Eindwerk. Gebruik van cycline D1 in de pathologie. Stedelijk Ziekenhuis Anatoom-pathologie. bij de diagnose van maligne melanomen

Eindwerk

Studiegebied Bachelor Afstudeerrichting Academiejaar Studente

Gezondheidszorg Biomedische Laboratoriumtechnologie Medische Laboratoriumtechnologie 2008-2009

De Wispelaere Ine

Thema

Gebruik van cycline D1 in de pathologie bij de diagnose van maligne melanomen

Stageplaats

Stedelijk Ziekenhuis Anatoom-pathologie

Cycline D1 in de pathologie bij de diagnose van melanomen

Woord vooraf

Een eindwerk schrijven en het uitvoeren van een praktisch gedeelte brengt heel wat met zich mee. Zonder de hulp van heel wat mensen zou deze taak moeilijker zijn geweest. Daarom wil ik graag een dankwoordje richten aan de mensen die voor het opstellen van dit eindwerk meer dan hun uiterste best hebben gedaan om het in goede banen te leiden. Veel dank gaat uit naar Dr. M Haspeslagh en Dr. E. Steenkiste. Ik dank hen voor de mogelijkheid om bij hen stage te lopen en een eindwerk tot stand te brengen. Ook dank ik hen voor de zeer goede begeleiding en het vertrouwen dat ze in mij hadden gedurende deze stage periode. Het was voor mij dan ook een heel goede ervaring. De collega’s met wie ik gedurende deze periode heb samengewerkt, bedank ik voor de goede sfeer, de nodige informatie en voor het leren van de dagelijkse routine in het laboratorium. Ik breng ook een dankwoordje uit naar mevrouw Kaat Van Oostveldt en mevrouw Nicole Kellner, opleidingscoördinator,voor de goede begeleiding van school uit, voor het bijbrengen van de kennis die ik nodig had om de taken in het laboratorium tot een goed einde te brengen. Ook het departementshoofd, mevrouw Riet Van Dale en het hele team van HOWEST wil ik bedanken om ons de mogelijkheid te bieden om stage te lopen. Deze ervaring brengt ons heel wat bij over hoe het er in een laboratorium aan toe gaat en geeft ons een idee op welke afdeling we later graag zouden terecht komen.

Daarnaast wil ik ook mijn ouders, zussen en vriend bedanken, voor de steun en de mogelijkheid die ik van hen kreeg om deze studies tot een goed einde te brengen.

1


Lijst met afkortingen en symbolen

AD

gedemineraliseerd water

Ag

antigen

Al

antilichaam

BCL-1

B-cel leukemie/lymfoom

CDK

Cycline Dependent Kinase

DAB

diaminebenzodine

GAR

goat anti-rabbit

GERD

gastro-esophageale reflux disease

kB

kilobasen

kDa

kilodalton

MPF

M-fase promoting factor

PRAD-1

Parathyroïd adenomatosis

pRb

Retinoblastoma proteïne

SPF

S-fase promoting factor

SSMM

Superficieel spreidend maligne melanoom

HMB

Human Melanoma Black

2


Verklarende woordenlijst

Acral melanoma

een subtype van melanoma dat voorkomt op handen en voetenen, dit vaak gelegen onder de nagels

Adenocarcinoma

maligne tumor van het klierweefsel

Amplificatie

uit zeer kleine hoeveelheden DNA (enkele moleculen) specifiek een of meer gedeeltes vermenigvuldigen

Anticholinergisch

middelen die de werking van het parasympathisch zenuwstelsel blokkeren

Antigen

een molecuul dat in staat is een reactie van het afweersysteem op te wekken

Antilichaam

zijn eiwitten die door de mens en andere gewervelde dieren worden geproduceerd als antwoord op het binnendringen van een lichaamsvreemde stof of lichaamsvreemde cellen

Apoptose

geprogrammeerde celdood

Biopsie

afname van weefsel voor het stellen van een histologische diagnose

Dermaal

betrekking hebbend op de huid

DNA polymerase

enzymcomplex betrokken bij de DNA-replicatie. Het verdubbelt het DNA door aan elke base de complementerende base te plakken

Enzym

een eiwit dat een chemische reactie in of buiten een cel mogelijk of versnelt deze zonder daarbij zelf verbruikt te worden of van samenstelling te veranderen

Epidermaal

behorend tot de opperhuid

3


Fosforylatie*

het plaatsen van een fosfaatgroep op een van de reactieve hydroxy-groepen (OH) van een aminozuur van dat eiwit

Goat anti-rabbit Al

antilichaam tegen konijn Anti-lichamen opgewekt in geiten

Gradiënt

geleidelijke overgang tussen 2 gebieden

HMB 45

HMB-45 is een monoklonaal antilichaam dat reageert tegen een antigen die aanwezig is in tumoren die melanocyten bevatten, zoals melanoma’s

Inflammatie

ontsteking. Waarneembare symptomen van een ontsteking zijn roodheid, warmte, zwelling, pijn en gestoorde functie

In situ hybridisatie

fluorescent in situ hybridization (afgekort FISH) is een techniek waarbij chromosoom(delen) aangekleurd worden met fluorochromen en vervolgens onder de fluorescentie microscoop bestudeerd kunnen worden. Deze techniek wordt in de cytogenetica gebruikt wordt om ziektes op te sporen die het gevolg zijn van een afwijking van de chromosomen.

Kinasen

enzymen die een fosfaat groep kan aanbrengen op een ander eiwit of een ander molecuul (fosforylering)

Maligniteit

kwaadaardigheid

Melanocyten

bepaald type huidcel dat melanosomen produceert

Melanoom***

vorm van huidkanker, kwaadaardig letsel uitgaande van de pigmentcellen in de opperhuid

Melanosoom

pigmentkorrels

Metastaseren

uitzaaien van tumorcellen in het lichaam

Mutatie

verandering in de normale functie, structuur van een chromosoom

Neoplasie

abnormale en ongecontroleerde groei van cellen

4


Nevi

moedervlek, benigne tumor samengesteld uit nevus cellen die zijn afgeleid uit melanocyten

Obesitas

zwaarlijvigheid

Oncologie

is de medische studie en behandeling van kanker

Overexpressie

in grotere mate dan normaal aanwezig

Parathyroïd adenomatosis

multiple goedaardige adenomen van de parathyroïd (bijschildklier)

Plaveiselcel epitheel

epitheelceltype dat voorkomt in de huid, mondholte, slokdarm en vagina. Plaveiselcelepitheel dankt zijn naam aan de vorm van de cellen. Deze zijn plat en liggen op elkaar gestapeld, waardoor ze lijken op een muur van plavei-stenen.

Progressie

voortgang, verderzetting

Proteolytische enzymen

eiwitsplitsende enzymen

Proto-oncogen

voorlopers van oncogenen, groeibevorderend effect in een normale cel

Squameuze cellen

plaveiselcelepitheel

Thymidine

deoxythymidine is het DNA nucleoside T; In de cel biologie wordt het gebruikt om de cellen in de S–fase te synchroniseren

Transcriptie**

kopiëren van DNA naar mRNA door het enzym RNApolymerase.

Translatie**

vertaling van RNA codes tot specifieke ketens aminozuren, namelijk polypeptiden, de bouwstenen van eiwitten

Translocatie*

verplaatsing, verplaatsing van erfelijk materiaal

Tumorigenesis

carcinogenesis, ontwikkeling van kanker; het proces waarbij normale cellen getransformeerd worden in kankercellen

5


Tumor suppressorgen

in normale cellen hebben deze genen een groeiremmend effect op de celcyclus

Ulceratie

vorming van een zweer

* Figuur zie bijlage 1 ** Figuur zie bijlage 3 *** Figuur zie bijlage 5 6


Lijst van tabellen en figuren

Figuren Figuur 1: Cycline D1 wordt gecodeerd door het CCND1 gen ..........................................11 Figuur 2: Cyclines in de celcyclus ....................................................................................14 Figuur 3: Invloed van cycline D1 op het Rb eiwit ..............................................................15 Figuur 4: Verschil in positief patroon voor cycline D1 tussen melanomen en Spitz nevi ...20 Figuur 5: Directe methode ...............................................................................................21 Figuur 6: Indirecte methode .............................................................................................22 Figuur 7: Indirecte methode met peroxidase enzym .........................................................24 Figuur 8: Microm HMP 110 ..............................................................................................25 Figuur 9: Medite Medizintechniek.....................................................................................25 Figuur 10: Microm HM 350 S ...........................................................................................26 Figuur 11: Shandon Varistain 24-4...................................................................................26 Figuur 12: DAKO Autostainer Plus ...................................................................................27 Figuur 13: Hemaluin - eosine kleuring ..............................................................................33 Figuur 14: De huid ...........................................................................................................36 Figuur 15: Cycline D1 kleuring bij concentratie van 1/200 ( vergroting 20x) .....................38 Figuur 16: Cycline D1 kleuring bij concetratie 1/100 (vergroting 20x) ...............................39 Figuur 17: Cycline D1 kleuring bij concentratie 1/50 (vergroting 20x) ...............................40 Figuur 18: Cycline D1 kleuring bij nevi .............................................................................43 Figuur 19: Cycline D1 kleuring bij Spitz Nevi ....................................................................44 Figuur 20: links: HMB 45 kleuring (vergroting 10 x) rechts: cycline D1 kleuring ( 40x)......45

7


Tabellen Tabel 1: Vergelijking tumorsuppressorgenen en proto-oncogenen [17]............................17 Tabel 2: Amplificatie en translocatie van het chromosoom 11q13 ....................................18 Tabel 3: Gradatie positiviteit.............................................................................................37 Tabel 4: Resultaten samenvatting ....................................................................................41 Tabel 5: Correlatie ulceratie – cycline D1 positiviteit ........................................................42

8


Inhoudsopgave

Inhoudsopgave Woord vooraf

1

Lijst met afkortingen en symbolen

2

Verklarende woordenlijst

3

Lijst van tabellen en figuren

7

Inhoudsopgave

9

1

Inleiding, situatieschets en probleemstelling

11

2

Literatuurstudie

13

2.1

Wat is cycline D1 en wat is zijn rol in de celcyclus?

13

2.2

Wat is een kankercel

16

2.3

Wat is de rol van cycline D1/ BCL-1/PRAD-1 bij kanker

17

2.4

Doel van dit onderzoek

20

3

Materiaal en methode

21

3.1

Immunohistochemische kleuring: principe

21

3.2

Materiaal

25

3.2.1

Apparatuur en benodigdheden

25

3.2.2

Reagentia

27

3.3

Methoden

28

3.3.1

Bewerking van het staal

28

3.3.2

Immunohistochemische kleuring

33

3.3.3

Tegenkleuren van de immunohistochemische coupes

35

4

Onderzoek en resultaten

36

4.1

Onderzoek

36

4.1.1

Op punt stellen van de immunohistochemische kleuring cycline D1

36

4.1.2

Eigenlijk onderzoek

37

4.2

Resultaten

38 9


4.2.1

Positieve controle

38

5

Discussie en besluiten

43

5.1

Vergelijking cycline D1 expressie bij melanomen, nevi en Spits nevi

43

5.1.1

Besluit over de kleuring cycline D1 in melanomen, nevi en Spitz nevi

43

5.1.2

Besluit over de vergelijking cycline D1 – HMB 45

44

5.1.3

Besluit over gradiënt van de kleuring cycline D1

45

5.1.4

Correlatie tussen aanwezigheid van ulceratie en cycline D1 positiviteit

46

Samenvatting

47

Literatuurlijst

49

Bijlagen

53

Bijlage 1 – Mutaties

53

Bijlage 2 – Transcriptie en translatie van genen

54

Bijlage 3 − Cellen in de huid

55

Bijlage 4 − Vergelijking Hemaluin-eosine, HMB 45 en cycline D1 kleuring

56

Bijlage 5 − Melanocyten

57

Bijlage 6 − Tabel van reagentia

58

Bijlage 7 – Tabel met resultaten

60

Colofon

64

Voor akkoord verklaring

65

10

Cycline D1 in de pathologie bij de diagnose van melanomen Literatuurstudie

1

Inleiding, situatieschets en probleemstelling

Cycline D1 is een eiwit van 36 kDa groot dat wordt gecodeerd door het gen CCND1 (BCL-1). Het behoort samen met cycline D2 en cycline D3 tot de familie van D cyclines. We vinden dit gen terug op de lange arm van chromosoom 11. [4]

Figuur 1: Cycline D1 wordt gecodeerd door het CCND1 gen

Cycline speelt een rol bij de regulering van de overgang tussen verschillende fasen in de celcyclus. Dit gebeurt door een associatie met een cycline afhankelijk (“dependent”) kinase (CDK). Door deze associatie kunnen de kinasen geactiveerd worden. De groep van cycline D kan het CDK4 en CDK6 binden en activeren. De activatie van CDK4 en CDK6 kan leiden tot de fosforylatie van het retinoblastoma eiwit (pRb). Cycline D1 is afhankelijk van groeifactoren voor zijn expressie en komt vroeg op gang in de G1 fase van de celcyclus. Bij verhoogde expressie van cycline D1, kan de cel overgaan naar de S-fase van de celcyclus. Cycline D kan ook een CDK onafhankelijke rol spelen in de celcyclus, namelijk de rol als transcriptieregulator. Cycline D1 is dus betrokken bij zowel de progressie van de celcyclus als bij de celgroei. Wanneer er zich problemen voordoen met dit gen, dan kan het cycline D1 overgeëxpreseerd worden. Dit kan resulteren in een tumor. In bepaalde tumoren stijgt de cycline D1 concentratie. 11


In de oncologie (tumorigenesis) speelt cycline D1 een rol in tal van tumoren: -

Parathyroïd adenoom Mantelcel lymfoom Barrett dysplasie/ adenocarcinoom van de slokdarm Borstcarcinoom Maligne melanoom van de huid

In ons onderzoek werd nagegaan of de cycline D1(DAKO) bruikbaar is als discriminerende merker voor maligniteit. Dit in de differentiële diagnose tussen het maligne melanoom met goedaardige navocellulaire nevi en Spits nevi. Na het op punt stellen van de immunohistochemische kleuring cycline D1, is het onze opzet na te gaan of cycline D1 kan gebruikt worden bij de diagnose van maligne melanomen in de huid. Hierbij werd de immuunhistochemische (over-) expressie van cycline D1 vergelijken bij 5 goedaardige nevi, 5 Spitz nevi en 20 melanomen.

Het onderzoek voor dit eindwerk werd uitgevoerd in het labo anatomo-pathologie van het Stedelijk ziekenhuis te Roeselare. Het werd met zorg begeleid door Dr. E. Steenkiste en Dr. M. Haspeslagh.

12


2

Literatuurstudie

2.1

Wat is cycline D1 en wat is zijn rol in de celcyclus?

Cycline D1 is een interessant proto-oncogen dat zijn rol speelt in de celcyclus van normale cellen en kankercellen. Tijdens de celdeling zullen cellen een aantal fasen doorlopen. De eerste fase die de cellen zullen doorlopen is de G1 fase. In deze fase zal het celvolume toenemen, door RNA en eiwitsynthese en dit in aanwezigheid van groeifactoren. Deze fase is de voorbereiding op de volgende fase, de S-fase of synthese fase. In de G1 fase kunnen cellen ook in rust gaan indien niet genoeg groeifactoren aanwezig zijn, de G0 fase genoemd.[17] De S-fase is de volgende stap in de celcyclus. Hier vindt de synthese van DNA plaats. Na de S-fase volgt de G2 fase, deze fase is een voorbereiding op de M-fase of mitose fase (kerndeling).[17] Wanneer een cel overgaat naar een volgende fase dan passeert het telkens een controlepunt of “checkpoint”. De controle punten in de celcyclus worden ingelast om fouten in het DNA te kunnen herstellen. Op deze controlepunten wordt de celdeling stilgelegd en gecontroleerd of er eventueel DNA schade is opgetreden. Indien er DNA schade is opgelopen dan wordt deze hersteld of gaat de cel in apoptose.[17] De overgang naar een volgende fase in de celcyclus van deze cellen gebeurt via deze controle punten, die afhankelijk zijn van schakeleiwitten. De schakeleiwitten die de overgang verzorgen van de G1-fase naar de S-fase, zijn de “S-phase promoting factors” (SPF). De schakeleiwitten voor de overgang van de G2-fase naar de M-fase, worden “Mphase promoting factors” (MPF) genoemd. “Promoting factors” bevatten kinase als actief bestanddeel. Deze kinasen worden ondermeer geactiveerd door binding met cyclines. Kinasen die voor hun activatie afhankelijk zijn van cyclines worden cycline “dependente” kinasen genoemd, CDK’s.[17]

13


Het is op deze momenten dat de cyclines tussenkomen in de celcyclus. Er bestaan verschillende cyclines die op verschillende momenten van de celcyclus binden met de aanwezige kinasen. Cycline D1, D2 en D3 vinden we terug in de G1-fase. Ze behoren allen tot de cycline D familie en hebben biochemisch een vrij analoge structuur. [16,17]

( M-fase )

(G2-fase )

(G1-fase)

(S-fase )

Figuur 2: Cyclines in de celcyclus

Cyclines zullen tijdens de celcyclus binden met CDK’s. Op deze manier worden de kinasen geactiveerd. De cycline D’s die voor komen in de G1 fase zullen CDK4 en CDK6 binden en activeren. Deze CDK’s kunnen het retinoblastoma eiwit (pRb) fosforyleren. [7,16,17,18] Niet gefosforyleerd pRb bindt E2F. Bij de fosforylatie van pRb komt E2F vrij. Niet gefosforyleerd pRb functioneert dus als repressor voor het E2F. E2F is een transcriptiefactor die betrokken is in de G1-fase en de S-fase. Als E2F vrijkomt kunnen de genen afgelezen worden die DNA polymerase en thymidine kinase produceren. [5,7,15] 14


P16

Figuur 3: Invloed van cycline D1 op het Rb eiwit

Het regulatorisch gen p16 vormt een complex met CDK4/6 en voorkomt de binding van cycline D1 met deze cycline “dependente” kinasen. Inactivatie van p16 of overexpressie van cycline D1 komt ten gunste van de progressie naar de S-fase. [5] De cycline D’s zijn afhankelijk van groeifactoren, indien er genoeg groeifactoren aanwezig zijn dan kan de cel overgaan naar de S-fase. De concentratie van cyclines stijgt dus naar het eind van de doorlopen fase, bij de hoogste concentratie gaat de cel over naar de volgende fase. Daarna komen de cyclines los en worden afgebroken door proteolytische enzymen, waardoor de concentraties aan cycline-cdk’s weer gaat dalen. Aan dit cyclisch stijgen en dalen, van de concentratie van cycline in de celcyclus, dankt het uiteindelijk zijn naam (“to cycle”).[17]

15


2.2

Wat is een kankercel

Wanneer een cel ongecontroleerd kan delen door een defect in de celcyclus van die cel, dan kan deze cel uitgroeien tot een kankercel. Als deze gemuteerde cel zich kan delen en blijven delen, ontstaat een tumor. Tumoren kunnen zowel goedaardig als kwaadaardig zijn. Goedaardige tumoren blijven altijd gelokaliseerd. Kwaadaardige tumoren zijn veel agressiever, met lokale destructie van het weefsel. Ze bevatten bovendien vaak de mogelijkheid van metastasering, waarbij ze zich verspreiden over het ganse lichaam. Bij de mutatie van een gen gaan we het onderscheid maken tussen twee vormen, mutatie in de tumor supressor genen en een mutatie in de proto-oncogenen. Wanneer er een mutatie ontstaat in een proto-oncogen dan evolueert het proto-oncogen naar een oncogen. Deze mutatie is een activerende mutatie, waarbij de cel ongecontroleerd kan blijven delen. Er is een kankercel ontstaan. Bij proto-oncogenen is het defect van 1 allel genoeg om tot overexpressie te leiden van het gen. Wanneer er zich een mutatie voordoet in de tumor suppressor genen, die in een normale cel een groeiremmende functie uitvoeren, dan verliest deze zijn functie. Het gen komt niet meer tot expressie waardoor hij een cel niet kan remmen in zijn groei. De cellen die onder controle stonden van dit gen kunnen ongecontroleerd gaan groeien. De functie van dit gen gaat slechts verloren bij de uitschakeling van beide allelen van het gen. Mensen die al een mutatie bevatten bij de geboorte, door een erfelijke aandoening, zijn hierdoor benadeeld. Zij zullen al bij een volgende (tweede) toevallige mutatie een functie verlies, van het betreffende gen, oplopen.[17]

16


Tabel 1: Vergelijking tumorsuppressorgenen en proto-oncogenen [17]

Aantal mutaties om een kanker te veroorzaken

Tumor suppressor genen

Proto-oncogenen

twee allelen uitschakelen

1 allel uitschakelen is al

om een kanker te veroorza-

voldoende

ken. Verlies of activatie van de functie van het gen

Rol in normale cel

Desactiverende mutatie,

activerende mutatie, waarbij

verlies van zijn remmende

de functie bevorderd wordt,

functie

ongecontroleerde deling

Groeiremmend effect

Groeibevorderend effect

Proto-oncogenen hebben slechts 1 uitgeschakeld allel nodig om een kanker te veroorzaken tegenover tumorsuppressor genen waarbij beide allelen uitgeschakeld moeten zijn om kanker te veroorzaken. Proto-oncogenen voeren in een normale cel een groeibevorderende functie uit. Als deze uitgeschakeld worden kunnen we spreken van een activerende mutatie. Tumorsuppressor genen hebben een groeiremmend effect, we spreken van een desactiverende mutatie bij mutaties.

2.3

Wat is de rol van cycline D1/ BCL-1/PRAD-1 bij kanker

Het exprimeren van cycline D1 gebeurt in verschillende tumoren op verschillende manieren. Een eerste manier waarbij cycline D1 geëxprimeerd wordt, komt voort uit een translocatie van het chromosoom 11, die het CCND1gen bevat dat cycline produceert en chromosoom 14, t(11;14) (q13;q32). Door deze translocatie wordt het BCL-1 gen (B-cel leukemie/lymfoom) veranderd en cycline D1 wordt overgeëxprimeerd. Dit is het geval bij mantelcellymfomen. Het eiwit cycline D1 kan gedetecteerd worden in alle mantelcellymfomen. Dit is een belangrijke toepassing van de immuunhistochemische kleuring cycline D1 in de pathologie. [1,20] Een tweede manier waarop cycline D1 overgeëxprimeerd wordt, is het gevolg van een translocatie van het PRAD-1 gen(parathyroïd adenomatosis), aanwezig op chromosoom 11q13 met het gen dat het parathyroïd hormoon produceert.

17


Hieruit volgt dat in zeldzame gevallen waarbij cycline D1 overgeëxprimeerd wordt, een parathyroïd adenoom kan ontstaan.[1] PRAD-1 en BCL-1 liggen op niet meer dan 130 kB afstand van elkaar en houden in zekere zin dan ook verband met elkaar. De PRAD-1 word de gelijke genoemd van BCL-1 oncogen in lymfoïde neoplasieën. Het “breakpoint locus” van het BCL-1gen ligt op 130 kB van het PRAD-1.[3]

Het overexprimeren van cycline D1 kan ook het gevolg zijn van DNA amplificatie. Dit komt voor in heel wat kankers van de darmen, borst, longen, hoofd en nek, en blaas. Het gaat hier over een amplificatie van chromosoom 11q13. [2, 3, 11, 12, 15, 18, 19] Er werd ook een DNA amplificatie van chromosoom 11q13 gevonden bij een subtype van melanomen, namelijk de acrale melanoma’s. In andere melanomen werd deze amplificatie niet altijd gevonden. [6,14]

Tabel 2: Amplificatie en translocatie van het chromosoom 11q13

categorie

proto-oncogen

activatiemechanisme

type tumor

cycline D1

amplificatie

oesophagus-, maagcar-

Celcyclus geassocieerd eiwit

cycline

cinoom

translocatie

mantelcellymfoom

In de tabel zijn enkele mogelijke mutaties te zien. Waarbij ook is beschreven welke types tumoren ze kunnen veroorzaken.

18


Bij melanomen is de rol van cycline D1 en het mechanisme van het overexprimeren van cycline D1 minder goed gekend. Niet enkel de melanomen met cycline D1 amplificatie vertonen immers een verhoogd geëxprimeerd cycline D1. Er werden, tijdens verschillende onderzoeken, melanomen gevonden die overdeëxprimeerd cycline D1vertoonden, maar waarbij geen amplificatie van chromosoom 11q13 gevonden werd. Niet alleen de tumoren met cycline D1 amplificatie kunnen het eiwit overexprimeren, maar ook een groot deel met een normale hoeveelheid kopieën. Wel weten we dat in alle gevallen van amplificatie er ook cycline D1overgeëxprimeerd wordt. In deze gevallen is bovendien de graad van proliferatie hoger. Voor de andere gevallen waarbij cycline D1 overgeëxprimeerd wordt, (bij een normaal aantal kopieën) zijn andere factoren betrokken die een invloed hebben op de cycline D1 die wordt overgeëxprimeerd. Deze factoren zijn tot nog toe niet gekend. [6] Normale melanocyten in histologisch normale huid, vertonen geen cycline D1 expressie. Ook goedaardige pigmentcelletels van de huid (nevus/ nevi) vertonen geen cycline D1 overexpressie.[12] Het kan moeilijk zijn voor pathologen om het morfologisch onderscheid te maken tussen Spits nevi en melanomen. Spitz nevi zijn goedaardige pigmentletsels. Er kan dan ook worden verondersteld dat cycline D1 niet wordt overgeëxprimeerd in goedaardige Spitz nevi. Maar na een studie, om het onderscheid te maken tussen maligne melanoma en Spits nevi, werd deze hypothese herzien. Spitz nevi vertonen een aankleuringspatroon met een gradiënt naar de diepte toe (verlies van positieve kernen naar de diepte). Voorlopig is de oorzaak van het overexprimeren van cycline D1 in Spitz nevi niet gekend. Amplificatie is niet altijd de oorzaak van het overexprimeren. Dit werd aangetoond doordat in een studie via een in situ hybridisatie techniek, amplificatie werd uitgesloten.[12] Er wordt dus zowel in maligne melanomen als in Spitz nevi cycline D1 overgeëxprimeerd. Maar een studie toonde een verschil in patroon van aankleuren. In Spitz nevi, is er verlies van positiviteit van cycline D1 in de diepere dermis. In tegenstelling tot vele cellen in neoplastische melanomen die sterk positief zijn voor cycline D1. In melanomen is er dus geen negatieve gradiënt naar de diepte toe.[12]

19


Figuur 4: Verschil in positief patroon voor cycline D1 tussen melanomen en Spitz nevi

Spitz nevi:

verlies van positiviteit van cycline D1 in de diepere dermis.

Melanomen:

geen negatieve gradiënt naar de diepte toe.

2.4

Doel van dit onderzoek

In ons onderzoek, in het labo pathologie Stedelijk Ziekenhuis Roeselare, werd nagegaan of de cycline D1(DAKO) bruikbaar is als discriminerende merker voor maligniteit. Dit in de differentiële diagnose tussen het maligne melanoom met goedaardige navocellulaire nevi en Spits nevi.

20

Cycline D1 in de pathologie bij de Diagnose van melanomen Materiaal en methode

3

Materiaal en methode m

3.1

Immunohistochemische mmunohistochemische kleuring: principe

De kleuring van immunohistochemische stalen berust op het toevoegen van een met enzym gemerkt antilichaam. Het toevoegen t van dit gemerkt Al kan op twee verschillende manieren gebeuren, direct of indirect. Directe methode: De antigenen die aanwezig zijn in de weefsel coupe worden aangeaang toond door een antilichaam die gebonden is met een enzym. Hier gebeurt alles in één enkele stap. [13] E

Antigenen X

E

E

Al gemerkt met enzym tegen AgX

Figuur 5: Directe methode

Het met enzym gemerkt Al bindt zicht op de antigenen. antigenen. Wanneer een substraat toegevoegd word, dan zal het enzym dit substraat omzetten in een gekleurd product.

21


Indirecte methode: Bij de indirecte methode wordt gebruik gemaakt van een primair en een secundair Al. Het is het secundair Al dat gelabeld is met een enzym. In een eerste stap wordt het primair Al gebonden en in de tweede stap wordt een gelabeld Al gebonden. Dit gelabeld Al bind met het primair Al, we kunnen dus eigenlijk spreken van een antianti antilichaam.[13]

Antigenen X

Konijn Anti-X E E

E

GAR gemerkt met een enzym

Figuur 6: Indirecte methode

Tweestappen methode: Als eerste stap wordt een konijn antilichaam (primair Al) toegevoegd die zich bindt met de antigenen. Als tweede stap wordt een met enzym gemerkt antianti konijn antilichaam (secundair Al) toegevoegd. Dit gemerkt antilichaam zal zich dus binden met het primaire antilichaam. Er ontstaat dus een antigen- primair Al-secundair Al Al-complex.

22


Bij het toevoegen van een substraat kan door de aanwezigheid van het enzym, dit substraat omgezet worden naar een gekleurd product. Via de lichtmicroscoop worden de resultaten geïnterpreteerd, dit gebeurt door de pathologen. Voor het opsporen van cycline D1 wordt gebruik gemaakt van het peroxidase enzym. Het peroxidase wordt bereid uit de mieriks-wortel. Het word ook nog wel de “horse radisch peroxidase “genoemd. Er word gebruik gemaakt van DAB ( diaminobenzidine) en H2O2. Peroxidase kan in aanwezigheid van H2O2 organische stoffen katalyseren. DAB wordt gebruikt als elektronen donor om de reactie te laten plaats vinden. Door de omzetting van het substraat naar een bruin onoplosbaar complex kan deze gemakkelijk gedetecteerd worden onder de microscoop.[13]

23


Figuur 7: Methode met primair antilichaam en polymeer.

24


3.2

Materiaal

3.2.1

Apparatuur en benodigdheden

Figuur 8: Microm HMP 110

De Microm HMP 110 wordt gebruikt voor het automatisch inbedden van de weefsels in paraffine.

Figuur 9: Medite Medizintechniek

De Medite Medizintechnik wordt gebruikt voor het handmatig inbedden van weefsel in paraffine. De weefsel worden hier correct georiënteerd zodat ze op de correcte manier worden doorgesneden. 25


Figuur 10: Microm HM 350 S

De Microm HM 350 S wordt gebruikt voor het snijden van coupes vertrekkend vanaf de paraffineblokken.

Figuur 11: Shandon Varistain 24-4

De Shandon Varistain 24-4 wordt gebruikt voor de hematoxyline-eosine kleuring, de papanicolau kleuring en het deparaffineren van coupes.

26


Figuur 12: DAKO Autostainer Plus

De “Autostainer” Plus, van DAKO, wordt gebruikt voor de immunohistochemische kleuringen van coupes. Verder worden ook nog cassettes gebruikt om de coupes in te bedden, een warmplaat (37° C), een microgolfoven, dekglaasjes (gecoate de kglaasjes voor immunohistochemische kleuringen) en een droogstoof (60 °C).

3.2.2

Reagentia

Zie bijlage 6.

27


3.3

Methoden

3.3.1

Bewerking van het staal

Allereerst gebeurt de identificatie van het staal. De stalen komen aan met een aanvraag formulier. We gaan na of alle nodige gegevens zijn ingevuld en geven het formulier een stempel met de datum en een biopsienummer (E nummer vb. E75426). Daarna leggen we de biopten in een cassette, waarbij voor kleine weefsel stukjes gebruik gemaakt wordt van een vloeipapiertje in de cassette. We noteren het staalnummer op de cassette. We meten het weefsel stukje(s) en noteren de lengte en het aantal fragmenten op het aanvraag formulier. Soms wordt gebruikt gemaakt van een tekening. Indien nodig worden de biopten bijgesneden, dan worden ook de sneden op de figuur aangeduid. We sluiten de cassette af met een dekseltje en plaatsen deze in formol 4%. Daarna doorlopen de stalen een aantal fasen. Van het inbedden in paraffine tot het kleuren van coupes.

Voorbehandeling: -

1e bad

formol 4%

gedurende 1u

-

2e bad

methanol

gedurende 1u

-

3e bad

-

methanol

gedurende 1u

e

methanol

gedurende 1u

e

4 bad

-

5 bad

methanol

gedurende 1u

-

6e bad

methanol

gedurende 1u

-

7e bad

-

methanol

gedurende 1u 30 min

e

xyleen

gedurende 1u

e

8 bad

-

9 bad

xyleen

gedurende 1u

-

10e bad

xyleen

gedurende 1u 30 min

-

11e bad

paraffine 60°C

gedurende 2u

paraffine 60°C

gedurende 2u

-

e

12 bad

Dit gebeurt overnacht omdat dit proces enige tijd in beslag neemt.

28


Uitbedden in paraffine: -

Neem een cassette die de voorbehandeling heeft ondergaan.

-

Neem het dekseltje van de cassette

-

Neem een ijzeren cupje, aangepast aan de grote van het in te bedden weefselstukje

-

Vul het cupje met paraffine en breng het weefsel stukje op zijn snijvlak in de paraffine.

-

Plaats even op de koelplaat en druk het weefselstukje aan, kijk nog eens of het weefsel stukje correct georiënteerd ligt.

-

Plaats de cassette boven op het cupje en druk het aan.

-

Vul de cassette op met paraffine.

-

Laat stollen op de koelplaat.

-

Maak de blokjes schoon, zodat ze gemakkelijk in de houder kunnen geplaatst worden en zo makkelijk te snijden

Snijden van de coupes: -

Zet de veiligheid op en plaats dan de te snijden blok in de houder.

-

Breng de houder met de blok verder weg van het mes met het knopje

-

Zet de veiligheid af en breng de blok naar beneden met het grote wiel (zijkant Microm)

-

Breng de blok dichterbij het mes met het knopje

maar zorg ervoor dat de

blok het mes niet raakt. -

Door een druk op het kleine wiel (zijkant Microm) plaatsen we de machine in de “TRIM” stand.

-

Door een druk op de pedaal word het snijden gestart. Bij een tweede druk kan de machine gestopt worden.

-

Ga door tot je diep genoeg bent in de blok en ga dan over naar de “feed” stand door een druk op het kleine wiel (zijkant Microm).

-

Als je aan het snijden bent op de “feed” stand dan neem je voorzichtig de lijntjes vast tot een goede lengte verkregen wordt. 29


-

Leg de machine stil door een druk op het pedaal, neem het hele lijntje op en leg deze op een houten bordje.

-

Plaats het juiste nummer (het E nummer dat op het blokje staat) op een etiket en kleef dit naast het lintje.

Kleven van de coupes -

Neem een draagglaasje en noteer met een potlood het juiste nummer van de te kleven coupe.

-

Kleef dit stukje op zone drie van het draagglaasje.

-

Leg het draagglaasje met de coupe op de verwarm plaat en strek uit met 2 fijne

Zone 1

Snij met een fijn mesje een vierkantje uit het diepst afgesneden lintje

Zone 2

-

Zone 3

Breng enkele druppels Stick-on (verdunning 2/100ml AD)

E75385

-

prikkers. -

Giet het overtollig Stick-on af en laat drogen op de verwarmplaat.

-

Na enkele minuten plaatsen de coupes in een rekje

-

Droog in de microgolf oven, 1 rekje 7 min op 360W, 2rekjes 8 min.

-

Plaats daarna in een rekje voor de kleuring.

Afhankelijk van de grote worden verschillende stukjes coupe gekleefd: Kleine lintjes: 2 vierkantjes aan elkaar. We nemen twee van deze aan elkaar hangende vierkantjes en leggen die boven elkaar als volgt: E75385 30


Grote lintjes: 1 vierkantje. We leggen twee vierkantjes boven elkaar: E75384 Van grote weefsels nemen we soms 1 lintje: E75383

Uitstrekken van de coupe: E75385

Hematoxyline-eosine kleuring: -

1e bad

xyleen

4 min

-

2e bad

xyleen

4 min

-

3e bad

-

alcohol 100

4 min

e

alcohol 90

4 min

e

4 bad

-

5 bad

alcohol 70 + ammoniak

4 min

-

6e bad

alcohol 90

/

-

7e bad

-

water

1min

e

hematoxyline

5 min

de

8 bad

-

9 bad

stromend water

10 sec

-

10e bad

zure alcohol (HCL 1/100ml)

1sec

-

11e bad

-

stromend water

1sec

e

alcohol 70 + ammoniak

/

e

water + ammoniak

1 min

12 bad 13 bad

31


-

14e bad

stromend water

10 sec

e

eosine

50 sec

e

15 bad

-

16 bad

stromend water

15 sec

-

17e bad

alcohol 90

5 sec

-

18e bad

-

papanicolau “solution” 2a oranje

/

e

alcohol 90

/

e

19 bad

-

20 bad

papanicolau “solution” 3b polychrome EA 50

/

-

21e bad

alcohol 90

5 sec

-

22e bad

-

alcohol 90

5 sec

e

alcohol 100

5 sec

e

xyleen

3 min

23 bad 24 bad

Monteren van de coupes: -

Draag handschoenen voor dit proces

-

De coupes bevinden zich in een bakje gevuld met xyleen

-

Leg enkele dekglaasjes klaar met de gewenste grootte

-

Breng een druppel canadabalsem aan op het dekglaasje (afgelengd met xyleen)

-

Neem een voor een met een pincet de coupes uit de xyleen en plaats het dekglaasje met canadabalsem tegen de coupes

-

Druk het dekglaasje aan

-

Zorg ervoor dat er geen luchtbellen meer tussen het draagglaasje en het dekglaasje aanwezig zijn.

-

Neem een papieren doekje en droog voorzichtig het draagglaasje af.

-

De coupes zijn klaar om onder de microscoop bekeken te worden.

32


3.3.2

Immunohistochemische kleuring

De coupes worden bekeken door Dr. M. Haspeslagh en Dr. E. Steenkiste. Vaak wordt naast een klassieke hemaluin-eosine kleuring, gebruik gemaakt van aanvullende immuunhistochemische kleuringen.

Figuur 13: Hemaluin - eosine kleuring

Voorbehandeling van de stalen alvorens de “Autostainer” kan gestart worden. -

Als de coupes gekleefd en gedroogd zijn worden de etiketten aangebracht

-

Plaats het rekje met de stalen overnacht in de broedstoof

-

De volgende morgen worden de stalen in de “Shandon Varistain” 24-4 gedeparaffineerd.

-

Plaats de coupes in water om uitdrogen uit te sluiten.

-

Maak een buffer pH 9 en pH 6 aan naargelang de eisen van de stalen. In een verdunning van 1/10 in een volume van 200 ml per bakje.

-

Plaats de stalen in de juiste buffer

-

Verwarm op 600 W in de microgolf oven, 7 min indien 2 rekjes, 5 min indien 1 rekje

-

Laat 1 min rusten en vul indien nodig AD aan.

-

Verwarm bij 600 W gedurende 5 min

-

Laat 20 min afkoelen op kamertemperatuur

-

Plaats de rekjes 10 min in tween 20 33


-

Plaats de draagglaasjes in de “Autostainer”

-

Maak de dopjes los van de reagentia

-

Start het proces met het scannen van de barcodes

-

Daarna kan het toestel gestart worden.

Proces: -

Eerst gebeurt de “cleaning” van de probe

-

Daarna worden alle draagglaasjes voor gespoeld met buffer

-

Daarna worden de draagglaasjes besprenkeld met “HRP blocking reagent” gedurende 10 min

-

Daarna is er weer “cleaning” van de probe

-

De draagglaasjes worden weer gespoeld met buffer

-

De draagglaasjes worden besprenkeld met een primaire antilichaam en gedurende 10 min blijft deze op de draagglaasjes.

-

Tussen de verschillende primaire antilichamen wordt de probe schoongemaakt.

-

Na die 10 min worden de draagglaasjes weer gespoeld met buffer

-

Daarna worden de plaatjes besprenkeld met “Envision Dual link” en dit blijft gedurende 30 min op de draagglaasjes

-

Probe schoonmaken

-

Daarna worden de draagglaasjes twee maal gespoeld met buffer

-

De machine schakelt over naar de “toxic waste” afvalcontainer (chromogeen in substraat is schadelijk)

-

Vervolgens wordt het substraat DAB + chromogeen op de draagglaasjes gesprenkeld en dit blijft 10 min op de draagglaasjes zodat het substraat tijd heeft om omgezet te worden in een gekleurd product.

-

De draagglaasjes worden gespoeld met water.

-

Machine is klaar druk op OK en “save” de “RUN LOG”

34


3.3.3

Tegenkleuren van de immunohistochemische coupes

-

Plaats het rekje gedurende 2 min in hematoxyline

-

Spoel in water

-

Dompel in zure alcohol (HCl 1/100ml alcohol)

-

Spoel in water

-

Dompel kort onder in water met ammoniak (opblauwen)

-

Spoelen in water

-

Dompel 2x in alcohol 90

-

Dompel 2x in xyleen

35

Cycline D1 in de pathologie bij de diagnose van melanomen Onderzoek en resultaten

4

Onderzoek en resultaten

4.1

Onderzoek

4.1.1

Op punt stellen van de immunohistochemische kleuring cycline D1

Volgens het protocol van Dako Cytomation, “Monoclonal Mouse Anti-Human” Cycline D1 werd een positieve controle uitgevoerd op de huid. Hier werd bij het gebruik van “En Vision" door DAKO zelf een verdunning aangeraden van 1/300 of 1/200. Er wordt nagegaan bij verschillende concentraties of er een nucleaire kleuring verkregen wordt. De concentratie, waarbij een nucleaire kleuring wordt verkregen, zullen we verder gebruiken voor het uitvoeren van de test op weefsel van goedaardige nevi, goedaardige Spitz nevi en melanomen.

Figuur 14: De huid

36


4.1.2

Eigenlijk onderzoek

In dit onderzoek worden 20 melanomen met 5 nevi en 5 samengestelde of dermale Spitz nevi vergelijken op het gebruik van de cycline D1(DAKO) als discriminerende merker voor maligniteit. Dit in de differentiële diagnose van het maligne melanoma met goedaardige navocellulaire nevi en Spits nevi. In het archief gaan we daarom op zoek naar biopten die werden beoordeeld als melanoom, nevi of Spitz nevi en vergelijken de of cycline D1 overgeëxprimeerd wordt. De cycline D1 wordt telkens vergeleken met de resultaten voor HMB45. HMB 45 is een merker die gebruikt wordt voor de bevestiging van melanomen. De coupes worden semi-kwantitatief gescoord voor de dermale component. Ook de aanwezigheid van een negatieve gradiënt naar de diepte wordt beoordeeld. Tabel 3: Gradatie positiviteit

Gradatie positiviteit

percentage

symbool

zwak

0-4%

+

matig

5-20%

++

sterk

> 20%

+++

Voor het beoordelen van de stalen word in overeenkomst een gradatie toegekend aan de positiviteit van de stalen. Van zwak positief tot sterk positief.

Melanomen: E53885, E62115, E64095, E64392, E64993, E66562, E66710, E66815, E67065, E67079, E68163, E68626, E70111, E71498, E72441, E72815, E73285, E73978, E74232 en E75583. Nevi:

E52365, E53370, E60505, E61086 en E61670.

Spitz nevi:

E41123, E64354, E67592, E62443 en E72900.

37


4.2

Resultaten

4.2.1

Positieve controle

Voor het maken van de concentratie werd telkens humaan anti-cycline D1 verdund in “En vision dual link”. Door het aanpassen van de concentratie wordt een nucleaire aan kleuring bekomen. Huidbiopsies voor kleuring van cycline D1 bij verdunning 1/200 ( E75757, E75769 en E75798/2) blijken niet goed aangekleurd. Op de figuur is te zien dat er geen nucleaire aankleuring wordt bekomen. Dit betekend dat we bij een verdunning van 1/200 geen goede kleuring bekomen hebben en dat de concentratie nog moet worden verhoogd. De kleuring wordt als goed aanzien indien een nucleaire kleuring wordt bekomen.

Figuur 15: Cycline D1 kleuring bij concentratie van 1/200 ( vergroting 20x)

38


De concentratie wordt voor de helft sterker gemaakt, ook hier zien we dat de huidbiopsies voor kleuring van cycline D1 bij verdunning 1/100 ( E75757, E75769 en E75798/2) niet goed aangekleurd zijn. De kleuring wordt gezien in het cytoplasma. Maar de resultaten worden enkel als positief aanzien, indien de kernen aangekleurd worden. We zoeken verder naar de goede concentratie. Op deze manier stellen we de kleuring op punt.

Figuur 16: Cycline D1 kleuring bij concetratie 1/100 (vergroting 20x)

39


De concentratie wordt nogmaals voor de helft sterker gemaakt. Huidbiopsies voor kleuring van cycline D1 bij verdunning 1/50 (E75757, E75769 en E75798/2) vertonen dit maal wel een nucleaire aan kleuring, zoals op de figuur te zien is. Voor ons onderzoek zullen we dus werken bij een concentratie van 1/50.

Figuur 17: Cycline D1 kleuring bij concentratie 1/50 (vergroting 20x)

40


Tabel 4: Resultaten samenvatting

Type

Aard

Cycline positief

Melanoom

Superficieel spreidend nodulair

HMB45 negatief

positief

negatief

11 (79%)

3 (21%)

9 (60%)

6 (40%)

4 (80%)

1 (20%)

4 (80%)

1 (20%)

15 (79%)

5 (21%)

13 (65%)

7 (35%)

2 (40%)

3 (60%)

/

/

2 (50%)

2 ( 50%)

0

3 (100%)

Totaal (melanomen) Naevus Spitz naevus

Naevoïd Gemengd; epitheloïd/ speolcellig

In deze tabel word voornamelijk een vergelijking gemaakt tussen beide kleuringen. Zo kunnen we snel nagaan of de kleuring met cycline D1 in de toekomst kan gebruikt worden tegenover de huidige kleuring met HMB 45.

Er kan worden besloten dat niet alle melanomen cycline D1 overexprimeren, in 21% van de gevallen wordt cycline D1 niet overgeëxprimeerd. Ongeveer eenzelfde aantal nodulaire en superficieel spreidende melanomen overexprimeren cycline D1( ± 80%). Opmerking: −

Bij de superficieel spreidende melanomen en de Spitz nevi valt 1 resultaat, voor cycline D1, uit omdat er geen dermale component in de diepere snede aanwezig is. Beide vertonen een positief beeld in de epidermale component.

−

Bij de klassieke nevi werd geen HMB 45 kleuring uitgevoerd, doch de HMB 45 kleuring kan als negatief worden verondersteld in de diepe dermale component.

−

Bij de Spitz nevi werden slechts in drie gevallen een HMB 45 uitgevoerd. Klassiek ziet men negativiteit voor HMB 45 in de diepe dermale component van een Spitz naevus.

41


Tabel 5: Correlatie ulceratie – cycline D1 positiviteit

Type

Aard

resultaat

Melanoom

Superficieel spreidend C+ / U+ (*)

Nodulair

Nevi

naevoïd

Spitz nevi

Gemengd; epitheloïd/ spoelcellig

Aantal gevallen 1 (7%)

C − / U−

3 (20%)

C+ / U−

11 (73%)

C− / U +

0

C+ / U+ (*)

3 (60%)

C − / U−

0

C+ / U−

1 (20%)

C− / U +

1 (20%)

C+ / U+ (*)

0

C − / U−

2 (40%)

C+ / U−

3 (60%)

C− / U +

0

C+ / U+ (*)

0

C − / U−

3 (60%)

C+ / U−

2 (40%)

C− / U +

0

Er wordt nagegaan of er een correlatie (ook in procent uitgedrukt) bestaat tussen ulceratie die gezien werd in de stalen en het positief resultaat voor de cycline D1. In de tabel werden vier mogelijkheden opgesteld. Positief resultaat voor beide (Cycline D1 positief en ulceratie) Ofwel beide negatief Ofwel een resultaat waarbij een van beide positief is. (*)

C = Cycline D1 U = ulceratie 42

Cycline D1 in de pathologie bij de diagnose van melanomen Discussie en besluiten

5

Discussie en besluiten

5.1

Vergelijking cycline D1 expressie bij melanomen, nevi en Spits nevi

5.1.1

Besluit over de kleuring cycline D1 in melanomen, nevi en Spitz nevi

Voor de naevus zou cycline D1 negatief moeten zijn. Toch kunnen we opmerken dat in enkele gevallen toch een beperkte positiviteit ( 1% van de kernen) gevonden wordt voor cycline D1, dit telkens aan het oppervlak. Er is echter steeds een negatieve gradiënt aanwezig naar de diepte. Deze negatieve gradiënt kan te verklaren zijn door het feit dat ons lichaam constant weerstand biedt tegen gemuteerde cellen. Wanneer op het moment van afname zo’n cel aanwezig is, dan wordt deze aangekleurd. Dit betekent niet dat deze persoon een kanker zal ontwikkelen. Het afweer systeem kan zo’n cellen nog vernietigen. We spreken pas van een tumor wanneer er een overheersend aantal van deze cellen aanwezig zijn.

Figuur 18: Cycline D1 kleuring bij nevi

43


Voor Spitz nevi is de helft positief en de andere helft negatief. In 1 Spitz naevus werd geen duidelijke negatieve gradiënt gezien. Immuunhistochemisch is er voor deze casus voor cycline D1 geen verschil met het maligne melanoom. Mogelijks betreft het een agressiever subtype van Spitz naevus (“high risk” Spitz naevus).

Figuur 19: Cycline D1 kleuring bij Spitz Nevi

5.1.2

Besluit over de vergelijking cycline D1 – HMB 45

Voor de SSMM (superficieel spreidend maligne melanoom) is HMB 45 vaker positief en dit met een sterkere intensiteit. Voor SSMM is de HMB 45 kleuring dan ook superieur aan de cycline D1 kleuring. Voor superficieel spreidende melanomen bevatten van de 11 gevallen die positief zijn voor cycline D1, 6 gevallen een gradiënt (55%).

Voor de nodulaire melanomen werd geen verschil opgemerkt tussen de cycline D1 kleuring en de HMB 45 kleuring. Eenzelfde aantal (80%) kleurt positief.

Spitz nevi hebben een wisselend aankleuringpatroon voor zowel HMB 45 als cycline D1. Beide kleuringen zijn dan ook niet overtuigend als discriminator tussen goedaardige en kwaadaardige Spitz nevi en Spitzoïde melanomen. Verder onderzoek met veel meer gevallen kan hierover in de toekomst eventueel meer duidelijkheid brengen. 44


Figuur 20: links: HMB 45 kleuring (vergroting 10 x) rechts: cycline D1 kleuring ( 40x)

5.1.3

Besluit over gradiënt van de kleuring cycline D1

In het geval van nodulaire melanomen kunnen we besluiten dat van de 4 positieve cycline D1 kleuringen, er 3 geen gradiënt vertonen (75%). De ene kleuring waarbij wel een gradient te vinden is, is beperkt in de diepte.

Bij nevi wordt telkens (in 3 van de cycline D1 positieven) een negatieve gradiënt gezien naar de diepte. 45


Bij Spitz naevus is deze beoordeling wat moeilijker daar er in twee gevallen cycline D1 positief was, maar slecht 1 resultaat kan beoordeeld worden op de gradiënt. Het tweede resultaat kan niet worden ingeschat omdat er geen dermale component aanwezig was in de diepere snede. Bij de dermale positieve Spitz naevus was bij ons geen gradiënt te zien voor de diepte.

5.1.4

Correlatie tussen aanwezigheid van ulceratie en cycline D1 positiviteit

Voor geen enkel type is er een duidelijke correlatie te zien tussen ulceratie en de positiviteit voor de kleuring cycline D1. Ulceratie kan in een letsel aanwezig zijn, maar heeft geen invloed op de kleuring cycline D1. Bij de verschillende types zijn er telkens een aantal gevallen waarvoor cycline D1 positief is, maar waarbij niet altijd een ulceratie te zien is.

46

Cycline D1 in de pathologie Samenvatting

Samenvatting Melanomen zijn agressieve kwaadaardige pigmentletsels van de huid. Maligne melanomen bestaan uit melanoomcellen. Deze cellen zijn de kwaadaardige vorm van normale pigment producerende cellen in de huid ( nevuscellen). Het is dan ook belangrijk onderscheid te maken tussen goedaardige pigmentcelletsels (nevi) en maligne melanomen. Daarom zal elke dermatoloog elk verdacht pigmentcelletsel wegnemen om het microscopisch te laten onderzoeken. In eerste instantie wordt een hemaluin-eosine kleuring uitgevoerd. Maar in sommige gevallen is een aanvullende immunohistochemisch onderzoek noodzakelijk.

Een van de vele immunohistochemische kleuringen is de kleuring met antilichamen tegen cycline D1. Cycline D1 is een eiwit dat tussenkomt in de G1-fase in de celcyclus. Wanneer cycline D1 wordt overgeëxprimeerd, kan de cel ongecontroleerd gaan delen. Deze overexpressie komt voor bij verschillende tumoren, waaronder borstcarcinomen, mantelcellymfomen, parathyroïd adenomen, maligne melanomen van de huid en Barret dysplasie/ adenocarcinomen van de slokdarm. Vaak gaat het om amplificatie, inversie of translocatie van het gen CCND1 op chromosoom 11q13. Maar in enkele gevallen is de overexpressie niet gerelateerd met één van deze oorzaken. [2,3,5,11,15,18,19] In een studie werden melanomen onderzocht, waarbij werd opgemerkt dat niet alle melanomen cycline D1 overexprimeren. Volgens deze studie waren voornamelijk acrale melanomen cycline D1positief, doch ook superficieel spreidende en nodulaire melanomen vertoonden soms overexpressie. [10] In een andere studie werd aangetoond dat goedaardige nevi en Spitz nevi afwel negatief zijn voor cycline D1 ofwel een nagatieve gradiënt vertonen voor de diepte. De studie voorgesteld in dit eindwerk betreft 20 melanomen, 5 nevi en 5 samengestelde of dermale Spitz nevi die aangekleurd worden met cycline D1 en vergeleken met de immuunhistochemische kleuring voor maligne melanomen HMB 45. In deze studie kan cycline D1 geen duidelijk onderscheid maken tussen maligne melanomen en Spitz nevi, doch wel met goedaardige naevocellulaire nevi.

47

Cycline D1 in de pathologie Samenvatting

Een cycline D1 kleuring is dan ook in zekere mate inferieur aan de HMB 45 kleuring, doch een positief resultaat van cycline D1, met name een diffuse positiviteit zonder negatieve gradiënt naar de diepte, pleit vermoedelijk voor maligniteit van het onderzochte pigmentletsel. Na dit onderzoek kan worden besloten dat het gebruik van de cycline D1 kleuring in de toekomst niet zal worden gebruikt binnen het labo. De HMB 45 kleuring blijft behouden in de routine voor het opsporen van maligne melanomen. De cycline D1 kan wel worden gebruikt als aanvullend onderzoek wanneer de HMB 45 kleuring geen duidelijkheid brengt.

48

Literatuurlijst

[1]

Bartkova J, Lukas J, Strauss M, Bartek J.; Cell cycle-related variation and tissue-restricted expression of human cyclin D1 protein;7 december 1993; URL: [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8195927]; Gezien op 27/02/2009

[2]

Bringuier P. P., Tamimi Y., Schuuring E., Schalken J; Expression of cyclin D1 and EMS1 in bladder tumours: relationship with chromosome 11q13 amplification. 1996, Oncogene, 12: 1747-1753; URL: [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8622895]; Gezien op 07/03/2009

[3]

Carol L. Rosenberg, Emily Wongt, Elizabeth M. Pettyt, Allen E. Balet, Yoshihide Tsujimotot,Nancy L. Harris, and Andrew Arnold; ‘PRAD1, a candidate BCL1 oncogene: Mapping and expression in centrocytic lymphoma’; URL: [http://www.pnas.org/content/88/21/9638.abstract]; Gezien op 19/02/2009

[4]

Dako Cytomation, Monoclonal Mouse Anti-Human Cycline D, Dako Cytomation Denmark, Versie 25.03.03, productionsvej 42.

[5]

Damian T. McManus, Andreea Olaru, and Stephen J. Meltzer; Biomarkers of Esophageal Adenocarcinoma and Barrett’s Esophagus; URL: [http://cancerres.aacrjournals.org/cgi/content/full/64/5/1561]; Gezien op 03/03/2009

[6]

Edward R. Sauter, Un-Cheol Yeo, Andrea von Stemm, Weizhu Zhu, Samuel Litwin, David S. Tichansky, Giuseppa Pistritto, Mark Nesbit, Dan Pinkel, Meenhard Herlyn and Boris C. Bastian; Cyclin D1 Is a Candidate Oncogene in Cutaneous Melanoma; URL: [http://cancerres.aacrjournals.org/cgi/content/full/62/11/3200]; Gezien op 27/02/2009 49

[7]

Jinna Bartkova, Jiri Lukas, Per Guldberg, Jan Aisner, Alexei F. Kirkin, Jesper Zeuthen, and Jiri Bartek2; The p16-cyclin D/Cdk4-pRb Pathway as a Functional Unit Frequently Altered in Melanoma Pathogenesis; URL: [http://cancerres.aacrjournals.org/cgi/reprint/56/23/5475]; Gezien op 10/03/2009

[8]

Kamal Bani-Hani, Iain G. Martin, Laura J. Hardie, Nicholas Mapstone, Jackie A. Briggs, David Forman, Christopher P. Wild ; Prospective Study of Cyclin D1 Overexpression in Barrett's Esophagus: Association With Increased Risk of Adenocarcinoma; August 16, 2000; Journal of the National Cancer Institute, Vol. 92, No. 16, 1316-1321; © 2000 Oxford University Press; URL: [http://jnci.oxfordjournals.org/cgi/content/abstract/92/16/1316] Gezien op 24/02/2009

[9]

Kanter-Lewensohn L, Hedblad MA, Wejde J, Larsson O.; Immunohistochemical markers for distinguishing Spitz nevi from malignant melanomas; 1997 Sep,;Department of Tumor Pathology, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden, Mod Pathol.;10(9):917-20; URL: [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9310955]; Gezien op 15/03/2009

[10]

Keyomarsi K., Pardee A. B.; Redundant cyclin overexpression and gene amplification in breast cancer cells. 1993,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1112-1116; URL: [http://www.pnas.org/content/90/3/1112.full.pdf+html]; Gezien op 06/03/2009

[11]

Leach F. S., Elledge S. J., Sherr C. J., Willson J. K., Markowitz S., Kinzler K. W., Vogelstein B; Amplification of cyclin genes in colorectal carcinomas. Cancer Res., 53: 1986-1989, 1993. URL: [http://cancerres.aacrjournals.org/cgi/content/abstract/53/9/1986]; Gezien op 07/03/2009

50

[12]

Nagasaka, Tetsuro M.D., Ph.D.; Lai, Raymond M.D., Ph.D.; Medeiros, L. Jeffrey M.D.; Brynes, Russell K. M.D.; McCourty, Althea B.Sc.; Harada, Tomoko M.D.; Saddik, Maruf M.D., Ph.D; Cyclin D1 Overexpression in Spitz Nevi: An Immunohistochemical Study; April 1999,The American Journal of Dermatopathology:Volume 21(2) pp 115-120

[13]

Nicole Kellner, Cursus Immunohistochemie 2008-2009, Immunohistochemie. Gezien op 14/02/2009

[14]

Schuuring E, Verhoeven E, Mooi WJ, Michalides RJ; Identification and cloning of two overexpressed genes, U21B31/PRAD1 and EMS1, within the amplified chromosome 11q13 region in human carcinomas; Division of Tumor Biology, The Netherlands Cancer Institute, Amsterdam; URL: [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1532244]; Gezien op 19/02/2009

[15]

Tetsuo Kondo, Shereen Ezzat & Sylvia L. Asa; Cell-cycle regulation in follicular cells; April 2006; Nature Reviews Cancer 6, 292-306 URL: [www.nature.com/.../v6/n4/fig_tab/nrc1836_F5.html]; Gezien op 19/02/2009

[16]

Véronique Baldin, Jiri Lukas, Maria Jesfis Marcote, Michele Pagano , and Giulio Draetta; Cyclin D 1 is a nuclear protein required for cell cycle progression in G1; Received November 13, 1992; revised version accepted February 8, 1993, Differentiation Programme, European Molecular Biology Laboratory, D-6900 Heidelberg, Germany URL: [http://genesdev.cshlp.org/content/7/5/812.full.pdf+html] Gezien op 12/02/2009

[17]

Van

Oostveldt

Kaat,

Cursus

hemato-oncologie

2008-2009,Hemato-

oncologie, gezien op 13/02/2009

51

[18]

Vivi Ann Flørenes, Ragnar S. Faye, Gunhild M. Mælandsmo, Jahn M. Nesland, and Ruth Holm; Levels of Cyclin D1 and D3 in Malignant Melanoma: Deregulated Cyclin D3 Expression Is Associated with Poor Clinical Outcome in Superficial Melanoma; URL: [http://clincancerres.aacrjournals.org/cgi/reprint/6/9/3614]; Gezien op 10/03/2009

[19]

Williams M. E., Gaffey M. J., Weiss L. M., Wilczynski S. P., Schuuring E., Levine P. A.; Chromosome 11q13 amplification in head and neck squamous cell carcinoma. 1993, Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg., 119: 12381243; URL: [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8217084]; Gezien op 07/03/20009

[20]

WI Yang, LR Zukerberg, T Motokura, A Arnold and NL Harris; ‘Cyclin D1 (Bcl-1, PRAD1) protein expression in low-grade B-cell lymphomas and reactive hyperplasia’; Department of Pathology, Massachusetts General Hospital, Boston 02114; URL: [http://ajp.amjpathol.org/cgi/content/abstract/145/1/86]; Gezien op 18/02/2009

52

Bijlagen Bijlage 1 – Mutaties

53

Bijlage 2 – Transcriptie en translatie van genen

54

Bijlage 3 − Cellen in de huid

55

Bijlage 4 − Vergelijking Hemaluin-eosine, HMB 45 en cycline D1 kleuring

(1) L margin, field cells present; FISH- 11q13 (red) amplification (arrow head), 5p15 (green) normal. No atypical melanocytes in H&E-stained sections; cyclin D1 and HMB45 not expressed strongly; (2) field cell in eccrine duct near L margin; (3) superficially invasive melanoma with 11q13 (red) and 5p15 (green) amplification: cyclin D1 and HMB45 strongly positive; (4) melanoma in situ with 11q13 and 5p15 amplification; few cyclin D1positive cells and robust expression of HMB-45; (5) R margin field cells; increased copy of 11q13 and 5p15. Weak expression of HBM45 (inset). Bars=100 m (H&E), 50 m (HMB45, cyclin D1).

56

Bijlage 5 − Melanocyten

57

Bijlage 6 − Tabel van reagentia

Product

Merk

lotnummer

Alcohol 70%

Conforma

08H07/V31481

Alcohol 90 %

Conforma

Ammoniak

VWR

Referentie

gevaren

vervaldatum

756D967F11

Licht ontvlambaar

08-2011

08H11/V31444

756D19F11

Licht ontvlambaar

07-2011

08D230524

1133.1000

Corrosief en

03-2010

nummer

Schadelijk voor de omgeving Canadabalsem

VWR

08D250502

21776.183

Ontvlambaar

04-2013

DAB + Chromo- Dako

10022990A

K3468

Schadelijk

09-2010

10023294

K4061

gen

substrate

buffer En vision + dual Dako

08-2009

link system HRP

/

Eosine

Zelf bereid*

Ethanol 99 %

klinipath

Formol (formal- VWR

0825502018

4098.9005

Licht ontvlambaar

10-2010

08L090503

giftig

11-2011

93137520

corrosief

dehyde 35%) HCl

UCB

Hematoxyline

Zelf bereid **

Methanol

Brenntag

Licht ontvlambaar en giftig

Paraffine

Labonord

703669

06148431

Peroxidase

Dako

10019067

S2001

Stick-on

Labonord

0705910015

11047600

Toluol

Brenntag

/

09-2013

schadelijk

05-2009

/

03-2009

blocking reagent

Licht ontvlambaar en schadelijk 58

Tween / wash

Dako

00048252

S3006

12-2009

buffer 10x

/

Xyleen

klinipath

090212A

4055.9005

schadelijk

02-2013

*Bereiding Eosine (cytoplasmakleuring): -

Alcohol 94° AD Eosine Gelblich (Merck art. 1345) Ijsazijn (CH3COOH)

**Bereiding Hematoxyline (kernkleuring) - Hematoxyline kristallen (Merck art.4.02) - Alcohol 100° - Kalium aluin (Merck art.1047) - AD - Kwikoxide (Merck art. 4466)

800 ml 200 ml 2.5 g 10 ml

5.0 g 50 ml 100 g 1000 ml

59

Bijlage 7 – Tabel met resultaten

Biopsie nummer

Aard van het

Celtype

Ulceratie HMB45

staal

Cycline Aantal D1

Gradiënt

positieve kernen

E53885

Nodulair melanoom

Gemengd; ja

+++

+

2%

neen

neen

+++

++

5%

neen

neen

+++

+

2%

ja

neen

−

−

/

/

epitheloïd

neen

++

++

5%

ja

epitheloïd

ja

+++

−

/

/

epitheloïd

ja

−

++

5%

neen

epitheloïd

ja

+++

+

2%

ja

epitheloïd

neen

+++

+++

overwegend spoelcellig

Superficieel spreidend E62115

melanoon met

epitheloïd

nodulaire component Superficieel E64095

spreidend melanoom Superficieel

E64392

spreidend

epitheloïd

epitheloïd (naevoïd)

melanoom E64993

E66562

E66710

Superficieel spreidend melanoom Nodulair Melanoom Nodulair melanoom Superficieel

E66815

spreidend melanoom Superficieel

E67065

spreidend melanoom

25%ED(*)

ja

3% D(**)

60

Biopsie nummer

Aard van het

Celtype

Ulceratie HMB45

staal

Cycline Aantal D1

Gradiënt

positieve kernen

E67079

Superficieel spreidend

epitheloïd

neen

+++

+++

25% ED

(***)

neen

++

+

4%

ja

neen

−

+++

25% ED

(***)

overwegend epitheloïd

neen

+++

++

10%

neen

epitheloïd

neen

+++

++

5%

neen

epitheloïd

ja

+++

+

3%

ja

gemengd

neen

−

++

5%

ja

epitheloïd

neen

++

+

3%

Neen

epitheloïd

neen

−

−

/

/

melanoom Superficieel E68163

spreidend melanoom

E68626

(naevoïd)

Superficieel

Gemengd;

spreidend

overwegend

melanoom

epitheloïd

Superficieel E70111

epitheloïd

spreidend Melanoom

Gemengd;

Superficieel E71498

spreidend Melanoom

Nodulair E72441

Melanoom

Superficieel E72815

spreidend melanoom Nodulair

E73285

Melanoom

Superficieel E73978

spreidend melanoom

61

Biopsie nummer

Aard van het

Celtype

Ulceratie HMB45

staal

Cycline Aantal D1

Gradiënt

positieve kernen

Superficieel E74232

spreidend

Neen, wel in epitheloïd

neen

+++

+++

25% D

melanoom

de intensiteit niet in aantal

Superficieel E75583

spreidend/

Spoelcellig

neen

−

−

/

/

neen

/

−

/

/

neen

/

+

1%

Ja

neen

/

+

1%

ja

neen

/

−

/

lengtigeneus melanoom Naevoïd E52365

Naevus

E53370

Naevus

Naevoïd

Naevoïd E60505

Naevus

E61086

Naevus

naevoïd

/ E61670

E41123

Naevus Samengestelde Spitz naevus

naevoïd

neen

/

+

1%

ja

Neen

/

+

3%

neen

Neen

−

+

1% ED

(***)

Neen

−

−

−

/

Gemengd; epitheloïd/ spoelcellig Gemengd;

E62443

Spitz naevus

epitheloïd/ spoelcellig

Gemengd; E64354

Spitz naevus


62

Biopsie nummer

Aard van het

Celtype

Ulceratie HMB45

staal

Cycline Aantal D1

Gradiënt

positieve kernen

Gemengd; E67592

Spitz naevus

epitheloïd/

Neen

/

−

/

/

neen

−

−

/

/

spoelcellig Spitz naevus

Gemengd;

E72900


In de tabel zijn de resultaten te zien van de verschillende stalen. Hierbij werd het celtype vermeld, werd er vermeld of de kleuringen met cycline D1 en HMB 45 positief of negatief waren. Zo kunnen we nagaan of er een verband bestaat met het staal en de positiviteit tussen de kleuringen, tussen de kleuringen onderling en of er een gradiënt te bespeuren is bij de positieve stalen. (*)

epidermaal

(**)

dermaal

(***) Afwezige dermale component in diepere snede

63

Colofon

Dit eindwerk is tot stand gekomen dankzij de goede begeleiding van Dr. E. Steenkiste en Dr.M. Haspeslagh op de afdeling anatomo-pathologie in het Stedelijk Ziekenhuis te Roeselare. Het eindwerk werd opgesteld in de periode tussen 12 februari en 27 maart 2009.

64

Voor akkoord verklaring

Naam Familienaam stagementor

Naam Familienaam stagebegeleider

65

Eindwerk. Gebruik van cycline D1 in de pathologie. Stedelijk Ziekenhuis Anatoom-pathologie. bij de diagnose van maligne melanomen

Recommend Documents