UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie
Studium chemického složení lupinové mouky (Lupinus albus L.)
DIPLOMOVÁ PRÁCE
Autor:
Barbora Kulhánková
Studijní program:
N1406 Biochemie
Studijní obor:
Biochemie
Forma studia:
Prezenční
Vedoucí práce:
RNDr. Petr Tarkowski, Ph.D.
Termín odevzdání práce: 26. 4. 2010
Prohlašuji, že jsem předloženou bakalářskou práci vypracovala samostatně za použití citované literatury. V Olomouci dne 26. 4. 2010
Podpis: ……………………………….
-2-
Děkuji svému školiteli RNDr. Petru Tarkowskému, Ph. D. za ochotu, cenné rady, věnovaný čas a trpělivost při vedení této diplomové práce. Děkuji i za podporu ze strany vedení Katedry biochemie UP, zejména pak doc. RNDr. Lence Luhové, Ph. D. A také bych ráda poděkovala své rodině a příteli za jejich podporu a pochopení.
-3-
Bibliografická identifikace: Jméno a příjmení autora
Barbora Kulhánková
Název práce
Studium chemického složení lupinové mouky (Lupinus albus L.)
Typ práce
Diplomová
Pracoviště
Katedra biochemie
Vedoucí práce
RNDr. Petr Tarkowski, Ph.D.
Rok obhajoby práce
2010
Abstrakt
Lupina bílá (Lupinus albus L.) je z nutričního hlediska významnou rostlinou. Obsahuje velké množství proteinů a vlákniny, má nízký obsah tuků a škrobu. Příznivý je také poměr ω-3/ω-6 mastných kyselin a obsah aminokyselin. Lupina obsahuje i antioxidanty, například karotenoidy, vitamín E či isoflavony. Uplatnění nachází tato rostlina v potravinářství a zemědělství. Experimentální část této práce je věnována chemickému složení lupinové mouky se zaměřením na flavonoidy, antioxidační kapacitu, mastné kyseliny, aminokyselinové složení a karotenoidy. Tyto parametry byly porovnávány u pražené a nepražené mouky z let 2007 – 2009. Byly identifikovány flavonoidy genistein
a
genistin.
Potvrzena
byla
také
značná
antioxidační kapacita (~ 0,36 µmol troloxu/g u nepražené mouky) a příznivé aminokyselinové složení s vysokým obsahem
esenciálních
aminokyselin.
Obsah
tuku
v lupinové mouce byl přibližně 7 %, tedy třikrát nižší v porovnání se sójou. Kvantifikovány a identifikovány byly jedny z nejvíce zastoupených mastných kyselin lupiny, tedy kyselina olejová a linolová. Karotenoidy identifikovány nebyly, protože došlo k jejich rozkladu vlivem světla a/nebo tepla. Klíčová slova
Lupinus albus, flavonoidy, složení tuku, mastné kyseliny, PUFA, aminokyselinové složení, β-karoten, antioxidační kapacita.
Počet stran
96
Počet příloh
0
Jazyk
Český -4-
Bibliographical identification: Autor’s first name and
Barbora Kulhánková
surname Title
The study of lupin flour (Lupinus albus L.) chemical composition
Type of thesis
Master
Department
Department of biochemistry
Supervisor
RNDr. Petr Tarkowski, Ph.D.
The year of presentation
2010
Abstract
White lupin (Lupinus albus L.) is important plant of nutritional value. Lupin includes a great deal of proteins and fibre and small amount of oil and starch. Positive is content of ω-3/ω-6 fatty acid ratio
and
amino
acid
too.
Lupina
includes
antioxidants, for example carotenoids, vitamine E or isoflavones. This plant use in grocery and agriculture. The experimental part of this thesis is focused
on
lupin
flour
chemical
composition
with the intention of flavonoids, antioxidant capacity, fatty acids, amino acid composition and carotenoids. This values was compared in roasted and nonroasted flour from 2007 to 2009. Flavonoids genisteine and genistine were identified. The marked antioxidant capacity (~ 0,36 µmol trolox/g for nonroasted flour) and positive amino acid composition with large amount of essential amino acid were confirmed. The oil content was approximately 7 % that is three times less compared to soya. Identified and quantified were one of the most abundant lupin fatty acid, oleic and linoleic acid. Carotenoids were not detected because of degradation by light and/or heat. Keywords
Lupinus albus, flavonoids, oil composition, fatty acids, PUFA, amino acid composition, β-carotene, antioxidant capacity.
Number of pages
96 -5-
Number of appendices
0
Language
Czech
-6-
OBSAH Cíle práce …………………………………………………………………………………
10
Teoretická část ……………………………………………………………………………
11
1. Pojem lupina ………………………………………………………………………….
12
2. Lupina bílá (Lupinus albus L.) ………………………………………………………
12
2.1.
14
Chemické složení semen lupiny bílé ………………………………………..…
2.1.1. Chinolizidinové alkaloidy …………………………………………………...….
17
2.1.2. Flavonoidy (fenolické látky) …………………….………………………………
20
2.1.3. Mastné kyseliny …………………………………………………………….……
27
2.1.3.1.
Rozdělení mastných kyselin ……………………………………………….
28
2.1.3.1.1. Nasycené mastné kyseliny (Saturated fatty acid, SAFA) ……………….
28
2.1.3.1.2. Mononenasycené mastné kyseliny (Monounsaturated fatty acid, MUFA) ……………………………………………………………………….
29
2.1.3.1.3. Polynenasycené mastné kyseliny (Polyunsaturated fatty acid, PUFA) ..
29
2.1.3.2.
ω-3 mastné kyseliny ………………………………………………………..
30
2.1.3.3.
Mastné kyseliny v semenech lupiny bílé ………………………………….
31
2.1.3.4.
GC-FID analýza mastných kyselin ………………………………………..
33
2.1.3.4.1. Příprava vzorku ……………………………………………………………..
33
2.1.3.4.2. Příprava methylesterů mastných kyselin (FAME) ………………………..
33
2.1.3.4.3. GC-FID analýza …………………….……………………………………….
35
2.1.4. Aminokyseliny …………………………………………………………………….
38
2.1.4.1.
Aminokyseliny a jejich výskyt v semenech lupiny bílé …………………..
39
2.1.4.2.
Analýza aminokyselinového složení ………………………………………
41
2.1.4.2.1. Příprava vzorku ……………………………………………………………..
41
2.1.4.2.2. HPLC analýza aminokyselin ……………….……………………………….
41
3. Antioxidační kapacita ………………………………………………………………..
43
3.1.
Karotenoidy ……………………………………………………………………….
45
3.1.1. Analýza karotenoidů ……………………………………………………………..
47
3.1.1.1.
Příprava vzorku ……………………………………………………………..
47
3.1.1.2.
HPLC analýza karotenoidů …………………………………………………
48
Metody stanovení antioxidační kapacity přírodních látek ……………………
48
3.2.1. Metody využívající HAT reakční mechanismus ………………………………
50
3.2.1.1.
Metoda ORAC (Oxigen Radical Absorbance Capacity) ………………..
50
3.2.2. Metody využívající SET reakční mechanismus ………………………………
51
3.2.2.1.
51
3.2.
Metoda FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) …………………….
-7-
3.2.3. Metody využívající HAT/SET reakční mechanismy …………………………. •+
52
3.2.3.1.
Metoda TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) s ABTS ….....
52
3.2.3.2.
Metoda s DPPH ……………………………………………………….…..…
53
Experimentální část ………………………………………………………………………
54
4. Materiál ……………………………………………………………………………….
55
5. Chemikálie ……………………………………………………………………………
55
6. Přístrojové vybavení a materiál …………………………………………………….
57
7. Použité metody ……………………………………………………………………….
58
7.1.
Stanovení obsahu celkových flavonoidů (TF) v lupinové mouce …………...
58
7.1.1. Příprava 80% methanolických extraktů ………………………………………..
58
7.1.2. Stanovení obsahu celkových flavonoidů ………………………………………
58
7.2.
Stanovení antioxidační kapacity lupinové mouky …………………………….
59
7.2.1. Příprava 80% methanolických extraktů ……………………………………….
59
7.2.2. Ověření lineární závislosti fluorescence na koncentraci fluoresceinu ..……. 59 7.2.3. Stanovení optimální koncentrace AAPH ………………………………………
59
7.2.4. Stanovení optimálního ředění vzorku a optimální délky extrakce ………….. 60 7.2.5. Stanovení celkové antioxidační kapacity metodou ORAC v mikrodestičkovém uspořádání ……………………………………………….
60
Stanovení obsahu aminokyselin v lupinové mouce ………………………….
60
7.3.1. Příprava vzorků …………………………………………………………………..
60
7.3.
7.3.2. Analýza obsahu aminokyselin s použitím střednětlaké kapalinové ionexové chromatografie ………………………………………………………..
61
Stanovení obsahu mastných kyselin v lupinové mouce ……………………..
61
7.4.1. Příprava vzorků …………………………………………………………………..
61
7.4.1.1.
Odtučnění lupinové mouky …………………………………………………
61
7.4.1.2.
Saponifikace a příprava FAME …………………………………………….
61
7.4.2. GC-FID analýza FAME ………………………………………………………….
62
7.5.
Stanovení karotenoidů v lupinové mouce …………………………………….
62
7.5.1. Příprava vzorků a standardu ……………………………………………………
62
7.4.
7.5.2. Příprava a optimalizace mobilní fáze ………………………………………….. 63 7.5.3. HPLC analýza karotenoidů se zaměřením na β-karoten ……………………
63
7.6.
Analýza flavonoidů v lupinové mouce ……………………………….……….
63
7.6.1. Příprava vzorků ………………………………………………………………….
63
7.6.2. UPLC-MS/MS analýza flavonoidů ……………………………………………..
64
8. Výsledky a diskuse ………………………………………………………………….
64
8.1.
64
Stanovení obsahu celkových flavonoidů ………………………………………
-8-
8.2.
Stanovení celkové antioxidační kapacity lupinové mouky …………………..
65
8.2.1. Ověření lineární závislosti fluorescence na koncnetraci fluoresceinu …......
65
8.2.2. Stanovení optimální koncentrace AAPH ………………………………………
66
8.2.3. Stanovení optimálního ředění vzorku a optimální délky extrakce ….………. 67 8.2.4. Stanovení celkové antioxidační kapacity metodou ORAC …………………..
68
8.3.
Aminokyselinové složení lupinové mouky …………………………………….
70
8.4.
Analýza mastných kyselin ………………………………………………………
71
8.4.1. Optimalizace GC metody pro stanovení FAME ………………………………
71
8.4.2. Stanovení obsahu mastných kyselin v lupinové mouce ……………………..
73
8.5.
Analýza flavonoidů v lupinové mouce …………………………………………
74
8.6.
Stanovení karotenoidů v lupinové mouce …………………………………….
76
9. Závěr ………………………………………………………………………………….
79
10. Použitá literatura ………………………………………..……………………………
80
11. Použité zkratky …………………………………………………….…………….…..
95
-9-
Cíle práce •
Vypracovat rešerši na téma chemické složení lupinové mouky (Lupinus albus L.) se zaměřením na chinolizidinové alkaloidy, flavonoidy, mastné kyseliny, aminokyseliny, karotenoidy a antioxidační kapacitu.
•
V rámci experimentální části provést analýzu vzorků lupinové mouky z hlediska obsahu flavonoidů, mastných kyselin, karotenoidů, aminokyselinového složení a antioxidační kapacity.
- 10 -
TEORETICKÁ ČÁST
- 11 -
1. Pojem lupina Pro většinu obyvatel České republiky je lupina zcela neznámým pojmem. Avšak tato rostlina se u nás již pěstuje a je docela možné, že díky svým vlastnostem v podobě vysokého obsahu proteinů a nízkého obsahu tuků, si brzy najde cestu do našich kuchyní. Z odborného hlediska je pojem lupina používán pro popis semen a zrn domestikovaných druhů rodu Lupinus, což zahrnuje zejména L. albus, L. angustifolius, L. luteus, L. cosetinii a L. mutabilis (Petterson, 2000). V současné době je známo více jak 500 druhů rostlin rodu Lupinus (Wink et al., 1995). Tyto rostliny řadíme do čeledi Bobovitých (Fabaceae), která je známá symbiózou s hlízkovitými bakteriemi, jež jsou schopny fixovat atmosférický dusík. Tato vlastnost tak spolu s vysokým obsahem proteinů řadí rod Lupinus mezi luštěniny. V případě lupin se jedná zejména o symbiózu s bakteriemi rodu Bradyrhizobium sp., konkrétně Bradyrhizobium lupini (Kurlovich et al., 2002; Schulze et al., 2006). Jejich hlízky jsou schopny během vegetačního období fixovat 160 – 200 kg N2/ha, přičemž přibližně polovina tohoto množství zůstává v půdě pro další rostliny (Písaříková & Zralý, 2009).
2. Lupina bílá (Lupinus albus L.) Lupina bílá (Lupinus albus L., Obr. 1) je jedním z nejstarších domestikovaných druhů. Již celá tisíciletí je tradičně pěstována zejména v oblasti Středozemního moře a v údolí Nilu. Pěstována je dnes ale i jinde v Evropě a Africe, také však v Austrálii, USA a dalších zemích. V současné době je největším producentem semen lupiny Austrálie, která zajišťuje 80 – 85 % světové produkce (White et al., 2007). V rámci Evropy jsou pak hlavními pěstebními oblastmi Polsko, Francie, Německo, Španělsko, Benelux, Ukrajina a Rusko. V České republice jsou nejčastěji pěstovanými druhy lupina bílá (Lupinus albus L.), lupina úzkolistá (Lupinus angustifolius L.) a lupina žlutá (Lupinus luteus L.) (Písaříková & Zralý, 2009).
- 12 -
Obr. 1 Lupina bílá (Lupinus albus L.).
Lupina bílá (Lupinus albus L.) je samosprašná, jednoletá, 30-120 cm vysoká, dvouděložná rostlina s bílými či modrofialovými květy. Zařazení lupiny bílé v systému rostlin je zobrazeno na následujícím schématu (Schéma 1): říše: Rostliny (Plantae) podříše: Cévnaté rostliny (Tracheobionta) nadoddělení: Semenné rostliny (Spermatophyta) oddělení: Krytosemenné rostliny (Magnoliophyta) třída: Dvouděložné rostliny (Magnoliopsida) podtřída: Rosidae řád: Bobotvaré (Fabales) čeleď: Bobovité (Fabaceae) podčeleď: Faboideae kmen: Genisteae podkmen: Luppineae rod: Lupina (Lupinus L.) druh: Lupina bílá (Lupinus albus L.)
V luscích (Obr. 2a) ukrytá semena (Obr. 2b) jsou poměrně velká, kruhovitě zploštělá, na povrchu žlutobílá a uvnitř žlutá. Průměrná váha semene se pohybuje kolem 350 mg. Mouka (Obr. 2c) získaná jejich pomletím má jasně žlutou barvu a charakteristickou luštěninovou chuť a vůni.
- 13 -
2a)
2b)
2c)
Obr. 2 Lupina bílá (Lupinus albus L.): a) lusk, b) semena, c) mouka (firma Alena Půlpánová, Olomouc). Tato rostlina je na pěstování nenáročná, je totiž schopna růst na rozličných, například i vápenatých, půdách a v různých klimatických podmínkách. Díky tomu se jedná o velmi hodnotnou rostlinu jak z hlediska ekonomického, tak z hlediska zemědělského. Problémem při pěstování však může být onemocnění zvané antraknóza způsobené houbami rodu Colletotrichum, například C. lupini (Nirenberg et al., 2002). Toto onemocnění, projevující se oranžověhnědými skvrnami na listech, květech i luscích, se šíří velmi rychle zvláště za deštivého počasí, kdy se spory snadno dostávají na okolní rostliny (Golubev & Kurlovich, 2002). Houba je také schopna procházet do semen (Golubev & Kurlovich, 2002), proto je nutné postižené rostliny ošetřit co nejdříve fungicidem, jinak dochází k úhynu rostlin. Díky
svým
vlastnostem
je
lupina
využívána
jak
v
potravinářství,
tak i zemědělství. V mnoha zemích zaměřených na chov ovcí, skotu, prasat, drůbeže či ryb je lupina tradičním krmivem, zejména v podobě zelené píce a semen. V potravinářství se používá pro výrobu omáček, těstovin, kojenecké výživy či sušeného masa, avšak nejširšího využití dosahuje v podobě mouky. Mimoto jsou semena využívávána i v tradiční čínské medicíně. V neposlední řadě je lupina používána také jako zelené hnojivo přispívající ke zlepšení půdní struktury, protože zvyšuje obsah organických látek a akumuluje dusík a fosfor v chudých písčitých půdách (Huyghe, 1997; Richter et al., 2002).
2. 1. Chemické složení semen lupiny bílé Složení semen u jednotlivých odrůd se může velice lišit v závislosti na genotypu a podmínkách prostředí (Bhardwaj et al., 1998). Obsahem látek v semenech, zejména obsahem bílkovin a neškrobových polysacharidů, je lupina velmi podobná sóje (Tab. 1; Straková et al., 2006). Oproti této luštěnině má však zhruba poloviční obsah tuků a dvojnásobné množství vlákniny (Tab. 1; Straková et al., 2006). V závislosti na druhu a klimatických podmínkách
- 14 -
obsahuje lupina bílá 33 – 47 % proteinů. Z nutričního hlediska je tedy chemické složení semen lupiny bílé velmi vhodné. Navíc mnohé studie na krysách i lidech potvrdily, že se proteiny z lupiny podílí i na prevenci kardiovaskulárních onemocnění, a to snižováním hladiny cholesterolu a snižováním krevního tlaku (Chiesa et al., 2006; Nowicka et al., 2006; Weiße et al., 2010). Tab. 1 Chemické složení lupiny bílé (Lupinus albus L. cv. AMIGA) a sóji (Glycine max L. cv. KORADA) (Straková et al., 2006). Látka
Lupina bílá
Sója
g/kg
%
g/kg
%
329,6
33,0
321,1
32,1
80,3
8,0
197,2
19,7
372,8
37,3
274,3
27,4
Škrob
85,7
8,8
62,0
6,2
Vláknina
110,2
11,0
63,8
6,4
Proteiny Tuky Neškrobové sacharidy
Z hlediska obsahu aminokyselin je pro lupinu typická nízká hladina methioninu (~ 0,2 %, tj. 0,66 g/16 g N), cysteinu (~ 0,4 %, tj. 1,34 g/16 g N) a lysinu (~ 1,46 %, tj. 4,75 g/16 g N) a naopak vyšší hladina argininu (~ 3,6 %, tj. 12,2 g/16 g N) (Petterson, 2000). Celkově aminokyseliny představují přibližně 90 % dusíku přítomného v semenech, zbylých 10 % dusíku tedy tvoří neproteinové zdroje (Petterson, 2000). Oproti ostatním luštěninám lupina obsahuje velké množství vlákniny (~ 16 %; Erbaş et al., 2005), důležité pro správnou činnost střev, a emulgační látky v jejich přirozené formě. Díky těmto vlastnostem prodlužuje lupinová mouka tzv. spotřebitelskou trvanlivost. Vysoký obsah vlákniny je výhodný z dietetického hlediska, jelikož vláknina se podílí na vstřebávání vody (Huyghe, 1997) a funguje jako prevence a/nebo léčba kardiovaskulárních onemocnění, diabetu, obezity či rakoviny (Kendall et al., 2010). Důležitým faktem je také skutečnost, že lupina neobsahuje lepek, což je směs proteinu gliadinu a glutelinu nacházející se spolu se škrobem v semenech některých obilovin. Je tedy vhodná pro tzv. bezlepkovou dietu nutnou u lidí trpících celiakií (nenášenlivostí lepku), tedy chronickým onemocněním sliznice tenkého střeva. Semena lupiny obsahují malé množství škrobu. Slupka semen je tvořena strukturními polysacharidy celulosou, hemicelulosou, pektiny a ligninem (Huyghe, 1997; Petterson, 2000). Zásobní neškrobové sacharidy, jejichž obsah v lupině je přibližně 40 % (Straková et al., 2006; Písaříková & Zralý, 2009), jsou uloženy ve ztluštělých buněčných stěnách kotyledonů (Huyghe, 1997). Jak uvádí Erbaş a kol. - 15 -
(2005), semena lupiny obsahují přibližně 6 % mono- a disacharidů, z nichž nejvíce zastoupeny jsou sacharosa (70,7 %), galaktosa (8,4 %) a glukosa (6,7 %). Z oligosacharidů (7,4 – 8 %) obsahují semena nejvíce α-galaktosidů (7 – 14 %), především stachyosu (2,8 %), rafinosu (0,4 %) a verbascosu (0,3 %) (Hyughe, 1997; Písaříková & Zralý, 2009). Obsah tuků, resp. olejů v lupině bílé závisí, stejně jako u ostatních látek, na odrůdě a podmínkách prostředí. V průměru obsahují semena 6 – 13 % oleje s vysokým množstvím nenasycených (86,5 %) a menším množstvím nasycených (13,5 %) mastných kyselin (Erbaş et al., 2005). Jak potvrzují mnohé studie, nejvíce zastoupenými mastnými kyselinami jsou kyselina olejová (~ 50 %), linolová (~ 20 %) a linolenová (~ 9 %) (Petterson, 2000; Bhardwaj et al., 2004; Uzun et al., 2007). Z minerálů obsahují semena ve větším množství draslík (2,8 – 11,1 g/kg), fosfor (2,5 – 9 g/kg), síru (2,1 – 2,7 g/kg), vápník (1,2 – 2,5 g/kg), hořčík (0,9 – 1,6 g/kg) a sodík (< 0,1 – 0,3 g/kg), jehož množství závisí na typu půdy. Méně zastoupenými prvky jsou pak mangan (23 – 37 mg/kg), zinek (22 – 38 mg/kg) a železo (21 – 44 mg/kg). Stopově je zastoupena měď, molybden, kobalt a selen. (Petterson, 2000) Co se týče vitamínů obsažených v semenech lupiny bílé, studie Erbaşe a kol. (2005) uvádí, že obsah vitamínů skupiny B je následující: thiamin (B1) 3,9, riboflavin (B2) 2,3 a niacin 39,1 mg/kg. Oproti sóje tedy lupina bílá obsahuje méně thiaminu a riboflavinu, ale více niacinu (Erbaş et al., 2005). Dále lupina obsahuje karotenoidy, vitamín C (64,8 mg/kg) a vitamín E, resp. α-tokoferol (1,9 mg/kg), γ-tokoferol (201 mg/kg) a δ-tokoferol (2,5 mg/kg) (Frias et al., 2005). Posledně jmenované látky jsou pro lidské zdraví velice důležité, neboť plní funkci antioxidantů (Paiva & Russel, 1999; Padayatty et al., 2003; Krinsky & Johnson, 2005; Maiani et al., 2009), tedy látek, které jsou schopny odstraňovat z těla volné radikály způsobující oxidativní poškození buněk. Pomáhají tak zpomalovat stárnutí a jak potvrzují mnohé studie, působí i jako prevence vůči nádorům a kardiovaskulárním onemocněním (Padayatty et al., 2003; Krinsky & Johnson, 2005; Constantinou et al., 2008; Verrax & Buc Calderon, 2008; Maiani et al., 2009). Kromě uvedených, z hlediska výživy prospěšných látek, obsahují semena lupin i tzv. antinutriční faktory (ANF, antinutrienty). Řadíme mezi ně chinolizidinové alkaloidy, fenolické látky, fytáty, inhibitory proteas, saponiny, taniny, lektiny a další. Obsah těchto látek u sladké lupiny bílé je uveden v tabulce 2. Přirozeně se vyskytující formy lupiny obsahují velké množství těchto antinutrientů, především chinolizidinových alkaloidů. Proto byly vyšlechtěny odrůdy se sníženou hladinou těchto látek tzv. „sladké“ (domestikované) odrůdy, u kterých jsou porušeny geny hrající důležitou roli v syntéze alkaloidů (Harrison & Williams, 1982). U těchto odrůd byl také zaznamenán menší - 16 -
výskyt alergických reakcí, které se projevují kopřivkou až anafylaktickým šokem. I přesto se však s alergií můžeme setkat a to zejména u jedinců, kteří již mají alergii na arašídy či sóju (tzv. křížová reaktivita; Moneret-Vautrin et al., 1999; Wassenberg et al., 2007) nebo trpí astmatem (Romano et al., 1997; Novembre et al., 1999) či jinými alergiemi, například na pyl (Martínez et al., 1997). Na druhou stranu některé ANF mohou být pro lidi i zvířata prospěšné. Například fenolické látky, fytát či inhibitory proteas jsou antioxidanty a vykazují i protinádorovou aktivitu (Lampart-Szczapa et al., 2003; Kobayashi et al., 2004; Schlemmer et al., 2009). Tab. 2 Obsah antinutričních faktorů v semenech sladké lupiny bílé (Petterson, 2000; Erbaş et al., 2005; Martínez-Villaluenga et al, 2009). Antinutriční faktory
Obsah <100 mg/kg
Chinolizidinové alkaloidy
1,82 mg FeA/g
Fenolické látky
0,57%
Fytáty
<0,2 mg/g
Inhibitor trypsinu Saponiny
Nedetekovány
Kondenzované taniny
0,02%
Lektiny
Nedetekovány
FeA = kyselina ferulová
2. 1. 1. Chinolizidinové alkaloidy Chinolizidinové alkaloidy jsou důležitými sekundárními metabolity rostlin rodu Lupinus. V různých druzích lupin bylo nalezeno kolem 70 chinolizidinových alkaloidů. Jejich biosyntéza probíhá ve stromatu chloroplastů a je regulována světlem (Wink & Hartmann, 1982; Lee et al., 2007). Z chloroplastů jsou pak floémem transportovány do vakuol všech rostlinných orgánů včetně semen, kde jsou uskladněny (Wink & Witte, 1984; Lee et al, 2007). Prekurzorem pro biosyntézu těchto alkaloidů je L-lysin,
který je pomocí enzymu lysin dekarboxylasy přeměňován na meziprodukt
kadaverin (Wink & Hartmann, 1980). Jednotky kadaverinu pak oxidativně cyklizují pomocí klíčového enzymu 17-oxosparteinsyntasy za vzniku tetracyklických alkaloidů, například lupaninu či multiflorinu, jejichž základní kostru, stejně jako u ostatních alkaloidů této skupiny, tvoří chinolizidinové jádro (Obr. 3) (Wink & Hartmann, 1980; Suzuki
et
al.,
1994).
Vzniklé
alkaloidy
jsou
pak
dále
enzymaticky
modifikovány – esterifikovány, dehydratovány či oxidovány (Saito et al., 1993). Právě esterifikace pomocí enzymu HMT/HLTasy (tigloyl-CoA:(2)-13-α-hydroxymultiflorin/(+)-
- 17 -
13-α-hydroxylupanin
O-tigloyltransferasy)
je
závěrečným
krokem
biosyntézy
chinolizidinových alkaloidů (Suzuki et al., 1994). Ve formě esterů jsou tudíž alkaloidy transportovány a skladovány (Okada, 2005).
N
Obr. 3 Chinolizidinové jádro.
V přirozené „hořké“ formě lupiny bílé se nachází asi 50x více chinolizidinových alkaloidů než v domestikované „sladké“ formě (Lee et al., 2007), proto se tato přirozená forma vyznačuje hořkou chutí. U vyšlechtěných „sladkých“ odrůd, určených pro konzumaci, je maximální přípustný celkový obsah chinolizidinových alkaloidů v produktech z lupiny 200 mg/kg (Australia New Zealand Food Authority, 2001). U lupiny bílé se vyskytují alkaloidy lupanin, albin, 13-α-hydroxylupanin, multiflorin a ve stopových množstvích také angustifolin a 13-tigloyloxylupanin. Strukturní vzorce těchto látek jsou uvedeny na obrázku 4. U ostatních druhů lupin se vyskytují navíc ještě lupinin, spartein, 3-hydroxylupanin a ve stopovém množství mnohé další. (Wink et al., 1995)
N
N
N
N
O
OH
O lupanin
13-α-hydroxylupanin CH3
O O
N
NH N N albin
m ultiflorin
NH
O
N
CH3
N
N
H CH3
O CH3
O
O angustifolin
13-α-tigloyloxylupanin
Obr. 4 Strukturní vzorce alkaloidů přítomných v lupině bílé. - 18 -
Množství alkaloidů v jednotlivých částech rostlin je odlišné (Wink et al., 1995). Porovnání zastoupení uvedených alkaloidů v listech a semenech lupiny bílé je uvedeno v tabulce 3. Jelikož přítomnost těchto alkaloidů je pro rostliny rodu Lupinus typická, bývají označovány také jako „lupanové alkaloidy“. Tab. 3 Porovnání zastoupení alkaloidů lupiny bílé v semenech a listech (Wink et al., 1995). Chinolizidinový alkaloid
Množství (%) - listy
Množství (%) – semena
50
70
6
15
13-α-hydroxylupanin
12
8
Multiflorin
10
3
3
<1
10
<1
Lupanin Albin
Angustifolin 13-tigloyloxylupanin
Nejpoužívanější
technikou
pro
kvantifikaci
chinolizidinových
alkaloidů
v semenech, jídle a krmivu z lupiny je plynová chromatografie v kombinaci s hmotnostní spektrometrií (GC-MS) (Jiménez Martínez et al., 2003; Reinhard et al., 2006; Lee et al., 2007; Boschin et al., 2008; Resta et al., 2008). Problémem studia těchto alkaloidů je skutečnost, že jen pro málo z nich jsou dostupné komerčně vyráběné standardy. Proto si je vědci sami připravují izolací z roslinného materiálu (Jiménez Martínez et al., 2003). Chinolizidinové alkaloidy fungují jako zásobárna dusíku (Aniszewski et al., 2001), podílí se na odolnosti rostlin vůči patogenům (zejména bakteriím a houbám) a býložravcům (Wink, 1988; Vega et al., 1996; Zamora-Natera et al., 2008). Byla rovněž prokázána jejich alelopatická aktivita (Zamora-Natera et al., 2008). Některé alkaloidy vykazují i antimutagenní aktivitu (Jiménez Martínez et al., 2003). Studie García
Lópeze
a
kol.
(2004)
taktéž
prokázala,
že
13-α-hydroxylupanin
a 17-oxolupanin zvyšují sekreci insulinu v reakci na zvýšenou hladinu glukózy, tudíž by se daly potenciálně použít při léčbě diabetu typu 2. Jak vyplývá ze studií zaměřených na toxicitu chinolizidinových alkaloidů, z pohledu zdraví lidí a zvířat jsou nejnebezpečnějšími alkaloidy lupanin a jeho isomery, spartein a anagyrin (Australia New Zealand Food Authority, 2001). Lupanin spolu se svými isomery a spartein působí neurotoxicky (středně akutní orální toxicita; Pothier et al., 1998) díky své schopnosti vázat se na nikotinové a muskarinové acetylcholinové receptory (Schmeller et al., 1994). Hovoříme o tzv. anticholinergní intoxikaci,
- 19 -
protože tyto alkaloidy působí jako reverzibilní inhibitory cholinesteras, což vede ke ztrátě kontroly svalů a pohybové koordinace (Australia New Zealand Food Authority, 2001; Litkey & Dailey, 2007). Intoxikace těmito alkaloidy u savců se projevuje třesem, podrážděním a křečemi (Pothier et al., 1998). U anagyrinu byla v případě skotu, ovcí a dalšího dobytka prokázána teratogenita (Panter et al., 1999). V druzích pěstovaných pro spotřebu lidí se však tento alkaloid nevyskytuje. Případy akutní otravy se u člověka vyskytují velmi vzácně (Tsiodras et al., 1999; Litkey & Dailey, 2007; Kurzbaum et al., 2008). Jejími příznaky jsou nevolnost, malátnost, narůstající slabost, pocení, poruchy vidění, rozšířené zorničky, zástava dechu až kóma (Australia New Zealand Food Authority, 2001).
2. 1. 2. Flavonoidy (fenolické látky) Spolu s chinolizidinovými alkaloidy tvoří fenolické látky nejdůležitější sekundární metabolity luštěnin a tedy i lupiny bílé. Flavonoidy se vyskytují především ve fotosyntetizujících buňkách rostlin, tudíž je lze najít téměř ve všech rostlinách. Kromě listů je však můžeme nalézt i v kořeni, stonku, květech či semenech. Obecně lze říci, že flavonoidy jsou syntetizovány zejména v odpovědi na biotické (patogeny, hmyz, býložravci aj.) a abiotické faktory prostředí (světlo, CuCl2, rtuť aj.), což bylo potvrzeno i mnohými studiemi lupiny bílé (Shibuya et al., 1992; Gagnon & Ibrahim, 1997; Stobiecki et al., 1997; Bednarek et al., 2001; Bednarek et al., 2003; Baer et al., 2006; Esteban et al., 2008). Flavonoidy jsou syntetizovány tzv. fenylpropanoidovou metabolickou dráhou. Prekurzorem
biosyntézy
je
aminokyselina
L-fenylalanin
(případně
tyrosin).
Rostliny přeměňují L-fenylalanin enzymem fenylalaninamoniaklyasou na cinamát, jenž je prekurzorem mnoha fenolických sloučenin včetně jednoduchých fenolů, fenylpropanoidů a flavonoidů. Enzymem cinamát-4-hydroxylasou je cinamát přeměněn na p-kumarovou kyselinu, která působením enzymu 4-kumarát:CoA ligasy přechází na thioester 4-kumaroyl-CoA. Kondenzací thioesteru s malonyl-CoA, katalyzovanou enzymem
chalkonsynthasou
nebo
chalkonsyntasou/chalkonreduktasou,
vznikají
chalkony – prekurzory všech flavonoidů. Působením enzymu chalkonisomerasy dochází následně k uzavření prostředního kruhu chalkonů. Vzniká tak základní kostra všech flavonoidů – flavanové jádro, tj. 2-fenyl-benzo[α]pyran, které je tvořeno dvěma benzenovými jádry (A a B) spojenými přes heterocyklický pyranový kruh (C) (Obr. 5) (Harborne & Baxter, 1999). Rozvětvující se metabolická dráha pokračuje dále mnoha enzymatickými reakcemi, díky nimž vznikají jednotlivé flavonoidy, například genistein či quercetin. (Paiva, 2000) Mnohé flavonoidy pak často vytváří konjugáty se sacharidy,
- 20 -
tzv. glykosidy. Například genistein s glukózou vytváří genistein-7-O-glukosid. Jiné flavonoidy, například wighteon či luteon, jsou prenylovány.
3´ 2´
4´
B
8
O
7
A
5´
2 6´
C
6
3 5
4
Obr. 5 Flavanové jádro.
Tyto sekundární metabolity zahrnují široké spektrum látek. Mezi hlavní skupiny látek patří aurony, flavony, isoflavony a od nich odvozené isoflavonoidy, neoflavonoidy, chalkony, dihydrochalkony, flavanony, flavanon-3-oly, flavonoly (3-hydroxyflavony), flavany,
flavan-3-oly
(katechiny),
flavan-3,4-dioly
(kondenzované
taniny
či leukoanthokyanidiny), anthokyanidiny a proanthokyanidiny. Jak potvrzují mnohé analýzy (Petterson, 2000; Lampart-Szczapa et al., 2003; D´Agostina et al., 2008; Martínez-Villaluenga et al., 2009), lupina bílá je bohatým zdrojem flavonoidů, ať již ve formě aglykonů (čistých látek) či glykosidů. Nejvíce se vyskytují v listech (Bednarek et al., 2001; Bednarek et al., 2003; D´Agostina et al., 2008), stonku (Bednarek et al., 2001; Baer et al., 2006; D´Agostina et al., 2008) a kořeni (Gagnon & Ibrahim, 1997; Stobiecki et al., 1999; Bednarek et al., 2003; D´Agostina
et
al.,
2008;).
V
květech
lupiny
najdeme
delphinidin
3-(6"-O-malonyl)glukosid a apigenin 7-(6"-O-malonyl)glukosid (Takeda et al., 1993). V semenech se flavonoidy vyskytují v nepatrném množství (Katagiri et al., 2000; Sirtori et al., 2004) nebo vůbec (D´Agostina et al., 2008). U lupiny bílé tvoří nejvíce zastoupenou skupinu flavonoidů isoflavony (Obr. 6), resp. isoflavonoidy, což je dáno skutečností, že isoflavonoidy jsou nezbytné pro přežití luštěnin. Vykazují totiž mnoho pro rostlinu důležitých vlastností, jak je uvedeno níže. D´Agostina a kol. (2008) prokázali, že množství isoflavonů v rostlině závisí na jejím vývojovém stádiu. O
Obr. 6 Základní struktura isoflavonů (isoflavonoidů) – isoflavan. - 21 -
Z mnoha studií isoflavonů a isoflavonoidů vyplývá, že v lupině bílé, resp. v jejím kořeni, stonku a listech (Tab. 4), je nejčastěji zastoupen genistein, genistin (genistein
7-O-glukosid),
2´-hydroxygenistein,
genistein
4´-O-glukosid,
2´-hydroxygenistein
genistein
7-O-glukosid,
4´,7-O-diglukosid,
wighteon,
luteon,
licoisoflavon A, lupalbigenin a 2´-hydroxylupalbigenin. V semenech (Tab. 4) jsou to pak genistein a genistin (Katagiri et al., 2000; Sirtori et al., 2004). Strukturní vzorce uvedených flavonoidů jsou na obrázku 7. Jak ukazuje tabulka 4, mnoho dalších isoflavonů je zastoupeno v menším množství, resp. se vyskytují pouze v jednom či dvou rostlinných orgánech.
- 22 -
OH HO
O
O
HO HO
O
O
OH OH
O OH
OH
genistein
O OH
genistin (genistein 7-O -glukosid)
HO
O
OH
O
OH O
OH OH
O HO genistein 4´-O -glukosid
OH O
HO HO
O
O
OH
OH
O
OH O
OH OH
O HO genistein 4´,7-O -diglukosid
OH HO
O
O
HO HO
HO
O
O
OH OH
OH
O OH
OH
2´-hydroxygenistein
O
2´-hydroxygenistein 7-O -glukosid
Obr. 7 Strukturní vzorce nejčastěji se vyskytujících isoflavonů v lupině bílé.
- 23 -
OH
HO
O
HO
O OH
H3 C
H3C CH3
HO
O OH
OH
CH3
O OH
w ighteon
luteon HO
O CH3
H3 C CH3
HO
CH3
O OH
lupalbigenin HO
O CH3
OH H3 C
CH3
HO
CH3
O OH
2´-hydroxylupalbigenin HO
O CH3
OH
CH3
HO
O OH
licoisoflavon A
Obr. 7 Strukturní vzorce nejčastěji se vyskytujících isoflavonů v lupině bílé – pokračování.
- 24 -
Tab. 4 Zastoupení isoflavonů v jednotlivých částech rostlin.
Flavonoid
Kořen
Stonek
Listy
Semena
Zdroj
Genistein genistein 4´-O-glukosid Genistin genistein 4´,7-O-diglukosid 2´-hydroxygenistein 2´-hydroxygenistein 7-O-glukosid Wighteon Luteon licoisoflavon A Lupalbigenin
+ + + + + + + + +
+ + + + + + + +
+ + + + + + + + +
+ + -
+ +
-
-
-
2´-hydroxyglupalbigenin
Literatura
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 7, 8, 9, 10 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11 2, 8, 9, 10 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 10 1, 2, 3, 4, 8, 9, 10 1, 3, 5, 9 1, 2, 3, 9 1, 2, 3, 9
1 Gagnon et al., 1992 2 Stobiecki et al., 1999 3 Gagnon & Ibrahim, 1997 4 D´Agostina et al., 2008 5 Baer et al., 2006 6 Weisskopf et al., 2006 7 Marczak et al., 2008 8 Bednarek et al., 2003 9 Katagiri et al., 2000 10 Bednarek et al., 2001 11 Sirtori et al., 2004
Některé flavonoidy řadíme mezi antinutriční faktory, protože snižují chutnost, příjem a stravitelnost živin. Zejména taniny a fenolické kyseliny mají svíravou chuť. Taniny navíc srážejí bílkoviny. Na druhou stranu však flavonoidy vykazují mnoho užitečných vlastností, ať už v rámci rostlin nebo zdraví lidí. Z medicínského hlediska se uplatňují zejména jejich následující vlastnosti: inhibice enzymů, antioxidační, protizánětlivá, estrogenní, antimikrobiální, antialergická, vaskulární
(cévní),
cytotoxická
protinádorová,
protikřečová,
hepatoprotektivní,
antifungální aktivita, analgetické a zklidňující účinky, prevence vůči malárii (Harborne & Williams, 2000; Middleton et al., 2000; Havsteen, 2002; Cushnie & Lamb, 2005). Studie Cos a kol. (1998) a Chen a kol. (2000) prokázaly, že za tyto vlastnosti, zejména antioxidační a inhibiční, je zodpovědná především chemická struktura kruhu C – dvojná vazba mezi uhlíky C2 a C3, přítomnost oxo skupiny na uhlíku C4 a hydroxy skupina/glukosid na pozici C3 – a hydroxylace kruhů A a B. - 25 -
U rostlin fungují flavonoidy jako pigmenty, podílí se na jejich ochraně vůči ultrafialovému záření, mají antimikrobiální účinky a hrají důležitou roli v interakci rostlin s mikroorganismy, houbami a živočichy (Harborne & Williams, 2000; Havsteen, 2002). Také se účastní světelné fáze fotosyntézy, při níž katalyzují přenosu elektronů, resp. energie (Middleton et al., 2000) a regulují iontové kanálky účastnící se fosforylace (Mukohata et al., 1978). Mají vliv i na tvorbu rostlinných hormonů a regulátorů, kontrolují respiraci, morfogenezi a určení pohlaví (Harborne & Baxter, 1999). Modré zbarvení květů, které je preferovaným atraktantem včelích opylovačů, je většinou dáno přítomností anthokyanidinů, resp. jejich glykosidů, v okvětních lístcích (Harborne & Williams, 2000; Yoshida et al., 2009). Velké množství těchto chromoforů má však světle fialovou barvu (Yoshida et al., 2009). Aby se zbarvily modře, vyžadují přítomnost flavonového kopigmentu, případně i jednoho či dvou kovových kationtů (Harborne & Williams, 2000; Yoshida et al., 2009). Ze studie Takedy a kol. (1993) vyplývá, že u rodu Lupinus je za modré zbarvení květů zodpovědný chromofor delphinidin
3-(6"-O-malonyl)glukosid
a
jeho
kopigment
apigenin
7-(6"-O-malonyl)glukosid, které jsou kovalentně vázány malonylovým zbytkem, přičemž obě látky vyžadují přítomnost železa. Ultrafialové záření typu B (UV-B) má rozsah vlnových délek 280 – 315 nm a ze všech typů UV záření největší energii. Může pronikat ozónovou vrstvou a způsobit tak například poškození DNA, zelených rostlinných pletiv či lidské kůže. Jeden ze způsobů, kterým se rostliny proti UV-B chrání, představují flavonoidové pigmenty, flavony či flavonolové glykosidy přítomné v listech (Harborne & Williams, 2000). Právě tyto flavonoidy absorbují v oblasti 280 – 315 nm a působí tak jako UV filtry, čímž chrání fotosyntetizující tkáně (Harborne & Williams, 2000). Afaq a kol. (2007) také prokázali, že anthokyanidin delphinidin chrání před oxidativním stresem způsobeným UV-B zářením i lidské keratinocyty. Některé
flavonoidy
působí
antimikrobiálně
(Cushnie
&
Lamb,
2005;
Lampart-Szczapa et al., 2003), proto jsou rostlinami syntetizovány de novo (fytoalexiny) při napadení patogenem (Ebel & Mithöfer, 1998; Harborne, 1999a; Paiva, 2000). Rostlinné flavonoidy jsou schopny postihnout široké spektrum rostlinných patogenů, a proto se je vědci rozhodli využít i v boji vůči patogenům lidským. Mnohé flavonoidy, například gardenin A, morin, fisetin, quercetin či myricetin, vykazují anti-HIV aktivitu, tj. působí antiretrovirálně (Middleton et al, 2000; Ko et al., 2009). Mechanismy působení jsou různé, například inhibice HIV-1 proteinasy (Brinkworth et al., 1992), HIV-1 integrasy (Fesen et al., 1994) či HIV-1 reverzní transkriptasy (Ko et al., 2009), tedy enzymů důležitých pro replikaci HIV-1 viru. Mimoto působí flavonoidy i na jiné viry – herpes simplex virus (HSV), rotavirus, poliovirus, lidský korona virus a další - 26 -
(Cushnie & Lamb, 2005). In vitro fungují některé flavony a flavonoly vůči HSV synergicky, například kaempferol a luteolin či quercetin a apigenin (Amoros et al., 1992). Flavonoidy také chrání rostliny před hmyzem (Simmonds, 2003) a býložravci (Harborne, 1999b). Vůči býložravcům se uplatňují zejména jednoduché fenoly, flavolany, kondenzované taniny či proanthokyanidiny (Harborne, 1999b; Harborne & Williams, 2000). Jako ochrana vůči hmyzu fungují flavony a jejich glykosidy, flavonoly, isoflavony a isoflavonoidy, flavonony či anthokyaniny (Harborne & Williams, 2000; Simmonds, 2003). V kořenových
exudátech
byly
flavonoidy
a
isoflavonoidy
identifikovány
jako signály navozující expresi symbiotických nod genů v rhizobiích (hlízkovitých bakteriích), což vede k tvorbě hlízek rostlinou (Peters & Verma, 1990; Maj et al, 2010; Phillips & Kapulnik, 1995; Veena & Nainawatee, 2002). Tato symbióza je velice důležitá, neboť zajišťuje nejen přísun dusíku pro danou rostlinu, ale také obohacení půdy o dusík (Carranca et al., 2009). Tomasi a kol. (2008) také prokázali, že flavonoidy uvolňované z kořenů na fosfor deficitní lupiny se účastní získávání fosforu jak přímo – mobilizací nerozpustného, na železo vázaného fosforu – tak i nepřímo – snižováním mikrobiální spotřeby citrátu a snižováním aktivity mikrobiálních enzymů účastnících se získávání fosforu.
2. 1. 3. Mastné kyseliny Mastné kyseliny (fatty acids, FA) jsou alifatické monokarboxylové kyseliny s dlouhými nerozvětvenými uhlovodíkovými řetězci, které se podílí na tvorbě nebo jsou součástí mnoha důležitých biologicky aktivních látek. Mají tudíž podíl na mnoha funkcích organismu. S alkoholy (například s glycerolem) vytváří mastné kyseliny estery, tzv. lipidy, které mají strukturní (fosfolipidy, glykolipidy aj.), zásobní (triacylglyceroly), transportní (lipoproteiny) a ochrannou funkci (acylglyceroly) a jsou prekurzory signálních molekul (fosfatidylinositol aj.) i steroidů (kortikoidy, pohlavní hormony, vitamín D). Lipidy přijímané v potravě jsou zdrojem nenasycených esenciálních mastných kyselin, tj. kyselin nezbytných k životu. Tyto kyseliny si živočichové nedokáží syntetizovat de novo, protože nemají k dispozici enzymy ∆-15 a ∆-12 desaturasu (SanGiovanni & Chew, 2005). Dalšími důležitými deriváty mastných kyselin jsou prostaglandiny, tromboxany, protektiny,
resolviny,
lipoxiny
a
leukotrieny.
Jejich
prekurzory jsou kyselina
arachidonová, eikosapentaenová, dokosahexaenová a dihomo-γ-linolenová. Uvedené látky působí jako mediátory regulující metabolické dráhy a působí protizánětlivě a protisrážlivě. (Gleissman et al., 2010) - 27 -
Biosyntéza těchto kyselin je lokalizována převážně v cytosolu buněk a až na některé odlišnosti se jedná o obrácenou β-oxidaci (Šípal et al., 1992). Existuje však ještě jeden biosyntetický systém – mitochondriální – který je podobný bakteriálnímu syntetickému aparátu (Wakil, 1961; Hiltunen et al., 2010). U člověka probíhá biosyntéza například v játrech, ledvinách, tukových tkáních či mozku. U rostlin jsou FA syntetizovány i v plastidech a prodlužovány v endoplazmatickém retikulu. Sasaki a kol. (1997) prokázali, že v případě chloroplastů je syntéza FA ovlivněná světlem. Základním prekurzorem je acetylkoenzym A (acetyl-CoA) vzniklý degradací sacharidů v mitochondriích. Acetyl-CoA je ve formě citrátu transportován výměnou za pyruvát člunkovým mechanismem přes membránu do cytosolu (Šípal et al., 1992). Acetyl-CoA je následně karboxylován aktivovaným oxidem uhličitým za účasti enzymu acetyl-CoA-karboxylasy,
jehož
kofaktorem
je
biotin
(Tong,
2005).
Vzniká
tak malonyl-CoA, důležitý klíčový produkt, poskytující dva uhlíky pro prodlužování řetězce mastné kyseliny (Wakil, 1961). Příslušná kyselina pak vzniká opakováním sledu několika enzymových reakcí, které probíhají na multienzymovém komplexu zvaném mastná kyselina-synthasa (Wakil, 1989; Šípal et al., 1992). Navazováním dalších malonyl-CoA se tudíž řetězec prodlužuje vždy o dva uhlíky. Z tohoto důvodu se v přírodě vyskytují pouze mastné kyseliny se sudým počtem uhlíků. Na rozdíl od β-oxidace, kde je přenašečem acylu CoA, při biosyntéze slouží k přenosu přenašečový protein ACP (acyl carrier protein), který taktéž vytváří thioesterovou vazbu (Majerus, 1967). Prekurzorem je tudíž acetyl-ACP, resp. malonyl-ACP. Tvorba mastných kyselin je regulována koncentrací citrát a NADPH v cytosolu buněk a činností hormonů insulinu, glukagonu, adrenalinu a noradrenalinu (Lakshmanan et al., 1972).
2. 1. 3. 1. Rozdělení mastných kyselin 2. 1. 3. 1. 1. Nasycené mastné kyseliny (Saturated Fatty Acids, SAFA) Tyto mastné kyseliny neobsahují žádnou dvojnou vazbu. Ve formě tuků slouží jako energetická rezerva. Patří sem například kyselina palmitová (16:0), stearová (18:0) či myristová (14:0). Jak uvádí ve svém přehledném článku Parodi (2009), bylo provedeno mnoho studií ohledně vztahu mezi SAFA a koronárními srdečními onemocněními. Některé zjistily pozitivní, jiné negativní vztah, ale převážná většina nezaznamenala žádný vztah. Můžeme tedy říci, že SAFA neovlivňují významně hladinu celkového cholesterolu ani LDL (low-density lipoprotein, tj. lipoproteinové částice s malou hustotou) cholesterolu, které jsou považovány za rizikové faktory srdečních onemocnění. - 28 -
2. 1. 3. 1. 2. Mononenasycené mastné kyseliny (Monounsaturated Fatty Acids, MUFA) Jedná se o kyseliny obsahující pouze jednu dvojnou vazbu. Vyskytují se převážně v cis formě, která snižuje hladinu krevního celkového cholesterolu a zvyšuje hladinu HDL (high-density lipoprotein, tj. lipoproteinové částice s vysokou hustotou) cholesterolu (Shah et al, 2004). Mohou se však vyskytovat i v konfiguraci trans, kdy naopak zvyšují hladinu celkového cholesterolu a LDL cholesterolu (Vijver et al., 2000). Řadíme sem například kyselinu olejovou (18:1) či erukovou (22:1).
2. 1. 3. 1. 3. Polynenasycené mastné kyseliny (Polyunsaturated Fatty Acids, PUFA) Jak již název napovídá, obsahují tyto kyseliny více než jednu dvojnou vazbu. Jedná se o velice důležitou skupinu látek, neboť zahrnují i tzv. esenciální mastné kyseliny (essential fatty acids, EFA), které si živočichové neumí syntetizovat de novo a musí tedy být součástí potravy (Innis, 2003). Do této skupiny patří i tzv. ω-3 (tj. n-3) a ω-6 (tj. n-6) nenasycené mastné kyseliny, které se liší polohou první dvojné vazby (SanGiovanni & Chew, 2005). U ω-3 mastných kyselin je tato dvojná vazba mezi uhlíky C3 a C4, počítáno od koncového methylu kyseliny, tj. od n-konce uhlíkového řetězce, zatímco u ω-6 mastných kyselin je mezi uhlíky C6 a C7 (Obr.8) (SanGiovanni & Chew, 2005). Mezi ω-3 FA řadíme kyselinu α-linolenovou (18:3) a od ní odvozené kyseliny eikosapentaenovou (eicosapentaenoic acid, EPA, 20:5; Sayanova & Napier, 2004) a dokosahexaenovou (docosahexaenoic acid, DHA, 22:6; Qiu, 2003). K ω-6 FA pak kyselinu linolovou (18:2) a od ní odvozené kyseliny dihomo-γ-linolenovou (dihomo-γ-linolenic acid, DGLA, 20:3; Fan & Chapkin, 1998) a arachidonovou (arachidonic acid, ARA, 20:4; Salem et al., 1999). Při tvorbě EPA, DHA, DGLA a ARA dochází ke kompetici mezi α-linolenovou a linolovou kyselinou o enzymy desaturasu a elongasu (Sayanova & Napier, 2004). Z tohoto důvodu je důležitý adekvátní příjem kyseliny α-linolenové (Barceló-Coblijn & Murphy, 2009), který zajistí dostatečnou produkci EPA a DHA, které jsou pro zdraví nezbytné. Jak však uvádí Whelan (2008), i pravidelný příjem kyseliny linolové je důležitý.
- 29 -
methylový konec
CH3 CH CH2(n) COOH
karboxylový konec
∆
ω k první dvojné vazbě
k místu desaturace CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CHCH2(7)COOH ω-6 ∆-12
kyselina linolová 18:2,ω-6
kyselin α-linolenová 18:3,ω-3
CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2(7)COOH ω-3 ∆-15
Obr. 8 Schématické zobrazení obecné struktury a nomenklatury mastných kyselin (Innis, 2008).
2. 1. 3. 2. ω-3 mastné kyseliny Mnohé studie prokázaly, že ω-3 mastné kyseliny jsou z fyziologického a nutričního hlediska velice důležité. Především se podílí na tvorbě nervového systému (Innis, 2008) a sítnice (SanGiovanni & Chew, 2005), ale také nás chrání před kardiovaskulárními, psychiatrickými, neurologickými, revmatologickými či kožními onemocněními (Seppänen-Laakso et al., 2002; Black & Rhodes, 2006; Mazza et al., 2007; Lavie et al., 2009). Je zkoumán jejich potenciál pro prevenci a léčbu rakoviny (Berquin et al., 2008; Gleissman et al., 2010). Hrají důležitou roli ve vývoji plodu a malých dětí (Makrides et al., 1995; Innis, 2007). Mají také antibakteriální, protisrážlivé, antiarytmické a protizánětlivé účinky a stabilizují krevní destičky (Mutanen,
1997;
Tapiero
et
al.,
2002;
Calder,
2004;
Leaf
et
al.,
2005;
Robinson & Stone, 2006; Gleissman et al., 2010; Huang & Ebersole, 2010). Z uvedených důvodů doporučuje mnoho zdravotnických organizací konzumaci potravin s vysokým obsahem ω-3 mastných kyselin a příznivým poměrem ω-3/ω-6 mastných kyselin. Tento poměr je dán poměrem α-linolenové a linolové kyseliny a měl by být v rozmezí 0,5 – 1 (Simopoulos, 2002).
Pokud je poměr nižší, hovoříme
o deficitu mastných kyselin. Zdrojem ω-3 mastných kyselin jsou především ryby a některé druhy rostlin, včetně lupiny bílé. Oproti tomu ω-6 mastné kyseliny lze získat pouze z rostlinných olejů. EPA, DHA a ARA (Obr. 9) jsou pro člověka nezbytné. Místem největší koncentrace
DHA
v
lidském
těle
jsou
fosfolipidy
sítnice,
především
fosfatidylethanolamin a fosfatidylserin. Oproti tomu EPA je nejvíce zastoupena - 30 -
v krevních elementech. V tkáních je jí jen malé množství, protože je rychle přeměňována na DHA a eikosanoidy (deriváty EPA) (Sierra et al., 2008). ARA je hlavní mastnou kyselinou nervových a cévních tkání mozku a sítnice. Nejvíce je zastoupena ve fosfatidylethanolaminu a fosfatidylcholinu. Tyto tři látky jsou klíčovými strukturními komponenty membrán, ligandy transkripčních faktorů, efektory signálních drah regulujících genovou transkripci a substráty pro eikosanoidy a endokanabinoidy. (SanGiovanni & Chew, 2005) O CH3
HO
kyselina eikosapentaenová (EPA)
O HO
CH3
kyselina arachidonová (AR A)
O HO
CH3
kyselina dokosahexaenová (D H A)
Obr. 9 Strukturní vzorce vybraných esenciální mastných kyselin.
2. 1. 3. 3. Mastné kyseliny v semenech lupiny bílé Semena lupiny bílé obsahují 7 – 14 % tuku, který je tvořen ze 40 – 60 % kyselinou olejovou, ze 12 – 25 % kyselinou linolovou a ze 6 – 12 % kyselinou α-linolenovou (Obr. 10). Další mastné kyseliny, například kyselina palmitová (~ 8 %), stearová (~ 1 %) či eruková (~ 3 %), se oproti těmto nejvíce zastoupeným vyskytují v menším množství. Vzhledem k uvedeným hodnotám se poměr ω-3/ω-6 mastných kyselin pohybuje v rozmezí 0,4 – 0,6, tedy je velice příznivý. (Petterson, 2000; Bhardwaj et al., 2004; Straková et al., 2006; Boschin et al., 2007; Uzun et al., 2007; Boschin et al., 2008)
- 31 -
O HO
CH3
kyselina olejová O HO
CH3
kyselina linolová O CH3
HO
kyselina α -linolenová
Obr. 10 Strukturní vzorce mastných kyselin nejvíce zastoupených v semenech lupiny bílé.
Uvedené hodnoty mají široké rozmezí. Jak již však bylo uvedeno dříve, je to dáno tím, že obsah jednotlivých látek závisí na genotypu, prostředí a podmínkách zemědělství (Bhardwaj et al., 1998; Boschin et al., 2007; Boschin et al., 2008). Jak uvádí tabulka 5, oproti jiným rostlinám obsahuje lupina bílá méně tuku a má příznivý poměr ω-3/ω-6 mastných kyselin. Právě díky vysokému obsahu ω-3 mastných kyselin, proteinů a vlákniny se začíná lupina stále více uplatňovat ve stravě lidí i zvířat (Huyghe, 1997). V rámci potravin obsahujích lupinu se můžeme setkat například s těstovinami, pečivem či náhražkami masa (Martínez-Villaluenga et al., 2010). Tab. 5 Porovnání obsahu tuku a poměru ω-3 a ω-6 mastných kyselin u vybraných rostlin a jejich částí (tabulka částečně převzata z Boschin et al., 2007). Rostlina / Produkt
Tuk (%)
ω-3/ω-6
Slunečnice
25-30
> 0,01
Olivy
38-58
0,13
Sója
18-23
0,15
pšeničné klíčky
8-11
0,19
vlašské ořechy
58-71
0,20
7-14
0,54
32-43
4,14
lupina bílá lněná semínka
- 32 -
Pro analýzu mastných kyselin je převážně využívána plynová chromaografie s plamenovým ionizačním detektorem (GC-FID) (Bhardwaj et al., 1998; Bhardwaj et al., 2004; Erbaş et al., 2005; Boschin et al., 2007; Uzun et al., 2007; Boschin et al., 2008). O této metodě pojednává následující kapitola. Dále je také využívána plynová chromatografie
ve
spojení
s
hmotnostní
spektrometrií
(GC-MS),
případně
vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) (Ruiz-Rodriguez et al., 2010).
2. 1. 3. 4. GC-FID analýza mastných kyselin 2. 1. 3. 4. 1. Příprava vzorku Nejdříve dochází k odtučnění vzorku, například lupinové mouky. Nejčastěji se extrakce provádí pomocí Soxhletovy aparatury. Případně prostou extrakcí, kde se můžeme setkat s Folchovou metodou (extrakce směsí chloroform/methanol, 2:1, v/v) či Bligt-Dyerovou metodou (extrakce směsí chloroform/methanol/voda) (Ruiz-Rodriguez et al., 2010). Jako extrakční činidlo se používá nejčastěji hexan (Boschin et al., 2007; Boschin et al., 2008), dále pak petroleum ether (Uzun et al., 2007; Petrović et l., 2010), směs hexan/isopropanol (3:2, v/v; Bhardwaj et al., 1998; Bhardwaj
et
al.,
2004)
a
další.
Extrakt
je
většinou
odpařen
ve
vakuu
nebo pod dusíkem. Obsah tuku pak určíme porovnáním hmotnosti vzorku před a po extrakci.
2. 1. 3. 4. 2. Příprava methylesterů mastných kyselin (FAME) Mastné kyseliny nejsou analyzovány ve své přirozené, málo těkavé formě, nýbrž
ve
formě
těkavých
methylesterů
(fatty
acid
methyl
esters,
FAME)
(Ruiz-Rodriguez et al., 2010). Před analýzou tedy musíme vzorek tzv. zderivatizovat, čímž zlepšíme citlivost a selektivitu detekce a zvýšíme účinnost separace. Navíc derivatizací získáme i nepolární deriváty FA, na rozdíl od polárních volných kyselin, což nám taktéž usnadní analýzu (Ruiz-Rodriguez et al., 2010). Kromě methylderivátů, které se používají nejvíce, se používají i ethyl-, propyl-, isopropyl-, butyla isobutylderiváty (Brondz, 2002). Derivatizaci často předchází saponifikace (zmýdelňování), která z tuků uvolňuje mastné kyseliny. K saponifikaci se nejčastěji používá hydroxid draselný v methanolu, případně hydroxid sodný v methanolu (Eder, 1995). Někdy saponifikace probíhá zároveň s derivatizací, například při použití CH3ONa/CH3OH (Gutnikov, 1995), KOH/CH3OH nebo HCl/CH3OH (Seppänen-Laakso et al., 2002).
- 33 -
Bylo vyvinuto mnoho metod přípravy FAME. Nejčastěji používanými způsoby transmethylace O-acyl lipidů jsou bazicky nebo kysele katalyzovaná methylace (včetně methylace fluoridem boritým), methylace s diazomethanem či jeho deriváty a silylace (Méndez Antolín et al., 2008). Jako alternativa k těmto metodám se používá metoda tepelné hydrolýzy a methylace (THM; Brondz, 2002; Ruiz-Rodriguez et al., 2010) Přehled nejpoužívanějších látek pro jednotlivé způsoby methylace uvádí tabulka 6. Uvedené metody derivatizace platí zejména pro mastné kyseliny s více než dvanácti uhlíky, tedy pro kyseliny fyziologicky a nutričně nejvýznamnější. Některé z metod esterifikace používaných pro analýzu FAME v semenech z lupiny a rostlinných olejích jsou uvedeny v tabulce 7. Tab. 6 Přehled derivatizačních metod a látek pro přípravu FAME (Eder, 1995; Gutnikov, 1995; Brondz, 2002; Seppänen-Laakso et al., 2002; Méndez Antolín et al., 2008; Ruiz-Rodriguez et al., 2010; Petrović et l., 2010). Způsob methylace
Látka
Bazicky katalyzovaná
CH3ONa CH3ONa/CH3OH NaOH/CH3OH KOH/CH3OH
Kysele katalyzovaná
BF3/CH3OH HCl/CH3OH Acetylchlorid/CH3OH H2SO4/CH3OH
Bazicky i kysele katalyzovaná
KOH/CH3OH i BF3/CH3OH
Methylace s diazomethanem či jeho deriváty
Diazomethan Dizomethan/ether Trimethylsilyldiazomethan (TMS-DM)
Silylace
Chlorotrimethylsilan (CTMS)/1-propanol Trimethylsilyldiazomethan (TMS-DM) Trimethylsilylimidazole (TMSI) N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamid (MSTFA)
Tepelná hydrolýza a methylace
Tetramethylammonium hydroxide (TMAH) Trimethylsulfonium hydroxid (TMSH) Tetramethylguanidin
Bazická katalýza je rychlejší než kyselá, ale vyžaduje striktně nevodné prostředí. Výhodou použití CH3ONa/CH3OH je, že reakce probíhá rychle a na rozdíl od kyselé katalýzy při laboratorní teplotě. Na druhou stranu nedochází k esterifikaci
- 34 -
volných mastných kyselin a sfingolipidů. Kyselá katalýza je ze všech metod nejuniverzálnější, a proto nejčastěji v laboratorní praxi používána, i když vyžaduje vysokou teplotu (50 – 100 °C). Fluorid boritý má vysokou methylační sílu, díky čemuž je reakce velmi rychlá, ale může poškodit GC kolonu. Využívanější je proto kyselina chlorovodíková v methanolu, která má však menší methylační sílu. Analýza je proto kratší, ale poskytuje téměř kvantitativní výtěžek. Nevýhodou diazomethanu je tvorba artefaktů, vysoká toxicita a potenciální explozivita, výhodou naopak rychlá reakce. Silylace s TMSI je oproti klasickým metodám esterifikace FA levnější a co se týče používaných látek často méně nebezpečná. Také můžeme použít i jiný alkohol než methanol a rozpustnost TMSI v organických rozpouštědlech zajišťuje současnou esterifikaci volných mastných kyselin a transesterifikaci lipidů. THM je rychlou a jednoduchou alternativou ke klasickým metodám, která vyžaduje menší množství vzorku, minimální manipulaci a přípravu vzorku i rychlou analýzu. (Eder, 1995; Gutnikov, 1995; Seppänen-Laakso et al., 2002; Ruiz-Rodriguez et al., 2010) Tab. 7 Přehled nejpoužívanějších způsobů derivatizace a následné extrakce FAME u semen z lupiny bílé a jiných rostlinných olejů. Způsob derivatizace
Extrakce FAME
Citace
CH3ONa
isooktan
Uzun et al., 2005
methanol:benzen:2,2´-dimethoxypropan: H2SO4 (37:20:5:2, v/v)
n-heptan
Garcés & Mancha, 1993 Erbaş et al., 2005
CH3ONa v CH3OH
diethylether
Boschin et al., 2007 Boschin et al., 2008
H2SO4 / CH3OH (1:99, v/v)
hexan
Bhardwaj et al., 2004
KOH v CH3OH
isooktan
Petrović et al., 2010
2. 1. 3. 4. 3. GC-FID analýza Jak již bylo zmíněno, kapilární plynová chromatografie je nejpoužívanější metodou pro analýzu komplexních směsí FAME tvořených mastnými kyselinami s více jak dvanácti uhlíky. S ohledem na dosažení vysoké přesnosti analýzy je nejkritičtějším krokem vstřikování vzorku. Nejpoužívanější je technika děleného vstřiku (split injection), kdy je vzorek zaveden do horké vstřikovací komory. Její nevýhodou je, že vzorek není zahřát na teplotu komory. Tento problém lze vyřešit nastřikováním vzorku za studena, kdy můžeme použít techniku přímého nástřiku na kolonu (on-column injection) - 35 -
nebo techniku s teplotně programovaným odpařováním (programme-temperature vaporizing injection). K největším nepřesnostem dochází, pokud nastřikujeme vzorek ručně. (Eder, 1995; Seppänen-Laakso et al., 2002) Komplexní směsi FAME jsou separovány pomocí kapilárních kolon s vysokou separační schopností (105 a více teoretických pater). Pro analýzu jednoduchých směsí FAME (do C18) jsou ještě někdy používány náplňové kolony, které mají sice velkou kapacitu, ale relativně malou separační schopnost oproti kapilárním kolonám. Nevýhodou kapilárních kolon je však jejich snadné přetížení, což vede ke snížení separačních a kvantitativních schopností. Také vyžadují citlivější detektor. (Eder, 1995; Gutnikov, 1995) K separaci FAME může docházet na kapilárních kolonách s nepolární, polární a vysoce polární stacionární fází, přičemž výběr fáze ovlivňuje separační schopnost kolony (Seppänen-Laakso et al., 2002). Zvláště u PUFA ovlivňuje polarita stacionární fáze retenční čas FAME. Obecně nejlepší separace nenasycených mastných kyselin dosáhneme s velmi polární stacionární fází, která však má malou životnost. Proto je většinou používána nepolární či polární stacionární fáze, která má ve většině případů dostatečnou separační schopnost. V případě lupiny bílé se z vysoce polárních fází často uplatňuje poly(bis-kyanopropyl siloxan) (SP-2340) (Boschin et al., 2004; Boschin et
al.,
2008).
Ze
středně
polárních
stacionárních
fází
je
nejpoužívanější
polyethylenglykol (ZB-WAX, Supelcowax10, Carbowax 20M) (Bhardwaj et al., 1998; Bhardwaj et al., 2004) či acidifikovaný PEG (FFAP) (Erbaş et al., 2005; Uzun et al., 2007). Polární stacionární fáze umožňuje separaci dle počtu uhlíků, kdy jsou nasycené mastné kyseliny eluovány před nenasycenými, přičemž dochází k minimálnímu překryvu různě dlouhých řetězců. Vysoce polární fáze zase lépe zachytí polární dvojné vazby a čím více je mastná kyselina nenasycená, tím později bude eluována oproti nasyceným. Tato fáze je vhodná i pro separaci cis- a trans-isomerů (Seppänen-Laakso et al., 2002). (Gutnikov, 1995; Eder, 1995; Ruiz-Rodriguez et al., 2010) Dalším důležitým faktorem ovlivňujícím separační schopnost kolony je její délka (Seppänen-Laakso et al., 2002). Pro stanovení složení FA u lupiny bílé se nejčastěji používají kolony mezi 25 a 60 m (Bhardwaj et al., 1998; Bhardwaj et al., 2004; Erbaş et al., 2005; Boschin et al., 2007; Uzun et al., 2007; Boschin et al., 2008). Čím delší je kolona, tím lépe se FAME separují, ale zvyšuje se retenční čas. Pro nenasycené mastné kyseliny platí, že na kratších vysoce polárních kolonách dochází k lepší separaci než na dlouhých nepolárních kolonách. (Eder, 1995) Separace, retenční čas FAME a kapacita kolony ovlivňuje také tloušťka filmu a vnitřní průměr kolony (Seppänen-Laakso et al., 2002). Čím je tloušťka filmu větší, tím se uvedené vlastnosti zvyšují (Eder, 1995). Obvyklá, plně dostačující tloušťka filmu, - 36 -
používaná i pro separaci FAME z lupiny bílé, je 0,25 µm (Bhardwaj et al., 2004; Erbaş et al., 2005; Uzun et al., 2007; Boschin et al., 2008). Důležitá je i volba nosného plynu, který také ovlivňuje separaci a délku analýzy a neměl by interagovat ani se stacionární fází ani se vzorkem. Nejkratší a nejpřesnější analýzy dosáhneme při použití vodíku nebo helia. Z důvodu bezpečnosti je ve většině studií, včetně studií lupiny bílé (Uzun et al., 2007), upřednostňováno helium. (Gutnikov, 1995) Nejpoužívanějším detektorem pro analýzu FAME je plamenový ionizační detektor (flame ionization detector, FID) (Bhardwaj et al., 2004; Erbaş et al., 2005; Boschin et al., 2007; Uzun et al., 2007). Tento detektor je vhodný pro analýzu FAME, neboť je dostatečně citlivý, selektivní a poskytuje lineární odezvu v širokém rozsahu koncentrací, navíc je levný (Eder, 1995; Tvrzická et al., 2002). Nejjednodušším způsobem identifikace FAME ve vzorku je porovnání zjištěných retenčních časů s retenčními časy jednotlivých komerčně dodávaných standardů. Pokud však standardy některých kyselin nejsou dostupné, lze využít dobře charakterizovaná spektra přírodních produktů, které obsahují široké spektrum mastných kyselin. Jiným způsobem identifikace je zjištění hodnot relativního retenčního času (relative retention time, RRT) nebo ekvivalentní délky řetězce (equivalent chain lenght, ECL; Tvrzická et al., 2002). RRT je poměr mezi retenčním časem daného FAME a retenční časem referenční FAME (C16:0 nebo C18:0). Porovnáním této hodnoty s literaturou, pak můžeme provést identifikaci. Identifikace pomocí ECL hodnot je založena na Kovatsově retenčním indexu a umožňuje snadnou vizualizaci pozic jednotlivých FAME vzhledem k nasyceným mastným kyselinám 14:0 až 24:0. Retenční časy FAME pro výpočet ECL hodnot určíme isotermickou operací. Aktuální hodnotu ECL pro danou mastnou kyselinu vypočteme z rovnice a porovnáme ji s daty uvedenými v literatuře. Tato metoda je používána například pro identifikaci cis/trans mastných kyselin. Pro absolutní potvrzení identifikace FAME je vhodné použít spojení GC-MS. Nejrychlejší a nejjednodušší z uvedených metod je identifikace pomocí standardu. Tato metoda spolu s ECL identifikací je také nepoužívanější. (Gutnik et al., 1995; Eder, 1995; Seppänen-Laakso et al., 2002) GC-MS se používá především pro analýzu stopových množství FA nebo pokud není k dispozici standard pro jejich identifikaci (Petrović et l., 2010). GC/GC analýza se využívá pro identifikaci FA s lichým počtem uhlíků (Mondello et al., 2006). V rámci kvantifikace dochází k největším ztrátám při esterifikaci a nastřikování vzorku. Pro kvantifikaci se používají roztoky standardů o známé koncentraci, která by měla být v oblasti linearity detektoru. Tyto koncentrace jsou odvozeny od množství FA zjištěného ve vzorku. Množství FAME určíme pomocí teoretických - 37 -
relativních responsních faktorů (relative response factors, RRFs) vycházejících z odezvy detektoru (např. plocha peaku) na konkrétní FAME a odezvy na referenční FAME (většinou interní standard). RRF pak vypočítáme jako poměr odezvy vzorku a standardu vynásobený množstvím standardu. Pro absolutní kvantifikaci se používá metoda standardního přídavku, kdy ke vzorku přidáváme určité množství interního standardu (IS). IS musí být methylester mastné kyseliny, která se ve vzorku nevyskytuje. IS může být i směs FAME (Uzun et al., 2007). V případě lupiny bílé se proto jako IS nejvíce používá methylester kyseliny heptadekanové (C17:0) (Bhardwaj et al., 1998; Boschin et al., 2007; Boschin et al., 2008). Výsledek analýzy můžeme vyjádřit v procentech (%) z celkového množství FA nebo jako jednotky hmotnosti, objemu či molarity vztažené na určité množství vzorku (mg FA/g vzorku mol.l-1 FA/g vzorku apod.). (Eder, 1995; Tvrzická et al., 2002)
2. 1. 4. Aminokyseliny Biogenní aminokyseliny (α-L-aminokyseliny, Obr. 11) jsou aminokyseliny nezbytné pro život (Reeds, 2000). Můžeme je rozdělit na proteinogenní aminokyseliny, podílející se na tvorbě proteinů a tedy i enzymů (biologických katalyzátorů), a neproteinogenní aminokyseliny mající v organismu jiné fyziologické a metabolické funkce (Šípal et al., 1992). Například tryptofan je prekurzorem neurotransiteru serotoninu (Savelieva et al., 2008). Oxid dusnatý, derivát argininu, se podílí na regulaci krevního tlaku a ochraně střev a také se podílí na přenosu signálů v mozku (Wu & Morris, 1998). Cystein, kyselina glutamová a glycin vytvářejí tripeptid glutathion, který je hlavním antioxidantem lidského organismu. Zároveň zajišťuje i detoxikaci organismu (Sies, 1999), je důležitou součástí imunitního systému a mnoha biochemických reakcí (Dröge et al., 1994). Glycin je taktéž základním stavebním kamenem porfyrinu hemu, který je součástí hemoglobinu (Shemin & Rittenberg, 1946). Pro vznik nukleotidů, resp. nukleových kyselin, jsou nutné aminokyseliny glycin, glutamin a kyselina asparagová (Šípal et al., 1992). Fenylpropanoidy, látky nutné pro přežití rostlin (Chong et al., 2009), jsou odvozeny od fenylalaninu (Weisshaar & Jenkins, 1998). Z uvedeného je patrné, že aminokyseliny jsou skutečně základem života, ať už živočichů, rostlin či mikroorganismů.
- 38 -
COOH3N+
Cα
H
R Obr. 11 Obecná struktura α-L-aminokyselin – obojetný ion (amfion).
2. 1. 4. 1. Aminokyseliny a jejich výskyt v semenech lupiny bílé Úspěšné používání sóji jako zdroje proteinů evokovalo zájem o další nutričně zajímavé rostliny. Z tohoto důvodu se vědci zaměřili na lupinu, která má obdobné a leckdy i nutričně vhodnější složení než sója a oproti ní je schopna růst za různých klimatických a půdních podmínek. Pěstování takovýchto rostlin, například v Africe, kde je ve stravě nedostatek proteinů, je velmi důležité. Mimoto se lupina využívá i jako proteinově bohaté krmivo prasat a dalších zvířat (Gdala et al., 1996). Jak již bylo zmíněno, lupina bílá obsahuje 33 – 47 % proteinů, tedy více než sója. Většina proteinů semen je v zásobních vakuolách děložních tkání a slouží zejména jako zdroj uhlíkatých a dusíkatých sloučenin pro klíčící rostliny. Semena lupiny bílé obsahují, dle klasifikace Osborna (1907), dvě hlavní proteinové frakce – albuminovou a globulinovou, přibližně v poměru 1:9. Jak uvádí Duranti a Cerletti (1979) albuminy tvoří 12,8 % a globuliny 87,2 % z celkových proteinů. Ostatní frakce, tedy gluteliny a prolaminy, jsou minoritní. Albuminy představují funkční proteiny, které zahrnují především metabolické enzymy, ale také inhibitory hydrolas. Při zrání jsou důležité zejména 2S albuminy, které jsou zdrojem síry při klíčení. Globuliny lze rozseparovat na konglutiny α (11S globulin), β (7S globulin), γ (7S globulin) a δ (2S globulin) (Melo et al., 1994; Wait et al., 2005; Locati et al., 2006). Důležitý je zejména konglutin γ, na síru bohatý glykoprotein, který obsahuje aminokyseliny (amino acid, AA) vzácně se vyskytující u jiných luštěnin. Jeho obsah představuje 4 – 5 % všech proteinů. (Duranti et al., 2008) Ze studií vyplývá, že pro aminokyselinové složení lupiny bílé je charakteristické vysoké množství kyseliny glutamové, asparagové a argininu a naopak malé množství tryptofanu, methioninu, cysteinu (Duranti & Cerletti, 1979; Sujak et al., 2006). Obsah jednotlivých aminokyselin je uveden v tabulce 8. Na rozdíl od rostlin si živočichové dokáží syntetizovat de novo pouze devět aminokyselin, tzv. neesenciálních (non-essential amino acid, NEAA). Ostatní musí přijímat v potravě, aby bylo možné
- 39 -
syntetizovat proteiny. Takové AA označujeme jako esenciální (essential amino acid, EAA). (Reeds, 2000) O nutriční hodnotě proteinů nám napoví poměr leucin/isoleucin a leucin/lysin. Nadbytek leucinu totiž snižuje adekvátní spotřebu isoleucinu a lysinu (Farran et al., 2003). Podobně příjem sirných aminokyselin methioninu a cysteinu by měl u dospělých osob být kolem 15 mg/kg/den (FAO/WHO/UNU, 2002). Průměrná denní spotřeba dalších důležitých AA je uvedena v tabulce 8. Tab. 8 Obsah aminokyselin v lupině bílé a doporučená denní dávka esenciálních aminokyselin (Chango et al., 1995; FAO/WHO/UNU, 2002; Sujak et al., 2006; Martínez-Villaluenga et al., 2007). Aminokyselina
Obsah (g/16 g N)
DDD (mg AA/kg váhy)
Lys
1,7 - 4,9
30
Met + Cys
0,6 - 2,5
15
Thr
2,5 - 3,5
15
Ile
2,2 - 4,3
20
Trp
0,6 - 3,2
4
Val
3,3 - 4,1
26
Leu
3,8 - 7,8
39
His
2,2 - 3,3
10
Phe + Tyr
3,7 - 7,9
25
Arg
3,3 - 11,4
---
Asp
7,1 - 10,9
---
Ser
4,4 - 4,8
---
Glu
18,4 - 23,5
---
Pro
3,0 - 3,7
---
Gly
3,0 - 4,3
---
3,1 - 3,5
---
Esenciální aminokyseliny
Neesenciální aminokyseliny
Ala DDD doporučená denní dávka
- 40 -
2. 1. 4. 2. Analýza aminokyselinového složení Pro analýzu aminokyselin se používá metoda vysokoúčinné kapalinové chromatgrafie (HPLC) s použitím kationtově výměnné chromatografické separace s postkolonovou derivatizací nebo separace na reverzní fázi s fluorescenční detekcí po prekolonové derivatizaci (Yokoyama et al., 1996).
2. 1. 4. 2. 1. Příprava vzorku Pokud chceme zjistit složení AA v jednotlivých frakcích proteinů, je nutná frakcionace (Duranti & Cerletti, 1979; Chango et al., 1995). Samotné analýze aminokyselin předchází kyselá hydrolýza vzorku. Hydrolýza probíhá nejčastěji v přítonosti 6 mol.l-1 kyseliny chlorovodíkové při teplotě 105 – 110 °C po dobu 21 – 24 hodin (Spindler et al., 1984; Chango et al., 1995; Sujak et a., 2006; Gulewicz et al., 2008). Sirné aminokyseliny se většinou hydrolyzují zvlášť, přičemž kyselé hydrolýze předchází oxidativní hydrolýza směsí kyselina mravenčí/peroxid vodíku (9:1, v/v) při 4 °C po dobu 16 – 20 hodin (Spindler et al., 1984; Sujak et al., 2006). Kyselá hydrolýza může ovlivňovat výsledky analýzy, neboť může vést k částečné (threonin, serin) či úplné destrukci (tryptofan) některých AA. Oxidativní destrukci však eliminujeme, pokud budeme vzorek hydrolyzovat v prostředí vakua či inertního plynu. Někdy také hydrolýze a frakcionaci předchází odtučnění mouky, například pomocí n-hexanu a Soxhletovy aparatury (Mubarak, 2001).
2. 1. 4. 2. 2. HPLC analýza aminokyselin Více jak polovina metod používaných pro analýzu AA využívá iontoměničovou chromatografii (IEC) s následnou postkolonovou derivatizací, například ninhydrinem. Právě
IEC
s
postkolonovou
ninhydrinovou
detekcí
je
pro
kvantifikaci
AA
nepoužívanější. Tato metoda má široký rozsah linearity, je citlivá, rychlá a jednoduchá (Yokoyama et al., 1996). Malou nevýhodou je skutečnost, že ne všechny aminokyseliny poskytují stejnou intenzitu zbarvení (Moore & Stein, 1948). Iontoměničová chromatografie využívá faktu, že aminokyseliny jsou amfoterní látky, tj. že jejich elektrický náboj závisí na pH okolního prostředí. V kyselém prostředí se chovají jako kationty, v zásaditém jako anionty. Pokud je pH prostředí rovno izoelektrickému bodu (pI) dané aminokyseliny, chová se tato aminokyselina jako neutrální. Pro analýzu komplexních fyziologických vzorků se používá kationtově výměnný systém na bázi lithia, zatímco pro jednodušší směsi aminokyselin systém na bázi sodíku. Jako interní standard je často používán norleucin (Spindler et al., 1984;
- 41 -
Chango et al., 1995; Gulewicz et al., 2008). Separace AA probíhá na základě změn pH a síly kationtu. Pro zlepšení separace se používá také teplotní gradient. Vzorky jsou připravovány v kyselém prostředí, díky čemuž se aminokyseliny chovají jako kationty a mohou být vázany katexem. Vzrůstající pH pak stimuluje disociaci záporně nabitých karboxylových
skupin,
až
každá
AA
dosáhne
svého
izoelektrického
bodu,
ve které se její ionty chovají neutrálně, a proto se mohou z ionexu postupně uvolňovat poté, co jsou vytěsněny výměnným iontem. Vyeluované aminokyseliny jsou pak směšovány s ninhidrinem. Reakcí ninhydrinu s aminokyselinami vznikají barevné produkty – primární aminokyseliny poskytují purpurové zbarvení s maximální absorbancí při 570 nm, sekundární (iminokyseliny) žluté zbarvení (Obr. 12) s maximální absorbancí při 440 nm. Ninhydrin, jakožto silné oxidační činidlo, reaguje s α-aminoskupinami za vzniku amoniaku, oxidu uhličitého, aldehydu a redukované formy ninhydrinu, tzv. hydrindantinu. S hydrindantinem a další molekulou ninhydrinu pak reaguje uvolněný
amoniak
za
vzniku
příslušného
zbarvení.
Barevná
reakce
je
spektrofotometricky monitorována při 570 a 440 nm. (Moore & Stein, 1948) O
O
O OH
+
R
OH
CH
COOH
N+
+
R
CHO
+ CO 2
NH2 O
O
O
R uherm anova èerveò
O
O
O OH
O
N
COOH
+ OH
N H
O
O
žlutý chrom ofor
Obr. 12 Reakce ninhydrinu s primárními a sekundárními aminokyselinami.
Výsledky analýzy lze vyjádřit vzhledem k dusíku (například g AA/16g N) nebo v jednotkách hmotnosti vzhledem k danému množství vzorku (mg AA /g vzorku), případně v procentech (%) z celkového množství aminokyselin.
- 42 -
3. Antioxidační kapacita Volné radikály, v pozitivním i negativním smyslu, hrají důležitou úlohu u rostlin i živočichů. Proto se pozornost mnoha vědců obrací právě k těmto molekulám s nepárovými elektrony. Volné radikály vznikají in vivo při oxidačních dějích a také jako vedlejší produkty metabolismu. Vykazují řadu prospěšných fyziologických funkcí. Například imunitní systém je využívá jako jednu z cest zničení patogenů (Mur et al., 2006), také se účastní buněčné signalizace (tzv. redoxní signalizace) (Shao et al., 2008) a protizánětlivých reakcí (Sheng et al., 2010). Na druhou stranu však mohou volné radikály, zejména reaktivní kyslíkové (ROS) a dusíkové (RNS) radikály, způsobit tzv. oxidativní stres. K tomu dochází, pokud dojde k disbalanci mezi tvorbou volných radikálů a systémy zajišťujícími detoxikaci organismu, resp. odstranění reaktivních meziproduktů metabolismu. Přebytečné radikály pak napadají proteiny, nukleové kyseliny a lipidy a způsobují tak změnu jejich struktury, resp. funkcí, což vede k poškození tkání, orgánů
a mnoha funkcí organismu a tím také k různým
onemocněním (Paulová et al., 2004). Z tohoto pohledu jsou pak důležité látky zvané antioxidanty, které brání negativnímu působení volných radikálů. Syntetické antioxidanty jsou často využívány v potravinářství, jelikož jsou účinnější a levnější než přírodní antioxidanty. Pomocí nich je zvyšována uchovatelnost potravin a stabilita lipidů a tím i kvalita potravin (Frankel, 1996). V posledních letech však lidé vyžadují v potravinách přírodní látky, a proto se vědecké výzkumy zaměřují na hledání přírodních látek s vysokou antioxidační kapacitou. Centrem jejich zájmu jsou především karotenoidy, vitamíny C a E (tokoferoly) a polyfenolické sloučeniny, tj. flavonoidy, katechiny a fenolické kyseliny (Isabelle et al., 2010; Wang et al., 2008; Ayaz et al., 2005; Lampart-Szczapa et al., 2003; Tsaliki et al., 1999; Frankel, 1996). Zejména polyfenolické sloučeniny, které byly podrobně popsány výše, s hydroxylovopu skupinou v poloze ortho a para se snadno účastní redoxních reakcí, tj. mají schopnost přenášet protony a elektrony (Lampart-Szczapa et al. 2003). Karotenoidy budou blíže popsány v následující kapitole. Vitamín C nebo-li kyselina L-askorbová (Obr. 13) je ve vodě rozpustný vitamín, který je nezbytný k životu. Vyskytuje se především v syrovém ovoci a zelenině, jeho doporučená denní dávka je 50 – 70 mg (Jelínek et al., 2000). Při nedostatku tohoto vitamínu vzniká onemocnění zvané kurděje nebo-li skorbut, které se projevuje zvýšenou krvácivostí,
chudokrevností,
vypadáváním
zubů či otokem kloubů.
Jako donor elektronů se vitamín C podílí na tvorbě aminokyselin hydroxyprolinu a hydroxylysinu, účastní se metabolismu tyrosinu, syntézy kolagenu (Peterkofsky, 1991), karnitinu (Rebouche, 1991) a neurotransmiterů (norepinefrin) (Harrison & May, 2009). - 43 -
HO
O
O
HO
HO
OH
Obr. 13 Strukturní vzorec kyseliny L-askorbové (vitamínu C).
Jako vitamín E (Obr. 14) jsou souhrnně označovány homology α-, β-, γa δ-tokoferol. Jejich biologická a antioxidační aktivita je odlišná (Kamal-Eldin & Appelquist, 1996). Jedná se o důležitý a v potravinářství nejvíce používaný antioxidant. Vitamín E je rozpustný v tucích a nachází se v obilných klíčcích, mléce, vejcích, másle, semenech rostlin či v mase, přičemž jeho doporučená denní dávka je 5 – 30 mg (Jelínek et al., 2000). Chrání buněčné membrány před peroxidací a také se podílí na jejich stabilitě a propustnosti (Sattler et al., 2004; Jordão et al., 2004). Tento vitamín je donorem vodíkového atomu, který je přenesen z fenolové skupiny tokoferolu na peroxoradikál, díky čemuž nedochází k řetězové reakci radikálů. Mimoto byly prokázány jeho pozitivní účinky u onemocnění jako je rakovina (Kline et al., 2007), srdeční choroby (Munteanu & Zingg, 2007) či neurodegenerativní onemocnění (Ricciarelli et al., 2007). CH3 HO CH3 H3C
CH3
O CH3
CH3 CH3
CH3
Obr. 14 Strukturní vzorec α-tokoferolu (vitamínu E).
Jako zdroj přírodních antioxidantů jsou nejvíce zkoumány semena luštěnin, tedy i semena lupiny bílé (Martínez-Villaluenga et al., 2009; Wang et al., 2008; Lampart-Szczapa et al., 2003; Tsaliki et al., 1999). Zdrojem těchto látek jsou však také jiné části rostlin, například květy. Dále pak zelenina (Sun et al., 2007), ovoce (Vieira et al., 2009), čaj (Roy et al., 2010) či víno (Xanthopoulou et al., 2010). Množství antioxidantů a tudíž i antioxidační kapacita jsou však ovlivněny klíčením a fermentací (Frias et al., 2005; Fernandez-Orozco et al., 2008). - 44 -
3. 1. Karotenoidy Karotenoidy které
se
jsou
vyskytují
v přírodě
v
široce
chloroplastech
a
rozšířené
organické
chromoplastech
pigmenty,
mnoha
různých
fotosyntetizujících organismů. Jedná se o látky lipofilního charakteru patřící do skupiny tetraterpenoidů (C40), jejichž prekurzorem je isopentenyl difosfát (IPP) (Hirschberg, 2001). Podobně jako esenciální mastné kyseliny či aminokyseliny si živočichové neumí karotenoidy syntetizovat de novo a musí je přijímat v potravě (Hirschberg, 2001). Karotenoidy zahrnují dvě třídy látek – karoteny a xantofyly. Barevnost těchto látek je dána řetězcem konjugovaných dvojných vazeb (Meléndez-Mrtínez, 2007a). Karoteny jsou oranžové pigmenty sestávající pouze z uhlíku a vodíku, které jsou důležité pro fotosyntézu, protože přenáší světelnou energii od chlorofylu dále (Young & Frank, 1996). Jsou schopny zhášet singletový kyslík, který vzniká při fotosyntéze, čímž chrání tkáně a DNA před oxidativním stresem (Edge et al., 1997). Mezi karoteny patří α- a β-karoten a lykopen (Obr. 15).
CH 3
CH 3
CH 3
CH 3 CH 3
H 3C CH 3
CH 3
CH 3
CH 3
lykopen
H3C CH 3
CH 3
H3C
CH3
H3C
CH3
CH 3
CH 3
CH3
β -karoten
H3C CH 3
H3C
CH 3
CH3
H3C CH 3
CH3
CH3
CH 3
α -karoten
Obr. 15 Strukturní vzorce vybraných karotenů.
Xantofyly jsou žluté, kyslík obsahující pigmenty vyskytující se především v listech rostlin, kde pomáhají prostřednictvím xantofylového cyklu zachytávat světelnou energii do antenálních komplexů (Young & Frank, 1996). Řadíme k nim lutein, zeaxantin, violaxantin, neoxantin a α- a β- kryptoxantin (Obr. 16).
- 45 -
OH
H3C CH 3
H3C
CH 3
CH3
H3C
HO
lutein
CH3
CH3
CH 3
CH 3
OH
H3C CH 3
CH 3
H3C
CH3
H3C
CH3
CH 3
CH 3
CH3
β -kryptoxantin
OH
H3C CH 3
H3C
CH 3
CH3
H3C
HO
CH3
CH 3
CH 3
CH3
zeaxantin OH
H3C CH 3
H3C
CH 3
O
CH3
O HO
CH3
H3C
CH3
CH 3
CH 3
violaxantin
Obr. 16 Strukturní vzorce vybraných xantofylů.
Karotenoidy obecně absorbují modré světlo, díky čemuž jsou součástí světlosběrných fotosyntetických komplexů (Young
& Frank,
1996).
Vyskytují
se především v ovoci a zelenině. Mají silné antioxidační účinky (Edge et al., 1997). Zhášejí volné radikály (Krinsky & Yeum, 2003) a mají antiproliferativní účinky, čímž přispívají i k prevenci kardiovaskulárních onemocnění či rakoviny (Larsson et al., 2010), chrání pokožku a sítnici (Stahl & Sies, 2005). Některé karotenoidy jsou zároveň provitamín A a mohou být přeměněny na aktivní vitamín A (Stahl & Sies, 2005). Mimo již uvedené vlastnosti mají karotenoidy mnoho dalších funkcí, ovlivňují imunitu, podílí se na gap-junction spojení atd. (Rao & Rao, 2007). Jejich největším zdrojem jsou ovoce a zelenina (O´Connell et al., 2007; Graça Dias et al., 2009). Nejdůležitějšími provitamíny A, zejména v chudých a rozvojových zemích jsou β-karoten a β-kryptoxantin (Wang et al., 2008). Wang a kol. (2008) porovnávají ve své studii obsah karotenoidů ve čtyřech druzích lupiny – Lupinus albus, L. angustifolius, L. mutabilis a L. luteus. U všech druhů identifikovali v semenech lupiny lutein, zeaxantin, α- a β-karoten, lykopen - 46 -
a cis-lykopen. Co se týče kvantifikace, obsah luteinu se u jednotlivých druhů příliš nelišil (v průměru 17 µg/g semen). V případě zeaxatinu je rozsah hodnot široký (16 – 135 µg/g). Nejvíce je zastoupen v L. albus a L. angustifolius, nejméně v L. mutabilis. Obsah β-karotenu byl v rozmezí 12 – 50 µg/g, přičemž nejvíce ho obsahoval druh L. angustifolius a nejméně L. mutabilis. Celkově je tedy nejvíce karotenoidů v druhu L. angustifolius, následovaném druhem L. albus.
3. 1. 1. Analýza karotenoidů 3. 1. 1. 1. Příprava vzorku Pro práci s karotenoidy platí tři základní pravidla: vyhýbat se 1) kyslíku, 2) světlu a 3) teplu. Dvojné vazby chromoforu totiž nezodpovídají jen za barvu, ale i za nestabilitu karotenoidů (Meléndez-Martínez et al., 2007a) Důležitým krokem předcházejícím samotné analýze je extrakce analytu ze
vzorkové
matrice
(Kajadphai
Taungbodhitham
et
al.,
1998).
Vzhledem
k rozpustnosti β-karotenu, který je analyzován nejčastěji, v jednotlivých organických rozpouštědlech (Craft & Soares, 1992) a vzhledem k bezpečnosti práce se pro extrakci karotenoidů z jídla používá: tetrahydrofuran, petroleumether či jeho kombinace s acetonem (1:1), případně isopropanolem (1:3), dichlormethan/methanol (1:1) nebo aceton v různých dalších kombinacích (Kajadphai Taungbodhitham et al., 1998; Meléndez-Martínez et al., 2007b; Wang et al., 2008). Kajadphai Taungbodhitham a kol. (1998) se snažili najít vhodnou kombinaci rozpouštědel, která by měla dobrou návratnost a byla univerzální pro extrakci z různých matricí. Tento úkol se jim podařil s využitím směsi ethanol/hexan (4:3, v/v). Karotenoidy se v přírodě vyskytují volně i vázané v lipidech. Proto se, podobně jako u mastných kyselin, po extrakci provádí většinou ještě saponifikace, která uvolní karotenoidy
z
esterů.
Karotenoidy
nejdříve
převedeme
do
diethyletheru
či petroelumetheru a poté je saponifikujeme. Tento mezikrok je důležitý zejména u xantofylů, které mají různý počet hydroxylových skupin, jež mohou být esterifikovány. K saponifikaci karotenoidů se používá KOH v mehanolu za laboratorní nebo zvýšené teploty. Po ukončení procesu jsou pigmenty opět převedeny do vhodného rozpouštědla, například diethyletheru, hexanu apod. (Oliver & Palou, 2000; Mendélez-Martínez et al., 2007b; Wang, 2008) Jako
interní
standard
slouží
v případě
karotenoidů
β-apo-8´-karotenal,
α- a β-karoten či lykopen aj. (Kajadphai Taungbodhitham et al., 1998; Oliver & Palou, 2000; Wang et al., 2008)
- 47 -
3. 1. 1. 2. HPLC analýza karotenoidů Díky své schopnosti rozlišit i velmi podobné struktury karotenoidů je nejpoužívanější technikou kvalitativní i kvantitativní analýzy karotenoidů HPLC. Výhodou je také rychlá analýza a malá spotřeba analyzovaného vzorku (Kajadphai Taungbodhitham et al., 1998). Separace probíhá na reverzní fázi s použitím kolon C18 nebo C30. Kolony C30, oproti stacionární fázi C18, umožňují lepší separaci karotenoidů s podobnou polaritou a tedy i geometrických isomerů. Příkladem takové stacionární fáze je kolona YMCTM C30 (Wang et al., 2008). Separace karotenoidů pak probíhá na základě gradientové eluce, která zvyšuje separaci. Na druhou stranu izokratická eluce má lepší opakovatelnost retenčního času a není nutné po každém měření provádět re-ekvilibraci kolony. (Meléndez-Martínez et al., 2007b) K detekci karotenoidů se používají spektrofotometrické HPLC detektory. Jedná se o přístroje velice přesné a citlivé, které jsou schopné selektovat danou vlnovou délku, případně mohou její nastavení během analýzy měnit. Pro HPLC separaci sloučenin s charakteristickým absorpčním spektrem, jako jsou karotenoidy, se používá detektor diodového pole (DAD), který je schopen zaznamenávat široký rozsah vlnových délek (190-800 nm). (Oliver & Palou, 2000; Meléndez-Martínez et al., 2007) Vyhodnocení
analýzy
je
stejné
jako
v případě
mastných
kyselin
(viz. kapitola 2. 1. 3. 4. 3.), přičemž výsledky se vyjadřují nejčastěji v hmotnostních jednotkách, například µg karotenoidu/g semen.
3. 2. Metody stanovení antioxidační kapacity přírodních látek Z výše uvedeného tedy vyplývá, že je třeba rozvíjet, vyvíjet a standardizovat metody
pro
stanovení
antioxidační
kapacity
přírodních
bioaktivních
látek,
tj. pro stanovení jejich schopnosti eliminovat volné radikály. V rámci této problematiky se využívají dva různé přístupy – buď stanovujeme reaktivitu izolovaných látek nebo směsí (rostlinné extrakty, potraviny) vůči různým volným radikálům (Paulová et al., 2004). V současné době existuje několik metod pro stanovení antioxidační kapacity, což je dáno skutečností, že nízkomolekulární antioxidanty působí rozmanitými mechanismy. U některých antioxidantů však není mechanismus působení dosud znám. V biologických systémech můžeme nalézt čtyři skupiny antioxidantů: 1) enzymy, například glutathionperoxidasa či katalasa; 2) vysokomolekulární látky, například albumin či feritin; 3) nízkomolekulární látky, například vitamín C, tokoferoly či polyfenoly; 4) hormony, například estrogen či melatonin;
- 48 -
a mnoho různých volných radikálů a oxidantů, například superoxidový anion-radikál O2•-, singletový kyslík
1
O2, hydroxylový radikál HO•, radikál oxidu dusíku NO•,
peroxonitritový anion ONOO-, peroxylový radikál ROO• (Prior et al., 2005). Kromě těchto přírodních radikálů se v rámci metod uplatňují i syntetické stabilní radikály, například DPPH či ABTS•+ (Paulová et al., 2004). Dle reakčního mechanismu můžeme metody pro stanovení antioxidační kapacity (Antioxidant Capacity, AOC) rozdělit do několika skupin (Prior et al., 2005): 1) metody využívající přenosu vodíkového atomu (Hydrogen Atom Transfer, HAT); 2) metody využívající přenos elektronu (Single Electron Transfer, SET); 3) metody využívající mechanismus HAT i SET. Schéma 2 přehledně zobrazuje, které metody řadíme do těchto kategorií. HAT metody měří schopnost antioxidantů zhášet volné radikály na základě darování protonu. SET metody detekují schopnost potenciálních antioxidantů poskytovat elektron na redukci sloučenin, například kovů, karbonylů či radikálů. (Prior et al., 2005) V praxi jsou nejčastěji používanými metodami ORAC, FRAP, TEAC (ABTS) a DPPH, které jsou popsány níže. Dalšími, méně používanými metodami jsou pak TRAP (Total Reactive Antioxidant Potentials) TOSC (Total oxidant Scavenging Capacity), chemiluminiscence (CL), fotochemiluminiscence (PCL), metoda eliminace lipidové peroxidace (bělení β-karotenu, LDL oxidace), CUPRAC (Copper Reduction Assay) a Folin-Ciolacteau metoda (Folin-Ciocalteau Reducing Capacity).
- 49 -
ORAC
TRAP
TOSC
HAT
CL PCL bělení βkarotenu LOO •
LDL
AOC
oxidace
metody FRAP
SET CUPRAC
TEAC (ABTS)
HAT/SET
DPPH
FolinCiocalteau
Schéma 2: Rozdělení metod pro stanovení antioxidační kapacity dle mechanismu reakce.
3. 2.. 1. Metody využívající HAT reakční mechanismus 3. 2.. 1. 1. Metoda ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) U metody ORAC měříme, na základě poklesu fluorescence v čase, schopnost sc antioxidantů inhibovat peroxylové či hydroxylové radikály. Generátorem peroxylových radikálů je zde 2,2´-azobis(2-methylpropionamid) 2,2´ methylpropionamid) dihydrochlorid (AAPH, (AAPH Obr. 17) a generátorem hydroxylových radikálů je systém H2O2 + Cu2+ (Paulová et al., 2004). Radikály reagují s fluorescenční próbou za vzniku nefluorescentního produktu, tj. dochází k oxidaci próby. Dříve se jako próba používal β-fykoerytrin fykoerytrin (B-PE) (B (Cao et al., 1993). Prokázalo se však, že u polyfenolů vykazuje vykazuje falešně nízké hodnoty vlivem nespecifické vazby a omezené fotostability (Ou et al., 2001). V současné době byl nahrazen fluoresceinem, jenž je stabilnější a méně reaktivní reaktiv (Prior et al., 2005). Výsledky měření obdržíme na základě základ integrace ploch pod fluorescenčními křivkami - 50 -
(AUC) a vyjádříme je v ekvivalentech troloxu, například v mikromolech troloxu na gram vzorku.
Trolox
(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-karboxylová
kyselina)
je
při stanovení používán jako standard. Jelikož ROS jsou jedny z nejreaktivnějších radikálů, je tato metoda široce využívána (Paulová et al., 2004).
NH
HCl
CH3
H3C
HCl
N H2 N
NH2 N
CH3
H3C
NH
Obr. 17 Strukturní vzorec 2,2´-azobis(2-methylpropionamid) dihydrochloridu (AAPH).
Výhodou metody je její uplatnitelnost v biologických systémech i v potravinách a lze ji upravit pro hydrofilní i hydrofóbní antioxidanty. Můžeme ji snadno automatizovat a je standardizovaná. Nevýhodou je její teplotní a pH citlivost a dlouhá doba analýzy. (Prior et al., 2005; Zulueta et al., 2009)
3. 2. 2. Metody využívající SET reakční mechanismus 3. 2. 2. 1. Metoda FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) Metoda
FRAP
sleduje
schopnost
Fe3+-2,4,6-tri(2-pyridyl-1,3,5-triazin)
antioxidantů
(Fe3+-TPTZ)
na
redukovat modře
komplex zbarvený
komplex Fe2+-TPTZ (Obr. 18, Magalhães et al., 2008). Při 593 nm pak dochází k
nárůstu
absorbance,
která
odpovídá
množství
Fe2+-TPTZ
komplexu
a tudíž antioxidační kapacitě vzorku (Thaipong et al., 2006).
N
N
N N
N
N
N
N
N
Fe(III) N N
N
N
Fe(II) N
N
N
N
N
N
N
N
N N
N
3+
2+
Fe -TPTZ + redukující antioxidant
Fe -TPTZ (intenzivně modrý)
Obr.18 Reakce metody FRAP (Prior et al., 2005). - 51 -
Nevýhodou této metody je, že sloučeniny s redox potenciálem nižším než je redox potenciál páru Fe3+/Fe3+ mohou falešně zvyšovat výsledky. Také nedochází k detekci látek působících mechanismem HAT, např. polyfenolů. Navíc reakce vyžaduje velmi nízké pH (3,6). (Paulová et al., 2004; Prior et al., 2005; Magalhães et al., 2008)
3. 2. 3. Metody využívající HAT/SET reakční mechanismy 3. 2. 3. 1. Metoda TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) s ABTS•+ U této metody sledujeme schopnost látek zhášet kation-radikál ABTS•+ (diamoniová sůl 2,2´-azinobis(3-ethyl-2,3-dihydrobenzothiazolin-6-sulfonové kyseliny); Obr. 19). Tuto schopnost sledujeme jako změnu absorpčního spektra ABTS•+ při 414, 645, 734 nebo 815 nm (Magalhães et al., 2008). Antioxidanty vystupují jako donory vodíku.
Generátorem
kation-radikálu
je
systém
ABTS/H2O2/peroxidasa
nebo ABTS/methmyoglobin/H2O2 (Paulová et al., 2004). Jelikož výsledky jsou vyjádřeny vzhledem k antiradikálové aktivitě syntetického standardu troloxu, bývá metoda označována také TEAC (Prior et al., 2005). Jedná se o jednoduchou spektrofotometrickou metodu, která může být použita v široké oblasti pH. Touto metodou lze stanovit hydrofilní i lipofilní antioxidační kapacitu. Nevýhodou je, že ABTS není fyziologickým zdrojem radikálů. Některé fenolické sloučeniny s nižším redox potenciálem než má ABTS mohou s ABTS reagovat a zpomalovat tak reakci. (Prior et al., 2005; Magalhães et al., 2008) -
C2H5 N
SO 3
NH4
-
NH4
S
+
N
N
S +
+
O3S
N C2 H5
Obr. 19 Strukturní vzorec diamoniové soli 2,2´-azinobis(3-ethyl-2,3-dihydrobenzothia-
zolin-6-sulfonové kyseliny) (ABTS•+).
- 52 -
3. 2. 3. 2. Metoda s DPPH Tato metoda patří mezi základní metody stanovení AOC. Je založena na měření redukčních schopností antioxidantů vůči DPPH• (2,2-difenyl-1-pikrylhydrazyl či 1,1-difenyl-2-(2,4,6-trinitrofenyl)hydrazyl, Obr. 20) (Prior et al., 2005). Jedná se o stabilní dusíkatý radikál tmavě fialové barvy, který je antioxidantem redukován na bledě žlutý difenylpikrylhydrazin (Magalhães et al., 2008) a který funguje zároveň jako radikálová próba i oxidant (Prior et al., 2005). Během reakce sledujeme nejčastěji pokles absorbance při 515-528 nm po uplynutí dané doby. Reakci však můžeme sledovat i pomocí elektronové spinové rezonance (ESR) nebo HPLC (Paulová et al., 2004). NO 2 . N
O2N
N
NO 2
Obr. 20 Chemický vzorec 2,2-difenyl-1-pikrylhydrazylu (DPPH•).
Antioxidační kapacita je vyjadřována v ekvivalentech kyseliny askorbové nebo v jednotkách troloxu. Výhodou této metody je, že radikál nemusí být před měřením generován a je snadno komerčně dostupný (Magalhães et al., 2008). Je to rychlá a jednoduchá metoda, nenáročná na vybavení, jejíž nevýhodou může být komplikovaná interpretace u některých látek (Prior et al., 2005).
- 53 -
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
- 54 -
4. Materiál Mouka z lupiny bílé (Lupinu albus L., odrůda Amiga) •
sklizeň 2007, 2008 a 2009
•
mouka neupravená (nepražená) – 2007, 2008 a 2009
•
mouka upravená (pražená) – 2008 a 2009
•
skladována za tmy a teploty 20 °C
Veškerý materiál byl poskytnut firmou Alena Půlpánová, Olomouc.
5. Chemikálie Stanovení celkových flavonoidů: •
Methanol p.a., Lach-ner s.r.o., Neratovice, Česká republika
•
Katechin hydrát, Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA
•
Dusitan sodný p.a., Lach-ner s.r.o., Neratovice, Česká republika
•
Hexahydrát chloridu hlinitého, Lach-ner s.r.o., Neratovice, Česká republika
•
Hydroxid sodný p.a., Lach-ner s.r.o., Neratovice, Česká republika
Stanovení celkové antioxidační kapacity metodou ORAC: •
Methanol p.a., Lach-ner s.r.o., Neratovice, Česká republika
•
Fluorescein, sodná sůl, Fluka, Steinheim, Německo
•
Dodekahydrát hydrogenfosforečnanu sodného p.a., Lach-ner s.r.o., Neratovice, Česká republika
•
Monohydrát dihydrogenfosforečnanu sodného p.a., Lachema a.s., Neratovice, Česká republika
•
Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-karboxylová kyselina) 97%, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Německo
•
2,2´-azobis[2-methylpropionamidin] dihydrochlorid (AAPH) 97%,Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Německo
GC-FID analýza obsahu mastných kyselin: •
Hexan p.a., Lachema a.s., Neratovice, Česká republika
•
Hydroxid draselný p.a., Lachema a.s., Neratovice, Česká republika
•
Methanol p.a., Lach-ner s.r.o., Neratovice, Česká republika
•
Methylester kyseliny heptadekanové p.a. (GC), Fluka, Buchs, Švýcarsko
- 55 -
•
Methyloranž (4´-(N,N-dimethylamino)azobenzen-4-sulfonová kyselina), Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA
•
Kyselina sírová 96% p.a., Lach-ner s.r.o., Neratovice, Česká republika
•
Chlorid sodný p.a., Lach-ner s.r.o., Neratovice, Česká republika
•
Methylester kyseliny olejové p.a. (GC), Fluka, Buchs, Švýcarsko
•
Methylester kyseliny linoleové p.a. (GC), Fluka, Buchs, Švýcarsko
HPLC stanovení karotenoidů: •
Dichlormethan p.a., Lachema a.s., Neratovice, Česká republika
•
Methanol p.a., Lach-ner s.r.o., Neratovice, Česká republika
•
β-karoten, typ I (UV), Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Německo
•
Cyklohexan p.a., Lach-ner s.r.o., Neratovice, Česká republika
•
Ethylester kyseliny octové p.a., Lachema a.s., Neratovice, Česká republika
•
Methanol (gradient grade for LC), Merck KGaA, Darmstadt, Německo
UPLC-MS analýza flavonoidů: •
Methanol p.a., Lach-ner s.r.o., Neratovice, Česká republika
•
Kyselina mravenčí p.a., Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Německo
•
Acetonitril (gradient grade for LC), Merck KGaA, Darmstadt, Německo
Analýza aminokyselin: •
Kyselina chlorovodíková 35% p.a., Lach-ner s.r.o., Neratovice, Česká republika
•
Citrát lítný, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Německo
•
Dihydrát kyseliny sulfosalicylové, p.a., Lach-ner s.r.o., Neratovice, Česká republika
•
Standardní roztoky aminokyselin Amino acid physiological, Lachema a.s., Neratovice, Česká republika
•
Ninhydrin, Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA
- 56 -
6. Přístrojové vybavení a materiál Předvážky KERN 440-21N, Kern & Sohn GmbH, Balingen, Německo Předvážky KERN 440-33, Kern & Sohn GmbH, Balingen, Německo Analytické váhy GR 200-EC, A & D Instruments Ltd, Abingdon, Velká Británie pH metr inoLab Level 1, WTW GmbH & Co. KG, Weilheim, Německo Elektroda Polyplast Pro, Hamilton Company, Reno, NV, USA Magnetická míchačka Big Squid STAR, IKA Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Německo Magnetická míchačka s ohřevem MST basic C s elektronickým kontaktním teploměrem IKATRON TC 1, IKA Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Německo Centrifuga Eppendorf 5415 R, Eppendorf AG, Hamburg, Německo Centrifuga IEC CL 31R Multispeed, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA Centrifuga Rotanta 460R, Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Německo Třepačka VXR basic Vibrax, IKA Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Německo Třepačka KS 130 basic, IKA Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Německo Minitřepačka MS 3 basic, IKA Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Německo Membránová vakuová pumpa D-Lab, Edwards, Crawley, Velká Británie Jednoplotýnkový vařič ETA 2109, ETA, Hlinsko, Česká republika Topné hnízdo LTH 250, Drutěva, Brno, Česká republika Termoblok BBD Grant-Boekel, Grant Instruments Ltd, Cambridge, Velká Británie Inkubátor INCUBAT 85, MELAG oHG Medizintechnik, Berlín, Německo Chlazený laboratorní termostat Q-cell 60/40, POLL LAB Sp. z o.o., Bielsko-Biala, Polsko Spektrofotometr Biochrom WPA Lightwave II UV/VIS, Biochrom Ltd, Cambridge, Velká Británie Spektrofotometr Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader, Bio Tek, Winooski, VT, USA Analyzátor aminokyselin AAA 400, INGOS s.r.o., Praha, Česká republika Plynový chromatograf Finnigan TRACE GC Ultra, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA HPLC System Gold 125 NM Solvent Modul s detektorem System Gold 168 NM Detector, Beckman Coulter Inc., Brea, CA, USA ACQUITY Ultra Performance LC System s detektorem PDA 2996, Waters, Milford, MA, USA a Micromass Quattro micro API benchtop hmotnostním spektrometrem, Waters MS Technologies, Manchaster, Velká Británie
- 57 -
Mikrocentrifugační filtry Costar Spin-X HPLC, Corning Incorporated, New York, NY, USA Pipety Eppendorf Research v rozsahu 0,5 – 5000 µl, Eppendorf AG, Hamburg, Německo Extrakční patrony 25 x 60 mm, Whatman International Ltd., Maidstone, Velká Británie
7. Použité metody 7. 1. Stanovení obsahu celkových flavonoidů (TF) v lupinové mouce Obsah celkových flavonoidů v lupinové mouce byl stanoven pomocí upravené kolorimetrické metody dle Marínez-Villaluenga a kol. (2009).
7. 1. 1. Příprava 80% methanolických extraktů Pro přípravu extraktů byla použita mouka 2008 upravená i neupravená a mouka 2009 upravená i neupravená. 1 g lupinové mouky byl extrahován 10 ml 80% vodného roztoku methanolu za stálého třepaní při 37 °C po dobu 2 hodin. Směs byla centrifugována při 12 000 g při 25 °C po dobu 10 minut. Supernatant byl přepipetován do centrifugačních zkumavek a ještě jednou centrifugován za stejných podmínek. Supernatant byl odpipetován a použit pro stanovení obsahu celkových flavonoidů. Pro každé stanovení byl připraven čerstvý extrakt.
7. 1. 2. Stanovení obsahu celkových flavonoidů 150, resp. 250 µl 80% methanolického extraktu bylo zředěno deionizovanou vodou na výsledný objem 1500 µl. K roztoku bylo přidáno 75 µl 5% NaNO2. Směs byla zvortexována a inkubována za laboratorní teploty. Po 6-ti minutách bylo do směsi přidáno 150 µl 10% AlCl3.6H2O. Směs byla zvortexována a inkubována za laboratorní teploty 5 minut. Nakonec bylo přidáno 500 µl 1 mol.l-1 NaOH a ihned po zvortexování směsi byla měřena absorbance při 510 nm proti blanku (deionizovaná voda). Celkový obsah flavonoidů byl vypočten metodou kalibrační přímky v porovnání se standardy o známé koncentraci katechinu. Příprava standardů je uvedena v tabulce 9. Kalibrační řada byla připravena ředěním zásobního 0,01% roztoku katechinu. Celkem byla provedena čtyři stanovení, každé v duplikátu. Výsledky byly vyjádřeny v ekvivalentech katechinu na gram mouky, tj. v µg katechinu/g mouky.
- 58 -
Tab. 9 Příprava standardů pro stanovení obsahu celkových flavonoidů. 0,01% katechin
H2O
5% NaNO2
10% AlCl3.6H2O
1 mol.l-1 NaOH
(µl)
(µl)
(µl)
(µl)
(µl)
20
1480
75
150
500
90
1410
75
150
500
160
1340
75
150
500
230
1270
75
150
500
300
1200
75
150
500
370
1130
75
150
500
7. 2. Stanovení celkové antioxidační kapacity lupinové mouky 7. 2. 1. Příprava 80% methanolických extraktů Pro přípravu extraktů byla použita mouka 2007 neupravená, mouka 2008 upravená i neupravená a mouka 2009 upravená i neupravená. 0,5 g mouky bylo extrahováno 3 ml 80% methanolu 2 hodiny, při 37 °C, za stálého třepání. Methanolický extrakt byl zcentrifugován při 16100 g, 10 minut, při 25 °C. Supernatant byl opět zcentrifugován při 16100 g, 10 minut, při 25 °C. Vzniklý supernatant byl následně použit pro stanovení AOC lupinové mouky.
7. 2. 2. Ověření lineární závislosti fluorescence na koncentraci fluoresceinu Pro stanovení celkové antioxidační kapacity metodou ORAC byla zvolena koncentrace fluoresceinu 500 nmol.l-1. Pro ověření linearity fluoresceinu v oblasti této koncentrace byl připraven roztok fluoresceinu o koncentraci 100, 300, 500, 700 a 900 nmol.l-1. Měření bylo provedeno v triplikátu.
7. 2. 3. Stanovení optimální koncentrace AAPH Ke 150 µl 500 nmol.l-1 fluoresceinu bylo přidáno 25 µl K-fosfátového pufru pH 7,4 (blank) nebo 25 µl troloxu o koncentraci 250 µmol.l-1. Mikrotitrační destička byla vložena do spektrofotometru Reader a inkubována 30 minut při 37 °C. Zároveň bylo po dobu 30 minut, při téže teplotě, inkubováno 5 x 2 ml K-fosfátový pufr pH 7,4. Po uplynutí této doby bylo do jednotlivých zkumavek s K-fosfátovým pufrem přidáno takové množství AAPH, aby jeho výsledná koncentrace byla 50, 125, 250, 300 a 400 mmol.l-1. Mikrotitrační destička byla vyndána z Readeru a co nejrychleji bylo do jamek - 59 -
napipetováno 50 µl jednotlivých roztoků AAPH, tj. vždy jedna koncentrace AAPH na triplikát blank a trolox 250 µmol.l-1. Poté byla destička rychle vložena do Readeru a třepána 30 sekund. Fluorescence byla měřena při excitační vlnové délce 485 nm a emisní vlnové délce 510 nm. Bylo měřeno 20 cyklů, přičemž délka jednoho cyklu byla 3 minuty. Měření bylo provedeno v triplikátu.
7. 2. 4. Stanovení optimálního ředění vzorku a optimální délky extrakce Ke 150 µl 500 nmol.l-1 fluoresceinu bylo přidáno 25 µl K-fosfátového pufru pH 7,4 (blank) nebo 25 µl vzorku ředěného 10x, 50x, 100x, 150x, 200x, 250x a 300x. Jako zdroj radikálů bylo přidáno AAPH o koncentraci 500 mmol.l-1. Vzorek byl připraven dvojím způsobem – extrakce probíhala výše uvedeným způsobem, ale různě dlouhou dobu – 1 nebo 2 hodiny.
7. 2. 5. Stanovení celkové antioxidační kapacity metodou ORAC v mikrodestičkovém uspořádání Ke 150 µl 500 nmol.l-1 fluoresceinu bylo přidáno 25 µl K-fosfátového pufru pH 7,4 (blank) nebo 25 µl standardu troloxu o koncentraci 12,5; 25; 50; 100 a 250 µmol.l-1 nebo 25 µl 200 x zředěného vzorku. Mikrotitrační destička byla
vložena
do spektrofotometru Reader a inkubována 30 minut při 37 °C. Zároveň bylo po dobu 30 minut, při téže teplotě, inkubováno 5 ml K-fosfátového pufru pH 7,4. Po uplynutí této doby bylo do zkumavky s K-fosfátovým pufrem přidáno takové množství AAPH, aby jeho výsledná koncentrace byla 250 mmol.l-1. Mikrotitrační destička byla vyndána z Readeru a co nejrychleji bylo do jamek napipetováno 50 µl roztoku AAPH. Poté byla destička rychle vložena do Readeru a třepána 30 sekund. Fluorescence byla měřena při excitační vlnové délce 485 nm a emisní vlnové délce 510 nm. Bylo měřeno 20 cyklů, přičemž délka jednoho cyklu byla 3 minuty. Měření bylo provedeno v triplikátu.
7. 3. Stanovení obsahu aminokyselin v lupinové mouce 7. 3. 1. Příprava vzorků Pro přípravu vzorků byla použita mouka 2008 upravená a neupravená a 2009 upravená i neupravená. 5 mg mouky bylo hydrolyzováno 3 ml 6 mol.l-1 HCl 24 hodin v tlakové nádobě na olejové lázni teploty 110 °C pod dusíkem. Hydrolyzáty byly odpařeny pod dusíkem na vodní lázni o teplotě 50 °C. Odparek byl rozpuštěn v 600 µl ředícího pufru (0,1 mol.l-1 citrát lítný, pH 2,2), směs byla třepána 1 minutu a následně - 60 -
5 minut ultrazvukována. Ke směsi bylo přidáno 60 µl 20% kyseliny sulfosalicylové. Směs byla opět 1 minutu třepána a 10 minut ultrazvukována. Nakonec byla směs centrifugována 3 minuty při 10000 rpm. Takto připravený vzorek byl analyzován.
7. 3. 2. Analýza obsahu aminokyselin s použitím střednětlaké kapalinové ionexové chromtografie Ke 20 µl vzorku bylo přidáno 20 µl interního standardu a 200 µl ředícího pufru. Aminokyseliny byly separovány na základě změny pH gradientu, který byl vytvořen pomoci pufru citrátu lítného o pH 1,9; 3,1; 3,35; 4,05 a 4,65. Pro analýzu byla použita náplňová ionexová kolona. Průtok pufru byl 0,4 ml/min při teplotě kolony 50 – 70 °C (dle programu). Průtok ninhydrinu byl 0,25 ml/min při teplotě reaktoru 121 °C. Reakce aminokyselin s ninhydrinem byla detekována spektrofotometricky při vlnových délkách 440 a 570 nm. Výsledky byly vyjádřeny v mg aminokyseliny na gram mouky (mg AA/g).
7. 4. Stanovení obsahu mastných kyselin v lupinové mouce
7. 4. 1. Příprava vzorků
7. 4. 1. 1. Odtučnění lupinové mouky Pro přípravu extraktů byla použita mouka 2007 neupravená, mouka 2008 upravená i neupravená a mouka 2009 upravená i neupravená. Do extrakční patrony byl navážen 1 g mouky. Patrona byla vložena do Soxhletovy aparatury, kde byla mouka extrahována 150 ml hexanu po dobu 2 hodin. Po ukončení byl extrakt zchlazen na laboratorní teplotu a následně odpařen na vakuové rotační odparce. Odparky byly uskladněny v lednici při 4 °C.
7. 4. 1. 2. Saponifikace a příprava FAME Z připraveného hexanového odparku bylo odebráno 500 µl do varné baňky. K extraktu bylo přidáno 10 ml 0,5 mmol.l-1 KOH v methanolu a 1 ml vnitřního standardu. IS byl připraven rozpuštěním 20 mg methylesteru kyseliny heptadekanové v 1 ml hexanu. Reakční směs byla zmýdelňována pod zpětným chladičem 45 minut na vroucí vodní lázni. Po ochlazení byly k reakční směsi přidány 2 kapky methyloranže a následně opatrně přikapávána koncentrovaná kyselina sírová až do zřetelně kyselé reakce (trvale červené zbarvení). Navíc byly přidány 2 kapky kyseliny. Pak byla směs opět povařena pod zpětným chladičem 45 minut. Po uplynutí této doby bylo ke směsi, přes chladič, přidáno 50 ml destilované vody. Po ochlazení byl obsah baňky převeden - 61 -
do dělící nálevky. FAME byly extrahovány 3 x 10 ml hexanu. Pro lepší rozdělení vrstev byly do nálevky přidány cca 3 ml nasyceného roztoku NaCl. Spojené hexanové extrakty byly promyty 3 x 20 ml destilované vody. Nakonec byly extrakty odpařeny pod dusíkem na vodní lázni o teplotě 47 °C. Odparky byly uskladněny v lednici při 4 °C.
7. 4. 2. GC-FID analýza FAME FAME byly analyzovány na plynovém chgromatografu s FID detektorem. Pro analýzu byla použita kolona ZEBRON ZB-WAX 30 m x 0,32 mm x 0,50 µm (Phenomenex, Torrance, CA, USA). Vzorek byl nastřikován ručně. Objem nástřiku byl 1 µl a teplota injektoru byla 240 °C. Jako nosný plyn bylo použito helium, pomocnými plyny byl dusík a kyslík. Průtok helia byl 2 ml/min. Teplotní program byl nastaven následovně: počáteční teplota 100 °C (6 min), rampa 10 °C/min, konečná teplota 240 °C (6 min). Teplota FID detektoru byla 260 °C. Píky byly identifikovány na základě srovnání s retenčními časy standardů (methylester kyseliny olejové a methylester kyseliny linolové). Zásobní roztoky standardů o koncetraci 1 µl/ml byly připraveny jejich rozpuštěním v hexanu. Pro potřeby kalibrace byly zásobní roztoky ředěny. Koncentrace mastných kyselin byla vypočítána metodou kalibrační přímky a upravena vzhledem k návratnosti IS. Výsledky byly vyjádřeny v mg mastné kyseliny na gram mouky (mg FA/g). Každá analýza byla provedena v duplikátu.
7. 5. Stanovení karotenoidů v lupinové mouce
7. 5. 1. Příprava vzorků a standardu Se vzorky i standardy je nutno pracovat ve tmě a za laboratorní teploty! Pro přípravu extraktů byla použita mouka 2007 neupravená, mouka 2008 upravená i neupravená a mouka 2009 upravená i neupravená. 5 g mouky bylo extrahováno 100 ml směsi dichlormethan:methanol (1:1) 1 hodinu za střídavého třepání (12 minut) a ultrazvukování (3 minuty). Extrakt byl ponechán několik minut sedimentovat. Vrchní část byla přelita do centrifugačních kyvet a centrifugována 10 minut při 5000 g a 25 °C. Vzniklý supernatant byl zfiltrován přes filtrační papír, čímž byl získán filtrát 1. Zbylá spodní část po sedimentaci byla zfiltrována přes filtrační papír, čímž byl získán filtrát 2. Spojené filtráty byly odpařeny pod dusíkem na vodní lázni o teplotě 35 °C. Odparky byly uskladněny v mrazáku při -20 °C. Po rozmražení byla odparky rozpuštěny v 1,5 ml směsi dichlormethan:methanol (1:1) za střídavého vortexování (1 minutu) a ultrazvukování (5 minut). Po rozpuštění
- 62 -
byla směs zfiltrována přes mikrospin. Takto připravené vzorky byly uskladněny v mrazáku při -20 °C. Rozpuštěním 1 mg β-karotenu v 1 ml cyklohexanu byl připraven zásobní roztok standardu. Po zvortexování byl standard uložen do lednice (4 °C). Pro kalibraci byly roztoky β-karotenu připraveny ředěním zásobního roztoku mobilní fází 150, 200 a 300x.
7. 5. 2. Příprava a optimalizace mobilní fáze Pro zajištění optimální separace karotenoidů bylo nutné optimalizovat složení mobilní fáze. K analýze byl použit zásobní roztok standardu β-karotenu. Jako první byla použita mobilní fáze methanol/ethylaceát 34:16 (v/v). Na základě získané odezvy pak byly testovány ještě mobilní fáze ve složení methanol/ethylaceát 80:20 (v/v) a 90:10 (v/v). Z výsledků analýzy vyplynulo, že nejvhodnější je mobilní fáze ve složení methanol/ethylaceát 90:10 (v/v). Mobilní fáze tedy byla připravena smícháním těchto sloučenin v daném poměru. Vzniklá směs byla zfiltrována pomocí vakuové pumpy a 10 minut ultrazvukována. Takto připravená mobilní fáze byla použita pro HPLC analýzu.
7. 5. 3. HPLC analýza karotenoidů se zaměřením na β-karotenu Chromatografická separace karotenoidů byla provedena pomocí HPLC s DAD detektorem, přičemž byla snímána vlnová délka v rozsahu 200 až 600 nm. Separace probíhala izokraticky v systému reverzních fází, za použití kolony GraceSmart RP 18, 5µm, 250 mm x 4,6 mm (W. R. Grace & Co., Deerfield, IL, USA). Jako mobilní fáze byla použita směs methanol/ethylacetát (90:10, v/v) s průtokem 0,8 ml/min. Identifikace β-karotenu ve vzorku byla provedena na základě porovnání s retenčním časem a UV profilem standardu β-karotenu.
7. 6. Analýza flavonoidů v lupinové mouce
7. 6. 1. Příprava vzorků Pro přípravu extraktů byla použita mouka 2007 neupravená, mouka 2008 upravená i neupravená a mouka 2009 upravená i neupravená. Vzorky byly připraveny dle modifikovaného postupu D´Agostina a kol. (2008). 1 g mouky byl extrahován 5 ml 50% methanolu. Po přidání methanolu byl vzorek 15 minut ultrazvukován a následně extrahován 2 hodiny za laboratorní teploty a stálého třepání. Poté byl extrakt - 63 -
zcentrifugován při 4700 g, 10 minut, při 25 °C. Ze supernatantu byl odebrán alikvot 2 x 600 µl. Alikvoty extraktu byly zfiltrovány přes mikrospin. Takto připravené extrakty byly uchovány v mrazáku při -20 °C.
7. 6. 2. UPLC-MS/MS analýza flavonoidů Parametry pro analýzu systémem UPLC-MS/MS byly převzaty z literatury. Separace látek byla provedena v systému reverzní fáze gradientovou elucí. Kolona BEH C8, 1,7 µm, 2,1 x 150 mm (Waters, Milford, MA, USA) byla termostatována na 30 °C. Jako mobilní fáze byla použita 7,5 mmol.l-1 kyselina mravenčí (roztok A) a acetonitril (roztok B) s průtokem 250 µl.min-1. Program gradientu mobilní fáze byl následující: 0 – 10 minut gradientová eluce 30 – 100 % B; 10 – 15 min izokraticky 100 % B; ekvilibrace výchozích podmínek do 20 min. Systém UPLC byl vybaven DAD detektorem s rozsahem 210 – 600 nm a rozlišením 1,2 nm a hmotnostním spektrometrem s trojitým kvadrupolem. Ionizace vzorků byla provedena pomocí elektrospreje v pozitivním módu (ESI+). Teplota odpařovacího bloku byla 100 °C, desolvatační teplota byla 350 °C. Napětí vložené na kapiláru bylo 2,5 kV a cone voltage (napětí na vstupní štěrbině) bylo nastaveno na 25 V. Jako kolizní plyn byl
použit argon (16 eV) a jako desolvatační plyn dusík s průtokem 500 l/hod. Kolizní spektra byla získána v modu daughter ion sean. Data byla zpracována pomocí software MassLynx v. 4.0.
8. Výsledky a diskuze
8. 1. Stanovení obsahu celkových flavonoidů Zjištění celkového obsahu flavonoidů v jídle, je důležitým parametrem. O mnohých flavonoidech je totiž známo, že na lidský organismus mají příznivé účinky (Havsteen, 2002; Lotito & Frei, 2006). Částečně nám také mohou napovědět, jaká je antioxidační kapacita dané potraviny, protože se na ní jako antioxidanty podílejí (Saija et al., 1995). Tabulka 10 ukazuje výsledky stanovení celkových flavonoidů v lupinové mouce. Z
nich
vyplývá,
že
obsah
flavonoidů
v pražených
moukách
je
2x
vyšší
než u nepražených mouk. Vlivem pražení mohlo dojít k uvolnění vázaných polyfenolických sloučenin, což vedlo k nárůstu hodnot obsahu flavonoidů.
- 64 -
Tab. 10 Obsah celkových flavonoidů v lupinové mouce. Mouka 2008
Mouka 2009
(µg katechinu/g mouky)
(µg katechinu/g mouky)
upravená
neupravená
upravená
neupravená
682,29 ± 97,49
353,58 ± 135,74
918,18 ± 105,42
415,82 ± 103,92
980,02 ± 44,48
558,33 ± 206,34
906,19 ± 105,16
671,28 ± 294,13
704,82 ± 80,30
495,65 ± 221,27
918,21 ± 145,78
644,62 ± 180,00
780,10 ± 55,13
683,13 ± 155,12
919,48 ± 54,47
582,01 ± 67,67
786,81 ± 117,28
522,67 ± 118,68
915,52 ± 5,41
578,43 ± 99,32
Celkově výsledky řádově odpovídají hodnotě 1000 µg katechinu/g naměřené Martínez-Villaluenga a kol. (2009) v lupinové mouce z odrůdy Multolupa. Hodnoty se však liší, což je pravděpodobně důsledek skutečnosti, že chemické složení semen lupiny se liší v závislosti na odrůdě a klimatických podmínkách. Neočekávaný nárůst obsahu celkových flavonoidů po pražení je dále možné vysvětlit vznikem sloučenin, které interferují s použitou spektrofotometrickou metodou. Použitá metoda měření je založena na tvorbě chelátů polyfenolů s kovem. Tato metoda je pouze orientační, vyznačující se nedostatečnou selektivitou.
8. 2. Stanovení celkové antioxidační kapacity lupinové mouky 8. 2. 1. Ověření lineární závislosti fluorescence na koncentraci fluoresceinu Pro ověření linearity fluoresceinu v oblasti koncentrace 500 nmol.l-1 byly využity roztok fluoresceinu o koncentraci 100, 300, 500, 700 a 900 nmol.l-1. Jak ukazuje graf 1, ve zvoleném rozsahu koncentrací fluoresceinu je odezva lineární. Koncentrace 500 nmol.l-1 je tedy vhodná.
- 65 -
y = 24.5527x + 69.8000 R² = 0.9958
fluorescence
25000 20000 15000 10000 5000 0 0
200
400
600
800
1000
c (nmol/l)
Graf 1 Ověření linearity fluoresceinu.
8. 2. 2. Stanovení optimální koncentrace AAPH Nalezení optimální koncentrace AAPH (zdroje radikálů) je důležité proto, aby analýza probíhala přiměřenou dobu. Pro analýzu byly použity koncentrace AAPH v rozsahu AAPH 50 – 400 mmol.l-1 a nejvyšší koncentrace troloxu 250 µmol.l-1. Tato koncentrace standardu je pro zjištění potřebné koncentrace AAPH nejvhodnější, protože při ní dochází k nejrychlejšímu vychytávání radikálů a tedy nejpomalejšímu poklesu fluorescence. Z grafu 2 vyplývá, že koncentrace AAPH 300 a 400 mmol.l-1 jsou nevhodné, protože by analýza trvala příliš dlouho. Koncetrace 50 a 125 mmol.l-1 jsou naopak příliš nízké, radikály jsou tedy příliš brzy eliminovány. Nejvhodnější koncentrací AAPH pro potřebu analýzy lupinové mouky je tedy koncentrace 250 mmol.l-1, která stačí generovat potřebné množství peroxylových radikálů a zároveň zbytečně neprodlužuje dobu analýzy.
- 66 -
fluorescence normalizovaná na počáteční intenzitu
1.2000 1.0000 0.8000
blank AAPH 50 mM
0.6000
AAPH 125 mM AAPH 250 mM
0.4000
AAPH 300 mM 0.2000
AAPH 400 mM
0.0000 0
9
18
27
36
45
54
čas (min)
Graf 2 Stanovení optimální koncentrace AAPH při použití 250 µmol.l-1 standardu
troloxu.
8. 2. 3. Stanovení optimálního ředění vzorku a optimální délky extrakce Pro optimalizaci parametrů analýzy je důležité stanovit vhodné ředění vzorku. Pro tento účel byl vzorek, připravený 1 i 2 hodinovou extrakcí, ředěn 10x, 50x, 100x, 150x, 200x, 250x a 300x. Koncentrace AAPH 500 mmol.l-1, byla zvolena schválně vysoká, aby analýza proběhla co nejrychleji. Výsledky analýzy (graf 3 a 4) ukazují, že při dvouhodinové extrakci klesá fluorescence pomaleji než při hodinové extrakci. Za dvě hodiny se tedy extrahovalo více látek s antioxidačními schopnostmi, proto byla tato délka extrakce zvolena pro přípravu vzorku. Co se týče vhodného ředění extraktu, nejideálnějšího
výsledku
bylo
dosaženo
u kterého fluorescence klesá přiměřeně rychle.
- 67 -
u
200x
zředěného
vzorku,
fluorescence normaizovaná na počáteční hodnotu
1.2000 1.0000
blank
0.8000
ředěno 10x ředěno 50x
0.6000
ředěno 100x 0.4000
ředěno 150x ředěno 200x
0.2000
ředěno 250x 0.0000 0
3
6
9 12 15 18 21 24 27 30 33
ředěno 300x
čas (min)
Graf 3 Stanovení optimálního ředění vzorku – mouka extrahovaná 1 hodinu.
fluorescence normalizovaná na počáteční hodnotu
1.2000 1.0000
blank
0.8000
ředěno 10x ředěno 50x
0.6000
ředěno 100x 0.4000
ředěno 150x ředěno 200x
0.2000
ředěno 250x 0.0000 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33
ředěno 300x
čas (min)
Graf 4 Stanovení optimálního ředění vzorku – mouka extrahovaná 2 hodiny.
8. 2. 4. Stanovení celkové antioxidační kapacity lupinové mouky metodou ORAC Antioxidanty jsou pro lidský organismus velice důležité, protože chrání tkáně před oxidativním poškozením. Díky tomu fungují jako prevence mnohých onemocnění. Největším přirozeným zdrojem antioxidantů jsou rostliny, resp. jejich semena. Stanovení AOC u semen rostlin je proto důležitým parametrem.
- 68 -
Metoda ORAC je jednou z nejpoužívanějších metod pro stanovení antioxidační kapacity (Paulová et al., 2004). Ve většině studií je vztažena vzhledem ke standardu troloxu (Obr. 21). CH3 HO
O OH
H3C
O
CH3
CH3 Obr. 21 Strukturní vzorec troloxu (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-karboxy-
lové kyseliny). Antioxidační kapacita lupinové mouky změřená pomoci metody ORAC byla v rozsahu 0,10 – 0,39 µmol troloxu/g (Tabulka 11). U pražené mouky 2009 je antioxidační kapacita o třetinu nižší než u nepražené mouky 2009. Obdobně u mouky 2008 dochází k poklesu antioxidační kapacity, ale jen o pětinu oproti mouce nepražené.
Rozdílný
pokles
hodnot
AOC
je
pravděpodobně
zapříčiněn
nereprodukovatelným procesem pražení. Rozdíl mezi praženými moukami 2008 a 2009 je dán použitím rozdílného pražícího stroje a tudíž i použitím odlišných teplotních křivek. Antioxidační kapacita je dána obsahem látek schopných vychytávat volné radikály (karotenoidy, fenolické kyseliny, flavonoidy, vitamín C a E). Proces pražení napomáhá degradaci těchto látek a zapřičiňuje tak pokles antioxidační kapacity. Tab. 11 Antioxidační kapacita lupinové mouky. Mouka
AOC (µmol troloxu/g)
2007 neupravená
0,39 ± 0,04
2008 upravená
0,26 ± 0,03
2008 neupravená
0,33 ± 0,03
2009 upravená
0,10 ± 0,02
2009 neupravená
0,36 ± 0,04
Relativně vysoká AOC lupinové mouky je jednou z mnoha pozitivních charakteristik v porovnání s pšeničnou moukou. Pečivo, jehož mouka byla obohacena lupinou, zůstává delší dobu čerstvé, nekazí se. Přestože pražení zlepšuje senzorické vlastnosti
- 69 -
lupinové mouky, její schopnost bránit oxidačním procesům při stárnutí pečiva se procesem pražení výrazně snižuje.
8. 3. Aminokyselinové složení lupinové mouky Jak již bylo zmíněno, esenciální aminokyseliny musíme přijímat v potravě, neboť si je neumíme syntetizovat. Potřeba jednotlivých aminokyselin se však liší v závislosti na věku. Děti potřebují, kvůli růstu, více proteinů bohatých na arginin a histidin, dospělí zase na lysin, methionin a tryptofan (FAO/WHO/UNU, 2002). Právě složení a množství proteinů určuje jeho nutriční kvalitu (Rama Rao et al., 1959). Důležitá je také přítomnost sirných aminokyselin, zejména methioninu, který je důležitý pro syntézu cysteinu, a také phenylalninu, který je potřebný pro syntézu tyrosinu. Obsah jednotlivých aminokyselin nalezených v lupinové mouce je uveden v grafu 5. Pro porovnání je v grafu uveden i obsah AA v semenech lupiny, naměřený Sujak a kol. (2006).
30
semena (Sujak et al., 2006) mouka 2009 upravená
25
mouka 2009 neupravená mouka 2008 upravená
20 Obsah AA (%)
mouka 2008 neupravená
15
10
5
0 Asp Thr Ser Gln Pro Gly Ala
Val Cys Met Ile
Leu Tyr Phe Lys
His Arg
Graf 5 Aminokyselinové složení lupinové mouky.
Analýza prokázala, že ve shodě s literaturou je zachován základní vzorec aminokyselinového složení – lupinová mouka obsahuje velké množství glutaminu (16,0 – 21 %) argininu (11,4 – 14,3 %) a aspartátu (9,9 – 11,3 %) a naopak velmi malé množství methioninu (0,2 – 0,5 %) a cysteinu (0,2 – 0,3 %) (Chango et al., 1995; Sujak et al., 2006). Oproti výsledkům Sujak a kol. (2006) však analýza prokázala o třetinu - 70 -
vyšší obsah glycinu a alaninu a naopak o pětinu menší obsah leucinu, o čtvrtinu menší obsah glutaminu, o třetinu menší obsah histidinu, o polovinu menší obsah methioninu a obsah cysteinu byl dokonce 7x nižší. Tyto rozdíly mohou být způsobeny tím, že Sujak a
kol.
analyzovali
jiné
odrůdy
lupiny
bílé
a
používali
čerstvá
semena.
Nejpravděpodobněji jsou však způsobeny skutečností, že sirné aminokyseliny byly stanovovány odlišně s využitím oxidativní hydrolýzy kyselinou peroxomravenčí. V mém případě tato hydrolýza provedena nebyla, v důsledku čehož došlo k větší degradaci sirných aminokyselin. Proto nebyl cystein u pražené mouky 2009 detekován vůbec, v případě ostatních vzorků byl jeho obsah velmi nízký. Působením kyselé hydrolýzy také může docházet k degradaci serinu, threoninu či tryptofanu, což se v případě této analýzy nestalo, protože hydrolýza probíhala v atmosféře dusíku. Ve všech moukách byl nejvíce zastoupenou aminokyselinou glutamin (16 - 19,7 %). V mouce 2009 nebyl detekován prolin. Navíc v pražené mouce 2009 nebyl detekován ani cystein. Obsah esenciálních aminokyselin a poměr leucin/isoleucin a leucin/lysin uvádí tabulka 12. Ideální poměr Leu/Ile by měl být kolem 2 a poměr Leu/Lys kolem 1,3 (FAO/WHO/UNU, 2002). Analýza tedy prokázala, že lupinová mouka obsahuje přiměřené množství leucinu, které nesnižuje adekvátní spotřebu isoleucinu a lysinu. Tab. 12 Obsah esenciálních aminokyselin a nutriční hodnota leucinu v lupinové mouce. Mouka 2008
Mouka 2009
upravená
neupravená
upravená
neupravená
EAA (%)
44,09
42,94
44,19
43,70
Leu/Ile
1,62
1,61
1,72
1,73
Leu/Lys
1,43
1,33
1,31
1,42
8. 4. Analýza mastných kyselin 8. 4. 1. Optimalizace GC metody pro stanovení FAME Aby byla analýza co nejkratší, separace co nejlepší a píky co nejostřejší, bylo nutné GC-FID metodu pro stanovení mastných kyselin optimalizovat. Analýza byla prováděna na standardech. Postupnou úpravou teplotního programu a průtoku helia bylo dosaženo požadovaných parametrů analýzy. Postup optimalizace, resp. přehled metod uvádí tabulka 13. Požadovaných parametrů analýzy bylo nejlépe dosaženo s použitím metody FAME8. Pomocí této metody tedy byly analyzovány i reálné vzorky. - 71 -
Tab. 13 Optimalizace GC pro stanovení FAME. Metoda
Parametry
FAME 1
Teplotní rampa • Počáteční teplota: 80 °C (6 min) • Rampa: 10 °C/min • Konečná teplota: 240 °C (5 min) Délka analýzy •
27 minut
• •
Teplota: 240 °C Průtok: 30 ml/min
• •
1,2 ml/min konstantní Nosný plyn: He
• •
Teplota. 260 °C Pomocné plyny: vzduch (350 ml/min) H2 (35 ml/min) N2 (30 ml/min)
Nástřik
Průtok
FID
FAME 6
Teplotní rampa • Počáteční teplota: 100 °C (6 min) • Rampa: 10 °C/min • Konečná teplota: 240 °C (12 min) Délka analýzy •
32 minut
• •
Teplota: 240 °C Průtok: 30 ml/min
• •
1,2 ml/min konstantní Nosný plyn: He
• •
Teplota. 260 °C Pomocné plyny: vzduch (350 ml/min) H2 (35 ml/min) N2 (30 ml/min)
Nástřik
Průtok
FID
- 72 -
Tab. 13 Optimalizace GC pro stanovení FAME – pokračování. Metoda
Parametry
FAME 8
Teplotní rampa • Počáteční teplota: 100 °C (6 min) • Rampa: 10 °C/min • Konečná teplota: 240 °C (6 min) Délka analýzy •
26 minut
• •
Teplota: 240 °C Průtok: 50 ml/min
• •
2 ml/min konstantní Nosný plyn: He
• •
Teplota. 260 °C Pomocné plyny: vzduch (350 ml/min) H2 (35 ml/min) N2 (30 ml/min)
Nástřik
Průtok
FID
8. 4. 2. Stanovení obsahu mastných kyselin v lupinové mouce Tabulka 14 uvádí obsah tuku a vybraných mastných kyselin. Obsah tuku je v průměru kolem 7 %, tedy na dolní hranici rozsahu uváděného v literatuře (Petterson, 2000; Bhardwaj et al., 2004; Straková et al., 2006; Boschin et al., 2007; Uzun et al.). Taktéž obsah kyseliny olejové (RT 24,20 min) a linolové (RT 25,02 min) odpovídá hodnotám naměřeným Boschin a kol. (2007). Chromatografická separace mastných kyselin ve vzorku (mouka 2008 neupravená) je uvedeny na obrázku 22. Výjimku v rámci obsahu tuku i uvedených mastných kyselin tvoří pražená mouka 2009, která má přibližně 1,3 x menší obsah tuku oproti ostatním moukám a také obsahuje mnohem menší množství kyseliny olejové a linoleové. Tyto rozdíly jsou zřejmě zapříčiněny úpravou mouky. Pro pražení v letech 2008 a 2009 byly použity jiné stroje, které měly odlišnou kapacitu a tedy i teplotní křivku. Hodnoty naměřené u nepražených mouk jsou odlišné, teoreticky to však může být způsobeno odlišnými klimatickými a půdními podmínkami v letech 2007 – 2009. Výsledky analýzy mouky 2008 jsou zcela nečekáné – pražená mouka má větší obsah mastných kyselin než nepražená. V případě kyseliny linolové téměř 2,3x. Pro tyto výsledky nebylo v literatuře nalezeno
- 73 -
žádné vysvětlení. Zřejmě tedy došlo k chybě při přípravě vzorků, protože analýza byla opakována 2x a výsledky byly stejné. IS (kyselina heptadekanová)
RT: 22.22 - 25.24 SM: 7B 22.44 1100000 1050000
kyselina olejová
1000000
24.20
950000 900000 850000 800000
Counts
750000 700000 650000 600000
kyselina linolová
550000
25.02 500000 450000 400000
23.81
350000
22.93
23.07
23.12 23.20 23.26
22.78
23.39
23.72
24.31 23.86 24.09
25.20
24.92 24.53 24.72 24.77
300000 22.4
22.6
22.8
23.0
23.2
23.4
23.6 23.8 Time (min)
24.0
24.2
24.4
24.6
24.8
25.0
25.2
Obr. 22 Chromatogram mastných kyselin lupiny bílé. Tab. 14 Obsah tuku a vybraných mastných kyselin v lupinové mouce. Obsah tuku (%)
Kyselina olejová
Kyseliny linolová
(mg/g mouky)
(mg/g mouky)
Mouka 2007 neupravená
7,77
14,19 ± 0,07
3,76 ± 0,43
Mouka 2008 upravená
7,11
12,08 ± 0,13
3,94 ± 0,12
Mouka 2008 neupravená
7,17
10,79 ± 0,07
1,74 ± 0,02
Mouka 2009 upravená
5,81
3,29 ± 0,25
0,52 ± 0,09
Mouka 2009 neupravená
7,84
15,06 ± 0,30
2,55 ± 0,12
8. 5. Analýza flavonoidů v lupinové mouce Jedním z nejdůležitějších flavonoidů, vyskytujícím se i v semenech lupiny bílé, je genistein (Sirtori et al., 2004). Bylo prokázáno, že genistein působí na lidský organismus příznivě. Má antioxidační (Middleton et al., 2000) a hormonální účinky
- 74 -
(Havsteen, 2002), funguje také jako prevence srdečních onemocnění či rakoviny a podílí se na imunitě (Middleton et al., 2000). Ve vzorcích byly v souladu s literaturou (Sirtori et al., 2004) identifikovány flavonoidy genistein (RT 5,7 min) a genistin (RT 4,42 min) (Obr. 23 a 24). V kolizních spektrech těchto flavonoidů pak byly nalezeny minimálně dva charakteristické fragmenty. U genisteinu to byly fragmenty m/z 145 a m/z 271 (genistein), u genistinu fragmenty m/z 271 (genistein) a m/z 433 (konjugát s glukózou). Získaná ESI-MS spektra a jednotlivé fragmenty (Obr. 23 a 24) jsou v souladu s literárními údaji Stobiecki a kol. (1999).
570 271
145
Obr. 23 Rekonstituovaný hmotnostní chromatogram genisteinu z lupiny bílé.
- 75 -
442 271
433
Obr. 24 Rekonstituovaný hmotnostní chromatogram genistinu z lupiny bílé.
8. 6. Stanovení karotenoidů v lupinové mouce V žádném ze vzorků nebyl v komplexní matrici detekován β-karoten. Bylo však detekováno mnoho látek s podobným UV profilem, jejichž hodnota retenčního času byla vyšší nebo nižší než hodnota retenčního času β-karotenu (18,13 min). Z 2D mapy záznamu DAD vzorku (Obr. 26 a) vyplývá, že ve vzorku byly obsaženy dvě látky méně polární než β-karoten. Na základě podobnosti UV spekter lze usuzovat, že se jedná o produkty rozkladu β-karotenu nebo o další formy karotenoidů α-karoten a lykopen či jejich degradační produkty. Rozpad karotenoidů byl zřejmě způsoben světlem či teplem, na které jsou obecně velmi citlivé (Meléndez-Martínez et al., 2007a). Záznamy z HPLC analýzy standardu β-karotenu a vzorku (mouka 2009 neupravená) jsou uvedeny na obrázku 25 a 26.
- 76 -
a)
b)
RT 18,13
c)
λmax 450 nm
Obr. 25 HPLC analýza standardu β-karotenu: a) 2D mapa záznamu DAD, b) chromatogram (455 nm), c) UV profil chromatogrfického píku β-karotenu
(18,13 min). - 77 -
a)
b)
c)
Obr. 26 HPLC analýza vzorku (mouka 2009 neupravená): a) 2D mapa záznamu DAD b) chromatogram (440 nm), c) UV profil chromatogrfického píku karotenoidu
(21,67 min). - 78 -
9. Závěr V rámci teoretické části této diplomové práce byla vypracována rešerše na téma chemické složení lupinové mouky se zaměřením na chinolizidinové alkaloidy, flavonoidy,
mastné
kyseliny,
především
polynenasycené
mastné
kyseliny,
aminokyseliny, karotenoidy, zejména na β-karoten, a antioxidační kapacitu. V experimentální části byla provedena analýza vzorků lupinové mouky z hlediska obsahu flavonoidů, mastných kyselin, karotenoidů, aminokyselinového složení a antioxidační kapacity. Vlivem procesu pražení došlo pravděpodobně k uvolnění vázaných flavonoidů a proto byl u pražených mouk naměřen 2x větší obsah flavonoidů než u mouk nepražených. S využitím UPLC-MS analýzy pak byly v lupinové mouce na základě fragmentačních spekter identifikovány isoflavony genistein a genistin. V souladu s literaturou (Katagiri et al., 2000; Sirtori et al., 2004) nebyly identifikovány žádné další isoflavony, protože se v semenech lupiny bílé jiné nevyskytují. Obsah tuku v analyzovaných moukách nepřekročil 8 %. Obsah kyseliny olejové a linolové byl v nepražených moukách 2007 a 2009 vyšší než u nepražené mouky 2008. Rozdílné hodnoty mohou být ovlivněny rozdílnými podmínkami při pěstování. Nepražená mouka 2008 však vykazuje dokonce i hodnoty nižší než mouka pražená, i když by tomu mělo být právě naopak. Jedním z možných vysvětlení této skutečnosti je, že došlo k chybě při přípravě vzorku. Analýza aminokyselinového složení potvrdila obecný vzorec výskytu AA u lupiny bílé. Charakteristická je přítomnost velkého množství glutaminu, argininu a aspartátu a malého množství methioninu a cysteinu. V případě aminokyselin nemělo pražení markantní vliv na obsah jednotlivých aminokyselin. β-karoten nebyl identifikován, jelikož pravděpodobně došlo k jeho rozkladu vlivem světla a vyšší teploty nebo také při procesu pražení. Chromatogram navíc obsahoval mnoho sloučenin s UV spektrem podobným β-karoten. Mohlo se tedy jednat o další karotenoidy. Antioxidační kapacita lupinové mouky byla pražením ovlivněna, protože celková suma antioxidačních vlastností je dána příspěvkem jednotlivých látek se schopností zhášet volné radikály. Pražením se tak sice mohl zvýšit obsah flavonoidů, na druhou stranu však došlo k degradaci karotenoidů, jejichž antioxidační účinky jsou větší. Tepelná úprava mouky procesem pražení tedy vede ke kvalitativním i kvantitivním změnám jednotlivých živin. Tyto změny mohou být pozitivní, jako v případě flavonoidů, nebo negativní jako v případě karotenoidů nebo antioxidační kapacity.
- 79 -
10. Použitá literatura Afaq F., Syed D. N., Malik A., Hadi N., Sarfaraz S., Kweon M. H., Khan M., Zaid M. A., Mukhtar A. (2007) Delphinidin, an anthocyanidin in pigmented fruits and vegetables, protects human HaCaT keratinocytes and mouse skin against UVB-mediated oxidative stress and apoptosis. J. Invest. Dermatol. 122, 222-232. Amoros M., Simões C. M. O., Girre L., Sauvager F., Cormier M. (1992) Synergistic effect of flavones and flavonols against herpes simplex virus type 1 in cell culture. Comparison with the antiviral activity of propolis. J Nat. Prod. 55(12), 1732-1740. Anieszewski T., Ciesołka D., Gulewicz K. (2001) Equilibrium between basic nitrogen compounds in lupin seeds with differentiated alkaloid content. Phytochemistry 57, 43-50. Australia New Zealand Food Authority (2001) Lupin alkaloids in food (A toxicological Technical report series No. 3. review and risk assessment). http://www.foodstandards.gov.au/_srcfiles/TR3.pdf [14. 10. 2009] Ayaz F. A., Hayirlioglu-Ayaz S., Gruz J., Novak O., Strnad M. (2005) Separation, characterization, and quantitation of phenolic acids in a little-known blueberry (Vaccinium arctostaphylos L.) fruit by HPLC-MS. J. Agric. Food Chem. 53(21), 8116-8122. Baer D., Saelzer R., Vega, Ibieta P., Molina L., von Baer E., Ibáñez R., Hashagen U. (2006) Isoflavones in Lupinus albus and Lupinus angustifolius: Quantitative determination by capillary zone electrophoresis, evolution of their concentration during plant development and effect on anthracnose causing fungus Colletotrichum lupini. J. Chil. Chem. Soc. 51(4), 1025-1029. Barceló-Coblijn G., Murphy E. J. (2009) Alpha-linolenic acid and its conversion to longer chain n-3 fatty acids: Benefits for human health and a role in maintaining tissue n-3 fatty acid levels. Prog. Lipid Res. 48, 355-374. Bednarek P., Frański R., Kerhoas L., Einhorn J., Wojtaszek P., Stobiecki M. (2001) Profiling changes in metabolism of isoflavonoids and their conjugates in Lupinus albus treated with biotic elicitor. Phytochemistry 56, 77-85. Bednarek P., Kerhoas L., Einhorn J., Frański R., Wojtaszek P., Rybus-Zając M., Stobiecki M. (2003) Profilin of flavonoid conjugates in Lupinus albus and Lupinus angustifolius responding to biotic and abiotic stimuli. J. Chem. Ecol. 29(5), 1127-1142. Berquin I. M., Edwards I. J., Chen Y. Q. (2008) Multi-targeted therapy of cancer by omega-3 fatty acids. Cancer Lett. 269(2), 363-377. Bhardwaj H. L., Hamama A. A., Merrick L. C. (1998) Genotypic and environmental effects on lupin seed composition. Plant Foods Hum. Nutr. 53, 1-13. Bhardwaj H. L., Hamama A. A., van Santen E. (2004) Fatty acids oil content in white lupin seed as affected by production practices. J. Am. Oil Chem. Soc. 81(11), 10351038. Black H. S., Rhodes L. E. (2006) The potential of omega-3 fatty acids in the prevention of non-melanoma skin cancer. Cancer Detect. Prev. 30, 224-232.
- 80 -
Boschin G., D´Agostina A., Annicchiarico P., Arnoldi A. (2007) The fatty acid composition of the oil from Lupinus albus cv. Luxe as affected by environmental and agricultural factors. Eur. Food Res. Technol. 225, 769-776. Boschin G., D´Agostina A., Annicchiarico P., Arnoldi A. (2008) Effect of genotype and environment on fatty acid composition of Lupinus albus L. seed. Food Chem. 108, 600-606. Boschin G., Annicchiarico P., Resta D., D´Agostina A., Arnoldi A. (2008) Quinolizidine alkaloids in seed of lupin genotypes of different origins. J. Agric. Food Chem. 56, 3657-3663. Brinkworth R. I., Stoermer M. J., Fairlie D. P. (1992) Flavones are inhibitors of HIV-1 proteinase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 188(2), 631-637. Brondz I. (2002) Development of fatty acid analysis by high-performance liquid chromatography, gas chromatography, and related techniques. Anal. Chim. Acta 465, 1-37. Calder P. C. (2004) Polyunsaturated fatty acids and inflamation. Oléagineux, Corps Gras, Lipides 11(1), 38-45. Cao G., Alessio H. M., Cutler R. G. (1993) Oxygen-radical absorbance capacity assay for antioxidants. Free Radical Biol. Med. 14, 303-311. Carranca C., Torres M. O., Baeta J. (2009) White lupine as a beneficial crop in Souther Europe: I. Potential for N mineralization in lupine amended soil and yield and N2 fixation by white lupin. Europ. J. Agronomy 31, 183-189. Constantinou C., Papas A., Constantinou A. I. (2008) Vitamin E and cancer: An insight into the anticancer activities of vitamin E isomers and analogs. Int. J. Cancer 123(4), 739-752. Cos P., Ying L., Calomme M., Hu J. P., Cimanga K., van Poel B., Pieters L., Vlietinck A. J., Vanden Berghe D. (1998) Structure-activity relationship and classification of flavonoids as inhibitors of xanthine oxidase and superoxide scavengers. J. Nat. Prod. 61, 71-76. Craft N. E., Soares J. H. (1992) Relative solubility, stability and absorptivity of lutein and β-karoten in organic solvents. J. Agric. Food Chem. 40, 431-434. Cushnie T. P. T., Lamb A. J. (2005) Antimicrobial activity of flavonoids. Int. J. Antimicrob. Agents 26, 343-356. D´Agostina A., Boschin G., Resta D., Annicchiarico P., Arnoldi A. (2008) Changes of isoflavones during the growth cycle of Lupinus albus. J. Agric. Food Chem. 56(12), 4450-4456. Dröge W., Schulze-Osthoff K., Mihm S., Galter D., Schenk H., Eck H. P., Roth S., Gmunder H. (1994) Functions of glutathione a glutathione disulfide in immunology and immunopathology. FASEB J. 8, 1131-1138. Duranti M., Cerletti P. (1979) Amino acid composition of seed proteins of Lupinus albus. J. Agric. Food Chem. 27(5), 977-978.
- 81 -
Duranti M., Consonni A., Magni C., Sessa F., Scarafoni A., (2008) The major proteins of lupin seed: Characterisation and molecular properties for use as functional and nutraceutical ingredients. Trends Food Sci. Technol. 19, 624-633. Ebel J., Mithöfer A. (1998) Early events in the elicitation of plant defence. Planta 206 (3), 335-348. Eder K. (1995) Gas chromatographic analysis of fatty acid methyl ester. J. Chromatogr. B 671, 113-131. Edge R., McGarvey D. J., Truscott T. G. (1997) J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 41, 181-200. Erbaş M., Certel M., Uslu M. K. (2005) Some chemical properties of white lupin seeds (Lupinus albus L.). Food Chem. 89, 341-345. Esteban E., Moreno E., Peñalosa J., Cabrero J. I., Millán R., Zornoza P. (2008) Short and long-term uptake of Hg in white lupin plants: Kinetics and stress indicators. Environ. Exp. Bot. 62(3), 316-322. Fan Y. Y., Chapkin R. S. (1998) Importance of dietary γ-linoleic acid in human health and nutrition. J. Nutr. 128, 1411-1414. FAO/WHO/UNU (2002). Protein and amino acid requirements in human nutrition Report of joint FAO/WHO/UNU Expert consultation on nutritional meeting, Ženeva, Švýcarsko. WHO Technical Report Series No. 935. Farran M. T., Barour E. K., Ahskarian V. M. (2003) Effect of excess leucine in low protein diet on ketosis in 3-week-old male broiler chicks fed different levels of isoleucine and valine. Anim. Feed Sci. Technol. 103, 171-176. Fernandez-Orozco R., Frias J., Muñoz R., Zielinski H., Piskula M. K., Kozlowska H., Vidal-Valverde C. (2008) Effect of fermentation conditions on the antioxidant compounds and antioxidant capacity of Lupinus angustifolius cv. zapaton. Eur. Food Res. Technol. 227, 979–988. Fesen M. R., Pommier Y., Leteurtre F., Hiroguchi S., Yung J., Kohn K. W. (1994) Inhibition of HIV-1 integrase by flavones, caffeic acid phenethyl ester (CAPE) and related compounds. Biochem. Pharmacol. 48(3), 595-608. Frankel E. N. (1996) Antioxidants in lipid foods and their impact on food quality. Food Chem. 57(1), 51-55. Frias J., Miranda M. L., Doblado R., Vidal-Valverde C. (2005) Effect of germination and fermentation on the antioxidant vitamin content and antioxidant acapacity of Lupinus albis L. var. Multolupa. Food Chem. 92, 211-220. Gagnon H., Seguin J., Bleichert E., Satoshi T., Ibrahim R. K. (1992) Biosynthesis of white lupin isoflavonoids from [U-14C]L-phenylaanine and their release into the culture medium. Plnt Physiol. 100, 76-79. Gagnon H., Ibrahim R. K. (1997) Effects of various elicitors on the accumulation and secretion of isoflavonoids in white lupin. Phytochemistry 44(8), 1463-1467.
- 82 -
Garcés R., Mancha M. (1993) One-step lipid extraction and fatty acid methyl esters preparation from fresh plant tissues. Anal. Biochem. 211(1), 139-143. García López P. M., Garzón de la Mora P., Wysocka W., Maiztegui B., Alzugaray M. E., Del Zotto H., Borelli M. I. (2004) Quinolizidine alkaloids isolated from Lupinus species enhance insulin secretion. Eur. J. Pharmacol. 504, 139-142. Gdala J., Jansman A. J. M., Leeuwen P., Huisman J., Verstegen M. W. A. (1996) Lupins (L. luteus, L. albus, L. angustifolius) as a protein source for young pigs. Anim. Feed Sci. Technol. 62, 239-249. Gleissman H., Johnsen J. I., Kogner P. (2010) Omega-3 fatty acids in cancer, the protectors of good and killers of evil? Exp. Cell Res. In press. doi:10.1016/j.yexcr.2010.02.039 Graça Dias M., Filomena M., Camões G. F. C., Oliveira L. (2009) Carotenoids in traditional Portuguese fruits and vegetables. Food Chem. 113, 808-815. Golubev A. A., Kurlovich B. S. (2002) Diseases and pests. In Lupins: Geograpgy, classification, genetic resources and breeding (Kurlovich B. S. [ed.]), pp. 269, OY International North Express, St. Petersburg, Russia – Pellosniemi, Finland. http://lupins-bk.blogspot.com/2006/07/nitrogen-fixation.html [15.10.2009] Gulewicz K., Martínez-Villaluenga C., Frias J., Cisołka D., Gulewicz K., Vidal-Valverde C. (2008) Effect of germination on the protein fraction composition of different lupin seeds. Food Chem. 107, 830-834. Gutnikov G. (1995) Fatty acid profiles of lipide samples. J. Chromatogr. B 671, 71-79. Harborne J. B. (1999a) The comparative biochemistry of phytoalexin induction in plants. Biochem. Syst. Ecol. 27(4), 335-367. Harborne J. B. (1999b) Recent advances in chemical ecology. Nat. Prod. Rep. 16, 509-523. Harborne J. B., Baxter H. (1999) The handbook of natural flavonoids, Vols 1 and 2, John Wiley and Sons, Chichester, UK. Harborne J. B., Williams C. A. (2000) Advances in flavonoid research since 1992. Phytochemistry 55, 481-504. Harrison F. E., May J. M. (2009) Vitamin C function in the brain: vital role of the ascorbate transporter SVCT2. Free Radical Biol. Med. 46, 719-730. Harrison J. E. M., Williams W. (1982) Genetical control of alkaloids in Lupinus albus. Euphytica 31, 357-364. Havsteen B. H. (2002) The biochemistry and medical significance of the flavonoids. Pharmacol. Ther. 96, 67-202. Hiltunen J. K., Autio K. J., Schonauer M. S., Samuli Kursu V. A., Dieckmann C. L., Kastaniotis A. J. (2010) Mitochondrial fatty acid synthesis and respiration. Biochim. Biophys. Acta doi:10.1016/j.bbabio.2010.03.006, In press.
- 83 -
Hirschberg J. (2001) Carotenoid biosynthesis in flowering plants.Curr. Opin. Plant Biol. 4, 210-218. Huang C. B., Ebersole J. L. (2010) A novel bioactivity of omega-3 polyunsaturated fatty acids and their ester derivatives. Mol. Oral Microbiol. 25(1), 75-80. Huyghe C. (1997) White lupin (Lupinus albus L.). Field Crop. Res. 53, 147-160. Chango A. Villaume C., Bau H. M., Nicolas J. P., Méjean L. (1995) Fractionation by thermal coagulation of lupin proteins: physicochemical characteristics. Food res. Int. 28(1), 91-95. Chen J. W., Zhu Z. Q., Hu T. X., Zhu D. Y. (2002) Structure-activity relationship of natural flavonoids in hydroxyl radical-scavenging effects. Acta Pharmacol. Sin. 23(7), 667-672. Chiesa G., Johnson S. K., Marchesi M., Parolini C., Caligari S., Gilio D., Cornelli L., Diani E., Rigamonti E., Sirtori C. R.: Lupin protein: A new source of cardiovascular protective agents? XIV International Symposium on Atherosclerosis, Řím 2006, Itálie, Th-W55:3. Chong J., Potaraud A., Hugueney P. (2009) Metabolism and roles of stilbenes in plants. Plant. Sci. 177, 143-155. Isabelle M., Lee B. L., Lim M. T., Koh W. P., Huang D. J., Ong C. N. (2010) Antioxidant activity and profiles of commnon vegetable in Singapore. Food Chem. 120(4), 993-1003. Innis S. M. (2003) Perinatal biochemistry and physiology of long chain polyunsaturated fatty acids. J. Pediatr. 143(4), 1-8. Innis S. M. (2007) Fatty acids and early human development. Early Hum. Dev. 83(12), 761-766. Innis S. M. (2008) Dietary omega 3 fatty acids and the developing brain. Brain Res. 1237, 35-43. Jelínek J., Zicháček V. a kolektiv (2000) Biologie pro gymnázia, pp. 322-323, Nakladatelství Olomouc, Olomouc, Česká republika. Jiménez Martínez C., Loarca-Piña G., Dávila Ortíz G. (2003) Antimutagenic activity of phenolic compounds, oligosaccharides and quinolizidinic alkaloids from Lupinus campestris seeds. Food Addit. Contam. 20(10), 940-948. Jordão A. A., Chiarello P. G., Arantes M. R., Meirelles M.S., Vannucchi H. (2004) Effect of an acute dose of ethanol on lipid peroxidation in rats: action of vitamin E. Food Chem Toxicol., 42(3), 459-464. Kajadphai Taungbodhitham A., Jones G. P., Wahlquist M. L., Briggs D. R. (1998) Evaluation of extraction method for the analysis of carotenoids in fruits and vegetables. Food Chem. 63(4), 577-584. Kamal-Eldin A., Appelquist L. A. (1996) The chemistry and antioxidant properties of tocopherols and tocotrienols. Lipids 31 (79), 671–701.
- 84 -
Katagiri Y., Ibrahim R. K., Tahara S. (2000) HPLC analysis of white lupin isoflavonoids. Biosci. Biotechnol. Biochem. 64(6), 1118-1125. Kendall C. W. C., Esfahani A., Jenkins D. J. A. (2010) The link between dietary fibre and human health. Food Hydrocolloids 24(1), 42-48. Kline K., Lawson K. A., Yu W., Sanders B. G. (2007) Vitamin E and cancer. Vitamins & Hormone 76, 435-461. Ko Y. J., Oh H. J., Ahn H. M., Kang H. J., Kim J. H., Ko Y. H. (2009) Flavonoids as potential inhibitors of retroviral enzymes. J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 52(4), 321-326. Kobayashi H., Fukuda Y., Yoshida R., Kanada Y., Nishiyama S., Suzuki M., Kanayama N., Terao T. (2004) Suppressing effects of dietary supplementation of soybean trypsin inhibitor on spontaneous, experimental and peritoneal disseminated metasis in mouse model. Int. J. Cancer 112(3), 519-524. Krinsky N. I., Johnson E. J. (2005) Carotenoid actions and their relation to health and disease. Mol. Aspects Med. 26(6), 459-516. Krinsky N. I., Yeum K. J. (2003) Carotenoid–radical interactions. biochem. Biophys. Res. Commun. 305, 754-760. Kurlovich B. S., Tikhonovich I. A., Kartuzova L. T., Heinänen J., Kozhemykov A. P., Tchetkova S. A., Cheremisov B. M., Emeljanenko T. A. (2002) Nitrogen fixation. In Lupins: Geograpgy, classification, genetic resources and breeding (Kurlovich B. S. [ed.]), pp. 269, OY International North Express, St. Petersburg, Russia – Pellosniemi, Finland. http://lupins-bk.blogspot.com/2006/07/nitrogen-fixation.html [15.10.2009] Kurzbaum A., Safori G., Monir M., Simsolo C. (2008) Anticholinergic syndrome in response to lupin seed toxicity. Isr. J. Emerg. Med. 8(2), 20-22. Lakshmanan M. R., Nepokroeff C. M., Porter J. W. (1972) Control of the synthesis of fatty-acid synthetase in rat liver by insulin, glucagon and adenosine 3´:5´cyclic monophosphate. Proc. Nalt. Acad. Sci. 60(12), 3516-3519. Lampart-Szczapa E., Korczak J., Nogala-Kalucka M., Zawirska-Wojtasiak R. (2003) Antioxidant properties of lupin seed products. Food Chem. 83(2), 279-285. Lampart-Szczapa E., Siger A., Trojanowska K., Nogala-Kalucka M., Malecka M., Pacholek B. (2003) Chemical composition and antibacterial activities of lupin seeds extracts. Nahrung/Food 5, 286-290. Larsson S. C., Bergkvist L., Wolk A. (2010) Dietary carotenoids and risk of hormone receptor-defined breast cancer in a prospective cohort of Swedish women. Eur. J. Cancer 46, 1079-1085. Lavie C. J., Milani R. V., Mehra M. R., Ventura H. O. (2009) Omega -3 polyunsaturated fatty acids and cardiovascular disease. J. Am. Coll. Cardiol. 54(7), 585-594. Leaf A., Albert C. M., Josephson M., Steinhaus D., Kluger J., Kang J. X., Cox B., Zhang H., Schoenfeld D. (2005) Prevention of fatal arrhythmias in high-risk subjects by fish oil n-3 fatty acid intake. Circulation 112, 2762-2768.
- 85 -
Lee M. J., Pate J. S., Harris D. J., Atkins C. A. (2007) Synthesis, transport and accumulation of quinolizidine alkaloids in Lupinus albus L. and L. angustifolius L. J. Exp. Bot. 58(5), 935-946. Litkey J., Dailey M. W. (2007) Anticholinergic toxicity associated with the ingestion of lupini beans. Am. J. Emerg. Med. 25(2), 215-217. Locati D., Morandi S., Zanotti M., Arnoldi A. (2006) Preliminary approaches for the development of a high-performance liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry method for the detection and label-free semiquantitation of the main storage proteins of Lupinus albus in foods. Rapid. Commun. Mass Spectrom. 20, 1305-1316. Lotito S. B., Frei B. (2006) Consumption of flavonoid-rich foods and increased plasma antioxidant capacity in humans: Cause, consequence, or epiphenomenon? Free Radical Biol. Med. 41, 1726-1746. Magalhães L. M., Segundo M. A., Reis S., Lima J. L. F. C. (2008) Methodological aspects about in vitro evaluation of antioxidant properties. Anal. Chim. Acta 613, 1-19. Maiani G., Periago Castón M. J., Catasta G., Toti E., Goñi Cambrodón I., Bysted A., Granado-Lorencio F., Olmedilla-Alonso B., Knuthsen P., Valoti M., Böhm V., MayerMiebach E., Behsnilian D., Schlemmer U. (2009) Carotenoids: Actual knowledge on food sources, intakes, stability and bioavailability and their protective role in humans. Mol. Nutr. Food Res. 53(S2), S194-S218. Maj D., Wielbo J., Marek-Kozaczuk M., Skorupska A. (2010) Response to flavonoids as a factor influencing competitiveness and symbiotic activity of Rhizobium leguminosarum. Mikrobol. Res. 165, 50-60. Majerus P. W. (1967) Acyl carrier protein: Structural requirements for function in fatty acid biosynthesis. J. Biol. Chem. 242(10), 2325-2332. Makrides M., Neumann M., Simmer K., Pater J., Gibson R. (1995) Are long-chain polyunsaturated fatty acids essential nutrients in infancy? Lancet 354, 1463-1468. Marczak L., Wojtaszek P., Stobiecki M. (2008) Influence of plant secondary metabolites on in vitro oxidation of methyl ferulate with cell wall peroxidases from lupine apoplast. J. Plant Physiol. 165, 239-250.
Martínez R., Gutiérrez D., García Cubillana A., Guardia P., Delgado J., de la Calle A., Durán S., Conde J. (1997) Contact urticaria from lupine (Lupinus albus). Allergy 52(s37), 114. Martínez-Villaluenga C., Frias J., Gulewicz K., Vidal-Valverde C. (2004) Improved method to obtain pure α-galactosides from lupin seeds. J. Agric. Food Chem. 52, 6920-6922. Martínez-Villaluenga C., Zieliński H., Frias J., Piskuła M. K., Kozłowska H., Vidal-Valverde C. (2009) Antioxidant capacity and polyphenolic content of high-protein lupin products. Food Chem. 112, 84-88.
- 86 -
Martínez-Villaluenga C., Torres A., Frias J., Vidal-Valverde C. (2010) Semolina supplementation with processed lupin and pigeon pea flours improve protein quality of pasta. LWT-Food Sci. Technol. 43, 617-622. Mazza M., Pomponi M., Janiri L., Bria P., Mazza S. (2007) Omega-3 fatty acids and antioxidants in neurological and psychiatric diseases: An overview. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry 31, 12-26. Melo T. S., Ferreira R. B., Teixeira a. N. (1994) The seed storage protein from Lupinus albus. Phytochemistry 37(3), 641-648. Meléndez-Martínez A. J., Britton G., Vicario I. M., Heredia F. J. (2007a) Relationship between the colour and the chemical structure of carotenoid pigments. Food Chem. 101, 1145-1150. Meléndez-Martínez A. J., Vicario I. M., Heredia F. J. (2007b) of carotenoids in orange juice. J. Food Comp. Anal. 20, 638-649.
Review: Analysis
Méndez Antolín E., Marrero Delange D., Canavaciolo Gonzáles V. (2008) Evaluation of five methods for derivatization and GC determination of a mixture of very long chain fatty acids (C24:0–C36:0). J. Pharm. Biomed. Anal. 46, 194-199. Middleton E., Kandaswami C., Theoharides T. C. (2000) The effects of plant flavonoids on mammalian cells: Implications for inflammation, heart disease, and cancer. Pharmacol. Rev. 52(4), 673-751. Méndez Antolín E., Marrero Delange D., Canavaciolo Gonzáles V. (2008) Evaluation of five methods for derivatization and GC determination of a mixture of very long chain fatty acids (C24:0–C36:0). J. Pharm. Biomed. Anal. 46, 194-199. Mondello L., Quinto Tranchida P. Dugo P., Dugo G. (2006) Rapid, micro-scale preparation and very fast gas chromatographic separation of cod liver oil fatty acid methyl esters. J. Pharm. Biomed. Anal. 41, 1566-1570. Moneret-Vautrin D. A., Guérin L., Kanny G., Flabbee J., Frémont S., Morisset M. (1999) Cross-alergenicity of peanut and lupine: The risk of lupine allergy in patients allergic to peanuts. J. Allergy Clin. Immunol. 104(4), 883-888. Moore S., Stein W H. (1948) Photometric ninhydrin method in the chromatogrphy of amino acids. J. Biol. Chem. 176, 367-388.
for
use
Mukohata Y., Nakabayashi S., Higashida M. (1978) Quercetin, an energy transport inhibitor in photophosphorylation. FEBS Lett. 85(2), 215-218. Mubarak A. E. (2001) Chemical, nutritional and sensory properties of bread supplemented with lupin seed (Lupinus albus) products. Nahrung/Food 45(4), 241-245. Munteanu A., Zingg J. M. (2007) Cellular, molecular and clinical aspects of vitamin E on atherosclerosis prevention. Mol. Asp. Med. 28, 538-590. Mur L. A. J., Carver T. L. W., Prats E. (2006) NO way to live; the various roles of nitric oxide in plant–pathogen interactions. J. Exp. Bot. 57(3), 489-505. Mutanen M. (1997) Cis-unsaturated fatty acids and platelet function. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 57(4-5), 403-410. - 87 -
Muzquiz M., Burbano C., Pedrosa M. M., Folkman W. (1999) Lupins as a potential source of raffinose family oligosaccharides. Preparative method for their isolation and purification. Ind. Crops Prod. 19, 183-188. Nirenberg H. I., Feiler U., Hagedorn G. (2002) Description of Colletotrichum lupini comb. nov. in modern terms. Mycologia 94(2), 307-320. Novembre E., Moriondo M., Bernardini R., Azzari C., Rossi M. E., Vierucci A. (1999) Lupin allergy in child. J. Allergy Clin. Immunol. 103(6), 1214-1216. Nowicka G., Klosiewicz-Latoszek L., Sirtori C. R., Arnoldi A., Naruszewicz M.: Lupin proteins in the treatment of hypercholesterolemia. XIV International Symposium on Atherosclerosis, Řím 2006, Itálie, Th-W55:4. O´Connell O. F., Ryan L., O´Brien N. M. (2007) Xanthophyll carotenoids are more bioaccessible from fruits than dark green vegetables. Nutr. Res. 27, 248-254. Okada T., Hirai M. Y., Suzuki H., Yamazaki M., Saito K. (2005) Molecular characteriaztion of a novel quinolizidine alkaloid O-tigloyltransferase: cDNA cloning, catalytic activity of recombinant protein and expression analysis in Lupinus plants. Plant Cell Physiol. 46(1), 233-244. Oliver J., Palou A. (2000) Chromatographic determination of carotenoids in foods. J. Chromatogr. A 881, 543-555. Osborne T. B. (1907) The proteins of the wheat kernel. Carnegie Institution of Washington, Washington D.C., USA. Ou B., Hampsch-Woodill M., Prior R. L. (2001) Development and validation of an improved oxygen radical absorbance capacity assay using fluorescein as a fluorescent probe. J. Agric. Food Chem. 49, 4619-4626. Padayatty S. J., Katz A., Wang Y., Eck P., Kwon O., Lee J. H., Chen S., Corpe C., Dutta A., Dutta S. K., Levine M. (2003) Vitamin C as an antioxidant: Evaluation of its role in disease prevention. J. Am. Coll. Nutr. 22(1), 18-35. Paiva N. L. (2000) An introdustion to the biosynthesis of chemicals used in plantmicrobe communication. J. Plant Growth Regul. 19, 131-143. Paiva S. A., Russell R. M. (1999) β-carotene and other carotenoids as antioxidants. J. Am. Coll. Nutr. 18(5), 426-433. Panter K. E., James L. F., Gardner D. R. (1999) Lupines, poison-hemlock and Nicotiana spp.: Toxicity and teratogenicity in livestock. J. Nat. Toxins 8(1), 117-134. Parodi P. W. (2009) Has the association between saturated fatty acids, serum cholesterol and coronary heart disease been over emphasized? Int. Dairy J. 19(6-7), 345-361. Paulová H., Bochořáková H., Táborská E. (2004) Metody stanovení antioxidační aktivity přírodních látek in vitro. Chem. Listy 98, 174-179.
- 88 -
Peterkofsky B. (1991) Ascorbate requirement for hydroxylation and secretion of procollagen: relationship to inhibition of collagen synthesis in scurvy. Am. J. Clin. Nutr. 54, 1135S-1140S. Peters N. K., Verma D. P. S. (1990) Phenolic compounds as regulators of gene expression in plant-microbe interactions. Mol. Plant Microbe Interact. 3(1), 4-8. Petrović M., Kezić N., Bolanča V. (2010) Optimization of the GC method for routine analysis of the fatty acid profile in several food samples. Food Chem. 122(1), 285-291. Petterson D. S. (2000) The use of lupins in feeding systems. Asian-Aus. J. Anim. Sci. 13(6), 861-882. Phillips D. A., Kapulnik Y. (1995) Plant flavonoids, pathogens and symbionts. Trends Microbiol. 3(2), 58-64. Písaříková B., Zralý Z. (2009) Nutritional value of lupine in the diets for pigs. Acta Vet. Brno 78, 399-409. Pothier J., Cheav S. L., Galand N., Dormeau C., Viel C. (1998) A comparative study of the effects of sparteine, lupanine and lupin extract on the central nervous system of the mouse. J. Pharm. Pharmacol. 50(8), 949-954. Price K. R., Lewis J., Wyatt G. M., Fenwick R. G. (1988) Flatulence – causes, relation to diet and remedies. Nahrung 32, 609-626. Prior R. L., Wu X., Schaich K. (2005) Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. J. Agric. Food Chem. 53, 4290-4302. Qiu X. (2003) Biosynthesis of docosahexaenoic acid (DHA, 22:6-4, 7,10,13,16,19): two distinct pathways. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 68(2), 181-186. Rama Rao P. B., Chalam Metta V., Connor Johnson B. (1959) The amino acid composition and the nutritive value of proteins. J. Nutr. 69, 387-391. Rao A. V., Rao L. G. (2007) Carotenoids and human health. Pharmacol Res. 55, 207-216. Rebouche C. J. (1991) Ascorbic acid and carnitine biosynthesis. Am. J. Clin. Nutr. 54, 1147S-1152S. Reeds P. J. (2000) Dispensable and indispensable amino acid for human. J. Nutr. 130, 1835S-1840S. Reinhard H., Rupp H., Sager F., Streule M., Zoller O. (2006) Quinolizidine alkaloids and phomopsins in lupin seeds and lupin containing food. J. Chromatogr. A 1112, 353-360. Resta D., Boschin G., D´Agostina A., Arnoldi A. (2008) Evaluation of total quinolizidine alkaloids content in lupin flours, lupin-based ingredients, and foods. Mol. Nutr. Food Res. 52, 490-495. Ricciarelli R., Argellati F., Pronzato M. A., Domenicotti C. (2007) Vitamin E and neurodegenerative diseases. Mol. Asp. Med. 28, 591-606. - 89 -
Richter R., Hlušek J., Ryant P., Lošák T. (2002) Organická hnojiva a jejich postavení v zemědělské praxi. Úroda 50(9), 9-12. Robinson J. G., Stone N. J. (2006) Antiatherosclerotic and antithrombotic effects of omega-3 fatty acids. Am. J. Cardiol. 98(4), 39-49. Romano C., Ferrara A., Tarallo S. (1997) Allergic reaction to lupine seed (Lupinus albus). Allergy 52(s37), 113-114. Roy M. K., Koide M., Rao T. P., Okubo T., Ogasawara Y., Juneja L. R. (2010) ORAC and DPPH assay comparison to assess antioxidant capacity of tea infusions: Relationship between total polyphenol and individual catechin content. Int. J. Food Sci. Nutr. 61(2), 109-124. Ruiz-Rodriguez A., Reglero G., Ibañez E. (2010) Recent trends in the advanced analysis of bioactive fatty acids. J. Pharm. Biomed. Anal. 51, 305-326. Saija A., Scalese M., Lanza M., Marzullo D., Bonina F., Castelli F. (1995) Flavonoids as antioxidant agents: Importance of their interaction with biomembranes. Free Radical Biol. Med. 19, 481-486. Saito K., Koike Y., Suzuki H., Murakoshi I. (1993) Biogenetic implication of lupin alkaloid biosynthesis in bitter and sweet forms of Lupinus luteus and L. albus. Phytochemistry 34(4), 1041-1044. Salem N., Pawloski R., Wegher B., Hibbeln J. (1999) In vivo conversion of linoleic acid to arachidonic acid in human adults. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 60(5-6), 407-410. SanGiovanni J. P., Chew E. Y. (2005) The role of omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in health and disease of the retina. Prog. Retin. Eye Res. 24, 87-138. Sasaki Y., Kozaki A., Hatano M. (1997) Link between light and fatty acid synthesis: Thioredoxin-linked reductive activation of plastidic acetyl-CoA carboxylase. Proc. Natl. Acad. Sci. 94(20), 11096-11101. Sattler S. E., Gilliland L. U., Magallanes-Lundback M., Pollard M., DellaPenna D. (2007) Vitamin E is essential for seed longevity and for preventing lipid peroxidation during germination. Plant Cell 16, 1419–1432. Savelieva K. V., Zhao S., Pogorelov V. M., Rajan I., Yang Q., Cullinan E., Lanthorn T. H. (2008) Genetic Disruption of Both Tryptophan Hydroxylase Genes Dramatically Reduces Serotonin and Affects Behavior in Models Sensitive to Antidepressants. PLoS ONE 3(10): e3301. doi:10.1371/journal.pone.0003301 Sayanova O. V., Napier J. A. (2004) Eicosapentaenoic acid: biosynthetic routes and the potential for synthesis in transgenic plants. Phytochemistry 65(2), 147-158. Seppänen-Laakso T., Laakso I., Hiltunen R. (2002) Analysis of fatty acids by gas chromatography, and its relevance to research on health and nutrition. Anal. Chim. Acta 465, 39-62. Shah M., Adams-Huet B., Grundy S. M., Garg A. (2004) Effect of a high-carbohydrate vs a high–cis-monounsaturated fat diet on lipid and lipoproteins in individuals with and without type 2 diabetes. Nutr. Res. 24(12), 969-979. - 90 -
Shao H. B., Chu L. Y., Lu Z. H., Kang C. M. (2008) Primary antioxidant free radical scavenging and redox signaling pathways in higher plant cells. Int. J. Biol. Sci. 4(1), 8-14. Shemin D., Rittenberg D. (1946) The biological utilization of glycine for the synthesis of the protoporphyrin of hemoglobin. J. Biol. Chem. 166, 621-625. Sheng K. C., Pietersz G. A., Tang C. K., Ramsland P. A., Apostolopoulos V. (2010) Reactive oxygen species level defines two functionally distinctive stages of inflammatory dendritic cell development from mouse bone marrow. J. Immunol. 184(6), 2863-2872. Shibuya Y., Sugimura Y., Tahara S., Mizutani J. (1992) Accumulation of isoflavones in lupin seedings treated with copper chloride. Biosci. Biotech. Biochem. 56(4), 690-691. Schlemmer U., Frølich W., Prieto R. M., Grases F. (2009) Phytate in foods and significance for humans: Food sources, intake, processing, bioavailability, protective role and analysis. Mol. Nutr. Food Res. 53(S2), S330-S375. Schmeller T., Sauerwein M., Sporer F., Wink M., Müller W. E. (1994) Binding of quinolizidine alkaloids to nicotinic and muscarinic acetylcholine receptors. J. Nat. Prod. 57(9), 1316-1319. Schulze J., Temple G., Temple S. J., Beschow H., Vance C. P. (2006) Nitrogen fixation by white lupin under phosphorus deficiency. Ann. Bot. 98, 731-740. Sierra S., Lara-Villoslada F., Comalada M., Olivares M., Xaus J. (2008) Dietary eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid equally incorporate as decosahexaenoic acid but differ in inflammatory effects. Nutrition 24, 245-254. Sies H. (1999) Glutathione and its role in cellular function. Free Radical Biol. Med. 27, 906-921. Simopoulos A. P. (2002) The importance of the ratio of omega-6/omega-3 essential fatty acids. Biomed. Pharmacother. 56, 365-379. Simmonds M. S. J. (2003) Flavonoid-insect interactions: recent advances in our knowledge. Phytochemistry 64, 21-30. Sirtori C. R., Lovati M. R., Manzoni C., Castiglioni S., Duranti M., Magni C., Morandi S., D´Agostina A., Arnoldi A. (2004) Proteins of white lupin seed, a naturally isoflavonepoor legume, reduce cholesterolemia in rats and increase LDL receptor activity in HepG2 cells. J. Nutr. 134, 18-23. Spindler M., Stadler R., Tanner H. (1984) Amino acid analysis of feedstuffs: Determination of methionine and cystine after oxidation with performic acid and hydrolysis. J. Agric. Food Chem. 32, 1366-1371. Stahl W., Sies H. (2005) Bioactivity and protective effects of natural carotenoids. Biochem. Biophys Acta 1740, 101-107. Stobiecki M., Malosse C., Kerhoas L., Wojtaszek P., Einhorn J. (1999) Detection of isoflavonoids and their glycosides by liquid chromatography/electrospray ionization
- 91 -
mass spectrometry in root extracts of lupin (Lupinus albus). Phytochem. Anal. 10, 198-207. Stobiecki M., Wojtaszek P., Gulewicz K. (1997) Application of solid phase extraction for profiling quinolizidine alkaloids and phenolic compounds in Lupinus albus. Phytochem. Anal. 8, 153-158. Straková E., Suchý P., Večerek V., Šerman V., Mas N., Jüzl M. (2006) Nutritional composition of seeds of the genus Lupinus. Acta Vet. Brno 75, 489-493. Sujak A., Kotlarz A., Strobel W. (2006) Compositional and nutritional evaluation of several lupin seeds. Food Chem. 98, 711-719. Sun T., Powers J. R., Tang J. (2007) Evaluation of the antioxidant activity of asparagus, broccoli and their juices. Food Chem. 105(1), 101-106. Suzuki H., Murakoshi I., Saito K. (1994) A novel O-tigloyltransferase for alkaloid biosynthesis in plants (Purification, characterization and distribution in Lupinus plants). J. Biol. Chem. 269(22), 15853-15860. Šípal Z., Anzenbacher P., Peč P., Pospíšil J., Růžička I. (1992) Biochemie, pp. 306, Státní pedagogické nakladatelství, Praha, ČR. Takeda K., Harborne J. B., Waterman P. G. (1993) Malonylated flavonoids and blue flower colour in lupin. Phytochemistry 34(2), 421-423. Tapiero H., Nguyen Ba G., Couvreur P., Tew K. D. (2002) Polyunsaturated fatty acids (PUFA) and eicosanoids in human healthand pathologies. Biomed. Pharmacother. 56(5), 215-222. Thaipong K., Boonprakob U., Crosby K., Cisneros-Zevallos L., Hawkins Byrne D. (2006) Comparison of ABTS, DPPH, FRAP, and ORAC assays for estimating antioxidant activity from guava fruit extracts. J. Food Comp. Anal. 19, 669-675. Tomasi N., Weisskopf L., Renella G., Landi L., Pinton R., Varanini Z., Nannipieri P., Torrent J., Martinoia E., Cesco S. (2008) Flavonoids of white lupin roots participate in phosphorus mobilization from soil. Soil Biol. Biochem. 40, 1971-1974. Tomomatsu H. (1994) Health effects of oligosaccharides. Food Technol. 48, 61-65. Tong L. (2005) Acetyl-coenzyme A carboxylase: crucial metabolic and attractive target for drug discovery. Cell. Mol. Life Sci. 62, 1784-1803.
enzyme
Tsaliki E., Lagouri V., Doxastakis G. (1999) Evaluation of the antioxidant activity of lupin seed flour and derivatives (Lupinus albus ssp. Graecus) Food Chem. 65, 71-75. Tsiodras S., Shin R. K., Christian M., Shaw L. M., Sass D. A. (1999) Anticholinergic toxicity associated with lupine seeds as a home remedy for diabetes mellitus. Ann. Emerg. Med. 33, 715-717. Tvrzická E., Vecka M., Staňková B., Žák A. (2002) Analysis of fatty acids in plasma lipoproteins by gas chromatography–flame ionization detection: Quantitative aspects. Anal. Chim. Acta 465, 337-350.
- 92 -
Uzun B., Arslan C., Karhan M., Toker C. (2007) Fat and fatty acids of white lupin (Lupinus albus L.) in comparison to sesame (Sesamum indicum L.). Food Chem. 102, 45-49. Veena J., Nainawatee H. S. (2002) Plant flavonoids: Signal to legume modulation and soil microorganisms. J. Plant Biochem. Biotechnol. 11(1), 1-10. Vega R., Guteierrez M. P., Sanz C., Calvo R., Robredo L. M., de la Cuadra C., Muzquiz M. (1996) Bactericide-like effect of lupin alkaloids. Ind. Crops Prod. 5, 141-148. Verrax J., Buc Calderon P. (2008) The controversial place of vitamin C in cancer treatment. Biochem. Pharmacol. 76(12), 1644-1652. Vieira F. G. K., Borges G. D. C., Copetti C., Amboni R. D. D. C., Denardi F., Fett R. (2009) Physico-chemical and antioxidant properties of six apple cultivars (Malus domestica Borkh) grown in southern Brazil. Sci. Hortic. 122(3), 421-425. Vijver L.P.L., Kardinaal A. F. M., Couet C., Aro A., Kafatos A., Steingrimsdottir L., Amorim Cruz J. A., Moreiras O., Becker W., Amelsvoort J. M. M., Vidal-Jessel S., Salminen I., Moschandreas J., Sigfússon N., Martins I., Carbajal A., Ytterfors A., Poppel G. (2000) Association between trans fatty acid intake and cardiovascular risk factors in Europe: The Transfair study. Eur. J. Clin. Nutr., 54(2), 126-135. Wait R., Gianazza E., Brambilla D., Eberini I., Morandi S., Arnoldi A. Sirtori C. (2005) Analysis of Lupinus albus storage proteins by two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. J Agric. Food Chem. 53, 4599-4606. Wakil S. J. (1961) Mechanism of fatty acid synthesis. J. Lipid Res. 2(1), 1-22. Wakil S. J. (1989) Fatty acid synthase, a proficient multifunctional enzyme. Biochemistry 28(11), 4523-4530. Wang S., Errington S., Yap H. H.: Studies on carotenoids from lupin seeds. 12th International Lupin Conference, Fremantle 2008, 198-202. Wassenberg J., Hofer M. (2007) Lupine-induced anaphylaxis in a child without known food allergy. Ann. Allergy Asthma Immunol. 98(6), 589-590. Weiße K., Brandsch C., Zernsdorf B., Nkengfack Nembongwe G. S., Hofmann K., Eder K., Stangl G. I. (2010) Lupin protein compared to casein lowers the LDL cholesterol:HDL cholesterol-ratio of hypercholesterolemic adults. Eur. J. Nutr. 49, 65-71. Weisshaard B., Jenkins G. I. (1998) Phenylpropanoid biosynthesis and its regulation. Curr. Opin. Plant Biol. 1, 251-257. Weisskopf L., Tomasi N., Santelia D. et al. (2006) isoflavonoid exudation from white lupin roots is influenced by phosphate supply, root type and cluster-root stage. New Physiologist 171, 657-668. Whelan J. (2008) The health imlications of changing linoleic acid intake. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 79, 165-167.
- 93 -
White C. L., Staines V. E., Staines M. V. H. (2007) A review of the nutritional value of lupines for dairy cows. Aust. J. Agric. Res. 58, 185-202. Wink M. (1988) Plant breeding: importance of plant secondary metabolites for protection against pathogens and herbivores. Theor. Appl. Genet. 75, 225-233. Wink M., Hartmann T. (1980) Enzymatic synthesis of quinolizidine alkaloids in lupin chloroplast. Z. Naturforsch. 35c, 93-97. Wink M., Hartmann T. (1982) Localization of the enzymes of quinolizidine alkaloid biosynthesis in leaf chloroplasts of Lupinus polyphyllus. Plant Physiol. 70(1), 74-77. Wink M., Meißner C., Witte L. (1995) Patterns of quinolizidine alkaloids in 56 species of the genus Lupinus. Phytochemistry 38(1), 139-153. Wink M., Wiite L. (1984) Turnover and transport of quinolizidine alkaloids. Diurnal fluctuations of lupanine in the phloem sap, leaves and fruits of Lupinus albus L. Planta 161, 519-524. Wu G., Morris S. M. (1998) Arginine metabolism : nitric oxide and beyond. Biochem. J. 336, 1-17. Xanthopoulou M. N., Fragopoulou E., Kalthara K., Nomikos T., Karantonis H. C., Antonopoulou S. (2010) Antioxidant and anti-inflammatory activity of red and white wine extracts. Food Chem. 120, 665-672. Yokoyama Y., Ozaki O., Sato H. (1996) Separation and determination of amino acids, creatinine, bioactive amines and nucleic acid bases by dual-mode gradient ion-pair chromatography. J. Chromatogr. A 739, 333-342. Yoshida K., Mori M., Kondo T. (2009) Blue flower color development by anthocyanins: from chemical structure to cell physiology. Nat. Prod. Rep. 26, 884-915. Young A. J., Frank H. A. (1996) Energy transfer reactions involving carotenoids: quenching of chlorophyll fluorescence. J. Photochem. Photobiol B: Biol. 36, 3-15. Zamora-Natera F., García-López P., Ruiz-López M., Salcedo-Pérez E. (2008) Composition of alkaloids in seeds of Lupinus mexicanus (Fabaceae) and antifungal and allelopathic evaluation of the alkaloid extract. Agrociencia 42(2), 185-192. Zdunczyk Z., Juskiewicz J., Frejnagel S., Gulewicz K. (1998) Influence of alkaloids and oligosaccharides from white lupin seeds on utilization of diets by rats and absorption of nutrients in the small intestine. Anim. Feed Sci. Technol. 72, 143-154. Zulueta A., Esteve M. J., Frigola A. (2009) ORAC and TEAC assays comparison to measure the antioxidant capacity of food products. Food Chem. 114, 310-316.
- 94 -
12. Použité zkratky AA
Aminokyseliny
AAPH •+
2,2´-azobis(2-methylpropionamid) dihydrochlorid
ABTS
2,2´-azinobis(3-ethyl-2,3-dihydrobenzothiazolin-6-sulfonové kyseliny)
ACP
Protein přenášející acyl
AOC
Antioxidační kapacita
ARA
Kyselina arachidonová
CoA
Koenzym A
DAD
Detektor diodového pole
DGLA
Kyselina dihomo-γ-linolenová
DHA
Kyselina dokosahexaenová
DPPH
2,2-difenyl-1-pikrylhydrazyl
EAA
Esenciální mastné kyseliny
EFA
Esenciální mastné kyseliny
EPA
Kyselina eikosapentaenová
ESI
Ionizace elektrosprejem
FA
Mastné kyseliny
FAME
Methylestery mastných kyselin
FID
Plamenový ionizační detektor
FRAP
Ferric reducing antioxidant power
GC
Plynová chromatografie
HAT
Hydrogen atom transfer
HDL
Lipoproteinové částice s vysokou hustotou
HIV
Virus lidské imunodeficience
HMT/HLTasa
tigloyl-CoA:(2)-13-α-hydroxymultiflorin/(+)-13-α-hydroxylupanin O-tigloyltransferasa
HPLC
Vysokotlaká kapalinová chromatografie
HSV
Herpes simlex virus
IEC
Iontoměničová chromatografie
LDL
Liproteinové částice s malou hustotou
MS
Hmotnostní spektrometrie
MUFA
Mononenasycené mastné kyseliny
NADPH
Nikotinamidadenindinukleotidfosfát
NEAA
Neesenciální mastné kyseliny
ORAC
Oxygen radical absorbance capacity
PEG
Polyethylenglykol
- 95 -
PUFA
Polynenasycené mastné kyseliny
RNS
Reaktivní dusíkové radikály
ROS
Reaktivní kyslíkové radikály
RRF
Relativní responsní faktor
SAFA
Nasycené mastné kyseliny
SET
Single electron transfer
TEAC
Trolox equivalent antioxidant capacity
TF
Celkové flavonoidy
THM
Tepelná hydrolýza a methylace
TMSI
Trimethylsilylimidazol
UPLC
Vysokotlaká kapalinová chromatografie
UV
Ultrafialové záření
- 96 -
