Vliv propan-2-olu na strukturu cytochromu c v kyselé oblasti ph

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA KATEDRA BIOCHEMIE

Jan Drahorád

Vliv propan-2-olu na strukturu cytochromu c v kyselé oblasti pH

Bakalářská práce

Školitel: Prof. RNDr. Jiří Hudeček, CSc.

Praha 2010

Prohlašuji, že jsem tuto bakalářskou práci vypracoval samostatně pod vedením školitele Prof. RNDr. Jiřího Hudečka, CSc. a všechny použité prameny řádně citoval.

V Praze dne 1.9.2010 Jan Drahorád

2

Chtěl bych poděkovat svému školiteli Prof. RNDr. Jiřímu Hudečkovi, CSc. za zadání tématu, za odborné vedení a všestrannou pomoc při vypracování této práce. Dále bych chtěl poděkovat celému kolektivu laboratoře za vytvoření příjemného pracovního prostředí. A v neposlední řadě své rodině a přátelům za všestrannou pomoc a podporu během studia. 3

OBSAH : Seznam použitých zkratek……………………………………………………………………3

1 Přehled literatury………………………………………………………………4 1.1 Bílkoviny a jejich struktura…………………………………………………..5 1.2 Stabilita proteinů…………………………………………………………….5 1.3 Denaturace proteinů…………………………………………………………5 1.4 Sbalování proteinů a molten globule………………………………………..6 1.5 Cytochrom c…………………………………………………………………7 1.5.1 Cytochrom c – struktura…………………………………………………...7 1.5.2 Vlastnosti cytochromu c…………………………………………………...9 1.5.3 Cytochrom c a jeho role v apoptóze……………………………………….9 1.6 Absorpční spektrum viditelné a ultrafialové oblasti – vznik……………….10 1.6.1 Absorpční spektrum cytochromu c……………………………………...13 1.7 Diferenční spektra………………………………………………………….14 1.7.1 TPDS (thermal perturbation difference spectrophotometry)……………15 1.7.2 SPDS (solvent perturbation difference spectrophotometry)…………….15 1.7.3 Další způsoby perturbace………………………………………………..16 1.8 Derivačníspektra……………………………………………………………17 2 Cíl práce…………………………………………………………………….19 3 Experimentální část…………………………………………………………20 3.1 Použitý materiál…………………………………………………………….20 3.2 Použité laboratorní přístroje………………………………………………..20 3.3 Postup………………………………………………………………………21 3.3.1 Příprava pufrů……………………………………………………………21 3.3.2 Měření na spektrofotometru……………………………………………..22 3.3.3 Zpracování výsledků měření…………………………………………….23 4 Výsledky měření…………………………………………………………….24 4.1 Absorpční spektra – úvod…………………………………………………..24 4.1.1 Vliv pH na konformaci cytochromu c…………………………………...27 4.2.1 Vliv isopropylalkoholu na cytochrom c při pH 2,60…………………….32 4.2.2 Vliv isopropylalkoholu na cytochrom c při pH 2,30…………………….38 4.2.3 Vliv isopropylalkoholu na cytochrom c při pH 2,10…………………….43 4.2.4 Vliv isopropylalkoholu na cytochrom c při pH 1,90…………………….46 5 Diskuze……………………………………………………………………...49 6 Souhrn……………………………………………………………………....51 7 Seznam použité literatury…………………………………………………………….52

4

Seznam použitých zkratek : SDS – Sodium dodecyl sulfát ms – milisekunda nm –nanometr MG – molten globule eV – elektronVolt J – Joule UV – ultraviolet EMG – electromagnetic Hz – Herz Ser- serin Thr – threonin Lys- lysin Met – methionin Asp – kyselina asparagová Glu –kyselina glutamová Asn – amid kyseliny asparagové Phe - fenylalanin Tyr – tyrosin Trp – tryptofan His – histidin  - objemový zlomek  - vlnová délka mg – miligram ml – mililitr IPA – isopropylalkohol Arg – arginin Cys-cystein Cys- - disociovaný cystein

5

1 PŘEHLED LITERATURY

1.1 Bílkoviny a jejich struktura Proteiny jsou makromolekuly složené z aminokyselin spojených peptidickou (v anorganické chemii nazývanou amidovou) vazbou. Pokud je počet aminokyselinových jednotek mezi 2 - 10

mluvíme o peptidech (oligopeptidech); pokud do 100 je

používántermín polypeptid a pokud je jich spojených více než 100, hovoříme již o bílkovinách (proteinech). Některé bílkoviny obsahují ještě další součásti – například lipidy, ionty kovů etc. Struktura proteinů je definována následovně : 1. Primární struktura proteinu je dána pořadím (sekvencí) aminokyselinových zbytků v polypeptidovém řetězci, bez ohledu na jejich prostorové uspořádání. 2. Sekundární struktura molekuly (segmentu) je prostorové uspořádání hlavního řetězce bez ohledu na uspořádání postranních řetězců a na vztah k ostatním molekulám (segmentům). 3. Terciární struktura bílkoviny (podjednotky) je prostorové uspořádání všech jejích atomů v prostoru bez ohledu na vztah k ostatním molekulám (podjednotkám). 4. Kvartérní struktura proteinu je prostorové uspořádání podjednotek bez ohledu na jejich vnitřní strukturu.1

Mezi základní sekundární struktury řadíme  - helix (šroubovice, která má v ideálním případě 3,6 zbytků na 1 obrátku a výšku závitu 0,54 nm) a  - skládaný list (paralelní a antiparalelní). Energetickou bilanci tvorby nativní konformace bílkoviny je možné vyjádřit rovnicí (1)

ΔGcelk= ΔHmol + ΔHrozp - T ΔSmol - T ΔSrozp

(1)

Změna celkové Gibbsovy energie (ΔGcelk) říká, nakolik je nativní struktura stabilní. Pravá strana rovnice vyjadřuje příspěvek vazebné energie intramolekulárních interakcí (ΔHmol), enthalpický zisk interakce s rozpouštědlem (ΔHrozp), entropickou ztrátu, která je 6

dána vzrůstem uspořádanosti v nativní struktuře bílkoviny (ΔSmol) a entropickou bilanci interakce molekuly proteinu s rozpouštědlem (ΔSrozp), součinitel T vyjařuje teplotu.2

1.2 Stabilita proteinů Pro udržení sekundární a vyšších struktur jsou velmi důležité kovalentní, koordinačně kovalentní i nevazebné interakce mezi řetězci. Pokud se dehydrogenují 2 cysteiny, mohou se propojit kovalentní disulfidovou vazbou (-S –S-). Koordinačně kovalentní vazby se uplatňují zejména mezi ligandy nebílkovinnového složení s bílkovinou. Iontová vazba (např. mezi kladně nabitým postranním řetězcem lysinu a záporně nabitým postranním řetězcem kyseliny asparagové) je v bílkovinách velmi často solvatovaná, avšak v nepolárním prostředí má efekt na konformaci. Sdílení vodíku mezi slabě kyselou skupinou a atomem s volným elektronovým párem nazýváme vodíková vazba (u bílkovin zvláště mezi skupinami –NH a –C=O či – S –). Jde o elektrostatickou interakci, délka vazby mezi vodíkem a jeho akceptorem se pohybuje mezi 0,27 až 0,31nm. Síla vazby je mnohem slabší, než vazby kovalentní, avšak mají nejsilnější vliv na prostorové uspořádání proteinu. Významný efekt mají také Londonovy disperzní síly, hydrofobní efekt a interakce dipól – dipól.3,4

1.3 Denaturace proteinů Nízká stabilita nativní struktury proteinu umožňuje narušení jeho terciární a kvartérní struktury. Denaturací proteinu myslíme velkou změnu proteinu z původního nativního stavu do jiného, přičemž se nemění ani pořadí aminokyselin, ani vazby v primární struktuře. Může být reversibilní (vratná) či irreversibilní (nevratná)5. Můžeme jí dosáhnout buď fyzikálně nebo chemicky. Mezi fyzikální denaturace patří změna teploty, změna tlaku, sonikace proteinu (probíhá lépe v aerobním prostředí, některé proteiny nedenaturují při slyšitelném zvuku – např. koňský seralbumin ). 7 Chemické metody : a)

změny pH – např. přídavkem močoviny, guanidin hydrochloridu a jiných solí, či naopak kyselin – HCl – postranní řetězce se zionizují a tím se přeruší vodíkové vazby. 3,5

b)

přídavkem některých detergentů (i v malých koncentracích) může dojít k změnám hydrofobního efektu u proteinu – nejvýznamnějším detergentem je SDS (působí denaturaci dvojím způsobem – pokud je jeho koncentrace menší než taková, při které tvoří spontánně 7

micely(sub-CMC – „sub Critical micelle concentration“), váží se SDS monomery k proteinu převážně hydrofobními interakcemi a způsobují tak jeho rozbalování a změny terciární struktury; pokud je však jeho koncentrace vyšší než CMC, potom celé micely nutí protein ke zvětšování – vytvářejí nukleační centra na hydrofobních částech proteinu a poté se protein kvůli hydrofobním interakcím a odpudivým silám mezi záporně nabitým SDS a negativními částmi postranních řetězců proteinu6. c)

vlivem chaotropních činidel (např. iontů I-, SCN-, Ba2+, Ca2+), které zvyšují rozpustnost postranních nepolárních řetezců proteinu a narušují tak hydrofobní interakce 3.

1.4 Sbalování proteinů a molten globule Nativní prostorové uspořádání, kterého protein dosahuje je zakódováno v jeho primární struktuře. Děj, při kterém tohoto uspořádání dosahuje se nazývá sbalování („folding“) proteinu. Protein se snaží dosáhnout co nejrychleji stavu s nejnižší energií. Ovšem nabízí se nepřeberné množství konformací, kterých by protein mohl dosáhnout. Vzhledem k počtu možných konfigurací by však protein potřeboval mnohem delší dobu, než je trvání vesmíru na nalezení té energeticky nejvýhodnější. Protein se dostává do svého nativního stavu během několika desítek ms, čemuž se říká Levinthalův paradox. 8 Proto se začalo uvažovat o možnostech, že protein se sbaluje podle předem určených kinetických postupů zakódovaných v primární struktuře bílkoviny. Během sbalování proteinu se tvoří meziprodukty, jenž nejsou ani v nativním stavu, ale mají již poměrně pevně tvarovanou sekundární a částečně terciární strukturu. Bylo zjištěno9, že meziprodukt při rozbalování (denaturace v kyselém prostředí) cytochromu c má hlavní řetězec složený stejně, jako by byl v nativním stavu, ale že mezimolekulární fluktuace jsou o mnoho větší než v nativním stavu. Jelikož byl tento stav podobný s pozorováním na jiném proteinu ( - laktalbuminu zkoumaném v r.1981 Dolgikhem), navrhli autoři teorii, že do tohoto stavu se dostává více globulárních proteinů a nazvali jej „molten – globule state“ (MG) (roztavená globule).

Při foldingu proteinů in vivo se na procesu podílí pomocné proteiny jako katalyzátory nebo chaperony (pomocné proteiny, které opravují, rozkládají a znovuskládají polypeptidy do správných konformací).3,10

8

1.5 Cytochrom c 1.5.1 Cytochrom c – struktura Cytochrom c (Obr.1) je globulární protein s navázanou hemovou strukturou, jehož aminokyselinové složení se liší dle organismu, ve kterém se vyskytuje. Byly porovnány cytochromy z člověka, prasete, králíka, tuňáka, kuřete a kvasinek11. Primární strukturu mají z 53% stejnou, pokud se nebudeme zabývat kvasinkami, tato hodnota stoupne na 73% (viz. Obr.3, str.8). Počet aminokyselin je u kvasinek 108, u ostatních výše jmenovaných 104.

Pořadí aminokyselin je již poměrně dlouho známo. Hem je kovalentně vázán

thioetherovými vazbami mezi cysteiny v poloze 14 a 17 od N – konce 12 (viz Obr.2, str. 8) a koordinačně kovalentními vazbami mezi atomem železa a methioninem v poloze 8013,14 a histidinem v poloze 18

16

. Devět

lysinových zbytků dává cytochromu

charakteristicky vysoký isoelektrický bod (blízko pH 10)14.

Obr.1 : Trojrozměrná struktura cytochromu c (převzato 23)

9

jeho

Obr. 2 – Navázání hemu na protein – (převzato 3) Sekundární struktura cytochromu c v oxidované formě sestává z 4  - helixů a jednoho 310 helixu (v pořadí čtvrtý) – první je tvořen zbytky aminokyselin v polohách 2 – 14 (přičemž struktura šroubovice je rozvolněna mezi zbytky 7 – 8), druhý mezi polohami 49 – 54, třetí mezi 60 – 69, čtvrtý 70 – 74 a pátý od 89 do C – konce. Nejvíce nepravidelné struktury jsou mezi zbytky 21 – 26, 44 – 47 a 83 - 86 . Hlavní rozdíl v redukované formě je zkrácení posledního helixu (je až od zbytku 91) a ve tvorbě smyčky mezi 32 – 38.15 Rozdíl mezi cytochromem c a ostatními cytochromy je v jinak substituovaném porfyrinovém cyklu. Zatímco cytochromy b obsahují protoporfirin IX, cytochrom c má navíc na vinylové substituenty připojeny substituenty thiolové skupiny cysteinu v místě dvojných vazeb a tvoří s proteinem thioesterové vazby.3

Obr.3 – Rozdíly mezi primární strukturou koňského a lidského cytochromu c (převzato 17)

10

1.5.2 Vlastnosti cytochromu c Cytochrom c je periferní membránový mitochondriální protein s kladnými náboji lysinových zbytků uvnitř 3D struktury (hydrofobní část) a s negativním nábojem vně

3

a

katalyzuje přenos elektronu z cytochrom c reduktasy (cytochrom c1) na cytochrom c oxidasu.

3,18

Hemové skupiny mohou přenášet elektrony na vzdálenost 1 – 2 nm. Při

přenosu elektronu interaguje cytochrom c s cytochrom c reduktasou pomocí lysinových zbytků a neproměnnou 70 – 80 sekvencí. Následuje nahrazení hem stabilizujícího aniontu fenylalaninem 82, přičemž se zvyšuje elektronová afinita hemové skupiny v přechodném (tranzitním) stavu. Následuje deprotonace 78 threoninu cytochrom c reduktasou a přenos protonu z 67 tyrosinu na 78 threonin. Tím se vytváří fenoxidový ion, který redukuje atom železa v hemu z Fe3+ na Fe2+, což je možné díky předchozímu nahrazení hem stabilizujícího aniontu. Podobné interakce nejspíše probíhají i během přenosu elektronu z cytochromu c na cytochrom c oxidasu 3.

1.5.3 Cytochrom c a jeho role v apoptóze Kromě funkce přenašeče elektronů mezi komplexem III a IV v dýchacím řetězci bylo roku 1996 zjištěno, že pro iniciaci apoptózy je nutná přítomnost cytosolového (tedy uvolněného z mitochondrií) cytochromu c. Pokud však buňky jsou stimulovány k větší expresi proteinu Bcl – 2 (například působením hypotonického roztoku sacharosy), jenž působí jako anti – apoptotikum a je přítomen ve vnější mitochondriální membráně, je uvolňování cytochromu inhibováno

19

. Stimulantem k vypuštění cytochromu do cytosolu

může být například staurosporin, či anti – Fas protilátky. 20

11

1.6 Absorpční spektrum viditelné a ultrafialové oblasti vznik Absorpce fotonu má často původ v excitaci elektronů z různých typů vazeb, či elektronů patřících ke specifické skupině atomů. Skupiny s charakteristickou optickou absorpcí nazýváme chromofory a jejich přítomnost často vysvětluje barvu látek. Například pokud absorbuje dvojná vazba C=C, excituje se  - elektron do antivazebného orbitalu *. Chromoforová aktivita je tedy důsledkem přechodu *  . Jeho energie je okolo 7 eV, takže z rovnic (2) a (3)

E = h 

=

(2) c

(3)

- kde  je frekvence (Hz),  je vlnová délka v m, h je Planckova konstanta (6,626 x 10-34 J.s), c je rychlost světla (2,998 x 108 m/s) a E energie v J (1 eV je - 1,602 x 10-19 J) vyplývá, že vlnová délka záření je 180 nm (UV oblast) (rozdělení oblastí EMG spektra viz Obr.4) a tento přechod je pro UV oblast nejčastějším. Méně časté jsou přechody *n a *n z nevazebných orbitalů. Jejich absorbce jsou slabší, neboť jde o zakázané přechody.21

Obr.4 – Elektromagnetické spektrum (převzato 22)

12

Chromofory u bílkovin jsou zejména aromatické postranní řetězce (max. absorpce v blízkém okolí vlnové délky 280 nm) a peptidová vazba (max. absorpce v rozmezí vlnových délek 190 – 220 nm) (přehled významných chromoforů aminokyselin viz Tab. 1 – str. 12) Touto metodou můžeme zjistit aminokyselinové složení a konformaci bílkovin. Abychom získali ze spekter více informací, používáme matematické metody na získání dalších spekter (derivační a diferenční) z již naměřených absorpčních.

13

Vlnová Chromofor (absorbující struktura)

Zbytek aminokyseliny

(nm)

C-H

všechny

125

C-C

všechny

135

O-H

Ser, Thr (cukry, voda)

150

délka

183 N-H

Lys, Arg, N-konec

173 213

S-H

Cys

195

S-

Cys-

235

C-S-C

Met

205

-S-S-

cystin

250

COOH

Asp, Glu, C-konec

205

CO-NH

Asn, Glu, peptid. vazba

188 225

Fenyl

Phe

188 206 261

Fenol

Tyr

193 222 275

Fenolát

Tyr

200 240 293

Indol

Trp

195 220 280 286

Imidazol

His

211

Tab. 1 : Přehled významných chromoforů aminokyselin (převzato, upraveno)35

14

max

1.6.1 Absorpční spektrum cytochromu c Cytochrom c je transparentním modelem malého stabilního proteinu, který se dá poměrně lehce isolovat a navíc je komerčně dostupný. Je však velmi zajímavý i kvůli svým unikátním vlastnostem. Jako jeden z mála hemoproteinů neváže kyslík, ani oxid uhličitý ve své nativní formě. Sám reaguje s 02 až když je denaturován – v prostředí s pH nad 12, či s pH pod 4. Jeho typické spektrum dává několik vrcholů -  vrchol (Soretův pás) okolo 415 nm (elektronové přechody),  vrchol (Q pás) (550 nm) (vibrační přechody) a  vrchol v 520 nm (vibračně – elektronové přechody)29. Bylo zjištěno30, že není moc velký rozdíl, když se nepoužije úplně čistý cytochrom (cytochrom s 30% čistotou vykazoval o 17% vyšší intenzitu, než když byl čistý). Pokud se nastaví pH v intervalu 1,5 - 3,5, posune se Soretův pás na 395 nm a zintenzivní se (po snížení koncentrace chloridových aniontů) . Pokud je naopak pH roztoku nastaveno na 14, posune se Soretův pás na 417 nm. Přemýšlelo se o možnosti, že cytochrom má v redukovaném stavu 3 formy – -

1. s jedním nadbytečným (nepárovým) elektronem a s d2sp3 vazbami,

-

2. s pěti nadbytečnými elektrony a iontovou vazbou a

-

3. se třemi nadbytečnými elektrony a dsp2 vazbami

Babul

31

dokázal, že pokud se pH nastaví na 2, vzroste v roztoku cytochromu

viskozita o polovinu, což by odpovídalo nataženému řetězci a ne náhodnému klubku. Pokud se kyselina, kterou bylo pH nastaveno, neutralizuje, viskozita klesne. Tato pozorování napovídají, že okolo pH 2 je transitní stav ve foldingu proteinu. Nakonec Babul vyslovil myšlenku, že pokud se hem koordinuje se 2 ligandy se silným polem (např. síra nebo dusík), indukuje nízko-spinový komplex se Soretovým pásem s max. 400 nm. Pokud je hem koordinován 2 slabými ligandy (např. halogen nebo kyslík), vzniká vysoko – spinový komplex se Soretovým pásem s max. mezi 395 a 390 nm a dalším maximem na 620 nm. Pokud se hem koordinuje s jedním slabým a jedním silným ligandem, vzniká rovnováha mezi nízko a vysoko spinovým komplexem a Soretův pás má maximum mezi 396 a 400 nm.

15

1.7 Diferenční spektra Vnější faktory, působící na protein, mohou zásadním způsobem ovlivňovat jeho spektrum (např. změnou teploty, či změnou polarity). Abychom zjistili, jakým způsobem jej ovlivňují (perturbují), používá se metoda diference (rozdílu) mezi čistým vzorkem a vzorkem perturbovaným. Diferenční spektrum se může měřit buď na dvoupaprskovém spektrofotometru opticky (jeden paprsek prochází čistým vzorkem a druhý perturbovaným) a to ve dvoukyvetovém, nebo čtyřkyvetovém uspořádání. Čtyřkyvetové se používá, pokud perturbent absorbuje ve stejných vlnových délkách jako náš vzorek,. Jednopaprskový spektrofotometr je používán následovně: nejdříve se změří spektrum čistého vzorku a poté se toto spektrum od perturbovaného odečítá. Tím obdržíme diferenční spektrum. Tvar diferenčního spektra sleduje průběh první derivace absorpčního spektra. (Příklad dif. spektra – Obr.5)

Obr. 5 – Příklad diferenčního spektra – spektrum dvou vrcholů BSA - modře zbarveno je naměřené spektrum, červeně spektrum vypočítané absorbance a černě spektrum diferenční – převzato 23.

16

1.7.1

TPDS

(thermal

perturbation

difference

spectrophotometry) Změnou teploty o několik stupňů se může změnit spektrum a schopnosti interakce chromofor– rozpouštědlo25. Tímto způsobem se získávají informace o skupinách, které jsou „exponované“ („exposed“) na povrchu bílkoviny. Aminokyselinové zbytky skryté uvnitř molekul bílkovin, se nazývají pohřbené („buried“) a předpokládá se, že ke spektru nepřispívají. Drobné posuny jsou dány změnou buď přímo energie a intenzitou elektronových přechodů

chromoforů,

nebo

změnou

chemické rovnováhy

mezi

tautomerními stavy v roztoku (např. u nukleových kyselin). Konformace bílkovin při této metodě zůstává většinou nezměněna. Metoda se používá mimo jiné ke stanovení počtu exponovaných chromoforů24, 35

1.7.2

SPDS

(solvent

perturbation

difference

spectrophotometry) Při této metodě se používá změn spekter vlivem přidané látky. Nejčastěji se používají organická rozpouštědla. Rozpouštědlo narušuje hydratační obal bílkoviny a ta mění svou konformaci26 na povrchu. Pokud během přidávání perturbentu dojde k denaturaci bílkoviny, můžeme spočítat i pohřbené aromatické zbytky (resp. spočítat všechny arom. zbytky). Tato metoda se často používá jako doplněk k TPDS – odečtem exponovaných zbytků od celkového počtu získáme počet pohřbených. Posuny jsou rozdílné i v závislosti na tom, zda je aminokyselina v bílkovině, nebo volná – takto se může zjišťovat například při proteolýze koncentrace tyrosinových zbytků (volné aminokyseliny mají spektrum posunuté více do kratších vlnových délek).

27

17

1.7.3 Další způsoby perturbace Perturbace změnou koncentrace bílkoviny je metoda zaměřená na měření odchylek v Lambert – Beerově zákoně, které jsou způsobeny asociací molekul.

Perturbace změnou pH se používá zejména jako spektrofotometrická titrace. Tyrosinové zbytky mají jiné absorpční schopnosti v disociovaném a nedisociovaném stavu. Postupným zvyšováním pH se docílí denaturace bílkoviny a tedy interakce i pohřbených zbytků. Přitom však můžeme rozlišit na titrační křivce 3 skupiny – plně exponované, částečně exponované a pohřbené zbytky.35

18

1.8. Derivační spektra Derivační spektrofotometrie je jednou z pokročilejších absorpčních metod. Je založena na derivacích původního spektra – za předpokladu platnosti Lambert – Beerova zákona. Derivace Lambertova-Berrova zákona (4)

33,35

(c je koncentrace absorbující látky, l je

optická délka , ε je absorpční koeficient) podle :

A  cl 

(4)

dA d  cl  d d

první derivace

(5)

d2A d 2  c  l  d2 d2

druhá derivace

(6)

dnA d n  c l  n dn d

n-tá derivace

(7)

…

Derivatizace základního spektra dokáže oddělit překrývající se signály a pomáhá s odstraněním pozadí , které vytváří ostatní složky roztoku. Tímto způsobem lze u proteinů zjistit, zda například raménka vedle velkých signálu jsou samostatná maxima, či pouze šum. Kde má původní signál své maximum, tudy prochází první derivace osou x. Minimum druhé derivace je v bodě, kde měla původní křivka své maximum. Vyšší liché stupně se chovají obdobně jako první derivace, vyšší sudé jako druhá. (Průběh spekter naznačen na Obr.6, str.18).

Tato metoda se používá zejména ke analýzám potravin,

kosmetických barviv a barev, ve farmaceutickém průmyslu ke stanovení složek léčiva 32 .

19

Obr.6. – Schéma průběhu derivací absorpčního spektra

20

2 CÍL PRÁCE Cílem práce bylo pomocí absorpční a derivační spektrofotometrie zkoumat vliv isopropylalkoholu v kyselé pH oblasti (1,90 – 2,60) na strukturu a stabilitu cytochromu c. Dále bylo cílem naučit se pracovat a využívat spektrofotometr s diodovým polem typu HP 8453. Mimo jiné jsem měl za úkol seznámit se s literaturou pojednávající o cytochromu c. Tato bakalářská práce navazuje na předchozí práce z laboratoře školitele, které již cytochrom

c

v kyselém

21

prostředí

zkoumaly.

3 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

3.1 Použitý materiál Sigma cytochrom c (z koňského srdce). Ostatní chemikálie (HCl, Na2HPO4.12H2O, isopropanol, NaCl) byly čistoty p.a. a pocházely od firmy Lachema (Česká republika).

3.2. Použité laboratorní přístroje

Spektrofotometr HP 8453, Agilent Technologies (USA)

Automatické mikropipety: BioHit (Finsko), Nichiryo (Japonsko)

pH metr perpHecT logR 370 , ATI Orion (USA) s kombinovanou elektrodou, kalibrovanou standardními pufry od výrobce.

Váhy: analytické váhy PESA 40SM-200A (Švýcarsko) předvážky KERN EW600-2M (Německo)

magnetická míchačka: Variomag Monotherm, (Německo)

22

3.3 Postup 3.3.1 Příprava pufrů 1.

Připravil jsem si fosfátový pufr o c = 0,005 M pufry (1, 79 g krystalického Na2HPO4.12 H20 do 1 l destilované H20).

2.

Bod 1. jsem zopakoval ještě 3x.

3.

Nakalibroval jsem si pH metr.

4.

Pufry jsem dotitroval na pH 1,90; 2,10; 2,30 a 2,60 pomocí 2 M HCl při měření pH pufrů pHmetrem za soustavného míchání (objemy 2 M HCl viz Tab.2).

5.

Každý pufr jsem si rozdělil na menší objem a do nich přiléval různé objemy isopropylalkoholu (IPA), abych si vytvořil koncentrační řadu s objemovým zlomkem IPA 0 – 0.2 (0; 0,04; 0.08; 0,12; 0,16; 0,20) (objemy viz Tab.3, str.22)

6.

Do těchto pufrů jsem přidával cytochrom c tak, abych získal c cytc  0,5 mg/ml a c cyt c  0,05 mg/ml.

pH

V (objem)

2 M HCl

(ml)

1,90

15,7

2,10

5,3

2,30

8,1

2,60

3,1

Tab. 2 – objemy 2 M HCl při titraci

23

V 0% IPA 4%

(objem)

isopropylalkohol

V (objem) 0,005 M fosfátový pufr

(ml)

(ml)

0

71

2,8

68,2

5,7

65,3

8,5

62,5

11,4

59,6

14,2

56,8

IPA 8% IPA 12% IPA 16% IPA 20% IPA

Tab.3 – Objemy isopropylalkoholu a 0,005 M fosfátového pufru při tvorbě koncentrační řady.

3.3.2 Měření na spektrofotometru Absorpční spektra jsem měřil na spektrofotometru HP 8453. Používal jsem křemennou maskovanou kyvetu o šířce 1 cm. Spektrofotometr byl propojen s počítačem a pro jeho ovládání jsme použili program ChemStation (Agilent). Nastavil jsem si rozsah vlnových délek 190 – 1100 nm – maximální spektrum vlnových délek, které přístroj umí změřit. Nastavil jsem si integrační čas na 5 s (tento čas byl vybrán kvůli optimalizaci kvality spekter na základě doporučení předchozích bakalářů, kteří s přístrojem pracovali).

24

Každý vzorek jsem si připravil 2x, abych minimalizoval nepřesnost v koncentraci cytochromu při přípravě roztoků a každý vzorek jsem proměřil 3x, abych minimalizoval náhodné chyby spektrofotometru. Výsledky jsou tedy aritmetickým průměrem 6 měření.

3.3.3 Zpracování výsledků měření Spektra jsem si uložil ve formě souborů s příponou „.csv“. Tyto jsem pak dále zpracovával v programu Origin 7.5. V tomto programu jsem si vytvořil grafy absorpčních spekter. Pro výpočet derivací jsem vybral příslušný sloupec a vynesl jej do grafu. V nabídce „Analysis“ jsem zvolil „Calculus“ „Diff/Smoothing“ → „Smoothing: Polynomial Order Second, Points to the Left 2, Points to the Right 2“. Program používá k výpočtu derivací metodu Savitzky-Golay34, zvolený postup vybírá proložení polynomem druhého stupně s minimálním vyhlazováním (pět bodů). Dále jsem si vybral druhou derivaci spektra → „Order of Derivative - Second“.

25

4 VÝSLEDKY MĚŘENÍ 4.1 Absorpční spektra - úvod Nejpodobnější tvar spektra spektru nativnímu bychom měli mít při použití pH 2,60. Demonstrujeme si tedy na něm nejdůležitější části spektra. (Obr.7)

pH 2,6

2

A

1

0

200

400

600

800

1000

1200

(nm)

Obr.7: Absorpční spektrum cyt c v oblasti vlnových délek 190 – 1100 nm (ccyt c0,5 mg/ml, 0,005 M fosfát, pH 2,60)

Při vlnových délkách pod 225 absorbuje nejvíce peptidová vazba. Okolo 280 nm absorbují nejvíce chromofory aromatických aminokyselin a hemu. Dominantní Soretův pás (okolo 400 nm) a jeho „raménko“ při 360 nm je absorpce hemu. Jelikož je tohoto pásu při

26

této koncentraci cyt c příliš vysoká, než aby se dala odečítat, použili jsme i koncentraci 10 x nižší (Obr.8 ).

pH 2,6 0,5

0,4

0,3

A 0,2

0,1

0,0 300

350

400

450

500

(nm) Obr.8: Absorpční spektrum cyt c v oblasti vlnových délek 300 – 500 nm (ccyt c0,05 mg/ml, 0,005 M fosfát, pH 2,60)

Z tohoto grafu již můžeme vyčíst, kde je maximum Soretova pásu (407 nm) a jeho intenzitu v maximu - 0,349 a jeho pološířku (1/2 = 34 nm).

27

V oblasti 450 – 600 nm vidíme další vrchol – Q pás s max. v 529 nm (Obr.9).

pH 2,6 0,6

0,5

0,4

A

0,3

0,2

0,1

0,0 450

500

550

600

(nm) Obr.9 : Absorpční spektrum cyt c v oblasti vlnových délek 450 – 600 nm (ccyt c0,5 mg/ml, 0,005 M fosfát, pH 2,60)

28

4.1.1 Vliv pH na konformaci cytochromu c Měřil jsem vliv IPA pro pH v hodnotách 1,90; 2,10; 2,30 a 2,60. Nejdříve bychom se tedy orientačně podívat, zda a kde se výrazně mění struktura cyt c v tomto intervalu. (Obr.10)

pH 2,6 pH 2,3 pH 2,1 pH 1,9

4

3

A

2

1

0

200

400

600

800

1000

1200

(nm) Obr.10: Celé absorpční spektrum cyt c v oblasti vlnových délek 190 – 1100 nm (ccyt c0,5 mg/ml, 0,005 M fosfát, pH 1,90; 2,10; 2,30; 2,60)

Již na první pohled je vidět rozdíl v intenzitách při 280 nm (pH 2,60 ji má větší, než ostatní) a velký posun Q pásu (zase pro pH 2,60). Když se podíváme ne na celé spektrum, ale jen na jeho části, tak

29

pH 2,6 pH 2,3 pH 2,1 pH 1,9

1,0

0,9

0,8

0,7

A 0,6

0,5

0,4

0,3 250

260

270

280

290

300

310

(nm)

Obr.11: Absorpční spektrum cyt c v oblasti vlnových délek 250 - 310 nm (ccyt c0,5 mg/ml, 0,005 M fosfát, pH 1,90; 2,10; 2,30; 2,60)

uvidíme (Obr.11), že v intervalu vlnových délek mezi mezi 270 – 300 se posouvají signály směrem ke kratším vlnovým délkám (čím kyselejší pH, tím kratší vlnové délky). Intenzity jednotlivých spekter můžeme seřadit sestupně 2,60; 1,90; 2,10 a 2,30. Rozdíl v intenzitách pro pH 1,90; 2,10 a 2,30 je malý. Intenzita spektra s pH 2,60 je však o dosti větší. I v oblasti 250 – 270 nm (oblast absorpce fenylalaninu) se spektrum pro pH 2,60 odlišuje i s průběhem. Lepší rozlišení uvidíme při derivaci spektra (Obr.12, str.29).

30

pH 1,9 pH 2,1 pH 2,3 pH 2,6

0,03

0,02

0,01 2

2

d A/d

0,00

-0,01

-0,02 250

260

270

280

290

300

310

(nm) Obr.12: Druhá derivace absorpčního spektra cyt c v oblasti vlnových délek 250-310 nm (ccyt c0,5 mg/ml, 0,005 M fosfát, pH 1,90; 2,10; 2,30; 2,60)

Z druhých derivací spekter můžeme vyčíst, že v intervalu vlnových délek 250 – 270 mají spektra stejný tvar. V oblasti mezi 270 a 295 nm vytváří spektrum s pH 2,60 pět ostrých maxim; spektrum s pH 2,30 má mnohem plošší průběh a vytváří pouze tři ostřejší maxima a spektra s pH 1,90 a 2,10 jsou si podobná – mají čtyři maxima.

31

pH pH pH pH

0,7

2,6 2,3 2,1 1,9

0,6 0,5 0,4

A

0,3 0,2 0,1 0,0 -0,1 -0,2 300

350

400

450

500

(nm) Obr.13: Absorpční spektrum cyt c v oblasti vlnových délek 300 - 500 nm (ccyt c0,05 mg/ml, 0,005 M fosfát, pH 1,90; 2,10; 2,30; 2,60)

Ze spektra ve vlnových délkách 300 – 500 můžeme vidět (Obr.13) poměrně velký modrý posun maxima Soretova pásu (406 nm u pH 2,60; 397 nm pro pH 2,30; 395 nm pro pH 2,10 a 1,90). Také vidíme nárůst intenzit spolu s klesajícím pH.

32

pH 2,6 pH 2,3 pH 2,1 pH 1,9

0,5

0,4

0,3

A 0,2

0,1

0,0 450

500

550

600

650

(nm) Obr.14: Absorpční spektrum cyt c v oblasti vlnových délek 300 - 500 nm (ccyt c0,5 mg/ml, 0,005 M fosfát, pH 1,90; 2,10; 2,30; 2,60)

Z průběhu spektra v okolí Q pásu (Obr.14) (450 – 650 nm) je zřejmé, při pH 2,60 je výrazný pás s maximem v 529 nm. Při pH 2,300 dochází k výraznému snížení intenzity tohoto pásu a posunutí maxima na 528 nm. Začíná se však vytvářet nový pás s maximem v 619 nm. Při pH 2,10 se vytváří maximum v 495 nm a druhé maximum v 620 nm. Při pH 1,90 není moc velký rozdíl mezi pH 2,10; spektrum s pH 1,90 má větší intenzitu v maximu a maximum má posunuté na 494 nm. Druhé maximum, které se při pH 1,90 vytváří, je také podobné jako u pH 2,10 – max. má v 619 nm a má nejvyšší absorpční hodnotu v tomto bodě ze všech čtyř pH.

33

4.2.1 Vliv isopropylalkoholu na cytochrom c při pH 2,60 Toto pH je nejméně kyselé z měřených. Vliv isopropylalkoholu (IPA) na strukturu můžeme posoudit ze změn Soretova pásu (Obr.15 )

(nm) Obr.15: Absorpční spektrum cyt c v oblasti vlnových délek 300-500 nm (ccyt c=0,05 mg/ml,0,005 M fosfát,pH 2,60, isopropanol 0; 0,04; 0,08; 0,12; 0,16; 0,20)

Z grafu můžeme vyčíst, že maximum Soretova pásu se s přidaným IPA. (Bez přidání je na 406 nm, při 4% na 404 nm, při 8% na 403 nm, při 12 % na 402 nm, při 16% a 20 % zůstává na 402 nm). Jde tedy o modrý posun. Intenzita spolu s přidaným IPA klesá, výjimkou je 8 % IPA).

34

Pokud se podíváme na oblast vlnových délek okolo 280 nm (Obr.16 ),

(nm)

Obr.16: Absorpční spektrum cyt c v oblasti vlnových délek 260 - 310 nm (ccyt c=0,5 mg/ml,0,005 M fosfát,pH 2,60, isopropanol 0; 0,04; 0,08; 0,12; 0,16; 0,20)

lze usoudit, že spektra jsou v podstatě totožná, rozdíl je hlavně v intenzitách. To napovídá také i 2. derivace spektra (Obr.17, str.34)

35

0% IPA 4% IPA 8% IPA 12% IPA 16% IPA 20% IPA

0,03

0,02

0,01

2

0,00

2

d A/d

-0,01

-0,02

-0,03 250

260

270

280

290

300

310

(nm) Obr.17: Druhá derivace absorpčního spektra cyt c v oblasti vlnových délek 250-310 nm (ccyt c0,5 mg/ml, 0,005 M fosfát, pH 2,60 isopropanol 0; 0,04; 0,08; 0,12; 0,16; 0,20)

Vlivem IPA tedy v těchto vlnových délkách nedochází prakticky k žádným změnám. Pouze u 20% IPA je v oblasti u 272 nm minimum, ostatní spektra ho mají až v 279 nm. Při hodnocení vlivu IPA na cytochrom ze spekter druhé derivace můžeme využít d faktor – neboli rozkmit druhé derivace36 (rozdíl mezi nejvyšším maximem a nejnižším minimem pro danou koncentraci – graf. znázornění viz. Obr.18, str.35 )

36





-2

d  /d  (n m )

0,00

d

250

260

270

280

290

3 00

 (nm )

Obr.18 : Parametr d – grafické znázornění

Na Obr 19.,str.36 vidíme závislost parametru d na změně koncentrace IPA pro různá pH. Pro pH 2,60 vidíme nejvyšší rozkmity, poté s klesajícím pH se rozkmity zmenšují. Závislost parametru d na koncentraci IPA je složitější. Pro pH 2,60 parametr nejprve klesá (4% IPA), poté stoupá (8% IPA) a poté zase klesá až do max. přídavku. Při pH 2,30 vidíme nejdříve zvýšení parametru d (4%), poté pokles (8%) a následuje postupné stoupání. Při pH 2,10 vidíme nejprve pokles a poté stabilizaci parametru. Při pH 1,90 je parametr prakticky stabilní.

37

1,8 1,6

d x 103 (nm-2)

1,4 1,2 pH 1,9 pH 2,1 pH 2,3 pH 2,6

1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0% IPA 4% IPA 8% IPA 12% IPA 16% IPA 20% IPA

přídavek IPA (obj. procenta) Obr.19 : Parametr d – změny parametru d v závislosti na přidaném IPA pro různá pH

38

(nm) Obr.20: Absorpční spektrum cyt c v oblasti vlnových délek 450 – 650 nm (ccyt c=0,5 mg/ml,0,005 M fosfát,pH 2,60, isopropanol 0; 0,04; 0,08; 0,12; 0,16; 0,20)

Z Obr.20. vidíme, že průběh spekter ve vlnových délkách 450 – 650 nm se příliš neliší od spektra bez IPA. Postupně s přibývajícím IPA se snižuje intenzita vrcholu v 529 nm a v 16% IPA se posunuje vrchol na 528 nm a v 20% IPA na 527 nm. V těchto dvou koncentracích se však již začíná tvořit vrchol v 618 nm.

39

4.2.2 Vliv isopropylalkoholu na cytochrom c při pH 2,30 Průběh spektra v intervalu vlnových délek 250 – 310 nm není moc zajímavý. (Obr.21) Všechna spektra jsou podobná, se zvyšující se intenzitou spolu s rostoucí koncentrací IPA. Jedinou výjimku tvoří 4% IPA, jehož spektrum má 2. nejvyšší intenzitu. Vrchol má 0% v 279 nm, 4% v 278 nm a ostatní v 277 nm.

1 ,3

20% 16% 12% 8% 4% 0%

1 ,2 1 ,1 1 ,0

IP A IP A IP A IP A IP A IP A

0 ,9

A

0 ,8 0 ,7 0 ,6 0 ,5 0 ,4 0 ,3 0 ,2 250

260

270

280

290

300

310

(nm)

Obr.21: Absorpční spektrum cyt c v oblasti vlnových délek 250 - 310 nm (ccyt c=0,5 mg/ml,0,005 M fosfát,pH 2,30, isopropanol 0; 0,04; 0,08; 0,12; 0,16; 0,20)

40

0% IPA 4% IPA 8% IPA 12% IPA 16% IPA 20 % IPA

0,02

0,01

2

20,00

d A/d

-0,01

-0,02 250

260

270

280

290

300

310


Spektrum druhé derivace (Obr.22) nevykazuje také výraznější změny při různých koncentracích IPA, pouze rozkmit 20% IPA je větší.

41

0,6

20% 16% 12% 8% 4% 0%

0,5

0,4

IPA IPA IPA IPA IPA IPA

0,3

A 0,2

0,1

0,0

-0,1 300

350

400

450

500


Maximum Soretova pásu (Obr.23) se posunuje od 395 (0%) až k 402 nm (20% IPA), jde tedy o červený posun. Intenzity Soretova pásu se zvyšující se koncentrací IPA snižují.

42

0,5


0,4

0,3

A 0,2

0,1

0,0 450

500

550

600

650


Z průběhu spekter v rozmezí vlnových délek 450 – 650 nm (Obr.24) je vidět, že se posouvá maximum z původních 528 nm (0%) na nejdříve 529 nm (4%) a poté již modrým posunem na 525 nm (8%), 523 nm (12%) a 521 nm (16%). Průběh 20 % IPA je ovšem velmi odlišný. V předchozích je vidět jemné vytváření vrcholu u 496 nm, při 20 % však je tento vrchol dovytvořen úplně a jeho intenzita je vyšší, než intenzita vrcholu v 528 nm. Maximum v 528 nm však nemizí, zůstává však jen lokálním. Vytváří se také druhé maximum v okolí 620nm, s přídavkem IPA se zde zvětšuje intenzita, posuny maxima jsou minimální (0%, 4% a 8% mají maximum v 619 nm; 12% v 621 nm; 16% v 620 nm a 20% v 621 nm).

43

Když se podíváme na spektrum druhé derivace (Obr.25), uvidíme spektrum s mnoha maximy a minimy. Největší rozkmit má 16 % IPA v oblasti 480 nm a okolo 620 nm. Většina koncentrací má podobný rozkmit a průběh druhé derivace. Větší odlišnosti má spektrum 20 % IPA v oblasti 530 – 560 nm, má méně maxim a minim, než spektra ostatní.

0%IPA 4%IPA 8%IPA 12%IPA 16%IPA 20%IPA

0,005 0,004 0,003 0,002 0,001 2

20,000

d A/d

-0,001 -0,002 -0,003 -0,004 -0,005 450

500

550

600

650

(nm)

Obr.25: Druhá derivace absorpčního spektra cyt c v oblasti vlnových délek 450 – 650 nm (ccyt c0,5 mg/ml, 0,005 M fosfát, pH 2,30 isopropanol 0; 0,04; 0,08; 0,12; 0,16; 0,20)

44

4.2.3. Vliv isopropylalkoholu na cytochrom c při pH 2,10 0% IPA 4% IPA 8% IPA 12% IPA 16% IPA 20% IPA

0,010

0,005

2

0,000

2

d A/d

-0,005

-0,010 250

260

270

280

290

300

310


Z průběhu 2. derivace absorpčního spektra mezi vlnovými délkami 250 – 310 nm (Obr.26) vidíme, že všechna spektra jsou si podobná, mají pouze rozdílné intenzity. Největší rozkmit má spektrum čistého cytochromu c, počet maxim a minim mají všechna stejně (7 maxim a 6 minim).

45

0,6

20% 16% 12% 8% 4% 0%

0,5

0,4


0,3

A 0,2

0,1

0,0

-0,1 300

350

400

450

500

(nm) Obr.27: Absorpční spektrum cyt c v oblasti vlnových délek 300 - 500 nm (ccyt c=0,05 mg/ml,0,005 M fosfát,pH 2,10, isopropanol 0; 0,04; 0,08; 0,12; 0,16; 0,20)

Soretův pás se se vzrůstající koncentrací IPA posouvá do červených hodnot (k delším vlnovým délkám). Na 0% má maximum na 395 nm, 4% na 397 nm a ostatní koncentrace mají maximum na 402 nm. Intenzitu má nejvyšší 4% IPA, poté cytochrom bez IPA a potom se se zvyšující koncentrací IPA snižuje intenzita Soretova pásu (Obr.27).

46

Z průběhu spekter mezi vlnovými délkami 450 – 650 nm (Obr.28)

0,5


0,4

0,3

A 0,2

0,1

0,0 450

500

550

600

650


vidíme, že všechny koncetrace IPA opisují podobnou křivku. Mají maximum v 496 nm (pouze čistý cytochrom má v 495 nm). Intenzitu má v tomto maximu nejvyšší čistý cytochrom, poté 20% IPA, poté 16% a následují ostatní – čím méně IPA, tím nižší intenzita. Vrchol při 620 nm již opisují všechny koncentrace IPA. Pouze 12% IPA je posunut na 621 nm. Celkově jsou intenzity o mnoho menší než u pH 2,10.

47

4.2.4 Vliv isopropylalkoholu na cytochrom c při pH 1,90

1,0


0,9

0,8

0,7

A 0,6

0,5

0,4

0,3 250

260

270

280

290

300

310

(nm) Obr.29: Absorpční spektrum cyt c v oblasti vlnových délek 250 - 310 nm (ccyt c=0,5 mg/ml,0,005 M fosfát,pH 1,90, isopropanol 0; 0,04; 0,08; 0,12; 0,16; 0,20)

Absorpční spektrum mezi vlnovými délkami 250 – 310 nm (Obr.29) má maximum pro čistý cytochrom a 4% IPA v 275 nm. Pro 8% a 12% má maximum v 276 nm. Pro 16% a 20% je maximum v 277 nm, takže s přídavkem IPA vidíme červený posun. Spektra jsou si pro různá pH velmi podobná, rozdíly jsou v intenzitách – nejnižší má 4% a s přídavkem IPA se zvyšuje. Výjimku tvoří čistý cytochrom, který je ve svém maximu třetí nejintenzivnější složkou.

48

0,6

20% 16% 12% 8% 4% 0%

0,5

0,4


0,3

A 0,2

0,1

0,0

-0,1 300

350

400

450

500

(nm) Obr.30: Absorpční spektrum cyt c v oblasti vlnových délek 300-500 nm (ccyt c=0,05 mg/ml,0,005 M fosfát,pH 1,90, isopropanol 0; 0,04; 0,08; 0,12; 0,16; 0,20)

U Soretova pásu (Obr.30) je vidět velmi přímá úměrnost červeného posunu a úbytku intenzity na přídavku IPA. Maximum pro cytochrom bez IPA je při 395 nm, pro 4 % 397 nm, pro 8% 398 nm, pro 12% a 16 % 401 nm a pro 20% 403 nm.

49

Absorpční spektrum cytochromu při pH 1,90 (Obr.31) mezi vlnovými délkami 450 – 650 nm 0,5


0,4

0,3

A 0,2

0,1

0,0 450

500

550

600

650


nám ukazuje, že 20% a 16% IPA skoro splývají. Spektra všech pH mají podobný průběh, s maximy při 496 – 495 nm (496 nm pro 20%, 16%, 12%, 8% a 495 nm pro 4% a 0%) a okolo 620 nm (625 nm pro čistý cytochrom, 620 nm pro koncentrace 4%, 8%, 12% a 16% a 619 nm pro 20% IPA).

50

5 DISKUZE 1. Vliv pH na strukturu cytochromu c Dle literatury31 odpovídá maximum Soretova pásu při 407 nm nativnímu stavu cytochromu c. Budeme tedy považovat cytochrom c při pH 2,60 bez přídavku IPA za nativní. Tomu odpovídá také maximum Q pásu (529 nm). Z Obr.12,str.29 lze zjistit, že se mění velikost rozkmitu pro ostatní pH (2,30; 2,10 a 1,90) a tudíž se cytochrom dostává do jiného konformačního stavu – se snižováním se rozkmit zmenšuje. Mění se také křivka v oblasti 275 nm, z čehož můžeme usuzovat na různé interakce tyrosinu s rozpouštědlem. V oblasti Soretova pásu se se snižováním pH posouvá maximum z 406 nm (což odpovídá nízkospinovému komplexu) pro pH 2,60 až na 395 nm pro pH 2,10 a 1,90 – tato hodnota odpovídá přechodu k vysokospinovému stavu, čemuž odpovídá i zvyšování intenzity vrcholu při 395 nm. Protein se tedy alespoň částečně denaturuje. To napovídá i změna absorpčního maxima Q pásu – modrým posunem se z maxima v 529 nm pro pH 2,60 se dostáváme až k maximu v 494 nm (pH 1,90) a zároveň tvorbou nového vrcholu v 620 nm. Malé rozdíly ve vlnové délce tohoto maxima (620 nm) jsou nejspíše vinou nepřesnosti spektrofotometru.

2. Vliv isopropylalkoholu na strukturu cytochromu c při pH 2,60 Malé posuny maxima Soretova pásu z 406 na 402 nm po přidání IPA vzhledem k tomu, že se pořád jedná o nízkospinový stav železa nejsou representativní. Taktéž rozdíly ve vlnových délkách a velikost rozkmitu druhé derivace spektra cytochromu c mezi 250 – 310 nm nejsou natolik velké, abychom mohli tvrdit, že jde o konformační změnu. Vrchol v 618 nm se začíná s přídavkem IPA pomalu vytvářet, avšak vrchol při 495 nm zatím ne. Lze tedy říci, že konformační změna při pH 2,60 vlivem IPA nenastává.

3. Vliv isopropylalkoholu na strukturu cytochromu c při pH 2,30

51

Posun spekter zde začíná být znatelný, zvláště při 20% IPA. Při druhé derivaci spektra v oblasti absorpce aromatických aminokyselin vidíme větší rozkmit a tedy nejspíše dochází k rozbalování proteinu. Červený posun maxima Soretova pásu z vysokospinového stavu přes stav rovnovážný mezi spinovými komplexy až k nízkospinovému je zajímavý, ukazuje na změnu konformace atomu železa a případně na tvorbu transitního stavu (což by mohla být „molten globule“). Tento přechodový stav je také vidět na absorpčním spektru v oblasti Q pásu, kde se již vytváří vrchol při 620 nm a dovytváří se vrchol při 496 nm. Spektrum druhé derivace této oblasti je však kvůli velkému šumu nereprodukovatelné. Intenzita 4% IPA a průběh spektra v okolí Q pásu je překvapivá (při tomto přídavku IPA vykazuje cytochrom větší změny, než by se dalo očekávat z jinak skoro lineárních změn intenzit. Proč jevšak intenzita při tomto přídavku větší, nelze přesně určit.

4. Vliv isopropylalkoholu na strukturu cytochromu c při pH 2,10 Změny v průběhu 2. derivace absorpčního spektra mezi vlnovými délkami 250 – 310 nm nejsou signifikantní. Soretův pás se však posouvá z vysokospinového stavu (bez přídavku IPA) podobně jako při pH 2,30 až do nízkospinového. Zvláštní je nárůst intenzity 4% IPA v této části spektra.

Průběh spektra v oblasti Q pásu se prakticky nemění.

Zajímavé je celkové snížení intenzity Q pásu na skoro poloviční hodnoty než při pH 2,30. Nejspíše se tedy vzhledem k uvedeným výsledkům konformační stav nemění. 5.

Vliv isopropylalkoholu na strukturu cytochromu c při pH 1,90 Maximum Soretova pásu se při tomto pH červeným posunem pomalu mění spolu se vzrůstajícími přídavky IPA z 395 na 403 nm. Průběh spektra Q pásu je podobný všem spektrům – je již vytvořen vrchol při 620 nm a při 495 nm. Spektrum 4% IPA v oblasti absorpce aromatických kyselin má znovu posunutou intenzitu (tentokrát nižší,než očekávanou). Dle práce36 je nejspíše protein ve stavu „molten globule“, avšak míru denaturace proteinu nelze přesně určit, protože jsme nezměřili spektra úplně denaturovaného proteinu.

Vynesením faktoru d můžeme rozpoznat rozdíly v důležitosti přídavku IPA. Pro pH 2,60 a 2,30 jsou změny rozkmitu poměrně velké (zvláště přídavek 20% IPA při pH 2,30); pro pH 2,10 již tento faktor není tolik důležitý a konformace při pH 1,90 se přídavkem IPA prakticky nemění a zůstává stabilizována.

52

6 SOUHRN 1. Změřil jsem absorpční spektra cytochromu c z koňského srdce mezi 190 – 1100 nm při pH 1,90; 2,10; 2,30 a 2,60 s 0%, 4%, 8%, 12%,16% a 20% objemovým procentem isopropylalkoholu. 2. Tato spektra jsem zpracoval v programu Origin 7.5 a vynesl jejich druhé derivace do grafů, jež jsem následně vyhodnotil. 3. Zaměřil jsem se na oblasti 250 - 310 nm, 300 - 500 nm a 450 – 650 nm. 4. Vynesl jsem pro kvantitativní určení druhých derivací parametr d. 5. Největší změny v konformaci cytochromu c vlivem IPA jsem zaznamenal při pH 2,30. 6. Při pH 2,10 a 1,90 je nejspíše cytochrom c ve stavu „molten globule“.

53

7 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY 1) IUPAC-IUB: J. Biol. Chem. 241, 2491 (1966) 2) Hudeček J., Kalous V.: Fyzikálně chemická podmíněnost struktury bílkovin, Academia, Praha (1989) 3) Voet D., Voet G. J.: Biochemistry, John Wiley & Sons, USA (2004) 4) Karlson P.: Základy biochemie, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (1977) 5) Tanford Ch.: Protein denaturation v knize Advances in Protein Chemistry, Vol. 23 (ed. Anfinsen, C.B. Jr.), Academic Press, New York (1968) 6) Bhuyan, A.K. : On the mechanism of SDS – Induced Protein Denaturation, Willey InterScience,Biopolymers, 93, 186 (2009) 7) Chambers A.L., Flosdorf E.W.: The Denaturation of Proteins by Sound Waves of Audible Frequences, The Journal of Biophysical Chemistry, 114, 75 (1936) 8) Levinthal C. J.: Are There Pathways for Protein Folding?, Journal of Chemical Physics 65, 44 (1968). 9) Ohgushi M., Wada A.:“Molten – globule state“ : A Compact Form of Globular Proteins with Mobile Side – Chains, FEBS Lett. 164, 21 (1983) 10) Dobson C. M.: Solid Evidence for Molten Globules, Current Biology 4, 636 (1994) 11) Margoliash E.: Primary Structure and Evolution of Cytochrome c, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 50, 672 (1963) 12) Margoliash E.: Amino Acid Sequence of Chymotryptic Peptides from Horse Heart Cytochrome c, Journal of Biological Chemistry, 237, 2161 (1962) 13) Jori, G., Gennari G., Galiazzo G., Scoffone E., : Photo – Oxidation of Horse Heart Cytochrome c. Evidence for Methinone – 80 as a Heme Ligand, FEBS Letters, 6, 267 (1969) 14) Cassina M.A., Hodara R., Souza J.M., Thomson L., Castro L., Ischiropoulos H., Freeman B.A., Radi R.: Cytochrome c Nitration by Peroxynitrite, Journal of Biological Chemistry, 14, 21409 (2000)

54

15) Banci L., Bertini I., Gray B.H., Luchinat C., Reddig T., Rosato A., Turano P. : Solution Structure of Oxidizied Horse Heart Cytochrome c, Biochemistry, 36, 9867 (1997) 16) McDonald C.C., Phillips W.D.: Proton Magnetic Resonance Studies of Horse Cytochrome c, Biochemistry, 12, 3170 (1973) 17) http://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/enzyme-explorer/learningcenter/cytochrome-c.html - převzato 21.8.2010 18) Harrison, J.E.: A Proposed Hydrogen Transfer Function for Cytochrome c, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 71, 2332 (1974) 19) Jiang X., Wang X. : Cytochrome c Promotes Caspase – 9 Activation by Inducing Nucleotide Binding to Apaf – 1, Journal of Biological Chemistry, 275, 31199 (2000) 20) Skulachev V.P.: Cytochrome c in th Apoptotic and Antioxidant cascades, FEBS Letters, 423, 275 (1998) 21) Atkins, P.W.: Physical chemics, 2b, Oxford University Press (1998) 22) http://www.absoluteastronomy.com/topics/Electromagnetic_radiation

-

převzato

21.8.2010 23) http://www.ijvs.com/volume6/edition2/section3.html - převzato 22.8.2010 24) Frechet D., Ehrlich R., Remy P.: Thermal perturbation differential spectra of ribonucleic acids. I. Hydration effects, Nucleic Acids Research, 7, 1965 (1979) 25) Frechet D., Ehrlich R., Remy P.: Thermal perturbation differential spectra of ribonucleic acids. II. Nearest neighbour interactions Nucleic Acids Research, 7, 1981 (1979) 26) Herskovits T.T., Laskowski M., Jr.: Spectrophotometric Criterion for „Buried“ and „Exposed“ Groups in Proteins, Journal of Biological Chemistry, 235, 56 (1960) 27) Leach S.J., Scheraga H.A., : Ultraviolet Difference Spectra and the Internal Structure of Proteins, Journal of Biological Chemistry, 235, 2827 (1960) 28) http://www.pharmainfo.net/reviews/introduction-analytical-method-developmentpharmaceutical-formulations - převzato 22.8.2010 29) Rasnik I., Sharp K.A., Fee A.J., Vanderkooi J.M.: Spectral Analysis of Cytochrome c : Effect of Heme Conformation, Axial Ligand, Peripheral Substituents, and Local Electric Fields, Journal of Physical Chemistry B., 105, 282 (2001)

55

30) Butt W.D., Keilin D. : Absorption Spectra and Some Other Properties of Cytochrome c and of Its Compounds with Ligands, Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences, 156, 429 (1962) 31) Babul J., Stellwagen E.: Participation of Protein Ligands in the Folding of Cytochrome c, Biochemistry, 11, 1195 (1972) 32) Karpińska, J.: Derivative spectrophotometry – recent applications and directions of developments, Talanta, 64, 801 (2004) 33) Owen T.: Fundamentals of UV – visible spectroscopy, Hewlett-Packard Company, Germany (1996) 34) Savitzky A., Golay M.J.E. : Smoothing and Differentiation of Data by Simplified Least Squares Procedures, Analytical Chemistry, 36, 1627 (1964) 35) Kodíček M., Karpenko V.: Biofyzikální chemie, Praha, Academia (2002) 36) Kratochvílová H.: Vliv pH a iontové síly na strukturu a stabilitu cytochromu c Diplomová práce, Přf UK, Praha (2009)

56

Vliv propan-2-olu na strukturu cytochromu c v kyselé oblasti ph

Recommend Documents