Laboratoř buněčné biologie PROJEKT
Mnohobuněčné kvasinky Libuše Váchová
ve spolupráci s laboratoří Prof. Palkové (PřFUK)
Do laboratoře přijímáme studenty se zájmem o vědeckou práci Kontakt:
[email protected]
Modelový organismus: kvasinka Saccharomyces cerevisiae = pekařské droždí Jednobuněčný eukaryotický mikroorganismus: Používán jako model pro studium základních buněčných procesů
JEDNOTLIVÉ KVASINKOVÉ BUŇKY Kvasinky jsou studovány na úrovni jednotlivých buněk ve třepaných kulturách Kultivace za příznivých podmínek
POPULACE KVASINKOVÉ KOLONIE V původním přirozeném ekosystému se kvasinky téměř nevyskytují jako jednotlivé buňky. V přírodě vytvářejí různě složité mnohobuněčné struktury Příklady: Kolonie, biofilmy
Jaké možnosti mohou buňkám poskytnout mnohobuněčné struktury ?
Buňky populace mohou interagovat, komunikovat a synchronizovat vývoj
JEDNOTLIVÉ KVASINKOVÉ BUŇKY
Buňky populace mohou diferencovat a tvořit specializované formy
POPULACE KVASINKOVÉ KOLONIE
Populace se může lépe adaptovat na změny prostředí
Populace může být lépe chráněna před vlivy prostředí
Existují procesy, které jsou specifické pro mnohobuněčné populace
?
O jaké procesy jde
?
2 typy kmenů Laboratorní kmeny S. cerevisiae
Přírodní divoké kmeny S. cerevisiae
Tvoří hladké kolonie
vlastnosti shodné i odlišné
Tvoří kolonie strukturované Kmeny čerstvě izolované z přírody
Jaká je skutečnost ?
Jaké vlastnosti mají populace kolonie, které je zvýhodňují ve srovnání se samostatnými buňkami ? Laboratorní kmeny
Jsou schopné komunikovat Signální molekula: amoniak
Jsou schopné adaptovat svůj metabolismus Acidic
pH
pH
Alkali
ESR
ROS
ESR
GC TCA TCA
TCA Limitace živin Aktivní mitochondrie (oxidativní fosforylace)
Ato
Pma1p
H+ATPase
H+ Stressed cells (acidic phase)
Kolonie na agaru s pH indikátorem žluté zbarvení – kyselé pH fialové zbarvení – alkalické pH vyvolané NH3
H+
ATP ADP
NH4+
NH3 + H+ Adapted cells (alkali phase)
Populace postupně vyčerpá dostupné živiny, zvyšuje se produkce ROS amoniak naindukuje v buňkách změny metabolismu, které jsou výhodné pro další přežití
Buňky jsou schopné diferencovat v rámci populace Laboratorní kmeny
Vytvářejí specializované buněčné skupiny se speciálními funkcemi
Příčný řez kolonií
pozorování 2-fotonovým konfokálním mikroskopem
Pohled na kolonii zespodu
povrch agaru 150 μm
Pouze populace buněk v zelené oblasti kolonie produkuje specifický membránový protein, který je označen GFP
Žijí v méně příznivých podmínkách Odlišné vlastnosti ?
Vnitřní struktura kolonie je odlišná Přírodní kmeny
Jsou pevně přichyceny k podkladu
Laboratorní kmen
Přírodní kmen
100 μm
Příčný řez kolonií
10 μm
Ve spodní části vytvářejí struktury, jakési „kořínky“
Oválné buňky laboratorní: celá kolonie přírodní: jen vrchní část 10 μm 10 μm
Používají dva hlavní typy ochranných mechanismů Produkují ochrannou extracelulární hmotu Přírodní kmeny
Tvořena hlavně polysacharidy
Příčný řez kolonií (38 h)
povrch agaru 100 μm
pohled do povrchových vrstev kolonie skenovacím elektronovým mikroskopem
Extracelulární hmota v červené oblasti je málo propustná Zabraňuje pronikání nežádoucích látek
Používají dva hlavní typy ochranných mechanismů Přírodní kmeny
Produkují a aktivují transportéry mnohočetné lékové resistence
Konkrétně Pdr5p a Snq2p
Mohou odstraňovat extracelularní toxické látky Příčný řez kolonií Barvení: ConA/Nile red povrch agaru 10 μm
100 μm
V povrchové zeleně zbarvené oblasti kolonie jsou aktivní transportéry mnohočetné lékové resistence
Naše představa: Oba mechanismy se doplňují Transportéry aktivně odstraňují škodlivé látky přicházející z prostředí a extracelulární hmota zabrání jejich průniku dovnitř kolonie. Přírodní kmeny
Populace v kolonii se může nerušeně vyvíjet a přežívat po dlouhou dobu
METODIKY • Analýza proteinů (elektroforéza, imunodetekce, HPLC) • Analýza enzymů
• Genetické a genové manipulace • Microarrays - změny exprese genomu 3
6
10
13 17
22
26 31 d
12
19 d
Pma1p 5 Pma1p [%] 100
BY4742
90 80 70 60 50
ARGININE
40 Pma1p ATPase activity
20 0
5
1600
10
15
nmol/g wet weight
30
[days] 20
BY4742 sok2
1400 1200 1000 800 600
25
peroxisomal catalase Cta1p
20 15 10 5 0 S3
Cta1p Ctt1p
Cta1p Ctt1p
S5
S7
S9
S12
S14
SF6
SF7
S19
S21
S25
S28
200 0
cytosolic superoxide dismutase Sod1p
1
0
S32
0
5
10
15
20
25
30 [d]
25
30 [d]
25
30 [d]
GLUTAMINE
350
BY4742 sok2
300 250 200 150 100 50
S3
S5
S7
S9
S12
S14
SF6
SF7
S19
S21
S25
S28
S32
0
Sod1p nmol/g wet weight
Catalase activity (U/mg)
cytosolic catalase Ctt1p
2
nmol/g wet weight
Superox ide dismutase activity (U/mg)
400
30
0
5
10
15
20
ALANINE
3500
BY4742 sok2
3000 2500 2000 1500 1000 500 0
0
5
10
15
20
METODIKY • Mikrobiologické techniky
• Konfokální a fluorescenční mikroskopie (fluorescenční proteiny, barvení) • Elektronová mikroskopie
METODIKY • Speciální techniky analýzy kolonií
150 μm
500 μm
Děkuji za pozornost !
