Dynamics and Organization of Chromosomes in the Cell Cycle and during Differentiation under Normal and Pathological Condition Projekt excelence 302/12/G157 Workshop č. 1
Collaboration in the Frame of the Project of Excellence (Discussion at the Workshop in Brno)
29. -30. března 2012
Hotel Continental, Brno
Workpackage 1 (Lead Scientist: I. Raška) Large-scale chromatin arrangement: Morphological description of euchromatin Za pomoci moderních metod světelné a elektronové mikroskopie přispět k charakterizací metabolicky aktivních míst v buněčném jádře. Spolupráce: E. Bártová, V. Rotrekl – využití hESC pro mikroskopické pozorování, P. Matula – zpracování obrazu, statistické vyhodnocování. Zahraniční partneři: C. Cardoso (Darmstadt) – buněčné linie obsahující rekombinantní replikační a transkripční faktory, světelná mikroskopie.
Workpackage 2 (Lead Scientist: J. Bednar) Mechanism of the relocation of nucleosomes Remodelace chromatinu na úrovni nukleozomů. Bude využita analýza tenkých hydratovaných preparátů kryo elektronovou mikroskopií. Spolupráce v rámci Centra je na diskusi. Zahraniční partneři: skupina S. Dimitrova (Grenoble).
Workpackage 3 (Lead Scientist: D. Cmarko) 3D nuclear organization and 3D tracking of Polycomb group protein (PcG) foci Charakterizace chromatinu asociovaného s PcG proteiny. Využití korelační světelné a elektronové mikroskopie. Spolupráce: E. Bártová – 3D analýzy světelněmikroskopického obrazu, experimenty se specifickými buněčnými inhibitory, skupina M. Kozubka – obrazová analýza.
Workpackage 4 (Lead Scientists: E. Smirnov) Time course of rRNA processing Determinace vzájemného vztahu transkripce a replikace ribozomálních genů v průběhu S fáze buněčného cyklu. Využití světelné a elektronové mikroskopie, RT PCR. Spolupráce: E. Bártová – chromatinové imunoprecipitace, skupina M. Kozubka – obrazová analýza.
1
Workpackage 5 (Lead Scientist: I. Koutná) The role of chromatin condensation and contiguity of RNAPII in the regulation of gene expression. No Task for 2012
Workpackage 6 (Lead Scientist: I. Koutná) The expansion and differentiation potential of HSCs populations derived from hESCs Společný projekt s pracovní skupinou dr. Rotrekla z LFMU a Dr.Bártové. z Biofyzikálního ústavu AV ČR, Mezinárodní spolupráce se Stem Cell Institute University of Minnesota Home, prof. Kaufman Lab Hematopoetické kmenové buňky (HSC) se dnes využívají pro transplantace a buněčné terapie, léčbě krevních poruch, AIDS a imunoterapiím. Konvenční zdroje jako kostní dřeň, mobilizovaná periferní krev či pupečníková krev jsou limitovány množstvím, nízkým obsahem HSC a kompatibilitou (182 HSC/100.000 MNC z pupečníkové krve, 249 HSC/100.000 MNC z mobilizované periferní krve) Potenciál ESC a iPS je v neomezené proliferační kapacitě a schopností diferencovat do HSC in vitro. V rámci tohoto podprojektu je nutno optimalizovat postup na zisk dostatečného počtu buněk (237 HSC/100.000 hESC) nutných pro klinické využití. Před klinickým využitím nutno prokázat, že jsou srovnatelné s konvenčními HSC - schopnost dlouhodobé obnovy hematopoézy (in vivo funkčnost) - bezpečnost: riziko vzniku teratomů, hematologických malignit (spolupráce s dr. Rotreklem) - genom a epigenom: získané HSC fenotypově shodné s konvenčními HSC na úrovni genomu a epigenomu (spolupráce s dr. Bártovou) Příprava iPS z adultních somatických buněk (spolupráce s Kaufman Lab) V rámci tohoto projektu bude taktéž řešena specifická spolupráce s dr. Cmarkem (Ústav buněčné biologie a patologie 1. LF UK ) na řešení problematiky ultrajemné struktury získaných HSC pomocí elektronové mikroskopie. Expertíza v oblasti primárních kultur krevních buněk bude poskytnuta pro spolupráci s dr. Falkem a ing. Lukášovou resp. prof. Michalovou.
CBIA FI MU Prof. Kozubek Biology group Informatics I. K. Koutná P. Matula Biofyzikální ústav AV ČR E. Lukášová, M. Falk Biofyzikální ústav E. Bártová
Biologický ústav LF MU Brno V. Rotrekl
Ústav buněčné biologie a patologie 1. LF UK D. Cmarko
Stem Cell Institute University of Minnesota Home prof. Kaufman Lab
2
Workpackage 7 (Lead Scientist: C. Lanctôt) 3D chromatin positioning in human embryonic stem cells: impact on differentiation and genome stability Goal of WP7 The goal of the project is to study higher-order chromatin structure in embryonic stem cells, with the aim of identifying spatial chromatin patterns that are associated with either the stem cell phenotype, long term culture or a given differentiation state. Collaborators Dr. Eva Bartová [epigenetics], Dr. Guy Hagen [high-resolution microscopy], Prof. Petr Dvořák [human embryonic stem cells] Methodology We will perform 3D FISH on embryonic stem cells using probes corresponding to the transcriptomes of cells differentiated along 3 distinct lineage, i.e. muscle, blood, neurons. These probes will be synthesized by reverse transcription of mRNA. This will allow us to determine if and how the various gene expression programs that unfold during differentiation are organized in 3D in the nuclei of stem cells. We will also perform co-labeling for selected histone marks in order to link the spatial position of chromatin segments and their structure. These analyses will be performed using the STORM variant of single-molecule superresolution microscopy. Main points of discussion during the workshop 1. CELLS. It was recommended to perform experiments on at least 2 different lines of human embryonic stem cells. These lines are known to be highly heterogeneous and the use of 2 lines will allow us to distinguish between cell type-specific (desired) and line-specific patterns (undesired). In addition, the logistics of fixing cell lines in Brno and processing them in Prague was discussed. 2. STARTING MATERIAL. The possibility of deriving probes from tissue mRNA (instead of starting from differentiated embryonic stem cells) was discussed. This was judged to be a good idea, especially in the case of the “differentiated blood” sample, which is notoriously difficult to obtain from human embryonic stem cells. 3. PROBE DESIGN. It was suggested to limit the probe complexity by focusing on genes expressed from a given chromosome. This possibility will be explored. 4. HIGH-RESOLUTION MICROSCOPY. Imaging of nuclear substructures at highresolution remains a challenge due to depth of sample. Solutions will have to be devised. 5. PATTERN RECOGNITION. The issue of computational analysis of FISH signals and pattern recognition was discussed. The expertise of the CBIA would be welcome. It was therefore suggested that the CBIA should be added as a collaborator to this project.
3
WORKPACKAGE 7 – CHROMATIN PATTERNS IN hES CELLS Planned collaboration Eventual collaboration
2012 Lanctôt, ÚBBP Probe synthesis from differentiated tissues muscle - neurons - [blood ?] Dvorák, MU 3D FISH
Human Embryonic Stem Cell (hESC) undifferentiated
Bartová, BFU Immunostaining for histone modifications Hagen, ÚBBP Super-resolution imaging
M. Kozubek, CBIA Image analysis, pattern recognition
4
Workpackage 8 (Lead Scientist: Eva Bártová) Epigenetics of human and mouse embryonic stem cells. Workpackage 9 (Lead Scientist: Eva Bártová) DNA repair in embryonic stem cells V rámci centra excellence P302/12/G157 hodláme spolupracovat se skupinou Doc. Dušana Cmarka (1.LF, UK v Praze), prof. Petra Dvořáka (LF MU v Brně) a dr. Pavla Matuly (FI MU v Brně). Zaměříme se na studium trajektorie Cajalových tělísek u pluripotentních a diferencovaných ES buněk. Tak zvanou „single particle tracking“ analýzou se bude zabývat dr. Pavel Matula a jeho tým. Skupina dr. Evy Bártové a prof. Petra Dvořáka zajistí kultivace lidských a myších ES buněk a dále analýzu živých buněk pomocí konfokálního mikroskopu. Dr. Lenka Stixová bude navíc studovat difúzi coilinu pomocí FRAP techniky. Morfologie Cajalových tělísek bude studována pomocí transmisní elektronové mikroskopie (EM) na LF UK v Praze. Dále budeme testovat funkční význam laminů typu A ve vztahu k trajektorii Cajalových tělísek. U myších ES buněk se dále zaměříme na studium epigenetických změn typu acetylací a metylací histonů. Změny v post-translačních modifikacích histonů během diferenciace ES buněk budeme studovat pro lokusy Oct4 a Nanog. Tuto práci bude realizovat Mgr. Soňa Legatová a Mgr. Veronika Foltánková. V rámci diplomových pracích se budeme zabývat kinetikou heterochromatinového proteinu HP1 v oblastech DNA lezí, indukovaných UV zářením. Touto problematikou se bude zabývat Bc. Petra Sehnalová a Bc. Jana Suchánková.
5
Workpackage 10 (Lead Scientist: P. Dvořák) The role of FGF2 induced changes in basal metabolism on genome stability of hESC and iPSC and the APE1 mediated changes of hESC and iPSC in long term culture Společný projekt s pracovní skupinou Dr. Ireny Koutné (CBIA), Dr. Evy Bártové (DMC) a Christianem Lanctotem a Dušanem Markem (ICBP) hESC a iPSC jsou, díky jejich diferenciačnímu a sebeobnovovacímu potenciálu využívány jako biologický model, současně by se však mohli v blízké budoucnosti stát nenahraditelným nástrojem regenerativní medicíny. S tím je však spojena potřeba dlouhodobé kultivace in vitro. Zde však vstupuje do hry adaptace hESC i iPSC na kultivační podmínky in vitro. Adaptace je spojena s nestabilitou genomu a metabolickými změnami. Proto budou v rámci toho projektu studovány mechanizmy adaptace na kultivační podmínky z hlediska genomové stability, metabolických změn a signálování FGF2. Součástí projektu bude zavedení robustní metody testování stability genomu na základě frekvence mutací. Tento nástroj umožní porovnávat nejen geonomovou stabilitu a její vliv na finální diferencované buňky u hESC. Ale i u iPSC a diferencovaných hematopoetických prekurzorů. IPSC a hESC linie odvozené v naší laboratoři budou použity k optimalizaci postupu derivace hematopoetických kmenových buněk (skupina Dr. Ireny koutné). Expertíza a buněčné linie, které jsou k dispozici na našem pracovišti budou poskytnuty ke studiu epigenetických změn spojených se stavem pluripotence a adaptace na dlouhodobou kultivaci ve spolupráci s Dr. Evou Bártovou. S využitím našich linií hESC, kultivovaných in vitro po různě dlouhou dobu, bude v rámci projektu řešena struktura chromatinu a jádra hESC za použití elektronové mikroskopie ve spolupráci s dr. Cmarkem a prostorová organizace genů ve spolupráci s Dr.Lanctotem v souvislosti se stavem pluripotence a adaptace na dlouhodobou kultivaci. Biologický ústav LF MU Prof. Petr Dvořák Podpůrné skupiny Genomová stabilita Metabolismus Diferenciace Mikroskopie Vladimír Rotrekl Albano Meli Miroslav Vařecha Yuch-Man Wadeley
CBIA FI MU Irena Koutná
Ústav buněčné biologie a patologie 1.LF UK Dušan Cmarko
Biofyzikální ústav Eva Bártová
Ústav buněčné biologie a patologie 1.LF UK Christian Lanctot 6
Hematopoetická diferenciace iPS a embryonálních kmenových buněk (ESC) (workpackage 10) Společný projekt s pracovní skupinou dr. Rotrekla z LFMU a Dr.Bártové. z Biofyzikálního ústavu AV ČR Mezinárodní spolupráce se Stem Cell Institute University of Minnesota Home, prof. Kaufman Lab Hematopoetické kmenové buňky (HSC) se dnes využívají pro transplantace a buněčné terapie, léčbě krevních poruch, AIDS a imunoterapiím. Konvenční zdroje jako kostní dřeň, mobilizovaná periferní krev či pupečníková krev jsou limitovány množstvím, nízkým obsahem HSC a kompatibilitou (182 HSC/100.000 MNC z pupečníkové krve, 249 HSC/100.000 MNC z mobilizované periferní krve) Potenciál ESC a iPS je v neomezené proliferační kapacitě a schopností diferencovat do HSC in vitro. V rámci tohoto podprojektu je nutno optimalizovat postup na zisk dostatečného počtu buněk (237 HSC/100.000 hESC) nutných pro klinické využití. Před klinickým využitím nutno prokázat, že jsou srovnatelné s konvenčními HSC - schopnost dlouhodobé obnovy hematopoézy (in vivo funkčnost) - bezpečnost: riziko vzniku teratomů, hematologických malignit (spolupráce s dr. Rotreklem) - genom a epigenom: získané HSC fenotypově shodné s konvenčními HSC na úrovni genomu a epigenomu (spolupráce s dr. Bártovou) Příprava iPS z adultních somatických buněk (spolupráce s Kaufman Lab) V rámci tohoto projektu bude taktéž řešena specifická spolupráce s dr. Cmarkem (Ústav buněčné biologie a patologie 1. LF UK ) na řešení problematiky ultrajemné struktury získaných HSC pomocí elektronové mikroskopie. Expertíza v oblasti primárních kultur krevních buněk bude poskytnuta pro spolupráci s dr. Falkem a ing. Lukášovou resp. prof. Michalovou.
CBIA FI MU Prof. Kozubek Biology group Informatics I. K. Koutná P. Matula Biofyzikální ústav AV ČR E. Lukášová, M. Falk Biofyzikální ústav E. Bártová Biologický ústav LF MU Brno V. Rotrekl
Ústav buněčné biologie a patologie 1. LF UK D. Cmarko
Stem Cell Institute University of Minnesota Home prof. Kaufman Lab
7
Workpackage 11 (Lead Scientist: Z. Zemanová) Instability of the genome of leukemic cells: complex chromosomal rearrangements and their implication in disease pathogenesis and progression Chromosom č. 5 je nejčastěji postižen v buňkách kostní dřeně u myeloidních malignit (myelodysplastický syndrom-MDS a akutní myeloidní leukémie –AML) primárních a zvláště sekundárních. Po intersticiální deleci dlouhých ramen je zbytek deletovaného chromosomu 5 často translokován případně insertován do některých dalších autosomů. Je tím potvrzena jeho velká nestabilita, která vede k dalším změnám v genomu a tím ke vzniku komplexních karyotypů. Nález komplexního karyotypu při diagnose svědčí o progresi onemocnění a pro pacienta znamená nepříznivou prognózu a špatnou odezvu na léčbu. Primární událostí, která má přímý vztah ke vzniku onemocnění je na chromosomové úrovni intersticiální dalece dlouhých ramen č. 5, která má u různých pacientů různý rozsah. Na základě rozsáhlých studií byly definovány dvě společné deletované oblasti (CDR). Proximální CDR v oblasti 5q31.2 je charakteristická pro nemocné s MDS, AML a sekundárními formami těchto onemocnění, distální CDR v oblasti 5q32-q33 byla prokázána u nemocných s 5q- syndromem. V současné době jsou obě oblasti předmětem intenzivního výzkumu s cílem lokalizace nádorových supresorových genů a určení významu haploinsuficience přítomných genů. V první fázi našeho společného projektu se budeme zabývat lokalizací CDR 5q v interfázním jádře krevní buňky a jeho aktivitou při dělení buněk. Technické podrobnosti sledování v konfokálním mikroskopu uvede skupina dr. Falka. Za vhodné buňky pro tyto experimenty považujeme separované CD34 z kostní dřeně. Separace provádí dr. Koutná dohodne se s ní dr. Falk. DNA sondy zajistí skupina prof. Michalové. První kroky již byly zahájeny. Zjistili jsme rovněž na velké skupině nemocných, že v jejich buňkách kostní dřeně při vzniku komplexních karyotypů nejsou nikdy postižena delecí nebo amplifikací krátká ramena chromosomu 10. Proto jsme se dohodli, že lokalizaci a distribuci v jádře v interfázi rovněž prověříme všemi výše uvedenými technikami. Sondy DNA získáme spoluprací s VÚVeL v Brně s oddělením prof. Rubeše. V tomto oddělení připravují laserovou mikrodisekcí sondy pro FISH.
8
Workpackage 12 (Lead Scientist E. Lukášová) The role of chromatin structure in the genesis of complex chromosome rearrangements U pacientů s myeloidními malignitami (myelodysplastický syndrom a akutní myeloidní leukémie) byly opakovaně detekovány komplexní chromosomální aberace spojené s velmi špatnou prognózou (Prof. K. Michalová, Centrum nádorové cytogenetiky VFN a 1.LF UK, Praha). Zároveň byly definovány některé chromosomální oblasti, které se na chromatinových výměnách nebo dalších aberacích podílejí s výraznější četností. Jedná se zejména o chromosom 5 (5p13, 5q12, 5q13, 5q14) a dále např. 7q21, 7q31, 11q23, 12p13, 17p11.2 a 21q22. (Michalova et al.). Na druhou stranu, při vzniku komplexních aberací nebyla nikdy zahrnuta krátká ramena chromosomu 10. Zaměříme se proto na studium mechanismu vzniku těchto translokací, zejména souvislostí mezi jejich tvorbou a lokalizací postižených lokusů v buněčném jádře. Pokusíme se zjistit, zda k tvorbě komplexních chromosomálních translokace přispívá zejména struktura chromatinu na nižších úrovních (fragilní místa, mikrohomologie, apod.), struktura chromatinu vyššího řádu (vzájemná jaderná lokalizace breakpoint lokusů, jejich lokalizace v heterochromatinu, euchromatinu apod.) nebo pohyb postižených lokusů (tzv „Breakage First Hypothesis“ vs „Position First Hypothesis“). Výzkumnou činnost lze shrnout do následujících bodů: 1. Jaderná a vzájemná lokalizace breakpoint lokusů Nejprve proto budeme pomocí metody 3D-FISH v kombinaci s konfokální mikroskopií studovat distribuci výše uvedených lokusů v interfázním buněčném jádře (např. u lymfocytů z periferní krve, buněk kostní dřeně apod.). Zjistíme, zda se tyto lokusy nacházejí na podobných koncentrických jaderných slupkách a ve vzájemné blízkosti (Fig.1), a mají tedy vyšší pravděpodobnost vzájemných interakcí. Uvidíme také, zda se chromosomální oblasti s vysokou frekvencí zlomů nacházejí spíše ve středu jádra, nebo u jeho periferie (A), zda interagují s heterochromatinem, jadernou matrix apod. a budeme hledat důvod těchto skutečností. Z těchto experimentů vyplyne, zda jaderná topologie chromatinu (statisticky nenáhodná) může přispět k vysvětlení vyšší frekvence translokací mezi zmíněnými lokusy, nebo zda je tato dána pouze strukturou chromatinu na nižších úrovních (fragilita chromatinu, mikrohomologie apod.). Je například zajímavé, proč některé chromosomy (X, Y) participují pouze zřídka na chromosomálních translokacích, zatímco jiné (5, 7, 11, viz výše) s nezanedbatelnou frekvencí. A budou se výsledky výše uvedených experimentů lišit pro fáze buněčného cyklu, různá vývojová stádia či typy buněk?
Fig.1.
9
2. Pozice breakpoint lokusů vůči mateřskému chromosomálnímu teritoriu (Fig.2) Budeme studovat pozice uvedených (a případně dalších) lokusů ve vztahu k jejich mateřskému chromosomálnímu teritoriu (zda se vyskytují preferenčně na povrchu chromosomálních teritorií nebo v jejich nitru) Určíme vzájemný "překryv" (intermingling, Branco and Pombo, 2006) teritorií participujících na translokacích. Uvidíme, zda tento překryv zahrnuje i sféru zjištěné průměrné lokalizace často translokovaných lokusů. Pokusíme se tak rozluštit, zda může docházet ke komplexním translokacím pouze na základě jejich jaderné pozice, nebo zda je vyžadován nějaký pohyb chromatinu.
2D-řez
ChT Break-point region
Break-point region 2
ChT2 Oblast prolínání (intermingling) Fig.2.
3. Modelování struktury HSA5, HSA7 a dalších chromosomů často se podílejících na komplexních aberacích Pomocí determinace vzájemných pozic frekventovaných breakpointů na chromosomech 5 a 7 se pokusíme o "modelování" vnitřní struktury teritorií těchto chromosomů v interfázním buněčném jádře. Chromosomy 5 a 7 jsou často zahrnuty v chromosomálních aberacích, přičemž velmi časté jsou intersticiální delece části jejich ramének q. Vysvětlení tohoto fenoménu by mohlo spočívat právě ve vhodné (statisticky nenáhodné) vyšší struktuře chromatinu.
10
4. Mechanismy reparace DSB a tvorby chromosomálních translokací - analýza ohnisek gH2AX (Fig.3) V souvislosti s výše uvedenými otázkami se zaměříme i na analýzu ohnisek gH2AX (markerů DSB) a chromosomálních translokací v buňkách ozářených různými druhy ionizujícího záření. Zejména se pokusíme určit, zda komplexní translokace vznikají následkem komplexity indukovaných DSB, nebo zda k nim dochází i díky dalším mechanismům účinkujícím v reparaci těchto lézí (např. dekondenzace chromatinu apod.). Zároveň budeme studovat vztah mezi výskytem interchromosomálních a intrachromosomálních aberací a kvalitou ionizujícího záření, použitého k jejich indukci. Zaměříme se též na podstatu "pozdních" ohnisek gH2AX a jejich vztah k chromosomálním translokacím, jak již bylo popsáno výše.
Fig.3.
5. Lokalizace breakpoint lokusů vůči RIDGE a antiRIDGE klastrům, exprese přilehlých genů Sledovat budeme také lokalizaci frekventovaných zlomů ve vztahu ke klastrům vysoce (RIDGE, Regions of Increased Gene Expression) a minimálně (antiRIDGE) exprimovaných genů. U frekventovaných zlomů s přesně známou lokalizací na DNA zjistíme, zda jsou geny v jejich okolí (u normálních buněk) silně exprimovány nebo naopak utlumeny. V případě, že by byly dostupné i buňky od pacientů s danou translokací, bude totéž provedeno i zde. Zajímavým zjištěním vyplývajícím z prací Prof. K. Michalové je také nízká frekvence (5-10%) participace lokusu 11q23 na chromosomálních translokacích u nově diagnostikovaných pacientů, zatímco u sekundárně vyvolané AML (patrně léčbou pomocí inhibitorů topoisomerasy II) tato hodnota činí 35%. Jak tedy inhibitory topoisomerasy II zvyšují tuto četnost? Mnoho dalších otázek jistě vyplyne ze vzájemné diskuse...
Schéma vzájemné spolupráce červené šipky – spolupráce s laboratořemi zahrnutými v Centru, modré šipky – spolupráce mimo Centrum
11
Centrum nádorové cytogenetiky VFN a 1.LF UK, Praha K Michalová
IHOK FN Brno A Oltová • Analýza chromosomálních translokací
Université Paris Sud (Francie) S Lacombe • Příprava nanočástic, radiosenzitizace nádorových buněk pomocí indukce Auger efektu
• Získávání vzorků • Analýza chromosomálních translokací BFU AVČR • Lokalizace míst zlomů M Falk et al. • Identifikace přilehlých • Prostorová lokalizace breakpoint lokusů v genů buněčném jádře VÚVeL • Modelování struktury chromosomů s ohledem na J. Rubeš breakpoint lokusy • Příprava DNA sond • Analýza ohnisek gH2AX a reparace DSB (mikrodisekce) • Kvantifikace exprese genů v okolí breakpoint lokusů a jejich lokalizace vůči různým jaderným strukturám FI Brno (HP1 domény, centrum/periferie jádra atd.)
M Kozubek Pa Matula Pe Matula • Vývoj potřebného software • Analýza obrazu a dat
FI Brno I Koutná • Kultivace krevních buněk • Separace krevních buněk
Evropský onkologický institut, Milano, Itálie (IG Dellino) • Mechanismus patogeneze akutní promyelocytární leukémie
Ústav jaderné fyziky AVČR Praha M Davídková
COST NanoIBCT (EU Network)
• Vývoj ozařování biologických vzorků urychlenými • Ozařování urychlenými ionty
JINR Dubna u Moskvy (Rusko) EA Krasavin • Vývoj ozařování biologických vzorků urychlenými • Ozařování urychlenými ionty
Workpackage 13 (Lead Scientist: E. Lukášová) The role of heterochromatin in the decision of carcinoma cells to enter senescence, survive or die by apoptosis during fractionated irradiation Plán práce na r. 2012 1) Objasnění některých problémů, které se vyskytly v počátečních experimentech při studiu vlivu replikačního stresu (RS) na smrt buněk nonhodgkinského lymfomu ( NHL) SU-DHL-4 s dominantně negativní mutací v p53. a) Buňky, které byly vystaveny RS při zablokování Chk1 kinázy umřely ve dvou fázích. Část buněk umřela již po 24 h působení RS, přeživší buňky se dělily po dobu dalších 24 h působení RS a pokračovaly v růstu po převedení do čistého media. 48 h po odstranění RS buňky náhle zastavily růst při vysoké hladině aktivní kaspázy 3. Chceme zjistit jak buňky umíraly, zda byla poškozenou DNA aktivována vnitřní apoptosa, nebo zda RS aktivoval receptory smrti a tím také vnější apoptosu. Tato apoptosa by mohla vést ke smrti části buněk po krátké době působení RS. b) Zjistit, jaký vliv na přežití buněk bude mít snížení koncentrace fludarabinu ve spojení se současnou inhibicí Chk1 a ATM. c) Jaký vliv na indukci γH2AX a apoptosy bude mít zablokování ATR místo Chk1 kinázy. d) Jak RS a inhibice Chk1 kinázy ovlivní vstup buněk do nového buněčného cyklu a positivitu buněk na Annexin V a propidium iodid. e) V mnoha buňkách, které byly vystaveny RS, přetrvávají po převedení do čistého média ohniska γH2AX. Zjistit, zda je v těchto buňkách aktivována kaspasa 3, což by znamenalo, že tyto buňky půjdou do apoptozy. f) Pokusit se najít příčinu vazby 53BP ke kondenzovaným metafázickým chromosomům v buňkách vystavených RS. 53BP se v oblasti DSB váže přímo na H3K20met2, který je v kondenzovaném chromatinu nedostupný. Jak je tedy možné, že je vázán na kondenzovaný chromatin metafázického chromosomu. g) Vystavit RS buňky MCF7 stabilně exprimující H2B-GFP po transfekci 53BP-RFP a zjistit, zda také u tohoto typu buněk bude docházek ke kondenzaci chromosomů s navázaným 53BP a zda tyto buňky projdou mitosou do dalšího cyklu. 2) Vliv RS indukovaný fludarabinem při zablokování Chk1 kinázy budeme sledovat v buňkách NHL- WSU, které mají wt p53 a představují stejný typ linie (DLBCL) jako SUDHL-4. Chtěli bychom zjistit jak bude RS, fosforylace γH2AX a smrt buněk ovlivněna funkčním p53 proteinem. Spolupráce Vliv replikačního stresu na zdravé buňky s vysokým proliferačním indexem, podobným leukemickým buňkám, bychom chtěli studovat u hematopoietických progenitorových buněk CD34 ve spolupráci s biologickou větví Fakulty informatiky v Brně (vedoucí I. Koutná). Kromě toho hodláme dále spolupracovat s Dr. Martinem Trbuškem z Hematoonkologické kliniky Fakultní nemocnice v Brně.
Workpackage 14 (Lead Scientist: G. Hagen) 3D superresolution microscopy of the cell nucleus Fluorescence microscopy has become firmly established as one of the chief tools available for the study of biological systems at the cellular level. Unfortunately, the resolution of optical microscopes in the lateral dimension is limited to 0.61 /NA (~ 250 nm). As many biological structures within cells are much smaller than this, increasing resolution is of prime importance. Recently, a great deal of progress has been made in this area, reviewed in [1]. Single molecule localization microscopy (SMLM) methods are one of the more common approaches for achieving superresolution. They have quickly been adopted as they are relatively easy to implement, and offer multicolor, 3D imaging with resolution in the 20 nm range. SMLM methods work by isolating and imaging single molecules in an extended time series. The idea is to, by photochemical means, convert nearly all the fluorescent molecules in a sample to a temporary dark state. The molecules then return to the fluorescent state both infrequently and randomly, such that they can be imaged individually. The molecules are then localized by fitting the imaged Airy patterns to a suitable model. Typically, the accuracy achieved is about 20 nm, primarily depending on the number of photons collected from each molecule. An example image is shown in Fig. 1.
Figure 1: Example of 3D single molecule localization super-resolution microscopy. Left, conventional image, right, super-resolution image. The sample is an A431 cell expressing mCitrine-erbB3. This receptor tyrosine kinase is overexpressed in or present in mutant forms in breast cancer. The resolution achieved is approximately 20 nm.
Structured illumination microscopy (SIM) usually refers to methods that utilize sinusoidally modulated patterns of light which are imaged on a fluorescent sample. Two main methods are currently in use. The first achieves optical sectioning, and was pioneered by Tony Wilson and co-workers [2, 3].
1
The second application of SIM achieves resolution beyond the Abbe limit. This method allows an improvement of lateral resolution by a factor of 2. Under ideal conditions, this would imply a lateral resolution of about 125 nm. The method involves reconstruction of the high resolution image using Fourier transform approaches. Unlike other high resolution methods (STED, 4Pi), no special equipment is required, apart from the ability to create the illumination patterns. High resolution structured illumination methods are beginning to be used in cell biological studies, including imaging of the nucleus [4].
Figure 2: Example of 3D super-resolution imaging using structured illumination. Left, conventional optically sectioned image, right, SIM image. The sample is a HEPG2 cell labeled with Atto532-phalloiden to visualize Factin. The resolution achieved in this image is approximately 185 nm.
Our workpackage (WP14) proposed two aims. Aim 1 involves improvement of a prototype STORM microscope in our laboratory to include 3D imaging capability. This basic aim is complete and we are now designing microscopes which will improve axial resolution even further. Aim 2 involved design and construction of a 3D structured illumination microscope. Construction of the microscope is underway, and we are able to acquire preliminary data (Fig. 2). During the meeting, I discussed collaborations with other members of the project of excellence. We plan to take advantage of the expertise of our own department in Prague, and also forge new collaborations with the institute of Biophysics in Brno. To begin, we will examine samples prepared by the Bartova group using 3D SIM.
2
Workpackage 15 (Lead Scientist: P. Matula) Image processing in confocal microscopy Během diskuze vyplynuly pro informatickou část CBIA následující úkoly: (1) Analýza trajektorií v obrazech živých buněk. Tato úloha bude řešena ve spolupráci se skupinou Evy Bártové. Mluvilo se o srovnání LMNA++ a LMNA-- buněk. O výhledové potřebě sledovat pohyb se zmínil také Martin Falk. (2) Vyhodnocení pozice lokusů v chromozomových teritoriích se bude řešit ve spolupráci s Martinem Falkem. Naším úkolem bude vyhodnotit zda se lokusy vyskytují blíže okraje teritoria nebo uvnitř. (3) Měření 3D vzdálenosti mezi lokusy ve spolupráci se skupinou Martina Falka. (4) Úprava software Acquiarium, aby více vyhovovalo uživatelům. Martin Falk zmínil potřebu uložit parametry vizualizace obrázků, aby se nemusely stále zadávat znovu. (5) Segmentace teček bude řešena ve spolupráci s Lubomírem Kováčikem. (6) Se stejnou skupinou budou diskutovány možnosti použití software Acquiarium při snímání na jejich mikroskopu s Andor kamerou. (7) Vladimír Rotrekl zmínil potřebu hodnotit maturaci mitochondrií, zejména jejich morfologické vlastnosti, pomocí metod zpracování obrazu. (8) Já jsem uvedl samostatný úkol spočívající ve vyhodnocení segmentačních algoritmů. V prvním roce provedeme studii 3D metod pro detekci bodových objektů.
Workpackage 16 (Lead scientist: J. Bednár) Morphological analysis of nanostructured materials Elektronověmikroskopická a tomografická vizualizace nanostruktur a buněčných struktur. Spolupráce: skupina J. Pavlíka (PřF UJEP, Ústí n.L.), skupina M. Kepczynskyho (Kraków, Polsko), skupina E: Kutejové (MBÚ AVČR). Spolupráce v rámci centra: P. Matula - zpracování 3D stacků, M. Falk – EM charakterizace zlatých nanočástic.
3
