Ektoenzymy a mikrobiální rozklad polymerů (Jaroslav Vrba, PřF JU a Hydrobiologický ústav BC AV ČR, v.v.i.)

Ektoenzymy a mikrobiální rozklad polymerů (Jaroslav Vrba, PřF JU a Hydrobiologický ústav BC AV ČR, v.v.i.) Většina organických látek ve vodě (> 95%) se skládá z molekul, které mají polymerní strukturu, vysokou molekulovou hmotnost a velké rozměry, takže nemohou do buněk vstupovat přímo. Hydrolýza těchto polymerů je obvykle krokem, který limituje rychlost využití organické hmoty ve vodním prostředí. Předtím než mohou být zabudovány do buněk mikrobů, musí projít postupnou degradací nejrůznějšími enzymy, které bývají lokalizovány buď na povrchu buněk, nebo v periplasmatickém prostoru (ektoenzymy), dále bývají vázané na částice, nebo vylučované mikroorganismy do prostředí jako volné, rozpuštěné enzymy (extracelulární enzymy). (Občas používaný termín exoenzymy je zcela nevhodný, protože má v enzymologii ještě jiný význam.) Nízkomolekulární sloučeniny (často monomery), produkty působení enzymů, mohou mikrobiální buňky využívat k pokrytí energetických potřeb nebo k tvorbě biomasy. Enzymatická transformace organických látek je tudíž klíčovým procesem, regulujícím obrat organických i anorganických sloučenin ve vodním prostředí. Kromě těchto primárně extracelulárních enzymů, cíleně vylučovaných živými mikroorganismy do prostředí, je ve vodním prostředí druhotně přítomno množství nejrůznějších enzymů jiného původu, které jsou buď uvolňovány z buněk odumřelých organismů, nebo vylučovány organismy původně za jiným účelem - např. trávicí enzymy prvoků, bezobratlých a ryb, svlékací enzymy korýšů a larev vodního hmyzu. Tyto enzymy jsou někdy různě chráněny proti působení extracelulárních proteáz, takže zůstávají po určitou dobu aktivní. Podle některých představ je většina extracelulárních enzymů reverzibilně imobilizována neenzymatickou vazbou s huminovými látkami, která enzymy zároveň chrání před poškozením. Většina ektoenzymů i extracelulárních enzymů přítomných ve vodě patří mezi hydrolázy. Nejvyšších aktivit obvykle dosahují proteázy (např. aminopeptidázy, endopeptidázy). Běžně se ve vodách vyskytují fosfatázy, které stěpí fosforečnan vázaný esterickou vazbou v organických sloučeninách. Značné aktivity alkalických fosfatáz produkuje obvykle fytoplankton, který je limitován fosforem. Bakteriální 5'-nukleotidázy štěpí specificky nukleotidový fosfát (např. ATP). Lipázy katalyzují rozklad tuků. Glykolázy jsou pestrou skupinou enzymů zodpovědných za štěpení polysacharidů a oligosacharidů - nejběžnější jsou ektoenzymy celulolytické, ligninolytické, chitinolytické, amylolytické atd. K aktivitě jednotlivých ektoenzymů obvykle přispívá celá škála vodních mikroorganismů, jsou však popsány i bakteriální kmeny specializované (např. na rozklad celulózy, chitinu apod.). Většina odumřelé polymerní organické hmoty je rozkládána již během sedimentace od hladiny, zvýšené aktivity ektoenzymů (tj. intenzivní mikrobiální rozklad) bývají v oblasti termokliny, kde se sedimentace zpomaluje díky změně hustoty vody. V hypolimniu jsou enzymatické aktivity obvykle mnohem nižší. Vysoké aktivity jsou obvyklé ve dnových sedimentech, kde jsou mineralizovány převážně těžce rozložitelné látky, případně větší či rychle klesající organické zbytky. Bakterie ve vodním sloupci často přisedají na živočišné a rostlinné zbytky, aby zvýšily účinnost působení ektoenzymů. Paralelně s enzymatickou aktivitou lze obvykle prokázat i příjem příslušného monomeru do buněk mikroorganismů. Ty mikroorganismy, které mají schopnost produkovat ektoenzymy, jsou zjevně zvýhodněny v kompetici o organické i anorganické živiny ve vodním prostředí. Jejich ekologický význam spočívá ve schopnosti růstu i v nedostatku nízkomolekulárních látek, a zejména v recyklaci hůře rozložitelných organických látek a také v recyklaci živin pro další organismy. Mikroorganismy přednostně využívají dostupné nízkomolekulární substráty, které mohou snadno transportovat do buněk a přímo metabolizovat. V případě nedostatku některé esenciální sloučeniny (např. fosforu) mobilizuje buňka jednak vnitřní rezervy, jednak intenzifikuje aktivní procesy získávání nedostatkové sloučeniny z prostředí. Např. při limitaci fosforem dochází mj. na povrchu 1 EKOTECH – Spektroskopie: Fluorescenční a radioizotopové metody v mikrobiální ekologii

buňky ke zmnožení míst pro aktivní transport P přes buněčnou membránu (fosfokinázy) a k indukci extracelulárních fosfatáz, které zpřístupňují organicky vázaný P v prostředí. Geny pro oba enzymy leží ve stejné oblasti genomu a jsou ovládány společně (tzv. pho-operon u E. coli). Takové uspořádání umožňuje mikrobům včasnou mobilizaci všech mechanismů při nedostatku esenciální látky. Mnohé polymery nejsou ve vodě přítomny trvale, takže trvalá produkce všech hydroláz je pro mikroorganismy nevýhodná. Účinná indukce ektoenzymů je ovšem komplikovanější než indukce intracelulárních enzymů. Jednak jsou molekuly polymerů příliš velké na to, aby mohly proniknout do buňky a sloužit jako induktor, jednak mikroorganismus musí být schopen monitorovat aktivitu ektoenzymu vně buňky. K tomu slouží vylučování malého množství, tzv. konstitutivního ektoenzymu. Pokud je v okolí buňky přítomen substrát, je hydrolyzován tímto konstitutivním ektoenzymem, nahromaděný produkt vstupuje do buňky a indukuje další tvorbu ektoenzymu. Dostatek nízkomolekulárních látek v prostředí působí na produkci většiny ektoenzymů represívně (katabolická represe). Poklesne-li koncentrace nízkomolekulárních látek pod určitou kritickou mez, dojde k derepresi, tj. k odblokování tvorby ektoenzymů. Využitím represívní strategie pro syntézu ektoenzymů mikroorganismy mohou zabránit zbytečné produkci induktivních enzymů, které nejsou nutné, pokud růst mikroorganismů není limitován zdroji uhlíku, dusíku nebo fosforu. Aktivita ektoenzymů může být výrazně snížena v přítomnosti nejrozmanitějších látek - tzv. inhibitorů. Zatímco kompetetivní inhibitory soupeří se substrátem o vazebné místo enzymu (mění afinitu k substrátu), nekompetetivní inhibitory obvykle poškozují enzym na jiném místě. CVIČENÍ 4, 5, 6: STANOVENÍ AKTIVITY EXTRACELULÁRNÍCH ENZYMŮ VE VODĚ Aktivitu extracelulárních enzymů je možné stanovit inkubací vzorku vody s vhodným umělým substrátem. Princip metody: Ke vzorku vody se přidá bezbarvý nebo nefluorescenční substrát*), který se skládá z molekuly barviva nebo fluorochromu, k níž je navázána specifická funkční skupina (např. glykosidickou vazbou cukr, esterickou vazbou fosfát, peptidickou vazbou aminokyselina). Pokud je ve vodě přítomen příslušný enzym (tj. např. glykosidáza, fosfatáza, amidopeptidáza), dojde k odštěpení funkční skupiny (viz schéma) a vyvine se charakteristické zbarvení nebo fluorescence, které je přímo úměrné množství hydrolyzovatelného substrátu. Intenzita zbarvení se měří spektrofotometricky nebo fluorimetricky. K rozlišení aktivity v různých velikostních skupinách mikroorganismů lze někdy použít frakcionace pomocí membránových filtrů. O

O

O–R

O +

CH3

umělý substrát (nefluoreskující)

O

E

hydroláza

OH +

CH3

fluorochrom (MUF)

R

+

E

monomer hydroláza

*) Fluorescenční metoda je náročnější na vybavení, ale je výrazně citlivější (umožňuje zkrátit dobu inkubace na maximálně několik hodin). Přírůstek fluorescence se měří na vhodném fluorimetru. Praktikum je zaměřeno právě na seznámení s fluorescenční metodou a její procvičení.

2 EKOTECH – Spektroskopie: Fluorescenční a radioizotopové metody v mikrobiální ekologii

STANOVENÍ AKTIVITY β-GLUKOSIDÁZ A ALKALICKÝCH FOSFATÁZ Potřeby:  2×10-5 M 4-methylumbelliferon (MUF, standard)+),  10-3 M MUF-fosfát (MUFP) *),  10-3 M MUF-β-D-glukosid (MUFGlc) *),  0,1 M Tris-pufr (pH = 9,0),  inhibiční roztok (0,2 M HgCl2),  alkalický roztok (2 M NaOH + 0,4 M EDTA),  redestilovaná voda,  automatické pipety s náhradními špičkami,  zkumavky, stojánky na zkumavky,  kádinky, Erlenmayerovy baňky,  temperovaná lázeň, termostat,  filtrační aparatura, membránové filtry vhodné porozity (např. 2,5 µm a 0,2 µm),  2 odsávačky, ruční vývěva,  odměrné válce,  fotometr Spekol 11 s fluorescenčním nástavcem, 1-cm kyveta z křemenného skla,  hodinky (stopky), milimetrový papír,  PC s vhodným softwarem.

+) Zásobní roztok standardu se připravují rozpuštěním navážky v malém množství etylenglykol monometyl eteru (všechny chemikálie od fy. SIGMA) a po úplném rozpuštění se objem doplní (naředí) redestilovanou vodou. *) Zásobní roztoky substrátů se připravují rozpuštěním navážky v malém množství etylenglykol monometyl eteru (všechny chemikálie od fy. SIGMA) na výslednou koncentraci 0.05 – 0.01 M (rodhodující je, aby finální koncentrace rozpoustědla ve vzorcích byla ≤ 1%!). Fluorigenní substráty je nutno uchovávat při < -18°C a zásobní roztoky by neměly přijít do styku s vodou, jinak dochází k jejich samovolnému rozkladu (i v mrazničce!). Potřebný objem pracovního roztoku se připraví až před měřením ze zásobního roztoku naředěním redestilovanou vodou. Kromě fy. Sigma dodává běžné fluorogenní (MUF) substráty též fa. GLYCOSYNTH (http://www.glycosynth.com; [email protected]), a to několikanásobně levněji!


I. Stanovení kalibračního faktoru Příprava přístroje k měření: 1) K zajištění přesného a stabilního měření fluorescence je nutné zahřátí přístroje a zejména rtuťové výbojky. Proto je nutné zapnout přístroj nejméně 30 min. před započetím měření! 2) Vlnovou délku excitačního monochromatického záření nastavit na 365 nm a zasunout monochromatický filtr 465 nm do dráhy emitovaného paprsku. 3) Zesílení napětí pro fotonásobič nastavit na 3, uzavřít vstup do fotonásobiče, místo kyvety zasunout žlutý hranol (jeho fluorescence odpovídá při daném zesílení fluorescenci MUF o koncentraci 0.1 µmol.l-1 v redestilované vodě). 4) Stisknout postupně tlačítka "E", "FL" a "Z-FL/MIN" - na displeji se objeví hodnota "0,0". Poté stisknout tlačítko "FAKT" - na displeji se objeví hodnota "1,000". 5) Otevřít vstup emitovaného záření do fotonásobiče a stisknout tlačítko "R" - na displeji se objeví hodnota blízká 1,000. Tím je přístroj připraven k měření. Po zasunutí kyvety s redestilovanou vodou by měla být fluorescence okolo 0,150. Pozor - kyveta musí mít čisté všechny boční stěny! V průběhu měření je vhodné občas zasunutím žlutého hranolu zkontrolovat nastavení. Liší-li se příliš od 1,000, je nutno nastavení obnovit (opakovat body 4 a 5). Postup: 1) Ze zásobního roztoku MUF (2×10-5 M) připravíme následující koncentrace (ředění - napipetováním do zkumavek): 10-5 M (2 ml zás. roztoku + 2 ml redest. vody), 10-6 M (1 ml [10-5 M] + 9 ml redest. vody), 10-7 M (1 ml [10-6 M] + 9 ml redest. vody). Tím získáme čtyři koncentrace standardu v rozmezí tří řádů, které po desetinásobném naředění ve vzorcích budou odpovídat výsledným koncentracím 2, 1, 0,1 a 0.01 µmol.l-1 MUF. 2) Do zkumavek č. 1-8 napipetujeme automatickou pipetou 4,5 ml a do zkumavek č. 9-16 jen 4,0 ml nevařeného vzorku. 3) Do zkumavek č. 9-16 přidáme automatickou pipetou 0,5 ml roztoku Tris-pufru (výsledná koncentrace bude 10 mmol.l-1). 4) Vždy do dvojice zkumavek (např. 1-2 a 9-10) přidáme automatickou pipetou po 0,5 ml příslušné koncentrace (postupujeme od nejnižší k nejvyšší) standardu. 5) Do všech zkumavek přidáme automatickou pipetou 100 µl inhibičního roztoku a dobře zamícháme. 6) Bezprostředně před měřením*) přidáme do všech zkumavek automatickou pipetou 100 µl alkalického roztoku a dobře zamícháme. 7) Fluorescenci měříme v 1-cm kyvetě na Spekolu 11 s fluorescenčním nástavcem při vlnové délce 465 nm (excitace při 365 nm). (Asi 2 ml vzorku napipetujeme ze zkumavky do kyvety a po měření odsajeme do odpadu.) 8) Paralelní hodnoty fluorescence zprůměrujeme a vynášíme na milimetrový papír proti koncentraci standardu. Graficky odečteme hodnotu fluorescence při koncentraci 1 µmol.l-1 MUF (tzv. kalibrační faktor). Pro (přesnější) stanovení kalibračního faktoru lze samozřejmě využít kterýkoliv program na výpočet lineární regrese. *)

Upozornění: MUF se působením louhu rozkládá, takže delší stání po alkalizaci způsobuje pokles fluorescence!


IIa. Časový průběh hydrolýzy substrátu - MUFGlc Postup: 1) Po 4,5 ml vzorku napipetujeme automatickou pipetou do zkumavek uspořádaných do 5 dvojic. Do zkumavek označených č. 1-2 přidáme automatickou pipetou po 100 µl roztoku HgCl2, který inhibuje přítomné enzymy, a dobře zamícháme. 2) Do všech zkumavek přidáme automatickou pipetou 0,5 ml roztoku MUFGlc (výsl. konc. 100 µmol.l-1). Dobře zamícháme. Substrát přidáváme rychle, aby mezi první a poslední zkumavkou nebyl velký časový rozdíl (větší než 2 minuty). Čas poznamenáme jako čas = 0 (spustíme stopky). Zdržíme-li se při přidávání substrátu, poznamenáváme čas počátku reakce jednotlivě pro každou zkumavku. 3) V časových odstupech zhruba 30 minut postupně zastavíme enzymatickou hydrolýzu v dalších dvojicích zkumavek přídavkem (automatickou pipetou) 100 µl inhibičního roztoku. Přesný čas vždy poznamenáme. 4) Bezprostředně před měřením přidáme do všech zkumavek automatickou pipetou 100 µl alkalického roztoku a dobře zamícháme. 5) Fluorescenci měříme v 1-cm kyvetě na Spekolu 11 s fluorescenčním nástavcem při vlnové délce 465 nm (excitace při 365 nm). (Asi 2 ml vzorku napipetujeme ze zkumavky do kyvety a po měření odsajeme do odpadu.) 6) Paralelní hodnoty zprůměrujeme. Od průměrné hodnoty pro živý vzorek odečteme příslušný blank a získaný přírůstek fluorescence vynášíme na milimetrový papír jako funkci času. Průběh by měl být lineární. Graficky odečteme přírůstek fluorescence za 1 hodinu. Hodnotu vydělíme příslušným kalibračním faktorem (viz I). Rychlost hydrolýzy MUFGlc (přírůstku MUF) vyjádříme v jednotkách µmol.l-1.hod-1 (extracelulární aktivita β-glukosidázy).


IIb. Časový průběh hydrolýzy substrátu - MUFP Postup: 1) Po 4 ml vzorku napipetujeme automatickou pipetou do zkumavek uspořádaných do 5 dvojic. Do zkumavek označených č. 1-2 přidáme automatickou pipetou po 100 µl roztoku HgCl2, který inhibuje přítomné enzymy, a dobře zamícháme. 2) Do všech zkumavek přidáme automatickou pipetou 0,5 ml roztoku Tris-pufru (výsledná koncentrace bude 10 mmol.l-1). 3) Do všech zkumavek přidáme automatickou pipetou 0,5 ml roztoku MUFP (výsl. konc. 100 µmol.l-1). Dobře zamícháme. Substrát přidáváme rychle, aby mezi první a poslední zkumavkou nebyl velký časový rozdíl (větší než 2 minuty). Čas poznamenáme jako čas = 0 (spustíme stopky). Zdržíme-li se při přidávání substrátu, poznamenáváme čas počátku reakce jednotlivě pro každou zkumavku. 4) V časových odstupech zhruba 30 minut postupně zastavíme enzymatickou hydrolýzu v dallších dvojicích zkumavek přídavkem (automatickou pipetou) 100 µl inhibičního roztoku. Přesný čas vždy poznamenáme. 5) Bezprostředně před měřením přidáme do všech zkumavek automatickou pipetou 100 µl alkalického roztoku a dobře zamícháme. 6) Fluorescenci měříme v 1-cm kyvetě na Spekolu 11 s fluorescenčním nástavcem při vlnové délce 465 nm (excitace při 365 nm). (Asi 2 ml vzorku napipetujeme ze zkumavky do kyvety a po měření odsajeme do odpadu.) 7) Paralelní hodnoty zprůměrujeme. Od průměrné hodnoty pro živý vzorek odečteme příslušný blank a získaný přírůstek fluorescence vynášíme na milimetrový papír jako funkci času. Průběh by měl být lineární. Graficky odečteme přírůstek fluorescence za 1 hodinu. Hodnotu vydělíme příslušným kalibračním faktorem (viz I). Rychlost hydrolýzy MUFP (přírůstku MUF) vyjádříme v jednotkách µmol.l-1.hod-1 (extracelulární aktivita alkalické fosfatázy).


IIIa. Hydrolýza MUFGlc při saturační koncentraci ve frakcích Postup: 1) Asi 50 ml vzorku zfiltrujeme přes membránový filtr s porozitou 2,5 µm (Synpor 2). Polovinu, tj. asi 25 ml filtrátu zfiltrujeme přes membránový filtr s porozitou 0,2 µm (Nuclepor) do druhé odsávačky. 2) Po 4,5 ml příslušného vzorku napipetujeme automatickou pipetou do zkumavek uspořádaných do čtveřic, např. podle schématu nefiltrovaný: č. 1-4, 2,5-µm filtrát: č. 5-8, 0,2-µm filtrát: č. 9-12. Do zkumavek č. 3-4, 7-8 a 11-12 přidáme automatickou pipetou po 100 µl roztoku HgCl2, který inhibuje přítomné enzymy, a dobře zamícháme. (V těchto zkumavkách stanovíme případnou neenzymatickou hydrolýzu substrátu během inkubace = tzv. slepé stanovení - blank.) 3) Do všech zkumavek přidáme automatickou pipetou 0,5 ml roztoku MUFGlc (výsledná koncentrace bude 100 µmol.l-1). Dobře zamícháme a zapíšeme přesně čas (start). Substrát přidáváme rychle, aby mezi první a poslední zkumavkou nebyl velký časový rozdíl (větší než 2 minuty). 4) Vzorky inkubujeme za stálých podmínek po dobu např. 3 hodin. Poté do zbývajících dvojic zkumavek přidáme automatickou pipetou po 100 µl inhibičního roztoku, dobře zamícháme a zapíšeme přesně čas. 5) Bezprostředně před měřením přidáme do všech zkumavek automatickou pipetou 100 µl alkalického roztoku a dobře zamícháme. 6) Fluorescenci měříme v 1-cm kyvetě na Spekolu 11 s fluorescenčním nástavcem při vlnové délce 465 nm (excitace při 365 nm). (Asi 2 ml vzorku napipetujeme ze zkumavky do kyvety a po měření odsajeme do odpadu.) 7) Paralelní hodnoty zprůměrujeme. Od průměrné hodnoty pro živý vzorek odečteme příslušný blank a tím získáme přírůstek fluorescence pro každý vzorek. Rozdíl vydělíme kalibračním faktorem pro MUF a dobou inkubace. Aktivitu enzymu vyjádříme opět v µmol.l-1.h-1. Aktivita v nefiltrovaném vzorku = celková extracelulární aktivita. Aktivita v 0.2-µm filtrátu = rozpuštěná aktivita. Rozdíl aktivit mezi dvěma vzorky = aktivita v příslušné frakci.


IIIb. Hydrolýza MUFP při saturační koncentraci ve frakcích Postup: 1) Asi 50 ml vzorku zfiltrujeme přes membránový filtr s porozitou 2,5 µm (Synpor 2). Polovinu, tj. asi 25 ml filtrátu zfiltrujeme přes membránový filtr s porozitou 0,2 µm (Nuclepor) do druhé odsávačky. 2) Po 4 ml příslušného vzorku napipetujeme automatickou pipetou do zkumavek uspořádaných do čtveřic, např. podle schématu nefiltrovaný: č. 1-4, 2,5-µm filtrát: č. 5-8, 0,2-µm filtrát: č. 9-12. Do zkumavek č. 3-4, 7-8 a 11-12 přidáme automatickou pipetou po 100 µl roztoku HgCl2, který inhibuje přítomné enzymy, a dobře zamícháme. (V těchto zkumavkách stanovíme případnou neenzymatickou hydrolýzu substrátu během inkubace = tzv. slepé stanovení - blank.) 3) Do všech zkumavek přidáme automatickou pipetou 0,5 ml roztoku Tris-pufru (výsledná koncentrace bude 10 mmol.l-1). 4) Do všech zkumavek přidáme automatickou pipetou 0,5 ml roztoku MUFP (výsledná koncentrace bude 100 µmol.l-1). Dobře zamícháme a zapíšeme přesně čas (start). Substrát přidáváme rychle, aby mezi první a poslední zkumavkou nebyl velký časový rozdíl (větší než 2 minuty). 5) Vzorky inkubujeme za stálých podmínek po dobu např. 1 hodiny. Poté do zbývajících dvojic zkumavek přidáme automatickou pipetou po 100 µl inhibičního roztoku, dobře zamícháme a zapíšeme přesně čas. 6) Bezprostředně před měřením přidáme do všech zkumavek automatickou pipetou 100 µl alkalického roztoku a dobře zamícháme. 7) Fluorescenci měříme v 1-cm kyvetě na Spekolu 11 s fluorescenčním nástavcem při vlnové délce 465 nm (excitace při 365 nm). (Asi 2 ml vzorku napipetujeme ze zkumavky do kyvety a po měření odsajeme do odpadu.) 8) Paralelní hodnoty zprůměrujeme. Od průměrné hodnoty pro živý vzorek odečteme příslušný blank a tím získáme přírůstek fluorescence pro každý vzorek. Rozdíl vydělíme kalibračním faktorem pro MUF a dobou inkubace. Aktivitu enzymu vyjádříme opět v µmol.l-1.h-1. Aktivita v nefiltrovaném vzorku = celková extracelulární aktivita. Aktivita v 0.2-µm filtrátu = rozpuštěná aktivita. Rozdíl aktivit mezi dvěma vzorky = aktivita v příslušné frakci.


IVa. Kinetika hydrolýzy MUFGlc (potenciální aktivita) Postup: 1) Z pracovního roztoku MUFGlc (10-3 M) připravíme následující koncentrace (ředění - napipetováním do zkumavek): 3×10-4 M (3 ml zás. roztoku + 7 ml redest. vody), 10-4 M (1 ml zás. roztoku + 9 ml redest. vody), 3×10-5 M (1 ml [3×10-4 M] + 9 ml redest. vody), 10-5 M (1 ml [10-4 M] + 9 ml redest. vody), 10-6 M (1 ml [10-5 M] + 9 ml redest. vody), 10-7 M (1 ml [10-6 M] + 9 ml redest. vody). Tím získáme sedm koncentrací substrátu v rozmezí čtyř řádů, které po desetinásobném naředění ve vzorcích budou odpovídat výsledným koncentracím 100, 30, 10, 3, 1, 0,1 a 0,01 µmol.l-1 MUFGlc. 2) Po 4,5 ml vzorku napipetujeme automatickou pipetou do zkumavek uspořádaných do 7 čtveřic. Do 2 zkumavek v každé čtveřici přidáme automatickou pipetou po 100 µl roztoku HgCl2, který inhibuje přítomné enzymy, a dobře zamícháme (blank). 3) Postupně přidáváme do každé čtveřice zkumavek po 0,5 ml substrátu (postupujeme od nejnižší k nejvyšší koncentraci) a vždy zapíšeme přesně čas (start) pro příslušnou koncentraci. 4) Vzorky inkubujeme za stálých podmínek po dobu např. 3 hodin. Poté do zbývajících dvojic zkumavek přidáme automatickou pipetou po 100 µl inhibičního roztoku, dobře zamícháme a zapíšeme přesně čas. 5) Bezprostředně před měřením přidáme do všech zkumavek automatickou pipetou 100 µl alkalického roztoku a dobře zamícháme. 6) Fluorescenci měříme v 1-cm kyvetě na Spekolu 11 s fluorescenčním nástavcem při vlnové délce 465 nm (excitace při 365 nm). (Asi 2 ml vzorku napipetujeme ze zkumavky do kyvety a po měření odsajeme do odpadu.) 7) Paralelní hodnoty zprůměrujeme. Od průměrné hodnoty pro živý vzorek odečteme příslušný blank a tím získáme přírůstek fluorescence pro každou koncentraci substrátu. Rozdíl vydělíme kalibračním faktorem a dobou inkubace. Aktivitu enzymu vyjádříme opět v µmol.l-1.h-1. 8) Na milimetrový papír vyneseme rychlost hydrolýzy (v) proti koncentraci substrátu (S), čímž získáme saturační křivku odpovídající rovnici Michaelise-Mentenové: v = Vmax × S / (Km + S) , kde Vmax je maximální aktivita daného enzymu (potenciální aktivita) a konstanta Km odpovídá takové koncentraci substrátu, při níž v = 1/2 Vmax. Km je nepřímo úměrným měřítkem afinity daného enzymu k substrátu, tj. čím nižší je hodnota Km, tím vyšší je afinita. 9) Provedeme Wolfovu transformaci (proti S vyneseme hodnoty S/v) a graficky odečteme hodnoty Km a Vmax: průsečík přímky s osou x odpovídá konstantě Km a její průsečík s osou y odpovídá hodnotě Km/Vmax. 10) Nejpřesnější hodnoty Km a Vmax lze získat pomocí nelineární regrese, např. s použitím IBM/PC programu Enzfitter nebo Fig.P for Windows (Biosoft), Prism (GraphPad), případně Excel.


IVb. Kinetika hydrolýzy MUFP (potenciální aktivita) Postup: 1) Z pracovního roztoku MUFP (10-3 M) připravíme následující koncentrace (ředění - napipetováním do zkumavek): 3×10-4 M (3 ml zás. roztoku + 7 ml redest. vody), 10-4 M (1 ml zás. roztoku + 9 ml redest. vody), 3×10-5 M (1 ml [3×10-4 M] + 9 ml redest. vody), 10-5 M (1 ml [10-4 M] + 9 ml redest. vody), 10-6 M (1 ml [10-5 M] + 9 ml redest. vody), 10-7 M (1 ml [10-6 M] + 9 ml redest. vody). Tím získáme sedm koncentrací substrátu v rozmezí čtyř řádů, které po desetinásobném naředění ve vzorcích budou odpovídat výsledným koncentracím 100, 30, 10, 3, 1, 0,1 a 0,01 µmol.l-1 MUFP. 2) Po 4 ml vzorku napipetujeme automatickou pipetou do zkumavek uspořádaných do 7 čtveřic. Do 2 zkumavek v každé čtveřici přidáme automatickou pipetou po 100 µl roztoku HgCl2, který inhibuje přítomné enzymy, a dobře zamícháme (blank). 3) Do všech zkumavek přidáme automatickou pipetou 0,5 ml roztoku Tris-pufru (výsledná koncentrace bude 10 mmol.l-1). 4) Postupně přidáváme do každé čtveřice zkumavek po 0,5 ml substrátu (postupujeme od nejnižší k nejvyšší koncentraci) a vždy zapíšeme přesně čas (start) pro příslušnou koncentraci. 5) Vzorky inkubujeme za stálých podmínek po dobu např. 1 hodiny. Poté do zbývajících dvojic zkumavek přidáme automatickou pipetou po 100 µl inhibičního roztoku, dobře zamícháme a zapíšeme přesně čas. 6) Bezprostředně před měřením přidáme do všech zkumavek automatickou pipetou 100 µl alkalického roztoku a dobře zamícháme. 7) Fluorescenci měříme v 1-cm kyvetě na Spekolu 11 s fluorescenčním nástavcem při vlnové délce 465 nm (excitace při 365 nm). (Asi 2 ml vzorku napipetujeme ze zkumavky do kyvety a po měření odsajeme do odpadu.) 8) Paralelní hodnoty zprůměrujeme. Od průměrné hodnoty pro živý vzorek odečteme příslušný blank a tím získáme přírůstek fluorescence pro každou koncentraci substrátu. Rozdíl vydělíme kalibračním faktorem a dobou inkubace. Aktivitu enzymu vyjádříme opět v µmol.l-1.h-1. 9) Na milimetrový papír vyneseme rychlost hydrolýzy (v) proti koncentraci substrátu (S), čímž získáme saturační křivku odpovídající rovnici Michaelise-Mentenové: v = Vmax × S / (Km + S) , kde Vmax je maximální aktivita daného enzymu (potenciální aktivita) a konstanta Km odpovídá takové koncentraci substrátu, při níž v = 1/2 Vmax. Km je nepřímo úměrným měřítkem afinity daného enzymu k substrátu, tj. čím nižší je hodnota Km, tím vyšší je afinita. 10) Provedeme Wolfovu transformaci (proti S vyneseme hodnoty S/v) a graficky odečteme hodnoty Km a Vmax: průsečík přímky s osou x odpovídá konstantě Km a její průsečík s osou y odpovídá hodnotě Km/Vmax. 11) Nejpřesnější hodnoty Km a Vmax lze získat pomocí nelineární regrese, např. s použitím IBM/PC programu Enzfitter nebo Fig.P for Windows (Biosoft), Prism (GraphPad), případně Excel.


Ektoenzymy a mikrobiální rozklad polymerů (Jaroslav Vrba, PřF JU a Hydrobiologický ústav BC AV ČR, v.v.i.)

Recommend Documents