Edice ALMA MATER. Tonko MardeцiК MIMOTГLNХ OPLODNГNХ. Faktory ovlivъujмcм spпцnost lилby

Edice ALMA MATER

Tonko MardeöiÊ

MIMOTÃLNÕ OPLODNÃNÕ Faktory ovlivÚujÌcÌ ˙spÏönost lÈËby

Edice ALMA MATER

Tonko MardeöiÊ


Vyd·nÌ podpo¯ili

Edice ALMA MATER

Tonko MardeöiÊ


Autor: MUDr. Tonko MardeöiÊ, CSc. Sanatorium Pronatal, Praha Recenzenti: prof. MUDr. Pavel Ventruba, DrSc. I. gynekologicko-porodnick· klinika LF MU, Brno prof. MUDr. Jaroslav éivn˝, DrSc. I. gynekologicko-porodnick· klinika 1. LF UK a VFN, Praha

Tonko MardeöiÊ MIMOTÃLNÕ OPLODNÃNÕ Faktory ovlivÚujÌcÌ ˙spÏönost lÈËby Edice ALMA MATER, svazek druh˝ Vydalo nakladatelstvÌ GalÈn 150 00 Praha 5, N·draûnÌ 116 PrvnÌ vyd·nÌ Editor PhDr. LubomÌr Houdek VedoucÌ redaktorka PhDr. SoÚa Dernerov· OdpovÏdn· redaktorka MUDr. Radmila Samkov· ⁄vodnÌ ilustrace Miroslav Bart·k Dokumentace z archÌvu autora Na vyd·nÌ spolupracovali Jarmila Jungwirthov· a MUDr. Marie ätÏdr· Sazba Blanka Halaökov·, GalÈn Tisk Glos, Semily 2,8 AA ñ 3,2 VA ñ 5,5 TA TS 08/29 MESH-CZ: 1. EMBRYO ñ PÿENOS 2. FERTILIZACE IN VITRO 3. MIMOTÃLNÕ OPLODNÃNÕ 4. OVULACE ñ INDUKCE 5. TÃHOTENSTVÕ ñ V›SLEDEK Obory: 1. gynekologie, porodnictvÌ 2. rozmnoûov·nÌ

Vöechna pr·va vyhrazena. Tato publikace ani û·dn· jejÌ Ë·st nesmÌ b˝t reprodukov·na, uchov·v·na v reöerönÌm systÈmu nebo p¯en·öena jak˝mkoli zp˘sobem (vËetnÏ mechanickÈho, elektronickÈho, fotografickÈho Ëi jinÈho z·znamu) bez pÌsemnÈho souhlasu nakladatelstvÌ. Autor i nakladatel vynaloûili znaËnÈ ˙silÌ, aby informace o lÈËivech odpovÌdaly stavu znalostÌ v dobÏ zpracov·nÌ dÌla. P¯esto za nÏ nakladatelstvÌ nenese odpovÏdnost a doporuËuje ¯Ìdit se ˙daji o doporuËenÈm d·vkov·nÌ a kontraindikacÌch uveden˝ch v p¯ÌbalovÈm let·ku p¯ÌsluönÈho lÈËivÈho p¯Ìpravku. T˝k· se to p¯edevöÌm p¯Ìpravk˘ vz·cnÏji pouûÌvan˝ch nebo novÏ uv·dÏn˝ch na trh. Galén® je chránìná znaèka – No. 191855 Copyright © GalÈn, 1998 ISBN 80-85824-83-3

5

OBSAH

PÿEDMLUVA KE KNIéNÕMU VYD¡NÕ .................................................. 7 ⁄VOD .................................................................................................... 8 1. KLINICK… PÿEDPOKLADY PR¡CE A SOUBORY ............................ 9 2. VLIV VÃKU NA ⁄SPÃCH IVF A†MOéNOSTI PREDIKCE A†OVLIVNÃNÕ V›SLEDKU .................... 2.1. V˝sledky IVF v z·vislosti na vÏku ûeny .................................... 2.1.1. Soubory a metodika ...................................................... 2.1.2. V˝sledky ....................................................................... 2.2. Testov·nÌ ovari·lnÌ funkce v†souvislosti s†vÏkem ............................................................... 2.2.1. Soubory a metodika ...................................................... 2.2.2. V˝sledky ....................................................................... 2.3. Ovari·lnÌ stimulace ûen nedostateËnÏ reagujÌcÌch na†obvyklÈ stimulaËnÌ protokoly (ªpoor responders´) ................................................... 2.4. Asistovan˝ hatching ................................................................ 2.4.1. Soubory a metodika ...................................................... 2.4.2. V˝sledky ....................................................................... 2.5. Strategie p¯i p¯enosu embryÌ ................................................... 2.5.1. Soubory a metodika ...................................................... 2.5.2. V˝sledky ....................................................................... 2.6. D·rcovstvÌ oocyt˘ .................................................................... 2.7. Z·vÏry .....................................................................................

21 22 22 23 25 25 26 27 27

3. VLIV OVARI¡LNÕ STIMULACE NA†V›SLEDKY IVF ........................................................................ 3.1. Soubory a metodika ................................................................ 3.2. V˝sledky ................................................................................. 3.3. Z·vÏry .....................................................................................

29 30 31 32

11 11 13 14 15 18 19

4. VLIV ANDROLOGICK…HO FAKTORU V†…ÿE INTRACYTOPLAZMATICK… INJEKCE SPERMIE (ICSI) ............... 33 4.1. ObstrukËnÌ azoospermie .......................................................... 36

6

4.1.1. Aspirace epididym·lnÌch spermiÌ ................................... 4.1.2. Extrakce testikul·rnÌch spermiÌ .................................... Mechanismy fertilizace oocytu po†intracytoplazmatickÈ injekci spermie .................................. KlinickÈ aspekty ICSI .............................................................. 4.3.1. Indukce ovulace ............................................................ 4.3.2. AndrologickÈ a neandrologickÈ indikace intracytoplazmatickÈ injekce (ICSI) ............................... 4.3.3. Kryokonzervace embryÌ po ICSI ..................................... 4.3.4. TÏhotenstvÌ po ICSI ....................................................... GenetickÈ aspekty ICSI ........................................................... Metodika ICSI ......................................................................... 4.5.1. P¯Ìprava spermiÌ ........................................................... 4.5.2. P¯Ìprava oocyt˘ ............................................................. 4.5.3. P¯Ìprava mikropipet ...................................................... 4.5.4. P¯ÌstrojovÈ vybavenÌ pro mikromanipulace .................... 4.5.5. Mikromanipulace .......................................................... 4.5.6. Kontrola oplozenÌ .......................................................... V˝sledky ................................................................................. Z·vÏry .....................................................................................

39 43 43 44 45 45 46 47 47 48 49 50 54

5. SELEKCE EMBRYÕ PRO TRANSFER (PRODLOUéEN¡ KULTIVACE EMBRYÕ) ........................................ 5.1. Soubory a metodika ................................................................ 5.2. V˝sledky ................................................................................. 5.3. Z·vÏr .......................................................................................

55 57 59 59

6. KRYOKONZERVACE EMBRYÕ ........................................................ 6.1. Soubor a metodika .................................................................. 6.2. V˝sledky ................................................................................. 6.3. Z·vÏr .......................................................................................

60 63 64 66

7. OSUD TÃHOTENSTVÕ A†PERINAT¡LNÕ V›SLEDKY V†SOUBORU TÃHOTN›CH éEN PO IVF A ET ............................... 7.1. Soubor a metodika .................................................................. 7.2. V˝sledky ................................................................................. 7.3. Z·vÏry .....................................................................................

67 67 68 70

4.2. 4.3.

4.4. 4.5.

4.6. 4.7.

36 37 37 39 39

PODÃKOV¡NÕ ..................................................................................... 71 LITERATURA ..................................................................................... 73 AUTOR ............................................................................................... 87

7

PÿEDMLUVA KE KNIéNÕMU VYD¡NÕ

Tato publikace nenÌ uËebnicÌ Ëi monografiÌ s cÌlem podrobnÏ popsat jednotlivÈ etapy lÈËby sterility metodou mimotÏlnÌho oplodnÏnÌ. Snahou autora je pouk·zat na moûnosti, kterÈ jsou k dispozici a†kterÈ umoûÚujÌ zv˝öit efektivitu rutinnÌch lÈËebn˝ch postup˘. V†souËasnÈ dobÏ, kdy se tÈmÏ¯ dennÏ objevujÌ novÈ informace a novÈ postupy, nenÌ zcela snadnÈ se v†nich orientovat a sledovat jejich skuteËn˝ klinick˝ dopad na†kaûdodennÌ praxi. Douf·m proto, ûe uvedenÈ informace, zahrnujÌcÌ jak liter·rnÌ p¯ehledy k danÈ problematice, tak i vlastnÌ praktickÈ zkuöenosti, budou p¯Ìnosem nejen pro ty, kte¯Ì v oblasti asistovanÈ reprodukce aktivnÏ p˘sobÌ, ale i†pro gynekology a porodnÌky, kte¯Ì se s†p·ry lÈËen˝mi metodami asistovanÈ reprodukce dost·vajÌ bÏûnÏ do styku a v neposlednÌ ¯adÏ i†pro odbornÌky v navazujÌcÌch oborech, neboù asistovan· reprodukce se rozvÌjÌ jako typicky interdisciplin·rnÌ odvÏtvÌ medicÌny. autor

8

⁄VOD

LÈËba sterility metodou mimotÏlnÌho oplodnÏnÌ (in vitro fertilizace) spolu s†ostatnÌmi metodami asistovanÈ reprodukce jiû d·vno opustila r·mec klinickÈho experimentu a stala se rutinnÌm postupem p¯i terapii nedobrovolnÏ bezdÏtn˝ch manûelstvÌ. Vzhledem ke st·lÈmu zvyöov·nÌ efektivity tÏchto metod se trvale zuûujÌ indikace pro tzv. ªklasickÈ´ lÈËebnÈ postupy a st·le se rozöi¯ujÌ indikace asistovanÈ reprodukce ñ p¯edevöÌm in vitro fertilizace (IVF). P˘vodnÌ indikace ñ jinak nelÈËiteln· tub·rnÌ sterilita ñ byla brzy rozöÌ¯ena o nevysvÏtlitelnou (idiopatickou) sterilitu, sterilitu p¯i endometriÛze, andrologicky podmÌnÏnou neplodnost a sterilitu podmÌnÏnou p¯ÌtomnostÌ protil·tek negativnÏ ovlivÚujÌcÌch reprodukËnÌ procesy. DalöÌm krokem bylo zavedenÌ lÈËby neplodnosti pomocÌ darovan˝ch oocyt˘. CelosvÏtov˝ rozvoj in vitro fertilizace p¯inesl exponenci·lnÌ n·r˘st poznatk˘ z oblasti biologie reprodukce a dosud nevÌdan˝m zp˘sobem zmÏnil p¯Ìstup k terapii neplodnosti. I v samotnÈ in vitro fertilizaci doölo bÏhem jejÌ relativnÏ kr·tkÈ historie k ¯adÏ z·sadnÌch zmÏn: ultrazvukem kontrolovanÈ punkce folikul˘ umoûnily prov·dÏt tuto lÈËbu ambulantnÏ, zavedenÌ agonist˘ GnRH do ovari·lnÌ stimulace zajistilo mnohem dokonalejöÌ kontrolu folikul·rnÌ f·ze cyklu, rutinnÌ kryokonzervace embryÌ ¯eöÌ etick˝ problÈm tzv. nadpoËetn˝ch embryÌ a zvyöuje ˙spÏönost IVF bez nutnosti podstupovat opakovanou stimulaci a punkci folikul˘, intracytoplazmatick· injekce spermie (ICSI) p¯inesla z·sadnÌ obrat p¯i lÈËbÏ z·vaûn˝ch p¯Ìpad˘ andrologicky podmÌnÏnÈ sterility. P¯estoûe v kvalitnÌch centrech je efektivita IVF plnÏ srovnateln· s efektivitou p¯irozenÈ reprodukce, ˙daje z celosvÏtovÈho registru zaznamen·vajÌ jen pozvolnÈ zvyöov·nÌ procenta implantovan˝ch embryÌ. Identifikace a rozbor vlivu jednotliv˝ch faktor˘ na efektivitu IVF jsou nejen nezbytnou podmÌnkou dalöÌho rozvoje metody, ale i z·kladnÌm p¯edpokladem pro objektivnÌ a ˙plnÈ informov·nÌ neplodnÈho p·ru p¯ed zah·jenÌm pl·novanÈ terapie.

9

1. KLINICK… PÿEDPOKLADY PR¡CE A SOUBORY

Rozsah vlastnÌho materi·lu, ze kterÈho vych·zÌme, a klinickou zkuöenost (poËty cykl˘ s aspiracÌ, poËty dosaûen˝ch tÏhotenstvÌ) dokumentujÌ grafy 1†a 2. počet těhotenství 200 195

180 175

160 140 120

118

100

104

80 60 58

40 20 0

15 1989

69

22 1990

rok 1991

1992

1993

1994

1995

1996

Graf 1. Klinická těhotenství v programu IVF 1989–1996 (ÚPMD, Pronatal) počet výkonů 1200 1000

1023

800 600

175 515

400 200 0

717

154 1989

232 1990

307

359 rok

1991

1992

1993

1994

1995

Graf 2. Punkce folikulů v programu IVF 1989–1996 (ÚPMD, Pronatal)

1996

10

V pr·ci jsou uvedeny liter·rnÌ p¯ehledy a vlastnÌ zkuöenosti a v˝sledky v†problematice t˝kajÌcÌ se: l vlivu vÏku na ˙spÏch IVF a moûnosti predikce a ovlivnÏnÌ v˝sledku; l vlivu ovari·lnÌ stimulace na v˝sledky IVF; l vlivu andrologickÈho faktoru v È¯e intracytoplazmatickÈ injekce spermie (ICSI); l moûnosti selekce nejkvalitnÏjöÌch embryÌ pro embryotransfer (prodlouûen· kultivace embryÌ); l kryokonzervace embryÌ; l osudu tÏhotenstvÌ a perinat·lnÌch v˝sledk˘ u ûen tÏhotn˝ch po lÈËbÏ metodou mimotÏlnÌho oplodnÏnÌ oocytu.

11

2. VLIV VÃKU NA ⁄SPÃCH IVF A†MOéNOSTI PREDIKCE A†OVLIVNÃNÕ V›SLEDKU

2.1. V˝sledky IVF v z·vislosti na vÏku ûeny V hospod·¯sky vyvinut˝ch zemÌch (a v poslednÌch letech z¯etelnÏ i†v†»R) je evidentnÌ trend odsunu porodu prvnÌho dÌtÏte aû po ukonËenÌ vzdÏl·nÌ a†zajiötÏnÌ profesion·lnÌ dr·hy. Nap¯. v USA rodÌ v souËasnÈ dobÏ kaûd· p·t· ûena svÈ prvnÌ dÌtÏ po 35. roce vÏku. Tento odklad zvyöuje riziko kontaktu s nÏkterou ze sexu·lnÏ p¯enosn˝ch chorob s n·sledn˝m postiûenÌm tub·rnÌ funkce, a takÈ pravdÏpodobnost snadnÈ a nekomplikovanÈ koncepce se s vÏkem sniûuje. KlesajÌcÌ p¯irozen· fertilita ûeny se stoupajÌcÌm vÏkem je proces komplexnÌ a multifaktori·lnÌ, z¯etelnÏ dokumentovan˝ ¯adou pracÌ.(58,115,124) UplatÚuje se pokles koit·lnÌ aktivity, kles· poËet norm·lnÌch ovulaËnÌch cykl˘ a naopak nar˘st· procento cykl˘ abnorm·lnÌch, zvyöuje se v˝znam uterinnÌho faktoru sterility.(77) MÈnÏ zn·mou skuteËnostÌ je exponenci·lnÌ n·r˘st chromosom·lnÌch aberacÌ. U†ûen nad 40 let je pravdÏpodobnÏ vÏtöina embryÌ aneuploidnÌch a†genetickÈ p¯ÌËiny se tak v˝znamnÏ uplatÚujÌ v etiologii sterility staröÌch ûen.(68) V jednÈ z nejzn·mÏjöÌch pracÌ Schwartz a Mayaux analyzovali v˝sledky intrauterinnÌch inseminacÌ spermiemi d·rce u†2193 ûen azoospermick˝ch muû˘ a†prok·zali, ûe pokles fertility zaËÌn· jiû od 30. roku vÏku.(177) Odklad tÏhotenstvÌ a†expozice negativnÌm vliv˘m ovlivÚujÌcÌm fertilitu spolu s p¯irozen˝m poklesem fertility vede k n·r˘stu nedobrovolnÏ bezdÏtn˝ch manûelstvÌ s nutnostÌ konzultace specializovanÈho pracoviötÏ. VÏk je proto mimo¯·dnÏ d˘leûit˝m faktorem i p¯i pl·nov·nÌ diagnostick˝ch a terapeutick˝ch postup˘. U staröÌch ûen je nutno trvat na co nejvËasnÏjöÌm p¯ed·nÌ p·ru do pÈËe specializovanÈho centra asistovanÈ reprodukce. P¯estoûe je situace p¯i in vitro fertilizaci odliön· od spont·nnÌ koncepce (jsou transferov·na vybran· nejkvalitnÏjöÌ embrya), je vÏk povaûov·n za jeden z nejd˘leûitÏjöÌch prognostick˝ch faktor˘ p¯i IVF. Vzhledem k p¯irozenÈmu poklesu fertility a vyööÌ incidenci genetick˝ch anom·liÌ u potomstva odmÌt· ¯ada IVF center pacientky

12

MimotÏlnÌ oplodnÏnÌ

nad 40 let vÏku. NeuspokojivÈ v˝sledky v tÈto vÏkovÈ kategorii jsou d·ny p¯edevöÌm nedostateËnou reakcÌ na ovari·lnÌ stimulaci(43,42) a†snÌûenou receptivitou endometria.(35,42,50) Lze jednoznaËnÏ prok·zat, ûe procento oplozen˝ch oocyt˘ u staröÌch ûen se neliöÌ od ûen mladöÌch, ale p¯i stejnÈm poËtu transferovan˝ch embryÌ je v˝raznÏ niûöÌ implantace. To m˘ûe b˝t podmÌnÏno jednak dÏloûnÌm faktorem (myomatÛza, snÌûen· vaskularizace endometria, porucha syntÈzy prostaglandin˘, lute·lnÌ insuficience), jednak niûöÌ kvalitou embryÌ,(61,151) resp. jejich omezenou ûivotnostÌ. KromÏ v˝sledk˘ z†anim·lnÌch experiment˘ podporujÌ tento p¯edpoklad i ˙daje o†ËastÏjöÌm v˝skytu ne˙spÏön˝ch tÏhotenstvÌ u staröÌch ûen, u nichû vöak p¯ÌËinou nenÌ chromosom·lnÌ aberace.(151) Uv·dÏn· vÏkov· hranice pro ªnorm·lnÌ´ ˙spÏönost IVF ñ 36 aû 37 let(50) ñ je v souhlase s†v˝sledky pracÌ zab˝vajÌcÌch se poklesem p¯irozenÈ fertility.(192) V˝sledky z†registru American Fertility Society(185) vykazujÌ 10,8 % tÏhotenstvÌ ukonËen˝ch porodem u Ëty¯icetilet˝ch ûen a staröÌch oproti 30,4†% u ûen mladöÌch. Tan ve svÈ pr·ci(204) prok·zal kumulativnÌ procento tÏhotenstvÌ po pÏti IVF cyklech 45ñ54 % u ûen mezi 20ñ34 lety, oproti 14,4 % u ûen nad 40 let vÏku. Nov˝ pohled na problematiku p¯inesly pr·ce o terapii darovan˝mi oocyty u ûen se syndromem p¯edËasnÈ menopauzy. Velmi povzbudivÈ v˝sledky vedly k p¯edstavÏ, ûe ªreprodukËnÌ st·rnutÌ´ (reproductive aging) je d·no spÌöe izolovan˝m poklesem kvality oocyt˘ neû uterinnÌmi faktory.(124,159) Jednou z moûnostÌ, jak oddÏlit kvalitu embryÌ od receptivity endometria, je ËistÏ matematicky posoudit dosaûen· tÏhotenstvÌ a vÌceËetnÈ implantace. ZatÌmco jak·koli implantace embrya je zn·mkou p¯Ìtomnosti receptivnÌho endometria, vÌceËetn· implantace odr·ûÌ kvalitu oocyt˘ a embryÌ.(186) Jasn˝m d˘kazem vlivu oocyt˘ na v˝sledky je i signifikantnÏ vyööÌ poËet tÏhotenstvÌ v p¯Ìpadech, kdy vÏk d·rkynÏ je niûöÌ neû 30 let.(155) V†pokusech na zvÌ¯atech byla dokumentov·na signifikantnÏ niûöÌ implantace v tÏch p¯Ìpadech, kdy byla embrya mladöÌch samic transferov·na staröÌm p¯ÌjemkynÌm.(4) Tyto n·lezy svÏdËÌ pro snÌûenou receptivitu endometria podmÌnÏnou vÏkem. PodobnÈ studie v hum·nnÌ medicÌnÏ vöak p¯inesly rozpornÈ v˝sledky. ÿada autor˘ na z·kladÏ dosaûenÈho procenta implantacÌ usuzuje, ûe dÏloûnÌ faktor nenÌ v tÏchto p¯Ìpadech v pop¯edÌ.(124,159) ExistujÌ vöak i pr·ce svÏdËÌcÌ o opaku. Abdalla(1) prok·zal signifikantnÏ horöÌ v˝sledky u†ûen nad 40 let (16 %) oproti ûen·m mladöÌm (36 %). V jinÈ studii Levrana byla vÏkov· hranice jeötÏ niûöÌ ñ 14% ˙spÏönost u†ûen nad 33 let a 31% ˙spÏönost u ûen mladöÌch.(89) Tuto teorii p¯izn·vajÌcÌ v˝znam uterinnÌmu faktoru na pokles fertility staröÌch ûen podporuje i studie ChetkowskÈho, kdy uterinnÌ receptivita 0,42†% u ûen mladöÌch 40 let poklesla na 0,29 % u ûen staröÌch.

Vliv vÏku na ˙spÏch IVF a moûnosti predikce a ovlivnÏnÌ v˝sledku

13

ExistujÌ vöak doklady o tom, ûe vysokÈ d·vky progesteronu v†lute·lnÌ f·zi mohou korigovat uterinnÌ faktor sterility.(113) Z·kladnÌm p¯edpokladem implantace je sekreËnÌ p¯emÏna endometria vlivem progesteronu, kter· je z·visl· na d·vce a dÈlce expozice a†na reaktivitÏ endometria. Porucha tohoto procesu byla v˝znamnÏ ËastÏji nalezena u ûen nad 35 let.(199) Navot a spol. uk·zali, ûe vyööÌ d·vky progesteronu urychlÌ sekreËnÌ transformaci endometria.(123) VyööÌ procento tÏhotenstvÌ u ûen nad 40 let po aplikaci vyööÌch d·vek progesteronu je v souladu s n·lezy opoûdÏnÈ a nedostateËnÈ sekreËnÌ p¯emÏny po aplikaci fyziologick˝ch d·vek tohoto hormonu.(170) Tato abnorm·lnÌ reakce na progesteron u staröÌch ûen m˘ûe b˝t zp˘sobena poklesem estrogennÌch receptor˘, kterÈ jsou ªpromotory´ endometri·lnÌch progesteronov˝ch receptor˘.(64) Tuto moûnost podporujÌ i†n·lezy niûöÌho endometria po ovari·lnÌ stimulaci u staröÌch ûen.(172) Tento defekt je korigovateln˝ suprafyziologick˝mi d·vkami progesteronu, coû je v souhlase s uspokojiv˝mi v˝sledky IVF s darovan˝mi oocyty u ûen nad 40 let, u kter˝ch byla dennÌ d·vka progesteronu aû 150 mg.(124,159) DalöÌm aspektem snÌûenÈ fertility staröÌch ûen je vyööÌ incidence spont·nnÌch potrat˘.(122) Procento potrat˘ ûen staröÌch neû 40 let se pohybuje mezi 41ñ62,5 %.(45,137,151,185) Tyto ˙daje korelujÌ s n·lezem Levrana, kter˝ zjistil, ûe procento potrat˘ je v souvislosti s†vÏkem d·rkynÏ a nikoli p¯ÌjemkynÏ.(89) To svÏdËÌ pro to, ûe tÏhotenskÈ ztr·ty staröÌch ûen jsou zp˘sobeny p¯edevöÌm abnormalitou oocyt˘, zejmÈna chromosom·lnÌ.(89,148) Mal· nadÏje na tÏhotenstvÌ ukonËenÈ porodem zdravÈho plodu vedla ¯adu pracoviöù k†vÏkov˝m limit˘m omezujÌcÌm dostupnost terapie. Tento postup vöak byl opakovanÏ zpochybnÏn, neboù reakce na stimulaci a v˝sledky terapie mnohem vÌce korelujÌ s tzv. ªovari·lnÌm vÏkem´ (ovarian age) neû s vÏkem biologick˝m.(112)

2.1.1. Soubory a metodika Studie zahrnuje 1642 ûen lÈËen˝ch naöÌm t˝mem v programu IVF a ET rozdÏlen˝ch do vÏkov˝ch kategoriÌ po dvou letech a stimulovan˝ch obvykl˝mi stimulaËnÌmi protokoly. Vzhledem k rozsahu souboru byla Ë·st ûen stimulov·na jeötÏ ªstaröÌmi´ protokoly kombinujÌcÌmi klomifencitr·t a†gonadotropiny (hMG) nebo hMG samotn˝m. V poslednÌch letech se pouûÌvajÌ tÈmÏ¯ v˝hradnÏ stimulaËnÌ protokoly vyuûÌvajÌcÌ analoga GnRH (v†kr·tkÈm Ëi dlouhÈm schÈmatu). Monitorov·nÌ zahajujeme osm˝ den cyklu stanovenÌm hladin 17-β-estradiolu a progesteronu a ultrazvukov˝m vyöet¯enÌm. Choriov˝ gonadotropin 10 000 j. i.m. se aplikuje tehdy, kdy dominantnÌ folikul dos·hne velikosti 18ñ20 mm za p¯Ìtomnosti nejmÈnÏ dalöÌch

14


dvou folikul˘ alespoÚ 16 mm v pr˘mÏru. DalöÌ podmÌnkou je stoupajÌcÌ hladina estradiolu a nÌzk· hladina progesteronu nesvÏdËÌcÌ pro luteinizaci folikul˘ in situ. OdbÏr oocyt˘ (34ñ36 h po aplikaci hCG) prov·dÌme transvagin·lnÌ punkcÌ v kr·tkÈ celkovÈ anestÈzii. Lute·lnÌ podporu aplikujeme u vöech pacientek po transferu embryÌ podle reakce na ovari·lnÌ stimulaci ñ buÔ pomocÌ hCG (1500 j. i.m. obden celkem 6x), nebo progesteronu (60 mg i.m. celkem 11x) poËÌnaje dnem p¯enosu embryÌ. V poslednÌ dobÏ se vöem pacientk·m pod·v· vagin·lnÏ mikronizovan˝ progesteron 2x 100 mg dennÏ.

2.1.2. V˝sledky PoËty pacientek v jednotliv˝ch vÏkov˝ch skupin·ch dokumentuje graf 3. VÏkov· hranice, kdy nast·v· pokles efektivity metody, je (ve shodÏ s pracemi ve svÏtovÈ bibliografii) 36ñ37 let. AËkoli oproti spont·nnÌ koncepci jsou p¯i IVF p¯en·öena do dÏlohy vybran· nejkvalitnÏjöÌ embrya, je zde jasnÏ patrn˝ vliv vÏku na dosahovanÈ v˝sledky. Graf 4 z¯etelnÏ dokl·d· pokles ˙spÏönosti u skupiny ûen staröÌch neû 37 let. KlesajÌcÌ fertilitu ûeny se stoupajÌcÌm vÏkem doprov·zÌ sniûov·nÌ tzv. ovari·lnÌ rezervy, a proto souËasnÏ kles· reakce na exogennÌ stimulaci. Sledujeme-li ovari·lnÌ reaktivitu na neselektovanÈm souboru, m˘ûeme jednoznaËnÏ prok·zat pokles citlivosti ovariÌ na exogennÌ stimulaci (graf 5). U†ûen ve vÏku kolem 40 let bylo pro nedostateËnou reakci na exogennÌ gonadotropiny p¯eruöov·no aû 50 % IVF cykl˘.

počet pacientek 500 450 400

410

350

401 366

300 250 244

200 150

140

100

81

50 0 < 30

< 32

< 34

Graf 3. Věková struktura IVF souboru

< 36

< 38

< 40

věk pacientek


15

% těhotenství 30,0 25,0

25,1

23,8

20,0

22,6

25,2

15,0

16,4

10,0

14,5

5,0 0 < 30

< 32

< 34

< 36

< 38

< 40

věk pacientek

Graf 4. Těhotenství/punkce v závislosti na věku 50 % 45 % 40 % 35 % 30 % 25 % 20 % 15 % 10 % 5% věk

0 ≤ 30

≤ 32

≤ 34

≤ 36

≤ 38

≤ 40

Graf 5. Přerušené cykly v závislosti na věku bez předchozí selekce pacientek

2.2. Testov·nÌ ovari·lnÌ funkce v†souvislosti s†vÏkem V˝sledkem zvyöujÌcÌho se ªovari·lnÌho vÏku´ je snÌûenÌ ovari·lnÌ funkce a†ovari·lnÌ rezervy projevujÌcÌ se nedostateËnou Ëi abnorm·lnÌ reakcÌ na ovari·lnÌ stimulaci.(212) V tÏchto p¯Ìpadech se p¯i ovari·lnÌ stimulaci vyvÌjÌ pouze jeden Ëi dva folikuly a cyklus se p¯eruöuje nebo pokraËuje s minim·lnÌ nadÏjÌ na ˙spÏch. Tuto skupinu ûen (poor responders) je zapot¯ebÌ identifikovat jeötÏ p¯ed zah·jenÌm vlastnÌ stimulace. Muasher(119) sledoval predikËnÌ hodnotu baz·lnÌ hladiny gonadotropin˘ na v˝sledek terapie a zjistil, ûe stanovenÌ baz·lnÌ hladiny FSH umoûÚuje diferencovat skupiny pacientek odliönÏ reagujÌcÌch na stimulaci, liöÌcÌ se poËtem zÌskan˝ch oocyt˘, transferovan˝ch

16


embryÌ a dosaûen˝ch tÏhotenstvÌ. Ke stejnÈmu z·vÏru dospÏl ve svÈ pr·ci i Scott.(164) Toner analyzoval 1478 po sobÏ jdoucÌch IVF cykl˘ a zjistil kontinu·lnÌ pokles poËtu tÏhotenstvÌ v†z·vislosti na stoupajÌcÌch hodnot·ch FSH.(212) TakÈ riziko p¯eruöenÌ cyklu pro nedostateËnou reakci stoupalo v z·vislosti na hladinÏ FSH, neprok·zal vöak jednoznaËnou z·vislost mezi vÏkem a rizikem p¯eruöenÌ cyklu. Tito auto¯i uzavÌrajÌ, ûe baz·lnÌ hladina FSH lÈpe koreluje s†reaktivitou na stimulaci neû vÏk. Navot(125) zavedl do praxe tzv. test ovari·lnÌ rezervy (ovarian challenge test). ProspektivnÏ hodnotil reaktivitu ovariÌ u 51 ûen staröÌch neû 35 let, kterÈ mÏly baz·lnÌ hladiny FSH v normÏ. Po pod·nÌ 100 mg klomifencitr·tu 5.ñ9. den menstruaËnÌho cyklu doölo u 18 z nich 10.ñ11. den cyklu ke zv˝öenÌ FSH na vÌce neû 26 mIU/ml (vÌc neû 2†SD). V†tÈto skupinÏ otÏhotnÏla pouze jedna pacientka ve srovn·nÌ se 14 tÏhotn˝mi z†33 ûen s†norm·lnÌmi hladinami FSH po stimulaci klomifencitr·tem. Tanbo(205) ve svÈ pr·ci potvrdil, ûe ªpoor responders´ s abnorm·lnÌ hodnotou FSH po stimulaci klomifencitr·tem majÌ malou nadÏji na dosaûenÌ tÏhotenstvÌ v†programu in vitro fertilizace ñ 4 % tÏhotenstvÌ u poor responders oproti 33†% u ûen s norm·lnÌ odpovÏdÌ. V dalöÌ pr·ci(207) dospÏl k†z·vÏru, ûe v˝sledky testu ovari·lnÌ rezervy majÌ vyööÌ predikËnÌ hodnotu neû vyöet¯enÌ baz·lnÌch hladin FSH. Loumaye navrhl pouûitÌ souËtu baz·lnÌch hodnot FSH a jejich hladiny 10.ñ11. den cyklu po stimulaci klomifencitr·tem.(94) Jako kritickou stanovil hodnotu FSH 26,03 mIU/ml. PoËet aspirovan˝ch folikul˘, zÌskan˝ch oocyt˘ a p¯en·öen˝ch embryÌ byl v pr˘mÏru 6x niûöÌ u ûen, kterÈ p¯ekroËily tuto hranici, oproti skupinÏ s†v˝sledky pod stanovenou hodnotou. Olivennes s ˙spÏchem pouûil test ovari·lnÌ rezervy s exogennÌm FSH.(133) Aplikoval 300 IU t¯etÌ den cyklu a sledoval hodnoty estradiolu a baz·lnÌ hladiny FSH p¯ed pod·nÌm exogennÌho FSH a hladinu estradiolu 24 h po pod·nÌ gonadotropinu. Baz·lnÌ hodnoty FSH vyööÌ neû 10 mIU/ml a†zv˝öenÌ estradiolu o mÈnÏ neû 30 pg/ml identifikovaly pacientky s mimo¯·dnÏ öpatnou prognÛzou. Sledov·nÌm predikËnÌho v˝znamu vzestupu 17β-estradiolu se zab˝vali i dalöÌ auto¯i, avöak vyuûili flare-up efektu po pod·nÌ analog GnRH. Padilla(136) nalezl ve svÈm souboru pouze 6 % tÏhotenstvÌ u†ûen s chybÏjÌcÌm vzestupem hladiny estradiolu v souvislosti s flare-up oproti 37 % tÏhotenstvÌ v p¯Ìpadech, kdy po pod·nÌ GnRH analog doölo k†vzestupu 17-βestradiolu. V˝znam sledov·nÌ tÏchto parametr˘ potvrdil i Winslow.(234) U ûen, u kter˝ch nedoölo k dvojn·sobnÈmu zv˝öenÌ hladiny estradiolu mezi 2. a 3. dnem cyklu po flare-up, nalezl v˝znamnÏ vysokÈ procento (39 %) p¯eruöen˝ch cykl˘ pro abnorm·lnÌ odpovÏÔ na stimulaci.


17

SkrytÈ (okultnÌ) ovari·lnÌ selh·nÌ St·rnutÌ je pouze jednÌm z proces˘, kterÈ redukujÌ poËet folikul˘ ñ d·le se mohou takÈ uplatÚovat chirurgickÈ v˝kony na ovariÌch, chemoterapie a†radioterapie. StejnÏ jako n·stup menopauzy je i†pokles fertility v z·vislosti na vÏku individu·lnÌ. Z v˝öe uvedenÈho vypl˝v·, ûe velmi citliv˝m ukazatelem stavu ovariÌ je hladina FSH. S klesajÌcÌ ovari·lnÌ funkcÌ stoup· hladina FSH,(90) z¯ejmÏ jako odraz klesajÌcÌ produkce inhibinu klesajÌcÌm poËtem gonadotropin-senzitivnÌch folikul˘.(23) Existuje p¯edpoklad, ûe hladina FSH je p¯Ìm˝ a†citlivÏjöÌ indik·tor stavu ovariÌ (ovarian age) neû biologick˝ vÏk. Cameron(23) popsal tzv. skrytÈ (okultnÌ) ovari·lnÌ selh·nÌ charakterizovanÈ tri·dou: sterilita, pravideln˝ menstruaËnÌ cyklus a†hypergonadotropnÌ stav. Ovari·lnÌ steroidogeneze je p¯itom zachov·na, z¯ejmÏ vöak jen za cenu zv˝öenÈ sekrece FSH. Hladina inhibinu u tÏchto ûen byla norm·lnÌ, coû podporuje domnÏnku, ûe tento stav zachycuje kompenzovanÈ ovari·lnÌ selh·nÌ. V pr·ci Tonera(212) byla ve vöech kategoriÌch baz·lnÌ hladina FSH lepöÌm ukazatelem v˝sledku IVF neû biologick˝ vÏk: v procentu p¯eruöen˝ch cykl˘, maxim·lnÌ dosaûenÈ hladinÏ estradiolu, poËtu aspirovan˝ch folikul˘, poËtu zÌskan˝ch i fertilizovan˝ch oocyt˘, v poËtu transferovan˝ch embryÌ i v poËtu dosaûen˝ch tÏhotenstvÌ. TakÈ Gindoff a Jewelewicz zjistili, ûe baz·lnÌ hladina FSH je nejsenzitivnÏjöÌm ukazatelem umoûÚujÌcÌm odhalit perimenopauz·lnÌ stav.(58) DoporuËujÌ za¯adit do programu IVF i ûeny staröÌ neû 40 let, je-li jejich hormon·lnÌ profil bez zn·mek klesajÌcÌ ovari·lnÌ funkce. Naproti tomu i u v˝raznÏ mladöÌch ûen lze oËek·vat velmi öpatnÈ v˝sledky p¯i zv˝öenÈ baz·lnÌ hladinÏ FSH a pomÏru FSH:LH > 1.(23,58) Ve skupinÏ 88 pacientek novÏ za¯azen˝ch do programu IVF nalezl Muasher ve 40 % pomÏr FSH:LH = 1:1 (p¯i hladinÏ obou pod 10†mIU/ml), 34 % mÏlo vyööÌ hladinu LH neû FSH a u 26 % byl pomÏr FSH:LH > 1.(119) Tato situace je tedy u pacientek v†programu IVF relativnÏ Ëast·. Hladina FSH stoup· ve druhÈ polovinÏ lute·lnÌ f·ze a kles· ve druhÈ polovinÏ folikul·rnÌ f·ze jako n·sledek modulaËnÌho efektu 17β-estradiolu, inhibinu a pravdÏpodobnÏ i dalöÌch gonad·lnÌch hormon˘ na hypotalamo-hypof˝zo-ovari·lnÌ osu. Je z¯ejmÈ, ûe rovnov·ha mezi produkcÌ ovari·lnÌch steroid˘ a sekrecÌ gonadotropin˘ odr·ûÌ schopnost ovaria odpovÌdat na stimulaci a nep¯Ìmo reprodukËnÌ potenci·l pacientky. Rovnov·ûn˝ stav mezi stimulaËnÌmi a supresÌvnÌmi vlivy na hladinu FSH t¯etÌ den menstruaËnÌho cyklu urËuje optim·lnÌ Ëasov·nÌ vyöet¯enÌ FSH, kterÈ zde odr·ûÌ reprodukËnÌ potenci·l.(164) P¯i jednou zachycenÈ zv˝öenÈ baz·lnÌ hladinÏ FSH jsou v˝sledky IVF öpatnÈ i v p¯ÌpadÏ jejÌ pozdÏjöÌ normalizace.(163) Tato variabilita je patrnÏ odrazem intermitentnÌho ovari·lnÌho selh·v·nÌ v perime-

18


nopauze.(173) Lze p¯edpokl·dat, ûe zb˝vajÌcÌ oocyty jsou za tÈto situace jiû nekvalitnÌ i†v†endokrinologicky norm·lnÌch cyklech.

2.2.1. Soubory a metodika Hodnotili jsme reakci na ovari·lnÌ stimulaci (a zejmÈna poËet p¯eruöen˝ch cykl˘ pro nedostateËnou odpovÏÔ) u 697 ûen za¯azen˝ch do IVF programu bez p¯edchozÌ aplikace jak˝chkoli selektivnÌch kritÈriÌ. U 35 ûen, jejichû cyklus byl pro nedostateËnou reakci p¯eruöen, jsme za dva mÏsÌce vyöet¯ili baz·lnÌ hladiny FSH se z¯etelem na tzv. skrytÈ (okultnÌ) ovari·lnÌ selh·nÌ. N·slednÏ jsme p¯ed za¯azenÌm do programu IVF vyöet¯ili 41 ûen testem ovari·lnÌ rezervy (stanovenÌ baz·lnÌch hladin gonadotropin˘ t¯etÌ den menstruaËnÌho cyklu a jejich opakovanÈ zhodnocenÌ po pÏtidennÌm pod·nÌ 100 mg klomifencitr·tu spolu se stanovenÌm hladin 17β-estradiolu). Za t¯i mÏsÌce po provedenÌ tohoto testu byly pacientky stimulov·ny v†lÈËebnÈm IVF cyklu kombinovan˝m pod·nÌm klomifencitr·tu a hMG v†obvykl˝ch schÈmatech. Podle odpovÏdi na stimulaci hodnocenou maxim·lnÌ dosaûenou hladinou 17β-estradiolu byly pacientky rozdÏleny do Ëty¯ skupin (1.†p¯eruöenÈ cykly pro nedostateËnou odpovÏÔ u ûen, kde se nejednalo o†POF, 2. estradiol < 1200 pg/ml (ªlow responders´), 3. estradiol >†1200†pg/ml, 4. skrytÈ ovari·lnÌ selh·nÌ a†reakce na stimulaci byla korelov·na s jednotliv˝mi parametry testu ovari·lnÌ rezervy. Sledov·nÌ hladin LH jsme v souhlase s literaturou vy¯adili a hodnotili pouze hladiny FSH p¯ed stimulacÌ a po nÌ klomifencitr·tem a 17β-estradiolem. StatistickÈ hodnocenÌ bylo pro p¯ehlednost a†grafickou zn·zornitelnost provedeno testem 95% spolehlivosti (ËÌm vÌce dysjunktnÌ jsou zn·zornÏnÈ intervaly, tÌm vÏtöÌ je v˝znamnost testovanÈ hypotÈzy). PlazmatickÈ hladiny estradiolu a progesteronu byly mÏ¯eny pomocÌ RIA (Amersham).

POF

norma

Graf 6. Výskyt skrytého ovariálního selhání (POF) u žen s přerušenými IVF cykly


19

2.2.2. V˝sledky V˝skyt skrytÈho ovari·lnÌho selh·nÌ v neselektovanÈm souboru pacientek, v nÏmû byla ovari·lnÌ stimulace p¯eruöena pro neadekv·tnÌ reakci, ukazuje graf 6. Z 35 vyöet¯en˝ch ûen splnilo 18 pacientek (51,4 %) kritÈria pro za¯azenÌ do souboru s okultnÌm ovari·lnÌm selh·nÌm. P¯i sledov·nÌ vÏku pacientek (graf 7) bylo z 18 pacientek 14 ve vÏkovÈ skupinÏ > 35 let.

poèet pacientek 10 9 8

8

7 6 5 4

5 4

3 2 1

1

0 28–30

31–33

34–36

37–39

věk

> 40

Graf 7. Skryté ovariální selhání v jednotlivých věkových kategoriích

50

40

30

20

10

0 přerušené cykly

nízká reakce

Graf 8. Predikční hodnota bazální hladiny FSH

dobrá reakce

skryté ovariální selhání

20


Vzhledem k relativnÏ ËastÈmu v˝skytu skrytÈho ovari·lnÌho selh·nÌ v†IVF populaci vystupuje do pop¯edÌ ot·zka vËasnÈ detekce. Naöe zkuöenosti s†pouûitÌm testu ovari·lnÌ rezervy podle Navota zachycujÌ grafy 8, 9 a 10 posuzujÌcÌ prediktivnÌ hodnotu jednotliv˝ch sledovan˝ch parametr˘ na reakci pacientky na ovari·lnÌ stimulaci. Ve v˝sledcÌch jasnÏ vystupuje skupina ûen se skryt˝m ovari·lnÌm selh·nÌm, baz·lnÌ hladiny FSH hodnocenÈ t¯etÌ den menstruaËnÌho cyklu se navÌc liöÌ u ûen s dobrou odpovÏdÌ na stimulaci a u pacientek s p¯eruöen˝mi cykly pro neadekv·tnÌ reakci. Z literatury i naöich v˝sledk˘ vypl˝v·, ûe sledov·nÌ baz·lnÌ hladiny FSH umoûÚuje vËasn˝ z·chyt ûen se skryt˝m ovari·lnÌm se40

30

20

10

0 přerušené cykly

nízká reakce

dobrá reakce

skryté ovariální selhání

Graf 9. Predikční hodnota FSH po stimulaci klomifencitrátem (x 100) 11

8

5

2

-1

-4 0 přerušené cykly

1 xnízká reakce

2 dobrá reakce

3 skryté ovariální selhání

Graf 10. Predikční hodnota 17-β – estradiolu po stimulaci klomifencitrátem


21

lh·nÌm. Toto vyöet¯enÌ by mÏlo pat¯it mezi z·kladnÌ vyöet¯enÌ p¯edevöÌm u pacientek staröÌch 35 let.

2.3. Ovari·lnÌ stimulace ûen nedostateËnÏ reagujÌcÌch na†obvyklÈ stimulaËnÌ protokoly (ªpoor responders´) AËkoli prvnÌ ˙spÏönÈ tÏhotenstvÌ po IVF bylo dosaûeno ve spont·nnÌm nestimulovanÈm cyklu,(198) v˝hody ovari·lnÌ stimulace jsou dnes neoddiskutovatelnÈ. VyööÌ poËet zÌskan˝ch oocyt˘ d·v· moûnost v˝bÏru nejkvalitnÏjöÌch embryÌ pro embryotransfer, transfer 2ñ4 embryÌ zvyöuje nadÏji na dosaûenÌ tÏhotenstvÌ a kryokonzervace ªnadpoËetn˝ch´ embryÌ d·le zvyöuje efektivitu IVF. S nedostateËnou reakcÌ na ovari·lnÌ stimulaci se setk·v·me p¯edevöÌm u staröÌch ûen a p¯edstavuje nejËastÏjöÌ p¯ÌËinu p¯eruöenÌ lÈËebnÈho IVF cyklu p¯ed provedenÌm punkce folikul˘. Definice nedostateËnÈ reakce nenÌ v†literatu¯e jednotn·,(35,71,120,206) nejËastÏji se zmiÚuje hladina estradiolu < 300 pg/ml a mÈnÏ neû t¯i folikuly > 15 mm p¯ed aplikacÌ hCG. Stimulace ªlow responders´ pat¯Ì k jednÈ z nejproblematiËtÏjöÌch oblastÌ asistovanÈ reprodukce. ProstÈ zv˝öenÌ d·vky gonadotropin˘ nevede automaticky k vyööÌ ovari·lnÌ odpovÏdi, nap¯. Ben-Rafael(11) nalezl vyööÌ poËet zÌskan˝ch oocyt˘ po aplikaci 150 IU hMG dennÏ oproti 225 IU. K†podobn˝m v˝sledk˘m dospÏl i Benadiva.(12) JinÌ auto¯i vöak s ˙spÏchem v†tÈto problematickÈ skupinÏ pacientek pouûili suprafyziologickÈ d·vky gonadotropin˘. Po zv˝öenÌ d·vky hMG ze 300 IU na 450 IU prok·zal Hofmann signifikantnÏ niûöÌ procento p¯eruöen˝ch cykl˘ a vyööÌ procento tÏhotenstvÌ.(71) ZavedenÌ analog GnRH do stimulaËnÌch protokol˘ vöeobecnÏ snÌûilo procento p¯eruöen˝ch cykl˘ a zv˝öilo kvalitu a poËet zÌskan˝ch oocyt˘.(153) Ve skupinÏ normogonadotropnÌch ªpoor responders´ prok·zal efektivitu agonist˘ GnRH Serafini.(168) JinÌ auto¯i vöak varujÌ p¯ed nadmÏrnou supresÌ (oversupression) zp˘sobenou protokoly vyuûÌvajÌcÌmi down regulaci s n·sledn˝m zhoröenÌm odpovÏdi na stimulaci.(40,120) Naopak v˝znamnÏ se uplatÚuje stimulace vyuûÌvajÌcÌ inici·lnÌ flare-up efekt analog. Tak nap¯. Muasher popsal pouze 5 % p¯eruöen˝ch cykl˘ a†21,3 % tÏhotenstvÌ po stimulaci poor-responders s vyuûitÌm flare-up efektu agonist˘ GnRH.(120) Pro tuto problematickou skupinu ûen bylo navrûeno i souËasnÈ pouûitÌ (co-treatment) r˘stovÈho hormonu, ˙dajnÏ zlepöujÌcÌ kvalitu ovari·lnÌ stimulace poor responders. N·slednÏ provedenÈ randomizovanÈ, dvojitÏ slepÈ a placebem kontrolovanÈ studie neprok·zaly û·dn˝ pozitivnÌ efekt tÈto finanËnÏ mimo¯·dnÏ n·roËnÈ stimulace.(13,73)

22


2.4. Asistovan˝ hatching Abnorm·lnÌ pr˘bÏh Ëi nemoûnost opuötÏnÌ zona pellucida embryem (hatching) jsou povaûov·ny za jedny z moûn˝ch p¯ÌËin relativnÏ st·le nÌzkÈ implantace po IVF.(24) Tento stav m˘ûe b˝t podmÌnÏn abnorm·lnÌ konzistencÌ zÛny (zona hardening) vzniklÈ p¯i kultivaci(47) nebo jejÌm ztluötÏnÌm vznikl˝m bÏhem folikulogeneze nebo na z·kladÏ embryon·lnÌch Ëi dÏloûnÌch faktor˘. Cohen publikoval ˙daje o vlivu tlouöùky a charakteru zona pellucida na pravdÏpodobnost implantace, kter· byla 10 % u homogennÌch zÛn oproti 29 % u embryÌ s tenk˝mi Ëi nepravideln˝mi zÛnami.(25) TakÈ vyööÌ procento implantovan˝ch embryÌ po mikromanipulacÌch v oblasti zona pellucida v p¯Ìpadech andrologickÈ sterility podporuje tuto teorii.(236) Byly proto navrûeny postupy k naruöenÌ integrity zona pellucida (asistovan˝ hatching), kterÈ majÌ embryu usnadnit opuötÏnÌ zÛny a n·slednou implantaci. Cohen sv˝mi v˝sledky dokazuje v˝znam asistovanÈho hatchingu p¯edevöÌm u ûen staröÌch > 39 let (implantace 16 % vers. 3†%) a u ûen se zv˝öen˝mi baz·lnÌmi hladinami FSH (26 % vers. 10,5†%). Schoolcraft(162) a†Stein(191) prok·zali signifikantnÏ lepöÌ v˝sledky u ûen > 39 let s opakovan˝m selh·nÌm implantace. Obruca(129) pouûÌval pro asistovan˝ hatching laser a srovn·val 129 ûen s opakovan˝m selh·nÌm implantace, u jejichû embryÌ byl proveden hatching, se 167 kontrolami. Procento implantace (implantation rate) bylo 14,4†% po asistovanÈm hatchingu oproti 6†% v†kontrolnÌm souboru a procento tÏhotentvÌ 40 % vers. 16,2 %. Ne vöichni auto¯i vöak jednoznaËnÏ prokazujÌ pozitivnÌ efekt asistovanÈho hatchingu. Hellebaut(69) ve svÈ prospektivnÌ randomizovanÈ studii neprok·zal efekt asistovanÈho hatchingu: procento implantace bylo 17, 9 % ve sledovanÈ skupinÏ oproti 17,1 % v kontrolnÌ skupinÏ. é·dn˝ rozdÌl nenaöla ani Mandelbaumov·.(99) V souËasnÈ dobÏ je z¯ejm· pot¯eba experiment·lnÌch studiÌ k objasnÏnÌ mechanism˘ a procesu hatchingu, kterÈ teprve p¯inesou racion·lnÌ p¯Ìstup k tÈto problematice. Nelze uËinit û·dnÈ definitivnÌ z·vÏry bez velk˝ch klinick˝ch randomizovan˝ch studiÌ, kterÈ se vyj·d¯Ì ke skuteËnÈ efektivitÏ a indikacÌm tÈto metody.

2.4.1. Soubory a metodika P¯Ìnos asistovanÈho hatchingu byl hodnocen na skupinÏ 192 pacientek, u†nichû byla mechanicky (pomocÌ dvou mikropipet) poruöena integrita zona pellucida. NaruöenÌ zona pellucida prov·dÌme na naöem standardnÌm mikromanipulaËnÌm za¯ÌzenÌ (inverznÌ mikro-


23

skop Olympus s Hoffmanov˝m modulaËnÌm kontrastem a vyh¯Ìvan˝m stolkem, hydraulickÈ mikromanipul·tory Narishige). Pipety, jak fixaËnÌ (holding), tak i operaËnÌ, nepouûÌv·me komerËnÌ, ale vlastnÌ v˝roby. Otvor v zona pellucida vytvo¯Ìme po p¯ichycenÌ embrya fixaËnÌ mikropipetou pr˘nikem operaËnÌ mikropipety zÛnou bez poruöenÌ blastomer a potÈ mechanicky kontaktem s fixaËnÌ pipetou. Ve sledovanÈm souboru bylo 79 ûen ve vÏku ≤ 34 let a 113 pacientek ve vÏkovÈ skupinÏ ≥ 35 let. Asistovan˝ hatching byl prov·dÏn 48 h po odbÏru oocyt˘ nejËastÏji na Ëty¯bunÏËn˝ch embryÌch. Jako kontrolnÌ skupina slouûilo 1493 ûen, u kter˝ch byl proveden p¯enos embryÌ bez p¯edchozÌ mikromanipulace (asistovanÈho hatchingu). V kontrolnÌm souboru bylo 1072 ûen ve vÏkovÈ skupinÏ ≤ 34 let a 421 ûen ≥ 35 let.

2.4.2. V˝sledky Z v˝sledk˘ 1493 embryotransfer˘ bez asistovanÈho hatchingu uveden˝ch v tab. 1 jednoznaËnÏ vypl˝v· vliv vÏku na v˝sledky IVF, kdy ve skupinÏ ûen ≥ 35 let lze prok·zat signifikantnÌ pokles efektivity terapie oproti ûen·m mladöÌm (16,6 % vers. 27,2 %). P¯Ìnos asistovanÈho hatchingu se projevil v celÈm souboru pacientek ñ u skupiny ûen ve vÏku ≤ 34 let vzrostla efektivita z 27 % na 38 %, u†pacientek ve vÏku ≥ 35 let z 16,6 % na 20,3 % (tab. 2). Tab. 1. Vliv věku na efektivitu IVF ve standardním IVF cyklu (bez asistovaného hatchingu) Věk

Počet cyklů s transferem

≤ 34

1072

292

(27,2)

≥ 35

421

70

(16,6)

Obr. 1. Asistovaný hatching (1. fáze)

Těhotenství (%)

24


Tab. 2. Vliv asistovaného hatchingu na výsledky IVF v závislosti na věku Věk

Počet cyklů s transferem

≤ 34 ≥ 35

79 113

Těhotenství (%) 30 23

(38,0) (20,3)

UvedenÈ v˝sledky jednoznaËnÏ dokazujÌ, ûe patologickÈ n·lezy zona pellucida (zona thickening, zona hardening) u embryÌ po IVF jsou jednou z†p¯ÌËin ne st·le jeötÏ zcela uspokojiv˝ch v˝sledk˘. NaruöenÌ integrity zona pellucida, kterÈ vytv·¯Ì embryu podmÌnky pro pozdÏjöÌ ˙spÏön˝ hatching, zlepöuje v˝sledky IVF ve vöech vÏkov˝ch skupin·ch a ne pouze u ûen staröÌch, jak se p˘vodnÏ p¯edpokl·dalo. Je vöak jednÌm z n·stroj˘, jak zv˝öit efektivitu IVF v tÈto obzvl·ötÏ z·vaûnÈ skupinÏ pacientek.

Obr. 2. Spontánní hatching blastocysty

Obr. 3. Asistovaný hatching (2. fáze)


25

2.5. Strategie p¯i p¯enosu embryÌ PoËet p¯en·öen˝ch embryÌ p¯edstavuje st·le diskutovanÈ tÈma. Se zvyöujÌcÌm se poËtem p¯en·öen˝ch embryÌ se do urËitÈ mÌry zvyöuje pravdÏpodobnost dosaûenÌ tÏhotenstvÌ,(42,128,187) souËasnÏ se vöak zvyöuje riziko dvou- a vÌceËetnÈho tÏhotenstvÌ.(187) ZejmÈna v˝skyt troj- a vÌceËetn˝ch tÏhotenstvÌ je neû·doucÌ se z¯etelem na alarmujÌcÌ perinat·lnÌ v˝stupy a soci·lnÌ a†zdravotnÌ rizika pro matku i dÏti.(166) NÏkte¯Ì auto¯i proto doporuËujÌ p¯en·öet pouze dvÏ embrya, a tak eliminovat riziko vzniku troj- a vÌceËetnÈho tÏhotenstvÌ.(128,188,223) AËkoli tento postup signifikantnÏ neovlivnil v˝sledky, ve dvou ze t¯Ì uveden˝ch studiÌ auto¯i uplatÚovali vÏkov˝ limit. Staessen(188) p¯en·öel dvÏ embrya pouze tehdy, jednalo-li se o prvnÌ IVF cyklus u ûeny mladöÌ neû 37 let a obÏ embrya byla posouzena jako velmi kvalitnÌ. VauthierñBrouzes(223) aplikoval jako jedno z limitujÌcÌch kritÈriÌ vÏk maxim·lnÏ 35 let. Nijs(128) se sice ve svÈ pr·ci o vÏkovÈm limitu nezmiÚuje, z jeho dalöÌ pr·ce vöak vypl˝v·, ûe i on uzn·v· maxim·lnÌ vÏkovou hranici pro uveden˝ postup 35 let. Poûadavek snÌûenÌ poËtu p¯en·öen˝ch embryÌ je tedy nepochybnÏ opr·vnÏn˝, nelze vöak pominout niûöÌ procento ˙spÏönÈ implantace u staröÌch ûen. VÏk proto p¯edstavuje jedno ze z·vaûn˝ch kritÈriÌ p¯i rozhodov·nÌ o poËtu p¯en·öen˝ch embryÌ.

2.5.1. Soubory a metodika P¯i hodnocenÌ vlivu poËtu p¯en·öen˝ch embryÌ na riziko vÌceËetnÈ implantace jsme se vr·tili k rozboru IVF cykl˘ z obdobÌ p¯ed rokem 1992, kdy se p¯en·öela prakticky vöechna zÌskan· embrya. Sledovali jsme v˝skyt vÌceËetnÈ implantace ve 406 IVF cyklech po p¯enosu 1ñ6 embryÌ. PravdÏpodobnost dosaûenÌ tÏhotenstvÌ v z·vislosti na poËtu p¯en·öen˝ch embryÌ jsme sledovali ve 435 IVF cyklech proveden˝ch po roce 1992, odkdy doölo k omezenÌ maxim·lnÌho poËtu p¯en·öen˝ch embryÌ na Ëty¯i. OdpovÏÔ na ot·zku, zda selekce embryÌ ovlivÚuje efektivitu, d·v· rozbor 126 cykl˘ s p¯enosem Ëty¯ vybran˝ch embryÌ (po selekci nejkvalitnÏjöÌch embryÌ zbyla jeötÏ embrya pro kryokonzervaci) a 103 cykl˘ s transferem vöech Ëty¯ zÌskan˝ch embryÌ bez moûnosti selekce. V souvislosti s vÏkem jsme sledovali ˙spÏönost IVF po p¯enosu Ëty¯ embryÌ u ûen staröÌch neû 36 let.

26


2.5.2. V˝sledky Rozbor v˝sledk˘ IVF v z·vislosti na poËtu p¯en·öen˝ch embryÌ potvrzuje zn·mou skuteËnost, ûe s poËtem p¯enesen˝ch embryÌ se zvyöuje pravdÏpodobnost dosaûenÌ tÏhotenstvÌ. Od urËitÈho poËtu (Ëty¯) embryÌ se vöak jiû efektivita IVF nezvyöuje a pouze vzr˘st· riziko vysoce mnohoËetnÈho tÏhotenstvÌ. Tuto skuteËnost jednoznaËnÏ demonstrujÌ tab. 3 a 4. Tab. 3. Pravděpodobnost vícečetné implantace v závislosti na počtu přenášených embryí Počet embryí při přenosu 1

Počet cyklů 111

Vícečetná implantace (%) –

2 3 4

101 94 49

1 7 6

(10,0) (38,9) (46,2)

5 6

29 22

4 4

(36,4) (44,4)

Tab. 4. Pravděpodobnost dosažení těhotenství v závislosti na počtu přenášených embryí Počet embryí při ET 1 2 3 4 celkem

Počet cyklů 65 71

Klinická těhotenství 7 11

% 10,8 15,5

70 229 435

19 67 104

27,1 29,3 23,9

V˝öe uvedenÈ v˝sledky nejsou z·sadnÏ ovlivnÏny skuteËnostÌ, zda se jednalo o selektivnÌ (vybran· Ëty¯i nejkvalitnÏjöÌ embrya z†vÏtöÌho poËtu) nebo elektivnÌ (transfer vöech Ëty¯ embryÌ, kter· po IVF vznikla) embryotransfer (tab. 5). Tab. 5. Pravděpodobnost dosažení těhotenství při selektivním a elektivním přenosu čtyř embryí Počet cyklů Klinické těhotenství (%)

Čtyři embrya + kryo 126 39 (30,7)

Čtyři embrya 103 28 (27,2)

Jak vypl˝v· z n·sledujÌcÌ tabulky (tab. 6), v˝sledky mnohem vÌce ovlivÚuje vÏk pacientky. Po p¯enosu Ëty¯ embryÌ u ûen staröÌch 36 let bylo dosaûeno tÏhotenstvÌ pouze v 16,6 %, oproti 30,7 %, resp. 27,2 % v†celÈm souboru.


27

Tab. 6. Pravděpodobnost dosažení těhotenství po přenosu čtyř embryí u žen starších 36 let Počet cyklů 42

Klinická těhotenství (%) 7

(16,6)

Je z¯ejmÈ, ûe jedinou moûnostÌ omezenÌ poËtu vÌceËetn˝ch tÏhotenstvÌ (jako komplikace asistovanÈ reprodukce s bezprost¯ednÌm dopadem na perinat·lnÌ v˝sledky) je snÌûenÌ poËtu transferovan˝ch embryÌ. Z v˝öe uv·dÏn˝ch v˝sledk˘ vypl˝v·, ûe je moûnÈ snÌûenÌ maxim·lnÌho poËtu p¯en·öen˝ch embryÌ ze Ëty¯ na t¯i, aniû dojde ke snÌûenÌ efektivity IVF. Tento p¯Ìstup by se vöak nemÏl uplatÚovat ploönÏ u vöech ûen a mÏl by zohledÚovat niûöÌ fertilitu staröÌch ûen, u nichû jsou v˝sledky IVF signifikantnÏ niûöÌ, stejnÏ jako riziko vÌceËetnÈ implantace.

2.6. D·rcovstvÌ oocyt˘ Lutjen(95) jako prvnÌ popsal tÏhotenstvÌ po p¯enosu embrya po fertilizaci darovanÈho oocytu a p¯edpovÏdÏl rozvoj tohoto postupu p¯i terapii ûen s†prim·rnÌm ovari·lnÌm selh·nÌm. Postupem Ëasu byla indikace rozöÌ¯ena i†na p¯Ìpady ûen nereagujÌcÌch adekv·tnÏ na obvyklÈ stimulaËnÌ protokoly a u jeötÏ menstruujÌcÌch ûen staröÌch neû 40 let.(169) Byly publikov·ny dokonce p¯Ìpady ˙spÏönÈ aplikace tohoto postupu u menopauz·lnÌch ûen.(9,160) O etick˝ch aspektech tohoto nepochybnÏ kontroverznÌho postupu diskutovali mj. i†Edwards(44) a†Antinori.(8) D·rcovstvÌ oocyt˘ p¯edstavuje rozöÌ¯enÌ terapeutick˝ch moûnostÌ v souvislosti se snÌûenou fertilitou staröÌch ûen, p¯edstavuje vöak naprosto samostatnou a svÈbytnou problematiku.

2.7. Z·vÏry l

VÏk je jednÌm z nejz·vaûnÏjöÌch faktor˘ ovlivÚujÌcÌch v˝sledky lÈËby sterility metodami asistovanÈ reprodukce. SniûujÌcÌ se ovari·lnÌ rezerva m· za n·sledek nedostateËnou odpovÏÔ na exogennÌ stimulaci gonadotropiny. I p¯es selekci nejkvalitnÏjöÌch embryÌ pro transfer do dÏlohy je z¯ejmÏ kombinace oocyt·rnÌho a uterinnÌho faktoru p¯ÌËinou poklesu efektivity terapie jiû u ûen ≥ 36 let a tento pokles se d·le zv˝razÚuje u†ûen ≥ 38 let.

28 l

l

l


SkrytÈ ovari·lnÌ selh·nÌ je Ëastou p¯ÌËinou nedostateËnÈ reakce na ovari·lnÌ stimulaci u ûen v programu IVF. Vyöet¯enÌ baz·lnÌ hladiny FSH (3.†den menstruaËnÌho cyklu) pat¯Ì mezi z·kladnÌ vyöet¯enÌ p¯ed za¯azenÌm do programu IVF, p¯edevöÌm u ûen ≥ 35 let. Jedin˝m racion·lnÌm postupem p¯i hypergonadotropnÌm stavu je terapie pomocÌ darovan˝ch oocyt˘. Asistovan˝ hatching zvyöuje ˙spÏönost IVF u ûen ve vöech vÏkov˝ch kategoriÌch. PatologickÈ stavy v oblasti zona pellucida jsou Ëastou p¯ÌËinou selh·nÌ implantace embryÌ v programu IVF. Efektivita naöich postup˘ umoûÚuje snÌûit maxim·lnÌ poËet p¯en·öen˝ch embryÌ ze Ëty¯ na t¯i, aniû dojde ke snÌûenÌ efektivity lÈËby. Tento p¯Ìstup by vöak mÏl b˝t aplikov·n selektivnÏ, ve vÏkovÈ skupinÏ ûen ≥ 36 let je riziko vÌceËetnÈ implantace malÈ.

29

3. VLIV OVARI¡LNÕ STIMULACE NA†V›SLEDKY IVF

Hormon·lnÌ prepar·ty pro vyvol·nÌ ovulace u pacientek neovulujÌcÌch nebo u ûen s oligo- aû amenoreou se v klinickÈ praxi pouûÌvajÌ jiû vÌce neû 30 let. S n·stupem mimotÏlnÌho oplodnÏnÌ zaËaly b˝t tyto prepar·ty pouûÌv·ny i†u pravidelnÏ ovulujÌcÌch ûen s norm·lnÌm menstruaËnÌm cyklem.(49) Tento postup umoûnil mnohem snazöÌ monitorov·nÌ sekrece LH, vÏtöÌ poËet p¯en·öen˝ch embryÌ zv˝öil pravdÏpodobnost dosaûenÌ tÏhotenstvÌ a†s†rozvojem kryokonzervace v˝raznÏ vzrostl i†poËet tÏhotenstvÌ dosaûen˝ch na punkci folikul˘. Pro ovari·lnÌ stimulaci se p˘vodnÏ nejËastÏji aplikoval klomifencitr·t v†kombinaci s hMG nebo hMG samotn˝. V˝znamn˝ p¯Ìnos pro asistovanou reprodukci znamenalo zavedenÌ stimulaËnÌch protokol˘ vyuûÌvajÌcÌch flare-up efekt Ëi desenzitizaci a down-regulaci navozenÈ p˘sobenÌm analog GnRH.(51,145,171) Protokoly p˘vodnÏ vypracovanÈ pro stimulaci ªpoor responders´ Ëi ûen s opakovanÏ p¯edËasnou sekrecÌ LH se uk·zaly natolik efektivnÌ,(96,97) ûe dnes p¯edstavujÌ metodu volby p¯i hormon·lnÌ p¯ÌpravÏ p¯ed terapiÌ metodami asistovanÈ reprodukce. Stimulace kombinacÌ klomifencitr·tu a hMG znamenala ve svÈ dobÏ znaËn˝ p¯Ìnos,(146) postupnÏ se vöak zaËaly mnoûit pr·ce poukazujÌcÌ na negativnÌ antiestrogennÌ vliv klomifencitr·tu.(34,110,161,239) Tomuto p˘sobenÌ nutno p¯iËÌtat i n·mi nalezenÈ vysokÈ procento p¯eruöen˝ch IVF cykl˘, znaËn˝ poËet mimodÏloûnÌch tÏhotenstvÌ i†vyööÌ ˙spÏönost p¯i pouûitÌ stimulaËnÌch protokol˘ vyuûÌvajÌcÌch analoga GnRH. Ke stejn˝m z·vÏr˘m doöel i Abdalla, kter˝ po stimulaci CC/hMG popsal ˙spÏönost 11,9 % a†7,1†% tÏhotenstvÌ ukonËen˝ch porodem, zatÌmco po stimulaci analogy GnRH a†hMG v kr·tkÈm protokolu dos·hl 24,4 % tÏhotenstvÌ a 17,4 % gravidit ukonËen˝ch porodem.(2) Z·sadnÌ zmÏnu nep¯inesla ani stimulace samotn˝mi menopauz·lnÌmi gonadotropiny(57,154) Ëi samotn˝m FSH.(125,156) O tom, ûe p¯i tÈto stimulaci je nejhoröÌ kontrola sekrece LH, svÏdËÌ nejen naöe v˝sledky s extrÈmnÏ vysok˝m procentem tÏhotenstvÌ ukonËen˝ch potratem, ale nap¯. i pr·ce Dora.(37) P¯edËasnou luteinizaci nalezl v†9,4 % cykl˘ stimulovan˝ch kombinacÌ CC/hMG, ve 13,7 % cykl˘ stimulovan˝ch samotn˝m hMG a pouze ve 3,6†% cykl˘ po stimulaci analogy GnRH a†hMG.

30


KvalitativnÌ zmÏnu do ovari·lnÌ stimulace p¯inesla analoga GnRH, p¯iËemû mÌra kontroly sekrece LH urËuje efektivitu stimulaËnÌho protokolu. Naöe v˝sledky, jednoznaËnÏ prokazujÌcÌ p¯evahu tzv. ªdlouhÈho´ stimulaËnÌho protokolu nad ªkr·tk˝m´ protokolem, jsou v souhlase s n·lezy ostatnÌch autor˘. Tak nap¯. Tarlatzis dos·hl tÏhotenstvÌ v 19,4 % po stimulaci GnRH v kr·tkÈm protokolu oproti 25, 8 % p¯i dlouhÈm protokolu,(208) Antoine(10) uve¯ejnil tÈmÏ¯ identick· ËÌsla (19,3 % vers. 25,3 %), stejnÏ jako Tan.(203) JednoznaËn˝m pr˘kazem efektivity tÏchto stimulaËnÌch protokol˘ je metaanalytick· studie Hughese, kter˝ uv·dÌ signifikantnÏ vyööÌ poËet klinick˝ch tÏhotenstvÌ dosaûen˝ch na stimulovan˝ cyklus i embryotransfer a†naopak signifikantnÏ niûöÌ procento p¯eruöen˝ch cykl˘.(72) Nev˝hodou stimulace s analogy GnRH je ËastÏjöÌ v˝skyt z·vaûnÈho hyperstimulaËnÌho syndromu. N·mi uv·dÏn· ËÌsla zcela souhlasÌ s v˝skytem popsan˝m v literatu¯e.(52,118) Zd· se, ûe analoga GnRH zvyöujÌ riziko hyperstimulaËnÌho syndromu mimo jinÈ i sv˝m p¯Ìm˝m p˘sobenÌm na buÚky granulÛzy.(118) Za optim·lnÌ stimulaËnÌ protokol budoucnosti vedoucÌ k dalöÌmu zefektivnÏnÌ mimotÏlnÌho oplodnÏnÌ lze z¯ejmÏ povaûovat aplikaci gonadotropin˘ novÈ generace (vysoce ËiötÏn˝ extrakËnÌ FSH ñMetrodin†HP a rekombinantnÌ FSH ñ Gonal-F, Puregon) a jejich kombinacÌ s†antagonisty GnRH kontrolujÌcÌch sekreci LH. PrvnÌ zkuöenosti s†antagonisty tzv. t¯etÌ generace (Cetrorelix, Ganirelix) jiû byly uve¯ejnÏny.(36,56,132)

3.1. Soubory a metodika SledovanÈ soubory zahrnujÌ pacientky stimulovanÈ kombinacÌ klomifencitr·tu a hMG, samotn˝mi hum·nnÌmi gonadotropiny, analogy GnRH a†hMG/FSH v tzv. ªkr·tkÈm´ protokolu a analogy GnRH a†hMG/FSH v†ªdlouhÈm´ protokolu. Klomifencitr·t (Gravosan) byl aplikov·n v dennÌ d·vce 100ñ150†mg (v†z·vislosti na hmotnosti pacientky) od 3. do 7. dne cyklu, od 6. dne bylo zapoËato s†aplikacÌ hMG (150 IU dennÏ) aû do dosaûenÌ adekv·tnÌ odpovÏdi, kdy byl aplikov·n hCG (Praedyn, Pregnyl) v†d·vce 10†000 j. i.m. P¯i stimulaci samotn˝mi gonadotropiny (Pergonal, Metrodin, Pergogreen, Humegon, Menogon) byla zapoËata stimulace 3. den cyklu a 150ñ225 IU†hMG aplikov·no aû do dne, kdy dominantnÌ folikul dos·hl velikosti 18 mm a byl aplikov·n hCG. P¯i stimulaci analogy GnRH a hMG/FSH v kr·tkÈm protokolu byla analoga GnRH (Suprefact nasal spray 800 μg dennÏ) pod·v·na od 2. dne menstruaËnÌho cyklu aû do aplikace hCG. Od 3. dne menstruaËnÌho cyklu byl p¯id·n hMG/FSH v d·vce 150ñ225 IU dennÏ. ªDlouh˝´

Vliv ovari·lnÌ stimulace na†v˝sledky IVF

31

protokol zaËÌn·me pod·nÌm depotnÌho analoga GnRH (Decapeptyl depot 3,75 mg) na zaË·tku menstruaËnÌho cyklu a po dosaûenÌ down regulace (za 14ñ21 dn˘) zaËÌn·me s vlastnÌ stimulacÌ hMG/FSH.

3.2. V˝sledky Tab. 7 srovn·v· v˝sledky IVF u 246 ûen stimulovan˝ch kombinacÌ CC-hMG se 142 cykly ûen, kterÈ nereagovaly adekv·tnÏ na stimuTab. 7. Výsledky IVF po stimulaci CC-hMG ve srovnání se stimulací GnRH analogy a hMG (krátký protokol) u low responders Stimulace

CC-hMG

GnRH-a + hMG

Počet cyklů Přerušené cykly (%)

246 61 (24,8)

142 23 (16,2)

Počet oocytů/pac. Počet transferů (%) Fertilizace % Těhotenství/ET %

5,6 158 (86,3) 58,2 25,9

5,1 94 (81,0) 63,1 22,3

laci CC-hMG a†byly proto stimulov·ny analogy GnRH a hMG v ªkr·tkÈm´ protokolu. NejlepöÌ kontrolu nad stimulovan˝m cyklem poskytuje stimulace analogy GnRH a hMG/FSH v tzv. dlouhÈm protokolu. V tab. 9 srovn·v·me na rozs·hl˝ch souborech v˝sledky IVF po stimulaci kombinacÌ CC-hMG, samotn˝m hMG, analogy GnRH a hMG/FSH v kr·tkÈm a dlouhÈm protokolu. V˝sledky terapie vyj·d¯enÈ poËtem klinick˝ch tÏhotenstvÌ na transfer nevypovÌdajÌ nic o dalöÌm osudu dosaûen˝ch tÏhotenstvÌ, kter˝ je Tab. 8. Osud dosažených těhotenství v závislosti na stimulačním protokolu Stimulace

CC-hMG

hMG

GnRHa/hMG

GnRHa-hMG

(krátký cyklus)

(dlouhý cyklus)

Pokračující gravidita %

69,7

50,0

73,5

85,5

Potrat % GEU %

22,7 7,6

44,4 5,6

22,1 4,4

9,7 4,8

Tab. 9. Klinická těhotenství po IVF v závislosti na stimulačním protokolu Stimulace

CC-hMG

hMG

GnRHa/hMG (krátký cyklus)

GnRHa-hMG (dlouhý cyklus)

Počet cyklů

326

132

792

383

Těhotné/ET %

21,5

21,2

23,7

32,7

32


takÈ v˝znamnÏ ovlivnÏn pouûit˝m stimulaËnÌm protokolem. Osud tÏhotenstvÌ v†z·vislosti na stimulaËnÌm protokolu ukazuje tab.†8. Za velmi dobrÈ v˝sledky p¯i stimulaci analogy GnRH a hMG/FSH v dlouhÈm protokolu vöak platÌme ËastÏjöÌm v˝skytem hyperstimulaËnÌho syndromu III. stupnÏ ñ zatÌmco bez down regulace byla tato komplikace zaznamen·na u 1,9 % stimulovan˝ch ûen, u pacientek s down regulacÌ ve†3,4†%.

3.3. Z·vÏry l

l

l

V˝sledky naöÌ pr·ce jednoznaËnÏ potvrdily p¯evahu stimulaËnÌch protokol˘ vyuûÌvajÌcÌch analoga GnRH nad stimulacÌ pomocÌ kombinace klomifencitr·tu a hMG Ëi hMG samotn˝m. KromÏ vyööÌho procenta dosaûen˝ch klinick˝ch tÏhotenstvÌ je zde i nejmenöÌ procento mimodÏloûnÌch tÏhotenstvÌ a nejvyööÌ procento tÏhotenstvÌ ukonËen˝ch porodem (baby take-home rate). Pr·ce potvrzuje skuteËnost, ûe za kontrolu folikulogeneze je zodpovÏdn˝ FSH, avöak osud dosaûen˝ch tÏhotenstvÌ je podmÌnÏn ˙rovnÌ kontroly sekrece LH. Stimulace gonadotropiny je po p¯edchozÌ down regulaci analogy GnRH nejen vysoce efektivnÌ, ale tÈû vysoce ekonomick· s ohledem na n·klady spojenÈ s opakovan˝mi IVF cykly.

33

4. VLIV ANDROLOGICK…HO FAKTORU V†…ÿE INTRACYTOPLAZMATICK… INJEKCE SPERMIE (ICSI)

Vyöet¯enÌ plodnosti muûe spoËÌvalo tradiËnÏ na vyËÌslenÌ poËtu spermiÌ v†ejakul·tu, popisu jejich morfologie a charakteru pohybu. V†souËasnÈ dobÏ vych·zejÌ vöechny laborato¯e z materi·lu WHO, kter˝ obsahuje standardnÌ doporuËenÌ pro zpracov·nÌ a hodnocenÌ ejakul·tu.(235) V p¯Ìpadech z·vaûnÈ poruchy plodnosti muûe byla aû doned·vna jedin˝m moûn˝m ¯eöenÌm sterility inseminace s pouûitÌm spermiÌ d·rce. MimotÏlnÌ oplodnÏnÌ oocytu nabÌdlo novou nadÏji i†doposud bez˙spÏönÏ lÈËen˝m p·r˘m, neboù umoûnilo kontakt oocytu s dostateËn˝m poËtem spermiÌ. NicmÈnÏ i p¯es sdÏlenÌ o†˙spÏön˝ch tÏhotenstvÌch(240) z˘stala efektivita standardnÌ IVF metodiky p¯i z·vaûnÈ oligospermii, astenospermii Ëi teratospermii nÌzk·. V tÏchto p¯Ìpadech je p¯i standardnÌm IVF postupu procento fertilizace oocyt˘ snÌûeno ˙mÏrnÏ postiûenÌ reprodukËnÌho potenci·lu muûe.(241) ZatÌmco u normospermick˝ch vzork˘ lze oËek·vat 70% fertilizaci preovulaËnÌch oocyt˘, p¯i oligospermii < 10 mil./ml fertilizace kles· na 50 %, p¯i oligospermii < 5 mil./ml na 20 % a†mÈnÏ.(242) V˝sledky v tÏchto z·vaûn˝ch p¯Ìpadech nesplnily oËek·v·nÌ, protoûe spermie nebyly schopny pr˘niku skrze zona pellucida a spojenÌ s oolemmou. Snaha o zv˝öenÌ procenta fertilizovan˝ch oocyt˘ proto nejprve vedla ke zvyöov·nÌ poËtu motilnÌch spermiÌ v inseminaËnÌm mÈdiu a sniûov·nÌ celkovÈho objemu inseminaËnÌho mÈdia. DalöÌ v˝voj byl zamÏ¯en na vypracov·nÌ optim·lnÌch metod pro selekci maxim·lnÌho poËtu norm·lnÏ utv·¯en˝ch a pohybliv˝ch spermiÌ. NejvÏtöÌho rozöÌ¯enÌ dos·hla metoda swim-up a n·slednÏ postupy vyuûÌvajÌcÌ diskontinu·lnÌ PercollovÈ gradienty. DalöÌ moûnost, jak zv˝öit pravdÏpodobnost ˙spÏönÈ interakce spermie-oocyt, p¯edstavuje pouûitÌ l·tek zvyöujÌcÌch motilitu spermiÌ (nap¯. pentoxifylin), kultivace v tzv. mikrokapk·ch (microdroplets) Ëi odstranÏnÌ bunÏk cumulus oophorus obklopujÌcÌch oocyt. Vöechny tyto postupy p¯inesly zlepöenÌ v˝sledk˘ v p¯Ìpadech st¯ednÏ z·vaûnÈ oligoastenospermie, nevedly vöak k z·sadnÌmu obratu p¯i z·vaûnÏ naruöenÈ spermiogenezi.

34


Jelikoû parametry standardnÌho vyöet¯enÌ nativnÌho ejakul·tu jednoznaËnÏ nekorelujÌ s funkËnÌ kompetencÌ spermiÌ,(183) byla ve snaze zkvalitnit diagnostiku i terapii vypracov·na ¯ada test˘, kterÈ se snaûÌ p¯edvÌdat v˝sledek interakce gamet in vitro.(5) Mezi nÏ pat¯Ì hypoosmotick˝ test podle Jeyendrana,(75,78) hodnotÌcÌ funkËnÌ integritu membr·n spermatozoÌ, a tzv. zona-free hamster oocyte penetration assay podle Yanagimachiho,(237) hodnotÌcÌ penetraci oocyt˘ zlat˝ch k¯eËk˘ zbaven˝ch zona pellucida vyöet¯ovan˝mi spermiemi. Oba tyto testy hodnotÌ nep¯Ìmo kapacitaci a akrosom·lnÌ reakci nezbytnou pro proces fertilizace. Tu je vöak moûnÈ posoudit i p¯Ìmo(30) pomocÌ tzv. ARIC testu (acrosome reaction to ionophore challenge). Ca2+ ionofor oznaËovan˝ jako A23187 generuje intracelul·rnÌ sign·l pro Ca2+ vedoucÌ k sekvenci dÏj˘ kulminujÌcÌch v akrosom·lnÌ reakci.(6,76) DalöÌm z†pouûÌvan˝ch test˘ je tzv. hemizona assay,(70,244) posuzujÌcÌ pro ˙spÏönou fertilizaci nezbytn˝ proces vazby spermie na zona pellucida. Vöechny tyto testy jsou vöak pro rutinnÌ provoz komplikovanÈ a n·kladnÈ a jsou vyhrazeny pro vysoce specializovanÈ klinickÈ laborato¯e. Z praktickÈho pohledu se jako velmi kvalitnÌ kritÈrium uk·zal poËet zÌskan˝ch spermiÌ pouûiteln˝ch pro IVF po laboratornÌ ˙pravÏ ejakul·tu.(107) Je-li v˝znamnÏ snÌûen poËet spermiÌ, jejich motilita Ëi vysokÈ procento vykazuje morfologickÈ odchylky, je pravdÏpodobnost ˙spÏönÈ penetrace zona pellucida velmi mal·. Byly proto vypracov·ny postupy, jejichû cÌlem bylo usnadnit spermiÌm pr˘nik touto glykoproteinovou bariÈrou. Jako nevhodnÈ ¯eöenÌ se uk·zalo kompletnÌ odstranÏnÌ zona pellucida, neboù mÏlo za n·sledek vznik polyspermie a naruöenÌ ËasnÈho embryon·lnÌho v˝voje, bÏhem kterÈho je pomocÌ zona pellucida embryo chr·nÏno. D·le byly prov·dÏny pokusy o zmÏkËenÌ zona pellucida (zona softening) pomocÌ enzym˘ (trypsin, pron·za) Ëi jejÌho otev¯enÌ (zona drilling) pomocÌ Tyrodova roztoku aplikovanÈho na omezen˝ ˙sek zona pellucida pomocÌ mikropipety. ModifikacÌ tohoto postupu bylo mechanickÈ otev¯enÌ zona pellucida nazvanÈ Cohenem ªparci·lnÌ disekce zona pellucida´ ñ PZD.(26) Artefici·lnÌ takto vznikl˝ otvor je 5ñ10x menöÌ neû otvor v zona pellucida po aplikaci Tyrodova roztoku, ËÌmû se snÌûilo riziko polyspermie a poökozenÌ blastomer. Takto oöet¯enÈ oocyty v inseminaËnÌm mÈdiu usnadÚovaly spermiÌm kontakt s oolemmou, ˙spÏön· fertilizace vöak vyûadovala p¯Ìtomnost progresÌvnÏ pohybliv˝ch, kapacitovan˝ch spermiÌ s†norm·lnÌ akrosom·lnÌ reakcÌ. Nev˝hodou bylo ne˙nosnÏ vysokÈ procento polyspermie p¯i aplikaci norm·lnÏ motilnÌch spermiÌ a†naopak ˙plnÈ selh·nÌ p¯i aplikaci spermiÌ s†naruöenou motilitou. DalöÌm krokem p¯i rozvoji metod tzv. asistovanÈ fertilizace byla subzon·lnÌ inseminace (SUZI), p¯i kterÈ byly spermie aplikov·ny pomocÌ mikropipety do perivitelinnÌho prostoru. Tento po-

Vliv andrologickÈho faktoru v†È¯e intracytoplazmatickÈ injekce spermie (ICSI)

35

stup dok·zal zv˝öit procento oplozen˝ch oocyt˘ i†v†p¯Ìpadech s naruöenou pohyblivostÌ spermiÌ. P¯Ìnos tÏchto postup˘ vöak z˘st·val st·le omezen˝, protoûe pro ˙spÏönou interakci gamet byla st·le rozhodujÌcÌ funkËnÌ integrita spermie (spermiÌ) schopnÈ norm·lnÌ akrosom·lnÌ reakce. Z v˝öe uveden˝ch d˘vod˘ se stala velmi atraktivnÌ moûnostÌ intracytoplazmatick· injekce spermie (ICSI) umoûÚujÌcÌ intracytoplazmatickou aplikaci jedinÈ spermie bez ohledu na jejÌ motilitu a stav akrosomu. Tento postup zcela obch·zÌ proces vazby spermie na oolemmu a jejÌ penetraci a†p¯ed v˝öe uveden˝mi metodami†sk˝t· ¯adu p¯ednostÌ, neboù ¯eöÌ vöechny abnormality sloûitÈho komplexnÌho procesu interakce spermie-oocyt a pr˘niku spermie vajeËn˝mi obaly. V anim·lnÌm modelu popsal pouûitÌ intracytoplazmatickÈ injekce spermie (ICSI) poprvÈ Lin v roce 1966.(91) V hum·nnÌ medicÌnÏ je prvnÌ zmÌnka o ICSI z roku 1988, vzhledem k vysokÈmu poËtu poökozen˝ch oocyt˘ a k ne˙spÏönÈ implantaci auto¯i v dalöÌ pr·ci nepokraËovali.(85) Metodika byla n·slednÏ rozpracov·na belgickou skupinou kolem Van Steirteghema a v roce 1992 byla publikov·na prvnÌ 4 tÏhotenstvÌ po ICSI.(196) Potenci·l tohoto postupu prok·zala dalöÌ pr·ce v˝öe uveden˝ch autor˘, kte¯Ì ve 300 cyklech provedli SUZI a ICSI: u 2214 oocyt˘ byla aplikov·na SUZI a v˝sledkem bylo 18 % oplozen˝ch oocyt˘, zatÌmco po ICSI u 716 oocyt˘ jich fertilizovalo 44 %.(195) JednoznaËnou dominanci ICSI nad SUZI potvrdili i ve svÈ dalöÌ pr·ci z roku 1994, kdy hodnotili zkuöenosti ze 600 cykl˘.(194) SrovnatelnÈ v˝sledky publikoval n·slednÏ Tsirigotis v roce 1994, kdyû pomocÌ ICSI dos·hl 25 tÏhotenstvÌ u 69 p·r˘.(221) Payne v dalöÌ publikovanÈ studii referoval o fertilization rate po ICSI v 67 %†a†o†dosaûen˝ch 30 klinick˝ch gravidit·ch ve 100 po sobÏ jdoucÌch IVF-ICSI lÈËebn˝ch cyklech.(143) V r·mci tÈto studie provedl prospektivnÌ srovn·nÌ standardnÌ IVF metodiky a ICSI: zatÌmco procento fertilizovan˝ch oocyt˘ po ICSI dos·hlo 67 %, pouze u 15 % oocyt˘ po standardnÌ IVF byla potvrzena norm·lnÌ fertilizace. NetuöenÈ moûnosti tÈto techniky potvrdily i dalöÌ a rozs·hlejöÌ studie uve¯ejnÏnÈ v roce 1995. Tucker lÈËil 92 neplodn˝ch p·r˘ v†celkem 105 cyklech a dos·hl 28 klinick˝ch tÏhotenstvÌ (27 % na cyklus). V tÈto studii prok·zal i vliv vÏku na v˝sledky po ICSI: zatÌmco u ûen do 36 let dos·hl tÏhotenstvÌ ve 40 %, z pacientek staröÌch 36 let otÏhotnÏlo pouze 14 %.(222) Palermo publikoval studii, ve kterÈ provedl ICSI u 227 p·r˘ se z·vaûnÏ naruöenou spermiogenezÌ a dos·hl 84 tÏhotenstvÌ.(140) Porovn·nÌ v˝sledk˘ po ICSI a po standardnÌ IVF provedenÈ u kontrolnÌ skupiny 179 p·r˘ s ËistÏ tub·rnÌ sterilitou neprok·zalo statisticky v˝znamnÈ rozdÌly: fertilizace po ICSI byla 59 % a po IVF 63 %, tÏhotenstvÌ po ICSI 37 % a†po IVF 33 %.(3) Srovnateln˝ v˝vojov˝ potenci·l embryÌ po ICSI

36


a†po standardnÌ IVF prok·zal i†Staessen. Po elektivnÌm transferu pouze dvou nejkvalitnÏjöÌch embryÌ neprok·zal statisticky v˝znamn˝ rozdÌl v ˙spÏönosti mezi embryi po ICSI a†po IVF.(189)

4.1. ObstrukËnÌ azoospermie 4.1.1. Aspirace epididym·lnÌch spermiÌ Vrozen·, zÌskan· Ëi iatrogennÌ (vazektomie) oboustrann· obstrukce Ëi atrÈzie vas deferens a/nebo epididymis vede k azoospermii. Mikrochirurgick· rekanalizace m˘ûe vÈst k ˙spÏchu a obnovenÌ fertility (zejmÈna u muû˘ po vazektomii za ˙Ëelem sterilizace), ne vûdy je vöak chirurgick˝ v˝kon ˙spÏön˝ ñ zejmÈna u poz·nÏtliv˝ch stav˘ a p¯Ìpad˘ s vrozenou oboustrannou absencÌ vas deferens (CBAVD). Aû do ned·vnÈ doby panoval n·zor, ûe epididym·lnÌ spermie nejsou ªdostateËnÏ zralÈ´ pro norm·lnÌ fertilizaci oocytu. ZavedenÌ mikrochirurgickÈ aspirace epididym·lnÌch spermiÌ (MESA) vöak jednoznaËnÏ prok·zalo, ûe i tyto spermie mohou b˝t pouûity k ˙spÏönÈ fertilizaci. Aplikace epididym·lnÌch spermiÌ ve standardnÌm IVF programu vedla k tÏhotenstvÌm, avöak procenta fertilizace i tÏhotenstvÌ byla velmi nÌzk·.(179) V roce 1994 publikoval Silber pr·ci srovn·vajÌcÌ 67 cykl˘ s MESA a†standardnÌ IVF se 17 MESA cykly a ICSI. Fertilizace byla 7% po IVF a†45% po ICSI, tÏhotenstvÌ dos·hl v 5 % po IVF a ve 47 % po ICSI.(181) PodobnÏ povzbudivÈ v˝sledky publikoval i Tournaye. U 12 p·r˘, kdy se u muûe jednalo o vrozenou oboustrannou aplazii vas deferens, dos·hl fertilizace u†58 % a tÏhotenstvÌ ve 36 %, vzhledem k vysokÈmu poËtu preklinick˝ch abort˘ bylo klinick˝ch tÏhotenstvÌ 21 %.(213) Vzhledem k vazbÏ CBAVD a†cystickÈ fibrÛzy je v tÏchto p¯Ìpadech nutnÈ genetickÈ vyöet¯enÌ obou partner˘ a v p¯ÌpadÏ prok·zanÈho nosiËstvÌ nutno modifikovat postup (d·rcovskÈ gamety) nebo vyuûÌt metod preimplantaËnÌ diagnostiky. Vzhledem k invazivitÏ a n·roËnosti MESA je snaha tento v˝kon maxim·lnÏ zjednoduöit. Spermie zÌskanÈ p¯i MESA lze kryokonzervovat: po pouûitÌ rozmrazen˝ch spermiÌ po MESA popsal Devroey fertilizaci ve 45 % a dvÏ ˙spÏön· tÏhotenstvÌ.(33) Shrivastav v†roce 1994 publikoval modifikaci spoËÌvajÌcÌ v perkut·nnÌ aspiraci epididym·lnÌch spermiÌ (PESA). V˝kon je provediteln˝ v mÌstnÌ Ëi celkovÈ anestÈzii a i p¯es vÏtöÌ kontaminaci materi·lu erytrocyty lze takto zÌskanÈ spermie pouûÌt pro ICSI a docÌlit tÏhotenstvÌ.(174) P¯i pouûitÌ tohoto p¯Ìstupu u 20 p·r˘ Craft t¯ikr·t nezÌskal spermie a†musel v˝kon konvertovat na MESA, ve zbyl˝ch 16 p¯Ìpadech docÌlil fertilizace ve 14 % a po transferu embryÌ i t¯Ì tÏhotenstvÌ.(29)


37

4.1.2. Extrakce testikul·rnÌch spermiÌ Logick˝m vy˙stÏnÌm zkuöenostÌ s MESA byl p¯edpoklad, ûe lze-li ˙spÏönÏ pracovat se spermiemi zÌskan˝mi z epididymis, lze pouûÌt i spermie zÌskanÈ p¯Ìmo z testes (extrakce testikul·rnÌch spermiÌ ñ TESE). PrvnÌ zkuöenosti a ˙spÏchy publikoval Schoysman,(176) n·slednÏ Devroey docÌlil u t¯Ì p·r˘ fertilizaci po TESE a ICSI v†46†%, û·dn· pacientka vöak neotÏhotnÏla.(32) Silber v pr·ci publikovanÈ v†roce 1995(180) srovn·val v˝sledky u 28 p·r˘, kdy v 16 p¯Ìpadech pouûil MESA a†ve 12 p¯Ìpadech TESE. V˝sledky v obou skupin·ch byly zcela identickÈ (fertilizace 45 % po MESA, 46 % po TESE, tÏhotenstvÌ 50 % po MESA a†43†% po TESE). KoneËnÏ Tournaye publikoval studii a v˝sledky terapie 42 p·r˘ s†obstrukËnÌ azoospermiÌ u†muûe, kdy po TESE-ICSI docÌlil fertilizaci v 62†% a tÏhotenstvÌ na zapoËat˝ cyklus ve 40†%.(213) StejnÏ jako u MESA hledajÌ se i pro TESE jednoduööÌ p¯Ìstupy nevyûadujÌcÌ otev¯enou biopsii testikul·rnÌ tk·nÏ. Nagy prok·zal, ûe pro ICSI lze pouûÌt i kryokonzervovanÈ testikul·rnÌ spermie, procento fertilizace a cykl˘ s embryotransferem je vöak niûöÌ neû p¯i pouûitÌ ªËerstv˝ch´ spermiÌ.(121) Moûn˝ je i perkut·nnÌ p¯Ìstup, aËkoli materi·l zÌskan˝ perkut·nnÌ biopsiÌ je mÈnÏ kvalitnÌ neû p¯i ªotev¯enÈ´ biopsii, i tyto spermie lze pouûÌt pro ICSI.

4.2. Mechanismy fertilizace oocytu po†intracytoplazmatickÈ injekci spermie Jiû z·hy po zavedenÌ ICSI do klinickÈ praxe bylo z¯ejmÈ, ûe ne vöechny oocyty po aplikaci tohoto postupu fertilizujÌ. CytogenetickÈ studie nefertilizovan˝ch oocyt˘ prok·zaly, ûe u vÌce neû 90 % byla spermie ˙spÏönÏ aplikov·na do cytoplazmy. Je tedy z¯ejmÈ, ûe v tomto p¯ÌpadÏ se uplatÚujÌ jinÈ mechanismy. JeötÏ doned·vna p¯edstavovala aktivace oocytu po ICSI otev¯en˝ problÈm, neboù p¯i ICSI je oocyt podroben ¯adÏ manipulacÌ, z†nichû teoreticky kaûd· m˘ûe vÈst k aktivaci oocytu. ExistujÌ dva hlavnÌ faktory, kterÈ p¯ich·zejÌ v†˙vahu: buÔ je stejnÏ jako v anim·lnÌm modelu aktivace oocytu navozena vlastnÌ mechanickou punkcÌ oocytu, nebo se uplatÚuje faktor vnesen˝ injikovanou spermiÌ. V˝zkumy sledujÌcÌ oscilace hladin kalcia a uvolnÏnÌ kortik·lnÌch granulÌ po ICSI uk·zaly, ûe oba v˝öe zmÌnÏnÈ mechanismy jsou stejnÏ pravdÏpodobnÈ.(85,209,210) Pokusy Dozortseva na nefertilizovan˝ch oocytech vöak jednoznaËnÏ p¯inesly odpovÏÔ na tuto ot·zku. Fertilizace oocyt˘, u nichû provedl skuteËnou ICSI, byla signifikantnÏ vyööÌ oproti kontrolnÌ skupinÏ,

38


kde provedl pouhou mechanickou penetraci oolemmy s aspiracÌ malÈho mnoûstvÌ cystoplazmy jako p¯i ICSI, avöak bez injekce spermie.(39) Tyto v˝sledky jednoznaËnÏ ukazujÌ na v˝znam injikovanÈ spermie p¯i aktivaci oocytu. DalöÌ pr·ce prok·zaly, ûe aktivace oocytu je vyvol·na cytoplazmatick˝m faktorem vnesen˝m spermiÌ, kter˝ je termolabilnÌ, druhovÏ nespecifick˝ a pouze intracelul·rnÏ ˙Ëinn˝.(200) Ukazuje se tedy, ûe selh·nÌ fertilizace oocytu po ICSI je nejspÌöe podmÌnÏno chybÏnÌm Ëi selh·nÌm tohoto faktoru u zvolenÈ spermie. Ve skuteËnosti jiû bylo pomocÌ anim·lnÌho modelu prok·z·no nÏkolik p¯Ìpad˘ deficience tohoto ªsperm-associated oocyte-activating factor´ oznaËovanÈho zkratkou SAOAF.(157) V souhlase se zkuöenostmi, ûe morfologickÈ charakteristiky spermie neovlivÚujÌ v˝sledky ICSI, nenÌ ani p˘sobenÌ SAOAF v·z·no na morfologii vybranÈ spermie.(202) Aby se vöak tento faktor mohl uplatnit, musÌ b˝t oocyt v odpovÌdajÌcÌm stupni zralosti. NezralÈ oocyty nejsou aktivov·ny, a cÌlov· struktura pro uplatnÏnÌ SAOAF se tedy objevuje aû po dosaûenÌ metaf·ze II. Ned·vnÈ pokusy prok·zaly, ûe na rozdÌl od myöÌ vede intracytoplazmatick· injekce kulat˝ch spermatid u ËlovÏka k relativnÏ vysokÈmu procentu fertilizace, a†je tedy z¯ejmÈ, ûe SAOAF se objevuje pr·vÏ na tomto stupni spermatogeneze. P¯i norm·lnÌm procesu fertilizace doch·zÌ ke spojenÌ cytoplazmy spermie a oocytu p¯i f˙zi membr·n obou gamet. P¯i ICSI je cel· spermie s†intaktnÌ membr·nou deponov·na do cytoplazmy oocytu, a je proto z¯ejmÈ, ûe uvolnÏnÌ SAOAF musÌ p¯edch·zet poruöenÌ integrity membr·ny spermie. Doposud provedenÈ pokusy naznaËujÌ, ûe cytoplazma oocytu neobsahuje faktor schopn˝ naruöit membr·nu spermie, a zd· se proto logickÈ, ûe p¯ed vlastnÌ ICSI by mÏla b˝t membr·na naruöena. Bylo prok·z·no, ûe p¯i manipulaci a znehybnÏnÌ spermie p¯ed ICSI doch·zÌ k naruöenÌ integrity membr·ny spermie, kterÈ je nezbytnÈ pro norm·lnÌ interakci spermie-oocyt vËetnÏ uvolnÏnÌ SAOAF a kterÈ tak nahrazuje f˙zi membr·n

Obr. 4. Oplozené oocyty ve stadiu prvojader


39

gamet p¯i norm·lnÌ fertilizaci.(38) Na druhÈ stranÏ polyvinylpyrolidon (PVP), bÏûnÏ uûÌvan˝ v†mÈdiÌch p¯i ICSI, stabilizuje membr·nu spermie a m˘ûe negativnÏ ovlivÚovat fertilizaci naruöenÌm uvedenÈho mechanismu.(38) Z v˝öe uvedenÈho vypl˝v·, ûe p¯i ICSI by spermie mÏly b˝t vûdy znehybnÏny naruöenÌm membr·ny biËÌku, a to i tehdy, jsou-li nepohyblivÈ nebo s minim·lnÌ pohyblivostÌ. SouËasnÏ pouûÌvan· koncentrace PVP v†mÈdiu by mÏla b˝t co nejniûöÌ, aby stabilizacÌ membr·ny spermie nebylo naruöeno uvolnÏnÌ SAOAF a aktivace oocytu.

4.3. KlinickÈ aspekty ICSI 4.3.1. Indukce ovulace ⁄Ëelem ovari·lnÌ stimulace p¯ed ICSI je stejnÏ jako p¯i pouûitÌ jin˝ch metod asistovanÈ reprodukce zisk vÏtöÌho poËtu oocyt˘ nejvyööÌ moûnÈ kvality, resp. optim·lnÌ zralosti. UrËitou specifitou stimulace p¯ed ICSI je snaha zÌskat co nejvÏtöÌ poËet oocyt˘, aby pro vlastnÌ injekci spermie mohly b˝t vybr·ny skuteËnÏ ty nejkvalitnÏjöÌ a†aby ñ vzhledem k technickÈ n·roËnosti ñ mohla b˝t event. nadpoËetn· embrya kryokonzervov·na. Problematika stimulaËnÌch protokol˘ v†programech AR byla opakovanÏ publikov·na. Pozornost je nutno vÏnovat i indikaci ICSI a v˝bÏru p·r˘, neboù p¯edevöÌm vÏk v˝raznÏ negativnÏ ovlivÚuje folikulogenezi a implantaci. Gonadotropiny jsou aplikov·ny v maxim·lnÌch d·vk·ch, p¯iËemû Ëist˝ FSH p¯in·öÌ o†nÏco lepöÌ v˝sledky neû ªklasickÈ´ gonadotropiny obsahujÌcÌ FSH:LH v†pomÏru 1:1. Metodou volby jsou dnes jednoznaËnÏ stimulaËnÌ protokoly s analogy GnRH, jejichû hlavnÌ v˝hodou je potlaËenÌ p¯edËasnÈ sekrece LH, a tÌm i rizika p¯edËasnÈ ovulace nebo luteinizace folikul˘ in situ. Optim·lnÌ stimulaËnÌ schÈma p¯edstavuje tzv. dlouh˝ protokol, p¯i jehoû pouûitÌ jsou hladiny LH ve folikul·rnÌ f·zi niûöÌ neû p¯i stimulaci samotn˝mi gonadotropiny nebo p¯i stimulaci s analogy GnRH v tzv. kr·tkÈm protokolu. Vliv stimulaËnÌho protokolu na v˝sledky ICSI potvrzuje pr·ce Greenblatta z†roku 1995.(62)

4.3.2. AndrologickÈ a neandrologickÈ indikace intracytoplazmatickÈ injekce (ICSI) MimotÏlnÌ oplodnÏnÌ otev¯elo novÈ moûnosti i pro ty p·ry, u kter˝ch byla pro z·vaûnÈ naruöenÌ plodnosti muûe aû doned·vna jedin˝m

40


moûn˝m ¯eöenÌm sterility inseminace s pouûitÌm spermiÌ d·rce. P¯i pouûitÌ standardnÌ metodiky je vöak patrn˝ v˝razn˝ pokles procenta fertilizovan˝ch oocyt˘ v z·vislosti na z·vaûnosti postiûenÌ reprodukËnÌho potenci·lu muûe.(241) P¯ed n·stupem intracytoplazmatickÈ injekce (ICSI) bylo doporuËeno neza¯azovat do IVF ty p·ry, u nichû je poËet spermiÌ menöÌ neû 10 mil./ml, motilita < 30 % a zastoupenÌ norm·lnÏ utv·¯en˝ch spermiÌ < 30 %. Pod tÌmto limitem byla nadÏje na dosaûenÌ tÏhotenstvÌ pouze 1 %.(81) Jiû v poË·tcÌch ICSI bylo z¯ejmÈ, ûe parametry klasickÈho spermiogramu majÌ pouze minim·lnÌ (pokud v˘bec nÏjak˝) vliv na v˝sledky tÈto metody. Ve svÈ ËasnÈ studii z†roku 1993 Palermo uv·dÌ, ûe morfologie ovlivÚuje v˝sledky SUZI a ICSI pouze okrajovÏ.(140) Na druhÈ stranÏ ovlivnÏnÌ motility spermiÌ aplikacÌ pentoxifylinu nezlepöuje v˝sledky ICSI, naopak p¯Ìtomnost stop pentoxifylinu m˘ûe negativnÏ ovlivnit procento fertilizace. V roce 1995 pr·ce t¯Ì nez·visl˝ch skupin a hodnocenÌ celkem 1188 ICSI cykl˘ potvrdily, ûe klasickÈ parametry spermiogramu (poËet, motilita, morfologie) û·dn˝m zp˘sobem neovlivÚujÌ v˝sledky ICSI. Nagy vöak jednoznaËnÏ demonstroval, ûe p¯Ìtomnost alespoÚ nÏkolika ñ byù jakkoli pohybliv˝ch ñ spermiÌ je p¯edpokladem ˙spÏönÈ fertilizace po ICSI.(122) Intracytoplazmatick· injekce spermie dramaticky zmÏnila p¯Ìstup k andrologickÈmu faktoru sterility a v˝znamnÏ snÌûila pot¯ebu darovan˝ch spermiÌ, p¯iËemû pouûitÌ epididym·lnÌch a testikul·rnÌch spermiÌ (MESA, TESE) umoûnilo dos·hnout tÏhotenstvÌ i v p¯Ìpadech kompletnÌ azoospermie.(179) Vysok· efektivita ICSI vedla nÏkterÈ autory k ˙vah·m o rozvolnÏnÌ indikacÌ tohoto postupu, kterÈ vy˙stily aû k diskusÌm o moûnÈ rutinnÌ ICSI v IVF programu u†vöech pacientek.

4.3.2.1. Soubory a metodika Hodnotili jsme fertilizaci oocyt˘ ve standardnÌm programu IVF u†p·r˘ se z·vaûn˝m andrologick˝m faktorem sterility (celkov˝ poËet spermiÌ po laboratornÌ ˙pravÏ ejakul·tu < 1 miliÛn), kterou jsme srovn·vali s fertilizacÌ oocyt˘ u ICSI z andrologickÈ indikace. Soubory tvo¯ilo 41 muû˘, jejichû ejakul·t byl upraven metodou swim-up, 57 muû˘, u kter˝ch byl pouûit Percoll, a 176 p·r˘ v ICSI programu, kde pr˘mÏrn˝ poËet spermiÌ po laboratornÌ ˙pravÏ byl v†celÈm souboru 250 000. Podrobn· metodika n·mi pouûÌvan˝ch postup˘ byla pops·na v jiû d¯Ìve publikovan˝ch sdÏlenÌch.(107,105) DosaûenÈ v˝sledky lze srovnat s dlouhodob˝m procentem fertilizace v†naöem IVF programu, kterÈ se pohybuje setrvale kolem 65 %.


41

Z neandrologickÈ indikace jsme prov·dÏli ICSI u 12 p·r˘ s idiopatick˝m selh·nÌm fertilizace v p¯edchozÌm IVF cyklu (po vylouËenÌ ªskrytÈho´ andrologickÈho faktoru a vöech p¯Ìpad˘ vysvÏtliteln˝ch abnorm·lnÌm pr˘bÏhem hormon·lnÌch hladin a oocyt·rnÌho faktoru) a p¯i selh·nÌ fertilizace ve standardnÌm IVF programu p¯i imunologickÈ sterilitÏ (13 p·r˘).

4.3.2.2. V˝sledky P¯i z·vaûnÈm andrologickÈm faktoru je pouûitÌ percollovÈho diskontinu·lnÌho gradientu öetrnÏjöÌ neû standardnÌ metodika swim-up a†zvyöuje procento fertilizace (37 % vers. 27 %), kterÈ vöak z˘st·v· st·le neakceptovatelnÏ nÌzkÈ. AplikacÌ intracytoplazmatickÈ injekce lze v tÏchto p¯Ìpadech dos·hnout stejnÈho nebo dokonce o nÏco vyööÌho procenta fertilizovan˝ch oocyt˘ (71 %), neû je tomu v kontrolnÌ skupinÏ IVF pacientek, kde andrologick˝ faktor nenÌ p¯Ìtomen (65 %). Tyto v˝sledky z¯etelnÏ dokumentuje graf 11. Aplikace ICSI p¯i nevysvÏtlitelnÈm selh·nÌ fertilizace ve standardnÌm IVF programu umoûÚuje dos·hnout v˝sledk˘ plnÏ srovnateln˝ch s kontrolnÌm souborem. V˝sledky u tÈto skupiny ûen jsou uvedeny v tab. 10. V˝sledky standardnÌ IVF metodiky u p·r˘ s imunologickou sterilitou a†v˝znam ICSI u imunologickÈ sterility s nÌzkou fertilizacÌ Ëi jejÌm selh·nÌm ukazuje tab. 11. Pozornost zaslouûÌ zejmÈna ty p·ry, u nichû ve 29 standardnÌch IVF cyklech fertilizovalo pouze 14 ze 122 zÌskan˝ch oocyt˘ a nedoölo k û·dnÈmu tÏhotenstvÌ. Po aplikaci ICSI se procento fertilizace zv˝öilo na 51,9 % a dos·hli jsme 23,1†% klinick˝ch tÏhotenstvÌ.

fertilizace 80 % 70 %

71

60 % 50 % 40 % 37

30 % 20 %

27

10 %

metoda

0 swim-up

Percoll

ICSI

Graf 11. Úspěšnost fertilizace při závažném andrologickém faktoru

42


Tab. 10. Výsledky ICSI u párů s idiopatickým selháním fertilizace ve standardním IVF programu Léčba

Počet cyklů

Oocyty

IVF

12

111

ICSI

12

106

Fertil. (%)

Deg. (%)

2 (1,8)

–

74 (69,8) 18 (16,7)

ET (%)

Embrya

Kryo (%)

Grav. (%)

2 (16,7)

2

–

–

11 (91,7)

44

4 (33,3)

3 (25,0)

Tab. 11. Význam ICSI při imunologické sterilitě Soubor Standardní IVF Selhání fertilizace (před ICSI) ICSI u párů s předchozím selháním fertilizace

Počet cyklů 24 29

Fertilizace (%) 238/111 (46,6) 122/14 (11,4)

Těhotenství (%) 9 (37,5) 0

13

102/53 (51,9)

3 (23,1)

Na z·kladÏ v˝öe uveden˝ch zkuöenostÌ a v˝sledk˘ indikujeme intracytoplazmatickou injekci v n·sledujÌcÌch p¯Ìpadech: l andrologickÈ indikace ICSI: ñ oligoastenoteratospermia gravis (ICSI s ejakulovan˝mi spermiemi), ñ azoospermie ñ obstrukËnÌ (MESA, event. TESE); ñ neobstrukËnÌ (TESE); l neandrologickÈ indikace ICSI: ñ idiopatickÈ selh·nÌ fertilizace p¯i standardnÌ IVF; ñ selh·nÌ fertilizace p¯i standardnÌ IVF u p·r˘ s imunologicky podmÌnÏnou sterilitou. Aplikace intracytoplazmatickÈ injekce spermie znamenala skuteËn˝ p¯evrat v p¯Ìstupu k andrologicky podmÌnÏnÈ sterilitÏ(139) a ICSI vzhledem ke svÈ vysokÈ efektivitÏ prakticky nahradila vöechny staröÌ terapeutickÈ postupy.(196) NÏkte¯Ì auto¯i navrhovali pouûÌt ICSI rutinnÏ pro fertilizaci vöech oocyt˘ v†programu IVF v p¯edstavÏ, ûe ICSI s kvalitnÌmi spermiemi jeötÏ d·le zv˝öÌ efektivitu tÈto metody.(63) S·m Hamberger(63) vöak na z·kladÏ vlastnÌch v˝sledk˘ uzavÌr·, ûe na souËasnÈm stupni v˝voje a pozn·nÌ je pouûitÌ ICSI opr·vnÏnÈ pouze v jasnÏ indikovan˝ch p¯Ìpadech. Tento z·vÏr jednoznaËnÏ podporuje i pr·ce Aboulghara,(3) kter˝ aplikoval ICSI u 58 pacientek s†ËistÏ tub·rnÌ sterilitou a dalöÌch 58 ûen s tub·rnÌ sterilitou lÈËen˝ch standardnÌ metodou IVF tvo¯ilo kontrolnÌ skupinu. Ve skupinÏ se standardnÌ IVF dos·hl fertilizace oocyt˘ v 64,8 % a 31 % klinick˝ch tÏhotenstvÌ na cyklus. Po ICSI fertilizovalo 70 % oocyt˘ a ˙spÏönost byla 32,8 % klinick˝ch tÏhotenstvÌ. V û·dnÈm ze sledovan˝ch parametr˘ nebyl mezi obÏma skupinami prok·z·n statistick˝ rozdÌl. ICSI vöak bylo provedeno ze 748 zÌskan˝ch oocyt˘ pouze u 572 oocyt˘ v metaf·zi II, a tudÌû fertilizace na zÌskan˝ oocyt byla signifikantnÏ vyööÌ po standardnÌ IVF neû po ICSI. Je


43

moûnÈ, ûe oocyty v metaf·zi I ponechanÈ v programu standardnÌ IVF v kultivaci mohou dos·hnout metaf·ze II a b˝t oplozeny, zatÌmco v programu ICSI jsou vy¯azov·ny. Intracytoplazmatick· injekce spermie je mimo¯·dnÏ cenn· metoda p¯edstavujÌcÌ kvalitativnÌ p¯Ìnos pro celou asistovanou reprodukci a andrologicky podmÌnÏnou sterilitu p¯edevöÌm, m· vöak jako jedna z metod bunÏËnÈ chirurgie svÈ definovatelnÈ indikace, jeû by mÏly b˝t dodrûov·ny.

4.3.3. Kryokonzervace embryÌ po ICSI Vysok· efektivita ICSI vedla z·hy k nutnosti kryokonzervace ªnadpoËetn˝ch´ embryÌ. Skupina kolem Van Steirteghema(193) porovnala v˝sledky kryokonzervace embryÌ po ICSI (1171 embryÌ zamrazeno, 413 rozmrazeno) a†po standardnÌ IVF (2495 zamrazeno, 969 rozmrazeno). V˝sledky byly naprosto srovnatelnÈ jak poËtem transferovan˝ch embryÌ (52 % po ICSI, 51 % po IVF), tak pozitivitou β-hCG (22 % po ICSI, 15 % po IVF) i poËtem klinick˝ch tÏhotenstvÌ (13 % po ICSI, 11 % po IVF). Pouze ve skupinÏ po ICSI bylo zaznamen·no vÏtöÌ procento preklinick˝ch potrat˘ (49 %) oproti standardnÌ IVF (27†%).

4.3.4. TÏhotenstvÌ po ICSI Od samÈho poË·tku pouûitÌ tÈto metodiky byla vÏnov·na mimo¯·dn· pozornost takto dosaûen˝m tÏhotenstvÌm a sledov·nÌ, zda nenÌ zv˝öeno riziko vrozen˝ch v˝vojov˝ch vad. Bonduelle v roce 1994 publikovala v˝sledky vyöet¯enÌ 55 dÏtÌ narozen˝ch po SUZI a ICSI, aniû prok·zala jakÈkoli zv˝öenÈ riziko abnormalit. Stejn· autorka v roce 1995 uve¯ejnila studii srovn·vajÌcÌ v˝sledky vyöet¯enÌ 130 dÏtÌ po ICSI a 130 dÏtÌ po standardnÌ IVF. Ani v tÈto pr·ci nebylo prok·z·no jakÈkoli riziko spojenÈ s ICSI oproti norm·lnÌ populaci a dÏtem narozen˝m po standardnÌ IVF. PoslednÌ pr·ce autorky hodnotÌ jiû 1160 dÏtÌ po ICSI. V z·vÏru ud·v·, ûe riziko porodu malformovanÈho plodu po ICSI je extrÈmnÏ nÌzkÈ. Vzhledem k samotnÈmu mechanismu ICSI, kter˝ obch·zÌ p¯irozenou selekci spermiÌ p¯i procesu fertilizace, je oblig·tnÌ vyöet¯enÌ metodami prenat·lnÌ diagnostiky u tÏchto tÏhotenstvÌ plnÏ indikov·no a sledov·nÌ takto poËat˝ch dÏtÌ musÌ d·le pokraËovat.

44


4.4. GenetickÈ aspekty ICSI PomocÌ intracytoplazmatickÈ injekce spermie lze dos·hnout jeötÏ ned·vno nep¯edstavitelnÏ vysokÈ procento fertilizovan˝ch oocyt˘. Touto metodikou se vöak obejdou p¯irozenÈ mechanismy selekce spermie p¯i fertilizaci a skuteËn· p¯ÌËina sterility se tak dost·v· do pozadÌ. Chromosom·lnÌ aberace a abnormality p¯edstavujÌ Ëastou p¯ÌËinu andrologickÈ sterility, p¯iËemû incidence pozitivnÌch n·lez˘ stoup· v z·vislosti na stupni poruchy spermiogeneze.(108) Podle Nielsena lze p¯i kompletnÌ azoospermii oËek·vat chromosom·lnÌ aberaci v†15,2 %, p¯iËemû v†91,3†% se jednalo o poruchu gonosom˘ a†v†8,7†% o poruchu autosom˘. NejËastÏjöÌm n·lezem aberace gonosom˘ byl karyotyp 47,XXY v 82,5 %. Ve skupinÏ muû˘ s oligospermiÌ pod 20 mil./ml byla incidence chromosom·lnÌch aberacÌ 3,6 %, p¯iËemû ve 21,1 % se podÌlely na poruöe gonosomy a v 78,9 % autosomy. P¯i normospermii byla incidence chromosom·lnÌch poruch 0,7†%, na kter˝ch se gonosomy podÌlely 14, 3 % a autosomy 85,7 %. P¯i poruöe autosom˘ lze v 60 % oËek·vat numerickou odchylku a†ve 40 % struktur·lnÌ aberaci.(127) DalöÌ moûnou geneticky podmÌnÏnou p¯ÌËinou andrologickÈ sterility jsou abnormality na ˙rovni DNA. Y-chromosom obsahuje asi 2 % vöech lidsk˝ch gen˘. Dist·lnÌ Ë·st kr·tkÈho ramÈnka zaujÌm· tzv. pseudoautosom·lnÌ oblast (PAR), jeho proxim·lnÌ Ë·st tzv. sex determinig region Y-chromosomu (SRY). Proxim·lnÌ Ë·st dlouhÈho ramÈnka nese tzv. azoospermic factor (AZF) a jeho dist·lnÌ Ë·st tzv. heterochromatinovou oblast. Vogt ve svÈ pr·ci jasnÏ uk·zal, ûe naruöenÌ AZF vede k poruöe spermiogeneze na r˘zn˝ch stupnÌch.(225) P¯edpokl·d· se, ûe u 5ñ20 % muû˘ s non-obstrukËnÌ azoospermiÌ nebo tÏûkou oligospermiÌ lze nalÈzt poruchu v AZF oblasti Y-chromosomu. Velmi z·vaûn˝m stavem je andrologick· sterilita v souvislosti s†genem cystickÈ fibrÛzy. Cystick· fibrÛza (CF) je geneticky podmÌnÏnÈ onemocnÏnÌ charakterizovanÈ abnorm·lnÌ sekrecÌ exokrinnÌch ûl·z. NejËastÏjöÌ klinickou manifestaci p¯edstavuje chronick· obstrukËnÌ chroroba bronchopulmon·lnÌ a exokrinnÌ insuficience pankreatu. Cystick· fibrÛza je diagnostikov·na jednou na kaûd˝ch 2500 porod˘ u bÌlÈ rasy v SevernÌ Americe a v EvropÏ, na kaûd˝ch 17 000 porod˘ u AfroameriËan˘ a na 90†000 porod˘ asijskÈ populace.(20) Vöichni muûi s CF majÌ oboustrannou vrozenou aplazii vas deferens (CBAVD), p¯iËemû CBAVD je p¯ÌËinou andrologickÈ sterility asi v 1,4 % a p¯i kompletnÌ azoospermii v 6,1 %.(149,152) Gen pro cystickou fibrÛzu (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene ñ CFTR) je lokalizov·n na dlouhÈm ramÈnku 7. chro-


45

mosomu a urËuje syntÈzu proteinu sest·vajÌcÌho ze 1480 aminokyselin, kter˝ je odpovÏdn˝ za transport chloridov˝ch iont˘ p¯es membr·nu epitelov˝ch bunÏk. VÏtöina muû˘ s CBAVD m· testes norm·lnÌ velikosti a norm·lnÌ hodnoty FSH, LH a†testosteronu.

4.5. Metodika ICSI 4.5.1. P¯Ìprava spermiÌ CÌlem preparace spermiÌ pro ICSI je zÌskat alespoÚ takov˝ poËet vit·lnÌch spermiÌ, aby bylo moûno provÈst intracytoplazmatickou injekci spermie do vöech zÌskan˝ch oocyt˘. Z nÏkolika moûn˝ch zp˘sob˘ preparace spermiÌ pro ICSI nelze jednoznaËnÏ oznaËit jedin˝, kter˝ by zaruËoval optim·lnÌ (nejvyööÌ) procento fertilizace. NavÌc v˝sledek ICSI nenÌ jednoznaËnÏ z·visl˝ na zvolenÈm zp˘sobu zpracov·nÌ spermiÌ, nap¯. pouûitÌm pentoxifylinu lze zv˝öit poËet zÌskan˝ch pohybliv˝ch spermiÌ, z nichû i ty s horöÌ kvalitou pohybu jsou ûivÈ, nesou haploidnÌ genetickou informaci a†splÚujÌ tak podmÌnky pouûitelnosti pro ICSI. ObecnÏ ¯eËeno, technika p¯Ìpravy by mÏla b˝t takov·, aby p¯i zpracov·nÌ vzork˘ s extrÈmnÏ nÌzk˝m poËtem spermiÌ byl zÌsk·n co nejvÏtöÌ poËet gamet, ale z·roveÚ p¯itom nedoölo k†poruöenÌ bunÏËnÈ integrity. Zpracov·van˝ vzorek by proto nemÏl b˝t centrifugov·n p¯i vÌce neû 300 G a v mnoha p¯Ìpadech se vzhledem k velmi mal˝m poËt˘m spermiÌ nehodÌ ani Ëasto pouûÌvan˝ swim-up. Ani percollov˝ gradient nelze vyuûÌt vûdy, navÌc je zde nutno prom˝t zÌskanÈ spermie od zbytk˘ Percollu, aby se p¯i ICSI nedostaly spolu se spermiÌ do cytoplazmy oocytu.

n Kombinovan· separace spermiÌ V naöÌ laborato¯i se osvÏdËila metoda separace spermiÌ, p¯i kterÈ jsou gamety nejprve centrifugov·ny v percollovÈm gradientu (40 %, 80 %, 200 g, 15 min) a potÈ promyty mÈdiem (5 min, 200 g). Po odstranÏnÌ supernatantu se peleta velmi opatrnÏ p¯evrstvÌ mal˝m objemem mÈdia (2ñ3 mm vysok˝ sloupec) a spermie se p¯i teplotÏ 37 ∞C a 5% CO2 nechajÌ vycestov·vat p¯ibliûnÏ 1 h. Jedn· se vlastnÏ o ponÏkud modifikovan˝ swim-up. Takto zÌskanÈ spermie jsou prost˝ vöech p¯ÌmÏsÌ (leukocyt˘, epiteliÌ, event. mikrobi·lnÌho n·plavu ap.), kterÈ se nepoda¯ilo odstranit opakovan˝mi centrifugacemi. Speci·lnÏ pro tento ˙Ëel vytaûenou ˙zkou Pasteurovou pipetou se odt·hne vrstviËka mÈdia tÏsnÏ nad peletkou a umÌstÌ se do p¯edem p¯ipravenÈ kapky PVP krytÈ parafinov˝m olejem. TÌmto postupem

46


se sice zredukuje poËet spermiÌ, ale zÌsk·me ûivÈ, vÌce Ëi mÈnÏ pohyblivÈ gamety, kterÈ jsou vhodnÈ pro ICSI.

n P¯Ìprava epididym·lnÌch a testikul·rnÌch spermiÌ Jestliûe ejakul·t neobsahuje û·dnÈ motilnÌ spermie, je t¯eba p¯ikroËit k†mikrochirurgickÈ aspiraci obsahu epididymis (microsurgical epididymal sperm aspiration ñ MESA). Punkt·t, tj. roztok mÈdia a epididym·lnÌch komponent (spermie, Ëasto erytrocyty a dalöÌ buÚky, mikroorganismy), se podvrstvÌ pod parafinov˝ olej a p¯id· se dalöÌ kapka mÈdia (na okraj kapky punkt·tu). Ve standardnÌch podmÌnk·ch (teplota 37 °C a 5% CO2) se spermie nechajÌ vycestovat na okraj kapky. Nejsou-li z epididymis zÌsk·ny û·dnÈ spermie, je t¯eba provÈst extrakci spermiÌ p¯Ìmo z testikul·rnÌ tk·nÏ (testicular sperm extraction ñ TESE). Identifikace a separace testikul·rnÌch spermiÌ je sloûit·. P¯i TESE se odeberou semenotvornÈ kan·lky, kterÈ v optim·lnÌm p¯ÌpadÏ obsahujÌ nejen na Sertoliho buÚky v·zanÈ, ale i†volnÈ spermie. Po omytÌ velk˝m objemem mÈdia (odstranÏnÌ krve po biopsii) a mechanickÈm otev¯enÌ kan·lk˘ se jejich obsah d·le rozpreparov·v· na malÈ kousky a†pomocÌ mikropipety p¯enese do kapek mÈdia a kultivuje pod parafinov˝m olejem cca 2 h ve standardnÌch podmÌnk·ch. Je d˘leûitÈ, aby v kapce nebylo p¯Ìliö mnoho bunÏk, protoûe by se velmi znesnadnil pohyb spermiÌ. BÏhem tÈto doby zÌskajÌ nÏkterÈ spermie progresÌvnÌ pohyb a migrujÌ na perifÈrii kapky. V nÏkter˝ch p¯Ìpadech se vöak spermie pohybujÌ velmi öpatnÏ nebo se nepohybujÌ v˘bec. TakovÈ spermie se potom aspirujÌ z ªkultivaËnÌch´ kapek mikroinjekËnÌ pipetou p¯Ìmo do PVP. K problematice mikrochirurgickÈho odbÏru spermiÌ je t¯eba dodat dvÏ z·kladnÌ pravidla. Za prvÈ, pacient, kter˝ m· podstoupit MESA, event. TESE, by mÏl vûdy p¯ed vlastnÌm operaËnÌm v˝konem odevzdat do laborato¯e ejakul·t a†k MESA Ëi TESE je t¯eba p¯istoupit teprve tehdy, aû je zcela jednoznaËnÈ, ûe z ejakul·tu nelze zÌskat û·dnÈ pouûitelnÈ spermie. Za druhÈ ñ ani opakovanÈ testikul·rnÌ biopsie ned·vajÌ vzhledem ke svÈmu fok·lnÌmu charakteru vyËerp·vajÌcÌ informaci o rezidu·lnÌ spermatogenezi.

4.5.2. P¯Ìprava oocyt˘ Cumulus oophorus i corona radiata musejÌ b˝t p¯ed ICSI kompletnÏ odstranÏny. Oocyto-kumul·rnÌ komplex se bezprost¯ednÏ po odbÏru kr·tce kultivuje (30 s) v roztoku mÈdia a hyaluronid·zy (koncentrace 80 IU/ml). Enzymaticky naruöenÈ vajeËnÈ obaly se potom mechanicky odstranÌ opakovan˝m nas·v·nÌm do Pasteuro-


47

vy pipety o pr˘mÏru tÈmÏ¯ srovnatelnÈm s velikostÌ oocytu (cca 150 μm). Protoûe lidskÈ oocyty jsou rezistentnÌ k†vÏtöinÏ partenogenetick˝ch aktivaËnÌch stimul˘, je velmi nepravdÏpodobnÈ, ûe by manipulace spojenÈ s odstraÚov·nÌm kumul·rnÌch a koron·rnÌch bunÏk vedly k†p¯edËasnÈ indukci oocyt·rnÌ aktivace. Mechanick· Ë·st odstraÚov·nÌ vajeËn˝ch obal˘ se musÌ prov·dÏt dostateËnÏ jemnÏ, aby nedoölo k poökozenÌ zona pellucida oocyt˘. Obaly je t¯eba odstranit zcela, protoûe zbytky corona radiata, kterÈ z˘stanou p¯ichyceny k zona pellucida, by mohly deformovat oocyt, a tÌm naruöit jeho dalöÌ v˝voj. BÏhem denudace oocyt˘ se kontroluje p¯Ìtomnost 1. pÛlovÈho tÏlÌska, tj.†dosaûenÌ metaf·ze II, a†eventu·lnÌ dalöÌ abnormality v morfologii oocyt˘ (nehomogenita cytoplazmy, tmavÈ oblasti v cytoplazmÏ nebo tmav· zona pellucida Ëi oolemma ªbulls eye´, vakuoly ap.), jeû by mohly negativnÏ ovlivnit schopnost fertilizace a†kvalitu embryÌ.

4.5.3. P¯Ìprava mikropipet V souËasnÈ dobÏ je jiû moûnÈ se rozhodnout, zda si bude pracoviötÏ mikropipety pro mikromanipulace p¯ipravovat samo nebo je zakoupÌ jiû hotovÈ. V naöÌ laborato¯i jsme dali p¯ednost p¯ÌpravÏ vlastnÌch kapil·r. MikroinjekËnÌ pipety vyr·bÌme z kapil·r Drummond (Drummond Scientific Company, USA). Kapil·ry opracov·v·me na p¯ÌstrojÌch Narishige. Kapil·ry nejprve umyjeme v ultrazvukovÈ l·zni a po opakovanÈm promytÌ redestilovanou vodou peËlivÏ vysuöÌme. PrvnÌm krokem opracov·nÌ kapil·ry je jejÌ vytaûenÌ na ªMicropipette Puller´ PB-7. N·sleduje zbrouöenÌ hrotu pomocÌ ªMicrogrinder´ EG-40. BrousÌme hroty se sklonem 40 stupÚ˘ a velikostÌ otvoru 7ñ10†μm, abychom postihli eventu·lnÌ morfologickÈ odliönosti hlaviËek spermiÌ. KoneËnou ˙pravou je tepelnÈ opracov·nÌ hrotu a ohnutÌ pipety na ªMicroforge´ MF-90 (˙hel cca 10°). Ve vlastnÌ laborato¯i si p¯ipravujeme i fixaËnÌ a denudaËnÌ pipety. Kapil·ry se umyjÌ stejnÏ jako ty, ze kter˝ch se zhotovujÌ mikroinjekËnÌ pipety. Po vytaûenÌ se zalomÌ kolmo na podÈlnou osu a†podle velikosti otvoru se rozdÏlÌ na fixaËnÌ a denudaËnÌ. ÿez se potom vÌce Ëi mÈnÏ opracuje teplem na ªMicroforge´ a fixaËnÌ pipety se zahnou (cca 10° vzhledem k podkladu).

4.5.4. P¯ÌstrojovÈ vybavenÌ pro mikromanipulace Z·kladem je vhodn˝ inverznÌ mikroskop, v naöem p¯ÌpadÏ IX70 Olympus s†Hoffmannov˝m modulaËnÌm kontrastem. Mikromani-

48


pul·tory Narishige ñ MNN-1 (Three Dimensional Micromanipulator) a MMO-202D (Hanging Joystick Hydraulic Micromanipulator) jsou umÌstÏny po obou stran·ch mikroskopu. SystÈm je doplnÏn na levÈ stranÏ (embryologovÈ pracujÌcÌ v†laborato¯i jsou prav·ci) ªhruböÌm´ mikroinjektorem IM-5B (Narishige), kter˝m se kontroluje podtlak fixaËnÌ mikropipety. Na pravÈ stranÏ je mikroinjektor IM-6 (Narishige) urËen˝ k injekcÌm spermiÌ. Nepostradatelnou souË·stÌ tohoto komplexu je vyh¯Ìvan˝ stolek HT 200, kter˝ se po kompletaci st·v· souË·stÌ mikroskopu a zaruËuje konstantnÌ teplotu pracovnÌho prostoru. Pro zd·rnou pr·ci je velmi d˘leûitÈ sestavenÌ celÈho systÈmu, peËlivÈ naplnÏnÌ mikroinjektor˘ miner·lnÌm olejem a odstranÏnÌ vöech vzduchov˝ch bublin.

4.5.5. Mikromanipulace Vöechny mikromanipualce se prov·dÏjÌ v kapk·ch mÈdia obsahujÌcÌho HEPES k udrûenÌ st·lÈho pH i na vzduchu. Kapky jsou umÌstÏny na vnit¯nÌ stranÏ vÌËka Petriho misky a p¯evrstveny parafinov˝m olejem vyh¯·t˝m na 37 °C. Spolu s kapkami jsou v misce i†kapky polyvinilpyrolidonu (PVP), do nichû se p¯id· mal˝ objem suspenze spermiÌ. PVP umoûÚuje dÌky svÈ vysokÈ viskozitÏ velmi dobrou kontrolu pohybu spermie a poslÈze cytoplazmy v mikroinjekËnÌ pipetÏ a selekci vhodnÈ spermie. Rychlost vlastnÌho provedenÌ z·visÌ na zkuöenosti a manu·lnÌ zruËnosti embryologa, na kvalitÏ spermiÌ a na eventu·lnÌm obsahu detritu Ëi jinÈho zneËiötÏnÌ suspenze PVP a spermiÌ. ObtÌûnÈ b˝v· provedenÌ ICSI p¯edevöÌm po MESA Ëi TESE.

n Selekce spermiÌ Pro rozhodnutÌ, kterou spermii injikovat, je d˘leûitÈ zohlednit p˘vod spermie. U ejakulovan˝ch spermiÌ je v˝hodnÏjöÌ aplikovat radÏji morfologicky ponÏkud odliönou spermii neû spermii zcela nepohyblivou, u kterÈ lze jen velmi tÏûko urËit, zda jiû nenÌ mrtv·. Spermie zÌskanÈ p¯i MESA Ëi TESE jsou vöak velmi Ëasto nepohyblivÈ z d˘vodu nezralosti, a nenÌ-li jin· moûnost, mohou b˝t injikov·ny. Ve spojitosti s ICSI vöak st·le z˘st·v· otev¯en· ot·zka v˝bÏru ªoptim·lnÌ´ a ªgeneticky zdravÈ´ spermie. Vzhledem k tomu, ûe zatÌm neexistuje moûnost selekce ªzdravÈ´ spermie podle jejÌ morfologie Ëi pohybu, je injikov·na takov· spermie, kter· se vöemi parametry nejvÌce p¯ibliûuje normÏ.


49

n P¯Ìprava spermie p¯ed injekcÌ Vybran· vhodn· spermie se mechanicky imobilizuje opakovan˝mi dotyky injekËnÌ jehly na st¯ednÌ Ë·st biËÌku. Tento dotyk staËÌ k†Ë·steËnÈmu poökozenÌ plazmatickÈ membr·ny spermie, kterÈ je podstatnÈ pro dekondenzaci j·dra spermie v oocytu a takÈ vede k†uvolnÏnÌ SAOAF (sperm-associated oocyte activating factor), l·tky zodpovÏdnÈ za aktivaci oocytu po pr˘niku spermie do jeho cytoplazmy. MechanickÈ zhmoûdÏnÌ biËÌku spermie je nutnÈ i u zcela nepohybliv˝ch spermiÌ. Takto p¯ipraven· spermie se potom aspiruje biËÌkem nap¯ed do injekËnÌ pipety. NÏkoliker˝m opakovan˝m posunem spermie v pipetÏ se ovÏ¯Ì, ûe se nep¯ilepila na jejÌ vnit¯nÌ stÏnu. PotÈ se injekËnÌ pipeta p¯esune do kapky mÈdia s jiû p¯edem denudovan˝m a zkontrolovan˝m oocytem. Zde se oocyt pomocÌ fixaËnÌ pipety zachytÌ tak, ûe pÛlovÈ tÏlÌsko je v postavenÌ ª12´ nebo ª6´. InjekËnÌ pipeta se potom umÌstÌ p¯esnÏ proti fixaËnÌ pipetÏ (v†poloze ª3´) a posunem nahoru Ëi dol˘ je dosaûena rovina. JedinÏ toto uspo¯·d·nÌ umoûÚuje ¯·dnou injekci spermie bez poruöenÌ dÏlÌcÌho v¯etÈnka oocytu.

n Injekce spermie Po dotyku zona pellucida injekËnÌ pipetou je spermie posunuta tÏsnÏ k†okraji injekËnÌ pipety. TÌm se minimalizuje objem PVP, kter˝ se dostane do oocytu. MikroinjekËnÌ pipeta se potom pomalu a opatrnÏ vsune dostateËnÏ hluboko do oocytu p¯i souËasnÈm vchlÌpenÌ vitelinnÌ membr·ny dovnit¯. Opatrn˝m nas·tÌm cytoplazmy do pipety je verifikov·na penetrace membr·ny, a tÌm se zaruËÌ, ûe po vypuzenÌ spermie z pipety se tato dostane skuteËnÏ do nitra oocytu a nikoli pouze do perivitelinnÌho prostoru. ObÏ operace, tj. aspirace i zpÏtn· injekce cytoplazmy a spermie, se musÌ prov·dÏt dostateËnÏ jemnÏ, aby nedoölo k z·vaûnÈmu poökozenÌ oocytu, kterÈ by vedlo k†jeho degeneraci nebo abnorm·lnÌmu v˝voji. InjikovanÈ oocyty se po opakovanÈm promytÌ od manipulaËnÌho mÈdia d·le kultivujÌ ve standardnÌch podmÌnk·ch obvykl˝ch v naöÌ laborato¯i.

4.5.6. Kontrola oplozenÌ Na z·kladÏ zn·m˝ch fakt˘ m˘ûeme ¯Ìci, ûe dalöÌ v˝voj oocyt˘ po ICSI je shodn˝ s v˝vojem ostatnÌch oocyt˘ v IVF programu. OplozenÌ (tj. p¯Ìtomnost prvojader a druhÈho pÛlovÈho tÏlÌska) se hodnotÌ cca 16ñ18 h po ICSI. D·le se kultivujÌ a poslÈze transferujÌ jen oocyty ¯·dnÏ oplozenÈ.

50


4.6. V˝sledky Intracytoplazmatick· injekce spermie je mimo¯·dnÏ sloûit˝ postup vyûadujÌcÌ nejen zruËnost a rutinu embryologa p¯i vlastnÌm v˝konu, ale i nezbytnÈ technickÈ ªknow-how´ jak p¯i p¯ÌpravÏ gamet p¯ed ICSI, tak i p¯i technickÈ p¯ÌpravÏ vlastnÌho mikromanipul·toru a†mikropipet a v neposlednÌ ¯adÏ i optim·lnÌ materi·lovÈ vybavenÌ (inverznÌ mikroskop s Hoffmannov˝m modulaËnÌm kontrastem, mikromanipul·tory Narishige s joystiky). V˝sledky dosaûenÈ v naöÌ laborato¯i dokumentuje tab. 12. Nelze-li zÌskat z ejakul·tu û·dnÈ spermie ani pro ICSI (kompletnÌ azoospermie), lze p¯istoupit k mikrochirurgickÈmu odbÏru epididym·lnÌch spermiÌ (MESA), event. p¯i ne˙spÏchu pokraËovat extrakcÌ spermiÌ p¯Ìmo z rete testis po bioptickÈm odbÏru (TESE). Tab. 13 ukazuje sum·rnÌ v˝sledky s pouûitÌm epididym·lnÌch a†testikul·rnÌch spermiÌ, v tab. 14 a 15 jsou samostatnÏ uvedeny v˝sledky pro epididym·lnÌ a testikul·rnÌ spermie. MESA a TESE jsme indikovali p¯i n·lezu kompletnÌ azoospermie v ejakul·tu. P¯i pr·ci s ejakulovan˝mi spermiemi byl po laboratornÌ ˙pravÏ pr˘mÏrn˝ celkov˝ poËet spermiÌ, kterÈ byly k dispozici pro ICSI, 250 000 (0,25 mil.). Od roku 1994 jsme jako prvnÌ v »eskÈ republice zavedli systÈm tzv. transportnÌ IVF. Stimulaci ovariÌ a odbÏr oocyt˘ prov·dÌ spoluTab. 12. Výsledky ICSI v období 1. 1.–31. 12. 1996 Počet pac. Oocyty

Fertil. (%) Deg. (%)

174

966 (71,1)

1358

ET (%)

161 (11,8) 162 (93,1)

Embrya Kryo (%) Grav. (%) 585

43 (24,7)

40 (24,7)

Tab. 13. Výsledky ICSI s použitím epididymálních a testikulárních spermií (MESA, TESE) Počet pac. Oocyty Fertil. (%) Deg. (%) ET (%) Embrya Kryo (%) Grav. (%) 12

132

58 (43,9)

13 (9,3)

9 (75)

36

3 (25)

3 (33,3)

Tab. 14. Výsledky ICSI s použitím epididymálních spermií (MESA) Počet pac. Oocyty 7 75

Fertil. (%) Deg. (%) 51 (68) 8 (10,7)

ET (%) 6 (85,7)

Embrya Kryo (%) Grav. (%) 24 2 (28,6) 2 (33,3)

Tab. 15. Výsledky ICSI s použitím testikulárních spermií (TESE) Počet pac. Oocyty 5 56

Fertil. (%) Deg. (%) 18 (32,1) 5 (8,9)

ET (%) 3 (60)*

Embrya Kryo (%) Grav. (%) 12 1 (20) 1 (33,3)

*) U dvou pacientek z pěti nebyly v bioptickému materiálu nalezeny žádné spermie, u všech tří zbylých pacientek byla získána embrya a proveden embryotransfer.


51

pracujÌcÌ gynekologickÈ pracoviötÏ, zÌskanÈ folikul·rnÌ tekutiny jsou potom transportov·ny do centr·lnÌ IVF laborato¯e, kde jsou identifikov·ny jednotlivÈ oocyty a†kde probÌh· laboratornÌ f·ze lÈËby a†transfer embryÌ do dÏlohy. Smyslem tohoto uspo¯·d·nÌ IVF programu je zainteresovat vÌce lÈka¯˘ do celÈho lÈËebnÈho procesu, p¯iblÌûit celou ªhigh-tech´ terapii pracoviöti a lÈka¯i, na kterÈho je pacientka zvykl·, a p¯itom racion·lnÏ koncentrovat n·roËnÈ materi·lovÈ vybavenÌ, zkuöenosti a embryologickÈ ªknow-how´ tak, aby pacient˘m byly zaruËeny optim·lnÌ v˝sledky a dostupnost poskytovanÈ pÈËe, pl·tci potom maxim·lnÏ racion·lnÌ vyuûitÌ poskytovan˝ch finanËnÌch prost¯edk˘. Vzhledem ke st·le nar˘stajÌcÌmu poËtu neplodn˝ch p·r˘ z d˘vodu snÌûenÈ plodnosti muûe jsme p¯istoupili i k prov·dÏnÌ ICSI u oocyt˘ z transportnÌho programu. V˝sledky 46 transportnÌch IVFICSI cykl˘ jsou uvedeny v tab. 16. U p·r˘ v transportnÌm ICSI programu, kdy intracytoplazmatickou injekci indikoval odesÌlajÌcÌ lÈka¯ a tato indikace byla respektov·na, byl po laboratornÌ ˙pravÏ pr˘mÏrn˝ celkov˝ poËet spermiÌ, kterÈ byly k dispozici pro ICSI, 2 080 000 (2,08 mil.). V roce 1996 bylo v programu IVF oplozeno 58,1 % vöech zÌskan˝ch oocyt˘ a efektivita terapie vykazovala 24,1 % klinick˝ch tÏhotenstvÌ na cyklus s transferem alespoÚ jednoho embrya. P¯i ICSI bylo tÈmÏ¯ ve vöech sledovan˝ch kategoriÌch dosaûeno vyööÌho procenta fertilizace neû ve standardnÌm IVF programu, coû v souvislosti se z·vaûnostÌ oöet¯ovan˝ch p¯Ìpad˘ (doned·vna terapeuticky zcela nep¯Ìstupn˝ch) nepochybnÏ svÏdËÌ o†mimo¯·dn˝ch moûnostech, kterÈ tato metodika nabÌzÌ. Na druhÈ stranÏ se na tomto faktu nepochybnÏ podÌlÌ i to, ûe metodika ICSI umoûÚuje dokonale posoudit kvalitu oöet¯ovan˝ch oocyt˘ a abnorm·lnÌ oocyty jsou z†programu vy¯azeny. Jedinou skupinou, kde je procento fertilizace signifikantnÏ niûöÌ oproti kontrolnÌ skupinÏ p·r˘ ve standardnÌm IVF programu, jsou nejz·vaûnÏjöÌ p¯Ìpady andrologickÈ sterility, u kter˝ch je nutno ICSI prov·dÏt se spermiemi zÌskan˝mi z testikul·rnÌ tk·nÏ. Pokud se vöak poda¯Ì tÌmto zp˘sobem spermie zÌskat a p¯ipravit je pro ICSI, lze i zde v naprostÈ vÏtöinÏ p¯Ìpad˘ oËek·vat, ûe bude proveden embryotransfer s velmi dobrou nadÏjÌ na dosaûenÌ tÏhotenstvÌ. Jelikoû partnerky tÏchto muû˘ jsou vÏtöinou gynekologicky bez jak˝chkoli problÈm˘ a jejich plodnost nenÌ naruöena, kompenzuje z¯ejmÏ tato skuteËnost handicap n·roËnÈho terapeutickÈho postupu a†vyhlÌdky na ˙spÏch jsou velmi dobrÈ. Tab. 16. Výsledky ICSI v transportním programu Počet pac. Oocyty 46 360

Fertil. (%) Deg. (%) ET (%) 260 (72,2) 37 (10,3) 45 (97,8)

Embrya Kryo (%) Grav. (%) 162 15 (32,6) 9 (19,5)

52


Jak jsme jiû d¯Ìve prok·zali v programu transportnÌ IVF, ani dÈle trvajÌcÌ p¯evoz oocyt˘ p¯i adekv·tnÌm zach·zenÌ neovlivÚuje dosahovanÈ v˝sledky. NenÌ proto p¯ekvapenÌm, ûe i v˝sledky ICSI (fertilizace 72,2†%, embryotransfer v 97,8 % cykl˘, kryokonzervace nadpoËetn˝ch embryÌ ve 32,6 % cykl˘) jsou v tÈto skupinÏ srovnatelnÈ s v˝sledky tÏch p·r˘, jejichû oocyty byly bezprost¯ednÏ oöet¯eny v†naöÌ embryologickÈ laborato¯i. O nÏco niûöÌ procento dosaûen˝ch tÏhotenstvÌ (19,5†%/ET) lze z¯ejmÏ vysvÏtlit tÌm, ûe pr˘mÏrnÈ parametry spermiogramu byly u†tÏchto p·r˘ signifikantnÏ lepöÌ a†ûe se z¯ejmÏ ve vyööÌm procentu na sterilitÏ p·ru spolu˙Ëastnil i jin˝ (gynekologick˝) faktor, kter˝ negativnÏ ovlivÚoval implantaci p¯enesen˝ch embryÌ. Intracytoplazmatick· injekce spermie umoûÚuje dos·hnout standardnÏ vysokÈho procenta fertilizace i u tÏch p·r˘, u kter˝ch na z·kladÏ poruchy interakce gamet nedoch·zÌ opakovanÏ k oplozenÌ oocyt˘ ani v kontrolovan˝ch podmÌnk·ch embryologickÈ laborato¯e

Obr. 5. Aspirace spermie do mikropipety před ICSI

Obr. 6. Fixace oocytu »holding« mikropipetou před ICSI, pólové tělísko u č. 6


53

Obr. 7. Hrot injekční mikropipety těsně před průnikem do cytoplazmy oocytu

Obr. 8. Deformace pružné oolemy před průnikem hrotu mikropipety do cytoplazmy

Obr. 9. Injekce spermie do ooplazmy

54


(aù je p¯ÌËina tÈto poruchy imunologickÈho p˘vodu nebo naöimi dneönÌmi vyöet¯ovacÌmi metodami zatÌm nezjistiteln·). NavÌc je z¯ejmÈ, ûe dojde-li k fertilizaci a p¯enosu embryÌ, vlastnÌ implantace jiû nenÌ naruöena a lze oËek·vat v˝sledky nejmÈnÏ tak dobrÈ, jako v†kontrolnÌm souboru. Dostupn· literatura a soubornÈ zkuöenosti renomovan˝ch pracoviöù neprok·zaly zv˝öenÈ riziko vrozen˝ch v˝vojov˝ch vad Ëi jin˝ch abnormalit u takto poËat˝ch dÏtÌ. P¯esto u vöech naöich tÏhotn˝ch po ICSI indikujeme vyöet¯enÌ metodami prenat·lnÌ diagnostiky a†doposud jsme nezaznamenali ani jeden z·chyt abnorm·lnÌho karyotypu plodu.

4.7. Z·vÏry l

l

l

l

l

l

DÌky rozvoji metod asistovanÈ reprodukce dnes pat¯Ì ned·vno jeötÏ prakticky nelÈËitelnÈ stavy andrologckÈ sterility mezi p¯Ìpady s mimo¯·dnÏ dobr˝mi vyhlÌdkami na ˙spÏch terapie. Intracytoplazmatick· injekce spermie p¯ekroËila problematiku nejasnÈ etiopatogeneze a ne˙spÏönÈ kauz·lnÌ terapie. DalöÌ rozvoj andrologie vöak vyûaduje n·vrat k tÈto problematice. Azoospermie jiû nenÌ jasnou indikacÌ pro pouûitÌ spermiÌ d·rce. Aspirace epididym·lnÌch spermiÌ Ëi extrakce testikul·rnÌch spermiÌ d·v· stejnou nadÏji na tÏhotenstvÌ jako ICSI s pouûitÌm ejakulovan˝ch spermiÌ. Ani vysok· efektivita ICSI by vöak nemÏla b˝t p¯ÌËinou menöÌ snahy o†exaktnÌ stanovenÌ p¯ÌËiny azoospermie, p¯edevöÌm se z¯etelem na genetickÈ aspekty. NavÌc p¯Ìpady obstrukËnÌ azoospermie majÌ mnohem vyööÌ nadÏji na ˙spÏch neû neobstrukËnÌ, a diagnÛza je proto d˘leûit· pro rozhodov·nÌ o dalöÌm postupu terapie. StandardnÌ ˙spÏönost transportnÌho IVF programu se potvrdila i v transportnÌm IVF-ICSI programu. Samotn˝ transport gamet neovlivÚuje dosaûenÈ v˝sledky, kritick˝mi se pro v˝sledky transportnÌho ICSI programu zdajÌ dalöÌ (gynekologickÈ) faktory sterility. KromÏ nejz·vaûnÏjöÌch p¯Ìpad˘ andrologicky podmÌnÏnÈ sterility p·ru existujÌ i neandrologickÈ indikace ICSI. Je to opakovanÈ idiopatickÈ selh·nÌ fertilizace oocyt˘ ve standardnÌm programu IVF a d·le selh·nÌ fertilizace p¯i prok·zanÈ imunologickÈ p¯ÌËinÏ sterility. Intracytoplazmatick· injekce spermie je postup, kter˝ v˝znamnÏ eliminuje nutnost pouûitÌ spermiÌ d·rce p¯i andrologicky podmÌnÏnÈ sterilitÏ a tÈmÏ¯ vöem postiûen˝m p·r˘m d·v· nadÏji dos·hnout tÏhotenstvÌ a†porodu geneticky vlastnÌho dÌtÏte.

55

5. SELEKCE EMBRYÕ PRO TRANSFER (PRODLOUéEN¡ KULTIVACE EMBRYÕ)

I p¯es rozs·hl˝ v˝zkum poskytujÌ bÏûn· komerËnÌ mÈdia suboptim·lnÌ podmÌnky pro v˝voj embryÌ projevujÌcÌ se jejich pomalejöÌm r˘stem in vitro neû in vivo.(21,66) P¯i pouûitÌ r˘zn˝ch p¯ÌsnÏ kontrolovan˝ch mÈdiÌ pouze 17ñ25 % ªnadpoËetn˝ch´ embryÌ dos·hlo po pÏtidennÌ kultivaci stadia blastocysty.(14,46) Naproti tomu po 48hodinovÈ kultivaci dos·hne 60ñ70 % inseminovan˝ch oocyt˘ stadia 4ñ6 bunÏËnÈho embrya a p¯i jejich p¯enosu v tomto stadiu je dosahov·no tÏhotenstvÌ v 15ñ20 %.(226) P¯i fertilizaci in vivo se embryo transportuje do dÏlohy ve stadiu kavitujÌcÌ blastocysty Ëtvrt˝ aû p·t˝ den po fertilizaci. Embrya transferovan· do dÏlohy za obvykl˝ch 48†h po inseminaci se dost·vajÌ do dÏloûnÌ dutiny minim·lnÏ o dva dny d¯Ìve a mohou degenerovat jeötÏ p¯ed implantacÌ. K selh·nÌ implantace m˘ûe p¯ispÌvat i chybÏnÌ Ëasn˝ch embryon·lnÌch sign·l˘. Za hlavnÌ p¯ÌËinu se vöak povaûuje nedostatek kritick˝ch r˘stov˝ch faktor˘ produkovan˝ch za norm·lnÌch okolnostÌ buÚkami reprodukËnÌho ˙strojÌ nebo jejich p¯ÌliönÈ na¯edÏnÌ v kultivaËnÌm mÈdiu, jsou-li produkov·ny samotn˝mi embryi. TÏmito mechanismy pak mohou autokrinnÌ a parakrinnÌ faktory regulovat v˝voj a diferenciaci preimplantaËnÌho embrya. Kontrola r˘stu a diferenciace savËÌ embryogeneze je regulov·na r˘stov˝mi faktory embryon·lnÌho Ëi mate¯skÈho p˘vodu. ÿada autor˘ prok·zala p¯i pouûitÌ odliön˝ch technik produkci r˘stov˝ch faktor˘ savËÌmi embryi.(142,232) Naproti tomu p¯id·nÌ r˘stov˝ch faktor˘ do chemicky p¯esnÏ definovan˝ch mÈdiÌ urychlilo r˘st myöÌch embryÌ i zr·nÌ a fertilizaci myöÌch oocyt˘ in vitro.(22,31) D˘kazem v˝znamu r˘stov˝ch faktor˘ pro v˝voj embrya je pr˘kaz specifick˝ch receptor˘ na kultivovan˝ch embryÌch. InzulÌnovÈ receptory se objevujÌ po dosaûenÌ osmibunÏËnÈho stadia souËasnÏ s p¯echodem z pyruv·tu na glukÛzu jako hlavnÌ zdroj energie bunÏËnÈho metabolismu.(109) Jednou z moûnostÌ, jak optimalizovat kultivaËnÌ prost¯edÌ, je pouûitÌ podp˘rn˝ch bunÏËn˝ch systÈm˘ (kokultivace). Tyto pomocnÈ buÚky buÔ uvolÚujÌ do prost¯edÌ r˘stovÈ faktory, a/nebo ab-

56


sorbujÌ toxiny negativnÏ ovlivÚujÌcÌ embryon·lnÌ v˝voj. V˝sledky lÈËby sterility p¯i tub·rnÌch transferech aù jiû gamet (GIFT) Ëi embryÌ (TET) jsou podle ˙daj˘ ¯ady pracoviöù lepöÌ neû v˝sledky klasickÈ IVF s uterinnÌm transferem embryÌ.(111) JednÌm z†moûn˝ch vysvÏtlenÌ je kr·tk· doba pobytu preembryÌ v artefici·lnÌm prost¯edÌ kultivaËnÌch mÈdiÌ a jejich Ëasn˝ transfer do vejcovod˘. SouËasnÏ embryotrofickÈ faktory p¯ÌtomnÈ v tub·rnÌ tekutinÏ podporujÌ jejich v˝voj a r˘st. Kokultivace embryÌ se tedy snaûÌ napodobit podmÌnky, kterÈ m· embryo ve fyziologickÈm prost¯edÌ.(18) Bongso pouûÌval pro kokultivace lidskÈ ampul·rnÌ buÚky a prok·zal morfologicky kvalitnÏjöÌ embrya a ËastÏjöÌ v˝voj aû do stadia blastocysty.(18) P¯i pouûitÌ kokultivaËnÌch systÈm˘ prok·zal lepöÌ v˝sledky oproti standardnÌ kultivaci jak p¯i IVF, tak p¯i TET. KromÏ ampul·rnÌch bunÏk se pouûÌvajÌ i jinÈ bunÏËnÈ linie,(18, 114,224, 232) avöak bez ohledu na jejich p˘vod je kvalita takto kultivovan˝ch embryÌ vûdy vyööÌ oproti standardnÌ kultivaci v samotnÈm mÈdiu. Je z¯ejmÈ, ûe efekt kokultivaËnÌch systÈm˘ nenÌ ani druhovÏ, ani tk·ÚovÏ specifick˝. Menezo pracuje s Vero buÚkami (stabilizovan· heteroploidnÌ tk·Úov· kultura z ledvin koËkodana) a publikoval ËastÏjöÌ v˝voj embryÌ aû do stadia blastocysty.(114) Mechanismy pozitivnÌho efektu kokultivacÌ nejsou doposud jednoznaËnÏ objasnÏny. V literatu¯e se diskutujÌ p¯edevöÌm dva moûnÈ zp˘soby: l do mÈdia jsou vyluËov·ny specifickÈ Ëi nespecifickÈ r˘stovÈ faktory; l buÚky podp˘rnÈ tk·ÚovÈ kultury odstraÚujÌ z mÈdia l·tky negativnÏ ovlivÚujÌcÌ embryon·lnÌ v˝voj. U ¯ady ûivoËiön˝ch druh˘ vËetnÏ ËlovÏka byla dokumentov·na z·stava r˘stu in vitro kultivovan˝ch embryÌ v dobÏ aktivace embryon·lnÌho genomu. KokultivaËnÌ systÈmy pom·hajÌ vÏtöinÏ savËÌch embryÌ toto kritickÈ stadium p¯eklenout, resp. umoûÚujÌ selekci norm·lnÏ se vyvÌjejÌcÌch embryÌ. PovzbudivÈ v˝sledky p¯i aplikaci kokultivacÌ naznaËujÌ, ûe r˘stovÈ faktory produkovanÈ buÚkami reprodukËnÌho ˙strojÌ mohou mÌt velmi d˘leûitou ˙lohu p¯i v˝voji a diferenciaci embrya. ProdlouûenÌ doby kultivace navÌc umoûÚuje lÈpe napodobit p¯irozenÈ mechanismy, a tak sniûuje nebezpeËÌ asynchronie mezi v˝vojem embrya a endometriem. Metodika kokultivacÌ m· vöak i svÈ nev˝hody a moûn· rizika. Mezi nev˝hody pat¯Ì p¯edevöÌm Ëasov· a finanËnÌ n·roËnost a riziko neuskuteËnÏnÌ embryotransferu z d˘vodu z·stavy r˘stu vöech embryÌ. HlavnÌ n·mitkou p¯i pouûitÌ kokultivacÌ jsou vöak obavy z†kontaminace embrya prost¯ednictvÌm bunÏk podp˘rnÈho monolayeru. Existuje sice pr·ce dokazujÌcÌ, ûe zona pellucida p˘sobÌ jako ochrann· bariÈra p¯ed infekcÌ baktÈriemi, plÌsnÏmi a vÏtöÌmi

Selekce embryÌ pro transfer (prodlouûen· kultivace embryÌ)

57

viry,(41) avöak pouze nÏkterÈ bunÏËnÈ linie jsou povaûov·ny za prokazatelnÏ bezpeËnÈ ñ jedn· se zejmÈna o Vero buÚky. PouûitÌ jin˝ch zvÌ¯ecÌch i lidsk˝ch bunÏËn˝ch liniÌ se povaûuje za potenci·lnÏ rizikovÈ. DalöÌm problÈmem je udrûov·nÌ ËistÈ plnohodnotnÈ a nekontaminovanÈ bunÏËnÈ linie bÏhem pas·ûov·nÌ, ¯eöenÌm jsou tk·ÚovÈ kultury udrûovanÈ co nejkratöÌ dobu. Velmi l·kavou alternativou, umoûÚujÌcÌ dlouhodobou kultivaci embryÌ stejnÏ jako kokultivace, jsou v poslednÌ dobÏ nov· komplexnÌ mÈdia, nap¯. mÈdium M3 (sloûenÈ z mÈdiÌ Ham F10 a F12 se syntetick˝m sÈrem SSR2) od firmy Medicult nebo HATCH-50 firmy Scandinavian IVF Science AB. Tak nap¯. Forsdahl docÌlil u neselektovan˝ch skupin pacientek po transferu maxim·lnÏ dvou morul (po 96 h kultivaci) nebo dvou blastocyst (po 120 h kultivace) 62 %, resp. 52 % klinick˝ch tÏhotenstvÌ na embryotransfer.(53) Huisman kombinoval Earlovo mÈdium a Ham F10 a docÌlil 50 % tÏhotenstvÌ po p¯enosu blastocyst po 120 h kultivace.(74) I p¯es rychl˝ v˝voj v uplynul˝ch tÈmÏ¯ dvaceti letech z˘st·v· efektivita lÈËby sterility metodou mimotÏlnÌho oplodnÏnÌ v pr˘mÏru kolem 20 %. Kokultivace a prodlouûenÈ kultivace embryÌ v komplexnÌch mÈdiÌch embryÌ se mohou uplatnit p¯edevöÌm u ûen s opakovan˝m selh·nÌm implantace ve standardnÌm uspo¯·d·nÌ IVF programu a souËasnÏ prohlubujÌ naöe znalosti o v˝voji a pot¯eb·ch preimplantaËnÌch embryÌ.

5.1. Soubory a metodika Ve skupinÏ pacientek, jejichû embrya byla kokultivov·na na podloûnÌ tk·ÚovÈ kultu¯e monolayeru Vero bunÏk, bylo 171 ûen, jejichû embrya byla p¯enesena do dÏlohy za 48 h po odbÏru oocyt˘, a 63 ûen, jejichû embrya byla transferov·na po 72 h kultivace. KontrolnÌ skupinu p¯edstavovalo 184 ûen s p¯enosem embryÌ po 48 h bez kokultivace. Ve skupinÏ ûen s prodlouûenou kultivacÌ embryÌ v komplexnÌch syntetick˝ch mÈdiÌch HATCH a M3 bylo 188 pacientek, jejichû embrya byla transferov·na po 72 h, 164 ûen s p¯enosem embryÌ po 96 h a 166 pacientek, jejichû embrya byla p¯enesena do dÏlohy po 120 h kultivace. Pro kokultivace jsme pouûÌvali Ëty¯jamkovÈ kultivaËnÌ n·dobky (Nunclon) a z·kladnÌ tk·Úov· kultura Vero bunÏk byla udrûov·na v mÈdiu H-199 obohacenÈm o 7 % bovinnÌho prekolostr·lnÌho sÈra (Bioveta). V den odbÏru oocyt˘ byla provedena trypsinizace z·kladnÌ tk·ÚovÈ kultury s pouûitÌm 0,05 % trypsinu a 0,02 % EDTA a p¯ipraven monolayer v mÈdiu obohacenÈm 15 % inaktivovanÈho sÈra

58


Obr. 10. Blastocysty po 120 hodinách kultivace

pacientky. Po 20ñ24 h byly buÚky z·kladnÌho monolayeru opakovanÏ promyty Ëist˝m mÈdiem a do ËerstvÈho mÈdia obohacenÈho sÈrem pacientky a na monolayer bunÏk podp˘rnÈ tk·ÚovÈ kultury byla p¯enesena embrya. Aû do transferu embryÌ nebylo mÈdium d·le mÏnÏno. ⁄SOL jako producent tk·ÚovÈ kultury Vero bunÏk zaruËuje jejich Ëistotu co se t˝k· kontaminace plÌsnÏmi, baktÈriemi, viry a mykoplazmaty. Za 24 h po odbÏru byla po mechanickÈm oËiötÏnÌ provedena kontrola inseminovan˝ch oocyt˘. Preembrya se dvÏma prvoj·dry a druh˝m pÛlov˝m tÏlÌskem byla rozdÏlena do dvou skupin bez ohledu na indikaci IVF, vÏk pacientky a poËet p¯edchozÌch IVF cykl˘ a d·le kultivov·na buÔ v samotnÈm mÈdiu H-199, nebo v†mÈdiu H-199 na podloûnÌ tk·ÚovÈ kultu¯e Vero bunÏk. Norm·lnÏ se vyvÌjejÌcÌ embrya rostoucÌ v samotnÈm mÈdiu byla transferov·na po 48 h kultivace a embrya kokultivovan· byla p¯enesena do dÏlohy za 48 nebo 72 h. PoËet transferovan˝ch embryÌ byl omezen na nejv˝öe Ëty¯i a vöechna eventu·lnÌ dalöÌ embrya byla kryokonzervov·na. U pacientek s prodlouûenou kultivacÌ v syntetick˝ch mÈdiÌch byla embrya kultivov·na 48 h ve standardnÌm IVF mÈdiu a potÈ ve Ëty¯bunÏËnÈm stadiu p¯enesena do mÈdia M3 nebo HATCH-50 a transferov·na po 72, 96 nebo 120 h od zÌsk·nÌ oocyt˘. Jako klinickÈ tÏhotenstvÌ bylo hodnoceno kaûdÈ tÏhotenstvÌ, u†nÏhoû byl ultrazvukem prok·z·n intrauterinnÏ gestaËnÌ v·Ëek. StatistickÈ hodnocenÌ bylo provedeno s pouûitÌm χ-kvadr·t testu.

Selekce embryÌ pro transfer (prodlouûen· kultivace embryÌ)

59

5.2. V˝sledky Ve sledovanÈ skupinÏ 171 ûen, jejichû kokultivovan· embrya byla transferov·na po 48†h, jich otÏhotnÏlo 41 (23,9 %) a nejlepöÌch v˝sledk˘ s kokultivacemi jsme docÌlili po transferech za 72 h: 20 tÏhotenstvÌ u 63 ûen p¯edstavuje ˙spÏönost 31,7 %. V kontrolnÌ skupinÏ 184 ûen s kultivacÌ embryÌ ve standardnÌm IVF mÈdiu a jejich p¯enosu po 48 h otÏhotnÏlo 39 pacientek (20,9 %). Ve skupinÏ s pouûitÌm modernÌch komplexnÌch syntetick˝ch mÈdiÌ otÏhotnÏlo 51 ûen (27,1 %) po transferu po 72 h, 44 ûen (26,8 %) po 96†h a†koneËnÏ 47 ûen (28,3 %) po p¯enosu embryÌ po 120 h kultivace. V˝sledky jsou sum·rnÏ uvedeny v tab. 17. Tab. 17. Srovnání výsledků IVF po standardní kultivaci a prodloužené kultivaci po kokultivaci s Vero buňkami nebo v syntetickém komplexním médiu Σ pacientek

Σ grav./ET

%

Standard kultivace Kokultivace VERO

48 hod 48 hod

184 171

39 41

20,2 23,9

Kokultivace VERO HATCH 50 + M3 HATCH 50 + M3

72 hod 72 hod 96 hod

63 188 164

20 51 44

31,7 27,1 26,8

HATCH 50 + M3

120 hod

166

47

28,3

5.3. Z·vÏr Prodlouûen· kultivace embryÌ (aù jiû za pomoci kokultivaËnÌch systÈm˘ nebo ve speci·lnÌch komplexnÌch mÈdiÌch) ve vöech p¯Ìpadech zv˝öila efektivitu IVF. Tyto postupy rozöi¯ujÌ moûnosti terapeutickÈho p¯Ìstupu v r·mci IVF tÌm, ûe umoûÚujÌ individu·lnÌ p¯Ìstup ke kaûdÈ pacientce. Na z·kladÏ vÌce neû dvoulet˝ch zkuöenostÌ s Vero buÚkami lze ¯Ìci, ûe jsme p¯i jejich pouûitÌ pro kokultivace lidsk˝ch embryÌ v†programu IVF nezaznamenali û·dnÈ komplikace (infekce, vÏtöÌ poËet potrat˘). PouûitÌ nov˝ch komplexnÌch mÈdiÌ tak nejen v˝znamnÏ zjednoduöilo a zp¯Ìstupnilo moûnost prodlouûen˝ch kultivacÌ, ale eliminuje i (teoretick· a n·mi neprok·zan·) p¯Ìpadn· rizika kultivace embryÌ za p¯Ìtomnosti jin˝ch bunÏËn˝ch kultur. Prodlouûen· kultivace zkvalitÚuje v˝sledky IVF dÌky moûnosti selekce ûivotaschopn˝ch embryÌ a moûnosti vÏtöÌ synchronizace mezi v˝vojem embrya a endometria.

60

6. KRYOKONZERVACE EMBRYÕ

PouûitÌ modernÌch stimulaËnÌch protokol˘ Ëasto vede k zÌsk·nÌ vÏtöÌho poËtu oocyt˘ a n·slednÏ embryÌ, kterÈ nenÌ moûnÈ najednou p¯enÈst do dÏlohy bez vysokÈho rizika mnohoËetnÈho tÏhotenstvÌ. Toto nejen ËistÏ odbornÈ, ale tÈû etickÈ dilema ¯eöÌ kryokonzervace embryÌ, jejÌû v˝hody byly rozpozn·ny jiû v dobÏ rozvoje metodiky IVF.(219) Po ˙spÏönÈ kryokonzervaci embryÌ ve veterin·rnÌ medicÌnÏ jsou od roku 1984 dosahov·na tÏhotenstvÌ i po transferu rozmrazen˝ch lidsk˝ch embryÌ.(27,147,211,216,243) Jiû v roce 1987 referoval Van Steirteghem na 5. svÏtovÈm kongresu IVF o v˝sledcÌch multicentrickÈ studie o kryokonzervaci embryÌ, kdy bylo ve 20 centrech porozeno 63 dÏtÌ. PrvnÌ zkuöenosti s touto metodou publikoval v dom·cÌm pÌsemnictvÌ Hanzelka(65) a prvnÌ ˙spÏön· tÏhotenstvÌ s porodem zdravÈho plodu naöe skupina.(117) Dnes jiû existuje ¯ada vypracovan˝ch metod kryokonzervace, kterÈ jsou bÏûnÏ pouûÌv·ny v ¯adÏ IVF laborato¯Ì po celÈm svÏtÏ. Kryokonzervace nadpoËetn˝ch embryÌ umoûÚuje jejich uchov·nÌ a†p¯enos v n·sledn˝ch cyklech zvyöuje efektivitu IVF a souËasnÏ ¯eöÌ etick˝ problÈm osudu tÏchto embryÌ. Kryokonzervace p¯edstavuje takÈ mimo¯·dnÏ efektivnÌ ¯eöenÌ nÏkter˝ch komplikacÌ asistovanÈ reprodukce, nap¯. p¯Ìpad˘ hrozÌcÌho z·vaûnÈho hyperstimulaËnÌho syndromu. HlavnÌm faktorem, kter˝ zp˘sobuje poökozenÌ vöech ûiv˝ch bunÏk p¯i zamrazenÌ a n·slednÈm rozmrazenÌ, je tvorba intracelul·rnÌho ledu a s tÌm spojenÈ osmotickÈ zmÏny. Tomu se zabraÚuje tÌm, ûe se buÚky p¯ed zamrazenÌm dostateËnÏ dehydratujÌ. Nutn· je tÈû p¯Ìtomnost tzv. kryoprotektant˘, kterÈ buÚku chr·nÌ p¯ed poökozenÌm a souËasnÏ sniûujÌ bod t·nÌ protekËnÌho mÈdia. Dehydratace bunÏk je moûnÈ dos·hnout v principu dvÏma zp˘soby. P¯i prvnÌm zp˘sobu probÌh· dehydratace p¯i teplot·ch pod bodem tuhnutÌ kryoprotekËnÌ smÏsi. Vyvol·nÌm tvorby ledu v kryoprotekËnÌm mÈdiu se zvyöuje relativnÌ koncentrace rozpuötÏn˝ch l·tek a doch·zÌ k poruöenÌ osmotickÈ rovnov·hy na bunÏËnÈ membr·nÏ. Aby se tato rovnov·ha obnovila, pronik· voda z buÚky do

Kryokonzervace embryÌ

61

okolnÌho mÈdia a buÚka se tÌm dehydratuje. P¯i dalöÌm snÌûenÌ teploty se tento jev opakuje, aû v koneËnÈ f·zi m˘ûe dojÌt k†tÈmÏ¯ ˙plnÈ dehydrataci. Sniûov·nÌ teploty musÌ b˝t velmi pomalÈ, aby voda obsaûen· v buÚce staËila prostupovat bunÏËnou membr·nou a nedoölo k jejÌmu zmrznutÌ uvnit¯ buÚky. Druhou moûnostÌ dehydratace je pouûitÌ l·tek, kterÈ neproch·zejÌ bunÏËnou membr·nou, a umoûÚujÌ tak prostup vody z buÚky ve smÏru koncentraËnÌho gradientu. Pro tento ˙Ëel se nejËastÏji pouûÌv· sacharÛza. V†praxi se nÏkdy oba zp˘soby kombinujÌ. Po zmrazenÌ je moûno uchov·vat buÚky p¯i teplotÏ kapalnÈho dusÌku (-196 °C) teoreticky po neomezenou dobu. Z d˘vod˘ etick˝ch i technick˝ch je t¯eba dobu skladov·nÌ limitovat. Zp˘soby rozmrazenÌ se liöÌ podle toho, jak˝m zp˘sobem bylo provedeno zamrazenÌ. V koneËnÈ f·zi je pak t¯eba odstranit z bunÏk kryoprotektant. To se musÌ prov·dÏt postupnÏ, aby nedoölo k nadmÏrnÈmu nabobtn·nÌ bunÏk a jejich poökozenÌ. Zde se opÏt uplatÚujÌ l·tky typu sacharÛzy, kterÈ p˘sobÌ jako osmotick˝ pufr. PrvnÌ pr·ce popisujÌcÌ norm·lnÌ v˝voj myöÌch embryÌ po zamrazenÌ na ≠196 °C se datujÌ od poË·tku 70. let.(231,230) Pro lidsk· embrya byl tento postup poprvÈ pouûit v roce 1983.(216) P˘vodnÌ metody pouûÌvaly pomalÈ ochlazenÌ rychlostÌ -0,2 °C/min do -80 °C za p¯Ìtomnosti dimetylsulfoxidu (DMSO) jako kryoprotektantu a pomalÈ oh¯Ìv·nÌ (4ñ25 °C/min) p¯i rozmrazenÌ. Od tÈ doby byly metody kryokonzervace modifikov·ny za pouûitÌ jin˝ch kryoprotektant˘ nebo jejich smÏsÌ a byly vypracov·ny zkr·cenÈ postupy s rychl˝m rozmrazov·nÌm.(27,28,46,67,87,130,178,220) V souËasnÈ dobÏ se pro kryokonzervaci lidsk˝ch embryÌ nejËastÏji pouûÌvajÌ metody zaloûenÈ na postupu popsanÈm Lassallem v roce 1985.(87) Jako kryoprotektant se pouûÌv· 1,5†M 1,2-propandiol (PROH) za p¯Ìtomnosti sacharÛzy, vzorek se ochlazuje rychlostÌ -0,3 °C/min do -30 °C a rozmrazenÌ se prov·dÌ rychlostÌ asi 200ñ300 °C/min. Jin˝ postup p¯edstavuje tzv. ªrapid freezing´ Ëi vitrifikace. Metoda vyûaduje jednor·zovou expozici embryÌ vysok˝m koncentracÌm kryoprotekËnÌho mÈdia s n·sledn˝m pono¯enÌm do tekutÈho dusÌku.(217,218) V˝hodou proti klasick˝m metod·m jsou minim·lnÌ n·roky na p¯ÌstrojovÈ vybavenÌ a rychlost provedenÌ (embrya se z pokojovÈ teploty nebo teploty 0ñ4†°C dost·vajÌ p¯Ìmo do tekutÈho dusÌku), nev˝hodou je vysok· koncentrace kryoprotektiva, kter· by p¯i delöÌm p˘sobenÌ p¯i laboratornÌ teplotÏ mohla p˘sobit toxicky. Pro lidsk· embrya pouûil tento postup poprvÈ Trounson v roce 1988(217) s pouûitÌm dimetylsulfoxidu jako kryoprotektiva. Tyto pr·ce p¯inesly rozöÌ¯enÌ kryokonzervace prakticky do vöech kvalitnÌch IVF laborato¯Ì. AËkoli je stanovenÌ ide·lnÌho kryokonzervaËnÌho protokolu obtÌûnÈ, vÏtöina laborato¯Ì d·v· p¯ednost zamrazov·nÌ embryÌ ve stadiu prvojader nebo v Ëasn˝ch f·zÌch jejich v˝voje v PROH nebo DMSO.

62


NovÈ postupy kultivace embryÌ p¯inesly moûnost kultivovat embrya aû do stadia expandovanÈ blastocysty a pop¯ÌpadÏ i nutnost kryokonzervace v tÏchto v˝vojov˝ch stadiÌch.(27,46,67) Pro tyto p¯Ìpady se jako kryoprotektant vyuûÌv· glycerol obsaûen˝ ve stoupajÌcÌch koncentracÌch v kryokonzervaËnÌm mÈdiu a po seedingu a pomalÈm ochlazenÌ na -36 °C n·sleduje rychlÈ zmrazenÌ na teplotu -196 °C. RozmrazenÌ se prov·dÌ v temperovanÈ l·zni s n·sledn˝m postupn˝m vymytÌm p¯ÌtomnÈho glycerolu. V˝öe zmÌnÏnÈ postupy tak umoûÚujÌ kryokonzervaci vöech v˝vojov˝ch stadiÌ lidsk˝ch preimplantaËnÌch embryÌ a umoûÚujÌ optim·lnÌ volbu lÈËebnÈ strategie. V˝sledky kryokonzervace ovlivÚuje ¯ada faktor˘: l technickÈ parametry (volba kryoprotektiva ñ glycerol, dimetylsulfoxid, 1,2-propandiol) v z·vislosti na pouûitÈ metodÏ mrazenÌ (¯Ìzen· kryokonzervace, ultra-rapid freezing); l embryon·lnÌ faktory ñ kvalita kryokonzervovan˝ch embryÌ pat¯Ì mezi z·sadnÌ faktory ovlivÚujÌcÌ v˝sledky; na tuto skuteËnost opakovanÏ upozornila ¯ada autor˘;(27,54,100,227) l mate¯skÈ faktory ñ p¯edevöÌm vÏk;(227) l poËet p¯en·öen˝ch embryÌ, pouûit˝ stimulaËnÌ protokol v p˘vodnÌm IVF cyklu. SkuteËn· efektivita kryokonzervace nenÌ z pÌsemn˝ch pracÌ snadno hodnotiteln·, neboù ¯ada autor˘ publikovala pouze malÈ soubory nebo v˝sledky u vybran˝ch skupin pacientek.(100,211) NovÏji publikoval soubor v˝sledk˘ 897 kryotransfer˘ Wang.(227) Ve sledovanÈm osmiletÈm obdobÌ docÌlil po 897 p¯enosech rozmrazen˝ch kryokonzervovan˝ch embryÌ 98 tÏhotenstvÌ (10,9 %). Mezi hlavnÌmi faktory ovlivÚujÌcÌmi dosaûenÈ v˝sledky uv·dÌ vÏk pacientky, poËet p¯en·öen˝ch embryÌ a poËet a kvalitu zÌskan˝ch oocyt˘ v p˘vodnÌm IVF cyklu. Vliv kvality embryÌ na v˝sledky kryokonzervace a†naopak vliv kryokonzervace na kvalitu p¯en·öen˝ch embryÌ dovolujÌ posoudit v˝sledky z programu darovan˝ch oocyt˘, kdy je Ë·st embryÌ poch·zejÌcÌch z oocyt˘ stejnÈ d·rkynÏ p¯en·öena v ªËerstvÈm´ stavu bez kryokonzervace a Ë·st po kryokonzervaci. Selick(165) ve svÈ pr·ci uv·dÌ, ûe signifikantnÏ vÏtöÌ poËet kvalitnÌch embryÌ ve vyööÌch v˝vojov˝ch stadiÌch lze nalÈzt p¯i p¯enosu Ëerstv˝ch embryÌ oproti rozmrazen˝m embryÌm, aËkoli n·slednÈ hodnocenÌ implantace Ëerstv˝ch a rozmrazen˝ch embryÌ (19/151ñ12,6 % vers. 9/111ñ8,1 %) a†tÏhotenstvÌ ukonËen˝ch porodem (11/42ñ26,2 % vers. 6/45ñ13,3†%) neprok·zalo statisticky signifikantnÌ rozdÌly. Auto¯i uzavÌrajÌ, ûe kryokonzervace sice Ë·steËnÏ negativnÏ ovlivÚuje kvalitu p¯en·öen˝ch embryÌ, nem· vöak vliv na implantaËnÌ a dalöÌ v˝vojov˝ potenci·l vysoce kvalitnÌch embryÌ.


63

6.1. Soubor a metodika Do souboru jsou za¯azeny pacientky, u kter˝ch byla provedena kryokonzervace embryÌ zÌskan˝ch v programu IVF na OddÏlenÌ asistovanÈ reprodukce ⁄stavu pro pÈËi o matku a dÌtÏ v letech 1991ñ1995 a od roku 1996 stejnou pracovnÌ skupinou v Sanatoriu Pronatal. Embrya byla zmrazov·na od stadia prvojader aû po stadium expandovanÈ blastocysty, tj. od 18 do 120 h po oplozenÌ. Kryokonzervace se prov·dÏla metodou ¯ÌzenÈho zmrazov·nÌ na p¯Ìstroji Planer Kryo 10/1,7 za pouûitÌ 1,5 M 1,2-propandiolu a†0,1†M sacharÛzy (ve v˝jimeËn˝ch p¯Ìpadech s pouûitÌm 8% glycerolu u stadia blastocyst), nebo metodou vitrifikace s pouûitÌm 4M 1,2-propandiolu a 0,25M sacharÛzy. Podrobn˝ popis n·mi uûÌvan˝ch protokol˘ je uveden v naöich d¯Ìve publikovan˝ch sdÏlenÌch.(117,116) Metoda vitrifikace byla pouûÌv·na v letech 1991ñ1993, kdy nebylo jeötÏ k dispozici kryokonzervaËnÌ za¯ÌzenÌ, v pozdÏjöÌ dobÏ pouze v Ëasov˝ch ˙secÌch, kdy toto za¯ÌzenÌ nebylo moûnÈ pouûÌt. Zamrazov·na byla: l ªnadpoËetn·´ embrya zbyl· po p¯enosu Ëerstv˝ch embryÌ; l embrya ve stadiu prvojader. V p¯ÌpadÏ vÏtöÌho poËtu oplozen˝ch oocyt˘ se urËit˝ poËet embryÌ zamrazoval uû ve stadiu prvojader, po transferu se pop¯ÌpadÏ dodateËnÏ zamrazila zbyl· embrya; l vöechna embrya u pacientek s komplikacemi (hrozÌcÌ z·vaûn˝ hyperstimulaËnÌ syndrom, endometri·lnÌ polypy detekovanÈ aû bÏhem stimulace). Po rozmrazenÌ se embrya transferovala ihned, nebo se kultivovala obvykle 24ñ48 h v odpovÌdajÌcÌm kultivaËnÌm mÈdiu podle stadia v˝voje (IVF-50, Hatch-Scandinavian IVF Science). Postupem Ëasu jsme opustili fixnÌ protokoly p¯Ìpravy p¯ed p¯enosem rozmrazen˝ch embryÌ a postupujeme individu·lnÏ. U spont·nnÏ ovulujÌcÌch ûen preferujeme ultrasonograficky a event. hormon·lnÏ sledovanÈ cykly s†Ëasov·nÌm ovulace pomocÌ aplikace hCG (Pregnyl). P¯enos rozmrazen˝ch embryÌ pl·nujeme 48 h po probÏhlÈ ovulaci. U pacientek s anovulaËnÌmi cykly volÌme buÔ stimulaci ovulace nÌzk˝mi d·vkami hMG (Pergonal, Humegon, Menogon) Ëi FSH (Metrodin), nebo p¯en·öÌme embrya do zcela artefici·lnÌch HRT cykl˘ po p¯ÌpravÏ endometria sekvenËnÌm pod·v·nÌm estradiolu a progesteronu.(102) HRT cykly volÌme z·sadnÏ u pacientek s PCO syndromem s rizikem hyperstimulace i po mal˝ch d·vk·ch gonadotropin˘ a u pacientek s ˙pornou anovulacÌ vyûadujÌcÌ vysokÈ d·vky gonadotropin˘ k dosaûenÌ norm·lnÌ folikulogeneze. StatistickÈ hodnocenÌ bylo provedeno pomocÌ Studentova t-testu.

64


500 450 437

400 350 300 250

258

200 150

175 147

100 50 11

59

1991

1992

0

1993

1994

1995

1996

Graf 12. IVF cykly s kryokonzervací embryí

6.2. V˝sledky PoËet pacientek, u kter˝ch byla provedena kryokonzervace embryÌ zÌskan˝ch v IVF cyklu, se v pr˘bÏhu let v˝raznÏ zvyöoval (graf 12). V˝sledky kryokonzervace v letech 1991ñ1996 jsou p¯ehlednÏ uvedeny v tab. 18. Na vznik tÏhotenstvÌ po transferu kryokonzervovan˝ch embryÌ m· velk˝ vliv kvalita zamrazen˝ch embryÌ (tab. 19). I kdyû se kvaTab. 18. Výsledky kryokonzervace embryí 1991–1996 Rok

Cykly – rozmrazení

Kryotransfery (%)

1991

3

3 (100)

1992 1993 1994

17 73 124

17 (100) 66 (90) 119 (96)

1995 1996 celkem

124 254 595

110 (89) 223 (88) 538 (90,4)

Těhotenství (%) 0 1 (6) 2 (3) 4 (12) 9 (8) 17 (8) 43 (8)

Tab. 19. Vliv selekce embryí na výsledky po přenosu rozmrazených embryí Skupina »nadpočetná« embrya prvojádra a cykly bez ET celkem +, ++ p < 0,05

Rozmrazení Kryotransfery Těhotenství (kryo) (KET) (%)

Grav./KET (%)

Grav./kryo (%)

474

451 (95)

33

7,3 +

7,0 ++

105

99 (94)

14

14,1 +

13,3 ++

579

550 (95)

47

8,5

8,1


65

lita embryÌ neprojevila v jejich schopnosti p¯eûÌt kryokonzervaci (stejnÈ procento kryotransfer˘ na cyklus s rozmrazenÌm), stupeÚ implantace byl signifikantnÏ vyööÌ ve skupinÏ, v nÌû byla zamrazena buÔ vöechna embrya, nebo embrya ve stadiu prvojader. V tÏchto p¯Ìpadech se p¯ed zamrazenÌm neprov·dÏlaû·dn· negativnÌ selekce a zamrazovan· embrya byla srovnateln· s embryi, kter· se transferovala v klasick˝ch IVF cyklech. Druh˝m faktorem, kter˝ v˝raznÏ ovlivÚuje implantaci, je kultivace embryÌ po rozmrazenÌ. Aû do ned·vnÈ doby doporuËovala vÏtöina autor˘ kultivovat pouze embrya zamrazen· ve stadiu prvojader, u rozdÏlen˝ch embryÌ se doporuËovalo provÈst transfer pokud moûno do jednÈ hodiny po rozmrazenÌ. V loÚskÈm roce publikoval Kjekshus(83) lepöÌ v˝sledky v p¯Ìpadech, kdy byla kryokonzervovan· embrya p¯ed transferem kultivov·na 24†h. Tato skuteËnost se potvrdila v naöem souboru (tab. 20). Podle naöich zkuöenostÌ p¯eûÌvajÌ kryokonzervaci nejlÈpe embrya zamrazen· ve stadiu prvojader. Proto u pacientek, u kter˝ch je indikovan· kryokonzervace vöech embryÌ, je nejvhodnÏjöÌ provÈst zamrazenÌ jiû v tomto stadiu (tab. 21). Vöechna pracoviötÏ, kter· prov·dÏjÌ kryokonzervaci embryÌ, shodnÏ popisujÌ snÌûenou schopnost implantace u rozmrazen˝ch embryÌ ve srovn·nÌ s embryi z p˘vodnÌch IVF cykl˘. Tento fakt m˘ûe b˝t do jistÈ mÌry ovlivnÏn v˝bÏrem embryÌ, urËen˝ch ke kryokonzervaci. I kdyû vÏtöina autor˘ uv·dÌ, ûe zamrazujÌ pouze kvalitnÌ embrya, nejkvalitnÏjöÌ embrya jsou tÈmÏ¯ vûdy transferov·na v†p˘vodnÌm cyklu. Jestliûe pacientka v p˘vodnÌm cyklu neotÏhotnÌ, prov·dÌ se transfer mÈnÏ kvalitnÌch kryokonzervovan˝ch embryÌ. HoröÌ v˝sledky jsou tedy zcela logick˝m n·sledkem. Tab. 20. Vliv kultivace rozmrazených embryí před transferem na počet dosažených těhotenství Skupina bez kultivace s kultivací celkem

Rozmrazení Kryotransfery Těhotenství (kryo) (KET) (%) 456 123 579

429 (94) 121 (98) 550 (95)

28 19 47

Grav./KET (%)

Grav./kryo (%)

6,6 + 15,7 + 8,5

6,1 ++ 15,4 ++ 8,1

+, ++ p < 0,01

Tab. 21. Vliv vývojového stupně zamrazených embryí na počet dosažených těhotenství Skupina prvojádra 48 hod 72–120 h +, ++ p < 0,05

Rozmrazení Kryotransfery Těhotenství (kryo) (KET) (%) 69 310 200

67 (97) 292 (94) 191 (95)

10 21 16

Grav./KET (%)

Grav./kryo (%)

14,9 + 7,2 + 8,4

14,5 ++ 6,8 ++ 8,0

66


V naöem souboru jsme zejmÈna zpoË·tku zamrazovali i mÈnÏ kvalitnÌ embrya (ve skupinÏ ªnadpoËetn˝ch´ embryÌ bylo tÈmÏ¯ 60†% embryÌ v˝raznÏ horöÌ kvality). P¯esto i v tÈto skupinÏ bylo dosaûeno 7 % tÏhotenstvÌ na cyklus s rozmrazenÌm. P¯eûÌv·nÌ embryÌ po kryokonzervaci bylo velmi dobrÈ ñ v 95 % vöech p¯Ìpad˘ se po rozmrazenÌ realizoval kryotransfer. LepöÌch v˝sledk˘ bylo dosaûeno ve skupinÏ, v nÌû se neprov·dÏla prim·rnÌ selekce embryÌ pro transfer, tj. v†p¯ÌpadÏ zamrazenÌ embryÌ jiû po 20 h kultivace, a†u†pacientek, u†kter˝ch byla zamrazena vöechna embrya. V†tÏchto p¯Ìpadech bylo dosaûeno 14 tÏhotenstvÌ na 99 kryotransfer˘. ZajÌmav˝ v˝sledek je pozitivnÌ vliv kultivace embryÌ po rozmrazenÌ. RozdÌl v procentu tÏhotenstvÌ na kryotransfer ve skupinÏ bez kultivace (6,6†%) a s kultivacÌ (15,7 %) je vysoce statisticky v˝znamn˝. Tento postup takÈ umoûÚuje vy¯adit embrya, kter· se po rozmrazenÌ nevyvÌjejÌ. Ve vÏtöinÏ p¯Ìpad˘ se vöak i Ë·steËnÏ poökozen· embrya vyvÌjela norm·lnÏ a pouze ve v˝jimeËn˝ch p¯Ìpadech nemohl b˝t kryotransfer proveden. DalöÌ v˝hodou je moûnost lÈpe koordinovat jednotlivÈ pracovnÌ ˙kony.

6.3. Z·vÏr Kryokonzervace embryÌ m· na souËasnÈm stupni v˝voje asistovanÈ reprodukce nezastupitelnÈ mÌsto. Zvyöuje efektivitu in vitro fertilizace ñ k tÏhotenstvÌm z p˘vodnÌho cyklu po p¯enosu Ëerstv˝ch embryÌ p¯istupuje dalöÌch 8,5 % tÏhotenstvÌ po p¯enosu rozmrazen˝ch embryÌ (hodnoceno v celÈm souboru od poË·tk˘ kryokonzervace na naöem pracoviöti), resp. dalöÌch 15,7 % (pozdÏjöÌ vybran˝ soubor, kde jiû byly aplikov·ny modifikace celÈho postupu). ÿeöÌ i†etick˝ problÈm tzv. nadpoËetn˝ch embryÌ a je souË·stÌ strategie p¯i prevenci a ¯eöenÌ komplikacÌ asistovanÈ reprodukce.

67

7. OSUD TÃHOTENSTVÕ A†PERINAT¡LNÕ V›SLEDKY V†SOUBORU TÃHOTN›CH éEN PO IVF A ET

Po narozenÌ Louisie BrownovÈ se lÈËba sterility metodou mimotÏlnÌho oplodnÏnÌ stala rutinnÌ terapeutickou metodou poskytujÌcÌ nadÏji na tÏhotenstvÌ ¯adÏ do tÈ doby ne˙spÏönÏ lÈËen˝ch bezdÏtn˝ch p·r˘. DÌky tÈto metodÏ se na celÈm svÏtÏ narodilo ñ podle zpr·vy z†10. svÏtovÈho kongresu o IVF ve Vancouvru ñ jiû vÌce neû 300 000 dÏtÌ. ⁄spÏönost IVF je vyjad¯ov·na poËty dosaûen˝ch tÏhotenstvÌ, aËkoli jedin˝m podstatn˝m faktem zajÌmajÌcÌm rodiËe je narozenÌ zdravÈho dÌtÏte. I kdyû existuje ¯ada celost·tnÌch registr˘ centralizujÌcÌch data o efektivitÏ metody, o osudech tÏchto tÏhotenstvÌ a perinat·lnÌch v˝sledcÌch je pracÌ mnohem mÈnÏ. V˝sledky tÏhotenstvÌ po IVF nelze jednoduöe srovn·vat s bÏûnou populacÌ vzhledem k†rozdÌlu ve v˝skytu takov˝ch rizikov˝ch faktor˘, jako je vÏk, parita, anamnÈza dlouhodobÈ sterility Ëi anamnÈza ªpoor reproductive performance´, stejnÏ jako v˝raznÏ ËastÏjöÌ vÌceËetn· tÏhotenstvÌ, kter· nutnÏ ovlivÚujÌ perinat·lnÌ v˝sledky. Sledovali jsme osud dosaûen˝ch tÏhotenstvÌ v programu IVF v z·vislosti na Ëetnosti tÏhotenstvÌ, zp˘sob porodu, termÌn porodu a perinat·lnÌ mortalitu.

7.1. Soubor a metodika Od roku 1989 do roku 1995 otÏhotnÏlo v naöem programu IVF 596 ûen, u†kter˝ch je zn·m osud tÏhotenstvÌ a v˝sledek porodu. Pouze u 180 porod˘ vöak bylo moûno dohledat n·mi sledovanÈ ˙daje a†tento soubor je p¯edmÏtem bliûöÌho rozboru. Metody ovari·lnÌ stimulace, odbÏr oocyt˘ i kultivace a transfer embryÌ jsou podrobnÏ pops·ny v naöich p¯edchozÌch pracÌch.(104, 103,106) Jako preklinickÈ tÏhotenstvÌ (kterÈ jsme jinak cÌlenÏ nesledovali a uvedenÈ p¯Ìpady p¯edstavujÌ pouze n·hodn˝ z·chyt) jsme hodnotili p¯Ìpady, kdy lute·lnÌ f·ze trvala vÌce neû 20 dn˘ p¯i hladinÏ hCG vyööÌ neû 50 mIU/ml, jestliûe se nepoda¯ilo vizualizovat amni·lnÌ v·Ëek p¯i ultrazvukovÈm vyöet¯enÌ. Jako klinickÈ tÏho-

68


tenstvÌ byla hodnocena gravidita s ultrazvukem prok·zan˝m intrauterinnÏ lokalizovan˝m plodov˝m vejcem, mimodÏloûnÌ tÏhotenstvÌ bylo vûdy prok·z·no histologick˝m vyöet¯enÌm.

7.2. V˝sledky U 596 pacientek tÏhotn˝ch po mimotÏlnÌm oplodnÏnÌ oocytu a transferu embrya (embryÌ) bylo 405 gravidit ukonËeno porodem (68 %), ostatnÌ tÏhotenstvÌ skonËila ne˙spÏönÏ. V 34 p¯Ìpadech (5,7 %) jsme zachytili biochemickÈ tÏhotenstvÌ, ve 115 p¯Ìpadech (19,3 %) tÏhotenstvÌ skonËilo potratem a u dalöÌch 42 pacientek (7,0 %) se jednalo o mimodÏloûnÌ tÏhotenstvÌ (tab. 22). Tabulka 23 hodnotÌ zp˘sob porodu v z·vislosti na Ëetnosti tÏhotenstvÌ. Ve†132 p¯Ìpadech (73,3 %) se jednalo o porod jednoho plodu, ve 46 p¯Ìpadech (25,5 %) o gemini a dvakr·t o p¯edËasn˝ porod t¯Ì plod˘. V celÈm souboru nalÈz·me mimo¯·dnÏ vysokou frekvenci cÌsa¯sk˝ch ¯ez˘ (29,6 % p¯i jednom plodu a 84,8 % p¯i porodech dvojËat). P¯i tÏhotenstvÌ s jednÌm plodem porodilo 88,6 % ûen v termÌnu, ze zbyl˝ch 15 p¯edËasn˝ch porod˘ byly pouze Ëty¯i p¯ed ukonËen˝m 34. t˝dnem tÏhotenstvÌ. P¯i tÏhotenstvÌ se dvÏma plody 27 ûen (58,7 %) naopak porodilo p¯edËasnÏ, z toho 12 p¯ed ukonËen˝m 34. t˝dnem tÏhotenstvÌ. O velmi p¯edËasnÈ porody p¯ed 34. t˝dnem gravidity se jednalo u pacientek s†trojËetn˝m tÏhotenstvÌm (tab. 24). V celÈm souboru bylo zaznamen·no celkem 10 perinat·lnÌch ˙mrtÌ. Jedno ve skupinÏ tÏhotn˝ch s jednÌm plodem (7,5 â), celkem 7 ve skupinÏ se dvÏma plody (76 â) a zem¯ela dvÏ z velmi p¯edËasnÏ narozen˝ch trojËat (tab. 25). Tab. 22. Osud těhotenství v programu IVF Těhotenství

Počet

%

Biochemické Klinický potrat Mimoděložní těhotenství

34 115 42

5,7 19,3 7,0

Porod Celkem

405 596

68,0 100

Tab. 23. Způsob porodu v závislosti na četnosti těhotenství Počet plodů 1 2 3

Počet porodů 132 46 2

Spont. (%) 92 (69,7) 7 (15,2)

Forceps (%) 1 (0,7) –

Sectio (%) 39 (29,6) 39 (84,8)

1 (50,0)

–

1 (50,0)

Osud tÏhotenstvÌ a†perinat·lnÌ v˝sledky v†souboru tÏhotn˝ch ûen po IVF a ET

69

Tab. 24. Délka těhotenství v závislosti na četnosti Počet plodů 1

> 37 týden (%) 117 (88,6)

> 34 týden (%) 11 (8,4)

< 34 týden (%) 4 (3,0)

2 3

19 (41,3) –

15 (32,6) –

12 (26,1) 2

Tab. 25. Perinatální mortalita v závislosti na četnosti těhotenství Počet plodů

Počet těhotných

Perinatální úmrtí (%)

1 132 2 46 3 2 a – 3x odumření jednoho z dvojčat in utero b – u jednoho z monozygotních dvojčat malformace neslučitelná se životem

1 (0,75) 7a (7,60) 2b (33,33)

NehodnotÌme-li biochemick· tÏhotenstvÌ, kter· souËasnÈ statistiky jiû neevidujÌ a takÈ v naöem souboru p¯edstavujÌ pouze n·hodn˝ z·chyt, je 17,9 % tÏhotenstvÌ ukonËen˝ch potratem ËÌslo srovnatelnÈ s ˙daji z literatury.(55,106,197) Pacientky za¯azenÈ do programu IVF p¯edstavujÌ samy o sobÏ rizikovou skupinu s vyööÌ frekvencÌ spont·nnÌch potrat˘ a mimodÏloûnÌch tÏhotenstvÌ. ZatÌmco riziko spont·nnÌho potratu v norm·lnÌ populaci je ud·v·no 10ñ15†%,(19) ve sterilnÌ populaci se zvyöuje na 21,7ñ30,5 %.(228) K†tomu p¯istupuje riziko spojenÈ s ovari·lnÌ stimulacÌ, kterÈ sice z·visÌ na pouûitÈm stimulaËnÌm schÈmatu, nekles· vöak pod 20 %.(19) Z·vaûnou problematiku p¯i hodnocenÌ v˝sledk˘ in vitro fertilizace p¯edstavujÌ mimodÏloûnÌ tÏhotenstvÌ. Frekvence tÈto komplikace se bÏûnÏ ud·v· mezi 5ñ7 %,(80) nÏkte¯Ì auto¯i vöak uv·dÏjÌ aû 11†%.(93) SpÌöe neû transfer embryÌ p¯Ìmo do vejcovod˘ je p¯ÌËinou vypuzenÌ embryÌ z dÏloûnÌ dutiny do vejcovod˘ (vÏtöinou patologicky zmÏnÏn˝ch) subendometri·lnÌmi kontrakcemi myometria. Pro toto tvrzenÌ svÏdËÌ v˝skyt oboustrann˝ch ektopick˝ch tÏhotenstvÌ po transferu vÌce embryÌ po IVF(79,215) stejnÏ jako ne zcela vz·cn˝ v˝skyt tzv. heterotopick˝ch tÏhotenstvÌ, tzn. tÏhotenstvÌ souËasnÏ v†dutinÏ dÏloûnÌ i v ektopickÈ lokalizaci.(150,158) Prevence tÈto komplikace je nere·ln·, neboù rutinnÌ oboustrann· salpingektomie u vöech pacientek je prakticky nemoûn· a navÌc by situaci ani ne¯eöila, neboù st·le zb˝v· riziko interstici·lnÌ ektopickÈ gravidity v dÏloûnÌm rohu. Frekvence ektopickÈho tÏhotensvÌ v naöem souboru (5,6 %) je tedy plnÏ srovnateln· s†v˝sledky ostatnÌch IVF skupin. V literatu¯e lze najÌt i dostateËnÏ rozs·hlÈ studie potvrzujÌcÌ naprosto norm·lnÌ psychosomatick˝ a soci·lnÌ v˝voj dÏtÌ porozen˝ch po IVF. Olivennes publikoval ojedinÏlou studii 422 dÏtÌ ve vÏku 6ñ13 let a neprok·zal û·dn˝ rozdÌl oproti jejich ªnorm·lnÏ´ poËat˝m

70


vrstevnÌk˘m.(134) Ke stejn˝m z·vÏr˘m u dÏtÌ narozen˝ch po p¯enosu rozmrazen˝ch embryÌ doöel Sutcliffe(201) a Olivennes.(135) V˝skyt malformacÌ u tÏhotenstvÌ po IVF je peËlivÏ celosvÏtovÏ monitorov·n a je vz·cn˝,(167,197) nep¯evyöuje riziko v norm·lnÌ populaci. Toto riziko nezvyöuje ani ovari·lnÌ stimulace.(175) V naöem souboru se vyskytla jedin· (s ûivotem nesluËiteln·) malformace v p¯ÌpadÏ trojËetnÈho tÏhotenstvÌ, kdy bylo postiûeno jedno z monozygotnÌch dvojËat. V naöem souboru je pomÏrnÏ vysok˝ poËet vÌceËetn˝ch tÏhotenstvÌ (25,5†% vöech porod˘). Toto ËÌslo ñ i kdyû vysokÈ ñ je plnÏ srovnatelnÈ s†v˝sledky ostatnÌch pracoviöù.(7,197) Vzhledem k vysokÈmu mate¯skÈmu a†zejmÈna perinat·lnÌmu riziku p¯edstavujÌ tato tÏhotenstvÌ jeden z velk˝ch problÈm˘ asistovanÈ reprodukce. V »eskÈ republice jsou od roku 1992 p¯en·öena do dÏlohy maxim·lnÏ Ëty¯i embrya, vöechna p¯Ìpadn· dalöÌ ªnadpoËetn·´ embrya jsou kryokonzervov·na.(104) S optimalizacÌ kultivaËnÌch podmÌnek a†zvyöov·nÌm efektivity celÈ terapie je celosvÏtovÏ evidentnÌ trend ke sniûov·nÌ poËtu p¯en·öen˝ch embryÌ ñ jedinÏ toto opat¯enÌ m˘ûe snÌûit incidenci v˝skytu vÌceËetn˝ch tÏhotenstvÌ. Jak ostatnÏ vypl˝v· i z naöich v˝sledk˘, v˝raznÏ horöÌ perinat·lnÌ v˝sledky (podmÌnÏnÈ p¯edevöÌm prematuritou) neovlivnÌ ani vysokÈ procento cÌsa¯sk˝ch ¯ez˘ znaËnÏ p¯evyöujÌcÌ ˙daje z norm·lnÌ populace. Tyto v˝sledky se vöak neliöÌ od poËtu operaËnÌch porod˘ a perinat·lnÌch v˝sledk˘ po IVF publikovan˝ch renomovan˝mi pracoviöti.(7,55,197) KromÏ obtÌûnÏ hodnotitelnÈho liber·lnÏjöÌho p¯Ìstupu k indikaci cÌsa¯skÈho ¯ezu u tÏchto ªvz·cn˝ch´ tÏhotenstvÌ se na tÈto skuteËnosti podÌlÌ vysok˝ poËet vÌceËetn˝ch tÏhotenstvÌ, vyööÌ pr˘mÏrn˝ vÏk matek a s nÌm spojen· vyööÌ frekvence mate¯sk˝ch komplikacÌ.

7.3. Z·vÏry Na z·kladÏ naöich v˝sledk˘ lze konstatovat, ûe tÏhotenstvÌ dosaûen· v programu mimotÏlnÌho oplodnÏnÌ je nutno povaûovat za rizikov·. Oproti norm·lnÌ populaci nenÌ zv˝öeno riziko vrozenÈ v˝vojovÈ vady, pravdÏpodobnost ukonËenÌ cÌsa¯sk˝m ¯ezem je vöak v˝znamnÏ vyööÌ, stejnÏ jako riziko p¯edËasnÈho porodu. Vysok· perinat·lnÌ mortalita ve skupinÏ ûen s vÌceËetn˝m tÏhotenstvÌm nenÌ ovlivnÏna ani frekvencÌ cÌsa¯sk˝ch ¯ez˘.

71

PODÃKOV¡NÕ

In vitro fertilizace je z·leûitostÌ t˝movÈ pr·ce, a proto by tato publikace nevznikla bez plnÈho zaujetÌ a profesionality Ëlen˘ celÈ pracovnÌ skupiny. DÏkuji vöem lÈka¯˘m a sestr·m z klinickÈho provozu i laboratornÌm pracovnÌk˘m a laborantk·m za jejich pr·ci a podporu nejen v†dob·ch, kdy se pr·ce da¯ila, ale zejmÈna v tÏch okamûicÌch, kdy oËek·vanÈ v˝sledky nep¯ich·zely. Zvl·ötnÌ podÏkov·nÌ pat¯Ì embryolog˘m RNDr. Lucii ZetovÈ-VlachovÈ a Mgr. RenatÏ H¸ttelovÈ za pr·ci v oblasti mikromanipulacÌ a†prodlouûenÈ kultivace embryÌ, RNDr. Marii MikovÈ, CSc., za pr·ci v†oblasti kryokonzervace embryÌ, spolupracovnÌk˘m ñ gynekolog˘m MUDr.†Pavlu M¸llerovi, MUDr. Janu Vobo¯ilovi a MUDr. Jaroslavu Hulvertovi a d·le ing. Alexand¯e ätroufovÈ a†ing. HanÏ SochovÈ za stanovenÌ hormon·lnÌch hladin a urologovi MUDr. VladimÌru Sobotkovi za jeho podÌl na ¯eöenÌ nejz·vaûnÏjöÌch p¯Ìpad˘ andrologickÈ sterility.

72


73

LITERATURA

1. ABDALLA, H. H. I., BABAU, R., KIRKLAND, A., et al.: A report on 100 cycles of oocyte donation: Factors affecting the outcome. Hum. Reprod., 5, 1990, s. 1018ñ1022. 2. ABDALLA, H. I., AHUJA, K. K., LEONARD, T., et al.: Comparative trial of GnRH analogues/hMG and CC/HMG in assisted conception programe. Fertil. Steril., 53, 1990, s.†473ñ479. 3. ABOULGHAR, M. A., MANSOUR, R. T., SEROUR, G. I., et al.: Prospective controlled randomized study of in vitro fertilization versus intracytoplasmic sperm injection in the treatment of tubal factor infertility with normal semen parameters. Fertil. Steril., 66, 1996, s. 753ñ756. 4. ADAMS, C. E.: Aging and reproduction in the female mammal with particular reference to rabbit. J. Reprod. Fertil., 12, 1979, (suppl.), s. 1ñ16. 5. AITKEN, R. J.: Assessment of sperm function for IVF. Hum. Reprod., 3, 1988, s. 89ñ95. 6. AITKEN, R. J., ROSS, A., HARGREAVE, T., et al.: Analysis of human sperm function following exposure to the ionophore A 23187. Comparison of normospermic and oligospermic men. J. Androl., 5, 1984, s. 321ñ329. 7. ANDREWS, M. C., MUASHER, S. J., LEVY, D. L., et al.: An analysis of the obstetric outcome of 125 consecutive pregnancies conceived in vitro and resulting in 100 deliveries. Amer. J. Obstet. Gynec., 154, 1986, s. 848ñ852. 8. ANTINORI, S., VERSACI, C., HOSSEIN-GHOLAMI, G., et al.: A child is a joy at any age. Hum. Reprod., 8, 1993, s. 1542. 9. ANTINORI, S., VERSACI, C., HOSSEIN-GHOLAMI, G., et al.: Oocyte donation in menopausal women. Hum. Reprod., 8, 1993, s. 1487ñ1490. 10. ANTOINE, J. M., SALAT-BAROUX, J., ALVAREZ, S., et al.: Ovarian stimulation using HMG with or without LHRH analogues in a long protocol for IVF: A prospective randomized comparison. Hum. Reprod., 5, 1990, s. 565ñ570. 11. BEN-RAFAEL, Z., BENADIVA, C. A., AUSMASAS, M., et al.: Dose of human menopausal gonadotropin influences the outcome of an in vitro fertilization programme. Fertil. Steril., 48, 1987, s. 964ñ968. 12. BENADIVA, C., BEN-RAFAEL, Z., STRAUSS, J. F., et al.: Ovarian response of individuals to different doses of human menopausal gonadotropin. Fertil. Steril., 49, 1988, s.†997ñ1001. 13. BERGH, C., HILLENSJO, T., WIKLAND, M., et al.: Adjuvant growth hormone treatment during in vitro fertilization : a randomized, placebo-controlled study. Fertil. Steril., 62, 1994, s. 113ñ120.

74


14. BOLTON, V., HAWES, S. M., TAYLOR, C. T., et al.: Development of spare human preimplantation embryos in vitro: an analysis of the correlations among gross morphology, cleavage rates and development to the blastocysts. J. In Vitro Fertil. Embryo Transfer, 6, 1989, s. 30ñ37. 15. BONDUELLE, M., DESMYTTERE, S., BUYSSE, A.: Prospective followup study of 55 childern born after subzonal insemination and intracytoplasmic sperm injection. Hum. Reprod., 9, 1994, s. 1765ñ1769. 16. BONDUELLE, M., LEGEIN, J., DERDE, M. P.: Comparative follow-up study of 130 children born after intracytoplasmic sperm injection and 130 children born after IVF. Hum. Reprod., 10, 1995, s. 3327ñ3331. 17. BONDUELLE, M., LEGEIN, J., WILLIKENS, A.: Follow-up study of children born after intracytoplasmic sperm injection. 11th Annual Meeting of ESHRE, Hamburg, 28.6. aû 1.7.1995, Abstr. 108. 18. BONGSO, A., NG, S. C., FONG, C. Y., et al.: Cocultures: A new lead in embryo quality improvement for assisted reproduction. Fertil. Steril., 56, 1991, s. 179ñ191. 19. BOUE, A., BOUE, J.: Le role des anomalies chromosomiques dans le echecs de la reproduction. J. Gynec. Obstet. Biol. Reprod., 6, 1977, s. 5ñ21. 20. BOUCHER, R.: Cystic fibrosis. In: ISSELBACHER, K., BRAUNWALD, E., WILSON, J., et al.: Harrisonís principles of internal medicine. New York, McGraw-Hill 1994, s. 1194ñ1197. 21. BOWMAN, P., McLAREN, A.: Cleavage rate of mouse embryos in vivo and in vitro. J.†Embryol. Exp. Morphol., 24, 1970, s. 203ñ207. 22. BUCKER, C., ISHIKAWA, M., SANDOW, B. A.: Transformation growth factor alpha improves fertilisation rate in immature mouse ooytes cultured in vitro. Hum. Reprod., 6, 1991 (suppl. 1), s. 47. 23. CAMERON, I. T., OíSHEA, F. C., ROLLAND, J. M., et al.: Occult ovarian failure: A†syndrom of infertility, regular menses and elevated FSH concentrations. J. Clin. Endocrin. Metab., 67, 1988, s. 1190ñ1195. 24. COHEN, J., ELSNER, C., KORT, H., et al.: Impairment of the hatching process following IVF in the human: Improvement of implantation by assisted hatching using micromanipulation. Hum. Reprod., 5, 1990, s. 7ñ13. 25. COHEN, J., INGE, K. L., SUZMAN, M.: Video-cinematography of fresh and cryopreserved embryos: a retrospective analysis of embryonic morphology and implantation. Fertil. Steril., 51, 1989, s. 820ñ827. 26. COHEN, J., MALTER, H., FEHILLY, C., et al.: Implantation of embryos after partial opening of oocyte zona pellucida to facilitate sperm penetration. Lancet, 2, 1988, s. 162. 27. COHEN, J., SIMONS, R. F., EDWARDS, R. G., et al.: Pregnancies following the frozen storage of expanding human blastocysts. J. In Vitro Fertil. Embryo Transfer, 2, 1985, s.†59ñ74. 28. COHEN, J., SIMONS, R. F., FEHILLY, C. B., et al.: Factors affecting survival and implantation of cryopreserved human embryos. J. In Vitro Fertil. Embryo Transfer, 3, 1986, s.†46ñ51. 29. CRAFT, I., TSIRIGOTIS, M.: Simplifies recovery, preparation, and cryopreservation of testicular spermatozoa. Hum. Reprod., 10, 1995, s. 1623ñ1627. 30. CUMMINS, J. M., PEMBER, S. M., JEQUIER, A. M., et al.: A test of human sperm acrosome reaction following ionophore challenge: relationship to ertility and other seminal parameters. J. Androl., 12, 1991, s. 98ñ103.

Literatura

75

31. DAS, K., STOUT, L. E., HENSLEIGH, H. C., et al.: Direct positive effect of epidermal growth factor on the cytoplasmic maturation of mouse and human oocytes. Fertil. Steril., 55, 1991, s. 1000ñ1004. 32. DEVROEY, P., LIU, J., NAGY, Z., et al.: Normal fertilisation of human oocytes after testicular sperm extraction and intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril., 62, 1994, s.†639ñ641. 33. DEVROEY, P., SILBER, S. J., NAGY, Z.: Ongoing pregnancies and birth after intracytoplasmic sperm injection with frozen-thawed epididymal spermatozoa. Hum. Reprod., 10, 1995, s. 903ñ906. 34. DIAMOND, M. P., MAXSON, W. S., VAUGHN, V. K., et al.: Antiestrogenic effect of clomiphencitrate in multiple follicular stimulation protocol. J. In Vitro Fertil. Embryo Transfer, 3, 1986, s. 106ñ109. 35. DICKER, D., GOLDMAN, J. A., ASHKENAZI, J., et al.: Age and pregnancy rates in vitro fertilization. J. In Vitro Fertil. Embryo Transfer, 8, 1991, s. 141ñ144. 36. DIEDRICH, K., DIEDRICH, C., SANTOS, E.: Supression of the endogenous LHRH surge by the GnRH antagonist Centrolerix during ovarian stimulation. Hum. Reprod., 9, 1994, s. 788-792. 37. DOR, J., BEN-SHLOMO, I., LEVRAN, D., et al.: The relative success of GnRH analogues, clomiphen citrate and gonadotropins in 1099 cycles of IVF. Fertil. Steril., 58, 1992, s. 986ñ991. 38. DOZORTSEV, D., RYBOUCHKIN, A., SUTTER, P. de, et al.: Sperm plasma membrane damage prior to intracytoplasmic sperm injection: A necessary condition for sperm nucleus decondensation. Hum. Reprod., 10, 1995, s. 2960ñ2964. 39. DOZORTSEV, D., RYBOUCHKIN, A., SUTTER, P. de: Human oocyte activation following intracytoplasmic sperm injection: Role of the sperm cell. Hum. Reprod., 10, 1995, s.†403ñ407. 40. DROESCH, K., MUASHER, S. J., BRZYSKI, R. G., et al.: Value of suppression with gonadotropin-releasing hormone agonist prior to gonadotropin stimulation for in vitro fertilization. Fertil. Steril., 51, 1989, S. 292ñ297. 41. EAGLESOME, M. D., HARE, W. C. D., SINGH, E. L.: Embryo transfer: A discussion on its potential for infectious diseases control based on a review of studies on infection of gametes and early embryos by various agents. Can. Vet. J., 21, 1980, s. 106ñ112. 42. EDWARDS, R. G., FISHEL, S., COHEN, J.: Factors influencing the success of in vitro fertilization for alleviating human infertility. J. In Vitro Fertil. Embryo Transfer, 1, 1983, s.†3ñ26. 43. EDWARDS, R. G., STEPTOE, P. C.: Current status of in vitro fertilization and implantation of human embryos. Lancet, 2, 1983, s. 1265ñ 1269. 44. EDWARDS, R. G.: Pregnancies are acceptable in post-menopausal women. Hum. Reprod., 8, 1993, s. 1542ñ1544. 45. EZRA, Y., SCHENKER, J. G.: Appraisal of in vitro fertilization. Eur. J. Obstet. Gynec. Reprod. Biol., 48, 1993, s. 127ñ133. 46. FEHILLY, C. B., COHEN, J., SIMONS, R. F., et al.: Cryopreservation of cleaving embryos and expanded blastocysts in the human: A comparative study. Fertil. Steril., 44, 1985, s.†638ñ645. 47. FELICI, M. de, SYRACUSA, G.: Spontaneous hardening of the zona pellucida of mouse oocytes during in vitro culture. Gamete Res., 6, 1982, s. 107ñ113.

76


48. FILICORI, M., FLAMIGNI, C., COGNINI, G. E.: Different gonadotropin and leuprorelin ovulation induction regimes markedly affect follicular fluid hormone levels and folliculogenesis. Fertil. Steril., 65, 1996, s. 387ñ393. 49. FISHEL, S. B., JACKSON, P.: Follicular stimulation for high tech pregnancies. Are we playing it safe? Brit. Med. J., 299, 1989, s. 309ñ311. 50. FIVNAT, P. C., MOUZON, J. de, BACHELOT, A., et al.: In vitro fertilization: influence of womanís age on pregnancy rates. Hum. Reprod., 5, 1990, s. 56ñ59. 51. FLEMING, R., COUTTS, J. R.: Induction of multiple follicular growth in normally menstruating women with endogenous gonadotropin supression. Fertil. Steril., 45, 1986, s.†226ñ230. 52. FORMAN, R. G., FRYDMAN, R., EGAN, D., et al.: Severe ovarian hyperstimulation syndrome using agonist of GnRH for IVF: An European series and a proposal for prevention. Fertil. Steril., 1990, s. 502ñ510. 53. FORSDAHL, F., BERTHEUSSEN, K., BUNGUM, L. J.: A study on extended culture time with embryo replacement at the morula and blastocyst stage. Hum. Reprod., 9, 1994, (suppl. 4.), s. 142ñ143. 54. FREEMAN, L., TROUNSON, A. O., KIRBY, C.: Cryopreservation of human embryos: progres on the clinical use of the technique in human in vitro fertilization. J. In Vitro Fertil. Embryo Transfer, 3, 1986, s. 53ñ61. 55. FRYDMAN, R., BELAISCH-ALLART, J., FRIES, N., et al.: An obstetric assessment of the first 100 births from the in vitro fertilization program at Clamart, France. Amer. J. Obstet. Gynec., 154, 1986, s. 550ñ555. 56. FRYDMAN, R., CORNEL, C., ZIEGLER, D. de: Prevention of premature LH and P rise with a GnRH antagonist, Nal-Glu, in controlled ovarian hyperstimulation. Fertil. Steril., 56, 1991, s. 923ñ928. 57. GARCIA, J. E., ACOSTA, A. A., JONES, G. S., et al.: Human menopausal gonadotropin/human chorionic gonadotropin follicular maturation for oocyte aspiration: Phase I and†II, 1981. Fertil. Steril., 39, 1983, s. 167ñ179. 58. GINDOFF, P. R., JEWELEWICZ, R.: Reproductive potential in the older woman. Fertil. Steril., 46, 1986, s. 989ñ1001. 59. GORDON, J. W., TALANSKY, B. E.: Assisted fertilization by zona drilling: A mouse model for correction of oligospermia. J. Exp. Zool., 239, 1986, s. 347ñ354. 60. GORDON, J. W.: Use of micromanipulation for increasing the efficiency of mammalian fertilization in vitro. In: JONESS, H., SCHRADER, C. (Eds): In vitro fertilization and other assisted reproduction. A. NY Acad. Sci., 541, 1988, s. 601ñ613. 61. GOSDEN, R. G.: Maternal age: a major factor influencing the prospects and outcome of pregnancy. A. NY Acad. Sci., 442, 1984, s. 45ñ47. 62. GREENBLATT, E. M., MERIANO, J. S., CASPER, R. F.: Type of stimulation protocol affects oocyte maturity,fertilization rate and cleavage rate after intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril., 64, 1995, s. 557ñ563. 63. HAMBERGER, L., SJ÷GREN, A., LUNDIN, K., et al.: Microfertilization techniques-the Swedish experience. Reprod. Fertil. Dev., 7, 1995, s. 263ñ268. 64. HAN, L., KOKKONEN, G. C., ROTH, G. S.: Effect of aging on population of estrogen receptor-containing cells in the rat uterus. Exp. Cell Res., 180, 1989, s. 234ñ242. 65. HANZELKA, Z., TESAÿÕK, J., LOPAT¡ÿOV¡, M., et al.: PrvnÌ zkuöenosti s kryokonzervacÌ lidsk˝ch embryÌ. »es. Gynek., 54, 1989, s. 729ñ733.

Literatura

77

66. HARLOW, G. M., QUINN, P.: Development of preimplantation mouse embryos in vivo and in vitro. Aust. J. Biol. Sci., 35, 1982, s. 187ñ193. 67. HARTSHORNE, G. M., ELDER, K., CROW, J.: The influence of in vitro development upon post-thaw survival and implantation of cryopreserved human blastocysts. Hum. Reprod., 6, 1991, s. 136ñ141. 68. HASSOLD, T., JACOBS, P., KLINE, J.: Effects of maternal age on autosomal trisomies. A.†Hum. Genet., 44, 1980, s. 29ñ34. 69. HELLEBAUT, S., SUTTER, P. de, ONGHENA, A.: Does assisted hatching improve implantation rates after IVF or ICSI in all patients: A†prospective randomized study. J.†Assist. Reprod. Genet., 12, 1995, Abstr. 321, s. 1075. 70. HODGEN, G. D., BURKMAN, L. J., CODDINGTON, Ch. C.: The hemizona assay (HZA): finding sperm that have the ªrigh stuff´. J. In Vitro Fertil. Embryo Transfer, 5, 1988, s.†311ñ313. 71. HOFMANN, G. E., TONER, J. P., MUASHER, S. J., et al.: High dose follicle stimulating hormone (FSH) ovarian stimulation in low responder patients for in vitro fertilization. J.†In Vitro Fertil. Embryo Transfer, 6, 1989, s. 285ñ289. 72. HUGHES, E. G., FEDORKOW, D. M., DAYA, S., et al.: The routine use of GnRH agonists prior to IVF and GIFT: A metaanalysis of randomized controlled trials. Fertil. Steril., 58, 1992, s. 888ñ897. 73. HUGHES, S. M., HUANG, Z. H., MORRIS, I. D., et al.: A double blind cross-over controlled study to evaluate the effect of biosynthetic growth hormone on ovarian stimulation in previous poor responders to in vitro fertilization. Hum. Reprod, 9, 1994, s. 13ñ18. 74. HUISMAN, G. J., LEERENTVELD, R. A., VERHOEFF, A., et al.: IVF results following transfer after 5 days of embryo culture. Hum. Reprod., 9, 1994, (suppl. 4.), s. 33. 75. CHAN, S. Y. W., WANG, C., CHAN, S. T. H., et al.: Differential evaluation of a human sperm hypoosmotic swelling test and its relationship with the outcome of IVF of human oocytes. Hum. Reprod., 5, 1990, s. 84ñ88. 76. IRVINE, D. S., AITKEN, R. J.: Measurement of intracelllular calcium in human spermatozoa. Gamete Res., 16, 1986, s. 57ñ72. 77. JAMES, W.: The causes of the decline in fecundability with age. Soc. Biol., 26, 1979, s.†330ñ339. 78. JEYENDRAN, R. S., VEN, H. H. van der, PEREZ-PALAEZ, M.: Development of an assay to assess the functional integrity of the human sperm membrane and its relationship to other semen characteristics. J. Reprod. Fertil., 70, 1984, s. 219ñ226. 79. JONG-CHOU, Ch., YIH, L., TA-TEH, S.: Bilateral tubal pregnancy after IVF and ET. J. In Vitro Fertil. Embryo Transfer, 8, 1991, s. 292ñ296. 80. KARANDE, V. C., FLOOD, J. C., HEARD, N., et al.: An analysis of ectopic pregnancies resulting from in vitro fertilizatio and embryo transfer. Hum. Reprod., 6, 1991, s. 446ñ450. 81. KENTENICH, H., PACHALLY, J., SCHMIADY, H.: Prognostischer Wert von Spermiogramm Parametern f¸r den IVF Erfolg. Fertilit‰t, 3, 1987, s. 151ñ156. 82. KIESSLING, A. A., LOUTRADIS, D., McSHANE,P.M., et al.: Fertilization in trypsin-treated oocytes. In: JONES, H. W. JR., SCHRADER, C. (Eds): In vitro fertilization and other assisted reproduction. A. NY Acad. Sci., 541, 1988, s. 614ñ620. 83. KJEKSHUS, E. A., TANBO, T., ABYHOLM, T.: A happy change in the cryopreservation protocol. Hum. Reprod., 11, 1996, Abstract Book 1, s. 80.

78


84. LANE, M., GARDNER, D. K.: Effect of incubation volume and density on the development and viability of mouse embryos in vitro. Hum. Reprod., 7, 1992, s. 558ñ562. 85. LANZENDORF, S. E., MALONEY, M. K., VEECK, L. L., et al.: A preclinical evaluation of pronuclear formation by microinjection of human spermatozoa into human oocytes. Fertil. Steril., 49, 1988, s. 835ñ842. 86. LANZENDORF, S., MALONEY, M., ACKERMAN, S.: Fertilizing potential of acrosome-defective sperm following microsurgical injection into eggs. Gamete Res., 19, 1988, s.†329ñ337. 87. LASSALLE, B., TESTART, J., RENARD, J. P.: Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1, 2-propanediol. Fertil. Steril., 44, 1985, s.†645ñ651. 88. LAUFER, N., CHERNEY, A. H. de, TARLATZIS, B.: Delaying HCG administration in HMG induced cycles decreases successful IVF of human oocytes. Fertil. Steril., 42, 1984, s.†198ñ203. 89. LENTON, E. A., SEXTON, E., LEE, S., et al.: Progressive changes in LH and FSH and LH:FSH ratios in women throughout reproductive life. Maturitas, 10, 1988, s. 35ñ39. 90. LEVRAN, D., BEN-SHLOMO, I., DOR, J., et al.: Aging of endometrium and oocytes: Observations on conception and abortion rates in an egg donation model. Fertil. Steril., 56, 1991, s. 1091ñ1094. 91. LIN, T. P.:Microinjection of mouse eggs. Sci., 151, 1966, s. 333ñ337. 92. LIU, J., NAGY, Z., JORIS, H., et al.: Intracytoplasmic sperm injection does not require special treatment of the spermatozoa. Hum. Reprod., 9, 1994, s. 1127ñ1130. 93. LOPATA, A.: Concepts in human in vitro fertilization and embryo transfer. Fertil. Steril., 40, 1983, s. 289ñ301. 94. LOUMAYE, E., BILLION, J. M., MINE, J. M., et al.: Prediction of individual response to controlled ovarian hyperstimulation by means of clomiphene citrate challenge test. Fertil. Steril., 53, 1990, s. 295ñ301. 95. LUTJEN, P., TROUNSON, A., LEETON, J., et al.: The establishment and maintenance of pregnancy using in vitro fertilization and embryo donation in a patient with primary ovarian failure. Sci., 307, 1984, s. 174ñ175. 96. MacLACHLAN, V., BESANKO, M., OíSHEA, F.: A controlled study of luteinizing hormone-relasing agonist (Buserelin) for the induction of folliculogenesis before in vitro fertilization. N. Engl. J. Med., 320, 1989, s. 1233ñ1237. 97. MacNAMEE, M. C., EDWARDS, R. G., HOWLES, C. M.: Short-term luteinizing hormone releasing hormone agonist treatment: Prospective trial of a novel ovarian stimulation regimen for in vitro fertilization. Fertil. Steril., 52, 1989, s. 264ñ269. 98. MacNAMEE, M. C., HOWLES, C. M., EDWARDS, R. G.: Pregnancies after IVF when high tonic LH is reduced by long term treatment with GnRH agonist. Hum. Reprod., 2, 1987, s. 569ñ573. 99. MANDELBAUM, J., PLACHOT, M., JUNCA, A. M.: The effects of partial zona dissection on in vitro development and hatching of human cryopreserved embryos. Hum. Reprod., 9, 1994, (suppl. 4.), s. 39. 100. MANDELBAUM, J., JUNCA, A. M., PLACHOT, M.: Cryopreservation of human embryos and oocytes. Hum. Reprod., 3, 1988, s. 117ñ119. 101. MANSOUR, R. T., ABOULGHAR, M. A., SEROUR, G. I.: The effect of sperm parameters on the outcome of intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril., 64, 1995, s.†982ñ986.

Literatura

79

102. MARDEäIΔ, T., MIKOV¡, M., M‹LLER, P., et al.: TÏhotenstvÌ a porod po p¯enosu rozmraûen˝ch embryÌ do cyklu bez ûlutÈho tÏlÌska s umÏle p¯ipraven˝m endometriem po p¯edchozÌ aplikaci analoga GnRH. »es. Gynek., 62, 1997, s. 19ñ21. 103. MARDEäIΔ, T., M‹LLER, P., ZETOV¡, L., et al.: SelektivnÌ redukce mnohoËetn˝ch tÏhotenstvÌ v prvnÌm trimestru: v˝sledky a zkuöenosti u 10 p¯Ìpad˘. »s. Gynek., 58, 1993, s.†115ñ119. 104. MARDEäIΔ, T., M‹LLER, P., ZETOV¡, L., et al.: VÌceËetn· tÏhotenstvÌ v programu IVF a†ET v ⁄PMD. »s. Gynek., 57, 1992, s. 102ñ108. 105. MARDEäIΔ, T., ZETOV¡, L., H‹TTELOV¡, R., et al.: Intracytoplasmatick· injekce spermie (ICSI) v lÈËbÏ nejz·vaûnÏjöÌch p¯Ìpad˘ andrologickÈ sterility. »es. Gynek. v tisku. 106. MARDEäIΔ, T., ZETOV¡, L., M‹LLER, P., et al.:: Multiple pregnancies as a result of IVF and ET in a program without cryopreservation possibility. Zbl. Gynec., 115, 1993, s.†24ñ26. 107. MARDEäIΔ, T.: Faktory ovlivÚujÌcÌ v˝sledky in vitro fertilizace. II. Vliv andrologickÈho faktoru. »es. Gynek., 59, 1994, s. 306ñ309. 108. MATSUDA, I., HOTII, Y., OGURA, K., et al.: Chromosomal survey of 1001 subfertile males: Incidence and clinical features of males with chromosomal anomalies. Acta Urol. Jap., 38, 1992, s. 803ñ809. 109. MATTSON, B. E., ROSENBLUM, I. Y., SMITH, R. M., et al.: Autoradiographic evidence for insulin and linsulin-like growth factor binding to early mouse embryos. Diab., 37, 1988, s. 585ñ589. 110. MAXSON, V. S., PITTAWAY, D. E., WENTZ, A. C.: Antiestrogenic effect of clomiphencitrate: Corelation with serum estradiol concentrations. Fertil. Steril., 42, 1984, s. 356ñ359. 111. MEDICAL RESEARCH INTERNATIONAL. SOCIETY FOR ASSISTED REPRODUCTIVE TECHNOLOGY: In vitro fertilisation-embryo transfer (IVF-ET) in the United States: 1990 results from the IVF-ET registry. Fertil. Steril., 57, 1992, s. 15ñ24. 112. MEDICAL RESEARCH INTERNATIONAL. SOCIETY FOR ASSISTED REPRODUCTIVE TECHNOLOGY. THE AMERICAN FERTILITY SOCIETY: In vitro fertilization-embryotransfer (IVF-ET) in the United States. 1989 results from the IVF-ET registry. Fertil. Steril., 55, 1991, s. 14ñ23. 113. MELDRUM, D. R.: Female reproductive aging-ovarian and uterine factors. Fertil. Steril., 59, 1993, s. 1ñ5. 114. MENEZO, Y. J. R., GUERIN, J. F., CZYBA, J. C.: Improvement of human early embryo development in vitro by co-culture on monolayers of Vero cells. Biol. Reprod., 42, 1990, s. 301ñ308. 115. MENKEN, J., TRUSSEL, J., LARSEN, U.: Age and infertility. Sci., 233, 1986, s. 1389ñ1394. 116. MIKOV¡, M., GROCHOLOV¡, R., MARDEäIΔ, T., et al.: Kryokonzervace embryÌ v†programu IVF-ET v ⁄stavu pro pÈËi o matku a dÌtÏ v†Praze. »es. Gynek., 60, 1995, s.†145ñ149. 117. MIKOV¡, M., ZETOV¡, L., MARDEäIΔ, T., et al.: Kryokonzervace embryÌ v programu IVF/ET. »es. Gynek., 58, 1993, s. 166ñ170. 118. MORDEL, N., SCHNEKER, J. G.: GnRH agonists and ovarian hyperstimulation syndrome in assisted reproduction. Hum. Reprod., 8, 1993, s. 2009ñ2015. 119. MUASHER, S. J., OEHNINGER, S., SIMONETTI, S., et al.: The value of basal and stimulated serum gonadotropin levels in prediction of stimulated response and in vitro fertilization outcome. Fertil. Steril., 50, 1988, s. 298ñ307.

80


120. MUASHER, S. J.: Treatment of low responders. J. Assist. Reprod. Genet., 10, 1993, s.†115ñ117. 121. NAGY, Z. P., LIU, J., CECILE, J., et al.: Using ejaculated, fresh, and frozen-thawed epididymal and testicular spermatozoa gives rise to comparable results after intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril., 63, 1995, s. 808ñ815. 122. NAGY, Z. P., LIU, J., JORIS, H.: The result of intracytoplasmic sperm injection is not related to any of the three basic sperm parameters. Hum. Reprod., 10, 1995, s. 1123ñ1129. 123. NAVOT, D., ANDERSON, T. V., DROECK, K., et al.: Hormonal manipulation of endometrial maturation. J. Clin. Endocrin. Metab., 68, 1989, s. 801ñ807. 124. NAVOT, D., BERGH, P. A., WILLIAMS, M. A., et al.: Poor oocyte quality rather than implantation failure as a cause of age-related decline in female infertility. Lancet, 337, 1991, s. 1375ñ1377. 125. NAVOT, D., ROSENWAKS, Z.: The use of FSH for controlled ovarian hyperstimulation in IVF. J. In Vitro Fertil. Embryo Transfer, 5, 1988, s. 3ñ14. 126. NAVOT, D., ROZENWAKS, Z.: Prognostic assessment of female fecundity. Lancet, 2, 1987, s. 645ñ647. 127. NIELSEN, J., SILLESEN, I.: Incidence of chromosome aberrations among 11.148 newborn children. Hum. Genet., 30, 1975, s. 1ñ12. 128. NIJS, M., GEERTS, L., ROOSENDAAL, E., et al.: Prevention of multiple pregnancies in an in vitro fertilization program. Fertil. Steril., 59, 1993, s. 1245ñ1250. 129. OBRUCA, A., STROHMER, H., SAKKAS, D.: Use of lasers in assisted fertilization and hatching. Hum. Reprod., 9, 1994, s. 1723ñ1726. 130. OEHNINGER, S., TONER, J. P., VEECK, L. L.: Performance of cryopreserved pre-embryos obtained in IVF cycles with or without a GnRH agonist. Fertil. Steril., 57, 1992, s.†620ñ625. 131. OEHNINGER, S., VEECK, L. L., LANZENDROF, S. E., et al.: Intracytoplasmic sperm injection: achievement of high pregnancy rates in couples with severe male factor infertility is dependent primarily upon female and not male factors. Fertil.Steril., 64, 1995, s. 977ñ981. 132. OLIVENNES, F., FANCHIN, R., BOUCHARD, P., et al.: The single or dual administration of the GnRH antagonist centrorelix prevents premature LH surges in an IVF-ET program. Fertil. Steril., 62, 1994, s. 468ñ476. 133. OLIVENNES, F., FANCHIN, R., ZIEGLER, D. de, et al.: Poor responders: Screening and treatment possibilities. J. Assist. Reprod. Genet., 10, 1993, s. 115ñ117. 134. OLIVENNES, F., KERBRAT, V., RUFAT, P., et al.: Follow-up of a cohort of 422 children aged 6 to 13 years conceived by in vitro fertilization. Fertil. Steril., 67, 1997, s. 284ñ289. 135. OLIVENNES, F., SCHNEIDER, Z., REMY, V., et al.: Perinatal outcome and follow-up of 82 children aged 1 to 9 years old conceived from cryopreserved embryos. Hum. Reprod., 11, 1996, s. 1565ñ1568. 136. PADILLA, S. L., BAYATI, J., GARCIA, J. E.: Prognostic value of early serum estradiol response to leuprolide acetate in in vitro fertilization. Fertil. Steril., 53, 1990, s. 288ñ294. 137. PADILLA, S. L., GARCIA, J. E.: Effect of maternal age and number of in vitro fertilization procedures on pregnancy outcome. Fertil. Steril., 52, 1989, s. 270ñ273. 138. PALERMO, G. D., COHEN, J., ALIKANI, M., et al.: Intracytoplasmic sperm injection: a†novel treatment for all forms of male factor infertility. Fertil. Steril., 63, 1995, s. 1231ñ1240.

Literatura

81

139. PALERMO, G., JORIS, H., DEVROEY, P., et al.: Pregnancies after intracytoplasmic sperm injection of single spermatozoon into an oocyte. Lancet, 340, 1992, s. 17ñ18. 140. PALERMO, G., JORIS, H., TOURNAYE, H., et al.: Sperm characteristics and outcome of human assisted fertilization by subzonal insemination and intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril., 59, 1993, s. 826ñ835. 141. PANTOS, K., MEIMETI-DAMIANAKI, T., VAXEVANOGLOU, T.: Oocyte donation to women after natural menopause. Hum. Reprod., 8, 1993, s. 488ñ491. 142. PATRIA, B. C., DEY, S. K.: Preimplantation embryo development in vitro: Cooperative interactions among embryos and role of growth factors. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87, 1990, s. 4756ñ4760. 143. PAYNE, D., FLAHERTY, S. P., JEFFREY, R., et al.: Successsful treatment of severe male factor infertility in 100 consecutive cycles using intracytoplasmic sperm injection. Hum. Reprod., 9, 1994, s. 2051ñ2057. 144. PEIRS, A. I., LOPATA, A., GRONOW, M. J., et al.: Analysis of the benefits and risks of the multiple embryo transfer. Fertil. Steril., 39, 1983, s. 468ñ471. 145. PORTER, R. N., SMITH, W., CRAFT, I., et al.: Induction of ovulation for IVF using Buserelin and gonadotrophins. Lancet, 2, 1992, s. 1284ñ1285. 146. QUIGLEY, M., SCHMIDT, C. L., BEAUCHAMP, P. J., et al.: Enhanced follicular recruitment in an IVF programme: CC alone versus CC/HMG combination. Fertil. Steril., 42, 1984, s. 25ñ33. 147. QUINN, P., KERIN, J. F. P.: Experience with the cryopreservation of human embryos using the mouse as a model to establish succesfull techniques. J. In Vitro Fertil. Embryo Transfer, 3, 1986, s. 40ñ45. 148. RICHARDSON, S. J., NELSON, J. F.: Follicular depletion during the menopausal transition. A. NY Acad. Sci., 592, 1990, s. 13ñ20. 149. RIORDAN, J. R., ROMMENS, J. M., KEREMN, B.: Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Sci., 245, 1989, s. 1066ñ1073. 150. RIZK, B., LIN TAN, S., MORCOS, S., et al.: Heterotopic pregnancies after in vitro fertilization and embryo transfer. Amer. J. Obstet. Gynec., 164, 1991, s. 161ñ165. 151. ROMEU, A., MUASHER, S. J., ACOSTA, A., et al.: Results of in vitro fertilization attempts in women of 40 years of age and older: The Norfolk experience. Fertil. Steril., 47, 1987, s. 130ñ136. 152. ROMMENS, J. M., IANNUZZI, M. C., KEREM, B.: Identification of the cystic fibrosis gene: Chromosome walking and jumping. Sci., 245, 1989, s. 1059ñ1065. 153. RON-EL, R., HERMAN, A., GOLAN, A., et al.: Gonadotropins and combined gonadotropin-releasing hormone agonist-gonadotropin protocols in a randomized prospective study. Fertil. Steril., 56, 1991, s. 574ñ578. 154. ROSENWAKS, Z., MUASHER, S. J., ACOSTA, A. A.: Use of HMG and/ or FSH for multiple follicle development. Clin. Obstet. Gynec., 29, 1986, s. 148ñ157. 155. ROZSTEJN, D. A., ASCH, R. H.: Effect of aging on assisted reproductive technologies (ART): Experience from egg donation. Semin. Reprod. Endocrin., 9, 1991, s. 272ñ279. 156. RUSSEL, J. B., POLAN, M. L., CHERNEY, A. de: The use of pure FSH for ovulation induction in normal ovulatory women in an IVF program. Fertil. Steril., 45, 1986, s.†829ñ833.

82


157. RYBOUCHKIN, A., DOZORTSEV, D., SUTTER, P. de, et al.: The mouse oocyte activation test has a predictive value for the outcome of intracytoplasmic sperm injection in the human. Hum. Reprod., 10, 1995, Abstracts of 11th Annual meeting of ESHRE, Abstr. 042. 158. SALAT-BAROUX, J., GIACOMINI, P., CORNET, D.: Caracteristiques des grossesses obtenues par fecondation in vitro. J. Gynec. Obstet. Biol. Reprod., 14, 1985, s. 365ñ374. 159. SAUER, M. V., PAULSON, R. J., LOBO, R. A.: A preliminary report on oocyte donation extending reproduction potential of women over 40. N. Engl. J. Med., 323, 1990, s.†1157ñ1160. 160. SAUER, M. V., PAULSON, R. J., LOBO, R. A.: Pregnancy after age 50. Application of oocyte donation to women after natural menopause. Lancet, 2, 1993, s. 322ñ323. 161. SAUNDERS, D. M., LANCASTER, P. A. L., PEDISICH, E. L.: Increased pregnancy failure rates after clomiphene following assisted reproductive technology. Hum. Reprod., 7, 1992, s. 1154ñ1159. 162. SCOOLCRAFT, W., SCHLENKER, T., GEE, M.: Assisted hatching in the treatment of poor prognosis in vitro fertilization candidates. Fertil. Steril., 63, 1994, s. 551ñ554. 163. SCOTT, R. T., HOFMANN, G. E., OEHNINGER, S., et al.: Intercycle variabilty of the day 3 FSH levels and its effect on stimulation quality in IVF. Fertil. Steril., 54, 1990, s. 297ñ306. 164. SCOTT, R. T., TONER, J. P., MUASHER, S. J., et al.: Follicle-stimulating hormone levels on day 3 are predictive of in vitro fertilization outcome. Fertil. Steril., 51, 1989, s. 651ñ654. 165. SELICK, C. E., HOFMANN, G. E., ALBANO, C., et al.: Embryo quality and pregnancy potential of fresh compared with frozen embryos-is freezing detrimental to high quality embryos. Hum. Reprod., 10, 1995,s. 392ñ395. 166. SEOUD, M. A. F., TONER, J. P., KRUITHOFF, C., et al.: Outcome of twin,triplet and quadruplet in vitro fertilization pregnancies. Fertil. Steril., 57, 1992, s. 825ñ834. 167. SEPPƒLLƒ, M.: The world collaborative report on in vitro fertilisation and embryo replacement: Current state of the art in January 1984. A. NY Acad. Sci., 442, 1985, s.†558ñ563. 168. SERAFINI, P., STONE, B., KERIN, J., et al.: An alternate approach to controllled ovarian hyperstimulation in ªpoor-responders´: Pretreatment with a gonadotropin-releasing hormone analog. Fertil. Steril., 49, 1988, s. 90ñ95. 169. SERHAL, P. F., CRAFT, I. L.: Oocyte donation in 61 patients. Lancet, 1, 1989, s. 1185ñ1187. 170. SHAPIRO, M., TALBERT, G. B.: The effect of maternal age on decidualisation in the mouse. J. Geront., 29, 1974, s. 145ñ148. 171. SHAW, R. W., NDUKWE, G., IMOEDEMHE, D. A. G.: Twin pregnancy pituitary desenzitisation with LHRH agonist and pure FSH. Lancet, 2, 1985, s. 506ñ507. 172. SHER, G., HERBERT, C., JACOBS, M. H.: Assessment of the late proliferative phase endometrium by ultrasonography in patients undergoing in vitro fertilization and embryo transfer (IVF-ET). Hum. Reprod., 6, 1991, s. 232ñ237. 173. SHERMAN, B. W., WEST, J. H., KORENAMN, S. G.: The menopausal transition: analysis of LH, FSH, estradiol and progesterone concentrations during menstrual cycles of older women. J. Clin. Endocrin. Metab., 42, 1976, s. 629ñ637.

Literatura

83

174. SHRIVASTAV, P., NADKARNI, P., WENSVOORT, S., et al.: Percutaneous epididymal sperm aspiration for obstructive azoospermia. Hum. Reprod., 9, 1994, s. 2058ñ2061. 175. SCHARTZ, M., JEWELEWICZ, R., DYRENFURTH, Y., et al.: The use of hMG and hCG for induction of ovulation. Amer. J. Obstet. Gynec., 138, 1980, s. 801ñ807. 176. SCHOYSMAN, R., VANDERZWALMEN, P., NIJS, M., et al.: Pregnancy after fertilization with human testicular spermatozoa. Lancet, 342, 1993, s. 1237. 177. SCHWARTZ, P., MAYAUX, M. J.: Female fecundity as a function of age. N. Engl. J. Med., 306, 1982, s. 404ñ406. 178. SIEBZEHNR‹BL, E., TODOROW, S., UEM, J. van: Cryopreservation of human and rabbitt oocytes and one cell embryos. Comparison of dimethylsulfoxide and 1,2-propanediol. Hum. Reprod., 4, 1989, s.†312ñ317. 179. SILBER, S. J., ASCH, R., BALMACEDA, J., et al.: Pregnancy with sperm aspiration from the proximal head of the epididymis: A new treatment for congenital absence of the vas deferens. Fertil. Steril., 50, 1988, s. 525ñ528. 180. SILBER, S. J., DEVROEY, P., TOURNAYE, H., et al.: Fertilizing capacity of epididymal and testicular sperm using intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Reprod. Fertil. Dev., 7, 1995, s. 281ñ293. 181. SILBER, S. J., NAGY, Z. P., LIU, J., et al.: Conventional in vitro fertilization versus intracytoplasmic sperm injection for patients requiring microsurgical sperm aspiration. Hum. Reprod., 9, 1994, s. 1705ñ1709. 182. SILBER, S. J., ORD, T., BALMACEDA, J., et al.: Congenital absence of the vas deference: The fertilizing capacity of human epididymal sperm. N. Engl. J. Med., 323, 1990, s.†1788ñ1792. 183. SILBER, S. J.: The relationship of abnormal semen parameters to male infertility. Hum. Reprod., 4, 1989, s. 947ñ954. 184. SOBEK, A., HRBKOV¡, K., PRIESNITZ, J.: PrvnÌ tÏhotenstvÌ v »eskÈ republice dosaûenÈ po fertilizaci oocytu pomocÌ ICSI ñ intracytoplasmatickÈ injekce jednÈ spermie. »es. Gynek., 61, 1996, s. 3ñ6. 185. SOCIETY FOR ASSISTED REPRODUCTIVE TECHNOLOGY: The American Fertility Society: Assisted reproductive technology in the United States and Canada. 1991 results from the Society for Assisted Reproductive Technology generated from The American Fertility Society Registry. Fertil. Steril., 59, 1993, s. 956ñ962. 186. SPEIRS, A. I., LOPATA, A., GRONOW, M. J., et al.: Analysis of the benefits and risks of the multiple embryo transfer. Fertil. Steril., 39, 1983, s. 468ñ471. 187. STAESSEN, C., CAMUS, M., BOLLEN, N., et al.: The relationship between embryo quality and the occurrence of multiple pregnancies. Fertil. Steril., 57, 1992, s. 620ñ630. 188. STAESSEN, C., JANSSENSWILLEN, C., ABBEEL, E. van den, et al.: Avoidance of triplet pregnancies by elective transfer of two good quality embryos. Hum. Reprod., 8, 1993, s.†1650ñ1653. 189. STAESSEN, C., NAGY, Z. P., JANSENSWILLEN, C., et al.: One yearsí experience with elective transfer of two good quality embryos in the human IVF and ICSI programmes. Hum. Reprod., 10, 1995, s.†3305ñ3312. 190. STANGER, J. D., YOVICH, J. L.: Reduced IVF of human oocytes from patients with raised basal luteinizing levels during the follicular phase. Brit. J. Obstet. Gynaec., 92, 1985, s. 385ñ393.

84


191. STEIN, Z. A., RUFAS, O., AMIT, S.: Assisted hatching by partial zona dissection of human pre-embryos in patients with recurrent implantation failure after in vitro fertilization. Fertil. Steril., 63, 1995, s.†838ñ841. 192. STEIN, Z. A.: Womenís ages: Childbearing and childrearing. Amer. J. Epidemiol., 121, 1985, s. 327ñ342. 193. STEIRTEGHEM, A. C. van, ELST, J. van der, ABBEEL, E. van den, et al.: Cryopreservation of supernumerary multicellular human embryos obtained after intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril., 62, 1994, s. 775ñ780. 194. STEIRTEGHEM, A. C. van, LIU, J., JORIS, H.: Assisted fertilization by subzonal insemination and intracytoplasmic sperm injection. Reprod. Fertil. Dev., 6, 1994, s. 85ñ89. 195. STEIRTGEHEM, A. C. van, LIU, J., JORIS, H., et al.: Higher success rate by intracytoplasmic sperm injection than by subzonal insemination. Report of a second series of 300 consecutive treatment cycles. Hum. Reprod., 8, 1993, s. 1055ñ1060. 196. STEIRTGEHEM, A. C. van, NAGY, Z., JORIS, H., et al.: High fertilization rates after intracytoplasmic sperm injection. Hum. Reprod., 8, 1993, s. 1061ñ1066. 197. STEPTOE, P. C., EDWARDS, R. G., WALTERS, D. E.: Observations on 767 clinical pregnancies and 500 births after human IVF. Hum. Reprod., 1, 1986, s. 89ñ94. 198. STEPTOE, P. C., EDWARDS, R. G.: Birth after the reimplantation of a human embryo. Lancet, 2, 1978, s. 366ñ368. 199. STERZIK, K., DALLENBACH, C., SCHNEIDER, U., et al.: In vitro fertilization: The degree of endometrial insufficiency varies with the type of ovarian stimulation. Fertil. Steril., 50, 1988, s. 457ñ462. 200. STICE, S. L., ROBL, J. M.: Activation of mammalian oocytes by a factor obtained from rabbit sperm. Mol. Reprod. Dev., 25, 1990, s. 272ñ280. 201. SUTCLIFFE, A., DíSOUZA, S., CADMAN, J., et al.: Outcome in children from cryopreserved embryos. Arch. Dis. Child, 72, 1995, s. 290ñ293. 202. SUTTER, P. de, DOZORTSEV, D., CHEN, Q., et al.: Oocyte morphology does not correlate with fertilization rate and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. Hum. Reprod., 11, 1996, s. 595ñ597. 203. TAN, S. L., KINGSLAND, C., CAMPBELL, S.: The long protocol of administration of GnRH-a is superior to the short protocol for ovarian stimulation for IVF. Fertil. Steril., 57, 1992, s. 810ñ815. 204. TAN, S. L., ROYSTON, P., CAMPBELL, S., et al.: Cumulative conception and livebirth rates after in vitro fertilisation. Lancet, 339, 1992, s. 1390ñ1394. 205. TANBO, T., ABYHOLM, T., BJORO, T., et al.: Ovarian stimulation in previous failures from in vitro fertilization: Distinction between two groups of poor responders. Hum. Reprod., 5, 1990, s. 811ñ815. 206. TANBO, T., DALE, P. O., ABYHOLM, T., et al.: Follicle stimulating hormone as a prognostic indicator in clomiphene citrate/human menopausal gonadotrophin stimulated cycles for in vitro fertilization. Hum. Reprod., 4, 1989, s. 647ñ650. 207. TANBO, T., DALE, P. O., LUNDE, O., et al.: Prediction of response to controlled ovarian hyperstimulation: a comparison of basal and clomiphene citrate stimulated follicle-stimulating hormone levels. Fertil. Steril., 57, 1992, s. 819ñ824. 208. TARLATZIS, B., PADOS, G., BONTIS, J.: Ovarian stimulation with Buserelin/HMG/HCG: Prospective randomized study of short versus long protocol. Hum. Reprod., 8, 1993, s.†807ñ812.

Literatura

85

209. TESARIK, J., SOUSA, M., TESTART, J.: Human oocyte activation after intracytoplasmic sperm injection. Hum. Reprod., 9, 1995, s. 511ñ518. 210. TESARIK, J., SOUSA, M.: Comparison of Ca2+ responses in human oocytes fertilized by subzonal insemination and by intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril., 62, 1994, S. 1197ñ1204. 211. TESTART, J., LASSALLE, B., BELAISCH-ALLART, J.: High pregnancy rate after early human embryo freezing. Fertil. Steril., 46, 1986, s.†268ñ272. 212. TONER, J. P., PHILPUT, C. B., JONES, G. S., et al.: Basal follicle-stimulating hormone level is a better predictor of in vitro fertilization performance than age. Fertil. Steril., 55, 1991, s. 784ñ790. 213. TOURNAYE, H., DEVROEY, P., LIU, J., et al.: Microsurgical epididymal sperm aspiration and intracytoplasmic sperm injection: A new effective approach to infertility as a†result of congenital bilateral absence of the vas deference. Fertil. Steril., 61, 1994, s.†1045ñ1051. 214. TOURNAYE, H., LINDEN, M. van der, ABBEEL, E. van den, et al.: Mouse in vitro fertilization using sperm treated with pentoxyphylline and 2-deoxyadenosine. Fertil. Steril., 62, 1994, s. 644ñ647. 215. TROTNOW, S., AL-HASANI, S., H‹NLICH, T., et al.: Bilateral tubal pregnancy following in vitro fertilisation and embryotransfer. Arch. Gynec., 234, 1983, s. 75ñ78. 216. TROUNSON, A. O., MOHR, L.: Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo. Nature, 335, 1983, s. 707ñ709. 217. TROUNSON, A. O., PEURA, A., KIRBY, C.: Ultrarapid freezing: a new low-cost and effective method of embryo preservation. Fertil. Steril., 48, 1987, s. 843ñ846. 218. TROUNSON, A. O., SJ÷BLOM, P.: Cleavage and development of human embryos in vitro after ultrarapid freezing and thawing. Fertil. Steril., 50, 1988, s. 373ñ375. 219. TROUNSON, A. O., WOOD, C., LEETON, J.: Freezing of human embryos: An ethical obligation. Med. J. Aust., 2, 1982, s. 332ñ334. 220. TROUNSON, A. O.: Preservation of human eggs and embryos. Fertil. Steril., 46, 1986, s. 1ñ12. 221. TSIRIGOTIS, M., YANG, D., REDGMENT, C. J., et al.: Assisted fertilization with intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril., 62, 1994, s. 781ñ785. 222. TUCKER, M. J., WRIGHT, G., MORTON, P. C., et al.: Practical evaluation and application of direct intracytoplasmic sperm injection for male factor and idiopathic fertilization failure infertilities. Fertil. Steril., 63, 1995, s. 820ñ827. 223. VAUTHIER-BROUZES, D., LEFEBVRE, G., LESOURD, S., et al.: How many embryos should be transferred in in vitro fertilization? Fertil. Steril., 62, 1994, s. 339ñ342. 224. VENTRUBA, P., é¡KOV¡, J., ADLER, J., et al.: Prodlouûen· kultivace lidsk˝ch embryÌ: srovn·nÌ kokultivace na lidsk˝ch tub·rnÌch epiteliÌch a kultivace v syntetickÈm mediu. »es. Gynek., 61, 1996, s. 351ñ357. 225. VOGT, P.: Genetic aspects of human infertility. Int. J. Androl., 18, 1995, s. 3ñ6. 226. VOLUNTARY LICENCING AUTHORITY: The second report of the Voluntary Licencing Authority for human in vitro fertilization and embryology. London, VLA 1987. 227. WANG, X. J., et al.: The contribution of embryo cryopreservation to in vitro fertilization/gamete intra-Fallopian transfer: 8 years experience. Hum. Reprod., 9, 1994, s. 103ñ109.

86


228. WEIR, N. C., HENRICKS, C. H.: The reproductive capacity of an infertile population. Fertil. Steril., 20, 1969, s. 289ñ298. 229. WEST, P. C.: Age and infertility. Brit. Med. J., 294, 1987, s. 853ñ854. 230. WHITTINGHAM, D. G., LEIBO, S. P., MAZUR, P.: Survival of mouse embryos frozen to -196 °C and -269 °C. Sci., 178, 1972, s. 411. 231. WHITTINGHAM, D. G.: Survival of mouse embryos after freezing and thawing. Nature, 233, 1971, s. 125ñ126. 232. WIEMER, K., AMBORSKI, G., DENNISTON, R., et al.: Use of hormone treated fetal uterine fibroblast monolayer for in vitro development for bovine embryos. Theriogenol., 27, 1987, s. 294ñ299. 233. WILEY, L. M., AYAMAMI, S., MUYDEN, D. van: Effect of potassium concentration, type of protein supplementation and embryo density on mouse preimplantation development in vitro. Fertil. Steril., 45, 1986, s. 111ñ119. 234. WINSLOW, K. L., TONER, J. P., BRYSKI, R. G., et al.: The gonadotropin-releasing hormone agonist stimulation test: a sensitive predictor of performance in the flare-up in vitro fertilization cycle. Fertil. Steril., 56, 1991, s. 711ñ717. 235. WORLD HEALTH ORGANIZATION: Laboratory manual for the examination of human semen and semen-cervical mucus interaction. 3. ed. New York, Cambridge Univ. Press 1992. 236. WRIGHT, G., WIKER, S., ELSNER, C.: Observation of the morphology of pronucleoli in human zygotes and implications for cryopreservation. Hum. Reprod., 5, 1990, s. 109ñ115. 237. YANAGIMACHI, R., YANAGIMACHI, H., ROGERS, B. J.: The use of zonafree animal ova as a test system for the assessment of the fertilizing capacity of human spermatozoa. Biol. Reprod., 15, 1976, s. 471ñ476. 238. YANAGIMACHI, R.: Zona-free hamster eggs: Their use in assesing fertilizing capacity and examining chromosomes of human spermatozoa. Gamete Res., 10, 1984, s. 187ñ232. 239. YOSHIMURA, Y., HOSOI, Y., ATLAS, S. J.: Effect of exposure of intrafollicular oocytes to clomiphene citrate on pregnancy in the rabbit. Fertil. Steril., 50, 1988, s. 153ñ159. 240. YOVICH, J. L., STANGER, J. D.: The limitation of IVF from males with severe oligospermia and abnormal semen morphology. J. In Vitro Fertil. Embryo Transfer, 1, 1984, s.†172ñ179. 241. YOVICH, J. L., STANGER, J. O., YOVICH, J. M.: Management of oligospermic infertility by IVF. A. NY Acad. Sci., 442, 1985, s. 311ñ323. 242. YOVICH, J. L.: Assisted reproduction for male factor infertility. In: BRINSDEN, P., RAINBURY, P. A. (Eds): A textbook of in vitro fertilization and assisted reproduction. 243. ZEILMAKER, G. H., ALBERDA, A. T., GIENT, I. van, et al.: Two pregnancies following transfer of intact frozen-thawed embryos. Fertil. Steril., 42, 1984, s. 293ñ296. 244. ZEILMAKER, G. H., RIJKMANS, C. M. P. M.: Experience with the hamster test in a IVF laboratory. In: AITKEN, R. J.: The zona-free hamster oocyte penetration test and the diagnosis of male infertility. Int. J. Androl., 6, 1986 (suppl.), s. 142ñ146.

87

AUTOR

MUDr. Tonko MardeöiÊ, CSc. (* 1955) LÈka¯skou fakultu UK v Praze absolvoval v roce 1980, kdy nastoupil na gynekologicko-porodnickÈ oddÏlenÌ nemocnice v BerounÏ. Od roku 1985 p˘sobil v ⁄stavu pro pÈËi o matku a dÌtÏ v Praze a od roku 1996 je vedoucÌm lÈka¯em Sanatoria Pronatal. Jeho hlavnÌm odborn˝m z·jmem je asistovan· reprodukce. ZÌskal hodnost kandid·ta lÈka¯sk˝ch vÏd (1989), z˙Ëastnil se zahraniËnÌch st·ûÌ v NÏmecku (Mnichov 1992, Hamburk 1993) a Anglii (Cambridge-Bourn Hall 1994). Od roku 1991 se vÏnuje postgradu·lnÌ a†od roku 1992 i pregradu·lnÌ v˝uce. Publikoval 43 odborn˝ch pracÌ v dom·cÌch a 7 v zahraniËnÌch periodicÌch, p¯ednesl vÌce neû 50 sdÏlenÌ na dom·cÌch a 19 na zahraniËnÌch vÏdeck˝ch setk·nÌch. Je autorem publikace Neplodnost (Makropulos, 1996). Je Ëlenem »eskÈ gynekologickÈ a porodnickÈ spoleËnosti (Ëlen v˝boru a p¯edseda sekce asistovanÈ reprodukce), EvropskÈ spoleËnosti pro lidskou reprodukci a embryologii (ESHRE) a AmerickÈ spoleËnosti pro reprodukËnÌ medicÌnu (ASRM). Je rovnÏû Ëlenem komise Ministerstva zdravotnictvÌ »R pro in vitro fertilizaci.

Edice ALMA MATER. Tonko MardeцiК MIMOTГLNХ OPLODNГNХ. Faktory ovlivъujмcм spпцnost lилby

Recommend Documents