UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie
Příprava a charakterizace fluorescenčně značených cytokininových derivátů
BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Autor:
Karolina Kubiasová
Studijní program:
B1406 Biochemie
Studijní obor:
Biochemie
Forma studia:
Prezenční
Vedoucí práce:
Mgr. Lucie Szüčová, Ph.D.
Odborný konzultant:
Mgr. Václav Mik, Ph.D.
Termín odevzdání práce:
7. 5. 2012
Prohlašuji, že jsem předloženou bakalářskou práci vypracovala samostatně za použití citované literatury.
V Olomouci dne 2. 5. 2012
_____________________________
Děkuji Mgr. Lucii Szüčové, Ph.D. za odborné vedení a vstřícnou pomoc při zpracování mé bakalářské práce. Za cenné rady a trpělivost bych ráda poděkovala celému kolektivu Laboratoře růstových regulátorů Přírodovědecké fakulty Univerzity Palackého, zejména Mgr. Václavu Mikovi, Ph.D. a Mgr. Tomáši Pospíšilovi, D.E.A., Ph.D. Další, komu bych chtěla poděkovat, je RNDr. Ondřej Plíhal, Ph.D. z Centra regionu Haná pro biotechnologický a zemědělský výzkum, a to za pomoc při zpracování cytokininových receptorových testů.
-2-
Bibliografická identifikace: Jméno a příjmení autora
Karolina Kubiasová
Název práce
Příprava
a
charakterizace
fluorescenčně
značených
cytokininových derivátů Typ práce
Bakalářská
Pracoviště
Centrum regionu Haná pro biotechnologický a zemědělský výzkum, Přírodovědecká fakulta UP v Olomouci
Vedoucí práce
Mgr. Lucie Szüčová, Ph.D.
Rok obhajoby práce
2012
Abstrakt
Práce je zaměřena na syntézu a studium biologické aktivity fluorescenčně
značených
derivátů
N6-isopentenyladeninu.
V teoretické části byla provedena literární rešerše cytokininů, jejich biologické aktivity, signální kaskády a přehledu malých organických fluorescenčních značek. V praktické části byly připraveny dva deriváty N6-isopentenyladeninu substituované v poloze C2 na purinovém skeletu alifatickým postranním řetězcem zakončeným primární aminoskupinou. Na tyto prekurzory bylo připojeno pět různých fluoroprob. Dále byly vybrané připravené látky testovány na cytokininovou aktivitu ve
standardním amaranthovém
biotestu
a
na
interakci
s cytokininovými receptory (CRE1/AHK4, ZmHK1, ZmHK3a). Klíčová slova
cytokininy, deriváty cytokininů, syntéza, fluorescenční značení, biologická aktivita, kumarin, Rhodamin B, dansyl, fluorescein, 7-nitrobenzooxadiazol
Počet stran
50
Počet příloh
0
Jazyk
Český
-3-
Bibliographical identification: Autor’s first name and surname
Karolina Kubiasová
Title
Synthesis and characterization of fluorescently labelled cytokinin derivatives
Type of thesis
Bachelor
Department
Centre of the Region Haná for Biotechnological and Agricultural Research
Supervisor
Mgr. Lucie Szüčová, Ph.D.
The year of presentation
2012
Abstract
The bachelor thesis is focused on synthesis and biological
activity
study
of
fluorescently
labelled
N6-isopentenyladenine derivatives. In the theoretical part, the literature concerning to cytokinins, their biological activity, signal pathway, and overview of small organic fluoroprobes is reviewed. The practical part deals with the synthesis of
two N6-isopentenyladenine derivatives
substituted in C2 position of the purine moiety substituted by aliphatic side chain terminated by amino group. Five different fluorescent probes were attached to the prepared derivatives and some selected compounds were screened for their cytokinin activity in the standard Amaranthus bioassay and for their ability to interact with cytokinin receptors (CRE1/AHK4, ZmHK1, ZmHK3a). Keywords
cytokinins, cytokinin derivatives, synthesis, fluorescent labelling, biological activity, coumarin, Rhodamine B, dansyl, fluorescein, 7-nitrobenzooxadiazole
Number of pages
50
Number of appendices
0
Language
Czech
-4-
Obsah Cíle práce .................................................................................................................................. - 7 Teoretická část .......................................................................................................................... - 8 1 Cytokininy ........................................................................................................................... - 9 1.1 Struktura cytokininů .................................................................................................. - 9 1.1.1 Cytokininy odvozené od adeninu .................................................................... - 9 1.1.2 Cytokininy odvozené od fenylmočoviny ...................................................... - 10 1.2 Biologické funkce .................................................................................................... - 10 1.3 Cytokininy a fluorescence ....................................................................................... - 12 1.3.1 Fluorescenční cytokininy .............................................................................. - 12 1.3.2 Fluorescenčně značené cytokininy ................................................................ - 13 2 Cytokininová signální dráha .............................................................................................. - 14 2.1 Receptory................................................................................................................. - 15 2.2 AHP ......................................................................................................................... - 16 2.3 ARR ......................................................................................................................... - 16 2.4 CRF ......................................................................................................................... - 17 2.5 Mechanismus signalizace cytokininů ...................................................................... - 17 3 Fluorescenční značky ......................................................................................................... - 18 3.1 Fluorescenční proteiny ............................................................................................ - 19 3.2 Organické fluoroproby ............................................................................................ - 19 3.2.1 Organické fluoroproby s emisí do 500 nm .................................................... - 20 3.2.1.1 Fluorescenční značky s kyslíkatými heterocykly ............................................... - 20 3.2.1.2 Fluorescenční značky se sirnými heterocykly .................................................... - 20 3.2.1.3 Fluorescenční značky s dusíkatými heterocykly ................................................ - 21 3.2.1.4 Fluorescenční značky s naftalenovým jádrem .................................................... - 22 3.2.2 Organické fluoroproby s emisí nad 500 nm .................................................. - 22 3.2.2.1 Fluoresceiny ....................................................................................................... - 22 3.2.2.2 Rhodaminy ......................................................................................................... - 23 3.2.2.3 Další fluorescenční značky ................................................................................. - 24 Experimentální část ................................................................................................................. - 25 4 Materiál a metody .............................................................................................................. - 26 4.1 Chemikálie............................................................................................................... - 26 4.2 Metody..................................................................................................................... - 26 4.2.1 Cytokininové biotesty ................................................................................... - 27 4.2.2 Receptorové testy .......................................................................................... - 27 -
-5-
4.3 Syntéza .................................................................................................................... - 28 4.3.1 Deriváty iP substituované na C2 atomu purinu ............................................. - 28 4.3.2 Označení C2-substituovaných derivátů iP pomocí fluorescenčních značek . - 29 5 Výsledky a diskuse ............................................................................................................ - 33 5.1 Syntéza .................................................................................................................... - 33 5.1.1 Prekurzory pro fluorescenční značení ........................................................... - 33 5.1.2 Fluorescenční značení ................................................................................... - 33 5.1.2.1 Fluorescenční značení Rhodaminem B .............................................................. - 33 5.1.2.2 Fluorescenční značení kumarin-3-karboxylovou kyselinou ............................... - 34 5.1.2.3 Fluorescenční značení fluoresceinem isothiokyanátem ..................................... - 35 5.1.2.4 Fluorescenční značení NBD-Cl .......................................................................... - 36 5.1.2.5 Fluorescenční značení dansyl chloridem ............................................................ - 36 5.2 Biologická aktivita připravených látek .................................................................... - 39 5.2.1 Amaranthový biotest ..................................................................................... - 39 5.2.2 Receptorové biotesty ..................................................................................... - 40 6 Závěr .................................................................................................................................. - 43 7 Literatura............................................................................................................................ - 44 8 Seznam zkratek .................................................................................................................. - 49 -
-6-
Cíle práce 1)
Zpracování
rešerše
o derivátech rostlinných
hormonů
cytokininů
značených
fluorescenčními značkami 2)
Příprava
prekurzorů
pro
fluorescenční
značení
látek
6
od N -isopentenyladeninu 3)
Značení připravených derivátů vhodnými fluorescenčními značkami
4)
Biologická aktivita připravených látek
-7-
odvozených
Teoretická část
-8-
1
Cytokininy Cytokininy jsou rostlinné hormony, které hrají významnou roli v regulaci buněčného
cyklu a ovlivňují mnoho procesů spojených s růstem a vývojem rostlin (Davies, 2004). Byly objeveny v laboratoři F. Skooga v 50. letech minulého století jako skupina látek, které v přítomnosti jiné třídy rostlinných hormonů auxinů podporují buněčné dělení (cytokinezi) a růst kalusu. První zástupce cytokininů byl izolován C. Millerem (Miller, 1955a, Miller, 1955b) jako degradační produkt DNA a byl pojmenován kinetin (6-furfurylaminopurin). Pojmenování získal díky své schopnosti vyvolat buněčné dělení. Zeatin (6-(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1ylamino)-9H-purin), první identifikovaný přírodní cytokinin, byl získán z nezralých kukuřičných zrn (Miller, 1961). Cytokininy se vyskytují ve všech rostlinných pletivech, zejména v kořenové špičce, vrcholcích výhonků nadzemní části rostlin nebo v nezralých semenech. Kromě rostlin jsou cytokininy
také
produkovány
cyanobakteriemi,
patogenními
rostlinnými
bakteriemi
(Agrobacterium tumefaciens, Rhodococcus fascians) nebo hlenkami (Dictyostelium discoideum) (Schmülling, 2004). Společně s dalšími rostlinnými hormony jsou cytokininy hojně využívány v zahradnictví a
biotechnologických
aplikacích
při
mikropropagaci
a
regeneraci
rostlin
(van Staden et al., 2008).
1.1 1.1.1
Struktura cytokininů Cytokininy odvozené od adeninu Přirozeně se vyskytující cytokininy (CK) lze definovat jako N6-substituované deriváty
adeninu. Podle struktury postranního řetězce připojeného na dusíkový atom v pozici N6 se dělí na dvě základní skupiny, a to na isoprenoidní (ICK) a aromatické (ACK). Mezi ICK se řadí například N6-isopentenyladenin, cis- a trans-zeatin a dihydrozeatin. Aromatické cytokininy pak reprezentují například N6-benzylaminopurin, o-, (Romanov, 2009).
-9-
m-,
p-topolin a
kinetin (Obr. 1)
OH
HN
OH
HN N
N
N
N
N H
N
N
N6-isopentenyladenin (iP)
HN N
N
N H
trans-zeatin (tZ)
Dihydrozeatin (DHZ)
N
O
HN N
HN N
N
N H N6-Benzyladenin (BA) N
N H
N
OH
HN
N
N
N H
N
cis-zeatin (cZ)
OH
HN
N
N
N H Topoliny (oT, mT, pT)
N H Kinetin (Kin)
N
N
Obr. 1. Struktury cytokininů odvozených od adeninu. Uvedené názvy (vyjma N6-benzyladeninu) jsou triviální a v závorkách jsou použity běžné zkratky.
1.1.2
Cytokininy odvozené od fenylmočoviny Kromě přirozeně se vyskytujících cytokininů existuje skupina látek odvozená od
fenylmočoviny, které vykazují také vysokou cytokininovou aktivitu. Do této skupiny látek patří například N,N’-difenylmočovina, N-fenyl-N’-(2-chlor-4-pyridyl)močovina nebo thidiazuron (Obr. 2) (Schmülling, 2004).
O
O N H
N H
N,N'-difenylmočovina (DPU)
N H
N N H
O Cl
N-fenyl-N'-(2-chlor-4-pyridyl)močovina (CPPU)
N H
N H
N N S
Thidiazuron (TDZ)
Obr. 2. Struktury cytokininů odvozených od fenylmočoviny. U struktur jsou uvedeny triviální názvy a jejich běžně používané zkratky.
1.2
Biologické funkce Cytokininy hrají významnou roli při regulaci růstu a vývoje rostliny během celého jejího
životního cyklu. Na buněčné úrovni stimulují buněčné dělení a diferenciaci, genovou expresi, syntézu chlorofylu a vývoj chloroplastů a syntézu některých sekundárních metabolitů (betacyanin, indolové alkaloidy). Na orgánové úrovni ovlivňují řadu významných vývojových a fyziologických procesů, jakými jsou klíčení semen, expanze kotyledonu, vývoj vodivých pletiv, apikální dominance, transport živin, vývoj květů a plodů a listovou senescenci (Davies, 2004).
- 10 -
Listová senescence je finálním stadiem ve vývoji listu, kdy dochází ke koordinovaným změnám ve struktuře buňky, genové expresi a výraznému poklesu fotosyntetické kapacity (Quirino et al., 2000). Schopnost cytokininů ovlivňovat senescenci byla zjištěna poprvé v roce 1957 po exogenní aplikaci kinetinu na oddělené listy řepeně (Xanthium pensylvanicum). Ošetření intaktních listů vedlo k oddálení senescence (listy zůstaly zelené) v porovnání s kontrolními listy (Richmond et Lang, 1957). Kromě listové senescence cytokininy oddalují také senescenci květů. Eisinger pozoroval prodloužení životnosti květů po aplikaci kinetinu u karafiátu (Dianthus caryophylus) (Eisinger, 1976). Obdobný efekt se projevil u variety krátkožijící růže (Golden wave), kdy po inkubaci květů s N6-benzyladeninem došlo k oddálení senescence (Mayak et Halevy, 1969). Dalším důkazem vlivu cytokininů na senescenci bylo sledování hladin endogenních cytokininů během ontogeneze. Studie odhalily vztah mezi hladinou cytokininů a nástupem senescence, při které tato hladina prudce klesá (Heindl et al., 1982). V roce 1995 byl sledován autoregulační systém inhibice senescence na transgenním tabáku, do kterého byl naklonován senescenčně specifický promotor ovlivňující expresi ipt. Při nástupu senescence nastává exprese ipt a následně dochází k syntéze cytokininů. Zvýšená hladina cytokininů brání senescenci a potlačuje aktivitu senescenčně specifického promotoru, aby nedošlo k nadprodukci cytokininů (Gan et Amasino, 1995).
A
B
Senescenčně specifický promotor
NOS-Ter
ipt
isopentenyl transferasa
Senescence
Cytokininy
Obr. 3. Inhibice listové senescence pomocí autoregulační produkce cytokininů. A/ Exprese ipt pod kontrolou senescenčně specifického promotoru SAG12. B/ Oddálená listová senescence u transgenního tabáku (vlevo), wt (vpravo) (Gan et Amasino, 1996).
B
Apikální dominance je jev, při kterém terminální výhonek reguluje růst a vývoj postranních pupenů (Cline, 1991). Grayburn et al. pozorovali tvorbu pupenů po aplikaci exogenních cytokininů (BA, Kin, iP) na meristematické buňky v bazální části listu Graptopetalum paraguayense (Grayburn et al., 1982). V případě aplikace kinetinu na stonkové segmenty ovsa bylo zjištěno, že kinetin stimuluje vývoj pupenů (Harrison et Kaufman, 1980).
- 11 -
Smigocki a Owens pozorovali zeslabení apikální dominance u transgenních rostlin tabáku (Nicotina plumbaginifolia) s nadprodukcí cytokininů (exprese ipt genu pod konstitutivním 35S promotorem) (Smigocki et Owens, 1988). Interakce cytokininů a auxinů je důležitým rysem při vývoji a růstu rostliny. Jejich role je antagonistická a změnou poměru koncentrací lze ovlivnit stimulaci růstu nadzemní či kořenové části. V případě převládajícího množství cytokininů dochází k zeslabení růstu kořenů a výrazné stimulaci nadzemní části, naopak při nedostatku cytokininů převládá úloha auxinů a nastává zvýšená tvorba kořenových vrcholů. Této skutečnosti se využívá v biotechnologiích v tkáňových kulturách při regeneraci celých rostlin z izolovaných částí (van Staden et al., 2008).
Varianta A B C D
Konc. BA [mg/L] 1 1 0 0
Konc. NAA [mg/L] 0 0,5 0 0,05
Obr. 4. Vliv koncentrace cytokininu a auxinu na morfogenezi u fazole (Vigna radiata). A/tvorba listů, B/ kalus, C/ kontrola, D/ tvorba kořenů. (Převzato z http://plantphys.info/plant_physiology/images/tissuehormonescu.gif).
1.3
Cytokininy a fluorescence Přirozeně
se vyskytující cytokininy nejsou fluorescenční.
Pro jejich využití
k fluorescenčnímu značení je nutné je vhodně substituovat fluorescenčními značkami nebo měnit strukturu a substituce purinového skeletu. Následně lze tyto látky použít například ke studiu interakce mezi cytokininy a jejich vazebnými proteinovými partnery (Brault, 1997). 1.3.1
Fluorescenční cytokininy V roce 1975 byly připraveny imidazo[4,5]chinazolinová analoga cytokininů a byly
stanoveny jejich aktivity v tabákovém testu. Společným prvkem připravených látek byly substituenty připojené na pyrimidinový kruh v pozici 4, a to buď benzylamin nebo 3-methylbut2-en-1-amin (analoga iP a BA). Analoga se lišila v připojení imidazolového kruhu na chinazolinové jádro ([4,5-f], [4,5-g], [4,5-h]) (Obr. 5).
- 12 -
Sloučeniny 2a a 2b vykazovaly v tabákovém testu vysokou aktivitu, zatímco látky 3a a 4a byly aktivní jen nepatrně nebo vůbec (3b a 4b). Sloučenina 2a dosáhla 100% aktivity iP v optimální koncentraci 10-2 M (optimální koncentrace iP – 10-4 M). Sloučenina 2b dosáhla 100% aktivity BA v optimální koncentraci 10-2 M (optimální koncentrace BA – 10-4 M) (Sprecker, 1976). X
X N
N N
N
N H
N
1a) X = NH2
X
X
N NH
N
N
N H
N N
N
N N H
2a) X =
3a) X = NH2
4a) X = NH2
abs= 320, 335, 350 nm em= 365, 380, 395 nm
abs= 325, 340 nm em= 350, 362, 378 nm
NH2 abs= 302, 312 nm em= 330, 340, 355 nm
2b) X = C6H5CH2NH
3b) X = C6H5CH2NH
4b) X = C6H5CH2NH
abs= 320, 335, 350 nm em= 365, 380, 395 nm
abs= 325, 338 nm em= 350, 362, 378 nm
abs= 302, 312 nm em= 328, 340, 355 nm
1b) X = C6H5CH2NH
Obr. 5. Imidazo[4,5]chinazolinová analoga cytokininů. Fluorescenční vlastnosti byly měřeny ve vodě s přesností ± 2 nm.
Dalším cytokininovým analogem vykazujícím vysokou fluorescenci je 4-n-butylamino-2methylthiopyrido[2,3-d]pyrimidin (BAMPP). Bylo zjištěno, že díky svým fluorescenčním vlastnostem je BAMPP vhodný v kalusovém testu pro izolaci proteinů vázajících cytokininy (Hamaguchi et al., 1985).
HN N S
N
N
abs= 338 nm em= 410 nm
Obr. 6. Cytokininový analog BAMPP.
1.3.2
Fluorescenčně značené cytokininy V roce 2010 Zawadski et al. připravili dva fluorescenčně značené cytokininy
močovinového typu (Obr. 7). Fluorescenční markery 4-chlor-7-nitrobenzooxadiazol (NBD-Cl) a rhodamin B byly připojeny k N-(3-karboxyfenyl)-N‘-(pyrid-4-yl)močovině (4PU) přes karboxylovou skupinu prostřednictvím oddalovacího ramínka o délce tří uhlíků. Při syntéze NBD-Cl značeného derivátu byl použit 1,3-diaminopropan, zatímco při značení rhodaminem B 1,3-propandiol (Zawadski et al., 2010).
- 13 -
O
N
A
O N
O
N O N
N H
H N
N H
+
O
N
B
O
O
O O
HN
O
H N
O
HN N
abs= 465 nm
abs= 558 nm
N
em= 584 nm
em= 532 nm
Obr. 7. Fluorescenčně značený cytokinin močovinového typu. A/ 4PU značený pomocí NBD-Cl (4PUNBD). B/ 4PU značený rhodaminem B (4PU-RhB).
Připravené fluorescenčně značené cytokininy byly použity pro studium interakce mezi ligandem a cytokinin-specifickým vazebným proteinem (VrCSBP) z fazolových klíčků (Vigna radiata) (Fujimoto et al., 1998). VrCSBP je homotetramer, jehož funkcí je skladování a transport cytokininů. V každé podjednotce je vazebná kapsa, do které je schopen navázat dvě molekuly zeatinu (Pasternak et al., 2006).
2
Cytokininová signální dráha Podle dosud známých dat cytokininy prostupují přes fosforylační kinasovou dráhu, která
je podobná dvou-komponentním systémům u bakterií, kterými odpovídají na stimuly z prostředí (Hwang et Sheen, 2001). Výsledkem fosforylační kinasové dráhy je aktivace transkripčních faktorů a genová exprese. Charakterizace dvou-komponentního systému u Arabidopsis thaliana, kukuřice a rýže ukázala, že odpověď na cytokininy je zprostředkována histidinkinasami, regulátory odpovědi (response regulators - ARR) a nově také CRF (cytokinin response factors). Převrat ve zkoumání cytokininové signální dráhy nastal v roce 1996 objevem CKI1, genu pro receptorovou histidinkinasu v A. thaliana. Transformovaný kalus Arabidopsis thaliana s over-expresí CKI1 kultivovaný v nepřítomnosti cytokininů vykazoval výrazné fenotypové změny typické pro odpověď na cytokininy (proliferace, zelenání, tvorba výhonků) (Kakimoto, 1996). Tyto počáteční experimenty a identifikace genů pro regulátory odpovědi (ARR) v Arabidopsis (Taniguchi et al., 1998) jako prvních genů v odpovědi na cytokininy ukázaly, že histidinkinasy a jejich ostatní komponenty mohou hrát významnou roli v cytokininové signální dráze. V roce 2001 byla v A. thaliana objevena další histidinkinasa. Jednalo
se
o
první
skutečný
cytokininový
receptor
pojmenovaný
CRE1/AHK4
(Inoue et al., 2001; Suzuki et al., 2001; Ueguchi et al., 2001). Díky dostupnosti genomové sekvence Arabidopsis byly vzápětí objeveny další cytokininové receptory – AHK2 a AHK3. V roce 2004 Yonekura-Sakakibara et al. izolovali z kukuřice geny pro cytokininové receptory (ZmHK1, ZmHK2, ZmHK3a) (Yonekura-Sakakibara et al., 2004).
- 14 -
Cytokininová signální kaskáda je nejvíce prostudována v A. thaliana, proto se následující kapitoly zaměří na popis jednotlivých komponentů nacházejících se v A. thaliana. 2.1
Receptory Cytokininy jsou v Arabidopsis vnímány přes cytokininové receptory AHK2, AHK3
a CRE1/AHK4. Současný model cytokininové signální dráhy předpokládal lokalizaci receptorů v plasmatické membráně na základě bioinformatické analýzy, analogie s receptorovými His kinasami v bakteriích a kvasinkách a experimentálně na lokalizaci AHK3:GFP fuzního proteinu (Kim et al., 2006). Nejnovější studie zaměřené na lokalizaci cytokininových receptorů v A. thaliana a kukuřici (Zea mays) s využitím receptor:GFP fuzních proteinů ukazovaly silnou fluorescenci na endoplasmatickém retikulu (Wulfetange et al., 2011, Lomin et al., 2011). V roce 2011 Hothorn et al. uveřejnili krystalovou strukturu sensorové domény receptoru CRE1/AHK4 v komplexu s cytokininy. Ligandy ve vazebném místě receptoru jsou vázány přímo pomocí dvou vodíkových vazeb mezi Asp262 a N6 a N7 atomy cytokininu nebo nepřímo prostřednictvím čtyř molekul vody. U Kin a tZ dochází k tvorbě další vodíkové vazby na postranním řetězci s Thr294 (Hothorn et al., 2011).
Obr. 8. Krystalová struktura sensorové domény receptoru CRE1/AHK4 v komplexu s iP. Vlevo – celková struktura sensorové domény, která vytváří homodimer. Vpravo – detail vazebného místa. Residua ve vzdálenosti 12 Å od substrátu, která vytváří vazebné místo. Substrát iP – modrozeleně, vody v aktivním místě – tmavě modré kuličky, vodíkové interakce – černé přerušované čáry, Asp262 spojen s N6 a N7 atomy iP (pdb 3T4J).
Výše zmíněné tři cytokininové receptory se liší v expresním profilu. CRE1/AHK4 je produkován převážně v kořenech, zatímco AHK2 a AHK3 jsou přítomny ve všech hlavních orgánech (Ueguchi et al., 2001). AHK2, AHK3 a CRE1/AHK4 se skládají z extracelulární cytokinin vázající CHASE domény, cytoplasmatické His kinásové domény, receiver domény a receiver-like domény (Obr. 9).
- 15 -
Obr. 9. Struktura cytokininových receptorů a dalších proteinů cytokininové signální dráhy. Aminokyseliny účastnící se přenosu fosfátu jsou označeny v kruhu. aa – aminokyselina, TM – transmembránová doména, LB – ligand-vazebná doména, HK – histidinkinasa, RLD – receiver-like doména, RD - receiver doména (podle Heyl et Schmülling, 2003).
2.2
AHP V A. thaliana bylo objeveno šest AHP genů, které jsou produkovány ve všech částech
rostliny a jejich transkripce není ovlivněna exogenními cytokininy (Tanaka et al, 2004). AHP jsou 12 kDa proteiny obsahující vysoce konzervovaný motiv XHQXKGSSXS odpovědný za přenos fosfátu (Obr. 10). Hlavní úlohou AHP je přenos signálu z receptoru lokalizovaného v plasmatické membráně na ARR nacházející se v jádře. Bylo zjištěno, že AHP6 (pseudo AHP) se neúčastní přenosu signálu a je považován za negativní regulátor cytokininové signální dráhy (Mähönen et al., 2006).
Obr. 10. Struktura AHP (podle Heyl et Schmülling, 2003).
2.3
ARR Výstupním prvkem signální dráhy jsou response regulátory, jejichž aktivita závisí
na stavu fosforylace. Analýza genomové sekvence z Arabidopsis odhalila existenci 21 předpokládaných genů regulátorů odpovědi (ARR) charakteristických přítomností konzervovaného
aminokyselinového
motivu
DDK
nezbytných
pro
příjem
fosfátu
(To et Kieber, 2007). Podle struktury jsou ARR rozděleny na A-typ a B-typ. Deset A-typů ARR jsou složeny hlavně z přijímačové (receiver) domény a krátkého karboxylového konce a jejich transkripce v přítomnosti exogenních cytokininů rapidně stoupá – jsou považovány za geny primární odpovědi. Naopak 11 B-typů je kromě vysílací domény složeno z C-terminální domény a jejich transkripce není ovlivněna cytokininy (Mason et al., 2004).
- 16 -
Obr. 11. Struktura A-typu a B-typu ARR. Aminokyseliny účastnící se přenosu fosfátu jsou označeny v kruhu. aa – aminokyselina, RD - receiver doména, NLS – jaderná lokalizační sekvence, OD – výstupní doména, AD – kyselá doména, GARP – DNA vázající motiv, P/Q-rich – sekvence obsahující velké množství Pro a Gln (podle Heyl et Schmülling, 2003).
2.4
CRF CRF z Arabidopsis je rodina šesti genů (CRF1-CRF6) patřící do skupiny rostlinných
transkripčních faktorů ze třídy APETALA2. Transkripce tří ze šesti CRF genů závisí na B-typu ARR. Bylo zjištěno, že po ošetření cytokininy se CRF:GFP fuzní proteiny akumulují v jádře. Jejich hromadění závisí na AHK a AHP, ale na A- a B-typu ARR závislé není. CRF proteiny mohou být importovány do jádra za účelem transkripce cílových genů (Rashotte et al., 2006).
2.5
Mechanismus signalizace cytokininů Mechanismus signalizace cytokininů spočívá v aktivaci několika krokové fosfátové
kaskády a genové exprese. V prvním kroku dochází k navázání CK do ligand-vazebné domény receptoru (CHASE doména) na extracelulární straně plasmatické membrány a následné dimerizaci receptoru. Při tomto procesu dochází k autofosforylaci konzervovaného His v histidinkinasové doméně. Aktivace receptoru vede k fosforylaci konzervovaného Asp na vysílací doméně na C-terminálním konci receptoru a dále k fosforylaci AHP (AHP1 – AHP5). CRE1/AHK4, který není navázán na cytokinin, může zprostředkovat reverzní fosforylaci, což má za následek defosforylaci AHP. Fosforylovaný AHP je následně translokován do jádra, kde přenese fosfátovou skupinu na A- nebo B-typ ARR na konzervované residuum (Asp). Přenos fosfátové skupiny z a na AHP může být inhibováno pseudo AHP (AHP6) lokalizovaném v protoxylemu. B-typ ARR je složen z N-koncové receiver domény a C-koncové DNA-vázající domény. V inaktivním stavu obě koncové domény spolu interagují a po fosforylaci dojde k přerušení vzájemné interakce a následné vazbě na DNA a transkripci cílových genů (A-typu ARR a CRF). CRF jsou aktivovány prostřednictvím AHP a následně dochází k jejich akumulaci v jádře a aktivaci transkripce. B-typ ARR a CRF mají částečně překryté transkripční cíle. A-typ ARR je složen z konzervované receiver domény a krátkého C-konce. Fosforylovaný A-typ ARR ovlivňuje funkce fytohormonů a regulaci cirkadiálních rytmů nebo působí jako negativní
- 17 -
regulátor cytokininové signální kaskády, kdy je schopen inhibovat fosforylaci AHP (To et Kieber, 2007).
Obr. 12. Model cytokininové signální kaskády (podle Heyl et Schmülling, 2003).
3
Fluorescenční značky Značení látek patří mezi jednu z nejpoužívanějších metod využívanou pro bioanalytické
účely. K těmto reakcím lze použít radioaktivní materiály nebo sloučeniny s absorpcí a fluorescencí v rozmezí od UV po blízkou IR oblast elektromagnetického záření. Fluorescenční značení se rozkládá přes široké spektrum vlnových délek za použití polovodičových nanokrystalů, fluorescenčních proteinů a organických molekul (Gonçalves, 2009).
- 18 -
3.1
Fluorescenční proteiny Jednou z nejpoužívanějších metod pro fluorescenční lokalizaci proteinů v buňce je tvorba
tzv. fuzních proteinů, kdy za gen sledovaného proteinu je naklonován gen pro fluorescenční protein. První fluorescenční protein (GFP) byl izolován z Aequorea victoria v roce 1962 Osamou Shimomurou (Shimomura, 1962). Objev a vývoj GFP byl oceněn Nobelovou cenou za chemii v roce 2008. GFP se skládá z 238 aminokyselin tvořících β-soudek. Uvnitř struktury se
nachází fluorofor (p-hydroxybenzylidenimidazilonin)
spontánně vytvořený ze
tří
aminokyselin (Ser-Tyr-Gly), jehož absorpční maximum je při 400 nm a emisní maximum při 505 nm. Kromě GFP je známa celá řada dalších fluorescenčních proteinů s emisí od 475 nm až po 650 nm (Shaner et al., 2005).
Obr. 13. Podjednotka GFP proteinu (pdb 1GFL).
3.2
Organické fluoroproby Alternativou k fuzním proteinům je využití nízkomolekulárních organických látek
(substráty, inhibitory, ligandy) vykazujících autofluorescenci nebo označených pomocí organických fluoroprob. Ty mohou být k analyzovanému vzorku připojeny buď kovalentní anebo nekovalentní vazbou. Obecně lze říct, že organické fluoroproby emisí pokrývají celé spektrum vlnových délek. Organické fluoroproby lze rozdělit do skupin podle emisní vlnové délky (od UV-500 nm a nad 500 nm) a dále podle struktury. Příkladem fluorescenčních prob vykazujících fluorescenci ve vlnových délkách od blízké UV po 500 nm jsou oxobenzopyrany, naftofurany, dansyl chlorid atd. V případě organických fluorescenčních prob emitujících nad 500 nm a blízké IR oblasti (900 nm) lze zmínit fluoresceiny, rhodaminy nebo kyaniny (Gonçalves, 2009).
- 19 -
Organické fluoroproby s emisí do 500 nm
3.2.1 3.2.1.1
Fluorescenční značky s kyslíkatými heterocykly
Kumariny, neboli 3-oxo-3H-benzopyrany, představují jednu z nejcitlivějších a komerčně dostupných skupin reagentů pro fluorescenční značení. Substituované kumariny našly využití například při modifikaci aminokyselin nebo nukleových bazí (Gonçalves, 2009). 2-Amino-3-(6,7-dimethoxy-3-oxo-3H-benzopyran)
kyselina
propanová
(Dmca)
(Obr. 14a) byla použita pro kvantitativní detekci syntetických peptidů (Bennett et al., 1999). Dmca má absorpční maximum o vlnové délce 345 nm a emisní maximum při 440 nm a navíc vykazuje vysoký kvantový výtěžek (F = 0,52) a vysoký molární absorpční koeficient ( = 10900 M-1cm-1). Peptidy označené pomocí Dmca bylo možno detekovat v pikomolárních koncentracích, což je citlivost srovnatelná se značením pomocí radioaktivních izotopů. CO 2H A
NH2 H3CO H3CO
O
B
MeO
O
O
abs= 345 nm em= 440 nm
O
C
N
O
COOH abs= 335 nm em= 400 nm
O COOH
abs= 407 nm em= 470 nm
Obr. 14. Příklady fluorescenčních derivátů kumarinu. A/ Dmca, B/ 7-ethoxykumarin-3-karboxylová kyselina, C/ 7-diethylaminokumarin-3-karboxylová kyselina.
Berthelot et al. (2004) použili dva deriváty kumarinu ke značení lysinu, a to 7-ethoxykumarin-3-karboxylovou kyselinu a 7-diethylaminokumarin-3-karboxylovou kyselinu (Obr. 14b a 14c), které byly prvně aktivovány pomocí N-hydroxysuccinimidu. Předpokládá se, že vzniklé produkty mohou sloužit jako fluorescenční stavební bloky pro syntézu peptidů na pevné fázi (Berthelot et al., 2004).
3.2.1.2
Fluorescenční značky se sirnými heterocykly
Oligothiofeny jsou sloučeniny s autofluorescencí, jejíž vlastnosti mohou být synteticky lehce pozměněny. Capabianco et al. ukázali poprvé použití oligothiofenu (terthiofen) jako fluorescenčního tagu pro oligonukleotidy, kde došlo k připojení přes fosfátovou skupinu. Vzniklý konjugát (15b) vykazoval absorpční maxima při 265 nm a 360 nm a emisní maximum při 454 nm (měřeno ve vodě) (Capabianco et al., 2005).
- 20 -
Obr. 15. Fluorescenční značky se sirnými heterocykly. A/ terthiofen, B/ oligonukleotid značený pomocí terthiofenu (podle Gonçalves, 2009).
3.2.1.3
Fluorescenční značky s dusíkatými heterocykly
Jsou známy dvě skupiny fluorescenčních derivatizačních činidel pro aminokyseliny a peptidy, a to benzooxadiazoly a 4,7-fenantrolin-5,6-diony (phanquinony). Benzooxadiazol substituovaný v poloze 4 a 7 (4-chloro-7-nitrobenzooxadiazol, NBD-Cl) je známou značkou používanou pro fluorescenční značení aminokyselin a proteinů. Jeho excitační maximum se pohybuje kolem 470 nm a emisní kolem 530 nm (Gonçalves, 2009). Pomocí NBD-Cl byl také označen cytokinin močovinového typu, konkrétně N-(3-karboxyfenyl)-N‘-(pyrid-4-yl)močovina (viz 1.3.2.). Mezi další fluorescenční značky s dusíkatými heterocykly patří 1,2-benzo-3,4dihydrokarbazol-9-ethyl chloroformiát (BCEOC) a 7-azatryptofan (AW). Druhý zmíněný vykazuje zajímavé optické vlastnosti a je využíván pro sledování proteinové struktury (Schlesinger, 1968), stability (Wong et Eftink, 1997), interakcí mezi makromolekulami (Mohammadi et al., 2001) a proteinových konformačních změn (Blouse et al., 2002). Ve srovnání s tryptofanem vykazuje AW díky dusíkatému atomu v pozici 7 posun v absorpci o 10 nm a v emisním spektru o 46 nm. 4-(N,N-dimethylamino)ftalimid (4-DMAP) je velmi citlivou fluorescenční značkou, jejíž optické vlastnosti závisí na polaritě a viskozitě prostředí. Změnou rozpouštědla z vody do 1,4-dioxanu došlo ke zvýšení kvantového výtěžku a fluorescenční maximum se posunulo až o 100 nm (Soujanya et al., 1996). O A
Cl
B N
NH NH
O N
C
O
-
N NO 2
OCOCl
-
NH
D N
N
N H
O
ex= 470 nm em= 530 nm
Obr. 16. Příklady fluorescenčních látek s dusíkatým heterocyklem. A/ NBD-Cl, B/ AW, C/ 4-DMAP, D/BCEOC.
- 21 -
3.2.1.4
Fluorescenční značky s naftalenovým jádrem
Dansyl chlorid a naftalen-2,3-dikarboxaldehyd (NDA) patři mezi fluoroproby s naftalenovým
jádrem
vhodné
pro
značení
aminokyselin,
peptidů
a
proteinů
(Chersi et al., 1997). N
A
B CHO
O
S
CHO
O
Cl ex= 420 nm em= 480 nm
ex= 337 nm em= 492 nm
Obr. 17. Příklady fluorescenčních látek s naftalenovým jádrem. A/ Dansyl chlorid, B/ NDA.
V roce 2001 Hermetter et al. použili dansyl chlorid pro značení velmi účinného inhibitoru β-glukosidasy z Agrobacterium sp. V prvním kroku bylo na fluorofor připojeno oddalovací ramínko reakcí dansyl chloridu s methyl 6-aminohexanoátem. Po alkalické hydrolýze esteru byl na vzniklou volnou karboxy skupinu připojen 1-amino-1,2,5-trideoxy-2,5-imino-D-mannitol. Vzniklý produkt (Obr. 18) byl využit pro sledování kinetických parametrů β-glukosidasy pomocí fluorescenčních spektrometrických metod (Hermetter et al., 2001). H N HO
HO
OH
O N H
H N
O S O
N
Obr. 18. 1-amino-1,2,5-trideoxy-2,5-imino-D-mannitol značený pomocí dansyl chloridu s využitím oddalovacího ramínka.
Organické fluoroproby s emisí nad 500 nm
3.2.2 3.2.2.1
Fluoresceiny
Fluorescein se řadí mezi nejběžnější fluoroproby používané v biologických aplikacích. Jedná se o polycyklický fluorofor s absorpčním a emisním maximem o hodnotách 490 nm a 512 nm. Fluorofory odvozené od fluoresceinu a jejich vysokomolekulární konjugáty mají také nevýhody, a to například relativně vysokou rychlost fotobleachingu, pH-sensitivní fluorescenci nebo poměrně široké fluorescenční emisní spektrum, omezující jejich použití s více fluorofory zároveň, a v neposlední řadě jejich tendenci ke samozhášení (Gonçalves, 2009).
- 22 -
A
B
HO
O
O
HO
O
COOH
O
COOH
NCS abs= 490 nm em= 512 nm
ex= 485 nm em= 513 nm
Obr. 19. Příklady fluoresceinů. A/ fluorescein, B/ fluorescein isothiokyanát.
3.2.2.2
Rhodaminy
Rhodaminy patří mezi nejstarší syntetická barviva používaná pro barvení textilií. Jsou toxické, rozpustné ve vodě, ethanolu a methanolu a svou strukturou patří mezi xanthenovou skupinu barviv. Obecně mají vysokou molární absorpci ve viditelné oblasti spektra a mnoho derivátů vykazuje silnou fluorescenci. Substituenty připojené na xanthenové jádro silně ovlivňují absorpční a emisní vlastnosti. Rhodaminová barviva našla využití nejen jako textilní pigment, ale také jako fluorescenční barviva pro studování struktury látek v mikroskopii, fotosenzitizérů a laserových barviv. Rhodamine 800 a Texaská červeň patří mezi moderní rhodaminové deriváty používané výhradně v bioanalytickým aplikacím. Jako další xanthenové fluorofory lze zmínit Rhodamin G6, Rhodamine 123, Rhodamin B nebo Rhodamin 110 používané pro biologické aplikace (Gonçalves, 2009).
A N
B
+
O
N
Cl
CN
-
N
COOH
O
+
N
Cl
-
Obr. 20. Příklady rhodaminů. A/ Rhodamin B, B/ Rhodamin 800.
Gilad G. M. a Gilad V. H. lokalizovali ornithin dekarboxylasu (ODC) v myších pomocí Rhodaminu
B.
Fluorescenční
značka
byla
ireverzibilně
navázána
na
inhibitor
α-difluoromethylornithin (α-DMFO) a následně vpravena do mozku a jater pokusných zvířat. Značený inhibitor byl úspěšně cytochemicky lokalizován uvnitř specifických myších mozkových a jaterních buněk (Gilad G. M. et Gilad V. H., 1980).
- 23 -
Další fluorescenční značky
3.2.2.3
Mezi další neméně důležité fluorescenční značky patří BODIPY (Obr. 21a). Strukturně se jedná o molekulu 4,4-difluor-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacenu, kterou lze v pozicích 1, 3, 5, 7 a 8 modifikovat za vzniku různých BODIPY fluoroprob. Komerčně dostupné BODIPY fluoroznačky se používají pro značení peptidů, proteinů, oligonukleotidů a lipidů. Squarainy (Obr. 21c) jsou fluorescenční značky vykazující fluorescenci v oblasti blízké IR oblasti s absorpčním maximem od 630 – 670 nm a emisním maximem od 650 – 700 nm. V současné době se používají jako senzory pro detekci iontů.
A
B N
-
N
Y
X
+
+
N R
B F F
n
N R
S
C
X, Y = O,S, C(CH3)2 nebo C=CH2 n = 0-4 R = (CH2)4SO3-
SO3+
N O
-
N
HOOC abs= 628/373 nm em= 642 nm
Obr. 21. Příklady dalších používaných fluorescenčních značek. A/BODIPY, B/ kyaniny, C/ squarin.
Další zajímavou skupinou fluorescenčních značek jsou kyaniny (Obr. 21b), jejichž základní struktura se skládá z dvou aromatických a heterocyklických kruhů spojených polymethinovým řetězcem. Uplatnění našly nejen v genetické analýze a DNA sekvencování, ale také v in vivo imagingu či proteomice. Kyaniny jsou považovány za hlavní zdroj organických fluoroznaček s excitačním rozsahem mezi 600-900 nm (Gonçalves, 2009).
- 24 -
Experimentální část
- 25 -
4 4.1
Materiál a metody Chemikálie Fluorescenční značky Rhodamin B, kumarin-3-karboxylová kyselina, fluorescein
isothiokyanát (FITC), 4-chlor-7-nitrobenzooxadiazol (NBD-Cl), 5-dimethylaminonaftalen-1sulfonyl chlorid (dansyl chlorid) a dále N-hydroxysukcinimid, MUG, IPTG a glycin byly zakoupeny od firmy Sigma Aldrich, NaHCO3, Na2SO4, DCC od firmy Merck. Triethylamin, MeOH, ACN, DMSO, CHCl3, PrOH, NaCl, Na2CO3 byly získány od firmy Lach-Ner. Aktivní uhlí, CaCl2 bylo zakoupeno od firmy Penta. 3-Methylbut-2-en-1-amin hydrochlorid byl připraven v Laboratoři růstových regulátorů UP a 2,6-dichlorpurin byl pořízen od firmy Olchemim. Během experimentů byla používána demi voda. Rozpouštědla byla vysušena dle literatury (Williams et Lawton, 2010) nad aktivovaným molekulovým sítem (20 % m/v) pod inertní atmosférou a CaCl2 zátkou po dobu 72 hodin. 3 Å molekulové síto (Sigma Aldrich) bylo aktivováno 24 hodinovým sušením v muflové peci při 300 °C. 4.2
Metody Pro sledování průběhu reakcí a orientační čistoty produktů byla použita analytická
tenkovrstvá chromatografie (TLC) na hliníkových foliích Merck Silikagel 60 F254 za použití mobilní fáze CHCl3:MeOH (4:1), n-propanol:NH3:H2O (55:10:35, pro 2 a 3). Vizualizace TLC byla
provedena
pod
UV
lampou
(Camag)
při
vlnové
délce
254
nm nebo
366 nm. Prekurzory pro fluorescenční značení byly vizualizovány pomocí ninhydrinu. Látka 9 byla purifikována s využitím sloupcové chromatografie na silikagelu Davisil 40-63 micron (Grace Davison,) a eluována směsí CHCl3:MeOH (15:1). Vybrané připravené látky byly přečištěny pomocí preparativní chromatografie na koloně XBridge Prep C18 velikosti 100 x 10 mm s pórovitostí 5μm. Separace byla provedena methanolickým gradientem (0’ – 80 % A; 25’ – 5 % A; 30’ – 5 % A; 31’ – 80 % A; 40’ – 80 % A) o průtoku 4,5 mL/min. Mobilní fázi A tvořila voda, mobilní fázi B MeOH. Jednotlivé složky byly detekovány UV detektorem při 254 nm. Bod tání byl změřen na bodotávku Stuart SMP30 a zjištěné hodnoty nebyly korigovány. Čistota připravených produktů byla změřena s použitím vysokoúčinného kapalinového chromatografu (HPLC Alliance 2690 Separations Module, Waters, Milford, MA, USA) na koloně C18 Symmetry (Waters) o průměru 2.1 mm a délky 150 mm s pórovitostí 5 μm. Vzorek byl rozpuštěn v MeOH (1 mg/mL) a naředěn 100 násobně do počáteční mobilní fáze (objem nastřiknutého vzorku – 10μl). Separace byla provedena methanolickým gradientem (0’ – 90% A; 25’ – 10% A; 35’ – 10% A; 36’ – 90% A; 45’ – 10% A) o průtoku 0.25 mL/min.
- 26 -
Mobilní fázi A tvořil 15 mM mravenčan amonný (pH = 4.0), mobilní fázi B MeOH. Složky byly detekovány DAD detektorem (PDA 2996, Waters) v rozmezí 210 – 400 nm. Pro
účely identifikace produktů pomocí
LC-MS byl
eluát
z kolony veden
do hmotnostního spektrometru ZMD 2000 (Micromass, Manchester, UK). Iontový zdroj (ESI) byl vyhříván na teplotu 120°C, desolvatační teplota byla 300°C. Dusík byl použit jako desolvatační i zmlžovací plyn. Ionizace byla dosažena kapilárním napětím 3.0 kV a napětím na vstupní štěrbině 20 V. Měření bylo prováděno pozitivním (ESI+) FULLSCAN módu v rozsahu m/z 50-850. Spektra nukleární magnetické rezonance (NMR) byla změřena na přístroji Bruker Avance 300 MHz, pracující při frekvenci 300,13 MHz (1H). Vzorky byly připraveny rozpuštěním v DMSO-d6 a CDCl3. Spektrální vlastnosti vybraných látek byly změřeny na spektrofotometru Synergy H4 hybrid reader (BioTek) při 28 °C. Pro měření byl připraven roztok o koncentraci 100 µM rozpuštěním v DMSO. 4.2.1
Cytokininové biotesty
Amaranthový biotest Vybrané připravené látky byly testovány v amaranthovém cytokininovém biotestu, ve kterém je sledována indukce biosyntézy betacyaninu v kotyledonu a hypokotylu Amaranthu ve tmě. Biotest byl proveden podle protokolu uvedeném v publikaci Holub et al. (1998). 4.2.2
Receptorové testy
Kompetiční test Kompetiční test je založen na kompetici radioaktivně značeného tZ ([2-3H] tZ) a testované látky, kdy je měřena zbytková radioaktivita navázaného triciovaného tZ na receptor. Vybrané
připravené
látky
byly
testovány
byl
proveden
podle
protokolu
uvedeném
v publikaci
postupu
uvedeném
v publikaci
Romanov et al. (2005). -galaktosidasový test β-galaktosidásový
test
podle
(Spíchal et al., 2004). Pro testování vybraných připravených látek byla použita kultura E. coli obsahující plasmid KMI-001-pIN-III (kódující cytokininové receptory ZmHK1, ZmHK3a nebo CRE1/AHK4). Kultury byly poskytnuty Dr. T. Mizunou (Nagoya, Japonsko). Při přípravě bakteriální pre-kultury bylo odebráno malé množství (cca 10 µL) zásobní kultury E. coli KMI001-pINIII a přeneseno do zkumavky s 3 mL M9 média. Zkumavky byly inkubovány 24 hodin při 25 °C a 300 rpm.
- 27 -
Testované látky a iP (standard) byly naředěny DMSO. Do falkonky o objemu 50 mL byl připraven pre-mix nalitím 20 mL M9 média, připipetováním 34 µL pre-kultury E. coli (ZmHK1 nebo ZmHK3a) a 20 µL ampicilinu (100 mg/mL v demi vodě). Pro indukci ZmHK1a bylo do falkonky přidáno 0,5 µL 25 µM IPTG. Měření bylo prováděno v triplikátech a minimálně dvou opakováních v 96-jamkové destičce. Do jamek byla připravena koncentrační řada testovaných látek (50 µM, 10 µM, 2 µM, 0,4 µM, 80 nM, 16 nM, 3,2 nM a 0,64 nM – finální koncentrace) v celkovém objemu 200 µL. Destička byla kultivována 17 hodin při 25 °C a 450 rpm. Do čisté 96-jamkové destičky bylo napipetováno 5 µL 10 mM MUG a bylo přidáno 50 µL reakční směsi z kultivační destičky připravené v předešlém kroku. Destička byla inkubována 20 minut při 37 °C za tmy. Reakce byla zastavena přidáním 100 µL Stop pufru (132 mM glycin a 83 mM Na2CO3, pH 10,7) a byla proměřena fluorescence na destičkovém spektrofotometru Synergy H4 hybrid reader (BioTek).
Syntéza
4.3 4.3.1
Deriváty iP substituované na C2 atomu purinu
2-chlor-6-[(3-methylbut-2-en-1-yl)amino]-9H-purin (1) 2,6-dichlor-9H-purin (10,9 mmol) byl refluxován 3 hodiny v PrOH (42 mL) s (3-methylbut-2en-1)amin hydrochloridem (1,2 ekv.) a Et3N (4 ekv.) a dále míchán za laboratorní teploty přes noc. Po ochlazení RS na 4 °C byl pevný produkt zfiltrován, promyt vychlazeným PrOH a vychlazenou H2O a vysušen při 50 °C (podle Mik, 2012).
Cl N Cl
HN N
N
N H
+
Et3N NH2 HCl
N
N
PrOH, 3 hod., 100 °C
Cl
N
N H
Obr. 22. Schéma přípravy 2-chlor-6-[(3-methylbut-2-en-1-yl)amino]-9H-purinu.
2-[(2-aminoethyl)amino]-6-[(3-methylbut-2-en-1-yl)amino]-9H-purin (2) 2-chlor-6-[(3-methylbut-2-en-1-yl)amino]-9H-purin
(1)
(14,3
mmol)
byl
zahříván
s ethylendiaminem (20 ekv.) v tlakové ampuli (ACE pressure tube – Sigma Aldrich) po dobu tří hodin při 160 °C. Nadbytek diaminu byl oddestilován. Žlutý pevný odparek byl rozpuštěn v MeOH (20 mL), přečištěn pomocí aktivního uhlí a zahuštěn na RVO. Čistý produkt byl získán krystalizací ze směsi MeOH/EtOAc (1:10) (podle Mik, 2012).
- 28 -
HN
HN N
N Cl
+
N H
N
H2N
NH2
N
N 3 hod, 160 °C
H2N
N H
N H
N
Obr. 23. Schéma přípravy 2-[(2-aminoethyl)amino]-6-[(3-methylbut-2-en-1-yl)amino]-9H-purinu.
2-[(2-aminohexyl)amino]-6-[(3-methylbut-2-en-1-yl)amino]-9H-purin (3) 2-chlor-6-[(3-methylbut-2-en-1-yl)amino]-9H-purin
(1)
(4,2
mmol)
byl
zahříván
s 1,6-diaminohexanem (20 ekv.) v tlakové ampuli po dobu tří hodin při 160 °C. Nadbytek 1,6diaminohexanu
byl
odstraněn
vakuovou
destilací.
Odparek
byl
rozmíchán
ve vychlazené H2O (20 mL) a ponechán přes noc při 4 °C. Vzniklý pevný produkt byl zfiltrován, promyt vychlazenou H2O a vysušen při 50 °C (podle Mik, 2012).
HN N Cl
HN N
N
N H
+
H2N
N
N NH2
3 hod, 160 °C
H2N
N H
N
N H
Obr. 24. Schéma přípravy 2-[(2-aminohexyl)amino]-6-[(3-methylbut-2-en-1-yl)amino]-9H-purinu.
4.3.2 4.3.2.1
Označení C2-substituovaných derivátů iP pomocí fluorescenčních značek Fluorescenční značení Rhodaminem B (5, 6)
Rhodamin B (0,104 mmol) a N-hydroxysukcinimid (1,04 ekv.) byly rozpuštěny v suchém acetonitrilu (2 mL) při 45 °C. K roztoku byl za stálého míchání přidán roztok DCC (1,16 ekv.) v acetonitrilu (1 mL). Výsledná směs byla zahřívána při 45 °C po dobu 1 hod a poté míchána 20 hod za RT. Vzniklá suspenze byla zfiltrována a pevný podíl byl důkladně promyt acetonitrilem. Filtrát byl zahuštěn na RVO na zelený odparek (4). K suspenzi 4 (1 ekv.) v suchém acetonitrilu (1 mL) byl přidán po kapkách roztok aminu 2 nebo 3 (1 ekv.) v uhličitanovém pufru pH 8,6 (1 mL). RS byla míchána 4 hod při RT a poté vychlazena v ledové lázni. Pevný produkt byl zfiltrován, promyt vychlazenou vodou do odbarvení filtrátu a vysušen v sušárně při 50 °C (podle Meng et al., 2007).
- 29 -
O N
A
COOH
N
O
+
+
O Cl
-
HO N
suchý ACN 45 °C, 1hod RT, 20 hod
N
O
O
O
DCC N
+
O Cl
-
N
4
B
HN O
N
N HN 4
+
N
N H2N
CH2
nN H
N
N H
N CH2
CO32- pufr pH 8,6 ACN RT, 4 hod
N
O
H N n
N
N H
N
n = 2 sloučenina 5 n = 6 sloučenina 6
Obr. 25. Fluorescenční značení rhodaminem B. A) Aktivace karboxylové skupiny rhodaminu B pomocí N-hydroxysukcinimidu, B) Značení cytokininových prekurzorů pomocí aktivovaného rhodaminu B.
4.3.2.2
Fluorescenční značení kumarin-3-karboxylovou kyselinou (8, 9)
K roztoku
kumarin-3-karboxylové
kyseliny
(1,05
mmol)
a
N-hydroxysukcinimidu
(1,04 ekv.) rozpuštěném v suchém acetonitrilu (2 mL) při 45 °C byl za stálého míchání přidán roztok DCC (1,16 ekv.) v acetonitrilu (1 mL). Výsledná směs byla zahřívána při 45 °C po dobu 1 hod a následně míchána 20 hod za RT. Pevný vedlejší produkt byl zfiltrován a důkladně promyt acetonitrilem. Filtrát byl zahuštěn na RVO na pevný bílý odparek (7). K suspenzi 7 (1 ekv.) v suchém acetonitrilu (1 mL) byl přidán po kapkách roztok cytokininu 2 nebo 3 (1 ekv.) v uhličitanovém pufru pH 8,6 (1 mL). RS byla míchána 4 hod při RT a poté vychlazena v ledové lázni. Pevný produkt byl zfiltrován, promyt vychlazenou vodou a vysušen v sušárně při 50 °C (podle Meng et al., 2007).
- 30 -
A
O
O COOH
DCC
+ O
HO N
O
O
suchý ACN 45 °C, 1hod RT, 20 hod
O
O
N
O
O
7
B HN
HN 7
+
N
N H2N
CH2
nN H
CO32- pufr pH 8,6
N
ACN RT, 4 hod
N H
CH2
N H O
N
N
O n
N H
N
N H
O
n = 2 sloučenina 8 n = 6 sloučenina 9
Obr. 26. Fluorescenční značení kumarin-3-karboxylovou kyselinou. A) Aktivace karboxylové skupiny kumarin-3-karboxylovou kyselinou pomocí N-hydroxysukcinimidu, B) Značení aminů pomocí aktivované kumarin-3-karboxylové kyseliny.
4.3.2.3
Fluorescenční značení fluorescein isothiokyanátem (10, 11)
Amin 2 nebo 3 (1 ekv., 0,26 mmol) a fluorescein isothiokyanát (1,1 ekv.) byly rozpuštěny v suchém MeOH (3 mL) a zahřívány jednu hodinu v přítomnosti NaHCO3 (3 ekv.) při teplotě 50 °C. Po ochlazení v ledové lázni byl vzniklý pevný produkt zfiltrován, promyt vychlazeným MeOH a vychlazenou vodou a vysušen v sušárně při 50 °C.
N C S HN HN N
N H2N
CH2
nN H
N
N
N
N H
COOH
+ O
O
OH
CH2
NaHCO3 suchý MeOH 50 °C, 1 hod
NH
S
nN H
N
N H
NH
COOH
O
O
OH
n = 2 sloučenina 10 n = 6 sloučenina 11
Obr. 27. Fluorescenční značení fluorescein isothiokyanátem.
4.3.2.4
Fluorescenční značení 4-chlor-7-nitrobenzooxadiazolem (12, 13)
Látka 2 nebo 3 (1 ekv.), 4-chlor-7-nitrobenzooxadiazol (1,1 ekv., 0,77 mmol) a NaHCO3 (3 ekv.) byly zahřívány v suchém MeOH (3 mL) na 50 °C po dobu jedné hodiny. Po ochlazení
- 31 -
RS v ledové lázni byl pevný produkt zfiltrován, promyt vychlazeným MeOH a vychlazenou vodou a vysušen v sušárně při 50 °C.
HN N
N H2N
CH2
nN H
HN
Cl
N H
N
NaHCO3
N
+
O
suchý MeOH HN 50 °C, 1 hod
N NO 2
N
N CH2
nN H
N H
N
N O N NO 2 n = 2 sloučenina 12 n = 6 sloučenina 13
Obr. 28. Fluorescenční značení 4-chlor-7-nitrobenzooxadiazolem.
4.3.2.5
Fluorescenční značení 5-dimetylaminonaftalen-1-sulfonyl chloridem (14, 15)
K cytokininovému aminu 2 nebo 3 (1 ekv., 0,38 mmol) v suchém DMSO (3 mL) byl přidán 5-dimethylaminonaftalen-1-sulfonyl chlorid (1,1 ekv.) a NaHCO3 (3 ekv.). Směs byla míchána za RT přes noc. K RS byla přidána H2O (25 mL) a následně byla provedena extrakce EtOAc (5x 5 mL). Spojené organické extrakty byly promyty vodou (3x 10 mL), nasyceným roztokem NaCl (3x 10 mL), vysušeny nad Na2SO4 a odpařeny na RVO.
Cl HN CH2
nN H
N
N H
S
HN O
+
NH O
N
N
N
50 °C, 1 hod
N
N H2N
O
S
CH2 O
nN H
N
N n = 2 sloučenina 14 n = 6 sloučenina 15
Obr. 29. Fluorescenční značení 5-dimethylaminonaftalen-1-sulfonyl chloridem.
- 32 -
N H
5
Výsledky a diskuse Syntéza
5.1
5.1.1 Prekurzory pro fluorescenční značení 2-chlor-6-[(3-methylbut-2-en-1-yl)amino]-9H-purin (1) Perleťově bílá látka, výtěžek: 85,0 %, bod tání: 236-238 °C. ES+-MS m/z (rel. int. %): 240,4 (21, [M+H]+), 238,4 (100, [M+H]+). H NMR (300 MHz, DMSO-d6) ppm: 1.68 (s, 3H, -CH3), 1.72 (s, 3H, -CH3), 4.00 (bs, 2H,
1
-CH2-), 5.28 (t, J = 6,4 Hz, 1H, -CH=), 8.10 (s, 2H, -NH-, H8), 12.98 (s, 1H, H9). 2-[(2-aminoethyl)amino]-6-[(3-methylbut-2-en-1-yl)amino]-9H-purin (2) Žlutá pevná látka, výtěžek: 60,0 %, bod tání: 125-127 °C. ES+-MS m/z (rel. int. %): 263,5 (16, [M+H]+), 262,5 (100, [M+H]+). H NMR (300 MHz, DMSO-d6) ppm: 1.67 (s, 3H, -CH3), 1.68 (s, 3H, -CH3), 2.68 (t,
1
J = 6.3 Hz, 2H, -CH2-), 3.17-3.26 (m, 2H, -CH2-), 4.02 (bs, 2H, -CH2-), 5.30 (t, J = 6,2 Hz, 1H, -CH=), 6.12 (t, J = 6,3 Hz, 1H, -NH-), 7.06 (bs, 1H, -NH-), 7.62 (s, 1H, H8).
2-[(2-aminohexyl)amino]-6-[(3-methylbut-2-en-1-yl)amino]-9H-purin (3) Světle žlutá pevná látka, výtěžek: 93,0 %, bod tání: 155-157 °C. ES+-MS m/z (rel. int. %): 319,5 (19, [M+H]+), 318,5 (100, [M+H]+). H NMR (300 MHz, DMSO-d6) ppm: 1.17-1.42 (m, J = 18 Hz, 8H, 4 x -CH2-), 1.42-1.59
1
(m, 2H, -CH2-), 1.67 (s, 3H, -CH3), 1.68 (s, 3H, -CH3), 3.16-3.26 (m, 2H, -CH2-), 4.02 (bs, 2H, -CH2-), 5.31 (t, J = 6,4 Hz, 1H, -CH=), 6.06 (t, J = 5,1 Hz, 1H, -NH-), 7.00 (bs, 1H, -NH-), 7.60 (s, 1H, H8).
5.1.2
Fluorescenční značení
5.1.2.1 Fluorescenční značení Rhodaminem B N-hydroxysukcinimidyl rhodamin B ester (4) Tmavě zelená látka, výtěžek: kvantitativní. H NMR (300 MHz, CDCl3) ppm: 1.35 (t, J = 7,0 Hz, 12H, 4 x -CH3), 2.79 (s, 4H, 2 x
1
-CH2-), 3.66 (q, J = 7,0 Hz, 8H, 4 x -CH2-), 6.83-6.93 (m, J = 5,8 Hz, 4H), 7.09 (d, J = 10,0 Hz, 2H), 7.28 (s, 1H), 7.49 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 7.84 (t, J = 7,3 Hz, 1H), 8.00 (t, J = 7,1 Hz, 1H), 8.43 (d, J = 8,0 Hz, 1H).
- 33 -
Rhodaminem B značený 2-[(2-aminoethyl)amino]-6-[(3-methylbut-2-en-1-yl)amino]-9Hpurin (5) Růžová pevná látka, výtěžek: 98,8 %. ES+-MS m/z (rel. int. %): 687,9 (22, [M+H]+), 686,5 (100, [M+H]+). H NMR (300 MHz, DMSO-d6) ppm: 1.05 (t, 12H, J = 6.9 Hz, 4 x -CH3), 1.64 (s, 3H,
1
-CH3), 1.67 (s, 3H, -CH3), 2.96 (bs, 2H, -CH2-), 3.27 – 3.29 (m, 10H, 5 x -CH2-), 3.90 (bs, 2H, -CH2-), 5.25 (app t, 1H, =CH-), 5.93 (app t, 1H, -NH-), 6.32-6.35 (m, 5H, HAr.), 6.987.00 (m, 2H, HAr), 7.49 (t, J = 4.3 Hz, 2H, HAr), 7.59 (s, 1H, H8), 7.78 (t, J = 4.3 Hz, 1H, HAr), 12.02 (vbs, 1H, H9). Rhodaminem B značený 2-[(2-aminohexyl)amino]-6-[(3-methylbut-2-en-1-yl)amino]-9Hpurin (6) Růžová pevná látka, výtěžek: 99,1 %. ES+-MS m/z (rel. int. %): 743,6 (42, [M+H]+), 742,6 (100, [M+H]+). H NMR (300 MHz, DMSO-d6) ppm: 1.00 – 1.08 (m, 16H, 2 x -CH2-, 4 x -CH3), 1.30 (bs,
1
2H, -CH2-), 1.40 (s, 6H, 2 x -CH3), 2.94 (bs, 2H, -CH2-), 3.06 (bs, 2H, -CH2-), 3.28-3.33 (m, 10H, 5x -CH2-), 3.99 (bs, 2H, -CH2-), 5.28 (app t, 1H, -CH=), 5.96 (s, 1H, -NH-), 6.27-6.36 (m, 5H, HAr), 7.04 (bs, 2H, HAr), 7.50 (bs, 2H, HAr), 7.59 (s, 1H, H8), 7.76 (bs, 1H, HAr), 12.08 (vbs, 1H, H9). C NMR (75 MHz, DMSO-d6) ppm: 18.31, 25.00, 25.91, 26.74, 26.89, 28.31, 29.62, 33.89,
13
41.60, 48.05, 64.52, 97.73, 105.84, 108.66, 113.61, 122.71, 123.51, 124.16, 128.78, 128.95, 131.52, 132.84, 133.03, 135.27, 148.89, 153.26, 153.63, 154.76, 157.16, 159.96, 167.16.
5.1.2.2
Fluorescenční značení kumarin-3-karboxylovou kyselinou
N-hydroxysukcinimidyl kumarin ester (7) Bílá pevná látka, výtěžek: kvantitativní. H NMR (300 MHz, DMSO-d6) ppm: 2.90 (s, 4H, 2 x -CH2-), 7.44 - 7.51 (m, 2H, 2 x
1
HAr), 7.84 (t, J = 7 Hz, 1H, HAr), 8.04 (d, J = 7.8 Hz, 1H, HAr), 9.14 (s, 1H, HAr). Kumarinem značený 2-[(2-aminoethyl)amino]-6-[(3-methylbut-2-en-1-yl)amino]-9H-purin (8) Nažloutlá pevná látka, výtěžek: 92,2 %. ES+-MS m/z (rel. int. %): 435,5 (20, [M+H]+), 434,4 (100, [M+H]+). H NMR (300 MHz, DMSO-d6) ppm: 1.64 (s, 3H, -CH3), 1.67 (s, 3H, -CH3), 3.42 (bs, 2H,
1
-CH2-), 3.52 (app. t, 2H,-CH2-), 4.01 (bs, 2H, -CH2-), 5.29 (app t, 1H, -CH=), 6.37 (bs, 1H,
- 34 -
-NH-), 7.11 (bs, 1H, -NH-), 7.41 – 7.51 (m, 2H, 2 x HAr), 7.52 – 7.76 (m, 1H, HAr), 7.97 (d, J = 7.4 Hz, 1H, HAr), 8.84 – 8.86 (m, 2H, H8, HAr), 12.13 (vbs, 1H, H9). Kumarinem značený 2-[(2-aminohexyl)amino]-6-[(3-methylbut-2-en-1-yl)amino]-9H-purin (9) Nažloutlá pevná látka, výtěžek: 43,0 %. ES+-MS m/z (rel. int. %): 491,5 (22, [M+H]+), 490,4 (100, [M+H]+). H NMR (300 MHz, DMSO-d6) ppm: 1.02 (bs, 6H,-CH2-), 1.33 (bs, 4H, -CH2-), 1.65 (s,
1
6H, 2 x -CH3), 3.31 (bs, 2H, -CH2-), 3.99 (bs, 2H, -CH2-), 3.99 (bs, 2H, -CH2-), 5,28 (s, 2H, -CH=), 6.12 (s, 1H, -NH-), 7.05 (s, 1H, -NH-), 7. 94 (m, 2H, HAr), 7.74 (t, 1H, HAr), 7.97 (d, 1H, HAr), 8.48 (s, 1H, H8), 12.11 (vbs, 1H, H9).
5.1.2.3
Fluorescenční značení fluoresceinem isothiokyanátem
Fluorescein isothiokyanátem značený 2-[(2-aminoethyl)amino]-6-[(3-methylbut-2-en-1yl)amino]-9H-purin (10) Oranžově-červená pevná látka, výtěžek: 33,0 %. ES+-MS m/z (rel. int. %): 652,2 (11, [M+H]+), 651,3 (28, [M+H]+). 326,3 (100, [M+2H]2+). H NMR (300 MHz, DMSO-d6) ppm: 1.64 (s, 3H, -CH3), 1.67 (s, 3H,
1
-CH3), 3.31 (bs, 2H, -CH2-), 3.69 (bs, 2H, -CH2-), 4.01 (bs, 2H, -CH2-), 5.29 (app. t, 1H, =CH-), 6.31 (app. t, 1H, -NH-), 6.64 (m, 4H, HAr), 6,65 (d, J = 9 Hz, 2H, 2 x HAr.), 7.07 (d, J = 9 Hz, 1H, HAr), 7.12 (bs, 1H, -NH-), 7.62 (s, 1H, HAr), 7.67 (bs, 1H, HAr), 8.19 (s, 1H, H8), 8.39 (vbs, 1H, -NH-), 10.22 (vbs, 1H, -OH), 12.26 (vbs, 1H, H9). Fluorescein isothiokyanátem značený 2-[(2-aminohexyl)amino]-6-[(3-methylbut-2-en-1yl)amino]-9H-purin (11) Oranžová pevná látka, výtěžek: 61,4 %. ES+-MS m/z (rel. int. %): 708,2 (22, [M+H]+), 707,2 (48, [M+H]+), 390,2 (100, [M+2H]2+). H NMR (300 MHz, DMSO-d6) ppm: 1.33 (bs, 4H, 2 x -CH2-), 1.53 (bs, 4H, 2 x -CH2-),
1
1.68 (s, 3H, -CH3), 1.67 (s, 3H, -CH3), 3.23 (bs, 2H, -CH2-), 3.47 (bs, 2H, -CH2-), 4.02 (bs, 2H, -CH2-), 5.30 (app. t, 1H, =CH2-), 6,12 (app. t, 1H, -NH-), 6.55 (d, J = 9 Hz, 2H, 2 x HAr), 6.60 (m, 4H, 4 x HAr), 7.03 (s, 1H, -NH-), 7.13 (d, J = 6 Hz, 1H, HAr), 7.60 (s, 1H, HAr), 7.70 (bs, 1H, HAr), 8.18 (bs, 1H, -NH-), 8.21 (s, 1H, H8), 9.95 (vbs, 1H, -OH), 12.10 (vbs, 1H, H9).
- 35 -
5.1.2.4
Fluorescenční značení NBD-Cl
NBD značený 2-[(2-aminoethyl)amino]-6-[(3-methylbut-2-en-1-yl)amino]-9H-purin (12) Hnědá pevná látka, výtěžek: 74,0 % ES+-MS m/z (rel. int. %): 426,5 (17, [M+H]+), 425, 3 (100, [M+H]+). H NMR (300 MHz, DMSO-d6) ppm: 1.65 (s, 3H, -CH3), 1.66 (s, 3H, -CH3), 3.39-3.73
1
(m, 4H, 2 x -CH2-), 3.99 (bs, 2H, -CH2-), 5.29 (app. t, 1H, -CH=), 6.07 (d, J = 8,0 Hz, 1H, HAr), 6.20 (bs, 1H, -NH-), 7.10 (bs, 1H, -NH-), 7.70 (s, 1H, H8), 7.84 (d, J = 8,0 Hz, 1H, HAr), 12.17 (s, 1H, H9).
NBD značený 2-[(2-aminohexyl)amino]-6-[(3-methylbut-2-en-1-yl)amino]-9H-purin (13) Hnědá pevná látka ES+-MS m/z (rel. int. %): 482,2 (21, [M+H]+), 481,3 (100, [M+H]+). H NMR (300 MHz, DMSO-d6) ppm: 1.37 (bs, 6H, 3 x -CH2-), 1.49-1.57 (m, 2H, -CH2-),
1
1.64 (s, 3H, -CH3), 1.66 (s, 3H, -CH3), 3.14-3.26 (m, 2H, -CH2-), 3.45 (app.t, 2H, -CH2-), 4.00 (s, 2H, -CH2-), 5.29 (app.t, 1H, -CH=), 6.36 (d, J = 8,0 Hz, 1H, HAr), 7.05 (bs, 1H, -NH-), 7.60 (s, 1H, H8), 8.46 (d, J = 8,0 Hz, 1H, HAr), 9.55 (bs, 1H, -NH-), 12.08 (s, 1H, H9).
5.1.2.5
Fluorescenční značení dansyl chloridem
Dansyl chloridem značený 2-[(2-aminoethyl)amino]-6-[(3-methylbut-2-en-1-yl)amino]-9Hpurin (14) Nažloutlá pevná látka ES+-MS m/z (rel. int. %): 496,2 (22, [M+H]+), 495,2 (100, [M+H]+). H NMR (300 MHz, DMSO-d6) ppm: 1.63 (s, 3H, -CH2-), 1.67 (m, 2H, -CH2-), 1.88 (s,
1
6H, 2x -CH3), 3.00 (app. t, 2H, -CH2-), 3.25-3.33 (m, 2H, -CH2-), 3,98 (bs, 2H, -CH2-), 5.26 (app.t, 1H, -CH=), 6.17 (app. t, 1H, -NH-), 7.17 (d, J = 6,0 Hz, 1H, HAr) 7.52 (m, 2H, 2 x HAr), 7.68 (s, 1H, H8), 8.33 (d, J = 9,0 Hz, 1H, HAr). Dansyl chloridem značený 2-[(2-aminohexyl)amino]-6-[(3-methylbut-2-en-1-yl)amino]-9Hpurin (15) Nažloutlá pevná látka, výtěžek: 1,7 % ES+-MS m/z (rel. int. %): 552,6 (25, [M+H]+), 551,4 (100, [M+H]+). H NMR (300 MHz, DMSO-d6) ppm: 1.65 (s, 3H, -CH2-), 1.69 (m, 2H, -CH2-), 1.87 (s,
1
6H, 2x -CH3), 3.34 (bs, 2H, -CH2-), 3.91 (bs, 2H, -CH2-), 3.92 (bs, 2H, -CH2-), 3,98 (bs, 2H,
- 36 -
-CH2-), 5.30 (app.t, 1H, -CH=), 6.17 (app. t, 1H, -NH-), 7.14 (d, 1H, HAr) 7.51 (m, 2H, 2 x HAr), 7.66 (s, 1H, H8), 8.33 (d, J = 9,0 Hz, 1H, HAr).
Tab. 1. Přehled připravených fluorescenčně značených cytokininových derivátů. Látka Fluorescenční Ramínko Výtěžek HPLC čistota Spektrální vlastnosti značka [%] [%] max ex [nm] max em [nm] Rhodamin B 2AmEAm 98,8 97,3 552 578 5 Rhodamin B 2AmHAm 99,1 98,1 554 588 6 Kumarin 2AmEAm 92,2 98,0 8 Kumarin 2AmHAm 43,0a 86,4 9 FITC 2AmEAm 33,0a 87,2 10 FITC 2AmHAm 61,4 66,1 11 NBD-Cl 2AmEAm 74,0 97,0 470 554 12 NBD-Cl 2AmHAm -b 99,4 480 552 13 Dansyl chlorid 2AmEAm -b 99,9 14 Dansyl chlorid 2AmHAm 1,7a 87,5 15 a) Surový výtěžek před chromatografickým čištěním. b) Výtěžek nezjištěn z důvodu přečištění části produktu pomocí preparativní HPLC. Oddalovací ramínka: 2AmEAm – 2-aminoethylamino, 2AmHAm – 2-aminohexylamino.
Výsledky syntézy připravených fluorescenčně značených cytokininových derivátů jsou přehledně shrnuty v Tab. 1. Při syntéze rhodaminových derivátů byla použita metodika pro fluorescenční značení glycinu, kde byla Rhodaminem B značená aminokyselina připravena s výtěžkem 63 % (Meng et al., 2008). Látky 2 a 3 se stejnou metodikou podařilo připravit v porovnání s literaturou s výrazně vyšším výtěžkem (99 %). Analogický postup byl následně aplikován na deriváty kumarinu (8, 9), kde karboxylová skupina kumarinu byla aktivována N-hydroxysukcinimidem. Látka 8 byla připravena opět s vysokým výtěžkem (92 %) a vysokou čistotou. Zatímco v případě látky 9 byla použitá metodika méně úspěšná, výtěžek pouze 43 %. Následný pokus o přečištění látky 9 pomocí preparativní HPLC byl neúspěšný. Důvodem byla nestabilita produktu při aplikovaných podmínkách. Rhodaminem B byly značeny také cytokininy močovinového typu, kde byla použita jiná strategie. Fluorescenční značka byla v prvním kroku modifikována připojením 1,3-propandiolem (výtěžek 54 %) a následně připojena na karboxylovou skupinu 4PU (88 % ) (Zawadski et al., 2010). Při fluorescenčním značení derivátů cytokininů pomocí FITC byla aplikována metodika použitá pro značení N9-substituovaných derivátů cytokininů (Szüčová L., nepublikovaná data). Průběh reakce a výtěžky získaných látek 10 a 11 (33 % a 61 %, respektive) naznačují, že danou metodiku nelze aplikovat na C2-substituované deriváty cytokininů s volnou N9 pozicí. Přítomnost kontaminantů s blízkým retenčním časem jako u požadovaných produktů zabránilo následné purifikaci pomocí preparativní HPLC. Fluorescenční značení pomocí NBD bylo úspěšně provedeno na derivátu iP prostřednictvím krátkého oddalovacího ramínka v pozici N9 na purinovém kruhu s výtěžkem 52 % (Mik, 2012). Použitou metodikou byla připravena látka v dostatečné čistotě bez nutnosti chromatografické purifikace. Analogickým postupem byla
- 37 -
připravena látka 12, a to s výtěžkem 74 % a čistotou 97 %. Látku 13 bylo ale pro další použití nutné přečistit pomocí preparativní HPLC. Zawadski et al. použili jiný postup pro značení 4PU pomocí NBD-Cl. V prvním kroku byl k NBD-Cl připojen 1,3-diaminopropan s výtěžkem 27 %. Takto modifikovaný
NBD byl
připojen
na karboxylovou skupinu 4PU
(13 %)
(Zawadski et al., 2010). Při fluorescenčním značení pomocí dansyl chloridu byla použita metodika pro značení různých aminů v uhličitanovém pufru (Bartzatt, 2001). Výtěžky látek 14 a 15 byly minimální. Látka 14 byla úspěšně přečištěna pomocí preparativní HPLC a látku 15 nebylo možné připravit v množství větším než pro charakterizaci pomocí NMR a ES+-MS analýzu. Důvodem je pravděpodobná nestabilita reagentů ve vodném prostředí a opět volná poloha v pozici N9 na purinovém skeletu. Fluorescenční značení pomocí dansyl chloridu v poloze N9 bylo provedeno analogickou metodou s úspěšnějšími výsledky (výtěžek 65 %) (Mik, 2012).
- 38 -
5.2 5.2.1
Biologická aktivita připravených látek Amaranthový biotest Vybrané připravené látky byly otestovány v amaranthovém biotestu a výsledky jsou
shrnuty v Tab. 2. Tab. 2. Přehled vybraných fluorescenčně značených cytokininových derivátů v amaranthovém testu. Optimální koncentrace Relativní aktivita Testovaná látka [mol/L] [%] -5 10 100 iP -4 10 10,6 5 10-4 13,7 6 -4 10 34,0 8 10-4 51,1 12 -4 10 24,8 13 10-4 31,0 14 Optimální koncentrace: koncentrace, při které testovaná látka vykazuje nejvyšší cytokininovou aktivitu. Relativní aktivita: aktivita testované látky v optimální koncentraci v porovnání s aktivitou standardu (iP) v optimální koncentraci.
Modifikací molekuly iP došlo k poklesu aktivity u všech testovaných látek v porovnání s mateřskou molekulou. V porovnání s ostatními látkami vykazovala nejvyšší cytokininovou aktivitu látka 12 s relativní aktivitou 51 % v optimální koncentraci 10-4 M. Látky 5 a 6 vykazovaly aktivitu zcela minimální (10,6 % a 13,7 %). Ostatní látky 8, 13, 14 byly pouze slabě aktivní. Jejich aktivita se pohybovala okolo 30 %. Z grafů (Obr. 30 a Obr. 31) je patrné, že míra cytokinové aktivity závisí na vlastnostech fluorescenční značky (např. velikost, polarita) a také na délce oddalovacího ramínka. Látky 8, 12 a 14 s krátkými oddalovacími ramínky označené kumarinem, NBD a dansylem, vykazovaly vyšší cytokininovou aktivitu než látky 5 a 6 označené Rhodaminem B nebo látka 13 označená NBD s dlouhým oddalovacím ramínkem. 0,35 iP DifAbsorbance [537-620nm] 0,30 5 6
0,25
Control 13
0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 1,E-09
1,E-08
1,E-07
1,E-06
1,E-05
Koncentrace [mol/L]
Obr. 30. Amaranthový test látek 5, 6 a 13 s porovnáním s iP.
- 39 -
1,E-04
1,E-03
DifAbsorbance [537-620nm]
0,45 iP
0,40
8
0,35
14
0,30
Control 12
0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 1,E-09
1,E-08
1,E-07
1,E-06
1,E-05
1,E-04
1,E-03
Koncentrace [mol/L]
Obr. 31. Amaranthový test látek 8, 14 a 12 s porovnáním s iP.
Fluorescenčně značené N9-substituované deriváty iP s krátkým oddalovacím ramínkem značené pomocí NBD-Cl a dansyl chloridu vykazovaly v amaranthovém testu relativně vysokou cytokininovou aktivitu v porovnání s BA. Derivát iP značený dansylem vykazoval aktivitu 49,6 % a druhý, značený NBD, měl aktivitu 69,4 % v optimální koncentraci 10-4 M (Mik, 2012).
5.2.2
Receptorové testy
5.2.2.1
Kompetiční test Látky 5, 6, 12, 13 byly otestovány v kompetičním testu na cytokininovém receptoru
CRE1/AHK4. Z testovaných látek vykazovala nejvyšší schopnost interagovat s receptorem CRE1/AHK4 látka 6 (7,2 %) (Obr. 32). Látky 5 a 12 měly pouze slabý vliv na vazbu radioaktivně značeného tZ do receptoru (64,9 % a 80,4 %), zatímco látka 13 neinteragovala s receptorem vůbec (118,3 %). CRE1/AHK4
Radioaktivita (DPM)
5600 5400 5200 5000 4800 4600 4400 4200 4000 3800 3600 3400 Kontrola
tZ 1 µM
5
6
12
13
Látky
Obr. 32. Kompetiční test vybraných připravených látek na cytokininovém receptoru CRE1/AHK4. DPM – počet rozpadů za minutu (decay per minute). Látky 5, 6, 12 a 13 byly testovány v koncentraci 10 µM.
- 40 -
Látka 6 byla dále otestována v kompetičním testu při různých koncentracích (Obr. 33). Byl potvrzen kompetiční charakter vazby, kdy se zvyšující se koncentrací roste schopnost testované látky se vázat do receptoru CRE1/AHK4 a bránit vazbě triciovaného tZ (maximum při koncentraci 20 µM). CRE1/AHK4 9000
Radioaktivita (DPM)
8000 7000 6000 5000 4000
µM 0, 5
µM 1
µM
µM 5
20
10
µM
µM 6
20 B
10 lá tk a
µM
µM 10 tZ Rh
od am in
[2 -3 H
]t Z
3000
Obr. 33. Kompetiční test látky 6 na cytokininovém receptoru CRE1/AHK4 při různých koncentracích.
5.2.2.2
β-galaktosidasový test Látky 6 a 13 byly testovány na receptorech ZmHK1 a CRE1/AHK4 (0br.34).
Z výsledků je patrné, že látka 6 má schopnost aktivovat oba testované receptory, zejména ZmHK1, zatímco látka 13 nevykazovala aktivitu téměř žádnou ani v jednom z testování. Testováním látky 13 byly potvrzeny výsledky z kompetičního testu.
Obr. 34. β-galaktosidasový test na receptorech ZmHK1 a CRE1/AHK4 pro látky 6 a 13.
Dalšími látkami testovanými na receptorech ZmHK1 a ZmHK3a byly 5 a 8. Ani jedna ze jmenovaných látek nezpůsobovala indukci reportérového genu.
- 41 -
Již dříve bylo i k jiným fytohormonům (kyselina abscisová a giberelinová) připojena fluorescenční značka (FITC) prostřednictvím oddalovacího ramínka (Obr. 35). A
S
H N
COOH H N
NH HOOC
OH N
O
O
O
O
H
OC OH
S
HO H COOH
S
H N
O O
n S n=3a4
B
OH O HO
Obr. 35. Fluorescenčně značená kyselina abscisová (A) a giberelinová (B) pomocí FITC.
Připravené látky byly použity k in vivo lokalizaci receptorů v rostlinách. Pomocí konfokální mikroskopie bylo ukázáno, že fluorescenčně značená kyselina abscisová se vázala na receptory lokalizované v cytoplasmatické membráně aleuronových protoplastů ječmene (Hordeum vulgare) (Asami et al., 1997). Interakce receptoru pro kyselinu giberelinovou s připravenými fluorescenčními látkami v in vivo experimentu byla prokázána tvorbou a sekrecí β-amylasy v aeluronových protoplastech ječmene (Pulici et al., 1996). Na základě provedených in vitro receptorových testů a již v minulosti studovaných aplikací fluorescenčně značené kyseliny abscisové a giberelinové v ječmeni lze očekávat úspěšnost v in vivo lokalizaci cytokininových receptorů. V současné době již probíhají prvotní experimenty za použití konfokální mikroskopie.
- 42 -
6
Závěr V teoretické části práce byla provedena literární rešerše o cytokininech, derivátech
roslinných hormonů cytokininů značených fluorescenčními značkami, signální kaskádě a přehledu malých organických fluoroprob. V praktické části byly připraveny dva deriváty N6-isopentenyladeninu substituované v poloze C2 na purinovém skeletu alifatickým postranním řetězcem zakončeným primární aminoskupinou, na kterou bylo následně připojeno pět různých fluorescenčních
značek
(Rhodamin
B,
kumarin-3-karboxylová
kyselina,
fluorescein
isothiokyanát, dansyl chlorid a 4-chlor-7-nitrobenzooxadiazol). Vybrané ve
připravené
látky
standardním amaranthovém
byly
biotestu
testovány a
na
na
interakci
cytokininovou
aktivitu
s cytokininovými
receptory
(CRE1/AHK4, ZmHK1, ZmHK3a). V amaranthovém testu vykazovala nejvyšší cytokininovou aktivitu látka 12. Pomocí kompetičního testu bylo zjištěno, že látka 6 je vhodným vazebným partnerem a její schopnost vázat se do receptoru CRE1/AHK4 roste se zvyšující se koncentrací. Navíc tato látka vykázala nejvyšší aktivitu v β-galaktosidasovém testu na cytokininovém receptoru ZmHK1 a CRE1/AHK4. Na základě výše zmíněných receptorových testů a výsledků s využitím fluorescenčně značených derivátů kyseliny abscisové a giberelinové je možné připravené látky použít pro in vivo lokalizaci cytokininových receptorů nebo pro studium kinetických parametrů mezi cytokinin-vazebnými proteiny a připravenými fluorescenčními látkami. Výsledky této práce jsou součástí připravované publikace.
- 43 -
7
Literatura
Asami T., Tao L., Yamamoto S., Ichinose K., Nakano T., Min Y.-K., Murofushi N., Yoshida S. (1997) Visualisation of binding of bioactive fluorescence-labeled abscisic acid to barley aleurone protoplasts. RIKEN Review 15, 43-44. Bartzatt R. (2001) Fluorescent labeling of drugs and simple organic compounds containing amine functional groups, utilizing dansyl chloride in Na2CO3 buffer. J. Pharmacol. Toxicol. 45, 247-253. Bault M., Maldiney R, Miginiac E. (1997) Cytokinin-binding proteins. Physiol. Plant. 100, 520527. Bennett F. A., Barlow D. J., Dodoo A. N. O., Hider R. C., Lansley A. B., Lawrence M. J., Marriott Ch., Bansal S. S. (1999) Synthesis and properties of (6,7-dimethoxy-4coumaryl)alanine: a fluorescent peptide label. Anal. Biochem. 270, 15-23. Berthelot T., Laïn G., Latxague L., Déleris G. (2004) Synthesis of novel fluorogenic L-Fmoc lysine derivatives as potential tools for imaging cells. J. Fluoresc. 14, 671-675. Blouse G. E., Perron M. J., Thompson J. H., Day D. E., Link Ch. A., Shore J. D. (2002) A concerted structural transition in the plasminogen activator inhibitor-1 mechanism of inhibition. Biochemistry 41, 11997-12009. Capabianco M. L., Naldi M., Zambianchi M., Barbarella G. (2005) Oligothiophene phosphoramidites for oligonucleotide labelling. Tetrahedron Lett. 46, 8181-8184. Cline M. G. (1991) Apical dominance. Bot. Rev. 57, 318-346. Davies P. J. (2004) The plant hormones: their nature, occurence, and function. In Plant hormones: biosynthesis, signal transduction, action! 3rd Edition (Davies P. J., ed.), pp. 7-8, Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, The Netherlands. Eisinger W. (1976) Role of cytokinins in carnation flower senescence. Plant Physiol. 59, 707709. Fujimoto Y., Nagata R., Fukasawa H., Yano K., Azuma M., Iida A., Sugimoto S., Shudo K., Hashimoto Y. (1998) Purification and cDNA cloning of cytokinin-specific binding protein from mung bean (Vigna radiata). Eur. J. Biochem. 258, 794-802. Gan S., Amasino R. M. (1995) Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin. Science 270, 1986-1988. Gan S., Amasino R. M. (1996) Cytokinins in plant senescence: From spray and pray to clone and play. Bioassays 18, 557-565. Gilad G. M., Gilad V. H. (1980) Cytochemical localization of ornithine decarboxylase with rhodamine or biotin-labeled -difluoromethylornithine. J. Histochem. Cytochem. 29, 687692.
- 44 -
Gonçalves M. S. T. (2009) Fluorescent labeling of biomolecules with organic probes. Chem. Rev. 109, 190-212. Grayburn W. S., Green P. B., Steucek G. (1982) Bud induction with cytokinin: A local response to local application. Plant Physiol.69, 682-686. Hamaguchi N., Iwamura H., Fujita T. (1985) Fluorescent anticytokinins as a probe for binding. Isolation of cytokinin-binding proteins from the soluble fraction and identification of a cytokinin-binding site on ribosomes of tobacco callus cells. Eur. J. Biochem. 153, 565-572. Harrison M. A., Kaufman P. B. (1980) Hormonal regulation of lateral bud (tiller) release in oats (Avena sativa L.). Plant Physiol. 66, 1123-1127. Heindl J. C., Carlson D. R., Brun W. A., Brenner M. L. (1982) Ontogenetic variation of four cytokinins in soybean root pressure exudate. Plant Physiol. 70, 1619-1625. Hermetter A., Scholze H., Stütz A. E., Withers S. G., Wrodnigg T. M. (2001) Powerful probes for glycosidases: novel, fluorescently tagged glycosidase inhibitors. Bioorg. Med. Chem. Lett. 11, 1339-1342. Heyl A., Schmülling T. (2003) Cytokinin signal perception and transduction. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 480-488. Holub J., Hanuš J., Hanke D. E., Strnad M. (1998) Biological activity of cytokinins derived from Ortho- and Meta-Hydroxybenzyladenine. Plant Growth Regul. 26, 109-115. Hothorn M., Dabi T., Chory J. (2011) Structural basis for cytokinin recognition by Arabidopsis thaliana histidine kinase 4. Nat. Chem. Biol. 7, 766-768. Hwang I., Sheen J. (2001) Two-component circuitry in Arabidopsis cytokinin signal transduction. Nature 413, 383-389. Chersi A., di Modugno F., Rosanò L. (1997) Selectvie ‘in synthesis’ labelling of peptides by fluorochromes. Biochim. Biophys Acta 1336, 83-88. Inoue T., Higuchi M., Hashimoto Y., Seki M., Kobayashi M., Kato T., Tabata S., Shinozaki K., Kakimoto T. (2001) Identifcation of CRE1 as a cytokinin receptor from Arabidopsis. Nature 409, 1060-1063. Kakimoto T. (1996) CKI1, a histidine kinase homolog implicated cytokinin signal transduction. Science 274, 982-985. Lomin S. N., Yonekura-Sakakibara K., Romanov G. A., Sakakibara H. (2011) Ligand-binding properties and subcellular localization of maize cytokinin receptors. J. Exp. Bot. 62, 51495159. Mähönen A. P., Bishopp A., Higuchi M., Nieminen K. M., Kinoshita K., Törmäkangas K., Ikeda Y., Oka A., Kakimoto T., Helariutta Y. (2006) Cytokinin signaling and its inhibitor AHP6 regulate cell fate during vascular development. Science 311, 94-98.
- 45 -
Mason M. G., Li J., Mathews D. E., Kieber J. J., Schaller G. E. (2004) Type-B response regulators display overlapping expression patterns in Arabidopsis. Plant Physiol. 135, 927937. Mayak S., Halevy A.H. (1969) Cytokinin activity in rose petals and its relation to senescence. Plant Physiol. 46, 497-499. Meng Q., Yu M., Zhang H., Ren J., Huang D. (2007) Synthesis and application of N-hydroxysuccinimidyl rhodamine B ester as an amine-reactive fluorescent probe. Dyes Pigments 73, 254-260. Mik V. (2012) Synthesis and characterization of novel compounds interacting with metabolic pathways of plant hormones cytokinins. Structure-activity relationship. Disertační práce. Miller C. O. (1955) Kinetin, a cell division factor from deoxyribonucleic acid. J. Am. Chem. Soc. 77, 1392. Miller C. O. (1955) Structure and synthesis of kinetin. J. Am. Chem. Soc. 77, 2662-2663. Miller C. O. (1961) A kinetin-like compound in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. 47, 170-174. Mohammadi F., Prentice G. A., Merrill A. R. (2001) Protein-protein interaction using tryptophan analogues: novel spectroscopic probes for toxin-elongation factor-2 interactions. Biochemistry 40, 10273-10283. Pasternak O., Bujacz G. D., Fujimoto Y., Hashimoto Y., Jelen F., Otlewski J., Sikorski M. M., Jaskolski M. (2006) Crystal structure of Vigna radiata cytokinin-specific binding protein in complex with zeatin. Plant Cell 18, 2622-2634. Pulici M., Asami T., Robertson M., Seto H., Yoshida S. (1996) Amylase induction activity of fluorescein labeled giberelin in barley aleurone protoplasts. Bioorg. Med. Chem. Lett. 6, 2549-2552. Quirino B.F., Noh Y.-S., Himelblau E., Amasino R.M. (2000) Molecular aspects of leaf senescence. Trends Plant Sci. 5, 278-282. Rashotte A. M., Mason M. G., Hutchison C. E., Ferreira F. J., Schaller G. E., Kieber J. J. (2006) A subset of Arabidopsis AP2 transcription factors mediates cytokinin responses in concert with a two-component pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. 103, 11081-11085. Richmond A. E., Lang A. (1957) Effect of kinetin on protein content and survival of detached Xanthium leaves. Science 125, 650-651. Romanov G. A. (2009) How do cytokinins affect the cell? Russ. J. Plant Physiol. 56, 268-290. Romanov G. A., Spíchal L., Lomin S. N., Strnad M., Schmülling T. (2005) A live cell hormonebinding assay on transgenic bakteria expressing a eukaryotic receptor protein. Anal. Biochem. 347, 129-134. Shaner N. C., Steinbach P. A., Tsien R. Y. (2005) A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods 2, 905-909.
- 46 -
Shimomura O., Johnson F. H., Saiga Y. (1962) Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J. Cell. Comp. Physiol. 59, 223-239. Schlesinger S. (1968) The effect of amino acid analogues on alkaline phosphatase formation in Escherichia coli K-12. J. Biol. Chem. 243, 3877-3883. Schmülling T. (2004) Cytokinin. In Encyclopedia of Biological Chemistry (Eds. Lennarz., W., Lane, M. D.), pp. 562-567, Academic Press/ Elsevier Science. Smigocki A. C., Owens L. D. (1988) Cytokinin gene fused with a strong promoter enhances shoot organogenesis and zeatin levels in tranformed plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 5131-5135. Soujanya T., Fessenden R. W., Samanta A. (1996) Role of nonfluorescent twisted intramolecular charge transfer state on the photophysical behavior of aminophthalimide dyes. J. Phys. Chem. 100, 3507-3512. Spíchal L., Rakova N. Y., Riefler M., Mizuno T., Romanov G. A., Strnad M., Schmülling T. (2004) Two cytokinin receptors of Arabidopsis thaliana, CRE1/AHK4 and AHK3, differ in their ligand specificity in a bacterial assay. Plant Cell Physiol. 45, 1299-1305. Sprecker M. A., Morrice A. G., Gruber B. A., Leonard N. J. (1976) Fluorescent cytokinins: stretched-out analogs of N6-benzyladenine and N6-(Δ2-isopentenyl)adenine. Phytochemistry 15, 609-613. Suzuki T., Miwa K., Ishikawa K., Yamada H., Aiba H., Mizuno T. (2001) The Arabidopsis sensor His-kinase, AHK4, can respond to cytokinins. Plant Cell Physiol. 42, 107-113. Tanaka Y., Suzuki T., Yamashino T., Mizuno T. (2004) Comparative studies of the AHP histidine-containing
phosphotransmitters
implicated
in
His-to-Asp
phosphorelay
in Arabidopsis thaliana. Biosci. Biotechnol. Biochem. 68, 462-465. Taniguchi M., Kiba T., Sakakibara H., Ueguchi Ch., Mizuno T., Sugiyama T. (1998) Expression of Arabidopsis response regulator homologs is induced by cytokinins and nitrate. Febs Lett. 429, 259-262. To J. P. C., Kieber J. J. (2007) Cytokinin signaling: two-components and more. Trends Plant Sci. 13, 85-92. Ueguchi Ch., Koizumi H., Suzuki T., Mizuno T. (2001) Novel family of sensor histidine kinase genes in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 42, 231-235. Ueguchi Ch., Sato S., Kato T., Tabata S. (2001) The AHK4 gene involved in the cytokininsignaling pathway as a direct receptor molecule in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 42, 751-755. van Staden J., Zažímalová E., Georgie E. F. (2008) Cytokinins, their analogues and antagonists. In Plant propagation by tissue culture 3rd Edition (George E. F., Hall M. A., De Klerk G.-J., eds.), pp. 205-226, Springer, Dordrecht, The Netherlands.
- 47 -
Williams D. B. G., Lawton M. (2010) Drying of organic solvents: quantitative evaluation of the efficiency of several desiccants. J. Org. Chem. 75, 8351-8354. Wong C.-Y., Eftink M. R. (1997) Biosynthetic incorporation of tryptophan analogues into staphylococcal nuclease: Effect of 5-hydroxytryptophan and 7-azatryptophan on structure and stability. Protein Sci. 6, 689-697. Wulfetange K., Lomin S. N., Romanov G. A., Stolz A., Heyl A., Schmülling T. (2011) The cytokinin receptors of Arabidopsis are located mainly to the Endoplasmic reticulum. Plant Physiol. 156, 1808-1818. Yonekura-Sakakibara K., Kojima M., Yamaya T., Sakakibara H. (2004) Molecular characterization of cytokinin-responsive histidine kinases in maize. Differential ligand preferences and response to cis-zeatin. Plant Physiol. 134, 1654-1661. Zawadski P., Ślósárek G., Boryski J., Wojtaszek P. (2010) A fluorescence correlation spectroscopy study of ligand interaction with cytokinin-specific binding protein from mung bean. Biol. Chem. 391, 43-53.
- 48 -
8
Seznam zkratek
4-DMAP
4-(N,N-dimethylamino)ftalimid
4PU
N-(3-karboxyfenyl)-N‘-(pyrid-4-yl)močovina
ACN
acetonitril
AHK
histidinkinasa z A. thaliana
AHP
Arabidopsis histidine phosphotransfer proteins
ARR
regulátory odpovědi z A. thaliana (Arabidopsis response regulator)
AW
7-azatryptofan
BA
N6-benzyladenin
BAMPP
4-n-butylamino-2-methylthiopyrido[2,3-d]pyrimidin
BCEOC
1,2-benzo-3,4-dihydrokarbazol-9-ethyl chloroformiát
BODIPY
4,4-difluor-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen
CK
cytokininy
CPPU
N-fenyl-N’-(2-chlor-4-pyridyl)močovina
CRF
cytokinin response factor
cZ
cis-zeatin
DCC
N,N‘-dicyklohexylkarbodiimid
DHZ
dihydrozeatin
Dmca
2-amino-3-(6,7-dimethoxy-3-oxo-3H-benzopyran) propanová kyselina
DMSO
dimethylsulfoxid
DPU
N,N’-difenylmočovina
ekv.
ekvivalent
Et3N
triethylamin
EtOAc
ethyl acetát
FITC
fluorescein isothiokyanát
GFP
zelený fluorescenční protein (green fluorescent protein)
hod
hodina
HPLC
vysokoúčinná kapalinová chromatografie (high-performance liquid chromatography)
iP
N6-isopentenyladenin
IPTG
isopropyl-β-D-thio-galaktosid
Kin
kinetin
MeOH
methanol
MUG
4-methylumbelliferyl galaktosid
mT
meta-topolin
- 49 -
NAA
kyselina 1-naftyloctová
NBD-Cl
4-chlor-7-nitrobenzooxadiazol
oT
orto-topolin
PrOH
propanol
pT
para-topolin
RS
reakční směs
RT
teplota místnosti
RVO
rotační vakuová odparka
TDZ
thidiazuron
TLC
tenkovrstevná chromatografie (thin layer chromatography)
tZ
trans-zeatin
ipt
adenylát isopentenyltransferasa (EC 2.5.1.27)
wt
wild type
ZmHK
histidinkinasa z kukuřice (Zea mays histidine kinase)
- 50 -
