Antimikrobiální látky Bakterie - bakteriociny Kvasinky Killer fenomén

Antimikrobiální látky • Bakterie - bakteriociny • Kvasinky – „Killer“ fenomén

Ing. Hana Sýkorová, PhD.

Bakteriociny • Látky peptidové povahy, ribosomální syntéza

• Produkce: bakterie G+ i G• Inhibiční účinek převážně na úzké spektrum mikroorganismů, často blízce příbuzné rody • Různý způsob účinku, biochemické vlastnosti, mol. hmotnost…

Bakteriociny • 1925 – identifikace látky s inhibičním účinkem E.coli – kolicin • 1928 – inhibiční účinek nisinu (léčba mastitidy skotu) • 1953 – Jacob: zavedení označení „bakteriocin“ • 2009 – popsáno 177 bakteriocinů (BACTIBASE)

Bakteriociny

• G+ 155 (BMK 113) • G- 19 • Archea 3

Bakteriociny - délka řetězce

84% bakteriocinů řetězec délky 20-60 ak

Bakteriociny G+ - 4 základní třídy (podle velikosti) - původně pro laktobacily (Klaenhammer) Třída I: lantibiotika -malé peptidy (2-3 kDa) obsahující lanthionin

Třída II: nízkomolekulární (do 10 kDa) -tepelně odolné hydrofobní peptidy

Třída III: vysokomolekulární (>30 kDa) -tepelně labilní

Třída IV: komplexní -proteinová a neproteinová část (lipid, sacharid)





Třída I - lantibiotika • krátké peptidy (20-40 ak)

• posttranslační úpravy • lanthionin nebo 3-methyl-lanthionin

lanthionin

Třída I - lantibiotika podle struktury dvě podskupiny: • IA - podlouhlé flexibilní amfipatické (polární a nepolární část) molekuly - nisin • IB - neohebná globulární struktura - mersacidin Aktivní forma: - jednopeptidová lantibiotika (nisin) - dvoupeptidová lantibiotika (lacticin 3147)

Třída I - lantibiotika IA:

thioetherové můstky lanthionin Ala-S-Ala IB:

3-methyl-lanthionin Abu-S-Ala Abu = 2-aminobutyric acid Dha = dehydrated Serine Dhb = dehydrated Threonine

Třída I – lantibiotika: Nisin • • • • •

Produkce: Lactococcus lactis 34 ak (posttranslační modifikace) 6 různých forem (A, B, C, D, E, Z) Účinek zejména na G+, včetně spór G- odolnější, zvýšením permeability vnější membrány (teplota, chelatační činidla) inhibiční účinek • Konzervant - E234 tavené i čerstvé sýry, fermentované masné a zeleninové výrobky

• Komerční produkt Nisaplin (2,5% nisin A, NaCl)

Třída I – lantibiotika: biosyntéza Geny pro syntézu • častá lokalizace na plasmidu • organizace v operonu: biosyntéza prekurzoru modifikace sekrece extracelulární proteáza regulace zajištění imunity proti vlastnímu bakteriocinu

Třída I – lantibiotika: biosyntéza

Figure 1—A schematic diagram of the biosynthesis of lantibiotics: (1) Formation of prebacteriocin; (2) The prebacteriocin is modified by LanB and LanC, translocated through a dedicated ABC-transporter LanT and processed by LanP, resulting in the release of mature bacteriocin; (3) Histidine protein kinase (HPK) senses the presence of bacteriocin and autophosphorylates; (4) The phosphoryl group (P) is subsequently transferred to the response regulator (RR); (5) RR activates transcription of the regulated genes; and (6) Producer immunity mediated by immunity proteins, LanI, and dedicated ABC-transport proteins, LanFEG.

Třída I – lantibiotika: biosyntéza

Třída I – lantibiotika: biosyntéza • • • • •

Prekursor NisA NisB dehydratace NisC cyklizace NisT transport NisP extracelulární proteáza

nisin A

Třída I – lantibiotika: mechanismus účinku Typ IA – tvorba pórů

wedge type

barrel-stave type

Třída I – lantibiotika: mechanismus účinku Typ IA – tvorba pórů - nisin

• vazba na membránu (lipid II) • vytvoření póru 2nm (stechiometrie 8:4 nisin:lipid II )

Třída I – lantibiotika: mechanismus účinku Typ IA – tvorba pórů – lacticin 3147

• vazba proteinu A1 na membránu (lipid II) • vytvoření vazebného místa pro protein A2 • vytvoření póru 0,6nm(stechiometrie 4:4:4 A1:A2:lipid II )

Třída I – lantibiotika: mechanismus účinku Typ IB – inhibice syntézy buněčné stěny

Třída I – lantibiotika: imunita

dva systémy působící společně: LanI – na vnější straně membrány, zabraňuje tvorbě pórů LanFEG – transportní protein, bakteriocin z membrány zpět





• • • •

Třída II. tepelně odolné hydrofobní proteiny do 10 kDa membránově aktivní neobsahují lanthionin bez posttranslačních modifikací

Podskupiny: • IIa: pediocinové (pediocin-like) • IIb: dvoupeptidové • IIc: jiné

Třída IIa – pediocinové bakteriociny • Silný účinek proti listeriím • Produkce zejména BMK pediocin – Pediococcus spp. (preparát ALTA) sakacin – Lactobacillus sakei

• N-koncová sekvence YGNGV (Tyr-Gly-Asn-Gly-Val) • Můstek Cys-Cys na N-konci • Hydrofobní C-koncová doména

Třída IIa – pediocinové bakteriociny Mechanismus účinku

Třída IIa – pediocinové bakteriociny Mechanismus účinku

receptor = man-PTS (mannose phosphotransferase system) vznik póru v membráně

Třída IIb – dvoupeptidové bakteriociny • • • •

dva peptidy (pro max účinek ideálně 1:1) dva strukturní geny pro dva proteiny jeden gen pro imunitní protein mechanismus účinku podobný jako IIa - póry

• lactococcin G – Lactococcus lactis • plantaricin EF – Lactobacillus plantarum

Třída IIb – dvoupeptidové bakteriociny Mechanismus účinku

transmembránová „helix-helix“ struktura interakce – zesílení poračního účinku

Bakteriociny G+: mechanismus účinku

• Koliciny

Bakteriociny G-

- E. coli - velké molekuly (25-80 kDa) - SOS regulace

• Mikrociny - < 10 kDa - bez SOS regulace

• Pyociny - podobné bakteriofágům - nukleáza- i proteáza-rezistentní - Pseudomonas sp.

G-: Koliciny •poprvé identifikován r.1925 (Gratia) •produkce E.coli •Klebsiella sp., Enterobacter sp., Serratia sp. „colicine-like“

•dva typy účinku: nukleázová aktivita, tvorba pórů •produkce spojená s lyzí buňky = letální biosyntéza

•geny lokalizovány na plasmidech (Col-plasmid): - toxin (cxa) - imunitní protein (cxi) - lytický protein (uvolnění toxinu) (cxl)

G-: Koliciny Restrikční mapa plasmidu pColU • cua - gen pro aktivní protein kolicinu • cui - gen pro imunitní protein • cul - gen pro lytický protein

• porační aktivita - imunitní protein v opačném směru - dva promotory • nukleázová aktivita - imunitní protein ve stejném směru - jeden promotor

G-: Koliciny Funkční domény kolicinu

1. T translokační translokace kolicinu do cílové buňky (N-konec) 2. R receptorová specifická vazba na receptor (střední část) 3. C cytotoxická - letální efekt kolicinu (C-konec)

G-: Koliciny SOS indukce • vyčerpání živin, UV záření, mitomycin C • SOS systém DNA oprav • LexA represor poškození DNA → aktivace RecA – proteinázová aktivita → rozštěpení represoru LexA → indukce exprese kolicinu

G-: Koliciny • imunitní protein (CxI) - čas pro produkci dostatečného množství kolicinu před lyzí producentské buňky - u kolicinů s nukleázou aktivitou – simultánní exprese pod jedním promotorem – ochrana vlastních NA

• lytický protein (CxL) - gen cxl transkribován v případě indukce cxa - aktivuje fosfolipázu A → permeabilizace c.m. → uvolnění kolicinu

G-: Koliciny vazba na receptor a translokace • receptor pro vitamin B12 (Btu) nebo pro transport železa • translokace přes vnější membránu, periplasmatický prostor, u kolicinů s nukleázovou aktivitou translokace i přes cytoplasmatickou membránu

G-: Koliciny účinek 1. tvorba iontových kanálů v cytoplasmatické m. 2. nukleázová aktivita (DNA i RNA)

G-: Koliciny syntéza spojená lyzí buňky

PROČ?

G-: Koliciny syntéza spojená lyzí buňky

PROČ? hypotézy: • aktivace SOS systému = DNA je poškozena - buňka by stejně zanikla • „altruismus“ – kolicin produkuje jen část populace – výhodnější podmínky pro vlastní „klon“

• Koliciny

Bakteriociny G-




• • • •

G-: Mikrociny

malé peptidy (< 10 kDa) produkce : Enterobacteriaceae ani SOS indukce ani letální syntéza hydrofobní, termostabilní, odolné vůči extrémnímu pH a proteázám = obdoba G+ • geny pro biosyntézu na plasmidech i chromosomech • syntéza ve formě prekursoru, enzymatické modifikace • různá struktura, různý mechanismus účinku (tvorba pórů, narušení potenciálu buněčné m.)

• Koliciny

Bakteriociny G-




• • • • •

G-: Pyociny r.1954 (Jacob) produkce: Pseudomonas sp. až 90% Ps. aeruginosa alespoň jeden pyocin lokalizace genů výhradně na chromosomu SOS indukce (mitomycin C)

 typy R a F – struktura podobná bakteriofágům  typ S – „colicin-like“ - proteáza senzitivní protein - účinek: tvorba pórů nebo DNázová a RNázová aktivita - genová kazeta neobsahuje gen pro lyzační protein – oproti kolicinům jiný mechanismus uvolnění toxinu

G-: Pyociny • R: non-flexible and contracile tails of bacteriofages (~ fág P2) • F: phage tails with a flexible and non-coctracile rod-like particles (~ fág λ)

• adsorpce na povrch cílové buňky, vytvoření póru • na rozdíl od fágů se v cílových buňkách nereplikují

Bakteriociny – shrnutí G+ (4 třídy) • I lantibiotika - lanthionin, posttranslační úpravy, tvorba pórů, inhibice syntézy b.s. (lipid II), př. nisin, lacticin • IIa pediocinové – membránově aktivní, účinek proti listeriím, koncová sekvence YGNGV • IIb dvoupeptidové – póry (lactococcin)

G- (3 skupiny) • koliciny – Col plasmidy, SOS regulace, letální biosyntéza, porační nebo nukleázová aktivita • mikrociny • pyociny (R,F – strukturně podobné bakteriofágům)

Bakteriociny – stanovení antimikrobiální aktivity Blank

Metoda vrstveného agaru • producentský kmen zamíchaný do agaru ve spodní vrstvě • cílový MO rozetřený na horní vrstvě • výhoda – simulace kontaktu • nevýhoda – časová náročnost, spotřeba materiálu

Bakteriociny – stanovení antimikrobiální aktivity Jamková difuzní metoda • testuje se pouze supernatant potenciálního producenta • cílový MO v agaru (často „soft“ agar – cca 0,7%)

• výhoda – více stanovení na jedné misce • určení charakteru antimikrobiálního účinku – různě ošetřený supernatant (např. vliv kyselin - neutralizovaný sup., vliv peroxidu - sup. s katalázou, účinek bakteriocinu - sup. s proteinázou…)

Bakteriociny – využití • kontrola růstu nežádoucích MO

• zejména třída I a II G+ • bakteriociny BMK - GRAS status (generally recognized as safe) • způsoby aplikace: • kultura produkující bakteriocin • čistý bakteriocin

• přídavek fermentovaného produktu

Bakteriociny – využití • Startovací kultury (fermentace mléčných, masných a zeleninových výrobků) • Prodloužení trvanlivosti potravin, obalové materiály

• výroba sýrů • vinařství – omezení SO2

• Listeria, Clostridium (včetně spor), Staphylococcus

Bakteriociny – využití • alternativa k běžně používaným antibiotikům (např. Campylobacter ve střevním traktu drůbeže)

• zatím nepopsán vznik/přenos rezistence

„Killer“ fenomén kvasinek

Killer fenomén • „killer“ kmeny – sekrece proteinového nebo glykoproteinového toxinu s letálním účinkem pro citlivé kmeny kvasinek

• 1963 S.cerevisiae (Bevan a Makower) • Candida, Cryprococcus, Debaryomyces, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia…

Killer fenomén • Young 1978 : 11 tříd killer faktorů. Kvasinky náležející do stejné třídy se nezabíjejí. • Podle vztahu ke killer faktoru lze kvasinky dělit: K killery - produkují toxin a jsou rezistentní (K+R+) N neutrální - neprodukující, ale rezistentní (K-R+)

S sensitivní - usmrcované killer faktorem (K-R-)

Killer fenomén

• lokalizace genů pro toxin:

dsRNA ve formě „virus-like particles“ (VPL) S.cerevisiae lineární dsDNA (cytoplasma) - Kuyveromyces chromosom (jádro) - Pichia

• mechanismus působení: narušení cytoplasmatické membrány a destabilizace buňky (K1 a K2) inhibice syntézy DNA a zablokování buňky v G1 fázi buněčného cyklu (K28)

Killer - S. cerevisiae • dsRNA • toxiny K1, K2, (K3), K28

• produkce toxinu vyžaduje dva typy dsRNA (virus-like particles): M satellite virus (toxin) 1-1.8 kb L-A helper virus (kapsidové proteiny) 4.6-4.8 kb

Killer - S. cerevisiae

Killer - S. cerevisiae

The killer virus (M) and the helper virus (L-A) are both double-stranded RNA (dsRNA) viruses. They compete for the L-A-encoded viral proteins Gag and Gag–Pol, which are essential for (a) single-stranded RNA (ssRNA) encapsidation, (b) virion assembly, (c) negative-strand RNA synthesis (replication), (d) positive-strand RNA synthesis (transcription) and extrusion from the particles into the cytosol, (e) ssRNA translation and (f) ssRNA binding.

Killer - S. cerevisiae • chromozomální geny hostitelské buňky potřebné k produkci toxinu: MAK (maitance of killer genes) - více než 30 různých genů - udržení obou dsRNA virů - většina kóduje ribosomální proteiny SKI (superkiller genes) - 6 genů - antivirový systém buňky - snižování počtu cytoplasmatických dsRNA

Killer - S. cerevisiae Processing a sekrece toxinu

Killer - S. cerevisiae Processing a sekrece toxinu

Killer - S. cerevisiae • Sestřih a úpravy podobné úpravám hormonů v savčích buňkách

Analogy in K28 preprotoxin processing in yeast and proinsulin maturation in mammalian cells (h-Kex2p, human homologue to yeast endopeptidase Kex2p).

Killer - S. cerevisiae Mechanismus účinku 1. vazba na receptor R1 v buněčné stěně • K1 a K2: β-1,6-D-glukan • K28: α-1,3,-mannoprotein

2. translokace a interakce s receptorem R2 v b. membráně 3. působení toxinu • K1 a K2: vytvoření póru • K28: přes GA a ER do jádra (klíčová signální sekvence HDEL na C-konci), inhibice syntézy DNA, zablokování v G1 fázi

Killer fenomén - význam • taxonomie kvasinek • modelový systém pro studium kontroly a exprese eukaryotických virů • možné vektory pro expresi a sekreci polypeptidů • biotechnologie – přirozené konzervanty, protiplísňové přípravky, kontrola kontaminace v prvních fázích kvašení vína…

Killer fenomén - shrnutí • „killer“ faktor – toxin • kvasinky náležející do stejné třídy se nezabíjejí (K, S, N)

• Saccharomyces cerevisiae – K1, K2, K28 • dsRNA - virus like particles (dva druhy částic) • plus chromosomální geny MAK a SKI • processing přes ER a GA (analogie se savčími hormony) • účinek – receptory v membráně, porační aktivita (K1, K2), zastavení v G1 fázi (K28) • využití – taxonomie, biotechnologie

Děkuji za pozornost.

Antimikrobiální látky Bakterie - bakteriociny Kvasinky Killer fenomén

Recommend Documents