fagyasztása előtt rendszerint előfőzik az enzimek inaktiválása és a minőségi paraméterek megőrzése céljából. A blansírozás 90–100 °C-on, néhány percig tart. A feldolgozási folyamatban a mikrobaszámot növelő és csökkentő lépéseket egyaránt találunk. A külső részek eltávolítása (pl. a borsó kifejtése) a mikrobaszaporodásnak kedvez, a mosás is csak csekély mértékben csökkenti a mikrobaszámot. Az előfőzés azonban 2–3 nagyságrenddel csökkentheti a mikrobás szennyezettséget. Az előfőzés után a mikrobiológiai veszély elhárítása végett a lehető legrövidebb idő alatt kell lehűteni és fagyasztani a terméket. A fagyasztás nem csökkenti jelentősen a mikrobaszámot. A –18 °C-on történő tárolás alatt a túlélő mikroorganizmusok száma azonos szinten marad, vagy lassú csökkenést mutat. A fagyasztott zöldségfélék mikrobaszáma átlagosan 104–106 tke/g. Gyakran izolálhatók Enterobacter, Pseudomonas, Bacillus fajok, valamint mikrokokkuszok és tejsavbaktériumok. Élesztő- és penészgombák általában kisebb számban fordulnak elő, mint a baktériumok. A mikrobiota nagy része a feldolgozó vonal berendezéseiről származik, számuk az üzem higiéniai gyakorlatát tükrözi. 256
Termékek mikrobiológiája, romlása Patogén baktériumok előfordulása viszonylag ritka, mivel a) a vegetatív baktériumsejtek nem élik túl az előfőzést; b) a túlélő sejtek nem képesek szaporodni a fagyasztás hőmérsékletén; c) a terméket a fogyasztás előtt többnyire megfőzik. Patogének (Sa. enterica, E. coli, Sta. aureus, Li. monocytogenes) jelenléte súlyos higiéniai hiányosságokra vagy az előfőzés elégtelenségére utal.
Fagyasztott gyümölcsök A legtöbb gyümölcsöt nyersen fagyasztják, mivel az előfőzés puhává tenné. Kivételt képeznek a sütőipari termékekhez használandó fagyasztott gyümölcsök. A gyümölcsökön eredetileg jelen lévő mikroorganizmusok nagy része túléli a fagyasztási-felengedtetési folyamatot. A szeletelt, magozott, passzírozott termékek a feldolgozó vonalon is szennyeződhetnek. Cukor adagolása mikrobiológiai szempontból egyaránt lehet kedvező vagy kedvezőtlen, mivel elősegítheti a mikrobák túlélését. A gyorsfagyasztott gyümölcsök leggyakrabban penészspórákat, élesztőgombákat és tejsavbaktériumokat tartalmaznak, amelyek a felengedtetés után a termék romlását okozhatják. A Salmonella Typhi és a vírusok előfordulása a gyorsfagyasztott gyümölcsök által okozott megbetegedésekben felhívja a figyelmet a patogének túlésének lehetőségére a fagyasztás és a felengedtetés után.
Gyümölcslevek, üdítőitalok A Magyar Élelmiszerkönyv előírása szerint a gyümölcslé olyan nem erjesztett termék, amelyet egészséges, megfelelően érett, friss vagy hűtéssel tartósított, egyvagy többfajta gyümölcsből nyernek, és az előállításhoz felhasznált gyümölcs(ök)re jellemző színe, illata, íze van. Ugyanaz a gyümölcslé visszanyerhető olyan gyümölcsből, amelyből feldolgozása során elkülönítették aromáját, velőjét és rostját. A gyümölcslé („juice”) a 100%-os levekre vonatkozik; a nektár legalább 25%ban gyümölcsöt tartalmaz, a 12%-nál több gyümölcsöt vagy annak megfelelő mennyiségű gyümölcslevet tartalmazó pedig a gyümölcsital. Az 1–12%-os levek a gyümölcstartalmú üdítőitalok. A gyümölcslé-koncentrátumot a víz vákuumban, emelt hőmérsékleten történő eltávolításával készítik. A koncentrátum előnye a kisebb térfogat, valamint a mikrobiológiai stabilitás – megfelelő hűtött körülmények között. Az üdítőitalok lehetnek gyümölcstartalmúak vagy anélkülküliek, szénsavval dúsítottak vagy szénsavmentesek. A gyümölcs alapú termékek mellett egyre jobban hódítanak a szénsavmentes, teakoncentrátumból készült italok, amelyek enyhén édesítettek és ízesítettek (többnyire citrom vagy őszibarack ízzel). A szénsavas üdítőitalok az enyhe nyomás alatt abszorbeált CO2-on kívül természetes vagy mesterséges édesítőszert, vitaminokat, savképző anyagokat, színező- és illatosító anyagokat, emulgálókat, stabilizáló, antioxidáns, valamint tartósítószer adalékokat tartalmazhatnak. A termékek eltarthatóságát pasztőrözés és esetenként tartósítószerrel való kombinálás biztosítja. A gyümölcslevek kémiai összetétele és a feldolgozás módja egyaránt befolyásolja a mikrobiota összetételét. A gyümölcslevek és üdítőitalok nyersanyagául felhasznált gyümölcsök pH-ja a nagy szervessav-tartalomnak köszönhetően általában 2,2–4,5 (8.5. táblázat). Az üdítőitalok átlagos pH-tartománya 2,5–3,0, a tea alapúaké a 3,2–4,2 pH-tartományba esik. A gyümölcslevek átlagos cukortartalma 10% (fruktóz, glükóz és szacharóz). Az üdítőitalok hasonló mennyiségű, átlagosan 7–12% cukrot tartalmaznak, amelyet Brix-fokban (w/w%) adnak meg. Az üdítőitalok jellegzetes ízének kialakításában az édes íz és a szerves savak által okozott savasság egyensúlya a döntő. Hozzáadott savként az adott gyümölcsre jellemző savakkal – citromsav, almasav, borkősav – találkozunk. A foszforsavat a kólaféléknél alkalmazzák. 257
Termékek mikrobiológiája, romlása Nitrogéntartalmú vegyületeket, valamint foszfátokat általában kis mennyiségben tartalmaznak (kivételt képez a foszforsavval savanyított cola). Káliumban gazdagok, azonban viszonylag kevés egyéb elemet (Na, Ca, Mg, Fe és Zn) tartalmaznak. Az általános fogyasztói vélekedéssel szemben az üdítőitalok csak kevés vitamint tartalmaznak. Talán csupán a feketeribiszke vagy a csipkebogyó említhető kivételként, amelyek eredendően nagy C-vitamin-tartalmúak. Más gyümölcsökből készült italokhoz gyakran utólag adagolnak aszkorbinsavat az íz- és színmegőrzés céljából, illetve táplálkozás-élettani szempontból. Az oldott oxigén a gyümölcslevekben kedvezőtlen változásokat okoz (fáradt íz, barnulás), ezért lehetőleg alacsony szinten kell tartani. Ezt segíti elő a forrón töltés, a pasztőrözés, valamint az antioxidánsok használata. Természetes antioxidáns vegyületként aszkorbinsav, továbbá szulfitok adagolása a leggyakoribb. A mikroorganizmusok számára speciális ökoszisztémát hoz létre az oxigén helyettesítése CO2-dal (1,5–3,5 v/v%). Az üdítőitalok és gyümölcslevek eltarthatóságának növelésére gyakran alkalmaznak tartósítószereket. Az engedélyezett tartósítószerekről és hatásmechanizmusukról részletesen szóltunk az 5.5. fejezetben. A tartósítószerek felhasználásánál figyelembe kell venni, hogy egyes élesztőgombák a kálium-szorbáttal szemben ellenállóak, sőt szénforrásként is tudják hasznosítani.
A mikrobás szennyeződés forrásai A gyümölcslevek és üdítőitalok kis pH-értéke és vízaktivitása elsősorban az élesztő- és penészgombáknak, a baktériumok közül a tejsav- és ecetsav-baktériumoknak nyújt életteret. Az élesztők és a penészgombák fő forrása a gyümölcs és a gyümölcslé. A friss gyümölcs felülete gyakran nagy számú penészgombával szennyezett, különösen a sérült felületeken. A penész aszkospórák széles körben elterjedtek a talajban, fertőzve a gyümölcsök felületét. A gyümölcs a feldolgozás minden fázisában sok élesztő faj legfőbb természetes előfordulási helye. Különösen az összeaszalódott, mumifikált gyümölcsök nyújtanak kiváló környezetet az ozmotoleráns élesztők számára, amelyek közül sok a gyümölcslevek romlását okozza. A gyümölcslevekből több mint 100 élesztőfajt írtak le, amelyek elsősorban a gyümölcsösökből vagy a szőlőskertekből származnak. Élesztős szennyeződések a léextraháló berendezésekből is eredhetnek. A technológiában felhasznált cukor is lehet forrása élesztőgombás szennyeződésnek. Az üdítőitalok gyártására használt víz mikrobiológiai minősége döntő fontosságú, ezért megfelelő mikrobaszám-csökkentő művelet beiktatása szükséges. A csomagolóanyagok, műanyag és üvegpalackok, kupakok hőtűrő penész aszkospórákkal lehetnek szennyezettek, ezek elsősorban a feldolgozótér levegőjéből származnak. A rovarok (legyek, darazsak) az élesztőgombák közvetítői. A legtöbb élesztő nem képes szaporodni a gyümölcslevekben, ezért higiéniai indikátornak tekinthetők. Az élesztők általában hőérzékenyek és csak kevés éli túl a lékoncentrálást vagy a pasztőrözést. Az élesztő aszkospórái azonban 10 °C-kal is nagyobb hőmérsékletet képesek túlélni, mint a vegetatív sejtek. A mikrobiológiai romlás járhat szemmel látható gázképzéssel, zavarosság, hártya, üledék képződésével, idegen íz, illat kialakulásával. Az élesztőgombák által okozott romlásban szerepet játszó leggyakoribb fajok a Dekkera bruxellensis, Dekkera naardenensis, S. cerevisiae, S. bayanus, S. exiguus, Sch. pombe, Zyg. bailii, Zyg. bisporus, Zyg. microellipsoides, Zyg. rouxii, Tp. delbrueckii. Különleges figyelmet érdemel a sűrítményekben is szaporodni képes, tartósítószer rezisztenciájával kitűnő Zyg. bailii. Ez az ozmotoleráns élesztőgomba viszonylag lassan szaporodik (generációs ideje 2,5 óra), de tűri az 50%-os glükózkoncentrációt, és a termékben rendkívül kis számban (akár 1 sejt/l koncentrációban) túlélve, majd elszaporodva képes romlást okozni. A gyümölcssűrítmények másik jellegzetes romlásokozója a Zyg. rouxii. Különlegesen ozmotoleráns élesztőgomba, szaporodásának minimális vízaktivitás-értéke 0,62. Elsősorban fruktózt erjeszt, tartósítószerekkel szemben ellenálló, és nagyon kis számban képes romlást okozni. 258
Termékek mikrobiológiája, romlása Az utóbbi években leírt új élesztőfaj, a Zyg. lentus 60% cukortartalom mellett is képes szaporodni és romlást okozni. Tartósítószer rezisztens, valamint kis hőmérsékleten (4 °C-on) is szaporodik, a hűtve tárolt gyümölcslevek romlását okozva. Megfelelő oxigéntartalom mellett sok penészgomba is képes a gyümölcslevek és üdítőitalok romlásában közreműködni. A pasztőrözést túlélő, hőtűrő penészgombák és aszkospórák közül gyakori az A. ochraceus, A. fisheri, A. tamarii, A. flavus, Byssochlamys nivea, Bys. fulva, Paecilomyces variotii, Neosartorya fischeri, Eupenicillium brefeldianum, Phialophora mustea, Talaromyces flavus, Talaro. trachyspermus és a Thermoascus aurantiacum. A hőtűrő penészgombák és aszkospórák a tartósítószerekkel szemben érzékenyek, de legjobban az oxigén kizárásával, megfelelő nyersanyaggal és jó gyártási higiéniával küszöbölhetők ki. Savas környezetben a baktériumok többsége nem képes szaporodni. A kis pH-jú közegekben a Gram-negatív ecetsav-baktériumok (Acetobacter, Gluconobacter fajok), tejsavbaktériumok (Lactobacillus, Leuconostoc és Enterococcus fajok) szaporodásával kell számolni. A gyümölcslevek, különösen a paradicsomlé, szennyeződhet Bacillus fajokkal (pl. B. coagulans, B. macerans, Paenibacillus polymyxa) is. A paradicsomlevek simasavanyodásos romlását a termofil B. coagulans okozza. Gyümölcslevek romlásában szerepet játszhatnak a spóraképző Cl. pasteurianum és Cl. butyricum, amelyek 3,6 pH-jú közegben is képesek szaporodni. Az utóbbi években egy újabban leírt spóraképző baktérium, az Alicycobacillus acidoterrestris, okoz gondot. Ez a baktérium képes túlélni a pasztőrözést (narancslében a D értéke 85 °C-on 42 perc, 91 °C-on 2,3 perc), jól szaporodik 2,5–5,5 pH-tartományban, és a gyümölcslevek romlását okozza. Lassan szaporodó mikroorganizmus, 30–70 °C közötti hőmérsékleten. A gázképződéssel nem járó romlás jellegzetessége az idegen („kórház”) íz és szag, amit a baktérium által termelt guajakol és 2,6-dibrómfenol okoz. Gyümölcslevek romlását okozó további termoacidofil, spórás baktérium faj az Alicyclobacillus acidocaldarius, Ali. cycloheptanicus, Ali. acidiphilus, Ali. herbarius, Ali. pomorum. Az először hőforrásokból izolált, obligát aerob, mozgékony, pálca alakú baktériumok különleges sav- és hőtűréséért valószínűleg a sejtmembránjukban található ciklohexán-zsírsav felelős.
Gabona-, malom- és sütőipari termékek A gabonák, illetve a belőlük malomipari és sütőipari technológiákkal készített termékek alapvető élelmiszereink. A gabonafélék keményítőben gazdag, fehérjetartalmú szemtermést hozó növények, amelyek különböző fajait az emberiség minden földrészen termeszti. A mérsékelt égövben a búza, a rozs és a kukorica a legfontosabb, északabbra az árpa és a zab, a melegebb égövben a rizs és a köles. A búza ősidők óta ismert, az egyiptomiak már 7000 évvel ezelőtt termesztették, a magvakat lisztté őrölték, a lisztből vízzel tésztát készítettek, amit megsütöttek. A lisztet vízzel keverve kovászt nyertek, amellyel a tésztát kelesztették. Egyiptomból való menekülésük alkalmával a zsidó törzsek nem vittek magukkal kovászt, innen ered a kovásztalan kenyér (pászka, macesz) hagyománya. A rizs az emberiség felének a tápláléka, különösen a rendkívül népes keleti országokban (Kína, Japán, India). A kukorica csak 1493-ban került át Európába, ahová Kolumbusz hozta Amerikából. Napjainkban a kenyérféléken kívül a sütőipari termékek rendkívül változatos sokasága készül szerte a világon.
Gabonatárolás Míg a gabonatermesztés, aratás, cséplés mezőgazdasági tevékenység, a gabonatárolás inkább élelmiszer-ipari feladat, amelynek mikrobiológiai vonatkozása jelentős. A gabonanövény a szántóföldön szennyeződhet a talajból, a széllel, porral, rovarokkal és más közvetítőkkel. A kórokozók, elsősorban gombák, súlyos termésveszteséget okoznak. Egyes helyeken, kritikus időjárási körülmények között a termés harmada is veszendőbe mehet. Maguk a magvak is hordoznak mikroorganizmusokat. A felületi mikrobaszám az éréssel fokozódik. Májusban a sejtszám csak 103/g, júliusban már eléri a 106–108/g-ot, a többsége penészgomba. A termőhelyi gombafélék igen változatosak, a Fusariumok számtalan faján (F. culmorum, F. graminearum, F. avenaceum stb.) kívül Cladosporium, Alternaria, 259
Termékek mikrobiológiája, romlása Verticillium, Epicoccum, Monilia és más nemzetségek fajai fordulnak elő. A gombafélék az aratás, szárítás, tárolás folyamán a vízaktivitás csökkenése miatt jórészt elpusztulnak. A tárolt gabonaszemeken az ún. raktári penészek (a Penicillium és az Aspergillus fajok, különösen a xerotoleráns A. glaucus csoport tagjai) veszik át az uralmat. Ezek a búza 80%-án, a kukorica 15–30%-án megtalálhatók. Baktériumok a frissen csépelt szemeken 104–106 nagyságrendben találhatók, gyakoriak a Flavobacterium, Pseudomonas, Brevibacterium, Bacillus, Enterobacter fajok. A gabonatárolás meghatározó tényezője a nedvességtartalom. Magyarországon a gabona betakarítását 17–18% nedvességtartalom-értéknél szokták megkezdeni, ami mintegy 60–65% relatív nedvességtartalmat jelent. A tárolókba, silókba tárolt gabona nedvességtartalmát rendszeres szellőztetéssel 6–8 nap alatt 12–15%-ra kell csökkenteni. Az így tárolt gabonán már nem szaporodnak baktériumok. A tárolt szemekben azonban folytatódik a légzés, ennek következtében víz képződik, és növekszik a hőmérséklet. Ezért a tárolás alatt további szellőztetést, átforgatást kell végezni. A hőmérséklettől, a levegő relatív nedvességtartalmától és a gabonafélétől függően változik az a biztonságos nedvességtartalom, ami megvédi a szemeket a csírázástól, a rovaroktól és a mikroorganizmusok elszaporodásától. Ha a gabonán megtelepednek a gombák, akkor anyagcseréjükből víz képződik, ami helyileg növeli a vízaktivitást, és utat nyit a további romlásnak. A silókban átmenetileg fellépő hőmérséklet-különbség is problémát okozhat, pl. a napsütötte oldalon az ERP csökken, ezért a hidegebb helyekről a nedvesség oda vándorol és vízaktivitás-növekedést okoz. Mind étkezési, mind takarmányozási szempontból a gabonaszemek mikotoxin-szennyezettsége a legnagyobb veszély, mert a méreg az őrléssel átkerül a lisztbe. Mint azt másutt tárgyaltuk (4.3.), az aflatoxin fő termelői az A. flavus és az A. parasiticus, a zearalenont főként Fusarium fajok képezik; ezeken kívül más mikotoxinok is előfordulnak. A középkorban tömeges megbetegedést okozott a rozson elszaporodott Claviceps purpurea gomba („anyarozs”) mérgező alkaloidja, ami ma fontos gyógyszer alapanyag, előállításához a rozsot mesterségesen fertőzik.
Malomipari termékek A malomipar főterméke a liszt, azonban hántolással és őrléssel sok más malomipari termék is készül és a keveréktakarmány-gyártás is az ipar fontos ágazata. Őrléshez a gabonát kissé nedvesítik, néhány óráig kondicionálják, ami a mikrobaszámot lényegesen nem növeli. A búza- és rozsszemeket borító héjat az őrlés során eltávolítják, ez csökkenti a mikrobaszámot. A pelyvával borított magvakat (pl. zab, rizs, köles stb.) hántolják, a rizsszemeket ezután gőzzel, burgonyakeményítővagy cukorszörppel fényezik. Az árpa kemény héját csiszolással távolítják el. A kiőrlés fokától, a szeparálás, szitálás mértékétől függően a lisztbe a magok eredeti szennyezettségének csak 1–20%-a kerül. A lisztek mikrobaszáma 103–105 nagyságrendű, a penészgombaszám eléri a 103-at, a baktériumspóráké 101–102/g. A durvább őrlésű dara, korpa a terméshéj nagyobb hányadát tartalmazza. A búzaliszt 65–95% keményítőt és jelentős mennyiségű (10–14%) fehérjét tartalmaz, ezek többsége alkotja a sikért, ami a lisztből készült tészta minőségét meghatározza. A liszt víztartalma nem lehet több 13–15%-nál, így hosszú ideig raktározható. A tároláskor fellépő romlási jelenségek a penészedés, az avasodás, a dohosodás. A keveréktakarmányok alapanyagai a kukoricából, árpából, szójából vagy más szemesterményből, olajosmagvakból készült darák, amelyekhez különböző adalékokat (aminosavakat, vitaminokat) kevernek a táp felhasználása szerint. Fehérjedúsításra sörélesztőt, állati eredetű összetevőket (vér, húsliszt, tolliszt, halliszt) használnak, ezek mikrobiológiai minősége kritikus lehet. A szemcsézés (pelletálás) és bizonyos mértékű hőkezelés javítja a mikrobiológiai állapotot. 260
Termékek mikrobiológiája, romlása
Sütő- és tésztaipari termékek A kenyér és a száraztészta jellemző, sok változatban készülő termék. Rajtuk kívül a sütőipar az egyéb termékek széles választékát állítja elő a péksüteményektől a kekszekig és a töltelékes süteményekig. Mind a kenyér, mind az egyéb termékek tésztája lényegében azonos módon készül: a lisztet vízzel és különböző adalékokkal kikeverik. A termékektől függően azonban mind a felhasznált liszt minősége, mind az adalékok különbözők és más-más a gyúrás, a dagasztás, a formázás művelete is. A kenyértésztát kelesztik, a száraztésztát nem, az adalékok közt tojás, tej, só, olaj, zsír, keményítő, cukor szerepelhet. A kelesztést sütőélesztő vagy kovász hozzáadásával végzik. A dagasztás során a sikér fehérjéi (főleg a hosszú láncmolekulájú glutenin és gliadin) szövedékké állnak össze, aminek hálószerkezete magába zárja a kelesztéskor képződő gázokat, döntő részben az élesztők termelte CO2-ot. Mikrobiológiai szempontból lényeges különbség van az élesztős és a kovászos tészták közt. A sütőélesztő a S. cerevisiae olyan változata, amely mind az élesztőgyártás, mind a kelesztés körülményeihez jól alkalmazkodott. Míg az élesztőgyártáskor a szaporításhoz döntő részben aerob körülményeket alkalmaznak, a kelesztéskor az élesztő anaerob erjesztésére van szükség, aminek során a CO2-on kívül etil-alkohol és kismértékben szerves savak és észterek képződnek. A kelesztés 3–16 óráig tarthat, az adalékokkal elősegített gyorskelesztés 1 órát sem vesz igénybe. A hagyományos kovászos kelesztéshez erjesztett kovászt használnak, amelyben az élesztőn kívül a tejsavbaktériumok is nagymértékben elszaporodnak. A kovász 105–106/g élesztőszámát a tejsavbaktériumok meghaladják, számuk elérheti a 108–1010/g mértéket. A kovászból 10–15-féle Lactobacillus, Leuconostoc és Pediococcus fajt mutattak ki; egyes biotermékek készítéséhez probiotikus tulajdonságú fajokat is adnak (lásd 6.2). A kovászos kelesztésű kenyér savanyúbb ízű, pH-ja 3,5–4,8, ezért tartósabb, mint az élesztős, amelynek pH-ja 5,4–6,0. A kenyeret a sütés, amelynek hőfokát 40 °C-ról 260 °C-ra növelik, tartósítja. Az élesztős gáztermelés 40 °C felett megszűnik, 50 °C felett az élesztők elpusztulnak, 60–80 °C között a fehérjék denaturálódnak, a keményítő vízfelvétellel csirizesedik, a tészta egésze megszilárdul, 80–100 °C-on a bél víztartalma csökkenni kezd, míg végül csak 30–40% marad. 100 °C felett a fehérjék és szénhidrátok közti Maillard-reakció és a cukrok karamellizálódása következtében létre jönnek a héj barna színanyagai. A kenyérbél nagyobb víztartalmával szemben a héj csak 16% nedvességet tartalmaz, ez nagyrészt védelmet nyújt a penészedés ellen. A szeletelt és csomagolt kenyéren azonban a penészek már könnyebben elszaporodnak, gyakran kifejlődnek a Penicilliumok kékeszöld vagy az Aspergillus és a Cladosporium feketés telepei, nagyobb páratartalom esetén még a Mucor és a Rhizopus szövedéke is kialakulhat. Sütéskor a kenyér belsejében a hőmérséklet nem haladja meg a 100 °C-ot és a baktériumspórák élve maradhatnak, azonban a 0,94–0,97 aw-nek megfelelő víztartalom mellett többnyire nem tudnak kicsírázni. Ha ez mégis előfordul, a B. licheniformis, B. pumilus, B. megaterium és más fajok nyúlósodást okoznak. A tartós kenyerek eltarthatóságát propionsav, szorbinsav vagy ecetsav hozzáadásával lehet elősegíteni. A száraztésztákhoz használt liszt sikértartalma általában nagyobb, keményítőtartalma kisebb (ún. durumliszt), a tészta készülhet tojással vagy anélkül. A tésztát kelesztés nélkül gyúrják, nyújtják, préselik, formázzák, majd tálcás vagy kamrás berendezésekben szárítják. 16–36 órás szárítás alatt a nedvességtartalom 25–30%ról 10–12%-ra csökken, az ennek megfelelő vízaktivitás a tartósság szempontjából megfelelő. Tojással (különösen tojáslével) készült tésztákban előfordulhat Sta. aureus, amely 0,86 aw-értékig szaporodni képes. Az egyéb sütőipari termékek általában csak korlátozott ideig eltarthatók. A fagyasztott, mélyhűtött tészták főként sütemények alapanyagai. A töltött sütemények vagy különböző magvakkal ízesített pékáruk mikrobiológiai romlása gyakoribb. Nagyobb nedvességtartalomnál (aw > 0,95) B. cereus, Sta. aureus vagy E. coli okozta élelmiszer-mérgezés, illetve fertőzés is előfordul; az ilyen megbetegedéseket gyakran a krémmel töltött sütemények okozzák.
261
Termékek mikrobiológiája, romlása
Cukor- és édesipari termékek Közös jellemzőjük, hogy több-kevesebb cukrot tartalmaznak, szárazanyag-tartalmuk nagy, ennek megfelelően eltarthatóságukat a kis vízaktivitás biztosítja. A cukoripar főterméke a cukor, az édesipari termékek változatos körébe a csokoládé, cukorkák, lisztesáruk tartoznak.
Cukorgyártás Európában, így hazánkban is, a cukorgyártás alapanyaga a cukorrépa, a Föld melegebb égövein a cukornád. Az érett cukorrépa átlagosan 17% cukrot (nagyrészt szacharózt) tartalmaz. A gyárba érkező cukorrépát vízzel szállítják (úsztatják) a mosógéphez, ez a vizes mosás a földszennyezést jórészt eltávolítja. A répát szeletelik, a szeletekből a cukrot ellenáramú, 65–70 °C-os vízzel kilúgozzák, e diffúzió eredménye a nyerslé, ami a cukron kívül még sok szerves és szervetlen anyagot tartalmaz. A létisztítás során mésztejjel és szén-dioxiddal a fehérjéket, pektint, szervetlen sókat 100 °C feletti hőmérsékleten kicsapják, majd kiszűrik. Az így nyert híglé 85%-a víz, belőle a cukrot többszörös bepárlással, illetve vákuum alatt sűrítik, főzik. A sűrűlét kristályosítják, a cukorkristályokat centrifugálással elválasztják. A visszamaradó szirup, a melasz, még több mint 48% cukrot tartalmaz, ennek kinyerése azonban nem gazdaságos. A cukrot átkristályosítással finomítják és a végterméket különböző alakban (kristály, por, kocka) forgalmazzák. Mint a gyártásfolyamat vázlatából kitűnik, az eredetileg rendkívül szennyezett cukorrépából a létisztító és bepárló műveletek révén végül nagy mikrobiológiai tisztaságú, a romlástól védett termék készül. Ez azonban nem teljesen mentes mikroorganizmusoktól, amelyek a cukorral az egyéb élelmiszerekbe jutva azok romlását okozhatják. A kristálycukor 10 grammjának összes mikrobaszáma legfeljebb 1,5 · 102 lehet. Ezek jó része talaj eredetű baktériumspóra, amelyek túlélték a gyártási műveleteket. Köztük különösen a termofil spórások jelentenek romlásveszélyt, mint a B. sporothermodurans, a Geobacillus stearothermophilus és a Thermoanaerobacterium (korábban Clostridium) thermosaccharolyticum. Ezek 55 °C felett szaporodnak, hőtűrésük 2–3 min D121 értéket is elér. Zöldségkonzervek és üdítőitalok romlását okozhatják.
Édesipari termékek A csokoládé, a cukorkák és a lisztesáruk (keksz, ostya, teasütemények) a jellemző termékfajták. A csokoládé alapanyaga a kakaópor, amelynek előállításában mikrobiológiai erjedés is szerepet játszik. A trópusi országokban termő kakaófa babtermését ugyanis több napig erjesztik a húsától elválasztva, ami a későbbi termék íz- és aromakialakulásához hozzájárul. A magot pörkölik, a héjat, csírát eltávolítják, a magbelsőt megőrlik, ebből préselik a kakaóvajat, míg a visszamaradó pogácsát, amely még 10–24% vajat tartalmaz, kiszárítva porrá őrlik. A kakaóporból készülnek cukor, tej és más adalékok hozzákeverésével a különböző csokoládék. A csokoládés termékekben mind a Sta. aureus, mind a szalmonellák hosszú ideig életben maradnak, bár nem szaporodnak. A kis vízaktivitás és a zsír védőhatása növeli a hőrezisztenciájukat, viszont így a sztafilokokkusz nem termel toxint. A keménycukorkák vízaktivitása olyan kicsi, hogy mikrobiológiailag tartósak, bár a töltelékes cukorkáknál felléphet romlás. A 8–12% víztartalmú fondant-ok, köztük a szaloncukor, valamint a 20% víztartalmú zselés cukrok hosszabb tárolás alatt megpenészedhetnek. A mandulával készült marcipánok tartósak, mivel 262
Termékek mikrobiológiája, romlása víztartalmuk 18%-nál kisebb. A lisztes készítmények (kekszek, ostyák) tartósságát ugyancsak a kis vízaktivitás biztosítja, a teasütemények és mézes sütemények jó része is, a töltelékek és ízesítőanyagok ellenére több hónapig eltartható. Mikrobiológiai biztonság szempontjából kiemelt figyelmet kell szentelni a tojással készült termékeknek, különösen a krémmel, tejszínnel ízesített cukrászsüteményeknek. Ezeket a rövid eltarthatósági idő alatt is hűtve kell tárolni. Az eltarthatósági időn túl fogyasztott krémesek, torták számos fertőzés, mérgezés kiváltói voltak, többnyire a Sa. enterica, illetve a Sta. aureus elszaporodása miatt.
Méz A méz antimikrobás tulajdonságát több tényezőnek köszönheti. Mindenekelőtt cukortartalma olyan nagy (> 80%), következésképp vízaktivitása olyan kicsi (< 0,6), hogy a mikroorganizmusok túlnyomó többsége nem tud benne szaporodni. Ehhez járul 3,2–4,5 közötti pH-ja, a glükózoxidáz-termelte H2O2, továbbá a növények virágjából belekerült flavonoidok, fenolok, szerves savak. Vonatkozik ez a gátlás csaknem minden baktériumra, különösen pedig az élelmiszer-fertőzést vagy mérgezést okozókra. Baktériumspórák életben maradhatnak a mézben, de nem csírázhatnak ki. Kivételesen, ha a méz víztartalma meghaladja a 17%-ot és tárolási hőmérséklete több mint 11 °C, élesztőgombák erjedést okozhatnak. A mézben előforduló Cl. botulinum spórák a csecsemőkben toxikoinfekciót okozhatnak, mivel kihajtásukat a még fejletlen bélmikrobiota nem gátolja.
Ízesítők, fűszerek E pontban két különböző termékcsoportot foglalunk össze, amelyek mikrobiológiai jellemzői lényegesen eltérnek. Az ételízesítők (mustár, kechup, majonéz, paprikakrémek stb.) mikrobiológiai tartóssága elsősorban ecetsavtartalmuknak, kis pH-juknak köszönhető, amit tartósítószerrel vagy enyhe hőkezeléssel fokozhatnak. A fűszerek többnyire szárított növényi részek (levelek, virágok, termések stb.), amiket kis vízaktivitásuk tartósít. A majonéz tojástartalma miatt mikrobiológiai veszélyt jelenthet. A tojással (tojáslével) bevitt enterális kórokozók túlélése azonban a kis pH-jú termékben csak rövid idejű lehet. A majonéz általában 1,5% ecetsavat tartalmaz, ami 4 körüli pH-t állít be. A kórokozók közül a Li. monocytogenes és a Sa. enterica képes lehet ezek elviselésére. A mustár, a tormakrém (majonézes torma) növényi mikrobagátló anyagokat tartalmaz, amelyek számos fűszerben is megtalálhatók. Ezekben az ízesítő készítményekben többnyire csak a tejsavbaktériumok és az élesztőgombák okoznak romlást. Ez utóbbiak közül a tartósítószert tűrő Zygosaccharomyces bailii gyakori. A fűszerek illat- és ízanyagokat tartalmazó növényi részek (magvak, termések, virágok, levelek, gyökér, héj), amelyek kis mennyiségben is növelik az élelmiszer élvezeti értékét. Számos fűszer antimikrobás hatású vegyületeket tartalmaz, amelyeket gyűjtőnéven fitoncidoknak szokás nevezni (8.7. táblázat). Ezek kémiailag igen sokfélék, gyakran illóolajok, terpének, glikozidok stb. Mikrobiológiai tekintetben is lehetnek általános mikrobagátlók (pl. benzoesav a fahéjban, szegfűszegben, ánizsban, allicin a fokhagymában) vagy csak baktériumok, illetve gombák ellen hatásosak (pl. az eugenol bakterioszatikus, a mustárolaj élesztőgombák ellen hat). A fűszerek kifejezett íze, illata miatt azonban csak olyan kis mennyiségben adhatók az élelmiszerekhez, hogy mikrobaellenes hatásuk nem számottevő.
8.7. táblázat - Fűszerek antimikrobás hatóanyagainak néhány példája Fűszer
Hatóanyag 263
Termékek mikrobiológiája, romlása Bors
piperin, citrál
Fahéj
cinnamon-aldehid, citrál, eugenol
Fokhagyma
allicin, akrolein
Fűszerpaprika
kapszaicin, kapszidin
Kömény
karvon, terpinén
Szegfűszeg
benzoesav, eugenol, szegfűolaj
Vöröshagyma
allilolaj, feniletil-olaj
A kedvező mikrobiológiai hatékonysággal szemben a fűszerek mikrobás szennyezettsége komoly romlási, sőt fertőzési forrást képez. Ez különösen a trópusi országokból származó fűszerekre (pl. bors, fahéj, szerecsendió) vonatkozik, amelyek előállításának higiéniai körülményei nagyon kedvezőtlenek lehetnek. (Az import feketebors-őrlemény hazánkban is okozott szalmonellás fertőzést.) A fűszerek, bár általában szárítmányok (víztartalmuk 5–10%), maradék mikrobaszáma igen jelentős és mind baktériumos, mind penészgombás szennyezettséget hordoznak (a baktériumszám általában 103–107/g, a penészgombaszám 102–105/g). Sajnálatos módon a hazai fűszerek mikrobás szennyezettsége sem lényegesen kisebb, ami a fűszernövény termesztésének és a termék előállításának körülményeiből következik. A hagymát, pl. a termőhelyen növénykórókozó baktériumok és penészgombák támadják meg, a fűszerpaprikán a szárítás folyamán penészgombák szaporodnak el. A mosás, kondícionálás nem csökkenti lényegesen a mikrobás szennyezettséget. Sok penészgomba veszélyes mikotoxinokat termel, amelyek megengedett határértékét igen kis értékben szabályozzák (pl. aflatoxin 5 μg/kg).
Növényolaj, margarin Sok növény terméséből vagy magvából (olívabogyó, pálma, szezám, földimogyoró) préselnek olajat, nálunk a napraforgó és a repce számottevő. A növényi olajok mikrobiológiailag nem jelentenek problémát. A keményített (hidrogénezett) olajokból vízzel, tejjel, alapos gyúrással, emulgeátorok és más adalékok (színezék, só, vitaminok) hozzáadásával a vajhoz hasonló „víz a zsírban” emulziót készítenek, ez a margarin. A néhány μm átmérőjű vízcseppek igen finom diszperz rendszert alkotnak az olajjal, ez, valamint a vízfázis kis tápanyagtartalma és kis pH-ja, sókoncentrációja, ami 8%-ot is elér a vízfázisban, korlátozza a mikrobatevékenységet. A tartósítószerek vagy pasztőrözés további gátat képeznek. Ennek ellenére romlás előfordul, ami egyrészt lipolitikus baktériumoknak (Pseudomonas, Flavobacterium), másrészt penészgombáknak tulajdonítható. A P. expansum a leggyakrabban előforduló penészgomba, ami nemcsak látható tenyészetet képez, hanem érzékszervi romlást is okoz, földszagú geozmin termelésével.
Kávé, tea Ezeknek a termékeknek a nagyon kis víztartalma (aw=0,4–0,6) mikrobiológiailag biztonságos. A belőlük készült italok is forró vízzel, főzéssel készülnek, ami a szárítmányokon maradt mikroorganizmusok nagy részét, a spórátlan kórokozó baktériumokat elpusztítja. A nyers termékek feldolgozásában viszont közrejátszanak mikrobiológiai folyamatok. 264
Termékek mikrobiológiája, romlása A zöld tea kivételével, amelyet csak fonnyasztanak, a többi teaféleség „erjesztéssel” készül. Ez valójában oxidáció, amelynek során a vékony rétegben szétterített tealeveleket gyakran forgatják, és részlegesen szárítják, eközben antimikrobás hatású polifenolok (katechin, teaflavin) képződnek. A végleges szárítást 80–100 °Cos forró levegővel vagy 130–250 °C-ra hevített serpenyőkben végzik, elkerülve a tealevelek megpörkölését. A teafüvek maradék mikrobaszáma általában 103– 104/g vagy kevesebb. A gyógyteák nem teanövényből, hanem különböző más növények (pl. kamilla, menta, narancs) virágjából, leveléből, terméséből készülnek. A begyűjtés, szárítás, aprítás higiéniai körülményei szerint mikrobás szennyezettségük milliós-tízmilliós nagyságrendű is lehet, amelyben sok spórás baktérium fordul elő, de Salmonella vagy más kórokozó általában nem. A kávénövény több fajtájának magvaiból készül az ital. A magok húsos, nyálkás termésben érnek, amitől szárítással, gyakrabban erjesztéssel szabadulnak meg. Az erjesztésben vegyes összetételű, jobbára pektinbontó aktivitású mikrobaközösség vesz részt. A spontán erjedési folyamat olykor érzékszervi hibát okoz. A mosott, szárított kávébabokat pörkölik, őrlik, osztályozzák, csomagolják. A kávébab tannin- és koffeintartalma mikrobagátló, de a mikrobiológiai biztonságot a pörkölés és a termék kis víztartalma (< 12%) határozza meg.
Palackozott vizek A palackozott vizek élelmiszernek számítanak. Eredetük és összetételük szerint az előírások különböző kategóriákba sorolják őket, megkülönböztetve a természetes ásványvizeket, a forrásvizeket, az ivóvizeket és az ásványi anyagokkal dúsított ivóvizeket. A vizeket legtöbbször szén-dioxiddal dúsítják. A palackozott ivóvíz főbb típusai és jellemzőik a következők: Forrásvíz: jóváhagyott föld alatti forrásból nyert víz, amelynek oldott ásványianyag-tartalma < 500 mg/l; a nemkívánatos kémiai és mikrobiológiai szennyeződések eltávolítása céljából kezelhető. Ásványvíz: jóváhagyott föld alatti forrásból nyert víz, amelynek oldott ásványianyag-tartalma > 1000 mg/l. Európában a nemkívánatos kémiai és mikrobiológiai szennyeződések eltávolítása céljából kezelhető. Természetes víz (forrásvíz, ásványvíz): föld alatti forrásból nyert, eredeti mikrobiológiai tisztaságú víz, ami fizikai szűrésen, vaseltávolításon kívül más kezelésen nem esett át. Az eredeti ásványi összetételt megváltoztató kezelés nem alkalmazható. Természetes, szén-dioxid-tartalmú ásványvíz: természetes ásványvíz, ami megfelelő kezelés és palackozás után az eredeti ásványvízzel azonos mennyiségű széndioxidot tartalmaz. Szén-dioxiddal dúsított ásványvíz: természetes ásványvíz, ami megfelelő kezelés és palackozás után külső forrásból hozzáadott szén-dioxidot tartalmaz. A legtöbb élelmiszerhez hasonlóan az ivóvíz sem steril. A palackozott vízben a természetben előforduló mikroorganizmusokon kívül a technológiai folyamatban bekerült mikroorganizmusokat találunk. A víz eredeti (elsődleges, autochton) mikrobaszáma függ a forrástól, a rétegektől, amelyeken keresztül a felszínre jut, az ásványianyag- és oxigéntartalomtól. A természetes vizek mikrobaszáma általában kevesebb, mint 103/cm3. A víz mikroorganizmusai általában aerobok és pszichrotrófok, jellemzőjük, hogy a szaporodáshoz kevés nitrogént és más szerves anyagot igényelnek. Köztük sokféle baktérium található, főleg Gram-negatív nemzetségek tagjai, mint az enterobaktériumok, a pszeudomonászok, a flavobaktériumok, az Alcaligenes és az Acinetobacter fajok, a Gram-pozitívok [főleg kokkusz alakúak (Micrococcus, 265
Termékek mikrobiológiája, romlása Staphylococcus, Enterococcus)], továbbá korineform és spórás baktériumok. Ha szennyeződés nem éri a vizeket, kórokozóktól mentesek. A fekáliás eredetű szennyeződés, amelyben baktériumokat, vírusokat és parazitákat egyaránt izoláltak, a megbetegedések leggyakoribb okozója az ivóvízben (8.8. táblázat).
8.8. táblázat - Ivóvíz eredetű humán megbetegedések kórokozói Baktériumok
Vírusok
Protozoonok
Aeromonas spp.
adenovírus
Cryptosporidium parvum
Campylobacter jejuni
enterovírusok
Entamoeba histolytica
Patogén E. coli
hepatitis A
Giardia intestinalis
Legionella spp.
non-A, non-B hepatitis vírusok,
Pseudomonas aeruginosa
hepatitis E
Salmonella Typhi
Norwalk vírus
Más szalmonellák
Rotavírus
Shigella spp. Vibrio cholerae Yersinia enterocolitica Ha a természetes mikrobaszám eléri, vagy meghaladja a 105/cm3-t, a víz csak csírátlanítás után palackozható, ami lehetséges szűréssel, UV-besugárzással, vagy ózonos kezeléssel. A palackozott víz az üzemi berendezésektől (szűrők, tartályok, vezetékek, szaturálók) is szennyeződhet, amelyek belső felületén kialakuló biofilm jelentős szennyezési forrás lehet. A csővezetékekben és tartályokban a Ps. aeruginosa kolonizációja és biofilmképzése a leggyakoribb szennyezési forrás. A víz palackozása után mind az eredeti, mind a szennyező mikroorganizmusok szaporodása tapasztalható (104–106 tke/ml). A palackozásnál a mikrobák szaporodását elősegítik a palack felszínére tapadt szerves anyagok, valamint az oldott oxigéntartalom növekedése a töltésnél. A későbbiekben a sejtszám változóan növekszik és csökken; tápanyagul az elhalt sejtek szolgálnak és az új nemzedékek többnyire más fajba tartoznak. A palackozott víz tárolása során számolni kell a baktériumok túlélésével. Mesterséges oltásos kísérletekkel bizonyították, hogy az Aeromonas hydrophila 60 napig túlél 22 °C-on tárolt vízben. Más baktériumok (E. coli, Lactobacillus, Flavobacterium, Ps. aeruginosa) a vízben elősegíthetik a patogének túlélését is. Az ásványvíz 3–5% széndioxiddal történő dúsítása a legtöbb baktériumra pusztító hatású. A pH-csökkenés (4–5% CO2 mellett a pH mintegy 3,3-ra csökken; ez és a széndioxid maga a szalmonellák, sztafilokokkuszok, vibriók és más patogén baktériumok pusztulását eredményezi órákon belül. Bár a széndioxid-adagolás hatékonyan elpusztítja a vízben lévő kórokozó baktériumokat, semmiképpen nem használható a higiéniai hiányosságok elfedésére, fertőtlenítésre. 266
Termékek mikrobiológiája, romlása Az előírások szerint a palackozott vizek megengedett mezofil aerob baktériumszáma cm3-enként 20, pszichrotróf baktériumszáma 100 lehet (22, illetve 37 °C-os tenyésztés után), koliform baktériumokat, enterokokkuszokat, Ps. aeruginosát, E. colit vagy más kórokozókat a víz 250 cm3-ben, szulfitredukáló spórás anaerobokat 50 cm3-ben nem tartalmazhat. A frissen palackozott vízhez képest a mikrobaszám növekedhet, a tápanyagszegénység ellenére is, ezért célszerű a palackokat fénytől védve és hűtve tárolni.
Tartósított termékek E címszó alatt az élelmiszerek két nagy csoportját: a hőkezeléssel tartósított konzerveket és a fagyasztással tartósított gyorsfagyasztott termékeket tárgyaljuk. Mindkét csoport összetételét és felhasználási módját tekintve sokféle terméket foglal magába, a nyers-, félkész- és készételeket, a hús-, gyümölcs-, zöldségalapú és tésztás készítményeket egyaránt; a konzervipar profiljába tartoznak vegyszeresen és/vagy erjesztéssel tartósított termékek, félkonzervek is, a gyorsfagyasztott termékek között pedig megtaláljuk az édesipar profiljába illő süteményeket, tortákat, jégkrémet és a fagylaltot is. Ezeknek megfelelően az egyes termékek mikrobiológiai tulajdonságai nagyon eltérnek. Általában megállapítható, hogy a kellően hőkezelt, dobozba, üvegbe zárt termék a csomagolás felbontásáig gyakorlatilag tartós, illetve a fagyasztott termék kellően kis hőfokon tárolva a felengedtetésig tartós.
Teljes konzervek A hőkezelés a mikroorganizmusok elpusztításának legbiztosabb módszere. A sterilezett, az utószennyeződés elkerülésére légmentesen tartályba zárt élelmiszerek gyakorlatilag korlátlan ideig tartósnak tekinthetők. Az eljárást appertizációnak is szokás nevezni, mivel alapjait az 1800-as évek elején a francia Nicholas Appert vetette meg, aki üvegbe töltött, lezárt élelmiszert forrásban lévő vízben tartósított. A teljes konzervek mikrobiológiai romlás nélkül évekig eltarthatók. Nem tekinthetők azonban abszolút sterilnek, mivel nem teljesen mentesek minden életképes mikroorganizmustól. Nem is cél az abszolút sterilitás elérése, a gyakorlatban a kereskedelmi sterilitásra törekszenek az élelmiszer-előállítók. Ez azt jelenti, hogy a termékben előfordulhatnak túlélő mikroorganizmusok, amelyek laboratóriumi körülmények között kitenyészthetők, a konzervben azonban nem képesek szaporodni. Ennek oka, hogy megnő a hőkezelést túlélt, esetleg sérült mikroorganizmusok igénye a regenerálódást és szaporodást lehetővé tevő környezeti tényezőkkel szemben, a konzervben uralkodó mikroökológiai tényezők (pH, av, Eh, összetétel stb.), valamint a tárolási hőmérséklet nem kedvez a szaporodásuknak. A mikrobiológiailag stabil konzerv csak nyugvó (dormans) állapotú baktérium endospórákat tartalmazhat. Átlagosan megengedett határérték 100 spóra/g élelmiszer. Vegetatív baktériumsejt vagy élesztőgomba a kereskedelmileg steril konzervben nem maradhat. A szükséges hőkezelés mértékét a termék típusa és a benne várhatóan előforduló, legellenállóbb mikroorganizmus hőtűrése szerint kell méretezni. Amint azt az 5.1. fejezetben tárgyaltuk, az általános tartósítóipari gyakorlat szerint a 4,5-nél nagyobb pH-jú termékek minimális hőterhelését a Cl. botulinum spórák 12 nagyságrendnyi elpusztításához kell méretezni. Az ilyen termékekben (főzelékek, hús- és halkonzervek) azonban számolni kell a Cl. botulinumnál jóval hőtűrőbb fajok előfordulásával és túlélésével. A 4,5-nél kisebb pH-jú konzervipari termékek (egyes főzelékek, paradicsomos termékek, gyümölcskonzervek, savanyúságok) mikrobiológiai stabilitása a botulinumfőzésnél lényegesen kisebb hőkezeléssel, pasztőrözéssel is biztosítható.
267
Termékek mikrobiológiája, romlása A hőkezelés eredményességét a nyersanyag mikrobiológiai állapota és az egyes technológiai szakaszok egyaránt befolyásolják. Különösen veszélyesek azok a gyártási szakaszok, ahol a termékben a mikroorganizmusok (hőellenálló spórások) elszaporodhatnak. Amennyiben a termék mikrobaszáma a hőkezelés előtt technológiai hiba (pl. hosszú állásidő) vagy higiéniai hiányosság következtében lényegesen megnő, a normális körülményekre méretezett hőterhelés nem elegendő. A konzervek mikrobiológiai romlásának fő okaiként az elégtelen hőkezelést és az utófertőződést szokták azonosítani. A 8.9. táblázat összefoglalóan mutatja az egyes termékcsoportokban előforduló, fontosabb, romlást okozó spórás baktériumokat, valamint a romlás jellegét. Az elégtelen hőkezelés okozta romlás mikrobiológiai képére jellemző, hogy a romlott konzervben többnyire egyféle, általában spórás baktériumot lehet találni. A gyengén savas élelmiszerekre a legnagyobb romlási veszélyt a leghőellenállóbb termofil spórások jelentik. A termofil aerob vagy anaerob spórások hőtűrése nagyságrenddel nagyobb lehet, mint a mezofiloké (a spórás baktériumok hőtűrési adatait összevethetjük az 5.4. táblázat segítségével). A túlélő spórák kicsírázásával csak nagy melegben, 45–50 °C-on kell számolni, ami hazai körülmények között nyári melegben napon tárolt terméknél vagy trópusi exportnál egyaránt előfordulhat. Különösen veszélyes a segédanyagok (pl. a zöldségkonzervek felöntőlevéhez használt cukor, a húskonzervekhez, készételekhez használt fűszerek) nagy termofil spórás szennyezettsége, vagy termofil mikroorganizmusok feldúsulása a gyártóvonalon. A húskonzervek mikrobiológiájával részletesen foglalkozunk a 8.1.5.4. fejezetben.
8.9. táblázat - A konzervekben előforduló fontosabb spórás baktériumok és az általuk okozott romlás jellege Termékcsoport és tipikus mikroorganizmus
Romlás jellege
Gyengén savas (pH > 4,5) élelmiszerek Termofil aerob Geob. stearothermophilus
nagy szénhidráttartalmú zöldségkonzervek (kukorica, zöldborsó), készételek
Termofil anaerobok
gázos savanyodás, kénhidrogénképzés, feketedés, záptojás szag
Cl. thermosaccharolyticum Desulfotomaculum nigrificans Mezofil aerobok B. licheniformis
sima savanyodás (pH csökken, gázképzés nincs), idegen illat, zavarosodás
főzelékek, húskonzervek, tejkonzerv
sima savanyodás, tej kicsapódás
zöldségkonzervek, hús- és halkonzervek
erős gázképzés, rothadt szag, pH gyakran nő
B. subtilis B. cereus B. megaterium Mezofil anaerobok Cl. sporogenes
268
Termékek mikrobiológiája, romlása Cl. botulinum A és B típus Cl. perfringens Savas (pH<4,5) élelmiszerek Termotoleráns aerob
zöldségek, paradicsomos termékek sima savanyodás, idegen illat, zavarosodás
B. coagulans Mezofil aerobok
zöldségek, paradicsomos termékek gázos savanyodás
B. polymyxa B. macerans Mezofil anaerobok Cl. butyricum
paradicsom- és gyümölcskonzervek
gázos rothadás, vajsavas erjedés
Cl. pasteurianum Összefoglalóan megállapítható, hogy egészségügyi veszélyt a hús- és a zöldségkonzervekben egyaránt a Cl. botulinum spórák túlélése okoz. Utószennyeződés következhet be, ha a csomagolóanyag vagy a zárás nem megfelelő. Az üvegekben és dobozokban a hőkezelést követő lehűtéskor vákuum keletkezik. Ha a zárás hibás, beszivároghat a hűtővíz, ami mikrobás szennyeződést hordozhat. A hűtővíz beszívásából eredő romlásra a mikrobiota vegyes összetételéből, vegetatív baktériumok, és élesztőgombák jelenlétéből lehet következtetni. A savas konzervipari termékek jellegzetes képviselője a sűrített paradicsom. A zúzott, passzírozott levet besűrítés után többnyire dobozba töltve pasztőrözik. A készítmény mikrobiológiai minőségét a nyersanyag mikrobiológiai állapota döntően befolyásolja. A nyersanyag rossz mikrobiológiai állapota utólag még a hőkezeléssel megfelelően tartósított termékből is megállapítható a penészfonalak számából, az ún. Howard-szám meghatározásával. A készítmény kis pH-ja (4,0– 4,3) és vízaktivitása csak néhány spórás baktérium szaporodását teszi lehetővé. Köztük számolni kell a sima savanyodást okozó termofilok (B. coagulans, Cl. termosaccharolyticum), a vajsavasan erjesztő mezofil anaerobok (Cl. butyricum, Cl. pasteurianum) vagy a mezofil fakultatív anaerobok (B. macerans, B. polymyxa) túlélésével és szaporodásával. A gyümölcskonzervek, befőttek romlását főként penészgombák, kisebb mértékben élesztők és tejsavbaktériumok okozhatják. A savas készítményekben a hőtűrő penész aszkospórák (Byssochlamys fulva, Bys. nivea, valamint Neosartorya, Talaromyces, Eupenicillium fajok) túlélésével kell számolni. A dzsemek és ízek mikrobiológiai stabilitását a kis vízaktivitás és a kis pH (2,8–3,2) biztosítja. A gyümölcsből és a cukorból a termékbe kerülő mikroorganizmusok nagy része a főzés alatt elpusztul. A terméket forrón töltik a csomagolóedénybe, majd pasztőrözik. A romlást többnyire a töltésnél a levegőből a termékbe kerülő penészek, főként a nagy cukorkoncentrációt tűrő, xerotoleráns vagy ozmotoleráns P. notatum, P. roquefortii, Paecilomyces variotii, Cladosporium, Byssochlamys és Aspergillus fajok okozzák. 269
Termékek mikrobiológiája, romlása
Fél- és háromnegyed konzervek A fél- és háromnegyed kifejezés az alkalmazott hőkezelés mértékére utal. A hőkezelt, pácolt húskészítmények esetében alkalmazott tartósítás mindkét esetben alatta marad a teljes konzervek hőkezelésének. A félkonzerveknél a hőkezelési egyenérték Fo = 0,1–0,3 perc, míg a háromnegyed konzerveknél 0,6–0,8 perc. A hőkezelést az első esetben legfeljebb 85 °C külső hőmérsékleten (65–75 °C maghőmérséklet eléréséig), a második esetben 100 °C-on végzik. Az alkalmazott hőkezelés meghatározza a túlélő mikrobiota összetételét, így a termék eltarthatóságát is. A félkonzervek legfőbb képviselője a dobozolt sonka és lapocka. Az ilyen, pasztőrözött termékek 5 °C-on legfeljebb 6 hónapig tarthatók el. Az eltarthatóságot és az egészségügyi ártalmatlanságot a hőkezelés és a hűtve tárolás mellett a pácsók (nátriumnitrit és konyhasó) jelenléte adja. A nitrit a húskészítményekben fontos szerepet játszik a szín- és ízkialakítás mellett a spórák csírázása, és a baktériumszaporodás gátlásában. Antioxidáns hatása is ismert. A hőkezelés hatására a félkonzervben a nem spórás baktériumok jelentős része és a spórás baktériumok vegetatív sejtjei elpusztulnak. A túlélő sejtek károsodást szenvednek, és a konyhasó és nitrit jelenléte miatt, valamint a hűtőtárolás következtében nem képesek szaporodni, a spórák nem képesek kicsírázni. A nitritet – egészségügyi kockázata ellenére (lásd 5.5.3. fejezet) – technológiai fontossága és mikrobiológiai veszélyt megelőző szerepe miatt napjainkban is alkalmazzák a húsiparban. A dobozolt félkonzervek túlélő mikrobiotáját Bacillus és Clostridium spórák, laktobacilusok, a Micrococcus nemzetség hőtűrőbb tagjai, valamint fekál sztreptokokkuszok alkotják. Ha a tárolási hőmérséklet nem megfelelő, a Bacillus és Clostridium spórák kicsírázhatnak, romlást okozhatnak. A romlás jellege fehérjebomlás, gázképződéssel vagy anélkül. A gyakorlatban ritkán fordul elő, de egészségügyi veszélyt jelent a Cl. botulinum és a Cl. perfringens esetleges elszaporodása. Ételmérgezést okozhat a Sta. aureus elszaporodása és enterotoxinképzése is. Ez rendszerint csak akkor következik be, ha a termék hőkezelés előtti Staphylococcus-szennyezettsége nagyon nagy volt, vagy a hőkezelés nem volt kellő mértékű. A termelt toxin azonban hőrezisztens, a hőkezelt termékben sem inaktiválódik, és potenciális veszélyforrás. A termékekben túlélő, romlást okozó baktériumok közül általában még hűtött körülmények között is a hőtűrő Lactobacillus fajok és az enterokokkuszok kezdenek szaporodni, először elszíneződést, majd illat- és ízváltozást (savanyodást) okozva. Enterokokkuszok szinte mindig előfordulnak a félkonzervekben, mivel igen nagy a hőtűrésük (74–75 °C maghőmérséklet elérése esetén sem pusztulnak el) és sótűrésük is kiemelkedő. Egészségügyi megítélésük nem egységes, egyes szerzők szerint fakultatív ételmérgezést okozó fajoknak kell tekinteni az enterokokkusz csoportba tartozó baktériumokat. A háromnegyed konzervek kereskedelmileg sterilnek tekintett termékek. Jellegzetes képviselőjük a löncshús és a dobozos virsli. A félkonzervekéhez képest erősebb hőkezelés következtében a vegetatív baktériumsejteken kívül a mezofil bacilusok és néhány klosztridium elpusztulásával számolhatunk. A hőkezelés és a pácsók kombinált hatásának eredményeképpen a háromnegyed konzervek szobahőmérsékleten is 6–12 hónapig eltarthatók.
Gyorsfagyasztott termékek A főbb termékcsoportokat a 8.10. táblázat mutatja be. A nyers- és adalékanyagoktól, az összetételtől, az elkészítés módjától függően a gyorsfagyasztott termékekben mindig találhatók túlélő mikroorganizmusok, amelyek azonban a termék fagyott állapotában szaporodásra képtelenek, sőt, a fagyott tárolás alatt a túlélők száma fokozatosan csökken. Teljes sterilitás azonban nem következik be, ezért felengedtetés alatt és után a túlélő mikroorganizmusok szaporodásnak indulnak, és romlást okoznak. A romlás jegyeit még nem mutató, átmenetileg tárolt felengedett termék pedig ételfertőzés vagy -mérgezés kiváltója lehet. 270
Termékek mikrobiológiája, romlása
8.10. táblázat - A gyorsfagyasztott termékek fő típusai Gyümölcsök, zöldségek, burgonya Tészták (derelye, galuska, krokett) Félkész étel (hamburger, fasírt, roló, pizza) Készétel (leves, főzelék, húsos étel) Sütemények (rétes, palacsinta, torta) Jégkrém, fagylalt A fagyasztott termékek túlélő mikrobiotája függ a fagyasztás előtti feldolgozás módjától, továbbá a fagyasztás, a fagyott tárolás és a felengedtetés körülményeitől (5.2.3. fejezet). Zöldség- és húskészítmények, készételek sejtszáma 3–4 nagyságrenddel is csökken, ha készítésükben előfőzés, hőkezelés szerepel. Az ezt követő további feldolgozás folyamán azonban az eszközöktől, berendezésektől újra szennyeződnek, elérve vagy meghaladva a 106/g értéket is. A hosszabb gyártási időszak alatt a mikroorganizmusok alkalmazkodni tudnak és felhalmozódnak az üzemi vonalakon. A gépek belsejében, zugaiban biofilm alakul ki a tisztítás, fertőtlenítés ellenére is. Emiatt pl. az előfőzött, fagyasztott zöldségfélék mikrobiotájára jellemzők a Gram-pozitív kokkuszok (Enterococcus, Leuconostoc), valamint a pálca alakú tejsavbaktériumok. A húsos termékekben, készételekben a Gram-negatív bélbaktériumok és spórás baktériumok vannak többségben. Kórokozók (Salmonella, E. coli O:157) túlélhetnek a fagyott termékekben, de elszaporodásukra csak felengedtetés után kerülhet sor. Ez bekövetkezhet a hűtőlánc megszakadása esetén, a tárolás, szállítás során, és ilyenkor, ha a terméket újra fagyasztják, ezek a baktériumok nagy számban maradnak életben. A fagyasztott termékek romlására nem kerül sor, ha megfelelően kis (< –15 °C) hőmérsékleten tárolják őket. Csak kevés pszichrofil mikroba (néhány spórás baktérium, élesztő- és penészgomba) képes szaporodni –10 °C-nál valamivel nagyobb hőmérsékleten. Bár ilyenkor a szaporodás nagyon lassú (a generációs idő több nap), a hosszú tárolás alatt látható bevonat, penészedés kialakulhat, ami a helytelen tárolás egyértelmű jele. A fagyasztott termékek közül különösen rossz egészségügyi statisztikája van a fagylaltoknak; ezek világszerte rendszeresen okoznak megbetegedéseket. A „fagylaltmérgezés” néha valóban a Sta. aureus okozta intoxikáció, azonban gyakrabban fertőzés, szalmonellózis. Ezek a kórokozók a fagyasztás előtti rossz higiéniai körülmények vagy technológiai hiba miatt szaporodhatnak el a fagylaltkészítményben. A túlélő mikroorganizmusok kimutatása csak a fagyott termék felengedtetése után lehetséges. A vizsgálatoknál gondot kell fordítani arra, hogy a fagyasztás és fagyott tárolás alatt sérült mikrobasejteket életre keltsük (regeneráljuk); ehhez tápanyagban dús, folyékony közeget, optimális hőmérsékletet, gátló tényezőktől mentes körülményeket kell biztosítani. Az életre keltés ideje csak néhány óra lehet, mielőtt a mikroorganizmusok szaporodni kezdenének.
Vendéglátó-ipari és hidegkonyhai készítmények A táplálkozási szokások változásával egyre nagyobb szerep jut a gyorséttermekben, büfékben kapható ételeknek (hamburgerek, szendvicsek, saláták és más hidegkonyhai készítmények). Ezeket rendezvények ellátására, utazások alkalmával az ún. catering szolgáltatás keretében is készítik. Mivel e termékek elkészítésében a kézimunka jelentős, nő a veszélye az ételmérgezést okozó Sta. aureus előfordulásának.
271
Termékek mikrobiológiája, romlása A hidegkonyhai készítmények, saláták gyakran tartalmaznak tojást, majonézt, illetve salátaönteteket a különböző főtt zöldségeken, húsokon, tésztákon, továbbá aszpikot, zselét és más ízesítő, díszítő anyagot, és elkészítés után hűtve is legfeljebb 1–2 napig tárolhatók. Vizsgálatok szerint a hidegkonyhai készítmények 35– 50%-ának összes sejtszáma meghaladta a 106/g-ot, a szendvicsek 60%-án, a saláták 40%-ában Sta. aureus volt jelen. A hidegkonyhai termékek biztonsága érdekében készítésükben és felszolgálásukban a higiéniai előírások messzemenő betartása nélkülözhetetlen.
272
9. fejezet - Élelmiszerek biztonsága és minősége Az utóbbi évtizedben világszerte megnövekedett az élelmiszerektől eredő vagy azok közvetítésével terjedő megbetegedések száma. Ebben több tényező játszik szerepet. A kórokozók tulajdonságainak megváltozásán kívül újabb, korábban nem ismert, vagy kórokozónak nem tekintett mikroorganizmusok léptek fel, megváltozott a lakosság immunológiai ellenálló képessége, fogyasztási szokásai, új feldolgozási technológiák, minimális tartósítási módszerek alakultak ki, bővül a nemzetközi élelmiszer-kereskedelem és az idegenforgalom, növekszik az általános környezetszennyezés. A fogyasztók egészségét számtalan, az élelmiszerrel a szervezetbe jutó egészségkárosító anyag veszélyeztetheti. Ezek jó része mikrobás eredetű: vagy maguk a fertőző mikroorganizmusok, vagy az általuk termelt méreganyagok, toxinok. A fő élelmiszer eredetű baktériumos megbetegedés a fejlett országokban a szalmonellózis, a kampilobakteriózis, a liszteriózis, a fejlődő országokban pedig a kolera. A penészgombák termelte mikotoxinokon kívül a mérgező gombák, a kékbaktériumok cianotoxinjai és egyes tengeri állatok toxinjai szintén veszélytényezők. A nem mikrobiológiai jellegű, de az élelmiszerbe kerülő káros anyagok közt vezető helyet töltenek be az ipari folyamatok, és más emberi tevékenység okozta környezetszennyező kémiai anyagok (pl. dioxin, klórozott bifenilek, nehézfémek). Végül, az utóbbi évtizedben a viták kereszttüzébe került a biotechnológiai, illetve a molekuláris biológiai úton módosított növények, mikrobák és állatok élelmiszerbiztonsági megítélése. Mindezen tényezők miatt az élelmiszerek előállításának és forgalmazásának teljes folyamatában a központi helyre kerültek az élelmiszerbiztonság szempontjai.
Az élelmiszer-biztonság általános kérdései Az élelmiszerekkel járó egészségügyi problémák érzékeltetésére álljon itt néhány statisztikai adat az Egészségügyi Világszervezet (WHO) tájékoztatójából. Világszerte évente mintegy 2,1 millió ember hal meg gyomor-bélbetegségekben, a megbetegedések aránya a fejlett országokban is eléri a népesség 30%-át. Bár az esetek többsége szórványos, egyedi, olykor a járványok, tömeges megbetegedések száma hatalmas méreteket ölt (pl. 1994-ben az Egyesült Államokban fagylalt okozta szalmonellózis 224 ezer, 1988-ban Kínában szennyezett kagylóval okozott hepatitisz A fertőzés 300 ezer embert érintett. Magyarországon kirívó nagyságú volt az 1996-ban ötezer szalmonellás megbetegedést okozó eperleves esete). Az országok vonatkozásában az esetszámot tükröző statisztikai adatok nem hasonlíthatók össze, viszont a népesség arányára eső megbetegedések illetve halálozások mértéke igen; ezt általában százezer lakosra vonatkoztatják. Így pl. az USA-ban évente mintegy 76 millió élelmiszer-megbetegedés történik, ami minden százezer emberből 26 ezret érintett, és ötezer eset halálos végű volt (1,7/100 000)! Nagy-Britanniában ez az arány 3400 (2 millió összes megbetegedésből), Franciaországban 1200 (750 ezer megbetegedésből). A rendelkezésre álló franciaországi adatok érdekes összehasonlítást tesznek lehetővé a megbetegedések okozói szerint. Mint a 9.1. táblázat mutatja, a három fő élelmiszer-fertőző baktérium mellett a protozoon paraziták és a vírusok szerepelnek az első öt kiváltó tényező közt, és feltűnő a liszteriózis jelentős szerepe a halálozások mértékét tekintve.
9.1. táblázat - Az élelmiszer okozta megbetegedések és halálozások fő tényezői (2000. évi franciaországi adatok) Okozó 1. Salmonella
Megbetegedés összes eset 8 000
2. Campylobacter 3 000
arány*
Okozó
Halálozás összes eset
arány*
13,0
1. Salmonella
300
0,5
5,0
2. Listeria
80
0,13 273
Élelmiszerek biztonsága és minősége 3. Parazita
900
1,4
3. Parazita
37
0,06
4. Listeria
300
0,5
4. Campylobacter 15
0,02
5. Hepatitis A
60
0,1
5. Hepatitis A
0,003
2
* százezer lakosra vonatkoztatott szám A magyarországi adatok általában hasonlók a nemzetközi statisztikákhoz. Az 1960–1998 közti időszak összesített élelmiszer-megbetegedési esetszáma 520 000 volt, ami éves átlagban közel 14 000 megbetegedést (140/100 000) jelent. A halálozások száma 375 volt (0,098/100 000). A vezető kórokozó tényező a szalmonellózis (53,7%), amit a kampilobakteriózis (20,5%) és a hepatitisz A (5,3%) követ, minden más élelmiszer eredetű kórokozó megbetegítési aránya 1% alatt maradt. Érdemes megemlíteni, hogy a megbetegedések 72%-a az otthoni ételekből adódott, a vendéglátóipar és a közétkeztetés okozta az esetek 23%-át, az élelmiszer-ipari termékek csak 5%-ban voltak felelőssé tehetők. A modern és intenzív mezőgazdasági és állattenyésztési módszerek növelik az élelmiszer-alapanyagok mennyiségét, a korszerű feldolgozó és tartósító eljárások pedig folyamatosan állítják elő az élelmiszereket és növelik választékukat. (Nem szabad elfelejtkezni azonban arról, hogy a fejlődő világ számos országa súlyos tápanyaghiánnyal küzd!) A növekvő élelmiszer-ellátás növeli az élelmiszerekkel járó egészségügyi kockázat veszélyét is. Az élelmiszerek biztonságának és minőségének ellenőrzése mind az egyes országokban, mind a nemzetközi kereskedelemben egyre fontosabb feladat. A mértékadó szabványokat, irányelveket, javaslatokat az Egyesült Nemzetek Élelmiszer és Mezőgazdasági Szervezete (ENSZ-FAO), valamint a FAO-WHO közös Codex Alimentarius Bizottsága dolgozza ki. Ezekre alapozódnak a minőségszabályozás, kockázatbecslés, veszélyelemzés módszerei, amelyekről az alábbiakban szólunk.
Minőségirányítási rendszerek Az élelmiszer-ellátás bővülésével és a feldolgozott élelmiszerek arányának növekedésével világszerte együtt jár az élelmiszer eredetű megbetegedések számának növekedése. Nyilvánvalóvá vált, hogy a késztermék mintáin alapuló élelmiszer-ellenőrzés nem nyújt megfelelő biztonságot a fogyasztók részére. Az élelmiszerbiztonság fokozására és a fogyasztók egészségének védelmére az a megelőző vizsgálati rendszer bizonyult alkalmasnak és hatékonynak, amely HACCP néven vált ismertté. A HACCP a „veszélyelemzés és kritikus szabályozási pontok” módszer angol elnevezéséből alkotott betűszó (magyar megfelelője VEKEP). A módszert az 1960as években az amerikai űrkutatási program keretében fejlesztették ki az űrhajósok biztonságos élelmezése érdekében, és miután nyilvánosságra hozták, elsőként a konzervek gyártásánál vezették be (1973-tól), majd a nyolcvanas években világszerte elterjedt az élelmiszeriparban. A FAO-WHO Codex Alimentarius Bizottság HACCP irányelveit 1993-ban adták ki, és ez vált a módszer nemzetközi előírásainak alapjává. Ennek megfelelője a Magyar Élelmiszerkönyv 1–2–18/1993. számú előírása. Az Európai Unióban 1995. decembere óta kötelező a HACCP alkalmazása (93/43 EU direktíva), amit a magyar csatlakozás előkészítéseként 2002. január 1-jétől tettek kötelezővé az élelmiszergyártók részére, majd 2004. május 1. óta a teljes élelmiszer-gazdasági ágazatban. A HACCP rendszer elsődleges célja a fogyasztó védelme, és jellegzetessége, hogy adott termékre, technológiára irányul. A gyártó adottságai szerint minden esetben egyedileg kell kidolgozni és alkalmazni. A HACCP módszer beilleszthető a szélesebb körű minőségirányítási és az általános, teljes körű minőségszabályozó rendszerekbe. A minőségirányítási rendszer a termékjellemzők folyamatos biztosításán és fejlesztésén kívül magába foglalja mindazokat a felügyeleti és ellenőrzési tevékenységeket, amelyek biztosítják a vállalat rendezett, eredményes és gazdaságos működtetésének, versenyképességnek feltételeit. Ezek megvalósítását 274
Élelmiszerek biztonsága és minősége legmagasabb szinten a teljes körű minőségszabályozási rendszer (TQM) foglalja össze. A minőségirányítási rendszer követelményeit a Nemzetközi Szabványosítási Szervezet (ISO) 9000-es sorozatú szabványai tartalmazzák, amelyek bármilyen termékre és gyártóra vonatkoztathatók. Az ISO 22000 sz. szabványa ötvözi az élelmiszer-biztonság és a minőségirányítás követelményeit a nyers- és alapanyagok beszállítóitól a feldolgozott élelmiszerek termeléséig és forgalmazásáig („a farmtól az asztalig”), az ISO 14000 sz. szabvány pedig a környezetközpontú irányítási rendszert, a környezetbarát technológiákat helyezi előtérbe. A minőségirányítás egységes és összefüggő rendszerében alkalmazni kell mindazokat az élelmiszer-biztonsági, higiéniai és ellenőrzési szabályokat és eljárásokat, amelyeket a „jó mezőgazdasági gyakorlat” (GAP), „jó gyártási gyakorlat” (GMP), „jó higiéniai gyakorlat” (GHP) és „jó konyhai gyakorlat” (GKP) néven szokás összefoglalni, és amelyek a minőségirányítási piramis alapját képezik (9.1. ábra).
9.1. ábra - A minőségirányítási piramis
A HACCP módszer A veszélyelemzés és kritikus ellenőrzési pontok módszere szakmai-tudományos szempontok szerint kialakított, a mikrobiológiai, közegészségügyi, kémiai, technológiai és analitikai ismereteken nyugvó, logikusan felépülő, egységes és összefüggő minőségellenőrzési és szabályozási rendszer. Célja az élelmiszerbiztonság megvalósítása révén a fogyasztó védelme, természetesen ennek következménye a termék eladhatósága és a vállalat megbecsülése. A HACCP rendszer kiépítésének alapvető feltétele, hogy az előállító megfelelő higiéniai és gyártási gyakorlatot folytasson és jó beszállítói minőségre támaszkodhasson. A HACCP módszer lényege, hogy az élelmiszer-biztonság érdekében meghatározza a jellemző veszélyeket, azok fellépésének kritikus helyeit és kijelöli a szabályozásukra szolgáló intézkedéseket. A HACCP rendszer hét alapelvre épül. Ezek: 1. A veszélyek elemzése. 2. A kritikus szabályozási pontok meghatározása. 3. A kritikus határértékek megállapítása. 275
Élelmiszerek biztonsága és minősége 4. A szabályozási pontok felügyelete. 5. Helyesbítő tevékenység a szabályozásra. 6. Hatékonyságot igazoló eljárások. 7. Az alkalmazás dokumentálása és nyilvántartása. A veszélyelemzés a termék leírása és felhasználása, valamint a gyártás folyamatábrája alapján a tevékenység minden lépésénél felméri a lehetséges veszélyek előfordulásának valószínűségét és káros egészségügyi hatásaik súlyosságát. Élelmiszer-biztonsági szempontból a veszélyelemzés elsősorban a kórokozó mikroorganizmusokra és azok toxinjaira irányul, de figyelembe kell venni az ezek előfordulását jelző (indikátor) mikroorganizmusokat, továbbá a romlást okozó mikrobákkal való szennyeződés, azok szaporodásának vagy túlélésének esélyeit is. Kritikus szabályozási pont (CCP) minden olyan gyártási mozzanat, folyamat, hely, berendezés, amelynél a mikroorganizmusok a termékbe kerülhetnek, elszaporodhatnak, illetve amelynél lehetőség van arra, hogy ezt megakadályozzuk, a mikrobaszámot csökkentsük, a túlélést kizárjuk. Fel kell mérni, melyek azok a határértékek, amelyek közt mindez lehetséges, és amelyek folyamatos vagy gyakori ellenőrzésével kellő időben közbelépésre, szabályozásra nyílik mód. A hosszadalmas mikrobiológiai vizsgáló módszerek általában nem alkalmazhatók, fizikai vagy kémiai mérések viszont elég gyorsak ahhoz, hogy tájékoztatást nyújtsanak a CCP állapotáról. Szakmai ismeretek szükségesek annak eldöntéséhez, hogy milyen mikrobiológiai következményekkel jár a hőmérséklet, az idő, a pH, a vízaktivitás, a szabad klórtartalom vagy más paraméterek kritikus határértékeinek átlépése. Ennek ismeretében kell meghatározni az eltérések korrekcióját, azokat a teendőket, amikkel az előírt határértékek helyrehozhatók, a CCP ismét szabályozottá válik. A CCP felügyeletével és szabályozásával kapcsolatos minden ilyen esetet dokumentálni kell, a felülvizsgálatokról és intézkedésekről nyilvántartást kell vezetni. A HACCP rendszer kiépítése nem egyszeri és végleges tevékenység. A módszer kidolgozásának része a belső felülvizsgálatára (validálására) szolgáló eljárás is: annak ellenőrzése és dokumentálása, hogy a rendszer megfelelően működik-e. A HACCP rendszert külső szakértőkkel is szükséges ellenőriztetni, jóváhagyatni (verifikálni). Az adott termékben vagy technológiában végrehajtott változtatás esetén a HACCP-t is megfelelően módosítani kell. A rendszer hatékony alkalmazásához elengedhetetlen a pontos nyilvántartás. A HACCP rendszert egyre szélesebb körben alkalmazzák az élelmiszerek előállításával és forgalmazásával kapcsolatos tevékenység során. Kidolgozása segít felismerni a gyártási folyamatok belső összefüggéseit, a technológiai és mikrobiológiai tényezők ok-okozati kapcsolatait, és elősegíti a jó gyártási gyakorlat megerősítését. Alkalmazása igazolta, hogy az élelmiszerek egészségügyi biztonsága jelentősen növelhető. A HACCP lendületet adott a hozzá kapcsolódó kutatásoknak, a gyorsvizsgálati módszerek, a mérés- és szabályozástechnika fejlődésének, új vizsgálati irányokban is, mint a kockázatelemzés és a prediktív mikrobiológia.
Kockázatelemzés A kockázatelemzés az élelmiszer-biztonságot megalapozó, az élelmiszerlánc egészére kiterjedő, annak összefüggéseit feltáró és tükröző tudományos felmérés, amelynek megállapításaira támaszkodva hatósági intézkedések teendők és a fogyasztók tájékoztathatók. A kockázatelemzés három fő része a kockázatbecslés, a kockázatkezelés és a kockázatközlés (9.2. ábra). 276
Élelmiszerek biztonsága és minősége
9.2. ábra - A kvantitatív kockázatelemzés elemei
Kockázat fogalmán az élelmiszerben rejlő veszély következményeként jelentkező egészségkárosító hatás valószínűségét és súlyosságát értjük. A veszély lehet kémiai (pl. növényvédőszer-maradvány, nehézfémek, toxinok) vagy biológiai jellegű (mikroorganizmusok, vírusok, férgek). Az elemzés végső célja az egészséget veszélyeztető hatás mértékének meghatározása, kifejezése. A kockázatbecslés lépései a veszély felismerése, azonosítása, jellemzése, a veszélynek való kitettség (expozíció) értékelése, a veszély megjelenésének lehetősége és ennek mértékében a kockázat súlyossága. Példákkal megvilágítva: növényi nyersanyagokon a termofil spórás baktériumok előfordulásának veszélye nagy, azonban a belőlük készült hidegkonyhai salátákban elszaporodásuk lehetősége és az ezek fogyasztásával járó egészségügyi kockázat kicsi. Ugyanakkor viszont a Listeria monocytogenes előfordulásának valószínűsége (veszélye) az ilyen termékekben kicsi, viszont a kockázat nagy, mivel a megbetegedés halálozási aránya eléri a 30%ot is. A kockázatbecslés számszerűsítése igen nehéz, mivel a szennyeződés, fertőződés az élelmiszer-hálózat bármely részén bekövetkezhet, de a túlélés, elszaporodás számtalan további tényező függvénye, és végső kimenetelében, a fogyasztó szervezetének reakciója, érzékenysége, fogékonysága, ellenálló képessége szintén megannyi változó, ami a kockázat súlyosságát befolyásolja. Mindezek ellenére a kockázatbecslés célja annak megállapítása, hogy mekkora az egyes veszélyek élelmiszerekben megengedhető szintje, ami nem haladja meg az ismert veszélytelen értéket. A becslés alapján intézkedések foganatosíthatók a veszély mérséklésére, a kockázat elhárítására. A kockázatkezelés már nem szakmai-tudományos elemzés, hanem részben a vállalat feladata, amit a HACCP rendszer keretében lehet a leghatékonyabban megoldani (9.3. ábra). Másrészt, a kockázatkezelés hatósági, kormányzati feladat is, az előírások, utasítások, szabályzatok megalkotása és kiadása. A kockázatokról és a velük kapcsolatos intézkedésekről a fogyasztókat tájékoztatni kell (kockázatközlés, kommunikáció), azért, hogy a fogyasztó is helyesen ítélje meg az adott élelmiszerrel járó egészségügyi veszélyt, illetve kockázatot és ennek értelmében járjon el.
277
Élelmiszerek biztonsága és minősége
9.3. ábra - A kockázatkezelés és a HACCP kapcsolata
Az élelmiszertörvény értelmében az élelmiszer minőségéért és biztonságáért elsősorban az előállító felelős. A gyártó felelőssége, hogy az élelmiszer fogyasztásának kockázata a lehető legkisebb mértékű legyen. A hatósági és felügyeleti szervek ellenőrzései arra szolgálnak, hogy elősegítsék a vonatkozó szabályok betartását, ami a biztonságot és minőséget garantálja. Végső soron azonban a fogyasztónál, a háztartásban dől el, hogy az élelmiszerbe „épített” biztonsági tényezők milyen mértékben nyújtanak védelmet. A hazai statisztikák szerint az ételmérgezési esetek 72%-a a háztartásokban következik be. A lakosság élelmiszer-higiéniai ismereteinek szintje, a konyhai műveletek higiéniája rendkívül alacsony. A fogyasztói kockázatkommunikáció, a felvilágosítás, az oktatás nélkülözhetetlen ahhoz, hogy az élelmiszerek előállításánál és forgalmazásánál bevezetett egyre szigorúbb biztonsági előírások eredménye realizálódjon.
Prediktív mikrobiológia A mikroorganizmusok környezeti tényezőkre adott válaszainak leírására és becslésére alkalmas modellek (matematikai egyenletek) kidolgozásával és azok alkalmazásával foglalkozik a prediktív mikrobiológia. Bár előzményei messzebbre nyúlnak, ez a vizsgálati terület az utóbbi 25 évben lendült fel a matematikai modellezést és a komputertechnikát alkalmazva, a mikrobák szaporodásának, túlélésének és pusztulásának előrejelzésére, „jóslására” az élelmiszerben uralkodó ökológiai viszonyok között. Laboratóriumi rendszerekben, adott paraméterek közt végzett mérési adatokhoz megfelelő modellt illesztve, interpolálni lehet nem vizsgált körülményekre, valós élelmiszerekre vonatkoztatva is. A prediktív mikrobiológia jelentős fejlődésen ment át, és az ipari gyakorlatban használható módszerré vált a HACCP minőségirányítási rendszer alkalmazásában, új termékek és technológiák kifejlesztésében, a kvantitatív kockázatbecslésben és általában az élelmiszerek biztonságának és minőségének javításában. A prediktív mikrobiológia nemcsak matematikai számításokat igényel, hanem kiterjedt kísérleti méretezést is. A prediktív modell készítésének lépései: 1. a kísérletek tervezése, 2. az adatgyűjtés, 3. egyenletek kidolgozása, illesztése az adatokhoz, 4. a modell alkalmazása a lehetséges eredmények előre vetítésére, 278
Élelmiszerek biztonsága és minősége 5. a becslések ellenőrzése (validálása) élelmiszereken, mások mérési eredményeivel összevetve. A modellezéshez nagyszámú és megbízható mérési adat szükséges, amelyek meghatározása, összegyűjtése technikailag is igényes feladat, különösen, ha több tényező hatásának modellezéséről van szó. A szaporodást vagy pusztulást vizsgáló mikrobiológiai módszerek az élősejt-szám meghatározásán alapulnak, aminek hagyományos módszerei idő- és munkaigényesek. A modell a szükséges mérési pontok számának csökkentésére is lehetőséget ad. Újabban műszeres és automatizált módszerek (pl. impedancia, turbidimetria, biolumineszcencia) alkalmassá váltak mikrobiológiai mérésekre, bár nem feltétlenül arányosak a sejtszámmal. Mindenesetre az adatok pontosságát, szórását figyelembe kell venni a modell kidolgozásánál és alkalmazásánál. A matematikai egyenletek, modellek kétségkívül központi helyet foglalnak el a prediktív mikrobiológiában. A mikrobaszaporodás és -pusztulás leírására régóta használnak különböző matematikai formulákat, ezek közül néhányat már ismertettünk (3. fejezet). Ezeknek alapvetően két típusa van: kinetikai és valószínűségi egyenletek. Az előbbiek a populáció exponenciális változásának (növekedésének vagy csökkenésének) sebességével modellezik az ökológiai paraméterek hatását, vagy a mérési pontokra görbét illesztve annak további jellemzőit (pl. lappangási szakasz hossza, maximális sejtszám, illetve D és z érték) is figyelembe veszik a modellezésnél. A valószínűségi modellek a pozitív vagy negatív válasz bekövetkezésének lehetőségét vizsgálják a különböző környezeti körülmények közt (szaporodás, túlélés van vagy nincs). A kétféle modell közt valójában nincs lényeges különbség, azok a mikrobiológiai lehetőségek két szélső helyzetét tükrözik. Ha az ökológiai tényezők a szaporodást gátolják vagy lehetővé teszik a túlélést, a kinetikai modellek alkalmasabbak, ha viszont a teljes gátló vagy pusztító hatást vizsgáljuk (nulla tolerancia, előírt nagyságrendű pusztulás), amelynek eredménye mindig csak bizonyos fokig valószínűsíthető, akkor az ilyen modellek használhatók. A szaporodást vagy pusztulást leíró elsődleges egyenletekből származnak azok a másodlagos modellek, amelyek e változásokat előre becsülik a különböző ökológiai tényezők hatásai között. Az egyenletek legegyszerűbb változatai csak egy vagy kevés paraméter hatását írják le egy adott mikrobára. A mikrobiológiai biztonság szempontjából a kórokozó mikroorganizmusok jelentősek, ezért a modellek többsége is ezekre irányul (pl. szalmonellák szaporodásának, vagy a Cl. botulinum spórák túlélésének lehetősége). A modellek egyre bonyolultabbá válnak, amint több tényező hatására terjednek ki. Több tényező különböző dózisainak együttes hatása is jól leírható polinom és válaszfelület modellekkel, azonosíthatók a leglényegesebb (szignifikáns) tényezők és azok kölcsönhatásai is. A modellezésben a következő nehézségi fokot az jelenti, ha a tényezők nem meghatározott és állandó szinten szerepelnek, hanem mértékük folyamatosan változik az idővel. A szaporodásra, illetve pusztulásra ható legfontosabb tényező a hőmérséklet, amelynek hatását lehet izoterm vagy anizoterm körülmények közt vizsgálni, továbbá egyéb tényezők (pl. pH, aw, Eh, nyomás) befolyása alatt. A modellek validálása élelmiszer-kísérletekkel, illetve az irodalomban található korábbi mérési adatokkal összevetve lehetséges. Ezek az összehasonlítások igazolják, hogy a laboratóriumi mérési eredményekből származó modellek jó közelítéssel leírják az élelmiszerekben uralkodó, valós, komplex viszonyokat, és megbízható becsléseket tesznek lehetővé. A prediktív mikrobiológia ma már sokféle mikroorganizmusra vonatkozó nagy adatbázisokra támaszkodik és különböző számítógépes modellrendszerek állnak rendelkezésre (pl. ComBase; www.combase.cc; Growth predictor, www.ifr.ac.uk).
Mikrobiológiai minőségellenőrzés A HACCP rendszer eredményességének feltétele a rendszeres ellenőrzés. A kritikus pontokon végrehajtott gyártásközi ellenőrzés azt vizsgálja, hogy a jó gyártási gyakorlat megvalósul-e a feldolgozás egész folyamatában. A gyártásközi vizsgálat megelőző ellenőrzés, ami nem lehetséges csak a késztermék vizsgálata alapján. A hatósági szervek ellenőrző tevékenysége és a gyártási tételek minősítése viszont elsősorban a késztermék adott tételéből vett mintákra szorítkozik. A tételminősítés is megbízhatóbbá válik a gyártásközi vizsgálatokra alapozva. 279
Élelmiszerek biztonsága és minősége
Fázisvizsgálatok A gyártás folyamatában, annak különböző szakaszaiban, a kritikus ellenőrzési pontoknál végzett fázisvizsgálatok nagyszámú adatot szolgáltatnak a termelés higiéniai és mikrobiológiai körülményeiről, a feldolgozó és tartósító eljárások hatékonyságáról, a technológiai fegyelemről. A rendszeres gyártásközi ellenőrzés tájékoztatást nyújt a mikrobiológiai állapotról a nyersanyagtól a késztermékig, különös tekintettel a HACCP rendszerbe foglalt kritikus szabályozási pontok állapotára. A fázisvizsgálatok kiterjednek az üzembe érkező nyers-, segéd- és adalékanyagok minőségére, a gépek, berendezések, kézi eszközök higiéniai állapotára, a személyi higiéniára, a gyártástechnológiai műveletek hatékonyságára, az esetleges romlások okainak felderítésére. A fázisvizsgálatokkal feltárhatók az előforduló hibák és végrehajthatók az elhárításukhoz szükséges technológiai módosítások vagy higiéniai intézkedések. A gyártásközi ellenőrzés tehát módot ad az időbeli beavatkozásra: megelőző jellegű. Segítségével kialakítható és fenntartható a technológiai vonal kívánatos, a jó gyártási gyakorlatnak megfelelő mikrobiológiai képe és megfelelő minőségű késztermék állítható elő. A jó gyártási gyakorlat eredményeként a feldolgozó vonal és a késztermék mikrobiológiai szennyezettsége az elérhető legkisebb mértékűre csökken, és ingadozása mérséklődik, a mikrobiológiai minőség állandósul (9.4. ábra). A kritikus pontokon mért sejtszámok és a mikrobiológiai állapotra utaló fizikai, kémiai jellemzők átlagainak és szórásainak ismeretében meghatározható az ún. belső üzemi norma. Ez az a mikrobiológiai szint, amelynél – nagy statisztikai valószínűséggel – várható, hogy a mikrobiológiai követelményeknek megfelelő késztermék készül.
9.4. ábra - A jó gyártási gyakorlat (GMP) hatása a mikrobás szennyeződés szintjére és hullámzására
280
Élelmiszerek biztonsága és minősége
Késztermék-minősítés A HACCP rendszer, a gyártásközi vizsgálatok kialakítása, és a belső mikrobiológiai norma meghatározása az üzem saját ellenőrzési rendszerének feladata. A belső ellenőrzés szorosan együttműködik a hatósági szervekkel, amelyek csak szúrópróbaszerű gyártásellenőrzést és tételes termékminősítést végeznek. Az élelmiszerek előállításának és forgalmazásának egészségügyi ellenőrzését és minősítését az üzemektől független hatósági szervek végzik. Magyarországon jelenleg ezek több minisztérium felügyelete alá tartoznak, és működési körük különböző területekre terjed ki (9.2. táblázat). Közegészségügyi szempontból az állami népegészségügyi és tisztiorvosi szolgálat, élelmezés-egészségügyi és állat-egészségügyi szempontból az állat-egészségügyi állomások, az élelmiszer-minőség ellenőrzése ügyében pedig az élelmiszer-vizsgáló intézetek, és a fogyasztóvédelmi felügyelőség jár el.
9.2. táblázat - Élelmiszerellenőrző hatósági szervek Földművelésügyi és Vidékfejlesztési Minisztérium Állategészségügyi és Élelmiszerellenőrző Szolgálat Megyei Állategészségügyi és Élelmiszerellenőrző Állomások Országos Élelmiszervizsgáló Intézet (OÉVI) Országos Állategészségügyi Intézet Országos Mezőgazdasági Minősítő Intézet (OMMI) Növényegészségügyi szolgálat Egészségügyi Minisztérium Országos Tisztifőorvosi Hivatal Állami Népjóléti és Tisztiorvosi Szolgálat (ÁNTSZ) Országos Közegészségügyi Központ Országos Élelmiszebiztonsági és Táplálkozástudományi Intézet (OÉTI) Magyar Élelmiszer-biztonsági Hivatal (MÉBIH) Gazdasági Minisztérium Fogyasztóvédelmi Főfelügyelőség Tárcaközi szervezetek Magyar Élelmiszerkönyv Bizottság (Codex Alimentarius Hungaricus)
281
Élelmiszerek biztonsága és minősége Az élelmiszerek mikrobiológiai biztonságát és minőségét az egészségre ártalmatlan, romlatlan, tartós és jó termékre vonatkozó követelmények szerint bírálják el. Ezek a követelmények általában megfelelnek az EU előírásoknak. Magyarországon az élelmiszer-ellenőrzés rendjét az élelmiszerekről szóló, többször átdolgozott törvény és annak végrehajtási utasításai szabályozzák, amelyekhez további rendeletek csatlakoznak (9.3. táblázat).
9.3. táblázat - Az élelmiszerek előállítására, forgalmazására és ellenőrzésére vonatkozó fontosabb jogszabályok Élelmiszertörvény LXXXII. 2003 (XC.1995; módosítás: LIV. 2001. tv.) Végrehajtási utasítások: 1/1996 (I.1) FM-NM-IKM és 1/1996 (I.9) FM-NM-IKM, 92/2004 (V. 25) FVM-EszM-GKM Élelmiszerek előállításának és forgalmazásának élelmiszerhigiéniai feltételei 17/1999 (II. 10) FVM-EüM Magyar Élelmiszerkönyv (Codex Alimentarius Hungaricus) 1-2-18/1993. sz. előírás HACCP végrehajtása élelmiszeriparban: 17/1999 (II. 10) FVM-EüM; vendéglátóiparban: 80/1999 (XII.28) GM-EüM-FVM Élelmiszerekben előforduló mikrobiológiai szennyeződések megengedhető mértéke. 4/1998 (XI. 11) EüM Import élelmiszerek ellenőrzése 21/1998 (IV. 8) FM-BM-HM-IKM-NM A mikrobiológiai előírások rögzítik 1. a termékre vonatkozó kórokozó, indikátor és romlásokozó mikrobák típusait, 2. e mikroorganizmusok előfordulásának megengedhető határértékeit, 3. a mintavételi és vizsgálati tervet és 4. a vizsgálatok módszereit. Az élelmiszerek fajtái szerint más-más mikrobafajokat vagy csoportokat kell vizsgálni és ugyanannak a mikrobának a megítélése (számszerű határértéke) is különböző lehet terméktípusonként. Élelmiszer-biztonsági, egészségügyi szempontból a kórokozók közül minden élelmiszerben és minden esetben vizsgálni kell a szalmonellák előfordulását, más fertőző vagy toxinképző mikrobára a termékre vonatkozó specifikus előírás szerint kell vizsgálatot végezni. Az egyes mikrobákra előírt határértékek nemcsak termékenként különbözhetnek, hanem az előírás szigorúsága szerint is. A szabványban vagy hatósági rendeletben előírt mikrobiológiai szintek kötelezők, az iparági normák vagy üzemi normák csak ajánlott értékek. Ez utóbbiak nagyobb súlyt helyeznek a szennyezettséget jelző indikátor mikroorganizmusokra (koliformok, enterobaktériumok, szulfitredukáló klosztridiumok), valamint az eltarthatóságot befolyásoló, romlást okozó mikrobacsoportokra (mezofil aerobok, pszichrotrófok, élesztők stb.), mivel üzemi laboratóriumok általában nem jogosultak kórokozók (különösen szalmonellák) vizsgálatára. A mintavételi terv előírja a minták számát és mennyiségét, amelyeket meg kell vizsgálni annak érdekében, hogy a termék adott tételéről minősítő véleményt lehessen alkotni. Mivel a mikroorganizmusok eloszlása a termékben és a tétel részei közt egyenetlen, a mintákból csak akkor lehet a tétel egészére következtetni, ha a mintavételi terv matematikai-statisztikai számításokon alapul. Az így készült mintavételi jelleggörbék (9.5. ábra) leírják, hogy milyen valószínűséggel lehet helyes tételminősítő véleményre jutni a mintaszám, a mikrobiológiai határérték és a mikroorganizmusok eloszlása függvényében. A határértéket a nagy biztonságot nyújtó 282
Élelmiszerek biztonsága és minősége valószínűségi aránynál vonják meg (pl. P = 95%). Az élelmiszerek egészségügyi mikrobiológiai minősítéséről szóló hazai rendelet (4/1998.(XI.11. EüM)) előírja mind a határértékeket, mind a mintaszámokat.
9.5. ábra - A mikrobiológiai minősítés elve. A minőségjelző mikroorganizmus gyakorisági eloszlása (- - -) és a mintavételi terv alapján meghatározzuk a mintavételi jelleggörbét (–––). Az elfogadási határértéket (m) általában nagyobbra választjuk annál a mikrobaszámnál, amelyet a tétel egységeinek 95%-a nem halad meg (ϕ). A tűrési érték (c) az m határnál több mikrobát tartalmazó mintaelemek száma. Kéthatáros minősítésnél M az a legnagyobb mikrobaszám, amelyet egy mintaelem sem léphet túl. Ez az érték egy vagy több nagyságrenddel kisebb, mint a minimális fertőzési vagy romlási mikrobaszám (FR). A mintavételi jelleggörbén (==) V a 95%-ban elutasított, E a 95%-ban elfogadott minőségi szinthez tartozó mikrobaszám
A mintavételi terv típusa szerint megadják a vizsgálandó minták számát (n), az alsó (m) és a felső (M) határértéket, valamint azoknak a mintáknak a számát (c), amelyek mikrobaszáma az alsó határt (m) meghaladhatja. A felső határértéket (M) egy minta sem lépheti át. Kórokozók (pl. szalmonellák) esetén, amelyek az élelmiszerben egyáltalán nem fordulhatnak elő (nulla tolerancia), a mintavételi terv igen szigorú, a mintaszám nagy (n ≥ 10), m = 0 és tűrési érték sincs (c = 0), a vizsgálandó elemi minta mennyisége pedig 1 g helyett 25 g. Feltételesen kórokozó, indikátor, vagy romlást okozó mikrobák esetén a mintaszám és mennyiség kisebb és a határértékhez tűrés is tartozhat. Egy adott mikrobára és a termék 1 g-jára n = 5 mintából c = 2 esetben még elfogadható lehet, ha a mikrobaszám nagyobb mint m (de nem haladja meg M-et!).
283
Élelmiszerek biztonsága és minősége A mikrobiológiai vizsgálatok módszereit nemzetközi szinten ajánlások, országos szinten előírások vagy szabványok egységesítik. Magyarországon pl. az MSZ 3640 számú szabványsorozat rögzíti a húsok és a hús alapú élelmiszerek mikrobiológiai vizsgálati módszereit, más szabványok az EU előírásoknak megfelelően specifikus mikroorganizmusok vizsgálatára (pl. MSZ EN ISO 6888-1-2000 Staphylococcus, 11290-1-1998 Listeria), illetve egyes termékek vizsgálatára vonatkoznak (pl. MSZ EN ISO 8261 Tej és tejtermékek). Az előírt módszer általában a legérzékenyebb, legnagyobb pontosságú és ismételhetőségű tenyésztési eljárás. Újabb, gyors, nem a hagyományos tenyésztésen alapuló vizsgálati módszerek többnyire csak tájékoztató vizsgálatokra szolgálnak.
284
10. fejezet - Mikrobiológiai vizsgálati módszerek A mikrobiológiai vizsgálatok kezdetén, a XIX. század második felében, a mikroorganizmusokat a laboratóriumban húslevesben vagy más folyadékokban elszaporítva, gyakran még vegyes tenyészetekben tanulmányozták. Így végezte vizsgálatait Louis Pasteur is, aki ennek ellenére zseniális felfedezésekre volt képes. Csak később sikerült mikrobák tiszta tenyészeteit, telepeit szilárd táptalajon, pl. burgonyaszeleteken létrehozni. A tiszta tenyészetek csak egyféle mikroorganizmust tartalmaznak, és kedvező esetben egyetlen sejt elszaporodott utódai. Robert Koch és munkatársai fejlesztették ki a zselatinnal, majd agarral mesterségesen szilárdított táptalajt. Ezzel lehetővé vált, hogy a mikroorganizmusok tulajdonságait tiszta tenyészetekben tanulmányozzák és valósan megismerjék. A lemezöntéssel vagy szélesztéssel, olykor más módon készített tiszta tenyészetekkel végzett munka mindmáig a mikrobiológia általános gyakorlatává vált. Számos, ma is használt mikrobiológiai vizsgálati módszer több mint száz éve alakult ki. Világszerte a vizsgálatok millióit végzik évente annak ellenére, hogy ezek a hagyományos tenyésztéses módszerek munka- és anyagigényesek, és fő hibájuk, hogy lassúak: az eredmény gyakran csak többnapos vizsgálatsorozat után értékelhető. A módszertani fejlesztés évtizedek óta arra törekszik, hogy a hagyományos módszereket új, nem tenyésztésen alapuló, gyors és automatizált eljárásokkal váltsa fel. A vizsgálati módszerek és eljárások részleteit a gyakorlati útmutatók, jegyzetek, kézikönyvek tartalmazzák. Ezekre itt nem térünk ki; az alábbiakban a vizsgálatok általános módjait és elveit ismertetjük.
A mikrobiológiai módszerek alapjai A mikroorganizmusok többségének sejtjei nagyon kicsik, méretük a mikrométeres (μm) nagyságrendbe esik, ezért az egyedi sejtek vizsgálata nagyon korlátozott. A vizsgálatok túlnyomó többsége mikrobapopulációkkal történik, amelyek a sejtek millióit tartalmazzák. Ezek a populációk a mikroorganizmusok elszaporodásával jönnek létre, természetes közegekben vagy mesterséges, laboratóriumi tápanyagokon. Az utóbbit tenyésztésnek nevezzük, aminek eredménye a tenyészet (gyakran nevezik kultúrának is). A természetes anyagokból vagy élelmiszerekből nyert tenyészet gyakran kevert, különböző mikroorganizmusokból áll. Ahhoz, hogy egy mikrobafaj tulajdonságait tanulmányozhassuk, populációját tiszta tenyészetben kell létrehozni, izolálni. A tenyésztésen kívül ez a másik alapművelet. Mind a tenyésztést, mind az izolálást úgy kell végrehajtani, hogy kizárjuk bármilyen külső szennyeződés, idegen mikroorganizmus bejutását. Az ilyen eljárásokat összefoglalóan aszeptikus technikának nevezzük. Ennek részét képezi minden eszköz, edényzet, tápközeg sterilezése, amelyeket a mikroorganizmusok tenyésztésére használunk, ami általában hőkezeléssel történik. A laboratóriumot és berendezéseit tisztán kell tartani és fertőtleníteni kell éppúgy, mint a laboratóriumi ruházatot (köpenyt, sapkát, cipőt). A mikroorganizmusokkal végzett műveletek során kellő elővigyázatot kell tanúsítani, és a biztonsági rendszabályokat be kell tartani. A kézmosás, fertőtlenítés elengedhetetlen a nem kimondottan kórokozókkal való munka esetén is; a használt eszközöket (pipettákat, oltókacsokat, táptalajokat stb.) sterilezni kell.
285
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek
Mintavétel és előkészítés Élelmiszerek, klinikai anyagok és minden más anyag sikeres mikrobiológiai vizsgálatának feltétele és legfontosabb lépése a mintavétel, majd a minta előkészítése az elemzésre. A mintának kellően reprezentálnia kell az egész anyagot, amelyből származik ahhoz, hogy a vizsgálat eredménye arra vonatkoztatható és megbízható legyen. Élelmiszerek tételeire irányuló vizsgálatoknál a statisztikai mintavétel szabályait előírások határozzák meg. A mintavételi eljárás függ attól, hogy szilárd vagy folyékony anyagról, felület vagy levegő mintázásáról van szó. Általános szabály, hogy a mintavétel módja aszeptikus legyen, vagyis a minta ne szennyeződjék olyan mikroorganizmusokkal, amelyek eredetileg nem voltak benne vagy rajta. A mintát a lehető legrövidebb idő alatt a laboratóriumba kell szállítani, szükség szerint hűtve, hogy a mikrobák szaporodására ne kerüljön sor. A tényleges vizsgálatokhoz a mintából kisebb mennyiségeket, 5, 10, 25 g-ból álló almintákat vesznek, majd ezeket az esetek többségében folyadékban szuszpendálják és homogenizálják. Ez a lépés egyúttal a minta hígítására is szolgál; mennyiségi vizsgálatoknál az alapszuszpenzió hígítása általában 1:10 arányú. Szilárd anyagoknál ez a lépés elkerülhetetlen; folyadékoknál az előkészítés egyszerűbb, a minta vagy közvetlenül vizsgálható, vagy megfelelő hígítása alapos keveréssel elkészíthető. Gyakran kerül sor az anyagok, eszközök, berendezések felületének vizsgálatára. Ilyenkor meg kell határozni, hogy a mintázás mekkora felületre vonatkozzék és milyen módon történjék. A felületet nedves vattatamponnal lemosva vagy arra az agaros táptalajt közvetlenül rányomva lehet mintázni, szóba jöhet megfelelő ragtapasz alkalmazása is, amelyet bizonyos idő után a felületről lehúzva táptalajra helyeznek. A levegő (pl. a feldolgozóüzem légtere) vizsgálatának legegyszerűbb módja, ha egy agarlemezt a fedelét eltávolítva bizonyos ideig (10–30 min) szabaddá teszünk a levegőből ráhulló mikrobasejtek, spórák, konídiumok számára. Pontosabb eljárás, ha alkalmas berendezéssel ismert mennyiségű levegőt átszívatva a mikrobás szennyeződést membránon szűrjük ki vagy agarlemez felszínével ütköztetve fogjuk fel. A levegő elfogadható tisztaságú, ha mikrobaszáma köbméterenként 100–300 körüli, és szennyezett, ha 300–500-nál nagyobb. A mintában található mikroorganizmusokat megfelelő tápközegben, kedvező körülmények közt elszaporítva, tenyésztéssel mutatjuk ki.
Tápközegek A mikroorganizmusok tenyésztésére szolgáló tápközegeknek tartalmazniuk kell minden, a szaporodásukhoz szükséges tápanyagot: energia-, szén- és nitrogénforrást, vitaminokat, ásványi sókat, és a tenyésztési körülményeknek ki kell elégíteniük a szaporodás környezeti igényeit is (hőmérséklet, oxigén, pH stb.). Mivel azonban a mikrobák tápanyag- és szaporodási igényei oly sokfélék, valamennyi mikroba számára kielégítő, ideális tenyésztési módszer nincs, jóllehet a különféle tápközegek ezreit dolgozták ki. A tápközegek lehetnek folyékonyak („levesek”) vagy agarral (ritkábban zselatinnal, szilikagéllel) szilárdítottak, és összetételük szerint lehetnek természetes eredetűek vagy szintetikusak. Az előbbiek valamilyen természetes anyagot vagy kivonatot tartalmaznak (pl. burgonya, maláta, élesztő, pepton), amelynek alkotói pontosan nem ismertek, míg az utóbbiak kémiai összetevői pontosan meghatározottak. Alkalmazás szerint a tápközeg szolgálhat általános, szelektív vagy differenciáló tenyésztésre, és szolgálhat valamely mikroba dúsítására is. A komplex táptalaj a mikrobák széles körének tenyésztésére alkalmas, és általában tartalmaz peptont, hús-, élesztőkivonatot, míg a szintetikus tápközeg szelektív lehet a mikrobák bizonyos csoportjára, amelynek igényeit kielégíti, vagy szolgálhat olyan mikrobafaj tenyésztésére, amelynek szaporodási feltételei pontosan ismertek. Szelektív tápközeg kialakítható gátlószer vagy toxikus anyag (pl. antibiotikum, kristályibolya) hozzáadásával vagy más gátló körülmény (pl. kis pH) alkalmazásával. A differenciáló táptalajokon többféle mikrobafaj kifejlődhet, de ezek telepei eltérő megjelenésűek, ami megkülönböztetésüket, gyakran előzetes azonosításukat is lehetővé teszi. A dúsítók a kívánt mikroba számára kedvező, másokkal szemben 286
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek viszont gátló körülményeket biztosítanak, ezzel a mintában kisebbségben, más mikrobákkal vegyesen előforduló faj vagy csoport felszaporodását elősegítik. A dúsítóból kioltva a keresett mikroba már könnyen izolálható. Az inokulum beoltása után a tápközeget inkubátorba helyezzük, amely megfelelő körülményeket (hőmérséklet, légtér gázösszetétele és nedvességtartalma) nyújt a mikrobák elszaporodásához. Az inkubálás ideje a mikroroganizmustól és a tenyésztés körülményeitől egyaránt függ, általában néhány nap; baktériumok többnyire gyorsabban, penészgombák lassabban fejlődnek ki. A tápközeg összetételén kívül a tenyésztési körülmények megválasztásával is elérhetünk szelektív vagy dúsító hatást. Egy vízmintát csak ásványi sókat tartalmazó szintetikus tápoldatba oltva, megvilágítva és 25 °C-on tartva, algák és kékbaktériumok szaporodnak el, míg 35 °C-on csak az utóbbiak tenyésznek ki, mivel az algák szaporodásának ez a hőmérséklet már nem kedvez. Ugyanebből a mintából, a tápközeghez szulfidokat adva és anaerob körülményeket teremtve, zöld és bíbor kénbaktériumok izolálhatók. A minták előkészítése is módot adhat szelekcióra, pl. a talajszuszpenzióból, ha beoltás előtt 80 °C-on, 10 percig hőkezeljük, csak spórás baktériumok tenyésznek ki.
Tenyésztés, izolálás, fenntartás Ha a steril táptalajt a vizsgálandó mintával (inokulummal) beoltják, akkor a benne lévő mikrobák abban vagy annak felületén néhány nap alatt elszaporodnak és szabad szemmel is látható tenyészetet, telepet képeznek. Az agaros táptalajjal való tenyésztésnek két alapvető módja van. Lemezöntésnek nevezzük, ha a mintát a megolvasztott agaros táptalajba keverjük, majd hagyjuk megdermedni, míg szélesztésről beszélünk, ha az inokulumot az előre kiöntött és megszilárdult táptalaj felszínén kenjük szét (10.1. ábra). Annak érdekében, hogy elkülönült, izolált telepeket kapjunk, az inokulumban lévő mikrobák számát megfelelő mértékű hígítással csökkenteni kell. Az eredeti mintát általában tízszeres léptékben hígítjuk, pl. 1 cm3-t oltva 9 cm3 hígítófolyadékba, és elkeverés után ezt többszörösen ismételjük (10.2. ábra). Megfelelő mértékű hígítás esetén feltételezhető, hogy az izolált telep egyetlen sejt utódaiból keletkezett, vagyis tiszta tenyészet. Erről ismételt szélesztéssel kell meggyőződni, mielőtt az izolátummal további vizsgálatokat folytatnánk.
287
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek
10.1. ábra - Lemezöntési és szélesztési módszerek. A: vegyes tenyészet lemezöntéssel, B: izolált telepek szélesztése oltókaccsal, C: izolált telepek készítése hígítással és felületi szélesztéssel
288
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek
10.2. ábra - Telepszámlálás hígítási sorral és lemezöntéssel. A 3. hígításból kapott telepszámból számítva (159 × 1000) a mintaszuszpenzió sejtszáma mintegy 1,6 × 105 volt cm3-ként
A tiszta tenyészetet kémcsőben, ferde vagy magas agaros táptalajba oltva, vagy folyadéktenyészetben lehet továbbszaporítani vagy élő állapotban fenntartani és megőrizni. Hosszabb tárolás céljára a tenyészetet, hűtéssel, fagyasztással, kiszárítással vagy más alkalmas módszerrel tartósítani kell. Bár az agaros tenyésztési módszer óriási jelentőségű volt a bakteriológia fejlődésében, mégsem alkalmazható minden mikrobára. A baktériumok és a gombák többségével szemben bizonyos mikrobák csak folyékony tápközegben tenyészhetők. Különleges, oxigénmentes tenyésztési körülményeket igényelnek az anaerob baktériumok. Az obligát paraziták, mint pl. a vírusok csak megfelelő gazdaszervezetben (pl. tojásembrióban) szaporíthatók. Élelmiszerekben a feldolgozás, tartósítás stresszhatásainak kitett mikrobák a sejtszerkezetben vagy az anyagcserében sérülhetnek, ezek tenyésztése, előzetes életre keltése különleges módszereket igényel. Az ún. „élő de nem tenyészthető” mikrobák kimutatására a szokásos tenyésztési módszerektől eltérő eljárások adnak módot.
289
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek
Mennyiségi meghatározási módszerek A mikroorganizmusok számának meghatározása a minta tömeg- vagy térfogat-egységére vonatkoztatva általános feladat az élelmiszer-mikrobiológiában. Ez gyakran az agarlemezen kifejlődött telepek számának meghatározását jelenti, feltételezve, hogy minden egyes telep a táptalajba oltott egy-egy sejtből alakult ki. Ez azonban nem feltétlenül igaz, mivel sejtcsomók, sejtláncok még a homogenizált mintában is maradhatnak, és inkubálás után egyetlen telepet képeznek. A sejtszám helyett gyakran használják a telepképző egységek számát (tke vagy cfu). Mind a telepszám meghatározása, mind más sejtszámolási módszer csak bizonyos határok közt végezhető el kellő pontossággal (a telepszám pl. 30–300 közt), ezért a minta mikrobaszámát hígítással, olykor koncentrálással be kell állítani. A hígítás már a minta előkészítésének első lépése lehet; az alapszuszpenziót általában tízszeres hígításúra állítjuk be. A további hígítási sorozat is decimális léptékben készül (pl. 1 cm3-t átoltva 9 hígító folyadékba, amely többnyire steril víz vagy híg, 0,1%-os peptonvíz). Az egyes hígítási fokok között a mintát alaposan homogenizálni, keverni kell. A végső kioltás tápközegbe lemezöntéskor általában 1 cm3, szélesztéskor 0,1 cm3. A minta eredeti koncentrációját a kapott telepszám és a hígítási fok szorzata adja, amit általában a 10 hatványában fejezünk ki. Pl. ha 108 hígításból készült lemezen 42 telep fejlődött ki, akkor minta mikrobaszáma 4,2 × 109 tke/g volt; ha ez a telepszám 0,1 cm3 szélesztéséből származik, akkor az eredeti mintára vonatkoztatva 4,2 × 1010 tke/g-ot kapunk. Néha a minta koncentrálására van szükség, ami centrifugálással vagy szűréssel végezhető. A mikrobasejteket visszatartó pórusnagyságú membránszűrőket közvetlenül az agarlemezre helyezve lehet inkubálni. A mikrobaszám-meghatározásnak többféle módszere lehetséges, történhet közvetlen (direkt) módon vagy közvetve (indirekt) becsléssel, és kiterjedhet az összes (élő és holt) sejtszámra vagy csak az élő sejtekre.
Lemezöntés és szélesztés A fentebb ismertetett telepszámolás leggyakrabban ezzel a két módszerrel történik. Lemezöntésnél a mintát (hígítást) Petri-csészébe pipettázzuk és a megolvasztott agaros táptalajjal összekeverjük, majd hagyjuk megdermedni. Szélesztéskor a már kiöntött és megkocsonyásodott lemez felületén terítjük szét a mintát. Ezeket a számolási módszereket gyakran nevezik aerob telepszám-, standard telepszám- vagy összes telepszám-meghatározásnak; valójában a mezofil aerob mikrobaszám meghatározására szolgálnak, az inkubálás (tenyésztés) szokásos körülményei között. A tápközeg és az inkubálás változtatásával a módszer más típusú mikrobák számolására is alkalmassá tehető, pl. a koliformok, az élesztők és penészek, az anaerobok vagy a spórás baktériumok számának meghatározására, mindenféle élelmiszerben vagy higiéniai vizsgálat céljából. Ez a rugalmasság a módszer nagy előnye; hátrányai viszont a lassúság, a nagy anyag- és munkaigény, a viszonylagos pontatlanság (pl. a bemérési és hígítási hibák következményeként).
A legvalószínűbb sejtszám módszere A legvalószínűbb sejtszámot (most probable number, szokásos rövidítése MPN) folyékony tápközegben, a szaporodást mutató (zavarossá váló) tenyészetek száma szerint, statisztikai alapon határozzák meg. A hígítási sorozat minden tagjából 1–1 cm3-t oltunk több (3–5) párhuzamosban, általános táplevesbe, és inkubálás után feljegyezzük a pozitív csövek számát. Elméletileg, ha legalább egy sejt került a táplevesbe, a szaporodás látható jeleit fogja mutatni. Statisztikai táblázat segítségével, a pozitív és negatív csövek számából a legvalószínűbb élősejtszám meghatározható. Az eredményesség feltétele, hogy a hígítás olyan mértékű legyen, hogy a 290
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek legnagyobb fokozat már ne adjon pozitív eredményt. A módszer pontossága nem éri el a telepszámolási módszerét, de előnyösen alkalmazható akkor, ha az utóbbi nem vagy csak kevésbé használható (pl. kis sejtszámoknál). Ha membránszűrést alkalmazunk a minta koncentrálására, a membránok folyékony tápközegben éppúgy inkubálhatók, mint agar felületén. A tápfolyadék összetételével az MPN módszer specifikus mikrobák számolására is alkalmas (pl. koliformok meghatározására ivóvízben).
A mikrobaszámbecslés közvetett módszerei A sejtszám közvetett becslése történhet turbidimetriával, anyagcsere-aktivitás, vagy sejttömeg méréssel. A levestenyészet zavarossága az sejtek által szétszórt fény következménye, és mértéke összefügg a sejtek koncentrációjával (számával) és méretével. A korrelációt előzetesen felvett kalibrációs görbével kell meghatározni. Ennek alapján a fotométerben mért abszopció arányos a sejtszámmal. Az optikai módszer gyors és pontos, azonban csak bizonyos felső határig (kisebb koncentrációknál). Előnyösen használható közel azonos tömegű, egysejtű mikroorganizmusok számának becslésére, különösen tenyésztés folyamán. Hátránya viszont, hogy nem tesz különbséget az élő és a holt sejtek között. Bizonyos anyagcseretermékek (pl. gázok, savak) képződésének vagy az oxigén felhasználásának sebessége és mértéke, alkalmas berendezésekkel mérve, közvetve használható az élő sejtek számának becslésére. A sejttömegmérés már inkább az összes sejtszám becslésére alkalmas; a centrifugálással, szűréssel elkülönített sejttömeget többnyire szárítás után mérik. A szárítás hosszadalmas; a mérés pontatlansága abból ered, hogy 1 mg száraztömeg is sok milliónyi baktériumsejtnek felel meg.
Összes sejtszám meghatározása A mikroszkópos sejtszám-meghatározás közvetlen módszer, amely általában az összes (élő és holt) sejt számolására használatos. Erre a célra szolgáló mikroszkópos tárgylemezeken, ismert térfogatú kamrákban határozható meg a látható sejtek száma. A leggyakrabban alkalmazott mikroszkópos, számlálókamrás eljárások közül a Bürker-kamra élesztőgombák számlálására, a Howard-kamra penészszennyezettség megállapítására alkalmas. A módszer gyors, de alsó határa legalább 106–107 sejt /cm3. A sejtek alakja, mérete szerint bizonyos mikrobák külön is számolhatók (pl. baktériumok és élesztők), sőt, alkalmas vitális festési eljárással még az élő és holt sejtek is megkülönböztethetők. A számolás azonban fáradságos és pontatlan; ezen a mikroszkópos sejtszám-meghatározásra szolgáló manuális és automata műszerek igyekeznek segíteni (lásd 10.4.2.).
A mikroorganizmusok meghatározása, azonosítása A mikrobiológia kezdeteitől a morfológiai, élettani és biokémiai tulajdonságok, vagyis a fenotípusos jellemzők vizsgálatán alapult a mikrobafajok leírása és meghatározása. Később ezek kibővültek a sejtek kémiai összetételének és a szubmikroszkópos szerkezetének tanulmányozásával. Az enzimek, anyagcsereutak felderítésével még a morfológiailag kevésbé változatos baktériumok közt is nagy különbségek mutatkoztak, ami olyan tenyésztési és élettani tulajdonságokban is kifejeződött, mint a tápanyag-hasznosítás, a szaporodás, a környezeti tényezőkhöz való viszony. Egy szervezet tulajdonságainak és jellemzőinek összessége a fenotípus, amely meghatározott körülmények közt megnyilvánul. A fenotípus azonban nem állandó, hanem a környezeti feltételek hatására megváltozhat, módosul. Egy baktériumsejtben pl. megindul egy enzim termelése, ha annak szubsztrátja a környezetben megjelenik. A fenotípusos tulajdonságok azonban csak a sejtekben meglévő génkészlet szabta határok közt változhatnak; a kromoszóma-DNS-ben tárolt, örökölt 291
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek genetikai információ a genotípus. Ritkán egy populáció millió vagy milliárd sejtje közül egynek a genotípusa is megváltozhat spontán mutáció következtében, mutagének hatására gyakrabban is. A fenotípushoz képest azonban a genotípus jóval állandóbb, és alkalmasabb a mikroorganizmusok jellemzésére, míg a fenotípusos jellemzők csak meghatározott körülmények közt használhatók a mikrobák leírására és tulajdonságaik összehasonlítására. A hagyományos laboratóriumi vizsgáló módszerek a fenotípusos tulajdonságok meghatározására szolgálnak. Az utóbbi két évtizedben alakultak ki és terjedtek el a genotípus jellemzésére alkalmas molekuláris vizsgálati módszerek, amelyek pontosabb és megbízhatóbb eredményeket nyújtanak (10.1. táblázat). Ezekről a fejezet további részeiben lesz szó.
10.1. táblázat - A mikroorganizmusok jellemzésére használt módszerek áttekintése Fenotípusos jellemzők
Genotípusos jellemzők
Megjelenő tulajdonságok
Genom DNS
Alaki
G+C% bázisösszetétel
Élettani
Genom méret
Biokémiai jellemzők
Kromoszóma szám
Szerológiai tulajdonságok
PFGE
Kemotaxonómiai jegyek
DNS-DNS homológia
Zsírsav összetétel
RFLP
Poláris lipidek
PCR-rDNS
Kinonok
RAPD, AFLP
Sejtfal összetevők
Szekvenálás
Tokanyagok
rRDS szekvenciák
Fehérjék, enzimek
16S, 23S, ITS
A mikroorganizmusok leírására és azonosítására hagyományosan használt fenotípusos tulajdonságok közé morfológiai, fiziológiai és biokémiai jellemzők tartoznak (10.2. táblázat).
10.2. táblázat - Mikroorganizmusok vizsgálatára szolgáló fenotípusos jellemzők Makromorfológia
Biokémiai teszt
Telep jellemzők
Erjesztés
Mikromorfológia
Aerob hasznosítás 292
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek Alak, méret
Anyagcsere-termék
Gram-festés
Enzimek
Mozgás
N-igény
Spóraképzés
Toxinok
Tenyésztés, élettani teszt
Kemotaxonómia
Hőmérséklet
Sejtfal
Oxigénigény
Membránok
pH, av
Enzimek
Növekedési faktor
Szerológia
Gátlóanyagok
Antigének
A morfológiai jegyek a sejtek alakjára, méretére, mozgására, osztódására, kitartó vagy ivaros spóraképzési módjára vonatkoznak, valamint belső, finom sejtszerkezeti tulajdonságaira terjednek ki, amelyek mikroszkóppal vizsgálhatók. Az alaktani tulajdonságok közé szabad szemmel is észlelhető, makroszkópos jellemzők is tartoznak, mint a tenyészetek, telepek mérete, alakja, színe, állaga és mások. Az élettani jellemzők közé fiziológiai és biokémiai tulajdonságok egyaránt sorolhatók, köztük határvonalat húzni sokszor nem is lehet, pl. a szaporodás egy bizonyos szubsztrátumon egyaránt lehet élettani jellemző és az enzimaktivitásra utaló biokémiai sajátosság. Mindezek a vizsgálatok, minthogy fenotípusos jellemzőkre vonatkoznak, pontosan meghatározott módszerekkel és körülmények közt hajtandók végre annak érdekében, hogy reprodukálható adatokat szolgáltassanak.
Alaktani és mikroszkópos módszerek A mikroorganizmusok felfedezését a holland Antonie van Leeuwenhoeknak tulajdonítják, aki elsőként nemcsak megfigyelt, hanem le is írt mikroorganizmusokat. Leeuwenhoek 1632 és 1723 között élt Delftben. Kedvtelésből maga csiszolta lencséivel 50–300-szoros nagyítást ért el, amivel a legkülönbözőbb vizsgált anyagokban (esőcsepp, foglepedék stb.) egysejtű állatokat, gombákat, sőt baktériumokat is észlelt, amint erről a londoni Királyi Társaságnak küldött leveleiben és rajzaiban beszámolt. Leeuwenhoek egyszerű mikroszkópja csak egyetlen lencséből állt, a később kifejlesztett összetett mikroszkópokban már legalább két lencse (valójában lencserendszer) van; az első (objektív lencse) által felnagyított képet a második (okulár lencse) tovább nagyítja. Az utóbbi nagyítása azonban „üres”, mivel nem növeli tovább a feloldóképességet. A feloldóképesség az a legkisebb távolság, amelynél két objektum még külön látszik. A fénymikroszkópokban a tárgy megvilágítását természetes fény vagy lámpaizzó végzi, ezek objektívjeinek nagyítóképessége 10–100-szoros, feloldóképessége pedig 1,0–0,2 μm. Ha a tárgy és a lencse közé a levegő fénytörését kiküszöbölő folyadékot teszünk, a lencse nagyító- és feloldóképessége javul; erre alkalmasak az ún. immerziós objektívek. A mikroszkópos kép minősége különböző vizsgálati módszerekkel és eljárásokkal javítható. Korán kifejlődtek a mikroszkópos festési eljárások, amelyekkel a mikrobasejtek vagy azok bizonyos részletei jobban láthatóvá vagy megkülönböztethetővé tehetők. Nevezetes az a festési módszer, amelyet Christian Gram, dán orvos, 1884-ben fejlesztett ki eredetileg abból a célból, hogy a baktériumsejteket a testi szövetekben láthatóvá tegye. Az összetett festési eljárás végén bizonyos 293
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek baktériumok piros, mások sötétkék színeződést kaptak. A későbbiekben kiderült, hogy ez a festődés a sejtfalösszetétel alapvető különbségeinek következménye, ami a két nagy csoport, az ún. Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok elkülönítésének alapja, illetve vizsgálati módszere lett. Sok más festési módszert dolgoztak ki, amelyekkel pl. a baktériumok endospórái, ostorai, a sejtmagok, az élő és a holt sejtek megkülönböztethetők. A képminőség javítására különböző mikroszkópos eljárások alkalmazhatók. Ilyenek a sötét látóterű és a fáziskontraszt megvilágítás vagy a fluoreszcens és az interferencia mikroszkópia. Az elektronmikroszkóp kifejlesztése nagyrészt a német Ernst Ruska munkásságának eredménye volt, az 1930-as évek elején. A nagyjelentőségű vizsgálati módszer lényege, hogy az objektumon a fénysugarak helyett a jóval kisebb hullámhosszúságú elektronsugarakat engedik át, ezzel a nagyító- és feloldóképesség ezerszeresére fokozódik. Az átvilágító (transzmissziós) elektronmikroszkóppal 100 ezerszeres nagyítást lehet elérni, 0,5 nm-es feloldóképességgel, így nemcsak a baktériumsejtek részletei, hanem vírusok is láthatóvá tehetők. Az elektronsugarakat nem üveg-, hanem mágneses lencsékkel fókuszálják, vákuumban, ezért a vizsgálandó tárgyat előzetesen fixálni kell, és a kép valójában fényképlemezen keletkezik. A transzmissziós elektronmikroszkóp továbbfejlesztése a pásztázó (scanning) elektronmikroszkóp, amellyel az objektumok felszíne vizsgálható. Bár feloldóképessége mintegy tízszer kisebb, felszínt letapogató elektronsugárral annak finom részletei feltárhatók. Az 1980-as években új elveken alapuló mikroszkópok születettek. A konfokális lézer pásztázómikroszkóp alkalmas háromdimenziós képek alkotására oly módon, hogy a fókusz síkját fokozatosan változtatja a vizsgált tárgy mélységében, és a kapott optikai metszeteket komputerrel összesíti. További fejlesztés eredményei az ún. atomerő-mikroszkóp és a pásztázó alagútmikroszkóp, amelyekkel már 2 milliószoros nagyítást lehet elérni, és leképezhetők molekulák, sőt atomok is. Elsőként nem a biológiai objektumok közvetlen vizsgálatára voltak alkalmasak, hanem azok alkotói, így pl. a DNS-molekulák és enzimkomplexek tanulmányozására. A berendezések igényes és költséges volta miatt a mikrobiológiai vizsgálatok mindennapos gyakorlatában sem ezek, sem az elektronmikroszkóp nem szerepel.
Élettani vizsgálati módszerek Számos, a szaporodással és az anyagcserével összefüggő próba, teszt, reakció, vizsgálat használatos a baktériumok, gombák vagy más mikrobacsoportok jellemzésére. Ilyenek pl. a szaporodás különböző hőmérsékleteken, pH-nál, vízaktivitásnál, légtér-összetételnél, gátlószerek jelenlétében, továbbá sokféle tápanyag hasznosítási képessége és lebontásának módja, különböző anyagcsereutak termékeinek és enzimeinek kimutatása és egyebek. A biokémiai jellemzők sorába tartoznak a sejtek összetevőire vonatkozó vizsgálatok, pl. a fehérjék, zsírsavak, sejtfalanyagok, extracelluláris termékek elemzése. Ezekkel kapcsolatosak a szerológiai tulajdonságok is, amelyek a sejtek antigén anyagainak összetevőire utalnak. A vizsgálatok célja is többféle lehet. Az elsődleges cél általában egy izolátum azonosítása, rendszertani meghatározása vagy besorolása. A faji szintű jellemzésen túl a vizsgálat kiterjedhet a fajon belüli, törzsi szintű megkülönböztetésre is, amit tipizálásnak nevezünk, és különösen gyakori az orvosi diagnosztikai célú vizsgálatokban. Az elvégzendő, illetve végrehajtható tesztek köre nagymértékben különbözik mind a vizsgálatok célja, mind pedig a szóban forgó mikroba faja, nemzetsége vagy magasabb taxonómiai csoportba való hovatartozása szerint (10.3. táblázat). Gyakran merőben más vizsgálatok szolgálnak a különböző baktériumnemzetségek fajainak azonosítására, nem beszélve a baktériumok, gombák, algák, protozoonok körében szokásos vizsgálatok különbségeiről. A penészgombák vizsgálatánál jóval nagyobb mértékben játszanak szerepet a morfológiai, mikroszkópos tulajdonságok, mint a baktériumoknál.
10.3. táblázat - Bélbaktériumok meghatározására gyakran alkalmazott vizsgálatok Urea hasítás
KCN tűrés 294
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek Mannit hasznosítás
Fenilalanin dezamináz aktivitás
Inozit hasznosítás
Lizin/ornitin dekarboxiláz aktivitás
H2S képzés
Indol próba
Citrát hasznosítás
Metilvörös próba
Laktóz erjesztés
β-galaktozidáz aktivitás
A hagyományos élettani vizsgálatok közül sokat miniatürizált, gyári készítményekkel, egy-egy meghatározott mikrobacsoport vizsgálatára szolgáló készletekkel el lehet végezni, ezek egy része automatizált rendszerekkel is végrehajtható. Ezek a készítmények többnyire dehidratált reagenseket tartalmaznak kis, műanyag rekeszekben, amelyekbe a vizsgálandó mikroba szuszpenziójának kis mennyiségét beoltva indítják el a reakciót. Mind az inokulum készítését, mind az inkubálást és a reakciók kivitelezését standardizált körülmények közt kell végezni. Az eredmények leolvasása és értékelése történhet manuálisan, többnyire kódok leolvasásával, amit a készlethez tartozó táblázatból lehet azonosítani. Automatizált berendezések esetén a gép az értékelést is elvégzi, az eredményt kiírja, és az azonosítást is statisztikus valószínűséggel közli. Számos ilyen készlet és berendezés kapható a kereskedelmi forgalomban; használatuk különösen nagyszámú rutinvizsgálat elvégzésére előnyös. Részletesen lásd a 10.4. fejezetben.
Biokémiai vizsgálati módszerek A hagyományos fenotípusos vizsgálatok közt említett anyagcseretermékek kimutatási és enzimreakcióin kívül különböző sejtösszetevők analízise is jelentős lehet bizonyos mikrobacsoportok jellemzésében. A meghatározásokban a szénhidrátok mint sejtfalösszetevők, a zsírsavak mint a membránok alkotórészei, a fehérjék mint enzimek, a citoplazma és a sejt általános összetevői jönnek számításba. Különösen nagy jelentőségre tettek szert a nukleinsavak (DNS, RNS) elemzésére szolgáló módszerek, amelyekkel alább (10.6.) részletesen foglalkozunk. A sejtfal-összetételbeli különbségek lényegesek a baktériumok jellemzésében. Peptidoglükán (murein) csak a valódi baktériumok sejtfalában fordul elő, összetétele a Gram-negatív baktériumoknál meglehetősen hasonló, míg a Gram-pozitívoknál változatos, a hozzá csatlakozó teichoinsavakkal együtt. A kivonás, tisztítás és a gáz- és folyadékkromatográfiás elemzés meglehetősen körülményes eljárás. A sejtfalban előforduló aminosavak típusát, valamint a cukrok összetételét a teljes sejthidrolizátumból vékonyréteg-kromatográfiával és megfelelő festéssel lehet kimutatni. A mikroorganizmusok sejtjeiben több ezerféle fehérje van. A sejtek fehérje-összetételét a tenyésztési körülmények befolyásolják, ezért csak az azonos körülmények között kapott eredmények hasonlíthatók össze. A vizsgálati módszer a sejtek feltárásából és az extraktum fehérjéinek poliakrilamid-gélelektroforézissel (PAGE) való szétválasztásából áll. A fehérjék szétválaszthatók natív állapotban vagy denaturálás után, az utóbbi leggyakrabban nátrium-laurilszulfáttal (SDS) történik. A natív fehérjék megtartják enzimaktivitásukat, és specifikusan kimutathatók szubsztrátumaikkal adott reakcióik alapján. Az elektroforézissel szétválasztott natív enzimfehérjék a gélben megfelelő reakciókkal megfesthetők, így ún. zimogram készíthető. A kemotaxonómiában a membránlipidek hosszú láncú zsírsavainak analízise vált jelentős identifikálási módszerré. A sejtekből kivont lipidek savas hidrolízise után a neutrális zsírsavak acetilezve vagy anélkül, különböző gázkromatográfiás módszerekkel vizsgálhatók. A sejtek zsírsav-összetétele erősen függ a tenyésztési körülményektől. Gondosan standardizált körülmények között azonban a törzsekre jellemző zsírsavprofilok kaphatók 295
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek A sejtösszetevők igényes, nagyon pontos vizsgálata többféle nagyműszeres analízissel végezhető el. Ilyen eljárások a pirolízis tömegspektrometria, a Fouriertranszformációs infravörös spektroszkópia, az UV-rezonanciás Raman-spektroszkópia és mások. Különböző mikrobacsoportoknál ezek egyikét vagy másikát kutatási célra alkalmazzák, rutinvizsgálatokra azonban nem használatosak
Szerológiai vizsgálatok Számos sejtösszetevő antigén hatású, és az állati szervezetben ellenanyagok képzését váltja ki. Ilyen összetevők lehetnek mind a sejt felszínén megjelenő vegyületek, mint a tokanyagok, sejtfal-szénhidrátok és -fehérjék, az ostorok, extracelluláris enzimek, toxinok, mind pedig a belső összetevők, amelyek a sejtek szétesése, lízise után szabadulnak ki. Antigén jellegük lehet általános, csoport- vagy fajspecifikus, sőt törzstipikus is. Kimutatásukra többféle szerológiai reakció szolgálhat (10.4. táblázat). Ezeket a módszereket a 10.5. pontban részletezzük.
10.4. táblázat - Immunológiai vizsgálatok Közvetlen kimutatás Fluoreszcens antitest próba Latex agglutináció Immunodiffúzió ELISA Toxinok Mikrobasejtek
Mikrobiológiai gyors módszerek A mikroorganizmusok hagyományos tenyésztésén alapuló, szabványos mikrobiológiai módszerekkel való kimutatása rendkívül idő- és munkaigényes folyamat. A szelektív és differenciáló tápközegek nagyon költségesek. Az eredmények csak hosszú idő, sokszor 3–5 nap eltelte után állapíthatók meg, a kórokozók biokémiai vagy szerológiai azonosítása további napokat vehet igénybe. Az élelmiszerekkel szemben támasztott fogyasztói igények, az élelmiszer-biztonságra való törekvés, a modern minőségbiztosítási rendszerek bevezetése szükségessé tette gyors mikrobiológiai módszerek kidolgozását és alkalmazását. Az új eljárásokkal szemben támasztott alapvető követelmény, hogy azok minél gyorsabban, több mintából, kevesebb munkával, olcsóbban és informatívabban adjanak eredményt. A szubletálisan károsodott, valamint az élő, de nem tenyészthető mikrobasejtek kimutatása, esetenként a nagyszámú kísérő mikrobiota mellett a kórokozó és a romlást okozó mikroorganizmusok megbízható kimutatása, a korszerű adattárolási és -elemzési lehetőség egyaránt fontos kritériumai az új 296
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek módszereknek. A gyorsaság mellett fontos követelmény, hogy az alternatív módszert nemzetközi szabványosító testület elfogadja, illetve validálási eljáráson essen át. A korszerű módszerek a mikrobiológiai kutatások eredményein túl számos más szakterület eredményeit, így pl. a kémia, biokémia, elektronika és számítástechnika által nyújtott lehetőségeket is felhasználják. A gyors módszerek a hagyományosénál általában nagyobb fokú műszerezettséget igényelnek, automatizáltak. Jelentőségüket gyorsaságukon túl az is fokozza, hogy használatukkal az egyes laboratóriumok eredményeinek összehasonlítása megbízhatóbbá válik. A mikrobiológiai gyors vizsgálati módszerek a vizsgálni kívánt mikroba mennyiségi meghatározását, kimutatását vagy kizárását teszik lehetővé rövid idő alatt, közvetlenül a vizsgálati anyagból. A gyors módszerek többségét egy célmikroorganizmus vagy -mikrobacsoport kimutatására tervezik, ami ideálissá teszi alkalmazásukat a minőség-ellenőrző és -biztosító programokban, lehetővé téve nagyszámú élelmiszerminta gyors vizsgálatát. A legtöbb gyors módszer percek vagy órák alatt elvégezhető. A 10.5. táblázatban összehasonlítjuk a hagyományos és az alternatív, illetve gyors módszereket az érzékenység, a specifikusság és a gyorsaság szempontjából.
10.5. táblázat - A hagyományos és az alternatív, illetve gyors módszerek összehasonlítása Módszer Tenyésztéses módszerek Biolumineszcencia Áramlásos citometria DEFT Impedimetria Immunológiai módszerek Nukleinsav alapú módszerek
Érzékenység (kimutatási határ) tke/ml vagy g 100
Specifikusság
Vizsgálat időtartama
jó
1–3 nap
nem specifikus
0,5 óra
jó
0,5 óra
10 –10
nem specifikus
0,5 óra
101
közepes/jó
6–24 óra
5
közepes/jó
1–2 óra
3
kiváló
6–12 óra
4
10
102–103 3
4
10 10
Hagyományos módszerek gyorsítása és automatizálása A hagyományos, tenyésztéses mikrobiológiai módszerek meggyorsítását teszik lehetővé az egyszer használatos eszközök (műanyag pipetták, Petri-csészék stb.), a gyári, porított tápközegek felhasználása, a táptalajkészítést és -adagolást megkönnyítő, a rutin laboratóriumi műveleteket elvégző eszközök és módszerek. Ezek a tenyésztési időt nem rövidítik le, csupán az előkészítés, az értékelés munka- és anyagigényét csökkentik. A minta homogénezésének ma már széles körben elterjedten alkalmazott eszköze a Stomacher-készülék. A berendezés a steril műanyag tasakba helyezett mintát pedálok periodikus mozgatásával rövid idő alatt aprítja és egyben homogénezi. 297
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek A mintaadagolás és -hígítás automatizálását teszi lehetővé a gravimetriás hígítókészülék. Ennek segítségével a 10–25 g körüli bemért mintamennyiséghez a gép a beállított (általában tízszeres) hígításnak megfelelően automatikusan adja hozzá a hígítófolyadékot. A gyors leoltási eljárások jelentősen lecsökkentik az előkészítés idejét és munkaszükségletét, kiváltják a körülményes laboratóriumi táptalajkészítést, és elősegítik az üvegeszközök mint veszélyforrások kizárását az üzemi higiéniai vizsgálatok elvégzésénél. A különböző gyári készítmények (pl. Dip slide, Contact slide, Prognostar, Hygicult, Count-Tact, Rodac Plates) általában műanyag felületre felvitt, adott mikrobacsoport kimutatására alkalmas (pl. mezofil aerob mikrobák, koliform csoport, élesztő- és penészgombák), steril tápközeget tartalmaznak, steril, zárható tokban elhelyezve (10.3. ábra). A mintavevő lemezt a vizsgálandó folyadékba merítik, a felülethez érintik vagy tamponnal viszik fel rá a mintát. A mintavételezést követően a lemez visszazárható a tartóba, és abban inkubálható. A teszthez a gyártók az eredmény értékeléséhez képsorozatot is mellékelnek. Ezek a kereskedelemben kapható készítmények a folyékony élelmiszerek szennyezettségének, szilárd élelmiszerek felületi szennyezettségének, munkafelületek tisztaságának vizsgálatán kívül alkalmasak a személyi higiénia, pl. a kéz megfelelő tisztasági állapotának vizsgálatára is.
10.3. ábra - Higiéniai vizsgálat Hygicult lemezzel
A Petri-film különleges papírfelületre gyárilag felvitt, dehidratált tápközeget tartalmaz, amelyet vékony fólia fed. A táptalaj különböző mikrobacsoportok kimutatására alkalmas. Rehidratálása steril vízzel vagy magával az élelmiszer felcseppentésével elvégezhető. A Petri-film közvetlenül alkalmas a mikrobaszám kimutatására vízből és folyékony élelmiszerből, szilárd élelmiszerből pedig szuszpenzió készítése után. Felületek higiéniai ellenőrzésére is jól használható. A spirál lemez módszer esetén az automata készülék a Petri-csészében levő agar felületére a csésze forgatása közben a középponttól kiindulva spirális alakban, egyenletes térfogatsebességgel viszi fel az inokulumot (10.4. ábra). Ezáltal a növekvő kerületű spirál mentén a mintában található mikroorganizmusok folyamatosan hígulva kerülnek fel a lemez felületre. Ennek következtében jelentős munka- és anyagmegtakarítással, hígítási sor készítése nélkül, egyetlen táplemezen meghatározható egy élelmiszerminta élősejtszáma (102–105 tke/g vagy cm3 alatti szennyezettség esetén).
298
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek
10.4. ábra - Spirál lemez leoltás Petri-csészében
A hidrofób hálózatos membránszűrő (HGMF) rendszer hidrofób rácsokkal részekre osztott cellulóznitrát vagy cellulózacetát membrán alkalmazásán alapszik. A telepek a hidrofób kockákban szétterjedni nem tudnak, és szaporodásuk erre alkalmas kamerával már akkor érzékelhető, amikor szemmel még nem látható. A HGMF számot a legvalószínűbb élősejtszám (MPN) módszerével határozzák meg. A számolást automata számlálóegység segíti. A HGMF rendszerrel a minta hígítása nélkül egyaránt meghatározhatunk baktérium-, élesztő- és penészgombaszámot. Az új típusú, szelektív táptalajok (pl. Rambach-agar, XLD agar, Fluorocult, Fluorogen, Readycult, Chromocult táptalajok) specifikus enzimaktivitást mutatnak ki kromogén és fluorogén szubsztrátok segítségével. A kromogén szubsztrát a kimutatandó mikroba specifikus enzimjével színreakciót ad, ami a folyadék színváltozásában, illetve a szilárd tápagaron a telep jellegzetes színében mutatkozik meg. A fluorogén szubsztrátok (pl. metil-umbelliferil-glükozid, MUG) a mikroorganizmus specifikus enzimével reagálva, UV-fényben fluoreszkáló vegyületet képeznek. Ezek a tápközegek a kórokozó mikroorganizmusok gyors kimutatása mellett esetenként azonosításukat is lehetővé teszik. Megfelelő számítógépes rendszerbe kapcsolva folyamatos monitoring is lehetővé válik. Ilyen pl. a víz mikrobiológiai minőségét figyelemmel kísérő „CALM” rendszer (Colifast At-line Microbial monitor). Automata leolvasóberendezés segítségével a táplevesben bekövetkező fluoreszcencia, így a baktériumok jelenléte 1–12 órán belül kimutatható, ezzel gyors beavatkozás válik lehetővé. Hasonló, kromogén és fluorogén szubsztrátot használó enzimaktivitás kimutatására épülnek a SimPlate gyorstesztek, amelyek a határhígításos eljárás elvén működnek. A módszer elsősorban a kis sejtszámú minták esetén használható. A 84 vagy 198 tesztlyukat tartalmazó műanyag lemezre kész dehidrált táptalaj beoltásával/visszanedvesítésével viszik fel a mintát. A kromogén/fluorogén tápközegek segítségével szelektíven meghatározható az élelmiszerek mikrobaszáma (koliform-, E. coli, penész-, élesztő-, illetve Campylobacter-szám) akár <10 sejt/cm3 szennyezettség esetén is. Nagyszámú minta vizsgálatakor a telepszámok megállapítását telepszámláló berendezések segítik. A telepek számlálása beépített kamerával, a kiértékelés pedig számítógéppel történik. A mikroorganizmusok biokémiai azonosítását segítik a miniatürizált identifikáló rendszerek (pl. API, BBL-Chrystal, ENTEROTUBE, MICRO ID). A tesztek biokémiai reakciók vizsgálatára alkalmas kis kamrákat tartalmaznak, amelyeket beoltva, inkubálás után értékelnek. A pozitív reakciót szemmel látható színváltozás, zavarosságváltozás, esetenként UV-fényben való fluoreszkálás jelzi (10.5. ábra). Számítógépes program/adatbázis vagy meghatározási kulcs segítségével határozzák meg az ismeretlen tenyészet faji hovatartozását. 299
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek
10.5. ábra - Enterobaktériumok azonosítása API teszttel
A direkt sejtszámlálás újabb módszerei A direkt sejtszámlásra alkalmas részecskeszámláló berendezések egy részében kapillárison halad át a mikrobaszuszpenzió. A sejteket a mérőkapun áthaladva, az átmenő áramimpulzusok alapján, tömegük szerint osztályozva számlálják. Az eredetileg a gyógyászatban, vérsejtek számlálására használt berendezésekkel (Picoscale, Laborscale) gyümölcslevek tárolás alatti változása is jól nyomon követhető. Az átfolyó (flow) citometria esetén a sejteket gyorsan mozgó folyadékáramban áramoltatják. A mérőállomásnál áthaladva a megvilágító fény szóródik a sejteken. A fény szóródásának intenzitása információt szolgáltat a sejtszám mellett a sejt alakjáról, méretéről, életképességéről és felületi morfológiájáról is (10.6. ábra). A vizsgálat előnye, hogy folyadékok esetén „real-time” módszerként alkalmazható. Érzékenysége növelhető fluoreszkáló festékek alkalmazásával.
300
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek
10.6. ábra - Az áramlásos citometria működési elve
A mikroszkópos módszerek kimutatási határa meglehetősen nagy, 106 sejt/ml vagy sejt/g, azaz csak akkor használhatók közvetlenül, ha az élelmiszerminta mikrobás szennyezettsége nagy. A mikroszkópos módszerek érzékenysége növelhető membránszűréssel. A direkt epifluoreszcenciás szűrési technikánál (DEFT) a folyadékvagy élelmiszer-szuszpenzió membránszűrése után a szűrőn felfogott mikroorganizmusokat fluoreszkáló festékkel (pl. akridin naranccsal) festik meg. A membrán mikroszkóptárgylemezre helyezve, fluoreszcens mikroszkóp alatt vizsgálható. Ultraibolya fény hatására a festéket felvett sejtek fluoreszkálnak, ami a számlálást segíti. Az előkezelés és számolás együttesen 30 percet vesz igénybe. A módszert eredetileg a nyers tej mikroorganizmusainak gyors számlálására, minőségi átvételére fejlesztették ki. Ma már automatizált formában is használható (COBRA-tejvizsgálat, Bactocount), gyorsan szűrhető termékekből óránként akár 70 minta vizsgálatát is lehetővé téve. A DEFT technika alkalmas baktériumok, élesztő- és penészgombák összes számának meghatározására különböző termékekben (pl. tej, joghurt, italok, húsfélék, hal, paradicsompüré).
Kémiai módszerek Az ATP-meghatározás az ún. real time (menet közben eredményt adó) eljárások közé tartozik. A módszer a szentjánosbogár fénykibocsátásában is működő luciferinluciferáz enzimrendszert alkalmazza. Minden élő sejt tartalmaz ATP-t, amely a sejt pusztulása esetén gyorsan elbomlik. Ennek az ATP-tartalomnak a meghatározása az alapja a mikrobás szennyezettség becslésének luminometriás vizsgálat révén. Az enzimes reakció hatására a jelen levő ATP fénykibocsátás mellett reagál. Az ATP extrakcióját követően a fénykibocsátás mérése a meghatározás lényege.
A reakció pH-optimuma 7,75, optimális hőmérséklete 15–25 ºC. Ideális esetben a kimutatás érzékenysége eléri a 10–13 g ATP-mennyiséget, amennyit már 5–10 élesztősejt vagy kb. 100 baktériumsejt tartalmaz. A kézi luminométerrel mért, relatív fényegységekben kifejezett fényintenzitás és az ATP mennyisége között szoros összefüggés tapasztalható. A vizsgálat időszükséglete az ATP extrakciójával együtt mindössze 15–20 perc.
301
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek Élelmiszerek vizsgálatánál a fő gondot az okozza, hogy a növényi és állati sejtekben a mikroba eredetűnél lényegesen nagyobb koncentrációban van ATP. A mintában levő mikroba-, illetve növényi vagy állati eredetű sejtek azonban detergenssel való előkezelés után egymástól elkülöníthetők. Nyersanyagok (tej, hús, hal), késztermékek (italipar, tejipar, kozmetikai ipar), vízvizsgálatára, valamint starterkultúrák aktivitásának megállapítására alkalmazható. A luminometriás módszert leggyakrabban a felületek higiéniai vizsgálatára használják, ahol a tisztítás-fertőtlenítés hatásfokának ellenőrzése néhány perc alatt megoldható. Számos, ATPmeghatározásra alkalmas berendezés van forgalomban (Biotrace, SystemSURE, HY LITE stb.; 10.7. ábra).
10.7. ábra - Luminométer ATP kimutatására
A penészgombák kimutatására szolgál a kitin és az ergoszterin kémiai analitikai meghatározása. A penészszennyezettség mérése azon alapszik, hogy a kitin a gombafonal fő komponense. A módszer a kitin glükózaminná való lebontásából és az ezt követő kolorimetriás vagy kromatográfiás meghatározásból áll. Az eljárás azonban nem elég érzékeny, továbbá pontatlan a különböző gombafajok glükózamin-tartalmának változása és az élelmiszer esetleges rovarrészekkel való szennyeződése miatt. Ezért a nagy glükózaminszint nem jelez szükségszerűen penésszel szennyezett nyersanyagot.
302
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek A gyakrabban használt másik kémiai módszer az ergoszterin meghatározása. Az ergoszterin a legtöbb gomba fő membránkomponense. A növényekben nem vagy csak kismennyiségben fordul elő, ezért a módszer főként gabonák penésztartalmának becslésére alkalmas. A penészfajok ergoszterintartalmának különbözősége miatt megkérdőjelezhető a meghatározás pontossága. A Limulus teszt segítségével a hőkezelésen átesett élelmiszerekben következtethetünk a Gram-negatív baktériumok mennyiségére. Ennek elve, hogy a Gram-negatív baktériumok külső membránjának endotoxinjai és a Limulus polyphemis tengeri rák lizátuma kicsapásos (gélképződéssel járó) reakciót ad. Az enterobaktériumok által termelt endotoxinnak már nagyon kis mennyisége koagulációt vált ki, ezért a módszer nagyon érzékeny. A zsírsavanalízis identifikálási módszerként alkalmazható a mikrobiológiában. Kis szénatomszámú zsírsavak gáz- vagy folyadékkromatográfiás meghatározásával adott zsírsavösszetétel alapján meghatározható az azonosítani kívánt mikroorganizmus faja. Ehhez szükség van egy „kód” könyvtárra, amely ismert mikroorganizmusok zsírsavösszetételét tartalmazza. Fehérjék és aminosavak elektroforézises elemzése hasonló identifikálási módszer, mint a zsírsavanalízis. A fehérje- vagy aminosav-molekulák elektromos erőtérben feszültség alá helyezve szétválaszthatók. A fehérje- vagy aminosav-összetétel alapján egy „kód” könyvtár segítségével az ismeretlen törzs meghatározható. A tenyésztésen alapuló mikrobiológiai vizsgálati módszereknél jóval gyorsabbak a mikrobák anyagcseretermékeire vagy enzimeire irányuló kémiai-biokémiai módszerek. Meghatározott esetekben ezek is alkalmasak lehetnek a mikrobiológiai biztonság vagy minőség jelzésére. Így pl. a hőstabilis dezoxiribonukleáz jellemző az enterotoxinképző Sta. aureusra, ultraibolya fénnyel való megvilágítással jelezhető az aflatoxin jelenléte, a lúgos foszfatázaktivitás a tejben a pasztőrözés utáni szennyeződésre utal, a nagy ATPáz-aktivitás általános szennyezettséget, rossz higiéniai állapotot jelez. A reduktáz próbák (rezazurin, TTC [trifenil-tetrazolium-klorid], metilénkék) az élő mikroorganizmusok anyagcsere-tevékenysége okozta változások mérését teszik lehetővé a tápközegekben. A reduktáz próbákban alkalmazott festéket a mikroba-dehidrogenázok redukálják; a bekövetkező színváltozás mértéke arányos a mikrobasejtek számával, amelyre kalibráció segítségével következtethetünk. A mikrobák által termelt CO2-színreakció alapján való műszeres érzékelése teszi lehetővé rövid időn belül aerob és fakultatív anaerob baktériumok automatikus és kvalitatív kimutatását. A készülék (Bact/Alert 3D) elsősorban gyümölcslevek és UHT tejtermékek sterilitásának vizsgálatára alkalmas.
Fizikai módszerek Az impedancia és konduktancia mérésén alapuló módszerek (Bactometer, Malthus, RABIT, BacTrac) lényege a mikrobák szaporodása során bekövetkező ellenállásvagy vezetőképesség-változás mérése, és lehetővé teszik az élelmiszerekben lévő baktériumok és élesztőgombák minőségi és mennyiségi meghatározását. A számítógéppel vezérelt berendezések teljesen automatizáltan működnek. A mérés elve az, hogy a táptalajban lévő, nagy molekulájú, töltetlen vagy kis mértékben töltött vegyületek a mikroorganizmusok anyagcsere-tevékenysége következtében töltéssel rendelkező, kis molekulájú vegyületekké alakulnak, s ezáltal növelik a tápközeg vezetőképességét (10.8. ábra). Mivel az impedancia/vezetőképesség erősen függ a hőmérséklettől, azt a berendezésekben pontosan szabályozzák. A vizsgálandó mintával beoltott táplevesbe merülő elektródokkal a berendezés meghatározott időközönként méri, és regisztrálja az oldat vezetőképességét. A mérés során a készülék automatikusan meghatározza az ún. detekciós időt, azt az időtartamot, amely alatt a mikrobaszaporodás által okozott változás egy bizonyos küszöbértéket elér. A detekciós idő fordítottan arányos a minta eredeti mikrobaszámával, és függ a kezdeti mikrobaszámtól, a vizsgált mikroorganizmus szaporodási 303
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek kinetikájától, valamint a tápközeg tulajdonságaitól. Megfelelő kalibráció alapján a detekciós időből a mikrobaszámra következtethetünk (10.9. ábra). Az induló sejtszámtól függően akár néhány órán belül eredményt kaphatunk.
10.8. ábra - A konduktometriás mérés elve
304
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek
10.9. ábra - Direkt impedimetriás görbék és a TTD és a sejtszám közötti összefüggés
Az ún. indirekt vizsgálati módszer esetén a készülék a mikrobák által termelt szén-dioxidot regisztrálja. Az elektródok nem érintkeznek közvetlenül a vizsgálandó mintával, hanem a mérőcellába elhelyezett kálium-hidroxidba merülnek. A termelődő szén-dioxid elnyelődik a lúgban, és kálium-karbonát képződik, ami viszont kisebb vezetőképességű, mint a kálium-hidroxid. Ebben az esetben a detekciós idő kritériuma a vezetőképesség meghatározott mérvű csökkenése (10.10. ábra). Ily
305
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek módon bármilyen, a hagyományos tenyésztéses eljárásoknál használt szelektív táptalaj segítségével a lassan tenyészthető vagy csekély impedanciaváltozást okozó baktériumok és élesztőgombák is kimutathatók.
10.10. ábra - Saccharomyces cerevisiae indirekt impedimetriás szaporodási görbéje
A módszer számos élelmiszer mikrobiológiai vizsgálatára alkalmas. A kórokozó és indikátor baktériumok (többek között Salmonella, Li. monocytogenes, Campylobacter, Sta. aureus, E. coli, koliformok) mellett kimutathatók az üdítőitalok és szörpök romlását okozó élesztőgombák (pl. Zygosaccharomyces, Brettanomyces). Antimikrobás anyagok hatékony koncentrációjának megállapításában, továbbá a prediktív mikrobiológiai modellek alkotásához szükséges adatgyűjtésben is segítséget nyújtanak ezek a műszeres gyors módszerek. Az oldatok turbiditásának mérésén alapuló fotometriás automata berendezések (bioscreen) használata is elterjedt. Tiszta oldatokban szaporodva a mikroorganizmusok zavarosodást okoznak, a fényáteresztő képesség csökkenése a szuszpendált mikrobák számával arányos. Hátránya, hogy élelmiszerminták vizsgálatára nem alkalmas. Tiszta tenyészetek esetén azonban egyszerre nagyon sok minta feldolgozása, számos, szaporodást befolyásoló paraméter egyidejű vizsgálata lehetséges. Radiometriás módszer esetén a tápközeg radioaktív izotóppal jelzett szubsztrátot (pl. 14C cukrot) tartalmaz. A szubsztrátból képződő anyagcseretermék (pl. CO2) radioaktivitását automata készülékkel (bactec) mérjük. Az élelmiszerek minőségi-biztonsági jellemzőit meghatározó hagyományos kémiai vagy mikrobiológiai módszerek többnyire a vizsgált minták roncsolásával járnak és vegyszert igényelnek. A szubjektív érzékszervi vizsgálatokat is helyettesítő, objektív, gyors, roncsolásmentes és vegyszert nem igénylő módszerek/műszerek fejlesztése és bevezetése az élelmiszer-ipari termékek vizsgálatában egyre nagyobb teret hódít. Az ún. elektronikus orr az utóbbi 20 évben jelent meg. A módszer alapját egy kémiai érzékelősor képezi, amelynek egyedi érzékelői nagy érzékenységűek, de kis specifitást mutatnak az egyes egyedi molekulákra. Az illékony komponensekre különböző jelválaszokat adnak, a gázkeverék ún. ujjlenyomatát hozzák 306
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek létre. Elektronikus orr esetén nem az egyedi komponensek szelektív elemzése, hanem az aktuális mérés komplex jelválaszát és a korábban mért minták eltárolt jelválaszát hasonlítják össze; ehhez igen komoly matematikai statisztikai módszerekre van szükség. A módszer alkalmazási területe az élelmiszeriparban egyre bővül; többek között alkalmazható a sajtok osztályba sorolására, gabonafélék minőségének megítélésére (penészes, savanyú, égett, idegen illat), gyümölcsök frissességének, az optimális tárolási idő és körülmények meghatározására is. Sikerrel használták húsokban előforduló patogén mikroorganizmusok kimutatására, a romlás előrejelzésére. Szintén roncsolásmentes, a kémiai analízist kiváltó vizsgálati módszer a közeli infravörös reflexiós (NIR) technika. A NIR spektrum adott minta abszorpciós vagy transzmissziós tulajdonságait írja le az 1000–2500 nm hullámhossztartományban, amely az analizált anyag molekuláris összetételét tükrözi. Az abszorpció mértéke adott hullámhossznál arányos a kémiai összetevő koncentrációjával. Az élelmiszerek kémiai komplexitása miatt matematikai modellezésre van szükség ahhoz, hogy megkapjuk a NIR-spektrum és a más (referencia) analitikai módszerekkel mért kémiai összetétel közötti összefüggést a mintában. A NIR technikát már hosszú ideje használják az élelmiszeriparban a kémiai összetevők (fehérjék, szénhidrátok) gyors mennyiségi meghatározására. A módszer alkalmas lehet a penészbiomassza mérésére is, a gabonafélék, takarmányok, fűszerek és paradicsomsűrítmény penésztartalmának becslésére. A mérőműszer kalibrálásához referencia módszerre van szükség; a penész meghatározásra alkalmas módszerek azonban kisebb-nagyobb hibával terheltek. A NIR technika nagy előnye a gyorsaság, továbbá, hogy környezetkímélő, a vizsgálatnál nincs vegyszermaradvány A mikroorganizmusok szaporodásuk közben hőt termelnek, amely érzékeny mikrokaloriméterrel mérhető. Mikrokalorimetriával lehetőség van mikroorganizmusok mennyiségi meghatározására, amennyiben a termelődött hőmennyiség és az élősejtszámok között egyenes összefüggést tapasztalható a 102–108 tke/ml tartományban. Kalibrációs görbe segítségével a minta sejtszáma becsülhető. A konzervek sterilitásának vizsgálatára, a tej és a darált hús mikrobaszámának megállapítására dolgoztak ki mikrokalorimetriás módszert. Az élelmiszerminták előkészítés nélkül, eredeti fizikai állapotukban, a mikrobasejtek „in vivo” vizsgálhatók.
Immunológiai módszerek Az immunológiai módszerek az antigének és az ellenük termelt ellenanyagok (antitestek) specifikus reakcióján alapulnak. Az ellenanyagokat a melegvérű állatok és az ember B limfocitái termelik a szervezetet fertőző vírusok, baktériumok, gombák és paraziták ellen. Az ellenanyag-termelést a mikrobákat felépítő szerves molekulák, az antigének váltják ki (indukálják). Az antigének általában nagy, komplex polimer molekulák, amelyek legfontosabb tulajdonsága, hogy immunválaszt váltanak ki. A legjobb (legerősebb) antigének közé tartoznak a fehérjék, glikoproteinek, lipoproteinek és nukleoproteinek, de a poliszacharidok, lipopoliszacharidok és nukleinsavak is ellenanyag-termelést indukálnak. A szervezetbe jutó antigének (akár egyetlen antigén is) többféle, ún. poliklonális ellenanyag termelését indukálja. Az ellenanyagok a vérszérum globuláris fehérje frakciójához tartoznak (immunglobulinok, Ig), és molekuláik hasonló szerkezet szerint épülnek fel. Az alapmolekula két hosszú (más néven nehéz, H) és két rövid (könnyű, L) láncból áll, amelyeket diszulfid kötések kapcsolnak össze. Az immunglobulinokat a H lánc típusa alapján öt csoportba sorolják (IgA, IgD, IgE, IgG és IgM), amelyek közül a mikrobák elleni védekezésben és a diagnosztikai célú alkalmazásnál az IgG-nek van a legnagyobb jelentősége (10.11. ábra). Az IgG-molekula két antigénkötő helye (ún. paratopja) gyenge kémiai kötésekkel kapcsolódik az antigén kötőhelyeihez, az ún. epitopokhoz. Az antigén-ellenanyag kapcsolódás eredményeként az antigén inaktiválódik; ha az antigén a mikrobasejt létfontosságú összetevője volt, a mikroba elpusztul.
307
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek
10.11. ábra - Az IgG ellenanyag szerkezete
A mikroorganizmusok és az általuk termelt extracelluláris makromolekulák (exotoxinok, poliszacharidok, enzimek), valamint a vírusok jó antigének. Valójában egy-egy sejt vagy vírus több millió antigént tartalmaz, ezért az immunrendszer is milliós nagyságrendben termel ellenük specifikus ellenanyagot. Ezt a keverék ellenanyagot poliklonális antitesteknek hívjuk. Poliklonális ellenanyagok segítségével azonban nehéz az immunológiai módszerek standardizálása, mivel a reakcióban részt vevő ellenanyagok nagyfokú heterogenitást mutatnak. A molekuláris genetika fejlődésének köszönhetően (a hibridoma technika segítségével) ma már szinte korlátlanul lehet monoklonális ellenanyagokat előállítani, amelyek csak egyféle ellenanyagot tartalmaznak. Ennek révén hatalmas fejlődés figyelhető meg az immundiagnosztikában. A legtöbb lehetőséget az élelmiszerekkel terjedő patogén baktériumok kimutatása és azonosítása területén nyújtják ezek a technikák. A baktériumok antigénjeit elhelyezkedésük alapján három csoportra oszthatjuk (lásd a 4.2. ábrát): 1. Sejtfelületi antigének. Ezekkel az antigénekkel találkozik először az immunrendszer, és intakt baktériumok esetében ezekkel reagálnak elsőként az ellenanyagok, ezért szerológiai szempontból a legfontosabb antigének tartoznak ide. Képviselőik a csillóantigének (H-antigének), a tokantigének (kapszula, K-antigének), a sejtfal antigénjei (szomatikus, O-antigének), a fimbriák és a Gram-negatív baktériumok külső membránjának antigénjei. 2. Belső sejtantigének. A sejtfal belső rétegeiben és a citoplazmában helyezkednek el, ezért intakt sejtek esetében az ellenanyagok számára nem hozzáférhetők. 3. Extracelluláris antigének. A sejtek által kiválasztott, elsősorban protein- és glikoproteinmolekulák. Ide tartoznak az exotoxinok, a bakteriocinek és az exoenzimek (pl. sztreptokináz, hemolizin, kollagenáz, foszfolipáz, DNáz). A szaporodás nem minden stádiumában termelődnek (pl. exotoxinok), vagy termelődésük nem egyenletes, esetleg indukciót igényel.
308
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek Az antigén-ellenanyag reakció azonban nemcsak a szervezeten belül (in vivo) játszódik le, hanem a vérből kivont ellenanyag in vitro is reagál a hozzáadott antigénnel, amit szerológiai reakciónak hívunk. A szerológiai reakció típusát az antigén tulajdonságai határozzák meg, mivel az ellenanyagok kémiai szerkezetüket tekintve azonosak (10.6. táblázat).
10.6. táblázat - A szerológiai reakciók típusai és jellemzői Szerológiai reakció
Antigén
Ellenanyag
Agglutináció
Teljes sejtek
Agglutinin
Precipitáció
Oldott (kolloidális) makromolekulák
Precipitin
Sejtlízis
Sejtmembrán
Lizin
Toxin-antitoxin reakció
Extracelluláris toxin
Antitoxin
Abban az esetben, ha a szerológiai reakcióban teljes mikrobasejtek vagy nagyobb sejtrészeik vesznek részt, az antigén-ellenanyag reakciót szemmel látható kicsapódás, agglutináció jelzi. Az agglutinációt számos mikroba kimutatására használják annak ellenére, hogy érzékenysége más immunológiai reakciókhoz képest kicsi. Leggyakoribb formája a tárgylemez-agglutináció, amikor az azonosítandó mikroba sejtjeiből tárgylemezen sűrű szuszpenziót készítenek, majd hozzáadják az azonosításhoz használt szérumot (ellenanyagot), ami a sejtek összecsapódását váltja ki. Hasonló reakció játszódik le precipitáció során is, ekkor azonban az antigének kicsapódása (precipitációja) szabad szemmel alig látható, ezért csak mikroszkóp alatt értékelhető. Különösen jól használhatók a patogén baktériumok virulenciafaktorait kimutató agglutinációs és precipitációs reakciók, amelyek során az antigének szerkezetében megnyilvánuló kisfokú különbségek (akár egyetlen aminosav eltérés) is kimutatható a diagnózisra használt immunszérumok sorozatának hozzáadásával. Ezt a módszert szerotipizálásnak hívják, amellyel gyorsan és pontosan azonosíthatók, illetve megkülönböztetők a vizsgált izolátumok. Így pl. meghatározható, hogy a vizsgált E. coli-izolátum az O antigén szerint a 157-es szerotípushoz tartozik-e vagy sem. Az extracelluláris antigének (pl. exotoxinok) precipitációs reakciót adnak az ellenanyaggal, azonban viszonylag nagy koncentrációban kell, hogy jelen legyenek a vizsgált mintában. A szerológiai reakció érzékenysége lényegesen megnövelhető a latexagglutináció alkalmazásával. Ennek során fehér latex- (műanyag) gyöngyök felületére rögzített ellenanyagokat adnak az azonosítandó antigénekhez, pl. baktériumokhoz. A pozitív reakciót a latexgyöngyök összecsapódása, agglutinációja kíséri. Számos patogén baktérium azonosítására fejlesztettek ki latexagglutinációs tesztet, pl. a Sta. aureus, Str. pyogenes, Campylobacter spp., E. coli O:157 ennek segítségével gyorsan kimutatható. Az ellenanyagokat mágneses gyöngyök felületére is lehet rögzíteni. Ezek megkötik a specifikus antigént tartalmazó sejteket, amelyek aztán külső mágnes segítségével összegyűjthetők és elkülöníthetők a mintából. Ezzel az immunmágneses szeparálással a patogén baktériumok tenyésztés nélkül is feldúsíthatók, illetve a gyöngycsapdához kötött sejtek kitenyészthetők és tovább vizsgálhatók. Ahhoz, hogy egy szerves molekula immunválaszt váltson ki, meghatározott méretet (kb. 5000 daltont) el kell érnie, ezért a kisméretű szerves molekulák (pl. szerves savak, antibiotikumok, mikotoxinok) nem immunogén hatásúak. Abban az esetben azonban, ha ezeket a molekulákat egy nagyobb, immunogén hordozóhoz (pl. fehérjéhez) kovalensen hozzákötik, specifikus ellenanyagok termelődnek. Az ellenanyagok egy része azonban nemcsak a teljes antigénnel reagál, hanem a szabadon lévő szerves kismolekulával is, amelyet hapténnek (fél antigénnek) neveznek. Ennek alapján fejlesztettek ki számos élelmiszer-vizsgálati tesztet, pl. ezen alapszik az antibiotikumok, mikotoxinok, hormonok, konzerválószerek immunológiai kimutatása. 309
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek Az enzimhez kötött ellenanyagokkal való antigéndetektálás (enzyme immuno assay, EIA) a legelterjedtebb immunológiai eljárás a patogén és a romlást okozó mikroorganizmusok azonosítására és vizsgálatára. A módszer lényege, hogy a vizsgálandó mikroorganizmusra specifikus ellenanyaghoz enzimet kötnek (konjugálnak), amelyet specifikus színreakcióval mutatnak ki. Leggyakrabban torma-peroxidázt, lúgos foszfatázt és -galaktozidázt alkalmaznak a jelölésre. A direkt (más néven szendvics) ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) módszer esetében a vizsgálandó mikroorganizmust hordozóhoz (pl. mikrotiter lemez falához, membránhoz, műanyag pipettahegyhez) rögzített ellenanyaggal kötik meg, majd a meg nem kötött antigéneket kimossák. A következő lépésben hozzáadják az enzimhez kötött második specifikus (riporter) ellenanyagot, majd a meg nem kötött konjugátumot kimossák. A megkötött riporter ellenanyagot az enzimre specifikus szubsztrátum hozzáadásával mutatják ki úgy, hogy a reakció lejátszódását színreakció kíséri. A módszer neve abból ered, hogy az antigén és a közrefogó két ellenanyagréteg szendvicsszerű szerkezetet hoz létre (10.12. ábra). Az eljárás kvantitatívvá is tehető, mivel a termelt színanyag mennyisége arányos a vizsgált antigén mennyiségével.
310
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek
10.12. ábra - Az ELISA módszer vázlata
Az ELISA módszer egyik nagy előnye, hogy viszonylag rövid idő (1–3 óra) alatt megbízható eredményhez vezet, azonban a teszthez kb. 105 sejt/ml koncentrációban kell jelen lennie a kimutatandó mikrobának. Ez patogének esetében általában előzetes dúsítást igényel, ami lényegesen meghosszabbítja a vizsgálat idejét. Gyorsítható a teszt olyan bemerülő lemez vagy propeller alkalmazásával, amely az elődúsítóból megköti a sejteket, így a dúsítás helyett egyszerű (gyorsabb szaporodást biztosító) táptalaj is elegendő a baktérium felszaporításához.
311
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek Az ELFA (enzyme linked fluorescent assay) annyiban különbözik az ELISA-tól, hogy a második ellenanyaghoz nem enzimet, hanem fluoreszkáló molekulát kötnek, ezért a végpontjelzés fluoreszcenciásan történik. A RIA (radio immunoassay) vizsgálatok esetén az antigént vagy az antitestet lágybéta sugárzó izotóppal (125I, vagy 14 C) jelölik, és szcintillációs számlálóval mérik a sugárzás erősségét. Az immunológiai módszerek (elsősorban az ELISA) alkalmazása rohamosan terjed a élelmiszer-mikrobiológiai laboratóriumi vizsgálatokban, ami a sokféle kórokozó mikrobára kifejlesztett teszteken kívül az automatizálásnak is köszönhető. Ilyenek pl. a VIDAS (bioMerieux), az Opus (Tecra) és az EIAFoss (Foss Electric) automatizált készülékek. Számos, kereskedelmi forgalomban kapható immunológiai eljárást validáltak, amelyek közül a leggyakrabban alkalmazott teszteket a 10.7. táblázatban mutatjuk be.
10.7. táblázat - Kereskedelmi forgalomban lévő immunológiai tesztek az élelmiszer eredetű és higiéniai szempontból fontos patogének és toxinok kimutatására Eljárás Immunprecipitáció
Latex agglutináció
Immunmágneses szeparálás
Organizmus
Gyártó
E. coli O157:H7 (EHEC)
PetrifilmHEC
3M
Listeria monocytogenes
Clearview
Unipath
Vibrio cholerae
CholeraSMART New Horizon
E. coli O157:H7 (EHEC)
Prolex
PRO-LAB
Listeria monocytogenes
Listeria latex
Unipath
Campylobacter
Campyslide
Salmonellaspp.
Bactigen
Becton Dickinson
Staphylococcus aureus
Staph Latex
E. coli O157:H7 (EHEC)
Dynabeads
Dynal Oxoid
E. coli ETEC– hőstabil toxin
E. coli ST
VICAM
Listeria monocytogenes ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)
Teszt neve
Wampole Labs Difco
Listertest
E. coli O157:H7 (EHEC)
TECRA
TECRA
Listeria monocytogenes
Listeria-TEK
Organon Teknika
312
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek Bacillus cereus
TECRA
TECRA
Clostridium botulinum
ELCA
Elcatech
Salmonella spp.
Salmonella TEK Organon Teknika
Staphylococcus aureus
S. aureus VIA
TECRA
Sta. aureus enterotoxin
SET-EIA
Toxin Technology
VIDAS
bioMERIEUX
Listeria monocytogenes
VIDAS
bioMERIEUX
Campylobacter spp.
VIDAS
bioMERIEUX
ELFA (Enzyme-linked fluorescent assay) E. coli O157:H7 (EHEC)
Molekuláris módszerek Mint arról már szó volt, az élőlények fenotípusát (morfológiai, biokémiai, élettani és egyéb tulajdonságait) erősen befolyásolja az élőhelyük környezete. Különösen igaz ez a mikroorganizmusokra, amelyek alkalmazkodása a megváltozott környezeti viszonyokhoz általában a fenotípus változásával jár. Ennek következtében a fenotípusos vizsgálaton alapuló kimutatási (diagnosztikai) és azonosítási (identifikálási) módszerek a megbízható eredményekhez a vizsgálati körülmények standardizálását követelik meg. Ezzel szemben az élőlény genotípusa (a genomi jellemzők összessége) a környezeti hatásoktól szinte függetlenül, mindenfajta környezetben állandó, és az örökítőanyagot alkotó DNS (a genom) nukleotidszekvenciájával egyértelműen jellemezhető. A genom állandósága azonban relatív, mivel a genetikai változékonyság ugyancsak jellemzője az élőlényeknek. A genetikai változások azonban jól nyomon követhető mutációkban és rekombinációkban nyilvánulnak meg, amelyek tovább öröklődnek az utódsejtekben, így a genom szintű vizsgálatok az élőlény jellemzésén kívül lehetőséget adnak a rövid távú (mikroevolúciós) és a hosszú távú (makroevolúciós) változások kimutatására, nyomon követésére is. Egy-egy mikroorganizmus-törzs a genomi szekvenciával egyértelműen jellemezhető, azonban erre a rutin mikrobiológiai vizsgálatokban, diagnosztikában ritkán nyílik lehetőség. A molekuláris technikák általában egy vagy néhány kiszemelt gén vagy jellemző nukleinsav-szekvencia kimutatásán, vizsgálatán alapulnak, amelyeket a legtöbb esetben az adott élőlény fenotípusos jellemzői alapján választanak ki. Különösen igaz ez a patogén mikroorganizmusokra, amelyeknél a patogenitási (virulencia)faktorokat kódoló gének általában fontos célpontjai a molekuláris vizsgálatoknak. A sejtes mikroorganizmusok (baktériumok, gombák, prozoonok, algák) genomja kétszálú (double-stranded, ds) DNS-molekulákból áll, amelyekben a két szál egymás komplementere, és a két szálban lévő AT és GC bázispárokat hidrogénhidak kapcsolják össze. Denaturálás következtében a két szál elválik egymástól, majd renaturálás során ismét visszaalakul az eredeti, kétszálú szerkezet. Nemcsak az eredeti DNS-szálak között jöhet létre azonban a kapcsolódás, hanem olyan, különböző eredetű DNS-szálak között is, amelyek teljes vagy részleges homológiát mutatnak, vagyis az egyszálú DNS-molekuláik kiegészítik egymást. Ebben az esetben hibridizációról beszélünk. A genomban tárolt genetikai információ (a gének) kifejeződése (expressziója) során a DNS először RNS-sé íródik át (ez a transzkripció), így mRNS-, rRNS- és tRNS-molekulák keletkeznek. Az mRNS lefordítása (transzlációja) fehérjemolekulák képződését eredményezi, amelyek 313
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek kialakítják és meghatározzák az élőlény fenotípusát. Nem a teljes genom íródik át azonban, vannak ún. nem kódoló szekvenciák is, amelyek szintén célpontjai lehetnek a molekuláris vizsgálatoknak. Egy adott vizsgálati időpontot tekintve nem minden gén „aktív”, azaz nem íródik át valamennyi, ezért az mRNS-vizsgálaton alapuló módszerek nem adnak teljes képet az élőlény genotípusáról. Az is igaz azonban, hogy a génkifejeződést elősegítő vagy gátló hatások tanulmányozása is fontos része lehet a molekuláris vizsgálatoknak (gondoljunk csak a toxintermelés befolyásolására), illetve egy gén jelenlétének kimutatásából még nem lehet egyértelműen következtetni a géntermék aktivitására vagy hatására. Ilyenek pl. a mikotoxinok termelésében szereplő gének, amelyek olyan fajokban vagy törzsekben is jelen vannak, amelyek nem termelnek kimutatható mennyiségben mikotoxinokat. Ezekben az esetekben általában a reakcióút enzimei nem termelődnek vagy nem aktívak. A vírusok egy része RNS-ből álló genomot hordoz, az élelmiszerekkel terjedő vírusokra pedig éppen az RNS genom jellemző. A vírusok kimutatása mind élelmiszerbiztonsági, mind pedig higiéniai szempontból egyre fontosabbá válik, ezért az RNS alapú módszerek ma már a rutin mikrobiológiai molekuláris vizsgálatoknak is fontos részét képezik. A molekuláris diagnosztikai módszerek alapvetően háromféle eljáráson alapulnak, nevezetesen • a sejtekből kivont DNS közvetlen vizsgálatán, • a hibridizációs technikákon, és • a polimeráz láncreakció (röviden PCR) alapú módszereken. Ezeket a technikákat számos esetben kombinálják egymással vagy más diagnosztikai, elsősorban ELISA alapú módszerekkel.
Izolált DNS közvetlen vizsgálata: az RFLP analízis Jóllehet a sejtekből izolált genomi DNS közvetlen vizsgálata indította el a molekuláris módszerek kifejlesztését, rutin diagnosztikai célú alkalmazásukra ma már csak elvétve kerül sor. Egyetlen kivétel a sejtekből kivont DNS restrikciós endonukleázos emésztése, majd agarózgélben való elektroforézises elválasztása és a kapott DNS-sávok mintázatának értékelése. A molekuláris vizsgálatokban alkalmazott restrikciós endonukleázok olyan, a kétszálú DNS-t hasító enzimek, amelyek specifikus felismerési és hasítási hellyel rendelkeznek. Ez a specifikusság olyan, 4–8 nukleotid hosszúságú szekvenciára vonatkozik, amelyet az enzim felismer, és egy síkban vagy lépcsősen elhasítja mindkét DNS-szálat. Amennyiben ugyanabból a törzsből származik a megemésztendő DNS, az enzim ugyanott fogja mindkét esetben elhasítani a DNS-molekulákat, így azonos hosszúságú darabok (fragmentumok) keletkeznek. Ennek eredményeként a fragmentumok gélelektroforézises elválasztása (szeparálása) után kapott mintázatok azonosak lesznek. Ha az összehasonlítandó DNS-molekulák szekvenciája különböző vagy a hasítási helyek száma eltérő, nagy valószínűséggel különböző mintázatot kapunk. Ennek a módszernek a neve REA (restriction enzyme analysis = restrikciós enzimes elemzés) vagy RFLP (restriction fragment length polymorphism = restrikciós fragmentum méret polimorfizmus) módszer. Abban az esetben azonban, ha a teljes baktériumgenom DNS-ére alkalmazzák a módszert és 4–5 nukleotid-felismerőhelyes restrikciós endonukleázokat használnak, általában túl sok fragmentumot kapnak ahhoz, hogy egyszerű agaróz gélelektroforézissel értékelhető legyen a mintázat. Megoldásként ritkán hasító (hosszabb felismerőhelyes) restrikciós enzimeket alkalmaznak, így hosszabb fragmentumokat kapnak. Ebben az esetben viszont a nagy töredékeket csak egy speciális gélelektroforézises technikával, az ún. pulzáló gélelektroforézissel, röviden PFGE (pulsed field 314
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek gel electrophoresis = pulzáltatott mezejű gélelektroforézis) módszerrel lehet elválasztani. Az eredmény jól reprodukálható gélelektroforézises mintázat lesz, amely molekuláris „ujjlenyomatnak” („fingerprint”-nek) tekinthető. A PFGE módszer lényege, hogy elektroforézis közben az áram iránya és általában még az elektródák által bezárt szög is egy előre meghatározott (mikroprocesszorral irányított) szabály szerint változik. Ennek hatására a DNS-molekulák cikcakkban vándorolnak a gélben, ami a kisebb DNS-molekulák lefékeződését és a nagyobbak vándorlását eredményezi. Hosszabb idejű (általában többnapos) elektroforézis alatt nagy mérettartományba eső DNS-molekulák elektroforézises elválasztására van lehetőség. A pulzáló gélelektroforézissel való DNS-szeparálás lehetőséget nyújt arra, hogy a hagyományos, egyirányú elektromos erőtérben való elválasztás lehetőségeihez képest (max. 50–100 Kb) lényegesen nagyobb (20 Mb) DNS-molekulákat is szeparálni lehessen a két méret közti tartományt teljes egészében átfogva. Ez a mérettartomány egyrészt magában foglalja a gombák intakt kromoszómáit, másrészt megfelelő specifikusságú restrikciós endonukleázok alkalmazásával a kromoszómák diszkrét fragmentekre hasíthatók, amelyek gélelektroforézises szeparálásával az ún. RFLP mintázatot kapjuk. PFGE módszerrel elválasztott intakt kromoszómáinak elektroforézises képét a gombák (vagy más eukariota szervezetek) kariotípusának nevezik. Mivel a különböző fajok, de ezen belül az egyes törzsek is különböző, de jellemző DNS-szekvenciával rendelkeznek, a kromoszómák méretében, valamint a restrikciós endonukleázos hasítóhelyekben való különbözőség vagy azonosság felhasználható jellemzésükre (10.13. ábra).
10.13. ábra - A pulzáló gélelektroforézis (PFGE) alkalmazása baktériumok molekuláris tipizálására. Az RFLP mintázatok molekuláris ujjlenyomatnak tekinthetők
Az RFLP és a PFGE technika széles körben elterjedt a kutatásban, azonban identifikációs és diagnosztikai célra csak korlátozottan alkalmazhatók. A mintázatok kiértékelése ugyanis nem egyszerű, a fajon belüli szekvencia szintű variabilitást is ismerni kell ahhoz, hogy megbízható, identifikációs és diagnosztikai célra alkalmas következtetéseket lehessen levonni. A minták preparálása is elég drága és időigényes, emellett nagy gyakorlatot kíván. Leginkább különböző eredetű törzsek, izolátumok összehasonlítására, egy-egy mikrobatörzs nyomon követésére, epidemiológiai vizsgálatokra alkalmas ez a módszer. A BioRad cég által kifejlesztett készülék és adatbázis a higiéniai szempontból legfontosabb baktériumok gyors kimutatását és megbízható azonosítását teszi lehetővé. 315
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek
Molekuláris hibridizációs módszerek A hibridizációs technikák célpontjai olyan gének, amelyek a kimutatni vagy azonosítani kívánt mikrobák jellemző génjeinek tekinthetők. A hibridizáció végbemenetelét speciális jelölési eljárásokkal mutatják ki. Ezek korábban radioaktív jelölési módszerek voltak, mára azonban a rutin diagnosztikából kiszorították őket a nem radioaktív (ún. hideg) jelölések. A kimutatni kívánt gént (ún. célgént) olyan homológ DNS-szekvencia segítségével azonosítják, amely a vizsgált mikroba genomjában nagy valószínűséggel csak az adott génnel hibridizál. Ezt a szakaszt DNS-próbának nevezik, és általában 15–30 nukleotid hosszúságú, egyszálú (ss) DNS-darab. Nemcsak DNS-sel, hanem RNS-sel is hibridizálnak a génpróbák, sőt mesterséges, a természetes DNS-hez vagy RNS-hasonló, de annál kedvezőbb tulajdonságú, ún. peptid-nukleinsav (PNS) próbákat is kifejlesztettek. A PNS a DNS-ben található cukorfoszfát gerinc helyett poliamid gerincet tartalmaz, ami DNS-sel való hibridizáció esetén nagyobb specifikusságot, erősebb affinitást, gyorsabb hibridizációt eredményez, és a PNS próba komplex szerkezetű rRNS-sel is jól hibridizál. A hibridizációs eljárásokat általában a sejtből kivont és részlegesen tisztított és dúsított vagy pedig egyszerűen a sejt feltárásával szabaddá tett DNS-sel valósítják meg. Az első esetben a DNS-t vagy hordozóhoz kötik, vagy pedig oldatban történik meg a hibridizáció. A következőkben ezeket az eljárásokat ismertetjük röviden.
Telephibridizáció Az élelmiszerből vagy egyéb (pl. környezeti mintából) szilárd táptalajon kifejlődött telepeket először egy hordozóra (pl. nitrocellulóz vagy nejlonmembránra) viszik át, majd pedig lúggal (> pH 12) és hőkezeléssel feltárják a sejteket. Ezt követően a kiszabadított DNS-t rögzítik a membránhoz, denaturálják, majd hozzáadják a megfelelően jelölt próbát és előhívják. A hibridizációt pozitív reakció jelzi. A telephibridizációs módszer általában nem elég érzékeny a patogén mikroorganizmusok élelmiszerekből való közvetlen kimutatására, mivel azok többnyire kis koncentrációban vannak jelen, így telepeik közvetlen tenyésztés után általában nem nőnek ki (számuk a kimutatási határnál kisebb), vagy pedig a kísérő mikrobiota telepei túlnövik a patogéneket. Elődúsítás vagy dúsítás után már nagyobb sikerrel alkalmazható a telephibridizációs eljárás, ebben az esetben azonban a kimutatáshoz szükséges idő lényegesen meghosszabbodik.
Hibridizáció membránon Ezzel a hibridizációs eljárással is membránhordozóhoz kötött DNS-t mutatnak ki, azonban a DNS-t előzőleg izolálják a sejtekből, majd restrikciós endonukleázzal rövid (< 50 kb) darabokra hasítják. A DNS-darabokat agaróz gélelektroforézissel elválasztják, majd membránhoz kötik és a jelölt próbával hibridizáltatják. A módszert kifejlesztő kutató neve után az eljárás Southern-féle hibridizációként (Southern blotting) ismert, aki radioaktívan jelölt (32P vagy 35S) génpróbát használt az azonosításhoz. Hasonló módszer a Northern blotting, ebben az esetben azonban a hibridizációs célmolekula nem DNS, hanem RNS. A Southern blotting speciális változata, amikor a riboszóma-RNS-t (rRNS-t) kódoló rDNS génekre specifikus próbákat hibridizálnak a sejtekből kivont és restrikciós endonukleázzal megemésztett DNS-hez. Ez a módszer főként a faj szintű identifikálásra alkalmas, mivel az rDNS gének (operonok) az erősen konzervatív gének közé tartoznak. Az rDNS gének egyrészt az érett rRNS-nek megfelelő, másrészt az érés közben kieső (ITS) szekvenciákat tartalmazzák. Míg az elsők erősen konzervatív szekvenciákat hordoznak, addig az ITS régiók változékonysága nagyobb. Megfelelő (többszörös) génpróbák segítségével nemzetség, faj szintű vagy fajon belüli (törzsek) azonosítása valósítható meg ezzel a módszerrel, amelyet az rDNS gének alapján hibridizációs ribotipizálásnak is hívnak.
316
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek
Molekuláris hibridizáció oldatban A módszer előnye, hogy lényegesen egyszerűbb, mint az előző eljárások, mivel elmarad a membránra való átvitel lépése. A mintában lévő sejteket feltárva, a kiszabaduló DNS-hez jelölt próbát hibridizálnak. A meg nem kötött próbát lebontják (degradálják), a hibridizáció végbemenetelét pedig a jelölésnek megfelelően detektálják. Sokkal érzékenyebb változat az ún. szendvics hibridizáció, mellyel a cél DNS-hez kétféle próbát kötnek: az egyik a specifikus jelölt (ún. riporter) próba, a másik pedig a csapda próba. A csapda próbát egy hordozóhoz rögzítik, és a cél DNS megkötése után a riporter próba ugyanannak a DNS-nek egy másik részéhez kötődik. A csapda próba azt a célt szolgálja, hogy a cél DNS-t a hordozón feldúsítsák, amelyet aztán a jelölt próbával mutatnak ki.
A molekuláris hibridizáció élelmiszer-mikrobiológiai alkalmazása A molekuláris hibridizációs módszerek élelmiszer-mikrobiológiai alkalmazása elsősorban a patogén baktériumok megbízható faji identifikálása, reprodukálható törzsi szintű azonosítása és jellemzése (tipizálása) területére terjed ki. Fontos, hogy a módszer pontosan meghatározza a faji hovatartozást, megkülönböztesse a fajon belül a patogén és apatogén törzseket, képes legyen molekuláris markerek alapján felismerni az azonos és a különböző törzseket (azaz megfelelő specifikusságú legyen), ugyanakkor minél kisebb mennyiséget tudjon kimutatni az azonosítandó mikrobából (azaz megfelelő érzékenységű legyen). A módszer specifikusságát alapvetően az határozza meg, hogy milyen célgént választunk a hibridizációhoz. Amennyiben nemzetség vagy faj szintű identifikálás a cél, ajánlatos olyan gént vagy géneket keresni, amelyek a nemzetség vagy faj evolúciója során nem vagy keveset változtak. Amennyiben élelmiszer-biztonsági szempontból jelentős baktériumok kimutatása vagy azonosítása a cél, ajánlatos közvetlenül a virulenciagénekkel hibridizáló próbákat alkalmazni. A 10.8. táblázatban mutatunk be néhány példát patogén baktériumok génpróbákkal való kimutatására és azonosítására.
10.8. táblázat - Élelmiszer eredetű patogén baktériumok kimutatására alkalmas génpróbák Baktérium Campylobacter jejuni
Célgén rDNS
Escherichia coli ETEC
Hőstabilis toxin (ST) Hőlabilis toxin (LT)
EHEC
Shiga-szerű toxinok
EIEC
Invazív gének
EHEC O157:H7
O157:H7
Listeria spp.
rDNS
L. monocytogenes
Liszteriolizin O Fő kiválasztott polipeptid (msp) 317
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek Salmonella spp.
rDNS
Shigella spp.
Invazív gének
Staphylococcus aureus
Enterotoxin B
Vibrio cholerae
Kolera enterotoxin
Vi. parahaemolyticus
Hőstabil direkt hemolizin (tdh)
Vi. vulnificus
Citotoxin-hemolizin
Yersinia enterocolitica
Citotoxicitás/Sereny Invazív gén (ail)
Ye. pseudotuberculosis
Invazív gén
A módszer érzékenységét több tényező is befolyásolja, amelyek közül kiemelendő a célgének kópiaszáma az adott genomban. Minél nagyobb a kópiaszám, annál jobb érzékenység érhető el. Ebből a szempontból kiemelendők az rDNS gének, amelyek kópiaszáma a legtöbb élőlény genomjában 100 feletti, bár kivétel is akad. A Cb. jejuni genomja pl. csak három kópiában tartalmazza ezeket a géneket. A jelölés módszere szintén fontos érzékenységi tényező; ebből a szempontból legjobb a radioaktív jelölés, bár a legújabb enzimes és kemilumineszcens technikák már megközelítik ennek érzékenységét. A kimutatási határ általában a 104–106 kópia/ célgén tartományban van, amelyet mikrobakoncentrációra is vonatkoztatni lehet, ha a célgén kópiaszáma a mintában állandó. Mivel a patogén baktériumok általában ennél kisebb koncentrációban vannak jelen a vizsgált mintákban, ezért elődúsítás vagy dúsítás is szükséges. Ebből következően a módszer a vizsgált baktérium jelenlétére vagy hiányára utal. A Southern-blotting eljárást sikerrel alkalmazzák Salmonella törzsek azonosítására, a shiga-típusú és a kolera toxingének és egyéb virulenciagének kimutatására, bár az utóbbi időben kezdik kiszorítani őket a jóval egyszerűbb PCR alapú eljárások. A kereskedelmi forgalomban lévő RiboPrinter készülék (DuPont Qualicon) rDNS hibridizáció alapján működő baktériumidentifikációs rendszer. A legújabb változatnál már kemilumineszcens végpontjelölést alkalmaznak, így gélelektroforézises szeparálásra nincs szükség. Az automatizált működésű eljárással az elődúsítást vagy dúsítást követően 8 óra múlva pontos identifikálási eredmény kapható. A RiboPrinter adatbázisa mintegy 1400 baktériumfaj adatait tartalmazza, ezen belül pedig mintegy 6000 különböző ribotípus található. Az adatbázisban nemcsak patogén, hanem romlást okozó és hasznos baktériumokra vonatkozó információk is megtalálhatók. A módszer standardizált, így laboratóriumok közötti adat-összehasonlításra is lehetőséget nyújt. Hátránya viszont, hogy viszonylag kevés minta vizsgálható egyidejűleg, ezért a fajlagos költsége nagy.
PCR alapú technikák A polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction, PCR) segítségével néhány száz, maximum 2500 bp hosszúságú DNS-szakaszok szaporíthatók fel mesterségesen, sejten kívüli (in vitro) módszerrel, akár milliószoros mennyiségben is, néhány óra alatt. A módszer kifejlesztése egy amerikai kutató, Kary Mullis nevéhez fűződik, aki az 1980-as évek közepén az addig csak lépésenként való és legfeljebb 1000 nukleotid hosszúságú DNS megkettőzésére alkalmas in vitro 318
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek módszert egy hőstabilis DNS polimeráz enzim alkalmazásával folyamatos láncreakcióvá fejlesztette, majd automatizálta. Ezt követően a módszer rohamosan terjedt el a biotechnológiai és a mikrobiológiai laboratóriumokban, és rövid idő alatt forradalmasította ezeket a területeket. Mullist 1996-ban Nobel-díjjal jutalmazták.
A PCR alapreakció A PCR reakció a következő három lépésnek 20–40 cikluson keresztüli ismétlését jelenti (10.14. ábra), amelyhez mikroprocesszor által vezérelt PCR készülékeket használnak:
319
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek
10.14. ábra - A polimeráz láncreakció (PCR) lépései
1. A felszaporítani kívánt cél DNS denaturációja. A denaturáció a reakcióelegy 94–95 °C-ra való felmelegítésével történik, ami a reakció elején néhány perc, a ciklusok között azonban egy percnél rövidebb idő is elegendő.
320
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek 2. A primer (indító) szekvenciák megkötődése. Az oligonukleotid primerek H-hidak segítségével hozzákapcsolódnak az egyszálúvá vált cél DNS-hez a felszaporítandó DNS-szakasz két végén lévő homológ szekvenciáknál. A primerek olyan rövid (általában 20–30 nukleotid hosszúságú), egyszálú DNS-darabok, amelyek közrefogják a felszaporítandó DNS-szakaszt. Ebből következően legalább ezeknek a szakaszoknak a nukleotidsorrendjét ismerni kell, a közrefogott szakasznál azonban nincs erre szükség. A kötődéshez a hőmérsékletet le kell csökkenteni arra az értékre, ahol a bázispárosodás már végbemehet. Ez a hőmérséklet függ a primerek GC-tartalmától és hosszától. Általános szabályként elmondható, hogy a primerek olvadáspontjánál (Tm értékénél) 5 °C-kal alacsonyabb hőmérsékletet ajánlatos alkalmazni. A primerek kötődésének erősségét úgy kell megválasztani (optimalizálni), hogy csak a teljesen homológ helyekkel hibridizáljanak a primerek, és a H-hidak kialakítása minden bázispárnál megtörténjen. Ha az optimálisnál kisebb a primer kötés hőmérséklete, akkor a nem homológ helyekre is bekötnek a primerek, ezáltal nem valós PCR termékek is létrejönnek, amelyek a további ciklusokban cél DNS-ként funkcionálva felszaporodnak. 3. Primer extenzió (kiterjesztés, hosszabbítás). A primerek által közrefogott DNS-szakasz kiegészítő szálának enzimes szintézise. Ehhez a lépéshez a hőmérsékletet a hőstabil DNS polimeráz (Taq polimeráz) működésének optimumához kell igazítani, ami 72 oC. A reakcióelegyhez adott dNTP-k (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) beépítésével a cél DNS mindkét szálán új, kiegészítő DNS-szál jön létre, amelyek újabb templát molekulaként szolgálnak a további ciklusokban (10.15. ábra).
10.15. ábra - A PCR reakciósorozat hőmérsékleti profilja
Ennek a három lépésből álló ciklusnak 20–40-szeres ismétlése során a cél DNS-szakasz mennyisége közel exponenciálisan nő, így a reakció végére a PCR termék az eredeti cél DNS-nek mintegy milliószorosára sokszorozódik (amplifikálódik). A PCR termék (amplikon) kimutatására különböző módszerek állnak rendelkezésre. Legegyszerűbb a PCR termékek agaróz vagy poliakrilamid gélben való gélelektroforézises elválasztása, majd etidium-bromiddal való festése és UV lámpa alatti detektálása. Így arról lehet megbizonyosodni, hogy a várt hosszúságú PCR termék keletkezett-e, a termék szekvenciájának vizsgálatához azonban restrikciós enzimes hasítás vagy közvetlen szekvenálás szükséges. Diagnosztikai célra gyakran alkalmazott módszer a jelölt próbával való hibridizálás is, ami a folyadékban való végpont detektálásra is lehetőséget nyújt. Ugyancsak jól alkalmazható a végpont detektálásra a PCR termék fluoreszcens jelölése. További, érzékenyebb és specifikusabb posztamplifikációs eljárásokat alább tárgyalunk.
321
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek
PCR reakción alapuló vizsgálati módszerek A PCR reakció mikrobiológiai alkalmazásának egyik nagy lehetősége abban rejlik, hogy a felszaporítani kívánt gént vagy DNS-szakaszt tetszőlegesen lehet kiválasztani, ezáltal a reakció specifikussága is a célnak megfelelően válaszható meg. Ha pl. a kiválasztott gén nemzetségre specifikus, akkor valamennyi, az adott nemzetséghez tartozó mikrobasejtet detektálni lehet. Ha a felszaporítandó gén fajspecifikus, akkor pontosan lehet identifikálni a kérdéses fajt. Élelmiszerbiztonsági szempontból azonban kiemelt fontosságú a virulenciagének megbízható detektálásának lehetősége, ami független attól, hogy az adott gén a vizsgálati körülmények között valóban kifejeződik-e. A másik nagy lehetőség abban rejlik, hogy PCR módszerrel, akár néhány sejtből kiindulva, olyan mennyiségű DNSt lehet felszaporítani, ami további molekuláris vizsgálatokat tesz lehetővé. Ugyanakkor azt is el kell mondani, hogy az élelmiszerekből való közvetlen PCR-es amplifikálásra ritkán van lehetőség, mivel a reakció egy enzimes folyamaton alapszik, és az élelmiszerekben található, sőt esetlegesen még a DNS izolálás során a DNS-sel együtt fel is dúsuló enzimgátlók meghiúsíthatják a reakciót. Ezért ebben az esetben is (hasonlóan a hibridizációs technikákhoz) a szelektív körülmények között felszaporított (pl. elődúsított vagy dúsított) tenyészetből vagy színtenyészetből kiindulva lehet a legbiztosabban megbízható eredményt elérni. A PCR reakció gyakran a célgének kimutatására irányul specifikus primerekkel. Az adott mikroorganizmusra (fajra vagy fajon belüli taxonra) jellemző specifikus gén kimutatásával következtetni lehet a keresett mikroorganizmus jelenlétére vagy hiányára. Különösen fontos ez az élelmiszer-biztonsági vagy higiéniai szempontból fontos patogén baktériumok esetében, ahol egy-egy szerotípus vagy veszélyes toxint termelő törzs gyors és megbízható detektálása vagy azonosítása a veszély időben való elhárítását teszi lehetővé. Ezekben az esetekben olyan primerek kiválasztása a cél, amelyek csak a kimutatni kívánt gén jelenlétében vezetnek PCR termékhez. A 10.9. táblázatban bemutatunk néhány példát a patogén mikroorganizmusok kimutatására és azonosítására alkalmas különböző PCR-primerekre.
10.9. táblázat - Élelmiszer eredetű patogén baktériumok kimutatása PCR technikával Organizmus Escherichia coli
Célgén/géntermék malB, LT1, ST1 LT (hőlabilis toxin) SLTI, SLTII (hőstabilis toxinok) VT1, VT2 and VTE ial (plazmid inváziós gén)
Listeria monocytogenes
16S rDNS listeriolizin O (hly) Listeria sejtfelszíni protein
Salmonella spp.
oriC, kromoszomális replikációs origo
Campylobacter spp.
16S rDNS 322
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek Cb. jejuni, Cb. coli
flaA-flaB intergénikus szekvencia
Shigella flexneri
plazmid inváziós gén
Vibrio cholerae
ctxAB
Vi. vulnificus
citotoxin-hemolizin
Yersinia enterocolitica
virulencia plazmid virF gén
Hepatitis A vírus
polimeráz gén – RT-PCR
Norwalk vírus
polimeráz gén – RT-PCR
A 10.8. táblázattal összevetve látható, hogy ugyanazok a specifikus célgének egyaránt szolgálhatnak DNS-próbaként vagy PCR-primerként. Gyakori, hogy az egyik primerpár faj- vagy nemzetségspecifikus, míg a másik primerpár a kimutatni kívánt génre (pl. toxin génre) specifikus. A 10.16. ábrán mutatunk be ilyen példákat, ahol a Ye. enterocolitica európai szerotípusára specifikus primerpárral kapott PCR terméket (A), valamint az E. coli fajszintű, illetve O157:H7 szerotípusra specifikus primerpárok (B) alkalmazásának lehetőségét mutatjuk be.
323
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek
10.16. ábra - E. coli törzs és O157:H7 szerotípus (A), valamint Yersinia enterocolitica európai szerotípus (B) detektálása specifikus PCR primerpárok segítségével. A: 1. és 2. oszlop: E. coli O157:H7 törzs cél DNS, 3. és 4. oszlop: nem patogén E. coli törzs cél DNS; 1. és 3. oszlop: E. coli faj-specifikus primer párral kapott PCR termékek; 2. és 4.: O157:H7-specifikus primer párral kapott PCR termékek; B: Ye. enterocolitica törzseknél (1. és 2. oszlop) kapott PCR temékek európai szerotípusra specifikus primer pár alkalmazásával; M: DNS molekula méret marker
A PCR alapú módszer változatai Napjainkra a PCR alapú molekuláris módszerek nemcsak a kutató laboratóriumokban, hanem a rutin vizsgálólaboratóriumokban is meghonosodtak, önálló diagnosztikai eljárásként is tért hódítva. Ennek érdekében a széleskörűen vizsgálták a módszerek alkalmazhatóságát és standardizálhatóságát, és törekednek azok validálására, a hagyományos módszerekkel való összemérhetőségük tanúsítására. Eközben folyamatosan zajlik a módszerek fejlesztése, egyszerűsítése, aminél nem utolsósorban gazdaságosságuk növelése is fontos szempont. A PCR alapmódszer érzékenységét és specifikusságát számos módosítással növelték, és újabb irányú vizsgálatokra tették alkalmassá. A számos változat közül az alábbiakban csak néhány jelentősebbet említünk.
RAPD-PCR A PCR módszer jelentős egyszerűsítését hozta az a felismerés, hogy találomra alkalmazott mesterséges primerekkel is jellegzetes mintázatokat adó reakciótermékekhez lehet jutni. 324
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek A módszer RAPD rövidített néven vált ismertté, és gyorsan, széleskörűen elterjedt, hiszen alkalmazásához nem szükséges restrikciós hasítás, DNS-próba, sőt a primer szekvencia előzetes ismerete sem. A kereskedelemben kapható szintetizált oligonukleotidok eredményes primerek lehetnek (10.17. ábra). A RAPD módszer gyorsasága és egyszerűsége előnyösnek bizonyult más molekuláris módszerekkel (RFLP, kariotipizálás) összehasonlítva is, azonban, mivel a találomra alkalmazott primerek kapcsolódása érdekében a PCR reakció kisebb hőmérsékleteken folyik, így több véletlenszerű kapcsolódás lehetséges, és az amplifikáció eredménye kevésbé reprodukálható.
10.17. ábra - A Sacharomyces bayanus fajon belüli diverzitásának vizsgálata RAPD analízissel. Aszúbor erjesztéséből származó S. bayanus izolátumok RAPD analízise OPA 10 primerrel
Több primert használó PCR módszerek A PCR reakció érzékenysége lényegesen (több nagyságrenddel) megnövelhető az ún. fészek (nested)-PCR módszerrel. Ennek lényege, hogy két specifikus primer párt alkalmaznak. Az első, ún. külső primer párt kevéssé szoros amplifikációs körülmények között alkalmazzák, így a kisebb mennyiségben lévő cél DNS is biztosan amplifikálódik. Ezt követően egy második, ún. belső specifikus primer párt alkalmaznak szoros amplifikációs körülmények között, amelynek során az első PCR termék cél DNS-sé válik. Az első lépésben felszaporodó cél DNS mennyisége mellett jelentős mennyiségű nem specifikus melléktermék keletkezik. Ezeket azonban a második lépés figyelmen kívül hagyja, mivel csak a pontos PCR termékekhez kötődik a belső primerpár. Hasonlóan nagy érzékenységű eljárás a PCR másik módozata, az AFLP módszer (amplified fragment length polymorphism), amellyel egymástól egyetlen nukleotidban eltérő, közeli rokonfajok is elválaszthatók. Ennek lényege, hogy a DNS-t előbb két restrikciós enzimmel (egy gyakran és egy ritkán hasítóval) töredékekre bontják, a végeiket megfelelően módosítják, majd egymást követően két PCR-t végeznek. Az első primer a töredékek egy részét, a másik, specifikus primer ezek közül még kevesebbet amplifikál; végeredményben a restrikciós töredékeknek csak 1/4000-ed része sokszorozódik meg.
325
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek A „multiplex PCR” módszer esetében egyidejűleg alkalmaznak több mint egy primer párt. Az egyik lehet egy általános primer pár, amely amplifikációs kontrollként viselkedik, míg a második a kimutatni kívánt génre specifikus primer pár.
RT–PCR Nemcsak DNS-t lehet a PCR reakcióban amplifikálni, hanem közvetve RNS-t is. Ebben az esetben azonban első lépésként a reverz transzkriptáz (RT) enzim segítségével az RNS-ről egy kiegészítő DNS-szálat (komplementer vagy cDNS) kell szintetizáltatni, amely már további templátként szolgál az egyszerű PCR-hez. A módszer legnagyobb előnye, hogy segítségével az RNS-vírusok is kimutathatók és azonosíthatók. Ez jelentősen megnövelte ismereteinket az élelmiszerekkel való vírusterjedés veszélyeit illetően. RT-PCR módszerrel kimutathatók az élő, de nem tenyészthető sejtek (ún. VNC formák) is, mivel ezeknél a génaktivitás (transzkripció) következtében mRNS-ek létrejönnek, de új sejtek nem. A VNC sejtek szaporodási képessége sok esetben az élelmiszer-tartósítási eljárás következtében áll meg, azonban megfelelő körülmények között újból megindulhat.
PCR–RFLP A PCR módszer és a restrikciós enzimekkel végzett hasítás (RFLP) kombinálásával nagymértékben megnövelhető a vizsgált DNS-ek közti különbségek kimutathatósága. A specifikus primerekkel felszaporított DNS-szakaszról az alkalmasan megválasztott restrikciós enzimekkel készült töredékek mintegy molekuláris ujjlenyomatot adnak a vizsgált mikrobáról. Az így kapott mintázatok értékelésével a törzsek azonossága vagy különbözősége meghatározható, ezért ez a módszer tipizálásra és epidemiológiai vizsgálatok végzésére különösen alkalmas. A 10.18. ábrán a patogén Campylobacter fajok egyik virulenciagénjéről, a flagellumot kódoló flaA génről kapott RFLP mintázatot mutatjuk be.
10.18. ábra - Campylobacter törzsek flaA génjeinek PCR-RFLP analízise 8: Cb. jejuni típustörzs, 11: Cb. coli típustörzs, a többi Campylobacter izolátum, M: molekulaméret jelző
326
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek Az rRNS gének különleges jelentőségre tettek szert a taxonómiában és az identifikálásban. A riboszóma-DNS valamely szakaszára specifikus primerek és a restrikciós enzimek alkalmas megválasztásával a PCR–RFLP módszer kiváló lehetőséget nyújt a faji szintű azonosításra is. Ez az eljárás a PCR-ribotipizálás, amelyet nagyon eredményesen alkalmaznak fajok meghatározására. Az rRNS génekre irányuló PCR és az RFLP analízis kombinációját ARDRA rövidítéssel jelölik (amplified rDNA restriction analysis).
Posztamplifikációs módszerek Az amplikon, a megsokszorozott DNS-szakasz kimutatása és további elemzése többféleképp lehetséges. Legegyszerűbb esetben az amplifikált DNS-t agarózgélben futtatják és etidiumbromiddal megfestve UV-fényben vizsgálják, lefényképezik. A hagyományos gélelektroforézis helyett különböző, a PCR utáni (posztamplifikációs) módszereket lehet alkalmazni, amelyek érzékeny tipizálásra, nagyon finom elemzésekre adnak módot. Az egyszálú konformációs polimorfizmus (SSCP) elemzés azon alapul, hogy az egyszálú PCR amplikonok a szekvenciájuktól függően összekapcsolódhatnak, ami megváltoztatja az elektroforézises mobilitásukat. A denaturáló gradiens elektroforézis (DGGE) és a hőmérséklet gradiens elektroforézis (TGGE) a szekvenciájuktól függően részlegesen denaturált DNS-molekulák elektroforézises mobilitása közti különbségeket használja ki, míg a terminális restrikciós töredékhossz polimorfizmus (T-RFLP) elemzésnél fluoreszcens jelölésű primereket alkalmaznak, és restrikciós enzimes hasítás után különböztetik meg a terminális restrikciós töredékeket. Ezekkel a technikákkal néhány bázispár eltérést is ki lehet mutatni, ezért a törzsek közötti különbség meghatározására jól alkalmazhatók. A denaturáló gélelektroforézises módszereket használják a leggyakrabban. A különböző hosszúságú DNS-molekulák egyszerű gélelektroforézises szeparálásuk során méretük alapján válnak szét, és így egy reprodukálható mintázatot adnak. A DNS-molekulák nukleotidszekvenciája azonban nem befolyásolja a mozgékonyságot és a kapott mintázatot. A molekulák denaturációs tulajdonságai azonban alapvetően a DNS bázisösszetételétől és szekvenciájától függenek. A kétszálú DNS hődenaturációjának (a két szál teljes szétválásának) hőmérséklete a DNS-molekula G + C-tartalmától függ, nevezetesen az olvadáspont (Tm) egyenesen arányos a G + C-tartalommal. A részleges szétválást azonban a molekula nukleotidszekvenciája is befolyásolja, ezért a részlegesen denaturált állapotú DNS-molekulák elektroforézises mozgékonyságából követekeztetni lehet a szekvenciakülönbségre. A denaturáló gélelektroforézises módszerek közül a DGGE a legelterjedtebb. Az elválasztás poliakrilamid gélelektroforézissel (PAGE) történik. A gélben a denaturáló közeget urea és formamid segítségével állítják elő, és benne a gélelektroforézis során a DNS-molekulák emelkedő denaturációs grádiens mentén, állandó (50–65 °C közötti) hőmérsékleten futnak, és különböző mobilitásuk szerint szétválnak.
Valós idejű, mennyiségi PCR A PCR módszer általában csak a cél DNS kimutatására, az azt tartalmazó mikroba jelenlétének vagy hiányának igazolására alkalmas függetlenül attól, hogy a keresett mikroorganizmus milyen számban, mennyiségben volt jelen. Élelmiszer-vizsgálat esetén azonban a mennyiségi viszonyok is jelentősek; a PCR egy változata alkalmas ennek a meghatározására is. A valós idejű („real-time”) PCR elnevezés arra utal, hogy az adott időben jelenlévő cél DNS-t nemcsak kimutatjuk, hanem mennyiségét is meghatározzuk. A kvantifikáláson kívül előnye még, hogy segítségével megkülönböztethetők az élő és holt sejtek is. Az egyszerű PCR esetében ugyanis az elhalt sejtekből kivont és még hosszú ideig, akár napokig amplifikálható DNS-molekulák ugyanolyan jó célpontjai a primereknek, mint az élő sejtekből származó DNS. Mivel azonban az elhalt sejtekből származó DNS mennyisége az idővel nem nő, míg az élő sejtek esetében igen, ezáltal a valós idejű PCR technikával az élő és holt sejtek aránya is meghatározható. A real time PCR módszer lényege, hogy a PCR termék amplifikálódása közben egy fluoreszcens festékkel jelölt specifikus génpróba mennyiségét is detektálják. A fluoreszcens technika többféle lehet. Az egyik esetben a fluoreszcens festék (SYBR green) a kétszálú DNS-hez kötődik, és minden egyes denaturáló PCR ciklusban 327
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek felszabadul. Egy másik megoldásban a fluorogén riporter a primerként szolgáló próba egyik (5’) végéhez, míg egy kioltó molekula a másik végéhez kapcsolódik. A PCR reakcióban a lánchosszabbítás közben a Taq polimeráz 5’-aktivitása révén lehasítja a fluorogént a kioltóról, és a megjelenő fluoreszkáló jel arányos lesz az amplifikált DNS mennyiségével. Egy további megoldásban két hibridizációs próbát használnak, az egyik a gerjesztő fluoreszceinnel, a másik a fluorogén festékkel van jelölve. Ha a PCR reakció során mindkettő bekötődik, megtörténik a fluoreszcens jelkibocsátás, ami a ciklusok számával, vagyis a képződött DNS mennyiségével arányos. Megfelelő kalibrációval a mintában lévő sejtkoncentrációra is következtetni lehet. A real-time kvantitatív módszer egyre inkább tért hódít a patogének detektálásában, élelmiszerekből is. A legújabb technikákkal a vizsgált mikrobából akár már egyetlen telepképző egység/ml is detektálható, és a multiplex PCR változat alkalmazásával többféle patogén egyidejű kimutatására is lehetőség nyílik. Előzetes dúsításra azonban ezekben az esetekben is szükség van. Számos patogén detektálására és mennyiségi kimutatására dolgoztak ki real time PCR tesztet. Példaként említhető az E. coli O157:H7 szerotípusnak nyers tejben és más élelmiszerben, a Salmonellának húsban, a Cl. botulinumnak módosított atmoszférás csomagolású halban, az enterotoxinogén B. cereusnak tejben való kimutatása. A PCR alapreakció kivitelezésére számos cég forgalmaz automata készülékeket. A módszer teljes automatizálását azonban sokáig gátolta a PCR termék gélelektroforézises kimutatásának nehézkessége. A lassú és nehézkes gélelektroforézist kiváltó módszer, a reagensek vagy az amplikon fluoreszcens jelölése lehetővé tette az automatizált, sorozatvizsgálatra alkalmas PCR berendezések és rendszerek kifejlesztését, amelyekből már többféle van kereskedelmi forgalomban. Ilyenek pl. a BAX mikrobadetektáló rendszer (DuPont Qualicon), a TaqMan (Perkin-Elmer Applied Biosystem) és a Light Cycler (Roche Diagnostics), számos más mellett. A 10.10. táblázatban bemutatunk néhány olyan, kereskedelmi forgalomban lévő, validált nukleinsav alapú technikát, amelyek jelentős segítséget jelentenek az élelmiszer eredetű patogének gyors és megbízható detektálásában.
10.10. táblázat - Kereskedelmi forgalomban lévő, hibridizáláson és PCR-es amplifikáláson alapuló módszerek élelmiszer eredetű patogének kimutatására Baktérium
Készítmény neve
Formája
Gyártó
Clostridium botulinum
Probelia
PCR
BioControl
Campylobacter spp.
AccuProbe
próba
GEN-PRÓBA
GENE-TRAK
próba
Neogen
Escherichia coli
GENE-TRAK
próba
Neogen
E. coli O157:H7
BAX
PCR
Qualicon
Probelia
PCR
BioControl
GENE-TRAK
próba
Neogen
AccuProbe
próba
GEN-PRÓBA
BAX
PCR
Qualicon
Probelia
PCR
BioControl
GENE-TRAK
próba
Neogen
Listeria spp.
Salmonella spp.
328
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek
Staphylococcus aureus Yersinia enterocolitica
BAX
PCR
Qualicon
Probelia
PCR
BioControl
AccuProbe
próba
GEN-PRÓBA
GENE-TRAK
próba
Neogen
GENE-TRAK
próba
Neogen
Nukleinsavak szekvenálása A DNS nukleotidbázis-sorrendjének meghatározására, a szekvenálásra két módszert dolgoztak ki. Allan Maxam és Walter Gilbert módszere a DNS nukleotidjait egyenként hasítja le kémiai úton. Ezzel szemben Frederick Sanger módszere a DNS-t enzimesen szintetizálja úgy, hogy a szintézist adott bázisnál specifikusan megállítja. A feladat megoldásáért 1980-ban, mindkét munkacsoportot Nobel-díjjal jutalmazták. A rohamos technikai fejlesztés eredményeként ma már szekvenálókészletek és automata szekvenciaanalizáló berendezések kaphatók a kereskedelemben. A hatalmas módszertani fejlődés tette lehetővé, hogy különböző szervezetek teljes genomjának bázissorrendje meghatározhatóvá vált, ezzel a tudományban beköszöntött a genomika korszaka (10.8. fejezet). A nukleinsavak szekvenálása beláthatatlan távlatokat nyitott a biológiában és ígéretes lehetőségekkel kecsegtet az orvostudományban, gyógyszeriparban, biotechnológiában, valamint a táplálkozás- és élelmiszer-tudományban is. Az utóbbi területen a közvetlen gyakorlati alkalmazás még várat magára. A szekvenálás, mint módszer, ma már nélkülözhetetlen a mikroorganizmusok biodiverzitásának tanulmányozásában a természetes élőhelyeken és az élelmiszerekben egyaránt. Az élelmiszerekből izolált mikroorganizmusok között az egyre nagyobb számban előkerülő új fajok megismerése csak azok DNS-szekvenciájának legalább részleges feltárásával és a számítógépes adatbázisokkal való összevetésével lehetséges. Példaként álljon itt az utóbbi öt évben különböző élelmiszerekből izolált új élesztőgombafajok listája, amelyek új fajként való leírását rDNS-szekvenciák támasztották alá (10.11. táblázat).
10.11. táblázat - Molekuláris jellemzők alapján leírt, élelmiszerekből izolált, új Candida fajok néhány példája Faj
Leírás éve
Élelmiszer
C. davenportii
2002
üdítőital
C. zemplinina
2003
erjedő must
C. sergipensis
2003
fagyasztott gyümölcspulp
C. neerlandica
2001
préselt élesztő
C. prunicola
2001
cseresznyefa nyálka
C. asparagi
2004
gyümölcs
C. diospyri
2004
gyümölcs
C. bombicola
2004
méz
329
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek C. cidri
2000
almabor (cider)
C. pomiphila
2000
almabor (cider)
C. gallii
2004
baromfihús
A szekvenálás közvetlenül alkalmazható rutin identifikálásra, pl. a klinikai diagnosztikában, és innen már csak egy további lépés használatba vétele a kórokozók kimutatására élelmiszerekből is. A fajokra jellemző rDNS gének adatbázisára építve már automata szekvenátort is kifejlesztettek (MicroSeq, Perkin Elmer-Applied Biosystem), amely a kitenyésztett izolátumból kivont DNS amplifikálásával és szekvenálásával a faji meghatározást 48 óra alatt elvégzi.
Újabb korszerű molekuláris módszerek A PCR technológia forradalmasította a molekuláris biológiai kutatást és nagy hatást gyakorolt a módszerek fejlődésére. Sok eljárás mindennapos gyakorlattá vált a kutatásban, a gyógyászatban, a biotechnológiában és az élelmiszeriparban. Míg az utóbbi területen a ma már rutin módszerek alkalmazásának elterjedése is csak a jövőben várható, eközben további fejlesztési lehetőségek születnek újabb elvek és elképzelések megvalósítására, a genetika, biokémia, mikroelektronika, computertechnológia és más diszciplínák határterületén. Nem vállalkozhatunk ezeknek a jövőbeni lehetőségeknek a felvázolására, csak néhány példával érzékeltetjük az ígéretes távlatokat.
In situ hibridizáció (FISH) Fluoreszcens festékkel jelölt oligonukleotid-próbák hibridizálhatók a sejtek rDNS vagy rRNS molekuláival a mikrobák eredeti élőhelyén, ha a sejteket megfelelő módszerrel rögzítik, és átjárhatóvá teszik a próba-DNS-re. Az így megfestett sejtek fluoreszcens mikroszkóppal vizsgálhatók. Ez a módszer, a fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) különösen széleskörű alkalmazásra talált a természetes élőhelyek, talaj, vízi üledékek, biofilmek mikrobiotájának biodiverzitás-vizsgálatában. Különböző specifikusságú próbákat használva feltárhatók ezen élőhelyek mikrobaközösségei, beleértve a nem tenyészthető mikrobák kimutatását is. Az élőhelyen előforduló kevert mikrobapopulációról átfogó képet lehet nyerni a teljes DNS-t kivonva és abból specifikus primerekkel az rDNS szakaszokat amplifikálva, majd szekvenálva (lásd később). A szekvenciák elemzésével, az ismert rDNS szekvenciák adatbázisával összehasonlítva azonosíthatók az adott élőhelyen található mikroorganizmusok azok tenyésztése nélkül. Alkalmas módszerekkel (DGGE, T-RFLP), a különböző mikrobacsoportok arányáról és annak a környezeti tényezők hatására végbemenő változásáról is képet nyerhetünk. A FISH módszert alkalmazták az Enterobacteriaceae szennyezettség meghatározására élelmiszer-mintákból membránszűrön kifejlődött 6 órás mikrotenyészeteken, és tenyésztés nélkül, rRNS próbákat használva, szalmonellák kimutatására élelmiszerüzemi berendezések felületén, pszeudomonászok és más baktériumok vizsgálatára, tejben.
Zöld fluoreszcens protein A fluoreszcens oligonukleotid próbák analógiájára specifikus alkalmazásokra ad módot egy medúzafajból (Aequorea victoria) izolált, különleges, zölden fluoreszkáló fehérje (GFP). Ennek génje beépíthető más szervezetbe és kifejeződése riporterként használható a génaktivitás vizsgálatára. A módszer ígéretes lehetőség kórokozó baktériumok (E. coli O157, Li. monocytogenes) túlélésének és szaporodási kinetikájának vizsgálatára élelmiszerekben. 330
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek
DNS mikrorendek Az eddig ismertetett molekuláris technikák általában egy, ritkán néhány patogén egyidejű detektálását teszik lehetővé, ami az adott élelmiszer mikrobiológiai állapotáról csak szűkös információt nyújt. Ezen segítenek a közelmúltban kifejlesztett DNS-mikrorendek (mikrochipek, DNA microarrays), amelyek egyidejűleg nagyszámú mikrobafaj detektálását is lehetővé teszik, valamint a génaktivitásról is képet adnak. A mikrochipek tulajdonképpen hordozóhoz rögzített, megfelelően elrendezett, egyszálú DNS darabok (cDNS oligonukleotidok), amelyek képesek egyidejűleg nagyszámú gén, illetve mikroorganizmus kimutatására, vagy pedig e gének különböző körülmények közötti expressziójának tanulmányozására. A módszer alapja a molekuláris hibridizáció. A referenciagenomból másolt több ezer oligonukleotidot meghatározott rendben egy hordozóhoz kötik (ez alig nagyobb, mint egy mikroszkópi fedőlemez), és a vizsgált genom fluoreszcensen jelölt DNS-ét adják hozzá. A hibridizáció megtörténte vagy hiánya a chip adott helyein tükrözi a vizsgált genom transzkripciós profilját. Faji identifikálás céljára jóval nehezebb mikrorendet készíteni, hiszen az egyes helyekre az ismert fajokból kell azokra jellemző, specifikus génszakaszokat elrendezni, amelyekhez az ismeretlen törzsből származó DNS hibridizálódhat. A rendkívül hatékony mikrorendtechnika egyelőre még csak a kutatólaboratóriumokban hódított teret. Rutin diagnosztikai célú alkalmazásához még további fejlesztőmunka szükséges. A legfontosabb kórokozók kimutatására már készültek mikrochipek. Patogén baktériumok identifikálására, a virulenciafaktorok expressziójának tanulmányozására is számos példa található. Élelmiszer vonatkozásban is kifejlesztettek már a Saccharomyces nemzetséghez tartozó fajok identifikálására, illetve a S. cerevisiae fajon belüli törzsek elkülönítésére alkalmas mikrochipeket. Ugyancsak sikerrel alkalmazták a mikrochipeket borélesztők különböző környezeti feltételek közötti génexpressziójának vizsgálatára, erjedő borban.
Bioszenzorok Talán a leginkább futurisztikus terület a bioszenzor-technika, bár a változatos elveken működő készülékekből már sok hozzáférhető. A bioszenzor lényegében valamilyen biológiailag aktív anyag (enzim, antitest vagy nukleinsav molekula, sejtszerv vagy egész sejt), amely hordozóhoz kötve egy érzékelőhöz és jeladóhoz kapcsolódik. Ez utóbbi lehet elektrokémiai (pl. feszültség, konduktancia), optikai (pl. fény, biolumineszvencia, fluoreszcencia), vagy más jel (pl. termisztor, kvarckristály). A bioszenzor érzékelhet toxint (pl. sztafilo-enterotoxint), specifikus patogént (Salmonella, E. coli O157), antibiotikumot vagy más hatóanyagot. Az enzim-bioszenzor egyszerű példája a glükózoxidáz, ami a glükózt glükonsavvá és hidrogén-peroxiddá alakítja, a reakciót pedig jelezni lehet amperometrikusan, az oxigénkoncentráció csökkenésével. A patogén baktériumok kimutatására többnyire immunológiai reakciók alkalmasak, pl. tömegérzékelő kvarckristályhoz kötve a specifikus antitestet. A bioszenzorok kísérleti modelljei még nem alkalmasak a kórokozók rutin kimutatására élelmiszerekből. A költségen kívül a fő probléma a biológiai érzékelő aktivitásának elvesztése.
Rekombináns DNS technológia A genetika és a molekuláris biológia nemcsak új ismereteket hozott a mikroorganizmusok és a magasabbrendű szervezetek genetikájának megértéséhez, hanem olyan új módszereket is kifejlesztett, amelyek lehetővé tették a genetikai tulajdonságok szándékos megváltoztatását, új, a természetben elő nem forduló genetikai kombinációk mesterséges létrehozását és ezek gyakorlati alkalmazását a biotechnológiában és más területeken. Az in vitro rekombináns géntechnológiával a genetikai információt hordozó DNS-t az egyik szervezetből egy másik, idegen szervezetbe viszik át és abban működésre késztetik. Mivel a bevitt gén egyetlen 331
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek sejt elszaporított utódjainak összességében, az ún. klónban megjelenik és kifejeződik, a módszert molekuláris klónozásnak is szokás nevezni. Az eljárást gyakran génsebészetnek, génmérnökségnek, vagy genetikai manipulációnak is nevezik. A rekombináns DNS technológia módszereinek kialakulása mintegy 40 évre nyúlik vissza, és ebben a legfontosabb felfedezések a következők voltak: a DNS hasításának és újraegyesítésének enzimes módszere, a DNS-t specifikus helyeken hasító restrikciós endonukleázokkal és a DNS-t összekapcsoló ligázokkal; a nukleinsav-hibridizáció, az egymást kiegészítő DNS- vagy RNS-szálak összekapcsolása; a DNS-klónozás, amellyel meghatározott DNS-szakaszok egy gyorsan replikálódó vektorba integrálva és gazdasejtbe juttatva megsokszorozhatók; a polimeráz láncreakció, amellyel a DNS-szakaszok in vitro megsokszorozhatók; végül a DNS szekvenálás, a nukleotidok bázissorrendjének részleges vagy teljes meghatározása. A módszerek részleteit illetően utalunk a fejezet előző pontjaira. Ezek a módszerek olyan lehetőségeket nyitottak meg, amelyek a molekuláris genetikát nemcsak új alapokra helyezték, hanem hathatós eszközöket is szolgáltattak annak gyakorlati hasznosításához a mezőgazdaságban, az iparban, az orvostudományban, a környezetvédelemben. A rekombináns géntechnikában hatalmas lehetőségek rejlenek, amelyek nélkülözhetetlenek a kutatásban, a gyakorlatban pedig nagy haszonnal kamatoztathatók, különösen a mikroorganizmusokkal előállított ipari termékek, gyógyszerek, vakcinák körében. Ezek mellett megjelentek az élelmiszer-ipari célokat szolgáló, genetikailag módosított növények és állatok is; ezekkel szemben azonban mind a szakemberek, mind a közvélemény még komoly fenntartásokat támaszt.
A génsebészet gyakorlati alkalmazásai Számos eukariota gént, köztük emberi géneket is, sikerrel vittek be mikroorganizmusokba, amelyekben ipari méretekben termeltetik öket. Ezek az eredmények nemcsak kiemelkedő tudományos sikerek, hanem a molekuláris biotechnológia leglátványosabb eredményeiként a széles nyilvánosság előtt is ismertté váltak. 1979ben sikerült az első emberi fehérjéket, a szomatosztatin növekedési hormont és az inzulint az E. coli baktériumban klónozni. Élelmiszer-ipari területen kiemelkedő jelentőségű volt az oltóenzim (kimozin, rennin) termelésének megvalósítása élesztőben, 1988-ban, amit számos más, az élelmiszeriparban használt, rekombináns enzim előállítása követett. Az 1970-es évek óta a rekombináns DNS technika részleteiben kifinomult, módszertanilag kidolgozott eljárássá vált, és széles körű alkalmazásra talált. Az eljárással szemben kezdetben aggályok merültek fel, mind a tudományos körökben, mind a közvéleményben. Tartani lehetett attól, hogy a genetikai „manipuláció” eredményeként olyan, a természetben elő nem forduló hibridek képződnek, amelyek fertőző tulajdonságai ismeretlenek, ökológiai hatásai kiszámíthatatlanok. Ezért a mesterséges klónozást szigorú rendszabályokkal korlátozták, megtiltották pl. az emberi kommenzalista-szimbionta E. coli klónozását toxinképző, antibiotikum rezisztens vagy rákkeltő géneket hordozó vektorokkal. A már több évtizedes tapasztalatok igazolták, hogy a feltételezett veszélyek kisebbek és biztonsággal korlátok közt tarthatók. A klónozáshoz olyan vektorokat és olyan gazdasejteket fejlesztettek ki, amelyek csak laboratóriumi körülmények közt működnek. Eukariota gének klónozására a potenciálisan patogén E. coli helyett az ártalmatlan S. cerevisiae biztonságosabb és előnyösebben is használható a fehérjetermék kifejeződésére. A soksejtű, magasabbrendű eukarioták (növények és állatok) esetében a mesterséges genetikai rekombináció megvalósítása jóval komplikáltabb, mint az eukariota mikrobáknál, pl. élesztőknél. Ahhoz, hogy a rekombináns DNS kifejeződjön, az is szükséges, hogy a szervezet valamennyi sejtjében jelen legyen, vagyis a bevitel az ivarsejtekkel, a fejlődés korai szakaszában kell hogy történjék. Az ilyen, genetikailag módosított vagy transzgénes szervezet szokásos rövidítése GMO, a belőle származó vagy általa előállított termék pedig GM jelölést kap. A genetikai transzformáció útjában lényeges akadály a növényi sejtfal, amelyet vagy el kell távolítani, vagy a DNS-t át kell juttatni rajta. A sejtfal nélküli sejt, a protoplaszt, megfelelő körülmények közt képes a sejtfalat regenerálni és elszaporodni. Bizonyos típusú sejtek korlátlan ideig tenyészthetők mesterségesen. Ezek a sejt- vagy szövettenyészetek is alkalmasak lehetnek hasznos termékek, másodlagos metabolitok kinyerésére. 332
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek A protoplaszt membránokon igen rövid elektromos impulzusok hatására lyukak üthetők, amelyeken DNS-molekulák bejuthatnak. Az elektroporáció a másodperc milliomod részéig tart, szabályozható és nem károsítja a membránt. Előállítottak olyan eszközt is („génpuskát”), amely a nukleinsavval bevont részecskéket nagy sebességgel belövi a sejtbe. A növények transzformációjához két természetes vektor is használható. Az egyik a növényi kórokozó (gyökérgolyvát okozó) baktérium, az Agrobacterium tumefaciens tumorindukáló (Ti) plazmidja, ami képes a növényi genomba integrálódni. A másik lehetőséget azok a növényi vírusok nyújtják, amelyek önállóan replikálódnak a sejtekben, pl. a karfiolmozaik-vírus. A növényi transzformációra alkalmas vektorok készítése céljából a Ti plazmidot úgy módosították, hogy a tumorindukáló génbe az E. coli pBr322 plazmidját iktatták, és ezzel ártalmatlanították (lefegyverzett = disarmed: D-Ti plazmid). Ugyanakkor a pBr322 plazmid rekombinálható azzal az idegen génnel, amellyel a növényt kívánják transzformálni. Az így módosított D-Ti plazmid az Agrobacteriummal természetes úton bejuttatható a növénybe vagy közvetlenül egy növényi protoplasztba, ahol az idegen gén a növényi genomba integrálódik, és alkalmas promoter segítségével kifejeződik. A transzformált protoplaszt, sejt vagy regenerált növény megfelelő markerekkel szelektálható, majd elszaporítható. Ily módon nagyszámú, különböző növényfaj rekombináns (transzgénes) változatát előállították, növelve azok ellenálló képességét rovarkártevőkkel, peszticidekkel, herbicidekkel szemben, fokozva a szárazságtűrést vagy javítva érési, összetételbeli és más tulajdonságaikat. A Ti plazmidvektor hátránya, hogy csak kétszikű növényekben használható, az egyszikűek (pl. gabonafélék) transzformálására más módszert (elektroporáció, génpuska, vírusvektor) kell használni. A növénytermesztésben elsődleges cél a nagyobb ellenálló képességű fajták létrehozása, mint a rovarrezisztens kukorica, gyapot, a herbicidrezisztens kukorica, szója, a vírusrezisztens burgonya, dohány. Kialakítottak továbbá késleltetett érésű paradicsomot, nagyobb telítetlen zsírsavtartalmú kukoricát és repcét. A genetikailag módosított (GM) fajták termesztésének előnye a nagyobb terméshozamban és a kémiai védekezőszerek (gyomirtók, rovarirtók stb.) csökkentett felhasználásában mutatkozik. Ez utóbbi környezetkímélő hatása is jelentős. Az első genetikailag módosított transzgénes növényeket az 1990-es évek elején hozták létre. Közülük a szója, a kukorica, a gyapot, a repce, a burgonya, paradicsom, a rizs a legfontosabbak. 2001-ben már 52 millió hektáron 13 országban termesztettek transzgénes növényeket, ezek több mint 90%-át négy országban: USA, Argentína, Kína, Kanada. Az Egyesült Államok élen jár ezen a téren, ahol ma a szója felét, a kukorica harmadát GM fajtából termesztik és a feldolgozott élelmiszerek kétharmada is tartalmaz valamilyen transzgénes összetevőt. A GM növények létrehozásának elsődleges célja a terméshozam növelése volt, a betegségekkel, rovarokkal szembeni ellenálló képesség, a herbicidekkel, időjárással szembeni tűrőképesség fokozása révén. Később kedvezőbb érzékszervi tulajdonságú, nagyobb tápanyag-tartalmú, kevesebb ártalmas anyagot tartalmazó transzgénes fajtákat is előállítottak. Több gazdasági növény transzgénes változatát széleskörűen termesztik az Egyesült Államokban és több más országban, de az Európai Unió nem engedélyezi ezek termesztését, és a transzgénes növények élelmiszer-ipari feldolgozását sem. Az állatok genetikai módosítása technikailag jóval komplikáltabb. A rekombináns géntechnikai módszerek elsősorban a sejt- és szövettenyészetekben alkalmazhatók. Transzgénes állatok főként mikroinjekciókkal hozhatók létre, klónozó vektorként pedig retrovírusok használhatók. A magasabbrendű állatok (emlősök, ember) sejtjeinek életben tartása és szaporítása csak különleges körülmények között lehetséges. Tápanyagigényük nagyon összetett, a közeg ozmózisos nyomását, pH-ját és hőmérsékletét nagyon pontosan kell szabályozni. A differenciálódott szöveti sejtek szaporodóképessége csökken, osztódása több napig tart. Az embrionális sejt gyorsabban szaporodik, de rövidebb életű, és mivel nem differenciálódott, ritkán termel specifikus hatóanyagot. A tumorsejtek viszont korlátlanul szaporodóképesek és mesterséges körülmények közt is jól tenyészthetők. Az 1950-es évektől használnak sejttenyészeteket kórokozó vírusok elleni vakcinák termelésére. Elsőként a gyermekbénulás (poliomielitisz) vírus elleni vakcina termelését valósították meg majom és emberi sejttenyészetben. A vakcinákhoz később csatlakozott a specifikus fehérjék, antitestek és interferonok termelése, aminek nagy lendületet adott a monoklónális ellenanyagok kifejlesztése. A limfociták és az immunrendszer más sejtjei természetes körülmények között a különböző antigénekkel szemben az ellenanyagok igen nagy számú változatát termelik, és a vérszérum ezek keverékét tartalmazza. Nathan Milstein 1975-ben 333
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek egér daganatsejteket (mielomasejteket) fuzionáltatott antigénnel indukált limfocitákkal. A keletkezett hibrid, amit hibridomának nevezett el, megtartotta a rákos sejtek korlátlan szaporodóképességét, és a limfocita ellenanyagai közül csak egy-egy specifikus immunfehérjét termelt. A hibridoma sejtek elszaporítva (klónozva) teljesen tiszta, egyféle immunfehérje termelésére alkalmasak, ezek a monoklón ellenanyagok, amelyek rendkívül nagy segítséget nyújtanak a vírusdiagnosztikában, a rákkutatásban, és amióta emberi hibridomát is sikerült létrehozni, lehetőség nyílt a gyógyászati alkalmazásra is. Transzgénes állat létrehozásához az idegen gént a megtermékenyített petesejt, de legkésőbb a néhány sejtes korai embrió (blasztocita) stádiumában kell bevinni. Ez történhet vírusfertőzéssel (rekombinált retrovírussal, pl. SV40) vagy mikroinjekciózással. Az utóbbi a legsikeresebb a még két előmag állapotú, megtermékenyített petesejtben. 1982-ben a Pennsylvania Egyetemen így sikerült a patkány növekedési hormon génjét egérbe ültetni, és a nagy feltűnést keltő „szuperegeret” létrehozni, ami 2–3-szor gyorsabban növekedett és kétszeres nagyságot ért el a normális egérhez képest. 1997-ben, egy skóciai kutatócsoportnak sikerült egy birkát klónozni egy már idős anyajuh sejtjeiből. A Dollynak keresztelt állat világszenzáció lett, de néhány év múlva a korai elöregedés jelei mutatkoztak rajta, majd elpusztult. Dolly esete is figyelmeztet arra, hogy a transzgénes állatokban a bevitt gének nem mindig a várt módon fejeződnek ki. A vírusvektor beépülési helye különösen bizonytalan. Transzgénes sertést, birkát és tehenet már létrehoztak, de a siker aránya alig 1%, szemben az egereknél elért 2–5%-kal. A halak ikrái külsőleg termékenyíthetők meg. Transzgénes utódaik aránya 70%-ot is elérhet.
A géntechnológiai tevékenység szabályozása A génsebészet és a genetikailag módosított szervezetek gyakorlati alkalmazása nagy vitákat kavar és súlyos etikai problémákat vet fel. Még azok is, akik elismerik, hogy bizonyos mikrobák és növények genetikai módosítása hasznos lehet, és elfogadták az így létrehozott szervezeteket, fenntartással fogadják, sőt ellenzik ugyanezt állatok, különösen emlősök esetén. Míg az alaptudományban, a gyógyászatban, pl. a rákkutatásban, gyógyszerfejlesztésben a rekombináns géntechnikák kísérleti alkalmazása állatokon szinte nélkülözhetetlen, addig ezek biotechnológiai hasznosítása már nemcsak a közvélemény felfogásával ütközik, hanem a tudományos etika elveivel is. A GM szervezetekkel szemben felmerült kifogásokat elsősorban az emberi egészséget veszélyeztető hatások, antinutritív tulajdonságok, lehetséges allergiát kiváltó tulajdonságok miatt támasztják. A biodiverzitással kapcsolatos aggály az esetleges génátadás a természetes fajtákba vagy a transzgénes fajta uralomra jutása és a bioszisztémák megváltoztatása. Távolabbi veszélyként még az emberbe való génátjutás lehetősége is felvetődik. A GM szervezetekkel kapcsolatos problémák olyannyira napjaink fő kérdései közé tartoznak, hogy érdemes a pro és kontra véleményeket szélesebben is áttekinteni a transzgénes növények néhány példáján. A Föld népessége jelentős részének a fő tápláléka a rizs, ami azonban A-vitaminban szegény és kevés vasat tartalmaz. Amíg ezt fel nem ismerték és kiegészítőkkel nem pótolták, a vészes vérszegénység és a pellagra a rizsevő emberek közt gyakori betegség volt. Nem véletlen, hogy kínai tudósok valósították meg az A-vitamin előanyagának, a β-karotinnak a szintézisét végző gének bevitelét rizsbe. Ehhez két gént a sárga nárciszból, két további gént az Erwinia uredovora baktériumból vittek át a rizsbe, ami a karotintól sárgás színű lett: innen a transzgénes fajta neve „aranyrizs”. Ugyancsak komplikált feladat volt a vastartalom javítása is. Egy vastartalmú fehérje, a ferritin génjét zöldbabból vitték át. A rizsben a vas felvételét gátló fitátok lebontásához a fitáz enzim génjét az Aspergillus fumigatusból „kölcsönözték”, egy másik gén pedig, ami elősegíti a vas felszívódását az emberi bélcsatornából, egy vad rizsféleségből származott. Végül a vasban dúsított rizst keresztezték az aranyrizzsel, amiben nem kevesebb, mint hét idegen gén található. Jelenleg vizsgálatok folynak ennek a transzgénes fajtának a termesztésbe vételére. A fontos olajnövényeknek, a szójának és a repcének olyan transzgénes módosításait hozták létre, amelyeknek az egészségre kedvező hatású telítetlenzsírsav-tartalma háromszorosa a természetes (vad) fajtáéhoz képest. A szójának kialakították egy herbicidrezisztens fajtáját is (RoundupReady, Monsanto). Ez a petúnia egy olyan enzimjének a génjét tartalmazza, ami glifozát hatóanyagú herbicidekkel szemben rezisztenciát nyújt. 334
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek Érdekes törekvés bizonyos gyomor-bél megbetegedések elleni védekezésre a megfelelő vakcinák felvétele a táplálékkal. Létrehoztak olyan rekombináns növényeket, amelyek a hepatitis B vírus felületi antigénjét tartalmazzák, és fogyasztásuk kiváltotta a szervezet immunitását a vírussal szemben. Az antigén kifejeződött burgonyában és paradicsomban is, ezek fehérjetartalma azonban kicsi. Az ehető vakcinák lehetséges hordozója lehet a banán. A közvetlenül az emberi szervezetre ható transzgénekkel szemben különösen szigorú követelményeket támasztanak az egészségügyi ártalmatlanság és biztonság tekintetében (napi bevitel, antinutritív, autoimmun és allergén hatás). Nagy publicitást kapott, és erős érveket adott a GM ellenzőknek a Starlink kukorica esete. Ebbe a transzgénes fajtába egy rovarkártevő elleni védelmet nyújtó toxin génjét (cryc9) építették be Bacillus thuringiensisből. A hatásos toxint permet és por alakban már évek óta használták, és az emberi szervezetre ártalmatlannak bizonyult. A kukoricába épített gén sem volt allergén hatású, de ellenállt az emésztésnek, ezért az 1998 és 2000 között termesztett Starlink kukoricát csak állatok etetésére engedélyezték. A nem megfelelően elkülönített GM kukorica azonban emberi táplálékba került (az amerikai gyorséttermi láncokban kedvelt mexikói taco ételbe). Ez a sajtó által felnagyított allergiaveszély miatt nagy botrányt kevert, és a termék tömeges visszahívásával járt. A GM növényekkel szemben támasztott biztonsági kockázatok megállapítása folyamatosan napirenden van. Hasonló bizonytalanság uralkodik atekintetben is, hogy átkerülhetnek-e a gének a növényből a talajbaktériumokba, az állati vagy emberi szervezetbe és válhatnak-e a patogenitás tényezőivé? Az utóbbi kérdés amiatt merül fel, mert a génbevitel kimutatásának szelektív jelzésére antibiotikum-rezisztencia géneket használnak. Nagy veszélyt jelenthet, ha ezek elterjednek a baktériumokban, amelyek között a horizontális génátvitel jelensége ismert. Bár sok nyitott kérdés még megoldásra vár, szembe kell nézni azzal a ténnyel, hogy a GM növényekkel vagy velük készült termékekkel való találkozás már nem kerülhető el. Az állattenyésztésben a kutatási eredmények alkalmazására még nem került sor. A háziállatok tartásában és a baromfitenyésztésben a GM fajták előállítása költséges és rossz a hatékonyságuk, a közvélemény ellenállása pedig nagy. A haltenyésztésben viszont jelentősek az eredmények. Transzgénes halfajok növekedési gyorsaságát, hidegtűrését, betegséggel szembeni ellenálló képességét és sterilitását sikerült kialakítani. Az utóbbi szempont a mesterséges tenyészetekből, halastavakból a természetbe véletlenül kiszabaduló GM fajták elszaporodásának megakadályozása miatt fontos. Nyilvánvaló, hogy a növényekkel és állatokkal szemben a mikroorganizmusok genetikai módosítását sokkal könnyebb megvalósítani. Az 1980-as évek óta a rekombináns termékek széles körét hozták létre mikroorganizmusokkal, amelyek között emberi fehérjék, interferonok, vakcinák, enzimek vannak, a gazdaszervezetek pedig különböző baktériumok, elsősorban az E. coli, valamint a S. cerevisiae és más élesztőgombák, pl. Pi. pastoris (10.12. táblázat). A 7. fejezetben példákat említettünk arra, hogy milyen genetikai módosításokat sikerült megvalósítani a sör- és borélesztő törzsek technológiai tulajdonságainak javítására. Néhány ilyen GMO élesztő gyakorlati alkalmazását is jóváhagyták, mint a növelt maltózhasznosítású sütőélesztőt (Hollandia, 1988), a STA2 gént tartalmazó, extracelluláris glükoamilázt termelő sörélesztőt (Anglia, 1994), valamint egy nagyobb aromatermelésű szaké-élesztőt (Japán, 2002). A biztonsági szempontok és egészségügyi aggályok miatt azonban ezek ipari alkalmazására mégsem került sor. Élelmiszerek előállítására jelenleg még nem használnak GMO mikroorganizmusokat, csupán élelmiszer-adalékok, ízesítőanyagok készítésére használhatók (pl. szerves savak, enzimek, aromák), amelyek élő mikroorganizmust nem tartalmaznak. Áttörést hozhat azonban ezen a téren az a transzgénes borélesztő törzs, amelyik az Oenococcus oeni malolaktikus enzimét és a Sch. pombe almasav permeázát hordozza. Ezt a törzset 2003-ban engedélyezték az USA-ban, és azóta ott kereskedelmi forgalomban van.
10.12. táblázat - Néhány példa heterológ fehérjék előállítására rekombináns élesztőkkel Expressziós gazdasejt S. cerevisiae
Termék
Megvalósítás éve Megjegyzés*
Humán interferon
1982
S
Humán inzulin
1983
S, P 335
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek Búza amiláz
1984
I
Hepatitisz B antigén
1984
I, P
Borjúgyomor kimozin
1984
I, P
HIV köpenyfehérje
1987
I
Humán szérumalbumin
1989
S
Aspergillus glükózoxidáz
1991
S
Hepatitisz B antigén
1987
I
Epidermális növekedési faktor
1987
S, P
Humán tumornekrózis faktor
1989
I
Kluyveromyces lactis Borjúgyomor prokimozin
1990
S, P
Sch. pombe
1989
S
Pi. pastoris
Schwanniomyces α-amiláz
* S: kiválasztott, I: intracelluláris, P: iparilag termelt A jelenlegi helyzetet összefoglalva megállapítható, hogy a GMO növények, állatok és mikrobák alkalmazása számos előnnyel jár mind egészségügyi és táplálkozási, mind környezeti szempontból. Növelhető a megtermelt tápanyagok mennyisége, ami a világ fejlődő országaiban élő népesség érdekében döntő, fokozható az élelmiszerek tápanyagtartalma, ami a fejlett országokban fő szempont, kialakíthatók az egészséget közvetlenül védő eljárások, pl. passzív immunizálás, és kivédhetők bizonyos táplálkozási és hiánybetegségek. Környezetvédelmi szempontból meghatározó jelentőségű a herbicidek, peszticidek, fungicidek használatának csökkentése, a talaj- és a vízminőség javulása. A nyilvánvaló előnyökkel összevetve a GM szervezetekkel szemben több aggály és fenntartás is felmerül. Egészségügyi szempontból a GM élelmiszerek allergiát okozhatnak, a fogyasztóra toxikusak lehetnek, táplálkozási kiegyensúlyozatlanságot okozhatnak. Még nem igazolható egyértelműen, hogy a rezisztencia nem terjed-e át a kórokozókra vagy a környezetkárosító gyomokra, mikrobákra. Környezeti kockázatot képezhet a transzgénes szervezetek elterjedésének biodiverzitást csökkentő hatása. A biztonsági szempontok és az etikai fenntartások korlátozzák a GM szervezetek társadalmi elfogadottságát.
Genomika az élelmiszeriparban A genomika a 20. század végén kialakult új tudományág: a szervezetek teljes genetikai állományának, a genomnak a tanulmányozása. Miután a teljes emberi genomot is feltárták, várható volt, hogy a genomika elsősorban az orvostudományt érdekli. Hamarosan megindult azonban a genomikai kutatások élelmiszeripari és biotechnológiai alkalmazása is, mind az élelmiszerek alapjául szolgáló növényi és állati nyersanyagok minőségének és tápértékének javítására, mind pedig az élelmiszerek biztonságában, tartósságában és előállításában jelentős szerepet játszó mikroorganizmusok tulajdonságainak jobb megismerése céljából. A mikrobagenomika előmozdítja a hatékonyabb, gazdaságosabb feldolgozási és tartósítási módszerek kifejlesztését, a biztonságos, jobb minőségű, természetesebb és tartós termékek előállítását. A számtalan, jelentős eredmény mellett a genomikai lehetőségek az élelmiszeriparban még a jövő ígéretei. Az élelmiszertechnológusoknak és -mérnököknek ismerniök kell a genomikában rejlő lehetőségeket annak érdekében, hogy azokat minél teljesebb mértékben kiaknázhassák. 336
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek Ez a fejezet döntő részben a 2005. év nyaráig feltárt ismereteket összegezi.
A genomika kialakulása A genomika gyökerei a molekuláris biológia kialakulásáig nyúlnak vissza (10.13. táblázat). Az előzmények természetesen messzebbre vezethetők vissza, ha tetszik, akár Gregor Mendelig, aki 1865-ben elsőként írta le az öröklődés törvényszerűségeit, vagy Thomas Morganig, aki az 1920-as években igazolta a kromoszómák és a gének szerepét az öröklődésben, majd Oswald Averyhez és munkatársaihoz, akik igazolták, hogy a DNS az örökítő anyag. Elegendő azonban csak 50 évre visszatekinteni: a dezoxiribonukleinsav (DNS) szerkezetének felfedezéséig, James Watson és Francis Crick alig másfél oldalas közleményének megjelenéséig a Nature folyóirat 1953. április 25-i, 4356. számában.
10.13. táblázat - A molekuláris biológia mérföldkövei Év
Felfedezés, eredmény
Kutatók
1944
DNS mint az öröklődési anyag
O. Avery, C. McLeod, M.McCarty
1953
DNS szerkezete
J. Watson, F. Crick
1958
Szemikonzervatív DNS replikáció
M. Meselson, F. Stahl
1961
mRNS átírás
S. Brenner, F. Jacob, M. Meselson
1962
restrikciós endonukleázok
D. Nathans, H. Smith
1966
genetikai kód megfejtése
M. Nirenberg, H.G. Khorana
1972
in vitro rekombináns DNS
P. Berg
1973
plazmid klónozás
Boyer, S.N. Cohen, P. Berg
1975
DNS szekvenálás
F.Sanger, A.M.Maxam, W.Gilbert
1977
első teljes genom, bakteriofág
F. Sanger
1988
polimeráz láncreakció
K. Mullis
1990
Humán Genom Projekt kezdete
J. Watson
1995
első teljes baktérium genomok
C. Venter, H. Smith
2001/2003 teljes humán genom szekvencia
F. Collins, C. Venter
A „csodálatos kettős spirál”, a DNS szerkezete és működése egyaránt magyarázatot nyújt a genetikai információ tárolásának, átörökítésének és megnyilvánulásának mikéntjére. A rohamosan megindult kutatások feltárták, hogy az egymást kiegészítő bázispárok kapcsolódása biztosítja a DNS megkettőződésének (replikációjának) hűségét, hogy a mindössze négyféle nukleotidbázis sorrendje határozza meg a géneket, hogy három-három bázis (triplet) felel meg egy-egy aminosavnak, hogy a genetikai kód 64-féle különböző triplet összessége, ami az egész élővilágban csaknem azonos, univerzális, és hogy a bázissorrendben rejlő genetikai információ 337
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek hogyan íródik át a küldönc ribonukleinsavra (másolat RNS, mRNS) és irányítja ily módon a fehérjék szintézisét, amikor a riboszómákon a nukleotid-betűzet aminosavakra fordítódik le. A DNS szerkezete és funkciója továbbá molekuláris szintű magyarázatot szolgáltatott a károsodott molekula kijavításának módjára, a hiányában bekövetkező mutációkra és a genetikai betegségekre. Az 1960-as években az egymást követő felfedezések, amelyek jelentőségét a Nobel-díjak sorozatos odaítélésével ismerték el, új, forradalmi korszakot nyitottak a biológiában, a molekuláris biológia korszakát. Az alapvető molekuláris biológiai, genetikai felismeréseket a DNS kivonására, tisztítására, vizsgálatára alkalmas új módszerek rohamos fejlődése tette lehetővé. Ezek közé tartoztak a DNS-t specifikus helyeken hasító restrikciós endonukleázok és a DNS-t összekapcsoló ligázok; a nukleinsav-hibridizáció, az egymást kiegészítő DNS- vagy RNS-szálak összekapcsolása; a DNS klónozás, amellyel meghatározott DNS-szakaszok egy gyorsan replikálódó vektorba integrálva és gazdasejtbe juttatva megsokszorozhatók; a polimeráz láncreakció, amellyel a DNS szakaszok in vitro megsokszorozhatók; végül a DNS szekvenálás, a nukleotidok bázissorrendjének részleges vagy teljes meghatározása (10.6. fejezet). A genomika közvetlen előzménye és létrejöttének feltétele a DNS szekvenálás volt. A DNS bázissorrend meghatározására, szekvenálására szolgáló eljárások kidolgozásuk idején rendkívül munkaigényesek voltak. 1977-ben Frederick Sangernek és munkatársainak egy éves munkájába került, amíg az első teljes DNS szekvenciát, a ϕ174 bakteriofág genomját, ami mindössze 5386 nukleotidból áll, meghatározták. A rohamos módszertani és technikai fejlődés magával hozta a szekvenálás automatizálását; erre a Sanger-féle didezoxi-analóg gátlási módszer különösen alkalmas volt, és ez lett az automata szekvenátorok működésének alapja is. Az 1986-ban elkészült első automata berendezés még lassú volt, naponta mintegy 250 bázis sorrendjét határozta meg. A teljesítményt egy évtized alatt hatezerszeresre növelték; a mai gépek mintegy másfélmillió bázist szekvenálnak naponta és ezekből sok százat üzemszerű gyártóvonalakká öszekapcsolva folyamatosan működtetnek. Egy szekvenáló cég az Ec. faecium genomját már egyetlen nap alatt határozta meg 2000-ben. Így alakult ki a genomika mint a genomnak, a szervezetek teljes genetikai készletének, a genetikai információ anyagának, tárolásának és kifejeződésének vizsgálatával foglalkozó új tudományterület.
Mikroorganizmusok és többsejtű szervezetek genomjai A 20. század utolsó két évtizedét tekinthetjük a genomika korszakának, amikor az elsődleges cél a szervezetek genom-DNS szekvenciáinak megismerése volt, a DNS-t alkotó bázisok sorrendjének meghatározása, a gének azonosítása, valamint az ehhez szükséges módszerek fejlesztése. Az 1980-as években egyre több vírus genomszekvenciáját határozták meg. Ezek általában tízezernél (10 Kb-nál) kevesebb nukleotidból állnak, a legnagyobbak is, mint a λ-bakteriofág és a herpes simplex vírus is csak 48, illetve 152 Kb-t tartalmaznak. Az első baktériumok, amelyek genomszekvenciája 1995-ban ismertté vált, az obligát sejtparazita, így redukált genetikai információt hordozó Mycoplasma genitalium és a Haemophilus influenzae volt. Az előbbi máig is az ismert legkisebb genomú sejtes élőlény, kromoszómája 580 Kbp-ból áll. A nagy léptekkel megindult genomszekvenálás máig már mintegy 350 prokariota mikroorganizmus teljes genomját tárta fel, köztük ősbaktériumok, Gram-negatív és Gram-pozitív baktériumok, aktinobaktériumok, cianobaktériumok egyaránt vannak. A 10.14. táblázat az elsőként feltárt 12 baktériumfaj szekvenciaadatait mutatja be.
10.14. táblázat - Prokariota kromoszómák teljes genomszekvenciái Faj Mycoplasma genitalium
Méret (Kb)
ORF*
Év
580
470
1995
Megjegyzés első baktérium 338
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek Haemophilus influenzae
1830
1743
1995
proteobaktérium
Methanococcus jannaschii
1665
1738
1996
első ősbaktérium
Synechocystis spp.
3573
3168
1996
cianobaktérium
Helicobacter pylori
1668
1590
1997
proteobaktérium
Archaeoglobus fulgidus
2178
2436
1997
ősbaktérium
Escherichia coli
4639
4288
1997
Gram-negativ modell
Bacillus subtilis
4215
4100
1997
Gram-pozitív modell
Treponema pallidum
1138
1041
1998
spirochéta
Rickettsia prowazekii
1111
834
1998
obligát parazita
Chlamydia trachomatis
1042
894
1998
obligát parazita
Mycobacterium tuberculosis
4411
3924
1998
aktinobaktérium
* ORF (open reading frames): ismert vagy feltételezett géneknek megfelelő szakaszok Az eukariota szervezetek közül az első, amelynek teljes genomszekvenciáját feltárták, a S. cerevisiae élesztőgomba volt, 1996-ban (10.15. táblázat). Ezt követően újabb élesztőfaj, a Scizosaccharomyces pombe genomszekvenciája csak 2002-ben vált ismertté, miközben bejelentették az első fonalasgomba, az Aspergillus oryzae teljes genomjának nukleotidsorrendjét is. A S. cerevisiae-t követően, még az ezredfordulót megelőző években, sikerrel járt néhány többsejtű eukariota szervezet, ízeltlábú, féreg, növény, emlősállat teljes genomjának szekvenálása is, máig már közel félszáz szervezeté (10.16. táblázat). Mind a prokarioták, mind az eukarioták körében a genomok szekvenálása nagy erőkkel folyik és egyre újabb fajok teljes genomjának megismerése várható.
10.15. táblázat - Az élesztő (Sacharomyces cerevisiae) genomjának áttekintése Teljes hossz (Kb)
Gének (ORF) száma
I
230
110
II
813
422
III
315
172
IV
1554
812
V
577
291
Kromoszóma
339
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek VI
271
135
VII
1091
572
VIII
589
288
IX
440
231
X
745
387
XI
667
334
XII
2352
547
XIII
924
487
XIV
784
421
XV
1091
569
XVI
948
497
Összesen (I–XVI) 13 389 Kbp, 6275 ORF, ebből 390 gén (6%) kérdéses
10.16. táblázat - Teljes eukariota genom szekvenciák Taxon
Genom (Mb)
Gének száma
Év
Saccharomyces cerevisiae
14,2
6 231
1996
Schizosaccharomyces pombe
12,6
4 824
2002
Neurospora crassa
43,0
10 082
2003
Protozoa
Plasmodium falciparum
22,7
5 300
2002
Rovar
Drosophila melanogaster
137
13 601
2000
Fonálféreg
Caenorhabditis elegans
100,1
16 384
1998
Növény
Arabidopsis thaliana
125
25 498
1999
Oryza sativa japonica
466
46 000
2002
Hal
Danio rerio
1450
20 000
2003
Emlős
Mus musculus
2932
28 000
2005
Rattus norvegicus
2719
23 400
2005
Gombák
Faj
340
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek Homo sapiens
3200
35 000
2003
A molekuláris genetika legnagyobb tudományos vállalkozása, az emberi tudomány egyik legkiemelkedőbb, korszakalkotó eredménye az emberi genom szekvenciájának feltárása. A Humán Genom Projekt kutatási programot 1990-ben kezdték el az Egyesült Államok négy vezető intézetének részvételével. A program első igazgatója James Watson volt. A hatalmas feladat végrehajtását 15 évre tervezték; elvégzésébe hamarosan bekapcsolódtak más országok (Anglia, Németország, Franciaország, Japán, Kína) kutatócsoportjai, és a 18 intézetet felölelő program átalakult és kibővült Nemzetközi Humán Genom Szekvenáló Konzorciummá, amelynek vezetője Francis Collins lett. Időközben, 1998-ban, vetélytárs is jelentkezett, Craig Venter, a Celera Genomics, egy privát intézet alapítója személyében, aki más, gyorsabb módszerrel közelítette meg a feladatot. Mindkét vállalkozás eredményre vezetett, néhány évvel az eredetileg tervezett határidő előtt. A humángenom megközelítőleg teljes vázlatát 2000 júniusában, majd 2001 februárjában közölték, a teljes szekvencia bejelentését 2003. április 14-ére, a DNS szerkezet publikációjának 50. évfordulójára időzítették. A tudomány etikai diadala is, hogy a teljes bázissorrend szabadon hozzáférhető az interneten (http:// www.ncbi.nih.gov), bár a Celera adatbázisa csak bizonyos megszorításokkal. A 22 kromoszóma és a két nemi (X, Y) kromoszóma összesen mintegy 3,12 milliárd bázisból áll és mintegy 35 ezer gént tartalmaz (10.17. táblázat).
10.17. táblázat - Az emberi genom szekvenciájának áttekintése Kromoszóma
Bázisok száma (millió bázispár)
Kromoszóma
Bázisok száma (millió bázispár)
1
245
3232
13
114
820
2
243
2653
14
105
1212
3
199
1906
15
100
1206
4
191
1631
16
89
1327
5
180
1772
17
81
1693
6
170
1935
18
77
670
7
158
1891
19
63
1761
8
145
1470
20
63
956
9
134
1468
21
46
440
10
135
1463
22
49
844
11
134
2027
X
152
1438
12
133
1673
Y
50
221
Gének száma
2003. 07. 28.-i adatok szerint 341
Gének száma
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek
Funkcionális genomika Az emberi genom teljes szekvenciájának megismerésétől számítható a posztgenomika korszaka. Bár mind több szervezet teljes genomszekvenciájának feltárása tovább folyik, a fő cél ma már a genomok működésének, a gének funkciójának a megismerése. Ez egyúttal erőteljes motiváció az ehhez szükséges nagyteljesítményű vizsgálati módszerek fejlesztéséhez is. A teljes genomoknak csak bizonyos szakaszai, kisebb-nagyobb hányaduk azonosítható ismert vagy feltételezett génekkel. Ennek aránya az E. colinál a 4300 gén közel 90%-a, a S. cerevisiae több mint 6000 génjének 50%-a, az ember mintegy 35000 génjének csak 10%-a. A nagyszámú, ismeretlen funkciójú gén megismerése a kutatás előterébe került és kialakította a funkcionális genomikának nevezett irányzatot. Ez a gének működésének megismerését lényegében három szinten igyekszik elérni, a sejtműködés hierarchiájának (vagyis a molekuláris genetika centrális dogmájának) megfelelően: a DNS-ről átírt mRNS-ek, az erről lefordított fehérjék és az enzimek révén létrehozott anyagcsere-termékek, metabolitok szintjén. A megközelítés módja azonban újszerű, holisztikus: nem az egyes komponenseket vizsgálja, hanem azok összességét, a teljes genom összefüggésében. Igy beszélünk az mRNS átiratok készletéről (transzkriptom), a szintetizált fehérjék és enzimek teljességéről (proteom), a keletkezett metabolitok összességéről (metabolom) és az ezekben közreműködő enzimreakciók, anyagcsereutak és folyamatok sebességéről, mértékéről (fluxom). A nukleinsav-szekvenciában meghatározott genotípus (genom) így nyilvánul meg a fenotípusban (fenom). Mindez ráadásul komplex szabályozással megy végbe és a környezet hatásaira reagálva jelentkezik (regulom). Nyilvánvaló, hogy az ilyen összetett vizsgálatokhoz új, a korábbiaknál sokkal nagyobb hatásfokú vizsgálati és adatkezelő (informatikai) módszerek kellenek. A funkcionális genomika felosztható a vizsgálat köre szerint transzkriptomikára, proteomikára, metabolomikára, és mindegyiknek nélkülözhetetlen vizsgálati módszere a bioinformatika (10.19. ábra). (A divatossá vált „omok” egyre újabb elnevezésekben jelentkeznek, pl. a különböző fenotípusokat összefogó közösségek és környezetük kapcsolatrendszerére vonatkoztatva beszélnek ökomikáról.)
10.19. ábra - A fukcionális genomika
342
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek
Transzkriptom elemzése A gén biológiai szerepét megismerhetjük, ha tudjuk, mikor és hogyan fejeződik ki. Bár a fehérjeszintézis szabályozása nem kizárólag az mRNS szintjén történik, a gének kifejeződése összefügg az mRNS-ek megjelenésével és tükrözi a sejt fiziológiai állapotát, a változó környezetben. Erre világít rá a transzkriptom elemzés. Néhány gén expresszióját az ún. Northern blot módszerrel el lehet végezni, de tömegesen már nagyon körülményes lenne. Az mRNS-ek elemzése azonban könnyen megvalósítható a róluk DNS-re visszaírt másolatok (cDNS-ek) révén, amelyek viszont nagy hatásfokkal vizsgálhatók a DNS mikrorendekkel (lásd 10.6.6.3.). A mikrorendtechnika kiválóan alkalmas a génkifejeződés vizsgálatára. A különböző körülmények közt (pl. gátlószer hatására és a kontrol mintából) izolált mRNSről másolt cDNS-t különböző színű fluoreszkáló festékkel jelölik és ugyanahhoz a mikrochiphez hibridizáltatják. Az egyes pontokban mért fluoreszcenciaintenzitás képet ad a génkifejeződés mértékéről a vizsgált tényező függvényében.
Proteom elemzés Bár a transzkriptom elemzés képet ad az mRNS kifejeződésről a sejtszabályozás és a környezettel való kölcsönhatás tükrében, a fehérjeszintézis szabályozásán túl a fehérjék sejten belüli lokalizációja, szállítása, lebontása, módosítása (foszforilezése, glikozilezése, acetilezése), összekapcsolódása szabja meg azok végső aktivitását és szerepét a sejt működésében. Ezért arról a teljes fehérjekészlet, a proteom elemzése további információt nyújt. Többféle, nagy hatásfokú és teljesítményű módszert fejlesztettek ki a tömeges fehérjevizsgálatokra. Az elválasztásra szolgál a kétdimenziós gélelektroforézis, a kapilláris izoelektromos fókuszálás, a fehérjék azonosítására pedig a tömegspektrometria különböző változatai. Újabban megjelentek a DNS-chipekhez hasonló fehérje mikrorendek is, amelyek az antigén-antitest specifikus kapcsolódáson alapulnak.
Metabolom elemzés Az anyagcseretermékek (kis molekulatömegű intermedierek, végtermékek) teljes profiljának vizsgálata rávilágít az anyagcsere-folyamatok működésére, a sejt környezeti hatásokra adott válaszreakcióira. Bizonyos metabolitok koncentrációja szabályozza a transzkripciót, transzlációt, enzimaktivitást. A metabolomika tehát újabb és más szintű információt szolgáltat a sejtműködésről. Nagyon sokféle hagyományos módszer és azok továbbfejlesztett, automatizált változata használható az ilyen összetett vizsgálatokra. Közéjük tartozik a kapilláris gélelektroforézis, a kétdimenziós vékonyréteg-kromatográfia, a HPLC, a GC-MS, LC-MS stb. Az új irányzat ezek miniatürizálása, a teljes mikroanalitikai rendszer (μTAS = micro total analytical system) kifejlesztése, amit chip laboratóriumnak is szokás nevezni.
Fluxom elemzés Az anyagcsereáramok, a különböző folyamatok sebességeinek, fluxusainak profilja még egy lépéssel továbbvisz a sejt anyagcsere-állapotának megértéséhez. A reakcióktól függően a fluxusok hagyományos biokémiai és enzimológiai módszerekkel vagy izotóptechnikával mérhetők és számíthatók. Változásaik fényt vetnek az anyagcsere-folyamatok szabályozására is. Ezek összessége a sejtszinten már olyan bonyolult hálózatot képez (regulom), amelynek áttekintése a transzkriptom, proteom, metabolom adatainak összefüggéseiben csak számítógépes modellezéssel lehetséges. 343
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek
Bioinformatika A teljes szekvenciaelemzések a nukleotidbázisok milliárdjainak sorozatait tárják fel, a transzkriptomika, proteomika, metabolomika nagyteljesítményű módszerei is az adatok özönét szolgáltatják. Ezek tárolása egyrészt hatalmas komputeres adatbázisokat igényel, másrészt kezelésükre, az adatok összehasonlító elemzésére szintén hatékony módszereket kellett kidolgozni. Így alakult ki a bioinformatika, mint a genomika társtudománya, amelynek fegyvertárába olyan matematikaistatisztikai módszerek tartoznak, mint pl. a főkomponens-analízis, a diszkrimináns-analízis, a nemlineáris térképezés stb., amelyek nemcsak két, hanem több adattömeg összehasonlítására is alkalmasak. Nyilvánvaló, hogy használatuk nagyteljesítményű számítógépeket, hatékony komputerprogramokat igényel. Csupán két baktériumtörzs genomszekvenciájának összehasonlítása is több órás vagy napos komputeres futtatást vehet igénybe. Az interneten olyan hatalmas adatbázisok halmozódtak fel, hogy azok értékelése messze elmarad az újabb és újabb adatok megjelenésének sebessége mögött. Az elérhető hatalmas adatbázisok elemzése alapján új eredményekre lehet jutni, saját laboratóriumi vizsgálatok nélkül is. Ez az ún. in silico analízis az utóbbi évek terméke. Világszerte ma három nagy adatbázis tartalmazza a DNS szekvenciákat, az európai EMBL, az amerikai GenBank és a japán DDBJ. Szerencsére, ezek kölcsönös kapcsolatban állnak és kiegészítik egymást. A felhasználók munkáját megkönnyíti, hogy ezekben az egyes szervezetek azonosítási számai megegyeznek. Számos kisebb, részletinformációkat nyújtó adatbázis is működik; számuk több mint 300. Ezek fehérjeszekvenciák, enzimek, anyagcseretermékek és -utak, fluxusok számítására, továbbá kezelőprogramok tárolására szolgálnak. Néhány genomszekvencia és fehérje adatbázist a 10.18. táblázat mutat be.
10.18. táblázat - Jelentősebb genom és fehérje adatbázisok Adatbázis
Internet elérhetőség
EMBL (European Bioinformatics Institute)
www.abi.ac.uk/embl [http:// www.abi.ac.uk/embl]
GenBank (National Center for Biotechnology Information)
www.ncbi.nlm.nih.gov [http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/]
DDBJ (DNA Database of Japan)
www.ddbj.nig.acjp [http:// www.ddbj.nig.acjp/]
Swissprot (Swiss Institute for Bioinformatics)
www.expasy.ch/sprot [http:// www.expasy.ch/sprot]
TIGR (The Institute for Genomics Research)
www.tigr.org/tdb [http:// www.tigr.org/tdb]
Human Genome Project
www.sanger.ac.uk [http:// www.sanger.ac.uk/]
Human Genome Database
www.ornl.gov/hgmis [http:// www.ornl.gov/hgmis] 344
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek E. coli
www.genome.wisc.edu [http:// www.genome.wisc.edu/]
S. cerevisiae
www.stanford.edu/ Saccharomyces [http:// www.stanford.edu/ Saccharomyces]
Fenomika, ökomika, metagenomika A biológiai kutatás útja a legutóbbi időkig a teljes szervezettől annak összetevő részeihez, a sejtszintű és a molekuláris szintű részletekig vezetett. A molekuláris összetevőkről, mechanizmusokról, anyagcsereutakról és szabályozási hálózatokról olyan hatalmas ismeretanyag gyűlt össze, ami időszerűvé teszi az élő rendszerekről alkotott felfogás átértékelését. A genomika közelebb hozta annak megértését, hogyan integrálódnak a gének és géntermékek a szervezet tulajdonságainak és viselkedésének kialakításában. A vizsgálódás iránya megfordul, a részleteket összefogó kapcsolatrendszer, a komplex szervezet megértése, a rendszerbiológia tanulmányozása irányába. Ennek az iránynak az első szintje a fenomika, ami azt vizsgálja, hogy a géntermékek összessége hogyan alakítja ki a tulajdonságokban megnyilvánuló rendszert. Nem a fenotípus az érdeklődés elsődleges tárgya, hanem az, hogy a genotípusból hogyan jön létre a fenotípus. Egy adott genotípusból többféle fenotípus alakulhat ki, mivel egyedi nukleotid-polimorfizmusok, egyes gének hiánya vagy többlete, a környezetre adott eltérő válaszokban nyilvánul meg. Ha megismerjük, hogy egy meghatározott fenotípus hogyan jön létre adott genotípusból, lehetővé válik, hogy olyan genotípust alakítsunk ki, amelyből a szükséges fenotípus kifejlődhet. Ez hatalmas lehetőséget rejt a mezőgazdasági, állattenyésztési, biotechnológiai, orvosi alkalmazásban. Bár ettől még messze vagyunk, már felsejlik a fenom szintnél is magasabb összefüggések megközelítése: az ökológiai kapcsolatrendszer, az „ökom” szintjén. Mikrobiológiai vonatkozásban napjaink valósága a metagenomika: a genomika alkalmazása a nem kitenyésztett mikroorganizmusokra. A természetes élőhelyek (talaj, tengervíz) biodiverzitásának genomszintű vizsgálatából az derült ki, hogy a kitenyészthető mikrobatípusok csak töredékét (1–10%-át) képviselik a létező sokféleségnek. A metagenomika (környezeti vagy közösségi genomika) a tenyészetekben nem ismert (mai módszerekkel ki nem tenyészthető) mikroorganizmusok DNS-ének kivonását és közvetlen elemzését jelenti. Egy adott élőhelyről kivont összes DNS-ről van szó, amelynek szekvenciaelemzése azonban feltárja az ott élő mikrobaközösség sokféleségét, az adatbázisokkal összevetve új, nem ismert fajok létezésére világít rá, új gének és géntermékek felfedezésére vezet, a populációk és társulások szerkezetére utal. Jelentős előrelépést hoz olyan élőhelyek mikrobiotájának jobb megismerésében is, mint pl. a száj vagy a bendő mikrobaközösségei, élelmiszer-mikrobiológiai vonatkozásban pedig a sérült (nem tenyészthető, VNC) mikrobák kimutatásában.
A genomika alkalmazásai A funkcionális genomika soha nem látott távlatokat nyit az élettudományokban. Először nyílik lehetőség arra, hogy átfogó betekintést szerezzünk a sejtben végbemenő folyamatokról, annak egyensúlyi (homeosztázis) állapotában és specifikus környezeti hatásra adott válaszként. A gének hatalmas számának funkciója válik ismertté (10.19. táblázat). Az új géneken kívül meghatározható a gének kópiaszáma, elhelyezkedése és kapcsolódása a kromoszómán. A globális génexpressziós elemzés olyan komplex molekuláris folyamatokat tár fel, mint a genetikai szabályozás hálózata, a sejt jeltovábbító rendszere. A különböző szervezetek szintjén végzett összehasonlító elemzéssel ismereteket kapunk mind a közös, általános, alapvető élettani folyamatokról, mind pedig valamely specifikus 345
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek tulajdonságot (pl. patogenitást) meghatározó tényezőkről. Mivel a S. cerevisiae volt az első eukariota, amelynek teljes genomszekvenciáját megfejtették, a további vizsgálatokban jóval több ismeret gyűlt össze róla. A különböző környezeti tényezőkre adott genomszintű válaszok összehasonlításából kiderült, hogy az élesztő összes génjeinek 14%-a, kereken 900 gén expressziója változott, 2/3 részének transzkripciója csökkent, 1/3-ra növekedett.
10.19. táblázat - Génfunkciók megoszlása (%) baktérium és élesztőgomba genomokban Működési kör
E. coli
H. influenzae
S. cerevisiae
Anyagcsere
21,0
19,0
12,0
Szerkezeti
5,5
4,7
7,4
Transzport
10,0
7,0
4,6
Szabályozás
8,5
6,6
6,0
Transzláció
4,5
8,0
10,3
Transzkripció
1,3
1,5
11,4
Replikáció
2,7
4,9
4,9
Sejtciklus
–
–
6,5
Egyéb, ismert
8,5
5,2
1,6
Ismeretlen
38,1
43,0
41,1
Az összehasonlító genomika ma elsősorban az ismeretlen funkciójú gének azonosítására törekszik, de lassan átfogó kép kezd kirajzolódni a genomok szerveződéséről az élővilágban. Összehasonlító elemzés nemcsak a teljes genomok vizsgálatával lehetséges, hanem a mikrorendek alkalmazásával is. Ez a technika alkalmas egyetlen nukleotidban mutatkozó különbség (polimorfizmus) kimutatására is; így pl. két élesztőtörzs között nem kevesebb, mint 3000 ilyen helyet találtak. Az emberi genom 99,9%-ban azonos, a 0,1%-nyi különbség azonban azt jelenti, hogy mind a 30 ezernyi gén átlagosan tízféle változatban fordulhat elő. A genomika elsődleges alkalmazási területe az orvostudomány és a gyógyszeripar. A transzkriptomika rávilágít azokra a különbségekre, amelyek az egészséges és kóros folyamatok közt mutatkoznak. Azonosíthatók azok a gének, amelyek kapcsolatba hozhatók a betegségekkel. Egy bioaktív hatóanyagra adott válasz átfogóan értékelhető a farmakológiai kutatásban, új gyógyszerek fejleszthetők ki. A proteomika az allergén fehérjék és az allergiás reakciók kutatásában nyit új lehetőségeket. A fermentációs iparok a metabolomikából kapnak legközvetlenebb adatokat a fenotípus és a termék összefüggéseiről, az anyagcsere-mérnökség hatásairól. Az értékes másodlagos anyagcseretermékek képzéséhez vezető szabályozás megismerése különösen hasznos lehet. A táplálkozás- és élelmiszer-tudomány is merít az új genomikai ismeretekből. A farmakogenomika után már szó van „nutrigenomikáról” is (10.20. ábra). A gyógyszerhatás-vizsgálatokhoz hasonlóan pontosabban megismerhetők a funkcionális élelmiszerek bioaktív tényezői, jobban körülhatárolhatók azok a folyamatok, amelyek a szervezetet segítik a betegség megelőzésben. Általában, az élelmiszer-összetevők biológiai hatása, egészségügyi biztonsága meghatározható a transzkriptom, proteom, metabolom globális változásaiból. Olyan gének, fehérjék, metabolitok azonosíthatók, amelyek közvetlenül kapcsolatba hozhatók egy specifikus élelmiszerrel terjedő kórokozó vagy romlást okozó mikroorganizmussal, azonosíthatók mind a mikroorganizmusok, mind azok a tényezők, amelyek 346
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek szaporodásukat, toxinképzésüket kiváltják, elősegítik; ezek ismeretében mód nyílik gátlásukra. Az élelmiszer-fermentációkban a hasznos vagy nem kívánt érzékszervi összetevő képződésének elősegítése, illetve megakadályozása jobban irányíthatóvá, szabályozhatóvá válik a proteom vagy metabolom profilból. A termelő törzsek genetikai módosítása célzottabban, megbízhatóbban valósítható meg.
10.20. ábra - A genomika alkalmazása a táplálkozás- és élelmiszer-tudományban: a nutrigenomika
Részleges génszekvenciákkal végzett összehasonlító transzkriptom-elemzéssel olyan géneket fedeztek fel, amelyek szerepet játszanak a növénykórokozó gombák gazdanövény-fertőzésében és kolonizációjában. Proteomanalízis vezetett a Trichoderma reesei celluláztermelését indukáló, illetve represszáló tényezők megismeréséhez a fermentációs közeg függvényében. A laboratóriumi E. coli K12 törzs és két E. coli O157:H7 törzs teljes genomszekvenciájának összehasonlítása feltárta, hogy több mint 1300 génben van különbség a verotoxinképző patogén és az apatogén törzsek között. Borélesztő törzs transzkriptom-profilját elemezték mikrorendekkel különböző tápanyag-ellátottságnál és szaporodási állapotban. A tejsavbaktériumok szerepének jobb megismerése a bélcsatornában elősegíti ezek alkalmazását a funkcionális élelmiszerekben és probiotikumokként. A genomika módszerei nemcsak egy szervezet génjeinek kifejeződéséről adnak átfogó képet, hanem a mikrobapopulációk tagjai közti különbségekről is. A stresszreakciók heterogén volta új megvilágításba helyezi az antimikrobás tényezők hatásvizsgálatát. A genomika módszereinek integrálásával az élelmiszer-tartósító rendszerek hatásai kvantitatívabban leírhatók, pontosabb prediktív modellek fejleszthetők és megbízhatóbb kockázatelemzés végezhető. E korszerű módszerek felfedték a baktériumok spóraképzésének és a hőrezisztencia kialakulásának mechanizmusában szereplő összetett genetikai folyamatokat és spórafehérjéket. A Lc. lactis teljes genomszekvenciájának ismeretében részletesen feltárhatók az anyagcserének azok a mellékútjai, amelyek a probiotikumok és egészségvédő hatóanyagok (pl. exopoliszacharidok, vitaminok) bioszintézisére vezetnek és ami genetikai beavatkozással fokozható. A DNS és fehérje alapú mikrochipek lehetővé teszik a mikroorganizmusok specifikus kimutatását közvetlenül (in situ) az élelmiszerekből, sőt, a hordozható, a feldolgozóvonalnál alkalmazható és valós időben eredményt adó mikroanalitikai rendszerek kifejlesztése a közeljövőben várható. A nukleinsav-, fehérje- és metabolit-profilelemzés módszereivel a genetikailag módosított élelmiszer-összetevők kimutatásának specifikussága, érzékenysége és hatékonysága fokozható. 1953-ban, a DNS szerkezetének felfedezésével a biológia fejlődése előtt roppant távlatokhoz vezető út nyílt meg. Ennek az útnak jelentős állomásai és fontos elágazásai a teljes genomok, köztük az emberi genom szekvenciájának feltárása, a rekombináns géntechnika módszereinek kifejlesztése, a gyógyászati és 347
Mikrobiológiai vizsgálati módszerek biotechnológiai hasznosítás. Az élelmiszer- és táplálkozástudomány szakemberei, köztük az élelmiszer-mikrobiológusok, az út egyik göröngyös, kanyargós elágazását járják, amelyen fontos jelzők és útmutatók a genomika, a transzkriptomika, a proteomika eddigi eredményei és további lehetőségei. Az egészséges, jó minőségű és biztonságos élelmiszerek előállításához vezető úton elengedhetetlen ezeknek az iránymutatóknak az ismerete és követése.
348
11. fejezet - Forrásmunkák és ajánlott irodalom Összefoglaló művek, tankönyvek Deák T., Farkas J., Incze K.: Konzerv-, hús- és hűtőipari mikrobiológia. pp. 356. Mezőgazd. Kiadó, Budapest, 1980 Doyle, M. P., Beuchat, L. R. & Montville, T. J. (szerk.): Food Microbiology. Fundamentals and Frontiers. ASM Press, Washington D. C., 1997. Garbutt, J.: Essentials of food microbiology. Arnold Publ., London, 1997 Jay, J. M., Loessner, M. J., Golden, D. A. Modern Food Microbiology. Springer, 2005 Lund B. M., Baird-Parker T. C., Gould G. W. (eds.): The microbiological safety and quality of food. Vol. 1–2. Aspen Publ., Gaithersburg, MD, 2000 Madigan M. T., Martinko J. M.: Brock Biology of microorganisms. 11th ed., Pearson Prentice Hall, 2006 Pesti M. (szerk.) Általános mikrobiológia. pp. 308. Dialóg Campus, Budapest, 2001 Bevezető Brock T.: Milestones in microbiology. 1961, 1975 Lechevalier H. A., Solotorovsky M.: A mikrobiológia három évszázada. pp. 629, Gondolat, Budapest, 1971 1. fejezet Board R. G., Jones D., Kroll R. G., Pettipher G. L. (szerk.) Ecosystems: microbes: food. Soc. Appl. Bact, Symp. No. 21. In: J. Appl. Bacteriol. 73: 1S–148S. 1992. 2. fejezet Farkas J.: A baktériumok stressz-adaptációja és ennek élelmiszer-biztonsági jelentősége. A Hús, 11: 139–141. 2001. 3. fejezet Deák T.: Élesztőgombák a természetben és az iparban. pp. 243. Mezőgazd. Szakt. Kiadó, Budapest, 1998 Jakucs E.: A mikológia alapjai. pp. 247. ELTE Eötvös Kiadó, Budapest, 1999 Jakucs E., Vajna L. (szerk.): Mikológia. pp. 477. Agroinform, Budapest, 2003. 349
Forrásmunkák és ajánlott irodalom 4. fejezet Brenner, F. W., Villar, R. G., Angulo, F. J., Tauxe, R. és Swaminathan, B.: Salmonella Nomenclature Journal of Clinical Microbiology, 2000, 2465–2467 Vol. 38, No. 7 Farkas J.: Az élelmiszer-biztonság mikrobiológiai alapjai és háttere. A Hús 2001 (4) 224–229. Krommer J., Gasparikné R. J.: Patogén baktériumok előfordulása vágóhidakon és húsfeldolgozó üzemekben. A Hús 2003 (4,5) 225–230 Téren J., Draskovics I., Novák E. (szerk.): Mikotoxinok, toxinogén gombák, mikotoxikózisok, MÉTE, 1990. Thomas A., McMeekin A. (eds.) Detecting pathogens in food. Woodhead Publ., Cambridge, England, 2003 5. fejezet Beke Gy. (szerk.): Hűtőipari kézikönyv. 1–2. Mezőgazda K., Budapest Davidson, P. M. és Zivanovic, S.: The use of natural antimicrobials. In: Zeuthen, P. és Bogh-Sorensen, L. (szerk.): Food Preservation Techniques. Woodhead Publishing Ltd., Cambridge, England, 2003. Farkas J.: Új, nem termikus módszerek élelmiszerek mikrobiológiai biztonságának és minőség-megőrzésének javítására. Élelmezési Ipar, 56, 164–170. 2002 Food and Drug Administration: Kinetics of microbial inactivation for alternative food processing technologies. J. Food Sci, supplement, 65 (12) 1–108. 2000 Francis G. A., Thomas C., O’Beirne D.: The microbiological safety of minimally processed vegetables. Int. J. Food Sci. Technol. 34, 1–22. 1999. Gould W. G.: Az élelmiszertartósítás fejlődési irányai. Élelmezési Ipar 51, 102–106. 1997. Gould, G. W. (szerk.): New Methods of Food Preservation. Blackie Academic & Professional, London, 1995. Juneya, V. K. és Sofos, J. N. (szerk.): Control of Foodborne Microorganisms. Marcel Dekker, Inc., New York, Basel, 2002. Kiss I.: A nagy hidrosztatikus nyomás élelmiszer-ipari alkalmazása. Konzervújság 1991(1) 6–8. Leistner L.: Food preservation by combined methods. Food Res. Internat. 25, 151–158. 1992 Shahidi, F., Arachchi, J. K. V. és Jeon, Y.-J.: Food applications of chitin and chitosans, Trends in Food Science & Technol., 10 (1999) 37–51. Shimizu, K.: Killer yeasts. In: Fleat, G. M. (szerk.): Wine Microbiology and Biotechnology. 6. fejezet 350
Forrásmunkák és ajánlott irodalom Bognár V.-né, Deák T.: Savanyúságok. Mezőgazd. Kiadó, Budapest, 1878 Edelényi M. (szerk.): Borászati mikrobiológia. pp. 385. Mezőgazdasági Kiadó, Budapest, 1978. Deák, T.: Élesztőgombák. Mezőgazdasági Szaktudás Kiadó, 1998 Eperjesi I., Kállay M., Magyar I.: Borászat. Mezőgazda Kiadó, 1998 Fleet, G. H.: Wine microbiology and biotechnology. Harwood Acd. Publ. 1993 Krommer J., Incze K.: Probiotikus mikroorganizmusok élelmiszerekben. A Hús 2001 (3) 135–138. Schoustra, S. (ed.): Food Fermentation. Wageningen Agricultural University, 1999 Szakály S.: Tejgazdaságtan. Dinasztia Kiadó Budapest, 2001 Walker, G.: Yeast physiology and biotechnology. John Willey&sons, Chichester, 1998 7. fejezet Gyaraky Z. (szerk.): A zöldség- és gyümölcsfeldolgozás előkészítő műveletei. Mezőgazd. K., Budapest, 1977 Gyaraky Z., Kovács J.: Az élelmiszer-előállítás és forgalmazás gyakorlati kézikönyve. Novorg, Budapest, 1996 8. fejezet Buck, J. W., Walcott, R. R. & Beuchat, L. R.: Recent trends in microbiological safety of fruits and vegetables. Plant Management Network, APSnet, 2003. Delammare S., Batt C. A. (1999): The microbiology and historical safety of margarine. Food Microbiol. 16: 327–333. Gasztonyi K. (2003): A kenyérkészítés folyamatai, I–IV. Sütőiparosok, pékek. 49: 3., 4., 5., 6. szám. Hegedűs H., Schmidt J., Rafai P.: Állati eredetű melléktermékek hasznosítása. Mezőgazda Kiadó, Bp. 1998. ICMSF: Microorganisms in Foods 6. Microbial Ecology of Food Commodities. Blackie Academic & Professional, London, 1998. Incze K. (1993): A fermentálás, pácolás és hőkezelés fejlődése a húsiparban. A hús 3 (2) 90. Krommer J., Szabó G., Zsarnóczay G. (2001): Bakteriocintermelő tejsavbaktériumok alkalmazása szárazáruknál. A hús 11(2) 71–74. Parádi S.-né, Szabó M., Tarjányi M.: Önkiszolgáló salátabárok vizsgálata az élelmiszer-kereskedelemben. Budapesti Közegészségügy, 31, 65–67. 1999. 351
Forrásmunkák és ajánlott irodalom Szabad Ágnes: A tea. Ásványvíz, üdítőital, gyümölcslé, 2 (4) 83–86. 2001. Szenes E.-né, Oláh M. (szerk.): Konzervipari kézikönyv. Pp.617. Integra-Projekt, Budapest, 1991 9. fejezet Biacs P.: A Magyar Élelmiszerbiztonsági Hivatal megalakításának jogi és szervezeti feltételei. Konzervújság 2003/3. 69–71. Farkas J.: A mikrobiológiai minőségbiztosítás HACCP/VEKIP rendszere. A hús, 1991/2 31–34. Farkas J.: Élelmiszerbiztonság: globális gondok – javítási törekvések. Magyar Tudomány 2002/12. 1608–10. Kovács F., Biró G. (szerk.): Élelmiszer-biztonság az EU szabályozás függvényében. MTA Agártudományok Oszt., 242 old., Budapest 2002 Pallaginé Bánkfalvi E.: Minőségbiztosítás. Mezőgazda, Budapest, 1999 Sósné Gazdag M. (szerk.): Minőségbiztosítás az élelmiszeriparban. Mezőgazda K., Budapest, 1996 Szabó Mária (szerk.): Magyarország élelmiszerbiztonsági helyzete az ezredfordulón. Élelmiszerbiztonsági Tanácsadó Testület tanulmánya, 147. old., 2000 Whiting R. C., Buchanan R. L.: Microbial modeling. Food Technology 48 (8) 113–120. 10. fejezet Abee T., Schaik van W., Siezen J.: Impact of genomics on microbial food safety. Trends Biotechnol. 12, 653–660. 2004. Bánáti D.: A géntechnológia élelmiszer-ipari alkalmazása. I–II. Konzervújság, 1991/1,2. 8–10, 37–40. Deák T.: A humángenom-szekvencia és az élelmiszer-mikrobiológia. Élelmezési Ipar 57, 294–300. 2003. Farkas J., Mohécsiné F. Cs.: GFP tesztorganizmusok élelmiszer-mikrobiológiai alkalmazási lehetőségei és korlátai. Élelm. vizsg. Közl. 49:195–205. 2003. Farkas J.: Mikrobás szennyezettség/aktivitás gyors kimutatása élelmiszerekben, műszeres módszerek alkalmazásával. Édesipar 50 (2) 51–56. 2004. Heszky L.: Transzgénikus növények, mint élelmiszeripari GM nyersanyagok. Konzervújság 2001/3. 63–66. Maráz, A.: Microbial analysis of food. In: Safety in the agri-food chain. (Eds.: Luning, P. A., Devliegher, P., Verhé, R.) Wageningen Academic Publ., 2006 Micsinai A., Szigeti T.: A génmódosított élelmiszerek élelmiszerbiztonsági megitélése. Konzervújság 2003 (4) 105–107. Pusztai Á., Bardócz Zs.: A genetikailag módosított élelmiszerek biztonsága. Kölcsei Intézet, Budapest, 2004. 352
Forrásmunkák és ajánlott irodalom Shuker L.: Genetically modified foods for human health and nutrition. Trends Food Sci. Technol. 14 (5–8) 169–338. 2003. Szigeti T.: Transzgenikus komponenseket tartalmazó élelmiszerek, takarmányok, ipari termékek és vizsgálati lehetőségeik. Olaj, szappan, kozmetika, 50: 19–23. 2001. Verrips C. T., Warmoeskerken M. M. C. G., Post J. A.: General introduction to the importance of genomics in food biotechnology and nutrition. Ward D. C, White D. C.: The new ’omics’ era. Curr. Opin. Biotechnol. 13, 11–13. 2002.
353
