Vliv účinných látek z rostlin na kvasinky kontaminující mléko a mléčné výrobky Diplomová práce

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výţivy rostlin

Vliv účinných látek z rostlin na kvasinky kontaminující mléko a mléčné výrobky Diplomová práce

Vedoucí práce: Ing. Libor Kalhotka, Ph.D.

Vypracoval: Bc. Jan Javorský

Brno 2014

ZADÁNÍ DIPLOMOVÉ PRÁCE

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, ţe jsem diplomovou práci na téma Vliv účinných látek z rostlin na kvasinky kontaminující mléko a mléčné výrobky vypracoval samostatně a pouţil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloţeném seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a můţe být pouţita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.

dne ………………………………………. podpis diplomanta ……………………….

PODĚKOVÁNÍ Rád bych poděkoval Ing. Liboru Kalhotkovi, Ph.D. za odborné vedení, konzultace a ochotu při tvorbě této diplomové práce. Upřímně také děkuji Ing. Lence Dostálové za čas a spolupráci na mé praktické části. Práce vznikla s podporou projektu Komplexní udrţitelné systémy v zemědělství 2012 – 2018 ,,KUS‘‘ – QJ1210302. V neposlední řadě děkuji své rodině za podporu v průběhu celého studia a také mé přítelkyni.

ABSTRAKT Diplomová práce se zabývá vlivem účinných látek z rostlin na vybrané druhy kvasinek. Literární rešerše pojednává o kvasinkách a jejich významu v mlékařství, dále zahrnuje antimikrobiální vliv účinných látek z rostlin. Pro účely experimentálního stanovení byly vybrány tři druhy silic, a to silice meduňková, rozmarýnová a tymiánová. Antimikrobiální účinek silic byl testován na vybrané druhy kvasinek, které byly izolovány z jednotlivých vzorků mlékárenských výrobků. Po identifikaci kvasinek byl antimikrobiální vliv silic testován diskovou difúzní metodou a metodou zřeďování v bujónu. Účinek silic byl testován ve dvou koncentracích, 1 % a 10 %. U diskové difúzní metody se jako nejúčinnější jevila meduňková silice o koncentraci 10 %. Slabší účinek byl prokázán u rozmarýnové silice. U metody zřeďování v bujónu byla zjištěna nejvyšší účinnost u rozmarýnové silice, nejslabší aktivitu vykazovala silice tymiánová. Klíčová slova: Antimikrobiální účinek, rozmarýnová silice, meduňková silice, tymiánová silice, Candida sp., kvasinky.

ABSTRACT

The purpose of this graduation theses is to enlighten the mechanism which influences active substances from plants in specific yeasts types. Literature research focuses on yeasts and their importace in dairy as well as antimicrobial influence of active substances in plants. Three types of essential oils were selected for the purpose of experimental determination; essential oil from melissa, essentiaĺ oil from rosemary and essential oil from thyme. Antimicrobial effect of essential oils was tested on specific yeasts types, isolated from specific dairy products samples. The next step after yeasts identification was testing antimicrobial influence of essential oils using disk diffusion method and broth dilution method. The influence of essential oils was tested in two concentrations, 1 % and 10 %. The best result employing the disk diffusion method was achieved using 10 % concentration essential oil from melissa. Essential oil from rosemary resulted as worse option. The best effect employing the broth dilution method was measured when using the essential oil of rosemary, whereas the essential oil derived from thyme showed the least effect.

Key words: Antimicrobial effect, essential oil from rosemary, essential oil from melissa, essential oil from thyme, Candida sp., yeasts.

OBSAH 1 2

ÚVOD……………………………………………………………………………...9 LITERÁRNÍ PŘEHLED………………………………………………………...10 2.1 Kvasinky……………………………………………………………………..10 2.1.1 Taxonomie kvasinek…………………………………………………….10 2.1.2

Výskyt kvasinek………………………………………………………...10

2.1.3

Cytologie kvasinek……………………………………………………...11

2.1.4

Genetický systém kvasinek……………………………………………..13

2.1.5

Morfologie kvasinek………………………………………………….....13

2.1.6

Chemické sloţení kvasinek……………………………………………..13

2.1.7

Rozmnoţování kvasinek………………………………………………..14

2.1.8 Metabolismus kvasinek…………………………………………………14 2.2 Kvasinky v mlékařství……………………………………………………...15 2.2.1 Charakteristiky nejvýznamnějších kvasinek……………………………15 2.2.1.1

Rod Candida……………………………………………………….15

2.2.1.2

Rod Kluyveromyces………………………………………………..16

2.2.1.3

Rod Yarrowia....................................................................................16

2.2.1.4

Rod Saccharomyces………………………………………………..17

2.2.1.5

Rod Rhodotorula…………………………………………………...18

2.2.1.6

Rod Debaryomyces………………………………………………...18

2.2.1.7

Rod Geotrichum…………………………………………………....19

2.2.2

Mléčné výrobky obsahující kvasinky…………………………………...19

2.2.3

Kefírová kultura…………………………………………………………20

2.2.4

Sýry……………………………………………………………………...22

2.2.4.1

Měkké sýry zrající pod mazem……………………………………..22

2.2.4.2

Sýry s plísní na povrchu……………………………………………23

2.2.4.3

Sýry s plísní v těstě…………………………………………………23

2.2.4.4

Kyselé sýry – tvarohy………………………………………………24

2.2.4.5 Olomoucké tvarůžky……………………………………………….25 2.3 Kvasinky způsobující kaţení mléka a mléčných výrobků………………..25 2.3.1 Mléko……………………………………………………………………26 2.3.1.1 Sladké kondenzované mléko……………………………………….26 2.3.2

Kysané mléčné výrobky………………………………………………...26

2.3.3

Máslo……………………………………………………………………27

2.3.4

Sýry……………………………………………………………………..27

2.3.5

Tvarohy…………………………………………………………………28

2.3.6

Mraţené smetanové krémy a zmrzliny………………………………….28

2.3.7 Jogurt……………………………………………………………………28 2.4 Boj proti neţádoucím kvasinkám…………………………………………..28 2.4.1 Čištění…………………………………………………………………...29 2.4.2

Dezinfekce………………………………………………………………29

2.4.3

Fyzikální prostředky…………………………………………………….29

2.4.4

Chemické prostředky…………………………………………………....30

2.4.5 Opatření v mlékařství…………………………………………………...30 2.5 Účinné látky z rostlin s antimikrobiální aktivitou………………………...31 2.5.1 Silice (éterické oleje)……………………………………………………32

3 4

2.5.1.1

Výskyt silic…………………………………………………………32

2.5.1.2

Složení silic………………………………………………………...32

2.5.1.3

Získávání silic……………………………………………………...33

2.5.1.4

Rozdělení silic podle účinku……………………………………….33

2.5.1.5

Využití silic v potravinářství……………………………………….33

2.5.1.6

Účinek silic na mikroorganismy…………………………………...34

CÍL PRÁCE……………………………………………………………………....35 MATERIÁL A METODIKA…………………………………………………....36 4.1 Charakteristika materiálu………………………………………………….36 4.2

Izolace kvasinek……………………………………………………………..37

4.3

Identifikace kvasinek………………………………………………………..37

4.4

Disková difúzní metoda……………………………………………………..39

4.5 Metoda zřeďování v bujónu………………………………………………..39 5 VÝSLEDKY A DISKUZE……………………………………………………….41 5.1 Identifikace kvasinek………………………………………………………..41 5.2

Disková difúzní metoda……………………………………………………..42

5.3 Metoda zřeďování v bujónu………………………………………………..46 6 ZÁVĚR……………………………………………………………………………55 7 SEZNAM POUŢITÉ LITERATURY…………………………………………..57 8 SEZNAM TABULEK A OBRÁZKŮ…………………………………………...66 8.1 Seznam tabulek……………………………………………………………...66 8.2 Seznam obrázků……………………………………………………………..66 9 PŘÍLOHY…………………………………………………………………………68

1 ÚVOD Kvasinky jsou jednobuněčné mikroorganismy, které zařazujeme mezi houby (Fungi). Pravděpodobně jsou jedním z prvních domestifikovaných organismů. Lidé vyuţívali kvasinky pro kvašení (fermentaci) a pečení jiţ v dávné historii. Zásluhou uţitečných fyziologických vlastností se kvasinky v dnešní době vyuţívají v potravinářství a biotechnologiích. Mnoho druhů kvasinek je vyuţíváno pro výrobu potravin, nachází se však mezi nimi i původci nemocí a kaţení potravin, ale patogenních druhů je pouze několik. Kvasinky jsou jedny z nejpouţívanějších modelových organismů v rámci genetiky a buněčné biologie. Výskyt kvasinek v mléčných výrobcích je přisuzován pro ně nepříliš náročným ţivotním podmínkám. Mohou být vyuţity; jak při výrobě vybraných fermentovaných výrobků, zvláště kefírové kultury a některé druhy při zrání sýrů, tak mohou působit i jako kontaminanty, kdy vyvolávají především senzorické znehodnocení. Antimikrobiální vliv účinných látek z rostlin je vyuţíván jiţ celá staletí, jejich výzkum ale započal aţ v osmdesátých letech devatenáctého století. Hlavní antimikrobiální sloţkou rostlin jsou silice (éterické oleje). Silice jsou obsaţeny nejen v květech a plodech, ale i v listech, kůře a kořenech. Vyuţívají se ve farmaceutickém, potravinářském a kosmetickém průmyslu. V potravinářském průmyslu jsou silice nejvíce vyuţívány jako aromata. Pouţití silici jako inhibitoru mikrobiálního růstu v potravinách je však často omezeno z důvodu změn organoleptických vlastností a texturních kvalit potravin nebo kvůli interakci silic se sloţkami potravin. Účinek silic můţe být také expektorační, kdy podporují v dýchacím ústrojí sekreci hlenů; karminativní, coţ se vyuţívá proti nadměrné plynatosti střev; diuretický, vyvolávající mírnou močopudnost; sedativní, kdy dochází k útlumu psychomotické činnosti. Některé silice však můţou mít i neţádoucí účinek, kdy některé jejich sloţky mohou působit dráţdivě na pokoţku nebo na sliznice (hlavně při vyšších koncentracích) nebo jako alergeny. Mohou obsahovat i jedovaté látky, např. thujon.

9

2 LITERÁRNÍ PŘEHLED

2.1 Kvasinky Kvasinky jsou heterotrofní eukaryotické organismy, které jsou řazeny mezi houby (Fungi), netvoří však jednotnou taxonomickou skupinu. Jejich český název je odvozen od schopnosti zkvašovat monosacharidy, popř. i některé disacharidy, za tvorby etanolu a oxidu uhličitého. (Buňková, Doleţalová, 2010) Velká většina druhů kvasinek náleţí mezi tzv. bílé kvasinky tvořící na kultivačních mykologických půdách bělavě zbarvené kolonie. Dále se v přírodě rovněţ vyskytují kvasinky červené, např. rod Rhodotorula, jejichţ kolonie jsou zbarveny růţově aţ červeně karotenoidními barvivy. Nakonec se rozlišují ještě tzv. černé kvasinky s koloniemi tmavými aţ černými jako je rod Aureobasidium. (Klaban, 2001) V potravinářské technologii mají kvasinky dvojí význam, jako technologicky vyuţívané mikroorganismy ve fermentačním průmyslu při výrobě piva, vína, lihu, kvasnic; v potravinářském průmyslu při výrobě pekařských produktů, ale i jako mikroorganismy kazící maso, ryby, drůbeţ, výrobky studené kuchyně, mléčné produkty, fermentované poţivatiny, výrobky s vysokým obsahem cukru apod. (Görner, Valík, 2004)

2.1.1 Taxonomie kvasinek Kvasinky jsou tradičně povaţovány za jednobuněčné houby. Lze je rozdělit do dvou hlavních tříd, Ascomycety a Basidiomycety. Nicméně existuje velké mnoţství druhů, jejichţ dokonalý stav není znám. (Deák, 2008) Rody, u nichţ není známa tvorba pohlavních spor, jsou zařazovány mezi Deuteromycety. (Šilhánková, 2002) 2.1.2 Výskyt kvasinek Kvasinky a kvasinkovité organismy jsou v přírodě velmi rozšířeny. Protoţe mají většinou pouze sacharolytické schopnosti, vyskytují se především na materiálech obsahujících cukry, tj. na ovoci, zvláště bobulovém a peckovém (hrozny, švestky apod.), a na cukernatých potravinách. Dále jsou v květních nektarech, výronech stromů, v půdě, ve vzduchu, ve střevním traktu lidí, zvířat a některého hmyzu (např. včel).

10

Šíří se různými přenašeči, hlavně hmyzem, větrem apod. Ve vzduchu je nejvíce kvasinek v době květu stromů a v době zrání švestek a hroznů. (Šilhánková, 2002)

2.1.3 Cytologie kvasinek Kvasinková buňka se skládá z pevné buněčné stěny, která má ochrannou funkci. U kvasinek Saccharomyces sp. je tvořena třemi vrstvami. Pod buněčnou stěnou je uloţena cytoplasmatická membrána označována i jako plasmalema, sloţena z lipidů a proteinů. Cytoplasma uloţena uvnitř buňky obsahuje hladké nebo drsné endoplasmatické retikulum, ribozomy, mitochondrie, vakuoly, Golgiho aparát, buněčné inkluze – zrna rezervních látek. Jádro je od cytoplasmy odděleno dvojitou jadernou membránou s póry. Lokalizováno je obvykle ve středu buňky. (Bábíková, 2010) Buněčná stěna Buněčná stěna kvasinkové buňky je pevná struktura, která tvoří přibliţně 25 % suché váhy buňky. Buněčná stěna dává buňce tvar a chrání ji před mechanickými vlivy a před osmotickým šokem. Velkými póry stěny mohou procházet všechny sloučeniny kromě sloučenin vysokomolekulárních. (Buňková, Doleţalová, 2010) Hlavní komponentou buněčné stěny kvasinek jsou polysacharidy podílející se 80 % na sušině stěny. Polysacharidy jsou zastoupeny hlavně glukany, u některých druhů kvasinek najdeme i mannany. (Klaban, 2001) Cytoplasmatická membrána Cytoplasmatická membrána kvasinek má obdobné sloţení i funkci jako cytoplasmatická membrána bakterií. Je poměrně tenká, tloušťky 7,5 – 8 nm, sloţená z lipidů a proteinů. Je volně propustná pouze pro malé molekuly bez náboje, a tvoří proto osmotické rozhraní mezi buňkou a vnějším prostředím. Podobně jako u bakterií je sídlem transportních mechanismů, umoţňujících jak příjem určitých látek buňkou, tak transport látek z buňky do prostředí. Na rozdíl od bakterií však neobsahuje dýchací enzymy a systém oxidační fosforylace. (Šilhánková, 2002)

11

Cytoplasma Po odstranění buněčných organel zůstává vodný podíl koloidního charakteru, který se označuje jako cytoplasma nebo cytosol. U mladých kvasinek se cytoplasma ve světelném mikroskopu jeví jako průhledná homogenní hmota, u starších buněk se objevují zrníčka a vakuolizace. Koloidní charakter je dán přítomností různých bílkovin, glykogenu a dalších rozpuštěných makromolekulárních látek. (Buňková, Doleţalová, 2010) V elektronovém mikroskopu je patrné, ţe cytoplasma kvasinek obsahuje systém dvojitých membrán, jenţ se podobně jako u rostlin a ţivočichů nazývá endoplasmatické retikulum. Na vnějším povrchu membrán jsou četná políčka polyzomů, tj. agregátů ribozomů, v nichţ se syntetizují bílkoviny. Dále jsou v cytoplasmě kvasinek přítomny mitochondrie, coţ jsou strukturální útvary velmi rozmanitého tvaru (kulovité, válcovité aţ vláknité, nebo laločnaté), široké 0,3 – 1 µm a dlouhé aţ 3 µm. (Šilhánková, 2002) Ribozomy kvasinek jsou sférické útvary s hodnotou sedimentační konstanty 70S aţ 80S. Počet ribozomů se mění v závislosti na rychlosti růstu buňky. V cytoplazmě kvasinek mohou být ribozomy volné nebo vázané na membrány endoplazmatického retikula. (Buňková, Doleţalová, 2010) V cytoplasmě se rovněţ nachází vylučovací systém, tvořený dutinami zvanými vakuoly. Tyto útvary jsou obklopené membránou zvanou tonoplast a obsahují především hydrolytické enzymy a rezervní látky. V nich se nespecificky štěpí proteiny a skladují se zde aminokyseliny, polyfosfáty a ionty kovů. Vakuoly také zajišťují osmotickou regulaci a homeostasu cytoplasmy. (Basařová et al., 2010) Dalším membránovým útvarem v cytoplasmě kvasinek je Golgiho aparát, který má tvar plochého měchýřku nebo zploštělých cisteren uvolňujících se na protilehlých koncích ve formě měchýřků. V kvasinkových buňkách je Golgiho aparát méně výrazný neţ v rostlinných. Golgiho komplex má výraznou polaritu, která je představována tvorbou a odškrcováním drobných měchýřků na jedné straně, tyto měchýřky dozrávají a na druhém konci se odškrcují. (Buňková, Doleţalová, 2010) Podobně jako ostatní eukaryota obsahují kvasinky také tzv. cytoskelet, coţ je síť proteinových vláken, která se rozprostírá v cytoplazmě i v jádře a umoţňuje vnitrobuněčný pohyb organel z jednoho místa na druhé. V cytoskeletu kvasinek hrají významnou roli mikrotubuly, coţ jsou poměrně málo ohebné trubice sloţené z bílkoviny zvané tubulin. (Šilhánková, 2002) Jaderné mikrotubuly zajišťují pohyb

12

chromozomů při mitóze, cytoplasmatické se uplatňují při migraci jádra během mitózy. Na pohybech realizovaných pomocí mikrotubulů se také podílejí cytoskeletální ,,motory“ – bílkoviny kineziny a dyneiny. (Buňková, Doleţalová, 2010) Jádro Jádro kvasinek je poměrně malé, sférické aţ laločnaté, uloţené přibliţně buď ve středu buňky nebo excentricky. (Klaban, 2001) Má v průměru asi 1,5 µm, je ohraničeno dvojitou membránou s póry a obsahuje intracelulární tubuly, které jsou spojené s cytosolickými mikrotubuly při dělení chromozomů mezi mateřskou a dceřinou buňkou. Jádro obsahuje jadérko a hlavní část nukleoplasmy tvoří DNA a histony, organizované v chromosomech. (Basařová et al., 2010) 2.1.4 Genetický systém kvasinek Genetická

informace

kvasinek

vázaná

na

molekuly

DNA

je

uloţená

v chromozomech jádra, v mitochondriální DNA a v plazmidech. Některé kvasinky obsahují i mimojádrové genetické determinanty ve formě dsRNA, (double strand), které jsou zodpovědné za tvorbu toxinu usmrcujícího buňky citlivých kmenů kvasinek. (Šipický, Šubík, 1992)

2.1.5 Morfologie kvasinek Morfologie kvasinek je jedním z určujících znaků. Podle tvaru buněk rozlišujeme oválné, kulaté, válcovité, trojúhelníkové nebo citronkovité (apikulátní) buňky. (Bábíková, 2010) Velikost kvasinkových buněk se obvykle pohybuje v rozmezí od 3 – 15 µm, jsou tedy větší neţ buňky bakterií. Velikost buňky je dána rodovou příslušností a kultivačními podmínkami, přičemţ haploidní buňky bývají menší neţ buňky diploidní a polyploidní. (Buňková, Doleţalová, 2010) 2.1.6 Chemické sloţení kvasinek Z chemického sloţení obsahují kvasinky 65 – 85 % vody, přibliţně 50 % bílkovin v sušině, 2 – 3 % tuku a 8 – 9 % minerálních látek, z nichţ má převahu P2O5 (50 %) a K2O (40 %), dále Ca, Mg, Si, S a Fe. Kvasinky jsou bohatým zdrojem vitamínů, hlavně skupiny B a provitaminu D; dále obsahují kyselinu listovou, biotin a některé také

13

provitamin A. (Pelikán et al., 2004) Při ošetření UV zářením se můţe v kvasinkách obsaţený ergosterol přeměnit na vitamin D2. Této moţnosti se vyuţívalo v dřívějších letech pro výrobu produktu bohatého na vitamin D2, který se pouţíval především k zajištění potřeby vitaminu D2 u prasat a telat. (Cempírková, Čermák, 2008) Další součástí jsou enzymy, jejichţ prostřednictvím uskutečňují řadu biochemických přeměn. (Pelikán et al., 2004) 2.1.7 Rozmnoţování kvasinek Rozmnoţují se obvykle nepohlavně – vegetativně pučením, ale i pohlavně – generativně, kdy dochází ke vzniku zygoty, ze které vznikají nové buňky. Kvasinky tvoří tři druhy pohlavních spor: -

Askospory.

-

Sporidie.

-

Balistospory. (Bábíková, 2010)

2.1.8 Metabolismus kvasinek Buňky kvasinek přijímají ţiviny celým svým povrchem a o tomto procesu rozhodují vlastnosti cytoplasmatické membrány, která tvoří osmotické rozhraní mezi buňkou a okolním prostředím. Hlavní mechanismy přenosu ţivin do kvasničné buňky se dělí na pasivní a aktivní transport. Pasivní transport se označuje také jako usnadněná difúze a probíhá ve směru koncentračního spádu, ale přesto vyţaduje přenašeč. Důleţitější je aktivní transport, který se podílí na přenosu anorganických iontů a jednoduchých sloučenin, jako jsou sacharidy a aminokyseliny. (Basařová et al., 2010) Kvasinky rozdělujeme do dvou skupin podle toho, jestli potřebují ke svému růstu kyslík, nebo ne. První skupinu tvoří kvasinky, kde spotřeba kyslíku je značná. Jsou to obligátní aeroby a patří sem některé druhy rodu Candida. Další skupinou jsou fakultativně anaerobní kvasinky, které potřebují malé mnoţství rozpuštěného kyslíku v ţivotním prostředí, např. některé druhy rodu Saccharomyces. (Drobnicová, Zemanová, 1991) Za ideálních aerobních podmínek získávají kvasinky energii oxidací cukru, přičemţ vzniká málo nebo vůbec ţádný alkohol a dochází k intenzivnímu mnoţení kvasinek. K získání energie pro stavbu kvasničné buňky mohou být vyuţity i nezkvasitelné cukry, např. pentosy, kyselina mléčná i samotný alkohol. (Pelikán et al., 2004)

14

Kvasinky mají ale schopnost přeměnit svůj metabolismus za anaerobních podmínek na fermentační a při velmi omezeném růstu buněčné hmoty produkovat etanol a CO2. (Görner, Valík, 2004) Nejdůleţitějším fyzikálním faktorem, který ovlivňuje ţivotnost kvasinek je teplota. (Deák, 2008) Jsou schopny růstu v širokém rozmezí teplot prostředí (0 – 45 oC), při velmi nízkých hodnotách pH, koncentraci etanolu aţ 18 % a sacharózy 55 – 60 %. (Vlková et al., 2009)

2.2 Kvasinky v mlékařství 2.2.1 Charakteristiky nejvýznamnějších kvasinek

2.2.1.1 Rod Candida Rozmnoţuje se pučením, tvoří pseudomycelium, které můţe být někdy značně výrazné. Některé druhy kvasí, ale slaběji neţ rod Saccharomyces. Z mléka a mléčných produktů se izoluje Candida tropicalis, která dobře zkvašuje maltózu a sacharózu, neasimiluje dusičnan a má silné redukční vlastnosti. (Görner, Valík, 2004) Candida kefyr vyuţívá laktózu; je imperfektním stadiem druhu Kluyveromyces marxianus. (Šilhánková, 2002) V kefírových zrnech a produktech můţeme dále nalézt Candida inconspicua a Candida maris. (Tamime, 2006) Kvasinky rodu Candida ţijí přirozeně na sliznicích, v trávicím traktu nebo kůţi člověka. Při svém přemnoţení (např. při oslabení imunity) mohou způsobit místní onemocnění zvané kandidóza projevující se tvorbou bílých povlaků. (Benešová et al., 2003) Candida albicans je druh kvasinky, který je nejvíce patogenním druhem rodu Candida. Jedná se o typický druh střevní a ústní mikroflóry. Za normálních okolností u 80 % populace neškodí. Kdyţ se však nadmíru přemnoţí, způsobuje kandidózu. Kandidóza je často diagnostikována u osob se sníţenou imunitou, kde je často příčinou nemocí a úmrtí. C. albicans se však můţe přemnoţit i v krvi a v genitálním traktu. U dětí způsobuje rovněţ nemoc zvanou moučnivka. (Sládková, Hlaváčová, 2011)

15

2.2.1.2 Rod Kluyveromyces Od rodu Saccharomyces se liší hlavně tím, ţe nemá hexosovou represi dýchání a ţe vegetativní fáze je převáţně haploidní, takţe spájení buněk většinou těsně předchází tvorbě asků. Kluyveromyces marxianus se svými dvěma variantami, a to var. marxianus a var. lactis, zkvašují laktózu a jsou součástí tzv. kefírových zrn, tj. konglomerátu kvasinek a bakterií, pouţívaného při výrobě kefíru. Jednotlivé varianty se liší tvarem askospor. (Šilhánková, 2002) U Kluyveromyces lactis se vytvářejí 1 – 4 askospóry, které jsou kulovité, hladké, z asku se snadno uvolňují a aglutinují. Jedná se o jediný heterothalický druh v rodu Kluyveromyces. Kluyveromyces marxianus má v ascích 1 – 4 ledvinovité spóry. Jedná se o homothalický kmen. (WWW.VSCHT.CZ) Schopnost Kluyveromyces marxianus asimilovat laktózu a inulin umoţňuje pro něj následující: extrémně rychlý růst, krátkou generační dobu, tepelnou odolnost a vysokou sekreční kapacitu, coţ bývá velmi vyuţíváno v biotechnologiích. (Zhou et al., 2013)

2.2.1.3 Rod Yarrowia Tento rod je zastoupen jediným druhem, Yarrowia lipolytica. (Šilhánková, 2002) Kolonie jsou bílé, krémové, matné, kučeravé, rozprostřené. Vegetativně se rozmnoţuje pučením. Pohlavní rozmnoţování – Asky jsou jednotlivé, vyrůstají laterálně nebo terminálně, jsou vejčité, elipsoidní nebo kulovité. Asky obsahují 1 – 2 spóry, ale někdy i 4 spóry. (WWW.VSCHT.CZ) Y. lipolytica se často nachází v měkkých sýrech s modrou plísní a sýrech zrajících na povrchu, i kdyţ není pouţívána jako startovací kultura. V sýrech produkuje nahnědlé pigmenty. Vyznačuje se výraznou lipolytickou a proteolytickou aktivitou, coţ by bylo obtíţné kontrolovat při jejím pouţití jako startovací kultury. Bylo však zjištěno, ţe má pozitivní vliv na chuť sýru Raclette, stejně tak i nízkotučných sýrů. Je poměrně citlivá na vysoké koncentrace NaCl, coţ můţe limitovat její růst např. u sýrů s modrou plísní. (Querol, Fleet, 2006)

16

Obr. č. 1: Yarrowia lipolytica, kolonie na sladinovém agaru po 3 týdnech při 25 oC. (WWW.VSCHT.CZ)

2.2.1.4 Rod Saccharomyces Tvoří většinou krátce elipsoidní, vejčité nebo protáhlé buňky. Spájení je izogamií a askospory jsou kulovité aţ elipsoidní a jsou po 1 – 4 v asku. Vegetativní fáze je většinou diploidní nebo polyploidní. (Šilhánková, 2002) Kvasinky rodu Saccharomyces jsou saprofyté nebo příleţitostní parazité, jsou součástí půdní mikroflóry, ţijí často na povrchu i uvnitř těl rostlin i ţivočichů, účastní se kvasných (fermentačních) procesů, při kterých jsou rozloţeny cukry za vzniku alkoholu a CO2. (Benešová et al., 2003) Nejdůleţitější druh je Saccharomyces cerevisiae, který se uplatňuje jako pekařská, lihovarská, vinařská, nebo spodní či svrchní pivovarská kvasinka. Zkvašuje glukózu, sacharózu, maltózu, galaktózu a částečně nebo úplně také trisacharid rafinózu. Tento druh slouţí také jako modelový mikroorganismus pro biochemické a genetické práce, a je proto neprostudovanější kvasinkou. (Šilhánková, 2002) Saccharomyces cerevisiae je nejčastější kvasinka produkovaná jako doplněk stravy pro dojnice v laktaci. (Thrune et al., 2009) Kvasinka Saccharomyces boulardii je pouţívána jako probiotikum pro prevenci a léčbu průjmů. (Vanhee et al, 2010) Blokuje růst patogenů včetně Clostridium difficale, indikuje tvorbu sekrečního IgA ve sliznici trávicího traktu a zvyšuje zde aktivitu disacharidáz v podobě laktázy a maltázy. (Vlková et al., 2009) Je relativně tolerantní

17

k aplikovaným teplotám, kyselému pH a soli ţlučových kyselin aţ do 0,3 % v přípravcích. (Duongthingoc et al., 2013) Probiotika jsou ţivé mikroorganismy přidávané do potravin, které příznivě ovlivňují zdraví jejich konzumenta zlepšením rovnováhy jeho střevní mikroflóry. (Kalač, 2003)

Obr. č. 2: Saccharomyces boulardii. (WWW.GUTMICROBIOTAFORHEALTH.COM)

2.2.1.5 Rod Rhodotorula Buňky toho rodu jsou kulaté, oválné nebo podlouhlé. Většinou netvoří pseudomycelium, nekvasí. (Görner, Valík, 2004) Rod Rhodotorula patří mezi striktně aerobní kvasinky se zvláštními metabolickými vlastnostmi, jako je například schopnost produkce glykogenu během exponenciální růstové fáze a dále, velké mnoţství lipidů a karotenoidů během stacionární fáze růstu. Nachází se ve vzduchu, půdě, na povrchu listů a také v mléčných a sýrových výrobcích. (Almanza et al., 2014)

2.2.1.6 Rod Debaryomyces Rod Debaryomyces zahrnuje kvasinky mnoţící se askosporami, některé druhy tvoří při mnohostranném pučení pseudomycelium. Jedná se o osmofilní rod snášející aţ 24 % koncentraci NaCl a velmi nízký redox potenciál prostředí. Vytváří bílé povlaky na povrchu láků, nálevů a sýrů. Způsobuje kaţení citrusových koncentrátů a mléčných výrobků. (Vlková et al., 2009) Druh Debaryomyces hansenii má buňky kulaté aţ krátce oválné, netvoří pseudomycelium.

Na

tekutých

produktech

18

často

vytváří

bílou

kůţičku.

(Görner, Valík, 2004) Vegetativně se rozmnoţuje multilaterálním pučením na zúţené bázi. Pohlavní rozmnoţování – Asky vznikají bez předchozí konjugace nebo po izogamní či heterogamní konjugaci. Spóry jsou kloboukovité nebo kulovité či dokonce saturnovité. (WWW.VSCHT.CZ) Některé kmeny kvasinek Debaryomyces hansenii jsou známy jako antagonisté k plísním. Inhibiční účinky na mléko a mléčné výrobky kmenem D. hansenii mohou být vyuţity jako biokontrolní činidlo proti řadě mléčných forem plísní v jogurtech a sýrech v rámci nezchlazeného prostředí. Inhibiční účinek tohoto antagonistického kmene kvasinek je však závislý na koncentraci plísní. Čím je koncentrace niţší, tím vyšší je účinek kvasinek. (Liu, Tsao, 2009)

2.2.1.7 Rod Geotrichum Rod Geotrichum, s jediným druhem, má bohaté mycelium s artrosporami a bílé sametové aţ vatovité kolonie. Tvoří přechod mezi kvasinkami a plísněmi. Nemá kvasné schopnosti. Vyskytuje se jako častá kontaminace mléčných výrobků, hlavně tvarohu a jogurtu. Obsahuje proteolytické a lipolytické enzymy. (Šilhánková, 2002) Způsob rozmnoţování je vegetativní, vytváří se arthrokonidie. Je to thalusové neboli somatické dělení. (WWW.VSCHT.CZ) Geotrichum candidum asimiluje galalaktózu a laktózu, která je velmi důleţitá při zrání plísní a bakteriálnímu zrání sýrů pod mazem. G. candidum produkuje velké mnoţství aromatických

sloučenin,

jako jsou alkoholy, estery, methylketony

a karbonylové sloučeniny. (Fox et al., 2004) 2.2.2 Mléčné výrobky obsahující kvasinky Kvasinky se v mléčných produktech pouţívají převáţně při výrobě sýrů, mohou však být zapojeny také do výroby fermentovaných mléčných výrobků, jako je kefír. Ve většině případů jsou pouţívány jako sekundární startovací kultury s cílem zvýšit produkci aroma a usnadnit růst jiných mikroorganismů. (Querol, Fleet, 2006) Mléčné kvasinky se liší od kvasinek vyuţívaných ve fermentačním průmyslu následujícími vlastnostmi: fermentují laktózu, ale nefermentují maltózu, jsou citlivé vůči alkoholu (Tab. č. 1) a pokud jej tvoří, tak pouze v malém mnoţství, jako zdroj dusíku spíše vyuţívají peptony něţ aminokyseliny, fermentace je pomalá, lépe snášejí vyšší koncentrace soli a kyseliny mléčné. (Görner, Valík, 2004)

19

Tab. č. 1: Minimální inhibiční koncentrace etanolu na růst kvasinek. (Deák, 2008) Druhy

Etanol %

Candida utilis

6.1 – 6.5

Kluyveromyces marxianus

8.6 – 9.4

Pichia anomala

10.0 – 10.9

Schizosaccharomyces pombe

11.8 – 12.5

Hanseniaspora valbyensis

11.9 – 13.2

Saccharomyces cerevisiae

11.3 – 13.7

Podle pouţití se v mlékárenském průmyslu rozeznávají kvasinkové kultury: -

Pro výrobu sýrů rokfortského typu.

-

Tvořící část mazové kultury pro výrobu měkkých sýrů.

-

Kultury, které jsou součástí kefírové kultury a jiných nápojových kultur. (Görner, Valík, 2004)

2.2.3 Kefírová kultura Kefírová kultura se pouţívá k výrobě kefíru nebo kefírového mléka. Tyto výrobky se liší mnoţstvím obsaţených kvasinek (Tab. č. 2), kdyţ kefír by jich měl obsahovat v 1 ml min. 10 000, zatímco kefírové mléko pouze 100. (Šustová, Sýkora, 2013)

20

Tab. č. 2: Poţadavky na mléčné výrobky a druhy mikroorganismů mléčného kysání. (Vyhláška č. 77/2003 Sb. v aktuálním znění) Druh výrobku

Pouţité mikroorganismy

Mléčná mikroflóra výrobku v 1 g

Kefír

Zákys připravený z kefírových zrn,

Bakterie mléčného

jehoţ mikroflóra se skládá z kvasinek

kvašení

zkvašujících laktózu Kluyveromyces

106

marxianus i nezkvašujících laktózu

a kvasinky

Saccharomyces unisporus,

104

Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces exignus a dále Leuconostoc, Lactococcus a Aerobacter, rostoucí ve vzájemném společenství. Kefírové mléko

Zákys skládající se z kvasinkových

Bakterie mléčného

kultur rodu Kluyveromyces, Torulopsis

kvašení

nebo Candida valida a mezofilních a

106

termofilních kultur bakterií mléčného

a kvasinky

kvašení v symbióze.

102

Kefír je krémový, šumivý, kyselý mléčný nápoj. Obsah kyseliny mléčné je 0,7 % aţ 1 %, jeho obsah alkoholu se pohybuje v rozmezí od 0,05 % do 1 %, ale jen zřídka přesahuje 0,5 %. (Walstra et al., 2006) Kefírová zrna se skládají z laktokoků, laktobacilů a kvasinek. Konkrétně se jedná o druhy Lactococcus lactis subsp. lactis nebo subsp. cremoris, Lactobacillus delbrueckii, Lb. brevis, Lb. casei, Lb. kefir, z kvasinek jsou to Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces marxianus, Torulopsis kefir, Candida kefir a další. Kvasinky štěpí laktózu za vzniku etanolu a CO2, který způsobuje problémy zejména při skladování kefíru, kdy můţe docházet k bombáţím obalů. Proto se v současné době pro výrobu kefíru pouţívají spíše uměle sestavené kefírové kultury, kde nejsou kvasinky obsaţeny. (Vlková et al., 2009)

21

Obr. č. 3: Kefírová zrna. (WWW.KEFIRGRAINS.INFO) Poměr mléčného a etanolového kvašení je dán charakterem kultury (kefírová zrna, uměle sestavená kultura) a podmínkami kultivace. Vyšší teplota kultivace podporuje bakterie, niţší teplota a provzdušňování mléka podporuje činnost kvasinek. Na délce kultivace záleţí i hloubka a rozsah proteolýzy a lipolýzy. (Kadlec et al., 2009) 2.2.4 Sýry Kvasinky jsou vedle zákysových a proteolytických bakterií anebo specifických plísní významnou, ale méně probádanou sloţkou mikroflóry sýrů zrajících od povrchu dovnitř. (Görner, Valík, 2004) 2.2.4.1 Měkké sýry zrající pod mazem Charakteristické pro tyto sýry je zrání pod mazem od povrchu směrem do středu sýra, proteolytickou aktivitu zde uplatňuje především ţlutočervená mazová kultura bakterií Brevibacterium brevis, Brevibacterium linens, mikrokoky a kvasinky – kultura se nanáší namáčením sýrů do solného roztoku nebo nástřikem. Sýry zrají při 4 – 16 oC 10 – 14 dnů, je nutné 2 – 3 krát obrátit. (Šustová, Sýkora, 2013) Sýry vyráběné ze syrového mléka, důleţitého zdroje povrchových mikroorganismů, jsou vystaveny vysoké relativní vlhkosti vzduchu (˃95 %), coţ způsobuje přirozenou tendenci tvořit vrstvu mazu na povrchu, který se skládá z kvasinek a bakterií. V mazu bylo identifikováno zhruba 19 druhů kvasinek, nejčastěji Debaryomyces hansenii, následován Geotrichum candidum, Issatchenkia orientalis a Kluyveromyces marxianus. Několik druhů Candida a Yarrowia lipolytica bylo také izolováno. V sýru Reblochon převládají druhy Candida zeylanoides, C. vini a C. famata. (Law, 1999)

22

Obr. č. 4: Reblochon. (WWW.GRETAGARBURE.COM) 2.2.4.2 Sýry s plísní na povrchu Typickým znakem sýrů této skupiny je porost bílé plísně Penicillium camemberti, případně P. caseicolum na povrchu sýra. Výroba a tvarování sýřeniny probíhá stejně jako u měkkých sýrů zrajících od povrchu dovnitř. Uvnitř má proto sýr podobnou konzistenci jako jiné měkké sýry zrající. (Gajdůšek, 1998) Po prokysání a vysráţení syřidlem se sýřenina formuje do poţadovaného tvaru pomocí forem a syrovátka se nechá odkapat do druhého dne. Po tuto dobu stále probíhá primární anaerobní zrání sýrů. Po té jsou sýry soleny a očkovány ušlechtilou plísní, zrání probíhá při teplotě 12 – 15 oC po dobu asi 3 týdnů. Zejména na počátku zrání se na povrchu sýrů často mnoţí některé kvasinky, které mohou brzdit rozvoj ušlechtilé plísně. (Vlková et al., 2009) Velmi brzy po výrobě rostou na povrchu kvasinky tvořící hustou vrstvu o tloušťce okolo 200 µm. Nejběţnějšími druhy jsou Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae a Debaryomyces hansenii. (Fox et al., 2004) 2.2.4.3 Sýry s plísní v těstě Během zrání, několik biochemických procesů přispívá k rozvoji typické struktury a chuti jednotlivých sýrů s modrou plísní. Některé procesy mohou produkovat pigmenty, jsou-li přítomny potřebné enzymy a prostředí v sýru stimuluje jejich produkci. Hnědé skvrny v sýrech s modrou plísní jsou obvykle mikrobiálního původu a mohou být vyvinuty kontaminujícími kvasinkami nebo plísněmi. Nejvíce se v sýrech

23

s modrou plísní vyskytuje kvasinka Debaryomyces hansenii (Candida famata). (McSweeney, 2007) Přehled o výskytu Debaryomyces hansenii ve vybraných sýrech s modrou plísní udává Fox et. al. (2004), viz tabulka č. 3. Dále mají silné zastoupení druhy Candida catenulata, C. lipolytica, C. krusei, Trichosporon cutaneum a Kluyveromyces marxianus. (Fox et al., 2004) Kvasinkové kultury pro výrobu sýrů s modrou plísní obsahují druhy Kluyveromyces lactis a Torulopsis candida. (Görner, Valík, 2004) Typickými představiteli sýrů jsou francouzský Roquefort, u nás vyráběný pod názvem Niva, anglický Stilton, případně dánské sýry Mycella nebo Danablu nebo holandský sýr Blue Master. (Gajdůšek, 1998) Tab. č. 3: Výskyt Debaryomyces hansenii ve vybraných sýrech s modrou plísní. (Fox et al., 2004) Druh sýru

Povrch, kvasinky/g

Vnitřek, kvasinky/g

sýru

sýru

D. hansenii (%)

Roquefort

7

1.7 x 10

4.4 x 106

74

Petite Fourme

2.1 x 107

2.0 x 105

66

Bleu d´Auvergne

1.7 x 107

5.5 x 106

64

Cambozola

2.7 x 105

2.6 x 104

70

Saint Agur

2.0 x 107

1.9 x 105

75

6

3

62

6

70

Gorgonzola Forume d´Ambert

3.6 x 10

7.3 x 10

7

2.1 x 10

1.4 x 10

2.2.4.4 Kyselé sýry – tvarohy Kyselé sýry jsou hlavně tvarohy a sýry vyrobené z tvarohu. Okyselením mléka kysáním nebo přídavkem kyseliny (např. citronové) vzniká mléčná sraţenina, která se oddělí od syrovátky. Pro zaručení optimálního průběhu sráţení se nejprve zahřeje mléko v kotli na 20 – 25 oC. Následně se do mléka přidá mlékárenská kultura, která hraje významnou roli týkající se smyslových vlastností zrajících sýrů. Při výrobě tvarohů a čerstvých sýrů se vyuţívají mezofilní kultury rodu Lactococcus příp. Leuconostoc. K výrobě dalších sýrů se vyuţívají také bakterie např. rodu Lactobacillus a Streptococcus. (Šustová, Sýkora, 2013)

24

Různé technologie výroby kyselých sýrů se ve výsledku projevují v podstatných rozdílech ve vzhledu, chuti a povrchové mikroflóry. Nejčastěji nalezenými kvasinkami jsou Kluyveromyces marxianus, Candida krusei, Candida utilis, Candida lipolytica a Trichosporon asahii. (Smit, 2003) 2.2.4.5 Olomoucké tvarůžky Olomoucké tvarůţky jsou vyráběné jako ţlutý sýr s typickou povrchovou mikroflórou, velmi tuhým těstem a výraznou chutí. (Teubner et al., 1990) Tvarůţky jsou jediným kyselým sýrem vyráběným z tvarohu o sušině 32 % (Šustová, Sýkora, 2013). Jedná se o tvaroh vyráběný pomocí smetanové nebo termofilní zákysové kultury bez pouţití syřidla. Po dosaţení poţadované kyselosti okolo 120 oSH se tvaroh rychle zchladí, dosolí, zformuje a suší. Nastává druhá fáze mikrobiálního zrání, kdy se na povrchu sýrů mnoţí mikroorganismy způsobující oxidační procesy, jedná se zejména o kvasinky rodů Torulopsis a Candida. Kvasinky zoxidují nadbytečnou kyselinu mléčnou na CO2 a vodu, čímţ je v povrchových vrstvách sníţena kyselost a je umoţněn rozvoj proteolytických bakterií. Po dosaţení pH povrchu 6,4 jsou sýry omývány, aby byly odstraněny kvasinky a vytvořily se vhodné podmínky pro rozvoj aerobních mikroorganismů třetí fáze zrání. Jedná se o proteolytické mazové bakterie Brevibacterium linens, popřípadě Lactobacillus casei, Lb. delbrueckii subsp. lactis a Lb. helveticus, pokud byla pro výrobu tvarohu pouţita termofilní zákvasová kultura. Tyto mikroorganismy zabezpečují rychlou hydrolýzu bílkovin, tedy zrání tvarůţků. V průběhu zrání se na povrchu tvarůţků tvoří oranţový maz a sýry získávají typickou chuť a aroma. Třetí fáze zrání trvá 4 - 8 dnů při teplotách 15 – 20 oC. (Vlková et al., 2009)

2.3 Kvasinky způsobující kaţení mléka a mléčných výrobků Na kaţení potravin se mohou podílet kvasinky, plísně i bakterie. Kaţení potravin je moţno popsat jako jakoukoliv změnu, která má za následek, ţe daný produkt je nepřijatelný pro lidskou spotřebu. Biochemická nebo mikrobiologická analýza je objektivnější a méně nákladná, neţ senzorické posouzení.

25

Kaţení potravin kvasinkami a plísněmi se projevuje produkcí slizových látek, kyselin, plynu, alkoholu a dále pigmentací povrchu potravin a změnami chuti a vůně. (Komprda, 2004) Růst kvasinek je v mléce a v mléčných výrobcích většinou neţádoucí, protoţe tyto mikroorganismy způsobují vysoké riziko kaţení. Přesto však hrají kvasinky důleţitou roli v potravinách, jelikoţ jsou schopny růst v širokém rozmezí pH prostředí. Kvasinky představují vysoké riziko kaţení pro mléčné výrobky s nízkým pH, jako kysané mléko, zakysané smetany, jogurty, smetanové sýry a kyselé mléčné výrobky s přídavkem ovocné směsi. (Büchl, Seiler, 2011)

2.3.1 Mléko Mléko je vynikající substrát pro růst mnoha mikroorganismů, včetně kvasinek. Čerstvé, syrové mléko obsahuje různé populace kvasinek, v závislosti na hygieně dojení. (Deák, 2008) Čerstvé mléko obsahuje určité látky působící inhibičně na mikroorganismy. Tato inhibiční schopnost není však natolik silná, aby mléko chránila před další kontaminací; za několik hodin zmizí. (Hrubý et al., 1984) 2.3.1.1 Sladké kondenzované mléko Sladké kondenzované mléko není sterilní. Obsahuje ţivé mikroby a spory. Ke zhoršení obvykle dochází pomocí osmofilních kvasinek, z nichţ většina patří do rodu Torulopsis. Kvasinky často způsobují tvorbu plynu, ovocnou chuť a koagulaci proteinu. Koagulace můţe způsobit produkci etanolu a v důsledku toho se výrobek stává nepřijatelný. (Walstra et al., 2006) 2.3.2 Kysané mléčné výrobky Kysané mléčné výrobky jsou v důsledku nízkých hodnot pH okolo 4,6 a méně do značné míry chráněné vůči rozvoji neţádoucích bakterií. Vady těchto produktů způsobují zejména plísně a kvasinky, které dobře snášejí nízké pH a dobře se mnoţí. Svou činností způsobují značné senzorické vady. Tvorba plynu v produktu, projevující se zejména deformacemi obalů a bombáţemi, můţe být způsobena jak koliformními bakteriemi, tak některými BMK, ale především kvasinkami. (Vlková et al., 2009) Ze zakysané smetany byl izolován druh Kluyveromyces lactis. (Deák, 2008)

26

2.3.3 Máslo Máslo obsahuje méně mikroorganismů neţ smetana před zpracováním, protoţe většina mikroorganismů odchází do podmáslí. (Dragounová, 2003) Máslo, pomazánky a margaríny jsou emulze s vnitřním omezením růstu většiny mikroorganismů. Mikrobiální aktivita je ovládána vysokým obsahem tuku, přídavkem soli a konzervačních látek, a vodnou fází, obsahující drobné kapičky. Na kaţení másla se z kvasinek nejvíce podílí Candida parapsilosis, Candida zeylanoides, Yarrowia lipolytica a Geotrichum candidum. (Deák, 2008) Kvasnicová chuť másla se vyskytuje častěji v období krmení řepou a řepnými skrojky a také v předjarním období a brzy z jara při zkrmování špatně uskladněné píce. Vlastní příčinou je kvasinková kontaminace zákysu. Sýrovitá chuť vzniká při zpracování nakyslého mléka nebo ze zákysu s příliš vysokým stupněm kyselosti. Vady toho druhu se nejsilněji rozvíjí při teplotách 5 – 10 oC. Z plísní se na vzniku této vady podílí Oospora lactis, penicilia a také kvasinky. (Lukášová et al., 2001) Mikroorganismy, které způsobují kaţení másla, jsou zapleteny i do kaţení margarínu. Nicméně rostlinné tuky jsou obvykle odolnější vůči lipolytickému znehodnocení neţ mléčný tuk. (Marth, Steele, 2001) 2.3.4 Sýry Významným zdrojem kontaminujících kvasinek jsou solné lázně. Po solení sýrů v solných lázních se povrch sýrů musí osušit. Vlhké sýry podporují růst kontaminujících kvasinek pocházejících ze solných lázní. Nejčastěji bývají izolované kvasinky rodu Candida, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces marxianus, Geotrichum candidum, Debaryomyces hansenii a rodu Pichia. Kvasinky se vyskytují i na povrchu sýrů tvořících kůru, např. ementálského typu, čedar, holandské sýry apod. Jejich mírná vlhkost a přítomnost značného mnoţství soli na jejich povrchu tvoří prostředí pro růst kvasinek. U těchto sýrů však nezpůsobují kvasinky významné negativní změny jejich povrchu. (Görner, Valík, 2004) Při nedostatečné hygieně můţe při výrobě sýrů s plísní na povrchu docházet k rozvoji neţádoucích i patogenních mikroorganismů. Jedná se zejména o Geotrichum candidum, stafylokoky, Escherichia coli a Listeria monocytogenes. (Vlková et al., 2009)

27

2.3.5 Tvarohy Tvarohy jsou mimořádně náchylné na kaţení způsobené jak bakteriemi, tak kvasinkami a plísněmi. Pro zvýšení trvanlivosti tvarohů se pouţívá tzv. termizace. To znamená, mírné zahřátí výrobku po krátkou dobu. (Vlková et al., 2009) Mnoţství kontaminující mikroflóry je obrazem hygienických podmínek při výrobě. Převáţně se jedná o koliformní bakterie, plísně a kvasinky. Výskyt Geotrichum candidum upozorňuje na nedostatky v sanitaci a hygieně. (Dragounová, 2003) 2.3.6 Mraţené smetanové krémy a zmrzliny Mraţené smetanové krémy mohou být kontaminovány mezofilními, psychrofilními, koliformními mikroorganismy, kvasinkami a plísněmi. Zdrojem kontaminace mohou být přídatné látky, látky určené k aromatizaci, pomocné látky. (Dragounová, 2003)

2.3.7 Jogurt Jogurt je produkován po celém světě, a i kdyţ je připravován pomocí kyselých mléčných startovacích kultur a můţe být zmraţen nebo pasterizován, často obsahuje kvasinky, které mohou být problematické. Mezi 233 izoláty se nejvíce vyskytoval druh Debaryomyces hansenii (22 %), dále Rhodotorula mucilaginosa (18 %), Yarrowia lipolytica (15 %), Metschnikowia reukaufii (13 %), Candida zeylanoides (9 %), Candida tropicalis (8 %) a Candida parapsilosis (6 %). (Deák, 2008)

2.4 Boj proti neţádoucím kvasinkám V boji proti činnosti neţádoucích mikroorganismů se obecně pouţívají mechanické, fyzikální a chemické prostředky a jejich kombinace. K mechanickým prostředkům patří zejména čistota strojů, zařízení, podlah, stěn apod. Často se pouţívají společně s fyzikálními a chemickými prostředky. (Gajdůšek, 1998) Spory většiny kvasinek a plísní nejsou termorezistentní a nepřeţijí ani krátkodobý záhřev na teplotu vyšší neţ 60 oC. Pasteračním ohřevem jsou tyto mikroorganismy inaktivovány. Do mlékárenských výrobků se mohou dostat kontaminací při mlékárenské výrobě z nedokonale čistého výrobního zařízení nebo provozního prostředí. (Dragounová, 2003)

28

2.4.1 Čištění Čištění můţe být definováno jako koloběh chemických roztoků a/nebo vody pomocí technologického zařízení, které je sestaveno v rámci konfigurace výroby tak, aby veškeré povrchy, které přicházejí do styku s produktem, byly čištěny na přijatelném vysokém standardu. Čištění by mělo být navrţeno tak, aby nedocházelo k demontáţi a zpětné montáţi různých jednotek v rámci výrobního procesu. (Lelieveld et al., 2003) Tab. č. 4: Účinek čistících látek na jednotlivá znečištění. (Gajdůšek, 1998) bílkoviny

tuky

cukry

škroby

soli

+++

+

+++

+

-

kyseliny

+

-

+++

+

+++

oxidanty

M

M

N

++

N

tensidy

+

+++

N

M

N

komplexotvorné látky

M

+

N

N

++

zásady

+++ velmi vhodný

M moţné ve zvláštních případech

++ dobrý

- nevhodný

+

N neţádoucí

vhodný

2.4.2 Dezinfekce Dezinfekce je proces usmrcení mikroskopických hub fyzikálními a chemickými prostředky v pracovním a ţivotním prostředí člověka, vedoucí k přerušení cest přenosu původců onemocnění. Dezinfekce míst napadených mikroskopickými houbami se provádí mokrou cestou. Při dezinfekci se uplatňují čtyři základní postupy: postřik, namočení a otření, ponoření (pouze u předmětů) a expozice v atmosféře vypařovaného dezinfekčního prostředku. Podle místa výskytu a velikosti kontaminace se doporučuje kombinace uvedených způsobů. Po pouţití dezinfekčních přípravků s deklarovanou fungicidní účinností ve všech výše uvedených případech následuje, pokud výrobce dezinfekčního přípravku doporučuje, mechanická očista napadeného místa. (Paříková et al., 1998) 2.4.3 Fyzikální prostředky Z fyzikálních prostředků nejvíce uplatňujeme vlhké teplo, ať uţ do 100

o

C

při pasteraci, teplé konzervaci kyselých potravin (o pH ˂ 4,0), nebo vaření kyselých

29

zápar v droţďárnách, nebo tlakovou páru, pouţívanou např. pro konzervaci nekyselých potravin, sterilací médií a propagačního zařízení v kvasném průmyslu. (Šilhánková, 2002) 2.4.4 Chemické prostředky Chemické metody vyuţívají biocidní účinky některých chemických sloučenin, které usmrcují mikroorganismy narušením jejich buněčných struktur nebo metabolických pochodů. (Basařová et al., 2010) Chemické

prostředky

pouţívané

v potravinářství

v boji

proti

neţádoucím

mikroorganismům nesmějí nepříznivě ovlivňovat chuť potravin, výrobní prostředí, zdraví zaměstnanců nebo konzumentů ani poškozovat výrobní zařízení. (Šilhánková, 2002) 2.4.5 Opatření v mlékařství Ošetřování a uchovávání syrového mléka po nadojení je nezbytnou součástí hygienických

opatření

při

výrobě,

nemůţe

však

napravit

škody vznikající

nehygienickým získáváním mléka. Mléko se ošetřuje v mléčnici, která má být co nejblíţe místa, kde se mléko získává, nesmí však souviset s kravínem přímo dveřmi. K umývání a úchově nářadí musí být u kaţdé mléčnice samostatná místnost – umývárna. Technologický postup při ošetřování mléka po nadojení zahrnuje čištění, chlazení a úchovu. (Gajdůšek, 2003) Sanitace se provádí v těchto intervalech: denní, týdenní a měsíční sanitace. Přípravky poţívané k sanitaci dojících zařízení mohou být jednoduché nebo kombinované. Jednoduché přípravky obsahují jen čistící nebo jen dezinfekční sloţku a kombinované obě. Přípravky dělíme na zásadité a kyselé. Zásadité přípravky odstraňují organické látky (tuky, bílkoviny). Kyselé, látky anorganické (mléčný nebo vodní kámen). (Šustová, Sýkora, 2013) Důleţitými aspekty mikrobiálního sloţení mléka jsou: -

Hygienická opatření při dojení a manipulaci s mlékem; to je důleţité zejména pro sýry vyrobené ze syrového mléka.

-

Pasterizace: nízká pasterizace zabije většinu mikroorganismů způsobující kaţení, s výjimkou spor Clostridium.

30

-

Baktofugace: můţe podstatně sníţit mikrobiální počet, včetně spor Clostridium.

-

Hrozba rekontaminace mléka po pasterizaci nebo baktofugaci.

Opatření, aby se zabránilo kontaminaci během výroby a zrání sýru: -

Pravidelné čištění zařízení, ošetření chloridem sodným a celkové dodrţování hygieny.

Opatření k omezení růstu mikroorganismů během výroby a zrání sýra: -

Můţe zahrnovat přidání inhibitorů do mléka a tvarohů, zvýšit rychlost a úplnost fermentace laktózy.

Fyzikálně-chemické vlastnosti sýru: -

Sledovat zejména obsah kyseliny mléčné a pH, obsah NaCl, přítomnost cukrů, teplotu, relativní vlhkost; určit, zda mohou na sýru růst mikroorganismy, jakoţ i to, zda mohou produkovat neţádoucí metabolity. (Walstra et al., 2006)

2.5 Účinné látky z rostlin s antimikrobiální aktivitou V současné době existuje významná poptávka spotřebitelů po potravinách, které jsou minimálně zpracované a bez syntetických chemických konzervantů s vnímáním, ţe jsou ,,přírodní‘‘. Výsledkem je, ţe potravinářský průmysl čelí velké výzvě vyuţívat přirozeně se vyskytující antimikrobiální látky a antioxidanty a produkovat bezpečné potraviny, které jsou rovněţ povaţovány za zdravé. Koření a bylinky jsou známé pro jejich antimikrobiální a antioxidační vlastnosti a mají schopnost vytvářet velké mnoţství příchutí v potravinách. (Weerakkody et al., 2009) Antimikrobiální účinky silic jsou způsobeny přítomnosti terpenové frakce v těchto látkách. Různé typy pepře, petrţele a kopru ukázaly antimikrobiální aktivitu proti přirozené mikroflóře, koliformním bakteriím, kvasinkám a plísním. (Gyawali, Ibrahim, 2012)

31

2.5.1 Silice (éterické oleje) Silice jsou směsi těkavých a zpravidla vonných látek nejrozmanitějšího typu. Mají olejovitou konzistenci a nejčastěji jsou to terpeny a jejich sloučeniny. Pouţívají se přímo, nebo jejich izolované sloţky v lékařství jako léčiva, významně se uplatňují v potravinářství i v kosmetickém průmyslu. (Valíček, 2003) Na rozdíl od mastných olejů se jiţ za pokojové teploty odpařují a nezanechávají ţádná rezidua. Často převládá jedna sloučenina, např. mentol v oleji z máty peprné. (Chloupek, 2005) Ve vodě nejsou obyčejně rozpustné a ani se s ní nemísí. Dobře se však rozpouští v etanolu, v éteru i jiných organických rozpouštědlech. Na vzduchu snadno oxidují a pryskyřičnatějí. (Janča, Zentrich, 1994) 2.5.1.1 Výskyt silic Silice se získávají z různých částí rostlin, jejich květů (např. jasmín), stonků nebo kvetoucích stonků (např. máta, tymián), plodů nebo semen (kmín, pepř, jalovec), oplodí plodů (citrusy), dřeva (santal), listů (bobkový list), cibulí nebo sloţených cibulí (česnek), oddenků (puškvorec, kurkuma) či kořenů (hořec). (Velíšek, Hajšlová, 2009) Na vzniku silic v rostlinách se podílejí prakticky veškeré produkty asimilačních procesů. (Vonášek et al., 1987) 2.5.1.2 Složení silic Silice obsahují vţdy uhlovodíky a kyslíkaté látky. Většina jich má skelet sloţený z isoprenových molekul řazených za sebou podle isoprenového pravidla – patří tedy mezi terpeny. V silicích převaţují monoterpeny s deseti uhlíkovými atomy v molekule a seskviterpeny s patnácti uhlíky v molekule. Vedle terpenů jsou v silicích také alifatické cyklické i aromatické sloučeniny, které kromě atomů uhlíku mají v molekule nejčastěji atom nebo atomy kyslíku, popřípadě dusíku nebo síry. Terpenické uhlovodíky nemají pro chuťové a vonné vlastnosti většinou rozhodující význam. Jen ve výjimečných případech, jako u citrusových silic, propůjčují monoterpenické uhlovodíky, zejména limonen, produktu příjemnou svěţest. (Vonášek et al., 1987) Terpenové a seskviterpenové uhlovodíky jsou však příčinou omezené rozpustnosti silic ve zředěném etanolu a jsou často příčinou zhoršení kvality silic, neboť na vzduchu snadno oxidují, případně polymerují. Odstraněním uhlovodíků ze silic se získávají koncentráty. (Velíšek, Hajšlová, 2009)

32

Hlavními nositeli vonných a chuťových vlastností silic jsou jejich komponenty obsahující v molekule kyslík. (Vonášek et al., 1987) 2.5.1.3 Získávání silic Destilací s vodní párou, lisováním nebo extrakcí nepolárním rozpouštědlem (a odpařením rozpouštědla) se získá silice konkrétní neboli konkret, která obsahuje kromě vonných látek ještě různé balastní látky, především vosky. Ty se oddělí tak, ţe se konkrétní silice rozpustí za tepla v etanolu a vymrazí. Vosky se vyloučí, oddělí filtrací a etanol se odpaří. Získá se silice absolutní. (Velíšek, Hajšlová, 2009) 2.5.1.4 Rozdělení silic podle účinku Podle účinku můţeme silice rozdělit na silice s účinkem: -

Expektoračním (bedrník anýz, mateřídouška obecná, dobromysl obecná, yzop lékařský, bazalka pravá, eukalyptus neboli blahovičník kulatoplodý).

-

Karminativním (fenykl obecný, kmín kořenný, koriandr setý, máta peprná).

-

Diuretickým (plody jalovce, kořen a semeno petrţele, kořen celeru).

-

Sedativním (list meduňky lékařské, kořen kozlíku lékařského, nať dobromysli obecné, květ levandule lékařské).

-

Desinfekčním (list myrty obecné, list šalvěje lékařské, list lichořeřišnice větší, list řepíku lékařského, hřebíček kořenný, květ heřmánku pravého). (Janča, Zentrich, 1994)

2.5.1.5 Využití silic v potravinářství Vzhledem k tomu, ţe je obecně zapotřebí vyšší koncentrace silic (éterických olejů) při přidávání do potravin, můţe být aplikace silic v potravinách omezena kvůli změnám organoleptických vlastností a texturním kvalitám potravin nebo kvůli interakci silic se sloţkami potravin. (Gutierrez et al., 2008) Nicméně, kombinace koření a dalších antimikrobiálních bariér můţe zvýšit trvanlivost a bezpečnost potravin, coţ by mohlo vyřešit stále větší poptávku po tzv. zelených potravinách obsahujících méně syntetických látek. Koření a jeho deriváty mohou být tedy vhodnou alternativou pro pouţití v potravinovém konzervačním systému a mohou působit jako hlavní nebo pomocná antimikrobiální sloţka. (Cwiková et al., 2010)

33

Terapeuticky se vyuţívají jako antiseptika, expektorantia, diuretika, antiflogistika a derrivantia. (Janča, Zentrich, 1994) Silice jsou nejdůleţitějšími surovinami potravinářských arómat. Např. k výrobě arómat chleba a pečiva se ze silic pouţívají citrónová, fenyklová, hřebíčková, kardamomová, kmínová, koriandrová, muškátová a skořicová. (Vonášek et al., 1987) 2.5.1.6 Účinek silic na mikroorganismy Pouţití

bylin,

koření

a

silic

s antimikrobiálními

účinky

srovnatelnými

se syntetickými účinky aditiv je stále v menší míře ze tří důvodů: omezené údaje o jejich účincích v potravinách, silný zápach a vysoké náklady. (Tajkarimi et al., 2010) Tymián je ekonomicky důleţitý pro jeho pouţití v lidovém léčitelství, pro chuť a organoleptické vylepšení, stejně tak se pouţívá jako potravinový konzervant. Jeho antioxidační a antimikrobiální vlastnosti poskytují základ pro mnoho aplikací, jako je konzervování syrových a zpracovaných potravin, farmaceutický průmysl, alternativní medicína a přírodní terapie. Mimo to, silice z tymiánu patří vzhledem k jejich aktivitě mezi nejúčinnější antimikrobiální rostlinné látky, a to zejména vůči patogenním mikroorganismům, které jsou rezistentní proti antibiotikům. (El Bouzidi et al., 2013) Meduňka se jiţ ve starověkém Řecku a Římě pouţívala k léčbě ran. Později se aplikovala orálně k léčbě chřipky, nespavosti, úzkosti, deprese a ţaludku. U extraktů z meduňky byla prokázána inhibice syntézy bílkovin a projevena antivirová účinnost proti Herpes simplex viru 1 (HSV – 1) i proti Herpes simplex viru 2 (HSV – 2). (Allahverdiyev et al., 2004) Rozmarýn působí antisepticky a antimikrobiálně. Má vysoký obsah cineolu – klíčové součásti antiseptických léčiv. (WWW.ESENCIALNIOLEJ.CZ) Na silice rozmarýnu a tymiánu je citlivá bakterie Brochothrix thermosphacta, převládající v mikroflóře chlazeného masa baleného v modifikované atmosféře. (Nowak et al., 2012) Rozmarýn také vykazuje silný antimikrobiální účinek vůči Listeria monocytogenes. (Tajkarimi et al., 2010)

34

3 CÍL PRÁCE Cílem této diplomové práce je zpracovat literární rešerši, v níţ budou zahrnuty poznatky o kvasinkách a jejich významu v mlékařství a antimikrobiálním působení účinných látek z rostlin. Zaměřit se na kvasinky působící kaţení mléka a mléčných výrobků, charakterizovat významné kvasinky a produkty jejich metabolismu a

charakterizovat

opatření

v boji

proti

kvasinkám.

Cílem

praktické

části

je experimentálně stanovit antimikrobiální působení vybraných látek a získaná data zpracovat a vyhodnotit.

35

4 MATERÍÁL A METODIKA V praktické části diplomové práce byly pouţity Petriho misky z mikrobiologických rozborů vzorků mléka a sýrů, které pocházely z farmových chovů nebo z obchodní sítě. Jednalo se o sedm mlék kravských, čtyři mléka kozí, jedno mléko ovčí a dva sýry. Nejprve byla provedena identifikace kvasinek. Antimikrobiální vliv účinných látek z rostlin byl testován pomocí diskové difúzní metody a metody zřeďování v bujónu.

4.1 Charakteristika materiálu Tab. č. 5: Kódy vzorků určených pro mikrobiologický rozbor. Popis vzorku

Kód vzorku mléko/sýr

původ

13 MFb

Kozí mléko

Farma Čelechovice

13 MFa

Kozí mléko

Farma Čelechovice

14 MF

Kozí mléko

Farma Račice

3 MF

Kozí mléko

Farma Šošůvka

1S

Balkánský sýr

10 MFa

Kravské mléko

ZD Senice

1 MF

Kravské mléko

ŠZP Ţabčice

2 MF

Kravské mléko

10 MFb

Kravské mléko

6 MFb

1 MK

Kravské mléko pasterované Selské mléko plnotučné pasterované - kravské

Ústav technologie potravin MENDELU

Farma Hrušová – Vysoké Mýto ZD Senice Farma Valašská Bystřice

Farma Radonice

2S

Sýr Čedar

Kanada

15 MFa

Ovčí mléko

Farma Brníčko

6 MFa

Kravské mléko pasterované

Farma Valašská Bystřice

36

U vzorků mléka a sýrů byl proveden mikrobiologický rozbor, ze kterého byly pro diplomovou práci pouţity Petriho misky s narostlými kvasinkami a plísněmi, které se při rozboru kultivovaly při teplotě 25 oC po dobu 120 h. Silice pouţité pro testování antimikrobiální aktivity byly zakoupeny od firem Manipura (meduňka a tymián) a Míča a Harašta s.r.o. (rozmarýn). .

4.2 Izolace kvasinek Pro izolaci kvasinek z mikrobiologického rozboru bylo pouţito ţivné médium Chloramphenicol glucose agar (Biokar Diagnostics, Francie). Z Petriho misky byla vyţíhanou bakteriologickou kličkou odebrána jedna kolonie, která byla metodou kříţového roztěru přenesena na Petriho misku s ţivným médiem. Celkově byly provedeny tři kříţové roztěry pro přečištění izolované kvasinky. Petriho misky s kříţovými roztěry byly vţdy kultivovány při teplotě 25 oC po dobu 120 h. Chloramphenicol glukose agar; sloţení [g/l]: - kvasničný extrakt

5,0

- glukóza

20,0

- chloramphenicol

0,1

- bakteriologický agar o

- konečné pH (při 25 C)

15,0 6,6 ± 0,2

4.3 Identifikace kvasinek Identifikace kvasinek byla provedena pomocí diagnostické soupravy CANDIDAScreen (Erba Lachema, Česká republika), která je určena pro screeningové rozlišení nejčastěji se vyskytujících klinicky významných druhů kvasinek. CANDIDA-Screen je umístěn v jamkách jednostripové mikrotitrační destičky.

37

Souprava CANDIDA-Screen obsahuje: - Jednostripové mikrotitrační destičky se sušidlem, 3 ks. - Návod a kódová kniha (Code book). - 3 PE sáčky pro inkubaci. - Sáček na uloţení nespotřebované destičky. - Barevná škála pro soupravu CANDIDA-Screen. - Formulář pro záznam výsledků. - Víčko. Pouţité potřeby pro práci se soupravou CANDIDA-Screen: - Petriho misky s Chloramphenicol glucose agar. - Parafinový olej sterilizovaný. - Zkumavky se sterilním nepufrovaným fyziologickým roztokem. - Přístroj Densitometr typ DEN-1B od firmy BIOSAN. - Vortex V1 plus od firmy BIOSAN. - Automatická mikropipeta o objemu 10 – 100 ml. - Termostat 25 – 30 oC. - Běţné laboratorní mikrobiologické vybavení (kličky, popisovače, kahan). Příprava inokula: Z čisté, dobře narostlé, 48 hodinové kultury byla připravena v nepufrovaném sterilním fyziologickém roztoku mikrobiální suspenze o hustotě zákalu 3 o McFarlanda. Příprava destičky CANDIDA-Screen: Po odstřihnutí strany aluminiového sáčku byla vyjmuta destička. Příslušný počet stripů mikrotitrační destičky byl oddělen a stripy byly vloţeny do rámečku.

Inokulace: 100 µl suspenze bylo inokulováno ve fyziologickém roztoku do jamek stripu. Nainokulované jamky byly převrstveny 3 – 4 kapkami parafinového oleje.

38

Inkubace: Takto připravené mikrotitrační destičky byly vloţeny do inkubačního PE sáčku a konec sáčku byl zahnut pod destičku tak, aby nedocházelo k vysychání inokula. Inkubace probíhala v termostatu nastaveném na teplotu 25 oC po dobu 24 h. Hodnocení: Po 24 hodinách bylo provedeno zhodnocení reakcí. Testy byly odečteny a zaznamenány (Obr. č. 5).

4.4 Disková difúzní metoda Antimikrobiální účinky silic byly testovány diskovou difúzní metodou a metodou zřeďování v bujónu. Pro diskovou difúzní metodu bylo pouţito ţivné médium Chloramphenicol glucose agar. Z čerstvé 48 hodinové kultury byla připravena ve fyziologickém roztoku suspenze o zákalu 1 o McFarlanda. 0,1 ml suspenze byl napipetován na Petriho misku se zatuhlým ţivným médiem a rozetřen sterilní skleněnou tyčinkou (,,hokejkou“). Pro testování antimikrobiální aktivity byly připraveny dvě koncentrace silic – 1 % a 10 %, a pro jejich zředění byl pouţit metanol, který slouţil také jako kontrola citlivosti kvasinek na rozpouštědlo. Na sterilní disky o průměru 9 mm bylo napipetováno 30 µl silice o příslušné koncentraci. Disky napuštěné silicí (metanolem) byly po třech pokladeny na zaočkovanou Petriho misku. Pro kaţdou koncentraci silice byly pro jednu kvasinku pouţity dvě Petriho misky, tj. celkem bylo pouţito 6 disků se silicí. Kultivace probíhala při teplotě 25 oC po dobu 120 h. Po kultivaci byly odečteny průměry inhibičních zón v mm a vyhodnocena účinnost silice.

4.5 Metoda zřeďování v bujónu Pro účely testování antimikrobiální aktivity silic (éterických olejů) byly zkumavky naplněny 5 ml TSB, zaočkovány 500 µl 48 hodinové kultury a následně doplněny o silice. Antimikrobiální aktivita silic byla testována při dvou koncentracích – 1% a 10 %. Zkumavky byly po dobu měření inkubovány při teplotě 25 oC. Od zaočkování

39

byla na přístroji NanoPhotometerTM Pearl (Implen, Germany) po 2, 4, 6 a 24 hodinách sledována změna absorbance při 550 nm. Kaţdá zkumavka byla provedena ve 2 opakováních a měřena dvakrát. Jako kontrola slouţily zkumavky s médiem a inokulem bez silic, dále inokulované zkumavky s metanolem. TSB (Biokar Diagnostics, Francie); sloţení [g/l]: - trypton

17,0

- sojová moučka natrávená papainem

3,0

- glukóza

2,5

- kys. fosforečná

2,5

- chlorid sodný

5,0

- konečné pH (při 25 oC)

7,3 ± 0,2

40

5 VÝSLEDKY A DISKUZE Vliv účinných látek z rostlin na kvasinky byl po identifikaci narostlých druhů kvasinek prováděn diskovou difúzní metodou a metodou zřeďování v bujónu. Výsledky jsou uvedeny v následujících tabulkách, obrázcích a částečně jsou také dokumentovány na fotografiích.

5.1 Identifikace kvasinek Podle tabulky barevných reakcí v testu CANDIDA-Screen byly vyhodnoceny pozitivní ( + ) a negativní ( - ) reakce. Dané vyhodnocení bylo zapsáno do formuláře na záznam výsledků. Výsledky byly zadány do identifikačního softwaru TNW 7.0. Po zadání pozitivních a negativních reakcí software identifikoval danou kvasinku. Identifikace kvasinek z vybraných izolátů je uvedena v tabulce č. 6.

Obr. č. 5.: Identifikace kvasinek pomocí diagnostické soupravy CANDIDA-Screen.

41

Tab. č. 6: Identifikace kvasinek z vybraných izolátů. Kód vzorku

Identifikovaná kvasinka

1 MF

Candida kefyr

1S

Candida guilliermondii

15 MFa

Candida lipolytica

10 MFa

Candida kefyr

6 MFa

Candida guilliermondii

1 MK

Candida lipolytica

6 MFb

Candida lipolytica

10 MFb

Candida kefyr

14 MF

Candida guilliermondii

2 MF

Candida albicans

3 MF

Candida albicans

5.2 Disková difúzní metoda Za účelem stanovení antimikrobiálního působení silic byly k diskové difúzní metodě pouţity následující identifikované druhy kvasinek: - Candida kefyr (izolovaná ze vzorku 1 MF – kravské mléko, ŠZP Ţabčice ). - Candida guilliermondii (1 S – balkánský sýr, Ústav technologie potravin MENDELU). - Candida lipolytica (15 MFa – ovčí mléko, farma Brníčko). - Candida kefyr (10 MFa – kravské mléko, ZD Senice ). - Candida guilliermondii (6 MFa – kravské mléko pasterov., farma Valašská Bystřice). - Candida lipolytica (1 MK – selské mléko plnotučné pasterované, farma Radonice). Dále byly pouţity čisté kultury Candida tropicalis CCM 8223 a Saccharomyces cerevisiae CCM 8191. Antimikrobiální působení silic po 120 hodinové kultivaci je vyjádřeno v tabulce č. 7, kde jsou jednotlivé zóny inhibice vypočítány v průměru a uvedeny v mm. Při hodnocení je počítáno s tím, ţe musí být odečten vliv kontroly. U vzorků, kde nebyl prokázán inhibiční účinek, se do průměru započítal průměr jednoho disku, který odpovídá hodnotě 9 mm. Jednalo se tak pouze u druhu Candida tropicalis CCM 8223, u kterého

42

nebylo antimikrobiální působení příslušných látek prokázáno ve dvou případech, a to při aplikaci rozmarýnu o koncentraci 1 % a u kontroly metanolem. Tab. č. 7: Antimikrobiální účinek silic na vybrané druhy kvasinek. (zóny inhibice uvedeny v mm) Druh kvasinky

koncentrace silice

tymián

rozmarýn

meduňka

Candida kefyr

1%

11,5

10,5

11,66

(1 MF)

10,3 10 %

18,5

10,33

Inhibován růst na celé misce

1%

11,33

9,66

11,66

10 %

Inhibován růst na celé misce

11

Inhibován růst na celé misce

1%

11,5

10,5

10,5

(15 MFa)

10 %

Inhibován růst na celé misce

10,6

Inhibován růst na celé misce

Candida kefyr

1%

10,5

10,5

10,33

Candida guilliermondii (1 S) Candida lipolytica

(10 MFa) Candida guilliermondii (6 MFa) Candida lipolytica

10,16

11,5

9,5 10 %

Inhibován růst na celé misce

10,5

Inhibován růst na celé misce

1%

10,66

9,33

10 %

Inhibován růst na celé misce

9,83

Inhibován růst na celé misce Inhibován růst na celé misce

1%

11,33

11,66

10 Inhibován růst na celé misce

9,83

Inhibován růst na celé misce

1%

10,83

9

9,66

CCM 8223

10 %

Inhibován růst na celé misce

11,33

Inhibován růst na celé misce

Saccharomyces cerevisiae

1%

10,83

11

11

10

Inhibován růst na celé misce

Candida tropicalis

10,83

9,83

10 %

(1 MK)

kontrola metanolem

9

9,66 CCM 8191

10 %

32,3

43

Z výsledků je patrno, ţe meduňková silice o koncentraci 10 % vykazovala silný inhibiční účinek u všech testovaných kvasinek. Příkladem můţe být reakce vůči Candida kefyr (izolované ze vzorku 1 MF – kravské mléko, ŠZP Ţabčice) na obrázku č. 6, kde je patrná inhibice růstu kvasinky na celé misce. Vysokou inhibiční aktivitu meduňky u diskové difúzní metody popisuje i Araujo et al. (2003), kdy po aplikaci meduňkové silice došlo ke kompletní inhibici růstu všech druhů testovaných kvasinek Torulaspora delbrueckii, Zygosaccharomyces bailii, Pichia membranifaciens, Dekkera anomala a Yarrowia lipolytica. Ve své studii dále uvádějí, ţe hlavní antimikrobiální sloţkou meduňkové silice je citral. Při 1 % koncentraci meduňková silice vykazovala po odečtení vlivu metanolu (kontrola) jen minimální inhibiční účinky nebo nepůsobila vůbec.

Obr. č. 6: Antimikrobiální aktivita meduňky při 10 % koncentraci vůči Candida kefyr. Velmi podobné výsledky byly zjištěny u tymiánové silice. Při koncentraci 10 % byl prokázán silný inhibiční účinek u testovaných kvasinek s výjimkou Candida kefyr (1 MF), u níţ, jak je znázorněno na obrázku č. 7, byl zjištěn slabý účinek. O něco slabší, ale ještě dostatečně silný, byl účinek na sbírkový kmen Saccharomyces cerevisiae CCM 8191. V koncentraci 1 % byl inhibiční účinek u všech kvasinek minimální.

44

Obr. č. 7: Antimikrobiální aktivita tymiánu při 10 % koncentraci vůči Candida kefyr. U všech testovaných vzorků kvasinek byl zjištěn minimální inhibiční účinek u obou koncentrací rozmarýnové silice. Kontroly inhibice metanolem vykazovaly minimální účinky na kvasinky, coţ je patrné na obrázku č. 8, kde je testován vliv vůči Candida lipolytica (izolované ze vzorku 15 MFa – ovčí mléko, farma Brníčko) Výše uvedené rozměry inhibičních zón byly zjišťovány po 120 hodinové kultivaci, proto mohou být ovlivněny odpařením silice v průběhu kultivace. Z výše uvedených výsledků vyplývá, ţe aţ na výjimky byl větší inhibiční účinek silic prokázán při aplikaci vyšších koncentrací, coţ koresponduje se studií Cwikové et al. (2010), ve které se uvádí, ţe inhibiční účinek na jednotlivé skupiny mikroorganismů nezávisí na jednotlivých podílech koření, ale na pouţitých koncentracích. Antimikrobiálním účinkem koření pomocí difúzní metody se zabývá i studie Arory a Kaura (1999), která uvádí, ţe kvasinkové kultury jsou citlivé na extrakty z hřebíčku a česneku.

45

Obr. č. 8: Kontrola metanolem u Candida lipolytica.

5.3 Metoda zřeďování v bujónu Antimikrobiální účinek vybraných druhů silic na jednotlivé kvasinky, včetně kontroly růstu a kontroly metanolem je vyjádřen v obrázcích dané kapitoly. Obrázky znázorňují medián a střední chybu průměru pro jednotlivé vzorky. Kódy silic jsou pro přehlednost vyjádřeny v tabulce č. 8. Vzhledem k horší rozpustnosti silic s tekutou ţivnou půdou bylo měření absorbance mnohdy problematické. Absorbance mohou být ovlivněny růstem kvasinky a reakcí na změnu prostředí. Z toho důvodu je v dalším hodnocení upuštěno od porovnávání absorbancí a hodnocení se omezuje pouze na vyjádření, jestli silice potlačují růst mikroorganismů či nikoliv. Nárůst kvasinek byl největší po 24 h ve zkumavkách pro kontrolu růstu, kde byla přítomna jen ţivná půda a kvasinky (Obr. č. 9). K metodě zřeďování v bujónu byly pouţity následující identifikované druhy kvasinek: - Candida kefyr (izolovaná ze vzorku 1 MF – kravské mléko, ŠZP Ţabčice ). - Candida guilliermondii (1 S – balkánský sýr, Ústav technologie potravin MENDELU). - Candida lipolytica (15 MFa – ovčí mléko, farma Brníčko). - Candida kefyr (10 MFa – kravské mléko, ZD Senice ). - Candida guilliermondii (6 MFa – kravské mléko pasterov., farma Valašská Bystřice).

46

- Candida lipolytica (1 MK – selské mléko plnotučné pasterované, farma Radonice). Dále byly pouţity čisté kultury Candida tropicalis CCM 8223 a Saccharomyces cerevisiae CCM 8191.

Obr. č. 9: Kontrola růstu kvasinek po 24 h. Tab. č. 8: Kódy vzorků znázorněných v obrázcích. Kód vzorku

Druh silice

Koncetrace silice

Barva znázorněna v grafu

TI

Tymián

1%

T II

Tymián

10 %

RI

Rozmarýn

1%

R II

Rozmarýn

10 %

MI

Meduňka

1%

M II

Meduňka

10 %

Kontrola růstu

-

-

Kontrola metanolem

-

-

47

0,3 0,25 TI

Absorbance

0,2

T II RI

0,15

R II 0,1

MI M II

0,05

KR KM

0 0

2

-0,05

4

6

24

Čas měření [h]

Obr. č. 10: Antimikrobiální účinek silic na Candida kefyr (1 MF).

0,2

Absorbance

0,15

TI T II

0,1

RI R II MI

0,05

M II KR 0 0 -0,05

2

4

6

24

Čas měření [h]

Obr. č. 11: Antimikrobiální účinek silic na Candida guilliermondii (1 S).

48

KM

0,2

0,15

Absorbance

TI T II

0,1

RI R II

0,05

MI M II KR

0 0

2

-0,05

4

6

KM

24

Čas měření [h]

Obr. č. 12: Antimikrobiální účinek silic na Candida lipolytica (15 MFa).

0,3 0,25 TI

Absorbance

0,2

T II RI

0,15

R II 0,1

MI M II

0,05

KR KM

0 0 -0,05

2

4

6

24

Čas měření [h]

Obr. č. 13: Antimikrobiální účinek silic na Candida kefyr (10 MFa).

49

0,25 0,2 TI T II

Absorbance

0,15

RI R II

0,1

MI 0,05

M II KR

0

KM 0

2

-0,05

4

6

24

Čas měření [h]

Obr. č. 14: Antimikrobiální účinek silic na Candida guilliermondii (6 MFa).

0,25 0,2 TI T II

Absorbance

0,15

RI R II

0,1

MI 0,05

M II KR

0

KM 0

-0,05

2

4

6

24

Čas měření [h]

Obr. č. 15: Antimikrobiální účinek silic na Candida lipolytica (1 MK).

50

0,3 0,25 TI

Absorbance

0,2

T II RI

0,15

R II 0,1

MI M II

0,05

KR KM

0 0

2

-0,05

4

6

24

Čas měření [h]

Obr. č. 16: Antimikrobiální účinek silic na Candida tropicalis CCM 8223.

0,3 0,25 TI

Absorbance

0,2

T II RI

0,15

R II 0,1

MI M II

0,05

KR KM

0 0 -0,05

2

4

6

24

Čas měření [h]

Obr. č. 17: Antimikrobiální účinek silic na Saccharomyces cerevisiae CCM 8191.

51

I přes stoupající poptávku po tzv. zelených potravinách není doposud příliš informací ohledně vlivu účinných látek z rostlin (silic) na potravinářsky významné kvasinky s výjimkou Candida albicans, jakoţto patogenního druhu. Z výše uvedených výsledků vyplývá, ţe větší nebo menší inhibiční účinek silic byl u metody zřeďování v bujónu prokázán u všech druhů kvasinek. Obecně lze však říci, ţe nejvyšší inhibiční účinek na vybrané druhy kvasinek měla rozmarýnová silice, následovaná silicí meduňkovou. Tymiánová silice měla v porovnání účinek niţší. I přes výkyvy je patrné, ţe lepší inhibiční účinek byl zaznamenán u vyšších koncentrací. Kontroly mohly být ovlivněny růstem kvasinek a reakcí na změnu prostředí (adaptace na tekutou půdu), po 2 – 6 h nastal pokles absorbance. Po 24 hodinách však můţeme pozorovat přizpůsobení novému prostředí, růst kvasinek je normální. Jak uvádí Tajkarimi et al. (2010), kromě výše uvedených silic byl antimikrobiální účinek prokázán i u nového koření, bobkového listu, kmínu, koriandru, oregána a šalvěje. Dle Jayasena a Cheoruna (2013), kteří zkoumali antimikrobiální aktivitu silic v mase a masných produktech, jsou za antimikrobiální aktivitu silic odpovědné fenolické sloučeniny, jako je např. eugenol, karvakrol a thymol. Dále ve své studii uvádějí, ţe antimikrobiální účinky na maso prokázaly silice z oregána, rozmarýnu, tymiánu, zázvoru, bazalky, koriandru a majoránky. I přesto, ţe u metody zřeďování v bujónu byla inhibiční účinnost tymiánové silice v celkovém porovnání s ostatními silicemi niţší, pozitivní účinek na kvasinky byl prokázán. Antimikrobiální účinky silic tymiánu, jak z kultivovaného tak z divoce rostoucího druhu testovali El Bouzidi et al. (2013), kdy u všech testovaných silic byla prokázána silná inhibiční aktivita vůči grampozitivním i gramnegativním bakteriím. V rámci našeho testování vykazoval tymián u metody zřeďování v bujónu silné inhibiční vlastnosti při aplikaci vyšší koncentrace vůči Saccharomyces cerevisiae CCM 8191 v celém průběhu měření, jak můţeme vidět na obrázku č. 17. Ve studii Cwikové et al. (2010) byl diskovou difúzní metodou prokázán vyšší inhibiční účinek u stejného druhu kvasinky při pouţití extraktu hřebíčku. V porovnání s metodou zřeďování v bujónu měl tymián silné inhibiční účinky u diskové difúzní metody při vyšší koncentraci u většiny druhů kvasinek, kdy byl po 120 hodinové kultivaci potlačen jejich růst na celé misce, případně byla prokázána silná inhibiční zóna kolem disků. Podle Bagamboula et al. (2004) je prokázáno, ţe disková difúzní metoda je uţitečná pouze

52

jako kvalitativní prověřovací metoda, kdeţto metoda zřeďování v bujónu nabízí více kvantitativních výsledků. Rozmarýnová silice vykazovala u metody zřeďování v bujónu nejlepší inhibiční účinek v porovnání s ostatními silicemi. Nejlépe působila proti Saccharomyces cerevisiae CCM 8191 (Obr. č. 17), kdy zejména po 24 hodinách můţeme pozorovat téměř úplnou inhibici u dané kvasinky. Slabší antimikrobiální účinky však daná silice měla u diskové difúzní metody, coţ mohlo být způsobeno délkou inkubace, kdy mohlo dojít k vypařování silice a tudíţ její slabší aktivitě. Studie Jianga et al. (2011) prokázala pozitivní antimikrobiální účinek rozmarýnu nejen proti testovaným grampozitivním a gramnegativním bakteriím, ale také výraznou inhibiční aktivitu proti kvasince Candida albicans, která jak uvádí Sládková a Hlaváčová (2011), je nejvíce patogenním druhem rodu Candida. Účinek rozmarýnové a tymiánové silice popisuje ve své studii Nowak et al. (2012), kde je popsán antimikrobiální účinek vůči bakterii Brochothrix thermosphacta, převládající v mikroflóře chlazeného masa baleného v modifikované atmosféře. Problémem v dané studii však bylo najít odpovídající koncentrace silic tak, aby měly poţadované účinky a zároveň nezhoršovaly organoleptické vlastnosti. Podle Tajkarimiho et al. (2010) vykazuje rozmarýnová silice silný antimikrobiální účinek vůči Listeria monocytogenes. Meduňková silice vykazovala u metody zřeďování v bujónu vysokou antimikrobiální účinnost zejména po 24 hodinách, kdy se dalo předpokládat přizpůsobení na nové prostředí (tekutou půdu). Největší inhibiční účinky měla koncentrace 10 % po 24 h na kvasinky Candida kefyr (izolované ze vzorku 1 MF – kravské mléko, ŠZP Ţabčice), Candida lipolytica (izolované ze vzorku 15 MFa – ovčí mléko, farma Brníčko) Candida kefyr (izolované ze vzorku 10 MFa – kravské mléko, ZD Senice) a Saccharomyces cerevisiae CCM 8191, coţ můţeme postupně pozorovat na obrázcích č. 10, 12, 13 a 17. Vůbec nejlepší účinky ze všech testovaných silic měla 10 % koncentrace u diskové difúzní metody, kdy byl potlačen růst u všech druhů kvasinek. Antimikrobiální aktivitou meduňkové silice se ve své studii zabývali Allahverdiyev et al. (2004), kteří na základě předchozích studií, kdy byla u extraktů z meduňky prokázána inhibice syntézy bílkovin a projevena antivirová účinnost proti Herpes simplex viru 1 prokázali, ţe meduňková silice inhibuje i Herpes simplex virus 2. Antimikrobiální účinek silic včetně meduňkové a tymiánové vůči plísňové kontaminaci semene pšenice popisuje Sumalan et al. (2013), kdy nejvyšší inhibiční aktivita byla prokázána proti rodu Fusarium a Aspergillus

53

po 5 dnech léčby, coţ je v souladu s výsledky inhibiční aktivity u diskové difúzní metody této diplomové práce, kdy dané silice po 5 dnech kultivace při vyšší koncentraci rovněţ vykazovaly vysoký inhibiční účinek. Inhibiční účinek silic můţe být posílen i jejich kombinací. Jak uvádí ve své studii Gutierrez et al. (2008), kombinací oregána s šalvějí nebo tymiánem byla účinnost vůči testovaným patogenům (Bacillus cereus, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa) větší, neţ kdyţ byly silice testovány odděleně. Dále byla v dané studii účinná kombinace silic majoránky s tymiánem ve směsi s bazalkou, rozmarýnem nebo šalvějí proti Listeria monocytogenes. Vzhledem k prokázaným inhibičním účinkům se jeví pouţití silic proti kvasinkám v potravinářství jako perspektivní za podmínek, ţe nedojde působením silic ke změně organoleptických vlastností potravin.

54

6 ZÁVĚR V praktické části diplomové práce, zabývající se antimikrobiálním působením účinných látek z rostlin na kvasinky, byla u většiny identifikovaných druhů kvasinek ve větší či menší míře antimikrobiální aktivita prokázána. Pro experimentální stanovení byl vliv účinných látek z rostlin (silic) na kvasinky zkoumán diskovou difúzní metodou a metodou zřeďování v bujónu. Výsledky jednotlivých metod se liší. Je to dáno především rozdílnou metodikou, kdy u diskové difúzní metody byly kvasinky inkubovány po dobu 120 hodin, kdeţto u metody zřeďování v bujónu 24 hodin. Kvasinky totiţ rostou pomaleji, zatímco s přibývajícím časem můţe silice ztrácet na síle vypařením, tudíţ můţe mít s odstupem času niţší inhibiční účinek. Při pouţití diskové difúzní metody, kde byly měřeny inhibiční zóny po nanesení jednotlivých druhů silic vţdy ve dvou koncentracích (1 % a 10 %), bylo porovnáváním průměrných výsledků zjištěno, ţe:

- Největší inhibiční účinek byl zaznamenán u meduňkové silice o koncentraci 10 %, kdy byl u všech druhů kvasinek potlačen jejich růst.

- Nejniţší inhibiční aktivitu při koncentraci 10 % vykazovala rozmarýnová silice. -

Při koncentraci 1 % byl zjištěn jen minimální nebo dokonce ţádný inhibiční účinek.

U metody zřeďování v bujónu byla měřena absorbance jednotlivých vzorků nanospektrofotometrem. Do vzorků s tekutou ţivnou půdou byly silice nanášeny vţdy ve dvou koncentracích (1 % a 10 %). Vzhledem k horší rozpustitelnosti silic s tekutou ţivnou půdou bylo měření absorbance mnohdy problematické. Z toho důvodu se spíše neţ porovnávání absorbancí hodnotilo, jestli silice potlačují růst kvasinek či nikoliv. Z hodnocení jednotlivých obrázků vyplývá, ţe: -

Vyšší či niţší pozitivní inhibiční účinek byl prokázán u všech druhů silic, přičemţ lépe dle očekávání působily silnější koncentrace silic.

-

Obecně lze říci, ţe nejlepší účinky u dané metody měla rozmarýnová silice, následována silicí meduňkovou. Tymiánová silice měla v porovnání inhibiční účinek niţší.

55

Vzhledem k prokázaným inhibičním účinkům lze konstatovat, ţe pouţití silic proti kvasinkám v potravinářství se jeví jako perspektivní za podmínek, ţe nedojde působením silic ke změně organoleptických vlastností potravin. Do budoucna se tedy dá očekávat, ţe i důsledkem poptávky ve vyspělých zemích po tzv. zelených potravinách bude zájem o účinné látky z rostlin stoupat, coţ by mělo vést také k jejich podrobnějšímu výzkumu.

56

7 SEZNAM POUŢITÉ LITERATURY ALLAHVERDIYEV A., DURAN N., OZGUVEN M., KOLTAS S., 2004: Antiviral activity of the volatile oils of Melissa officinalis L. against Herpes simplex virus type-2. Phytomedicine. Databáze online [cit. 2014-3-19]. Dostupné na: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S094471130400100X ALMANZA A.H., MONTANEZ J.C., AGUILAR –GONZÁLEZ M.A., MARTÍNEZÁVILA C., RODRÍGUEZ-HERRERA R., AGUILAR C.N., 2014: Rhodotorula glutinis as source of pigments and metabolites for food industry. Food Bioscience. Databáze online [cit. 2014-2-24]. Dostupné na: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2212429213000849

ARAUJO C., SOUSA M.J., FERREIRA M.F., LEAO C., 2003: Activity of essential oils from Mediterranean Lamiaceae species against food spoilage yeasts. Journal of Food Protection. Databáze online [cit. 2014-4-10]. Dostupné na: http://apps.webofknowledge.com/full_record.do?product=UA&search_mode=GeneralS earch&qid=6&SID=Y1REeEa7BxQddFCGFWf&page=1&doc=7

ARORA D.S., KAUR J., 1999: Antimicrobial activity of spices. International Journal of Antimicrobial Agents. Databáze online [cit. 2014-4-10]. Dostupné na: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0924857999000746 BÁBÍKOVÁ P., 2010: Vinařská mikrobiologie – pracovní sešit. Mendelova univerzita v Brně, Brno, 58 s. ISBN 978-80-7375-465-5.

BAGAMBOULA C.F., UYTTENDAELE M., DEBEVERE J., 2004: Inhibitory effect of thyme and basil essential oils, carvacrol, thymol, estragol, linalool and p-cymene towards Shigella sonnei and S. flexneri. Food Microbiology. Databáze online [cit. 2014-4-9]. Dostupné na: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0740002003000467

57

BASAŘOVÁ G. et al., 2010: Pivovarství. Vydavatelství VŠCHT Praha, Praha, 863 s. ISBN 978-80-7080-734-7. BENEŠOVÁ M. et al., 2003: Odmaturuj z biologie. Didaktis, Brno, 224 s. ISBN 80-86285-67-7. BÜCHL N.R., SEILER H., 2011: YEASTS AND MOLDS | Yeasts in Milk and Dairy Products. Encyclopedia of Dairy Sciences (Second Edition). Databáze online [cit. 20142-4]. Dostupné na: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123744074004982 BUŇKOVÁ L., DOLEŢALOVÁ M., 2010: Obecná mikrobiologie. Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně, Zlín, 190 s. ISBN 978-80-7318-973-0. CEMPÍRKOVÁ R., ČERMÁK B., 2008: Krmiva konvenční a ekologická. Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, České Budějovice, 326 s. ISBN 978-80-7394-141-3. CWIKOVÁ O., GREGOR T., ŠOTTNÍKOVÁ V., MAŠKOVÁ H.,

2010:

Antimikrobiální aktivita koření. Potravinárstvo. Databáze online [cit. 2014-2-24]. Dostupné na: http://www.potravinarstvo.com/dokumenty/mc_februar_2010/pdf/4/Cwikova.pdf DEÁK T., 2008: Handbook of food spoilage yeasts – 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, 325 s. ISBN 978-1-4200-4493-1. DRAGOUNOVÁ H., 2003: Hodnocení jakosti mléka a mlékárenských výrobků. Česká zemědělská univerzita v Praze a ISV Praha, Praha, 57 s. ISBN 80-86642-24-0. DROBNICOVÁ I., ZEMANOVÁ M., 1991: Návody na cvičenia z biológie kvasiniek. Univerzita Komenského v Bratislave, Bratislava, 68 s. ISBN 80-223-0492-1.

58

DUONGTHINGOC D., GEORGE P., GORCZYCA E., KASAPIS S., 2013: Studies on the viability of Saccharomyces boulardii within microcapsules in relation to the thermomechanical properties of whey protein. Food Hydrocolloids. Databáze online [cit. 2014-2-28]. Dostupné na: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0268005X13002269

EL BOUZIDI L., JAMALI CH.A., BEKKOUCHE K., HASSANI L., WOHLMUTH H., LEACH D., ABBAD A., 2013: Chemical composition, antioxidant and antimicrobial activities of essential oils obtained from wild and cultivated Moroccan Thymus species. Industrial Crops and Products. Databáze online [cit. 2014-3-19]. Dostupné na: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0926669012004414 FOX F.P. et al., 2004: Cheese – chemistry, physics and microbiology. 3rd ed. Elsevier, Amsterdam, 617 s. ISBN 0-12-263652-X. GAJDŮŠEK S., 2003: Laktologie. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Brno, 84 s. ISBN 80-7157-657-3. GAJDŮŠEK S., 1998: Mlékařství II. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Brno, 142 s. ISBN 80-7157-342-6. GÖRNER F., VALÍK L´., 2004: Aplikovaná mikrobiológia poţívatín. Vydavatel´stvo MALÉ CENTRUM, Bratislava, 528 s. ISBN 80-967064-9-7.

GUTIERREZ J., BARRY-RYAN C., BOURKE P., 2008: The antimicrobial efficacy of plant essential oil combinations and interactions with food ingredients. International Journal of Food Microbiology. Databáze online [cit. 2014-2-4]. Dostupné na: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160508001177

GYAWALI R., IBRAHIM S.A., 2012: Impact of plant derivatives on the growth of foodborne pathogens and the functionality of probiotics. Applied Microbiology and Biotechnology. Databáze online [cit. 2014-2-4]. Dostupné na: http://link.springer.com/article/10.1007/s00253-012-4117-x

59

HRUBÝ S., 1984: Mikrobiologie v hygieně výţivy. Avicenum, zdravotnické nakladatelství, Praha, 208 s. 08-083-84. CHLOUPEK O., 2005: Pěstování a kvalita rostlin. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Brno, 181 s. ISBN 80-7157-897-5. JANČA J., ZENTRICH J.A., 1994: Herbář léčivých rostlin – 1. díl. Eminent, Praha, 288 s. ISBN 80-85876-02-7.

JAYASENA D. D., CHEORUN J., 2013: Essential oils as potential antimicrobial agents in meat and meat products: A review. Trends in Food Science & Technology. Databáze online [cit. 2014-4-9]. Dostupné na: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0924224413002033#

JIANG Y., WU N., FU YU-JIE, WANG W., LUO M., ZHAO CHUN-JIAN, ZU YUAN-GANG, LIU XIAO-LEI, 2011: Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oil of Rosemary. Environmental toxicology and pharmacology. Databáze online [cit. 2014-4-9]. Dostupné na: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1382668911000469# KADLEC P., MELZOCH K., VOLDŘICH M. et al., 2009: Co byste měli vědět o výrobě potravin? Technologie potravin. KEY Publishing, Ostrava, 536 s. ISBN 978-80-7418-051-4. KALAČ P., 2003: Funkční potraviny. DONA s.r.o., České Budějovice, 130 s. ISBN 80-7322-029-6. KLABAN V., 2001: Svět mikrobů. Gaudeamus, Hradec Králové, 416 s. ISBN 80-7041-687-4. KOMPRDA T., 2004: Obecná hygiena potravin. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Brno, 146 s. ISBN 80-7157-757-X

60

LAW B.A., 1999: Technology of cheesemaking. Sheffield Academic Press, Sheffield, 322 s. ISBN 1-84127-037-7.

LELIEVELD H.L.M., 2003: Hygiene in food processing. CRC Press, Boca Raton, 392 s. ISBN 0-8493-1212-4.

LIU S.-Q., TSAO M., 2009: Biocontrol of dairy moulds by antagonistic dairy yeast Debaryomyces hansenii in yoghurt and cheese at elevated temperatures. Food Control. Databáze online [cit. 2014-2-17]. Dostupné na: http://www.scopus.com/record/display.url?eid=2-s2.0-63449084548&origin =resultslist&sort=plf-f&src=s&st1=Biocontrol+of+dairy+moulds +by+antagonistic+dairy+yeast+Debaryomyces+hansenii+in+yoghurt+and+cheese+at+e levated+temperatures&sid=C957289D79AB59826B7197F6AC73BF54.WeLimyRvBM k2ky9SFKc8Q%3a140&sot=b&sdt=b&sl=138&s=TITLE-ABSKEY%28Biocontrol+of+dairy+moulds+by+antagonistic+dairy+yeast+Debaryomyces+ hansenii+in+yoghurt+and+cheese+at+elevated+ temperatures%29&relpos=0&relpos=0&citeCnt=12&searchTerm=TITLE-ABSKEY%28Biocontrol+of+dairy+moulds+by+antagonistic+dairy+yeast+Debaryomyces+ hansenii+in+yoghurt+and+cheese+at+elevated+temperatures%29 LUKÁŠOVÁ J. et al., 2001: Hygiena a technologie mléčných výrobků. Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, Brno, 180 s. ISBN 80-7305-415-9.

MARTH E.H., STEELE J.L., 2001: Applied dairy mikrobiology. 2nd ed. Marcel Dekker, New York, 744 s. ISBN 0-8247-0536-X.

MCSWEENEY P.L.H., 2007: Cheese problems solved. CRC Press, Boca Raton, 402 s. ISBN 978-1-4200-4394-5

61

NOWAK A., KALEMBA D., KRALA L., PIOTROWSKA M., CZYZOWSKA A., 2012: The effects of thyme (Thymus vulgaris) and rosemary (Rosmarinus officinalis) essential oils on Brochothrix thermosphacta and on the shelf life of beef packaged in high-oxygen

modified

atmosphere.

Food

Microbiology.

Databáze

online

[cit. 2014-3-19]. Dostupné na: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0740002012001165 PAŘÍKOVÁ et al., 1998: Metodický postup dezinfekce mikroskopických hub v pracovním

prostředí

člověka.

ACTA

HYGIENICA,

EPIDEMIOLOGIA

ET

MICROBIOLOGIA. Příloha č. 2/1998. Státní zdravotní ústav, Praha, 13 s. ISBN 0862-5956 PELIKÁN M., DUDÁŠ F., MÍŠA D., 2004: Technologie kvasného průmyslu. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Brno, 135 s. ISBN 80-7157-578-X.

QUEROL A., FLEET G., 2006: Yeasts in food and beverages. Springer, Berlin, 453 s. ISBN 3-540-28388-9. SLÁDKOVÁ P., HLAVÁČOVÁ J., 2011: Speciální mikrobiologie. Mendelova univerzita v Brně, Brno, 88 s. ISBN 978-80-7375-558-4. SMIT G., 2003: Dairy processing – Improving quality. CRC Press, Boca Raton, 546 s. ISBN 1 85573 676 4.

SUMALAN R.M., ALEXA E., POIANA M.A., 2013: Assessment of inhibitory potential of essential oils on natural mycoflora and Fusarium mycotoxins production in wheat. Chemistry Central Journal. Databáze online [cit. 2014-4-10]. Dostupné na: http://apps.webofknowledge.com/full_record.do?product=UA&search_mode=GeneralS earch&qid=1&SID=Y1REeEa7BxQddFCGFWf&page=1&doc=1 ŠILHÁNKOVÁ

L.,

2002:

Mikrobiologie

pro

potravináře

Nakladatelství Academia, Praha, 363 s. ISBN 978-80-200-1703-1.

62

a

biotechnology.

ŠIPICKÝ M., ŠUBÍK J., 1992: Genetika kvasiniek. VEDA, vydavatel’stvo Slovenskej akademie vied, Bratislava, 312 s. ISBN 80-224-0396-2. ŠUSTOVÁ K., SÝKORA V., 2013: Mlékárenské technologie. Mendelova univerzita v Brně, Brno, 223 s. ISBN 978-80-7375-704-5.

TAJKARIMI M.M., IBRAHIM S.A., CLIVER D.O., 2010: Antimicrobial herb and spice compounds in food. Food Control. Databáze online [cit. 2014-3-19]. Dostupné na: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0956713510000459

TAMIME A.Y., 2006: Fermented Milks. Blackwell Publishing, Oxford, 262 s. ISBN 0-632-06458-7. TEUBNER CH., 1990: Sýry – Velká encyklopedie. Perfekt, Bratislava, 256 s. ISBN 80-8046-101-5.

THRUNE M., BACH A., RUIZ-MORENO M., STERN M.D., LINN J.G. 2009: Effects of Saccharomyces cerevisiae on ruminal pH and microbial fermentation in dairy cows: Yeast supplementation on rumen fermentation. Livestock Science. Databáze online [cit. 2014-2-24]. Dostupné na: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1871141309000584 VALÍČEK P., 2003: Léčivé rostliny a omamné drogy. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Brno, 96 s. ISBN 80-7157-725-1.

63

VANHEE L.M.E., GOEMÉ F., NELIS H.J., COENYE T., 2010: Quality control of fifteen probiotic products containing Saccharomyces boulardii. Journal of Applied Microbiology. Databáze online [cit. 2014-2-24]. Dostupné na: http://www.scopus.com/record/display.url?eid=2-s2.0-78650438674&origin= resultslist&sort=plf-f&src=s&st1=Quality+control+of+fifteen+probiotic +products+containing+Saccharomyces+boulardii&sid= 50B7CDFB39EAF04B4A6B2CBABF2A2C50.fM4vPBipdL1BpirDq5Cw%3a230&sot =b&sdt=b&sl=95&s=TITLE-ABS-KEY%28Quality+control+of+fifteen+ probiotic+products+containing+Saccharomyces+boulardii%29&relpos=0&relpos=0&ci teCnt=6&searchTerm=TITLE-ABS-KEY%28Quality+control+of+fifteen+probiotic+ products+containing+Saccharomyces+boulardii%29 VELÍŠEK J., HAJŠLOVÁ J., 2009: Chemie potravin 2. OSSIS, Havlíčkův Brod, 644 s. ISBN 978-80-86659-16-9. VLKOVÁ E., RADA V., KILLER J., 2009: Potravinářská mikrobiologie. Česká zemědělská univerzita v Praze, Praha, 168 s. ISBN 978-80-213-1988-2. VONÁŠEK F., TREPKOVÁ E., NOVOTNÝ L., 1987: Látky vonné a chuťové. SNTL – Nakladatelství technické literatury, Praha, 440 s. 04-810-87. WALSTRA P., WOUTERS J.T., GEURTS T.J., 2006: Dairy Science and Technology – Second Edition. Taylor and Francis, Boca Raton, 782 s. ISBN 0-8247-2763-0.

WEERAKKODY N.S, CAFFIN N., TURNER M.S., DYKES G.A., 2009: In vitro antimicrobial activity of less-utilized spice and herb extracts against selected food-borne bacteria. Food Control. Databáze online [cit. 2014-2-4]. Dostupné na: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0956713510001301

64

ZHOU HAI-XIANG, XU JIN-LI, CHI Z., LIU GUANG-LEI, CHI ZHEN-MING, 2013: ß-Galactosidase over-production by a mig1 mutant of Kluyveromyces marxianus KM for efficient hydrolysis of lactose. Biochemical Engineering Journal. Databáze online [cit. 2014-2-24]. Dostupné na: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X13001149 Vyhláška č. 77/2003 Sb. v aktuálním znění, kterou se stanoví poţadavky pro mléko a mléčné výrobky, mraţené krémy a jedlé tuky a oleje. WWW.ESENCIALNIOLEJ.CZ Databáze online [cit. 2014-3-19]. Dostupné na: http://www.esencialniolej.cz/produkty/smesi-oleju/thieves-_zlodeji_ WWW.VSCHT.CZ Databáze online [cit. 2014-3-17]. Dostupné na: https://www.vscht.cz/obsah/fakulty/fpbt/ostatni/miniatlas/mikr.htm

65

8 SEZNAM TABULEK A OBRÁZKŮ

8.1 Seznam tabulek Tab. č. 1: Minimální inhibiční koncentrace etanolu na růst kvasinek. (Deák, 2008)…..20 Tab. č. 2: Poţadavky na mléčné výrobky a druhy mikroorganismů mléčného kysání. (Vyhláška č. 77/2003 Sb. v aktuálním znění)…………………………………………..21 Tab. č. 3: Výskyt Debaryomyces hansenii ve vybraných sýrech s modrou plísní. (Fox et al., 2004)………………………………………………………………………..24 Tab. č. 4: Účinek čistících látek na jednotlivá znečištění. (Gajdůšek, 1998)…………..29 Tab. č. 5: Kódy vzorků určených pro mikrobiologický rozbor………………………...36 Tab. č. 6: Identifikace kvasinek z vybraných izolátů…………………………………..42 Tab. č. 7: Antimikrobiální účinek silic na vybrané druhy kvasinek. (zóny inhibice uvedeny v mm)……………………………………………….43 Tab. č. 8: Kódy vzorků znázorněných v obrázcích…………………………………….47

8.2 Seznam obrázků Obr. č. 1: Yarrowia lipolytica, kolonie na sladinovém agaru po 3 týdnech při 25 oC. (WWW.VSCHT.CZ/obsah/fakulty/fpbt/ostatni/miniatlas/yarro.htm)............................17 Obr. č. 2: Saccharomyces boulardii. (WWW.GUTMICROBIOTAFORHEALTH.COM/s/saccharomyces-boulardii-does-notprevent-relapse-of-crohns-disease)..................................................................................18

66

Obr. č. 3: Kefírová zrna. (WWW.KEFIRGRAINS.INFO/?tag=kefir-grains)................22 Obr. č. 4: Reblochon. (WWW.GRETAGARBURE.COM /tag/reblochon/)…………...23 Obr. č. 5.: Identifikace kvasinek pomocí diagnostické soupravy CANDIDA-Screen…41 Obr. č. 6: Antimikrobiální aktivita meduňky při 10 % koncentraci vůči Candida kefyr…………………………………………………………………………..44 Obr. č. 7: Antimikrobiální aktivita tymiánu při 10 % koncentraci vůči Candida kefyr..45 Obr. č. 8: Kontrola metanolem u Candida lipolytica…………………………………..46 Obr. č. 9: Kontrola růstu kvasinek po 24 h…………………………………………….47 Obr. č. 10: Antimikrobiální účinek silic na Candida kefyr (1 MF)…………………….48 Obr. č. 11: Antimikrobiální účinek silic na Candida guilliermondii (1 S)……………..48 Obr. č. 12: Antimikrobiální účinek silic na Candida lipolytica (15 MFa)……………..49 Obr. č. 13: Antimikrobiální účinek silic na Candida kefyr (10 MFa)………………….49 Obr. č. 14: Antimikrobiální účinek silic na Candida guilliermondii (6 MFa)…………50 Obr. č. 15: Antimikrobiální účinek silic na Candida lipolytica (1 MK)……………….50 Obr. č. 16: Antimikrobiální účinek silic na Candida tropicalis CCM 8223…………...51 Obr. č. 17: Antimikrobiální účinek silic na Saccharomyces cerevisiae CCM 8191…...51

67

9 PŘÍLOHY Příloha 1: Přehled naměřených výsledků u diskové difúzní metody. (zóny inhibice uvedeny v mm) Druh

koncentrace

kvasinky

silice

Candida kefyr (1 MF)

Candida

1%

10 %

1%

guilliermondii (1 S)

10 %

Candida

1%

lipolytica (15 MFa)

Candida kefyr (10 MFa)

Candida

10 %

1%

10 %

1%

guilliermondii (6 MFa)

10 %

Candida

1%

lipolytica (1 MK)

10 %

Candida

1%

tropicalis CCM 8223

10 %

Saccharomyces

1%

cerevisiae CCM 8191

10 %

tymián

rozmarýn

meduňka

11, 12, 12,

11, 10, 10,

11, 11, 11,

11, 11, 12.

11, 11, 10.

12, 12, 13.

19, 19, 21,

10, 10, 11,

17, 17, 18.

10, 10, 11.

Inhibován růst na celé misce

11, 11, 12,

11, 9, 9,

10, 11, 12,

11, 11, 12.

9, 9, 11.

12, 13, 12.

Inhibován růst na celé misce

11, 10, 12, 11, 10, 12.

Inhibován růst na celé misce

13, 10, 12,

9, 9, 10,

9, 9, 14,

12, 12, 10.

10, 9, 16.

9, 9, 13.

Inhibován růst na celé misce

9, 9, 15, 9, 11, 11.

Inhibován růst na celé misce

10, 10, 10,

9, 11, 10,

9, 10, 12,

11, 10, 12.

12, 11, 10.

11, 10, 10.

Inhibován růst na celé misce

9, 10, 10,

Inhibován růst na celé misce

10, 11, 12,

9, 9, 10,

10, 10, 11.

9, 9, 10.

12, 11, 11.

Inhibován růst na celé misce Inhibován růst na celé misce

Inhibován růst na celé misce

9, 11, 10,

11, 12, 11,

9, 14, 15,

9, 9, 10,

11, 12, 11.

9, 11, 12.

11, 10, 10.

Inhibován růst na celé misce

11, 10, 9, 9, 9, 11.

Inhibován růst na celé misce

10, 10, 11,

9, 9, 9,

10, 9, 11,

12, 11, 11.

9, 9, 9.

10, 9, 9.

Inhibován růst na celé misce

13, 11, 10, 14, 10, 10.

Inhibován růst na celé misce

10, 10, 11,

10, 10, 11,

10, 11, 12,

10, 12, 12.

14, 10, 11.

10, 12, 11.

23, 15, 25,

10, 10, 11,

36, 45, 50.

9, 10, 10.

Inhibován růst na celé misce

9, 10, 10.

68

kontrola metanolem

9, 9, 10, 13, 10, 11.

12, 9, 10, 9, 9, 12.

9, 10, 14, 9, 12, 15.

10, 9, 9, 9, 9, 11.

9, 9, 12, 9, 9, 17.

9, 10, 12, 9, 9, 11.

9, 9, 9, 9, 9, 9.

10, 10, 9, 9, 10, 10.

Příloha 2: Přehled absorbancí naměřených u metody zřeďování v bujónu.

Tymián 1 % - Candida kefyr (1 MF)

MEDIÁN

SMODCH*

0h

0,03

0,029

0,049

0,044

0,037

0,00869

2h

0,058

0,002

0,046

0,047

0,0465

0,02145

4h

0,045

0,02

0,064

0,044

0,0445

0,01561

6h

0,039

0,04

0,041

0,07

0,0405

0,01301

0,027

0,04

0,039

0,033

0,00771

MEDIÁN

SMODCH

24h 0,022 * Směrodatná odchylka

Tymián 1 % - Candida guilliermondii (1 S) 0h

0,046

0,045

0,063

0,087

0,0545

0,01702

2h

0

0,014

0,012

0

0,006

0,00654

4h

0,148

0,151

0,132

0,131

0,14

0,00907

6h

0,058

0,072

0,128

0,111

0,0915

0,02834

24h

0,071

0,063

0,111

0,119

0,091

0,02433

MEDIÁN

SMODCH

Tymián 1 % - Candida lipolytica (15 MFa) 0h

0,08

0,094

0,069

0,08

0,08

0,00887

2h

0,116

0,177

0,145

0,156

0,1505

0,02201

4h

0,098

0,098

0,115

0,147

0,1065

0,02001

6h

0,088

0,064

0,078

0,087

0,0825

0,00963

24h

0,097

0,035

0,093

0,067

0,08

0,02478

Tymián 1 % - Candida kefyr (10 MFa)

MEDIÁN

SMODCH

0h

0,081

0,096

0,099

0,073

0,0885

0,01069

2h

0,061

0,015

0,018

0

0,0165

0,0227

4h

0,139

0,179

0,2

0,148

0,1635

0,02438

6h

0,099

0,115

0,088

0,093

0,096

0,01016

24h

0,072

0,078

0,06

0,06

0,066

0,00779

69

Tymián 1 % - Candida guilliermondii (6 MFa)

MEDIÁN

SMODCH

0h

0,135

0,068

0,062

0,067

0,0675

0,03011

2h

0,032

0,041

0,04

0,046

0,0405

0,00502

4h

0,152

0,171

0,174

0,183

0,1725

0,01129

6h

0,111

0,162

0,173

0,203

0,1675

0,03318

24h

0,107

0,128

0,094

0,166

0,1175

0,02724

MEDIÁN

SMODCH

Tymián 1 % - Candida lipolytica (1 MK) 0h

0,075

0,074

0,077

0,077

0,076

0,0013

2h

0,038

0,022

0,065

0,084

0,0515

0,02392

4h

0,177

0,21

0,234

0,215

0,2125

0,02053

6h

0,14

0,23

0,125

0,147

0,1435

0,04091

24h

0,107

0,131

0,078

0,158

0,119

0,02953

MEDIÁN

SMODCH

Tymián 1 % - Candida tropicalis CCM 8223 0h

0,075

0,097

0,1

0,102

0,0985

0,01083

2h

0,087

0,053

0,093

0,018

0,07

0,03

4h

0,195

0,134

0,135

0,17

0,1525

0,02558

6h

0,192

0,09

0,102

0,199

0,147

0,04999

24h

0,193

0,169

0,092

0,152

0,1605

0,03731

Tymián 1 % - Saccharomyces cerevisiae CCM 8191

MEDIÁN

SMODCH

0h

0,087

0,072

0,072

0,083

0,0775

0,006652

2h

0,008

0,018

0,02

0,031

0,019

0,008166

4h

0,164

0,159

0,185

0,241

0,1745

0,03253

6h

0,138

0,125

0,097

0,095

0,111

0,018349

24h

0,178

0,083

0,142

0,164

0,153

0,036266

70

Rozmarýn 1 % - Candida kefyr (1 MF)

MEDIÁN

SMODCH

0h

0,055

0,06

0,049

0,037

0,052

0,00858

2h

0

0,001

0

0

0

0,00043

4h

0,216

0,157

0,156

0,191

0,174

0,02511

6h

0,052

0,045

0,052

0,045

0,0485

0,0035

24h

0,106

0,115

0,109

0,091

0,1075

0,00884

MEDIÁN

SMODCH

Rozmarýn 1 % - Candida guilliermondii (1 S) 0h

0,039

0,041

0,034

0,034

0,0365

0,00308

2h

0

0,033

0

0,035

0,0165

0,01701

4h

0,162

0,143

0,169

0,121

0,1525

0,01863

6h

0,033

0,021

0,038

0,035

0,034

0,00646

24h

0,086

0,152

0,134

0,129

0,1315

0,02422

Rozmarýn 1 % - Candida lipolytica (15 MFa)

MEDIÁN

SMODCH

0h

0,025

0,021

0,016

0,018

0,0195

0,00339

2h

0,021

0,059

0

0,032

0,0265

0,02127

4h

0,126

0,115

0,104

0,096

0,1095

0,01132

6h

0,027

0,025

0,021

0,024

0,0245

0,00217

24h

0,09

0,164

0,099

0,129

0,114

0,02897

Rozmarýn 1 % - Candida kefyr (10 MFa)

MEDIÁN

SMODCH

0h

0,038

0,014

0,012

0,024

0,019

0,0103

2h

0,068

0,044

0,041

0,016

0,0425

0,01842

4h

0,088

0,108

0,08

0,125

0,098

0,01756

6h

0,023

0,025

0,028

0,027

0,026

0,00192

24h

0,209

0,118

0,196

0,204

0,2

0,0371

71

Rozmarýn 1 % - Candida guilliermondii (6 MFa)

MEDIÁN

SMODCH

0h

0,005

0,001

0

0

0,0005

0,00206

2h

0,001

0

0

0,005

0,0005

0,00206

4h

0,067

0,082

0,075

0,069

0,072

0,00585

6h

0,025

0,031

0,025

0,027

0,026

0,00245

24h

0,035

0,046

0,033

0,026

0,034

0,00718

MEDIÁN

SMODCH

Rozmarýn 1 % - Candida lipolytica (1 MK) 0h

0,001

0,003

0,011

0,016

0,007

0,00606

2h

0,057

0,073

0

0,014

0,0355

0,02996

4h

0,07

0,069

0,077

0,069

0,0695

0,00334

6h

0,016

0,023

0,034

0,041

0,0285

0,00966

24h

0,134

0,097

0,093

0,056

0,095

0,02761

MEDIÁN

SMODCH

Rozmarýn 1 % - Candida tropicalis CCM 8223 0h

0,014

0,016

0,084

0,019

0,0175

0,02935

2h

0,012

0

0,051

0

0,006

0,02093

4h

0,053

0,057

0,048

0,048

0,0505

0,00377

6h

0,041

0,007

0,006

0,014

0,0105

0,0142

24h

0,094

0,09

0,06

0,045

0,075

0,0205

Rozmarýn 1 % - Saccharomyces cerevisiae CCM 8191

MEDIÁN

SMODCH

0h

0,104

0,179

0,135

0,108

0,1215

0,029904

2h

0

0

0

0

0

0

4h

0,046

0,045

0,037

0,038

0,0415

0,004031

6h

0,014

0,011

0,012

0,013

0,0125

0,001118

24h

0,059

0,075

0,054

0,02

0,0565

0,020037

72

Meduňka 1 % - Candida kefyr (1 MF)

MEDIÁN

SMODCH

0h

0,025

0,062

0,013

0,029

0,027

0,01816

2h

0,008

0

0

0

0

0,00346

4h

0,09

0,071

0,078

0,087

0,0825

0,0075

6h

0,023

0,038

0,026

0,033

0,0295

0,00587

24h

0,013

0,021

0,054

0,065

0,0375

0,02179

MEDIÁN

SMODCH

Meduňka 1 % - Candida guilliermondii (1 S) 0h

0,018

0,017

0,023

0,054

0,0205

0,01518

2h

0

0

0

0,016

0

0,00693

4h

0,121

0,126

0,133

0,16

0,1295

0,01505

6h

0,129

0,193

0,148

0,167

0,1575

0,02367

24h

0,072

0,063

0,072

0,1

0,072

0,01392

MEDIÁN

SMODCH

Meduňka 1 % - Candida lipolytica (15 MFa) 0h

0,043

0,044

0,02

0,097

0,0435

0,02824

2h

0,012

0

0

0

0

0,0052

4h

0,117

0,118

0,135

0,123

0,1205

0,00715

6h

0,184

0,12

0,128

0,114

0,124

0,02787

24h

0,123

0,138

0,145

0,124

0,131

0,00934

Meduňka 1 % - Candida kefyr (10 MFa)

MEDIÁN

SMODCH

0h

0,076

0,067

0,103

0,123

0,0895

0,02215

2h

0

0,006

0

0

0

0,0026

4h

0,12

0,127

0,148

0,178

0,1375

0,02255

6h

0,117

0,102

0,115

0,073

0,1085

0,01757

24h

0,047

0,073

0,088

0,086

0,0795

0,01635

73

Meduňka 1 % - Candida guilliermondii (6 MFa)

MEDIÁN

SMODCH

0h

0,058

0,036

0,026

0,027

0,0315

0,01287

2h

0,036

0,036

0,026

0,024

0,031

0,00555

4h

0,133

0,122

0,155

0,156

0,144

0,01453

6h

0,161

0,089

0,157

0,113

0,135

0,03025

24h

0,085

0,037

0,02

0,026

0,0315

0,02556

MEDIÁN

SMODCH

Meduňka 1 % - Candida lipolytica (1 MK) 0h

0,034

0,04

0,045

0,037

0,0385

0,00406

2h

0,044

0,03

0,026

0,034

0,032

0,00669

4h

0,114

0,097

0,123

0,138

0,1185

0,01485

6h

0,107

0,18

0,15

0,16

0,155

0,02668

24h

0,095

0,109

0,122

0,097

0,103

0,0108

MEDIÁN

SMODCH

Meduňka 1 % - Candida tropicalis CCM 8223 0h

0,045

0,036

0,042

0,039

0,0405

0,00335

2h

0,011

0,019

0,045

0,043

0,031

0,01479

4h

0,12

0,168

0,189

0,129

0,1485

0,02818

6h

0,086

0,037

0,055

0,045

0,05

0,01859

24h

0,116

0,116

0,145

0,107

0,116

0,01434

Meduňka 1 % - Saccharomyces cerevisiae CCM 8191

MEDIÁN

SMODCH

0h

0,047

0,03

0,05

0,052

0,0485

0,0087

2h

0,055

0,034

0,018

0,033

0,0335

0,013172

4h

0,235

0,256

0,222

0,255

0,245

0,014265

6h

0,068

0,059

0,06

0,054

0,0595

0,005019

24h

0,095

0,091

0,109

0,097

0,096

0,006708

74

Tymián 10 % - Candida kefyr (1 MF)

MEDIÁN

SMODCH

0h

0,116

0,098

0,078

0,077

0,088

0,016068

2h

0,032

0,05

0,038

0,073

0,044

0,01569

4h

0,132

0,101

0,154

0,073

0,1165

0,0307

6h

0,077

0,095

0,094

0,116

0,0945

0,013829

24h

0,077

0,097

0,14

0,155

0,1185

0,031515

MEDIÁN

SMODCH

Tymián 10 % - Candida guilliermondii (1 S) 0h

0,074

0,101

0,112

0,061

0,0875

0,02041

2h

0,057

0,077

0,062

0,075

0,0685

0,00847

4h

0,11

0,166

0,159

0,047

0,1345

0,04761

6h

0,12

0,119

0,108

0,088

0,1135

0,01287

24h

0,101

0,1

0,132

0,067

0,1005

0,02299

MEDIÁN

SMODCH

Tymián 10 % - Candida lipolytica (15 MFa) 0h

0,127

0,137

0,183

0,113

0,132

0,02625

2h

0,094

0,129

0,098

0,082

0,096

0,01734

4h

0,059

0,038

0,127

0,037

0,0485

0,03672

6h

0,066

0,135

0,058

0,161

0,1005

0,04406

24h

0,1

0,072

0,089

0,129

0,0945

0,02074

MEDIÁN

SMODCH

Tymián 10 % - Candida kefyr (10 MFa) 0h

0,149

0,193

0,167

0,142

0,158

0,0197

2h

0,093

0,104

0,118

0,106

0,105

0,00887

4h

0,018

0,012

0,036

0,056

0,027

0,01717

6h

0,183

0,165

0,215

0,214

0,1985

0,02123

24h

0,176

0,143

0,1

0,073

0,1215

0,03949

75

Tymián 10 % - Candida guilliermondii (6 MFa)

MEDIÁN

SMODCH

0h

0,175

0,141

0,242

0,172

0,1735

0,03684

2h

0,074

0,075

0,122

0,151

0,0985

0,03265

4h

0,05

0,074

0,039

0,075

0,062

0,0155

6h

0,154

0,214

0,147

0,182

0,168

0,02642

24h

0,074

0,03

0,035

0,07

0,0525

0,01988

Tymián 10 % - Candida lipolytica (1 MK)

MEDIÁN

SMODCH

0h

0,224

0,191

0,183

0,197

0,194

0,015401

2h

0,126

0,075

0,09

0,112

0,101

0,019639

4h

0,03

0,069

0,113

0,083

0,076

0,029844

6h

0,177

0,171

0,148

0,121

0,1595

0,022038

24h

0,045

0,037

0,029

0,056

0,041

0,009984

MEDIÁN

SMODCH

Tymián 10 % - Candida tropicalis CCM 8223 0h

0,124

0,185

0,086

0,103

0,1135

0,03743

2h

0,131

0,115

0,097

0,077

0,106

0,02015

4h

0,063

0,087

0,087

0,104

0,087

0,0146

6h

0,044

0,085

0,069

0,099

0,077

0,02044

24h

0,08

0,134

0,05

0,096

0,088

0,0303

MEDIÁN

SMODCH

Tymián 10 % - Saccharomyces cerevisiae CCM 8191 0h

0,1

0,085

0,146

0,143

0,1215

0,026557

2h

0,087

0,095

0,12

0,063

0,091

0,020352

4h

0,068

0,024

0,075

0,054

0,061

0,019562

6h

0,086

0,057

0,077

0,07

0,0735

0,010595

24h

0,055

0,058

0,083

0,113

0,0705

0,023328

76

Rozmarýn 10 % - Candida kefyr (1 MF)

MEDIÁN

SMODCH

0h

0,102

0,124

0,106

0,134

0,115

0,013067

2h

0,053

0,045

0,062

0,017

0,049

0,016843

4h

0,108

0,127

0,102

0,112

0,11

0,00923

6h

0,046

0,039

0,028

0,042

0,0405

0,006685

24h

0,077

0,055

0,058

0,053

0,0565

0,009549

MEDIÁN

SMODCH

Rozmarýn 10 % - Candida guilliermondii (1 S) 0h

0,144

0,127

0,185

0,135

0,1395

0,02233

2h

0,009

0,016

0,062

0,018

0,017

0,02091

4h

0,005

0,017

0,008

0,014

0,011

0,00474

6h

0,048

0,042

0,104

0,111

0,076

0,03142

24h

0,014

0,015

0,028

0,019

0,017

0,00552

MEDIÁN

SMODCH

Rozmarýn 10 % - Candida lipolytica (15 MFa) 0h

0,143

0,104

0,155

0,19

0,149

0,03072

2h

0,017

0,018

0,017

0,008

0,017

0,00406

4h

0,018

0,039

0,021

0,018

0,0195

0,00875

6h

0,045

0,034

0,048

0,057

0,0465

0,00822

24h

0,076

0,04

0,055

0,047

0,051

0,0135

MEDIÁN

SMODCH

Rozmarýn 10 % - Candida kefyr (10 MFa) 0h

0,135

0,155

0,1

0,114

0,1245

0,02087

2h

0,019

0,022

0,039

0,026

0,024

0,00763

4h

0,024

0,038

0,021

0,02

0,0225

0,00722

6h

0,038

0,006

0,002

0,021

0,0135

0,01417

24h

0,014

0,009

0,003

0,011

0,01

0,00402

77

Rozmarýn 10 % - Candida guilliermondii (6 MFa)

MEDIÁN

SMODCH

0h

0,056

0,066

0

0

0,028

0,0307

2h

0,038

0,026

0,031

0,028

0,0295

0,00455

4h

0

0

0

0,001

0

0,00043

6h

0,015

0

0

0,024

0,0075

0,01026

24h

0,01

0,008

0

0,007

0,0075

0,00377

MEDIÁN

SMODCH

Rozmarýn 10 % - Candida lipolytica (1 MK) 0h

0,037

0,032

0,021

0,014

0,0265

0,009028

2h

0,042

0,051

0,031

0,029

0,0365

0,008871

4h

0,007

0,008

0,004

0,022

0,0075

0,006942

6h

0,021

0,021

0,021

0,014

0,021

0,003031

24h

0,1

0,033

0,055

0,077

0,066

0,024934

MEDIÁN

SMODCH

Rozmarýn 10 % - Candida tropicalis CCM 8223 0h

0,006

0,015

0,016

0

0,0105

0,00661

2h

0,031

0,041

0,045

0,022

0,036

0,00895

4h

0,022

0,031

0,01

0,017

0,0195

0,00765

6h

0,03

0,038

0,048

0,036

0,037

0,00648

24h

0,058

0,034

0,022

0,011

0,028

0,01746

MEDIÁN

SMODCH

Rozmarýn 10 % - Saccharomyces cerevisiae CCM 8191 0h

0

0,017

0,016

0,023

0,0165

0,008515

2h

0,018

0,035

0,01

0,021

0,0195

0,009028

4h

0,016

0,021

0,02

0,03

0,0205

0,005117

6h

0

0,009

0,004

0

0,002

0,0037

24h

0

0

0

0,015

0

0,006495

78

Meduňka 10 % - Candida kefyr (1 MF)

MEDIÁN

SMODCH

0h

0,026

0,056

0,081

0,084

0,0685

0,023328

2h

0,034

0,045

0,075

0,08

0,06

0,019474

4h

0,081

0,085

0,119

0,159

0,102

0,031401

6h

0,036

0,049

0,056

0,042

0,0455

0,007496

24h

0,041

0,038

0,018

0,055

0,0395

0,01321

MEDIÁN

SMODCH

Meduňka 10 % - Candida guilliermondii (1 S) 0h

0,018

0,021

0,06

0,091

0,0405

0,03009

2h

0,091

0,063

0,076

0,061

0,0695

0,01201

4h

0,177

0,191

0,124

0,128

0,1525

0,02945

6h

0,043

0,042

0,081

0,111

0,062

0,02878

24h

0,055

0,024

0,091

0,109

0,073

0,0328

MEDIÁN

SMODCH

Meduňka 10 % - Candida lipolytica (15 MFa) 0h

0,124

0,116

0,139

0,16

0,1315

0,01675

2h

0,077

0,103

0,097

0,108

0,1

0,01178

4h

0,13

0,125

0,168

0,113

0,1275

0,02058

6h

0,109

0,075

0,08

0,127

0,0945

0,0213

24h

0,03

0,085

0,028

0,043

0,0365

0,02296

MEDIÁN

SMODCH

Meduňka 10 % - Candida kefyr (10 MFa) 0h

0,191

0,249

0,153

0,197

0,194

0,03419

2h

0,104

0,141

0,093

0,084

0,0985

0,02169

4h

0,099

0,135

0,153

0,136

0,1355

0,01968

6h

0,12

0,098

0,124

0,113

0,1165

0,00991

24h

0,023

0,049

0,048

0,03

0,039

0,01128

79

Meduňka 10 % - Candida guilliermondii (6 MFa)

MEDIÁN

SMODCH

0h

0,255

0,208

0,193

0,212

0,21

0,02305

2h

0,066

0,064

0,06

0,043

0,062

0,00907

4h

0,137

0,129

0,092

0,091

0,1105

0,02094

6h

0,14

0,109

0,156

0,13

0,135

0,01703

24h

0,059

0,06

0,072

0,067

0,0635

0,00532

Meduňka 10 % - Candida lipolytica (1 MK)

MEDIÁN

SMODCH

0h

0,142

0,143

0,198

0,223

0,1705

0,035132

2h

0,06

0,08

0,094

0,055

0,07

0,015658

4h

0,16

0,123

0,119

0,157

0,14

0,018833

6h

0,101

0,136

0,1

0,101

0,101

0,015305

24h

0,073

0,07

0,054

0,066

0,068

0,007224

MEDIÁN

SMODCH

Meduňka 10 % - Candida tropicalis CCM 8223 0h

0,273

0,145

0,141

0,266

0,2055

0,06331

2h

0,078

0,087

0,09

0,104

0,0885

0,00934

4h

0,163

0,122

0,098

0,099

0,1105

0,02635

6h

0,108

0,07

0,092

0,085

0,0885

0,01366

24h

0,06

0,042

0,057

0,047

0,052

0,0073

MEDIÁN

SMODCH

Meduňka 10 % - Saccharomyces cerevisiae CCM 8191 0h

0,09

0,13

0,165

0,081

0,11

0,03353

2h

0,076

0,058

0,078

0,086

0,077

0,010235

4h

0,087

0,103

0,111

0,109

0,106

0,009421

6h

0,099

0,118

0,187

0,099

0,1085

0,036203

24h

0,043

0,036

0,049

0,056

0,046

0,007382

80

Kontrola růstu – Candida kefyr (1 MF)

MEDIÁN

SMODCH

0h

0,036

0

0,082

0,122

0,059

0,04611

2h

0,091

0,086

0,034

0,079

0,0825

0,02263

4h

0,02

0,018

0,005

0,04

0,019

0,01252

6h

0,05

0,075

0,098

0,083

0,079

0,01739

24h

0,121

0,137

0,161

0,164

0,149

0,01771

MEDIÁN

SMODCH

Kontrola růstu – Candida guilliermondii (1 S) 0h

0,179

0,135

0,144

0,157

0,1505

0,01654

2h

0,043

0,047

0,022

0,003

0,0325

0,01764

4h

0,015

0,043

0

0

0,0075

0,01756

6h

0,028

0,046

0,031

0,016

0,0295

0,01069

24h

0,136

0,157

0,166

0,17

0,1615

0,01314

MEDIÁN

SMODCH

Kontrola růstu – Candida lipolytica (15 MFa) 0h

0,057

0,059

0

0,031

0,044

0,02392

2h

0,01

0,012

0,018

0,008

0,011

0,00374

4h

0,003

0,006

0,003

0,01

0,0045

0,00287

6h

0

0,006

0

0,004

0,002

0,0026

24h

0,173

0,176

0,195

0,175

0,1755

0,00887

MEDIÁN

SMODCH

Kontrola růstu – Candida kefyr (10 MFa) 0h

0,047

0,063

0,103

0,02

0,055

0,03006

2h

0,004

0,007

0,003

0,007

0,0055

0,00179

4h

0,006

0,021

0,036

0,002

0,0135

0,01342

6h

0,07

0,027

0,036

0,007

0,0315

0,02277

24h

0,161

0,162

0,16

0,169

0,1615

0,00354

81

Kontrola růstu – Candida guilliermondii (6 MFa)

MEDIÁN

SMODCH

0h

0,025

0

0,059

0,011

0,018

0,0222

2h

0,004

0

0,002

0

0,001

0,00166

4h

0,001

0,002

0,004

0,037

0,003

0,01505

6h

0

0

0

0,013

0

0,00563

24h

0,032

0,023

0,002

0

0,0125

0,01365

MEDIÁN

SMODCH

Kontrola růstu – Candida lipolytica (1 MK) 0h

0,002

0

0

0,006

0,001

0,00245

2h

0,006

0,007

0,002

0,004

0,005

0,00192

4h

0,007

0,041

0,006

0,004

0,0065

0,01534

6h

0,017

0,02

0,032

0,016

0,0185

0,00638

24h

0,175

0,161

0,156

0,15

0,1585

0,00923

MEDIÁN

SMODCH

Kontrola růstu – Candida tropicalis CCM 8223 0h

0,052

0,024

0,035

0,062

0,0435

0,01472

2h

0,02

0,004

0,001

0,006

0,005

0,00729

4h

0

0

0

0

0

0

6h

0,008

0,011

0

0

0,004

0,00487

24h

0,185

0,207

0,175

0,165

0,18

0,01556

Kontrola růstu – Saccharomyces cerevisiae CCM 8191

MEDIÁN

SMODCH

0h

0,126

0,205

0,169

0,111

0,1475

0,036921

2h

0,026

0

0,001

0,001

0,001

0,010977

4h

0

0

0

0

0

0

6h

0

0

0,012

0,003

0,0015

0,004918

24h

0,01

0,068

0,026

0,014

0,02

0,022995

82

Kontrola metanolem – Candida kefyr (1 MF)

MEDIÁN

SMODCH

0h

0,099

0,053

0,025

0,063

0,058

0,02648

2h

0

0,001

0,008

0,003

0,002

0,00308

4h

0,001

0

0

0,005

0,0005

0,00206

6h

0

0,011

0,003

0,007

0,005

0,00415

24h

0,114

0,125

0,169

0,158

0,1415

0,02268

MEDIÁN

SMODCH

Kontrola metanolem – Candida guilliermondii (1 S) 0h

0,068

0

0,05

0,082

0,059

0,03102

2h

0,016

0

0,001

0,001

0,001

0,00665

4h

0,007

0,005

0,02

0,013

0,01

0,00585

6h

0,036

0

0

0

0

0,01559

24h

0,166

0,163

0,163

0,144

0,163

0,00875

MEDIÁN

SMODCH

Kontrola metanolem – Candida lipolytica (15 MFa) 0h

0,033

0,055

0,071

0,085

0,063

0,01934

2h

0,001

0

0,008

0

0,0005

0,00334

4h

0,009

0,01

0

0

0,0045

0,00476

6h

0

0

0

0

0

0

24h

0,156

0,176

0,191

0,147

0,166

0,01715

MEDIÁN

SMODCH

Kontrola metanolem – Candida kefyr (10 MFa) 0h

0,192

0,126

0,252

0,201

0,1965

0,04482

2h

0

0,01

0,022

0,018

0,014

0,00841

4h

0,002

0,007

0,009

0,007

0,007

0,00259

6h

0

0,001

0,013

0

0,0005

0,0055

24h

0,105

0,16

0,142

0,193

0,151

0,03177

83

Kontrola metanolem – Candida guilliermondii (6 MFa)

MEDIÁN

SMODCH

0h

0

0,004

0

0

0

0,00173

2h

0,008

0,003

0

0

0,0015

0,00327

4h

0

0

0

0

0

0

6h

0,04

0

0

0,03

0,015

0,01785

24h

0,044

0,059

0,028

0,03

0,037

0,01246

Kontrola metanolem – Candida lipolytica (1 MK)

MEDIÁN

SMODCH

0h

0,047

0,036

0,061

0,033

0,0415

0,01099

2h

0,02

0,003

0,012

0,012

0,012

0,00602

4h

0,007

0,005

0,011

0,005

0,006

0,00245

6h

0,018

0,023

0,047

0,015

0,0205

0,0126

24h

0,128

0,164

0,197

0,2

0,1805

0,02919

MEDIÁN

SMODCH

Kontrola metanolem – Candida tropicalis CCM 8223 0h

0

0,009

0

0

0

0,0039

2h

0,019

0,012

0,006

0,021

0,0155

0,00594

4h

0,016

0

0

0,006

0,003

0,00654

6h

0

0,005

0

0,009

0,0025

0,00377

24h

0,148

0,14

0,142

0,17

0,145

0,01192

Kontrola metanolem – Saccharomyces cerevisiae CCM 8191

MEDIÁN

SMODCH

0h

0

0

0,032

0,019

0,0095

0,013553

2h

0,006

0,049

0,024

0,008

0,016

0,01721

4h

0,01

0,026

0,021

0,016

0,0185

0,005932

6h

0,003

0,03

0,006

0,042

0,018

0,016346

24h

0,011

0,063

0,06

0,057

0,0585

0,021323

84

Příloha 3: Nanospektrofotometr pro měření absorbance u metody zřeďování v bujónu.

85