EKSPLORASI MARKA MIKROSATELIT YANG TERKAIT DENGAN SIFAT TOLERANSI KERACUNAN ALUMINIUM PADA PADI SARI YUNIARINI

EKSPLORASI MARKA MIKROSATELIT YANG TERKAIT DENGAN SIFAT TOLERANSI KERACUNAN ALUMINIUM PADA PADI

SARI YUNIARINI

DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Eksplorasi Marka Mikrosatelit yang Terkait dengan Sifat Toleransi Keracunan Aluminium pada Padi adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Penelitian ini adalah bagian dari proyek penelitian atas nama Dr. Kurniawan Rudi Trijatmiko M.Si. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.

Bogor, Agustus 2013 Sari Yuniarini NIM G84090027

ABSTRAK SARI YUNIARINI. Eksplorasi Marka Mikrosatelit yang Terkait dengan Sifat Toleransi Keracunan Aluminium pada Padi. Dibimbing oleh LAKSMI AMBARSARI dan KURNIAWAN RUDI TRIJATMIKO. Tanah asam membatasi produktivitas pertanian di seluruh dunia karena tingginya kelarutan aluminium (Al). Penelitian ini bertujuan untuk mencari lokasi gen sifat toleransi keracunan aluminium pada kromosom padi hasil persilangan Cabacu dan IR64. Salah satu cara menentukan lokasi gen toleran aluminium pada kromosom yaitu dengan menggunakan analisis fenotip dan marka molekuler mikrosatelit atau SSR (Simple Sequence Repeats). Seleksi terhadap marka yang terpaut sifat tertentu dapat dilakukan dengan metode Bulk Segregant Analysis (BSA). Sebanyak 187 galur tanaman padi F6 hasil persilangan Cabacu dan IR64 diuji menggunakan larutan Yoshida. Panjang akar pada media perlakuan 45 ppm AlCl3 selama 21 hari digunakan sebagai data fenotip untuk analisis keterpautan dengan marka molekuler. Hasil analisis keterpautan menggunakan 47 primer mikrosatelit menunjukkan bahwa marka RM 104, RM 25, RM 72, dan RM 201 terpaut sifat toleransi cekaman Al. Marka tersebut menunjukkan lokasi gen yang terpaut dengan sifat toleransi keracunan aluminium terletak pada posisi 40.166.840 bp kromosom 1, 4.377.460 bp dan 6.762.710 bp kromosom 8 serta pada 20.174.289 bp kromosom 9. Kata kunci: bulk segregant analysis, marka mikrosatrelit, padi, toleran aluminium. ABSTRACT SARI YUNIARINI. Exploration of Microsatellites Marker Linked to Aluminum Tolerance in Rice. Supervised by LAKSMI AMBARSARI and KURNIAWAN RUDI TRIJATMIKO. Acid soils limited agricultural productivity around the world because of the high solubility of aluminum (Al). The objective of this study was to find gene location of Al tolerant trait in rice chromosome from crossed between Cabacu and IR64. One way to found gene location of Al tolerant was by using phenotype analysis and molecular marker microsatellite or SSR (Simple Sequence Repeats). Markers with a specific character could be selected using Bulk Segregant Analysis (BSA). Total 187 strains of F6 rice population from crossed between Cabacu and IR64 were tested using solution of Yoshida. Root length at 45 ppm AlCl3 condition for 21 days was used as data for phenotype linkage analysis with molecular markers. The result of linkage analysis using 47 microsatellite primer shown that RM 104, RM 25, RM 72 and RM 201 were associated with Al stress tolerant trait. These markers shown the genes location which associated with aluminum toxicity tolerance at position 40.166.840 bp chromosome 1, 4.377.460 bp dan 6.762.710 bp chromosome 8 and 20.174.289 bp chromosome 9. Keywords: aluminum tolerant, bulk segregant analysis, microsatellites marker, rice.

EKSPLORASI MARKA MIKROSATELIT YANG TERKAIT DENGAN SIFAT TOLERANSI KERACUNAN ALUMINIUM PADA PADI

SARI YUNIARINI

Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013

Judul Skripsi : Eksplorasi Marka Mikrosatelit yang Terkait dengan Sifat Toleransi Keracunan Aluminium pada Padi Nama : Sari Yuniarini NIM : G84090027

Disetujui oleh

Dr Laksmi Ambarsari, MS Pembimbing I

Dr Kurniawan R Trijatmiko, MSi Pembimbing II

Diketahui oleh

Dr Ir I Made Artika, MAppSc Ketua Departemen

Tanggal Lulus:

PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas rahmat dan karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Karya ilmiah yang berjudul “Eksplorasi Marka Mikrosatelit yang Terkait dengan Sifat Toleransi Keracunan Aluminium pada Padi” ini ditujukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana sains pada Departemen Biokimia dan dilakukan dari bulan Januari sampai dengan April 2013 di Laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian (BB-Biogen), Jalan Tentara Pelajar 3A, Cimanggu, Bogor, Jawa Barat. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Laksmi Ambarsari, M.S. selaku Pembimbing I dan Dr. Kurniawan Rudi Trijatmiko M.Si selaku Pembimbing II atas bimbingan serta arahan yang telah diberikan. Terima kasih penulis persembahkan kepada kedua orang tua tercinta, kakak, adik, dan Gamma atas segala doa, kasih sayang, dan dukungannya yang sangat berarti bagi penulis. Tidak lupa penulis sampaikan terima kasih kepada segenap staf di Laboratorium Biologi Molekuler BB-Biogen, rekan-rekan selama penelitian, teman-teman Biokimia 46 dan juga sahabat-sahabat yang tidak dapat disebutkan satu persatu atas segala bantuan, masukan dan motivasi yang diberikan. Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam karya ilmiah ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun untuk perbaikan di masa mendatang. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Agustus 2013 Sari Yuniarini

DAFTAR ISI DAFTAR TABEL

viii

DAFTAR GAMBAR

viii

DAFTAR LAMPIRAN

viii

PENDAHULUAN

1

METODE

2

Waktu dan Tempat Penelitian

2

Bahan

2

Alat

2

Prosedur Penelitian

3

Prosedur Analisis Data

4

HASIL DAN PEMBAHASAN

5

Hasil

5

Pembahasan

8

SIMPULAN DAN SARAN

11

Simpulan

11

Saran

12

DAFTAR PUSTAKA

12

LAMPIRAN

15

RIWAYAT HIDUP

23

DAFTAR TABEL 1 2 3 4

Statistik sederhana beberapa fenotip dari dua tetua dan F6 Koefisien korelasi sederhana di antara sifat-sifat fenotip yang diamati Hasil pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA daun padi Hasil skoring pita elektroforegram

6 6 6 7

DAFTAR GAMBAR 1 Analisis fenotip padi F6 (Cabacu x IR64) selama 21 hari 2 Panjang akar setelah perlakuan 45 ppm AlCl3 selama 21 hari 3 Distribusi frekuensi panjang akar seminal populasi F6 persilangan Cabacu x IR64 pada media Yoshida ditambah 45 ppm AlCl3 4 Elektroforegram PAGE 8% dari primer mikrosatelit (SSR)

3 5 5 8

DAFTAR LAMPIRAN 1 Komposisi larutan Yoshida (Yoshida et al. 1976) 2 Daftar Primer untuk Analisis Mikrosatelit (SSR) 3 Panjang akar seminal 187 galur tanaman padi F6 hasil persilangan Cabacu x IR64 pada media Yoshida ditambah 45 ppm AlCl3 4 Distribusi frekuensi padi F6 pada media Yoshida ditambah 45 ppm AlCl3 dari berbagai sifat fenotip yang diamati 5 Elektroforegram PAGE 8% menggunakan 47 primer mikrosatelit 6 Lokasi primer mikrosatelit (SSR) di kromosom padi

15 16 18 19 20 22

2

PENDAHULUAN Padi (Oryza sativa L.) merupakan tanaman pangan yang sangat penting karena digunakan sebagai sumber makanan pokok sebagian besar penduduk dunia, termasuk Indonesia. Jumlah penduduk Indonesia 237.641.326 jiwa pada tahun 2010 dengan rata-rata pertumbuhan penduduk 1.49% per tahun dan luas areal panen 11.8 juta hektar. Kebutuhan beras nasional pada tahun 2012 dengan konsumsi per kapita rata-rata 113.48 kg per tahun, maka Indonesia dihadapkan pada ancaman rawan pangan pada tahun 2030 (BPS 2012). Pertambahan penduduk yang kian pesat ini mendorong usaha peningkatan produksi pertanian guna mencukupi kebutuhan beras. Salah satu kendala yang sering dihadapi dalam usaha peningkatan produksi pertanian adalah pH tanah rendah (tanah asam). Tanah asam mencakup sekitar 30% dari total lahan dunia, presentasinya di benua Amerika 40.9%, Asia 26.4%, Afrika 16.7%, Eropa 9.9%, serta Australia dan Selandia Baru 6.1% dari tanah asam dunia (Zhou et al. 2011). Tanah asam ini membatasi hasil panen karena menyebabkan tanaman kekurangan nutrisi (terutama kalsium, magnesium dan fosfor) maupun keracunan mineral (Kochian et al. 2004). Aluminium (Al) adalah faktor utama yang membatasi produktivitas tanaman akibat keracunan mineral di tanah asam (Mao et al. 2003). Kelimpahan aluminium di kerak bumi cukup tinggi (Hoekenga et al. 2003), namun sebagian besar aluminium berada dalam bentuk mineral yang tidak berbahaya bagi tanaman. Aluminium menjadi racun apabila berada pada kondisi asam karena akan lebih mudah larut dan melepaskan trivalen aluminium (Al3+) yang merusak sel tanaman (Delhaize et al. 2012). Padi menunjukkan toleransi tertinggi terhadap toksisitas aluminium di antara tanaman sereal lain. Namun mekanisme dan respon genetika terhadap toleransi aluminium tersebut belum dipahami dengan baik (Ma et al. 2002). Ukuran kromosom padi yang kecil yaitu 430 juta nukleotida (Sakata et al. 2000; Shen et al. 2004) membuat padi dapat dijadikan harapan untuk isolasi gen toleran terhadap cekaman aluminum. Analisis karakter fisiologi (fenotip) dan marka molekuler yang terpaut sifat toleransi keracunan aluminium dapat membantu proses seleksi dalam program perakitan galur padi toleran keracunan aluminium. Salah satu marka molekuler yang telah digunakan secara luas adalah mikrosatelit atau SSR (Simple Sequence Repeats). Mikrosatelit mendeteksi suatu segmen DNA yang mengandung pola perulangan sederhana dari basa nitrogen (2-5 unit nukleotida). Sekuen DNA ini dikenali dengan teknik polymerase chain reaction (PCR) menggunakan primer yang dibuat sesuai dengan urutan spesifik dari pola perulangan tersebut. PCR merupakan metode yang sensitif, selektif, dan cepat dalam menggandakan DNA target yang diinginkan (Murray et al. 2003), sehingga dari satu pasang molekul DNA dapat diperbanyak menjadi jutaan kali lipat setelah 30-40 siklus PCR (Campbell et al. 2002). Proses PCR diperlukan untuk memperbanyak fragmen DNA target yang mengandung sekuen mikrosatelit. Seleksi terhadap marka yang terpaut karakter yang diinginkan dapat dilakukan dengan metode Bulk Segregant Analysis (Collard et al. 2005). Penelitian sebelumnya mengenai karakter perakaran padi toleran aluminium telah dilakukan oleh Hariyanto (2009) dan Akhmad (2009) pada padi F2 persilangan IR64 x Hawarabunar, Prasetiyono et al. (2003) pada padi hasil

2 persilangan Dupa x ITA131 serta Nurlaela (2008) pada padi varietas IR64 dan Krowal. Penelitian menggunakan padi varietas Cabacu yang diketahui toleran kekeringan dan Al (Trijatmiko et al.2013) masih sangat jarang dilakukan. Tujuan penelitian ini adalah mencari lokasi gen sifat toleran keracunan aluminium pada kromosom padi F6 hasil persilangan Cabacu x IR64. Melalui penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi lokasi gen toleran keracunan aluminium pada kromosom padi sehingga dapat digunakan untuk program pemuliaan varietas unggul secara berkelanjutan.

METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan selama 4 bulan (Januari - April 2013). Adapun tempat pelaksanaan penelitian bertempat di rumah kaca Cikeumeuh, Cimanggu, Bogor untuk seleksi padi dengan perlakuan aluminium dan untuk analisis mikrosatelit dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BBBiogen), Jalan Tentara Pelajar No 3A, Cimanggu, Bogor. Bahan Bahan tanaman yaitu 187 galur tanaman padi generasi keenam (F6) hasil persilangan Cabacu x IR64, tetua tanaman padi yaitu varietas Cabacu (padi gogo, toleran Al) dan IR64 (padi sawah, peka Al) serta padi varietas Dupa (toleran Al) dan ITA131 (peka Al) sebagai kontrol. Bahan-bahan yang digunakan yaitu larutan hara Yoshida (Yoshida et al. 1976), AlCl3, HCl, NaOH, nitrogen cair, Tris HCl, EDTA (ethylene diamine tetra acetic), NaCl, dH2O, sodium bisulfit, SDS 20%, sodium asetat, isopropanol dingin, RNAse, etanol 70%, bufer TE 0.1x (TrisEDTA), PCR mix (PCR bufer, dNTPs, dan enzim Taq polimerase), 47 primer mikrosatelit, larutan PAGE (poliakrilamid gel elektroforesis) 8%, 10% APS (amonium persulfat), TEMED (tetra metil etilen diamin), alkohol teknis, TBE 1x (Tris Borate EDTA), EtBr (ethidium bromida), DNA marker 100 bp dan 50 bp (0.1 µg/µL). Alat Peralatan yang digunakan adalah polibag kecil, bak plastik, sterofoam, kain kasa, benang nilon, jarum, tabung plastik (corning), tabung mikro, mikropipet, tip, alat-alat gelas, coolbox, ice maker, waterbath Stuart Scientific, stirer, autoklaf, vorteks, pH meter, oven, sentrifus, neraca analitik Kern 770, nanodrop Thermo Fisher Scientific 2009, UV Illuminator ChemiDoc EQ Biorad, alat elektroforesis CBS Scientific, dan mesin PCR DNA Engine Tetrad Peltier Thermal Cycler.

3 Prosedur Penelitian Analisis Fenotip untuk Seleksi Padi (Yoshida et al. 1976) Seleksi padi dilakukan di rumah kaca (Gambar 1a) menggunakan Rancangan Acak Lengkap yang terdiri atas 2 perlakuan dengan masing-masing 3 ulangan. Media perlakuan terdiri atas 24 bak plastik yaitu 12 bak (3 ulangan, masing-masing ulangan terdiri atas 4 bak plastik) untuk perlakuan kontrol atau normal tanpa aluminium (Gambar 1b) dan 12 bak (3 ulangan) untuk perlakuan dengan aluminium (Gambar 1c). Bak plastik diisi dengan aquades dan larutan hara Yoshida (Yoshida et al. 1976) untuk perlakuan normal dan untuk perlakuan aluminium ditambah dengan AlCl3 sebesar 45 ppm. Komposisi larutan hara Yoshida yang akan digunakan disajikan dalam Lampiran 1. Sebanyak 187 galur padi generasi F6 (Cabacu x IR64), kedua tetuanya (Cabacu dan IR64), serta kedua tanaman padi kontrol (Dupa dan ITA131) diletakkan berdasarkan nomor urutan yang telah dibuat di atas styrofoam berlubang yang bagian bawahnya diberi lapisan kain kasa. Styrofoam ini kemudian diletakkan di atas bak plastik yang telah berisi larutan perlakuan agar akar padi dapat tumbuh. Larutan Yoshida dipertahankan pada pH 4 dengan mengamati perubahan pH larutan setiap 2 hari sekali. Tanaman ditumbuhkan selama 21 hari (3 minggu) kemudian diukur panjang akar seminal (akar utama), tinggi tanaman, bobot kering akar, dan bobot kering tajuk. Setelah dilakukan pengukuran, maka dipilih 20 galur tanaman padi yang memiliki akar terpanjang (toleran Al) dan 20 terpendek (peka Al) pada perlakuan dengan penambahan 45 ppm AlCl3.

c a b Gambar 1 Analisis fenotip padi F6 (Cabacu x IR64) selama 21 hari. (a) Keadaan padi di rumah kaca; (b) Media Yoshida (Normal); (c) Media Yoshida ditambah AlCl3 dengan konsentrasi 45 ppm Analisis Keterpautan Marka Mikrosatelit (SSR) dengan Sifat Toleransi Keracunan Aluminium Isolasi DNA. Daun padi yang akan diisolasi dikelompokkan berdasarkan analisis segregasi massal (Bulk Segregant Analysis) dengan menggabungkan daun dari 20 galur tanaman padi toleran Al (Bulk 1) dan 20 galur tanaman padi yang peka Al (Bulk 2). Daun tanaman padi dari tetua (Cabacu dan IR64) dan kedua Bulk tersebut diambil dan diisolasi DNAnya menggunakan metode Miniprep (Dellaporta et al. 1983). Bufer ekstraksi dibuat dari Tris-HCl, EDTA, NaCl, ddH2O, dan sodium bisulfit. Pemurnian dan pemekatan DNA dilakukan dengan menambahkan potasium asetat, RNAse, sodium asetat dan isopropanol dingin. Pelet DNA dilarutkan dengan bufer TE (Tris EDTA) 0.1x sebanyak 50 μL. Selanjutnya kemurnian dan konsentrasi DNA hasil isolasi diukur dengan spektrofotometer nonodrop (Thermo Fisher Scientific 2009).

4 Amplifikasi DNA. Hasil isolasi DNA yang telah ditentukan konsentrasinya selanjutnya diamplifikasi dengan mesin PCR DNA Engine Tetrad Peltier Thermal Cycler. Total volume reaksi PCR pada setiap tabung PCR adalah 10 µL yaitu 7 µL PCR mix yang terdiri atas komposisi ddH2O, 10x PCR bufer (Dream Taq Buffer), dNTPs (10 mM), dan enzim DNA Dream Taq polimerase ( 5 U/µL), 1 µL primer (5µm) forward dan reverse, dan 2 µL DNA hasil isolasi (25 ng/µL). Primer yang digunakan terdiri atas 47 jenis primer seperti yang terdapat pada Lampiran 2. Program PCR yang digunakan adalah SSR padi. Program PCR ini diawali dengan tahap pradenaturasi pada suhu 94oC selama 4 menit, kemudian denaturasi DNA selama 25 detik pada 94oC. Penempelan primer terjadi pada suhu 55oC selama 30 detik. Tahap selanjutnya adalah pemanjangan primer suhu 72oC selama 45 detik. Siklus kedua sama seperti siklus pertama, sampai terjadi 35 siklus. Pemanjangan primer terakhir dilakukan pada suhu 72oC selama 7 menit. Tahap PCR selesai setelah diinkubasi pada suhu 15oC selama 5 menit. Elektroforesis DNA. Elektroforesis DNA dilakukan menggunakan Gel Poliakrilamid 8% (Sambrook et. al. 1989). Gel poliakrilamid dibuat dengan mencampurkan larutan PAGE yaitu 8% akrilamid sebanyak 50 ml, APS 10% sebanyak 500 µL dan TEMED sebanyak 50 µL. DNA marker yang digunakan yaitu 100 bp dan 50 bp. Sampel DNA dialiri arus listrik dengan daya 75 volt selama 110 menit. Gel poliakrilamid yang telah selesai dirunning diwarnai dengan larutan EtBr (etidium bromida 10 mg/L). Selanjutnya gel divisualisasi pita DNA nya dengan alat UV Illuminator ChemiDoc EQ Biorad. Penentuan Lokasi Gen Toleran Aluminium pada Kromosom Padi Elektroforegram DNA dari galur-galur padi terpilih yang diamplifikasi dengan menggunakan primer mikrosatelit (Lampiran 2) akan menghasilkan pita yang beragam sesuai primer yang digunakan. Pola pita bulk toleran (Bulk 1) yang mengikuti pita tetua Cabacu dan bulk peka (Bulk 2) yang mengikuti tetua IR64 menunjukkan primer mikrosatelit (SSR) yang terpaut dengan sifat toleransi keracunan aluminium. Lokasi gen toleran aluminium dapat diketahui dengan mencari posisi marka (primer) tersebut pada kromosom padi berdasarkan data dari database genom padi yang tersedia di http://www.gramene.org. Prosedur Analisis Data Data hasil pengamatan fenotip diolah dengan program SPSS versi 20 untuk melihat sebaran data dan dilakukan uji normalitas menggunakan Uji ShapiroWilk. Selain itu, data yang diperoleh juga diolah untuk menentukan koefisien korelasi dari berbagai sifat fenotip yang diamati.

5

HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Fenotip Padi Gambar panjang akar tanaman padi tetua Cabacu (toleran Al) dan IR64 (peka Al) serta padi kontrol Dupa (toleran Al) dan ITA131 (peka Al) yang ditumbuhkan pada media Yoshida ditambah 45 ppm AlCl3 selama 21 hari menunjukan adanya perbedaan yang nyata antara padi yang toleran Al dengan yang peka Al. Panjang Cabacu yaitu 28.60 cm, IR64 yaitu 11.03 cm, Dupa yaitu 20.9 cm dan ITA131 yaitu 5.75 cm (Gambar 2). Sebagian besar individu F6 hasil persilangan Cabacu x IR64 memiliki panjang akar di antara kedua tetuanya, dan hanya sebagian kecil saja yang lebih panjang dari Cabacu maupun lebih pendek dari IR64 (Gambar 3).

Gambar 2

Panjang akar setelah perlakuan 45 ppm AlCl3 selama 21 hari. Kontrol ITA131 (peka Al) dan Dupa (toleran Al), Tetua IR64 (peka Al) dan Cabacu (toleran Al)

IR64

Cabacu

Gambar 3

Distribusi frekuensi panjang akar seminal populasi F6 persilangan Cabacu x IR64 pada media Yoshida ditambah 45 ppm AlCl3

6 Selain panjang akar seminal, sifat fenotip lain yang diamati adalah tinggi tanaman, bobot kering akar dan bobot kering tajuk (Tabel 1 dan Lampiran 4). Keempat sifat dari populasi F6 yang diamati tersebut menunjukkan distribusi frekuensi yang menyebar normal. Tabel 1 Statistik sederhana beberapa fenotip dari dua tetua dan F6 Tetua/F6 Cabacu (tetua toleran Al) IR64 (tetua peka Al) Rataan F6 Kisaran F6 W:Normal1

PAS 28,60 11,03 18,1795 7,10 – 30,20 0,211n

TT 27,83 21,67 24,7212 15,93 – 33,83 0,563n

BKA 0,0645 0,0358 0,050763 0,0220 – 0,0802 0,768n

BKT 0,0594 0,0466 0,061316 0,0264 – 0,0913 0,835n

Keterangan : PAS = Panjang akar seminal (cm) TT = Tinggi tanaman (cm) BKA = Bobot kering akar (g) BKT = Bobot kering tajuk (g) 1 Distribusi normal diuji menggunakan statistik Shapiro-Wilk n = Distribusi normal pada tingkat signifikansi 5%

Hasil koefisien korelasi dari keempat sifat fenotip yang diamati dapat dilihat pada Tabel 2. Panjang akar seminal (PAS) berkorelasi positif terhadap tinggi tanaman (TT), bobot kering akar (BKA) dan bobot kering tajuk (BKT). Tabel 2 Koefisien korelasi sederhana di antara sifat-sifat fenotip yang diamati Fenotip PAS TT PAS 1 0,491** TT 0,491** 1 BKA 0,590** 0,555** BKT 0,225** 0,615** Keterangan : ** Nyata pada tingkat signifikansi 1%

BKA 0,590** 0,555** 1 0,640**

BKT 0,225** 0,615** 0,640** 1

Keterpautan Mikrosatelit dengan Sifat Toleransi Keracunan Aluminium Pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA padi hasil isolasi dilakukan menggunakan alat spektrofotometer nanodrop Thermo Fisher Scientific. Konsentrasi keempat sampel DNA cukup tinggi dan kemurniannya cukup baik karena berada pada kisaran 1.8 sampai 2 yang berarti bebas dari kontaminan protein maupun RNA. Tabel 3 Hasil pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA daun padi No. Sampel Konsentrasi (ng/µL) A260/280 1 Cabacu 293,1 1,87 2 IR 64 284 1,85 3 Bulk 1 328,1 1,84 4 Bulk 2 455,8 1,82 Keterangan: Bulk 1 = DNA 20 tanaman padi dengan akar terpanjang (toleran Al) Bulk 2 = DNA 20 tanaman padi dengan akar terpendek (peka Al)

7 Skoring pita elektroforegram dilakukan pada hasil amplifikasi PCR yang telah dielektroforesis menggunakan gel poliakrilamid 8% (Tabel 4). Berdasarkan skoring, dari 47 primer mikrosatelit (SSR) yang digunakan terdapat 4 primer yang memiliki pita Bulk 1 (toleran Al) mengikuti tetua Cabacu dan Bulk 2 (peka Al) mengikuti pita tetua IR64 yaitu RM104, RM5, RM7 dan RM 201 (Gambar 4 dan Lampiran 5). Tabel 4 Hasil skoring pita elektroforegram No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47

Primer RM 5 RM 104 RM 233A RM 240 RM 262 RM 263 RM 132 RM 156 RM 186 RM 255 RM 13 RM 31 RM 153 RM 159 RM 161 RM 178 RM 188 RM162 RM 118 RM 125 RM 172 RM 214 RM 248 RM 25 RM 32 RM 72 RM 152 RM 210 RM 230 RM 264 RM 105 RM 201 RM 215 RM 242 RM 205 RM 147 RM 171 RM 222 RM 244 RM 21 RM 167 RM 209 RM 254 RM 4A RM 20A RM 179 RM 247

Cabacu

IR64

A A A A A

B B B B B

A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A

B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B

A A A A A A A

B B B B B B B

A A A A A A A A

B B B B B B B B

A

B

Bulk 1 (toleran Al) tidak muncul pita A B A B A tidak muncul pita B A B B B B B B B A A B A A B B A A A B pita monomorfik pita monomorfik B A A A A A A pita monomorfik A B A B B A A A pita monomorfik B

Bulk 2 (peka Al) B B A B A B A B A A A B B A A A B A A B B B A B B

B A B A A A A A A A B B A A A B

8 Keterangan : A = pita tetua Cabacu B = pita tetua IR64 = primer mikrosatelit yang pita Bulk 1 sejajar Cabacu dan Bulk 2 sejajar IR64

RM 104

Gambar 4

RM 25

RM 72

RM 201

Elektroforegram PAGE 8% dari primer mikrosatelit (SSR). M = marker 100 bp, 1 = Tetua Cabacu, 2 = Tetua IR64, 3 = Bulk 1 (toleran Al), 4 = Bulk 2 (peka Al)

Lokasi Gen Toleran Aluminium pada Kromosom Padi Lokasi keempat marka (primer) mikrosatelit pada kromosom padi diketahui berdasarkan data dari database genom yang tersedia di http://www.gramene.org. Lokasi marka ini menunjukan lokasi gen toleran aluminium pada kromosom padi tersebut. Lokasi yang diperoleh menunjukkan jarak fisik yang berupa urutan pasang basa (basepare atau bp) di lengan panjang kromosom padi (Tabel 5). Jarak genetik diperoleh dengan mengkonversi jarak fisik sebesar 244 kb untuk jarak genetik sebesar 1 centimorgan (Chen et. al. 2002). Tabel 5 Primer mikrosatelit (SSR) yang menghasilkan pita Bulk 1 (toleran Al) sejajar Cabacu dan Bulk 2 (peka Al) sejajar IR64 di kromosom padi Primer

Kromosom

RM104 RM25 RM72 RM201 Keterangan: bp = basepare cM = centimorgan

1 8 8 9

Posisi primer di kromosom padi Jarak Fisik Jarak Genetik 40.166.840 bp 164,62 cM 4.377.460 bp 17,94 cM 6.762.710 bp 27,72 cM 20.174.289 bp 82,68 cM

Pembahasan Fenotip Padi Fenotip padi yang diamati meliputi panjang akar seminal, tinggi tanaman, berat kering akar dan berat kering tajuk. Panjang akar digunakan sebagai parameter utama untuk menyeleksi padi yang digunakan dalam analisis

9 keterpautan dengan marka mikrosatelit karena dari beberapa hasil penelitian, target utama keracunan aluminium (Al) adalah jaringan akar terutama ujung akar (Prasetiyono et al. 2003). Berdasarkan hasil pengamatan, rata-rata panjang akar pada media tanpa Al untuk tetua Cabacu mencapai 48.20 cm dan IR64 mencapai 30.15 cm, sedangkan pada 45 ppm Al untuk Cabacu sebesar 28.60 cm dan IR64 hanya 11.03 cm (Gambar 2). Hasil ini berarti bahwa Cabacu tetap menunjukkan sifat toleran Al dan IR64 peka Al. Beberapa individu F6 mempunyai nilai rata-rata panjang akar seminal lebih besar dari Cabacu atau lebih kecil dari IR64. Fenomena segregasi transgresif dua arah ini kemungkinan menunjukkan tidak satupun tetua membawa semua alel positif atau alel negatif. Transgresi terjadi karena akumulasi alel-alel komplementer yang diwariskan oleh kedua tetua pada individu tertentu (Trijatmiko et al. 2001). Sebaran normal diperlukan untuk memperoleh dua kelompok galur yang berbeda dalam tingkat toleransi terhadap cekaman aluminium (Tabel 1). Galur yang dipilih adalah galur yang termasuk kategori sangat toleran dan galur yang sangat peka. Menurut Aluko dan Oard (2004), analisis fenotip dengan metode diskriminan ini telah berhasil memisahkan genotipe yang toleran dan genotipe yang peka. Pemisahan ini sangat menentukan dalam keberhasilan metode Bulk Segregant Analysis yang digunakan dalam seleksi marka. Hasil analisis korelasi (Tabel 2) menunjukkan terdapat korelasi positif yang nyata antara berbagai sifat fenotip yang diamati. Korelasi menunjukkan hubungan yang erat apabila nilainya semakin mendekati 1. Pengamatan secara visual (Gambar 3) terlihat bahwa akar tetua IR64 yang peka Al tampak pendek, kaku dan tebal dibandingkan dengan akar tetua Cabacu (toleran Al) yang tampak lurus dan panjang. Akumulasi Al yang tinggi pada inti sel tudung akar yang menghambat pertumbuhan akar (pendek dan tebal) merupakan akibat dari kerusakan sel tudung akar yang berfungsi sebagai sensor terhadap cekaman lingkungan. Perubahan perkembangan akar tersebut bisa terjadi karena Al mengikat nukleotida yang kaya unsur atau gugus bermuatan negatif seperti fosfat (PO4-) (Schetinger et al. 2003). Hal ini menyebabkan permukaan akar berwarna cokelat kekuningan, berbintik dan mudah patah. Aluminium (Al) banyak ditemukan di dalam inti dan dinding sel pada tanaman yang sensitif Al. Penghambatannya pada dinding sel terjadi karena Al menggantikan kedudukan Ca2+ pada lamela tengah. Ikatan Al dengan gugus karboksil akan menimbulkan ikatan yang kuat sehingga sel tidak dapat membesar (Ryan et al. 1997). Sedangkan di dalam inti sel, Al berikatan dengan DNA sehingga menghentikan proses pembelahan sel meristem apikal. Aluminium dalam bentuk polimer memiliki muatan positif yang besar serta memiliki banyak situs pengikatan. Polimer Al ini dapat mengikat fosfat yang ada pada kedua utas DNA, sehingga mengakibatkan gagalnya utas ganda DNA terpisah. Tanaman yang toleran terhadap keracunan Al memiliki kemampuan untuk menekan pengaruh buruk keracunan Al sehingga akar dapat tumbuh terus dan ujung akar tidak rusak. Keterpautan Mikrosatelit dengan Sifat Toleransi Keracunan Aluminium Setelah dilakukan pengamatan terhadap fenotip 187 galur padi F6 di media Yoshida ditambah 45 ppm AlCl3, maka dipilih 20 tanaman toleran Al dengan nilai rata-rata panjang akar terpanjang yaitu tanaman galur 263, 278, 123, 293, 210, 51, 303, 54, 295, 16, 65, 147, 157, 195, 21, 62, 280, 39, 30, dan 153. Serta 20

10 tanaman padi yang peka Al dengan nilai rata-rata panjang akar terpendek yaitu tanaman galur 184, 154, 91, 80, 135, 316, 321, 136, 48, 225, 49, 174, 203, 64, 83, 118, 163, 155, 146, dan 312 (Lampiran 3). Selain itu, diambil juga daun tanaman padi dua tetuanya yaitu Cabacu dan IR64. Daun tanaman padi tersebut diisolasi DNAnya menggunakan metode Miniprep (Dellaporta et al. 1983). Isolasi DNA 40 galur tanaman padi F6 dikelompokkan berdasarkan sifat panjang akarnya, yaitu sesuai dengan analisis segregasi massal. Daun 20 galur tanaman padi yang toleran Al dicampur menjadi Bulk 1, sedangkan daun 20 tanaman padi peka Al dicampur menjadi Bulk 2. Analisis segregasi massal (Bulked Segregant Analysis) atau BSA adalah salah satu strategi untuk membantu dalam mengurangi ukuran sampel dengan dua sampel DNA tanaman yang dikelompokkan sesuai dengan ekpresi tinggi atau rendahnya suatu sifat tertentu (Kanagaraj et al. 2010). Metode BSA digunakan karena dapat dengan pasti menyeleksi marka-marka yang terpaut pada karakter yang diinginkan (Trikoesoemaningtyas et al. 2008). BSA digunakan untuk mendeteksi lokasi marka pada daerah spesifik kromosom, melalui bulk DNA, semua lokus teracak kecuali bagian yang mengandung gen target (Collard et al. 2005). Hasil isolasi DNA yang telah murni disamakan konsentrasinya menjadi 25 ng/µL dan selanjutnya diamplifikasi dengan mesin PCR menggunakan 47 primer SSR (Lampiran 2). Marka SSR bersifat kodominan sehingga dapat membedakan segregasi alel yang bersifat heterozigot. Proses PCR dilakukan pada sampel DNA kedua tetua (Cabacu dan IR64), Bulk 1 dan Bulk 2 menggunakan mesin PCR DNA Engine Tetrad Peltier Thermal Cycler. DNA hasil PCR tersebut dielektroforesis menggunakan gel poliakrilamid 8%. Setelah elektroforesis (Lampiran 5), pita-pita DNA yang teramplifikasi dianalisis dengan cara diskoring, apakah mengikuti pola pita tetua Cabacu atau IR64. Nilai A menunjukkan pita yang sesuai dengan tetua Cabacu, sedangkan B sesuai dengan tetua IR64. Sampel DNA massal yang diamplifikasi dengan marka SSR ini menunjukkan polimorfisme terhadap tetuanya. Keseluruh primer mikrosatelit padi (Rice Microsatellite) atau RM ini mewakili kromosom yang berbeda yang terpilih secara acak dan digunakan untuk mengamplifikasi daerah SSR di antara tetuanya. Analisis keterpautan menggunakan populasi segregasi mensyaratkan bahwa populasi tersebut harus bersegregasi untuk fenotip yang diteliti maupun untuk marka-marka yang diuji (Trijatmiko et al. 2001). Keterpautan mikrosatelit dengan sifat toleransi keracunan aluminium menggunakan analisis segregasi massal (Bulk Segregant Analysis) yang dilakukan memperoleh bahwa marka (primer) RM 104, RM 25, RM 72, dan RM 201 terpaut dengan karakter panjang akar padi yang menunjukkan sifat toleransi terhadap cekaman Al. Hasil tersebut berdasarkan pada pola pita yang terbentuk dari elektroforegram, Bulk 1 (toleran Al) mengikuti pola pita tetua Cabacu sedangkan Bulk 2 (peka Al) mengikuti pola pita IR64. Lokasi Gen Toleran Aluminium pada Kromosom Padi Lokasi gen dapat ditentukan dengan mencari posisi marka RM 104, RM 25, RM 72, dan RM 201 pada kromosom padi. Lokasi marka mikrosatelit ini dalam kromosom padi dapat diketahui berdasarkan data dari database genom padi yang tersedia di http://www.gramene.org. Gramene merupakan sebuah database genom rumput-rumputan dan padi (Oryza sativa). Gramene berisi kumpulan genom serealia dan urutan DNA-nya, peta genetik, perbandingan peta, publikasi yang

11 berkaitan dengan hal tersebut, serta database mutan-mutan padi, marka molekuler, dan protein. Usaha menentukan posisi gen dalam kromosom disebut pemetaan gen atau pemetaan kromosom. Pemetaan kromosom dapat dilakukan secara fisik melalui observasi mikroskopik atau peta sitologi yang disebut peta fisik dan dinyatakan dengan jumlah pasangan basa/basepare (bp). Selain itu, dapat pula melalui studi rekombinasi gen atau pindah silang yang disebut peta genetik dan dinyatakan dalam centimorgan (cM) (Jusuf 2001). Jarak fisik rata-rata per centimorgan diamati menjadi 244 kb untuk genom padi (Chen et al. 2002). Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, lokasi gen yang terkait dengan sifat toleransi keracunan aluminium pada padi F6 hasil persilangan Cabacu x IR64 yaitu di kromosom 1 pada posisi 40.166.840 bp (164.62 cM), kromosom 8 pada posisi 4.377.460 bp (17.94 cM) dan 6.762.710 bp (27.72 cM) serta di kromosom 9 pada posisi 20.174.289 bp (82.68 cM). Identifikasi gen toleran Al pada tanaman telah dipetakan dan dikloning dari berbagai spesies (Zhou 2011). Gen toleran aluminium juga telah dapat dideteksi lokasinya pada kromosom berbagai varietas padi dengan marka molekuler RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) yaitu pada kromosom 1, 2, 6, 9, dan 12. Mao et al. (2004) telah mendeteksi gen toleran Al pada kromosom 1, 9, dan 12. Sedangkan Ma et al. (2002) mendeteksi gen yang mengontrol toleransi Al pada kromosom 1, 2 dan 6. Penelitian tersebut telah dibuat peta tautannya pada padi Japonika varietas Nipponbare dan dipublikasikan di http://www.gramene.org. Hal ini menunjukkan bahwa RM104 di kromosom 1 memiliki hubungan yang dekat dengan marka RFLP R3203 pada posisi 40.235.397 bp, C742 pada 40.918.693 bp (Kurata et al. 1994), RZ801 pada 40.565.651 bp (Causse et al. 1994), RG323 pada 40.343.585 bp dan RG222 pada 40.741.959 bp (McCouch et al. 1988). Sedangkan RM201 di kromosom 9 dekat dengan marka RFLP RZ422 pada posisi 15.545.371 bp (Causse et al. 1994). Penentuan lokasi gen toleran aluminium menggunakan marka di kromosom 8 belum ada, berbeda dengan hasil penelitian bahwa RM25 dan RM72 di kromosom 8 terpaut dengan sifat toleransi keracunan aluminium pada padi F6 hasil persilangan Cabacu x IR64. Hasil ini merupakan informasi penting dalam tahap awal perakitan padi varietas unggul yang toleran aluminium. Gen toleran Al pada padi yang telah diketahui yaitu ART1 (Yamaji et al. 2009), serta STAR1, STAR2 (Huang et al. 2009).

SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Keterpautan marka mikrosatelit (SSR) dengan sifat toleransi keracunan 45 ppm aluminium berada di dekat marka RM104, RM25, RM72, dan RM201. Lokasi gen yang terkait dengan sifat toleransi keracunan aluminium pada padi F6 hasil persilangan Cabacu x IR64 yaitu terletak di kromosom 1 pada posisi 40.166.840 bp, kromosom 8 pada posisi 4.377.460 bp dan 6.762.710 bp serta di kromosom 9 pada posisi 20.174.289 bp.

12 Saran Penelitian lanjutan untuk menentukan jenis gen toleran aluminium yang ada di padi F6 hasil persilangan Cabacu x IR64 di kromosom 1 pada posisi 40.166.840 bp, kromosom 8 pada posisi 4.377.460 bp dan 6.762.710 bp serta di kromosom 9 pada posisi 20.174.289 bp perlu dilakukan. Gen tersebut dapat diisolasi untuk perakitan varietas padi unggulan yang toleran aluminium.

DAFTAR PUSTAKA Akhmad. 2008. Analisis marka molekuler terpaut sifat fisiologi dan toleransi aluminium pada populasi F2 padi. [Tesis]. Bogor : Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB. Aluko GK, Oard JH. 2004. Evaluation of discriminant analysis as a toolfor rapid identification of marker associated with drought resistance in rice. Rockefeller Foundation Workshop. CIMMYT. [BPS] Badan Pusat Statistik. 2012. Berita Resmi Statistik. Jakarta: BPS. Campbell NA, Reece JB, Mitchell LG. 2002. Biologi. Ed ke-5. Lestari R, Adil EIM, Anita N, Andri, Wibowo WF, Manulu W, penerjemah; Safitri A, editor. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Biology Fifth Edition. Causse MA, Ronald PC, Tanksley SD, McCouch SR. 1994. Saturated molecular map of the rice genome based on an interspecific backcross population. Genetics. 138: 1251-1274. Chen M, Presting G, Barbazuk WB, Goicoechea JL, Blackmon B, Fang G, Kim H, Frisch D, Yu Y, Sun S, et al. 2002. An integrated physical and genetic map of the rice genome. The Plant Cell. 14: 537-545. Collard BCY, Jahufer MZZ, Brouwer JB, Pang ECK. 2005. An introduction to markers, quantitative trait loci (QTL) mapping and marker-assisted selection for crop improvement: The basic concepts. Euphytica. 142: 169-196. Delhaize E, Ma JF, Ryan PR. 2012. Transcriptional regulation of aluminium tolerance genes. Review Trends in Plant Science. 17(6): 341-348. Dellaporta SL, Wood J, Hikcs JB. 1983. A Plant DNA minipreparation: version II. Plant Mol Biol. 1 (4): 19-21. Gramene website. [http://www.gramene.org]. Hariyanto. 2009. Marka molekuler terpaut sifat ketahanan aluminium dan karakter agronomi pada populasi F2 padi (Oryza sativa L) [disertasi]. Bogor: Institut Pertanian Bogor. Hoekenga OA, Vision TJ, Shaff JE, Monforte AJ, Lee GP, Howell SH, Kochian LV. 2003. Identification and characterization of aluminum tolerance loci in Arabidopsis (Landsberg erecta x Columbia) by quantitative trait locus mapping. A physiologically simple but genetically complex trait. Plant Physiol. 132: 936-948. Huang CF, Yamaji N, Mitani N, Yano M, Nagamura Y, Ma JF. 2009. A bacterialtype ABC transporter is involved in aluminum tolerance in rice. Plant Cell. 21: 655-667. Jusuf M. 2001. Genetika I, Struktur dan Ekspresi Gen. Jakarta : Sagung Seto.

13 Kanagaraj P, Prince KSJ, Sheeba JA, Biji KR, Paul SB, Shentil A, Babu RC. 2010. Microsatellite markers linked to drought resistance in rice (Oryza sativa L.). Current Science. 98(6): 836-839. Kochian LV, Hoekenga OA, Pineros MA. 2004. How do crop plants tolerate acid soils? - Mechanisms of aluminum tolerance and phosphorous efficiency. Ann Rev Plant Biol. 55: 459-493. Kurata N, Nagamura Y, Yamamoto K, Wang ZX. 1994. A 300 kilobase interval genetic map of rice including 883 expressed sequences. Nature Genetics. 8: 365-372. Ma JF, Shen R, Zhao Z, Wissuwa M, Takeuchi Y, Ebitani T, Yano M. 2002. Response of Rice to Al Stress and Identification of Quantitatif trait Loci for Al Tolerance. Plant Cell Physiol. 43(6): 652-659. Mao C, Yi K, Yang L, Zheng B, Wu Y, Liu F, Wu P. 2004. Identification of aluminum-regulated genes bu cDNA-AFLP in rice (Oryza sativa L.): aluminum-regulates genes for the metabolism of cell wall components. J of Exp Botany. 55 (394): 137-143. McCouch SR, Yu ZH, Khush GS, Tanksley SD, Wang ZY. 1988. Molecular mapping of rice chromosomes. Theoretical and applied genetics. 76: 815-829. Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. 2003. Harper’s Illustrated Biochemistry. New York: McGraw Hill. Nurlaela. 2008. Distribusi dan akumulasi Al pada akar padi dalam kondisi cekaman Al pada larutan hara [skripsi]. Bogor: Institut Pertanian Bogor. Prasetiyono J, Tasliah, Aswidinnor H, Moeljopawiro S. 2003. Identifikasi marka mikrosatelit yang terpaut dengan sifat toleransi terhadap keracunan aluminium pada padi persilangan Dupa x ITA131. J Bioteknol Pertan. 8:35-45. Ryan PR, Reid RJ, Smith FA. 1997. Direct evaluation of the Ca2+ - displacement hypothesis for Al toxicity. Plant Physiol. 113: 1351-1357. Sakata K, Antonio BA, Mukai Y, Nagasaki H, Sakai Y, Makino K, Sasaki T. 2000. INE: a rice genome database with an integrated map view. Nucleic Acids Research Oxford University. 28(1): 97-101. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning A Laboratory Manual. 2nd Ed. New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press. Schetinger MRC, Morsch VM, Bohrer D. 2003. Aluminum: interaction with nucleotides and analytical asfects of its determination. Structur and Bonding. 104:101-137. Shen YJ, Jiang H, Jin JP, Zhang ZB, Xi Bao, He YY, Wang G, Wang C, Qian L, Li X et al. 2004. Development of genome-wide DNA polymorphism database for map-based cloning of rice genes. Plant Physiol. 135: 1198-1205. Thermo Fisher Scientific. 2009. Nanodrop 2000/200c Spectrpphotometer V1.0 User Manual. Wilmington: Thermo Fischer Scientific. Trijatmiko KR, Aswidinnoor H, Moeljopawiro S, Sopandie D. 2001. Keterpautan marka RAPD dengan sifat daya tembus akar tanaman padi IRAT121. J Bioteknol Pertan. 6: 29-35. Trijatmiko KR, Supriyanta, Prasetiyono J, Thomson MJ, Cruz CMV, Moeljopawiro S, Pereira A. 2013. Meta-analysis of QTLs for grain yield and component traits under reproductive-stage drought stress in an upland rice population. Molecular Breeding, fothcoming.

14 Trikoesoemaningtyas, Widodo I, Wirnas D, Arsyad DM, Sopandie D. 2008. Aplikasi marka RAPD dalam seleksi galur kedelai toleran naungan. Inovasi Teknologi Kacang-kacangan dan Umbi-umbian Mendukung Kemandirian Pangan dan Kecukupan Energi. Pusat Penelitian dan Pengembangan Tanaman Pangan. Yamaji N, Huang CF, Nagao S, Yano M, Sato Y, Nagamura Y, Ma JF. 2009. A zinc finger transcription factor art1 regulates multiple genes implicated in aluminum tolerance in rice. Plant Cell. 21: 3339-3349. Yoshida S, Forno DA, Cock J and Gomez KA. 1976. Laboratory Manual for Physiological Studies of Rice. IRRI. Los Banos. Philippines. 83 p. Zhou G, Delhaize E, Zhou M, Ryan PR. 2011. Biotechnological solutions for enhancing the aluminum resistance of crop plants, Abiotic Stress in Plants – Mechanisms and Adaptations.

15

LAMPIRAN Lampiran 1 Komposisi larutan Yoshida (Yoshida et al. 1976) Elemen

Bahan kimia

Konsentrasi akhir yang diinginkan (ppm)

Larutan stok (gr/liter)

Larutan stok (gr/100 mL)

Kebutuhan larutan stok (mL)/liter dH2O

Kebutuhan larutan stok (mL)/bak (kap. 10 liter)

Kebutuhan larutan stok (mL)/100 liter dH2O

N P

NH4NO3 NaH2PO4.2H2O K2SO4 CaCl2 MgSO4.7H2O

40 10

91.4 40.3

9.14 4.03

1.25 1.25

12.5 12.5

125 125

40 40 40

71.4 88.6 324

7.14 8.86 3.24

1.25 1.25 1.25 1.25

12.5 12.5 12.5 12.5

125 125 125 125

MnCl2.4H2O (NH4)6.MO7O2 4.4H2O H3BO3 ZnSO4.7H2O CuSO4.5H2O FeCl3.6H2O

0.5 0.05

1.5 0.074

0.15 0.0074

0.2 0.01 0.01 2

0.934 0.035 0.031 7.7 11.9

0.094 0.0035 0.0031 0.77

K Ca Mg Unsur mikro: Mn Mo B Zn Cu Fe Citric acid

16 Lampiran 2 Daftar Primer untuk Analisis Mikrosatelit (SSR) No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Primer

Sekuen

RM 5 F RM 5 R RM 104 F RM 104 R RM 233A F RM 233A R RM 240 F RM 240 R RM 262 F RM 262 R RM 263 F RM 263 R RM 132 F RM 132 R RM 156 F RM 156 R RM 186 F RM 186 R RM 255 F RM 255 R RM 13 F RM 13 R RM 31 F RM 31 R RM 153 F RM 153 R RM 159 F RM 159 R RM 161 F RM 161 R RM 178 F RM 178 R RM 188 F RM 188 R RM162 F RM162 R RM 118 F RM 118 R RM 125 F RM 125 R RM 172 F RM 172 R RM 214 F RM 214 R RM 248 F RM 248 R RM 25 F RM 25 R

TGCAACTTCTAGCTGCTCGA GCATCCGATCTTGATGGG GGAAGAGGAGAGAAAGATGTGTGTCG TCAACAGACACACCGCCACCGC CCAAATGAACCTACATGTTG GCATTGCAGACAGCTATTGA CCTTAATGGGTAGTGTGCAC TGTAACCATTCCTTCCATCC CATTCCGTCTCGGCTCAACT CAGAGCAAGGTGGCTTGC CCCAGGCTAGCTCATGAACC GCTACGTTTGAGCTACCACG ATCTTGTTGTTTCGGCGGCGGC CATGGCGAGAATGCCCACGTCC GCCGCACCCTCACTCCCTCCTC TCTTGCCGGAGCGCTTGAGGTG TCCTCCATCTCCTCCGCTCCCG GGGCGTGGTGGCCTTCTTCGTC TGTTGCGTGTGGAGATGTG CGAAACCGCTCAGTTCAAC TCCAACATGGCAAGAGAGAG GGTGGCATTCGATTCCAG GATCACGATCCACTGGAGCT AAGTCCATTACTCTCCTCCC GCCTCGAGCATCATCATCAG ATCAACCTGCACTTGCCTGG GGGGCACTGGCAAGGGTGAAGG GCTTGTGCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC TGCAGATGAGAAGCGGCGCCTC TGTGTCATCAGACGGCGCTCCG TCGCGTGAAAGATAAGCGGCGC GATCACCGTTCCCTCCGCCTGC TCCGCCTCTCCTCTCGCTTCCC GCAACGCACAACCGAACCGAGC GCCAGCAAAACCAGGGATCCGG CAAGGTCTTGTGCGGCTTGCGG CCAATCGGAGCCACCGGAGAGC CACATCCTCCAGCGACGCCGAG ATCAGCAGCCATGGCAGCGACC AGGGGATCATGTGCCGAAGGCC TGCAGCTGCGCCACAGCCATAG CAACCACGACACCGCCGTGTTG CTGATGATAGAAACCTCTTCTC AAGAACAGCTGACTTCACAA TCCTTGTGAAATCTGGTCCC GTAGCCTAGCATGGTGCATG GGAAAGAATGATCTTTTCATGG CTACCATCAAAACCAATGTTC

Ukuran dan Suhu Annealing 113 pb 550 222 pb 610 162 pb 550 132 pb 550 154 pb 550 199 pb 550 83 pb 670 160 pb 670 124 pb 610 144 pb 550 141 pb 550 140 pb 550 201 pb 550 248 pb 550 187 pb 610 117 pb 670 210 pb 610 229 pb 610 156 pb 670 127 pb 550 159 pb 550 112 pb 550 102 pb 550 146 pb 550

Kromosom 1 1 2 2 2 2 3 3 3 4 5 5 5 5 5 5 5 6 7 7 7 7 7 8

17 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47

RM 32 F RM 32 R RM 72 F RM 72 R RM 152 F RM 152 R RM 210 F RM 210 R RM 230 F RM 230 R RM 149 F RM 149 R RM 105 F RM 105 R RM 201 F RM 201 R RM 215 F RM 215 R RM 242 F RM 242 R RM 205 F RM 205 R RM 147 F RM 147 R RM 171 F RM 171 R RM 222 F RM 222 R RM 244 F RM 244 R RM 21 F RM 21 R RM 167 F RM 167 R RM 209 F RM 209 R RM 254 F RM 254 R RM 4A F RM 4A R RM 20A F RM 20A R RM 179 F RM 179 R RM 247 F RM 247 R

AGTCTACGTGGTGTACACGTGG TGCGGCCTGCCGTTTGTGAG CCGGCGATAAAACAATGAG GCATCGGTCCTAACTAAGGG GAAACCACCACACCTCACCG CCGTAGACCTTCTTGAAGTAG TCACATTCGGTGGCATTG CGAGGATGGTTGTTCACTTG GCCAGACCGTGGATGTTC CACCGCAGTCACTTTTCAAG GCTGACCAACGAACCTAGGCCG GTTGGAAGCCTTTCCTCGTAACACG GTCGTCGACCCATCGGAGCCAC TGGTCGAGGTGGGGATCGGGTC CTCGTTTATTACCTACAGTACC CTACCTCCTTTCTAGACCGATA CAAAATGGAGCAGCAAGAGC TGAGCACCTCCTTCTCTGTAG GGCCAACGTGTGTATGTCTC TATATGCCAAGACGGATGGG CTGGTTCTGTATGGGAGCAG CTGGCCCTTCACGTTTCAGTG TACGGCTTCGGCGGCTGATTCC CCCCCGAATCCCATCGAAACCC AACGCGAGGACACGTACTTAC ACGAGATACGTACGCCTTTG CTTAAATGGGCCACATGCG CAAAGCTTCCGGCCAAAAG CCGACTGTTCGTCCTTATCA CTGCTCTCGGGTGAACGT ACAGTATTCCGTAGGCACGG GCTCCATGAGGGTGGTAGAG GATCCAGCGTGAGGAACACGT AGTCCGACCACAAGGTGCGTTGTC ATATGAGTTGCTGTCGTGCG CAACTTGCATCCTCCCCTCC AGCCCCGAATAAATCCACCT CTGGAGGAGCATTTGGTAGC TTGACGAGGTCAGCACTGAC AGGGTGTATCCGACTCATCG ATCTTGTCCCTGCAGGTCAT GAAACAGAGGCACATTTCATTG CCCCATTAGTCCACTCCACCACC CCAATCAGCCTCATGCCTCCCC TAGTGCCGATCGATGTAACG CATATGGTTTTGACAAAGCG

168 pb 550 166 pb 550 151 pb 550 140 pb 550 257 pb 550 253 pb 550 134 pb 550 158 pb 550 148 pb 550 225 pb 550 122 pb 550 97 pb 550 328 pb 550 213 pb 550 163 pb 550 157 pb 550 128 pb 550 134 pb 550 165 pb 550 159 pb 550 140 pb 550 190 pb 610 131 pb 550

8 8 8 8 8 8 9 9 9 9 9 10 10 10 10 11 11 11 11 12 12 12 12

18 Lampiran 3 Panjang akar seminal 187 galur tanaman padi F6 hasil persilangan Cabacu x IR64 pada media Yoshida ditambah 45 ppm AlCl3 Galur 2 3 9 11 13 15 16 17 19 21 22 23 26 27 29 30 33 35 37 38 39 41 44 46 47 48 49 51 52 53 54 59 60 61 62 64 65 66 68 69

Galur 18.07 cm 21.77 cm 20.07 cm 14.60 cm 20.97 cm 19.73 cm 25.47 cm 20.00 cm 17.27 cm 23.63 cm 19.63 cm 17.93 cm 21.87 cm 21.93 cm 20.47 cm 23.10 cm 20.67 cm 15.57 cm 19.27 cm 19.73 cm 23.13 cm 18.17 cm 18.67 cm 15.60 cm 21.33 cm 12.07 cm 12.40 cm 26.17 cm 15.97 cm 13.97 cm 25.70 cm 22.03 cm 14.73 cm 15.73 cm 23.43 cm 12.73 cm 25.37 cm 15.33 cm 15.53 cm 20.03 cm

70 73 76 77 80 81 83 86 87 88 91 94 95 96 97 98 99 101 102 103 105 109 110 111 113 115 116 118 119 123 125 126 128 131 132 135 136 137 138 142


144 146 147 148 149 150 151 153 154 155 157 158 159 160 161 163 164 167 168 172 173 174 175 178 180 184 187 188 189 192 194 195 197 198 199 200 203 205 206 207


210 212 213 216 218 219 221 223 225 226 228 229 230 232 234 237 238 239 240 241 244 245 246 247 248 253 255 257 259 262 263 264 265 266 267 268 270 271 275 277

Keterangan : = 20 galur padi toleran Al dengan akar terpanjang = 20 galur padi peka Al dengan akar terpendek


278 279 280 282 284 285 286 288 291 293 294 295 297 298 302 303 307 308 309 311 312 314 315 316 317 321 324

28.23 cm 16.50 cm 23.27 cm 14.00 cm 16.50 cm 22.77 cm 20.60 cm 19.67 cm 17.90 cm 27.27 cm 14.77 cm 25.57 cm 15.37 cm 20.13 cm 22.13 cm 25.97 cm 14.70 cm 18.90 cm 22.70 cm 18.37 cm 13.63 cm 14.03 cm 19.97 cm 11.70 cm 15.87 cm 11.87 cm 14.43 cm

19 Lampiran 4 Distribusi frekuensi padi F6 pada media Yoshida ditambah 45 ppm AlCl3 dari berbagai sifat fenotip yang diamati 45 40 35 30 Frekuensi 25 20 F6 15 10 5 0

IR64

Cabacu

Tinggi Tanaman (cm)

60 50 40 Frekuensi 30 F6 20

Cabacu

IR64

10 0

Bobot Kering Akar (g) Cabacu 60 50 40 Frekuensi 30 F6 20

IR64

10 0

Bobot Kering Tajuk (g)

20 Lampiran 5 Elektroforegram PAGE 8% menggunakan 47 primer mikrosatelit

RM 104 RM 262

RM 132

RM 31

RM 186

RM 233A

RM 156

RM 263

RM 5

RM 13 RM 255

RM 240

RM 159

RM 162

RM 153

RM 188

RM 161

RM 172

RM 118 RM 178 RM 125

RM 214 RM 248

RM 230

RM 32 RM 25

RM 242 RM 149

RM 72

RM 215 RM 201

RM 152 RM 210

RM 105

RM 205

21

RM 171 RM 222 RM 244 RM 209 RM 254

RM 21 RM 167 RM 147

Keterangan : M 1 2 3 4

= marker 50 bp = tetua Cabacu = tetua IR 64 = Bulk 1 (toleran Al) = Bulk 2 (peka Al)

RM 4 A

RM 179

RM 20 A

RM 247

22 Lampiran 6

Lokasi primer mikrosatelit (SSR) di kromosom padi. (Lokasi ditunjukkan oleh tanda )

RM104 di kromosom 1 padi




23

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Banjarnegara pada tanggal 24 Juni 1991 dari ayah bernama Sudarsono, S.T. dan ibu bernama Suwasti, S.Pd. Penulis merupakan anak kedua dari tiga bersaudara. Tahun 2009 penulis menyelesaikan pendidikan Sekolah Menengah Atas di SMA Negeri 1 Banjarnegara, Jawa Tengah dan pada tahun yang sama lolos seleksi masuk dan melanjutkan studi di Institut Pertanian Bogor melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Di IPB penulis mengambil mayor Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam dan minor Komunikasi, Fakultas Ekologi Manusia. Selama mengikuti perkuliahan penulis pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah Biokimia Umum dan Pengantar Penelitian Biokimia tahun ajaran 2012/2013. Penulis juga aktif dalam kegiatan organisasi kemahasiswaan di IPB yaitu sebagai staf Human Research and Development dan keilmuan Bioanalisis Community Research and Educatioan of Biochemistry (CREBs) periode 2010/2011 dan 2011/2012. Selain itu penulis juga menjadi anggota Himpunan Keluarga Mahasiswa Banjarnegara (Ikamabara) di Bogor. Penulis melakukan Praktik Lapang di Laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB-Biogen), Jalan Tentara Pelajar Nomor 3A Cimanggu, Bogor dengan judul Analisis Morfologi Perakaran dan SSR Galur Persilangan Padi Gogo dan Padi Sawah.

EKSPLORASI MARKA MIKROSATELIT YANG TERKAIT DENGAN SIFAT TOLERANSI KERACUNAN ALUMINIUM PADA PADI SARI YUNIARINI

Recommend Documents