Ecologie van de fosfaatopname door macrofyten, met bijzondere aandacht voor Chara giobuiaris

KA THOLIEKE UNIVERSITEIT TE LEUVEN

FACULTEIT WETENSCHAPPEN DEPARTEMENT BIOLOGIE LAB ORATORIUM VOOR PLANTENECOLOGIE

Ecologie van de fosfaatopname door macrofyten, met bijzondere aandacht voor Chara giobuiaris

door

Heroen Verbruggen

Promotor: Prof. Dr. J. Van Assche

proefschrift ingediend tot het behalen van de graad van licentiaat in de Biologie

2000-2001

Dit proefschrift is een examendocument, dat na verdediging niet gecorrigeerd wordt voor eventueel vastgestelde fouten. In publicaties mag enkel naar dit werk gerefereerd worden mits schriftelijke toelating van de promotor vermeld op de voorpagina.

Vele mensen hebben mij bijgestaan en geholpen gedurende het voorbije jaar en ik wil hiervoor mijn dankbaarheid uiten. Zoals het hoort, dank ik in de eerste plaats mijn promotor, JozefVan Assche, voor de kans die hij mij gaf op zijn labo het onderzoek te doen dat me erg geboeid heeft. Ik heb van hem bijzonder veeI vrijheid gekregen bij het invullen van het onderzoek, wat ik erg apprecieer. Ik wil ook Wouter, mijn begeleider, bedanken voor alle hulp en de kritische opmerkingen. De professoren en het personee1 van de laboratoria Ontwikkelingsbiologie en Plantenfysiologie wil ik bedanken voor hun collegialiteit. Het gebruik van hun materiaal was, ten gevolge van defecte pH-meters en drukbezette fotospectrometers in het eigen laboratorium, een absolute noodzaak. Andre van Laere en Jan Colpaert hebben mij bijgestaan toen er zich problemen stelden in verband met de transporterkinetica. Luc De Meester en Steven Declerck hebben een aantal nuttige suggesties en opmerkingen aangebracht in verband met een aantal hypothesen over de pH-afhankelijkheid van de fosforhuishouding en de consequenties hiervan voor de ecologie van het meer. Luc Vervoort verschafte mij toegang tot het natuurreservaat Vorsdonkbos-Turfputten en wisselde met mij van gedachten over de groeistrategieen van Chara en Elodea. Allemaal bedankt hiervoor. I would like to thank Tetsuro Mimura and Robert Reid for their unpublished findings and their helpful comments on the regulation of phosphate uptake in Chara. Ik wens ook Olga te bedanken voor de resultaten van haar arbeidsintensief telwerk die ik heb mogen incorporeren in de gegevensset over de seizoenale opvolging. Bedankt ook voor de hulp bij de wateranalyse en voor het foutloos meenemen van pen en papier op het veld. Pieter, bedankt voor de diepgaande babbels over de ecologie van ondiepe meren en over tal van andere onderwerpen, voor de hulp bij de wateranalyse en voor de niet aflatende vriendschap gedurende de voorbije vier jaren. Ineke en Annemie hebben het hobbelige pad van de stikstotbepaling voor mij geeffend, heel stevig bedankt daarvoor. Ik wil ook aIle andere mensen op het labo bedanken, voor de geweldige tekeningen op het bord en de samenwerking, en last but not least, voor het opgebrachte geduld, dat ongetwijfeld nodig was om een heeljaar in (relatieve) vrede met mij samen te werken. Ook dank aan aI mijn vrienden, in het bijzonder aan Kurt, Philippe en Saar. Ik wens ook mijn broer te danken omdat hij mij toch maar blijft steunen in wat hij zelf mijn vakidiotie noemt. Uiteindelijk zou ik deze gelegenheid willen aangrijpen om heel mijn familie, maar in het bijzonder mijn ouders, te danken. Zonder hen zou ik onmogelijk staan waar ik nu sta. Ik wil hen danken voor aile steun, zowel de materiele als de psychologische. Het is aan mijn ouders dat ik deze eindverhandeling opdraag. Heroen Verbruggen, 10 mei 2001.

INHOUD INLEIDING EN DOELSTELLINGEN

LITERATUURSTUDIE

3

2.1 2.2 2.3 2.4

3 3 4 5 5 8 9

FOSFOR ALS MACRO NUTRIENT FOSFOR IN AQUA TISCHE MILIEUS FOSFORCOMPARTIMENTEN EN -POOLS IN DE CEL FOSFAATOPNAME IN PLANTEN: TRANSPORTERS EN REGULATIE

2.4.1 2.4.2 2.4.3 2.4.4

FOSF AA TOPNAME DOOR PLANTEN DE RESPONS VAN PLANTEN BIJ FOSFORUITHONGERING CONTROLEMECHANISMEN VAN DE FOSFAATOPNAME FOSF AA THOMEOSTASE

13

2.5 DE INVLOED VAN pH EN NATRIUM OP DE FOSFAA TOPNAME 2.6 MACROFYTEN EN DE FOSFORHUISHOUDING VAN ONDIEPE MEREN 2.6.1 WATERKOLOM EN SEDIMENT ALS FOSFORBRONNEN VOOR MACROFYTEN 2.6.2 MACROFYTEN EN DE PI-CONCENTRATIE VAN WATERKOLOM EN SEDIMENT 2.6.3 FOSFOR EN DE ECOLOGIE V AN CHARA 2.6.4 FYTOPLANKTON EN DE FOSFORHUISHOUDING V AN ONDIEPE MEREN 2.7 BIOLOGISCHE STOICHIOMETRIE: EEN KORTE INLEIDING 2.8 INTERACTIES TUSSEN FYTOPLANKTON, PERIFYTON EN MACROFYTEN 2.9 BEKNOPTE UITDIEPING VAN DE ECOLOGIE VAN ONDIEPE WATERS 2.9.1 EUTROFIERING 2.9.2 HET VOEDSELWEB IN ONDIEPE ZOETWATERECOSYSTEMEN 2.9.3 ALTERNATIEVE EVEWICHTEN 2.9.4 MACROFYTEN EN DE HELDERE TOESTAND 2.9.5 BIOMANIPULATIE

34 34

MATERIAAL EN METHODEN

37

3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7

16 17 17 19 21

23 24 28 30 30 31

32

W ATERANALYSE EN SEIZOENALE OPVOLGING VAN DE FOSFAA TOPNAME

37

DE INVLOED VAN NA+ EN K+ OP DE FOSFAATOPNAME

40 43 44

OPNAME-EXPERIMENTEN VAN ZEER KORTE DUUR INVLOED VAN DE pH OP DE PI-OPNAME HET CBARA-ELODEA EXPERIMENT

46 46

HET CHARA FOSFORVERZADIGINGSEXPERIMENT

49

SNELHEID VAN DE RESPONS BIJ FOSFORUITHONGERING

RESULTATEN

51

4.1 KINETICA VAN DE FOSFAATOPNAME 4.2 SEIZOENALE OPVOLGING

51

4.3 DE INVLOED VAN NA+ EN K+ 4.4 OPNAME-EXPERIMENTEN VAN ZEER KORTE DUUR 4.5 INVLOED VAN DE pH OP DE PI-OPNAME

56 59 60 63 64

4.6 SNELHEID VAN DE RESPONS BIJ FOSFORUITHONGERING 4.7 BET CHARA-ELODEA EXPERIMENT 4.8 BET CHARA FOSFORVERZADIGINGSEXPERIMENT

51

70

BESPREKING

73

5.1 DE OPNAME VAN FOSFOR DOOR CHARA GLOBULARIS 5.2 KINETICA VAN DE FOSFAATOPNAME 5.3 SEIZOENALE OPVOLGING

73

5.4 DE INVLOED VAN NA+ EN K+ OP DE FOSFAATOPNAME 5.5 OPNAME-EXPERIMENTEN VAN ZEER KORTE DUUR

5.6 5.7 5.8 5.9

INVLOED VAN DE

pH OP DE SNELHEID VAN FOSFAATOPNAME

74 75 78

79 80

BET CHARA-ELODEA EXPERIMENT

81 81

BET CHARA FOSFORUITHONGERINGSEXPERIMENT

86

SNELHEID VAN DE RESPONS BIJ FOSFAATUITHONGERING

REFERENTIELIJST

89

SAMENVATTING SUMMARY

93 95

ApPENDICES ApPENDIX 1: SAMENSTELLING VAN APW

A-1

ApPENDIX 2: AFKORTINGENLIJST

A-2

ApPENDIX 3: MA TERIAAL EN METHODEN

A-3

ApPENDIX 4: RESULTATEN

A-5

INLEIDING EN DOELSTELLINGEN Fosfor is een belangrijk macronutrient. Het is een component van structure Ie en functionele moleculen in de cel. Het speelt bovendien een belangrijke rol in het energiemetabolisme en de regulatie van enzymen. In natuurlijke omstandigheden is fosfor vaak in ondermaat aanwezig. Planten hebben dan ook tal van morfologische en fysiologische adaptaties verworven om efficient fosfaat op te nemen. Voor natuurlijke zoetwater-ecosystemen wordt tamelijk algemeen aanvaard dat fosfor de voornaamste limiterende factor is voor de groei. De laatste decennia werden echter de meeste vijvers en meren uit bewoonde gebieden, door toedoen van menselijke activiteiten, overmatig aangerijkt met fosfor en andere nutri"enten (eutrofiering). De reactie op deze aanrijking was vaak overweldigend. De vijvers en meren, die voorheen helder waren en voorzien van een florerende onderwatervegetatie en dito fauna, werden omgevormd tot sobere waters waarin, op de dense fytoplanktongemeenschap na, nog amper leven te bespeuren was. Ondergedoken macrofyten, en in het bijzonder charofyten, zijn belangrijk in het behoud van de heldere toestand van zoetwatersystemen. Charofyten verdwijnen relatief snel bij nutrientaanrijking van een water. De oorzaak hiervoor was een punt van discussie. Vroeger nam men, op basis van slechts een studie, aan dat de charofyten verdwenen ten gevolge van toxische effecten van de hoge fosforconcentraties. Deze fosfaatinhibitie werd echter hoe langer hoe meer tegengesproken. Tegenwoordig neemt men aan dat het verdwijnen van de charofyten, net zoals van de andere macrofyten, vooral te wijten is aan lichtcompetitie met het fytoplankton en epifyton, dat door de nutrientaanrijking in staat is sterk te floreren. Macrofyten stabiliseren de heldere toestand van het water. Hiertoe zijn er enkele mechanismen gekend, waarvan allelopathie en sterke competitieve kracht voor het verwerven van groeilimiterende nutrienten er twee zijn. Uit een aantal studies blijkt dat macrofyten over het algemeen sterke competitoren zijn voor fosfor en dat ze op die manier in staat zijn de fosforcyclus van het water te domineren. Het onderzoek dat in deze scriptie wordt voorgesteld had als doel bijkomende informatie en inzichten te verwerven over dit fenomeen. De studie kent in hoofdzaak drie doelstellingen. De eerste is om seizoenale patronen in abiotische factoren te koppelen aan de fosfaatopname van Chara globularis in een door deze soort gedomineerde vijver. Ten tweede werd beoogd in laboratoriumomstandigheden de invloed van een aantal parameters (ionenconcentraties, pH) op de fosfaatopname na te gaan. Een laatste doelstelling is om de groeistrategieen van Chara (typisch voor oligo- en mesotrofe waters) en Elodea (typisch voor eutrofe waters) te koppelen aan hun fosfaatopname-gedrag. Wat betreft de eerste doelstelling werd gedurende een volledig jaar een vijver maandelijks bemonsterd. De fosfaatopname van de erin aanwezige Chara globularis werd in het laboratorium gekwantificeerd en er werd getracht de kinetische parameters te koppelen aan enerzijds de groeipatronen en het inwendige fosforgehalte van de planten en anderzijds aan de abiotische kenmerken van het ecosysteem. Het tweede luik besteedt aandacht aan de invloed van abiotische factoren op de fosfaatopname van Chara globularis. Vooral de pH en de natrium- en kaliumconcentraties werden hierbij geviseerd. Wat betreft pH werd ook een experiment uitgevoerd met Nitella jlexilis. Er werden bovendien een

aantal experimenten uitgevoerd om na te gaan hoe snel Chara reageert op fosforuithongering en om de aard van het transmembranair transport van fosfaat na te gaan. Het derde luik centreert zich rond een aantal biotische kenmerken die mogelijk een invloed hebben op de fosfaatopname. Chara globularis en Elodea nutallii werden in het laboratorium gedurende lange termijn blootgesteld aan fosforloos en -bevattend medium. De snelheid van fosfaatopname werd opgevolgd terwijl de inwendige fosforgehaltes veranderden door toedoen van de incubatie. De waargenomen patronen werden gekoppeld aan de levensstrategieen van beide soorten.

2

LITERA TUURSTUDIE

2.1 FOSFOR ALS MACRONUTRIENT Fosfor is een belangrijk macronutrient dat instaat voor ongeveer 0.2% van het drooggewicht van de gemiddelde plant. Het is een essentieel component van nucleYnezuren en fosfolipiden en is bovendien van enorm belang in het energiemetabolisme en de regulatie van enzymen (Mimura, 1995 en referenties daarin). De rol van fosfor in metabolische pathways, in de regulatie van RNasen en fosfatasen, voor wortelarchitectuur en mycorrhiza-interacties en in zijn eigen opname zijn reeds intensief bestudeerd (Theodorou & Plaxton, 1993; Raghothama, 1999 en referenties daarin) Algemeen wordt aangenomen dat, voor terrestrische ecosystemen, fosforlimitatie de tweede meest voorkomende vorm van macronutrientlimitatie is; waarschijnlijk komt stikstoflimitatie nog meer voor (Schachtman et at., 1998). Voor zoetwater-ecosystemen wordt voornamelijk fosfor als de groeilimiterende factor gezien. Een recent gepubliceerde grootschalige studie toont echter aan dat stikstoflimitatie meer voorkomt dan algemeen aangenomen (Elser et at., 2000b). Fosfaattekort reduceert relatief snel de groei van de plant. De deficientie remt de fotosynthese, veroorzaakt een herverdeling van het aanwezige fosfor en heeft een duidelijke invloed op de allocatie van de gevormde assimilaten.

2.2 FOSFOR IN AQUATISCHE MILIEUS 2.2.1 FOSFOR IN DE WATERKOLOM Meestal komt fosfor voor in de geoxideerde P.P. Tot-P = total phosphorus vorm, als anorganisch orthofosfaation (HPO/-, P.P. = particulate phosphorus { S. P. = soluble phosphorus HP0 4-) of gebonden aan organische stoffen Tot-P S.P. {S.R.P S.R.P. = soluble reactive phosphorus (Holtan et at., 1988). Fosfor kan onder verS.U.P. =soluble unreactive phosphorus schillende gedaanten voorkomen in de waterS.U.P. kolom. Eerst kan men onderscheid maken tusFiguur 2.1 Fosfor in de waterkolom (naar Holtan et sen de fractie fosfor die gebonden is in zwea/., 1988) vende partikels (p.p.1) en de oplosbare fosforfractie (S.P.). Deze laatste kan nog verder ingedeeld worden in oplosbaar reactief fosfor (S.R.P.) en oplosbaar onreactieffosfor (S.U.P.) (figuur 2.1). Van het S.R.P. nam men lang aan dat het grotendeels equivalent was aan het orthofosfaat (HPO/-, H2 POn en de onmiddellijk beschikbare fosforfractie was. Tussen de verschillende vormen van het S.P. en het P.P. bestaat er intensieve uitwisseling, met belangrijke gevolgen voor de fosforbeschikbaarheid van organismen. Van het S.R.P. neemt men aan dat het volledig beschikbaar is voor opname door organismen. Het S.U.P. is snel mobiliseerbaar (enzymatische hydrolyse) en het P.P. kan snel in oplossing komen als de omstandigheden hiertoe 1

Appendix 2 vat de gebruikte afkortingen samen.

3

geschikt zijn. Vee 1 van het fosfor dat niet direct beschikbaar is voor groei van organismen kan dus relatief snel worden omgezet in een beschikbare vorm. In eutroficatiestudies gebruikt men vaak de totale hoeveelheid fosfor die aanwezig is in de waterkolom (totaal-P of TP). Dit brengt echter twee beperkingen met zich mee. Ten eerste kan niet de volledige hoeveelheid TP in de waterkolom snel worden omgezet in beschikbare vorm en ten tweede is er in ondiepe meren een sterke uitwisseling van P tussen het sediment en de waterkolom, zodat een momentopname van het TP van de waterkolom niet noodzakelijk representatief is voor de nutrientstatus van het meer (zie ook figuur 2.21). Orthofosfaatconcentraties in zoetwatermeren en -vijvers zijn meestal te situeren tussen 1.5 IlgP rl (0.05 11M) en 60 IlgP rl (211M) of zelfs meer (Bieleski, 1973).

2.2.2 FOSFOR IN HET SEDIMENT EN INTERACTIES TUSSEN BE IDE FOSFORPOOLS

Holtan et al. (1988) en Scheffer (1998) gaan dieper in op de fosforreservefunctie van het sediment. De fosforcyclus van een doorsnee ondiep meer wordt kort geschetst in figuur 2.2.a. Turbulentie speelt hierin een belangrijke rol. Enerzijds wordt het fosfortransport vanuit het sediment naar de waterkolom versneld door turbulentie (fosforvrijzetting door resuspensie). Anderzijds zorgt turbulentie voor een blijvende aerobe bovenlaag van het sediment. Dit haalt fosfor weg uit de waterkolom door sedimentatie van Fe3+ met Pi. De invloed van de turbulentie op de fosforvrijzetting uit het sediment wordt samengevat in figuur 2.2.b. Merk op dat de zuurstofstatus in de toplaag van het sediment ook in belangrijke mate onder invloed van het biotische activiteiten (b.v. microbieel zuurstofverbruik) staat. (a)

(b)

ji

t:::::====~ J Afbraak

,

'. ~ ~

,

turbulentie aan sedimentoppervlak

-................ -_ .. -_ .. __ .. -- ........ -.... -- -_ .. ',

Figuur 2.2 (a) Schematische voorstelling van de belangrijkste processen van de interne fosforcyclus van een ondiep meer. Turbulentie veroorzaakt maar tempert tegelijk de fosfaatvrijzetting. Naar Scheffer, 1998. (b) Schematische voorstelling van het effect van turbulentie aan het sedimentoppervlak op de fosforvrijzetting vanuit het sediment. Naar Scheffer, 1998.

2.3 FOSFORCOMPARTIMENTEN EN -POOLS IN DE CEL Het grootste gedeelte (ongeveer 90%) van het fosfaat in de eel is aanwezig in de vacuole. De overige 10% van het fosfaat wordt, samen met het veresterd fosfor, teruggevonden in het cytoplasma (Bieleski & Ferguson, 1983 en referenties daarin). Recentere 31 p _NMR spectroscopie toont aan dat het Pi-gehalte van het cytoplasma nog lager is dan voorheen gedacht (ca. 1-5% van de totale Pi in de eel) (Schachtman et al., 1998). Ais radioactief gemerkt fosfor wordt toegediend aan cellen zullen de cyto-

4

plasmatische Pi-pool en de fosfaatesters van het cytoplasma gemerkt worden lang voordat de eerste radioactiviteit verschijnt in de vacuole. In lagere planten is vaak een polyfosfaatreserve aanwezig.

O.B

0.6 .!!!

~

0.4

0.2 Ook binnen het het cytoplasma kunnen verschillende fosfaatpools worden onderO~------~--~------~--~----~~ o 1 2 3 4 5 6 7 B 9 10 11 12 13 14 scheiden. Enerzijds maakt men vaak onderpH scheid op basis van de chemische vorm Figuur 2.3 pH-afhankelijkheid van het ionkarakter van waaronder het fosfor voorkomt: Pi, DNA, fosfaat. Bij lage pH komt Pi voor onder vorm van H3P04. Met toenemende pH verliest het steeds meer protonen RNA, vetgebonden P en andere P-esters aan het medium ...... : H3 P04; - : H2P04-; - - -: HPO/-; (Bieleski, 1973; Schachtman et ai., 1998). . - . -: P043-. Anderzijds kan men onderscheid maken op basis van de fYsische compartimentatie: de verschillende organellen en het grondplasma kunnen als afzonderlijke pools gezien worden. Afhankelijk van de pH in het compartiment zal fosfaat voorkomen als H3 P04 , H2 P04-, HPO/- of pol- (zie figuur 2.3).

AIleen de cytoplasmatische fosfaatpool is metabolisch actief. Voor de metabolische reacties is het zeer belangrijk de cytoplasmatische fosfaatconcentratie binnen nauwe grenzen te houden (homeostase). Hiertoe wordt voomamelijk gebruik gemaakt van de fosfaatreserve in de vacuole (cf. 2.4.4).

2.4 FOSFAATOPNAME IN PLANTEN: TRANSPORTERS EN REGULA TIE

2.4.1 FOSFAATOPNAME DOOR PLANTEN

2.4.1.1 Inleiding De import van fosfor in de plant gebeurt aan het plasmalemma. De fosfaatopname over de plasmamembraan gebeurt tegen een steile concentratiegradient in (1000x tot meer). Bij de meeste onderzochte planten wordt tweefazige opname waargenomen. De hoge affiniteitstransporters (vaak zijn er meerdere aanwezig) werken optimaal bij lage concentraties Pi in het medium (grootte-orde )lM) en de lage affiniteitstransporter (waarschijnlijk in de meeste soorten maar een) werkt optimaal in het mM gebied. Gezien de lage fosfaatconcentraties in de meeste natuurlijke milieus is het zeer waarschijnlijk dat voomamelijk de hoge affiniteitstransporters van primair belang zijn voor de fosfaatopname. Het H2P0 4- ion wordt het makkelijkst opgenomen door piantencellen. Aangezien immers de orthofosfaationen tegen een elektrische potentiaal in moeten worden opgenomen, is deze vorm energetisch gunstiger dan de andere twee (HPO/-, PO/-).

5

2.4.1.2 Opname met behulp van proton-cotransport

Voor de opname werd cotransport met protonen voorgesteld (Sakano, 1990; Sakano et al., 1992; Raghothama, 1999 en referenties daarin). Sakano (1990) vond dat toevoeging van fosfaat aan het incubatiemedium van celsuspensies van Catharanthus roseus (L.) G. Don. stijging van de pH van het incubatiemedium veroorzaakte (figuur 2.4.a). Deze stijgingen bleken proportioneeJ toe te nemen met de hoeveelheid toegediend fosfaat (figuur 2.4.b). De proton/fosfaat stoichiometrie is negatief gecorreleerd met de hoeveelheid toegediend fosfaat (figuur 2.4.c). Ze bedraagt meestal tussen de 2 (zoals eerder al voorgesteld door Ullrich-Eberius et at., 1981 en 1984; beide uit Sakano, 1990) bij relatief hoge fosfaatconcentratie en 4 bij zeer lage fosfaatconcentraties. Buffering van het medium veroorzaakt dan ook een lichte pH-stress voor de plantencellen (Sakano, 1990; Sakano et al., 1992; figuur 2.5)

(b)

lOmin
5.0

lOmin

Pi dose (.umoie/g fresh wt)

Figuur 2.4 Fosfaatopname in celsuspensies van Catharanthus roseus (L.) G. Don. (a) en (b) tonen de pH-verschuivingen die gepaard gaan met fosfaatopname. In (a) werd telkens 10 !lmol fosfaatoplossing toegediend. De tijd nodig om te pH-piek te bereiken is telkens 7 minuten. (b) Bij toediening van verschillende hoeveelheden Pi veranderde ook de pH-respons, wat een goede aanduiding is voor proton/fosfaat cotransport. Bij de eerste toediening van 1 !lmol fosfaat werd geen daling van de pH waargenomen, waarschijnlijk omdat voor zulke kleine verschillen de H+-ATPasen niet in werking worden gesteld. (c) De waargenomen proton/fosfaat stoichiometrie staat duidelijk in negatief verband met de hoeveelheid toegevoegd fosfaat. Uit Sakano, 1990.

Fosfaattransporters worden gecodeerd door een kleine genenfamilie (Muchhal et al., 1996; uit Muchhal & Raghothama, 1999). Alle gekloneerde Pi transporters zijn integrale protei'nes met 12 membraanoverspannende regio's. Deze membraanoverspanningen zijn, door een grote hydrofiele regio aan de cytoplasmatische zijde, opgedeeld in twee groepen van zes (figuur 2.6). Deze structuur komt voor bij de meest uiteenlopende organismen en is erg gelijkend aan suiker-, ionen-, antibiotica- en aminozuurtransporters (Raghothama, 1999). 100

Het pH optimum van de fosfaattransporters ligt in het bereik 4.5 a 5.0.

;;;

:

80

8

60

t

40

il

.s

--<>-----0

;;: 20 0 0

20

10

Time

cytoplasmatische zijde

Figuur 2.6 Een model van de fosfaattransporter van planten, met 12 membraanoverspannende gebieden. Uit Raghothama, 1999.

6

30

(min)

Figuur 2.5 Het tijdsverloop van de fosfaatopname door een celsuspensie van Catharanthus roseus (L.) G. Don. bij een initiele pH van 4.2, in ongebufferd (0) en MES-TRIS gebufferd (e) medium. Uit Sakano et al., 1992.

2.4.1.3 Fosjaatopname bij Chara corallin a De kinetica van de fosfaatopname van het groenwier Chara corallina werd bestudeerd door Mimura et al. (1998). Figuur 2.7 toont hun bevindingen. Er kunnen twee opnamesystemen worden onderscheiden, een met hoge affiniteit voor Pi (Km ~ 4 11M ~ 124 I1gP/l) en een met lage affiniteit voor Pi (Km ~ 220 11M ~ 6820 IlgP/I).

30

~'"

's

(a)

20

"0 S

,5.

>< ~

10

.S

e::

0 0.2

0

Er werden bij Chara corallina geen pH-variaties waargenomen bij toediening van fosfaat, zoaIs weI het geval was bij vroeger onderzoek met hogere planten (Sakano, 1990; Ullrich-Eberius et al., 1981; Ullrich-Eberius et al., 1984). Om een eventueIe invloed van in de praktijk onmeetbare pHvariaties over de plasmamembraan na te gaan werd de cytoplasmatische pH gevarieerd door intracellulaire perfusie (Mimura et al., 1998). Dit experiment leverde geen verband op tussen de cytopIasmatische pH en de fosfaatopname en doet dus vermoeden dat het opnamesysteem niet uit een proton/fosfaat cotransporter bestaat.

0.4

0.6

0.8

Pi (mM)

(b)

0.2 N

"'

's

"0 S

:S ::: " 0:::

0,15 0.1 0.05

.S

0

if

0.6

r 0

0.4 0.2 0 50

100

r 0

50

100

l/Pi concentration (l/mM)

Figuur 2.7 Fosfaatopname in geTsoleerde internodiumcellen van Chara corallina. e: controle; 0: fosforuitgehongerde cellen. (a) Afhankelijkheid van fosfaatinflux op de externe Pi concentratie. (b) dubbele reciproque plots van (a). Uit Mimura et al. (1998),

Toen Smith en Walker (1989) aantoonden dat K+ influx bij Chara australis Na+ vereiste stelden ze de hypothese dat Na+ gekoppeld membraantransport een vaker voorkomend mechanisme is bij Chara en dat dit een adaptatie zou kunnen zijn aan de relatief aIkalische omgevingsomstandigheden waarin Chara vaak voorkomt. Walker & Sanders (1991) stelden bovendien vast dat ook in het genus Nitella Na+-cotransportsystemen aanwezig zUn voor de opname van K+, ureum en lysine.

Reid et al. (2000) diepten de fosfaatopname van Chara corallina verder uit. Hun resultaten tonen dat de aanwezigheid van Na+ in het medium een duidelijke invloed heeft op de fosfaatopname door het hoge-affiniteitssysteem (figuur 2.8). 6

Om een Na+/Pi cotransport aan te tonen volstond het dus om hierbovenop ook aan te tonen dat Pi een stimulator is van Na+ opname. Figuur 2.9 toont de fosfaatafuankelijke Na+ influx in functie van de fosfaatconcentratie van het medium. We zien hier het lage-affiniteits Pi opnamesysteem (gefitte Km ~ 5 11M) tevoorschijn komen. Na+ kan in zekere mate worden vervangen door K+ maar in dat geval is de stimulatie vee I lager. In waters met een hoge K+/Na+ verhouding zal de fosfaatopname dus door competitieve inhibitie van K+ aan de Na+ bindingsplaats worden geremd.

+Na

!

I~I

.~

-----''--'"

.-,

r

i

-Na .~_-o---D---.¢-----V

o ~------~----~------------~ 600 800 400 200 o Pi (IJM)

Figuur 2.8 Concentratieafhankelijkheid van de 32p influx in Chara corallina in aan- (_) en afwezigheid (0) van 0.4 mM Na bij pH 6. De cellen ondergingen zes dagen pre"lncubatie in fosforloos APW. Uit Reid et al. (2000).

7

Reid et al. (2000) von den ook een sterk synergetisch effect bij toediening van NaT in combinatie met toediening van ATP aan het cytoplasma (figuur 2.10). De eenvoudigste verklaring voor dit patroon is dat het ATP nodig is om de depolarisatie van de membraan, die door het Na+/Pi cotransport wordt veroorzaakt (cotransport van ongeveer 6 Na+ per Pi), tegen te werken. Het zwak transport in de derde conditie kan dan worden verklaard doordat Na+ gedeeltelijk terug naar buiten kan diffunderen. Deze hypothese verklaart echter niet dat bij lage pH de Pi opname hoog blijft (figuur 2.19). De Na+/Pi stoichiometrie zal immers bij lage pH waarden nog veel hoger zijn dan 6. Een alternatieve hypothese is dat het transportsysteem een Na+/Pi ATPase zou zijn (cf. Na+/K+ ATPase bij dieren). Dit zou de goede werking van de transporter bij lage pH verklaren maar zou dan weer in tegenspraak zijn met de opname in een ATP-arm cytoplasma (figuur 2.10). Een derde hypothese is dat een Na+/Pi cotransporter zorgt voor de Pi opname maar dat de Na+ ionen bij lagere pH kunnen worden vervangen door protonen. Het genoom van Chara coral/ina codeert zowel voor een Na+/Pi cotransporter als voor een W/Pi cotransporter (Tetsuro Mimura, pers. med.). Mogelijk is de aanwezigheid van beide transporters verantwoordelijk voor de waargenomen patronen

1.5

,,'"

'", 108 ~ E .s

/ .....O-'.--.~.- .....--..........-.-..- -..............~

1.0

.s

!

)(

..,

6, P

4

E 0 E

:::>

r;::

~

0.5

fJ-

2W

0

o

100

200

300

[Pij (IJM)

Figuur 2.9 Fosforafhankelijkheid van de 22Na influx bij Chara coral/ina. Enkel de component van de 22Na influx die door Pi gestimuleerd werd is weergegeven. De curve is een MichaeIis-Menten fit met Km = 5 (..1M en Vmax = 10 nmol m-2 S-1. Dit komt overeen met het lage affiniteitssysteem voor fosfaatopname. Uit Reid et al. (2000).

ATP (mM) Na (mM)

~

I

r---J

0 0

11 0

0

0.4

0.4

Figuur 2.10 Het effect van toediening van Na+ aan het externe medium en ATP aan het interne medium (intracellulaire perfusie) op de 32 p influx in ge"lsoleerde internodiumcellen van Chara coral/ina. De gebruikte externe fosfaatconcentratie was 10 (.1M. Uit Reid et a/. (2000).

2.4.2 DE RESPONS VAN PLANTEN BIJ FOSFORUITHONGERING Fosfordeficientie is zeer algemeen in de natuur. De evolutie heeft dan ook geleid tot zeer gespecialiseerde mechanismen om het zeldzame fosfor uit de omgeving te verwerven en te gebruiken. Een fosfortekort activeert in de meeste organismen een aantal uithongeringsresponsen die in twee categorieen kunnen worden ingedeeld, namelijk de P-specifieke en de algemene. De P-specifieke responsen passen de heersende fosforlimiterende omstandigheden aan door de efficiente mobilizatie en verwerving van fosfor te bevorderen. Zo zal er accumulatie van fosfaattransporters met hoge affiniteit en synthese met bijhorende secretie van RNasen en fosfatasen met een breed substraatspectrum plaatsvinden. Er zullen bovendien metabolische veranderingen optreden. Zo zal bijvoorbeeld de glycolyse een alternatieve, weinig fosfaatvereisende, pathway volgen (Raghothama, 1999 en referenties daarin).

8

De algemene responsen trachten het organisme aan te passen aan de omstandigheden, door te zorgen dat het metabolisme (en de groei) zodanig wordt aangepast dat het organisme (zo lang mogelijk) kan overleven bij de heersende nutrientencondities. Er kunnen ook morfologische veranderingen optreden als respons op fosforstress. Zo zal in wortelende planten bij fosforstress het wortelstelsel zodanig worden uitgebreid dat een grotere oppervlakte:volume verhouding tot stand komt.

2.4.3 CONTROLEMECHANISMEN VAN DE FOSFAATOPNAME: FOSFORBESCHIKBAARHEID EN INTERNE FOSFORCONCENTRA TIE

2.4.3.1 Inductie van de hoge-a.ffiniteitstransporter De meeste planten bezitten een fosfaatopnamesysteem met lage affiniteit en een of meerdere met hoge affiniteit (waarschijnlijk zes in het geval van Arabidopsis). Het lage affiniteitssysteem lijkt constitutief tot expressie te komen terwijl het systeem met hoge affiniteit bij fosfordeficientie wordt gei"nduceerd (Furihata et al., 1992). Het inductieproces van de hoge-affiniteitstransporter omvat 'de novo' synthese van transporterprotei"nes (Muchhal & Raghothama, 1999). Bij tomaat (Lycopersicon esculentum) vonden Muchhal & Raghothama (1999) een duidelijke negatieve correlatie tussen de fosfaatbeschikbaarheid in het medium en de hoeveelheid LePT1-protei"nes (Lycopersicon esculentum Phosphate Transporter) in de worteI. Er werd bovendien aangetoond dat reeds na 24 uur fosforstress duidelijke accumulatie van LePTl voorkomt. Deze respons is voIIedig reversibel; de hoeveelheid van het protei"ne nam, binnen de 24 uur na de fosfortoediening volgend op de uithongering, terug sterk af. Het is duidelijk dat deze regulatie leidt tot een verhoogde fosforopname bij Pi-uithongering, niet door verlaging van Km, maar door verhoging van Vmax (Jungk et al., 1990). Ook bij Chara corralina wordt de hoge affiniteitstransporter bij fosfaatuithongering snel gei"nduceerd (Tetsuro Mimura, ongepubliceerde gegevens). Merkwaardig is in dit geval dat ook de natriumconcentratie in het prei"ncubatiemedium een rol speelt. In aanwezigheid van fosfor en afwezigheid van Na+ wordt toch de hoge affiniteitstransporter gei"nduceerd. AIs fosforuitgehongerde planten in fosfaatrijk medium worden gebracht zal ook een sneJIe respons volgen (de fosfaatopname vertraagt snel). Dit wordt toegeschreven aan de toxische effecten van overdadige fosfaatopname (Clarkson & Scattergood, 1982).

2.4.3.2 'Phosphorus Starvation Response' Wykoff et al. (1999) beschreven in Chlamydomonas reinhartii (Chlorophyta) een gen dat het fosformetabolisme reguleert. Uit mutantenstudies bleek dat het betreffende PSRI-gen (Phosphorus Starvation Response) absoluut noodzakelijk is voor de adaptatie aan P-limiterende omstandigheden.

9

Het voomamelijk in de celkem voorkomend protelne Psrl bezit, naast DNA-bindende gebieden en een dimerisatiezone ook een glutaminerijk gebied zoals men dat aantreft in transcriptie-activatoren. Bij fosforuithongering van wildtype Chlamydomonas werd een tienvoudige toename van het Psrl protelne waargenomen. Vanaf acht uur na de initiatie van de P-uithongering neemt men significant hogere hoeveelheden fosfaattransporters met hoge affiniteit waar en vanaf zestien uur worden ook fosfatasen uigescheiden. Wykoff et al. (1999) stellen, op basis van sequentieovereenkomsten met Arabidopsis, Nicotiana en Lycopersicon, dat Psr-achtige regulatie van het fosformetabolisme mogelijk ook voorkomt in hogere planten.

2.4.3.3 Typische respons op fosforuithongering Er werden verschillende studies ondemomen om de controle van de fosforopname te achterhalen (o.a. Lefebvre & Glass, 1982; Clarkson & Scattergood, 1982; Cogliatti & Clarkson, 1983; Jungk et aI., 1990; Dunlop et aI., 1997; Liu et aI., 1998; Dong et aI., 1999;). Wat voIgt (2.4.3.3 en 2.4.3.4) is een beknopte samenvatting van een selectie uit de resultaten van deze studies. Bij fosforuithongering stijgt over het algemeen de opnamesnelheid relatief snel, een plateau bereikend na een 3- a 5-tal dagen, afhankelijk van de bestudeerde soort (zie ook figuur 2.7 voor Chara coral/ina). In figuur 2.11 is duidelijk dat de fosfaatopname nagenoeg constant blijft in de +P conditie (voorbehandeling was ook in +P) en geleidelijk toeneemt in de -P conditie. De opnamesnelheid bereikt een maximum en daalt daama terug. Als men aan het medium van fosforuitgehongerde planten fosfaat toevoegt (streepjeslijn), nam in dit experiment de opname gedurende de eerste twee dagen sterk toe. Daama daalde ze tot het niveau van de controle. Deze piek is echter uitzonderlijk (komt niet terug in andere studies).

BTomato

§]

jll

-

(li«l . :J i~ °0 8 16 1 Tane(d)

,~!i: \

i

;

f

, \

B Tomato

_,

600

600

JO ;-'........

20

10

~.!.

~ 12

Figuur 2.11 Absorptie en translocatie van gemerkt fosfaat door de wortels van (a) gerst en (b) tomaat. Symbolen: . - : controle, 150 ~M Pi; ·· .. 0·· .. : fosforuithongeringsconditie, geen Pi; ---e---: herincubatie van de fosforuitgehongerde planten in fosforbevattend medium, 150 ~M Pi. Uit Clarkson & Scattergood, 1982.

10

'

«ll

~

16

Figuur 2.12 Variatie van de fosforconcentratie in de bebladerde stengels van gerst (a) en tomaat (b) gedurende incubatie in oplossingen met of zonder 150 ~M H2P04-. Zelfde symbolen als in figuur 2.11. De patronen gevonden voor de wortels van dezelfde planten waren erg gelijkend maar minder uitgesproken. Uit Clarkson & Scattergood, 1982.

Het fosforgehalte per biomassa-eenheid neemt af tijdens de fosforuithongering (figuur 2.12). AIs na een peri ode van fosforstress planten in een fosforbevattend medium worden gezet, gaan ze, dank zij de verhoogde opnamecapaciteit die tijdens de peri ode van fosforstress werd opgebouwd, zeer snel het fosfor opnemen uit het medium. De fosfaatconcentratie in het weefsel overstijgt snel dat van de controleplanten (figuur 2.12). Dit is waarschijnlijk te wijten aan de lage turn-over van de fosfaattransporters die in grote hoeveelheden in de plasmamembraan werden aangelegd (Dong et aI., 1999; en referenties daarin). De hoge opnamesnelheid daalt snel als de planten blijvend blootgesteld worden aan hogere fosfaatconcentraties, maar blijft hoger dan de opname bij controleplanten.

2.4.3.4 De invloed van cytoplasmatisch en vacuolair fosfaat op de fosfaatopname Bij hogere planten wordt waargenomen dat Pi opgenomen in het cytoplasma de fosfaatopname inhibeert. Lefebvre & Glass (1982) stelden voor dat de fosfaatopname aIIosterisch gereguleerd wordt door cytoplasmatisch Pi (zie ook Dong et aI., 1999). Pi zou een niet-competitieve inhibitor van de W-ATPasen in de plasmamembraan zijn (Tetsuro Mimura, pers. med.). Voor de instandhouding van de fosfaatopname is het nodig dat deze protonpompen actief blijven. Ook bij Chara corallina lijkt inhibitie van de fosfaatopname door intern Pi voor te komen (Tetsuro Mimura, pers. med.). Dat aIIosterische effecten van cytoplasmatisch Pi relatief onbelangrijk zijn in vergelijking met de hoeveelheid fosfaattransporters in de plasmamembraan blijkt uit figuur 2.12. Mocht de aIIosterische opnamehindering van Pi dominant zijn, zouden de fosfaatuitgehongerde planten hun opname staken als de fosforconcentratie die van de controleplanten bereikte. Dit is duidelijk niet het gevaI. Liu et al. (1998) vonden dat de expressie van LePT! en LePT2 bij tomaat nauw gecorreleerd is met de beschikbaarheid van Pi in het medium. Hun experimenten met in twee gedeelde wortels toonden echter aan dat de expressie niet door de externe fosfaatconcentratie wordt gereguleerd maar door een interne factor. In dit kader vonden Bun-ya et al. (1991) voor gist dat hoge interne Pi concentraties de opnamesnelheid verlagen door regulatie van de transcriptie. Liu et al. (1998) vonden voor hogere planten dat de opnamesnelheid afneemt met interne fosfaatconcentratie, ook door transcriptionele regulatie. De mechanismen aan de basis van deze transcriptionele regulatie zijn voorlopig onbekend. In de zoektocht naar de controle van de fosfaatopname werd ook de hypothese gesteld dat de vacuolaire fosforconcentratie een rol zou spelen (Takeshige et ai., 1992; Mimura et al., 1998; en de referenties in beide). Deze geeft immers aan in welke mate de cel fosforstress ondervindt, omdat de vacuolaire Pi-pool aangesproken wordt onder fosfaatstress en aangevuld wordt onder niet fosforlimiterende omstandigheden. Mimura et al. (1998) acht het onwaarschijnlijk dat de vacuolaire Pi concentratie een rol speelt in de fosfaatopname van Chara corallina (cf. figuur 2.17.b).

2.4.3.5 Het belang van de internefosforstatus Een heel aantal experimenten tonen aan dat planten hun fosfaatopname aanpassen aan hun interne fosforstatus (figuur 2.13), meestal door Vmax te verhogen (figuur 2.13, a & b) en in veel mindere mate door veranderingen aan te brengen in de Km en/of de minimale fosfaatconcentratie waarbij nog netto opname gebeurt (C min ) (Junkg eta!., 1990) (figuur 2.13.c).

11

'0

(b)

(a)

. )

J

U

~+ r

1.1 .

1

T""

\ \_."

3D

Mo,z ..

0

~

.,-

20

,~

"is:

• "noo\

s.,,,~~

E

osheO!

H)

_E ..~

..\

0.00\ y~ 23.)-2s.e~

r.-0.939

0

0

02

0'

0.6

aB

15

6

\

10

0

I

0.00

"

1.2

1.0

£' Q

I J

-0.96:

'00 '00

~

20

-in

.rOOI

.,-

(e)

Plant P concentr. % in d.m

I

I

I

0.25

0.50

0.75

1.00

% PindeVo.Ortel

Figuur 2.13 (a) Negatieve correlatie, zoals gevonden tussen de fosfaatinflux en de fosfaatconcentratie in gerstworlels. Uit Lefebvre & Glass, 1982. (b) Negatieve correlatie tussen Vmax en het fosforgehalte van de worlels bij Glycine max en Zea mays. Uit Jungk et a/., 1990. (e) Afhankelijkheid van Km van de fosfaatstatus van de worlel van Glycine max. Naar gegevens uit Jungk et a/., 1990.

In een aantal experimenten (o.a. Clarkson & Scattergood, 1982; Lefebvre & Glass, 1982) werd een omgekeerd evenredig verband tussen de opnamesnelheid en de weefseIconcentratie teruggevonden. Clarkson & Scattergood (1982) suggereerden dat de verhoogde opnamesnelheden bij fosfaatuithongering best als een derepressie van het opnamesysteem wordt gei"nterpreteerd.

4.0

3.5 0'

0::

~

*

(I)

f'i2=0.85

(a)

'"

2.5

~

1.0

+

0.5 7.0

b: Dong et al. (1999) en Jungk et al. (1990) vonden bij respectievelijk de zandraket (Arabidopsis thaliana) en maYs (Zea mays) en de sojaboon (Glycine max) dat opnamesnelheid lineair afnam met het fosforgehalte van de plant (figuur 2.14 resp. figuur 2.13.b). Dong et al. (1999) stelden, op basis van de zeer gelijkende correlatie tussen de expressie van de transporter en de interne fosforstatus (figuur 2.14), dat transcriptionele regulatie aan de basis lag van het waargenomen verband tussen de opnamesnelheid en deze interne fosforstatus.

~ 3_0

'" c

~.~

"*

a:

f'i2=0.93

(b)

~ 6.0 5.0 4.0

~

3.0 '" 2.0

x

1.0

0.0

0.00 0.05 0.10 0.15 0.200.250.30 Pi concentration in roots

(~g

mg" fw)

Figuur 2.14 Afname van de opnamesnelheid en de relatieve transporlerexpressie (APT1 en APT2) met toenemende interne fosforstatus bij Arabidopsis thaliana. Uit Dong et a/., 1999.

2.4.3.6 Andere mechanismen en signaaitransductie Bij Saccharomyces cerevisiae (bakkersgist) komen er, naast analogen van sommige van de hierboven beschreven processen, ook protei"ne-protei"ne interacties voor in de regulatie van de Pi opname (tussen de transporter (Ph084) en Pho86, ook een membraanprotei"ne) (Bun-ya et aI., 1996). Er werd reeds gesuggereerd dat protei"ne-protei"ne regulatie van de Pi opname ook bij planten voorkomt (Raghothama, 1999). De mechanismen die fosforstress in verband brengen met de respons zijn voorlopig slecht gekend. Hoewel er nooit rechtstreeks bewijs voor is geleverd, zijn er aanwijzingen dat ethyleen een rol zou kunnen spelen in de fosfaatuithongeringsrespons (Liu et al., 1998 en referenties daarin). Een signaalfunctie van suikerfosfaten mag zeker niet worden uitgesloten (Liu et al., 1998).

12

2.4.3. 7 Samenvatting

Uit de gepubliceerde studies kan men afleiden dat in de meeste gevallen de capaciteit van de fosfaatopname gereguleerd wordt door transcriptionele controle over het totaal aantal transporters. Allosterische regulatie is waarschijnlijk, maar wordt sinds de ontdekking van de genetische mechanismen als ondergeschikt beschouwd. Mogelijk zijn meerdere systemen werkzaam. Zo is het bijvoorbeeld denkbaar dat bij fosforstress de externe fosfaatconcentratie van primair belang is in de bepaling van de opnamesnelheid, terwijl dit bij niet fosforgelimiteerde omstandigheden de interne concentratie is. Aangezien in de natuur de fosfaatconcentratie meestal zeer laag is, zal zeer waarschijnlijk de expressie van de genen voor en de hoeveelheid Pi transporters hoog zijn. In de natuur kan tijdelijke verhoogde fosforstress overwonnen worden zonder sterk effect op de groei, door herverdeling van fosfaat in de plant. Onder natuurlijke omstandigheden wordt bovendien de groeisnelheid aangepast aan de nutrientenbeschikbaarheid.

2.4.4 FOSFAATHOMEOSTASE

2.4.4.1 Inleiding Pi is een zeer belangrijk metaboliet van het suikermetabolisme, is een belangrijk structuuronderdeel van nucle'inezuren en fosfolipiden en speelt een cruciale rol in de energiehuishouding en de enzym- en transcriptiecontrole. Het is dan ook van groot belang dat de cytoplasmatische concentratie strikt gereguleerd is. Er bestaat dan ook, net zoals voor een aantal andere belangrijke ionen, een fosfaathomeostase in de cel: de interne concentratie (cytoplasma) wordt nagenoeg constant gehouden (grootteorde mM) terwijl de externe concentraties sterk variabel zijn (grootteorde 11M). In hogere planten fungeren cytoplasma en vacuole als gescheiden Pi bevattende compartimenten. Overschot aan Pi wordt opgeslagen in de vacuole en bij fosfordeficientie doet de vacuole dienst als Pibron. Lagere planten leggen een fosforreserve aan onder vorm van polyfosfaat, ze maken geen (of weinig) gebruik van hun vacuole als fosforreserve. Mimura et al. (1998) namen bij Chara corallina waar dat de vacuole een belangrijke rol heeft als fosforreserve. Over andere mechanismen van fosforopslag bij Chara werd geen uitspraak gedaan. Als men planten in fosforarme omstandigheden onderbrengt, zal de fosfaatconcentratie in de protoplast nagenoeg constant blijven door de fosforreserve van de vacuole aan te spreken. Pas nadat de vacuolaire pool uitgeput raakt, wordt ook een concentratieverlaging in het cytosol waargenomen.

13

2.4.4.2 De Tol van de vacuole Mimura et al. (1990) onderzochten bij cellen van gerstbladeren (Hordeum vulgare L.) het transport van fosfaat over de verschillende membranen en de consequenties hiervan voor de fosfaathomeostase van de eel. Ze kwamen tot het besluit dat de epidermis en de apoplast van gerstbladeren zeer weinig belang hebben voor de fosfaathomeostase van het blad. Het teveel aan Pi wordt opgenomen in de mesofy1cellen, waar het opgeslagen wordt in de vacuole. Deze accumulatie in de vacuole is energetisch gunstig dankzij het elektrisch potentiaalverschil over de tonoplast (positief binnen de vacuole).

Figuur 2.14 Opname van 32Pi door ge"lsoleerde protoplasten van gerst-mesofylcellen. Controleplanten (e) werden opgegroeid in aanwezigheid van Pi, de planten van de tweede conditie (0) werden opgegroeid in fosforloos medium. In de figuur is de afhankelijkheid van de Pi opname van de uitwendige fosfaatconcentratie weergegeven. In de inzet zijn dezelfde gegevens uitgezet als Lineweaver-Burk plot. De fosfaat-uitgehongerde cellen namen uitgesproken beter fosfaat op, vooral bij lage uitwendige Pi concentraties. Uit Mimura et a/. (1990).

In Pi uitgehongerde cellen werd zeer snelle fosfaatopname waargenomen (figuur 2.14). De uitgehongerde cellen hadden bovendien een veel hogere capaciteit om 32p op te slaan in hun vacuo len (figuur 2.15), niet enkel omdat de eel snel Pi opneemt en er dus meer Pi beschikbaar is om naar de vacuole te lei den, maar ook omdat het ATPaangedreven fosfortransport van het cytosol naar de vacuole sterk wordt verhoogd (figuur 2.16). Bij fosfaatstress zal de vacuolaire reserve aangesproken worden om de cytoplasmatische fosfaathomeostase in stand te houden. Mimura et al. (1990) vonden echter dat de efflux van Pi uit de vacuole traag verloopt, zowel in aan- als afwezigheid van AIP. De regulatie van het uittreden van fosfaat uit de vacuole bij fosforstress is vooriopig onopgehelderd.

.

-ATP

+ATP

-!.;n 15

Vi 15 OJ -0

OJ

-0

::>

u

ttl

>

ttl

>

'"'g 10

g10

2ttl

.c a. ~ .c a. -0 E c::

o

30

60

time (min)

Figuur 2.15 Transport van Pi naar de vacuole van ge"lsoleerde mesofylcellen van gerst-mesofylcellen. e: controleplanten, opgegroeid in Pi bevattend medium. 0: planten opgegroeid in fosforloos medium. Uit Mimura et a/. (1990).

14

~

a

~ a.

5

0

90

/ ID r Y

::>

u

til

0

.c a. -0 E c::

0

10

0

20 time (min)

5

b

~/~ 0

10

20 time (min)

Figuur 2.16 Het tijdsverloop van de afhankelijkheid van de Pi opname van ATP in vacuolen ge·isoleerd uit controleplanten (e) of Pi uitgehongerde planten (0). In (a) werd geen ATP toegevoegd aan het incubatiemedium van de vacuolen, in (b) werd 1 mmoW1 ATP toegevoegd. Uit Mimura et a/. (1990).

2.4.4.3 De rol van fosfaatefllux Efflux van fosfaat uit de cel (over de plasmamembraan) werd reeds een aantal maal voorgesteld als regulerende factor van de cytoplasmatische fosfaatconcentratie (Cogliatti & Clarkson, 1983; Raghothama, 1999 en referenties daarin). Als fosfor niet de graeilimiterende factor is, is efflux uit het cytoplasma waarschijnlijk het voornaamste element in het behoud van de homeostase. In dat geval neemt men immers vaak waar dat verhoogde P-efflux de hogere P-influx, die resulteert uit de hogere externe Pi concentratie, compenseert. De efflux verhoogt aanzienlijk met toenemende exteme Pi concentratie. Waarschijnlijk zijn anionenkanalen, die gereguleerd worden door pH en/ofmembraanpotentiaal, betrokken bij de efflux.

2.4.4.4 De situatie bij Chara Uit de experimenten van Mimura et al. (1998) kan worden besloten dat ook in Chara corallina de Pi concentratie van het cytoplasma constant wordt gehouden, en dit tenminste gedeeJtelijk door het gebruik van de vacuole als reservoir. PreYncubatie bij verschillende Pi regimes toonde aan dat, ten gevolge van fosforlimitatie, geleidelijk een reversibele verhoogde opnamecapaciteit tot stand komt (figuur 2.17.a). In de conditie waar Chara fosfaatuithongering onderging, yond men een daling van de vacuolaire Pi concentratie na 2 dagen terwijl een daling van de cytoplasmatische Pi concentratie pas na 6 dagen zichtbaar werd. Dit illustreert de verwachte stabiliserende invloed van de vacuolaire Pi reserve op de cytoplasmatische Pi concentratie. In de zoektocht naar de contra Ie van de fosfaatopname werd, zoals reeds eerder aangehaald, de hypothese gesteld dat de vacuolaire fosforconcentratie een ral zou spelen (cf. 2.4.3.4). Figuur 2.17.b ontkracht deze hypothese enigszins. In het geval dat de vacuolaire fosforconcentratie een invloed zou hebben op de opnamesnelheid, zou men immers na de omschakeling van fosfaatbevattend naar fosfaatloos medium op dag 10 naast een stijging van de opnamecapaciteit ook een daling van de vacuolaire fosfaatconcentratie vinden. Deze laatste blijft echter afwezig. Bovendien zou bij de fosfaatIoze incubatie de vacuolaire Pi concentratie moeten dalen om de waargenomen stijgende opnamesnelheid te verklaren. Het is belangrijk zich er van bewust te zijn dat fosfaathomeostase een relatiefbegrip is. Er zijn in sommige gevallen kleine maar duidelijke fluctuaties van de fosfaatconcentratie waar te nemen. Zo nam men bij Chara waar dat de cytosolische fosfaatconcentratie verandert afhankelijk van de lichtintensiteit. In het donker werden hogere fosfaatconcentraties gemeten. Zeer waarschijnlijk is de oorzaak voor deze fluctuatie een hoge graad van verestering van fosfor in het licht. 20.---------------------~

(a)

"f:'

20~------------------~

(b)

16

'0 12

"

...

-5 ~ c:

.5 0:

8 1

'"

10

Q

,

.."=

l'

______ l ___ =-",,-~~- ' .r·----···=-f-·-~··-

~:>:b,

6

Time (d)

10

12

>

!-I

o

2

6

8

10

12

time (d)

Figuur 2.17 Verloop van de fosfaatinflux (a) en de vacuolaire Pi concentratie (b) gedurende incubatie van internodiumcellen van Chara corallina in fosforloos medium (-0-), medium met 0.1 mM Pi (---0---) en medium met 5 mM Pi (.... A ... ) Na 10 dagen werd de conditie met 0 mM Pi getransfereerd naar 0.1 mM Pi en vice versa. Uit Mimura et a/., 1998.

15

2.5 DE INVLOED VAN pH EN NATRIUM OP DE FOSFAATOPNAME 2.5.1 DE INVLOED VAN DE pH VAN HET MEDIUM De fosfaatopname wordt in veel gevallen bei"nvloed door de pH van het omliggende medium. Box (1986) onderzocht de pH-afhankelijkheid van de fosfaatopname in het rizoi"d van Chara hispida L. en nam hogere opnamesnelheden waar bij intermediaire pH-waarden (figuur 2.18.a). Toen Leggewie et al. (1997) de genen die coderen voor StPTI en StPT2 (Solanum tuberosum Phosphate Transporter) tot expressie brachten in een fosfaatopname-deficiente giststam, von den ze een negatief verband tussen fosfaatopname van de getransformeerde gist en de pH van het omliggende medium (figuur 2.18.b). Dit patroon komt overeen met de verwachting voor een W /Pi transporter. Hierbij moet niet enkel het pH-optimum van het transporterprotei"ne in acht worden genomen, maar ook het feit dat fosfaat samen met protonen over de plasmamembraan wordt gezet. Leggewie et al. (1997) argumenteren dat vooral dit laatste bepalend is voor het waargenomen patroon. Reid et al. (2000) onderzochten hoe de opnamesnelheid van Chara corallina. Figuur 2.19 geeft hun bevindingen weer. De stippellijn geeft weer hoeveel van het Pi onder vorm van H2P04- aanwezig is. We kunnen dus tot de conc1usie komen dat, enkel op basis van de specificiteit van de transporter (er is immers geen, of slechts weinig, W cotransport bij Chara corallina), H2 P04- vee I beter wordt opgenomen dan HPol-. Dunlop et al. (1997) vonden bij de zandraket (Arabidopsis thaliana) geen verband tussen fosfaatopname en de pH van het opnamemedium.

pH

Figuur 2.19 De pH- en Na-afhankelijkheid van de 32Pi influx in ge'isoleerde internodiumcellen van Chara corallina . • : geen Na+-toediening; 0: 0.4 mM Na+ in het externe medium. De curve stelt de berekende concentratie H2P04- voor, bij een totale fosfaatconcentratie van 10 iJM in het externe medium. Uit Reid et at. (2000).

(b)

(a)

;- 140

c

'E ~

2100~ ~

~ ~ §-:g ii: ~

9

10

80 60

~ ~

.§.

4(),

"0

20

! pH

l

120 ~

.'-

~

4

4.5

5

55

6

6.5

7

7.5

8

pH ____ YStPT1 ________ YStPT2

Figuur 2.18 (a) pH-afhankelijkheid van de 32Pi-opname in het rizo"id van Chara hispida L. De experimenten werden uitgevoerd bij een initiele fosfaatconcentratie van 1 iJM ('" 30 iJgPII) en liepen gedurende vier uur. Naar gegevens van tabel 2 uit Box (1986). (b) pH-afhankelijkheid van de 32Pi-opname in gist getransformeerd met StPT1 of StPT2. De opname werd gemeten bij 140 iJM ('" 4340 iJgPII) Pi. De gistcellen werden voor het opnameexperiment gedurende vijf minuten gepre"incubeerd in glucose. Naar figuur 5 uit Leggewie et at. (1997).

16

2.5.2 DE INVLOED VAN NATRIUM Bij Chara corallina werd waargenomen dat aanwezigheid van natrium in het medium de opname van fosfaat sterk stimuleert (figuren 2.8 en 2.19). Dit is te wijten aan het mechanisme van fosfaatopname (Na+/Pi cotransport; Reid et al., 2000). Kalium is in staat de rol van natrium over te nemen in het transmembranair transport, maar de stimulatie door kalium is niet zo sterk dan die door natrium. Dit zou inhibitie van de fosfaatopname kunnen teweegbrengen in waters met lage Na+/K+ verhoudingen. Recent werd verder uitgediept hoe de natriumconcentratie van het medium de fosfaatopname beYnvloed. Natriumuithongering van intemodiumcellen van Chara corallina veroorzaakte een stimulatie van de fosfaatopname (Tetsuro Mimura & Robert Reid, ongepubliceerde gegevens).

2.6 MACROFYTEN EN DE FOSFORHUISHOUDING VAN ONDIEPE MEREN 2.6.1 W ATERKOLOM EN SEDIMENT ALS FOSFORBRONNEN VOOR MACROFYTEN

2.6.1.1 INLEIDING MacrofYten staan in contact met het sediment, waarin ze wortelen, en met de waterkolom, waarin ze hun bladeren uitspreiden. Dit brengt met zich mee dat zowel het sediment als de waterkolom in theorie als fosforbron kunnen fungeren (cf. 2.2). De relatieve bijdrage van beide compartimenten werd reeds zorgvuldig onderzocht, zowel in tamelijk artificiele laboratoriumexperimenten (o.a. Littlefield & Forsberg, 1965; Bristow & Whitcombe, 1971; Box, 1986) als in veldexperimenten (o.a. Carignan & Kalff, 1980; Rattray et al., 1991). Deze studies hebben uitgewezen dat zowel sediment als waterkolom een bijdrage hebben in de fosforvoorziening. In welke mate ze bijdragen is afhankelijk van de plant in kwestie en van de relatieve beschikbaarheid van fosfor in beide pools.

2.6.1.2 SEDIMENT OF W ATERKOLOM? Lundegard (1966; uit Bristow & Whitcombe, 1971) stelt dat macrofYten zich voornamelijk voorzien van fosfor door opname uit het sediment via de wortel. Sutcliffe (1962; uit Bristow & Whitcombe, 1971) besluit echter, op basis van de waarneming van ionenabsorptie door bladeren en op basis van de afwezigheid van goed gedifferentieerd geleidingsweefsel, dat fosfaat voornamelijk via de bladeren uit het water wordt opgenomen. Dat fosfaat effectief opgenomen wordt door de wortels van macrofYten en ook verplaatst wordt in de plant, werd pas in 1970 aangetoond (McRoy & Barsdate, 1970; uit Bristow & Whitcombe, 1971). Er zijn een aantal argumenten om het belang van de wortel niet te onderschatten. Zo vormt de wortel een aanzienlijk deel van de biomassa van de plant, wat wijst op een hoge allocatie van C naar de wortel. Bovendien bezitten wortels van macrofyten vaak wortelharen en veroorzaakt worteldruk waterbeweging in aquatische vaatplanten.

17

Bristow & Whitcombe (1971) onderzochten bij een aantal waterplanten (aUemaal vaatplanten) de bijdrage van de wortelzone in de fosfaatopname. Ze brachten de plant hiertoe in een incubatieapparaat met twee compartimenten, zodat het bovenste en het onderste (bewortelde) deel elk in een apart compartiment zaten. De experimenten leverden duidelijk bewijs voor opname van 32p in het onderste compartiment (met de wortels). Er gebeurde echter ook opname door de bladeren. Deze was echter transient, terwijl de opname door de wortels langdurig van aard was. Carignan & Kalff (1980) deden 'in situ' experimenten met een aantal vaatplanten om te achterhalen waar ze in de natuur hun fosfor vandaan halen. Macrofyten uit potten met 32p gemerkt sediment namen het overgrote dee I van hun fosfor op uit het sediment. Rattray et al. (1991) deden 'in situ' experimenten in een eutroof en een oligotroof meer. Ze plaatsten in beide meren potten met eutroof en oligotroof sediment, afkomstig uit de twee meren in kwestie. In deze potten werden dan een aantal planten gebracht. Ze namen waar dat in het oligotroof meer de groei (biomassa en stengellengte) sterk gestimuleerd werd in de potten met het eutrofe sediment (in vergelijking met het oligotrofe sediment). Dit komt overeen met de hypothese van McRoy & Barsdate (1970; uit Twilley et al., 1977) dat bij lagere nutrientengehaltes het sediment toeneemt in belang voor de nutrientvoorziening. Er werd verder waargenomen dat de planten in het eutroof meer vee I meer fosfor bevatten dan de planten van dezelfde conditie in het oligotroof meer. Dit bevestigt opnieuw bovenstaande hypothese: bij hoge nutrientbeschikbaarheid in het water, neemt het relatief belang van deze pool toe.

2.6.1.3 DE FOSFORBRONNEN VAN CHARACEAE Characeae zijn vastgehecht aan hun substraat met een rizoYd. Aangezien ze voorkomen in waters met weinig fosfor is het mogelijk dat het sediment een rol speelt in de fosforvoorziening. Bij Chara werd de rol van dit rizoYd in de fosforopname reeds bestudeerd. Littlefield & Forsberg (1965) toonden aan dat, bij fosforuitgehongerde jonge Chara globularis plantjes, ongeveer even veel 32 Pi werd opgenomen door het rizoYd dan door de rest van de plant. Translocatie van Pi gebeurde zowel apipetaal als basipetaal. Box (1986) onderzocht de kortetermijn Pi-opname van het Chara hispida rizoYd. Zijn resultaten tonen dat aan het rizoYd ongeveer 4.3% bijdraagt aan de totale Pi-opname van de plant, terwijl het rizoYd slechts 1.24% van de biomassa bedraagt. In afwezigheid van O2 viel de opnamesnelheid van het rizoYd echter sterk terug in vergelijking met de controleconditie (bij normale Ordruk).

2.6.1.4 INVLOEDEN VAN COMPARTIMENTATIE VAN HET BESCHIKBARE FOSFOR EN VAN (AN)AEROBIE

De relatieve bijdrage van de wortel en de stengel aan de fosforopname is uiteraard afhankelijk van de relatieve beschikbaarheid van fosfor in het sediment en de waterkolom. Carignan en Kalff (1980) voerden daarom hun experimenten uit met varierende fosforconcentraties, zowel in het sediment als in het water (verschillende locaties in hetzelfde meer). In mesotrofe omstandigheden werd waargenomen dat nagenoeg al het opgenomen P afkomstig was van het sediment. In eutrofe omstandigheden ging het nog steeds om meer dan 90% en in het hypertrofe meer vonden ze dat 72% van het opgenomen fosfor afkomstig was uit het sediment. 18

2.6.2.2 INVLOED OP DE PI-CONCENTRA TIE VAN DE WA TERKOLOM Dat macrofyten, en meer in het bijzonder charofyten, in laboratoriumexperimenten in staat zijn zeer snel grote hoeveelheden fosfaat te onttrekken aan de waterkolom werd aangetoond door Kufel & Ozimek (1994). Op deze manier zouden zij zelfs de grote nutrientenstroom die het Luknajno-meer te verwerken krijgt kunnen opvangen (cf. 2.6.3.3). Ook het sediment speelt een belangrijke rol in de fosforvoorziening (cf. 2.6.1). Macrofyten kunnen dan ook een grote rol spelen in de nutrientcyclus van een ondiep meer. Ze zijn immers in staat fosfor uit het sediment in hun bovengrondse biomassa te brengen. Dit fosfor kan dan op twee verschillende manieren in de waterkolom terechtkomen. Enerzijds werd bij verschillende so orten waargenomen dat secretie van nutrienten (ook fosfor) naar de waterkolom plaatsvindt (o.a. Twilley et ai., 1977; Carignan & Kalff, 1982). Dit proces kan echter slechts zwak bijdragen aan de fosforconcentratie in de waterkolom (o.a. Graneli & Solander, 1988). July AUQ Sept Oc t 120

Anderzijds kan deze biomassa-nutrientenpool zeer snel omgezet worden naar beschikbaar fosfor in de waterkolom door seizoenale sterfie van de macrofyten (Graneli & Solander, 1988; Barko et ai., 1991 en referenties daarin). Dit wordt aangetoond in een experiment van Landers (1982; uit Graneli & Solander, 1988). Na afsterven van de macrofyten, steeg het TP in de macrofyt-conditie sterk in verhouding met die van de macrofytloze conditie (figuur 2.20, bovenaan). Deze stijging van het fosforgehalte werd gevolgd door een snelle toename van de fYtoplanktondensiteit (gemeten als chlorofyl a) (figuur 2.20, onderaan). In de conditie waar de macrofyten werden verwijderd, bleef het TP laag, net zoals in de vijver zelf (buiten de afgesloten delen) (figuur 2.20). Het proces van nutrientuitlekking na sterfie zal alleszins een veel aanzienlijker bijdrage leveren aan het TP van de waterkolom dan secretie.

a. -l

~

060 I-

30

o,+---____ o

July 90

01

-l -l

roo

a.

20

..0

__

10

~

120

Experiment Day

:I:

De uitlekking van fosfor uit afstervende macrofyten is een fysisch proces. De snelheid is rechtevenredig met de initiele fosforconcentratie van het weefsel. Carpenter (1980) stelde een model op waarin de fosforvrijzetting uit senescente macrofYten wordt voorspeld aan de hand van de initiele fosforconcentratie, de tijd en nog twee bijkomende constanten. Gemiddeld wordt per dag 1 it 10% van de initiele fosforconcentratie vrijgegeven (Graneli & Solander, 1988 en referenties daarin). Het is voomamelijk anorganisch fosfaat dat vrijkomt. Bij initiele fosforconcentraties lager dan 0.1 % van het drooggewicht lekt geen of slechts zeer weinig fosfor uit (Carpenter & Adams, 1978; uit Graneli & Solander, 1988).

~--~--~--~

Oct

~:;:~:~;:;;;;::;:(~;;:jS: I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

!

i

I

I

I

I

o a: o

-l :I: U

Sept

AUQ

\

I

30

..,

.0

Experiment Day PLANTS

DENUDED

OPEN

Figuur 2.20 TP (boven) en chlorofyl a (onder) in afgesloten stukken met Myriophyllum spicatum (plants), in afgesloten stukken waar de vegetatie werd verwijderd (denuded) en in niet-afgesloten stukken van de vijver (open). Naar Landers (1982), uit Graneli & Solander (1988).

Macrofyten zijn dus in staat de fosforcycIus van het meer te versnellen. Deze effecten zijn vooral in ondiepe meren uitgesproken. Hier vindt men immers vaak een grote hoeveelheden ondergedoken macrofyten met een hoge biomassa-turnover tijdens hun groeiseizoen, dat in vele gevallen overeenkomt met de peri ode van maximale productie van de planktongemeenschappen (Barko et aI., 1991 en referenties daarin). In oligotrofe ondiepe meren is de biomassa-turnover door macrofYten vaak laag. De nutrientencycIus wordt hierdoor aanzienlijk vertraagd. Studies die de fosforconcentratie binnen macrofytbedden (zonder senescentie) vergeleken met die buiten de bedden, komen niet tot eenduidige resultaten (Graneli & Solander, 1988 en referenties daarin). Waarschijnlijk is het relatief belang van de verschiIIende factoren vooral afhankelijk van de macrofytsoorten. Deze bepalen immers in welke mate er partikelsedimentatie (met bijhorende mineralisatie en vrijzetting van nutrienten) zal optreden, hoeveel fosfor opgenomen (of vrijgegeven) wordt uit (aan) de waterkolom en of de zuurstofconcentratie en de pH aan het sedimentoppervlak al dan niet gunstig zijn voor fosforvrijzetting.

2.6.2.3 Conclusie

Samengevat kan men stellen dat macrofyten een erg tweeledig karakter hebben voor de fosforconcentraties in de waterkolom en in het sediment. Enerzijds zorgen zij ervoor dat fosfor wordt vrijgezet uit het sediment (door een heel gamma aan processen), en anderzijds zorgen zij ook voor heraanvulling van de sedimentaire fosforpooi.

2.6.3 FOSFOR EN DE ECOLOGIE VAN CHARA

2.6.3.1 CHARA KOMT VOORAL VOOR OLIGOTROFE WATERS Chara komt vooral voor in kalkrijk water met hoge pH (vaak hoger dan 8). Deze twee factoren hebben een sterk gemeenschappelijk effect op de nutrientensamenstelling van het water. Bij hoge pHwaarden en Ca2+ concentraties is het immers vee I waarschijnlijker dat een aantal belangrijke nutrienten (o.a. fosfor) neerslaan. Het valt dan ook op dat Chara vooral voorkomt bij lage fosforconcentraties. In natuurlijke vijvers van de gematigde streken waar de fosforconcentratie lager is dan 20 J.lgP/l (~ 0,65 J.lM) wordt de macrofytenflora vaak voIIedig door Chara gedomineerd (Forsberg, 1964).

Ook recentere studies tonen aan dat het voorkomen van Chara-soorten afhankelijk is van de fosforconcentratie. Zo heeft vegetatieonderzoek langs een eutroficatiegradient in de Everglades aangetoond dat Chara zeyTanika een relatief betrouwbare indicator voor lage Pi concentratie in het water is (Vaithiyanathan & Richardson, 1999). Toen Chiang et aT. (2000) in dezelfde Everglades nutrienten (N en P) toedienden leidde dit echter tot de vervanging van het 'Utricularia-perifYton complex' door een Chara-gedomineerde vegetatie.

21

2.6.3.2 FOSFAATINHIBITIE Fosfor is vaak een limiterende factor voor plantengroei door de lage concentraties waarin het in regel voorkomt. In sommige gevallen kan echter ook een teveel aan fosfor de groei inhiberen. Zo wordt de groei van sommige eencellige wieren (o.a. Dinobryon divergens en Uroglena americana, beide chrysofyten) ge"inhibeerd door toenemende fosforconcentraties (Rodhe, 1948; uit Forsberg, 1964). In het geval van Dinobryon en Uroglena begint de groeirepressie vanaf ongeveer 5 flgP/I ~ 0,16 flM). Deze onderdrukking is dus realistisch in veel meren; het SRP in eutrofe waters overstijgt vele mal en deze concentratie. Forsberg (1964) stelde vast dat het moeilijk is om Chara globularis Thuill. var. globularis te kweken in een aantal standaardgroeimedia. Na toevoeging van Ca2+ behaalde hij betere resultaten. Kraantjeswater (relatief hoge Ca2+ concentratie, lage Pi concentratie) leverde ook goede resultaten op. Toevoeging van fosfaat aan het kraantjeswater resulteerde in verminderde groei. Na toevoeging van 8 flgP/I (~ 0,26 flM) vie I de groei terug op 70% van die in de controle; toevoeging van 30 flgP/I (~ I flM) resulteerde in een volledige groeistop. Verdere experimenten met welomschreven groeimedia toonden aan dat de groei van steriele thalli van Chara globularis inderdaad wordt ge"inhibeerd door stijgende fosforconcentratie en dat deze inhibitie verzwakt bij langere daglengtes en bij doorborreling van het medium. Op basis van de groeireductie in deze experimenten en van de lage fosfaatconcentraties waarbij de soort van nature voorkomt, kwam Forsberg tot de conclusie dat Chara globularis fosforgevoeligheid vertoont. Henricsson (1976; uit Blindow, 1988) herhaalde de experimenten van Forsberg en yond geen verschillen tussen de condities met fosfaattoediening en de controleconditie. Hij sloot ook uit dat het kation uit het toegediende fosfaatzout de groei-inhibitie in de experimenten van Forsberg veroorzaakte en suggereerde dan ook dat de afwezigheid van Chara in eutrofe waters niet kan worden verklaard door de fosfaatconcentratie maar eerder door competitie met andere primaire producenten. Blindow (1988) onderzocht de fosfortoxiciteit bij niet-steriele thallusfragmenten van Chara tomentosa en van Chara hispida. Ook hij yond geen verschillen tussen de groei in fosfaatrijk en fosfaatarm medium.

2.6.3.3 DE ROL VAN CHARA IN DE CONTROLE VAN DE FOSFORCYCLUS IN ONDIEPE MEREN Kufel & Ozimek (1994) onderzochten de fosfaatopname door Chara aspera Deth. ex Willd. uit het Luknajno-meer in Polen. In dit meer is de macrofytenvegetatie gedomineerd door vier charofyten (Chara aculeolata Klitz., C. aspera Deth. ex Willd., C. contraria Klitz. en C. tomentosa L.) die er een dense vegetatiemat vormen. Hoewel het meer een aanzienlijke nutrienteninput kent is het slechts weinig geeutrofieerd (lage fosforconcentratie, weinig fytoplankton). De resultaten van hun laboratoriumexperimenten tonen aan dat in aanwezigheid van C. aspera het toegevoegd fosfaat vee I sneller wordt gedepleteerd en dat de groei van de planten in het meer voornamelijk door fosfor werd gelimiteerd. Het potentieel om snel grote hoeveelheden fosfor op te nemen stelt de planten in staat de jaarlijkse fosforinput efficient te compenseren. Op deze manier verhindert Chara de ontwikkeling van fytoplankton. De resultaten van Kufel & Ozimek (1994) bieden verdere aanwijzingen voor de afwezigheid van fosfortoxiciteit bij Chara. Ze von den namelijk een positieve verband tussen de biomassatoename en de hoeveelheid toegediend fosfor, en weI tot bij de hoogste fosforconcentratie die ze toedienden (770 flgP r l ). 22

Chara is dus, dankzij snelle opname en grote opslagcapaciteit, in staat veel fosfor te immobilisereno Naast deze immobilisatie door opname kan, in ca1ciumrijke waters, ook neerslag van ca1ciumfosfaat lei den tot reductie van de fosfaatconcentratie van de waterkolom (Blindow, 1992; en referenties daarin).

2.6.3.4 CONCLUSIE Ongeacht de rol van de fosforconcentratie op de groei van Chara, is het onwaarschijnlijk dat aileen fosfortoxiciteit de afwezigheid van Chara in eutrofe meren kan verklaren. Het werd meermaals aangetoond dat in eutrofe meren de Secchi-diepte sterk afneemt ten gevolge van de hoge fYtoplanktondensiteiten. Oeze lichtlimitatie zal waarschijnlijk een bijkomende rol spelen in de densiteitsafname van Characeae in eutrofierende vijvers.

2.6.4 FYTOPLANKTON EN DE FOSFORHUISHOUDING VAN ONDIEPE MEREN Naast de macrofYten kan ook het fYtoplankton een belangrijke rol spelen in de fosforhuishouding van een ondiep water. Ten eerste kan bij het afsterven en de afbraak van algen in de zomer veel Pi vrijkomen in de waterkolom als de omstandigheden hiertoe geschikt zijn. Ten tweede kan er, bij hoge productiviteit van het fytoplankton, ijzergebonden fosfor uit het sediment vrijkomen in de waterkolom. Hiertoe werden drie processen beschreven (Scheffer, 1998). Het eerste proces is de mortaliteitsgemedieerde anoxische fosfaatvrijzetting. De hoge productiviteit brengt een hoge mortaliteit met zich mee, zodat de omstandigheden aan het sedimentoppervlak anoxisch worden ten gevolge van de afbraak van het dood fytoplankton. De kans op anoxische fosfaatvrijzetting (ten gevolge van reductie van Fe 3+ tot Fe2+) wordt hierdoor groter. Het tweede fosfaatvrijzettend proces is een gevolg van de hoge fotosynthetische activiteit. Dit verhoogt immers de pH in het water met aIs gevoIg dat de capaciteit van ijzer om fosfaat te binden daalt. Het derde proces komt op gang omdat de aIgenbloei vee 1 fosfaat vereist. Het fYtoplankton zal door zijn sterke algen groei nagenoeg al het S.R.P. in het water rtotaal- P opgebruiken. Oit verhoogt de kans dat bij algen totaal-P-< sedimentresuspensie partikelgebonden fosfaat zal SRP SRP vrijkomen in het water. sediment

Deze fYtoplankton-gemedieerde fosforvrijzetting heeft een belangrijk effect op de interpretatie van het totaal-P (figuur 2.21). AIs het fYtoplankton hoge densiteiten bereikt, zodat fosfaat limiterend wordt in de waterkolom, zal bijkomend fosfaat uit het sediment worden vrijgezet en opgenomen in de biomassa. Ais de fYtoplanktondensiteit laag wordt gehouden, bijvoorbeeld door zooplanktonbegrazing, zal er relatief meer fosfor in het sediment blijven en zal het totaal-P van de waterkolom aanzienlijk lager ZIJn.

sediment

Figuur 2.21 Het effect van de algenbiomassa op de TP concentratie van de waterkolom. De aanwezigheid van grote hoeveelheden algen bevordert de vrijzetting van fosfor uit het sediment. Het vrijgekomen fosfor zal daarop zeer efficient in de fytoplanktonbiomassa worden vastgehouden. Het TP is dus, via dit proces, gecorreleerd met de fytoplanktonbiomassa. Naar Scheffer (1998).

23

2.7 BIOLOGISCHE STOICHIOMETRIE: EEN KORTE INLEIDING 2.7.1 INLEIDING Recent werd, onder leiding van James Elser van de Arizona State University, een prestigieus IRCEB onderzoeksproject (Integrated Research Challenges in Environmental Biology) opgestart. Dit kreeg als doel het belang van de ecologische stoichiometrie (de C:t~:p verhoudingen) uit te doeken te doen, van celbiologisch tot ecologisch niveau, in een breed spectrum aan habitattypes. Biologische stoichiometrie is een breder begrip dan ecologische stoichiometrie. Het wordt omschreven als de studie van de balans van energie en verschillende chemische elementen in levende systemen. Bovendien streeft men in het bestuderen van de biologische stoichiometrie naar een begrijpen van de moleculaire achtergrond van de zich op ecosysteem uitende nutritionele en energetische vereisten. In wat voigt wordt ingegaan op twee van de artikels die reeds resulteerden uit het onderzoeksproject en op een aantal andere artikels in verband met ecologische stoichiometrie (onder andere bij primaire producenten).

2.7.2 DE N:P VERHOUDING VAN DE VEGETATIE ALS INSTRUMENT VOOR HET BEPALEN VAN DE HEERSENDE NUTRIENTLIMIT ATIE Het is, zeker voor primaire producenten, van belang in te zien dat nutrientlimitatie een relatief begrip is. Sommige planten zullen in hun groei beperkt worden door een tekort aan een bepaald nutrient terwijl andere planten bij dezelfde concentratie van het betreffende nutrient geen stress ondergaan (Koerselman & Meuleman, 1996 en referenties hierin). Oit geldt zowel op niveau van het individu als op niveau van de populatie. Het is voomamelijk deze niche-differentiatie die kan lei den tot hoge diversiteit in een vegetatie (Tilman, 1985; uit Koerselman & Meuleman, 1996). Het nagaan van de aard van nutrientlimitatie in de natuur is een zeer arbeidsintensieve bezigheid. Hiertoe moeten experimenten opgezet worden waarbij de respons op toediening van elk individueel nutrient wordt nagegaan. Omwille van deze arbeidsintensiviteit is men op zoek gegaan naar altematieve methodes. Men kan veronderstellen dat, bij lage fosforbeschikbaarheid en hoge stikstofbeschikbaarheid, de vegetatie meer N dan P zal opnemen. De N:P verhouding van het plantenmateriaal zal dus, ten gevolge van de overdadige opname van N, hoog zijn. Bij omgekeerde relatieve nutrientbeschikbaarheden kan men ook een omgekeerde N:P verhouding in het plantenmateriaal verwachten. Koerselman & Meuleman (1996) hebben, uitgaande van bovenstaande redenering, de aard van nutrientlimitatie trachten in verband te brengen met de N:P verhouding van de vegetatie. Hiervoor gingen ze uit van de beschikbare literatuur over moerasvegetaties. Figuur 2.22 toont het resultaat van hun onderzoek. Voor N:P massaverhoudingen van de vegetatie kleiner dan 14 yond men telkens stikstoflimitatie of colimitatie tussen stikstof en kalium. Bij N:P massaverhoudingen groter dan 16 yond men dan weer fosforgelimiteerde vegetaties. Tussen beide in (14 < N:P < 16) werden voomamelijk vegetaties onder colimitatie van N en P teruggevonden. Het betreft hier massaverhoudingen.

24

Men kan dus inderdaad tot het besluit komen dat de stikstof- en fosforgehaltes van planten voomamelijk door de beschikbaarheid hiervan wordt bepaald. Het wordt bovendien duidelijk uit het brede bereik dat beide nutrientconcentraties vertonen (figuur 2.22), dat er geen duidelijk verband bestaat tussen de nutrientinhoud van de plant en de aard van nutrientlimitatie. Koerselman & Meuleman (1996) stellen weI dat er mogelijk een limietwaarde be staat (1.1 mgP (g DWr 1 ~ 0.035 mmolP (g DWrl) boven dewelke geen fosforlimitatie meer kan voorkomen. Let weI dat het gebruik van de N:P verhouding als middel om de limitatie van de plantengroei te achterhal en, slechts bruikbaar is als ofwel N ofwel P de groeilimiterende factor is. In de natuur komt echter zelden een andere vorm van nutrientlimitatie v~~r. De N:P zegt bovendien niets over de absolute nutr"ientbeschikbaarheid. Het doet enkel uitspraak over de relatieve beschikbaarheid van be ide.

4

3.5

'", .s'"

3

2.5

...

. ....

c: oS c::

0

1.5

<.l

ci.. 0.5

Figuur 2.22 Het verband tussen het stikstof- en fosforgehalte van de vegetatie en de aard van nutrientlimitatie voor 40 Europese moerassen. Elk punt in de grafiek komt overeen met een fertilisatiestudie. De stippellijnen wijzen duiden de N:P massaverhoudingen 14 en 16 aan. Dit komt, op atomaire schaal, neer op 31 en 35.4. 0: Plimitatie; .: N-limitatie; 0: colimitatie tussen N en P; ... : colimitatie tussen N en K. Uit Koerselman & Meuleman, 1996.

2.7.3 HET VERBAND TUSSEN C:N:P STOICHIOMETRIE EN GROEI

Autotrofen kennen een zeer uiteenlopende C:N:P samenstelling, zowel intra- als interspecifiek. Er is een duidelijke negatieve trend tussen het N- en P-gehalte van de plant en zijn biomassa. Deze trend gaat gepaard met hogere gemiddelde groeisnelheden bij de afnemende lichaamsgrootte. Wat vooral opvalt is dat, bij toenemende groeisnelheid, het P-gehalte sneller toeneemt dan het N-gehalte. Het komt er dus op neer dat kleine autotrofen (bv. eencellige algen) veellagere N:P gehalten hebben dan grotere autotrofen. Bij autotrofen is de C:N:P verhouding niet zonder meer te vergelijken aangezien een gedeelte van de variatie in deze verhouding te verklaren is door reserveopslag van nutrienten in peri odes dat het aanbod de vraag overstijgt. Ze kunnen bovendien vlot hun groeisnelheid aanpassen aan de omstandigheden (ongebalanceerde groei). Elser et al. (2000a) vatten een aantal vuistregels voor de autotrofe C:N:P verhouding samen. De N:P verhouding van het plantenmateriaal zal steeds volgen in het spoor van het opgelegde N:P regime. Bovendien zal, bij een con stante toevoersnelheid van een nutrient X, de C:X verhouding afnemen als de lichtintensiteit en/of de partiele COrdruk stijgt. Als de groei gelimiteerd wordt door nutrient X zal, bij afnemende groeisnelheid, de C:X verhouding van de biomassa snel toenemen (Elser et ai., 2000a en referenties daarin). Uiteraard heeft het nutrientgehalte van de primaire producenten consequenties voor de hogere trofische niveaus. Meercellige dieren vertonen immers (over het algemeen) gebalanceerde groei en moeten daarom een vaak hoger, maar vooral constant nutrientgehalte handhaven. Men heeft reeds duidelijke bewijzen dat herbivoren lijden aan fosforlimitatie bij opname van fosforarm voedsel (Urabe

25

et al., 1997; Elser et al., 2000c; beide uit Elser et ai., 2000a). Zulke stressomstandigheden kunnen gevolgen hebben voor de evolutie (Elser et al., 1996). Bij sommige dieren kan echter de C:N:P verhouding varieren, bijvoorbeeld door opslag van hoogenergetische nutrientloze reservestoffen (o.a. vetten). De adaptatie die de meeste dieren vertonen om met voedsel om te gaan met een andere C:N:P stoichiometrie dan die van zichzelf, is selectieve excretie van het element dat in overvloed voorkomt. Verder zal de groei geremd worden als er een element in 1000T I -------------, lo'll" invenebrates te lage hoeveelheid aanwezig is. Deze adaptaties staan dus in schril contrast met de luxe-opslag van het f 100 £! overvloedig aanwezig element, en het gebruik hiervan in peri odes van nutrientstress, zoals dat bij planten wordt ; 10 :z: waargenomen.

. e

.'

1+-~~~~~~~-r-r~~--­

-16 ·14 ·12 ·10 ·8

Voor dieren wordt, net zoals voor planten, verwacht dat de N:P verhouding toeneemt met omvang en groeisnelheid (figuur 2.23). Hier vindt men echter, bij grotere dieren, twee verschillende strategieen. Enerzijds zijn er de vertebraten, die bij toenemende grootte meer en meer gaan investeren in beenderen (P-rijk) en anderzijds zijn er de invertebraten, die bij toenemende grootte investeren in een stevig chitineskelet.

·6

·4

·2

0

2

4

6

8

Log(Mass. g)

Figuur 2.23 De voorspelde variatie in de N:P ratio van heterotrofe organismen, in functie van hun lichaamsgrootte (massa). De stippeliijnen wijzen erop dat er waarschijnlijk grote ecologisch of evolutionair ontstane variatie aanwezig is. 8ij grote lichaamsomvang zijn twee trajecten mogelijk (zie tekst).

In de ecologie werd traditioneel energie gebruikt als maat om de trofische dynamiek te bestuderen, met veel succes trouwens. Rekening houdende met bovenstaande overwegingen, kan men zich echter de vraag stellen of opgenomen energie wei altijd de beste maatstaf is voor de toename in fitness van het consumerende trofisch niveau. Zeer waarschijnlijk is dit niet het geval en speelt ook de minerale voedselkwaliteit een grote roi.

2.7.4 DE CELBIOLOGISCHE BASIS VAN HET VERBAND TUSSEN C:N:P EN GROEI Om na te gaan welke celbiologische processen belang kunnen hebben in de C:N:P stoichiometrie van een organisme is het nuttig te gaan kijken waar de nutrienten in de cel voorkomen. Figuur 2.24 (a en b) geeft een idee van de nutrientinhoud van enkele belangrijke molecules en van de organellen. Van al de molecules die fosfor bevatten hebben de meeste ofwel een nagenoeg con stante hoeveelheid in de cel, ofwel komen ze slechts in onbeduidende concentraties v~~r. Alleen de nucle'inezuren en de prote'ines vormen hierop een uitzondering. De rRNA concentratie van de cel varieert binnen brede grenzen. Een heel aantal studies relateren variaties in groeisnelheid aan de allocatie naar fosforrijk rRNA (Elser et ai., 2000a en referenties daarin). Aangezien RNA voor ongeveer 10% uit fosfor bestaat, zijn verschillen in het RNA-P voldoende om de verschillen in N:P van het volledige organisme te

26

25T5~O:-,~:----~p~n~os~pn~o~.,~g;~n;~n.~--~

(a)

verklaren (Elser et ai., 2000a). Het komt er dus op neer dat een fosforrijke (lage N :P) habitus een noodzaak is voor snelle groei.

20 Z

15

?fi

10

.. •

15:1

7:1

(b) 2 0 ~OO'" 15

phosphocreatine

rOi

•

ein

~

ATP.

• E:~'

nbOSO:!~" /.

•

Chromosome..........

/

• nucleus.......... pr~karyotic

(\.~~~~; •••.7;'

"bosom.

• chiti~

5 ::..-

: .' mitochondrion .... ......

phOSPhOlipidS· o ::.' ,.-.o 5

Merk op dat de processen die in dit punt behandeld zijn voor dieren werden gevonden. Planten spelen, zoals reeds eerder aangehaald, anders om met nutrienten door hun ongebalanceerde groei.

1:

,uk.'yoUe .'

.'

:5:"'

:~mma.·

:':

nucleic acids

!! ./

50;1

: "biideria

•

•

10

15

o -:'' -----.-... o 2

20

.. .. _ ... 1.1 ....... ----

3

%P

4

5

6

%P

Figuur 2.24 Stoichiometrisch diagram ter iIIustratie van de stikstof- en fosforsamenstelling van (a) nutrientbevattende biomolecules en (b) organellen. De percentages stikstof en fosfor zijn massapercentages. De stippellijnen situeren de ligging van een aantal N:P waarden. Let op de verschillende schalen. Uit Elser et al., 1996.

2.7.5 VERGELIJKING VAN TERRESTRISCHE EN ZOETWATER-ECOSYSTEMEN Terrestrische voedselketens kennen meestal een zeer nutrientenarme basis. De autotrofen hebben er een veel hogere C:N en C:P dan in zoetwaterecosystemen (figuur 2.25.a). Desondanks dat is, voor beide habitattypes, de N:P verhouding van de primaire producenten nagenoeg constant (figuur 2.25.a).

(a) 60

'"c0

.~

~

50 40

~

30

0

20

.D

'*

• freshwater

Oterrestrial

mean: median:

s.d.:

10.2 9.6 3.0 0.29 267

36 32 23

C.V.: 0.64

n; 406

o terrestrial

(b)40

mean:

'"

c .Q

i

30

0

20

'*

10

o terrestrial

40

mean: 968 median: 799

<0 30

s.d.: 73' C.V.: 0.75 n: 413

~

~ .D 20 0 ;f. '0

•

freshwater

307 256 2'2 0.69 273

.2

~

mean: 116 C.V.:

n;

~

0.62 27

~

• •• • -- •

60

40

e

Cl

50 40

:e

0 N 8 N ~ '" ~ '" ~ '" N N '"N '" ~

o terrestrial

•

mean: 26.4 s.d.: '0,1 C.v.: 0.38 n; 22

30

Cl Cl

30

0.47

37

-. •

20

40

30

Biomass CoN in food Daphnia magna

• •

20 '0

.

Mean

freshwater

22.3 18.5 10.5

median: 22.6

()

W

10

..

~~~

10%

•

'0

~

.

~

Mean

5

0.38

10

<0

1

,:,.:• .

0

~

40

.D

10

124 114 48

Biomass C:P

'"c

~

freshwater

20

Biomass C:P

.2

'5

a •

median: 73.2 s.d.: 72.4

30

N

:£

'0

••

Pieris rapae

o terrestrial

~ '" :il

.2 <0 1

20

Biomass C:N

.D

'*

~ '"c;,

W

<0

0

25

Cl Cl

40

:£

(e)

()

v

.!2

6.3 6.0 1.3 0.21 38

C.V.: 0.29 no 124

BiomassC:N

'"c

freshwater

.D

10

so

•

6.5 6.4 1.'

median: s.d.:

'0% 0 0

200

90%

400

600

800

1.000

Biomass CoP in food

20

.D

0

0

'*

'* Biomass N:P

10

'"v '"

~

:2

~

gJ

?l

~

Biomass N:P

0

~

~

:il :ll ~

Figuur 2.25 (a) Frequentiehistogrammen van C:N:P stoichiometrie in autotrofen, in terrestrische en zoetwaterecosystemen (vnl. fytoplankton voor de zoetwater-ecosystemen); (b) Frequentiehistogrammen van C:N:P stoichiometrie in invertebrate herbivoren (vnl. zooplankton voor de zoetwater-ecosystemen); (c) Afname van de bruto groei-efficientie (GGEc) met toenemende C:N in het voedsel, voor typische terrestrische en zoetwatergrazers. Uit Elser et al., 2000b.

27

De traditionele visie dat N de groeilimiterende factor bij uitstek is in terrestrische ecosystemen en P in aquatische, komt hierdoor eventueel op de helling te staan. Het is echter ook mogelijk dat de optimumwaarde voor N:P verschilt in aquatische versus terrestrische ecosystem en en dat dus, ondanks gelijkende N:P verhoudingen in de vegetatie, toch P overwegend de groei limiteerd in het water en N op land. Deze laatste hypothese wordt echter niet ondersteund door de studie van Verhoeven et al. (1996; uit Elser et al., 2000b). De autotrofen mogen dan grote verschillen in C:N:P verhouding vertonen tussen terrestrische en aquatische systemen, hun grazers hebben een zeer gelijkende C:N:P stoichiometrie (figuur 2.25.b). Aan de lage voedselkwaliteit (hoge C:nutrienten) wordt, zoals reeds eerder aangehaald, verholpen door selectief C te excreteren en door, indien nodig, de groeisnelheid te verlagen (figuur 2.25.c).

2.7.6 CONCLUSIE De ecologische stoichiometrie blijkt een nuttig instrument bij de interpretatie van ecosystemen. De N:P verhouding blijkt, onder strikte voorwaarden, een goede maat om de aard van nutrientlimitatie na te gaan. De variabiliteit in de ecologische stoichiometrie is vaak te wijten aan verschillen in groeisnelheid. Bij planten speelt echter nog een ander, en waarschijnlijk belangrijker element: de ongebalanceerde groei. Dit laatste maakt dat bij planten zeer omzichtig moet worden omgesprongen met interpretaties vanuit de ecologische stoichiometrie.

2.8 INTERACTIES TUSSEN FYTOPLANKTON, PERIFYTON EN MACROFYTEN In een aquatisch ecosysteem zijn er drie verschillende habitats die door fototrofen bezet kunnen worden: het open water, het sedimentoppervlak en het wateroppervlak. In diepe meren is de oppervlakte aan belicht sediment zeer klein en zal de primaire productie nagenoeg volledig door fytoplankton worden gedomineerd. In ondiepere systemen kunnen echter macrofyten een aanzienlijk deel van de primaire productie voor hun rekening nemen.

2.8.1 NUTRIENT EN De nutrientenbeschikbaarheid is over het algemeen veel lager in de waterkolom dan in het sediment. Macrofyten zijn vaak in staat om, naast de waterkolom, ook het sediment aan te spreken als nutrientenbron (cf. 2.6.1.2). Fytoplankton en epifyten zijn daarentegen volledig aangewezen op de waterkolom voor hun nutrientenvoorziening, hoewel fytoplankton dus wei in staat is fosfor vrij te zetten uit het sediment (cf. 2.6.4). De stikstof- en fosforbehoefte van macrofyten is aanzienlijk lager dan die van veel fytoplanktonsoorten. Sand-Jensen & Borum (1991) trachten dit te verklaren steunend op drie verschillen tussen beide. Ten eerste hebben macrofyten hoge inwendige C:P en dito C:N verhoudingen. Voor mariene macrofyten werden gemiddelde C:N:P verhoudingen van 550:30: 1 gevonden, terwijl fytoplankton aanzienlijk meer stikstof en fosfor bevat (C:N:P gemiddeld 106: 16: 1) (Sand-Jensen & Borum, 1991 en referenties daarin). Ten tweede groeit fytoplankton sneller, wat op zich meer nutrienten kost. Deze

28

twee verschillen zijn gedeeltelijk samenhangend (cf. 2.7). Een derde verschil dat kan instaan voor de verschillende nutrientenbehoeften is de efficiente bewaring en herverdeling van de aanwezige nutrienten die bij macrofyten wordt waargenomen. Dat macrofyten minder nutrienten nodig hebben dan fytoplankton komt dus goed overeen met hun ecologische verspreiding. Terwijl fytoplankton vaak domineert in eutrofe waters zijn het vaak macrofyten die overheersen in oligotrofe waters (zowel in zoetwater-, brakwater- en mariene omgevingen). Epifyten zijn voornamelijk afhankelijk van het water voor hun nutrientenbiomassa. Aangezien zij voorkomen op macrofyten, die vaak in oligotrofe system en voorkomen, is hun groei zeer vaak n utri entge 1im iteerd. Een aantal studies tonen echter aan dat de macrofyten spontaan nutrienten, die opgenomen werden uit het sediment, afstaan aan de waterkolom (Twilley et ai., 1977; en referenties daarin). Hoewel in de natuur waarschijnlijk minder nutrienten worden afgestaan dan in de artificiele experimenten van Twilley et al. (1977), mag zeker niet uitgesloten worden dat epifyten een gedeelte van hun nutrientenvoorziening aan hun gastheer te danken hebben. Carignan & Kalff (1982) toonden aan dat epifyten op Myriophyllum spicatum L. een kleine fractie (3.4 Ii 9%) van hun fosfor te danken hebben aan hun gastheer. Bij extreem lage fosforbeschikbaarheid kan dit oplopen tot 60% (Moeller et ai., 1988; uit Sand-Jensen & Borum, 1991).

2.8.2 KOOLSTOF EN ZUURSTOF Door fotosynthese zal in dense fototrofe gemeenschappen de pH en de Oz-beschikbaarheid stijgen, terwijl het DIC afneemt in concentratie. Dit zou kunnen leiden tot verminderde COz-fixatie en verhoogde fotorespiratie. Vooral macrofyten zullen hieronder lijden, aangezien in dense macrofytbedden diffusie de belangrijkste factor is voor de Or en de COz-voorziening, waar deze in open water (voor fytoplankton) voornamelijk door waterbewegingen worden gecontroleerd (Sand-Jensen & Borum, 1991).

2.8.3 LICHT Licht is waarschijnlijk de belangrijkste factor in de bepaling van de samenstelling van fototrofe gemeenschappen. Hoewel het fytoplankton blootstaat aan zeer variabele lichtcondities (verandert voortdurend van positie in de waterkolom) is het sterk bevoordeeld wat betreft de competitie voor licht. Het is immers in suspensie in de bovenste lagen van de waterkolom en heeft alsdusdanig (als gemeenschap) de volledige lichtintensiteit ter beschikking. Ondergedoken macrofyten en hun epifyten ontvangen relatief minder licht dan het fytoplankton, maar de intensiteit is, op korte termijn althans, nagenoeg constant. De minimale Iichtbehoefte van macrofyten wordt 10 maal hoger geschat dan die van fytoplankton (Sand-Jensen & Borum, 1991) en licht is dan ook de meest waarschijnlijke groeilimiterende factor voor macrofyten. Naast de beschaduwing door fytoplankton en de zelfbeschaduwing waarmee ondergedoken macrofyten geconfronteerd worden, kunnen ook epifyten hun gastheer aanzienlijk beschaduwen. Er werd reeds aangetoond dat de absorptie in de epifytenfilm soms belangrijker is dan de absorptie in de volledige bovenliggende waterkolom. Als bij eutroficatie de nutrientlimitatie op de groei van de

29

epifyten wegvalt, kan de proliferatie van de epifytenmat aanzienlijk bijdragen tot het uiteindelijke afsterven van de macrofytvegetatie (Phillips et al., 1978; Sand-Jensen & Borum, 1991). Van Vierssen & Prins (1985) trekken het belang van beschaduwing door epifyten echter in vraag. Ze namen waar dat voomamelijk oudere delen van de macrofyt gekoloniseerd werden, terwijl de jongste delen van de plant voor het meerendeel van de productie instaan. Ze suggereren dat het voorkomen van de epifyten op oudere delen van de macrofyt vooral toe te schrijven is aan verhoogde nutrientenvrijzetting door oudere weefsels. Sand-J ensen & Borum (1991) berekenden dat de maximale kolonisatiediepte van macrofyten veel sterker door het lichtopslorpend effect van de waterkolom dan door de lichtabsorptie van het epifyton wordt bepaald.

2.8.4 CHEMISCHE OORLOGSVOERING Het onderzoek naar allelopathische interacties in aquatische milieus staat nog in zijn kinderschoenen. Er werden reeds een aantal organische stoffen geYsoleerd uit macro:tytweefsels, die de groei van fytoplankton significant onderdrukken bij lage concentratie (o.a. Wium-Andersen et ai., 1982; Kleiven, 1991). Dat dergelijke bioactieve stoffen uit plantenmateriaal geYsoleerd kunnen worden, wi! echter nog niet zeggen dat ze ook effectief worden uitgescheiden in voldoende concentratie om fytoplankton- en epifytongroei te inhiberen. Tot op heden is er in situ nooit allelopathie door macrofyten op fytoplankton aangetoond. Het bestaan ervan wordt dan ook vaak in vraag gesteld (o.a. Forsberg et al., 1990). Hoewel er geen dus geen sluitend experimenteel bewijs voor bestaat is het best mogelijk dat allelopathie voorkomt. De lichtlimitatie ten gevolge van fytoplankton- en epifytongroei kan immers bij macrofyten resulteren in een sterke selectie voor dit kenmerk. Epifyten zullen waarschijnlijk de eerste slachtoffers zijn van allelopathie, aangezien zij in direct contact staan met de plant. Effecten op fytoplankton liggen moeilijker aangezien de afgescheiden stoffen erg worden verdund in de waterkolom vooraleer ze deze gemeenschap bereiken. In ondiepe waters is de waarschijnlijkheid dat ook fytoplankton in aanzienlijke mate blootgesteld wordt aan vrijgezette allelopathische stoffen dan ook groter dan in diepe systemen. Ook andersom kunnen allelopathische effecten aanwezig zijn. Zo to on den Van Vierssen & Prins (1985) aan dat ook fytoplankton in staat is bioactieve stoffen aan te maken die de netto zuurstofproductie van de macrofyt Zanichellia peltata Berto!. reduceren.

2.9 BEKNOPTE UITDIEPING VAN DE ECOLOGIE VAN ONDIEPE WATERS 2.9.1 EUTROFIERING De heldere meren en vijvers met overweldigende groei van waterplanten en grote hoeveelheden zooplankton, zoals die een aantal decennia geleden nog voorkwamen zijn nu zeer zeldzaam geworden in bewoonde gebieden. De meeste van deze vijvers zijn tegenwoordig troebe!. De meest algemene

30

oorzaken voor deze verandering zijn de overrnatige influx van afvalwater afkomstig van steden en industrie, en van het regenwater dat afvloeit van de met meststoffen verzadigde landbouwgronden. Deze overmatige influx van nutrienten (eutrofiering) veroorzaakt in het meer een hoge densiteit aan f)rtop Iankton , dat ervoor zorgt dat licht niet kan doordringen tot de bodem. De waterplanten verdwijnen dan ook sne!. Het enige wat overblijft in zulke meren is fYtoplankton, een laagdiverse benthifauna en benthivore vis. Aangezien fosfor traditioneel aanzien wordt als de limiterende groeifactor in zoetwaterecosystemen, wordt over het algemeen de fosforconcentratie (vooral TP) gebruikt om de graad van eutroficatie aan te duiden (o.a. Jeppesen et al., 2000). Vijvers met lage nutrientgehaltes vertonen meestal een heldere toestand terwijl deze met hoge nutrientgehaltes over het algemeen troebel zijn. Nu blijkt dat interrnediaire nutrientgehaltes meestal niet overeenkomen met een intermediaire troebelheid, maar dat in de mesotrofe vijvers ofwel helder, ofwel troebel zijn. Hierop word verder ingegaan in punt 2.9.3; eerst wordt wat meer uitleg gegeven bij het voedselweb in ondiepe meren.

2.9.2 HET VOEDSELWEB IN ONDIEPE ZOETWATERECOSYSTEMEN Aan de basis van de voedselketen vindt men de macrofYten, in het littoraal van de vijver, en het fYtoplankton, zowel in het littoraal als in de limnetische zone. Het f)rtoplankton wordt voornamelijk door zooplankton geconsumeerd. De carnivore vissen voeden zich met de benthivore en de planktivore vissen, die zich op hun beurt voeden met respectievelijk benthische en planktonische invertebraten. De benthifauna leeft van gesedimenteerd organisch materiaa!' De graad van eutrofiering (gemeten als TP) heeft een duidelijke invloed op de relatieve abundantie van elk van de hoger besproken trofische groepen (figuur 2.26). Ook de verschillende taxonomisch-ecologische groepen die deel uitmaken van deze verschillende trofische niveau's vertonen andere abundanties afhankelijk van de fosforstatus van het water (figuur 2.27).

Figuur 2.26 De densiteit een planktivore vis, het percentage carnivore vis, de zooplankton:fytoplankton verhouding, de chlorofyl a concentratie, de Secchi-diepte en de maximale diepte tot waar macrofytengroei voorkomt, allen in functie van de TP-concentratie van het water. De gegevens zijn afkomstig van een grootschalige screening van Deense meren. Uit Jeppesen et al., 2000. Hoge fosforconcentraties zijn duidelijk positief gecorreleerd met fytoplanktondensiteit (chlorofyl a) en planktivore vis (vnl. cypriniden). De densiteit aan carnivore vis neemt sterk af met toenemende TP. De Secchi-diepte en de zooplankton:fytoplankton verhouding nemen, grotendeels ten gevolge van de sterk stijgende fytoplanktondensiteit, af met toenemende fosforconcentratie. De maximumdiepte tot waar macrofyten voorkomen is nauw gecorreleerd met de Secchidiepte en neemt dus af bij toenemende eutroficatie. Uit Jeppesen et al., 2000.

I

0-0.05 0.05-0.1 0.1-0.2 0.2-0.4 Total phosphorus (mg t'l

31

(a)

fi 3:

o

C)

1 .S

1.0

E!Sl Rotifers

!2J Cyclopoid copepods CJ CaIanoid copepods ~ Small cladocerans _ Daphnia spp.

.5.

(b)

fi

E .5. I:! as

.~ .c

I

'"as '"

Cii

::E

~

,..is .B

·c

;:

8 0.4 Total phosphorus (mg P 1:')

<0.05 .05-0.1 0.1-0.2 0.2-0.4

>0.4

Total phosphorus (mg P t')

Figuur 2.27 De gemiddelde zomerbiomassa (boven) en percentage vertegenwoordiging (onder) van de verschillende zooplankton- (a) en fytoplanktongroepen (b). De biomassa zooplankton neemt toe met de fosforconcentratie. Hoe hoger echter de fosforconcentratie, hoe minder abundant de grote cladoceren (Daphnia spp.) worden en hoe abundanter de kleine soorten (cycloporde copepoden en kleine cladoceren) worden. De biomassa fytoplankton neemt toe met de fosforconcentratie. Bij hogere fosforconcentratie worden relatief minder flaggelate soorten waargenomen (dinofyten en cyanofyten), terwijl de abundantie van de chlorofyten en de cyanofyten toeneemt. Uit Jeppesen et al. (2000).

2.9.3 ALTERNATIEVE EVENWICHTEN Uit verschillende studies kan worden besloten dat de turbiditeit van meren in lineair verband staat met de fosforconcentratie (o.a. Jeppesen et at., 2000) (figuur 2.26). Het is nochtans zo dat over een breed bereik van nutrientconcentraties twee alternatieve toestanden kunnen voorkomen in ondiepe meren. De ene is een heldere toestand, gedomineerd door macrofyten; de tweede is een troebele toestand, waar vooral het fytoplankton het belangrijkste aandeel heeft in de primaire productie en vaak peri odes van massale bloei kent. Elk van deze alternatieve toestanden stabiliseert zichzelf middels een aantal feedback mechanismen die zich vooral centreren rond de interactie tussen de ondergedoken vegetatie en de turbidite it (figuur 2.28). Ondergedoken planten kunnen maar groeien tot een bepaalde diepte, afhankelijk van de turbiditeit van het water (figuren 2.29 en 2.26). Het verdwijnen van planten bij toenemende eutroficatie gebeurt waarschijnlijk door lichtlimitatie (toenemende beschaduwing door epifyten (o.a. Phillips et aI., 1978) en fytoplankton (o.a. Melzer et aI., 1977 (uit Blindow, 1988); Sand-Jensen & Borum, 1991). In het model van Scheffer wordt duidelijk de nadruk gelegd op het fytoplankton. De aanwezigheid van de vegetatie heeft echter een verhelderend effect op het water door de resuspensie van bodempartikels te verhinderen en door de groei van fytoplankton te inhiberen. Voor dit laatste zijn er twee mechanismen voorzien in het

32

Figuur 2.28 De belangrijkste feedback mechanismen waarvan gedacht wordt dat ze aan de basis liggen van de twee alternatieve evenwichtstoestanden in ondiepe meren. Zowel de heldere als de troebele toestand versterken zichzelf. Naar Scheffer et al., 1993.

model: aIIelopathie en competitie voor nutrienten. Eens er zich een troebele toestand heeft gevestigd stabiliseert deze zichzelf door hoge fytoplanktonconcentraties en een hoge sedimentresuspensie te handhaven (figuur 2.28). Deze idee is eenvoudig grafisch voor te steIIen (figuur 2.30.a). Merk op dat deze figuur op nogal onbehouwen veronderstellingen steunt. Zo zal bijvoorbeeld de vegetatie niet plots verdwijnen bij een kritische troebelheid. Meer realistische modellen leveren grafieken op als in figuur 2.30.b. Het model van alternatieve helderheidstoestanden kan ook voorgesteld worden met behulp van het welbekende knikkermodel.

I

(/)

Q)

>. .c

0..

e

al

E

"0

o

3

5

7

6

8

9

Secchi-depth (m)

..

t

Toenemende eutroficatie van heldere waters met weelderige vegetatie leidt tot verkleining van de stabiliteit van de heldere toestand (langs de onderste curve steeds dichter bij de kritische helderheid - figuur 2.30). De kans dat een verstoring (bvb. storm met vernietiging van de vegetatie) optreedt die groot genoeg is om het water naar troebele toe stand te brengen wordt dus alsmaar groter. Bij verdere eutroficatie van het water zal het zonder bijkomende stimulans overgaan naar de troebele toestand.

2

...

...... ..'".. ~j.

":'~~~~~~~;)~..~.:;.~.:..:.-t~.•:...:.... ,..........

o

100

200

300

_

500

600

700

eoo

900

1000

Total phosphorus (J.1g P 1") Figuur 2.29 Bovenaan het verband tussen de transparantie van het water (Secchi-diepte) en de onderlimiet van vegetatie in 27 Finse meren. Onderaan werd de Secchi-diepte van Deense meren uitgezet in functie van TP, voor meren met (e) en zonder (L) hoge bedekking door macrofyten. Uit Scheffer et a/. (1993).

Sinds een aantal decennia zijn een groot aantal meren door nutrientinflux van menselijke oorsprong gestabiliseerd in de troebele toestand. De grote soortenrijkdom die de heldere watertoestand karakteriseert is dan ook een grate stimulans geweest om methoden te zoeken die deze troebele toestand naar een heldere toestand omzetten. Het komt er hierbij op neer om, nadat het nutrientgehalte voldoende is verlaagd, de kritische schakel tussen turbiditeit en vegetatie tijdelijk te onderbreken zodat er zich opnieuw ondergedoken planten kunnen vestigen. Dit kan door een tijdelijke verlaging van de waterstand (figuren 2.26 en 2.27 bovenaan) of door een zogenaamde biomanipulatie waarbij de planktivore vissen die de traebele toestand karakteriseren (vnl. cypriniden) worden weggevist. Dit zal dan via twee feedback mechanismen (figuur 2.26) leiden tot een verlaging van de turbi(a) (b) diteit. Het mechanisme dat speelt via de vraat van zoo~ plankton op fytoplankton wordt het trofisch cascade effect genoemd. CD


. .... ,.'

crilical

-------- turbiditY"

Merk uiteindelijk nog op dat de kwantificatie van de verschiIIende feedback mechanismen uit figuur 2.26 moeilijk is en dat ze waarschijnlijk variabel zijn tussen meren.

Nutrients

nutrients

Figuur 2.30 Alternatieve evenwichten in de turbiditeit, met aan- of afwezigheid van vegetatie als bepalende factor van de toestand bij intermediaire nutrientconcentraties. (a) theoretisch model, (b) een realistischer vegetatie-algen model. Uit Scheffer et a/. (1993).

33

2.9.4 MACROFYTEN EN DE HELDERE TOESTAND Macrofyten stabiliseren de heldere toestand van het water door algen te onderdrukken (nutrientlimitatie, allelopathie en verschaffen van schuilgelegenheid aan zooplankton) en door resuspensie te minimaliseren (cf. figuur 2.28). Hoewel macrofyten een belangrijk potentieel tot compensatie van nutrienttoevoeging, zonder grote gevolgen voor het ecosysteem, bezitten (Balls et al., 1989; Kufel & Ozimek, 1994), stelt men bij eutrofiering van een zoetwatersysteem systematisch vast dat de macrofytenvegetatie wordt teruggedrongen (o.a. van den Bergh et aI., 1998; Jeppesen et at., 2000). Het wordt algemeen aangenomen dat lichtlimitatie (ten gevolge van verhoogde hoeveelheden fytoplankton en epifyton) een dominante rol speelt in het verdwijnen van de macrofyten. Vooral Charofyten blijken gevoelig voor eutrofiering (Forsberg, 1964; Blindow, 1992a; en referenties in beide). Ze vertonen nochtans een lager lichtcompensatiepunt dan angiospermen en komen in heldere meren tot op veel grotere diepte voor (figuur 2.31). Bij eutrofiering zal echter de helderheid van het water sterk terugvallen en in deze omstandigheden is de kolonisatiediepte van angiosperme macrofyten groter dan die van charofyten (Blindow, 1992a) (figuur 2.31). Dit heeft waarschijnlijk te maken met een aantal morfologisch-rysiologische adaptaties die de angiospermen toelaten hun bladeren dichter bij het oppervlak te brengen.

20

:§

15

r.

~

'"0

10

o"

:::; 5

2

6 Secchi depth (m)

8

10

Figuur 2.31 Schematische weergave van het verband tussen de Secchi-diepte en de maximale diepte tot waarop macrofyten voorkomen. Uit Blindow, 1992a.

2.9.5 BIOMANIPULATIE Eutrofe waters zuIlen, door nutrientreductie aIleen, niet gemakkelijk in staat zijn om te slaan van de troebele naar de heldere toestand, hoewel beide toestanden kunnen voorkomen over een breed bereik van nutrientconcentraties. Dit is een gevolg van de stabilisatiemechanismen van de troebele toestand. Het bekomen van een heldere toestand met hoge biodiversiteit is echter een streefdoel van veel beheerswerkers. Vit het model van Scheffer et al. (1993) kan worden afgeleid dat de aanwezigheid van vegetatie cruciaal is voor de instandhouding van de heldere toestand. De vegetatie staat vooral onder invloed van de intensiteit van zonne-instraling. Vit het model blijkt dat er twee mechanismen zijn die in staat zijn deze intensiteit te bevorderen, namelijk het artificieel verlagen van de waterdiepte en het verwijderen van de zooplanktivore vissen. Het eerste mechanisme werkt rechtstreeks in op de stralingsintensiteit door de attenuatie door de waterkolom te verlagen. Het tweede mechanisme werkt via de trofische cascade. Als er minder zooplanktivore vissen aanwezig zijn verlaagt de predatiedruk op het zooplankton en floreert deze gemeenschap. Bijgevolg zal het fytoplankton sterk begraasd worden, met een verlaagde turbiditeit en dus een verhoogde intensiteit van zonne-instraling tot gevolg.

34

Biomanipulatie zorgt enkeI voor het tot stand komen van de heldere toestand; wiI deze persisteren moet hij verder gestabiliseerd worden. Het is hierin dat herkolonisatie van het water door ondergedoken vegetatie cruciaaI is. Characeae zijn in dit verband zeer interessant aangezien zij zeer sneIIe kolonisatoren zijn dankzij hun massale aanwezigheid onder vorm van sporen. Bovendien vormen de meeste Characeae dichte vegetatiematten (sterke sedimentatie van partikeIs) en zijn ze vaak gedurende het voIIedige jaar aanwezig. Van den Bergh et al. (1998) steIden voor om bij biomanipulatie in vijvers waar nooit tevoren Characeae hadden gestaan, propagules te introduceren.

35

MATERIAAL EN METHODEN 3.1 W ATERANALYSE EN SEIZOENALE OPVOLGING VAN DE FOSFAATOPNAME

3.1.1 STAALNAMES Tijdens het jaar 2000 werden elke maand (met uitzondering van juni) stalen genom en in vijver 19bis van natuurreservaat 'de Maten' in Genk. De temperatuur, de pH en de zuurstofconcentratie van het water werden ter plekke gemeten (zie 3.1.2.1). Er werd iedere keer een waterstaal en een bodemstaal (boorkem) genomen. Het waterstaal (ongeveer een liter) werd nabij het oppervlak van de vijver genomen. Het bodemstaal werd genomen met behulp van een PVC-buis en een plastic stop om deze buis afte sluiten. De water- en bodemstalen werden bij aankomst in het laboratorium ingevroren voor latere analyse. Er werden elke maand drie kwadraten van 0,25 m 2 leeggeplukt om de aanwezige Charabiomassa te bepalen. Er werd bovendien telkens voldoende van het wier geoogst om een fosfaatopname-experiment uit te voeren in het laboratorium (zie 3.1.5). Het betreft Chara globularis ThuiIl. var. globularis (Breekbaar kransblad).

3.1.2 WATERANALYSE De wateranalyse gebeurde in samenwerking met Olga Jongeneelen, Wouter Rommens en Pieter Vanormelingen. Er werden standaardmethoden gebruikt uit APHA, A WWA & WPCF (1985).

3.1.2.1 TEMPERATUUR, pH, OPGELOSTE ZUURSTOF EN CONDUCTIVITEIT De temperatuur, de pH en de zuurstofconcentratie van het water werden tijdens de staalname gemeten. Voor de pH en de temperatuur werd hiertoe gebruik gemaakt van een elektronische pHmeter (HI 9025, Hanna instruments). De zuurstofconcentratie (D.O.) van het water werd bepaald met een elektronische zuurstofmeter (HI 9143, Hanna instruments) en werd uitgedrukt in percentage zuurstofverzadiging. AIle andere abiotische waterkenmerken werden bepaald uitgaande van de waterstalen die na elke staalname ingevroren werden (zie 3.1.1). Vlak na de ontdooiing werd de conductiviteit gemeten met een elektronische conductiviteitsmeter (LF 340, WTW instruments). De conductiviteit werd uitgedrukt in /lS em-I.

3.1.2.2 CHLOROFYL Het chlorofyIgehalte, dat in rechtstreeks verband staat met de fytoplanktondensiteit, werd bepaald door chlorofylextractie van het fytoplankton, dat na filtratie van het ontdooide waterstaal over een Millipore filter (1.2 /lm) achterbleef op het filter. De absorbanties bij 630, 645, 665 en 750 nm werden gemeten, na een donkerperiode van ongeveer 24 uur en hieruit werden de concentraties chlorofyI a, b en c berekend. De chlorofylconcentraties werden uitgedrukt in Ilg rl.

37

3.1.2.3 FOSFOR EN NITRAA T Voor elk waterstaal werden SRP, orthofosfaatconcentratie (o-P) en totaalgehalte fosfor (TP) bepaald. Hiertoe werd de ascorbinezuunnethode van Murphey & Riley (1962) toegepast op ongeschud en ongefilterd waterstaal (aIle partikels naar de bodem gezonken) voor het SRP, afgefilterd waterstaal (Milipore 1.2 ~M) voor het o-P en opgeschud, ongefilterd, perchloorzuurverteerd staal voor het TP. AIle fosforconcentraties werden uitgedrukt in ~gP rl. Nitraat werd bepaald met een geautomatiseerde methode (Technikon AutoAnalyzer II). Hierbij wordt het nitraat over een Cu/Cd kolom gereduceerd tot nitriet. Dit nitriet reageert met een kleurreagens tot een paarse verbinding, waarvan de absorbantie bij 520 nm een maat is voor de nitrietconcentratie.

3.1.2.4 VRIJ CO2 EN TOT ALE ALKALINITEIT Het vrij CO 2 gehalte werd titrimetrisch bepaald. Het waterstaal werd getitreerd met NaOH zodat NaHC0 3 wordt gevonnd. De reactie is volledig bij de kleuromslag van fenolfthaleine (pH 8.3). Het gehalte vrij CO 2 werd uitgedrukt in mg rl. Ook de totale alkaliniteit (een maat voor de buffercapaciteit van het water) werd titrimetrisch bepaald door, onmiddeIlijk na de bepaling van het vrij CO 2 gehalte, het staal met HCI te titreren tot de kleuromslag van methyloranje. De gebruikte hoeveelheid HCl is een directe maat voor aIle aanwezige titreerbare basen (vn!. CO/-, HC03- en OW). De alkaliniteit werd uitgedrukt in me rl.

3.1.2.5 OPGELOSTE ORGANISCHE STOF De opgeloste organische stof werd bepaald door in zwavelzuur, kaliumpennanganaat en natriumoxalaat gekookt staal te titreren met kaliumpennanganaat. Het zwavelzuur werd toegevoegd bij het begin van de opwanning, kaliumpennanganaat bij het bereiken van het kookpunt en natriumoxalaat na tien minuten koken. Het gehalte opgeloste organische stof werd uitgedrukt in mg rl.

3.1.2.6 ANDERE ANION EN EN KA TIONEN Het sulfaatgehalte werd bepaald met de geautomatiseerde methylthymolblauw-methode (Technicon AutoAnalyzer III). Het SO/- reageert met bij lage pH met BaCh (slaat neer als BaS04). Het overschot aan Ba2+ reageert na een pH-verhoging met methylthymolblauw tot een blauw chelaat. De hoeveelheid overblijvend ongecheleerd methylthymolblauw (grijs) werd afgelezen en is een maat voor de initiele sulfaatconcentratie. De sulfaatconcentratie werd uitgedrukt in mg rl. Het chloridegehalte werd bepaald door titratie van het staal met zilvemitraat, in aanwezigheid van kaliumchromaat als indicator (kleuromslag). Het zilverchloride slaat kwantitatief neer vooraleer het rode zilverchromaat wordt gevormd. De chlorideconcentratie werd uitgedrukt in mg rl. Er werd uiteindelijk ook de concentratie van een aantal kationen (K+, Ca2+, Na+ en Mg2+) bepaald door de atomaire absorptie te meten. De concentraties werden uitgedrukt in mg rl.

38

3.1.3 BODEMANALYSE De bodemstalen werden voorlopig niet onderzocht.

3.1.4 BEPALING VAN DE AANWEZIGE BIOMASSA EN DE KOOLSTOF-, FOSFOR- EN STIKSTOFCONCENTRA TIE VAN HET GEOOGSTE PLANTENMA TERIAAL Er werden elke maand drie willekeurig geplaatste kwadraten (0,25 m2) leeggeplukt om de aanwezige biomassa kranswieren te kwantificeren (zie 3.1.1). Bij aankomst in het laboratorium werden de geoogste wieren gespoeld om het merendeel van de onzuiverheden weg te halen en werden de stalen gedroogd bij ca. 95°C. Na volledige droging van de stalen werd hun drooggewicht genoteerd. De biomassa werd uitgedrukt per oppervlakte-eenheid (g DW m-2). De fosforconcentratie van het plantenmateriaal werd colorimetrisch bepaald (Murphey & Riley, 1962) na veras sing (5 uur bij 550°C) van het staal en zoutzuurdigestie van de as. De stikstofconcentratie werd bepaald volgens Kjeldahl (1883). De koolstofconcentratie werd berekend uit het verschil tussen het drooggewicht en het asvrij drooggewicht na 5 uur verassing bij 550°C. De fosfor-, koolstofen stikstofconcentraties werden uitgedrukt in mmol (g DWrl.

3.1.5 METING VANDE FOSFAATOPNAME 3.1.5.1 PREINCUBA TIE Tijdens elke staalname (zie 3.1.1) werd voldoende Chara meegebracht om een fosfaatopnameexperiment uit te voeren. Het plantenmateriaal werd bij aankomst in het laboratorium grondig gespoeld met leidingwater om onzuiverheden en het grootste gedeelte van het epifyton te verwijderen. Daama werd het plantenmateriaal tot de volgende morgen gei"ncubeerd in A.P.W. (Artificial Pond Water), gebufferd met MES op pH 6,5 (bij benadering de pH die he erst in vijver 19bis - zie appendix 1 voor de samenstelling van het A.P.W.) en in een kweekkamer geplaatst (T = 18°C, 14 uur licht - 10 uur donker).

3.1.5.2 HET OPNAME-EXPERIMENT De fosfaatopname van de thalli werd gemeten in zuurgewassen glazen cuvetten van 100 ml (gevuld met 80 ml medium). De fosfaatopname werd gemeten in een A.P.W. gebufferd op pH 6,5 met MES-buffer (appendix 1) bij fosforconcentraties 0, 100,200, 500, 1000,2000, 5000 en 10000 !lgP rl. Van elke conditie werden drie replica's voorzien. De depletie van de fosfaatconcentratie in de incubatiecuvetten werd gevolgd door regelmatig een kleine hoeveelheid medium te verwijderen en hiervan de resterende fosfaatconcentratie te bepalen met de fosfomolybdaatmethode van Murphy & Riley (1962). De opname-experimenten gebeurden in een kweekkamer om gedurende het experiment een relatief con stante temperatuur (± 18°C) en lichtintensiteit (± 17300 lux) te behouden. Na afloop van het experiment (voldoende fosfaatdepletie) werden de gebruikte thalli gedroogd bij ca. 95°C gedurende ongeveer 3 dagen en werd het drooggewicht opgetekend.

39

3.1.5.3 VERWERKING VAN DE GEGEVENS VAN DE FOSFAATOPNAME-EXPERIMENTEN De afnemende fosfaatconcentraties in het medium werden vermenigvuldigd met het cuvetvolume om de overblijvende hoeveelheid fosfor in de cuvet te bepalen en werden daarna gedeeld door de hoeveelheid plantenmateriaal (g DW). De resulterende gegevens werden voor elke replica apart uitgezet tegenover de tijd en de opnamesnelheid (dit is het complement van de richtingscoeffici'ent van de regressierechte), die quasi constant bleek gedurende de relatief korte duur van de experimenten, werd aldus voor elke replica apart berekend. De initiele fosforconcentraties werden in deze regressies niet gebruikt om de hoge initiele opnamesnelheid door absorptie aan de celwanden niet in rekening te brengen. Met de opnamesnelheden werden zowel Michaelis-Menten, Eadie-Hofstee als Hanes-Woolf plots gemaakt. Op basis van hyperbolische curve-fits door de datapunten uit de Michaelis-Menten plots (enkel de datapunten uit het concentratiebereik tussen 0 en 2000 IlgP I-I werden gebruikt) werden de kinetische constanten Km en V max van de fosfaatopname bepaald. Voor de motivaties in verband met deze werkwijzen wordt verwezen naar de discussie (cf. 6.2). Deze methode werd gebruikt voor aile fosfaatopname-experimenten die aan bod komen in deze scriptie, al werden soms geen Michaelis-Menten curve-fits gemaakt.

3.1.6 WATERKWALITEIT EN SEIZOENALE FOSFAATOPNAME: GEGEVENSVERWERKING

De gegevens van de wateranalyse en de fosfaatopname-experimenten werden, samen met de door Olga Jongeneelen verzamelde gegevens over de epifytenflora op de kranswiervegetatie, samengebracht in een gegevenstabel. Vanaf de maand juli werden ook de stikstof- en fosforgehaltes van het plantenmateriaal gemeten. Van aile gegevens van de maanden juli tot december werd nog een extra tabel gemaakt. Tijdens de bepaling van het stikstofgehaite van het plantenmateriaal voor de maand juli is een fout gebeurd, waardoor dit gegeven niet bruikbaar was. In de gegevenstabel werd het stikstofgehaite van de maand augustus ook ingevuld voor de maandjuli. Op de resulterende tabellen werden een aantal exploratieve principaaIcomponentanalysen (PCA) uitgevoerd. Verdere uitdieping van patronen gebeurde met Pearson en Spearman rank correlatieanalysen. Aile analyses gebeurde met STATISTICA 4.1 (StatSoft, Inc.).

3.2 DE INVLOED VAN NA+ EN K+ OP DE FOSFAATOPNAME

3.2.1 INLEIDING Reid et al. (2000) vonden bij Chara corallina een sterke stimulatie van de fosfaatopname door Na+ (cf. 2.4.1.3), werden ook met Chara globularis een aantal experimenten uitgevoerd om een eventuele gelijkaardige stimulatie te bevestigen of te ontkennen. In twee inleidende experimenten werd, naast de maandelijkse opnamemeting (cf. 3.1.5) een extra opnamemeting gedaan waarin fosfaat werd toegediend als NaH 2P04 in plaats van K3P04 . Er werd ook of er verschillen waren in opnamesnelheid 40

bij incubatie in verschillende Na+ concentraties (0, 1, 2, 3 en 5 mM). Dit experiment werd later herhaald om de invloed van een vijf dagen durende natriumuithongering van het plantenmateriaal na te gaan. Uiteindelijk werd nog een bijkomend experiment uitgevoerd met prelncubatie en opnamemeting bij verschillende Na+ en K+ concentraties.

3.2.2 INLEIDENDE EXPERIMENT EN

3.2.2.1 PLANTENMATERIAAL De opname-experimenten uit deze inleidende experimenten verliep volledig parallel met de opname-experimenten voor de seizoenale opvolging (maanden november en december). Het plantenmateriaal heeft dan ook dezelfde oorsprong (cf. 3.1). De behandeling en prelncubatie van de planten gebeurde zoals beschreven in 3.1.5.1.

3.2.2.2 HET OPNAME-EXPERIMENT De snelheid van fosfaatopname werd gemeten bij pH 6.5 en bij exteme fosfaatconcentraties 0, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 en 10000 flgP rl. In de eerste conditie werd fosfaat toegediend als K 3P0 4 (cf. 3.1.5), in de tweede conditie als NaH2P0 4 . De opname werd gemeten zoals beschreven in 3.1.5.2.

3.2.2.3 VERWERKING VAN DE GEGEVENS Op de bekomen resultaten werd, zowel voor de resultaten van november als december, tweewegs ANOV A uitgevoerd met conditie (fosfaattoediening als natrium- of als kaliumzout) en [Pi]medium als onafhankelijke variabelen en opnamesnelheid als afhankelijke variabele. Voor elke maand apart werden bovendien de bekomen kinetische parameters Km en Vmax vergeleken met behulp van een t-test.

3.2.3 INVLOED VAN DE NATRIUMCONCENTRATIE

3.2.3.1 PLANTENMATERIAAL Het gebruikte plantenmateriaal voor beide stimulatie-experimenten was afkomstig uit vijver 19bis van natuurreservaat 'de Maten' te Genk. Het betreft Chara globularis Thuil. var. globularis (Breekbaar kransblad). De oogst van het plantenmateriaal gebeurde op 12 oktober 2000. De opname-experimenten gebeurden nadat het plantenmateriaal enkele weken de kans had gekregen zich aan te passen aan de laboratoriumomstandigheden.

41

3.2.3.2 HET OPNAME-EXPERIMENT Er waren in beide experimenten vijfverschillende condities (0,1,2,3 en 5 mM Na+). Na+ werd toegevoegd als NaC\; KCI, CaCh en MES-buffer werden toegediend zoals in het standaard gebruikte APW-medium (appendix 1). De media werden op pH 6.5 gebracht met KOH. Voor elk van de condities werd de fosfaatopname gemeten bij een initiele fosforconcentratie van 500 IlgP r 1, met 5 replica's per conditie. Fosfaat werd toegediend als K 3P04 . Voor het experiment zonder voorafgaande natriumuithongering werd het plantenmateriaal gedurende een nacht in standaard APW op pH 6.5 gepre'incubeerd. Voor het experiment met natriumuithongering werd het plantenmateriaal vijf dagen voor het opname-experiment in een natriumloos APW -medium gebracht. Het pre'incubatiemedium werd op de derde dag van de pre'incubatie vervangen.

3.2.3.3 GEGEVENSVERWERKING Er werd een gepaarde t-test uitgevoerd op de opnamesnelheden te vergelijken tussen de condities met en zonder natriumuithongering.

3.2.4 STIMULATIE VAN DE FOSFAATOPNAME DOORNA+ EN K+

3.2.4.1 PLANTENMA TERIAAL Het plantenmateriaal (Chara globularis Thuillier var. globularis - Breekbaar kransblad) die voor dit experiment gebruikt werd is afkomstig uit natuurreservaat 'de Maten' te Genk (vijver 19bis) en werd geoogst op 19 januari 2001. Het werd bij aankomst in het laboratorium gespoeld en ontdaan van onzuiverheden. Het plantenmateriaal kreeg de kans zich enkele weken aan te passen aan de laboratoriumomstandigheden (incubatie in standaard APW).

3.2.4.2 DE VERSCHILLENDE CONDITIES Er werden experimenten gedaan bij verschillende Na+ en K+ concentraties. Er werd gekozen voor twee verschillende K+ (0.125 en 1.25 mM) concentraties en, hiermee in combinatie, 3 Na+ concentraties (0, 1 en 5 mM). De planten voor de condities 1 tot 6 werden vier dagen voor de aanvang van het opname-experiment gepre'incubeerd bij de omstandigheden van het opname-experiment, maar dan zonder fosfor. Voor de condities 7 tot 12 werden de p1anten even lang gepre'incubeerd, maar allemaal onder dezelfde Na+ en K+ regimes. Tabel A.3.2 in appendix 3 vat de condities samen. ABe incubaties gebeurden in een kweekkamer bij een nagenoeg con stante temperatuur (ongeveer 18°C) en een dagnacht ritme van 14 uur licht en 10 uur donker.

3.2.4.3 HET OPNAME-EXPERIMENT De fosfaatopname werd gemeten in zuurgewassen glazen cuvetten van 100 ml (gevuld met 80 ml medium). Voor elk van de condities werd de fosfaatopname van de planten gemeten bij een initiele fosforconcentratie van 775 IlgP rl. Van elke conditie werden drie replica's voorzien. De depletie van 42

de fosfaatconcentratie in de incubatiecuvetten werd gevold door regelmatig een kleine hoeveelheid medium te verwijderen en hiervan de resterende fosfaatconcentratie te bepalen met de fosfomolybdaatmethode (Murphy & Riley, 1962). De opname-experimenten gebeurden in een kweekkamer om gedurende het experiment een relatief constante temperatuur (± 18°C) en lichtintensiteit (± 17300 lux) te behouden. Voordat de planten in het opnamemedium werden geplaatst, werden ze gespoeld in gedesioniseerd water.

3.2.4.4 METING VAN DE pH GEDURENDE HET OPNAME-EXPERIMENT Gedurende het experiment werd een aantal maal de pH van het medium van elke replica gemeten (HI 9025, Hanna instruments).

3.2.4.5 VERWERKING VAN DE GEGEVENS Er werd een volledige gegevensset samengesteld met voor elke replica de [Na+]medium, [K+]medium, gebruikte biomassa, preYncubatieregime, pH-stijging gedurende het opname-experiment en depletiesnelheid. Hierop werd een exploratieve factoranalyse (PCA) uitgevoerd. Gebruik makende van dezelfde gegevensset werden eventuele globale effecten van enkele van de variabelen op de opnamesnelheid gezocht (eenwegs ANOVA). De gebruikte variabelen zijn [Na+]medium, [K+]medium en preYncubatieregime. Er werd ook tweewegs ANOVA uitgevoerd met [K+]medium en preYncubatieregime als onafhankelijke en opnamesnelheid als afhankelijke variabele. Er werd een Mann-Whitney U test uitgevoerd om de condities met toevoeging van 0 mM Na+ te vergelijken met die waar 1 mM Na+ werd toegevoegd.

3.3

OPNAME-EXPERIMENTEN VAN ZEER KORTE DUUR

In een poging de aard van het transmembranair transport te achterhalen (proton- of natriumgemedieerd), werden een aantal opname-experimenten van zeer korte tijdsduur uitgevoerd. In de experimenten was een zeer grote hoeveelheid biomassa aanwezig in het opnamemedium en was de initiele fosfaatconcentratie hoog, zodat eventuele veranderingen in natriumconcentratie of pH ten gevolge van fosfaatopname merkbaar zouden zijn.

3.3.1 HET PLANTENMA TERIAAL Het plantenmateriaal (Chara globularis Thuill. var. globularis - Breekbaar kransblad) werd geoogst op 11 maart 2001 uit vijver 19bis van 'De Maten'. Het werd op de gebruikelijke manier gespoeld en ontdaan van onzuiverheden (cf. 3.1.5.1) en geYncubeerd in standaard APW gebufferd op pH 6 (zie appendix 1).

43

3.3.2 DE OPNAME-EXPERIMENTEN

De opname-experimenten gebeurden in zuurgewassen erlenmeyers (250 ml). Hierin was een klein compartiment afgescheiden van de grote, er boven liggende watermassa, door een geplastificeerd metaalgaas. Hierdoor kon het medium constant worden opgeschud met behulp van een magnetische roerstaaf, zonder schade toe te brengen aan het plantenmateriaal. Wegens tijdsgebrek bleven deze experimenten in een erg verkennende fase. Er werden in totaal 6 experimenten uitgevoerd, waaronder enkele in gebufferd en enkele in ongebufferd medium, enkele bij 1 mM Na+ en enkele bij 0.4 mM Na+. De planten werden in het opnamemedium gebracht voordat hier fosfaat aan toegevoegd werd. De menging van het medium werd op gang gebracht en het systeem werd toegelaten (gedurende ongeveer een uur) te stabiliseren. Na stabilisatie van de pH werd een fosfaatoplossing (KH 2 P04 ) toegediend zodat de fosfaatconcentratie van het opnamemedium 2000 ~gP rl bedroeg. Deze fosfaatoplossing werd op dezelfde pH gebracht dan de pH van het opnamemedium na stabilisatie, zodat de toevoeging geen invloed zou hebben op de pH. De fosfaatoplossing werd in het onderste compartiment van de erlenmeyer gebracht met behulp van een pasteurpipet. Dit verzekert een zeer snelle (minder dan een seconde) en efficiente menging (werd getest met een gekleurde vloeistof). Op welbepaalde tijdstippen (tabel A.3.4 uit appendix 3) werd de pH van het opnamemedium afgelezen en werd een gedeelte van het opnamemedium weggenomen voor analyse van de natrium- en de fosfaatconcentratie. De fosfaatconcentratie werd bepaald met de methode van Murphy & Riley (1962) en de natriumconcentratie werd bekomen door atomaire absorptiespectrometrie.

3.4

INVLOED VAN DE

pH OP DE PI-OPNAME

3.4.1 INLEIDING

De pH-experimenten werden uitgevoerd met twee soorten: Chara globularis Thuil. var. globularis (Breekbaar kransblad) (in wat voigt kortweg Chara) en Nitellajlexilis (L.) Agardh (Buigzaam glanswier) (in wat voigt kortweg Nitella). Voor Chara werd het pH-experiment tweemaal uitgevoerd, een eerste maal zonder langdurige preYncubatie bij de pH waarbij de opnamemeting zou gebeuren en een tweede maal waarbij wei zo'n preYncubatie voorafging aan het experiment. Voor Nitella kon, wegens een probleem met de cultuur ervan, enkel een experiment zonder voorafgaande preYncubatie worden gedaan. De pH's waarbij de fosfaatopname werd gemeten zijn 5, 6, 7, 8 en 9.

3.4.2 HET PLANTENMATERIAAL

De Chara gebruikt voor de experimenten is allemaal afkomstig uit natuurreservaat 'de Maten' te Genk (vijver 19bis). De Nitella is afkomstig uit een prive-vijver in Heestert (Zwevegem). Voor het experiment met Chara zonder langdurige preYncubatie (kortweg Czp) werd plantenmateriaal geoogst op 20 januari 2001. Het experiment werd uitgevoerd op 1 februari 2001. Voor het experiment met Chara met langdurige preYncubatie (kortweg Cmp) werd plantenmateriaal geoogst op 11 maart 2001 en het experiment werd uitgevoerd op 22 maart 2001 (na 11 dagen preYncubatie bij de verschillende 44

pH's). Nitella werd geoogst op 20 februari 2001 en het opname-experiment werd voltrokken op 22 februari 2001. Het plantenmateriaal werd op de gebruikelijke manier gespoeld en ontdaan van afvalresten.

3.4.3 PREINCUBA TIEREGIMES Voor de experimenten zonder langdurige prei"ncubatie bij de verschillende pH's werd het plantenmateriaal ongeveer 14 uur voor de aanvang van het opname-experiment gelncubeerd bij die pH waarbij ook de meting zou verlopen. De samenstelling van de verschillende APW-media, inclusief de gebruikte buffers, is te vinden in appendix 1. Voor de experimenten met langdurige prelncubatie bij de verschillende pH's werden dezelfde media gedurende langere tijd (11 dagen voor Cmp) gebruikt. De media werden tijdens de prei"ncubatieperiode dagelijks op pH gebracht (indien nodig) en driedagelijks vervangen. Aile incubaties gebeurden in een kweekkamer bij een nagenoeg con stante temperatuur (ongeveer 18°C) en een dag-nacht ritme van 14 uur licht en 10 uur donker.

3.4.4 FOSFAA TOPNAME-EXPERIMENTEN De fosfaatopname werd gemeten in zuurgewassen glazen cuvetten van 100 ml (gevuld met 80 ml medium). Voor elk van de vijfprelncubatieregimes (pH 5,6, 7, 8 en 9) werd de fosfaatopname van de planten gemeten onder vier condities, namelijk bij een initiele fosforconcentratie van 0, 150, 500 en 2000 /lgPll (zie tabel A.3.3 in appendix 3 voor de exacte samenstellingen). Van elke conditie werden drie replica's voorzien. De depletie van de fosfaatconcentratie in de incubatiecuvetten werd gevold door regelmatig een kleine hoeveelheid medium te verwijderen en hiervan de resterende fosfaatconcentratie te bepalen met de fosfomolybdaatmethode (Murphy & Riley, 1962). De opname-experimenten gebeurden in een kweekkamer om gedurende het experiment een relatief con stante temperatuur (± 18°C) en lichtintensiteit (± 17300 lux) te behouden.

3.4.5 METING VAN DE pH GEDURENDE HET EXPERIMENT Tijdens de incubatieperiode van het plantenmateriaal voor Crop werd de pH van het incubatiemedium dagelijks opgemeten om de adaptatie van het plantenmateriaal na te gaan (HI 9025, Hanna instruments ). Gedurende het opname-experiment werd een aantal maal de pH van het medium gemeten.

3.4.6 VERWERKING VAN DE GEGEVENS Voor elk van de experimenten werd een gegevenstabel opgesteld met hierin de gemiddelde opgemeten pH-waarde, de pH-stijging gedurende het experiment, [Na+]medium, de gebruikte biomassa, de fosforconditie (0, 150,500 of2000 /lgP rI) en de snelheid van fosfaatopname.

45

Op deze gegevenstabel werd telkens een exploratieve factoranalyse (PCA) uitgevoerd. Er werd tweewegs ANOV A uitgevoerd met fosfaatconcentratie in het opnamemedium en pH-conditie als onafhankelijke variabelen en opnamesnelheid als afhankelijke variabele.

3.5 SNELHEID VAN DE RESPONS BIJ FOSFORUITHONGERING 3.5.1 HET PLANTENMATERIAAL Er werd tweemaal een experiment uitgevoerd om na te gaan of een pre'incubatie van ongeveer 14 uur in fosforloos medium een invloed heeft op de snelheid van fosfaatopname. Deze experimenten liepen steeds gelijk met het experiment van de +P conditie van het Chara fosforverzadigingsexperiment (zie later). Het plantenmateriaal is dan ook identiek.

3.5.2 DE PREINCUBATIECONDITIES EN DE OPNAME-EXPERIMENTEN De achtergrond van het plantenmateriaal is hetzelfde dan dat van de +P conditie van het Chara fosforverzadigingsexperiment. De experimenten werden uitgevoerd op dag 21 (12 maart) en dag 28 (19 maart) na de start van de incubatie. Naast het gewone opname-experiment voor de +P conditie van het Chara fosforverzadigingsexperiment werd een conditie gecreeerd waarbij het plantenmateriaal niet ovemacht gepre'incubeerd wordt in fosforloos APW maar in fosforbevattend medium (1.5 mgP rl, zoals in de incubatie (cf. 3.7.4)). Voordat het opname-experiment gestart werd, werden de planten afgespoeld in standaard APW om zoveel mogelijk aangehecht fosfor te verwijderen. De snelheid van fosfaatopname werd gemeten bij 750 ~gP rl. Er waren in het eerste experiment drie en in het tweede experiment vijfreplica's van elke conditie. De methode uit 3.1.5.2 werd gevolgd.

3.5.3 VERWERKING VAN DE GEGEVENS am de opnamesnelheden van beide condities met elkaar te vergelijken werd een ongepaarde t-test uitgevoerd.

3.6 HET eBARA-ELODEA EXPERIMENT 3.6.1 INLEIDING Teneinde de verschiIlende groeistrategieen van Chara en Elodea te koppelen aan hun fosfaatopnamegedrag werd de fosfaatopname van beide so orten opgevolgd gedurende een nutrientaanrijkings- en -uithongeringsexperiment.

46

3.6.2 HET PLANTENMA TERIAAL De gebruikte soorten zijn Elodea nutallii (Planeh.) St John (Smalle waterpest) en Chara globularis Thuillier var. globularis (Breekbaar kransblad), in wat voIgt kortweg Elodea en Chara. De Elodea werd verzameld uit een van de bomkraters uit natuurreservaat 'Vorsdonkbos-Turfputten' te Gelrode (Aarsehot). Aangezien in de bomkraters onvoldoende Chara aanwezig was om het experiment te starten werd gekozen om plantenmateriaal van deze soort te gebruiken uit natuurreservaat 'de Maten'te Genk (vijver 19bis). Al het plantenmateriaal werd verzameld op 19 januari 2001 (in wat voIgt dag 0). Bij aankomst in het laboratorium werd het plantenmateriaal ontdaan van dode plantenresten en meermaals gespoeld onder strom end leidingwater.

3.6.3 ANALYSE VAN DE NUTRITIONELE OORSPRONG VAN RET PLANTENMA TERIAAL Er werd onmiddellijk een gedeelte van het plantenmateriaal gedroogd bij ongeveer 95°C voor analyse van de nutrientensamenstelling (totaalgehalte N en P - zie 3.6.6). Er werd ook, bij verzameling van het plantenmateriaal, een waterstaal genomen uit de vijver voor analyse in het laboratorium.

3.6.4 DE INCUBA TIEREGIMES Nadat de planten gewassen waren werd Elodea gefragmenteerd wegens de onhandelbaarheid van stijve stengels langer dan ongeveer 5 em. Al het plantenmateriaal werd dan getneubeerd bij de versehillende nutrientenregimes. Voor elk van de soorten was er een fosfaatloos (kortweg i-P) en een fosfaatbevattend (kortweg i+P) regime. Deze regimes worden in wat voIgt afgekort door Ci-P en Ci+P voor Chara en door Ei-P en Ei+P voor Elodea. De exaete samenstelling van de ineubatiemedia is weergegeven in tabel 3.1. Het medium werd tweedagelijks vervangen. Vanaf dag 26 van het experiment werden de ineubatieregimes veranderd. De i-P eondities kregen vanaf dan fosfaatrijk en de i+P eondities fosfaatloos medium (zie tabel 3.1 voor de samensteling). Het regime werd een laatste maal herzien op dag 31 van het experiment. In de i-P eondities werd de relatieve abundantie fosfaat verder opgedreven. De fosfaatloze ineubatieregimes bleven onveranderd.

Tabel3.1 De index 1 staat voor het ineubatieregime van dag 0 t.e.m. dag 25, de index 2 voor het regime van dag 26 t.e.m. dag 30 en de index 3 voor het regime van dag 31 tot de afloop van het experiment. De incubatiemedia werden op pH 6 gebracht met NaOH en He!. Er werd geen buffersubstantie toegevoegd.

regime i+P 1 i-P 1 i+P 2 i-P 2 i+P3 i-P3

NaCI

CaCb

KCI

NaN03

Na2HP04

[N031

[Pi]

(mM)

(mM)

(mM)

(uM)

(uM)

(uM)

(mqNII)

(UqPII)

1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

357 357 178 178 178 178

22.7 0 0 22.7 0 45.4

1.45 0 0 1.45 0 2.90

5 5 2.5 2.5 2.5 2.5

750 0 0 750 0 1500

NaH 2 P04

47

Alle incubaties gebeurden in een kweekkamer bij een nagenoeg con stante temperatuur (ongeveer 18°C) en een dag-nacht ritme van 14 uur licht en 10 uur donker.

3.6.5 FOSFAATOPNAME-EXPERIMENTEN Er werden opname-experimenten gedaan op de dagen 1,3, 6, 10, 16,26, 31 en 35 van het experiment. Voor Elodea werd nog een bijkomend experiment gedaan op dag 44. Ongeveer 14 uur voor de aanvang van elk opname-experiment werd een gedeelte van het plantenmateriaal gei'ncubeerd in nitraat- en fosfaatloos APW medium (MES gebufferd, pH 6 - zie appendix 1). Het opnameexperiment van dag 1 geeft de fosfaatopname van de planten weer voordat ze nutrientenbehandeling ondergingen. Hiertoe werd na het was sen van het plantenmateriaal op dag 0 dadelijk plantenmateriaal gei'ncubeerd in het nitraat- en fosfaatloos APW medium. De fosfaatopname werd gemeten in zuurgewassen glazen cuvetten van 100 ml (gevuld met 80 ml medium). Voor elk van de vier prei'ncubatieregimes werd de fosfaatopname van de planten gemeten onder drie condities, namelijk bij een initiele fosforconcentratie van 200, 750 en 2000 /lgP rl (zie tabel A.3.5 in appendix 3 voor de exacte samenstellingen). Van elke conditie werden drie replica's voorzien. De depletie van de fosfaatconcentratie in de incubatiecuvetten werd gevold door regelmatig een kleine hoeveelheid medium te verwijderen en hiervan de resterende fosfaatconcentratie te bepalen met de fosfomolybdaatmethode (Murphy & Riley, 1962). De opname-experimenten gebeurden in een kweekkamer om gedurende het experiment een relatief con stante temperatuur (± 18°C) en lichtintensiteit (± 17300 lux) te behouden. Na afloop van het experiment (voldoende fosfaatdepletie) werden de gebruikte thalli gedroogd bij ca. 95°C gedurende ongeveer 3 dagen en werd het drooggewicht opgetekend.

3.6.6 OPVOLGING VAN DE N- EN DE P-STATUS VAN DE PLANTEN Om de fosfor- en de stikstofstatus in de planten op te volgen werden, elke keer de planten geprei'ncubeerd werden voor een opname-experiment, een aantal scheuten gedroogd (± 95°C). Van dit gedroogd plantenmateriaal werd achteraf het totaalgehalte P en N bepaald zoals beschreven in 3.1.4.

3.7.7 VERWERKING VAN DE GEGEVENS Er werd een gegevenstabel samengesteld met daarin voor elke individuele replica de dag van het experiment, de incubatieconditie (+P of -P), de fosfaatconditie (200, 750 of2000 /lgP r 1), de snelheid van fosfaatopname, de gebruikte biomassa in het opname-experiment en de nutrientenverhoudingen C:P, C:N en N:P. Op deze gegevenstabel werd een exploratieve factoranalyse uitgevoerd (PCA). Er werden een aantal correlatie-analysen gedaan om de trends die uit de biplot naar voren kwamen uit te diepen. Omdat de N:P verhouding in grote mate door het P-gehalte werd bepaald, werd ook een correlatie gezocht tussen het stikstofgehalte van het plantenmateriaal en de snelheid van fosfaatopname.

48

3.7

BET CHARA FOSFORVERZADIGINGSEXPERIMENT

3.7.1 INLEIDING

Uit het Chara-Elodea experiment kon niet worden afgeleid of Chara een bovenlimiet van interne fosforconcentratie had. Het is echter onwaarschijnlijk dat plantenmateriaaI fosfor kan blijven accumuleren. Er werd, om na te gaan of Chara niet toch zulk een bovengrens heeft, een bijkomend experiment uitgevoerd met zeer vee I gelijkenis aan het Chara-Elodea experiment maar dan enkel met Chara en met drastischere incubatieregimes.

3.7.2 HET PLANTENMATERIAAL Chara globularis ThuiIlier var. globularis (Breekbaar kransblad) werd geoogst uit natuurreservaat 'de Maten' te Genk (vijver 19bis) op 19 februari 2001. Bij aankomst in het laboratorium werd het plantenmateriaal ontdaan van dade plantenresten en meermaals gespoeld onder stromend leidingwater.

3.7.3 ANALYSE VAN DE NUTRITIONELE OORSPRONG VAN HET PLANTENMATERIAAL

Er werd onmiddeIlijk een gedeelte van het plantenmateriaal gedroogd bij ongeveer 95°C voor analyse van de nutrientensamensteIling (totaaIgehalte N en P - zie 3.7.6). Er werd ook, bij verzameling van het plantenmateriaal, een waterstaal genomen uit de vijver voor analyse in het laboratorium.

3.7.4 DE INCUBATIEREGIMES

Het plantenmateriaal werd geincubeerd bij 0 f.!gP rl voor de -P conditie en bij 1,5 mgP rl voor de +P conditie. Het betreft telkens ongebufferd APW (appendix J) op pH 6 met daarin al dan niet fosfaat (mengsel van NaH2P04 en Na2HP04). De natriumconcentratie werd constant gehouden tussen de condities door minder NaCl toe te voegen in de +P conditie. Er werd voor beide regimes 2.5 mgN rl toegevoegd als NaN0 3 . AIle incubaties gebeurden in een kweekkamer bij een nagenoeg constante temperatuur (ongeveer 18°C) en een dag-nacht ritme van 14 uur licht en 10 uur donker. De incubatiemedia werden dagelijks vervangen.

3.7.5 FOSFAATOPNAME-EXPERIMENTEN

Er werden opname-experimenten gedaan op de dagen 1, 4, 14, 21 en 28 van het experiment. Ongeveer 14 uur voor de aanvang van elk opname-experiment werd een gedeelte van het plantenmateriaal geincubeerd in nitraat- en fosfaatloos APW medium (MES gebufferd, pH 6 - zie appendix J). Het opname-experiment van dag 1 geeft de fosfaatopname van de planten weer voordat ze nutrientenbehandeling ondergingen. Hiertoe werd na het wassen van het plantenmateriaal op dag 0 dadelijk plantenmateriaal geincubeerd in het nitraat- en fosfaatloos APW medium.

49

De fosfaatopname werd gemeten in zuurgewassen glazen cuvetten van 100 ml (gevuld met 80 ml medium). Voor elk van de prelncubatieregimes werd de fosfaatopname van de planten gemeten bij 750 IlgP rl (zie tabel A.3.5 (middelste rij) in appendix 3 voor de exacte samenstellingen). Van elke conditie werden drie replica's voorzien. De depletie van de fosfaatconcentratie in de incubatiecuvetten werd gevold door regelmatig een kleine hoeveelheid medium te verwijderen en hiervan de resterende fosfaatconcentratie te bepalen met de fosfomolybdaatmethode (Murphy & Riley, 1962). De opname-experimenten gebeurden in een kweekkamer om gedurende het experiment een relatief con stante temperatuur (± 18°C) en lichtintensiteit (± 17300 lux) te behouden. Na afloop van het experiment (voldoende fosfaatdepletie) werden de gebruikte thalli gedroogd bij ca. 95°C gedurende ongeveer 3 dagen en werd het drooggewicht opgetekend.

3.7.6 OPVOLGING VAN DE N- EN DEP-STATUS VAN DE PLANTEN Om de fosfor- en de stikstofstatus in de planten op te volgen werden, elke keer de planten gepre'incubeerd werden voor een opname-experiment, een aantal scheuten gedroogd (± 95°C). Van dit gedroogd plantenmateriaal werd achteraf het totaalgehalte P en N en het prote'inegehalte bepaald zoals beschreven in 3.104.

3.7.7 VERWERKING VAN DE GEGEVENS Er werd een gegevenstabel samengesteld met daarin voor elke individuele replica de dag van het experiment, de incubatieconditie (+P of -P), de snelheid van fosfaatopname, de gebruikte biomassa in het opname-experiment en de nutrientenverhoudingen C:P, C:N en N:P. Op deze gegevenstabel werd een exploratieve factoranalyse uitgevoerd (PCA). Er werden een aantal correlatie-analysen gedaan om de trends die uit de biplot naar voren kwamen uit te diepen. Omdat de N:P verhouding in grote mate door het P-gehalte werd bepaald, werd ook een correlatie gezocht tussen het stikstofgehaite van het plantenmateriaal en de snelheid van fosfaatopname.

50

RESULTATEN 4.1 KINETICA VAN DE FOSFAATOPNAME Voor de fosfaatopname van Chara werden zeer typische Michaelis-Menten scatterplots waargenomen (zie figuur 4.1 voor een voorbeeld). De fosfaatopname voIgt een typisch patroon tot bij de fosfaatconcentratie 2000 f.lgP 1-1• Vanaf de volgende concentratie (5000 f.lgP r1) worden duidelijk lagere snelheden van fosfaatopname waargenomen. Dit is waarschijnlijk een gevolg van de inhibitie van het hoge-affiniteits opnamesysteem bij hogere externe fosfaatconcentraties (cf. 5.2). Voor het weergegeven voorbeeld in de figuur is er een terugval van de snelheid van fosfaatopname bij deze hoge concentraties. In andere gevallen was het lage-affiniteitssysteem in veel hogere mate werkzaam en lagen de opnamesnelheden bij 5000 en 10000 f.lgP r1 hoger dan die uit het 0-2000 f.lgP r1 bereik. De kinetische constanten Km en V max werden berekend door een hyperbolische functie door het bereik 0-2000 f.lgP r1 te fitten. In figuur 4.1 is een voorbeeld weergegeven. Voor een tweefazig opnamesysteem moet normaalgezien de som van twee hyperbolen worden gefit. Dit resulteerde echter vaak in negatieve Km-waarden, wat onzinnig is. In de plaats hiervan werd verkozen 'gewone' Michaelis-Menten kinetische curven te gebruiken, wat een zeer goede benadering biedt voor het bereik 0-2000 f.lgP r1 (cf. 5.2). Voor verdere gegevensanalyse werd de opnamesnelheid bij 5000 f.lgP r1 gebruikt als maat voor de activiteit (en de mate van aanwezigheid) van de lage-affiniteits transporter.

'0

'w

.<:

Qi

.~ E

c:

~ "E'" 0

4.0

4.0

3.5

3.5

3.0

"0

'.r:::w 1:E

3.0

2.5

Qi

'"'" 0~ E .g '"t::o.. c.",

2.5

t::

2.0

.g

c:" 'c.", 0..

1.5

°3

1.0

°3

0.5

2.0 1.5 1.0 0.5

0.0

0.0 0

1000 2000

3000 4000

5000

6000

7000

8000

[Pi]medium (~gP 1"')

9000 10000 11000

250

500

750

1000

1250

1500

1750

2000

2250

[Pi]medium (~gP 1"')

Figuur 4.1 Voorbeeld van een Michaelis-Menten plot van de fosfaatopnamesnelheden bij Chara g/obularis. De linkergrafiek geeft het volledige bereik van de gebruikte fosfaatconcentraties weer en toont de afnemende opnamesnelheid boven 2000 j.JgP 1-1" De rechtergrafiek toont, voor dezelfde gegevens, het bereik 0-2000 j.JgP 1-1 met de hyperbolische curve fit erdoor. De kinetische constanten zijn, voor dit voorbeeld, Km = 285 j.JgP ,-1 en Vmax =3.7 j.JgP (g DWr1 min-1 (in de figuur aangeduid met stippellijnen).

4.2 SEIZOENALE OPVOLGING 4.2.1 EXPLORATIEVE ANALYSE De gegevens over de maandelijkse fosfaatopname zijn terug te vinden in tabel A.4.1 uit appendix 4. Tabellen A.4.2 en A.4.3 tonen de gegevenstabellen gebruikt voor respectievelijk biplot 1 en 2 (zie verder).

51

Pagina hiertegenover: Figuur 4.3 Seizoenaal verloop van de meeste van de opgemeten variabelen. Voor de figuur met de chlorofylgehalten: - . - : chlorofyl a; ___ .A. ___ : chlorofyl b; - -T- -: chlorofyl c. Voor de figuur met de fosforconcentraties: ___ .A. ___ : orthofosfaat; - . - : totaal fosfaat.

Op de gegevens over de seizoenale opvolging van de waterkwaliteit, de plantenbiomassa en de fosfaatopname werden een aantal principaalcomponentanalyses (peA) uitgevoerd. Biplot 1 (figuur 4.2 en tabel Ao4o4 uit appendix 4) bevat de gegevens van februari tot december. Aangezien vanaf juli gegevens zijn verzameld over het fosfor- en stikstofgehalte van het plantenmateriaal en de fosfaatopname vanaf toen ook minder willekeurig verloopt dan in de maanden ervoor (zie figuur 4.3 en bespreking in 6.3), werd een tweede biplot geconstrueerd (figuur 404 en tabel A.4.S uit appendix 4), met enkel de gegevens van de periode juli tot december. In deze biplot werd ook de fosfaatopname

0.8

S042-

okt

•

o.

bacillariofyten

•

TP

o.

~..•...........

apr ...........

o.

nov ...........

........

02 .........

...........................................)1

N

....

-§

DOC

0

co

chlorofyten

LL

ei

-0.

K+ •co l211ka I

••

-0.

•

•

.... ......

....····aug

....

tempe..r.af~ur

eL'

-0.

Na+

•

-0.

-1

-1. -1.2

-1

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.2

Factor 1

Figuur 4.2 Siplot 1 van de seizoenale opvolging. De factorscores voor de datapunten (de verschillende maanden) werden gedeeld door 2.5 om binnen de schaal van de grafiek te vallen. Factor 1 verklaart 42% van de variabiliteit en factor 2 verklaart 15%, zodat de biplot in totaal 57% van de totale variabiliteit verklaart. De factorladingen voor de verschillende variabelen zijn terug te vinden in tabel A.4.4 uit appendix 4.

52

.....

400

CO

rJl~

300

CO E 250 200

"2 ~ .c

25

CO _

20

c.. -

15

Q;~

rJl"

E~

30r-----------------------------------,

::l ::l

350

E

2

150 100 50

140r-------------------------------------, I+-

g>

120

.8 :Ql

100

~n

80

E

::s

~

60

~ 0

N'#.

40

c

20

~

4

00>

2

3

}

2

400~

::-

350 300 250

OJ

.s

a ~~~ U

:.

100 50

800

o-r-'--.--r--r--r--r--r-'r-.--'--.-~

700

::-

600

500r---------------------------------~--,

0-

500

2

400

450 400 350 300 250 200 150 100 50

0>

~

300 200 100

O~_r--r__r--r__r--~~--._~--._~~

50 16r-----------------------------------,

45

- - ca>'

40 12

35 0>

2

>.

30

2

25

:cU

20

0

K' .--... -- Na+

"" .................___ .. ,"

'\

.. __ ............. _ ............ J

------------ _---

15

........

10 50

CD

~ .....

c-

~.[

C

8

I:: CllN' 4000 >,"

o ffi - '" .s:::U

~

-~

6000 5000

-§ 2:§

40

----- so.," - - - CI"

30 20 10

3000 100 2000 80 Z

1000

Cl

3

60

jg

40

co 6000

"2

20

I:: 5000 :Cll ";:: CllN' 4000

U§ Jl~

1000 3000

o

~ 1::_

CO

()'

900 2000 0-

0>

2

1000

(J)

CD

:;::; 5000

I:: Cll 4000 >,N'

O§ .~ ~

'OJ! CO

.c

800

~

600

1:: CD

500

U I::

400

~ 0

3000

't5

2000

0

1000

F

M

A

M

J

A

S

0

N

D

700

300 200 100

FMAMJJASOND

53

bij 5000 IlgP rl uitgezet (maat voor de werkzaamheid fosfaattransporter met Iage affiniteit). De gegevens werden in functie van de tijd uitgezet in figuur 4.3. Beide bipIots en de grafieken met het seizoenaaI verIoop zuBen in wat voIgt samen aan bod komen. In de vroege herfst (september-oktober) is een duideIijke fosfaatpiek waar te nemen (figuur 4.3). Gedurende deze piek is nagenoeg aI het fosfor in het water aanwezig aIs orthofosfaat. Tijdens ongeveer dezeIfde periode wordt een terugvaI van de gangbare, hoge zuurstofconcentratie waargenomen, terwijI het CO2-gehalte van het water hoog is. Ook de conductiviteit is hoog in deze periode, ten gevoIge van piekende ionenconcentraties (vnl. Ca2+, cr en SOi-). De fosfaatconcentratie heeft sIechts een zeer kIeine invIoed op de conductiviteit. Ze bedraagt op haar hoogste niveau (septem-

0.8 bacill§~

••

okt Mg2 +

o.

0

o.

...

02

N

~co

0

I.L.

de

DOt<;___..............·············...N·~9~~;!t~~;I~i'~:~·.j •

-0.

!

~""

I I I I I I I I

-0.

co~ductiviteit

/

@'\l

I I I I I

/

N03

•

temperatuur biomctssa

I

Vr:v\ax

j I

-0.2

o

t

-0.

•

•

I I

-0.

alkalin~it

rofyt

•

-1

-1.2

·1

-0.8

·0.6

-0.4

0.2

0.4

0.6

0.8

1.2

Factor 1 Figuur 4.4 Biplot 2 van de seizoenale opvolging. Enkel de gegevens van juli tot december werden gebruikt. Factor 1 verklaart 40% van de totale variabiliteit, factor 2 nog een bijkomende 20%. De factorscores werden gedeeld door 2 om binnen de schaal van de grafiek te vallen. Tabel AA.5 in appendix 4 geeft de factorladingen van de verschillende variabelen weer.

54

ber) nog steeds minder dan I mgP rl. Ook de cyanobacterie-epifYten vertonen een densiteitspiek in september-oktober. Zowel V max als Km van de fosfaatopname zijn laag gedurende de herfst. Figuren 4.2 en 4.4 (verder respectievelijk biplot I en biplot 2 genoemd) tonen dat oP en TP nagenoeg samenvallen (in biplot I is oP het punt net onder TP, het label kon niet weergegeven worden wegens samenvallend met dat van TP) en bijgevolg een nauwe correlatie vertonen (cf. figuur 4.3). Beide biplots zijn, ondanks het gebruik van een aantal andere variabelen en slechts een gedeelte van de meetwaarden in biplot 2, erg gelijkend. Biplot I suggereert dat de maximumsnelheid van de fosfaatopname (Vmax) niet gecorreleerd is met de fosfaatconcentratie van het water. Biplot 2 suggereert nochtans dat er mogelijk toch een correlatie bestaat tussen Vmax en oP (hoek tussen beide ongeveer 137°). Het nitraatgehalte lijkt weI een verband te vertonen met Vmax, vooral voor biplot I. De lage Km-waarden tijdens de fosfaatpiek van de late zomer en de vroege herfst uiten zich ook in de biplots: Km vertoont een negatief verband met de fosfaatconcentratie. Het COz-gehalte staat in negatief verband met de zuurstofconcentratie in het water. Biplot 2 suggereert bovendien een negatieve correlatie tussen het fosforgehalte van het plantenmateriaal enerzijds en Km en opname bij 5000 IlgP rl anderzijds. Merk op dat het stikstof- en fosforgehalte van het plantenmateriaal slechts weinig van de variabiliteit voor hun rekening nemen. In biplot 2 valt op dat de maximale snelheid van fosfaatopname (V max) een nagenoeg rechte hoek vertoont met het fosforgehalte van de plant. Dit zou betekenen dat de snelheid van fosfaatopname in het bereik 0-2000 IlgP r l , niet afhangt van de fosforstatus van de plant. Links in biplot I is een sterke clustering van een aantal afwijkende datapunten uit september waar te nemen. De cyanofYten liggen hier samen met een aantal ionen en het COz-gehalte. Ook de andere ionen (incIusief fosfaat), en de conductiviteit meer in het algemeen, liggen in deze buurt. De fosfaatpiek uit de herfst komt dus, zoals reeds eerder aangehaald, overeen met een cyanofYtenbloei in de epifytengemeenschap, hoge CO2-gehalten en lage Oz-gehalten. Ook in biplot 2 is dit patroon zichtbaar (met de cluster deze maal aan de rechterzijde van de grafiek). Het chlorofYlgehalte (maat voor de densiteit van fytoplankton) profileert zich in geen van beide biplots (Jigt altijd tamelijk dicht bij de oorsprong).

4.2.2 VERDERE UITDIEPING In dit deel zullen een aantaI van de suggesties uit voorgaande biplots worden uitgewerkt. Een eerste opvallende waameming uit de biplots is dat de zuurstofconcentratie en het COz-gehalte volledig aan de andere zijde van de biplot Iiggen. Dit suggereert een sterke negatieve correlatie tussen beide. Figuur 4.5.a bevestigt deze correlatie, aI zijn het vooral de maanden met de extreme O2 - en COzgehalten die er sterk toe bijdragen. Figuur 4.5.b toont het verband tussen de ortho- en de totaal-fosfaatconcentratie. Deze correlatie is uitsluitend toe te schrijven aan de waarden van september en oktober. Zonder deze waarden, of met een niet-parametrische test, is het verband niet significant (p-waarden 0.859 en .072 voor een Pearson correlatie-analyse zonder de outliers en een Spearman rank correlatie-analyse, respectievelijk).

55

140

(a)

.'~" "~

.

~

I ~

i

1200

(b)

.

120

.

1000

moo

ap'un

.

100

£"

'"' 60

600

2: ro

~

..

60 40

600

.

.g

0<

0;

-".2

400

200

20

40

60

120

160

200

240

260

320

360

v

0

C02 gehalte van het water (mg/l)

orthofosfaat (l-IgP/I)

Figuur 4.5 (a) Regressie van de zuurstofconcentratie tegenover het C02-gehalte. De Pearson-correlatie is significant (p < 0.001), met R2 van de gefitte rechte 0.78. (b) Regressie van totaal fosfaat tegenover orlhofosfaat. De Pearson-correlatie is significant (p < 0.0001). De R2 van de gefitte rechte bedraagt 0.9967.

Om correlaties te achterhalen die Vmax of Km bevatten werden, om hogergenoemde redenen, telkens twee verschillende analyses uitgevoerd, een eerste op de gegevens van aIle maanden samen en een tweede op de gegevens vanaf de maand julio Pearson correlatie-analyses bevestigen dat Vmax niet gecorreleerd is met oP. Omdat de grafiek (niet weergegeven) echter twee outliers vertoonde (zeer hoge orthofosfaatconcentraties in september en oktober, terwijl de V max-waarden niet proportioneei mee veranderden), werd ook een niet parametrische correlatie-analyse uitgevoerd. Deze bevestigt opnieuw dat er geen correlatie is tussen beide variabelen. Beide biplots suggereren sterk dat Km in negatief verband staat met de orthofosfaatconcentratie. Ook figuur 4.3 geeft suggesties in die aard. Pearson noch Spearman correlatie-analyses vinden een betekenisvol verband. Ook de nitraatconcentratie vertoont geen significant lineair verband met V max. Wat betreft de invloed van het fosforgehalte van het plantenmateriaal op de opname van fosfaat werden ook een aantal mogelijke verbanden onderzocht. Deze analyses beslaan enkel de maanden juli tot december (cf. hoger). Het fosforgehalte van de plant stond in significant lineair verband met noch de affiniteit of de maximale snelheid van de fosfaatopname, noch de opnamesnelheid bij 5000 IlgP rl.

4.3 DE INVLOED VAN NA+ EN K+ 4.3.1 INLEIDENDE EXPERIMENTEN In november werd, parallel met het opname-experiment voor de seizoenale opvolging, nog een experiment gedaan om na te gaan of de Na+- of de K+-concentratie van het opnamemedium een invloed hebben op de fosfaatopname. De resultaten zijn samengevat in figuur 4.6.a. De kinetische constanten kunnen worden teruggevonden in het bijschrift van de figuur. De depletiegegevens zijn weergegeven in tabel A.4.6 uit appendix 4.

56

De opnamesnelheid verschilt significant tussen de twee condities (p = 0.0104, tweewegs ANOYA) en ook de interactie tussen fosfaatconcentratie van het opnamemedium en conditie blijkt de snelheid van fosfaatopname significant te bei"nvloeden (p < 0.001). Dit betekent dat bij verschillende fosfaatconcentraties de opname anders door de conditie zal bei"nvloed worden. Hetzelfde experiment werd herhaald in december. De resultaten van dit experiment zijn terug te vinden in figuur 4.6.b. De opnamesnelheden van december liggen veel hoger dan die van november (andere schaal in figuren a en b). Er was opnieuw op een significant andere opname in beide condities (p < 0.001, tweewegs ANOY A). De interactie tussen de conditie en de concentratie bleek in deze analyse de fosfaatopname niet significant te bei"nvloeden. De opnamesnelheid wordt dus voor aIle fosfaatconcentraties in het opnamemedium geIijkaardig bei"nvloed, wat reeds door figuur 4.6.b werd gesuggereerd. Op de bekomen kinetische constanten werd ook nog een ongepaarde t-test uitgevoerd. In november verschilden de Ymax - en Km-waarden significant van elkaar (p-waarden 0.0042 en 0.0137, respectievelijk). In december waren de kinetische constanten niet significant verschillend. Merk op dat, bij hogere fosfaatconcentraties in het opnamemedium, NaH 2 P0 4 -toediening resulteert in relatief hogere opnamesnelheid in november maar in lagere in december. Bij de lage concentraties (100 en 200 ~gP r 1) verloopt de opname steeds beter als het fosfaat werd toegediend als K3 P04 .

(a)

(b)

3.0

6

2.5

:Et ~"f

2.0

'" s:0

1.5

a.

1.0

~~ Q)

~.9 'En

°20

li

---------------r------------------------------

0.5

O.O+--,...--.,---,--,...---r--,--r---. 250

500

750

1000

1250

[Pilm• dium (~gP

1500

1750

2000

250

. 500

r')

750

1000

1250

1500

1750

2000

[Pilm.d;um (~gP I·')

Figuur 4.6 (a) Fosfaatopname in november, bij toediening van NaH2P04 (-e-) of K3P04 (---.---). De kinetische constanten zijn, voor de K+-conditie: V max = 1.6 I-lg (g Dwr1 min-1 en Km = 190 I-lgP 1-1; en voor de Na+conditie: Vmax = 2.5 I-lg (g DWr1 min-1 en Km = 552 I-lgP 1-1. (b) Dezelfde grafiek voor het experiment van december. De kinetische constanten zijn in dit geval Vmax = 5.4 I-lg (g DW)-1 min-1 en Km = 553 I-lgP 1-1 voor de K+-conditie en Vmax = 3.9 IJg (g DWr1 min-1 en Km = 594 I-lgP 1-1 voor de Na+-conditie. Let op de verschillende schalen.

4.3.2 INVLOED VAN DE NATRIUMCONCENTRATIE In dit experiment werd de Na+-concentratie van het opnamemedium gevarieerd. Het verschil tussen beide condities is dat het plantenmateriaal al dan niet natriumuitgehongerd werd gedurende 5 dagen voor het opname-experiment. De depletiegegevens zijn weergegeven in tabel AA.7 uit appendix 4.

57

De waargenomen patronen zijn weergegeven in figuur 4.7. Voor het experiment zonder Na+-uithongering werden hoge opnamesnelheden gevonden in het concentratiebereik 0-2 mM Na+, bij de concentraties 3 en 5 mM Na+ was de opname minder sneI. Voor het experiment met Na+-uithongering wordt een ander patroon waargenomen: bij de twee extreme concentraties (0 en 5 mM Na+) worden Iagere opnamesnelheden opgetekend dan bij de intermediaire. De opnamesnel= heden zijn significant hoger in het tweede experiment dan in het eerste (p = 0.0013).

2.5

:=-

2.0

Ji "e ~ ~

1.5

~

1.0

~

c

EO

i

.5

•••--.................

l ................................_

0.5

O.O+----r--,--,-----r---/-O.O o [Na+]medlum (m M)

Figuur 4.7 Invloed van de natriumconcentratie op de fosfaatopname. ---.---: zonder voorafgaande Na+-uithongering; -e-: met voorafgaande Na+-uithongering. De opnamesnelheden werden gemeten bij 500 I-lgP 1-1 .

4.3.3 STIMULATIE VAN DE FOSFAATOPNAME DOOR NA+ EN K+ Dit is het Iaatste uit de rij van experimenten die de invloed van Na+ en K+ op de fosfaatopname tracht aan het Iicht te brengen. In dit experiment werd aan een aantaI onnauwkeurigheden uit vorige experimenten oplossing geboden (cf. 5.4). De depletiegegevens zijn weergegeven in tabeI A.4.8 uit appendix 4. Een exploratieve factoranalyse van de voIIedige gegevensset (figuur A.4.1 en tabeI A.4.9 in appendix 4) toont een nagenoeg rechte hoek tussen de opnamesnelheid en de Na+- en K+-concentratie. De preincubatie Iijkt een negatieve correlatie te vertonen met de opnamesnelheid. Op de voIIedige dataset werden een aantal statistische analyses gedaan. Er werd een eenwegs ANOV A uitgevoerd om een eventueel globaal effect van natriumconcentratie na te gaan. Dit effect was aanwezig (p = 0.0086), toevoeging van 1 mM Na+ had een stimulerend effect op de opnamesnelheid (p-waarde van de Tukey HSD test 0.0063) ten opzichte van de totale afwezigheid ervan. Bij 5 mM werd terug een afname van de opname waargenomen. De verschillen tussen de conditie met 5 mM Na+ en de condities zonder en met 1 mM Na+ waren niet significant.

o

De condities: 1: 0 mM Na+, 0.125 mM K+, pre"incubatie identiek 2: 1 mM Na+, 0.125 mM K+, pre"incubatie identiek 3: 5 mM Na+, 0.125 mM K+, pre"incubatie identiek

a.

4: 0 mM Na+, 1.25 mM K+, pre"incubatie identiek

.::; '"

5: 1 mM Na+, 1.25 mM K+, pre·incubatie identiek

.~

E

~

"0

.0;

6: 5 mM Na+, 1.25 mM K+, pre"incubatie identiek

.s:

a;

.,'" t:

7: 0 mM Na+, 0.125 mM K+, standaard APW preinc.

E

8: 1 mM Na+, 0.125 mM K+, standaard APW preinc. 9: 5 mM Na+, 0.125 mM K+, standaard APW preinc.


t:

C.

o

10

conditie

11

12

10: 0 mM Na+, 1.25 mM K+, standaard APW preinc. 11: 1 mM Na +, 1.25 mM K+, standaard APW preinc. 12: 5 mM Na+, 1.25 mM K+, standaard APW preinc.

Figuur 4.8 Opnamesnelheden bij de verschillende Na+', K+- en pre"incubatieregimes. De opnamesnelheden werden gemeten bij 775 I-lgP

r1.

58

De K+ concentratie had geen significant globaal effect op de opnamesnelheid (t-test). Noch de interactie tussen Na+- en de K+ -concentratie, noch die tussen K+ en prei"ncubatietype had een significante invloed op de opnamesnelheid (tweewegs ANOV A's). Hoewel het prei"ncubatieregime een duidelijk effect had op de opnamesnelheid, werd geen significant effect gevonden (p = 0.075, t-test). Ook voor de condities zonder Na+-toediening, waar de verschillen tussen de prei"ncubatiecondities het grootst lijken, kan net niet worden besloten tot een significant verband tussen de opnamesnelheid bij prei"ncubatie in standaard APW of natriumloos APW (p = 0.057). Bij het bekijken van de balken uit figuur 4.8 kan in drie van de vier groepen een maximale opnamesnelheid worden waargenomen bij de conditie met 1 mM Na+. Het zou dus kunnen dat het optimum van de opname als functie van de natriumconcentratie in de buurt van 1 mM ligt en dat hogere concentraties de fosfaatopname afremmen. Dit werd ook in het vorige experiment waargenomen. Het optimum van de fosfaatopname lag daar in de buurt van 1 it 2 mM Na+ (figuur 4.7). Als, voor het hier besproken experiment, enkel de concentraties 0 en 1 mM Na+ in de analyse werden gehouden, kon een significante stimulatie van de opnamesnelheid door de aanwezigheid van Na+ worden aangetoond (p = 0.0047). De verschiIlen in opnamesnelheid zijn vooral duidelijk merkbaar in de condities waar prei"ncubatie gebeurde in standaard APW (laatste zes balken van figuur 4.8). Daar waar de opnamesnelheid bij 1 mM nagenoeg gelijk blijft over het prei"ncubatieregime heen (condities 2, 5, 8 en 11), is deze bij 0 mM opmerkelijk lager in de condities waar prei"ncubatie gebeurde in standaard APW (condities 1 en 4 versus 7 en 10). Dit effect is net niet significant (p = 0.0575).

4.4

OPNAME-EXPERIMENTEN VAN ZEER KORTE DUUR

In een poging de aard van het transmembranair transport te achterhalen (proton- of natriumgemedieerd), werden een aantal opname-experimenten van zeer korte tijdsduur (± 20 min) uitgevoerd. In deze experimenten was een zeer grote hoeveelheid biomassa aanwezig in het opnamemedium en was de initiele fosfaatconcentratie hoog, zodat eventuele veranderingen in natriumconcentratie of pH tengevolge van fosfaatopname merkbaar zouden zijn. Wegens tijdsgebrek bleven deze experimenten in een erg verkennende faze. Er werden in totaal 6 experimenten uitgevoerd, waaronder enkele in gebufferd en enkele in ongebufferd medium, enkele bij 1 mM Na+ en enkele bij 0.4 mM Na+. De algemene waarnemingen zijn de volgende. In de eerste plaats werd er na de fosfaattoediening vaak een kleine pH-daling waargenomen. Na een tiental minuten was deze meestal ongedaan gemaakt. De fosfaatconcentratie van het opnamemedium nam, gedurende de opnameperiode, nagenoeg lineair af. De natriumconcentratie, die initieel telkens meer dan het dubbele bedroeg van de toegediende concentratie, kon met de gebruikte methode niet nauwkeurig genoeg worden bepaald. Typische patronen zijn weergegeven in figuur 4.9.

59

~~,---------------~ E~

~::.

.1 '5,

=-

6.7

(a)

17~-:··

J:

6.5

~Eo '+' E

... .'.

6.4

1500-

(e)

~~ nn

Cl.

~3

~~,---------------~

(b)

6.6

~3

27~

-. 2500

6.3

6.2-!---,--,----,--..,----I

o

200

400

600

800

tijd (5)

1CXXl

o

200

400

600

800

1CXXl

o

200

tijd (5)

Figuur 4 . 9 TYPIsche patronen zoals voJaargenomen fosfaatconcentratie, (b) pH, (c) natriumconcentratie.

400

600

8IXl

1CXXl

tijd (5)

de kortetermijn opname-experimenten. (a)

4.5 INVLOED VAN DE pH OP DE PI-OPNAME 4.5.1 pH-AFHANKELIJKHEID VAN DE FOSFAATOPNAME BIJ CHARA Met Chara werden twee experimenten gedaan om na te gaan hoe de pH van het incubatiemedium de fosfaatopname belnvloed. Bij het eerste experiment werd de Chara slechts gedurende een nacht (ongeveer 14 uur) geprelncubeerd bij de pH waarbij ook het opname-experiment zich zou voltrekken. Dit experiment wordt in wat voIgt Czp genoemd (Chara zonder prelncubatie). Voor het tweede experiment werd het opname-experiment voorafgegaan door een twee weken durende prelncubatie bij de gewenste pH, met als doel de planten te adapteren aan deze pH. Dit experiment wordt in wat voIgt Cmp (Chara met prelncubatie) genoemd. Tabel A.4.1 0 uit appendix 4 geeft de depletiegegevens van het opname-experiment weer.

4.5.1.1 pH-adaptatie tijdens de langdurige prei"ncubatie van het emp-experiment

Het plantenmateriaal paste zich, zoals verwacht, geleidelijk aan aan de opgelegde pH. Elke dag (ongeveer op hetzelfde uur) werd de pH van het medium gecorrigeerd tot de gewenste pH. Vooraleer deze pH-aanpassing gebeurde, werd gemeten hoeveel de pH was veranderd gedurende de voorbije dag. Figuur A.4.2 uit appendix 4 toont de adaptatie van het plantenmateriaal aan de pH.

4.5.1.2 Exploratieve analyse

Een aantal exploratieve factoranalysen (biplots niet weergegeven) leverden noch voor het Cmp-, noch voor het Czp-experiment merkwaardige trends.

4.5.1.3 Afwijkingen van de initiele pH gedurende de opname-experimenten

Hoewel de incubatiemedia gebufferd werden op de gewenste pH met 2 mM MES, MOPS of CHES buffer, werden toch in enkele gevallen gedurende de loop van het experiment pH-variaties waargenomen. In het experiment met Chara zonder prelncubatie (Czp) werden significante stijgingen van de pH waargenomen in de conditie pH 5 en significante dalingen in de condities pH 8 en pH 9. In

60

de condities pH 6 en pH 7 bleef de pH nagenoeg onveranderd. Figuur 4.1 O.a toont een voorbeeld van een tijdsopvolging van de pH, figuur 4.1 O.b geeft voor elk van de pH-condities (Czp experiment) weer in welke mate de pH afweek van de initiele waarde.

6.25

(a) 6.00

:c

5.75

0-

5.50 5.25 5.00

De pH-veranderingen uit het Czp-experiment werden in enkele gevallen significant bei"nvloed door de biomassa plantenmateriaal in de incubatiecuvet (Pearson correlatieanalyse). Voor de conditie pH 5 werd op elk van de vier tijdstippen waarop de pH werd gemeten een significant effect van de biomassa op de pH-toename gevonden (p = 0.003). Ook voor de conditie pH 9 werd een significant effect gevonden (p = 0.003). In aIle andere condities was er geen duidelijk effect van de biomassa op de pH-variatie.

0

100

De afwijking vanaf de initiele pH werd, net als de gemiddelde pH gedurende het experiment, voor elke replica apart betrokken in de exploratieve factoranalyses (4.5.1.2).

300

400

500

60J

tijd (min) • 0

~gP/I

... 150

~gPIl

.., 500 ~gPIl • 2000

~gP/I

1..0,-------------------,

c

(b)

en'"

0-

Cil >

~

'" '"

.0

pH 5

Tijdens het Cmp-experiment was er amper een afwijking van de initiele pH. De grootste afwijking deed zich voor bij pH 5 en bedroeg slechts 0.3 pH-eenheden.

200

pH 6

pH 7

pH 8

pH 9

pH conditie

Figuur 4.10 Verloop van de pH gedurende het Czp experiment. (a) conditie pH 5: De pH neemt significant toe in de tijd. De curve fits zijn exponentieel (pH :: span.exp(K.x) + plateau). (b) De totale afwijking vanaf de initie Ie pH is het grootst bij de extreme pH condities. De hoogte van de balken wordt bepaald door het gemiddelde (over de 4 fosforcondities) van de 'span' (de hoogte van de exponentiele fit). Deze waarde geeft een zeer goed beeld van de afwijking vanaf de initiele pH.

4.5.1.4 Bei"nvloeding van de josjaatopname door de pH De pH-conditie had een significant effect op de fosfaatopname (p < 0.000 I voor Cmp en p = 0.0062 voor Czp), en de afhankelijkheid die de fosfaatopname vertoont ten opzichte van de pH verandert met de fosfaatconcentratie in het medium (p < 0.0001 voor Cmp en p = 0.0062 voor Czp). Met andere woorden, bij lage fosfaatconcentraties in het opnamemedium heeft de pH een ander effect dan bij hoge fosfaatconcentraties. De opnamesnelheden zijn gevisualiseerd in figuur 4.11 (a tot c), voor elke fosfaatconcentratie waarbij de opname werd gemeten apart. De twee experimenten die werden uitgevoerd met Chara kunnen niet zonder meer met elkaar worden vergeleken, aangezien het plantenmateriaal op verschillende datums geoogst werd. Absolute opnamesnelheden kunnen bijgevolg niet enkel als gevolg van de prei"ncubatie-omstandigheden worden gezien. Enkel de patronen van fosfaatopname kunnen worden vergeleken. Uitgaande van de figuren 4.11 (a tot g) kan men tot de conclusie komen dat de langdurige prei"ncubatie van het plantenmateriaal, dat het toestond zijn metabolisme te adapteren aan de heersende pH, geen verandering van de patronen in de opnamesnelheid heeft veroorzaakt.

61

"0_

~ID ~~_

1.4

:;;~ 0.8

E

OJ

"'0.. C

OJ

C. ::!.

0-

~ID_~~

0.6 0.4

--- --~

2.0

IDCl

//'

1.5

E.9

"'0.. C

1.0

0-

0.5

OJ

C. ::!.

0.2 0.0

(b)

2.5

:;;~

vkt±",+ - - r .l1

IDCl

3.0

"0_

(a)

1.2 1.0

0.0 567

4

9

4

10

5

6

pH conditie

7

8

9

10

4

5

6

pH conditie

in1'~i~jDI

~~1~~

}l~

o

~::.

f&

"

6

7

5

56789

__

'~

8

1500~f)

5

pH conditie

pH conditie

10

9

~ ::~g.), . . . . .s\.' ; ;. .;•

1CXXJ

9

8

pH conditie

~ ~:,\,

,}"~'

7

6

~E

., i· '., 7

8

9.'X)

o

9

pH conditie

~'

~,

(

... ;

•.. . ':

••

5

7

9

6

8

pH conditie

Figuur 4.11 pH-afhankelijkheid van de fosfaatopname bij Chara globularis. (a) fosfaatopname bij 150 I-lgP 1-1 ; (b) fosfaatopname bij 500 I-lgP 1-1 ; (e) fosfaatopname bij 2000 I-lgP 1-1 ; ---+---: Cmp, -e-: Czp. Let op de andere sehalen. V max van de opname voor Cmp (d) en Czp (e). Km van de opname voor Cmp (f) en Czp (g).

4.5.2 pH-AFHANKELIJKHEID VAN DE FOSFAATOPNAME BIJ NITELLA Voor Nitella werd enkel een experiment uitgevoerd zonder langdurige prei"ncubatie omdat, gedurende de langdurige prei"ncubatie, de planten overwoekerd werden door een dichte epifytenmat. De depletiegegevens zijn weergegeven in tabel A.4.11 uit appendix 4.

In dit experiment werden (op 2 fosforcondities van de pH 9 conditie na) geen trendmatige veranderingen van de pH gevonden. Er was nergens een verband tussen pH variatie en biomassa in de cuvet. Bij het opname-experiment werd netto efflux waargenomen in aIle 0 IlgP rl condities en ook in een aantal 150 IlgP rl condities (pH 5 en pH 9). Voor de verdere analyse werd verondersteld dat de efflux onafhankelijk is van de externe fosfaatconcentratie (wat zeer waarschijnlijk niet zo is). De opnamesnelheden werden vermeerderd met de efflux-snelheid bij 0 IlgP rl. Een exploratieve factoranalyse (niet weergegeven) bracht geen opmerkenswaardige patronen met zich mee.

"0

0.75,----------,

'Qi ~

~ ~

(a) 0.60

;; ~ 045 IDCl E .9 0.30

~~

g.2;

~

]ID _

0.75..,----------,

(b)

0.60

('h

;; ~ 0.45 alCl E .9 0.30 c 0>

"'0..

g. 2;

0.15 O.OO+--f~_.__,_-,___.___I

4

5

6

8

pH conditie

9

10

0.15

Q)

5

6

7

pH conditie

-

;;~

al Cl

E ~

10

1.00-

0.75-

CO>

i

g. 2;

0.00-+--.,.-...--.--.---.---1 4

1.50.,-----------,

]~1.25-(C)~ 0.500.25-

0.00+--.--,..--,--.--,..--1 4

678

10

pH conditie

Figuur 4.12 pH-afhankelijkheid van de fosfaatopname bij Nitella f1exilis. Opnamesnelheden bij (a) 150 I-lgP 1-1 , (a) 500 I-lgP r , (e) 2000 I-lgP 1-1 . Let op de verschillende schalen

62

Ook in het geval van Nitella is het moeilijk een algemeen patroon te herkennen in de figuren (figuur 4.12). Bij lagere fosfaatconcentraties in het opnamemedium (150 maar vooral 500 IlgP I-I) wordt een relatief hogere snelheid van fosfaatopname waargenomen in het centrale deel van het onderzochte pH-spectrum. Bij 2000 IlgP rl zien we een vrij con stante opname over het pH-bereik van 5 tot 7. Bij hogere pH daalt bij deze fosfaatconcentratie de opnamesnelheid, al is deze daling niet betekenisvol door de grate variabiliteit in de andere condities.

4.5.3 VERGELIJKING VAN DE PATRONEN BIJ CHARA EN NITELLA Figuur 4.13 verzamelt de waargenomen patronen bij Chara en Nitella, voor elke fosfaatconcentratie waarbij de opname werd gemeten apart. De resultaten die voor Chara zijn weergegeven zijn die van het Czp experiment. De figuur toont dat, voor aIle condities, de opnamesnelheden hoger zijn bij Chara dan bij Nitella. De patronen zijn erg gelijkend, behalve misschien bij de condities met 2000 IlgP rl. Hier wordt, voor toenemende pH, een afname van de opnamesnelheid waargenomen bij Nitella, terwijl de opname bij Chara een optimum vertoont bij intermediaire pH. De fosforconcentraties van het plantenmateriaal waren, voor de in figuur 4.13 weergegeven resultaten, 0.023 en 0.189 mmol P (g DWr l , respectievelijk voor Chara en Nitella.

-0 _

1.4..,-----------.,

'0; -c £ '0;

1.2

'" _

~ ~

'" 0

E

~

"0 _

-c

(a)

'0; £0;

1.0

"0 _

~~~5 (c)~

.

~~2.0-

0.8

'" 0

1.5-

~

~

'a Q.::l.

0.4 0 - 0.2

g-2:0.5-

O.O+--1'''--.,.--r-..,.---.--i 4

5

6

7

8

pH conditie

9

10

'7

4

'" 0

3

en

2

"'~

E~ ~ 'S, 1.0-

0.6

~

6-,----------,

3.0..,-----------, 25- (b)

E~

c:

~

Co Ol

!

g-2:1

i

•

•

__

678

9

O.O+--;:,-.,-..,.---.-.--i 4

5

6

7

8

9

10

4

pH conditie

10

pH conditie

Figuur 4.13 Vergelijking van de pH-afhankelijkheid van de snelheden van fosfaatopname bij Chara globularis en Nitella f1exilis. - . - : Nitella, -~- Chara. Opname bij (a) 150, (b) 500 en (c) 2000 I-lgP 1-'. Let op de verschillen de schalen

4.6 SNELHEID VAN DE RESPONS BIJ FOSFORUITHONGERING Er werd bij Chara onderzocht of een preYncubatieperiode van een nacht in fosforvrij medium, zoals dit gebeurde voor de seizoenale opvolging van de fosfaatopname en voor het Chara-Elodea en het Chara fosforverzadigingsexperiment, een significante invloed heeft op deze fosfaatopname. Hoewel een duidelijk lagere opnamesnelheid werd waargenomen als geen preYncubatie in fosforvrij medium werd doorgevoerd (figuur 4.14.a), waren de gemiddelde opnamesnelheden niet significant verschiIlend van elkaar (p-waarde voor de ongepaarde t-test 0.1978). Dit was voornamelijk te wijten aan de grote variabiliteit van de opnamesnelheid. Toen in een tweede, identiek experiment (figuur 4.14.b) vijfreplica's (in de plaats van drie in het eerste experiment) en gelijke versgewichten planten-

63

materiaal werden gebruikt, waren de gemiddelde opnamesnelheden van beide groepen wei significant verschillend van elkaar, met hoge significantie (p = 0.0081).

(a)

l

(b)

1.0

l

1.0

0.8

0.8

0.6 .

0.6 ,

0.2

pre'lnc

O.O....L..----=~""'--.....I""-"""""'-'---

geen pre"lnc

conditie

conditie

Figuur 4.14 Opnamesnelheden met en zender evernacht pre·incubatie in fosforloos medium. (a) experiment van 12 maart, (b) experiment van 19 maart.

4.7 HET CHARA-ELODEA EXPERIMENT In het Chara-Elodea experiment wordt beoogd meer te leren over de strategieen die beide soorten evolutionair hebben ontwikkeld om met verhoogde fosfaatconcentraties (eutrofiering) om te gaan. Elke soort werd in laboratoriumomstandigheden gei'ncubeerd bij aan- en afwezigheid van fosfaat in het medium. Na 26 dagen incubatie werden de incubatieregimes omgewisseld. De vier condities worden als voigt aangeduid: Ei+ (Elodea met initiele +P incubatie), Ei- (Elodea met initiele -P incubatie), Ci+ (Chara met initieJe +P incubatie) en Ci- (Chara met initiele -P inc 'b cubatie). c 0.8

C CC 0.6

II'

dag

4.7.1 EXPLORATIEVE ANALYSE

c

0.'

VAN DE GEGEVENS 0.2

In eerste instantie werden ook hier een aantal exploratieve principaa1com(PCA) uitgevoerd. ponentanalysen Figuur 4.15 toont de biplot voor Elodea. Hieruit blijkt dat de C:P verhouding van het plantenmateriaaI in nauw verband staat met de opnamesnelheid. De biplot suggereert verder dat de C:N verhouding van het plantenmateriaal weinig invloed heeft op de fosfaatopname. De C:N verhouding neemt af met toenemende incubatieduur.

64

N

!

C

0

...

-0.2

I

""

blomassa

-0.'

•

-0.6

:N

-0.8

-0..

-0.2

0.2

0.6

08

Factor 1

Figuur 4.15 Siplot 1 voor Elodea. De factorscores van de individuele waarnemingen werden gedeeld door 3 om binnen de schaal van de figuur te vallen. 0: Ci+; 0: Ci-. Factor 1 verklaart 44% van de totale variabiliteit, factor 2 nog eens 25%. De factorladingen van de verschillende variabelen kunnen in appendix 4 worden teruggevonden (tabel A.4.12).

Let op, de biomassa uit de biplot is niet de totale biomassa in de preYncubatieconditie maar de biomassa die voor elk van de individuele replica's van de opname-experimenten werden gebruikt. Deze variabele zegt dus niets over de groei van de planten. De hoeveelheid gebruikte biomassa neemt af met de incubatietijd. De gebruikte hoeveelheid biomassa lijkt geen invloed te hebben op de opnamesnelheid. Bijkomende informatie op de grafiek (figuur 4.16 links) toont dat de twee incubatietypes zich met toenemende incubatietijd (variabele dag) duidelijk van elkaar scheiden. Ook voor de Chara condities werd een dergeIijke biplot geconstrueerd (figuur 4.7 rechts). De algemene trends uit de biplots voor Elodea komen ook hier terug. De opname lijkt bij Chara echter zwakker gecorreleerd te zijn met de C:P verhouding en bovendien suggereert de biplot een negatief verband tussen opnamesnelheid en de C:N verhouding. Ook hier blijkt C:N af te nemen met toenemende incubatieduur.

r I

,,

d"

\

C:P

.,,

.

N:P

."

." lI''', ,"'.,"

Factor 1

C:N

Factor 1

Figuur 4.16 Links biplot 2 voor Elodea. De labels geven de incubatieconditie (Ei+ of Ei-) en de incubatieduur in dagen weer. Zelfde biplot als in figuur 4.15. - - -: Ei-, - : Ei+. Rechts de biplot voor Chara. De factorscores van de individuele waarnemingen werden gedeeld door 3 om binnen de schaal van de figuur te vallen. 0: Ci+; 0: Ci-. - : Ci+; - - -: Ci-. Factor 1 verklaart 34% van de totale variabiliteit, factor 2 nag eens 30%. De factorladingen van de verschillende variabelen kunnen in appendix 4 worden teruggevonden (tabel A.4.13).

4.7.2 VERLOOP VAN DE NUTRIENTENGEHALTES VAN HET PLANTENMATERIAAL Omdat aanzienlijke hoeveelheden plantenmateriaal nodig zijn voor een succesvolle Kjeldahlstikstofbepaling, zijn telkens de gehaItes van slechts een replica gemeten, en dit zowel voor de stikstof- als de fosforbepalingen. Vooriopig worden enkel de patronen van voor de incubatieomwisseling besproken (cf. 4.7.6 voor de patron en erna). Het koolstofgehalte is tamelijk constant in de tijd, zowel in Chara als in Elodea (figuur AA.3 in appendix 4). De twee incubatieregimes resuIteren echter duidelijk in twee trends wat betreft het verioop van het fosforgehalte (figuur 4.17 a&b). In de Ci+ conditie stijgt de fosforconcentratie geleidelijk, zodat op dag 26 bijna het drievoudige van de oorspronkeIijke fosforconcentratie aanwezig is. In de Ci- conditie daalt de fosforconcentratie, maar niet in aanzienlijke mate.

65

Voor Elodea worden gelijkaardige trends waargenomen. Hier zien we echter weI een duidelijke daling van het fosforgehalte in de Ei- conditie. In de Ei+ conditie laat de stijging van de fosforconcentratie bovendien even op zich wachten. Vanaf dag 10 neemt het fosforgehalte echter duidelijk toe, zodat het op dag 26 nagenoeg 150% van de initiele concentratie bedraagt. De stikstofgehalten (figuur 4.17 c&d) varieren amper bij Chara. Na een initiele afname neemt het stikstofgehalte geleidelijk toe in de Ci+ conditie terwijl in de Ci- conditie, na een geleidelijke stijging het stikstofgehalte terug afnam. Bij Elodea varieren de stikstofgehalten wei. In de Ei+ conditie zien we dat het geleidelijk toeneemt na een korte periode waarin ze amper verandert. In de Ei- conditie zien we dat na een initiele stijging het stikstofgehalte een plateau bereikt en terug begint afte nemen. Door de tamelijk con stante koolstofgehaltes leren de C:P verhoudingen noch de C:N verhoudingen (figuur A.4.2 in appendix 4) ons vee I bij over de nutritionele toestand van het plantenmateriaal. Het verioop van de N:P verhoudingen is weergegeven in figuur 4.17 (e&f). De N:P verhouding van het plantenmateriaal van de condities Ci- en Ei- neemt geleidelijk toe met de tijd. In de Ci+ conditie neemt de N:P verhouding gestaag af, terwijl deze verhouding in de Ei+ conditie nauwelijks verandert (op een outlier na, te wijten aan een abnormaal hoog stikstofgehalte). 0.30,.--------------,

(a)

0.30-,----------,---------.,

(b)

§-

0.25

~

0.25

o

0.20

o

0.20

S

i::~

0.15

c.. ~

0.10

E

0.05

O.OO-l---,.-.,..--,--,..--,--r--r---,r---I

O.oo-l--,..---,--,---.--....--..-----r--,---; o 5 10 15 20 25 30 36 40 45

incubatietijd (dagen)

incubatietijd (dagen)

1.75,.---------r------,

(e)

~

o

tED 12

S

1.00

Z

0.75

§o

_

~ rc'~

20,.---------------------,

(d)

~~

1.5

-

1.0

Z

(5

(5

E

§

O.ED

E

0.5

0.25 O.O-l---r---.--,----,---....--,...---,.--,---; 15 40 45 o 5 10 20 25 30 36

0.00-1---,.-.,..--,..J-,--,.---,---,r---r---I o 4 8 12 16 20 24 28 32 36

incubatietijd (dagen)

incubatietijd (dagen) 36,.------------r-------,

(e)

.Q 30

~

0..

25

36-,---------------------,

(f) .Q

30

~ c.. 25

Z

20

Z

20

~ .0;

15

~ '0;

15

is

10

is

10

iii

iii

5

5

o

incubatietijd (dagen)

5

10

15

20

25

30

36

40

45

incubatietijd (dagen)

Figuur 4.17 Verloop van de nutrientgehalten van het plantenmateriaal. De grafieken links (a, c, e) betreffen Chara, die rechts (b, d, f) Elodea. De bovenste grafieken (a en b) geven het fosforgehalte weer, de middelste (c en d) het stikstofgehalte en de onderste (e en f) de atomaire N:P verhouding. - . - of -e-: i+, - .... -: i-. De verticale stippeliijn geeft het tijstip van de incubatieomwisseling weer.

66

4.7.3 VERLOOP VAN DE OPNAMESNELHEDEN Het verloop van de opnamesnelheden is gevisualiseerd in figuur 4.18. Voor Chara werd waargenomen dat de opnamesnelheid reeds na twee dagen incubatie (dag 3 van het experiment) een hogere opnamesnelheid vertoonde in de Ci- conditie. Deze hogere opnamesnelheid werd niet aangehouden, na de initiele stijging van de opnamesnelheid wordt opnieuw een lichte daling waargenomen. Vanaf incubatiedag 16 werd opnieuw een hogere opnamesnelheid waargenomen. Het patroon voor de Ci+ conditie vertoont een gelijkaardig patroon, maar de opnamesnelheid ligt hier gemiddeld 1 flgP (g DWr l min-I lager dan in de Ci- conditie. Voor Elodea wordt een volledig ander patroon waargenomen. Hier daalden de opnamesnelheden, zowel in de Ei+ als de Ei- condities. Pas op dag 16 van de incubatie kon een merkbaar hogere opnamesnelheid worden waargenomen bij het plantenmateriaal van de fosforloze incubatie. Deze stijging van de fosfaatopnamesnelheid zette zich door tot aan de incubatieomwisseling. In de Ci+ conditie daalde de opnamesnelheid traag tot ze, op dag 26 van het experiment (dag van de incubatieomwisseling), nog slechts 28% van de initiele waarde bedroeg.

10-,-------------, "O~

·o:;.s

10-,---------------,

8

='= E Q) ...,

:.;; ~

6

Q)a

~.9

c c..

4

Cl.C)

O

2

2

incubatietijd (dagen)

incubatietijd (dagen)

Figuur 4.18 Verloop van de opnamesnelheid van fosfaat, bij pre'incubatie in fosforloos (i-, _.A_) en fosforbevattend (i+, - e - ) medium. De vertikale stippellijn geeft het tijdstip aan waarop de incubatiecondities omgewisseld werden. De linkse figuur betreft Chara, de rechtse Elodea.

4.7.4 VERBAND TUSSEN DE OPNAMESNELHEID EN HET FOSFORGEHALTE De biplots suggereerden, zeker in het geval van Elodea, een positief verband tussen opnamesnelheid en de C:P verhouding van het plantenmateriaal. De uitgevoerde Pearson correlatie-analyse op de gegevens van voor de omwisseling van de incubatiemedia resuIteerde inderdaad in een significant positief resuItaat (p < 0.0001, figuur 4.19 .a). Voor Chara werd geen significant lineair verband gevonden (figuur 4.19.b). Een betere voorstellingswijze blijkt echter de opnamesnelheid uit te zetten tegen het fosforgehaIte van de plant (zie figuur 4.19 c&d). De opnamesnelheid vertoont in deze grafiek bij benadering een hyperbolisch verband met het fosforgehalte. Uit figuur 4.19.c, en in mindere mate ook uit 4.20.d, blijkt dat de opnamesnelheid snel toeneemt als het fosforgehaIte van de plant een bepaalde kritische ondergrens bereikt. am de verschillen tussen Chara en Elodea beter te visualiseren werden beide in eenzelfde grafiek gezet (figuur 4.20). De gegevens van het 'Chara fosforverzadigingsexperiment' (cf. 4.8) werden ook toegevoegd aan de grafiek. De grafiek laat toe te besluiten dat de gebruikte Elodea reeds bij hogere interne fosforconcentraties zijn fosfaatopname stimuleert dan het geval is voor beide experimenten met Chara. Opvallend is dat, voor beide experimenten met Chara, de opnamesnelheid bij 'fosforverzadiging' (horizontaal deel van de grafiek) niet even groot is.

67

(a)

6.,-------------------,

(b) 6 - . - - - - - - - - - - - - - - - - - - , "tJ

1:

.r:

E

. ••

5

0Qj ._

•

0;"7

4

.

iii~

.• .

IDCl 3

.

E '"

°a 500

700

1250

1000

o

~) 6,-----------------------------~

. ....,•••. . .••

5-

•

'Qi ..r: E 4ai.,-

••+

••

iii~

Q)Cl 3-

E '" C\l~

ca. 2c.",

°a

•• •

atomaire C:P verhouding

(e) 6

i::

•+

O~---.---r---.----~-----r-~ 250 500 750 1000 1250 1500

1500

atomaire C:P verhouding

"tJ

·•

ca. 2 c.",

o~-~·.,---._----._----._----.---~ 250

•·

C\l~

••• • *'1

o

•

• ••• •• • • • ••

, ,.; .*•

1-

•

0 0.00

0.05

0.10

0.15

••

.•

• 0.20

••

O~----,_----._----~----~----~--~

0.25

0.30

0.00

fosforgehalte plantenmateriaal (mmol (g 0\1\1)-1)

0.10

0.05

0.15

0.20

0.25

0.30

fosforgehalte plantenmateriaal (mmol (g 0\1\1)-1)

Figuur 4.19 (a,b) Verband tussen de fosfaatopnamesnelheid bij 750 I-IgP 1-1 en de C:P verhouding van het plantenmateriaal voor (a) Elodea en (b) Chara. (c,d) Verband tussen de fosfaatopnamesnelheid bij 750 I-IgP 1-1 en het fosforgehalte van het plantenmateriaal voor (c) Elodea en (d) Chara.

I I I¢ I I I I I \

" E

[J

Chara verz

"

Chara

¢

Elodea

~

4

iCl S a.

a'"

3

"tJ

'Qi .r:

ai

iii ID E

C\l

c:

0.

°

¢

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

fosforgehalte (mmol (g 0\1\1)-1)

Figuur 4.20 Verband tussen fosforgehalte en opnamesnelheid. Er werden geen gegevens ge"incorporeerd van na de mediumomwisseling. De gefitte hyperbolische curven zijn weergegeven (----: Chara verzadigingsexperiment, - : Chara, - -: Elodea). De parameters voor de hyperbolen kunnen in appendix 4 worden teruggevonden (tabel AA.14).

68

4.7.5 VERBAND TUSSEN DE OPNAMESNELHEID EN HET STIKSTOFGEHALTE Het verband tussen de N:P verhouding van het plantenmateriaal en de opnamesnelheid, dat gesuggereerd werd in de biplots (figuren 4.15 en 4.16), blijkt significant (Pearson correlatie) voor zowel Chara als Elodea (p < 0.001 in beide gevallen) (figuur 4.21 c&d). De opnamesnelheid werd ook tegenover het stikstofgehalte van het plantenmateriaal uitgezet (figuur 4.21). Voor een bepaald stikstofgehalte, lijkt de opnamesnelheid steeds gemiddeld hoger te liggen voor de i- conditie dan voor de i+ conditie. Voor Elodea kan uit de grafiek niet veel afgeleid worden. Het patroon voor Ei- is zeer onregelmatig en er wordt hier dan ook geen correlatie gevonden. Voor Ei+ wordt een negatieve correlatie waargenomen tussen opnamesnelheid en N-gehalte (p = 0.0097, Pearson correlatie). Voor de Ci- conditie wordt een positieve trend waargenomen tussen het stikstofgehalte en de opnamesnelheid (p = 0.0139). Voor Ci+ moet worden aangenomen dat de opnamesnelheid niet verandert in functie van de stikstofconcentratie.

7.5

Ow 0_i:: J:: E "0

Qi.,.

55$ Q)o ~.9

Co.. 0..0> 0 3

7.5

(a)

i:: .0; ."0

6.0-

J::

•

3.01.5-

55$ Q)O

4.5

0>

3.0

E

.

C\l~

.. *

•. i .. ' !

E

Qi.,.

.

4.5-

Co.. 0..0> 0 3

•

0.0 0.8

0.9

1.1

1.0

(b) 6.0

··.-- . . •

1.4

1.3

1.5

1.5

1.6

(e)

.

Q) .-

E 5.0

.

IllS EO C\l

0>

0..0.. 0 0>

I

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6

N-gehalte plantenmateriaal (mmol (g DVV)-1) 7.5

" ' ._0C

C~

"

.: "

N-gehalte plantenmateriaal (mmol (g DVV)-1)

C"-.

.

t" ..

0.0

1.2

7.5

J:: Qi~

.... .. .

.....

...•'I ••

3 0.0 0

1

2

3

4

5

Q) .-

== E Q)~

C"-.

6

7

~

... •

*

C\l

0>

C~

0..0.. o 0>

. .. ... .... . t· .. • .

5.0-

IllS EO

•

2.5

(d)

"0";._ C

•

I

•••• •• •••

2.5

3

•

0.0 8

9

10 11

atomaire N:P verhouding

12 13 14 15

0

5

10

15

20

25

30

35

40

atomaire N:P verhouding

Figuur4.21 De opnamesnelheid bij 750 !lgP 1-1 als functie van het stikstofgehalte (a en b) en de N:P verhouding (c en d) van de plant. e: i+, ... : i-. (a) en (c): Elodea; (b) en (d): Chara. Let op de verschillende schalen op de xas van figuren (c) en (d).

4.7.6 W AARGENOMEN PATRONEN BIJ DE INCUBATIEOMWISSELING Op dag 26 van het experiment werden de incubatieregimes omgewisseld. De planten die voordien in fosforbevattend medium zaten, werden nu in fosforloos medium geplaatst en vice versa. De condities blijven echter, voor de eenvoud, dezelfde naam behouden: i+ en i-. De opname-experimenten stopten voor Chara op dag 35 van het experiment, voor Elodea op dag 44. De incubatieomwisseling had een aantal opmerkelijke responsen tot gevolg. Het fosforgehalte (figuur 4.17 a&b) leek voor Ci+ nagenoeg constant te blijven op het bereikte niveau; bij Ci- steeg het echter zeer snel. Waar de Ci+ conditie voor de incubatieomwisseling 25 dagen nodig had om zijn

69

fosforgehalte te verdrievoudigen, verviervoudigde na de herincubatie de Ci- conditie zijn fosforgehalte op slechts negen dagen. Bij Elodea steeg het fosforgehalte net zo spectaculair in de Ei- conditie. Voor Ei+ daalde het fosforgehalte gestaag na de incubatieomwisseling. Het stikstofgehalte (figuur 4.17 c&d) bleef constant in de Ei+ conditie en begon opnieuw toe te nemen in de Ei- conditie. Bij Chara leken de stikstofgehaltes niet systematisch te veranderen na de herincubatie. Ook de veranderingen in opnamesnelheid zijn spectaculair. In Ci+, waar de opnamesnelheid nagenoeg constant was gebleven gedurende de volledige periode voor de preYncubatie, verdubbelde deze na de herincubatie om daar een plateau te bereiken. De opnamesnelheid van de Ci- conditie daalde geleidelijk maar snel tot ongeveer 25% van de waarde bij preYncubatie na negen dagen herincubatie. Bij Elodea waren de veranderingen nog opzienbarender. De opnamesnelheid van de Ei+ conditie vertienvoudigde op 5 dagen, waarna ze op dit niveau stabiliseerde en terug een beetje afnam op experimentdag 45. In de Ei- conditie decimeerde de opname op 9 dagen tijd. Na 18 dagen in het fosfaatrijke medium te zitten werd bij zelfs netto efflux waargenomen bij de opnamecondities 200 en 750 /lgP rl. In de data-analysen werden de opnamesnelheden hiervoor manueel op 0 gebracht.

4.8 HET CHARA FOSFORVERZADIGINGSEXPERIMENT In een poging na te gaan of het fosforgehalte bij Chara een bovengrens kent werd een bijkomend experiment uitgevoerd waarbij de planten in de ene conditie aan zeer hoge fosfaatconcentraties werden blootgesteld (1.5 mgP rl); in de andere conditie werd Chara nogmaals uitgedag hongerd. De nitraatconcentratie werd zodanig gekozen dat ze zeker voldoende laag was om stikstoflimitatie tot ---- ............ "stand te laten komen in de incubatie bij /'"":.;;; ~ hoge fosforconcentratie. \ / 0.8

0.6

//

00

0.4

~

I

0.2

Bij het bepalen van de stikstofgehaltes van het plantenmateriaal werd voor de vierde dag van het experiment (tweede meting) een fout gemaakt. Om niet aIle gegevens van deze metingsdag veri oren te laten gaan in de analyses werd een waarde voor het stikstofgehalte berekend door lineaire intrapolatie van de stikstofgehaltes van de omringende metingsdagen (dag 1 en dag 14).

/ ·:14 0-:14.

//

-:2\

/'

\._~

\

I I

0-:

opijamesl1elheld /' ./

I

5 or--=--__________~~~I--~r-~+~~----~

I

~

~4

I I I

C

·0

G;N ·0.

1

C 0

/

+:4

!.. .bio1'Tlass

.(J

-1.2

-0.8

-0.6

-OA

+:~:4

•

I • t

-0.2

0.2

0.4

0.6

0.8

'-2

Factor 1

Figuur 4.22 toont de biplot die resulteerde uit de principaalcomponentanalyse. Opvallend zijn opnieuw de correlatie tussen C:P, N:P en opname70

Figuur 4.22 Biplot voor het fosforverzadigingsexperiment. Factor 1 verklaart 50% van de variabiliteit, factor 2 nog eens 35% (totaal 85%). De factorladingen van de verschillende variabelen zijn terug te vinden in tabel A.4.15 uit appendix 4. - -: Ci-; - : Ci+.

snelheid. De datapunten zijn duidelijk geclusterd volgens de verschillende meetdagen. De twee condities bewegen zich ook in deze figuur snel weg van elkaar in functie van de tijd. De afbuiging die beide paden vertonen zijn grotendeels gevolg van het gebruik van de variabele incubatieduur (dag) in de factoranalyse. Ook in deze biplot liggen C:N en biomassa ongeveer tegenover de incubatietijd. De +P conditie beweegt zich reeds vanaf de tweede meetdag (na 3 dagen preYncubatie) sterk weg van de cluster met C:P, N:P en opnamesnelheid. De planten namen veel stikstof op (figuur 4.23.b); na de volle 28 dagen incubatie was hun stikstofgehalte opgelopen tot meer dan 160% van de initiele waarde. De planten van de -P conditie namen in het begin van de incubatie ook vlot nitraat op, maar deze opname stopte later. Het koolstofgehalte van de Chara uit de +P conditie lag hoger dan dat van de -P conditie, ten gevolge van een plotse stijging tussen dag 1 en dag 4 van het experiment. De fosforconcentratie van de planten neemt snel toe in de +P conditie. Na de volle 28 dagen bedroeg het fosforgehalte meer dan het tienvoudige dan bij de start van het experiment. De fosforconcentratie van de -P conditie kent een wisselvallig patroon (figuur 4.23.a), wat zich zeer sterk uit in de C:P en N:P verhoudingen (figuur 4.23.c). De C:P en de N:P verhoudingen vertonen een nagenoeg identiek patroon, omdat be ide vooral bepaald worden door de grote verschillen in fosforconcentratie van het weefsel. In wat voIgt zal vooral de C:P verhouding gebruikt worden. De snelheden van fosfaatopname (enkel gemeten bij 750 /lgP rl, figuur 4.23.d) verlopen volgens eenzelfde patroon als de C:P en de N:P verhoudingen, zoals de biplot reeds suggereerde. Ook in deze grafiek is het merkwaardige wisselvallige patroon dat we zagen in de C:P verhoudingen van de -P conditie terug te vinden (figuur 4.23.d). De opnamesnelheid vertoont dan ook een extreem significant lineair verband met de C:P verhouding van het plantenmateriaal (p < 0.000001) (figuur 4.23.e). De opnamesnelheid werd ook hier uitgezet in functie van het fosforgehalte (figuur 4.23.f). Het hyperbolische verband tussen beide variabelen, dat we reeds eerder zagen (figuur 4.20), is weergegeven in de figuur.

~~

0.30 0.25

"'3:

1.00

<1> '" ~~

0.75

0.20

~o

.e:: '" 0

0.15

£z

E

O.OS

~o Q)

Cl

Cl

~

.2 E

""'" -E0 Ui

0.10

E

0.00

1800

1.25

Q)::::""

(a)_+p _.p

0.50

(b)

~

·ro

-+p

10

0.25

10

15

20

25

30

~f ~ ~

--p

~~3~

~

~ ~E

/

.•

g.3 1 20

25

20

25

30

o

300

600

.

900

.

1200 1600 1600

atomaire C:P verhouding

-+p --p

(e)

1200

900 600

300

30

0: 0•

4

E .8l 2 '" c:: ll. 0>

§-2:1 15

15

(e)

<1> 0

OJ Il. <:: '"

10

0

5~-----------,

'iii :; ;;; ~ 3

E .8l 2

5

E

1500

10

incubatietijd (dagen)

5~-------------. 4 (d) -+P

incubatietijd (dagen)

10

5

incubatietijd (dagen) ~

~

--p

0.00 5

0.. U

15

20

25

30

incubatietijd (dagen) "C

.;:; :;

~ ~E

5..,.---------------, (f)

4

;;;~3 <1>0

E .8l 2 "'Il. <:: 0>

g-2;1

L.

:-.-~-,....--.

0.00 O.OS

0.10

0.15 0.20 0.25 0.30

fosforgehalte (rrm::i PIg DV\?")

Figuur 4.23 Verloop van de nutrientengehaltes en de opnamesnelheid bij het Chara fosforverzadigingsexperiment. (a) verloop van het fosforgehalte; (b) verloop van het stikstofgehalte; (c) verloop van de C:P verhouding; (d) verloop van de opnamesnelheid bij 750 IJgP 1-1 ; (e) opnamesnelheid in functie van de C:P verhouding. met de lineaire fit; (f) opnamesnelheid in funtie van het fosforgehalte. met de hyperbolische fit.

71

In de -P conditie is de opnamesnelheid duidelijk positief gecorreleerd met het stikstofgehalte van het plantenmateriaal (Pearson correlatie: p = 0.002; figuur 4.24.a) terwijl in de +P conditie (figuur 4.24.b) de opnamesnelheid geen patroon vertoont in functie van het stikstofgehalte (de eerste opnamedag niet te na gesproken - drie datapunten links in de scatterplot). Zowel voor het Chara-Elodea experiment als voor het Chara fosforverzadigingsexperiment werd waargenomen dat de planten van de +P condities donkerder groen waren dan de planten van de -P condities. Bovendien was in het Chara fosforverzadigingsexperiment het plantenmateriaal van de +P conditie veel zwakker dan dat van de -P conditie. Vooral de kranscellen waren in de eerstgenoemde conditie veel gemakkelijker los te maken van het thallus. Geen van deze bijkomende waarnemingen werd gekwantificeerd.

5,--------------------------, (b)

~ ~t: ~'E 4

(a)

·•~ .• · .: *

Q)~

•

~

§'

3

"'0

~ 9 Co..

2

•

:

Q.Cl1

02:

O~--r-~---r--~~---r--'-~

0.50

0.55

0.60

0.65

0.70

0.75

stikstofgehalte (mmol (g DVV)-1)

0.60

0.50

0.55

0.60

0.65

0.70

0.75

0.60

0.85

0.00

stikstofgehalte (mmol (g DVV)-1)

Figuur 4.24 Opnamesnelheid in functie van de stikstofconcentratie. (a) gegevens van de -P conditie, (b) gegevens van de +P conditie_

72

BESPREKING Omwille van de aanzienlijke omvang van de bespreking werd aan sommige punten een korte samenvatting toegevoegd.

5.1 DE OPNAME VAN FOSFOR DOOR CHARA GLOBULARIS Ondergedoken macrofyten staan zowel in contact met het sediment als met de waterkolom en kunnen dus van de fosforpools aanwezig in beide compartimenten gebruik maken. Over het algemeen vertegenwoordigt het sediment in de meeste ondiepe meren een belangrijke fosforreserve (zie o.a. Raven (1981) en Scheffer (1998) voor een overzicht). Het lijkt er echter op dat Chara geen, of slechts zeer weinig, fosfaat opneemt uit het sediment. De meeste vasculaire macrofyten doen dit weI, en meestal is het sediment zelfs de belangrijkste fosforbron (o.a. Carignan & Kalff, 1980; Rattray et al., 1991). Ook in vijver 19bis bevat het sediment waarschijnlijk grote hoeveelheden fosfor (cf. 5.3). Dat de Chara globularis uit deze vijver waarschijnlijk geen fosfor opneemt uit het sediment blijkt uit het zeer lage fosforgehalte van het plantenmateriaal (gemiddeld ca. 0.025 mmol (g DWrl ;::; 0.08 massa% van het drooggewicht). Bij deze interne fosforconcentraties bevindt het plantenmateriaal zich in fosforstress (cf. figuur 4.20 en latere bespreking in 5.8). Te verklaren waarom Chara geen fosfor opneemt uit het sediment blijfi, op basis van de verzamelde gegevens, giswerk. Er kunnen in dit kader echter twee hypothesen vooropgesteld worden. De eerste is dat Chara niet in staat is fosfor op te nemen uit het sediment. Box (1986) toonde aan dat het rizoid van Chara hispida in staat was Pi op te nemen, maar dat de opname sterk terugviel bij anoxiciteit van het incubatiemedium. In dense Chara-matten werd vastgesteld dat het sedimentoppervlak soms anaeroob is (Round, 1981). Ook in vijver 19bis werd met de diepte in de Chara-mat een gradient van afnemende aerobie vastgesteld (Wouter Rommens, ongepubliceerde gegevens). Het is mogelijk dat de combinatie van deze twee factoren de opname van fosfor uit het sediment verhindert. Een tweede hypothese is dat Chara weI in staat is fosfor op te nemen uit het sediment maar dat dit fosfor het groeiende thallus niet kan bereiken. De Chara globularis van vijver 19bis vertoont immers basale sterfie. Dit fenomeen werd voor het eerst beschreven door Andrews et al. (1984). Deze basale sterfte houdt in dat de onderste internodia (bij de Chara uit vijver 19bis een vijftal) sterk senescent of afgestorven zijn. Het is waarschijnlijk dat transport van fosfor vanuit het rizoid naar het groeiende thallus sterk wordt gehinderd of onmogelijk wordt gemaakt door deze basale sterfie. In het kader van de eerste hypothese kan men zich afvragen waarom er uit de anaerobe zone, waar veel fosfor in oplossing is (Scheffer, 1998), geen fosfaat ontsnapt naar de waterkolom. Mogelijk is ook hier de Chara-mat voor verantwoordelijk. Die zou immers een scherp afgelijnde grens kunnen veroorzaken tussen een anoxische zone (vlakbij het sediment, in de zone van de bas ale sterfie) en een zuurstofrijke zone (in de actieffotosynthetiserende zone van de vegetatiemat). Deze scherpe overgang zou, in het ijzerrijke water van vijver 19bis kunnen zorgen voor een uiterst efficiente resedimentatie van het vrijgekomen fosfor. Merk nogmaals op dat het bovenstaande in sterke mate hypothetisch is. Uitsluitsel geven in deze kwesties vraagt verder onderzoek.

73

Merk op dat de tweede hypothese enkel mag toegepast worden op dense Chara-matten waar de planten basale sterfie vertonen. Het rizold en de fosforpool uit het sediment kunnen wei een rol spelen in situaties waar geen basale sterfte optreedt (b.v. bij diffuse Chara-bedden of in vegetaties waar ook vaatplanten staan die de vorrning van dense bedden tegengaan) of bij kiemplantjes, waar helemaal geen sprake is van basale sterfie. In dit laatste geval is het zelfs heel waarschijnlijk dat het rizold een aanzienlijke bijdrage aan de fosforvoorziening levert (grate gelijkenis met de omstandigheden uit de experimenten van Littlefield & Forsberg, 1965 en Box, 1986). Samenvatting: Op basis van de resultaten kan worden besloten dat in vijver 19bis het sediment waarschijnlijk een belangrijke fosforreserve vertegenwoordigt. Nochtans lijkt het er sterk op dat de aanwezige Chara, in tegenstelling tot wat bij de meeste vaatplanten wordt waargenomen, geen fosfor opneemt uit het sediment. In dit kader werden twee hypothesen gesteld. Enerzijds kan een zuurstofgebrek aanleiding geven aan slechte fosfaatopname uit het sediment. Anderzijds is het mogelijk dat basale sterfie geen transport van opgenomen fosfor naar het groeiende thallus toelaat.

5.2

KINETICA VAN DE FOSFAATOPNAME

Tijdens de opname-experimenten voor de seizoenale opvolging werd gedurende ongeveer vijf uur de fosfaatconcentratie van het incubatiemedium opgevolgd. Deze ken de, over deze lange tijdspanne, een bij benadering exponentieel afnemend verloop. Aangezien echter de capaciteit tot fosfaatopname van het gebruikte plantenmateriaal snel afneemt bij incubatie in medium met hogere fosfaatconcentraties (o.a. Muchhal & Raghothama, 1999; Dong et ai., 1999; Liu et al., 1998; eigen waamemingenresultaten niet weergegeven), werd ervoor gekozen enkel de eerste drie a vier meetwaarden te gebruiken. Door de scatterplot van deze datapunten kon met zeer hoge nauwkeurigheid een rechte kon worden gefit. De Michaelis-Menten scatterplots die voor Chara werden waargenomen wijzen op de aanwezigheid van (minstens) twee opnamesystemen, een van hoge en een van lage affiniteit. Dit is overeenkomstig met wat in andere Characeae (Mimura et ai., 1998; Reid et ai., 2000) en ook in hogere planten wordt gevonden (o.a. Dunlop et al., 1997; Raghothama, 1999 en referenties hierin; Van Tichelen & Colpaert, 2000). Bij Chara globularis Thuill. var. globularis (Breekbaar kransblad) lijkt het er sterk op dat het hoge affiniteitssysteem gelnhibeerd wordt als de fosfaatconcentratie van het opnamemedium 2000 IlgP rl (~ 65 11M) overstijgt (figuur 4.I.a). Dit werd niet teruggevonden bij Chara corallin a (Mimura et al., 1998; Reid et ai., 2000). Het was, ten gevolge van dit fenomeen, niet mogelijk door het volledige bereik van de gebruikte concentraties (0 tot 10000 IlgP rl) zinvolle curven te fitten. De functies die door Borstlap (1983) werden voorgesteld (figuur 5.1), voldoen enkel voor situaties waar zulke inhibitie niet voorkomt. Het is, bij mijn weten, voorlopig niet bekend hoe zulke patranen best wiskundig worden beschreven.

74

V = Vmax . [Pi]medium Km + [Pi ]medium

e[p·]. V =Vmax.[Pi]medium .] +. I medium [ K m+ PI medium Vmax 2 . [Pi ]medium V = Vmax I . [Pi ]medium + --==-=--~ Kml + [Pi ]medium Km2 + [Pi ]medium Figuur 5.1 Gebruikte functies ter beschrijving van de fosfaatopname. Naar Borstlap, 1983.

Er werd gekozen om door het bereik 0 tot 2000 IlgP rl de curven voorgesteld door Borstlap (1983) te fitten. De curve die gebruikt wordt voor standaard Michaelis-Menten kinetica (figuur 5.1, bovemi.an) leverde goede r2-waarden. De curve met een bijkomende lineaire factor (figuur 5.1, midden) gaf resultaten van gelijkaardige kwaliteit. De derde functie die BorstIap voorstelde benaderde echter de resultaten het best (figuur 5.1, onderaan). Gebruik van deze functie bracht echter een ander, groot probleem met zich mee. In een aantal gevallen werden negatieve Kml-waarden gevonden. Daarom werd geopteerd om in het bereik 0 tot 2000 IlgP rl de zeer goede benadering met een opnamesysteem te gebruiken (figuur 5.1, bovenaan). Hoewel dus duidelijk blijkt uit de resultaten dat twee opnamesystemen aanwezig zijn, wordt de kinetica wiskundig benaderd door een functie opgesteld voor de werking van een enkel enzym. Binnen het gebruikte bereik van fosfaatconcentraties is dit echter een zeer goede benadering van de gegevens, die ook door andere auteurs wordt aangewend (o.a. Dong et ai., 1999). Aangezien het er sterk op lijkt dat bij de fosfaatconcentraties 5000 en 10000 JlgP I-I de fosfaatopname door het opnamesysteem met hoge affiniteit tot nul is herleid, werd in de gegevenstabel voor de seizoenale opvolging van de ecologie van vijver 19bis de opnamesnelheid bij 5000 JlgP rl toegevoegd als maat voor de werkzaamheid en de mate van aanwezigheid van de lage affiniteits-transporter.

Samenvatting: Chara globularis bezit, net zoals andere charofYten en de hogere planten, een tweefazig opnamesysteem voor fosfaat. Het lijkt er zeer sterk op dat bij Chara globularis het opnamesysteem met hoge affiniteit ge"inhibeerd wordt bij hogere externe fosfaatconcentraties (> 65 11M). Er werd, om praktische redenen, gekozen om, ondanks het feit dat de opname tweefazig is, eenfazige Michaelis-Menten curven te fitten door de gegevens.

5.3

SEIZOENALE OPVOLGING

Op de gegevens over de seizoenale opvolging van enkele belangrijke abiotische en biotische componenten van vijver 19bis werd pricipaalcomponentanalyse (PCA) toegepast. Er werd zowel op de gegevens van het volledige jaar 2000 als op de gegevens van de maanden juli tot december van hetzelfde jaar een aparte analyse gedaan. Dit werd gedaan omdat enerzijds vanaf juli bijkomende gegevens werden verzameld over de nutrientinhoud van het plantenmateriaal (C:N:P verhoudingen). Anderzijds is het zo dat gedurende de eerste helft van het jaar de fosfaatopname-experimenten door een andere onderzoeker werden uitgevoerd (De Smedt, 2000). De eerder willekeurige patron en die werden waargenomen tijdens die eerste he 1ft van hetjaar stonden in contrast met het duidelijk patroon dat werd waargenomen gedurende de tweede he 1ft van het jaar en deden twijfels rijzen bij deze resultaten. De levenscyc1us van Chara lijkt een aantal ingrijpende invloeden te hebben op het systeem. Injuli sporuleerde de aanwezige Chara. Deze sporulatie werd gevolgd door senescentie en afsterven van de planten. In de maand van het afsterven van het plantenmateriaal (augustus) werd een veellagere zuurstofverzadiging van het water waargenomen. Dit is waarschijnlijk een gevolg van de verminderde fotosynthese in combinatie met de persistentie van de aerobe afbraak van organisch materiaal in het water. Het is mogelijk dat deze aerobe afbraak door vrijzetting van organische stoffen uit het dood macrofYtweefsel (Graneli & Solander, 1988; Carpenter, 1980) wordt gestimuleerd.

75

Dat verminderde fotosynthese en/of persistente aerobe afbraak van organisch materiaal aan de basis ligt van de achteruitgang van de zuurstofconcentratie wordt verder gesuggereerd door het verloop van de CO2-concentratie, die tijdens de betrokken periode nagenoeg het dubbele bedroeg van de gangbare waarde. In de herfst (september en oktober) werd een omvangrijke fosfaatpiek duidelijk. Bierbij is het opvaIlend dat nagenoeg aIle fosfor in de waterkolom aanwezig is als orthofosfaat. Bet is onmogelijk dat deze fosfaatpiek door uitlekking van fosfor uit de senescente Chara-planten wordt veroorzaakt. Een ruwe berekening op basis van de fosforinhoud van het plantenmateriaal in augustus, september en oktober wees uit dat, ten gevolge van uitlekking van Pi uit het plantenmateriaal, slechts ongeveer 30 IlgP rl in het water kon terechtkomen in de periode augustus-september en ongeveer 90 IlgP rl in de peri ode september oktober. De fosfaatpiek van september is echter aanzienlijk groter (ongeveer 900 IlgP rl). Er moeten dus andere mechanismen werkzaam zijn geweest. De lage zuurstofverzadiging die werd waargenomen vanaf augustus heeft mogelijk een bijdrage in de vrijzetting van fosfor uit het sediment. Bet fosfaat in het sediment is aanwezig als onoplosbare Fe- en Al-zouten. Bij anoxiciteit worden echter ijzer en aluminium gereduceerd en is hun affiniteit voor fosfaat vee I kleiner. Op deze manier kunnen aanzienlijke hoeveelheden fosfor worden vrijgezet uit het sediment (Scheffer, 1998; Holtan et ai., 1988; zie ook 2.2 en in het bijzonder figuur 2.2.b). Deze hypothese kan echter niet met de beschikbare gegevens worden bevestigd. Onderzoek van de genomen bodemsta1en kan hier verdere evidentie leveren. De fosforpiek uit de herfst is grotendee1s als orthofosfaat aanwezig. Dit betekent dat het fytop1ankton over deze tijdspanne niet in staat was het beschikbare fosfor op te nemen. De fytoplanktondensiteit was en bleef laag tijdens de herfst. Er moet een of andere beperkende factor voor fytoplanktongroei aanwezig zijn geweest gedurende deze maanden. Landers (1982; uit Graneli & Solander, 1988) yond in zijn experiment dat, na het afsterven van de macrofytvegetatie, de fytoplanktondensiteit weI toenam ten gevolge van de hogere nutrientconcentraties. De uitgesproken densiteitspiek van cyanobacterien in de epifytongemeenschap gedurende de maanden september en oktober komt bijzonder goed overeen met de fosfaatpiek. Dat dit in een oorzaak-gevolg verband moet worden gezien is niet duidelijk. Enerzijds werd de groei van de cyanobacterien ongetwijfeld gunstig be'invloed door de hoge fosfaatconcentratie, maar anderzijds is de late zomer en de vroege herfst vaak de peri ode waarin cyanobacterien van nature in hoge densiteit voorkomen (Jeppesen etai., 1999; Jupp & Spence, 1977). De afname van de fosfaatconcentratie na de piek in september is niet eenvoudig te verklaren. Vanaf oktober, maar zeer duidelijk vanaf november was er plaatselijk hernieuwde groei van Chara. Deze hernieuwde groei zal ongetwijfeld een gedeelte van het fosfaat hebben weggenomen, maar kan, door opname alleen, niet instaan voor het verdwijnen van de volledige hoeveelheid fosfor, mede omdat Vmax laag is in die periode. Waarschijnlijk heeft de hernieuwde groei terug voldoende zuurstof in de vijver gebracht om het fosfor als ijzer- en aluminiumzout te do en neerslaan. Uit de tweede biplot blijkt dat de maximale snelheid van fosfaatopname (V max) geen verband vertoont met het intern fosforgehalte van de plant. In het Chara-Elodea experiment en het Chara fosforverzadigingsexperiment vonden we echter weI een duidelijke correlatie tussen fosforgehalte en snelheid van fosfaatopname (cf. figuur 4.20). Bet fosforgehalte van Chara was echter zeer laag in het veld (verticale deel van het patroon in figuur 4.20) en vertoonde slechts weinig variatie (minimum 21

76

~mol P (g DWr I, maximum 24 ~mol P (g DWrI). Bij deze permanente fosforstress zullen ook andere

factoren een invloed hebben op de opnamesnelheid (zie verder). Er werd geen correlatie gevonden tussen het fosfaatgehalte van het plantenmateriaal enerzijds en Km en de opnamesnelheid bij 5000 ~gP I-I anderzijds. Van de fosfaattransporter met lage affiniteit vermoedt men sterk dat hij constitutief tot expressie komt (Furihata et aI., 1992; Raghothama, 1999). Uit deze gegevens blijkt dat deze constitutieve expressie niet onder invloed staat van de interne fosforconcentratie. De snelheid van de fosfaatopname door het hoge-affinteitssysteem wordt, voor planten die in fosforstress verkeren, eerder door de externe fosfaatconcentratie dan door het intern fosforgehalte gecontroleerd (Liu et al., 1998; Muchhal & Raghothama, 1999). Uit de gegevens blijkt dat de fosfaatconcentratie in de waterkolom geen invloed heeft op de snelheid van fosfaatopname van Chara globularis uit vijver 19bis, hoewel de planten zeer waarschijnlijk in hun groei beperkt waren door fosfor. In dit kader kunnen drie mogelijke oorzaken naar voren worden geschoven. Eerst kan men stellen dat bij Chara andere mechanismen werkzaam zijn dan in de hogere planten die Liu et al. (1998) en Muchhal & Raghothama (1999) bestudeerden. Ongepubliceerde gegevens van Tetsuro Mimura tonen aan dat dezelfde fenomenen die bij hogere planten waargenomen worden ook bij Chara corallina voorkomen. Een tweede hypothese is dat geen verband kan worden gevonden tussen de opnamesnelheid en de fosfaatconcentratie van het water omwille van de lage variatie die deze laatste vertoont. Uiteindelijk kan geopperd worden dat de prei"ncubatie in fosforloos medium gedurende de nacht voor het opname-experiment de verschillen in opnamesnelheid heeft uitgevlakt. De vooropgestelde vraag, of er een verband bestaat tussen opnamesnelheid enerzijds en interne en externe fosforconcentraties anderzijds, kan niet uit de verzamelde gegevens worden beantwoord. Waarschijnlijk heeft dit vooral te maken met de geringe variatie van de fosforconcentraties in waterkolom en weefsel. Aan de hand van de waargenomen patronen van fosfaatopname is het aannemelijker deze in verband te brengen met ontwikkelingsstadia van de planten. Er werden hoge opnamesnelheden waargenomen in de peri ode van sporulatie en in de peri ode van de heraanvatting van de groei in de late herfst en de vroege winter. In dit verband is verder onderzoek gewenst. Enclosure-experimenten met manipulatie van de externe fosforconcentratie kunnen hier een uitweg bieden. Deze laten toe om bij planten van hetzelfde ontwikkelingsstadium de snelheid van fosfaatopname enkel in functie van de externe (en interne) fosforconcentratie te beschouwen. Ze laten tegelijkertijd toe te controleren of het inderdaad de ontwikkelingscyc1us is die verantwoordelijk is voor de waargenomen patronen. Merk uiteindelijk op dat het gevaarlijk is de waargenomen kinetische kenmerken te extrapoleren naar het fosfaatopname in het veld. In het laboratorium werd immers gewerkt onder constante licht- en temperatuursomstandigheden. Deze variabelen veranderen echter in veldomstandigheden, met aanzienlijke invloed op energiebeschikbaarheid en werkingssnelheid van de transporters. Dat energiebeschikbaarheid een duidelijke invloed heeft op de fosfaatopname werd door Reid et al. (2000) aangetoond voor Chara corallina. Het vooropgestelde doel, namelijk om na te gaan welke invloed interne en externe fosforconcentratie hebben op de snelheid van fosfaatopname, kon echter enkel bereikt worden door te werken bij con stante incubatieomstandigheden.

77

Samenvatting: De levenscyclus van Chara, de dominante macrofyt in vijver 19bis, heeft een grote invloed op het ecosysteem. Dit blijkt uit de drastische veranderingen die de abiotische kenmerken ondergingen na de senescentie en het afsterven van de planten. In deze peri ode werd een omvangrijke fosfaatpiek waargenomen in de waterkolom. Deze wordt toegeschreven aan anoxische fosfaatvrijzetting uit het sediment. De kinetische parameters van de fosfaatopname konden niet in verband worden gebracht met de fosforconcentratie van het water, noch met die van het plantenmateriaal. Oat de interne fosforconcentratie weinig invloed heeft op de opnamesnelheid is waarschijnlijk: het plantenmateriaal beyond zich gedurende het volledige jaar in fosforstress. Onder fosforstress staat de snelheid van fosfaatopname van planten vooral onder controle van de externe fosforconcentratie. Oat ook hiermee geen verband werd gevonden is waarschijnlijk te wijten aan de geringe variatie die ze vertoonde. De enige variabele waarmee de opnamesnelheid correlatie vertoonde was de ontwikkeling van de plant. De opnamesnelheid was hoog bij sporenvorming en intense groei van jonge scheuten. Er worden enclosure-experimenten voorgesteld om de invloed van de interne en externe fosforconcentratie verder uit te diepen.

5.4 DE INVLOED VAN NA+ EN K+ OP DE FOSFAATOPNAME Het kation waarmee het fosfaat wordt toegediend speelde wei degelijk een rol in de inleidende experimenten (cf. 4.3.1). Bij lage fosfaatconcentraties in het medium verliep de opname steeds sneller als fosfaat werd toegediend als K3P04 • Bij hoge fosfaatconcentraties werd in december waargenomen dat K+ een gunstiger effect had dan Na+ de fosfaatopname; in november was dit omgekeerd. Er werden geen seizoenale variaties gevonden die verantwoordelijk kunnen zijn voor dit verschil. Verder werden twee experimenten uitgevoerd om na te gaan welke invloed de natriumconcentratie heeft op de opnamesnelheid, een met en een zonder voorafgaande natriumuithongering. De fosfaatopname is duidelijk hoger in de conditie met natriumuithongering. Oat door natriumuithongering de fosfaatopname gestimuleerd wordt geeft een aanw1Jzmg in verband met de aard van het transmembranair transport van fosfaat. Ais de fosfaattransporter immers ook een natriumtransporter is, zal deze bij natriumstress worden gei"nduceerd. Tetsuro Mimura en Robert Reid (pers. med.) von den zeer recent gelijkaardige fenomenen bij Chara corallin a, waar reeds Na+IPi cotransport werd aangetoond (Reid et aI., 2000). Wat betreft het waargenomen patroon van fosfaatopname in functie van de natriumconcentratie (figuur 4.7) kan worden besloten dat de opnamesnelheden globaal gezien het hoogst liggen in de condities met I en 2 mM natrium. Bij hogere natriumconcentraties werd een duidelijke afname van de fosfaatopname vastgesteld. In afwezigheid van natrium was de opnamesnelheid hoger dan in aanwezigheid ervan in de conditie zonder prei"ncubatie; in de conditie met prei"ncubatie daarentegen was de opnamesnelheid lager in de 0 mM Na+ conditie. Heel waarschijnlijk wijst dit op een onnauwkeurigheid in het experiment. Het plantenmateriaal werd in de cuvetten gebracht zonder voorafgaande spoeling in gedesioniseerd water. Zo heeft de aan- of afwezigheid van natrium in het oorspronkelijke medium (standaard APW in het geval van het experiment zonder prei"ncubatie, APW zonder Na+ in het geval van de natriumuithongeringsconditie) waarschijnlijk een invloed gehad op de opname. Deze hypothese wordt bevestigd door het derde experiment (4.3.3), waarbij, na spoelen van het plantenmateriaal in gedes78

ioniseerd water, de opnamesnelheden bij afwezigheid van Na+ telkens lager waren dan die bij aanwezigheid ervan. Uiteindelijk werd nog een experiment uitgevoerd om zowel de invloed van Na+ als K+ op de fosfaatopname na te gaan, deze keer zonder Na+-contaminaties. De opnamesnelheid nam duidelijk toe in aanwezigheid van natrium. De verschillen waren vooral groot in de condities waar preYncubatie gebeurde in standaard APW. Dit komt overeen met wat eerder reeds werd vastgesteld, namelijk dat de snelheid van fosfaatopname toeneemt als de planten natriumuitgehongerd worden (condities 1 en 4 tegenover 7 en 10). De hier vastgestelde resultaten komen overeen met de resultaten van Reid et al. (2000). Zij vonden dat toediening van 0.4 mM Na+ een significant stimulerend effect had op de snelheid van fosfaatopname bij Chara corallina. Het is wei van belang op te merken dat de verschillen tussen de condities met 0 en 1 mM Na+ vee I kleiner zijn dan in het experiment met C. corallin a (Reid et al., 2000). Er kunnen twee oorzaken aan de basis liggen van dit verschil. Ten eerste werd in het experiment van Reid et al. (2000) 0.4 mM Na+ toegediend. Mogelijk wordt de fosfaatopname reeds bij 1 mM Na+ ge"inhibeerd. Een tweede mogelijkheid is dat het verschil tussen beide experimenten te wijten is aan het gebruik van andere soorten. Bij C. corallin a staat de grote intemodiumcel in direct contact met het exteme medium, terwijl deze bij C. globularis bedekt wordt door een laag cortexcellen. Dit kan tot gevolg hebben dat er bij het spoelen van het plantenmateriaal toch nog Na+ aanwezig blijft in de intercellulaire matrix. Het is ook mogelijk dat de cortexcellen en de kranscellen, die in het experiment van Reid et al. (2000) niet aanwezig waren, het afwijkende gedrag verklaren. Een derde mogelijkheid in verband met het gebruik van andere soorten is dat bij C. globularis, hier geoogst uit zoet water, het W/Pi transportsysteem sterker tot expressie komt dan het Na+/Pi transportsysteem. Mimura en medewerkers vonden recent dat dat bij C. corallina naast het Na+lPi cotransportsysteem ook genetische code voor een W/Pi transporter aanwezig is (Tetsuro Mimura, pers. med.).

Samenvatting: De fosfaatopname van Chara corallina, een soort uit brak water, is natriumgemedieerd (Reid et al., 2000). Dit betekent niet dat ook Chara-soorten uit zoet water dit Na+/Pi cotransport vertonen. Nochtans werd bij Characeae uit zoet water reeds cotransport van een aantal andere stoffen met Na+ aangetoond (o.a. Walker & Sanders, 1991). Aanwezigheid van natrium in het opnamemedium had ook bij Chara globularis een stimulerend effect op de snelheid van fosfaatopname. Bovendien werd de fosfaatopname gestimuleerd door natriumuithongering. Uit deze resultaten kan echter niet besloten worden dat ook hier de fosfaatopname gebeurt via Na+lPi cotransport. De kaliumconcentratie bleek van ondergeschikt belang aan de natriumconcentratie.

5.5

OPNAME-EXPERIMENTEN VAN ZEER KORTE DUUR

Uit de experimenten die trachtten de natrium- en kaliumconcentraties aan de fosfaatopname te koppelen bleek reeds een duidelijke invloed van de aanwezigheid van natrium. Mimura en medewerkers toonden aan dat het genoom van Chara coral/ina zowel codeert voor een Na+/Pi cotransporter 79

als voor een H+(Pi cotransporter. In een poging de aard van het transmembranair transport bij Chara globularis te achterhalen werd een kortetermijn experiment uitgevoerd. Er gebeurde duidelijke fosfaatopname in de experimenten. De pH van het medium zakte lichtjes in aIle experimenten bij de fosfortoediening. Sakano (1990) nam, in een systeem met protoncotransport, waar dat de pH van het medium sterk steeg bij fosfortoediening. Er moet dus besloten worden dat in deze experimenten met Chara globularis waarschijnlijk geen protoncotransport plaatsgrijpt. De natriumbepalingen in het opnamemedium zijn echter onvoldoende nauwkeurig om een cotransport te bewijzen. Om ondubbelzinnig aan te tonen dat de opname van fosfaat natriumgemedieerd is, zuIlen dus andere methoden moeten worden gevonden. Het gebruik van radioactief natrium 2Na) zal vee I nauwkeurigere resultaten opleveren en laat toe zowel de radioactiviteit van het het medium als van het plantenmateriaal op te volgen. Deze methode werd door Reid et al. (2000) met succes toegepast op gei"soleerde intemodiumceIlen van Chara corallina.

e

Samenvatting: Ook in deze experimenten kon niet worden bewezen dat de fosfaatopname via een Na+lPi transporter verloopt. De resultaten suggereren weI dat protoncotransport onwaarschijnlijk is. Bijkomende experimenten waarin 22Na wordt gebruikt, kunnen oplossing bieden.

5.6 INVLOED VAN DE pH OP DE SNELHEID VAN FOSFAATOPNAME De adaptatie van het plantenmateriaal aan de opgelegde pH verliep voor de meeste condities vrij vlot. Na drie a vier dagen was de pH meestal nagenoeg stabiel. Bij de extreme pH-condities werd voor het Czp experiment afwijking van de oorspronkelijke pHwaarde waargenomen (figuur 4.1 O.a). Aangezien voor het bepalen van de opnamesne1heden slechts de eerste datapunten, waardoor een rechte kon worden gefit, werden gebruikt (cf. 5.2), zal de invloed van deze pH-variaties eerder klein zijn. Bij de andere pH-experimenten werd weinig afwijking van de beoogde pH-waarden waargenomen. De fosfaatopname blijkt voor Cmp en Czp significant verschillend bij verschillende pH-waarden. De waargenomen patronen zijn bovendien verschillend bij de verschillende fosfaatconcentraties in het opnamemedium. In de 200 IlgP rl conditie werd eerder een afname van de opnamesnelheid gevonden met toenemende pH. Bij de 750 en 2000 IlgP rl condities werd echter een duidelijk optimum van de opnamesnelheid gevonden bij intermediaire pH-waarden. Deze gegevens komen niet overeen met het pH-optimum dat waargenomen werd voor de proton-fosfaat transporters (dit bedraagt 4.5 a 5) (Raghothama, 1999). De waargenomen patronen van fosfaatopname zijn erg gelijkend aan wat Box (1986) vond voor het rizoid van Chara hispida. Het patroon dat door Reid et al. (2000) werd gevonden voor de fosfaatopname van Chara coral/ina was duidelijk anders. Hier nam de opname af met toenemende pH. Het lijkt er sterk op dat bij Chara globularis de voorkeur voor opname van H 2P04- boven sterker geYoniseerde vormen van Pi veel kleiner is dan bij Chara corallina. Ook voor Nitella blijkt de fosfaatopname gemiddeld genomen optimaal te verlopen bij intermediaire pH. De opnamesnelheid was opmerkelijk hoger bij Chara (Czp) dan bij Nitella. Ais de 80

interne fosforconcentraties van beide so orten echter gei'nterpreteerd worden naast figuur 4.20 met de resuItaten van het Chara-Elodea experiment en het Chara fosforverzadigingsexperiment, moet men tot de conclusie komen dat deze verschiIlen eerder hieraan gebonden zijn dan aan intrinsieke verschillen in fosfaatopname tussen beide soorten. Hoewel de pH in natuurlijke waters sterk varieert (dag-nacht cyclus), zou deze een aantal ecologische consequenties kunnen hebben voor de fosfaathuishouding van het meer. Naast het belang van de pH voor het evenwicht van de fosforconcentraties in het sediment en de waterkolom (Scheffer, 1998), is hier dus ook een invloed op de fosfaatopname door macrofYten aangetoond.

Samenvatting: De fosfaatopname van de onderzochte soorten verloopt globaal genom en optimaal in het centrale deel van het onderzochte bereik. De voorkeur voor laaggei'oniseerd Pi (H2 P04-) is zwakker dan bij Chara corallina. Waarom de patronen in opnamesnelheid verschillen bij de verschillende fosfaatconcentraties in het opnamemedium blijft onduidelijk. De lagere opnamesnelheid die Nitella verto on de was waarschijnlijk te wijten aan het grote verschil in fosforstatus van het plantenmateriaal en niet aan soortspecifieke verschillen.

5.7 SNELHEID VAN DE RESPONS BIJ FOSFAA TUITHONGERING Er werd aangetoond dat de fosfaatopname van Chara met hoog intern fosforgehalte, dat gei'ncubeerd was bij 1500 f.lgP rl (experiment parallel met het fosforverzadigingsexperiment), significant hoger was als de planten voor het opname-experiment een prei'ncubatie in fosforloos medium ondergingen. De opnamesnelheid nam nochtans lang niet zoveel toe dat ze in de buurt kwam van de -P conditie van het fosforverzadigingsexperiment. Het blijkt dus dat het opnamesysteem met hoge affiniteit bij Chara globularis geactiveerd wordt door gedurende korte periodes exteme fosforstress aan te leggen. Dit is consistent met de gegevens over andere planten en wieren (Liu et al., 1998; Muchhal & Raghothama, 1999; Wykoff et al., 1999; Dong et al., 1999; Raghothama, 1999). De resultaten van het Chara-Elodea experiment en het Chara fosforverzadigingsexperiment werden waarschijnlijk slechts weinig bei'nvloed.

5.8 HET CHARA-ELODEA EXPERIMENT Het Chara-Elodea experiment is het eerste uit het derde luik van het voorgesteld onderzoek. Het doel was de patronen die de nutrientgehaItes en de fosfaatopname vertonen bij fosforuithongering en fosforaanrijking in verband te brengen met de groeistrategieen van beide so orten en aldus een zicht te krijgen op de competitieve sterkte bij eutrofiering. In de bespreking van het Chara-Elodea experiment zullen regelmatig resuItaten uit het Chara fosforverzadigingsexperiment worden aangehaald.

Chara en Elodea houden er een andere groeistrategie op na. Chara globularis vormt typisch dense bedden, waarbij het grootste deel van de biomassa zich dicht bij de bodem van het meer bevindt. De soort vertoont trage apicale groei, die vaak gecompenseerd wordt door basale sterfte (Andrews et al., 1984). De tum-over snelheid van biomassa (en dus ook nutrienten) is laag. 81

Elodea nutallii, een exoot in onze streken, groeit uitgesproken sneller, en zal vanop de bodem snel naar de oppervlakte groeien en daar het grootste gedeelte van zijn biomassa produceren. De snelle en persistente groei geeft in de bovenste waterlaag aanleiding aan een dichte vegetatiemat. De tum-over snelheid van biomassa (en nutrienten) is hoog. Bij fosforuithongering van Chara bleefhet fosforgehalte nagenoeg constant terwijl het bij Elodea weI aanzienlijk daalde. Waarschijnlijk was dit een gevolg van het feit dat de Chara bij aanvang van het experiment onder sterkere fosforstress stond dan de Elodea. De Elodea uit de fosforuithongeringsconditie bleef groeien en waarschijnlijk herverdeelde het hiertoe de reserve aan fosfor. Bij vergelijking van de fosforaanrijkings- en -uithongeringscondities zien we dat het stikstofgehalte voor elke soort toeneemt in beide condities, maar dat deze toename in de uithongeringscondities snel een plateau bereikt. Dit lijkt overeen te komen met de hypothese van Shaver & Melillo (1984; uit Graneli & Solander, 1988), die zegt dat luxe-opname van een element element geremd wordt als een ander element limiterend is. Hierbij moet weI opgemerkt worden dat het stikstofgehalte niet aIleen functie is van luxe-opname en reserveopslag maar bijvoorbeeld ook van herverdeling na groei. De N:P gehaltes van het plantenmateriaal zijn sterk variabel bij Chara, terwijl deze bij Elodea binnen veel striktere grenzen blijven. De sterke variatie van de N:P gehaItes in Chara zijn in eerste plaats toe te schrijven aan de sterke toename van het fosforgehalte in de +P conditie. De stikstofgehaIten varieren amper bij Chara. De N:P verhouding van Elodea blijft binnen veel nauwere grenzen, ondanks sterk variabele stikstof- en fosforgehaltes van het plantenmateriaal. De N:P verhouding die voor Elodea werd waargenomen blijft niet aIleen binnen strikte grenzen, ze is gemiddeld ook veel lager dan die voor Chara. Hoewel planten van nature zeer uiteenlopende nutrientgehaltes kunnen vertonen ten gevolge van hun ongebalanceerde groei (Elser et al., 2000a), komen lage N:P verhoudingen globaal gezien overeen met snelgroeiende soorten (Elser et al., 1996 en 2000a). Gedurende het experiment werden inderdaad duidelijke verschillen in groeisnelheid waargenomen. Elodea groeide zowel in de fosforuithongerings- als -aanrijkingsconditie veel sneller dan Chara. Indien de nauwe grenzen waarbinnen de N:P van Elodea varieert genetisch bepaald zijn, heeft dit belangrijke consequenties voor zijn concurrentiele positie. Het zal immers relatief fosforrijke waters nodig hebben om de macrofytvegetatie efficient te domineren. In fosforgelimiteerde vijvers zal Elodea het lastiger hebben. Merk hierbij weI op dat Elodea bij lage fosforconcentraties in het water in staat is fosfor uit het sediment op te nemen (Carignan & Kalff, 1980; Bristow & Whitcombe 1971). Verderop wordt nog dieper ingegaan op de fosforminnende aard van Elodea. In figuur 4.20 wordt gesuggereerd dat de grens van interne fosforconcentratie onder dewelke verhoogde fosfaatopname (fosforstress) optreedt, een fysiologische constante is voor het ecotype (of de soort). Beide curven voor Chara stijgen immers vanaf ongeveer dezelfde fosforconcentratie. In dit verband is echter verder onderzoek wenselijk. De huidige experimenten werden immers uitgevoerd met Chara uit slechts een vijver, zodat het enige verschil tussen de planten van het Chara-Elodea experiment en het fosforverzadigingsexperiment is dat ze met een maand verschil werden geoogst. Elodea kwam uit een andere vijver. Hoewel de fosforconcentratie vanafwaar fosforstress optreedt nagenoeg gelijk is voor beide experimenten met Chara, verschilt de minimale opnamesnelheid (bij relatief hogere interne fosfaat82

concentraties) weI. In dit verband kunnen drie hypothesen naar voren worden gebracht. De eerste is dat er een seizoenaal effect waar te nemen is. Het plantenmateriaal voor het Chara-Elodea experiment werd een maand vroeger geoogst dan dat voor het verzadigingsexperiment. Dat de planten bij het bereiken van het horizontaal deel van de grafiek reeds geruime tijd onder laboratoriumomstandigheden waren ondergebracht, ontkracht deze hypothese enigszins. Een tweede mogelijkheid is een verschil in de incubatiecondities. Voor het Chara-Elodea experiment werd het plantenmateriaal voor de fosforaanrijkingsconditie gelncubeerd in APW met 750 )lgP r I en 5 mgN rl. Voor dezelfde conditie van het fosforverzadigingsexperiment waren de incubatieomstandigheden drastischer: er werd gebruik gemaakt van APW met 1500 )lgP rl en slechts 2.5 mgN I-I. Het is voor hogere planten geweten dat de fosforconcentratie van het medium een invloed heeft op de fosfaatopname (o.a. Liu et aI., 1998; Muchhal & Raghothama, 1999). Een laatste hypothese in dit verband is dat een eventueel verschil in protelnegehalte (fosfaattransporters) de verschillen in opnamesnelheid zou veroorzaken. In de uithongeringsconditie van het verzadigingsexperiment was N immers de beperkende factor in het medium. De stikstofgehaltes (geen protelnegehaltes) zijn inderdaad lager in het verzadigingsexperiment (gemiddeld ongeveer 0.7 mmol (g DWrl tegenover ongeveer 1.0 mmol (g DWr l voor het Chara-Elodea experiment). Verdere analyse van de resultaten uit het Chara-Elodea experiment tonen een correlatie tussen het stikstofgehalte van het plantenmateriaal en de fosfaatopname, in de eerste plaats voor de -P condities. Of dit zonder meer in een oorzaak-gevolg verband mag worden gezien is niet af te leiden uit de resultaten. Hoewel het stikstofgehalte (via het protelnegehalte) ongetwijfeld een invloed uitoefent op de fosfaatopname, covarieerden in de hier besproken condities de graad van fosforuithongering en het stikstofgehalte. Dit laat dus niet toe te besluiten dat de toename van de snelheid van fosfaatopname enkel gevolg is van hogere stikstofgehalten. Bij de incubatieomwisseling werden een aantal interessante waamemingen gedaan. Ten gevolge van de hoge opnamesnelheden die werden bereikt gedurende de fosforuithongering, nam het fosforgehalte van de planten uit de i- condities zeer snel toe na de incubatieomwisseling. De opnamesnelheid zakt tamelijk snel bij Elodea, bij Chara eerder traag. De fosforuithongering die vanaf de incubatieomwisseling wordt opgelegd aan het plantenmateriaal van de i+ condities maakt dat de opnamesnelheden zeer snel stijgen en deze hoge waarden aanhouden. De respons is minder uitgesproken bij Chara dan bij Elodea. Het is duidelijk dat na de incubatieomwisseling andere factoren de snelheid van fosfaatopname controleerden dan ervoor. In de i+ condities, waar de opnamesnelheid mooi gecontroleerd leek door het fosforgehaite het plantenmateriaal, steeg plots de opnamesnelheid met een factor 2 voor Chara en met een factor 10 voor Elodea, terwij I de fosforgehaltes niet aanzienlijk veranderden. Dit is in overeenkomst met de resultaten uit de literatuur (Clarkson & Scattergood, 1982; Muchhal & Raghothama, 1999; Dong et al., 1999) en wijst er duidelijk op dat de exteme fosforconcentratie van groot belang is voor de opnamesnelheid. Het is erg waarschijnlijk dat de hoge snelheden van fosfaatopname die ontstonden bij de fosforuithongering gevolg zijn van verhoogde expressie van de genen coderend voor de fosfaattransporters met hoge affiniteit (Muchhal & Raghothama, 1999; Dong et al., 1999). Deze kunnen op korte termijn (dagen tot uren) sterk in aantal toenemen door 'de novo' synthese. Ook de afname van de opnamesnelheid, die werd waargenomen bij toediening van fosfaat aan het groeimedium van fosforuitgehongerde planten, komt overeen met de resultaten uit de literatuur. Dat de 83

terugval van de opnamesnelheid een nagenoeg perfect exponentieel verloop kent, steunt de hypothese dat de sterke verhoging van het fosforgehalte van de planten (soms tot toxische niveaus, cf. Cogliatti & Clarkson, 1983), een gevolg is van een eerder lage turn-over snelheid van de fosfaattransporters uit de membraan (Dong et aI., 1999; en referenties daarin). Bij Chara nam de opnamesnelheid veeI trager af dan bij Elodea. Vooraleer in te gaan op een aantaI ecologische aspecten van de waarnemingen, wordt nog een bedenking gemaakt bij het model van Koerselman en Meuleman (1996) dat de N:P verhouding van de vegetatie koppelt aan de aard van nutrientlimitatie. Koerselman & Meuleman (1996) stelden voor een gamma Europese moerasvegetaties (vennen, moerassen, natte heide) een model op om te bepalen of de groei van het plantenmateriaal in natuurlijke omstandigheden in fosfor-, stikstof- of cogelimiteerd was door beide. Ze vonden voor de door hen gebruikte gegevens kritische massa-N:P waarden van 14 en 16. Dit komt ongeveer overeen met atomaire verhoudingen van 31 en 35.5. Voor N:P verhoudingen onder de eerste waarde von den zij stikstofgelimiteerde groei, voor verhoudingen hoger dan de tweede waarde fosforgelimiteerde. In wat voIgt worden enkel nog atomaire N:P verhoudingen besproken. Als we de snelheid van fosfaatopname gebruiken als maat voor fosforlimitatie, kunnen we, afgaande op het waargenomen patroon tussen opnamesnelheid en N:P gehalte bij Elodea (figuur 4.2l.c), besluiten dat deze soort reeds vanaf een inwendige N:P verhouding van ongeveer 12.5 fosforlimitatie ondervond. Voor Chara (figuur 4.21.d) werd geen duidelijke stijging van de opnamesne1heid waargenomen vanaf een welbepaalde N:P verhouding. Mogelijk was het plantenmateriaal de heIe tijd in fosforstress. Dit laatste word alleszins gesuggereerd door figuur 4.20 waar, voor het Chara verzadigingsexperiment, een diepteplateau van de fosfaatopname wordt waargenomen na een tijdje incubatie in de +P conditie. Dit diepteplateau werd, waarschijnlijk door de minder drastische behandeling, niet bereikt in de Ci+ conditie van het Chara-Elodea experiment. Dat het model van Koerselman en Meuleman niet overeenkomt met de gegevens voor Elodea uit deze studie kan een aantal verschillende oorzaken hebben. Zo is het mogelijk dat niet gedurende het hele experiment aan de assumpties voor het gebruik van het model werd voldaan. Er moet nameIijk op elk ogenblik ofwel fosforlimitatie, ofwel stikstoflimitatie, ofwel een combinatie van deze twee voorkomen. Hoewel dit waarschijnlijk het geval was, kan men dit niet zonder meer aannemen. Een tweede oorzaak voor het verschil tussen beide studies is dat Koerselman & Meuleman zich toelegden op moerasplanten. Deze staan in contact met de bodem en halen het merendeeI van hun nutrienten hieruit. De situatie in 'eehte' aquatisehe systemen en in dit experiment is anders. Elser et al. (2000b) haalden bovendien aan dat mogelijk de ideale N:P verhouding lager is voor limnetische systemen dan voor terrestrisehe. Op eventuele oorzaken hiervoor werd niet ingegaan. Enkel op basis van gegevens voor een soort het model van Koerselman & Meuleman (1996) verwerpen of aanpassen is onzinnig. Binnen eenzelfde vegetatie vertonen verschillende soorten immers vaak andere, soms sterk afwijkende, N:P verhoudingen (Koerselman & Meuleman, 1996). Door vergelijking van de waarnemingen bij Chara en Elodea kan worden bevestigd dat Elodea een fosforminnende soort is, of dat ze tenminste geadapteerd is aan relatief fosforrijk water. Een eerste waarneming is dat bij fosforuithongering het fosforgehalte van Elodea duidelijk afnam terwijI het bij Chara nagenoeg constant bleef. Dit mag echter niet zonder meer gei"nterpreteerd worden alsof Chara beter in staat is het aanwezige fosfor vast te houden. Waarschijnlijk is dit eerder gevolg van hun andere groeistrategieen die zieh ook in het laboratorium uitten: de Nitella groeide duidelijk sneller, en 84

de lagere fosforgehalten in het weefsel zijn dan ook waarschijnlijk grotendeels te verklaren door herverdeling van het fosfor. Ook figuur 4.20 wijst op de fosfonninnende aard van Elodea. Het weefsel reageert reeds bij veel hogere fosforgehalten op fosforuithongering door de opnamesnelheid te verhogen. Men zou dit patroon echter ook kunnen toeschrijven aan de verschillende achtergrond van beide soorten (Chara uit vijver 19bis, Elodea uit bomkrater). Deze mogelijkheid wordt gedeeltelijk ontkracht door de fosforconcentraties van beide waters, die nagenoeg gelijk zijn (zelfs iets hoger in vijver 19bis). Verder onderzoek is in dit verband gewenst. Een algemene waarneming bij de incubatieomwisseling is dat de opnamesnelheid bij Elodea sneller reageert op de veranderende omstandigheden dan bij Chara. Dit blijkt vooral bij fosforuithongering van de i+ conditie. Ondanks het hoge fosforgehalte van het plantenmateriaal verhoogt Elodea in deze omstandigheid zeer snel de opnamesnelheid. Men zou de hypothese kunnen stellen dat het net aan dit hoge fosforgehalte te danken is dat er zo snel kan worden gereageerd. Hoge fosforconcentraties komen immers overeen met grote hoeveelheden rRNA (Elser et al., 1996 en 2000a) en Iaten op die manier snelle aanmaak van fosfaattransporters toe. Ook de afname van de opnamesnelheid gebeurt sneller bij Elodea dan bij Chara, al is hier het verschil niet zodanig groot. Waarschijnlijk is de tum-over van membraanproteYnes groter bij Elodea. De snelheid van de reactie op cellulair vlak, zoals hierboven beschreven, komt goed overeen met die van de reactie op het niveau van de volledige plant. Elodea is een snel groeier, met hoge turn-over van biomassa, Chara groeit veel trager. Elodea zal, bij fosfaataanrijking, op korte tijd veel biomassa aanmaken, Chara niet. Ais Chara en Elodea blootgesteld worden aan eutrofiering zijn beide soorten in staat zijn een aanzienlijke hoeveelheid fosfor op te slaan in hun weefsels en op die manier de heldere toe stand te bufferen (o.a. Scheffer, 1998). Chara is echter niet in staat de fosforaanrijking om te zetten in snellere groei. Dit betekent dat, als Chara en Elodea samen voorkomen in een vijver, Elodea bij eutrofiering sterk zal bevoordeeld zijn. Dit wordt bevestigd door waarnemingen uit het veld: bij eutrofiering wordt Chara vaak overwoekerd door Elodea (Luc Vervoort en Wouter Rommens, pers. med.). Hetzelfde geldt voor fytoplankton. Bij fosforaanrijking wordt de groei van het fytoplankton sterk gestimuleerd (o.a. Forsberg et aI., 1990, Jeppesen et al., 2000). Hierdoor worden de ondergedoken waterplanten beschaduwd (o.a. Scheffer et al., 1993). Ook in dit geval zal Chara meer nadeel ondervinden dan Elodea aangezien bij Chara het grootste deel van de biomassa kort bij de bodem van de vijver zit en Elodea dichter aan het wateroppervlak groeit. Het is echter mogelijk dat Chara, bij middel van allelopathie, het hoofd kan bieden aan het fytoplankton (Wium-Andersen et al., 1992; Kleiven, 1991).

Samenvatting: De opnamesnelheid bleek duidelijk gecorreleerd met de inwendige fosforstatus van de plant. Elodea lijkt gevoeliger aan fosforstress dan Chara. Het verhoogt reeds zijn fosfaatopname als het inwendig fosforgehalte afneemt onder 0.3% van het DW. Chara doet dit pas als het fosforgehalte onder de 0.15% van het DW zakt. De N:P verhouding van het weefsel is bij Elodea tamelijk constant en veel lager dan bij Chara, wat in overeenstemming lijkt met de groeistrategie van beide soorten. Bij fosforstress is de snelheid van fosfaatopname gekoppeld aan het stikstofgehalte van het plantenmateriaal. Of dit in een oorzaak-gevolg verband moet worden gezien is echter niet duidelijk. 85

De fosfaatopname van Elodea reageert sneller op veranderende omstandigheden dan die van Chara. Waarschijnlijk is Elodea, door toedoen van zijn lage N:P verhouding, in staat op korte tijd veel fosfaattransporters te produceren. Vermoedelijk is ook de turn-over snelheid van membraanproteYnes groter. Elodea kan, beter dan Chara, een toediening van fosfor omzetten in verhoogde groeisnelheid. Dit betekent een competitief voordeel van de soort bij eutrofiering. Bij lage fosforconcentraties is Chara waarschijnlijk competitief bevoordeeld.

5.9 HET CHARA FOSFORVERZADIGINGSEXPERIMENT Uit het Chara-Elodea experiment bleek dat Elodea in staat was fosforaanrijking om te zetten naar hogere groeisnelheden. Bij Chara was dit vee I minder het geval. Desondanks dit nam Chara veel fosfor op in het weefsel. Dit experiment heeft als hoofddoel na te gaan of de fosforopslag in het weefsel beperkt is tot een zeker niveau, of er met andere woorden een limiet is waarboven Chara geen fosfaat meer kan opslaan in het weefsel. De fosforconcentratie van het plantenmateriaal stijgt, net als in het Chara-Elodea experiment geleidelijk in de +P conditie, al is de stijging in dit geval veel sneller dan in het Chara-Elodea experiment. Het fosforgehalte vertienvoudigde gedurende het experiment en nog steeds werd geen asymptotisch verloop gevonden. De snellere stijging van het fosforgehalte in vergelijking met het CharaElodea experiment is waarschijnlijk te wijten aan het drastischere incubatieregime. Het stikstofgehalte stijgt zowel in de +P als de -P conditie. In de -P conditie vie I het N-gehalte echter terug na de initiele toename. Dit komt overeen met wat we waarnamen in het Chara-Elodea experiment, zowel voor de Ci- als de Ei- conditie. De hypothese van Shaver & Melillo wordt hier dus opnieuw bevestigd. Er werd in de -P conditie een significant positief verband waargenomen tussen het stikstofgehalte van het plantenmateriaal en de opnamesnelheid. In de +P conditie was geen dergelijk verband aanwezig. Dit komt overeen met de gegevens uit het Chara-Elodea experiment. Een opvallende waarneming is dat de Chara uit de +P conditie veel zwakker was dan in de -P conditie. Vooral de kranscellen kwamen snel los van de rest van het thallus. Dit fenomeen is, bij mijn weten, nooit eerder beschreven. Indien inderdaad het plantenmateriaal zwakker wordt met incubatie in fosforrijk medium, zou dit belangrijke ecologische gevolgen kunnen hebben. Het plantenmateriaal zal in dit geval bij eutrofiering sneller beschadigd worden. Ook is het mogelijk dat deze zachte en nutrientrijke planten meer gegeten worden. Van Chara is geweten dat het door vissen, vogels en slakken wordt gegeten. Characeae zijn bij de eerste macrofyten die verdwijnen bij eutrofiering (Forberg, 1964; Blindow, 1992a; en referenties in beide). De vraagstelling bij dit experiment, of er een limiet is aan het fosforgehalte van Chara, kan voorlopig niet worden beantwoord. Er werd gedurende het experiment een vertienvoudiging van het fosforgehalte waargenomen zonder een asymptoot werd bereikt. Hiermee is natuurlijk niet bewezen dat er helemaal geen bovenlimiet aan de fosforconcentratie is. Het is echter zeer onwaarschijnlijk dat in de natuur fosforgehaltes zo hoog als de hier waargenomen (0.78% van het DW) tot stand kunnen komen.

86

KufeI & Ozimek (1994) toonden aan dat Chara in staat was de aanzienlijke nutrientinflux in het Luknajno-meer te compenseren. Ze kwamen tot de concIusie dat dit gedeeltelijk aan groei, en gedeeItelijk aan de opslagcapaciteit voor fosfor te danken was. Uit de hier besproken resuitaten blijkt dat Chara bijzonder grote hoeveelheden fosfor kan opslaan in het weefseI. Deze opslagcapaciteit betekent een competitief voordeeI, dat er, samen met de mogelijkheid tot sneIIe absorptie van fosfaat bij ogenblikkelijke fosforinput, voor zorgt dat Chara in staat is fYtoplanktonbloei te voorkomen (KufeI & Ozimek, 1994).

Samenvatting: Er kon geen bovengrens aan het fosforgehalte van Chara worden vastgesteld. De fosforconcentratie in het weefsel Iiep uiteindelijk op tot 0.78% van het drooggewicht. Deze grote opslagcapaciteit betekent dat de soort een aanzienlijke bufferwerking kan uitoefenen bij eutrofiering van een meer.

87

REFERENTIELIJST Andrews, M., I.R. Davison, M.E. Andrews and J.A. Raven. (1984) Growth ofChara hispida: I. Apical growth and basal decay. Journal of Ecology 72: 873-884 APHA, A WW A & WPCF (1985) Standard methods for the determination of water and wastewater. 16th edition. American Public Health Association, American Water Works Association, and Water Pollution Control Federation. Balls, H., B. Moss and K. Irvine. (1989) The loss of submerged plants with eutrophication: I. Experimental design, water chemistry, aquatic plant and phytoplankton biomass in experiments carried out in ponds in the Norfolk Broadland. Freshwater Biology 22: 71-87 Barko, J.W., D. Gunnison and S.R. Carpenter. (1991) Sediment interactions with submerged macrophyte growth and community dynamics. Aquatic Botany 41: 41-65 Bieleski, R.L. (1973) Phosphate pools, phosphate transport, and phosphate availability. Ann. Rev. Plant Physiol. 24: 225-252 Bieleski, R.L. and LB. Ferguson. (1983) Physiology and metabolism of phosphate and its compounds. In: A Uiuchli, A. and R.L. Bieleski, eds, Inorganic Plant Nutrition. Encyclopedia of Plant Physiology, New Series, Vol 15A, Springer- Verlag, Berlin, Germany, pp 422-449 Blindow, I. (1988) Phosphorus Toxicity in Chara. Aquatic Botany 32: 393-395 Blindow, I. (1992a) Decline of charophytes during eutrophication: comparison with angiosperms. Freshwater biology 28: 9-14 Blindow, I. (1992b) Long- and short-term dynamics of submerged macrophytes in two shallow eutrophic lakes. Freshwater biology 28: 15-27 Borstlap, A.C. (1983) The use of model-fitting in the interpretation of 'dual' uptake isotherms. Plant, Cell and Environment 6: 407-416 Box, RJ. (1986) Quantitative short-term uptake of inorganic phosphate by the Chara hispida rhizoid. Plant, Cell and Environment 9: 501-506 Bristow, J .M. and M. Whitcombe. (1971) The role of roots in the nutrition of aquatic vascular plants. American Journal of Botany 58: 8-13 Bun-ya M., K. Shikata, S. Nakade, C. Yompakdee, S. Harashima and Y. Oshima. (1996) Two new genes, PH086 and PH087, involved in inorganic phosphate uptake in Saccharomyces cerevisiae. Current Genetics 29: 344-351 Carignan, R. and J. Kalff. (1980) Phosphorus sources for aquatic weeds: water or sediments? Science 207: 987-989 Carignan, R. and J. Kalff. (1982) Phosphorus release by submerged macrophytes: Significance to epiphyton and phytoplankton. Limnology and Oceanography 27: 419-427 Carpenter, S.R. (1980) Enrichment of lake Wingra, Wisconsin, by submerged macrophyte decay. Ecology 61: 1145-1155 Chiang, C., C.B. Craft, D.W. Rogers and c.J. Richardson. (2000) Effects of 4 years of nitrogen and phosphorus additions on Everglade plant communities. Aquatic Botany 68: 61-78. Clarkson, D.T. and C.B. Scattergood. (1982) Growth and phosphate transport in barley and tomato plants during the development of, and recovery from, phosphate-stress. Journal of experimental botany 33: 865-875 Cogliatti, D.H. and D.T. Clarkson. (1983) Physiological changes in, and phosphate uptake by potato plants during development, and recovery from phosphate deficiency. Physiologia plantarum 58: 287-294 De Smedt, E. (2000) Allelopathie en nutrientopname bij Chara, Studie waterkwaliteit van 'De Maten' in Genk. Graduaatsthesis

89

Dong, B., P.R. Ryan, Z. Zengel and E. Delhaize. (1999) Phosphate uptake in Arabidopsis thaliana: dependence of uptake on the expression of transporter genes and internal phosphate concentrations. Plant, Cell and Environment 22: 1455-1461 Dunlop, J., H.T. Phung, R. Meeking and D.W.R. White. (1997) The kinetics associated with phosphate absorption by Arabidopsis and its regulation by phosphorus status. Australian Journal of Plant Physiology 24: 623-629 Elser, J.J., D.R. Dobberfuhl, N.A. MacKay and J.H. Schampel. (1996) Organism size, life history, and N:P stoichiometry. Bioscience 46: 674-684 Elser, J.1., R.W. Sterner, E. Gorokhova, W.F. Fagan, T.A. Markow, J.B. Cotner, J.F. Harrison, S.E. Hobbie, G.M. Odell and L.1. Weider. (2000a) Biological stoichiometry from genes to ecosystems. Ecology Letters 3: 540-550 Elser, J.J., W.F. Fagan, R.F. Denno, D.R. Dobberfuhl, A. Folarin, A. Huberty, S. Interlandi, S.S. Kilham, E. McCauley, K.L. Schulz, E.H. Siemann and R.W. Sterner. (2000b) Nutritional constraints in terrestrial and freshwater food webs. Nature 408: 578-580 Fish, G.R. and G.M. Will (1966) Fluctuations in the chemical composition of two lakeweeds from New Zealand. Weed Res. 6: 346-349 Forsberg, C. (1964) Phosphorus, a Maximum Factor in the Growth of Characeae. Nature 201: 517518 Forsberg, C., S. Kleiven and T. Willen. (1990) Absence of allelopathic effects of Chara on phytoplankton in situ. Aquatic botany 38: 289-294 Furihata, T., M. Suzuki, H. Sakurai. (1992) Kinetic characterization of two phosphate uptake systems with different affinities in suspension-cultured Catharanthus roseus protoplasts. Plant Cell Physiol. 33: 1151-1157 Graneli, W. and D. Solander. (1988) Influence of macrophytes on phosphorus cycling in lakes. Hydrobiologia 170: 245-266 Holtan, H., L. Kamp-Nielsen and A.O. Stuanes. (1988) Phosphorus in soil, water and sediment: an overview. Hydrobiologia 170: 19-34 Jeppesen, E., J.P. Jensen, M. Sondergaard & T. Lauridsen. (1999) Trophic dynamics in turbid and clearwater lakes with special emphasis on the role of zooplankton for water clarity. Hydrobiologia 408/409: 217-231 Jeppesen, E., J.P. Jensen, M. Sondergaard, T. Lauridsen and F. Landkildehus. (2000) Trophic structure, species richness and biodiversity in Danish lakes: changes along a phosphorus gradient. Freshwater biology 45: 201-218 Jungk A., c.J. Asher, D.G. Edwards and D. Meyer. (1990) Influence of phosphate status on phosphate uptake kinetics of maize (Zea mays) and soybean (Glycine max). Plant and Soil 124: 175-182 Jupp, B.P. and D.H.N. Spence (1977) Limitations on macrophytes in a eutrophic lake, Loch Leven. I. Effects of phytoplankton. Journal of Ecology 65: 175-186 Kjeldahl, J. (1883) A new method for the determination of nitrogen in organic matter. Z. Anal. Chem. 22: 366 Kleiven, S. (1991) An analysis of allelopathic effects of Chara on phytoplankton development. Acta Universitatis Upsaliensis. Comprehensive summaries of Uppsala Dissertations from the Faculty of Science 313 Koerselman, W. and A.F .M. Meuleman. (1996) The vegetation N:P ratio: a new tool to detect the nature of nutrient limitation. Journal of applied ecology 33: 1441-1450 Kufel, L. and T. Ozimek. (1994) Can Chara control phosphorus cycling in Lake Luknajno (Poland)? Hydrobiologia 275/276: 277-283 Lee, K-S and K.H. Dunton. (1999) Inorganic nitrogen acquisition in the seagrass Thalassia testudinum: Development of a whole-plant nitrogen budget. Limnology and oceanography 44: 1204-1215 90

Lefebvre, D.O. and A.D.M. Glass. (1982) Regulation of phosphate influx in barley roots: Effects of phosphate deprivation and reduction of influx with provision of orthophosphate. Physiologia plantarum 54: 199-206 Leggewie G., L. Willmitzer and J.W. Riesmeier. (1997) Two cDNAs from potato are able to complement a phosphate uptake-deficient yeast mutant: Identification of phosphate transporters from higher plants. Plant Cell 9: 381-392 Littlefield, L. and C. Forsberg. (1965) Absorption and translocation of phosphorus-32 by Chara globularis Thuili. Physiologia Plantarum 18: 291-296 Liu, C., U.S. Muchhal, M. Uthappa, A.K. Kononowicz and K.G. Raghothama. (1998) Tomato phosphate transporter genes are differentially regulated in plant tissues by phosphorus. Plant physiology 116: 91-99 Mimura, T. (1995) Homeostasis and transport of inorganic phosphate in plants. Plant Cell Physiol. 36: 1-7 Mimura, T., KJ. Dietz, W. Kaiser, MJ. Schramm, G. Kaiser and U. Heber. (1990) Phosphate transport across biomembranes and cytosolic phosphate homeostasis in barley leaves. Planta 180: 139-146 Mimura, T., RJ. Reid and A. Smith. (1998) Control of phosphate transport across the plasma membrane of Chara corallina. Journal of Experimental Botany 49: 13-19 Muchhal U.S. and K.G. Raghothama. (1999) Transcriptional regulation of plant phosphate transporters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 96: 5868-5872 Murphy, J. and J.P. Riley. (1962) A modified single solution method for the determination of phosphate in natural waters. Analytica Chimica Acta 27: 31-36 Ozimek, T., R.D. Gulati and E. van Donk. (1990) Can macrophytes be useful in biomanipulation of lakes? The Lake Zwemlust example. Hydrobiologia 200/201: 399-407 Phillips, G.L., D.F. Eminson and B. Moss. (1978) A mechanism to account for macrophyte decline in progressively eutrophicated freshwaters. Aquatic Botany 3: 55-63 Raghothama, K.G. (1999) Phosphate acquisition. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Bioi. 50: 665-693 Rattray, M.R., C. Howard-Williams and J .M.A. Brown. (1991) Sediment and water as sources of nitrogen and phosphorus for submerged rooted aquatic macrophytes. Aquatic botany 40: 225-237 Raven, J.A. (1981) Nutritional strategies of submerged benthic plants: the acquisition of C, Nand P by rhizophytes and haptophytes. New. Phytol. 88: 1-30 Reid, RJ., T. Mimura, Y. Ohsumi, N.A. Walker and F.A. Smith. (2000) Phosphate uptake in Chara: membrane transport via NaiPi cotransport. Plant, Cell and Environment 23: 223-228 Round, F.E. (1981) The ecology of algae. Cambridge University Press, Cambridge Sakano, K. (1990) Proton/phosphate stoichiometry in uptake of inorganic phosphate by cultured cells of Catharan thus roseus (L.) G. Don. Plant Physiology 93: 479-483 Sakano, K., Y. Yazaki and T. Mimura. (1992) Cytoplasmatic acidification induced by inorganic phosphate uptake in suspension cultured Catharanthus roseus cells. Plant Physiology 99: 672680 Sand-Jensen K. and J. Borum. (1991) Interactions among phytoplankton, periphyton, and macrophytes in temperate freshwaters and estuaries. Aquatic Botany 41: 137-175 Schachtman, D.P., RJ. Reid and S.M. Ayling. (1998) Phosphorus uptake by plants: from soil to cell. Plant Physiology 116: 447-453 Scheffer, M. (1990) Multiplicity of stable states in freshwater systems. Hydrobiologia 200/201: 475486 Scheffer, M. (1998) Ecology of Shallow Lakes. Chapman & Hall, London Scheffer, M., S.H. Hosper, M-L. Meijer, B. Moss and E. Jeppesen. (1993) Alternative Equilibria in Shallow Lakes. Trends in Ecology and Evolution 8: 275-279 91

Smith, F.A. and N.A. Walker. (1989) Transport of potassium by Chara australis. 1. A symport with sodium. Journal of Membrane Biology 108: 125-137 Takeshige, K., F. Mitsumori, M. Tazawa and T. Mimura. (1992) Role of cytoplasmic inorganic phosphate in light-induced activation ofW-pumps in the plasma membrane and tonoplast of Chara corallina. Planta 186: 466-472 Theodorou, M.E. and W.e. Plaxton. (1993) Metabolic adaptations of plant respiration to nutritional phosphate deprivation. Plant Physiology 101: 339-344 Twilley, R.R., M.M. Brinson and GJ. Davis. (1977) Phosphorus absorption, translocation, and secretion in Nuphar luteum. Limnology and Oceanography 22: 1022-1032 Ullrich-Eberius, C.1., A. Novacky, E. Fischer and U. Llittge. (1981) Relationship between energydependent phosphate uptake and the electrical membrane potential in Lemna gibba. Plant physiology 67: 797-801 Ullrich-Eberius, C.l., A. Novacky, A.J.E. van Bel. (1984) Phosphate uptake in Lemna gibba: energetics and kinetics. Planta 161: 46-52 Vaithiyanathan, P. and e.J. Richardson. (1999) Macrophyte species changes in the Everglades: Examination along a eutrophication gradient. J Environ. Qual. 28: 1347-1358 Van den Bergh, M.S., M. Scheffer and H. Coops. (1998) The role of charace an algae in the management of eutrophic shallow lakes. Journal of Phycology 34: 750-756 Van Tichelen, K.K. & J.V. Colpaert. (2000) Kinetics of phosphate absorption by mycorrhizal and non-mycorrhizal Scots pine seedlings. Physiologia Plantarum 110: 96-103 Van Vierssen, W. and T.e. Prins. (1985) On the relationship between the growth of algae and aquatic macrophytes in brackish water. Aquatic Botany 21: 165-179 Walker, N.A. and D. Sanders. (1991) Sodium-coupled solute transport in charophyte algae: A general mechanism for transport energization in plant cells? Planta 185: 443-445 Wium-Andersen, S., U. Anthoni, C. Christophersen and G. Houen. (1982) Allelopathic effects on phytoplankton by substances isolated from aquatic macrophytes (Charales). Oikos 39: 187-190 Wykoff, D.D., A.R. Grossman, D.P. Weeks, H. Usuda and K. Shimogawara. (1999) Psrl, a nuclear localized protein that regulates phosphorus metabolism in Chlamydomonas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 96: 15336-15341

92

SAMENVATTING Fosfor is een belangrijk macronutrient dat in de natuur voornamelijk door hoge-affiniteits fosfaattransporters wordt opgenomen. In deze scriptie wordt beschreven dat de fosfaatopname van Chara globularis afneemt bij externe fosfaatconcentraties groter dan 65 11M. Er word gesteld dat, bij deze hoge concentraties, het hoge-affiniteitssysteem geYnhibeerd wordt. De eerste doelstelling van deze studie was om seizoenale patron en van abiotische en biotische factoren uit een door de ondergedoken macrofyt C. globularis gedomineerde vijver te koppelen aan de kinetica van de fosfaatopname van deze soort. Er kon niet besloten worden dat de fosfaatopname verbonden was aan de fosforconcentratie van het plantenmateriaal of de waterkolom. Ze was eerder afhankelijk van het ontwikkelingsstadium van de planten, met hoge opnamesnelheden bij sporenvorming en intense groei van jonge scheuten. C. globularis bleek een grote impact te hebben op het ecosysteem. Bij afsterven van de planten werd het water anaeroob en gebeurde er waarschijnlijk fosfaatvrijzetting uit het sediment. Het lijkt er sterk op dat C. globularis in de bestudeerde vijver geen fosfor opneemt uit het sediment. In dit kader werden twee hypothesen gesteld. Enerzijds kan een zuurstofgebrek aanleiding geven aan slechte fosfaatopname uit het sediment. Anderzijds is het mogelijk dat basale sterfie geen transport van opgenomen fosfor naar het groeiende thallus toelaat. In een tweede luik van het onderzoek stond de invloed van abiotische factoren op de fosfaatopname centraal. Vooral natrium kreeg hierbij aandacht, omdat recent werd aangetoond dat de fosfaatopname bij Chara corallina in cotransport met natrium gebeurt. Ook de invloed van de pH werd onderzocht. Hoewel het niet rechtstreeks kon bewezen worden, suggereren drie waarnemingen duidelijk dat de fosfaatopname bij C. globularis, net zoals bij C. corallina, gebeurt door Na+/Pi cotransport. Vooreerst had de aanwezigheid van natrium in het opnamemedium een stimulerend effect op de fosfaatopname, met een optimum nabij 1 a 2 mM. Ten tweede veroorzaakte natriumuithongering verhoogde fosfaatopname en ten derde deed toediening van Pi aan het medium de pH hiervan niet stijgen, zoals verwacht kan worden bij proton-fosfaat cotransport. De fosfaatopname verliep, zowel voor C. globularis als voor Nitella jlexilis, optimaal in het centrale deel van het onderzochte bereik, bij pH-waarden van 6 tot 8. De voorkeur voor laaggeYoniseerd Pi (H 2POn is dus duidelijk zwakker dan bij sommige andere soorten. De patronen van fosfaatopname in functie van de pH waren anders bij verschillende fosfaatconcentraties. Dit fenomeen blijfi onduidelijk. Nitella vertoonde een lagere opnamesnelheid dan Chara. Dit was waarschijnlijk te wijten aan het grote verschil in fosforstatus van het plantenmateriaal en niet aan soortspecifieke verschillen. In een derde en laatste luik van het onderzoek werd nagegaan welke invloed de nutrientstatus van het plantenmateriaal had op de fosfaatopname. Hiertoe werden twee macrofytsoorten (c. globularis en Elodea nutallii) onderworpen aan een fosforaanrijking en -uithongering. De opnamesnelheid bleek duidelijk gecorreleerd met de inwendige fosforstatus van de plant. Elodea lijkt gevoeliger aan fosforstress dan Chara. Het verhoogt reeds zijn fosfaatopname als het inwendig fosforgehalte afneemt onder 0.3% van het drooggewicht. Chara doet dit pas als het fosforgehalte onder de 0.15% van het drooggewicht zakt. De N:P verhouding van het weefsel is bij Elodea

93

tamelijk constant en veel lager dan bij Chara, wat in overeenstemming lijkt met de groeistrategie van beide soorten. De fosfaatopname van Elodea reageert sneller op veranderende omstandigheden dan die van Chara. Waarschijnlijk is Elodea, door toedoen van zijn lage N:P verhouding, in staat op korte tijd veel fosfaattransporters te produceren. Vermoedelijk is ook de turn-over snelheid van membraanprote'ines groter. Elodea kan, beter dan Chara, een toediening van fosfor omzetten in verhoogde groeisnelheid. Dit betekent een competitief voordeel van de soort bij eutrofiering. Desondanks het feit dat Chara minder goed in staat is een toediening van fosfor om te zetlen in verhoogde groeisnelheid, kan deze soort bij fosfortoediening de fosfaatconcentratie in het water laag houden. Dit is voornamelijk toe te schrijven aan opslag van het fosfor in het weefsel. Er kon geen bovengrens aan het fosforgehalte van Chara worden vastgesteld. De fosforconcentratie in het weefselliep in een van de experimenten op tot 0.78% van het drooggewicht. Deze grote opslagcapaciteit betekent dat de soort een aanzienlijke bufferwerking kan uitoefenen bij eutrofiering van een meer.

94

SUMMARY Phosphorus is a major nutrient acquired primarily via high-affinity inorganic phosphate transporters. In this thesis, it is shown that phosphorus uptake activity in Chara globularis decreases at external phosphate concentrations exceeding 65 11M. It is suggested that, at these high concentrations, the high-affinity transport system is inhibited. The first major aim of the present study was to link seasonal patterns in abiotic and biotic factors from a pool dominated by the submerged macrophyte C. globularis to the phosphate uptake kinetics in this species. The phosphate uptake could not be linked to the phosphorus concentrations of either tissue or water. It rather seemed dependent on the developmental stage of the plants, showing high uptake rates when spores were formed and young shoots were intensively growing. C. globularis seemed to have a large impact on the ecosystem. As the plants died off, the water became anoxic, and most probably anoxic phosphate release from the sediment occured. It seems the C. globularis from the studied pool does not use the sediment as a source for

phosphorus. To explain this, two hypotheses were formulated. Firstly, a lack of oxygen at the sediment surface could cause uptake rates to be low, and secondly, basal decay of the plants could inhibit the transport of phosphorus taken up from the sediment to the actively growing parts of the thallus. A second aim was to investigate the influence of abiotic factors on the uptake rate. As Na+/Pi cotransport was recently shown in C. corallin a, Na+ was given most attention. The influence of medium pH on uptake rate was also investigated. Although it could not be proven directly, three observations provide evidence for the existence of Na+/Pi cotransport in C. globularis. Firstly, the uptake of Pi was stimulated by the presence ofNa+ in the medium, with an optimal concentration in the range 1-2 mM. Secondly, Na+ starvation of the plants enhanced the phosphate uptake rates. Thirdly, addition of Pi to the uptake medium did not increase its pH, suggesting uptake does not occur through proton-phosphate cotransport. In both C. globularis and Nitellaflexilis, phosphate uptake was maximal in the central part of the studied pH range, at pH 6 to 8. Preference for weakly ionised Pi (H 2POn is obviously lower than in certain other studied species. The patterns the uptake rate showed as a function of pH changed with increasing phosphate concentrations in the uptake medium. This phenomenon stays unclear. Nitella showed lower uptake rates than Chara. This was probably due to the large difference in tissue phosphorus content and not to species-specific differences. The third aim of the study was to investigate the influence of the tissue nutrient status on phosphate uptake. For this purpose two macrophyte species (c. globularis and Elodea nutallii) were subjected to phosphorus starvation and enrichment. The uptake rate was correlated with the tissue phosphorus content for both species. Elodea seems more susceptible to phosphorus stress than Chara. It increases its uptake rate as the internal phosphorus content decreases below 0.3% of dry weight. Chara only starts showing increased uptake rates until its phosphorus content decreases below 0.15% of dry weight. The N:P ratio of the tissue is rather constant in Elodea and considerably lower than in Chara. This seems to agree with the growth strategies of both species.

95

Phosphate uptake responds more quickly to changing conditions in Elodea. Probably this species can produce great amounts of phosphate transporters at a fast rate. Most probably the turnover rate of membrane proteins too, is higher in Elodea. On supply of phosphorus to the plants, Elodea is better able to convert this into higher growth rates. This means the plants will be competitively advantaged on eutrophication of the water. Although Chara hardly succeeds to convert higher phosphorus supply rates into an increased growth rate, it is able to keep the phosphorus concentration of natural waters low. This is in great amount due to the accumulation of phosphorus in plant tissue. In the experiments no upper limit to the phosphorus content of Chara could be observed. The phosphorus concentration of the plant tissue increased to 0.78% of dry weight in one of the experiments. Chara can, due to its capacity to store phosphorus to large amounts, efficiently stabilize moderate eutrophication of natural waters.

96

Appendix 1: samenstelling van A.P. W.

BASISSAMENSTELLING

waterige oplossing met NaCI KCI

1mM 0,5 mM 0,1 mM

toegevoegd als CaCb.2H20

BUFFERS

eventuele toevoeging van volgende buffers: 2-(N-morfolino )-ethaansulfonzuur (MES) 3-(N-morfolino )-propaansulfonzuur (MOPS) 2-( cycIohexylamino)-ethaansulfonzuur CCHES)

2mM 2mM 2mM

voor pH 5, 6 en 6,5 voor pH 70f8 voorpH 9

A-1

~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~---.---~-. ~-~~~--~---~~--~-

Appendix 2: Atkortingenlijst [X] A.P.W. ATP Cmin

D.LC. D.O.C.

Km me NMR o-p P

P.A.R. P.P. PCA Pi S.P. S.R.P. S.U.P. tot TP V max

A-2

concentratie van de stof X artificial pond water adenosine trifosfaat minimale concentratie waarbij de transporter nog actief is dissolved inorganic carbon dissolved organic carbon affiniteitsconstante van de Michaelis-Menten kinetica mill i-equivalent nucleomagnetic resonance orthofosfaatconcentratie fosfor photo-active radiation particulate phosphorus - partikelgebonden fosfor principaalcomponentanalyse anorganisch fosfor - de som van alle fosfaationen (H2 P0 4-, HP042-, POl-) soluble phosphorus soluble reactive phosphorus soluble unreactive phosphorus totaal totaalgehaIte fosfaat (total phosphorus) maximale opnamesnelheid van de Michaelis-Menten kinetica

Appendix 3: MateriaaI en methoden

Tabe/ A.3.1 De exacte samenstelling van de opnamemedia voor de seizoenale opvolging. De afkortingen van de verschillende condities stellen de fosforconcentratie v~~r. In werkefijkheid ligt de Na+ concentratie een weinig hoger omdat de stockoplossing met NaCI, CaCI2, KCI en MES-buffer met NaOH op pH 6.5 werd gebracht. NaCI

CaCI 2

KCf

MES

K3P04

[Pi]

conditie

(mM)

(mM)

(mM)

(mM)

(iJM)

(iJgP/I)

0 100 200 500 1000 2000 5000 10000

0.88 0.88 0.88 0.88 0.88 0.88 0.88 0.88

0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44 0.44

0.09

1.75 1.75 1.75 1.75 1.75 1.75 1.75 1.75

0 3.23 6.45 16.1 32.3 64.5 161 323

0.09 0.09 0.09

0.09 0.09 0.09 0.09

a 100 200 500 1000

2000 5000 10000

Tabe/ A.3.2 De verschiflende opnamemedia voor het experiment 'Stimulatie van de fosfaatopname door Na+ en K+' (ct. 3.2.4). Aan aile opnamemedia werd 437.5 IJM CaCI2 en 591.5 IJM Ca(OH)2 toegevoegd De resulterende [Ca 2+] is weergegeven in de tabel. De media, gebufferd met 2 mM MES, werden dan met HCI op pH 6 gebracht. [Na1

[K1tot

[Ca 21tot

conditie

(mM)

(mM)

(mM)

1 2

1.00

0.125 0.125

1.03 1.03

o

775 775

pre'incubatieregime

zoals in opname-exp. zoals in opname-exp.

3 __ _~cqQ _________ UP.. ___ _q._1_~~ _______ :! ~g~___ ~9§1l~ _i!1_ 9P_I!~~~:~~P~ 4 5

0 1.00

775 775

1.250 1.250

1.03 1.03

zoals in opname-exp. zoals in opname-exp.

._________ ~___ _~cqQ _________ ???____ _1'f_~Q __ _____ :! ~g~___ ~9§1l~ _i!1_ 9pn~~~:~~P~ 7 8 9

775 0.125 1.03 in standaard APW 775 0.125 1.03 in standaard APW 5.00 775 0.125 1.03 in standaard APW ---------------------------------------------.-----------.-----in standaard APW 10 0 775 1.250 1.03 in standaard APW 11 1.00 775 1.250 1.03 in standaard APW 12 5.00 775 1.250 1.03 0 1.00

o 8 40 ----------

o

0.8 5

o 8 40 ---------0 0.8

5

A-3

Tabel A.3.3 De exacte samenstelling van de opnamemedia voor de pH-experimenten (cf. 3.4). De afkortingen van de verschillende condities zijn steeds samengesteld uit de pH en de fosforconcentratie in IJgP/1. De percentuele bijdragen van NaH2P04 en Na2HP04 werden zo gekozen dat ze bij de betreffende pH zo weinig mogelijk verstoring van deze pH zouden betekenen. De Na+ concentratie werd tussen de verschillende condities constant gehouden (1 mM) door, afhankelijk van de hoeveelheid toegevoegd NaH2P04 en Na2HP04, meer of minder NaCI toe te voegen. In werkelijkheid ligt de Na+ concentratie een weinig hoger omdat de stockoplossing met CaCI2, KCI en MES-buffer met NaOH op de juiste pH werd gebracht. In de gegevenstabellen werd hiervoor gecorrigeerd door de concentratie Na + te verhogen met de toegevoegde concentratie NaOH.

conditie 5-0 5-150 5-500 5- 2000 -----------6-0 6-150 6-500 6- 2000 .--.-------7-0 7-150 7-500 7 - 2000 ----------.8-0 8-150 8-500 8 - 2000 ._---------9-0 9-150 9-500 9- 2000

KCI

CaCh

buffer

NaH 2P0 4

Na2 HP04 NaCI

(mM)

(mM)

(mM)

(!JM)

(~M)

(mM)

(~gP/I)

0.1 0.1 0.1 0.1

0.5 0.5 0.5 0.5

2.0 2.0 2.0 2.0

0 4.83 16.1 64.5

0 0 0 0

1.000 0.995 0.984 0.936

0 150 500 2000

[Pi]

-------------------------------------------------------- ---------

0.5 2.0 0 0 1.000 0.5 2.0 4.55 0.290 0.995 0.5 2.0 15.2 0.968 0.983 0.5 2.0 60.6 3.87 0.932 -------------------------------------------------------0.5 2.0 0 0 1.000 0.1 0.1 0.5 2.0 3.00 1.84 0.993 0.1 0.5 2.0 10.0 6.13 0.978 0.1 0.5 2.0 40.0 24.5 0.911 ----------------------------------.--------------------2.0 0.1 0.5 0 0 1.000 2.0 0.1 0.5 0.677 4.16 0.991 0.1 0.5 2.0 2.26 13.9 0.970 0.1 0.5 2.0 9.03 55.5 0.880 -------------------------------------------------------0.1 0.5 2.0 0 0 1.000 0.1 0.5 2.0 0 4.83 0.990 0.5 2.0 0 0.1 16.1 0.968 0.5 2.0 0 0.1 64.5 0.871 0.1 0.1 0.1 0.1

0 150 500 2000 -------.0 150 500 2000

--------0 150 500 2000

---------

0 150 500 2000

Tabel A.3.4 De tijdstippen waarbij, voor de opname-experimenten van zeer korte duur (cf. 3.6), de pH werd genoteerd en mediumstaal werd genomen voor analyse. -20", 15", 30", 45", 1'00", 1'30", 2'00", 2'30", 3'00", 4'00", 5'00", 6'00", TOO", 9'00", 11 '00", 13'00", 15'00" en 19'00"

Tabel A.3.5

De exacte samensteliing van de opnamemedia voor het Chara-Elodea experiment. De Na +

concentratie werd tussen de verschiliende condities constant gehouden (1 mM) door, afhankelijk van de hoeveelheid toegevoegd NaH2P04, meer of minder NaCI toe te voegen. In werkelijkheid ligt de Na+ concentratie een weinig hoger omdat de stockoplossing met CaCb, KCI en MES-buffer met NaOH op pH 6 werd gebracht.

conditie 200 750 2000

A-4

CaCh

KCI

MES

NaH 2P04

NaCI

[Pi]

(mM)

(mM)

(mM)

(mM)

(mM)

(lJgP/I)

0.44 0.44 0.44

0.09 0.09 0.09

1.75 1.75 1.75

6.45 24.2 64.5

0.994 0.976 0.935

200 750 2000

Appendix 4: Resultaten Tabel A.4.1 Gegevens over de fosfaatopname-experimenten van de seizoenale opvolging.

Fosfaatopname juli 2000 fosfBBtconcentratie (lIgP 1") t(min

0 38 63 90 120 t(min)

0 38 63 90 120

0-1 1 1 1 1 1

0-2 1 1 1 1 1

0-3 1 1 1 1 1

100-1 48 10 1 1 1

100-2 96 6 1 1 1

100-3 63 1 1 1 1

200-1 176 153 96 77 39

200-2 228 129 96 44 29

200-3 195 63 115 72 44

500-1 399 224 195 181 124

500-2 522 323 252 162 172

500-3 479 290 224 186 110

1000-1 1223 1024 835 749 640

1000-2 1138 844 721 650 569

1000-3 1091 783 607 489 375

2000-1 2341 2152 1867 1725 1640

2000-2 2583 1640 2033 1801 1863

2000-3 2564 2066 1972 1834 1683

5000-1 4767 4601 4596 4525 4534

5000-2 4814 4482 4487 4430 4444

5000-3 4842 4478 4587 4563 4577

10000-1 7676 7705 7657 7439 7525

10000-2 7733 7610 7724 7496 7553

10000-3 7932 7733 7799 7051 7297

0-1 0.079

0-2 0.107

0-3 0.108

100-1 0.112

100-2 0.107

100-3 0.172

200-1 0.064

200-2 0.100

200-3 0.080

500-1 0.129

500-2 0.137

500-3 0.122

1000-1 0.115

1000-2 0.132

1000-3 0.147

2000-1 0.139

2000-2 0.108

2000-3 0.133

5000-1 0.116

5000-2 0.136

5000-3 0.119

10000-1 0.145

10000-2 0.121

10000-3 0.133

drooggewlcht (g OW)

correctle voor cuvetvolume en drooggewicht (lIgP (g OWr') t(min

0 38 63 90 120 t(min)

0 38 63 90 120

0-1 1 1 1 1 1

0-2 1 1 1 1 1

0-3 1 1 1 1 1

100-1 35 7 1 1 1

100-2 72 4 1 1 1

100-3 29 0 0 0 0

200-1 168 145 91 73 37

200-2 183 103 77 35 24

200-3 194 62 114 72 43

500-1 247 139 121 112 77

500-2 305 189 147 95 100

500-3 316 191 147 122 72

1000-1 855 716 583 524 448

1000-2 689 511 437 394 345

1000-3 594 426 331 266 204

2000-1 1346 1237 1074 962 943

2000-2 1915 1216 1507 1335 1381

2000-3 1543 1244 1187 1104 1013

5000-1 3299 3164 3181 3131 3138

5000-2 2828 2633 2636 2602 2611

5000-3 3250 300S 3078 3072

10000-1 4229 4245 4219 4099 4146

10000-2 5125 5044 5119 4968 5006

10000-3 4786 4565 470S 4254 4403

3052

richtingscoiifficient van de gefitte rechte (lIgP (g OWr' min")

0-1 0

0-2 0

0-3 0

100-1 -0.7117

100-2 -1.7742

100-3 -0.7551

200-1 -1.132

200·2 -1.336

200-3 -1.283

500-1 -2.8605

500-2 -3.0597

500-3 -3.2833

1000-1 -4.255

1000-2 -4.OS2

1000-3 -4.199

2000-1 -4.111

2000-2 -5.437

2000-3 -4.797

5000-1 -1.967

5000-2 -3.218

5000-3 -3.029

10000-1 -1.032

10000-2 -1.084

10000-3 -3.976

opnamesnelheid (lIgP (g OWr' min")

condo 0 100 200 500 1000 2000 5000 10000

",pI 1 0 0.712 1.13 2.86 4.26 4.11 1.97 1.03

",pI 2 0 1.77 1.34 3.06 4.06 5.44 3.22 1.08

re 13

em.

0 0.755 1.28 3.28 4.20 4.80 3.03 3.96

0 1.08 1.25 3.07 4.17 4.78 2.74 2.03

A-5

Fosfaatopname augustus 2000

fosfaatconcentratie (lJgP I"')

t(min)

0 30 59 95 142 179 241 300 t(min)

0 30 59 95 142 179 241 300

0-1 1 1 1 1 1 1 1 1

0-2 1 1 1 1 1 1 1 1

0-3 1 1 1 1 1 1 1 1

100-1 72 42 21 86 1 1 1 1

100-2 89 28 1 1 1 1 1 1

100-3 72 52 32 1 1 1 1 1

200-1 184 120 228 59 18 86 1 1

200-2 140 133 109 89 65 35 8 1

200-3 201 167 177 65 21 1 1 1

500-1 391 340 276 235 164 116 62 8

500-2 418 384 337 292 235 177 130 76

500-3 465 320 282 215 154 86 25 1

1000-1 916 804 757 709 658 608 553 516

1000-2 825 780 740 672 631 584 503 445

1000-3 828 784 733 692 631 597 536 462

2000-1 1770 1658 1624 1546 1482 1448 1357 1306

2000-2 1733 1699 1662 1614 1540 1485 1431 1391

2000-3 1746 1635 1611 1675 1482 1418 1319 1255

5000-1 3085 3119 3204 3197 3105 3095 3051 3021

5000-2 3078 3170 3163 3207 3163 3099 3092 3048

5000-3 3105 3122 3146 3136 3085 3092 3017 2956

10000-1 3021 3058 2668 3011 3519 3051 3417 2983

10000-2 2607 2661 2536 2489 2899 2492 2828 2265

10000-3 2682 2682 3092 2546 2889 2506 2929 2309

0-1 0.057

0-2 0.060

0-3 0.035

100-1 0.064

100-2 0.073

100-3 0.042

200-1 0.056

200-2 0.051

200-3 0.055

500-1 0.069

500-2 0.064

500-3 0.062

1000-1 0.044

1000-2 0.046

1000-3 0.047

2000-1 0.053

2000-2 0.036

2000-3 0.049

5000-1 0.054

5000-2 0.047

5000-3 0.058

10000-1 0.059

10000-2 0.091

10000-3 0.077

drooggewicht (g OW)

correctie voor cuvetvolume en drooggewicht (lJgP (g OWr')

!(min)

0 30 59 95 142 179 241 300 t(min

0 30 59 95 142 179 241 300

0-1 1 1 1 1 1 1 1 1

0-2 1 1 1 1 1 1 1 1

0-3 2 2 2 2 2 2 2 2

100-1 91 52 27 108 1 1 1 1

100-2 98 31 1 1 1 1 1 1

100-3 137 99 60 2 2 2 2 2

200-1 261 170 324 83 25 122 1 1

200-2 220 209 172 140 103 55 12 2

200-3 291 242 257 95 31 1 1 1

500-1 451 392 318 271 189 134 72 9

500-2 526 483 423 368 295 223 163 95

500-3 598 411 363 276 197 110 32 1

1000-1 1681 1476 1389 1302 1208 1115 1015 947

1000-2 1422 1346 1276 1159 1089 1007 867 767

1000-3 1403 1329 1242 1174 1070 1013 909 783

2000-1 2672 2503 2452 2334 2237 2186 2048 1971

2000-2 3851 3775 3693 3587 3421 3301 3180 3090

2000-3 2845 2663 2625 2729 2415 2310 2150 2045

5000-1 4613 4664 4791 4780 4644 4628 4563 4517

5000-2 5229 5364 5372 5447 5372 5263 5252 5177

5000-3 4321 4344 4377 4363 4292 4302 4198 4113

10000-1 4075 4125 3600 4061 4747 4116 4610 4025

10000-2 2305 2353 2242 2200 2562 2203 2499 2002

10000-3 2775 2775 3200 2635 2989 2593 3031 2390

richtingscoefficient van de gefi'tte rechte (~gP (g OWr' min")

0-1

0-2 0

0-3 0

100-1 -1.083

100-2 -1.638

100-3 -1.313

200-1 -1.581

200-2 -0.871

200-3 -1.902

500-1 -1.759

500-2 -1.681

500-3 -2.463

1000-1 -3.866

1000-2 -2.745

1000-3 -2.459

2000-1 -3.38

2000-2 -2.786

2000-3 -3.757

5000-1 -0.58

5000-2 -0.4777

5000-3 -0.7515

10000-1 2.587

10000-2 -0.8183

10000-3 -1.99

repl3 0 1.31 1.90 2.46 2.46 3.76 0.752 1.99

gem.

opnamesnelheid (~gP (g OW)"' min-')

condo 0 100 200 500 1000 2000 5000 10000

A-6

repl1 0 1.08 1.58 1.76 3.87 3.38 0.580 0.00

repl2 0 1.84 0.87 1.68 2.75 2.79 0.478 0.818

0 1.34 1.45 1.97 3.02 3.31 0.60 0.94

Fosfaatopname september 2000 fosiaatconcentratie (lJgP

t(min

0 30 59 95 142 179 241 t(min

0 30 59 95 142 179 241

r')

0·1 1 1 1 1 1 1 1

0·2 1 1 1 1 1 1 1

0·3 1 1 1 1 1 1 1

100·1 71 1 1 1 1 1 1

100·2 71 14 1 1 1 1 1

100·3

200·1 118 18 1 1 1 1 1

200·2 151 68 28 1 1 1 1

200·3 148 31 1 1 1 1 1

500·1 315 288 208 124 41 1 1

500·2 381 158 61 1 1 1 1

500·3 305 198 81 1 1 1 1

1000·1 782 652 495 341 221 78 1

1000·2 658 485 311 148 38 1 1

1000·3 785 715 585 458 341 235 91

2000·1 1790 1332 1156 952 765 522 361

2000·2 1783 1426 1249 1035 849 652 398

2000·3 1886 1419 1279 1089 925 685 482

5000·1 4436 3675 4048 3621 3221 2433 2260

5000·2 4035 3928 3474 3701 3208 2679 2260

5000·3 4436 3541 3448 3141 2727 2300 1739

10000·1 7652 7666 7052 6384 6665 6932 6852

10000·2 9481 7185 7532 6611 5957 5971 6932

10000·3 8814 7679 7639 6918 6091 5690 6905

0·1 0.116

0·2 0.157

0·3 0.131

100·1 0.105

100·2 0.095

100·3 0.155

200·1 0.129

200·2 0.124

200·3 0.108

500·1 0.107

500·2 0.205

500·3 0.140

1000·1 0.131

1000·2 0.189

1000·3 0.134

2000·1 0.178

2000·2 0.148

2000·3 0.169

5000·1 0.173

5000·2 0.180

5000·3 0.239

10000·1 0.182

10000·2 0.154

10000·3 0.172

drooggewicht (9 OW)

correctie voorcuvetvolume en drooggewicht

t(min

0 30 59 95 142 179 241 t(min

0 30 59 95 142 179 241

(~gP

(9 OW}")

0·1 1 1 1 1 1 1 1

0·2 1 1 1 1 1 1 1

0·3 1 1 1 1 1 1 1

100·1 54 1 1 1 1 1 1

100·2 60 12 1 1 1 1 1

100·3

200·1 73 11 1 1 1 1 1

200·2 98 44 18 1 1 1 1

200·3 109 23 1 1 1 1 1

500·1 236 216 156 93 31 1 1

500-2 149 62 24 0 0 0 0

500·3 174 113 46 1 1 1 1

1000·1 478 399 303 209 135 48 1

1000·2 279 205 132 63 16 0 0

1000·3 469 427 349 274 204 140 54

2000·1 804 599 519 428 344 234 162

2000·2 961 769 673 558 457 351 215

2000·3 895 673 607 517 439 325 228

5000·1 2052 1700 1873 1676 1490 1126 1046

5000·2 1794 1747 1545 1646 1426 1191 1005

5000·3 1483 1184 1153 1050 912 769 581

10000·1 3367 3373 3103 2809 2933 3050 3015

10000·2 4922 3730 3910 3432 3093 3100 3598

10000·3 4107 3578 3559 3223 2838 2651 3217

richtingscoefficient van de gefitte rechte (~gP (9 Owr' min")

0·1 0

0·2

0·3 0

100·1 ·1.724

100·2 ·1.5426

100·3

200·1 ·2.0027

200·2 ·1.7362

200·3 ·2.7882

500·1 ·1.659

500·2 ·2.135

500-3 ·2.167

1000·1 ·2.712

1000·2 -2.065

1000·3 -2.123

2000·1 -3.366

2000·2 -3.764

2000·3 -3.295

5000·1 -4.064

5000·2 -3.253

5000·3 -3.317

10000·1 -4.421

10000·2 -12.26

10000·3 -9.004

repl3

gem.

0

0 1.63 2.16 1.99 2.30 3.48 3.54 8.56

opnamesnelheid (~gP (g OW)"' min")

100 200 500 1000 2000 5000 1DDDO

repl1 0 1.72 2.00 1.66 2.71 3.37 4.06 4.42

repl2 0 1.54 1.74 2.14 2.07 3.76 3.25 12.3

2.79 2.17 2.12 3.30 3.32 9.00

A-7

Fosfaatopname oktober 2000 fosfaatconcentratie (lJgP 1'1)

t(min)

0 30 58 118 177 238 t(min)

0 30 58 118 177 238

0·1 21.626 25.685 20.699 16.743 13.873 11.631

0·2 5.222 4.017 3.270 ·0.249 ·0.374 0.793

0.3 2.459 6.529 5.393 0.430 ·1.007 0.490

100·1 98.315 85.846 70.359 46.104 33.983 23.436

100·2 114.592 92.167 73.603 50.107 36.366 26.807

100·3 87.861 73.683 58.125 34.812 25.635 15.676

200·1 146.422 114.290 85.523 44.851 31.569 20.067

200·2 173.597 157.232 10.248 66.313 37.195 20.976

200·3 147.555 115.392 85.268 47.765 31.488 17.236

500·1

500·2 377.196 271.886 196.243 106.786 48.337 22.011

500·3 398.147 362.473 267.353 183.212 122.374 71.192

1000·1 800.440 692.193 577.046 419.872 310.785 215.427

1000·2 884.279 809.168 715.239 615.918 539.608 466.748

1000·3 920.147 841.198 756.429 657.009 567.556 496.130

2000·1 1679.171 1622.317 1474.938 1324.426 1152.800 1027.768

2000·2 1608.859 1590.199 1463.478 1156.507 1063.408 919.534

2000·3 1776.164 1692.511 1552.574 1388.205 1276.301 1153.271

5000·1 4366.564 4607.388 4502.736 4256.980 3829.344 3546.944

5000·2 4507.272 4767.048 4773.316 4945.904 4529.628 4289.729

5000·3 4477.004 4832.220 4420.028 4327.968 4192.340 3687.144

10000·1 8966.324 9324.984 9677.416 9389.140 8931.428 8049.652

10000·2 8961.624 9704.420 9437.208 9305.176 9203.096 8210.372

10000·3 9067.944 9562.484 9997.168 9457.872 9360.160 8176.988

0·1 0.194

0·2 0.231

0·3 0.204

100·1 0.207

100·2 0.189

100·3 0.228

200·1 0.258

200·2 0.201

200·3 0.182

500·1 0.209

500·2 0.221

500·3 0.193

1000·1 0.172

1000·2 0.217

1000·3 0.285

2000·1 0.232

2000·2 0.214

2000·3 0.237

5000·1 0.234

5000·2 0.225

5000·3 0.271

10000·1 0.211

10000·2 0.271

10000·3 0.256

drooggewicht (g OW)

correctie voorcuvetvolume en drooggewicht (lJgP (g OW)")

t(min

0 30 59 95 142 179 t(min)

0 30 59 95 142 179

0·1 9 11 9 7 6 5

0·2 2 1 1 0 0 0

0·3 1 3 2 0 0 0

100·1 38 33 27 18 13 9

100·2 49 39 31 21 15 11

100·3 31 26 20 12 9 6

200·1 45 35 26 14 10 6

200·2 69 63 4 26 15 8

200·3 65 51 37 21 14 8

500·1

500·2 136 98 71 39 17 8

500·3 165 150 111 76 51 29

1000·1 371 321 268 195 144 100

1000·2 326 299 264 227 199 172

1000·3 259 237 213 185 160 140

2000·1 580 560 509 457 398 355

2000·2 601 594 546 432 397 343

2000·3 599 571 524 468 431 389

5000·1 1493 1576 1540 1456 1310 1213

5000·2 1605 1698 1700 1762 1613 1528

5000·3 1323 1428 1306 1279 1239 1090

10000·1 3404 3541 3674 3565 3391 3056

10000·2 2847 2867 2788 2749 2719 2426

10000·3 2839 3000 3130 2961 2931 2560

richtingscoefficUint van de gefitte rechte (~gP (g OWr' min")

0·1 0

0·2

0·3 0

100·1 ·0.1862

100·2 ·0.3

100·3 ·0.1799

200·1 ·0.2639

200·2 ·0.3736

200·3 ·0.368

500·1

500·2 ·1.13

500·3 ·0.9285

1000·1 ·1.796

1000·2 ·1.074

1000·3 ·0.7931

2000-1 ·0.972

2000·2 ·1.171

2000·3 ·0.8846

5000·1 ·1.431

5000·2 ·0.446

5000·3 ·1.078

10000·1 ·1.617

10000·2 ·1.09

10000.3 ·1.292

repl3 0 0.180 0.368 0.929 0.793 0.885 1.08 1.29

0 0.222 0.335 0.686 1.22 1.01 0.985 1.33

opnamesnelheid (~gP (g OWr' min")

0 100 200 500 1000 2000 5000 10000

A-a

repll 0 0.186 0.284 0.000 1.79 0.972 1.43 1.62

repl2 0 0.300 0.374 1.13 1.07 1.17 0.446 1.1

gem.

Fosfaatopname november 2000 fosfaatconcentratie (~gP r')

T 30 63 98 146 187 247 305

0-1 39 23 11 5 -2 -2 2

0-2 32 17 5 2 -2 -2 -2

0-3 29 17 8 5 -2 2 2

100-1 113 79 51 32 17 8 2

100-2 98 63 36 23 8 5 2

100-3 82 54 29 20 2 5 2

200-1 194 132 91 57 36 23 11

200-2 166 101 57 26 11 5 -2

200-3 153 104 79 45 23 14 5

500-1 441 333 249 178 132 70 42

500-2 451 321 252 163 110 67 36

500-3 435 336 302 225 175 119 67

T 30 63 98 146 187 247 305

1000-1 875 785 699 596 513 401 327

1000-2 912 789 702 578 500 429 345

1000-3 894 779 705 612 590 497 414

2000-1 1836 1718 1588 1427 1362 1229 1123

2000-2 1814 1603 1532 1367 1284 1160 1070

2000-3 1805 1653 1557 1405 1337 1191 1098

5000-1 1290 1222 1052 1086 987 962 1074

5000-2 1325 1281 1052 1108 1018 974 1080

5000-3 1380 1287 1083 1182 1052 1036 1142

10000-1 2338 2285 1966 2189 1799 1802 1994

10000-2 2276 2136 1845 2081 1727 1734 2012

10000-3 2319 2270 1941 2118 1814 1789 2096

0-1 0.110

0-2 0.099

0-3 0.088

100-1 0.096

100-2 0.147

100-3 0.133

200-1 0.109

200-2 0.187

200-3 0.142

500-1 0.149

500-2 0.173

500-3 0.121

1000-1 0.139

1000-2 0.117

1000-3 0.124

2000-1 0.127

2000-2 0.141

2000-3 0.134

5000-1 0.135

5000-2 0.134

5000-3 0.106

10000-1 0.194

10000-2 0.211

10000-3 0.154

drooggewicht (g OW)

correctie voor cuvetvolume en drooggewlcht (lIgP (g OW)"')

T 30 63 98 146 187 247 305

T 30 63 98 146 187 247 305

0-1 28 17 8 3 -1 -1 1

0-2 26 14 4 1 -1 -1 -1

0-3 27 16 7 4 -1 1 1

100-1 94 66 42 27 14 6 1

100-2 53 35 19 13 4 3 1

100-3 49 33 18 12 1 3 1

200-1 142 97 67 42 26 17 8

200-2 71 43 25 11 5 2 -1

200-3 86 58 45 25 13 8 3

500-1 238 179 134 96 71 38 23

500-2 209 148 117 75 51 31 16

500-3 289 223 200 149 116 79 44

1000-1 504 452 402 343 295 231 188

1000-2 622 537 478 394 341 292 235

1000-3 577 503 455 395 381 321 267

2000-1 1155 1081 999 897 856 773 706

2000-2 1026 907 867 784 727 656 606

2000-3 1076 985 928 838 797 710 655

5000-1 766 725 624 644 586 571 637

5000-2 791 765 628 881 608 582 645

5000-3 1044 973 819 894 795 784 8S3

10000-1 963 941 810 902 741 742 821

10000-2 865 812 701 791 656 659 765

10000-3 1205 1179 1008 1100 942 930 1069

rlchtlngscollfflcillnt van de gefitte rechte (lIgP (g OW)"' min")

0-1 0

0-2 0

0-3 0

100-1 -0.3797

100-2 -0.4993

100-3 -0.4362

200-1 -0.8738

200-2 -0.7387

200-3 -0.6062

500-1 -1.086

500-2 -0.9751

500-3 -1.045

1000-1 -1.722

1000-2 -1.751

1000-3 -1.685

2000-1 -1.907

2000-2 -2.049

2000-3 -1.907

5000-1 -6.692

5000-2 -9.444

5000-3 -11.01

10000-1 -14.91

10000-2 -14.46

10000-3 -11.06

0.44 0.61 1.05 1.69 1.91 11.0 11.1

0.74 1.04 1.72 1.95 9.0 13.5

opnamesnelheid (lIgP (g OW)"' min-')

100 200 500 1000 2000 5000 10000

repl1 0 0.38 0.87 1.09 1.72 1.91 6.7 14.91

repI2 0 0.50 0.74 0.98 1.75 2.05 9.4 14.5

A-9

Fosfaatopname december 2000 fosfaatconcentratie (1J9P 1"1)

T 30 63 116 183 247 305

0-1 25 12 -8 -21 -24 -27

0-2 22 5 -14 -24 -24 -27

0-3 15 5 8 -24 -24 -27

100-1 87 74 -5 -24 -24 -27

100-2 129 90 61 28 12 -5

100-3 80 54 22 -5 -14 -27

200-1 198 162 123 87 54 31

200-2 178 145 93 57 35 5

200-3 194 158 116 74 54 25

500-1 439 387 273 191 132 77

500-2 458 390 295 220 158 106

500-3 436 361 256 -37 96 51

T 30 63 116 183 247 305

1000-1 882

1000-2 885 778 631 494 383 299

1000-3 908

2000-1 1922

2000-3 1811

1837

722 592 498 419

1746 1687 1586 993

1485 1296 1123 1476

5000-1 4337 4768 4585 4742 4207 4155

5000-2 4976 4937 4233 4494 4376 4090

5000-3 4390 4129' 3698 3503 3516 2851

10000-1 6241 6085 6098 5654 6176 6111

10000-2 6646

840

2000-2 1932 1779 1635 1547 1423 1127

6046 6646 5980 6515

10000-3 6789 6567 6463 7076 6411 7024

0-1 0.065

0-2 0.057

0-3 0.058

100-1 0.088

100-2 0.048

100-3 0.065

200-1 0.045

200-2 0.047

200-3 0.044

500-1 0.062

500-2 0.064

500-3 0.072

1000-1 0.051

1000-2 0.069

1000-3 0.063

2000-1 0.056

2000-2 0.061

2000-3 0.051

5000-1 0.063

5000-2 0.058

5000-3 0.064

10000-1 0.091

10000-2 0.054

10000-3 0.056

833

709 618 517 439

1676"

6346

drooggewicht (g OW)

correctie voor cuvetvolume en drooggewicht (~gP (g OWr1)

T 3D 63 116 183 247 305

0-1 30 14 -10 -26 -30 -34

0-2 30 7 -20 -34 -34 -39

0-3 21 7 12 -33 -33 -38

100-1 79 67 -4 -22 -22 -25

100-2 217 151 102 47 20 -8

100-3 99 67 27 -6 -18 -34

200-1 352 288 218 155 96 56

200-2 304 248 159 98 59 9

200-3 352 287 211 134 98 45

500-1 570 502 354 248 172 100

500-2 576 490 371 277 199 133

500-3 487 403 286 -42 108 57

T 30 63 116 183 247 305

1000-1 1395 1317 1122 977 817 694

1000-2 1028 903 733 574 445 347

1000-3 1153 1068 917 752 632 532

2000-1 2751 2630 2499 2415 2270 1421

2000-2 2538 2337 2148 2033 1870 1480

2000-3 2858 2647 2344 2045 1773 2328

5000-1 5552 6103 5869 6069 5385 5318

5000-2 6864 6810 5839 6198 6037 5641

5000-3 4200 3951 3539 3352 3364 2728

10000-1 5499 5361 5373 4982 5442 5364

10000-2 9937 9489 9040 9937 8943 9742

10000-3 9751 9432 9283 10163 9208 10088

richtingscoefficient van de gefitte rechte (~gP (g OW)"' min")

0-1

1000-1 -3.225

0-2

0-3

a

a

100-1 -1.006

100-2 -1.3

100-3 -0.8346

200-1 -1.531

200-2 -1.681

200-3 -1.632

500-1 -2.538

500-2 -2.367

500-3 -2.317

1000-2 -3.413

1000-3 -2.75

2000-1 -2.886

2000-2 -4.44

2000-3 -5.958

5000-1 -1.767

5000-2 -3.915

5000-3 -4.593

10000-1 -0.2993

10000-2 -0.6731

10000-3 1.065

repl3

gem.

opnamesnelheid (~gP (g OW)"' min")

0 100 200 500 1000 2000 5000 10000

A-10

repll 0 1.01 1.53 2.54 3.23 2.89 1.77 0.299

repl2

a

a

a

1.30 1.68 2.37 3.41 4.44 3.92 0.673

0.835 1.63 2.32 2.75 5.96 4.59 0.000

1.05 1.61 2.41 3.13 4.43 3.43 0.324

Tabel A.4.2 De gegevenstabel gebruikt voor biplot 1 van de seizoenale opvolging (figuur 4.2).

datum

maand

biomassa

conductiviteit

Vmax

Km

N03·

J

152 176 153 262 286 257 230 188 111 112 94 (gm·2)

247 266 231 202 221 304 350 367 252 224 209

3.76 2.27 2.77 0.95 2.77 6.34 3.70 3.01 1.43 2.41 5.35 OW/min

698 36 432 81 653 582 285 107 482 640.3 553

T·P 28.7 13.8 26.7 14.6 46.9 16.3 13.9 925 458 36.9 43.6

o·p

13-01·00 16·02-00 15·03·00 12-04-00 29-05·00 3-07·00 16·08·00 17·09·00 12·10·00 8·11·00 19-12·00

32.7 12.7 16.0 14.4 19.4 19.4 2.69 775 355 7.70 7.11

85 52 51 0 19 45 14 34 6 5 25

~gP/1

~gP/1

~gPtl

~gNtl

F M A M A

S 0 N

0

datum

maand

13·01·00 16·02·00 15·03·00 12·04-00 29·05-00 3-07-00 16·08-00 17-09-00 12·10·00 8·11·00 19-12·00

J F M A M A

S 0 N

0

datum

maand

13·01·00 16-02·00 15-03·00 12-04-00 29-05-00 3·07-00 16·08-00 17·09-00 12·10-00 8·11-00 19·12-00

J F M A M A

S 0 N 0

CamgtL

~Scm·1

MgmgtL

4.72 2.72 2.43 3.49 4.98 6.08 8.2 8.04 2.83 3.1 mgtl

sulfaat

15 20 20 14 15 14 26 29 14 14 mgn

18.8 6.32 6.88 3.68 8.64 8.96 24.32 12.88 14.16 20.8 mgtl

DOC

20.9 18.8 22.4 22.0 19.8 18.9 14.4 18.5 21.6 23.5 mgtl

~gP/g

KmgtL

1.3 1.26 1.2 1.3 1.91 2.36 2.58 1.5 1.28 1.42 mgtl

Cyanophyta

698 360 519 180 2624 1566 5913 2513 455 1889 aantal cm·2

NamgtL

5.8 6 6.8 8 11.4 10 9.5 6.9 6 7.3 mgtl

Chlorophyta

4540 5392 5101 5407 2016 4127 931 2270 1058 730 aantal cm·2

chloride

18.1 13.5 12.8 13.1 20.2 22.3 42.6 22.7 18.1 17.7 mgtl

CO2

HC03·

220 158.4 158.4 167.2 149.6 308 299.2 220 184.8 184.8 mg C02l1

0.66 0.62 0.8 0.8 1.17 1.7 1.6 0.76 0.82 0.71 meq

chi a

chi b

chi c

0.00 0.00 0.00 7.25 10.5 7.59 27.1 11.2 8.95 11.2 42.9

0.00 0.00 0.00 3.73 1.41 0.41 3.60 2.27 1.96 2.10 5.28 J.lg/I

0.00 0.00 0.00 5.65 0.81 0.00 4.12 1.83 2.67 3.46 3.14 J.lgtl

~gtl

Bacillarioph ceae

zuurstof

temperatuur

550 1513 1386 519 979 2111 2217 2963 1730 1032 aantal cm·2

105.2 101.1 110.2 98.2 101.2 89.0 45.0 49.2 80.0 88.4 93.5 %02

2.3 5.6 8.2 12.3 16.2 24.4 23.6 17.5 11.6 8.9 5.7 ·C

Tabel A.4.3 De gegevenstabel gebruikt voor biplot 2 van de seizoenale opvolging (figuur 4.4).

A·11

datum maand biomassa 3-07-00 257 16-08-00 A 230 17-09-00 188 S 12-10-00 0 111 112 8-11-00 N 19-12-00 D 94 (g m-2)

datum maand J 3-07-00 A 16-08-00 17-09-00 S 12-10-00 v' N 8-11-00 19-12-00 D

datum maand 3-07-00 J 16-08-00 A 17-09-00 S 12-10-00 0 8-11-00 N D 19-12-00

A-12

Mg mg/L 8.64 8.96 24.32 12.88 14.16 20.8 mg/l

Cyanophyta 2624 1566 5913 2513 455 1889 aantal cm-2

conductiviteit 304 350 367 252 224 209 ~S cm-1

Kmg/L 1.91 2.36 2.58 1.5 1.28 1.42 mg/l

Vmax

~gP/g

Na mg/L 11.4 10 9.5 ',:).;1

6 7.3 mg/l

Chlorophyta 2016 4127 931 2270 1058 730 aantal cm-2

6.34 3.70 3.01 1.43 2.41 5.35 DW/min

chloride 20.2 22.3 42.6 22.7 18.1 17.7 mgll

chi a 7.59 27.1 11.2

Km 582 285 107 482 640.3 553

T-P 16.3 13.9 925 458 36.9 43.6

o-P 19.4 2.69 775 355 7.70 7.11

N0345 14 34 6 5 25

~gP/I

~gP/I

~gP/I

~gN/I

8.95

1.96

11.2 42.9

2.10 5.28

chi c 0.00 4.12 1.83 2.67 3.46 3.14

~g/l

~g/l

~g/l

Bacillariophyceae 979 2111 2217 2963 1730 1032 aantal cm-2

chi b 0.41 3.60 2.27

zuurstof 89.0 45.0 49.2 80.0 88.4 93.5 %02

sulfaat 15 14 26

29 14 14 mg/l

temperatuur 24.4 23.6 17.5 11.6 8.9 5.7 "C

CO2 149.6 308 299.2 220 184.8 184.8 mgC02/1

HC031.17 1.7 1.6 0.76 0.82 0.71 meq

Ca mg/L 4.98 6.08 8.2 8.04 2.83 3.1 mg/l

DOC 19.8 18.9 14.4 18.5 21.6 23.5 mg/l

fosforgehalte 0.023 0.023 0.024 0.023 0.024 0.021 mmol P/gDW

stikstofgehalte 0.76 0.76 0.80 0.66 0.80 0.85 mmol N/gDW

opname 5000 2.74 0.603 3.54 0.985 9.05 3.43 ~gP/(g DW.min)

Tabel AAA Factorladingen en verklaarde variabiliteit voor biplot 1 van de seizoenale opvolging (figuur 4.2).

biomassa conductivitei Vma Km TP oP N03 CO2 alkalinitei Ca2 Mg2 K Na CI chlorofyl a chlorofyl b chlorofyl c S042 DOC cyanofyten chlorofyten bacillariofyten 02 temperatuu

Factor 1 0.03908 -086833 -0.14877 0.302146 -0.80639 -0.81371 -0.04168 -0.79926 -0.80889 -0.85989 -0.51148 -0.90824 -0.58001 -0.93442 -0.1423 -0.11621 -0.04013 -0.47743 0.83707 -0.89908 0.487206 -0.60909 0.875348 -0.67471

ExplVa Prp.Totl

10.11384 0.42141

Factor 2 -0.58432 -0.36615 -0.72546 -0.21751 0.399483 0.375474 -0.44443 0.07477 -0.3821 0.112282 0.337727 -0.32136 -0.6922 0.108741 -007337 0.248846 0.406811 0.622838 -0.04588 0.050167 -0.15701 0.49859 0.121857 -0.5769 3.665934 0.152747

Tabel AA.5 Factoriadingen en verklaarde variabiliteit voor biplot 2 van de seizoenale opvolging (figuur 4.4). Factor 1

Factor 2

P-gehalte plant N-gehalte plant

0.550999 0.898542 -0.22803 -0.87714 -0.45296 0.735491 0.757809 0.291483 0.732737 0.788806 0.858564 0.155818 0.878115 0.547996 0.853839 -0.41483 -0.32023 -0.24208 0.574003 -0.95387 0.791675 0.291472 0.504254 -0.81748 0.615323 0.452427 -0.291

-0.79429 -0.33499 -0.81158 -0.12061 0.230521 0.537972 0.500489 -0.61564 0.198425 -0.38982 0.255174 0.548375 -0.30383 -0.79492 0.25717 -0.06905 0.221505 0.423203 0.622228 -0.15138 0.134554 -0.40038 0.641026 0.011228 -0.71349 0.059666 -0.1665

Expl.Va Prp.Totl

10.93348 0.404944

5.508726 0.204027

biomassa conductivitei Vma Km opname 5000 TP oP N03 CO2 alkaliniteit Ca2+ Mg2+ K+ Na+ CIchlorofyl a chlorofyl b chlorofyl c 5042 DOC cyanofyten chlorofyten bacillariofyten

02 temperatuu

A-13

Tabel AA.6 Gegevens over de fosfaatopname-experimenten van de inleidende experimenten over de invloed van Na+ en K+ op de opnamesnelheid (4.3.1).

conditie met K 3 PO 4 -toediening

Fosfaatopname november 2000 fosfaatconcentrafie (~gP

T 30

r')

8 5 ·2 2 2

100.1 113 79 51 32 17 8 2

100·2 98 63 36 23 8 5 2

100·3 82 54 29 20 2 5 2

200·1 194 132 91 57 36 23 11

200·2 166 101 57 26 11 5 ·2

200·3 153 104 79 45 23 14 5

500·1 441 333 249 178 132 70 42

500·2 451 321 252 163 110 67 36

500·3 435 336 302 225 175 119 67

1000·2 912 789 702 578 500 429 345

1000·3 894 779 705 612 590 497 414

2000·1 1836 1718 1588 1427 1362 1229 1123

2000·2 1814 1603 1532 1387 1284 1160 1070

2000·3 1805 1653 1557 1405 1337 1191 1098

5000·1 1290 1222 1052 1086 987 962 1074

5000·2 1325 1281 1052 1108 1018 974 1080

5000·3 1380 1287 1083 1182 1052 1036 1142

10000·1 2338 2285 1966 2189 1799 1802 1994

10000·2 2276 2136 1945 2081 1727 1734 2012

10000·3 2319 2270 1941 2118 1814 1789 2096

0·1 0.110

0·2 0.099

0·3 0.088

100·1 0.096

100·2 0.147

100·3 0.133

200·1 0.109

200·2 0.187

200·3 0.142

500·1 0.149

500·2 0.173

500·3 0.121

1000·1 0.139

1000·2 0.117

1000·3 0.124

2000·1 0.127

2000·2 0.141

2000-3 0.134

5000·1 0.135

5000·2 0.134

5000·3 0.106

10000·' 0.194

10000·2 0.211

10000·3 0.154

0·2 32 17 5 2 ·2 ·2 ·2

0·3 29

98 146 187 247 305

0·1 39 23 11 5 ·2 ·2 2

T 30 63 98 146 187 247 305

1000·1 875 785 699 596 513 401 327

63

n

drooggewicht (g OW)

co"ectie voor cuvetvo/ume en drooggewichf (~gP (9 OWr')

T 30 63 98 146 187 247 305

0·1 28 17 8 3 ·1 ·1 1

0·2 26 14 4 1 ·1 ·1 ·1

0·3 27 16 7 4 ·1 1 1

100·1 94 66 42 27 14 6 1

100·2 53 35 19 13 4 3 1

100·3 49 33 18 12 1 3 1

200·1 142 97 67 42 26 17 8

200·2 71 43 25 11 5 2 ·1

200·3 86 58 45 25 13 8 3

500·1 238 179 134 96 71 38 23

500·2 209 148 117 75 51 31 16

500·3 289 223 200 149 116 79 44

T 30 63 98 146 187 247 305

1000·1 504 452 402 343 295 231 188

1000·2 622 537 478 394 341 292 235

1000·3 577 503 455 395 381 321 267

2000·1 1155 1081 999 897 856 773 706

2000·2 1026 907 867 784 727 656 606

2000·3 1076 965 928 838 797 710 655

5000·1 766 725 624 644 586 571 637

5000·2 791 765 626 661 608 582 845

5000·3 1044 973 619 894 795 784 863

10000·1 963 941 610 902 741 742 821

10000·2 865 812 701 791 656 659 765

10000·3 1205 1179 1006 1100 942 930 1089

richtingscoiifficiijnt van de gefitte rechte (lJgP (g OW)"' min")

0·1 0

0·2 0

0·3 0

100·1 ·0.3797

100·2 ·0.4993

100-3 ·0.4362

200·1 ·0.8738

200·2 ·0.7387

200·3 ·0.6062

500·1 ·1.086

500-2 ·0.9751

500-3 -1.045

1000·1 ·1.722

1000·2 ·1.751

1000·3 ·1.685

2000·1 ·1.907

2000·2 ·2.049

2000.3 ·1.907

5000·1 -6.692

5000·2 ·9.444

5000-3 ·11.01

10000·1 ·14.91

10000·2 ·14.46

10000·3 ·11.06

repl3 0 0.44 0.61 1.05 1.69 1.91 11.0 11.1

gem.

opnamesnelheid (lJgP (g OW)"' min")

repl1 0 100 200 500 1000 2000 5000 10000

A-14

a 0.38 0.87 1.09 1.72 1.91 6.7 14.91

repl2 0 0.50 0.74 0.98 1.75 2.05 9.4 14.5

0 0.44 0.74 1.04 1.72 1.95 9.0 13.5

conditie met NaH 2 PO 4 -toediening

Fosfaatopname november 2000 fosfaatconcentratie (~gP I"')

T 30 63 98 146 247

0-1 2 0 0 0 0

0-2 2 0 0 0 0

0-3 11 2 0 2 0

100-1 79 54 54 23 11

100-2 79 48 29 17 5

100-3 110 82 70 51 32

200-1 163 122 91 70 39

200-2 150 107 76 51 23

200-3 156 135 107 88 67

500-1 414 324 271 200 125

500-2 327 259 203 122 54

500-3 367 290 225 166 88

T 30 63 98 146 247

1000-1 841 739 671 584 448

1000-2 801 609 534 417 203

1000-3 807 714 587 479 308

2000-1 1780 1579 1517 1377 1086

2000-2 1805 1653 1520 1393 1173

2000-3 1836 1718 1628 1501 1337

5000-1 5015 4643 4085 4296 3255

5000-2 5473 4817 4457 4470 3775

5000-3 5238 4817 4333 4593 3949

10000-1 10320 10109 8597 9415 7692

10000-2 10580 10059 8969 9873 8287

10000-3 10406 9935 8795 9340 8051

0-1 0.086

0-2 0.109

0-3 0.123

100-1 0.093

100-2 0.117

100-3 0.108

200-1 0.096

200-2 0.118

200-3 0.096

500-1 0.132

500-2 0.143

500-3 0.132

1000-1 0.101

1000-2 0.144

1000-3 0.137

2000-1 0.137

2000-2 0.138

2000-3 0.119

5000-1 0.164

5000-2 0.126

5000-3 0.097

10000-1 0.137

10000-2 0.132

10000-3 0.172

drooggewicht (g OW)

correctie voor cuvetvolume en drooggewicht (J,lgP (9 DWr1)

T 30 63 98 146 247

0-1 1 0 0 0 0

0-2 0 0 0 0 0

0-3 7 1 0 1 0

100-1 68 47 47 20 9

100-2 54 33 20 12 3

100-3 81 61 52 38 24

200-1 136 102 76 58 32

200-2 102 72 51 35 16

200-3 130 112 89 73 55

500-1 251 196 164 121 76

500-2 183 145 114 68 30

500-3 223 176 136 100 53

T 30 63 98 146 247

1000-1 668 586 532 464 355

1000-2 445 338 297 232 113

1000-3 472 417 343 280 180

2000-1 1037 920 884 802 633

2000-2 1046 958 881 807 680

2000-3 1232 1153 1093 1008 897

5000-1 2451 2269 1996 2099 1591

5000-2 3470 3053 2825 2833 2393

5000-3 4333 3985 3585 3800 3267

10000-1 6030 5907 5024 5502 4495

10000-2 6436 6120 5456 6007 5041

10000-3 4837 4618 4088 4342 3743

richtingscoefficient van de gefitte rechte (~gP (g OW)"' min-')

0-1 0

0-2

0-3 0

100-1 -0.3797

100-2 -0.4993

100-3 -0.4362

200-1 -0.8738

200-2 -0.7387

200-3 -0.6062

500-1 -1.086

500-2 -0.9751

500-3 -1.045

1000-1 -1.722

1000-2 -1.751

1000-3 -1.685

2000-1 -1.907

2000-2 -2.049

2000-3 -1.907

5000-1 -6.692

5000-2 -9.444

5000-3 -11.01

10000-1 -14.91

10000-2 -14.46

10000-3 -11.06

repl3 0 0.44 0.61 1.05 1.69 1.91 11.0 11.1

gem.

opnamesnelheid (~gP (g OW)"' min")

0 100 200 500 1000 2000 5000 10000

repl1 0 0.38 0.87 1.09 1.72 1.91 6.7 14.91

repl2 0 0.50 0.74 0.98 1.75 2.05 9.4 14.5

0 0.44 0.74 1.04 1.72 1.95 9.05 13.5

A-15

conditie met K 3 PO 4 -toediening

Fosfaatopname december 2000 fosfaatconcentratie (JlgP 1'1)

T 30 63 116 183 247 305

0-1 25 12 -6 -21 -24 -27

0-2 22 5 -14 -24 -24 -27

0-3 15 5 8 -24 -24 -27

100-1 87 74 -5 -24 -24 -27

100-2 129 90 61 26 12 -5

100-3 80 54 22 -5 -14 -27

200-1 198 162 123 87 54 31

200-2 178 145 93 57 35 5

200-3 194 158 116 74 54 25

500-1 439 387 273 191 132 77

500-2 458 390 295 220 156 106

500-3 436 361 256 -37 96 51

T 30

1000-1 882 833 709 618 517 439

1000-2 885 778 631 494 383 299

1000-3 908 840 722 592 498 419

2000-1 1922 1837 1746 1687 1586 993

2000-2 1932 1779 1635 1547 1423 1127

2000-3 1811 1678 1485 1296 1123 1476

5000-1 4337 4768 4585 4742 4207 4155

5000-2 4976 4233 4494 4376 4090

5000-3 4390 4129 3698 3503 3516 2851

10000-1 6241 608S 6098 5654 6176 6111

10000-2 6646 6346 6046 6646 5980 6515

10000-3 6789 6567 6463 7076 6411 7024

0-1 0.065

0-2 0.057

0-3 0.058

100-1 0.088

100-2 0.048

100-3 0.065

200-1 0.045

200-2 0.047

200-3 0.044

500-1 0.062

500-2 0.064

500-3 0.072

1000-1 0.051

1000-2 0.069

1000-3 0.063

2000-1 0.056

2000-2 0.061

2000-3 0.051

5000-1 0.063

5000-2 0.058

5000-3 0.064

10000-1 0.091

10000-2 0.054

10000-3 0.056

63'

116 183 247 305

4937

drooggewicht (g OW)

correctie voor cuvetvolume en drooggewicht {lJgP (9 Dwrt)

T 30 63 116 183 247 305

0-1 30 14 -10 -26 -30 -34

0-2 30 7 -20 -34 -34 -39

0-3 21 7 12 -33 -33 -38

100-1 79 67 -4 -22 -22 -25

100-2 217 151 102 47 20 -8

100-3 99 67 27 -6 -18 -34

200-1 352 288 218 155 96 56

200-2 304 248 159 98 59 9

200-3 352 287 211 134 98 45

500-1 570 502 354 248 172 100

500-2 576 490 371 277 199 133

500-3 487 403 286 -42 108 57

T 3D 63 116 183 247 305

1000-1 1395 1317 1122 977 817 694

1000-2 1028 903 733 574 445 347

1000-3 1153 1066 917 752 632 532

2000-1 2751 2630 2499 2415 2270 1421

2000-2 2538 2337 2148 2033 1870 1480

2000-3 2858 2647 2344 2045 1773 2328

5000-1 5552 6103 5869 6069 5385 5318

5000-2 6864 6810 5839 6198 6037 5641

5000-3 4200 3951 3539 3352 3364 2728

10000-1 5499 5361 5373 4982 5442 5384

10000-2 9937 9489 9040 9937 8943 9742

10000-3 9751 9432 9283 10163 9208 10088

richtingscoefficienf van de gefitte rechte (~gP (g OW)"' min·')

0-1

0-2

0-3

100-1 -1.006

100-2 -1.3

100-3 -0.8346

200-1 -1.531

200-2 -1.681

200-3 -1.632

500-1 -2.538

500-2 -2.367

500-3 -2.317

1000-1 -3.225

1000-2 -3.413

1000-3 -2.75

2000-1 -2.886

2000-2 -4.44

2000-3 -5.958

5000-1 -1.767

5000-2 -3.915

5000-3 -4.593

10000-1 -0.2993

10000-2 -0.6731

10000-3 1.065

repl3 0 0.835 1.63 2.32 2.75 5.96 4.59 0.000

gem.

opnamesnelheid (~gP (g OW)"' min"')

0 100 200 500 1000 2000 5000 10000

A-16

repll 0 1.01 1.53 2.54 3.23 2.89 1.77 0.299

repl2 0 1.30 1.68 2.37 3.41 4.44 3.92 0.673

0 1.05 1.61 2.41 3.13 4.43 3.43 0.324

conditie met NaH 2 PO 4 -toediening

Fosfaatopname december 2000 fosfaatconcentratie (jJgP 1"1)

T 30 63 116 183 247 305

0-1 -1 -5 -14 -37 -21 -24

0-2 -1 -5 -8 -18 -21 -21

0-3 5 5 2 -5 -8 -11

100-1 87 67 48 25 8 -1

100-2 87 80 113 -37 25 18

100-3 87 64 48 18 12 -5

200-1 178 162 129 93 80 57

200-2 181 162 136 116 113 74

200-3 162 136 87 44 18 2

500-1 -37 308 224 132 77 41

500-2 442 400 390 299 266 217

500-3 403 370 318 253 188 149

T

1000-1 -37 758 625 491 390 312

1000-2 879 752 690 524 423 351

1000-3 885 807 670 586 471 413

2000-1 1808 1769 1577 1433 1296 1127

2000-2 1805 1776 1538 1371 1251 1137

2000-3 1821 1642 1482 1423 1189 1062

5000-1 3398 4324 4350 3933 3672 3542

5000-2 4872 4455 4324 4116 4259 4024

5000-3 4390 4116 3972 3959 3764 3438

10000-1 9697 8680 9319 9110 8380 8054

10000-2 9084 9045 8980 8158 8432 7884

10000-3 8876 8823 8628 8002 8706 8237

0-1 0.052

0-2 0.029

0-3 0.038

100-1 0.047

100-2 0.040

100-3 0.042

200-1 0.046

200-2 0.044

200-3 0.066

500-1 0.070

500-2 0.053

500-3 0.064

1000-1 0.057

1000-2 0.058

1000-3 0.058

2000-1 0.080

2000-2 0.068

2000-3 0.067

5000-1 0.072

5000-2 0.063

5000-3 0.061

10000-1 0.055

10000-2 0.071

10000-3 0.081

30 63 116 183 247 305

drooggewicht (g OW)

correctie voor cuvetvolume en drooggewicht {f.lgP (g OW)"1) T 30 63 116 183 247 305

0-1 -2 -7 -22 -57 -32 -37

0-2 -4 -13 -22 -49 -58 -58

0-3 11 11 4 -10 -17 -23

100-1 148 115 81 42 14 -2

100-2 174 161 227 -75 50 37

100-3 164 121 90 35 22 -9

200-1 307 279 223 161 138 99

200-2 333 297 249 213 207 135

200-3 197 165 105 54 22 2

500-1 -43 353 256 151 88 47

500-2 672 608 593 454 405 330

500-3 501 461 396 315 234 185

T 30 63 116 183 247 305

1000-1 -53 1074 864 695 552 441

1000-2 1208 1033 948 720 581 482

1000-3 1226 1117 928 810 652 571

2000-1 1801 1762 1571 1428 1291 1123

2000-2 2114 2080 1801 1606 1465 1331

2000-3 2174 1960 1770 1700 1419 1267

5000-1 3766 4791 4820 4358 4069 3925

5000-2 6226 5693 5526 5260 5443 5143

5000-3 5785 5424 5235 5218 4960 4531

10000-1 14079 12602 13530 13227 12167 11694

10000-2 10221 10177 10104 9180 9488 8871

10000-3 8820 8769 8574 7952 8652 8185

richtingscoefficient van de gefitte rechte (~gP (g

owr' min-')

0-1

0-2

0-3 0

100-1 -0.6728

100-2 -0.5645

100-3 -0.8081

200-1 -0.9879

200-2 -0.9694

200-3 -1.066

500-1 -1.674

500-2 -1.322

500-3 -1.219

1000-1 -3.14

1000-2 -2.992

1000-3 -2.751

2000-1 -2.483

2000-2 -2.977

2000-3 -3.086

5000-1 -1.299

5000-2 -3.066

5000-3 -3.766

10000-1 -6.692

10000-2 -4.934

10000-3 -2.025

repl2

repl3

gem.

0 0.58 0.97 1.32 2.99 2.98 3.07 4.934

0 0.808 1.07 1.22 2.75 3.09 3.79 2.025

0 0.69 1.01 1.41 2.96 2.85 2.72 4.55

opnamesnelheid (~gP (g OW)"' min-')

100 200 500 1000 2000 5000 10000

repll 0 0.67 0.99 1.67 3.14 2.48 1.30 6.692

A-17

Tabel A.4. 7 Gegevens over de fosfaatopname-experimenten van de experimenten uit punt 4.3.2.

Experiment zonder voorafgaande natrium uithongering fosfaatconcentraties tijd

29 58 89 118

0·1 344 259 159 100

0·2 369 175 128 71

0·3 388 291 215 206

0-4 325 244 150 87

0·5 266 212 140 90

1·1 309 200 109 40

1-2 353 209 147 96

1-3 316 212 128 74

1-4 331 184 137 90

1-5 394 256 234 172

2-1 297

2-2 347 237 78 49

2-3 225 231 125 87

2-4 303 165 90 49

2-5

;~;I 90

3-1 309 153 100 62

3-2 231 100 46 18

3-3 241 109 53 24

3-4 278 272 106 62

3-5 259 172 87 46

96

65 27

29

58 89 118

40

5-1 313 178 74 56

5-2 200 49 24

190 131 53 40

231 87 34 31

153 62 46 12

0·1 0.251

0·2 0.232

0-3 0.187

0-4 0.185

0-5 0.209

1-1 0.238

1-2 0.239

1-3 0.278

1-4 0.263

1-5 0.229

2·1 0.304

2-2 0.268

2-3 0.206

2-4 0.249

2-5 0.249

3·1 0.299

3·2 0.366

3-3 0.303

3-4 0.310

3-5 0.296

5-1 0.375

5-2 0.318

5-3 0.282

0.365

5-5 0.312

0-1 110 83 51 32

0-2 127 60 44 25

0-3 166 124 92 88

0-4 141 105 65 38

102 81 54 34

1-1 104 67 37 13

1-2 119 70 49 32

1-3 91 61 37 21

1-4 101 56 42 27

1-5 137 89 82 60

2-1 78 25 17

2·2 104 71 23 15

2-3 88 90 48 34

2-4 97 53 29 16

2-5 104 54 29 13

3-1 83 41 27 17

3-2 51 22 10

3-3 64 29 14 6

3-4 72 70 27 16

3-5 70 46 23 12

5-2 50

5-3 51 19

7

5-5 39 16 12

biomassa

correctie voor biomassa

tijd 29

58 89 118

29

58 89 118

29

58 89 118

en cuvetvolume

7 5-1 67 38 16 12

12

54 37 15 11

0-5

richtingscoefticienten van de raaklijnen

0·1 -0.98

0·2 -1.37

-1.23

0-4 -1.27

0-5 -0.80

1-1 -1.12

1-2 -1.15

1-3 -0.90

1-4 -0.98

1-5 -0.92

2-1 -1.01

2-2 -1.34

2-3 -0.66

2-4 -1.14

2-5 -1.25

3·1 -0.93

3-2 -0.67

3·3 -0.82

3-4 -0.75

3·5 -0.78

5-1 -0.84

5-2 -0.52

5-3 -0.65

-0.72

5-5 -0.45

r1 0.98 1.12 1.01 0.93 0.84

r2 1.37 1.15 1.34 0.67 0.52

,3 1.23 0.90 0.66 0.82 0.65

,4 1.27 0.98 1.14 0.75 0.72

,5 0.80 0.92 1.25 0.78 0.45

0-3

opnamesne/heden Na-cond.

A-18

gem. 1.13 1.01 1.08 0.79 0.64

Experiment met voorafgaande natriumuithongering fosfaatconcentraties "d 17 46 78 116 171

428 389 304

0-2 589 477 409 324 245

0-3 621 487 399 317 212

0-4 680

0-5 569

546

396

481 396 327

330 248 173

17 46 78 116 171

2-1 576 379 258 160 95

2-2 608 409 255 154 65

2-3 648 520 409 252 183

2-4 599 379 245 147 62

2-5 576 474 343

17 46 78 116 171

5-1 631 360 288 150 68

=

5-2 618 425 379 275 163

5-3 605 484 350 242 131

5-4 477 474 216 114 46

5-S 589 474 373 248 167

0-1 0.197

0-2 0.172

0-3 0.197

0-4 0.157

2-1 0.225

2-2 0.219

2-3 0.221

5-1 0.258

5-2 0.220

0-2 273

0-1 628 546

1-1 572 369 258 167 75

1-2 697 523 494 389 291

1-3 595 438 297 216 137

1-4 576 409 307 245 150

1-5 576 399 294 212 121

3-1 618 438 265 252 134

3-2 572 386 301 212 91

3-3 612 455 350 232 144

3-4 671 527 432 347 226

3-5 546 360 275 173 88

0-5 0.175

1-1 0.223

1-2 0.158

1-3 0.200

1-4 0.179

1-5 0.252

2-4 0.239

2-5 0.216

3-1 0.184

3-2 0.221

3-3 0.204

3-4 0.236

3-5 0.246

5-3 0.230

5-4 0.261

5-S 0.279

0-5 261 181 151 114 79

1-1 205 133 93 60 27

1-2 352 264 250 197 147

1-3 238 175 119 86 55

1-4 258 183 138 110 67

1-5 176 122 90 65 37

3-1 269 191 115 110 58

3-2 207 140 109 77 33

3-3 240 178 137 91 56

3-4 227 178 146 117 76

3-5 178 117 89 56 29

121

biOnJaua

cOn'ectie voor biomassa en cuvetvoJume

tijd 17 46

78 116 171

0-1 255 222 174 150 124

=

0-3 252 198 152 129 86

0-4 347 278 245 202 167

17 46 78 116 171

2-1 204 135 92 57 34

2-2 222 149 93 56 24

2-3 235 189 148 95 66

2-4 201 127 82 49 21

2-5 213 176 127 82 45

17 46 78 116 171

5-1 196 112 89 47 21

5-2 225 155 138 100 60

5-3 211 169 122 84 46

5-4 146 145 66 35 14

5-S 169 136 107 71 48

0-1 -1.33

0-2 -1.36

0-3 -1.47

0-4 -1.66

0-5 -1.78

1-1 -1.84

1-2 -1.66

1-3 -1.95

1-4 -1.96

1-5 -1.40

2-1 -1.01

2-2 -1.84

2-3 -2.11

2-4 -1.42

2-5 -1.93

3-1 -2.52

3-2 -1.60

3-3 -1.67

3-4 -1.32

3-5 -1.44

5-1 -1.73

5-2 -1.41

5-3 -1.46

S-4 -1.34

5-S -1.01

r1 1.33 1.84 1.84 2.52 1.73

r2 1.36 1.66 2.11 1.60 1.41

r3 1.47 1.95 1.42 1.67 1.46

r4 1.66 1.96 1.93 1.32 1.34

rS 1.78 1.40 1.41 1.44 1.01

190 150 114

richtingscoefficJinten van de raaklijnen

opnamesnelheden

Na-cond. 0 1 2 3 5

gem. 1.52 1.76 1.74 1.71 1.39

A-19

Tabel A.4.B Gegevens over de fosfaatopname-experimenten van de experimenten uit punt 4.3.3.

fosfaatconcentratie tijd (min)

2·1

2·2 757

2-3

4·2 719

1·1 750

1·2

1-3

20

728

3·2 738

741

662

665

722 668

3·1 731

697

728 687

712

49

643

643

694

4·1 662 665

668

722 675

90

589

637

583

690 596

640

599

567

580

637

627

618

608

148

567

640

536

539

611

517

533

583

570

498

574

492

482

539

444

485

586 548

580

209

533 485

520

567

523

5·1

5·2 738

5-3

6·1 744

6·2 738

6-3

7·1 706

7·2 753

7-3

8·1 719

8·2

8-3 757

728 643

20 90 49 148 209

1

0

706

690 634

634

659 624

646

~~~I

659

646

621

593

615

675

602

570

~~:I'

728 690

611

611

646

627

533

529

570

570

586

526 454

545

561

618 583

501

593

9-3

10~1

10-2

10-3

11-1

11-2

11-3

12-1

12-2

12-3

738

725

753

753

719

687

731

725

728

706

703

640

741 671

722

731

687

675

678

649

643

548

640

662

615

652 611

728

728

574

640

479

630

403

586

9·1 744

757

:;1

9·2

697

712

9

731

725

690

0

659

668

652

697

148

662

640

608

684

649

611

599

488

593

608

567

555

209

608

605

555

668

640

574

536

413

520

580

520

495

1·1

1-2 0.0398

1-3

2·1

2·2

2-3

3·1

3·2

3-3

4-3

0.0282

0.0368

0.0428

0.0371

0.0338

0.0287

4·1 0.0319

4-2

0.0462

0,0319

0.0382

8·1 0,0337

8·2

8-3

0.0251

0,0224

drooggewicht 0,0397

correctie

v~~r

5·1

5-2

5-3

6·1

6-2

6-3

7·1

7·2

7-3

0.0439

0.03

0.0232

0.0363

0.0252

0.0358

0.0268

0.0206

0.025

9·1 0.019

9·2 0.0217

9-3

10-1

10-2

10-3

12-1

12-2

12-3

0.0196

0,0221

0.0248

11·' 0.0229

11-3

0.0287

0.043

0.0304

0.0192

0.0303

0.0285

cuvetvolume en drooggewicht

tijd (min) 20

1-1 1511.931083

1-2 1467.430126

1-3 1435.643728

2-1 1467.430126

2-2 1524.645642

49 90 148

1403,85733 1187.709824 1143.208866

1384.785491

1333.927254

1454.715567 1346.641814

1473.787406 1295.783577

1486.501965 1295.783577

1492.859244 1397.50005

1333.927254 1340.284534

1448.358287 1346.641814

1454,715567 1359.356373

, 174.995264 1079.636071

1391.142771 1200.424383 1085.99335

1340.284534

1283.069018 1289.426297

1289.426297 1232.210781

1206.781662 1073.278791

1143.208666 1041.492393

1168.637985 1073.278791

1283.069018 1181.352544

1263.997179 1168.637985

1244.92534 1174.995264

1225.853501 1149.566146

209

1003.348715

1155.923426

990.6341562

971.5623174

1085.99335

977.919597

895.2749622

977.919597

1105.065189

1047.849673

1143.208866

1054.206952

5·1 1467.430126 1295.783577 1155.923426

5·2 1486.501965 1467.430126 1289.426297

5-3 1467.430126 1422.929169 1302.140856

6·1 1499.216524 1422.929169 1302.140856

6·2 1486.501965 1391.142771 1276.711738

6-3 1480.144685 1429.286448

7·1 1422.929169 1327.569975

7·2 1518.288363 1403.86733

7--3 1505.573804 1429.286448

8·1 1448.358287 1327,569975

8-2

20 49 90

1467.430126 1391.142771

8-3 1524.645642 1435.643728

12.76.711738

1257.639899

148 209

965.2050378 812.6303275

1270.354458 1181.352544

1251.28262 1130.494307

1213.138942 1073.278791

1149.566146 1066.921511

1232.210781 1149.566146

1232.210781 1149.566146

1302.140856 1302.140856

1251.28262 1244.92534

1194.067103 1060.564232

1238.56806 1098.707909

1359.356373 1263.997179

1181.352544

1174.995264

914.346801

1009.705995

1194.067103

9·2 1524.645642

9-3

10-1 1461.072846

10-2 1518.288363

10-3 1518.288363

11-1 1448.358287

11-2

12-1 1454.715567

12-3

1384.785491

11-3 1492.859244

12-2

20

9·1 1499.216524

1473,787406 1327.569975

1461.072846 1346.641814 1289.426297

1422.929169 1308.498136

1416.571889 1295.783577

1289.426297 1105.065189

1352.999093 1289.426297

1384.785491 1333,927254

1473.787406 1359.356373

1461.072846 1314.855416

1238.56806

1232.210781

1232.210781

984.2768766 831.7021662

1194.067103 1047.849673

1225.853501 1168.637985

1143.208866 1047.849673

1117.779748 996.9914358

·2.06

49 90 148 209

1486.501965 1391.142771

1473.787406

1467.430126

1314.855416 1225.853501 1117.779748

1403.85733 1378.428212 1346,641814

1365.713652 1308.498136 1289.426297

1155.923426

1206.781662 1079.636071

1·2 -1.464

1-3 -2.327

2·1 -2.664

2·2 -1.998

2-3 -2.514

3·1 -2.865

3·2 -2.487

3-3 -2.025

4·1 -1.596

4-2 -1.564

5·1 -3.373

5·2 -1.65

5-3 -1.753

6·1 -2.201

6·2 -2.219

6-3 -1.749

7·1 -1.296

7·2 -1.561

7-3 -1.685

8·1 -2.753

-2.487

8-3 -1.706

9·1 -1.407

9·2 -1.594

9-3 -1.862

10-1 -1.241

-1.86

-1.984

11-2 -2.909

11-3 -2.161

-1.512

-2.176

12-3 -2.304

1333.927254 1225.853501

1219.496222

richtingscoefficitinten van de lineaire fits

1·1

opnamesnelheid (zie balkenfiguur in basisbestand.pzm) r1

r2

cond 1

2.59

1.46

cond 2

2.66

2.00 2.49 1,56

condJ

2.87

cond4

1.60

cond5

3.37

cond 6 cond7

2.20 1.30

cond 8

2.75

cond 9 cond 11

1.41 0.68 1.98

cond 12

1.51

cond 10

A-20

1.65 2.22 1.56 2.49 1.59 1.24 2.91 2,18

r3 2.33 2.51

2.03 2.06 1,75 1,75

gem.

2.13 2.39 2.46 1.74 2.26

1.69

2.06 1.51

1.71

2.32

1.86 1.86 2.16

1.26 2.35

2.30

2.00

1.62

10-3

8-2

4--3

Figuur A.4.1 Biplot bij de factoranalyse van het Na+/K+ stimulatie experiment (4.3.3). De factorladingen en de verklaarde variabiliteit zijn terug te vinden in tabel A.4.9 (hieronder).

0.8

0.6

0.4

bioma opnamesnelt¥!id

0.2

.0.

.0.

pH-stijging

.0.

.0.

-D.8

..0.6

-0.4

.0.2

0.2

0.4

0.6

0.8

Factor 1

Tabel A.4.9 Factorladingen en verklaarde variabiliteit van de biplot over het Na+/K+ stimulatie experiment (figuur A.4.1)

natrium kalium biomassa preincubatie pH-stijging 0 namesnelheid Expl.Var Prp.Totl

Factor 1

Factor 2

0.10 0.01

2.22

-0.59 -0.67 0.21 -0.16 -0.66 0.16 1.33

0.37

0.22

0.91 -0.72

0.55 0.75

A-21

Tabel A.4.10 Gegevens over de fosfaatopname-experimenten van het pH-experiment voor Chara (4.5.1).

Czp - pH 5 fosfaatconcentraties (~gPII) tijd 0-1 0-2 0-3

150-1

150-2

150-3

500-1

500-2

500-3

2000-1

2000-2

2000-3

98 50

104 56 15 2 2

o

117 79 47 15 6 6 2 2 2

2

2 2 2

409 285 171 72 18 2 2 2 2

371 260 136 44 9 2 6 2 2

403 311 206 120 50 12 6 2 2

1861 1709 1455 1372 1156 898 775 552 355

1734 1674 1369 1261 1048 794 666 419 218

1871 1734 1461 1375 1226 1026 867 692 527

0-3

150-1

150-2

150-3

500-1

500-2

500-3

2000-1

2000-2

2000-3

0.148

0.084

0.123

0.159

0.162

0.174

0.097

0.118

0.128

0.074

correctie voor cuvetvolume en drooggewicht (~gP/gDW) tijd 0-1 0-2 0-3 150-1 150-2 150-3

500-1

500-2

500-3

2000-1

2000-2

2000-3

202 141 84 36 9

170 119 62 20 4

334 257 171 99 41 10 5 2 2

1264 1160 988 932 785 610 526 375 241

1087 1049 858 790 657 498 418 262 137

2025 1877 1581 1489 1327 1110 938 749 570

24 59

2 2 6

106 174 255

2 2

a a o

2 2

o o

658

o o o o o

o o o

o o

289 427 543

2

o o

drooggewichten (g) 0-1 0-2

0.111

24 59

0.094

2 2 4

106 174 255

o o

289 427

2 2

543 658

o o

2 2

1 0

a a a a

o a a o o o o

a o o

15

2 2 2 2

o

o

112 75 45 14 5 5 2 2 2

63 32 10 2 2 2 2

52 28 8

3

o 2

Czp - pH 6 fosfaatconcentraties tijd 0-1

(~gPII)

0-2

0-3

150-1

150-2

150-3

500-1

500-2

500-3

2000-1

2000-2

2000-3

o

a o o

96 64 26

89 45 7

99 58 20 7

341 209 118 33 4 17

382 246 127 45 7

325 206 86 23 4 1

1781 1564 1337 1098

375 171 61

1674 1501 1246 1048 756 520 356 174 64

1784 1611 1416 1193 932 696 536 316 162

24 58 107 166

4

o o

248 341 420

4

536 650

a o

o

drooggewichten (g) 0-1

0.079

a o o o

a

o o

a o a a

a

4 4 4

1

4

0

1

1

1

o

0-2

0-3

150-1

150-2

150-3

500-1

500-2

500-3

2000-1

2000-2

2000-3

0.078

0.088

0.116

0.121

0.072

0.149

0.113

0.109

0.111

0.123

0.108

150-3

500-1

500-2

500-3

2000-1

2000-2

2000-3

109 64 22 8

183 112 63 18 2 9 2

270 174 90 32 5

238 151 63 17 3

1279 1123 960 789

1091 979 813 683 493 339 232 114 42

1323 1194 1050 884 691 516 397 234 120

correctie voor cuvetvolume en drooggewicht (~gP/~gDW) tijd 0-1 0-2 0-3 150-1 150-2 24 1 0 66 59 58 0 44 30

a

107

4

166

a

a

341

4

420

o a

o o o a

248

536 650

A-22

a

o

18 3 1 3 3

a

5

o

270 123 44

Czp - pH 7 fosfaatconcentraties ("gPII) tijd 0-1 0-2 24 7 4 54 4 4 4 102 13 4 162 4 7 244 4 337 4 10 4 415 7 531 7 4 646 4 4 drooggewicht (g) 0-1 0.135

0-2 0.090

0-3 7 7 4 4 4 4 7 4 4

150-1 67 29 7 4 7 4 7 4 7

150-2 83 54 19 10 7 7

7

7 7 4 7

0-3 0.080

150-1 0.132

150-2 0.094

150-3 0.119

150-3 83 35 10

13 7 7 7

500-2 361 247 133 54 16 7 7 7

7

7

500-3 361 238 130 45 10 7 7 4 7

500-1 0.102

500-2 0.126

500-3 0.124

2000-1 0.146

2000-2 0.143

2000-3 0.143

500-1 285 198 109

500-2 229 157 85 34 10 4 4 4 4

500-3 233 153 84 29 6 4 4

2000-1 871 730 540 377 191 68 21 4 4

2000-2 907 802 619 465 282 149 66 18 6

2000-3 933 779 599 428 249 106 37 7 6

500-1 364 253 140

7

7

10

correctie voor cuvetvolume en drooggewicht ("gP/gDW) tijd 0-1 0-2 0-3 150-1 150-2 150-3 24 4 3 7 41 70 56 54 2 3 7 18 46 24 102 8 3 4 4 16 7 162 2 3 4 2 8 5 244 2 6 4 4 6 5 337 4 6 5 2 6 3 6 5 4 415 7 3 4 8 531 4 2 2 6 2 6 4 4 646 5 3 2

10 5

5 5 5

2 4

2000-3 1670 1395 1072 766

7

2000-2 1616 1430 1104 829 503 266 117 32 10

2000-1 1591 1335 987 690 348 124 38 7

446

190 67 13 10

Czp -pH 8 fosfaatconcentraties ("gPII) tijd 0-1 0-2 24 2 2 55 2 0 100 o a 171 a a 241 o a 327 a a 406 a 2 a 521 a 636 a a drooggewicht (g) 0-1 0.1438

0-2 0.0973

0-3 2

a a a a a a 5

a 0-3 0.1051

150-1 107 85 40 18 5

150-3 82 46 14 5

2

150-2 107 78 34 8 5 2 14 2 2

150-1 0.0984

150-2 0.0856

2 11

a

correctie voor cuvetvolume en drooggewicht ("gP/gDW) tijd 0-1 0-2 0-3 150-1 150-2 24 1 1 87 100 55 a 0 69 73 100 a a 0 33 31 171 a 0 0 14 8 241 4 5 a a a 1 a 2 327 a a 9 14 406 a a a 2 521 a a 4 2 636 a a

a

5 5

500-1 389 264 142 43 8

500-2 386

2

277 152 62

2 5 2

2000-1 1646 1333 1010 706 459 229 104 21 5

2000-2 1666 1512 1294 1022 789 546 2 219 101

2000-3 1720 1592 1352 1122 939 731 549 331 181

500-3 395 290 200 104 50 11

2

8 2

5

2

2 2 2 2

150-3 0.1786

500-1 0.1396

500-2 0.1308

500-3 0.0984

2000-1 0.1156

2000-2 0.1009

2000-3 0.1432

150-3 37 21

500-1 223 151 82 25 5 1 5

500-2 236 169 93 38

500-3 321 236 163 85 40 9

2000-1 1139 922 699 488 318 158 72 14 3

2000-2 1321 1199 1026 811 625 433

2000-3 961 889 755 627 525

5

6 2 2 2

2 1 2

4 1

174 80

409

307 185 101

A-23

Czp - pH 9 fosfaatconcentraties (..,gPII) tijd 0-1 0-2 0-3 19 7 7 55 27 7 4 4 90 4 65 162 4 4 4 231 4 4 4 318 4 4 7 397 11 4 4 4 512 7 4 4 626 4 4

150-1 132 97 74 46 23 11 11 7 7

150-2 122 74 52 20 11 7 7 7 7

150-3 122 90

drooggewicht (g) 0-1 0.089

150-1 0.092

150-2 0.095

0-2 0.091

0-3 0.073

39 20 7 7 7 7

500-1 426 336 260 164 94 43 23 7 7

500-2 483 438 416 365 317 272 224 164 113

500-3 413 358 307 208 148 97 58 23 11

2000-1 1833 1709 1587 1345 1156 965 799 662 499

2000-2 1862 1645 1549 1278 1026 885 738 524 378

2000-3 1763 1571 1444 1332 1112 981 818 620 454

150-3 0.089

500-1 0.117

500-2 0.083

500-3 0.095

2000-1 0.139

2000-2 0.170

2000-3 0.154

500-1 291 230

500-2 466 423 401 352 306 263 217 158 109

500-3 349 303 260 176 125 82 49 20 9

2000-1 1054 983 913

2000-2 878 775 730 602 483 417 348 247 178

2000-3 919 819 752 694 579 511 426 323 237

correctie voor cuvetvolume en drooggewicht (..,gP/gDW) tijd 0-1 0-2 0-3 150-1 150-2 150-3 19 7 7 8 115 103 109 55 24 7 5 85 63 81 90 4 4 71 65 44 162 4 4 5 40 17 35 4 4 231 5 20 9 18 4 318 4 6 7 8 9 6 7 397 10 4 5 9 512 7 7 4 5 6 6 626 4 4 7 5 6 6

177

112 64 29 16

5 5

773

665 555 460 381

287

Cmp - pH 5 fosfaatconcentraties (1J9P r') ti"d min 0-1 0-2 21 8 8 47 8 8 84 5 5 151 5 5 230 8 8 326 8 8

0-3 8 8 5 5 5 8

150-1

150-2

150-3

500-1

500-2

500-3

2000-1

2000-2

2000-3

126

129 101 79 42

441 434

55

132 98 73 39

33 14

20 8

23

14

213 114 42

462 416 347 241 154 67

459 413 335 269 188 92

1926 1811 1789 1605 1418 1225

1926 1910 1702 1506 1344 1141

1935 1889 1748 1543 1266 1082

0-2

0-3

150-1

500-1

500-2

500-3

2000-1

2000-2

2000-3

0.085

0.073

150-2 0.100

150-3

0.107

0.088

0.118

0.108

0.097

0.091

0.108

0.106

150-2

150-3

500-1

500-2

500-3

2000-1

2000-2

2000-3

106 79 59

298 294 212 145 77 29

343

6

117 92 72 38 21 13

50

380 341 277 223 156 76

1693 1592 1573 1411 1247 1077

1423 1411 1257 1112 993 843

1459 1424 1318 1163 954 816

drooggewichten (9 OW) 0-1

0.091

104

76

correctie voor biomassa en drooggewicht (1J9P (9 OW)"') ti"d min 0-1 0-2 0-3 150-1 21 7 6 7 137 114 47 7 6 7 4 83 84 4 4 151 59 4 4 4 230 7 6 36 4 326 7 6 15 7

31 16

313

308

257 179 114

Cmp - pH 6 fosfaatconcentraties (1J9P ti"d 0-1 50

-1 -1

93

-4

144 222

-4 -1

318

-1

r') 0-2

0-3

150-1

150-2

150-3

500-1

500-2

500-3

2000-1

2000-2

2000-3

-1 -4 -4 -4 -4 -4

-1 -1

114

126 111 76 34

120 95 53

457 394 289 206 111 37

460 416 324 235 133 63

1940 1851 1650 1450 1278 1049

1937 1695 1739 1351 1132 893

1911 1771 1666 1478 1249 1036

-1 -1

9 -1

15

25 9

2

-1

438 397 295 203 117 44

0-3

150-1

150-2

150-3

500-1

500-2

500-3

2000-1

2000-2

2000-3

0.098

0.086

0.059

0.075

0.069

0.083

0.068

0.091

0.083

0.088

150-2

150-3

500-1

500-2

500-3

2000-1

2000-2

2000-3

172 150 103 47

128 101 57

511 463 344 237 136 51

439 378 277 198 106

541 489 380 276 156 74

1707 1629 1452 1276 1125 923

1860 1628 1670 1298 1087 858

1737 1610 1515 1344 1136 942

-4 2

88 60

41

drooggewichten (g DW)

0-1 0.080

0-2 0.086

correctie voor biomassa en drooggewicht (f.JgP (g DW) -1 ) ti"d 0-1 0-2 0-3 150-1

-1

-1

-1

106

-1

-4 -4 -4 -4 -4

-1 -3

82 56

2

38

-1 -1

8

-4 -4 222

318

A-24

-1 -1

-1

21 3

26 9 -1

36

Cmp - pH 7 fosfaatconcentraties (llgP 1") trd 0-1 0-2 -2 1 84 -2 -2 -2 135 -2 1 212 -2 308 drooggewichten (g OW) 0-1 0.112

0-2 0.114

0-3

-2

-2

0-3 0.114

150-1 122 81 58 33 10

150-2 106 109 68 46 20 7

150-3 125 90 42 30 14

500-1 422 371 224 132 46 10

500-2 489 428 364 183 52 10

500-3 460 399 278 234 119 36

2000-1 1920 1605 1557 1420 1142 964

2000-2 1975 1828 1566 1429 1161 954

2000-3 1917 1767 1643 1442 1161 977

150-1 0.098

150-2 0.093

150-3 0.110

500-1 0.118

500-2 0.134

500-3 0.113

2000-1 0.106

2000-2 0.105

2000-3 0.111

150-2 92 94 59 39 17 6

150-3 91 66 31

500-1 286 251 152 89 31 7

500-2 292 255 217 109 31 6

500-3 326 283 197 166 84 26

2000-1 1453 1215 1178 1075 865 729

2000-2 1512 1399 1199 1094 889 731

2000-3 1384 1276 1186 1041 839 705

500-2 490 449 373 206 114 51

500-3 480 344 183 82 57

2000-1 1872 1759 1418 1127 932 689

2000-2 1781 1964 1487 1260 1011 865

2000-3 1920 1695 1503 1231 1023 853

correctie voor biomassa en drooggewicht (pgP (g OW) -7 ) trd 0-1 0-2 0-3 150-1 -2 99 48 1 1 66 84 -2 -2 -2 47 135 -2 -2 -2 27 212 1 1 9 308 -2

22 10

Cmp - pH 8 fosfaatconcentraties (Ilg PI") trd 0-1 0-2 13 7

4

4

7 4

7 7

0-3 7 7 4 4 7 7

drooggewichten (g OW) 0-1 0.105

0-2 0.131

0-3 0.134

7 4

7 4

150-1 142 136 86 38 16 7

150-2 146 133 79 32 13 10

150-3 146 86 54 10 7

500-1 458 316 218 127 51 19

150-1 0.098

150-2 0.094

150-3 0.106

500-1 0.137

500-2 0.106

500-3 0.114

2000-1 0.138

2000-2 0.121

2000-3 0.094

150-2 124 114 68 27 11 8

150-3 110 65 41 17 7 5

500-1 268 185 128 74 30 11

500-2 370 339 281 155 86 38

500-3 336 241 128 58 40

2000·1 1089 1023 825 656 542 401

2000-2 1174 1295 981 831 666 571

2000-3 1630 1440 1276 1046 869 724

7 7

150·1 135 119 93 32 13 7

150-2 138 132 100 39 13 16

150-3 132 93 61 20 10 10

500-1 456 401 283 202 106 52

500-2 478 366 234 190 90 36

500-3 456 350 299 167 65 20

2000-1 1930 1706 1613 1443 1334 1113

2000-2 1959 1940 1607 1434 1312 1103

2000-3 1930 1619 1533 1401 1180 985

0-3 0.162

150·1 0.103

150-2 0.102

150-3 0.115

500-1 0.096

500-2 0.086

500-3 0.149

2000-1 0.127

2000-2 0.106

2000-3 0.134

150-2 109 104 78 31 10 13

150-3 92 65 43 14 7 7

500-1 381 335 236 169 89 43

500-2 445 341 218 177 84 33

500-3 244 188 160 90 35 11

2000-1 1216 1075 1016 909 840 701

2000-2 1484 1470 1217 1086 994 836

2000-3 1154 968 917 838 706 589

correctie voor biomassa en drooggewicht (pgP (g OW) ·7 ) trd 0-1 0-2 0-3 150-1 10 4 4 116 5 111 4 4 3 2 70 2 31 2 3 2 5 13 4 4 3 4 4 5

22

Cmp - pH 9 fosfaatconcentraties (llgP 1") trd 0-1 0-2

7 7 7 7 7

7 7 7 4 7 7

drooggewichten (g OW) 0-1 0.110

0-2 0.107

16

0-3 7 7 7

7

correctie voor biomassa en drooggewicht (llgP (g OW) -7 ) trd min 0-1 0-2 0-3 150-1 21 5 5 3 105 3 92 51 5 5 3 5 72 12 85 142 3 3 25 5 221 5 5 3 10 323 5 5 5 3

A-25

Opnamesnelheden samengevat Cmp

Czp

IpHS repll 0 0 0.856 150 1.12 500 2000 1.99

repl2 0 0.732 1.10 1.96

repl3 0 0.703 1.05 2.21

IpH6 repll 0 0.696 2.31 2.66

H5 re 11 0 0 150 OB10 1.42 500 2000 1 2.26

re 12 0 0.644 1.31 2.14

re 13 0

H6 re 11 0

0,539

0573

1.98 3.70

1.41 3.40

repl2 0 0.982 2.00 3.35

reol3 0 0.846 2.21 2.67

pH7 reoll 0 0.820 2.20 2.72

reol2 0 0.560 1.20 3.21

reol3 0 0.968 2.10 2.81

pHS reoll 0 0.719 2.09 3.40

reol2 0 0.869 1.36 3.18

reol3 0 1.02 1.97 4.29

re 12 0 0.643 2.14 2.90

H7 re 13 re 11 0 0 1.03 0.45 2.09 1 2.22 4.22 3.05

re 12 0 0.680 1.82 3.70

HS re 13 re 11 0 0 0.601. 0.717 1.83 1.87 1 4.23 5.73

re 12 0 0.910 1.87 3.879

re 13 0

'pH9 reoll 0 0.669 1.81 1.55

H9 re 11 0 n -=ta~ 0.7Q5 1.61 1 1.99 2.73

-;05

repl2 0 0.674 2.21 2.18

rej>l3 0 0.632 1.22 1.69

re 12 0

re 13 0

0.832

a

0.917 2.09

1.25 2.35

Figuur A.4.2 Adaptatie van het plantenmateriaal van het Cmp-experiment aan de gewenste pH. Op de vertikale as werd de absolute waarde van de mate van afwijking (in pH-eenheden) van de gewenste pH uitgezet.

1.50-,--------------------------, - - pH 5 ---1<-- pH 6 - ... - pH 7 ----- pH 8 --e-- pH 9 ::r:

1.25

c. Ol

'O~

0>.,Ol 0>

~~ C.

.

0'0 Ol .-

'OJ!

c: c: III Ol > Ol

o>::r:

c: c.

~:=-

s:

rn

pre'lncubatieduur (dagen)

A-26

Tabe/ AA.11 Gegevens over de fosfaatopname-experimenten van het pH-experiment voor Nitella (4.5.2).

Nzp - pH 5 fosfaatconcentraties (/lgPII) T 0·1 22 36 50 61 91 79 148 92 224 123 321 144 438 156 516 163 636 159 756 drooggewichten (g) 0·1 0.156

0·2 46 46 55 52 64 55 55 49 52

0·3 104 89 101 98 101 132 129 135 132

150·1 156 166 169 178 181 187 212 206 200

150·2 212 212 240 258 286 320 366 381 375

150·3 184 181 172 169 163 153 141 141 144

500·1 581 597 587 578 563 520 547 544 535 507

500·2 526 517 501 477 474 480 495 486 474 560

500·3 486 477 489 480 492 517 547 535 538 517

2000·1 1961 1930 1890 1939 1837 1736 1951 1853 1874 1871

2000·2 1917 1862 1874 1874 1779 1720 1813 1804 1770 1727

2000·3 1998 1939 1865 1847 1816 1727 1751 1748 1631 1677

0·2 0.137

0·3 0.046

150·1 0.133

150·2 0.127

150·3 0.106

500·1 0.174

500·2 0.101

500·3 0.076

2000·1 0.128

2000·2 0.116

2000·3 0.104

150·2 134 134 151 163 181 202 231 241 237

150·3 139 137 130 128 123 116 107 107 109

500·1 267 274 270 265 258 239 251 250 246 233

500·2 417 409 397 378 375 380 392 385 375 443

500·3 510 500 513 504 517 542 575 562 565 542

2000·1 1227 1208 1183 1214 1150 1087 1222 1160 1173 1171

2000·2 1328 1290 1298 1298 1232 1192 1256 1249 1226 1196

2000·3 1537 1492 1435 1421 1397 1328 1347 1345 1255 1290

correctie voor cuvetvolume en drooggewicht (/lgP I g DW min) T 0·1 0·2 0·3 150·1 22 19 27 179 94 ~ ~ V 1~ 100 91 41 174 101 32 148 169 47 107 30 224 174 109 63 38 321 113 227 74 32 438 80 127 222 32 516 233 29 84 124 636 82 30 120 227 756

Nzp - pH 6 fosfaatconcentraties (/lgPII) 0·2 T 0·1 23 54 17 51 66 45 87 73 51 143 79 51 218 91 48 315 103 42 433 119 39 36 510 125 631 159 33 750 drooggewichten (g) 0·1 0.104

0·2 0.103

0·3 125 128 137 168 193 174 174 162 147

150·1 128 134 122 103 94 88 85 79 73

150·2 147 8 140 137 116 116 110 110 100

150·3 196 199 190 184 165 153 137 125 110 119

500·1 479 446 446 415 390 362 338 350 325 279

500·2 479 498 479 461 427 393 372 365 344 338

500·3 711 711 708 686 649 627 606 590 538 575

2000·1 1922 1848 1768 1709 1651 1571 1478 1469 1426 1481

2000·2 2058 1925 1916 1857 1814 1759 1728 1737 1666 1682

2000·3 1885 1805 1814 1728 1685 1565 1521 1450 1472 1441

0·3 0.100

150·1 0.091

150·2 0.118

150·3 0.106

500·1 0.123

500·2 0.093

500·3 0.122

2000·1 0.137

2000·2 0.157

2000·3 0.188

150·2 100

150.3 148 150 143 139 125 115 104 94 83 90

500·1 313 291 291 270 254 236 220 228 212 182

500·2 411 427 411 395 366 337 319 313 295 290

500·3 466 466 464 450 426 412 398 387 353 377

2000·1 1122 1078 1032 997 963 917 863 857 832 864

2000·2 1049 981 976 946 924 896 880 885 849 857

2000-3 804 770 774 737 719 668 649 619 628 615

correctie voor cuvetvolume en drooggewicht (/lgP I g DW min) T 0·1 0·2 0·3 150·1 23 42 13 100 113 51 51 35 103 118 87 56 40 110 107 143 40 135 91 61 218 155 70 37 83 315 140 79 32 78 433 140 75 91 30 510 69 130 96 28 631 118 64 122 25 750

96 93 79 79 75 75 68

A-27

Nzp - pH 7 fosfaatconcentraties (pgPfl) T 0-1 0-2 22 7 50 16 89 22 13 142 16 10 216 22 13 312 25 10 10 430 29 10 508 19 13 628 19 7471 drooggewichten (g) 0-1 0.144 correctie

0-2 0.155

v~~r cuvetvolume

T 22 50 89 142 216 312 430 508 628 747

0-1 4 9 12 9 12 14 16 11 11

0-3 38 41 38 29 25 19 19 13 16

150-1 126 120 107 94 82 85 79 69 73 47

150-2 151 145 138 126 101 91 76 63 51 107

150-3 148 157 138 132 116 101 110 104 110 211

500-1 471 459 430 374 361 314 292 267 242 164

500-2 487 424 411 383 336 280 236 214 192 135

500-3 468 421 393 346 302 248 207 192 157 1340

2000-1 1880 1833 1616 1645 1563 1510 1453 1397 1340 1629

2000-2 1965 1905 1842 1824 1764 1673 1714 1670 1654 1541

2000-3 1940 1896 1842 1820 1698 1648 1585 1488 1598 226

0-3 0.114

150-1 0.122

150-2 0.119

150-3 0.170

500-1 0.118

500-2 0.133

500-3 0.185

2000-1 0.177

2000-2 0.111

2000-3 0.098

en drooggewicht (pgP f 9 DW min) 0-2 3 7 5 7 5

0-3 27 29 27 20 18 13 13 9 11

150-1 83 78 70 62 54 56 52 46 48

150-2 102 98 93 85 68 62 51 43 34

150-3 70 74 65 62 55 47 52 49 52

500-1 319 311 291 253 245 213 198 181 164 111

500-2 292 255 247 230 202 168 142 128 115 81

500-3 202 182 170 150 130 107 90 83 68

2000-1 851 830 732 745 708 684 658 632 607 738

2000-2 1419 1376 1330 1317 1274 1208 1237 1206 1194 1113

2000-3 1585 1549 1506 1488 1388 1347 1295 1216 1306

0-3 50 53 56 63 66 72 94 94 97

150-1 156 156 153 175 172 222 203 216 219 310

150-2 263 219 200 203 185 178 175 175 178 206

150-3 156 147 150 144 131 128 128 128 131 181

500-1 469 450 400 378 378 353 353 335 335 475

500-2 541 528 500 494 472 444 435 441 441 438

500-3 513 516 519 525 522 497 535 535 516 513

2000-1 1910 1873 1776 1688 1679 1585 1591 1519 1451 1623

2000-2 1951 1901 1766 1745 1738 1713 1663 1623 1666 1510

2000-3 1929 1857 1879 1857 1748 1654 1638 1666 1679 1491

0-3 0.146

150-1 0.118

150-2 0.130

150-3 0.151

500-1 0.112

500-2 0.102

500-3 0.142

2000-1 0.158

2000-2 0.190

2000-3 0.108

150-2 162 135 123 125 114 110 108 108 110 127

150-3 83 78 80 76 70 68 68 68 70 96

500-1 334 321 285 269 269 252 252 238 238 338

500-2 426 417 394 389 372 350 343 348 348 345

500-3 290 291 293 297 295 281 302 302 291 290

2000-1 967 948 899 854 850 802 805 769 734 821

2000-2 820 799 743 733 731 720 699 682 701 635

2000-3 1425 1372 1388 1372 1291 1222 1210 1231 1240 1102

Nzp - pH 8 fosfaatconcentraties (pgPfl) T 0-1 0-2 24 16 47 50 22 53 86 31 50 138 44 60 211 63 60 307 78 66 426 88 78 503 85 81 623 88 94 742 drooggewichten (g) 0-1 0.150

0-2 0.115

correctie voor cuvetvolume en drooggewicht (pgP f 9 DW min) T 0-1 0-2 0-3 150-1 24 106 33 8 28 50 29 37 12 106 86 31 17 35 104 138 34 119 42 23 117 211 34 36 42 307 151 42 46 40 426 138 47 55 52 45 503 147 52 57 623 47 149 66 53 742 210

A-28

Nzp - pH 9 fosfaatconcentraties (pgPII) T 0·1 0·2

22 51 90 136 208 305 424 500 620 739

21 31 43 65 77 90 102 124

189 171 143

500·1 503 500 488 494 485 479 475 463 441 348

500·2 482 460 472 472 460 444 435 444 426 429

500·3 510 497 522 535 528 541 500 528 507 538

2000·1 1888 1844 1807 1801 1760 1720 1633 1673 1602 1427

2000·2 1829 1779 1720 1698 1602 1577 1490 1514 1440 1589

2000·3 1916 1847 1785 1776 1714 1695 1595 1598 1490 1676

150·2 0.093

150·3 0.130

500·1 0.109

500·2 0.178

500·3 0.115

2000·1 0.125

2000·2 0.175

2000·3 0.214

150·2 166 174 174 185 185 183 172 180 166 164

150·3 98 105 105 103 103 107

500·1 370 367 358 363 356 351 349 340 324 255

500·2 217 207 213 213 207 200 196 200 192 193

500·3 353 345 362 371 366 375 347 366 351 373

2000·1 1211 1183 1159 1155 1129 1103 1047 1073 1027 916

2000·2 837 815 788 778 733 722 682 694 659 728

2000·3 717 692 669 665 642 635 597 599 558 628

12 28 152 46 59 71 84 87 105

0·3 21 46 65 80 90 102 112 118 124

150·1 164 186 196 214 233 258 283 289 298 224

150·2 192 202 202 214 214 211 199 208 192 189

150·3 158 171 171 168 168 174

0·2 0.073

0·3 0.163

150·1 0.163

drooggewichten (g)

0·1 0.099

correctie voor cuvetvotume en drooggewicht (pgP I g DW min) 0·3 150·1 T 0·1 0·2

22 51 90 136 208 305 424 500 620 739

17 25 35 52 62 72 82 100

13 30 51 64 78 92 95 115

10 23 32 39 44 50 55 58 61

81 91 96 105 114 126 138 141 146 109

117 105 88

Aile opnamesnelheden samengevat (effiuxwaarde eraf getrokken) Nzp

pHS IpH5 repl1 repl2 repl3 repl1 0 ·0.135 0.02219 0.1178053 0.0623 150 0.01104 ·0.186 0.1894873 0.3933 500 0.13853 0.27757 0.0709273 0.4866 2000 0.72124 0.44377 1.5779473 1.2331

repl2 ·0.0245 0.26693 0.43493 0.90273

repl3 ·0.1929 0.22766 0.31616 0.59546

IpH7 repl1 -0.0148 0.16806 0.54896 0.98986

repl2 0.03248 0.17376 0.49696 0.87496

repl3 0.08082 0.13098 0.47013 0.86053

H8 repl1 ·0.0586 0.11129 0.66789 1.09349

repl2 0.07153 0.71892 0.45512 0.92132

IpH9 repl2 repl3 repl3 repl1 ·0.031 0 0.15781 0.0131 0.25216 0.0706 0.13005 0.20788 0.14387 0.33193 0.32348 0.15889 0.54609 0.6734 0.80915 0.6203

Tabel AA.12 Factorladingen bij de biplot voor Elodea uit het Chara-Elodea experiment (figuren 4.15 en 4.16a) Factor 1 dag opnamesnelheid

C:P C:N N:P biomassa concentratie

-0.79 -0.61 -0.66 0.66 -0.85 0.68 -0.15

Factor 2 0.51 -0.56 -0.61 -0.66 -0.36 -0.39 -0.34

A-29

Tabe/ A.4.13 Factorladingen bij de biplot voor Chara uit het Chara-Elodea experiment (figuur 4.16b)

dag concentratie opnamesnelheid C:P C:N N:P biomassa

Factor 1 0.50 0.41

Factor 2

-0.73

0.76

0.05 0.09

0.43

0.86

-0.76

0.41

0.62 -0.51

0.70 0.41

Figuur A.4.3 Verloop van de koolstofgehaltes en de C:P en C:N verhoudingen van het plantenmateriaal van het Chara-Elodea experiment. Voor de grafieken van de C:P verhouding gelden dezelfde legendes dan voor de andere. koolstofgehalte Chara

koolstofgehalte Elodea

50.0

-Ci+ -Ci-

~~47.5

50.0

;:

a S

45.0

U42,5~

U 42.5

~

40.0

~

a S

I

-Ei+ -Ei-

~'- 47.5

45.0

40.0

~ ....~~~:=-----0::::::-----

E 37.5

E 37,S 35.0+--,---,-.,.--,---,-,--,--,---, o 8 12 16 20 24 28 32 36

35.0+--.---,-,--,--,--,--.--,---, o 5 10 15 20 25 30 35 40 45

incubatietijd (dagen)

incubatielijd (dagen)

C:Pverhouding Chara

C:P verhouding Elodea

1200

,2

1200

§

11XXJ

"§ Cl..

.-- ",

(.)

~ '0;

Em

E

400-

0

n;

11XXJ

~ Cl..

-:-----~-.

Em

Em

(.)

,.

200-

~

600

E

400

'0; 0

n;

0

0 0

4

8

12

16

20

24

28

32

36

0

incubatietijd (dagen)

incubatietijd (dagen)

C:N verhouding Chara

.,

60

~

50

Z

ii

.~

.,§

A-30

70

.S!

-----.:.-.------ - :"-~--z-----~

200

C:N verhouding Elodea -Ci+ -Ci-

70

-Ei+ -Ei-

60 50

::~

40

30

20

20

10

10

O+--,--.-r-.--,--,--o--r-. o 8 12 16 20 24 28 32 36

0+--.--.-.,.--,--,--,--.--,---, o 5 10 15 20 25 30 35 40 45

incubatietijd (dagen)

incubatietijd (dagen)

Tabel AA.14 Parameters van de hyperbolen gefit door de gegevens uit figuur 4.20

Gefitte hyperbolen waren van het type y = a . x / (b + x)

verzadigingsexperiment Chara Elodea

a 1.005 1.860 0.6744

b -0.01596 -0.01916 -0.07233

Tabel AA.15 Factorladingen bij de biplot voor Chara uit het Chara-Elodea experiment (figuur 4.22)

dag opnamesnelheid

C:P C:N N:P biomassa

Factor 1 0.06 -0.95 -0.98 0.34 -0.99 -0.12

Factor 2 0.95 0.14 -0.14 -0.62 -0.04 -0.88

A-31