UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI. Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie

Vyšetření paraneoplastických protilátek u vybraných nádorových onemocnění

DIPLOMOVÁ PRÁCE Autor:

Bc. Jan Cmajdálka

Studijní program:

M1406 Biochemie

Studijní obor:

Biochemie

Forma studia:

Prezenční

Vedoucí práce:

Mgr. Lucie Roubalová

Termín odevzdání práce: 2. 5. 2013

Prohlašuji, že jsem uvedenou diplomovou práci vypracoval samostatně pod vedením a odborným dohledem paní Mgr. Lucie Roubalové za použití citované literatury.

V Olomouci dne Jan Cmajdálka

2

Rád bych poděkoval především vedoucí mé diplomové práce Mgr. Lucii Roubalové za odborné vedení a pomoc při vypracování této práce. Poděkování za pomoc během odběru vzorků patří také personálu Oddělení klinické biochemie Fakultní nemocnice Olomouc. Panu RNDr. Davidu Friedeckému, Ph.D. děkuji za pomoc při zpracování fotografií. V neposlední řadě děkuji své rodině za podporu v průběhu celého studia.

3

Bibliografická identifikace:

Jméno a příjmení autora

Bc. Jan Cmajdálka

Název práce

Vyšetření paraneoplastických protilátek u vybraných nádorových onemocnění

Typ práce

Diplomová

Pracoviště

Oddělení klinické biochemie, FN Olomouc

Vedoucí práce


Rok obhajoby práce

2013

Abstrakt Paraneoplastické protilátky jsou orgánově specifické protilátky třídy IgG namířené proti neuronálním antigenům. Tyto antigeny jsou exprimovány buňkami nervové tkáně, ale také buňkami nádorovými. Paraneoplastické neurologické syndromy jsou degenerativní onemocnění centrálního či periferního nervového systému nebo svalové tkáně,

která

vznikají v souvislosti s malignitou bez přímé invaze nádoru.

Paraneoplastické protilátky jsou vysoce specifické markery paraneoplastické etiologie u

pacientů

s

neurologickými

příznaky.

Význam

laboratorního

vyšetření

paraneoplastických protilátek je důležitý pro včasnou detekci kancerogenního procesu a zahájení včasné léčby. K detekci protilátek byla použita imunochemická metoda zvaná imuno-dot-bloting. Cílem práce je stanovení citlivosti metody, porovnání souprav různých výrobců, zavedení metody do rutinní laboratorní praxe, vypracování diskuze a její porovnání s dostupnou literaturou.

Klíčová slova

Paraneoplastické protilátky, anti-Hu, anti-Yo, anti-Ri, antiCV2, anti-Amphiphysin, anti-Ma1/Ma2, paraneoplastické neurologické syndromy

Počet stran

72

Počet příloh

0

Jazyk

Český

4

Bibliographical identification:

Autor’s first name and surname

Bc. Jan Cmajdálka

Title

Determination of paraneoplastic antibodies in selected cancers

Type of thesis

Master

Department

Department of clinical biochemistry, UH Olomouc

Supervisor


The year of presentation

2013

Abstract Paraneoplastic antibodies are organ-specific IgG antibodies againts neuronal antigens. These antigens are expressed by neural tissue cells but also tumor cells. Paraneoplastic neurological syndromes are degenerative diseases of the central or peripheral nervous system or muscle tissue that arise in connection with malignancy without tumor invasion. Paraneoplastic antibodies are highly specific markers of paraneoplastic etiology in patients with neurological symptoms. The laboratory investigation of paraneoplastic antibodies is important in the diagnosis and management of these disorders. Immunochemical method called immuno-dot-blotting was used to determine antibodies. The aim of this thesis is to determine sensitivity of methods, compare sets from different producers, put the method into laboratory practice, create the disccusion and comparison with the available literature.

Keywords

Paraneoplastic antibodies, anti-Hu, anti-Yo, anti-Ri, anti-CV2, anti-Amphiphysin, anti-Ma1/Ma2, paraneoplastic neurological syndromes

Number of pages

72

Number of appendices

0

Language

Czech

5

Obsah 1. Cíle diplomové práce.............................................................................................. 7 2. Teoretická část........................................................................................................ 8 2. 1. Paraneoplastické protilátky ............................................................................... 8 2. 2. Dobře charakteristické paraneoplastické protilátky.......................................... 10 2. 3. Paraneoplastické syndromy ............................................................................ 12 2. 4. Paraneoplastické neurologické syndromy ....................................................... 12 2. 4. 1. Klasické PNS .......................................................................................... 14 2. 4. 2. Neklasické PNS ...................................................................................... 16 2. 4. 3. Diagnóza PNS......................................................................................... 16 2. 4. 4. Výskyt ..................................................................................................... 19 2. 5. Patogeneze PNS ............................................................................................ 19 2. 6. Nádorová onemocnění typická pro PNS.......................................................... 22 2. 6. 1. Nádorové markery................................................................................... 23 3. Praktická část........................................................................................................ 26 3. 1. Chemikálie ...................................................................................................... 26 3. 2. Biologický materiál .......................................................................................... 28 3. 2. 1. Výběr skupin pacientů ............................................................................. 28 3. 3. Metodika měření ............................................................................................. 33 3. 3. 1. Detekce protilátek ................................................................................... 33 3. 3. 2. Princip metody ........................................................................................ 33 3. 4. Ověření citlivosti metody ................................................................................. 35 3. 4. 1. Algoritmus ředícího pokusu pozitivních kontrol........................................ 35 3. 5. Postup analýzy................................................................................................ 36 4. Výsledky ................................................................................................................ 38 4. 1. Ověření citlivosti.............................................................................................. 38 4. 2. Naměřené výsledky - skupina 1 ...................................................................... 40 4. 3. Naměřené výsledky - skupina 2 ...................................................................... 45 5. Diskuse.................................................................................................................. 56 6. Závěr...................................................................................................................... 63 7. Literatura ............................................................................................................... 64 7. 1. Seznam hypertextových odkazů ..................................................................... 70 8. Seznam použitých zkratek ................................................................................... 72

6

1. Cíle diplomové práce Cílem práce bylo zavedení metody detekce paraneoplastických protilátek do rutinní laboratorní praxe na Oddělení klinické biochemie Fakultní nemocnice Olomouc. Součástí zavedení metody je vytvoření SOPVu nebo-li standardního operačního postupu vyšetření. Dále

byla

cílem

práce

detekce

paraneoplastických

protilátek

v

séru

a

v mozkomíšním moku pacientů s neurologickými symptomy bez přítomnosti karcinomu i s různými typy karcinomů. V neposlední řadě bylo cílem práce stanovení citlivosti metody, porovnání souprav různých výrobců a podrobná diskuze výsledků srovnaná s dostupnou literaturou.

-7-

2. Teoretická část 2. 1. Paraneoplastické protilátky Paraneoplastické protilátky jsou orgánově specifické protilátky třídy IgG namířené proti

neuronálním

antigenům.

Tyto

neuronální

antigeny

jsou

exprimovány

neuroektodermální (nervovou) tkání a nádorovými buňkami. Proto jsou tyto protilátky často nazývané jako onkoneurální protilátky (Graus F., et al., 2010). První protilátka byla popsána pány Greenlee a Brashear v roce 1983 u dvou pacientů s nádorem vaječníku a paraneoplastickou cerebelární degenerací metodou imunofluorescenční mikroskopie. Jednalo se o protilátku anti-Yo (PCA-1) (Greenlee J. E. & Brashear H. R., 1983). Podle lokalizace antigenu v nervové buňce se protilátky klasifikují jako nukleární, cytoplazmatické a membránové (Tab. 1) (Iorio R. & Lennon V. A., 2012). Tab. 1: Klasifikace paraneoplastických protilátek Protilátky Nukleární protilátky ANNA-1 (anti-Hu) ANNA-2 (anti-Ri) ANNA-3 AGNA-1 Anti-Ma1/Ma2 Anti-Zic 4 Cytoplazmatické protilátky PCA-1 (anti-Yo) PCA-2 PCA-Tr Anti-Amphiphysin Anti-CRMP-5 (CV2) Membránové protilátky Anti-VGCC N Anti-VGCC P/Q VGKC Anti-AChr Anti-NMDA receptor Anti-AMPA receptor Anti-GABA β Glycin receptor GAD

Antigeny

Molekulová hmotnost (kDa)

HuD,HuC,Hel-N1 NOVA 1, 2 SOX-1 PNMA1, 2 Zic-4

35-40 55 a 80 170 40 a 42 -

CDR2 Amphiphysin CRPM-5

34, 52, 62 280 128 66

VGCC N VGCC P/Q LGI1, CASPR2 Achr NR1 GluR1, 2 GABA β α1 GlyR GAD65

65 a 67

-8-

V roce 2002 byly přezkoumány všechny doposud objevené onkoneurální protilátky a z nich bylo vybráno a definováno šest protilátek jako tzv. dobře charakteristické protilátky (Tab. 2) (Graus F. et al., 2004). Tab. 2: Dobře charakteristické paraneoplastické protilátky Protilátky

Antigeny

Molekulová hmotnost (kDa)

Anti-Hu

HuD, HuC, Hel-N1

35-40

Anti-Yo

CDR2

34, 52, 62

Anti-Ri

NOVA 1, 2

55 a 80

Anti-Ma1/Ma2 (Ta)

PNMA1, 2

40 a 42

Anti-Amphiphysin

Amphiphysin

128

Anti-CV2

CRPM-5

66

Jedná se o protilátky, které jsou typické pro paraneoplastické neurologické syndromy (PNS). Tyto tzv. dobře charakteristické protilátky reagují s intracelulárními antigeny s definovanou molekulovou hmotností. Bývají silně spojeny s nádorovým onemocněním a jsou detekovány u pacientů s dobře definovanými neurologickými syndromy (Graus F. et al., 2004). Existují také tzv. částečně charakteristické protilátky, které se vyskytují pouze u malého počtu pacientů a jejichž cílové antigeny nejsou známy. Jsou to protilátky PCA-Tr, ANNA-3, PCA-2, anti-Zic4, anti-mGluR1 (Beukelaar J. W. & Sillevis Smitt P. A., 2006). Paraneoplastické protilátky jsou vysoce specifické markery paraneoplastické etiologie u pacientů s neurologickými příznaky. Detekce těchto protilátek ulehčuje diagnózu

paraneoplastických

neurologických

syndromů

a

napomáhá

odhalit

preexistující nádorové onemocnění. Protilátky bývají nalezeny u 50-60 % pacientů s PNS (Raspotnig M., et al., 2011). Pořadí výskytu těchto protilátek v rutinním screeningu u pacientů s možnými PNS je anti-Hu ~ anti-CV2 > anti-Yo > anti-Amphiphysin > anti-Ri > anti-Ma2, kdy anti-Hu společně s anti-CV2 protilátkami jsou nejvíce vyskytovanými protilátkami (Monstad S. E. et al., 2009). Všichni pacienti s neurologickými příznaky, jejichž sérum je pozitivní na tyto dobře charakteristické onkoneurální protilátky, by měly být definováni jako pacienti s určitým paraneoplastickým syndromem, bez ohledu na to, jestli mají nebo nemají skrytou malignitu (Gozzard P. & Maddison P., 2011). Ačkoli jsou onkoneurální protilátky často asociované s PNS, mohou být nalezeny také u pacientů s nádorovým onemocněním bez neurologických příznaků (Monstad S. E. et al., 2009). Téměř jedna třetina pacientů s PNS nemá žádné dobře

-9-

charakteristické onkoneurální protilátky. U těchto pacientů se včasná diagnóza nádoru stává problémem, což vede k opožděné nádorové léčbě (Honnorat J., 2006). Paraneoplastické protilátky předpovídají typ nádorového onemocnění mnohem přesněji než neurologické syndromy (Gozzard P. & Maddison P., 2011).

2. 2. Dobře charakteristické paraneoplastické protilátky Anti-Hu (ANNA-1 = Anti-Neuronal Nuclear Antibody) Jde o nejčastější onkoneurální diagnostikovanou protilátku. Název „Hu“ pochází z první slabiky příjmení pacienta, u kterého byly tyto protilátky objeveny. Nejvíce jsou spojovány se subakutní senzitivní neuronopatií (SSN), paraneoplastickou limbickou encefalitidou (PLE) a paraneoplastickou mozečkovou degenerací (PCD). Mezi nejběžnější nádorová onemocnění, které se pojí s protilátkou anti-Hu patří malobuněčný karcinom plic (SCLC), nádory varlat a prostaty mužů. U pacientů s pozitivními anti-Hu protilátkami bývá vzácně nalezen neuroblastom (internet 5). Anti-Hu protilátky rozpoznávají proteiny o velikosti 35-40 kDa, které se nacházejí v cytoplazmě a jádrech všech neuronů (Honnorat J., 2006). Jsou namířené proti neuron-specifickým proteinům HuD, HuC a Hel-N1. HuD proteiny jsou také exprimovány na všech SCLC buňkách (Beukelaar J. W., 2009). Tyto RNA-vázající proteiny se podílejí na post-transkripční regulaci RNA v neuronech (McKeon A. & Pittock S. J., 2011). Pacienti s pozitivními protilátkami anti-Hu jsou obvykle muži v průměrném věku 63 let. Neurologické příznaky u lidí jsou příčinou úmrtí z více než 65 % (Graus G. Et al., 2001). Anti-Yo (PCA-1 = Purkinje cell autoantibodies) Jedná se o protilátky namířené proti Purkyňovým buňkám. Název „Yo“ pochází z prvních dvou písmen příjmení prvního pacienta, u něhož byly protilátky objeveny. Tyto protilátky jsou nejčastěji spojovány s paraneoplastickou mozečkovou degenerací (PCD). Nádorová onemocnění typická pro anti-Yo protilátky jsou karcinom prsu, vaječníku, vejcovodu a karcinom dělohy. Pacienti s pozitivními anti-Yo protilátkami jsou převážně ženy. Antigeny rozpoznané těmito protilátkami jsou 32, 52 a 62 kDa proteiny exprimované v cytoplazmě Purkyňových buněk. Proteiny s molekulovou hmotností 62 kDa jsou navíc exprimovány v mukóze střeva (internet 5). CDR2 (cerebellar degeneration-related protein 2), antigen o molekulové hmotnosti 52 kDa, reguluje DNA transkripci inhibicí cMyc genu (McKeon A. & Pittock S. J., 2011).

- 10 -

Anti-Ri (ANNA-2) Tyto protilátky se nejvíce nacházejí u pacientů s paraneoplastickým syndromem opsoklonus-myoklonus. Pacienti s touto protilátkou mívají nejčastěji nádorová onemocnění jako je SCLC, karcinom prsu, karcinom vaječníku, karcinom dělohy, karcinom děložního hrdla a karcinom močového měchýře (Pittock S. J. et al., 2003, Prestigiacomo C. J. et al., 2001). Jsou namířeny proti antigenům Nova-1 (55 kD) a Nova-2 (80 kD). Tyto antigeny obsahují RNA-vázající domény, které regulují neuronální pre-mRNA. Nova-1 (Neuron oncological ventral antigen-1) je specifický protein, který se podílí na sestřihu premRNA. Tento protein se považuje za cílový antigen u paraneoplastického opsoklonumyoklonu (Knudsen A. et. al, 2006). Nova-1 a nova-2 přispívají k biologické rozmanitosti prostřednictvím regulace alternativního sestřihu neuronálních transkriptů kódující synaptické proteiny. Protilátky anti-Ri se nacházejí v jádrech všech neuronů v CNS (Honnorat J., 2006). Jsou exprimovány také buňkami SCLC (McKeon A. & Pittock S. J., 2011). Pacienti s pozitivními protilátkami anti-Ri jsou převážně ženy. Muži s pozitivními protilátkami anti-Ri se nacházejí vzácně (Heeyoung K. et al., 2009). Anti-Ma1/Ma2 (Ta) Protilátky anti-Ma1/Ma2 jsou asociovány s paraneoplastickou limbickou encefalitidou spojenou s výskytem zárodečného tumoru varlete (Honnorat J., 2006). Ve spojení s PNS ovlivňují především střední spánkové laloky, mezimozek, mozkový kmen a mozeček. Tyto protilátky jsou namířené proti antigenům Ma1 (PNMA1) a Ma2 (PNMA2) o molekulové hmotnosti 40 a 42 kDa. Funkce Ma proteinů je zatím neznámá. Jsou lokalizované v jadérku a ostatních malých strukturách, kde jsou koncentrovány ribonukleoproteiny a ribosomální proteiny, a proto se spekuluje, že Ma proteiny hrají roli v RNA transkripci (McKeon A. & Pittock S. J., 2011). Pacienti s pozitivními protilátkami anti-Ma2 jsou obvykle muži ze 78 % s nádorem varlete. Pacienti pozitivní na protilátky anti-Ma1 a anti-Ma2 jsou častěji ženy, které mají z 82 % nádor prsu, tlustého střeva nebo vaječníku. Protilátky anti-Ma1 a anti-Ma2 jsou exprimovány jak nervovým systémem, tak i nádory. Protilátky anti-Ma1 jsou také exprimovány zdravými varlaty (Rosenfeld M. R. et al., 2001). Anti-Amphiphysin Protilátky anti-Amphiphysin byly poprvé objeveny u pacientů se stiff-person syndromem. Tyto protilátky byly také pozorovány u pacientů s paraneoplastickou encefalomyelitidou a senzorickou neuropatií. Nádorová onemocnění typická pro tuto protilátku jsou SCLC, karcinom prsu a karcinom vaječníku (Honnorat J., 2006).

- 11 -

Tyto protilátky rozpoznávají 128 kDa antigeny exprimované v synaptických vehiklech mozečku. Pacienti s pozitivními protilátkami anti-Amphiphysin jsou převážně ženy (McKeon A. & Pittock S. J., 2011). Anti-CV2 (CRMP-5) Protilátky anti-CV2 byly poprvé objeveny u pacientů s mozečkovým syndromem a s periferní neuropatií (Antoine J. C. et al., 1993). Název „CV2“ pochází z iniciál pacienta, u kterého byly prvně objeveny tyto protilátky, jehož vzorek séra byl označen číslem 2 (Honnorat J. et al., 1998). Tyto protilátky se nacházejí převážně u pacientů s polyneuropatií

a

mozečkovou

degenerací.

Dále

se

nacházejí

u

pacientů

s encefalitidou, encefalomyelitidou, retinopatií, optickou neuritidou a choreou. Z 60 % jsou protilátky anti-CV2 asociovány s SCLC. Další nádorová onemocnění pojící se s těmito protilátkami jsou maligní thymom a děložní sarkom (Honnorat J., 2006) Anti-CV2 protilátky rozpoznávají cytoplazmatické proteiny o velikosti 66 kDa., které jsou exprimované mozečkem a buňkami v bílé hmotě mozkové (Rogemond V. & Honnorat J., 2000, Honnorat J. et al., 1996). Pacienti s protilátkami anti-CV2 jsou ze 70 % mužského pohlaví ve věku kolem 62 let (Honnorat J., 2006). Často se vyskytují po boku protilátek anti-Hu (Honnorat J. et al., 2012).

2. 3. Paraneoplastické syndromy Paraneoplastické syndromy jsou heterogenní skupinou symptomů a funkčních poruch u pacientů s maligním tumorem. Tyto poruchy vznikají sekrecí hormonů, peptidů či cytokinů nádorovými tkáněmi nebo v důsledku imunologické reaktivity maligních a normálních tkání. Projevy těchto syndromů se vyskytují spíše na vzdálených místech než v místě nádoru či jeho metastází (internet 5). Paraneoplastické syndromy se mohou vztahovat k různým orgánovým systémům, přičemž

nejčastější

jsou

endokrinologické,

neurologické,

dermatologické,

revmatologické nebo hematologické (internet 14). Paraneoplastické syndromy slouží jako časný indikátor maligní choroby, neboť se vyskytují v raných stadií nádorů. Proto je kladen důraz na včasnou diagnostiku a terapii (internet 5).

2. 4. Paraneoplastické neurologické syndromy Paraneoplastické

neurologické

syndromy

jsou

degenerativní

onemocnění

centrálního nebo periferního nervového systému nebo svalové tkáně, která vznikají v souvislosti s malignitou bez přímé invaze nádoru (internet 5). Paraneoplastické jsou

- 12 -

nazývány proto, že neurologické příznaky nejsou výsledkem invaze tumoru či jeho metastázy, chemoterapie, radioterapie, malnutrice ani oportunní infekce. Vznikají postižením různých struktur nervového systému patologickým procesem s přítomností charakteristických protilátek proti centrálním nebo periferním neuronovým antigenům (Nestrašil I., 2005). První popis PNS se datuje do 19. století a byl popsán francouzským lékařem M. Auche, který v roce 1890 popsal zapojení periferního nervového systému u pacientů s nádorovým onemocněním (Auche M., 1890). Většina PNS má subakutní a progresivní průběh. PNS mohou být nerozeznatelné od obvyklých neurologických onemocnění (Vernino S., 2006). Subakutní progresivní klinický průběh a těžké postižení je typické pro PNS. Avšak nízká progrese, relaps nebo benigní průběh neurologických onemocnění nevylučuje diagnózu PNS (Honnorat J., 2006). PNS se vyskytují izolovaně nebo v asociaci. PNS jsou obvykle rozděleny podle Posnerovy klasifikace (Tab. 3). Některé syndromy jsou definované jako tzv. klasické syndromy, protože jejich přítomnost silně nasvědčuje skrytému nádoru. Ostatní syndromy jsou definované jako tzv. neklasické syndomy, neboť nejsou asociovány s nádory v takové míře jako klasické syndromy (Gozzard P. & Maddison P., 2011). Tab. 3: Posnerova klasifikace PNS Nejvíce vyskytované skryté nádory

Syndromy

Detekované protilátky

Klasické PNS Paraneoplastická encefalomyelitida

anti-Hu, antiAmphiphysin, anti-CV2

SCLC

anti-Hu, anti-Ma2, antiCV2, anti-Amphiphysin

SCLC, karcinom varlat, prsu

Limbická encefalitida

Paraneoplastická anti-Yo, anti-CV2, antimozečková degenerace Ri, anti-Hu, anti-Ma

SCLC,karcinom prsu, dělohy, vaječníku, vejcovodu

Senzorická neuropatie

SCLC, karcinom prsu, vaječníku

anti-Hu, anti-CV2, antiAmphiphysin

Opsoklonus-myoklonus anti-Ri, anti-Hu syndrom

SCLC, karcinom prsu, dělohy, vaječníku, vejcovodu

Neklasické PNS Encefalitida mozkového anti-Hu, anti-Ri, anti-Ma2 karcinom prsu, dělohy, kmene vaječníku, vejcovodu, varlat a SCLC Stiff-person syndrom

anti-Amphiphysin

- 13 -

karcinom prsu

2. 4. 1. Klasické PNS Termín klasické PNS platí pro ty neurologické syndromy, které se často pojí s nádorovým onemocněním. Diagnóza klasických PNS by měla být podnětem pro vyšetření okultního nádoru bez ohledu na status protilátek. Pokud je nalezen nádor méně typický pro konkrétní PNS, je doporučeno hledání více typického nádoru (Graus F. et al., 2004). Paraneoplastická cerebelární degenerace (PCD) Jde o nejčastěji se vyskytující paraneoplastický syndrom v CNS. Je spojena s karcinomem prsu, SCLC a gynekologickými malignitami, jako je karcinom dělohy, vaječníku nebo vejcovodu. Převážně postihuje ženy v průměrném věku 61 let (Vedeler C. A. et al., 2006). U pacientů jsou detekovány především protilátky anti-Yo. Dále antiHu, anti-Tr, anti-Ri, anti-CV2, anti-Ma. Bylo nalezeno 9 různých specifických protilátek a více než 5 typů nádorového onemocnění, které se pojí s PCD (Vernino S., 2006). PCD je nejčastěji spojována s Yo protilátkami, které jsou namířené proti proteinu CDR2 (Touland S. et al., 2011). Protilátky přítomné v séru jsou ve vysokých titrech. Vysoké titry jsou ale i v mozkomíšním moku, což ukazuje na intratekální syntézu (internet 5). U pacientů, kteří mají vysoký předpoklad pro syndrom PCD, je proto vhodné vyšetřit i mozkomíšní

mok.

Neurologické

příznaky

předchází

diagnóze

nádorového

onemocnění z 65 % případů. Málokdy se pojí s jinými PNS. V současné době není stanovena žádná standardní léčba pro PCD (Ogita S., 2008). Příznaky a symptomy zahrnují nestabilní nebo zhoršenou chůzi, nedostatek svalové koordinace v končetinách, neschopnost udržet pozici trupu, závratě, nevolnost, zvracení, nedobrovolné pohyby očí, dvojité vidění, potíže s mluvením nebo obtíže při polykání (internet 1). Znakem PCD je také rozsáhlá ztráta Purkyňových buněk, které můžou být spojené se zánětem v mozečkové kůře (Dalmau J. & Rosenfeld M. R., 2008). Paraneoplastická limbická encefalitida (PLE) Termín limbická encefalitida zavedl v roce 1986 Corsellis u skupiny pacientů se subakutní encefalopatií doprovázející nádorové onemocnění. Nejčastěji detekovanými protilátkami jsou anti-Hu, anti-Ma2, anti-Amphiphysin a anti-CV2. Je asociována s SCLC, terminálním tumorem varlete a výjimečně s karcinomem prsu (Krýsl D., 2012). Protilátky jsou nalézané jak v séru, tak i v mozkomíšním moku, a to u 60 % pacientů s PLE. (Vedeler C. A. et al., 2006). PLE postihuje muže i ženy všech věkových kategorií. Jde o zánět postihující oblast mozku známou jako limbický systém, který řídí emoce, chování a některé paměťové funkce. Hlavním klinickým příznakem je subakutně rozvinutá porucha paměti a epileptické záchvaty (Krýsl D., 2012). Pacienti s LE mívají

- 14 -

také vizuální a sluchové halucinace nebo paranoidní posedlost. Pro tyto pacienty je obvyklá i deprese a úzkost (Vedeler C. A. et al., 2006). Paraneoplastická encefalomyelitida (PEM) Nádorové onemocnění typické pro PEM je SCLC. V séru a mozkomíšním moku většiny pacientů jsou nalézány protilátky anti-Hu. PEM postihuje muže i ženy v průměrném věku 63 let (Graus F. et al., 2001). Méně frekventované protilátky u PEM jsou protilátky anti-CV2 a anti-Amphiphysin. PEM býva často doprovázena klinickými syndromy PCD, PLE a subakutní senzorickou neuropatií (SSN) (internet 2). Projevuje se postižením více oblastí nervového systému se známkami zánětu v mozku, mozkovém kmeni, míše, gangliích zadních míšních kořenů a nervových kořenech (internet 5). Patologicky je charakterizována ztrátou neuronů a zánětlivými infiltráty v konkrétních oblastech nervové soustavy. Klinické propuknutí je subakutní a obvykle způsobuje závažné neurologické dysfunkce (Graus F. et al., 2001). Subakutní senzorická neuropatie (SSN) SSN se nejčastěji pojí s protilátkami anti-Hu. Tyto protilátky nalézáme v séru i mozkomíšním moku většiny SSN pacientů. SSN postihuje muže i ženy všech věkových kategorií. Protilátky anti-CV2 a anti-Amphiphysin jsou nalézány v menším měřítku u SSN pacientů (Honnorat J. & Antoine J. Ch., 2007). SCLC je nejčastěji se vyskytující nádor u SSN pacientů (Dalmau J. et al., 1992). Neuropatie je nezánětlivé poškození funkce a struktury periferních nervů. Senzorická neuropatie je charakterizována primárním poškozením senzorických nervů předních míšních kořenů. Pacienti mají zpočátku asymetrické a bolestivé neuropatie, které se vyvíjejí do úplné ztráty propriocepce (Voltz R., 2002). Jde o postižení nervů, které přenášejí zprávy z kostí, kůže a svalů do mozku. Ovlivňuje především smysly, a to nejčastěji v horních a dolních končetinách (internet 3). Opsoklonus-myoklonus (OMS) Nádorová onemocnění typická pro OMS jsou karcinom vejcovodu, dělohy a vaječníku s detekovanými protilátkami anti-Ri. Dále mezi nádorová onemocnění typická pro OMS patří SCLC. Žádné protilátky u dospělých OMS pacientů s SCLC zatím ale nebyly nalezeny (Sabater L. et al., 2008). Existují případy, kdy se objevily u OMS pacientů i protilátky anti-Ma2 (Wong A. et al., 2001). OMS postihuje muže i ženy v průměrném věku 66 let (Beukelaar J. W. & Sillevis Smitt P. A., 2006). OMS způsobuje rychlé, nepravidelné pohyby očí (opsoklonus) a mimovolní, chaotické svalové záškuby (myoklonus) v končetinách a trupu. Často se projevuje u dětí s neuroblastomem. Až 50 % dětí s opsoklonem-myoklonem má neuroblastom (Beukelaar J. W. & Sillevis Smitt P. A., 2006). U dospělých dochází také k poškození mozkového kmene, projevuje se periferní neuropatie, svalová rigidita a svalové

- 15 -

spasmy (internet 5). OMS je vzácná porucha, která se vyznačuje rychlým pokrokem příznaků

včetně

závratě,

nevolností

a

zvracením

následovaná

opsoklonem,

myoklonem, ataxií a encefalopatií (Brieva-Ruíz L. et al., 2008). 2. 4. 2. Neklasické PNS Encefalitida mozkového kmene Encefalitida mozkového kmene se může vyskytovat ve spojitosti s různými nádory, jejichž společným patologickým znakem je ztráta neuronů a perivaskulární zánětlivé infiltráty. Nádory vejcovodu, vaječníku, dělohy, prsu, varlat a SCLC jsou nejčastěji se vyskytující nádory u tohoto syndromu. Bývá v kombinaci s OMS a PLE. Často také bývá zaměňována s rhomboencefalitidou (Jubelt B. et al., 2011). Detekované protilátky u toho syndromu jsou anti-Hu, anti-Ma2 a anti-Ri. Mezi klinické příznaky patří pohledová obrna, porucha řeči, diplopie, centrální spánková apnoe, závratě a ataxie (Voltz R., 2002). Stiff-person syndrom Je autoimunitní CNS porucha charakterizována progresivní těžkou svalovou ztuhlostí postihující převážně páteř a nohy. To může způsobit také bolestivé svalové křeče (Squintani G. et al., 2012). V séru a mozkomíšním moku se nacházejí protilátky proti amphiphysinu v kombinaci s nádorem prsu. (Butler M. H. et al., 2000). 2. 4. 3. Diagnóza PNS Před určením diagnózy PNS musejí být všechny ostatní různé diagnózy vyloučeny. Klinické příznaky nejsou nikdy patognomické (charakteristické pro určitou chorobu) pro paraneoplastickou etiologii, ale vysoký index klinického podezření je velice důležitý. Příznaky mohou být atypické, psychiatrické nebo dokonce kolísavé. Detekce dobře charakteristických paraneoplastických protilátek je velmi užitečná, protože dokazuje paraneoplastickou etiologii neurologických syndromů. Jelikož mohou být různé protilátky spojeny se stejnými klinickými nálezy a stejně tak stejné protilátky mohou být spojeny s různými klinickými nálezy, měly by se paraneoplastické protilátky hledat především screeningem než soustředěním se na specifické protilátky (Graus F. et al., 2004, Beukelaar J. W. & Sillevis Smitt P. A., 2006 ). Pokud je paraneoplastická diagnóza potvrzena nebo je na ni podezření, je nezbytné zahájit rychlé hledání nádoru. Jelikož se PNS rozvíjejí v časných stádií nádorového onemocnění, může být toto hledání dost obtížné (Beukelaar J. W. & Sillevis Smitt P. A., 2006). PNS mohou být diagnostikovány i u pacientů s negativními výsledky na všechny známé onkoneurální protilátky. Pacienti s podezřelými neurologickými příznaky bez

- 16 -

pozitivity onkoneurálních protilátek v séru by měli být i přesto důkladně vyšetřeni na okultní malignitu (Gozzard P. & Maddison P., 2011). Určení diagnózy PNS je často složité. Jeden z důvodů je přítomnost PNS před klinicky ověřenou malignitou. Dalším důvodem je absence klinického obrazu a absence zobrazení včetně laboratorních abnormalit, které jsou typické pro PNS. K dosažení časné diagnózy je třeba kombinovat klinická a laboratorní hodnocení. Systematické příznaky jako jsou anorexie, ztráta váhy, horečka, únava a poruchy chuti, napomáhají určit diagnózu PNS stejně jako rodinná anamnéza nádorového onemocnění (Kannoth S., 2012). PNS by měly být brány v úvahu při diferenciální diagnóze neurologických syndromů, ať už se jedná o vyšší či nižší pravděpodobnost (Voltz R., 2002). PNS jsou definovány přítomností nádorového onemocnění a zároveň vyloučením ostatních známých příčin neurologických příznaků. Existují kritéria, která oddělují skutečné PNS od neurologických syndromů vyskytujících se náhodně s nádorovým onemocněním (Santillan A. & Bristol R. E., 2006). Na základě těchto kritérií se PNS dělí na tzv. definitivní a možné PNS.

Definitivní PNS: 1) klasické syndromy s nádorovým onemocněním diagnostikovaným do 5 let od rozvoje neurologických symptomů 2) neklasické syndromy, který se významně zlepšují po léčbě nádoru bez doprovázející imunoterapie 3) neklasické syndromy diagnostikovány s nádorovým onemocněním do 5 let od rozvoje neurologických symptomů a s pozitivními neuronálními protilátkami 4) neurologické syndromy (klasické i neklasické) bez nádorového onemocnění s dobře charakteristickými neuronálními protilátkami (anti-Hu, anti-Yo, anti-Ri, anti-Ma2, anti-CV2, anti-Amphiphysin)

Možné PNS: 1) klasické syndromy s vysokým rizikem nádorového onemocnění bez neuronálních protilátek 2) neurologické syndromy (klasické i neklasické) bez nádorového onemocnění s částečně charakteristickými neuronálními protilátkami 3) neklasické syndromy diagnostikovány s nádorovým onemocněním do 2 let od rozvoje neurologických symptomů bez neuronálních protilátek (Dalmau J. & Rosenfeld M. R., 2008)

- 17 -

Pro rozdělení PNS na definitivní a možné se v klinické praxi používá schéma uvedené na Obr. 1.

Klasické PNS

Pozitivní dobře charakteristické neurální protilátky

Vysoké riziko nádoru

Definitivní

Pozitivní částečně charakteristické protilátky

Negativní neuronální protilátky

Nádor diagnostikován do 5 let

Možné

Definitivní

Možné

Neklasické PNS

Přítomnost nádoru

Zlepšení nádorové terapie

Definitivní

Pozitivní dobře charakteristické neurální protilátky

Pozitivní částečně charakteristické protilátky


Definitivní

Definitivní

Negativní neuronální protilátky


Možné

Obr. 1: Schéma počátečního diagnostického přístupu PNS

- 18 -

Možné

2. 4. 4. Výskyt Přesný výskyt a rozšíření těchto poruch je neznámé. Výskyt těchto poruch se mění v závislosti na neurologickém syndromu a v závislosti na nádorovém onemocnění (Beukelaar J. W., 2006). PNS jsou považované za vzácný klinický stav. Celkově se odhaduje, že 0,5 - 1 % všech pacientů s nádorovým onemocněním má klinicky způsobující PNS (Kannoth S., 2012). Výskyt nádorového onemocnění se liší podle neurologické poruchy od 5 do 60 %. U 80 % pacientů PNS předchází diagnóze nádorového onemocnění několik měsíců až několik let. Většina nádorových onemocnění je diagnostikována do 4-6 měsíců a riziko rozvoje těchto onemocnění značně klesá po 2 letech a stává se velmi nízké po 4 letech (Honnorat J., 2006). Převaha PNS u dětí je neznámá. Nejběžnější PNS u dětí jsou opsoklonusmyoklonus, limbická encefalitida (Wells E. M., 2011). Některé výzkumy tvrdí, že přibližně 1 pacient z 10 000 pacientů s nádorovým onemocněním má PNS (Dalmau J. & Rosenfeld M. R., 2008).

2. 5. Patogeneze PNS Jak je obecně známo, nádorové buňky vznikají během našeho života v našem těle neustále. Většina těchto nádorových buněk je ovšem destruována pomocí imunitního systému. Za eliminaci nádorových buněk je zodpovědná tzv. specifická imunitní odpověď, která je zprostředkovaná T-lymfocyty a B-lymfocyty. Přechod mezi nespecifickou a specifickou imunitou tvoří dendritické buňky. Tyto buňky patří mezi buňky označované jako buňky APC (antigen-presenting cells), tedy buňky prezentující antigen. Dendritické buňky jsou schopné fagocytovat nádorové buňky. Po pohlcení nádorových buněk dendritické buňky migrují do lymfatických uzlin, kde tyto onkoantigeny prezentují pomocí HLA komplexu I. a II. třídy specifickým CD8+ a CD4+ T-lymfocytům. Tím dochází k aktivaci T-lymfocytů (Hořejší V. & Bartůňková J., 2009). T-lymfocyty jsou buňky schopné rozpoznávat nádorové buňky prostřednictvím svých povrchových receptorů (TCR). Důležitou součástí T-lymfocytů jsou povrchové molekuly CD4+ a CD8+. T-lymfocyty, které mají na svém povrchu molekuly CD4+, jsou označované jako pomocné T-lymfocyty (TH). CD4+ TH-lymfocyty rozpoznávají antigeny, které jsou prezentovány HLA molekulami II. třídy. Vylučováním cytokinů stimulují imunitní reakci a pomáhají ostatním buňkám. Hlavně podporují aktivaci a proliferaci CD8+ TC-lymfocyty a stimulaci B-lymfocytů. T-lymfocyty s povrchovými molekulami CD8+ jsou označované jako cytotoxické T-lymfocyty (TC). CD8+ TC-lymfocyty reagují s antigenem, který prezentují HLA molekuly I. třídy. Úkolem CD8+ TC-lymfocytů je rozpoznání nádorové buňky a její následné zničení.

- 19 -

B-lymfocyty stejně jako T-lymfocyty mají schopnost rozpoznávat nádorové buňky prostřednictvím svých povrchových receptorů (BCR). Po rozpoznání cizorodých antigenů exprimovaných nádorovou buňkou jsou schopné B-lymfocyty diferencovat v plazmatické buňky, které produkují velké množství protilátek. Tyto protilátky mají stejnou specifitu jako receptor mateřského B-lymfocytu, a tudíž se váží na stejný antigen. Napomáhají tak jeho opsonizaci a umožňují dalším buňkám imunitního systému, aby ho snáze nalezly a zneškodnily (Hořejší V. & Bartůňková J., 2009). Na základě studií bylo zjištěno, že podstata vzniku PNS spočívá v autoimunitní patologické reakci (Kannoth S., 2012). Autoimunita je schopnost imunitního systému rozpoznat antigeny vlastních tkání a reagovat s nimi. Jde o fyziologický jev, který se uplatňuje v homeostatických mechanismech. Eliminuje staré, poškozené, apoptické či jinak pozměněné buňky vlastního těla. Pokud autoimunitní reakce vede k poškození tkání, hovoří se o autoimunitních onemocnění (Hořejší V. & Bartůňková J., 2009). Imunohistopatologická analýza tkání a experimentální studie ukazují, že CD8+ TClymfocyty jsou zodpovědné za vznik PNS (McKeon A. & Pittock S. J., 2011). Tyto CD8+ TC-lymfocyty jsou schopné přecházet přes hematoencefalickou bariéru, která odděluje vnitřní prostření mozku od cévního systému. Tato bariéra za fyziologických podmínek brání vstupu lymfocytů a dalších buněk imunitního systému do nerovové soustavy. Přítomností nádorových buněk ovšem dochází ke snížení její integrity, a lymfocyty tak mohou procházet do nerovové tkáně (Compston A. & Coles A., 2002). V mozku CD8+ TC-lymfocyty napadají nerovové buňky a poškozují je (Darnell R. B. & Poster J. B., 2003). Tyto nervové buňky exprimují za fyziologických podmínek identické antigeny jako nádorové buňky, a proto jsou nervové buňky napadány CD8+ TC-lymfocyty (Carpentier A. F. et al., 1998). Destrukcí nervových buněk dochází ke vzniku PNS (Obr. 2) (Darnell R. B. & Poster J. B., 2003). Role protilátek v patogenezi PNS je stále nejasná. I plazmatické buňky přecházejí přes hematoencefalickou bariéru. Spolu s nimi přecházejí i CD4+ TH-lymfocyty, které stimulují B-lymfocyty k produkci specifických protilátek. Tyto protilátky jsou namířené proti intracelulárním antigenům, ale nedokáží je rozpoznat, neboť fragmenty neuronových antigenů jsou prezentovány prostřednictvím HLA komplexu třídy I. pouze CD8+ TC-lymfocytům. Tyto protilátky se tedy nepodílejí na patogenezi PNS a slouží zde pouze jako diagnostické markery (McKeon A. & Pittock S. J., 2011). Existují studie, které tvrdí, že se protilátky namířené proti intracelulárním antigenům nepodílejí na patogenezi PNS. Ovšem existují i studie, které toto tvrzení vyvrací. Byla provedena řada pokusů, kdy se pasivně přenášely protilátky od pacientů s PNS do zvířete s cílem navodit u zvířat neurologické poškození. Stejně tak se prováděla i aktivní imunizace na zvířecích modelech. Všechny tyto pokusy byly neúspěšné

- 20 -

(Roberts W. K. & Darnell R. B., 2004). Nedávné studie ovšem ukazují, že protilátky anti-Amphiphysin od pacientů s paraneoplastickým stiff-person syndromem navodili neurologické poškození u laboratorních krys (Raspotnig M. et al., 2011). Proto je role intracelulárních protilátek v patogenezi PNS stále záhadou. Patogenetická role je připisována membránovým protilátkám, které jsou namířené proti membránovým antigenům. Po vytvoření komplexu antigen-protilátka dojde ke spuštění mechanismu ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity), který vede k degradaci nervových buněk (Beukelaar J. W. & Sillevis Smitt P. A., 2006). Známkou těchto poruch, které potvrzují diagnózu, je vysoký titr onkoneurálních protilátek v séru a mozkomíšním moku pacientů. Přítomnost vysokého titru protilátek u pacientů poskytuje počáteční důkaz patologické podstaty pro patogenezi onemocnění (Roberts W. K. & Darnell R. B., 2004). Geny pro onkoneurální antigeny nejsou mutovány v nádorových buňkách, a proto PNS nemohou být připisovány mutacím v genech kódujících tyto antigeny (Darnell R. B. & Poster J. B., 2003).

Obr. 2: Mechanismus patogeneze

- 21 -

2. 6. Nádorová onemocnění typická pro PNS Jedná se o nádorová onemocnění, která se vyskytují u pacientů s PNS nejčastěji. Malobuněčný plicní karcinom (SCLC) SCLC je nejagresivnější forma nádorového onemocnění plic, typická pro kuřáky (Jackman D. M & Johnson B. E., 2005). U 95 % kuřáků se rozvíjí SCLC (Brownson R. C. et al., 1992). Klinicky a histologicky se liší od všech jiných typů nádorů plic. Jeho patologické rysy byly poprvé rozpoznány v roce 1926 panem W. G. Bernardem (Barnard W., 1926). Právě on popsal SCLC jako nádor odlišný od jiných typů plicních nádorů. Protože mu maligní buňky připomínaly zrnka ovsa, pojmenoval je jako „oat cells“. Proto bývá SCLC nazýván jako „karcinom ovesných buněk“. SCLC tvoří 2025 % všech plicních nádorů (internet 6). Jde o nejčastěji se vyskytující karcinom u PNS (Titulaer M. J. et al., 2011). U pacientů s tímto karcinomem nalézáme téměř všechny dobře charakteristické onkoneurální protilátky. Ovšem nejčastěji se pojí s protilátkou anti-Hu a anti-CV2. Stejně tak se nachází u celé řady PNS. Karcinom prsu Karcinom prsu je nejčastějším zhoubným nádorem diagnostikovaným u žen. Ročně tímto karcinomem onemocní více než půl milionu žen na světě. Prsní nádory jsou příčinou úmrtí u 3,6 % žen naší populace. Karcinom prsu postihuje převážně ženy kolem věku 40 let. V poslední letech se objevují pacientky mladší 35 let. V malém procentu se vyskytuje i u mužů. Karcinomem prsu jsou označovány různé histologické formy maligních nádorů vznikajících z epiteliálních buněk mléčné žlázy. Tyto maligní buňky, které infiltrují prsní žlázu, se můžou dostávat do okolních struktur a vytvářet vzdálené metastáze. Nejčastěji bývá postižen horní zevní kvadrant (47 %), dále horní vnitřní kvadrant (14 %), dolní zevní kvadrant (7 %) a dolní vnitřní kvadrant (2 %) (internet 15). Onkoneurální protilátky typické pro karcinom prsu jsou anti-Yo, anti-Ri a antiAmphiphysin. Z PNS se u karcinomu prsu vyskytují ty, které jsou v asociaci s těmito protilátkami. Karcinom vaječníku a vejcovodu Tyto nádory představují cca 15 % všech zhoubných novotvarů u žen. Postihují ženy převážně ve věku mezi 50 a 75 lety. Biologické chování karcinomů vaječníků a vejcovodů je velice podobné, proto jsou uváděny spolu (internet 7). Karcinom vaječníku Karcinom vaječníku se u žen vyskytuje se po 50. roce života a představuje až 70 % všech maligních nádorů vaječníku (internet 9).

- 22 -

Nádory vaječníku jsou nejčastěji děleny do skupin podle jejich histogeneze, kdy největší skupinu zaujímají epitelové nádory, které představují 90 % všech ovariálních nádorů (internet 13). Příčina vzniku nádoru vaječníku není známa. Významná role se připisuje vlivu ženských pohlavních hormonů a jejich vlivu na dozrávání vajíčka. Existují i dědičné formy nádorů ovaria, které jsou způsobeny mutací genů BRCA-1 a BRCA-2 (internet 7). Karcinom dělohy Karcinom dělohy tvoří přes 40 % gynekologických zhoubných nádorů (internet 8). Nejčastěji se setkáváme s nádorem děložního hrdla. Tento nádor postihuje ženy kolem 50. roku života, ale bývá nalézán také u žen ve věku 20-30 let. Hlavní příčinou vzniku zhoubného nádoru děložního hrdla je infekce jeho epitelu způsobená jedním z typů lidských papilomaviru HPV (human pailloma virus) (internet 11). Karcinom varlat Karcinom varlat je nejčastějším nádorovým onemocněním u mužů ve věkové skupině 15-35 let. V drtivé většině případů jde o nádory, které vznikají z transformované zárodečné buňky. Mluví se tedy o zárodečných (germinálních) nádorech varlat. Nádory varlat patří v současnosti mezi léčitelná nádorová onemocnění u vysokého procenta případů (95 %) (internet 12). 2. 6. 1. Nádorové markery Nádorové markery jsou látky převážně bílkovinné povahy produkované maligními buňkami nebo organizmem jako odpověď na nádorové bujení. Laboratorně jsou prokazatelné v biologických tekutinách nebo v tkáních. Pomocí nádorových markerů můžeme prokázat riziko vzniku, přítomnost, prognózu nádorového onemocnění a účinnost/neúčinnost nádorové léčby. Následující nádorové markery jsou markery, které se vyskytují v různé míře u výše uvedených nádorových onemocnění. Uvedené referenční hodnoty jsou pouze orientační a pro každý typ nádorového onemocnění nebo v různém stádiu léčby je zvýšení jinak signifikantní. CA 15-3 Nádorový marker CA15-3 je antigen polymorfního epiteliálního mucinu, nazývaný rovněž MUC1. Tento marker je syntetizován v epiteliálních buňkách vývodu mléčné žlázy, slinných žláz a bronchů. Zvýšené hodnoty nalézáme především u nemocných s maligními nádory prsu. Referenční hodnota:

35 kU/l

- 23 -

CA 125 Nádorový marker CA 125 je heterogenní glykoprotein s vysokým obsahem sacharidů. Je produkován fetálními epiteliálními tkáněmi coelomového původu. V dospělosti může být v omezené míře syntetizován v epitelu normální tkáně vejcovodů, bronchů, cervixu. Zvýšené hodnoty nalézáme především u nemocných s maligním onemocněním vaječníku. Dále také u karcinomu dělohy, prsu, děložní sliznice a plic. Referenční hodnota:

35 kU/l

CA 72-4 Nádorový marker CA 72-4 je antigen definovaný jako epitop mucinu. Zvýšené hodnoty nalézáme především u nemocných s adenokarcinomem žaludku, tlustého střeva, pankreasu, žlučových cest, ale také u nádorů mléčné žlázy a vaječníku. Referenční hodnota:

7 kU/l

CA 19-9 Nádorový antigen CA 19-9 se vyskytuje jako glykolipid ve tkáni nebo jako mucin v séru. Ačkoli je tento antigen charakteristický spíše pro karcinomy tlustého střeva, konečníku, žaludku, jater a pankreatu, může se vyskytovat i u karcinomů prsu nebo vaječníku. Referenční hodnota:

39 kU/l

CEA (karcinomembryonální antigen) Nádorový marker CEA je onkofetální glykoprotein s vysokým obsahem sacharidů. Za fyziologických podmínek je produkován ve vyvíjejícím se embryu. V dospělosti je omezeně syntetizován epiteliálními buňkami střevní sliznice, žaludku a bronchů. CEA je nejznámějším a nejvýznamnějším nádorovým markerem. Zvýšené hodnoty nalézáme především u nemocných s kolorektálním nádorem, nádorem žaludku, prsu a jater. Referenční hodnota:

5 µg/l

NSE (neuron specifická enolasa-EC 4.2.1.11) Nádorový

marker

NSE

je

glykolytický

enzym

přítomný

ve

tkáních

neuroektodermálního původu, v seminomech a adenokarcinomech ledvin. Ve zdravém organismu se vyskytuje především v neuronech. Vysoké hodnoty NSE markeru nacházíme především u pacientů s SCLC a neuroblastomem. Referenční hodnota:

17 µg/l

SCC (antigen skvamozních buněk) Tento antigen patří k tumor-asociovaným nádorovým antigenům. Je vhodný především pro monitoring nemocných s karcinomem plic, cervixu, hlavy a krku. Referenční hodnota:

1,7 µg/l

- 24 -

TPA (tkáňový polypeptidový antigen) Nádorový marker TPA je proliferační nádorový antigen jehož struktura odpovídá směsi fragmentů cytokeratinů. TPA je vhodný univerzální nádorový marker pro dlouhodobé sledování a monitoring nemocných s karcinomy plic, cervixu, močového měchýře a dalších. Byl prokázán ve většině karcinomů. Referenční hodnota:

75 U/l

HE4 Nádorový marker HE4 je nedávno objevený marker, který byl poprvé detekován v epitelu distálního nadvarlete. Vykazuje vysokou expresi ve tkáni karcinomu vaječníku. Právě u pacientek s nádorem vaječníku lze nalézt vysoké hladiny HE4 v séru. V praxi se používá kombinace markerů HE4 a CA 125 pro větší citlivost. Tato kombinace je přesnějším prediktorem maligního onemocnění, než když jsou použity jednotlivě. Z této kombinace lze vypočítat tzv. ROMA skóre (Risk of Ovaria Malignancy Algorithm). Jde o moderní diagnostický test pro posouzení rizika ovariálního karcinomu žen s rezistencí nejasné povahy v malé pánvi. Referenční hodnoty:

< 70 pmol/l premenopauzální ženy < 140 pmol/l postmenopauzální ženy

(Bálková O., 2012, internet 4, internet 10) Tab. 4: Přehled vybraných karcinomů s typickými nádorovými markery Karcinomy

Nádorové markery

Karcinom prsu

CA 15-3, CA 125, CA 72-4, CEA, HE4

Karcinom vaječníku

CA 15-3, CA 125, CA 72-4, CA 19-9, CEA

Karcinom vejcovodu

CA 125, CEA

Karcinom dělohy

CA 125, CEA, HE4

SCLC

NSE, TPA, SCC

Karcinom varlat .

CEA

- 25 -

3. Praktická část 3. 1. Chemikálie Prvním krokem k provedení správného postupu je výběr vhodného materiálu. V našem

případě

šlo

o

výběr

komerční

soupravy

vhodné

pro

stanovení

paraneoplastických protilátek. Bylo třeba provést průzkum trhu a zjistit, která souprava bude pro naše měření nejvhodnější. Protože jsme se rozhodli pro vzájemné porovnání citlivosti dvou souprav, bylo naším cílem vybrat podobné soupravy od dvou různých výrobců. Současný český trh diagnostických souprav pro vyšetření paraneoplastických protilátek nabízí relativně spoustu výrobců, jejichž soupravy slouží k detekci tří základních paraneoplastických protilátek (anti-Hu, anti-Yo, anti-Ri) v séru, ale nabízí daleko méně výrobců, jejichž soupravy lze použít k detekci šesti základních paraneoplastických protilátek v séru. Výrobce, jehož soupravu lze použít pro detekci protilátek v séru a zároveň v likvoru, je na českém trhu pouze jeden. K měření byly vybrány čtyři soupravy ravo PNS-Blot od výrobce ravo Diagnostika a dvě soupravy Immublot Anti-Neuronal Antibody Western Blot Immunoassay od výrobce IMMCO Diagnostics. Souprava ravo PNS-Blot Tato souprava umožňuje detekci šesti základních paraneoplastických protilátek (anti-Hu, anti-Yo, anti-Ri, anti-CV2, anti-Amphiphysin, anti-Ma1/Ma2). Stanovení se provádí ze séra a z mozkomíšního moku. Kit obsahuje dostatečné množství reagencií k provedení 12 stanovení ze séra a 12 stanovení z likvoru. Celkově tedy obsahuje 24 stanovení. Reagencie: - koncentrovaný promývací pufr (3 x 50 ml) - ředící pufr pro vzorky obsahující 0,01% Thimerosal (3 x 25 ml) - pozitivní kontrola obsahující 0,01% Thimerosal (3 x 2 ml) - konjugát pro pozitivní kontrolu obsahující 0,01% Thimerosal (3 x 2 ml) - anti-human IgG konjugát s ALP obsahující 0,01% Thimerosal (3 x 20 ml) - substrát (BCIP/NBT) (3 x 20 ml) - 20 nitrocelulosových proužků pro detekci IgG protilátek Spotřební materiál: - čistý 1000 ml odměrný válec - čistá 1000 ml kádinka pro promývací pufr - absorpční papír nebo papírové ručníky

- 26 -

- destilovaná voda - mikropipety o velikosti 10 – 5000 µl - jednorázové špičky na pipety - 1,5 ml ependorfky - 1 kontrolní sken - 3 inkubační vaničky - budík - pinzeta - třepačka - stojany na ependrofky - Pasteurovy plastové pipety Souprava IMMCO Immublot Anti-Neuronal Antibody Tato souprava umožňuje detekci tří neuronálních protilátek anti-Hu, anti-Ri a anti-Yo. Stanovení se provádí pouze ze séra. Kit obsahuje dostatečné množství reagencií k provedení 20 stanovení ze séra. Reagencie: - pozitivní kontrola (1 x 110 µl) - negativní kontrola (1 x 110 µl) - konjugát A (1 x 240 µl) - konjugát B (1 x 240 µl) - ředící roztok (1 x 60 ml) - substrát (1 x 25 ml) - práškový promývací pufr - 20 Western Blot proužků - 1 kontrolní sken - 3 inkubační vaničky Spotřební materiál: - čistý 1000 ml odměrný válec - čistá 1000 ml kádinka pro promývací pufr - absorpční papír nebo papírové ručníky - destilovaná voda - mikropipety o velikosti 10 – 5000 µl - jednorázové špičky na pipety - 1,5 ml ependorfky - 1 kontrolní sken - 3 inkubační vaničky

- 27 -

- budík - pinzeta - třepačka - stojany na ependrofky - Pasteurovy plastové pipety

3. 2. Biologický materiál Jako biologický materiál bylo použito krevní sérum a mozkomíšní mok. Mozkomíšní mok (likvor, CSF) je čirá, bezbarvá tělní tekutina, která vyživuje a chrání mozek a míchu. Vyšetření likvoru patří k základním metodám, které přispívají k diagnostice neurologických onemocnění. Odběr likvoru se provádí lumbální punkcí, a to odběrem 3-5 ml z páteřního kanálu v oblasti bederní páteře. Likvor se odebírá do řádně označené plastové odběrové nádobky bez úprav. Odběr se provádí na Neurologické klinice Fakultní nemocnice Olomouc. Odtud se materiál transportuje na Oddělení klinické biochemie (OKB) Fakultní nemocnice Olomouc. Zde je materiál skladován v lednici při teplotě +4°C po dobu 3 dn ů. Z plastové odběrové nádobky, uchovávané v lednici, bylo odebráno potřebné množství (cca 1 ml) likvoru do ependorfky a zamraženo na -20°C na pozd ější analýzu. Krevní sérum je nažloutlá tekutina, která vzniká po vysrážení plné krve a následným odstraněním krevní sraženiny centrifugací. Složením odpovídá krevní plazmě, avšak na rozdíl od plazmy neobsahuje fibrinogen a další srážecí faktory krve. Pro vyšetření krevního séra se odebírá srážlivá žilní krev. Srážlivá krev se získává odběrem do řádně označených plastových nádobek bez přísad nebo se separačními gely. Odběry žilní krve se provádí na jednotlivých pracovištích Fakultní nemocnice Olomouc. Z těchto jednotlivých pracovišť jsou vzorky transportovány na OKB Fakultní nemocnice Olomouc. Zde jsou vzorky stáčeny na centrifuze pro získání krevního séra a následně skladovány v lednici při

teplotě +4°C po dobu 3 dn ů. Jednotlivé vzorky séra byly

odebírány z plastových odběrových nádobek, uchovávaných v lednici, do 1,5 ml ependorfek. Bylo odebráno cca 1 ml séra pomocí 2000 µl automatické pipety. Během sběru vzorků se veškeré vzorky nechávaly zmrazit na -20°C na po zdější analýzu. 3. 2. 1. Výběr skupin pacientů Byly vytvořeny dvě skupiny pacientů, které se liší výběrovým kritériem. Veškeré informace o pacientech byly získávány z LISu (laboratorní informační systém) nazývaného OpenLims. Všichni pacienti byli vyhledávání v LISu pomocí zadání jejich rodných čísel nebo identifikačních čísel s datem odběru. Vzorky pacientů vybraných

- 28 -

pro analýzu byly vyhledány v archivu LISu a následně potřebné množství těchto vzorků bylo odebráno pro pozdější analýzu. Skupina 1: Do této skupiny byli vybíráni pacienti na základě jejich diagnózy. Tyto diagnózy byly vybírány podle klinických příznaků, které se pojí s jednotlivými PNS nejčastěji nebo jsou pro ně přímo typické (Tab. 5). Výskyt paraneoplastických protilátek u této skupiny pacientů je i tak nízký. Pacientům této skupiny byl současně odebrán mozkomíšní mok a sérum. Pro analýzu bylo vybráno 22 sér a 22 likvorů z přibližně 150 vybraných pacientů (Tab. 6). Vzorky byly testovány soupravou ravo PNS-Blot. Tab. 5: Diagnózy související s daným onemocněním Kód diagnózy G048 G049 G111 G112 G122 G130 G20 G250 G253 G35 G400 G401 G402 G409 G430 G431 G439 G61 G628 G629 G820 G822 G959 R251 R252 R270 R402 R42 R509 R51 R55

Název diagnózy Jiné encefalitidy, myelitidy a encefalomyelitidy Encefalitida, myelitida a encefalomyelitida Cerebelární - mozečková - ataxie s časným začátkem Cerebelární - mozečková - ataxie s pozdním začátkem Nemoci motorického neuronu Paraneoplastická neuromyopatie a neuropatie Parkinsonova nemoc Esenciální třes Myoklonus Roztroušená skleróza - sclerosis multiplex Idiopatická epilepsie a epil. sy příbuz. lokal. se záchv. lok. začátku Symptom. epil. a epil. sy příbuz. lokal. s jednotl. parciál. záchvaty Symptom. epil. a epil. sy příbuz. lokal. s komplexem parciál. záchvatů Epilepsie Migréna bez aury (běžná migréna) Migréna s aurou (klasická migréna) Migréna Zánětlivá polyneuropatie Jiné určené polyneuropatie Polyneuropatie Chabá paraplegie Paraplegie Nemoci míchy Třes - tremor Křeče a spazmy Ataxie NS Bezvědomí - kóma Závrať – vertigo Horečka Bolest hlavy Mdloba - synkopa a zhroucení - kolaps

- 29 -

Tab. 6: Vzorky ze skupiny 1 vybrané pro analýzu. S = sérum, L = likvor Číslo vzorku

Pohlaví

Věk

Materiál

Kód diagnózy

1

muž

52

S/L

G430

2

muž

61

S/L

R55

3

muž

49

S/L

R251

4

žena

59

S/L

G628

5

muž

60

S/L

G629

6

žena

72

S/L

G409

7

muž

74

S/L

R402

8

muž

57

S/L

G400

9

žena

63

S/L

G111

10

muž

59

S/L

G629

11

žena

80

S/L

G35

12

žena

71

S/L

G959

13

žena

78

S/L

G820

14

žena

82

S/L

G35

15

muž

77

S/L

G20

16

žena

80

S/L

G20

17

žena

67

S/L

G959

18

žena

70

S/L

G822

19

muž

74

S/L

G959

20

muž

61

S/L

G409

21

muž

58

S/L

G400

22

žena

74

S/L

G20

- 30 -

Skupina 2: Tato skupina zahrnuje pacienty s probíhajícím nádorovým onemocněním. Jedná se především o taková nádorová onemocnění, která se vyskytují u daného onemocnění nejčastěji (Tab. 7). Byli vybíráni pacienti s vysokými hodnotami nádorových markerů typickými pro dané onemocnění. U těchto diagnóz je prokázaná přítomnost paraneoplastických protilátek dokonce ještě před klinickou manifestací onemocnění. Proto se předpokládá větší výskyt protilátek než u pacientů skupiny 1. Stanovení bylo provedeno pouze ze séra. Z přibližně 780 pacientů s probíhajícím nádorovým onemocněním bylo vybráno 53 pacientů, kteří měli vysoké hodnoty nádorových markerů. Z 53 pacientů bylo pro analýzu vybráno 38 vzorků. Ze 38 vzorků bylo 28 vzorků testováno soupravami ravo PNS-Blot a IMMCO ImmuBlot Anti-Neuronal Antibody, zbylých 10 vzorků bylo testováno pouze soupravou ravo PNS-Blot (Tab. 8). Tab. 7: Diagnózy novotvarů Kód diagnózy C210 C33 C34 C340 C341 C342 C343 C348 C349 C50 C500 C501 C502 C503 C504 C505 C506 C508 C509 C531 C538 C548 C549 C55 C56 C570 D381 D390 D391 D486 J90

Název diagnózy ZN - řiť ZN průdušnice - trachey ZN průdušky - bronchu a plíce ZN - hlavní bronchus ZN - horní lalok, bronchus nebo plíce ZN - střední lalok, bronchus nebo plíce ZN - dolní lalok, bronchus nebo plíce ZN - léze přesahující průdušku nebo plíci ZN - průduška a plíce ZN prsu ZN - bradavka - mamilla a dvorec - areola ZN - stření část prsu ZN - horní vnitřní kvadrant prsu ZN - dolní vnitřní kvadrant prsu ZN - horní zevní kvadrant prsu ZN - dolní zevní kvadrant prsu ZN - axilární část prsu ZN - léze přesahující prs ZN - prs NS ZN - exocervix ZN - léze přesahující hrdlo děložní ZN - léze přesahující tělo děložní ZN - tělo děložní - corpus uteri ZN dělohy, část ZN vaječníku ZN - vejcovod - tuba Fallopii Novotvar NNCH - průdušnice, průdušky a plíce Novotvar NNCH - děloha Novotvar NNCH - vaječník Novotvar NNCH – prs Pohrudniční výpotek

- 31 -

Tab. 8: Vzorky ze skupiny 2 vybrané pro analýzu. S = sérum. Číslo Pohlaví vzorku 1 žena 2 žena 3 žena

Věk

Materiál

53 72 73

S S S

Kód diagnózy C504 C56 C503

4 5

žena žena

57 80

S S

C504 C504

6 9 10 11 12 13

žena žena žena žena žena žena

58 71 62 61 82 55

S S S S S S

C549 C504 C56 C503 C504 C504

14 15

žena žena

45 63

S S

C504 C56

16

žena

58

S

C504

17 18 19 20

žena žena žena žena

74 75 58 59

S S S S

C501 C503 C504 C56

21 22 24

žena žena žena

53 57 81

S S S

C504 C504 C504

27 28 29 30 33 34


82 61 65 67 69 57

S S S S S S

C502 C504 C56 C56 C504 C56

38 40 44

žena žena žena

63 68 60

S S S

C509 C504 C504

46 47 48 49


61 63 88 46

S S S S

C504 C56 C531 C210

50 51

žena žena

58 48

S S

C504 C509

52 53

muž muž

59 62

S S

D381 J90

- 32 -

Nádorový marker CA 125 CA 15-3 CA 125 HE4 CA 125 CA 125 HE4 HE4 CA 15-3 CA 125 CA 125 CA 125 CA 125 HE4 CA 15-3 CA 125 HE4 CA 125 CA 72-4 CA 125 CA 15-3 CA 125 CA 125 HE4 CA 125 HE4 CA 125 HE4 CA 72-4 CA 125 CA 125 CA 125 CA 15-3 CA 125 HE4 CA 19-9 CA 19-9 CA 125 HE4 CA 15-3 CA 19-9 SCC SCC CA 15-3 CA 15-3 CA 125 HE4 TPA TPA

Hodnota markeru 10458 kU/l 1106 kU/l 220 kU/l 1878 pmol/l 241 kU/l 239 kU/l 434 pmol/l 229 pmol/l 1232 kU/l 919 kU/l 489 kU/l 2058 kU/l 115 kU/l 236 pmol/l 2687 kU/l 81 kU/l 284 pmol/l 302 kU/l 98 kU/l 255 kU/l 1684 kU/l 345 kU/l 514 kU/l 1050 pmol/l 105 kU/l 430 pmol/l 1216 kU/l 527 pmol/l 227 kU/l 5723 kU/l 567 kU/l 255 kU/l 478 kU/l 2867 kU/l 2098 pmol/l 2125 kU/l 1404 kU/l 8438 kU/l 1380 pmol/l 1087 kU/l >10 000 kU/l 719 kU/l 99 kU/l 181 pmol/l -

3. 3. Metodika měření 3. 3. 1. Detekce protilátek Onkoneurální protilátky se stanovují převážně v séru a výjimečně v mozkomíšním moku. Standardní metodou pro detekci onkoneurálních protilátek je nepřímá imunofluorescence prováděná na krysí mozkové tkáni. Výhoda této metody spočívá ve screeningu pro několik protilátek v čase, ale citlivost a specifita této metody je relativně nízká (Raspotnig M. et al., 2011). K detekci se také používá metoda imunoprecipitace, která má vyšší citlivost a specifitu než metoda nepřímé imunofluorescence. Metoda imunoprecipitace se používá pouze ve výzkumu (Monstad S. E. et al., 2009). Rozvíjí se in vitro transkripční a translační metoda, která je velmi citlivá a specifická pro detekci protilátek (Totland C., 2010). V rutinní praxi se nejvíce využívá imunochemická metoda imunobloting, která používá rekombinantní proteiny nebo neuronální extrakt k detekci protilátek. Při našem měření byla použita metoda imuno-dot-bloting. 3. 3. 2. Princip metody Metoda Imunobloting je velmi citlivá metoda k určení většiny protilátek. Tato imunochemická analytická metoda umožňuje přenos molekul z pohyblivé fáze (polyakrylamidový gel) do pevné fáze (nitrocelulózová membrána). Molekuly jsou v gelu rozděleny podle molekulové hmotnosti a poté v elektrickém poli přeneseny na membránu. Po přenesení molekul do pevné fáze je možné provést jejich detekci reakcí se specifickými protilátkami. Působením vyšetřovaného materiálu na proužek nitrocelulózy s takto rozdělenými molekulami (buněčnými antigeny) dojde v pozitivním případě k vytvoření imobilizovaného komplexu autoprotilátka - antigen, který se projeví vznikem proužku či proužků lokalizovaný dle molekulové hmotnosti antigenu. Detekce proteinů na nitrocelulosové matrici se provádí buď přímým specifickým značením, anebo nepřímým specifickým značením. Při přímém specifickém značení se používá pouze jedna specifická protilátka, která nese enzym. Při nepřímém specifické značení se využívá dvou ligandů (protilátek). První ligand se specificky naváže jen na analyzovaný protein, druhý ligand nesoucí enzym se pak naváže na první ligand. Enzym navázaný na protilátkách reaguje se substrátem a umožňuje tak zviditelnění protilátek na membráně. Metoda Imuno-dot-bloting se liší pouze v tom, že antigeny se aplikují přímo na membránu bez počáteční elektroforetické separace.

- 33 -

Souprava ravo PNS-Blot Nitrocelulózové proužky, které jsou potaženy rekombinantními antigeny HuD, Yo, Ri, CV2, Amphiphysin, Ma1 a Ma2, jsou inkubovány se vzorky séra a likvoru. Specifické protilátky obsažené ve vzorcích se váží na antigeny. Nespecifické molekuly ve vzorcích jsou odstraněny během promývání proužků. Navázané protilátky jsou detekovány alkalickou fosfatasou (ALP, EC 3.1.3.1), která je konjugovaná s lidským IgG. Reakcí s kombinací substrátů 5-brom-4-chlor-3-indolyl fosfát (BCIP) a nitro blue tetrazolium chlorid (NBT) dochází ke zviditelnění. Souprava IMMCO Immublot Anti-Neuronal Antibody Nitrocelulózové proužky, které jsou potaženy rekombinantními antigeny HuD, Yo a Ri, jsou inkubovány s naředěným vzorkem séra. Protilátky se specificky váží na neurální jaderné antigeny. Po promytí proužků a inkubaci s konjugáty A a B jsou proužky inkubovány se substrátem. Pozitivní reakce se objeví jako modrofialové pásky v oblasti 35-40 kD (Hu), 62 kD (Yo) a 55 kD (Ri).

Obr. 3: Princip detekce

- 34 -

3. 4. Ověření citlivosti metody Před uvedením metody do rutinního provozu je potřeba provést verifikaci - ověření analytických parametrů vybrané soupravy. V případě kvalitativních metod je dle doporučení odborné společnosti klinické biochemie zapotřebí k provedení verifikace pouze striktní dodržování návodu výrobce. Protože jsme měli k dispozici 2 soupravy od různých výrobců, rozhodli jsme se vytvořit vlastní algoritmus na ověření citlivosti jednotlivých souprav a jejich vzájemné porovnání. Citlivost byla ověřena dvěma způsoby. Jako první způsob byl zvolen parametr ředícího pokusu pozitivní kontroly až k mezi detekce. Postupným ředěním byly získány barevné pásy o různé intenzitě pro jednotlivé imobilizované antigeny. Pomocí počítačového programu jsme se pokusili vyjádřit intenzitu zabarvení a na základě získaných údajů určit a porovnat citlivost souprav jednotlivých výrobců. Dále byla provedena analýza pacientských vzorků současně oběmi soupravami a opět bylo provedeno jejich porovnání. 3. 4. 1. Algoritmus ředícího pokusu pozitivních kontrol Pozitivní kontroly jsme nejprve ředili 3x, a to v poměrech 1:2, 1:10, 1:50 u obou souprav. Podle výsledku intenzity zabarvení nejslabšího proužku jsme dále ředili 5x, a to v poměrech 1:30, 1:70, 1:100, 1:150, 1:200 pro soupravu ravo PNS-Blot a 1:5, 1:20, 1:70, 1:100, 1:150 pro soupravu IMMCO Immublot Anti-Neuronal Antibody. Celkem jsme získali 8 různě naředěných pozitivních kontrol. Tab. 9: Ředění pozitivní kontroly. ravo PNS-Blot

IMMCO Immublot Anti-Neuronal Antibody

Ředící Pozitivní Ředící pufr poměr kontrola (µl) (µl)

Ředící Pozitivní Ředící pufr poměr kontrola (µl) (µl)

1:2

1000

1000

1:2

5

5

1:10

200

1800

1:5

2

8

1:30

66,7

1933,3

1:10

5

45

1:50

40

1960

1:20

2

38

1:70

28,6

1971,4

1:50

5

245

1:100

20

1980

1:70

5

345

1:150

13,3

1986,7

1:100

5

495

1:200

10

1990

1:150

2,5

372,5

- 35 -

3. 5. Postup analýzy Všechny zamražené vzorky byly před vlastní analýzou vytemperovány na pokojovou teplotu. Tyto rozmražené vzorky byly následně zvortexovány. Rozmražené a zvortexované vzorky jsou již připraveny pro vlastní analýzu.

Souprava ravo PNS-Blot Všechny komponenty kitu musejí být před použitím vytemperovány na pokojovou teplotu. Příprava promývacího pufru: Koncentrovaný promývací pufr se ředí 1:20 s destilovanou vodou. Příprava vzorku: Vzorek se naředí 1:2000 s ředícím pufrem ve dvou krocích: 1. krok: 10 µl vzorku přidáme do 90 µl ředícího pufru, promícháme 2. krok: 2 ml ředícího pufru přidáme na proužky (viz. postup bod č. 2)

1) Proužky umístíme do inkubační vaničky a přidáme 2 ml pozitivní kontroly na jeden příslušný proužek. 2) Na ostatní proužky přidáme 2 ml ředícího pufru. 3) Přidáme 10 µl předředěného vzorku na proužky (mimo proužek s pozitivní kontrolou) a opatrně promícháme. 4) Necháme 60 min inkubovat na třepačce při pokojové teplotě. 5) Pomocí mikropipety odsajeme veškeré přidané tekutiny z jednotlivých drážek ve vaničce. 6) 5x promyjeme 2 ml naředěného promývacího pufru použitím mikropipety. 7) Přidáme 2 ml konjugátu pro pozitivní kontrolu na příslušný proužek. 8) Na ostatní proužky přidáme 2 ml anti-human IgG konjugátu s ALP. 9) Necháme 30 min inkubovat na třepačce při pokojové teplotě. 10) Pomocí mikropipety odsajeme veškeré přidané tekutiny z jednotlivých drážek ve vaničce. 11) 5x promyjeme 2 ml naředěného promývacího pufru použitím mikropipety. 12) Přidáme 2 ml substrátu na každý proužek. 13) Necháme 25 min inkubovat do zviditelnění při pokojové teplotě. 14) Odsajeme 2 ml substrátu a přidáme destilovanou vodu pro zastavení reakce. 15) Proužky necháme uschnout na absorpčním papíru. Skladujeme ve tmě.

- 36 -

Souprava IMMCO Immublot Anti-Neuronal Antibody Všechny komponenty kitu musejí být před použitím vytemperovány na pokojovou teplotu. Příprava promývacího pufru: Práškový promývací pufr rozpustíme v jednom litru destilované vody. Rozpouštění trvá přibližně 10 min. Nádobu s rozpuštěným promývacím pufrem je třeba promíchat před použitím. Rozpuštěný promývací pufr skladujeme při teplotě 4°C. Příprava vzorku: Vzorek je naředěn 1:101 ředícím roztokem během postupu (viz. bod č. 2 a 3).

1) Pomocí pinzety umístíme požadované množství proužků označenou stranou nahoru do jednotlivých jamek vaničky. 2) Do každé jamky nepipetujeme 1 ml ředícího roztoku. 3) Do příslušných jamek nepipetujeme 10 µl negativní kontroly, pozitivní kontroly a vzorky pacientů tak, abychom získali 1:101. 4) Necháme inkubovat 60 min na třepačce při pokojové teplotě. 5) Pomocí mikropipety odsajeme veškeré přidané tekutiny z jednotlivých drážek ve vaničce. 6) 2x promyjeme 2 ml naředěného promývacího pufru použitím mikropipety. 7) Napipetujeme 1 ml ředícího roztoku a následně 10 µl konjugátu A do každé jamky. 8) Necháme inkubovat 30 min na třepačce při pokojové teplotě. 9) Pomocí mikropipety odsajeme veškeré přidané tekutiny z jednotlivých drážek ve vaničce. 10) 2x promyjeme 2 ml naředěného promývacího pufru použitím mikropipety. 11) Napipetujeme 1 ml ředícího roztoku a následně 10 µl konjugátu B do každé jamky. 12) Necháme inkubovat 30 min na třepačce při pokojové teplotě. 13) Pomocí mikropipety odsajeme veškeré přidané tekutiny z jednotlivých drážek ve vaničce. 14) 2x promyjeme 2 ml naředěného promývacího pufru použitím mikropipety. 15) Napipetujeme 1 ml substrátu do každé jamky. 16) Necháme 10 min inkubovat při jemném promíchávání při pokojové teplotě a tlumeném světle. 17) Odsajeme 1 ml substrátu a přidáme destilovanou vodu pro zastavení reakce. 18) Proužky necháme uschnout na absorpčním papíru. Skladujeme ve tmě.

- 37 -

4. Výsledky 4. 1. Ověření citlivosti Proužky s naředěnými pozitivními kontrolami byly nejprve seřazeny podle poměru ředění od nejvyšší po nejnižší koncentraci. Seřazené proužky byly vyfoceny full-frame fotoaparátem Canon 5D Mark II v manuálním režimu pod umělým osvětlením za účelem dosažení identických podmínek pro všechny záznamy. Fotografie byly upraveny v software Adobe Photoshop. Bylo provedeno vyvážení na bílou a černou barvu přítomnou v obraze. Následně byly fotografie převedeny do odstínů šedi. Pomocí nástroje pro vzorkování barev byla zjištěna tmavost odstínu pásu (bandu) v procentuálních jednotkách (100% = černá, 0% = bílá). Jednotlivým pásům (bandům) na proužcích jsme tak přiřadili procentuální hodnotu, která odpovídá stupni intenzity zabarvení.

1:2

1:10

1:30

1:50

1:70

1:100

1:150

1:200

Reakční kontrola Ma2 Ma1 Amphiphysin CV2 Ri Yo Hu

Obr. 4: Naředěné pozitivní kontroly. Ravo PNS-Blot.

Tab. 10: Intenzity zabarvení pozitivních kontrol vyjádřené v % R. kontrola Ma2 Ma1 Amphiphysin CV2 Ri Yo Hu

1:2 98 96 95 95 93 96 95 95

1:10 97 93 80 93 83 95 97 95

1:30 96 73 48 78 66 93 96 86

1:50 97 59 40 71 50 91 91 65

- 38 -

1:70 97 53 37 63 48 86 88 66

1:100 96 37 28 47 34 76 75 51

1:150 95 36 28 36 28 69 63 41

1:200 94 35 29 35 26 60 59 39

S rostoucím poměrem naředění lze jasně vidět, že intenzita zabarvení klesá. Intenzita zabarvení je i při našem nejnižším naředěním (1:200) stále dost vysoká. Kvůli omezenému množství chemikálií jsme nemohli provést další naředění vzorků. Téměř nulových hodnot intenzity bychom patrně dosáhli při naředění vzorku 1:1000 a více. Antigeny Ri a Yo se jeví jako silně koncentrované, a to i při naředění 1:200.

Konc.

1:2

1:5

1:10

1:20

1:50

1:70

1:100

1:150

Reakční kontrola 1 Reakční kontrola 2 Yo Hu

Obr. 5: Naředěné pozitivní kontroly IMMCO Immublot Anti-Neuronal Antibody. Konc. = koncentrovaný. Tab. 11: Intenzity zabarvení pozitivních kontrol vyjádřené v %. konc.

1:2

1:5

1:10

1:20

1:50

1:70

1:100 1:150

R. kontrola 1

95

95

95

96

94

94

97

96

95

R. kontrola 2

99

96

93

94

91

93

97

93

94

Yo

77

51

38

26

25

22

24

20

23

Hu

100

100

100

94

89

67

49

45

48

Intenzita zabarvení je také klesající s rostoucím poměrem naředění. Intenzita zabarvení pásu v oblasti antigenu Yo je při koncentrovaném vzorku jen 77 % a při naředění vzorku 1:10 má tato intenzita hodnotu 26 %. Jako nejvíce koncentrovaný se jeví antigen Hu, a to i při naředění 1:150. Nulových hodnot intenzity u antigenu Hu bychom patrně dosáhli při naředění vzorku 1:500 a více.

- 39 -

4. 2. Naměřené výsledky - skupina 1 1L

1S

2L

2S

3L

3S

4L

4S

5L

5S

6L


Obr. 6: Vzorky 1-6. L-likvor, S-sérum.

Tab. 12: Vzorky 1-6. Číslo vzorku 1L 1S 2L 2S 3L 3S 4L 4S 5L 5S 6L 6S

Kód Výsledek diagnózy

Pohlaví

Věk

muž

52

G430

muž

61

R55

muž

49

R251

žena

59

G628

muž

60

G629

žena

72

G409

negativní negativní negativní negativní negativní negativní negativní negativní negativní negativní negativní negativní

Ve vzorcích 1-6 nebyla detekována žádná paraneoplastická protilátka.

- 40 -

6S

7L

7S

8L

8S

9L

9S

10L

10S

11L

11S



Tab. 13: Vzorky 7-11. Číslo vzorku 7L 7S 8L 8S 9L 9S 10L 10S 11L 11S


Pohlaví

Věk

muž

74

R402

muž

57

G400

žena

63

G111

muž

59

G629

žena

80

G35

negativní negativní negativní negativní negativní pozitivní negativní negativní negativní negativní

Vzorek 9S (žena, 63 let, dg. G111) vykazoval pozitivitu anti-Yo protilátky. V ostatních vzorcích nebyly detekovány žádné paraneoplastické protilátky.

- 41 -

12L

12S

13L 13S

14L

14S 15L

15S

16L 16S

17L 17S



Tab. 14: Vzorky 12-17. Číslo vzorku 12L 12S 13L 13S 14L 14S 15L 15S 16L 16S 17L 17S


Pohlaví

Věk

žena

71

G959

žena

78

G820

žena

82

G35

muž

77

G20

žena

80

G20

žena

67

G959

negativní negativní negativní negativní negativní negativní negativní negativní negativní negativní negativní negativní


- 42 -

18L

18S

19L

19S 20L

20S

21L

21S

22L

22S



Tab. 15: Vzorky 18-22. Číslo vzorku 18L 18S 19L 19S 20L 20S 21L 21S 22L 22S


Pohlaví

Věk

žena

70

G822

muž

74

G959

muž

61

G409

muž

58

G400

žena

74

G20

negativní negativní negativní negativní negativní negativní negativní negativní negativní negativní


- 43 -

22 21

22

negativní

20

pozitivní

18

počet pacientů

16 14 12 10 8 6 4 1

2

0

0 likvor

sérum

Obr. 10: Počet pacientů (skupina 1) s pozitivním/negativním nálezem protilátek v séru a likvoru. Souprava ravo PNS-Blot.

- 44 -

4. 3. Naměřené výsledky - skupina 2

1

3

5

12

20

24

28

34

44


Obr. 11: Vzorky 1, 3, 5, 12, 20, 24, 28, 34, 44. Ravo PNS-Blot.

Tab. 16: Vzorky 1, 3, 5, 12, 20, 24, 28, 34, 44. Číslo vzorku 1

Pohlaví

Věk

žena

53

3

žena

73

5

žena

80

12

žena

82

20

žena

59

24

žena

81

28

žena

61

34

žena

57

44

žena

60

Kód Nádorový Hodnota diagnózy marker markeru C504 CA 125 10458 kU/l CA 125 220 kU/l C503 HE4 1878 pmol/l CA 125 239 kU/l C504 HE4 434 pmol/l C504 CA 125 2058 kU/l CA 125 514 kU/l C56 HE4 1050 pmol/l CA 125 1216 kU/l C504 HE4 527 pmol/l C504 CA 125 5723 kU/l CA 125 2867 kU/l C56 HE4 2098 pmol/l CA 125 8438 kU/l C504 HE4 1380 pmol/l

Výsledky pozitivní negativní negativní negativní negativní negativní negativní negativní negativní

Vzorek 1 (žena, 53 let, dg. C504) vykazoval pozitivitu v protilátce anti-Amphiphysin. V ostatních vzorcích nebyly detekovány žádné paraneoplastické protilátky.

- 45 -

1

3

5

12

20

24

28

34

44

Reakční kontrola 1 Reakční kontrola 2

Yo

Hu

Obr. 12: Vzorky 1, 3, 5, 12, 20, 24, 28, 34, 44. Immco Immublot AntiNeuronal Antibody.

Tab. 17: Vzorky 1, 3, 5, 12, 20, 24, 28, 34, 44. Číslo vzorku 1

Pohlaví

Věk

žena

53

3

žena

73

5

žena

80

12

žena

82

20

žena

59

24

žena

81

28

žena

61

34

žena

57

44

žena

60

Kód Nádorový Hodnota diagnózy marker markeru C504 CA 125 10458 kU/l CA 125 220 kU/l C503 HE4 1878 pmol/l CA 125 239 kU/l C504 HE4 434 pmol/l C504 CA 125 2058 kU/l CA 125 514 kU/l C56 HE4 1050 pmol/l CA 125 1216 kU/l C504 HE4 527 pmol/l C504 CA 125 5723 kU/l CA 125 2867 kU/l C56 HE4 2098 pmol/l CA 125 8438 kU/l C504 HE4 1380 pmol/l

Výsledky pozitivní negativní negativní pozitivní negativní pozitivní negativní negativní pozitivní

Vzorek 1 (žena, 53 let, dg. C504) vykazoval pozitivitu v protilátce anti-Yo. Vzorek 12 (žena, 82 let, dg. C504) vykazoval pozitivitu v protilátce anti-Ri. Vzorek 24 (žena, 81 let dg. C504) vykazoval pozitivitu v protilátce anti-Ri. Vzorek 44 (žena, 60 let, dg. C504) vykazoval pozitivitu v protilátce anti-Yo. V ostatních vzorcích nebyly detekovány žádné paraneoplastické protilátky.

- 46 -

2

6

9

10

14

15

18

21

22

46


Obr. 13: Vzorky 2, 6, 9, 10, 14, 15, 18, 21, 22, 46. Ravo PNS-Blot.

Tab. 18: Vzorky 2, 6, 9, 10, 14, 15, 18, 21, 22, 46. Číslo vzorku 2 6 9 10 14

Pohlaví

Věk

žena žena žena žena žena

72 58 71 62 45

Kód diagnózy C56 C549 C504 C56 C504

15

žena

63

C56

18 21 22 46


75 53 57 61

C503 C504 C504 C504

Nádorový marker CA 15-3 HE4 CA 15-3 CA 125 CA 15-3 CA 125 HE4 CA 15-3 CA 125 HE4 CA 15-3

Hodnota markeru 1106 kU/l 229 pmol/l 1232 kU/l 919 kU/l 2687 kU/l 81 kU/l 284 pmol/l 1684 kU/l 105 kU/l 430 pmol/l 1087 kU/l

Výsledky negativní negativní negativní negativní negativní negativní pozitivní negativní negativní negativní

Vzorek 18 (žena, 75 let, dg. C503) vykazoval pozitivitu v protilátce anti-Yo. V ostatních vzorcích nebyly detekovány žádné paraneoplastické protilátky.

- 47 -

2

6

9

10

14

15 18

21

22

46


Yo

Hu

Obr. 14: Vzorky 2, 6, 9, 10, 14, 15, 18, 21, 22, 46. Immco Immublot Anti-Neuronal Antibody. Tab. 19: Vzorky 2, 6, 9, 10, 14, 15, 18, 21, 22, 46. Číslo vzorku 2 6 9 10 14

Pohlaví

Věk

žena žena žena žena žena

72 58 71 62 45

Kód diagnózy C56 C549 C504 C56 C504

15

žena

63

C56

18 21 22 46


75 53 57 61

C503 C504 C504 C504

Nádorový marker CA 15-3 HE4 CA 15-3 CA 125 CA 15-3 CA 125 HE4 CA 15-3 CA 125 HE4 CA 15-3

Hodnota markeru 1106 kU/l 229 pmol/l 1232 kU/l 919 kU/l 2687 kU/l 81 kU/l 284 pmol/l 1684 kU/l 105 kU/l 430 pmol/l 1087 kU/l

Výsledky negativní negativní negativní negativní negativní negativní negativní negativní negativní negativní

Ve vzorcích nebyla detekována žádná paraneoplastická protilátka.

- 48 -

2

11

13

16

19

29

30

33

38

40



Tab. 20: Vzorky 2, 11, 13, 16, 19, 29, 30, 33, 38, 40. Číslo vzorku 2 11

Pohlaví

Věk

žena žena

72 61

13

žena

55

16

žena

58

19 29 30 33 38 40


58 65 67 69 63 68

Kód Nádorový diagnózy marker C56 CA 15-3 C503 CA 125 CA 125 C504 HE4 CA 125 C504 CA 72-4 C504 CA 125 C56 CA 125 C56 CA 125 C504 CA 15-3 C509 CA 19-9 C504 CA 19-9

Hodnota markeru 1106 kU/l 489 kU/l 115 kU/l 236 pmol/l 302 kU/l 98 kU/l 345 kU/l 567 kU/l 255 kU/l 478 kU/l 2125 kU/l 1404 kU/l

Výsledky negativní negativní negativní negativní negativní negativní negativní negativní negativní negativní

Ve vzorcích nebyla detekována žádná paraneoplastická protilátka.

- 49 -

2

11

13

16

19

29 30 33

38 40


Yo

Hu

Obr. 16: Vzorky 2, 11, 13, 16, 19, 29, 30, 33, 38, 40. Immco Immublot Anti-Neuronal Antibody. Tab. 21: Vzorky 2, 11, 13, 16, 19, 29, 30, 33, 38, 40. Číslo vzorku 2 11

Pohlaví

Věk

žena žena

72 61

13

žena

55

16

žena

58

19 29 30 33 38 40


58 65 67 69 63 68

Kód Nádorový diagnózy marker C56 CA 15-3 C503 CA 125 CA 125 C504 HE4 CA 125 C504 CA 72-4 C504 CA 125 C56 CA 125 C56 CA 125 C504 CA 15-3 C509 CA 19-9 C504 CA 19-9

Hodnota markeru 1106 kU/l 489 kU/l 115 kU/l 236 pmol/l 302 kU/l 98 kU/l 345 kU/l 567 kU/l 255 kU/l 478 kU/l 2125 kU/l 1404 kU/l

Výsledky negativní negativní negativní negativní negativní negativní negativní negativní pozitivní negativní

Vzorek 38 (žena, 63 let, dg. C509) vykazoval slabou pozitivitu v protilátce anti-Yo. V ostatních vzorcích nebyly detekovány žádné paraneoplastické protilátky.

- 50 -

4

17

27

47

48

49

50

51

52

53



Tab. 22: Vzorky 4, 17, 27, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53. Číslo vzorku 4 17 27

Pohlaví

Věk

žena žena žena

57 74 82

Kód diagnózy C504 C501 C502

47

žena

63

C56

48

žena

88

C531

49

žena

46

C210

50

žena

58

C504

51

žena

48

C509

52 53

muž muž

59 62

D381 J90

Nádorový Hodnota marker markeru CA 125 241 kU/l CA 125 255 kU/l CA 72-4 227 kU/l >10 000 CA 19-9 kU/l SCC SCC CA 15-3 CA 15-3 719 kU/l CA 125 99 kU/l HE4 181 pmol/l TPA TPA -

Výsledky negativní negativní negativní negativní negativní pozitivní negativní pozitivní pozitivní negativní

Vzorek 49 (žena, 46 let, dg. C210) vykazoval pozitivitu v protilátce anti-Yo. Vzorek 51 (žena, 48 let, C509) vykazoval pozitivitu v protilátce anti-Yo. Vzorek 52 (muž, 59 let, D381) vykazoval pozitivitu v protilátce anti-Ma2. V ostatních vzorcích nebyly detekovány žádné paraneoplastické protilátky.

- 51 -

Tab. 23: Přehled pacientů vyšetřených souběžně soupravou ravo PNS-Blot a IMMCO Immublot Anti-Neuronal Antibody. Číslo Pohlaví vzorku 1 3 5 12 20 24 28 34 44 2 6 9 10 14 15 18 21 22 46 11 13 16 19 29 30 33 38 40

žena žena žena žena žena žena žena žena žena žena žena žena žena žena žena žena žena žena žena žena žena žena žena žena žena žena žena žena

Věk 53 73 80 82 59 81 61 57 60 72 58 71 62 45 63 75 53 57 61 61 55 58 58 65 67 69 63 68

Protilátky Kód Protilátky (IMMCO Immublot Antidiagnózy (ravo PNS-Blot) Neuronal Antibody) C504 C503 C504 C504 C56 C504 C504 C56 C504 C56 C549 C504 C56 C504 C56 C503 C504 C504 C504 C503 C504 C504 C504 C56 C56 C504 C509 C504

anti-Amphiphysin anti-Yo -

anti-Yo anti-Ri anti-Ri anti-Yo anti-Yo -

Při vzájemném porovnání vzorků proměřených oběmi soupravami můžeme vidět, že se nám nepodařilo detekovat stejnou protilátku u žádného vzorku. U vzorku 1 jsme detekovali 2 různé protilátky, kdy protilátka anti-Amphiphysin byla detekována soupravou ravo PNS-Blot a protilátka anti-Yo byla detekována soupravou IMMCO Immublot Anti-Neuronal Antibody. Výsledky obou souprav se u žádného vzorku neshodují.

- 52 -

38 36 33

34 32 30

počet pacientů

28 26

negativní

24

pozitivní

22 20 18 16 14 12 10 8 5

6 4 2 0 sérum

Obr. 18: Počet pacientů (skupina 2) s pozitivním/negativním nálezem protilátek v séru. Souprava ravo PNS-Blot.

5

4

počet pacientů

3 3

2

1

1

anti-Ma2

anti-Amphiphysin

1

0 anti-Yo

Obr. 19: Detekované protilátky v séru 5 pozitivních pacientů. Souprava ravo PNS-Blot.

- 53 -

28 26 24

23

22 20

počet pacientů

18

negativní pozitivní

16 14 12 10 8 6

5

4 2 0 sérum

Obr. 20: Počet pacientů (skupina 2) s pozitivním/negativním nálezem protilátek v séru. Souprava IMMCO Immublot Anti-Neuronal Antibody.

5

4

počet pacientů

3 3

2 2

1

0 anti-Yo

anti-Ri

Obr. 21: Detekované protilátky v séru 5 pozitivních pacientů. Souprava IMMCO Immublot Anti-Neuronal Antibody.

- 54 -

5

3 diagnózy protilátky 2

1

1

1

anti-Yo

C210

C503

anti-Amph

anti-Yo

0

C504

1 anti-Ma2

1 1

anti-Yo

počet pacientů

4

C509

D381

Obr. 22: Typ nádorového onemocnění u pozitivních pacientů s detekovanými protilátkami. C210 = ZN (zhoubný nádor) – řiť, C503 = ZN – dolní vnitřní kvadrant prsu, C504 = ZN – horní zevní kvadrant prsu, C509 = ZN – prs, D381 = novotvar NNCH (nejistého nebo neznámého chování) – průdušnice, průdušky a plíce. Souprava ravo PNS-Blot.

5

4

počet pacientů

4

diagnóza

3

anti-Yo 2

anti-Ri

2

2

1

1

1

0 C504

C509

Obr. 23: Typ nádorového onemocnění u pozitivních pacientů s detekovanými protilátkami. C504 = ZN – horní zevní kvadrant prsu, C509 = ZN – prs. Souprava IMMCO Immublot Anti-Neuronal Antibody.

- 55 -

5. Diskuse Ověření citlivosti Pásy (bandy) všech antigenů se vizuálně jeví jako pozitivní při naředění 1:200 u soupravy ravo PNS-Blot. Ze zjištěných procentuálních hodnot intenzity zabarvení jsme zjistili, že nejméně koncentrovaným antigenem při naředění 1:200 je antigen CV2, jehož hodnota intenzity zabarvení je 26 %. Nejvíce koncentrovaným antigenem při stejném naředění je antigen Ri, který má hodnotu intenzity zabarvení 60 %. Silnou koncentraci při našem nejnižším naředění má také antigen Yo (59 %). Hodnoty intenzity zabarvení ostatních antigenů jsou v průměru 35 %. Antigeny CV2 s intenzitou zabarvení 26 % jsme určili jako antigeny, podle kterých lze prezentovat výsledek jako stále pozitivní výsledek u soupravy ravo PNS-Blot. U soupravy IMMCO Immublot Anti-Neuronal Antibody se koncentrace antigenů podstatně liší. Ze zjištěných procentuálních hodnot intenzity zabarvení jsme zjistili, že nejméně koncentrovaným antigenem je antigen Yo, jehož hodnota intenzity zabarvení je 26 %, a to už při naředění 1:10. V koncentrovaném vzorku je jeho hodnota intenzity zabarvení pouze 77 %. Silně koncentrovaný je antigen Hu, jehož hodnota intenzity zabarvení je 48 %, a to při našem nejnižším naředění 1:150. Antigeny Yo s intenzitou pod 26 % jsme určili jako antigeny, podle kterých lze prezentovat výsledek jako negativní výsledek u soupravy IMMCO Immublot Anti-Neuronal Antibody. Porovnáním naředěných pozitivních kontrol obou souprav jsme zjistili, že souprava ravo PNS-Blot má několikanásobně vyšší citlivost než souprava IMMCO Immublot AntiNeuronal Antibody. Antigeny na proužcích dokáží zachytit protilátky z vysoce naředěného vzorku u soupravy ravo PNS-Blot. Vyšší citlivost u této soupravy jsme předpokládali, protože tato souprava umožňuje detekci protilátek v likvoru. Výhodou soupravy ravo PNS-Blot je možnost detekce všech základních paraneoplastických protilátek (anti-Hu, anti-Yo, anti-Ri, anti-CV2, anti-Amphiphysin, anti.Ma1/Ma2) jak v séru, tak i v likvoru. Souprava IMMCO Immublot Anti-Neuronal Antibody umožňuje detekci pouze tří základních protilátek (anti-Hu, anti-Yo, anti-Ri), přičemž pozitivní kontrola této soupravy obsahuje antigeny pouze Hu a Yo. Podle výrobce se antigeny Ri nachází mezi antigeny Yo a Hu. Na základě odhadování lokalizace antigenů Ri nelze z jistotou říct, kdy se jedná o pozitivní výsledek na protilátky anti-Ri. Pro stanovení paraneoplastických protilátek doporučujeme soupravu ravo PNS-Blot na základě její vyšší citlivosti, možnosti stanovení 6 paraneoplastických protilátek v séru a likvoru a nepřítomnosti nespecifických pásů ve výsledku.

- 56 -

Vzorky ze skupiny 1 Bylo proměřeno 22 sér a 22 likvorů od 22 pacientů. Jednalo se o 11 žen v průměrném věku 72 let a 11 mužů v průměrném věku 62 let. Vzorky byly proměřeny soupravou ravo PNS-Blot. Podařilo se nám detekovat protilátky anti-Yo v séru ženy ve věku 63 let, která byla diagnostikována s diagnózou G111, tedy cerebelárnímozečkovou-ataxií s časným začátkem. Mozečkovou ataxií se rozumí neurologické poškození mozečku, kdy dochází k poruše koordinace pohybů. Jedná se tedy o diagnózu, která je přímo typická pro PNS. Lze ji brát jako paraneoplastickou cerebelární degeneraci (PCD). Pozitivita v séru nebyla úplně výrazná, proto jsme předpokládali, že díky nízké koncentraci v séru nebudou protilátky detekovatelné v likvoru, což se potvrdilo. Doporučujeme nový odběr. Na základě této diagnózy a detekovaných protilátek se dá předpokládat, že žena má predispozici k nádorovému onemocnění. PCD bývá často asociována s nádorem vaječníku a nádorem prsu (Ogita S. et al., 2008). Žena by proto měla být vyšetřena v oblasti hrudi a pánve na možný výskyt skrytého nádoru. V případě pozitivního nálezu se zahajuje symptomatická terapie, jejíž cílem je zmírnění příznaků nádorového onemocnění. Pokud není nalezen žádný nádor, pacientům jsou podávána nejrůznější imunosupresiva, která potlačují imunitní reakci. Protilátky anti-Yo jsou velice často detekované u žen s PCD. Existuje mnoho studií, které potvrzují toto tvrzení. Například ve studii Storsteinové, která uvádí, že z 20 pacientů pozitivních na protilátky anti-Yo mělo 13 pacientů PCD. Všichni tito pacienti byli ženy v průměrném věku 61 let (Storstein A. et al., 2011). Jiná studie uvádí, že z 295 pacientů testovaných na onkoneurální protilátky bylo 59 pacientů (57 žen, 2 muži) pozitivních v protilátce anti-Yo, a z toho 54 pacientů mělo PCD. Všichni tito pacienti byli ženy v průměrném věku 65 let (Psimaras D. et al., 2010). Nám se potvrdilo, že výsledky našeho pacienta souhlasí se závěry uvedenými v literatuře. Vzorky ze skupiny 2 Celkově bylo proměřeno 38 pacientů (36 žen, 2 muži). Z toho 28 žen bylo proměřeno soupravou ravo PNS-Blot a zároveň soupravou IMMCO Immublot AntiNeuronal Antibody. Zbylých 10 pacientů (8 žen, 2 muži) bylo proměřenou pouze soupravou ravo PNS-Blot. Převážnou část pacientů tvoří ženy v průměrném věku 64 let. Muži mají průměrný věk 60 let. Podařilo se nám detekovat onkoneurální protilátky v séru 5 pacientů soupravou ravo PNS-Blot a v séru 5 pacientů soupravou IMMCO Immublot Anti-Neuronal Antibody. Celkově jsme detekovali protilátky v séru pouze 9 pacientů, protože jeden pacient vykazoval pozitivitu v protilátkách u obou souprav. Porovnáním výsledků 28 pacientů proměřených oběmi soupravami jsme ověřovali citlivost jednotlivých souprav. Z 28 proměřených vzorků se nám nepodařilo získat

- 57 -

žádný vzorek, který by vykazoval pozitivitu ve stejné protilátce u obou souprav zároveň. Protože souprava IMMCO Immublot Anti-Neuronal Antibody neumožňuje detekci všech základních protilátek, porovnávali jsme pouze protilátky anti-Hu, anti-Yo, anti-Ri., které lze detekovat u obou souprav. Ze tří základních protilátek jsme soupravou ravo PNS-Blot detekovali protilátky anti-Yo, a to pouze u jednoho pacienta. Šlo o ženu ve věku 75 let s diagnózou C503 (ZN – dolní vnitřní kvadrant prsu). Pittockova studie uvádí, že z 60 000 pacientů testovaných na onkoneurální protilátky bylo 101 pacientů pozitivních na protilátky anti-Yo a z toho 9 pacientů mělo nádor prsu, 43 pacientů mělo nádor vaječníku, 9 jich mělo nádor dělohy a zbytek pacientů neměl žádné nádorové onemocnění (Pittock S. J. et al., 2004). Studie Monstadové uvádí, že z 974 pacientů s různými typy nádorového onemocnění bylo 8 pacientů pozitivních na protilátky anti-Yo, přičemž 3 pacienti měli nádor prsu, 3 pacienti měli nádor vaječníku, 1 pacient měl nádor dělohy a 1 pacient měl SCLC (Monstad S. E. et al., 2009). Jiná studie od Monstadové uvádí, že z 810 testovaných pacientů (557 mělo nádor vaječníku, 253 mělo nádor prsu) byly protilátky anti-Yo nalezeny u 13 pacientů s nádorem vaječníku a u 4 pacientů s nádorem prsu. Všichni tito pacienti byli ženy v průměrném věku 63 let (Monstad S. E. et al., 2006). Studie Storseinové z roku 2011 uvádí, že z 555 testovaných pacientů na onkoneurální protilátky bylo 20 pacientů pozitivních na protilátky anti-Yo, kdy 1 pacient měl nádor prsu. Převážná většina těchto pacientů měla nádor vaječníku. Všichni tito pacienti byli ženy v průměrném věku 65 let (Storstein A. et al., 2011). Potvrdili jsme, že protilátky anti-Yo jsou typické pro ženy s nádorem prsu v průměrném věku 63 let. Soupravou ravo PNS-Blot byla dále detekována protilátka anti-Amphiphysin ve skupině 28 testovaných vzorků. Tato protilátka byla detekována u ženy ve věku 53 let s diagnózou C504 (ZN – horní zevní kvadrant prsu). Byla provedena studie, ve které detekovali protilátky anti-Amphiphysin v séru 63 pacientů z celkového počtu přibližně 120 000 pacientů. Z 63 pacientů pozitivních na protilátky anti-Amphiphysin mělo 16 pacientů (16 žen) nádor prsu, 27 pacientů (10 žen, 17 mužů) mělo SCLC a u zbytku nebyl nalezen žádný nádor. Ženy s nádorem prsu měly průměrný věk 57 let (Pittock S. J. et al., 2005). Jiná Pittockova studie uvádí, že z celkového počtu přibližně 60 000 pacientů bylo 26 pacientů pozitivní na protilátky anti-Amphiphysin, z toho 8 pacientů mělo nádor prsu a 10 pacientů mělo SCLC (Pittock S. J. et al., 2004). Studie Monstadové uvádí, že z 974 pacientů s různými typy nádorového onemocnění bylo 7 pacientů pozitivních na protilátky anti-Amphiphysin, přičemž 2 pacienti měli nádor prsu a 5 pacientů mělo SCLC (Monstad S. E. et al., 2009). Studie Storseinové z roku 2011 uvádí, že z 555 testovaných pacientů na onkoneurální protilátky byli 4 pacienti (2 ženy, 2 muži) pozitivní na protilátky anti-Amphiphysin, ale žádný z těchto pacientů

- 58 -

neměl nádor prsu. Jeden pacient měl nádor močového měchýře, 3 pacienti měli SCLC (Storstein A. et al., 2011). Potvrdili jsme, že protilátky anti-Amphiphysin se vyskytují u žen s nádorem prsu ve věku přibližně 57 let. Naše pacientka v anamnéze vykazuje příznaky svalové ztuhlosti postihující páteř. Tyto příznaky v kombinaci s nádorem prsu a protilátkami anti-Amphiphysin nasvědčují Stiff-person syndromu (Butler M. H. et al. 2000). U této ženy byly také detekovány protilátky anti-Yo, ale soupravou IMMCO Immublot Anti-Neuronal Antibody. Tyto protilátky vykazovaly pouze slabou pozitivitu. Není známa žádná studie, ve které by pacient s nádorem prsu a se Stiff-person syndorem vykazoval pozitivitu v protilátkách anti-Yo. Na základě literatury a nepotvrzení pozitivity soupravou ravo PNS-Blot usuzujeme, že šlo o falešnou pozitivitu. Soupravou IMMCO Immublot Anti-Neuronal Antibody jsme detekovali protilátky u 4 žen. Dvě ženy vykazovaly pozitivitu v protilátkách anti-Yo a dvě ženy v protilátkách anti-Ri. Anti-Yo pozitivní ženy byly ženy ve věku 60 let s diagnózou C504 (ZN – horní zevní kvadrant prsu) a ve věku 63 let s diagnózou C509 (ZN – prs). Po srovnání s výše uvedenou literaturou jsme potvrdili, že protilátky anti-Yo jsou typické pro ženy s nádorem prsu v průměrném věku 63 let. Žena ve věku 63 let s diagnózou C509 vykazuje pouze slabou pozitivitu. Protože tato žena v anamnéze nevykazuje žádné neurologické příznaky a pozitivita nebyla prokázaná citlivější soupravou (ravo PNSBlot), domníváme se, že se opět jedná o falešnou pozitivitu. Anti-Ri pozitivní ženy byly ženy ve věku 82 a 81 let s diagnózou C504 (ZN – horní zevní kvadrant prsu). Pittockova studie uvádí, že ze 75 000 testovaných pacientů bylo 34 pacientů pozitivních na protilátky anti-Ri, z toho 9 pacientů mělo nádor prsu. Většina pacientů s pozitivními anti-Ri protilátkami měla SCLC (Pittock S. J. et al., 2003). Jiná Pittockova studie uvádí, že z přibližně 60 000 testovaných pacientů na onkoneurální protilátky bylo 17 pacientů pozitivních na protilátky anti-Ri a z toho 3 pacienti měli nádor prsu, 5 pacientů mělo SCLC a zbytek pacientů neměl žádné nádorové onemocnění (Pittock S. J. et al., 2004). Studie Monstadové uvádí, že z 974 pacientů s různými typy nádorového onemocnění bylo 6 pacientů pozitivních na protilátky anti-Ri, přičemž 1 pacient měl nádor prsu, 1 pacient měl nádor vaječníku, 1 pacient měl nádor dělohy a 3 pacienti měli SCLC (Monstad S. E. et al., 2009). Studie Knudsenové z roku 2006 uvádí, že z 1010 testovaných pacientů (200 mělo SCLC, 253 mělo nádor prsu, 557 mělo nádor vaječníku) byly protilátky anti-Ri nalezeny u 9 pacientů s SCLC, 2 pacientů s nádorem prsu a 1 pacienta s nádorem vaječníku (Knudsen A. et al., 2006). Studie Storseinové z roku 2011 uvádí, že z 555 testovaných pacientů na onkoneurální protilátky byli 2 pacienti pozitivní na protilátky anti-Ri, kdy 1 tento pacient měl nádor prsu a 1 měl SCLC. V obou případech šlo o ženy. Věk ženy s nádorem prsu byl 84 let (Storstein A. et al., 2011). Nádorová onemocnění prsu jsou

- 59 -

typická pro ženy. Výskyt nádorového onemocnění prsu u mužů je velice nízký. Představuje přibližně 1 % všech nádorových onemocnění prsu (Giordano S. H. et al., 2004). Existuje studie popisující muže s nádorem prsu, v jehož séru byly detekovány protilátky ani-Ri (Heeyoung K. et al., 2009). Potvrdili jsme, že protilátky anti-Ri se vyskytují u žen s nádorem prsu v průměrném věku 81 let. Žena ve věku 82 let vykazuje pouze slabou pozitivitu. Protože tato žena v anamnéze nevykazuje žádné neurologické příznaky a pozitivita nebyla prokázaná citlivější soupravou (ravo PNS-Blot), domníváme se, že i v tomhle případě se opět jedná o falešnou pozitivitu. Porovnáním souprav jsme zjistili, že souprava IMMCO Immublot Anti-Neuronal Antibody poskytuje ve výsledku plno nespecifických pásů (bandů), a proto je těžké určit pozitivitu protilátek. Naopak souprava ravo PNS-Blot ve výsledku neposkytuje žádné nespecifické pásy, proto je určení pozitivity protilátek jednoduší. Porovnáním naředěných pozitivních kontrol obou souprav jsme zjistili, že vyšší citlivost má souprava ravo PNS-Blot. Výsledky soupravy ravo PNS-Blot považujeme za správné, protože tato souprava má vyšší citlivost a detekované protilátky u obou žen jsou typické pro jejich diagnózy. Na základě získaných informací považujeme výsledky u soupravy IMMCO Immublot Anti-Neuronal Antibody za falešně pozitivní, protože byla detekována pouze velmi slabá pozitivita. Navíc antigeny Ri se nenachází na pozitivní kontrole, a proto nemůžeme z jistotou říct, kdy se jedná o pozitivní výsledek na protilátky anti-Ri. Z těchto důvodů soupravu IMMCO Immublot Anti-Neuronal Antibody pro stanovení paraneoplastických protilátek nedoporučujeme. Z 10 pacientů (8 žen, 2 muži), kteří byli proměřeni pouze soupravou ravo PNS-Blot, se nám podařilo detekovat protilátky u 2 žen a 1 muže. Žena ve věku 48 let s diagnózou C509 (ZN – prs) vykazovala pozitivitu v protilátkách anti-Yo. Podle výše uvedených studií se nám potvrdilo, že protilátky anti-Yo jsou typické pro ženy s diagnózou C509. Studie z roku 2008 popisuje ženu ve věku 32 let, která vykazovala pozitivitu v protilátkách anti-Yo a měla nádor prsu (Ogita S. et al., 2008). Potvrzuje se nám, že žena s protilátkami anti-Yo a nádorem prsu může být i s nižším věkem než průměrných 63 let. Pozitivitu v protilátce anti-Yo vykazovala také žena ve věku 46 let s diagnózou C210 (ZN – řiť). Ve studii Storsteinové z roku 2011 byl uveden pacient, který měl nádor střeva a tento pacient byl pozitivní na protilátky anti-Yo. Jednalo se o muže ve věku 77 let (Storstein A. et al., 2011). V literatuře nebyl nalezen žádný další případ pacienta pozitivního na protilátky anti-Yo, který by měl nádor střeva nebo konečníku. Protilátky anti-Yo nejsou typické pro tuto diagnózu. Výsledek ukazuje, že tato žena by mohla mít nediagnostikovaný nádor v oblasti hrudi. Podle nádorových markerů této ženy by se mohlo jednat s velkou pravděpodobností o nádor prsu.

- 60 -

Muž ve věku 59 let a s diagnózou D381 (novotvar NNCH – průdušnice, průdušky a plíce) vykazoval pozitivitu v protilátce anti-Ma2. Studie Monstadové z roku 2009 uvádí, že z 974 pacientů s různými typy nádorového onemocnění bylo 8 pacientů pozitivních na protilátky anti-Ma2, přičemž 2 pacienti měli SCLC, 4 pacienti měli nádor prsu a 2 pacienti měli nádor dělohy. (Monstad S. E. et al., 2009). Studie Storseinové z roku 2011 uvádí, že z 555 testovaných pacientů na onkoneurální protilátky bylo 5 pacientů pozitivních na protilátky anti-Ma2, z toho 1 pacient měl SCLC, 1 pacient nádor prsu a 1 pacient nádor ledvin. Pacient s SCLC byl muž ve věku 69 let (Storstein A. et al., 2011). Studie Hoffmanna z roku 2008 prezentuje 8 pacientů mužského pohlaví pozitivních na protilátky anti-Ma2, kdy 6 těchto pacientů má nádor varlat a u 2 pacientů nebyl nalezen žádný nádor. Průměrný věk mužů byl 49 let (Hoffman L. A. et al., 2008). Prokázali jsme, že protilátky anti-Ma2 se mohou vyskytovat u pacientů s nádorem plic. Studie uvádí, že se protilátky anti-Ma2 vyskytují ve větší míře u mužů v průměrném věku přibližně 50 let, což se nám také potvrdilo. Pacienti s anti-Ma2 protilátkami jsou převážně muži s nádorem varlete, což se nám nepotvrdilo. Z našich detekovaných protilátek se nejvíce vyskytuje protilátka anti-Yo, což se shoduje s dostupnou literaturou. Ostatní protilátky (anti-Ri, anti-Amphiphysin, anti-Ma2) se vyskytují vůči protilátce anti-Yo mnohem méně, což se také shoduje s literaturou. Studie uvádí, že se paraneoplastické protilátky vyskytují u mužů a žen staršího věku, což se nám potvrdilo. Dále studie uvádí, že se protilátky anti-Yo, anti-Ri a antiAmphiphysin vyskytují více u nádorů, které jsou typické pro ženy. Jedná se o nádory prsu, vaječníku a dělohy. Proto se tyto protilátky vyskytují více u žen, což se nám také potvrdilo. Dále se nám potvrdilo, že protilátky anti-Ma2 jsou více typické pro muže, jak uvádí literatura. Žádný protokol na léčbu PNS zatím neexistuje (Darnell R. B. & Poster J. B., 2003). Rozvoj účinné léčby pro PNS je ztížen vzácností těchto syndromů a rychlou progresí syndromů, která může způsobit nevratnost neuronálního poškození (Greenlee J. E., 2010). Léčba PNS zahrnuje léčbu nádoru, symptomatickou a Imunomodulační léčbu. Protinádorová terapie je nezbytná u pacientů vykazující pozitivitu v paraneoplastických protilátkách. Cílem této terapie je vyhledat nádor a podle jeho lokalizace nasadit patřičnou léčbu (Honnorat J. & Antoine J. Ch., 2007). Cílem symptomatické terapie je zmírnění příznaků nádorového onemocnění. Symptomatická léčba může pomoci ovlivnit klinický průběh PNS, ale nemá žádný léčebný účinek na PNS (Grisold W. et al., 1995). Imunomodulační léčbou se rozumí veškeré léčebné postupy, které zasahují do imunitního systému. Použití kortikosteroidů, intravenosních IgG, cyklofosfamidu a výměny plazmy patří k nejužívanějším prostředkům imunomodulační terapie (Honnorat

- 61 -

J. & Antoine J. Ch., 2007). Nejlepší cesta ke stabilizaci PNS je začít léčit nádory co nejdříve (Kannoth S., 2012).

- 62 -

6. Závěr Našim cílem bylo zavedení metody detekce paraneoplastických protilátek do rutinní laboratorní praxe na oddělení Klinické biochemie Fakultní nemocnice Olomouc a vytvoření SOPVu nebo-li standardního operačního postupu vyšetření, který se vyhotovuje při každém zavedení nové metody. Tento postup obsahuje všechny důležité informace potřebné pro správné provedení metody. Oba tyto cíle jsme splnili. Z celkového počtu 60 pacientů se nám podařilo detekovat paraneoplastické protilátky v séru 10 pacientů. S pozitivních pacientů byl diagnostikován s PNS pouze 1 pacient, který vykazoval predispozici k nádorovému onemocnění. PNS jsou vzácná onemocnění. Odhaduje se, že pouze 1 % všech pacientů s nádorovým onemocněním má klinicky způsobující PNS. Nalezením 1 takového pacienta jsme splnili cíl naší práce. Souprava ravo PNS-Blot je s ohledem na množství stanovení, citlivosti a odečítání výsledků mnohem lepší soupravou než souprava IMMCO Immublot Anti-Neuronal Antibody, a proto tuto soupravu doporučujeme pro stanovení paraneoplastických protilátek. Imuno-dot-bloting je jednoduchá, časově nenáročná, vysoce specifická metoda, která umožňuje stanovení paraneoplastických protilátek v séru a likvoru. Na trhu zatím lepší metoda stanovení neexistuje. Stanovení paraneoplastických protilátek se v současné době provádí pouze v několika málo laboratořích v ČR. Vzhledem k tomu, že detekce paraneoplastických protilátek ulehčuje diagnózu PNS a napomáhá odhalit preexistující nádorové onemocnění, mělo by se stanovení paraneoplastických protilátek zavést do každé rutinní laboratoře.

- 63 -

7. Literatura Antoine J. C., Honnorat J., Vocanson C., Koenig F., Aguera M., Belin M. F., Michel D. (1993) Posterior uveitis, paraneoplastic encephalomyelitis and auto-antibodies reacting with developmental protein of brain and retina. J. Neurol. Sci. 117, 215–223.

Bálková O., (2012), HE4 – nový nádorový marker pro ovariální karcinom s širokým diagnostickým využitím. Labor Aktuell 34-36.

Barnard W. (1926) The nature of the ‘oat-celled sarcoma’ of the mediastinum. J. Pathol. 29, 241-244.

Beukelaar J. W., Milikan J. C, Verjans G. M., Graf M. T., Norden Y., Lamers Ch., Bent M. J., Bromberg J. E., Hulsenboom E., Sintnicolaas K., Gratama J. W., Sillevis Smitt P. A. (2009) No evidence for the presence of HuD-specific T cells in the cerebrospinal fluid of patiens with Hu-associated paraneoplastic neurological syndromes. J. Neuroal. 256, 279-282.

Beukelaar J. W., Sillevis Smitt P. A. (2006) Managing Paraneoplastic Neurological Disorders. Oncologist. 11, 292-305.

Brieva-Ruíz L., Hurtado M. D., Matias-Guiu X., Márquez-MEdina D., Tarragona J., Graus F. (2008) Anti-Ri-associated paraneoplastic cerebellar degeneration and breast cancer: An autopsy case study. Clin. Neurol. Neurosurg. 110, 1044-1046.

Brownson R. C., Chány J. C., Davis J. R. (1992) Gender and histologic type variations in smoking-related risk of lung cancer. Epidemiology 3, 61-64.

Butler M. H., Hayashi A., Ohkoshi N., Cillmann C., Becker C. M., Feng G., De Camilli P., Solimena M. (2000) Autoimmunity to Gephyrin in Stiff-Man Syndrome. Neuron. 26, 307-312.

Carpentier A. F., Voltz R., DesChamps T., Poster J. B., Rosenfeld M. R. (1998) Absence of HuD gene mutations in paraneoplastic small cell lung cancer tissue. Neurology 50, 1919.

- 64 -

Compston A., Coles A. (2002) Multiple sclerosis. Lancet 359, 1221-1231.

Dalmau J., Rosenfeld M. R., (2008), Paraneoplastic syndromes of the CNS. Lancet Neurol. 7, 327-40.

Dalmau J., Graus F., Rosenblum M. K., Posner J. B., (1992), Anti-Hu-associated paraneoplastic encephalomyelitis/sensory neuronopathy. A clinical study of 71 patients, Medicine 71, 59-72.

Darnell R. B., Poster J. B. (2003) Paraneoplastic Syndromes Involving the Nervous System. N. Engl. J. Med. 349, 1543-1554.

Giordano S. H., Cohen D. S., Buzdar A. U., Perkins G., Hortobagyi G. N. (2004) Breast carcinoma in men: a population-based study. Cancer 101, 51-57.

Gozzard P., Maddison P. (2011) Republished: Which antipody and which cancor in which paraneoplastic syndromes? Postgrad. Med. J. 87, 60-70.

Graus F, Delattre J. Y., Antoine J. C., Dalmau J., Giometto B., Grisold W., Honnorat J., Smitt P. S., Vedeler Ch., Verschuuren J. J., Vincent A., Voltz R. (2004) Recommended diagnostic criteria for paraneoplastic neurological syndromes. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 75, 1135-1140.

Graus F., Keime-Guibert F., Reñe R., Benyahia B., Ribalta T., Ascaso C., Escaramis G., Delattre J. Y. (2001) Anti-Hu-associated paraneoplastic encephalomyelitis: analysis of 200 patients. Brain 124, 1138-1148.

Graus F., Saiz A., Dalmau J. (2010) Antibodies and neuronal autoimmune disorders of the CNS. J. Neuroal. 257, 509-517.

Greenlee J. E., Brashear H. R. (1983) Autoantibodies to cerebellar Purkinje cells in patients with paraneoplastic cerebellar degeneration and ovarian carcinoma. Ann. Neurol. 14,609-613.

Greenlee J. E. (2010) Treatment of Paraneoplastic Neurologic Disorders, Curr. Treat. Options. Neurol. 12, 212-230.

- 65 -

Grisold W., Drlicek M., Liszka-Setinek U., Wondrusch E. (1995) Anti-tumour therapy in paraneoplastic neurological disease. Clin. Neurol. Neurosurg. 97, 106-111.

Heeyoung K., Youngmin L., Kwang-Kuk K. (2009) Anti-Ri-Antibody-Associated Paraneoplastic Syndrome in a Man with Breast Cancer Showing a Reversible Pontine Lesion on MRI. J. Clin. Neurol. 5, 151-152.

Hoffmann L.

A., Jarius

S., Pellkofer

H.L., Schueller

M., Krumbholz M., Koenig

F., Johannis W. la Fougere C., Newman T., Vincent A., Voltz R. (2008) Anti-Ma and anti-Ta associated paraneoplastic neurological syndromes: 22 newly diagnosed patients and review of previous cases. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 79, 767-773.

Honnorat J., Antoine J.-Ch. (2007) Paraneoplastic neurological syndromes. Orphanet J. Rare Dis. 2, 22.

Honnorat J. (2006) Onconeural antibodies are essential to diagnose paraneoplastic neurological syndromes. Acta Neurol. Scand. 183, 64-68.

Honnorat J., Aguera M., Zalc B., Goujet C., Quach T., Antoine J. C., Belin M. F. (1998) POP66 a paraneoplastic encephalomyelitis-related antigen, is a marker of adult oligodendrocytes. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 57, 311–322.

Honnorat J., Antoine J.C., Derrington E., Aguera M., Belin M.F. (1996) Antibodies to a subpopulation of glial cells and a 66 kD developmental protein in patients with paraneoplastic neurological syndromes. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 61, 270-278.

Honnorat J., Cartalat-Carel S., Richard D., Camdessanche J. Ph., Carpentier A. F., Rogemond V., Chapuis F., Aquera M., Decullier E., Duchemin A. M., Graus F., Antoine J. C. (2009) Onco-neural antibodies and tumour type determine survival and neurological symptoms in paraneoplastic neurological syndromes with Hu or CV2/CRMP5 antibodies. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 80, 412-416.

Hořejší V., Bartůňková J. (2009) Základy imunologien, 4. vydání, pp. 43-44, 61, 138139, 227, TRITON Praha.

Iorio R., Lennon V. A. (2012) Neural antigen-specific autoimmune disorders. Immunol. Rev. 248, 104-21.

- 66 -

Jackman D. M., Johnson B. E. (2005) Small-cell lung cancer. Lancet 366: 1385-1396.

Jubelt B., Mihai C., Li T. M., Veerapaneni P. (2011) Rhombencephalitis / Brainstem Encephalitis. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 11, 543-552.

Kannoth S. (2012) Paraneoplastic neurologic syndrome: A practical approach. Ann. Indian Acad. Neurol. 15: 6-12.

Knudsen A., Monstad S. E., Dorum A., Lonning Per E., Salvesen H. B., Drivsholm L., Aarseth J. H., Vedeler C. A. (2006) Ri antibodies in patients with breast, ovarian or small cell lung cancor determined by a sensitive immunoprecipitation technique. Cancer Immunol. Immunother. 55, 1280-1284.

Krýsl D., Marusič P. (2012) Autoimunitní limbické encefalitidy. Neurol. Prax. 13, 160164.

McKeon A., Pittock A. J. (2011) Paraneoplastic encephalomyelopathies: patology and mechanisms. Acta Neuropathol. 122, 381-400.

Monstad S. E., Knudsen A., Salvesen H. B., Aarseth J. H., Vedeler Ch. A. (2009) Onconeural antibodies in sera from patients with various types of tumours. Cancer Immunol. Immunother. 58, 1795-1800.

Monstad S. E., Storstein A., Dorum A., Knudsen A., Lonning P. E., Salvesen H. B., Aarseth J. H., Vedeler C. A. (2006) Yo antibodies in ovarian and breast cancer patients detected by a sensitive immunoprecipitation technique. Clin. Exp. Immunol. 144, 53-58.

Nestrašil I. (2005) Neurologické projevy systémových maligních nádorů. Neurol. Prax. 6, 24-27.

Ogita S., Laguna O. H., Feldman S. H., Blum R. (2008) Paraneoplastic Cerebellar Degeneration with Anti-Yo Antibody in a Patient with HER2⁄neu Overexpressing Breast Cancer: A Case Report with a Current Literature Review. Brest J. 14, 382-384.

Pittock S. J., Kryzer T. J., Lennon V. A. (2004) Paraneoplastic Antibodies Coexist and Predict Cancer, not Neurological Syndrome. Ann. Neurol. 56, 715-719.

- 67 -

Pittock S. J., Lucchinetti C. F., Lennon V. A. (2003) Anti-neuronal nuclear autoantibody type 2: Paraneoplastic Accompaniments. Ann. Neurol. 53, 580-587.

Pittock S. J., Lucchinetti C. F., Parisi J. E., Benarroch E. E., Mokri B., Stephan C. L., Kim K. K., Kilimann M. W., Lennon V. A. (2005) Amphiphysin Autoimmunity: Paraneoplastic Accompaniments. Ann. Neurol. 58, 96-107.

Prestigiacomo

C.

J.,

Balmaceda

C.,

Dalmau

J.

(2001)

Anti-Ri-associated

paraneoplastic opsoclonus–ataxia syndrome in a man with transitional cell carcinoma. Cancer 91, 1423-1428.

Psimaras D., Carpentier A. F., Rossi C. (2010) Cerebrospinal fluid study in paraneoplastic syndromes. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 81, 42-45.

Raspotnig M., Vedeler C. A., Strostein A. (2011) Onconeural antibodies in patiens with neurological symptoms: detection and clinical significance. Acta Neurol. Scand. 191, 83-88.

Roberts W. K., Darnell R. B. (2004) Neuroimmunology of the paraneoplastic neurological degenerations. Curr. Opin. Immunol. 16, 616-622.

Rogemond V., Honnorat J. (2000) Anti-CV2 autoantibodies and paraneoplastic neurological syndromes. Clin. Rev. Allergy. Immunol. 19, 51-59.

Rosenfeld M. R., Eichen J. G., Wade D. F., Posner J. B., Dalmau J. (2001) Molecular and clinical diversity in paraneoplastic immunity to Ma proteins. Ann. Neurol. 50, 339– 348.

Sabater L., Cifro X., Saiz A., Albrech J., Graus F. (2008) Analysis of antibodies to neuronal surface antigens in adult opsoclonus–myoclonus. J. Neuroimmunol. 196, 188191.

Santillan A., Bristow R. E. (2006) Paraneoplastic cerebellar degeneration in a woman with ovarian cancer. Nat. Clin. Pract. Oncol. 3, 108-112.

- 68 -

Squintani G., Bovi T., Ferigo L., Musso A. M., Ottaviani S., Moretto G., Morgante F., Tinazzi M. (2012) Efficacy of pregabalin in a case of stiff-person syndrome: Clinical and neurophysiological evidence. J. Neurol. Sci. 314, 166-168.

Storstein A., Monstad S. E., Haugen M., Mazengia K., Veltman D., Lohndal E., Aarseth J., Vedeler C. (2011) Onconeural antibodies: improved detection and clinical correlations. J. Neuroimmunol. 232, 166-170.

Suché M. (1890) Des nevrites peripheriques chez les cancereux. Rev. Med. 10, 785807.

Titulaer M. J., Soffietti R., Dalmau J., Gilhus N. E., Giometto B., Graus F., Grisold W., Honnorat J., Sillvevis Smitt P. A., Tanasescu R., Vedeler C. A., Voltz R., Verschuuren J. J., European Federation of Neurological Societies (2011) Screening for tumours in paraneoplastic syndromes: report of an EFNS Task Force. Eur. J. Neurol. 18, 19-27.

Totland C., Aarskog N. K., Eichler T. W., Haugen M. Nostbakken J. K., Monstad S. E., Salvesen H. B., Mork S., Haukanes B. I., Vedeler Ch. A. (2011) CDR antigen and Yo antibodies. Cancer Immunol. Immunother. 60, 283-289.

Totland C., Bredholt G., Haugen M., Haukanes B. J., Vedeler CH. A. (2010) Antibody to CCDC104 is associated with a paraneoplastic antibody to CDR2 (anti-Yo). Cancer Immunol. Immunother. 59, 231-237.

Vedeler C. A., Antoine J. C., Giometto B., Graus F., Grisold W., Hart I. K., Honnorat J., Sillevis Smitt P. A., Verschuuren J. J., Voltz R., Paraneoplastic Neurological Syndrome Euronetwork (2006) Management of paraneoplastic neurological syndromes: report of an EFNS Task Force. Eur. J. Neurol. 13, 682-690.

Vernino S., (2006) Paraneoplastic Neurologic Syndromes. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 6, 193-199.

Voltz R. (2002) Paraneoplastic neurological syndromes: an update on diagnosis, pathogenesis, and therapy. Lancet Neurol. 1, 294-305.

Wells E. M., Dalmau J. (2011) Paraneoplastic Neurologic Disorders in Children. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 11, 187-194.

- 69 -

Wong A. M., Musallam S., Tomlinson R. D., Shannon P., Sharpe J. A. (2001) Opsoclonus in three dimensions: oculographic, neuropathologic and modelling correlates. J. Neurol. Sci. 189, 71-81.

7. 1. Seznam hypertextových odkazů internet 1, staženo: 2013-02-27 http://www.mayoclinic.com/health/paraneoplasticsyndromes/DS00840/DSECTION=symptoms

internet 2, staženo: 2013-02-27 http://www.pnseuronet.org/pem.php

internet 3, staženo: 2013-02-27 http://www.diabetes.org.uk/Guide-todiabetes/Complications/Nerves_Neuropathy/sensory_neuropathy/

internet 4, staženo: 2013-04-01 http://www.imalab.cz/kategorie/imunochemie.aspx

internet 5, staženo: 2013-01-14 http://zdravi.e15.cz/clanek/priloha-lekarske-listy/paraneoplasticke-syndromy-aautoprotilatky-157828

internet 6, staženo: 2013-03-28 http://zdravi.e15.cz/clanek/priloha-lekarske-listy/malobunecny-karcinom-plic-463625

internet 7, staženo: 2013-03-28 http://www.linkos.cz/gynekologicke-nadory-c51-54-c56-57/nadory-vajecniku-avejcovodu/

internet 8, staženo: 2013-03-28 http://www.linkos.cz/gynekologicke-nadory-c51-54-c56-57/nadorove-onemocneni-teladelozniho/

internet 9, staženo: 2013-03-28 http://zdravi.e15.cz/clanek/priloha-lekarske-listy/maligni-nadory-vajecniku-153464

- 70 -

internet 10, staženo: 2013-03-28 http://www.cskb.cz/cskb.php?pg=doporuceni--tumorove-markery#charakter

internet 11, staženo: 2013-03-30 http://zdravi.e15.cz/clanek/priloha-pacientske-listy/pozor-na-karcinom-delozniho-hrdla450004

internet 12, staženo: 2013-03-30 http://zdravi.e15.cz/clanek/priloha-lekarske-listy/testikularni-nadory-nejcastejsimalignita-mladych-muzu-467021

internet 13, staženo: 2013-03-30 http://zdravi.e15.cz/clanek/postgradualni-medicina/nadory-vajecniku-138919

internet 14, staženo: 2013-02-17 http://www.tribune.cz/clanek/21684-paraneoplasticke-syndromy-diagnosticky-alecebny-postup

internet 15, staženo 2013-03-29 http://zdravi.e15.cz/clanek/sestra/karcinom-prsu-464792

- 71 -

8. Seznam použitých zkratek ALP

enzym alkalická fosfatasa (EC 3.1.3.1)

ANNA

anti-neuronální jaderná protilátka (z angl. Anti Neuronal Nuclear Antibody)

BCIP

5-brom-4-chlor-3-indolyl fosfát

BCR

receptor B-lymfocytu (z angl. B Cell Receptor)

BRCA

lidský gen, jehož mutací vzniká predispozice k nádoru prsu nebo vaječníku (z angl. Breast Cancer)

CA

nádorový marker (z angl. Carbohydrate Antigen)

CDR2

antigen CDR2 (z angl. Cerebellar Degeneration-Related protein2)

CEA

karcinomembryonální antigen (z angl. Carcinoembryonic Antigen)

CNS

centrální nerovový systém

CSF

mozkomíšní mok, likvor (z angl. Cerebrospinal Fluid)

CV2

protilátka anti-CV2

HLA

histokompatibilní systém (z angl. Human Leucocyte Antigen)

IgG

protilátka – imunoglobulin třídy G

LIS

laboratorní informační systém

NBT

nitro blue tetrazolium chlorid

NNCH

novotvar nejistého nebo neznámého chování

NSE

neuron specifická enolasa (EC 4.2.1.11)

OMS

opsoklonus-myoklonus syndrom

PCA-1

protilátka

proti

Purkyňovým

buňkám

(z

angl.

Purkinje

Cell

Autoantibodies) PCD

paraneoplastická mozečková degenerace (z angl. Paraneoplastic Cerebellar Degeneration)

PEM

paraneoplastická encefalomyelitida

PLE

paraneoplastická limbická encefalitida

PNS

paraneolastické neurologické syndromy

ROMA

diagnostický test (z angl. Risk of Ovaria Malignancy Algorithm)

SCC

antigen skvamozních buněk (z angl. Squamous Cell Carcinoma Antigen)

SCLC

malobuněčný plicní karcinom (z angl. Small-Cell Lung Cancer)

SSN

subakutní senzorická neuropatie

TCR

receptor T-lymfocytu (z angl. T Cell Receptor)

TPA

tkáňový polypeptidový antigen

ZN

zhoubný nádor

- 72 -

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI. Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie

Recommend Documents