UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie
Vliv klinicky využívaných psychofarmak, benzodiazepinů, na transkripční aktivitu xenoreceptorů v lidských nádorových liniích
DIPLOMOVÁ PRÁCE
Autor:
Bc. Kateřina Kubešová, Dis.
Studijní program:
M1406 Biochemie
Studijní obor:
Biochemie
Forma studia:
Prezenční
Vedoucí práce:
Ing. Radim Vrzal, Ph.D.
Termín odevzdání práce:
26.4. 2010
„Prohlašuji, že jsem předloženou diplomovou práci vypracovala samostatně za použití citované literatury.“ Veškerá data této diplomové práce jsou součástí publikace, která je připojena jako příloha na konci práce. V Olomouci dne 26.4.2010
………………………… Vlastnoruční podpis
Poděkování Děkuji vedoucímu mé diplomové práce Ing. Radimu Vrzalovi, Ph.D. za cenné rady, náměty a připomínky, které mi během zpracování zadané práce poskytl. Dále také děkuji vedoucímu Katedry Buněčné biologie a genetiky Prof. Zdeňkovi Dvořákovi, Ph.D., který mi byl při provádění diplomové práce taktéž nápomocen a všem zaměstnancům této katedry za velmi vstřícné vystupování a ochotu.
Bibliografická identifikace: Jméno a příjmení autora Název práce Typ práce Pracoviště Vedoucí práce Rok obhajoby práce Abstrakt
Klíčová slova Počet stran Počet příloh Jazyk
Kateřina Kubešová Vliv klinicky využívaných psychofarmak, benzodiazepinů, na transkripční aktivitu xenoreceptorů v lidských nádorových liniích Diplomová Katedra Buněčné biologie a genetiky Ing. Radim Vrzal, Ph.D. 2010 Benzodiazepiny jsou široce využívány ve farmakoterapii pro své anxiolytické, myorelaxační, hypnotické, amnestické a antikonvulzivní vlastnosti. Nicméně, některé z nich u lidí způsobují poškození jater. Je zajímavé, že tyto látky nebyly testovány na schopnost indukovat cytochrom P450 a to i přes to, že jsou v praxi využívány přes 50 let. Cílem této diplomové práce bylo studium schopnosti indukovat CYP1A2 a CYP3A4 v primární kultuře lidských hepatocytů u Alprazolamu, Bromazepamu, Chlordiazepoxidu, Clonazepamu, Diazepamu, Lorazepamu, Medazepamu, Midazolamu, Nitrazepamu, Oxazepamu, Tetrazepamu a Triazolamu. Uvedené benzodiazepiny byly testovány v terapeutických koncentracích a v koncentracích odpovídajících plazmatickým hladinám u intoxikovaných pacientů. Byla nalezena slabá, ale významná indukce CYP3A4 u Midazolamu a Medazepamu. Ostatní benzodiazepiny neindukovaly expresi CYP3A4. Žádná z testovaných sloučenin neindukovala CYP1A2 a to ani v jedné ze třech nezávislých kultur lidských hepatocytů. Kromě toho, bylo pomocí metodiky Gene Reporter Assay zjištěno, že testované benzodiazepiny neaktivovaly aryluhlovodíkový receptor (AhR). Tato metodika byla prováděna pomocí transfekce hepatokarcinomové linie buněk. Výsledkem je zjištění, že Alprazolam, Bromazepam, Chlordiazepoxid, Clonazepam, Diazepam, Lorazepam, Nitrazepam, Oxazepam, Tetrazepam a Triazolam mohou být považovány za bezpečné léky na základě jejich neschopnosti indukovat enzymy CYP1A2 a CYP3A4. Slabá schopnost Medazepamu a Midazolamu mírně indukovat CYP3A4 v lidských hepatocytech může představovat zdroj mezilékových interakcí u pacientů léčených těmito látkami. Lidské hepatocyty, cytochrom P450, benzodiazepiny, indukce enzymů 69 1 Český
Bibliographical identification: Autor’s first name and surname Title Type of thesis Department Supervisor The year of presentation Abstract
Keywords Number of pages Number of appendices Language
Kateřina Kubešová The effect of clinically used benzodiazepines on transcriptional aktivity of xenoreceptors in human cancer cell lines Master Department of Cell Biology and Genetics Ing. Radim Vrzal, Ph.D. 2010 Benzodiazepines have wide-spread used in pharmacotherapy for their anxiolytic, myorelaxant, hypnotic, amnesic and anticonvulsive properties. However, some of them induce liver injury in humans. Despite benzodiazepines are used in clinics over 50 years, they have not been surprisingly tested for capability to induce major drug-metabolizing cytochromes P450. In the current study, I have examined the potency of Alprazolam, Bromazepam, Chlordiazepoxide, Clonazepam, Diazepam, Lorazepam, Medazepam, Midazolam, Nitrazepam, Oxazepam, Tetrazepam and Triazolam to induce CYP1A2 and CYP3A4 in primary cultures of human hepatocytes. Benzodiazepines were tested in therapeutic concentrations and in concentrations corresponding to their plasma levels in intoxicated patients. It was found weak but significant induction of CYP3A4 mRNA by Midazolam and Medazepam, while other benzodiazepines did not induce CYP3A4 expression. None of the tested compounds induced CYP1A2 mRNA in three independent human hepatocytes cultures. In addition, employing Gene Reporter Assays with transiently transfected hepatocarcinoma cells, it was found that tested benzodiezpines did not activate aryl hydrocarbon receptor (AhR). In conclusion, Alprazolam, Bromazepam, Chlordiazepoxide, Clonazepam, Diazepam, Lorazepam, Nitrazepam, Oxazepam, Tetrazepam, Triazolam can be considered as safe drugs in term of their inability to induce cytochrome P450 enzymes CYP1A2 and CYP3A4. A weak potency of Medazepam and Midazolam to induce CYP3A4 mRNA in human hepatocytes may represent a source of drugdrug interactions in patients treated with these compounds. Human hepatocytes, Cytochrome P450, Benzodizepines, Enzyme induction 69 1 Czech
OBSAH 1.
ÚVOD ...................................................................................... 1
2.
CÍL PRÁCE ………………………………………………….
3.
TEORETICKÁ ČÁST ………………………………………… 4
3.1
BENZODIAZEPINY ……………………………………………
4
3.1.1
Charakteristika ………………………………………………………...
4
3.1.2
Rozdělení ……………………………………………………………...
4
3.1.3
Syntéza …………………………………………………………….......
6
3.1.4
Vlastnosti ……………………………………………………………...
8
3.2
MECHANISMUS ÚČINKU NA CENTRÁLNÍ NERVOVOU SOUSTAVU 17
3.2.1
Kyselina γ-aminomáselná ……………………………………………..
17
3.2.2
GABAA- receptor ……………………………………………………...
18
3.2.3
GABAB, GABAC – receptor …………………………………………... 20
3.3
BIOTRANSFORMACE ………………………………………… 20
3.3.1
Absorbce a distribuce léčiv ……………………………………………
20
3.3.2
Osud xenobiotik v organismu …………………………………………
21
3
3.3.2.1
I.Fáze (oxidačně/redukční) ……………………………………………….
21
3.3.2.2
II.Fáze (konjugační) ………………………………………………………
22
3.3.2.3
III.Fáze (transmembránový transport) …………………………………..
22
3.4
CYTOCHROM P450 ………………………………………….. 23
3.4.1
Názvosloví …………………………………………………………….
23
3.4.2
Lokalizace a struktura …………………………………………………
23
3.4.3
Funkce cytochromu P450 ……………………………………………... 24
3.4.4
Vybrané podrodiny cytochromu P450 ………………………………...
26
3.4.4.1
Podrodina CYP1A …………………………………………………………….
26
3.4.4.2
Podrodina CYP3A …………………………………………………………….
28
3.5
REGULACE ENZYMŮ KATALYZUJÍCÍCH BIOTRANSFORMAČNÍ REAKCE XENOBIOTIK ………………………………………... 30
3.5.1
Aryluhlovodíkový receptor (AhR) ……………………………………. 30 Funkce AhR ………………………………………………………..
30
Pregnanový X receptor (PXR) ………………………………………...
31
Funkce PXR ……………………………………………………….
32
3.5.1.1
3.5.2
3.5.2.1
3.6
METABOLISMUS BENZODIAZEPINŮ ………………………….
32
4.
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST …………………………………….
34
4.1
MATERIÁL …………………………………………………... 34
4.1.1
Chemikálie …………………………………………………………….
34
4.1.1.1
Izolace RNA, reverzní transkripce na cDNA, RT-PCR …………………..
34
4.1.1.2
Gene Reporter Assay (GRA) …………………………………………………
35
4.1.2
Přístroje a vybavení …………………………………………………… 36
4.2
METODY …………………………………………………….
37
4.2.1
Kvantifikace genové exprese ………………………………………….
37
4.2.1.1
Primární kultura lidských hepatocytů ………………………………………
37
4.2.1.2
Izolace RNA z lidského vzorku jater…………………………………………
37
4.2.1.3
Přepis na cDNA ……………………………………………………………….
38
4.2.1.4
Polymerázová řetězová reakce v reálném čase (RT-PCR) ……...
39
4.2.1.5
Statistické vyhodnocení testovaných vzorků ……………………………….
39
Gene Reporter Assay (GRA) ………………………………………….
40
4.2.2
4.2.2.1
Princip metody ………………………………………………………………… 40
4.2.2.2
Příprava buněk hepatocellulárního karcinomu pro GRA ………………..
41
4.2.2.3
Počítání buněk hepatocellulárního karcinomu ……………………………
42
4.2.2.4
Vlastní měření reportérového genu pro luciferasu ……………………….
42
4.2.2.5
Statistické vyhodnocení testovaných vzorků ……………………………….
4.3 4.3.1
44 VÝSLEDKY ……………………………………………………. 44 Účinek benzodiazepinů na expresi CYP1A1/2 a CYP3A4 mRNA v primární kultuře lidských hepatocytů (RT-PCR) …………………… 44
4.3.2
Účinek benzodiazepinů na aktivaci AhR a PXR xenoreceptorů v hepatocellulárním karcinomu (GRA) ……………………………….. 54
4.4
DISKUZE ……………………………………………………… 57
5.
ZÁVĚR ………………………………………………………... 58
6.
POUŽITÁ LITERATURA ……………………………………….. 59
7.
SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK …………………………….... 66
8.
PŘÍLOHA ……………………………………………………… 69
1. ÚVOD Lidský organismus je v dnešní době vystaven účinku velkého množství chemických látek. Velké procento z nich tvoří látky přírodního původu, ale také látky syntetické, které jsou pro náš organismus cizorodé a jsou označovány jako xenobiotika. Nacházejí se všude kolem nás. Patří sem nejen velká skupina látek, která je viníkem znečištění životního prostředí, ale také jsou to léky, různé přísady do potravin, aj. Během evoluce se proto lidský organismus musel adaptovat na různé změny. Jinými slovy si musel vytvořit jakýsi „obranný systém“ proti nízkomolekulárním látkám. Ten je při vstupu cizorodé látky aktivován a jeho úkolem je transformovat látku tak, aby byla snadno odstranitelná z organismu. Jelikož jsou xenobiotika většinou látky lipofilní (hydrofobní), systém funguje tak, že jejich strukturu metabolicky přemění na látku hydrofilní, která je snadno eliminována z organismu. Pokud tento obranný systém funguje tak jak má, tak ve velké většině případů snižuje riziko akumulace cizorodých látek v organismu, čímž nedochází k poškození jednotlivých tkání, buněk či orgánů. Samozřejmě existují výjimky, které poškozují buňky a tkáně právě v důsledku metabolizace (např. benzopyren). Jelikož současná populace této planety žije ve velkém shonu, asi není náhodou, že psychofarmaka patří mezi nejužívanější léčiva po celém světě. Do této skupiny látek patří i benzodiazepiny (BZP). Jsou to jedny z nejvíce používaných psychofarmak. Mají široké spektrum farmakologických vlastností, od sedativních přes hypnotické, anxiolytické, antikonvulzivní, amnestické až po svalové relaxanty. Jednotlivé BZP se liší nejen svými farmakologickými vlastnostmi jako takovými, ale také jejich kombinací. Tzn., že určitý typ BZP může mít jednu jedinou farmakologickou vlastnost, ale také dvě nebo tři. Tyto vlastnosti dělají BZP velice užitečnými z medicínského hlediska (tj. při úzkosti, rozčilení, záchvatech, svalových křečích, u osob trpících nespavostí, alkoholovými abstinenčními příznaky a v neposlední řadě také jako premedikace při různých lékařských zákrocích). Na druhou stranu, ale jednotlivé kombinace BZP mohou způsobovat mezilékové interakce, které nejsou doposud ještě příliš objasněny. Očekávalo by se tedy, že tyto léky budou dostupné pouze na lékařský předpis. Opak je ale pravdou. V současné době je velká většina léků volně dostupných. A jejich vzájemnou kombinací se zvyšuje riziko jejich mezilékových interakcí (Kremers, 2002). Mezilékové interakce BZP se zjišťují na základě in vitro metodiky „sledování aktivity biotransformačních enzymů“. Aktivita některých těchto enzymů je významně ovlivňována změnou jejich exprese, která je ovlivněna fyziologickými faktory (hormony, vitamíny, růstové faktory, žlučové kyseliny, cytokiny), vnějšími vlivy (léky, cigarety, UV záření, výživy, environmentální polutanty) a patofyziologickými faktory (zánět, infekce). Na transkripční
-1-
úrovni je exprese některých těchto genů regulována dvěma jadernými receptory, pregnanovým X receptorem (PXR) a aryluhlovodíkovým receptorem (AhR). Obsahem této diplomové práce bylo zjistit, zda vybrané BZP ovlivňují expresy genů vybraných biotransformačních enzymů kontrolovaných výše zmíněnými receptory.
-2-
2. CÍL PRÁCE Teoretická část
Provést literární rešerši týkající se BZP (vlastnosti, rozdělení, syntéza a charakterizace
konkrétních BZP, které byly používány v této práci), mechanismu účinku těchto látek, biotransformace a cytochromu P450 (CYP). Experimentální část
Otestovat sadu vybraných BZP (Alprazolam, Bromazepam, Clonazepam, Diazepam,
Chlordiazepoxid, Lorazepam, Medazepam, Midazolam, Nitrazepam, Oxazepam, Tetrazepam, Triazolam) na možnost vyvolávat mezilékové interakce za využití metodiky RT-PCR (semikvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase).
Na základě získaných dat pak otestovat výše zmíněné BZP, jejichž hodnota je větší než
1,5 násobek negativní kontroly alespoň u dvou kultur, na schopnost transaktivovat promotor pro CYP1A1 a CYP3A4 za využití metodiky Gene Reporter Assay.
-3-
3. TEORETICKÁ ČÁST 3.1 Benzodiazepiny 3.1.1 Charakteristika První historicky syntetizovaný BZP byl chlordiazepoxid. Objevil jej roku 1955 rakouský vědec Leo Henryk Sternbach, který v době svého objevu pracoval pro švýcarskou farmaceutickou společnost Hoffman-La Roche. Po prvotním nadšení, kdy se předpokládalo, že tyto léky budou výbornou náhražkou barbiturátů, se zjistilo, že jsou tyto látky vysoce návykové a jejich užívání by proto nemělo být dlouhodobé (Bignell, 2008). V současnosti jsou BZP jedny z nejvíce používaných psychofarmak. Jsou to léky předepisované pacientům s poruchou centrálního nervového systému. Tyto léky mají potlačit strach, pocit napětí a utlumit negativní emoce, které pacienty zužují. Jsou tedy využívány jako sedativa (látky navozující zklidnění a v dostatečné dávce též spánek), hypnotika (látky navozující spánek), anxiolytika (léky pro potlačení strachu a úzkosti), myorelaxancia (léčiva uvolňující křeče) a antiepileptika (léčiva snižující nebo úplně odstraňující záchvaty) (Lincová et al., 2005).
3.1.2 Rozdělení Jednotlivé BZP se mezi sebou liší svými farmakologickými vlastnostmi. Dalším rozdílem je míra jejich dávkování. Odlišnost v síle dávkování je důležitá, ale bohužel ani v dnešní době není příliš doceněna a vyskytují se případy, kdy lidé užívají velké dávky silných BZP jako jsou Alprazolam (Xanax), Lorazepam (Ativan) nebo Clonazepam (Klonopin). Proto je velice důležité znát, jak jednotlivé druhy léků působí na lidský organismus (tzn. jaká je doba jejich účinku v organismu a následně jaká je rychlost jejich vyloučení z organismu). Podle těchto důležitých kritérií jsou také rozdělovány. Podle průměrné doby vylučování z organismu na ultrakrátké, krátké až střední a dlouhé a podle intenzity působení uvnitř organismu na vysoce a méně účinné (Rang & Dale´s et al., 2009) (Tab. 1). Každá kategorie je pak doporučena na určitý typ léčby. BZP, které patří do kategorie ultrakrátkého a středního poločasu vylučování jsou využívány k léčbě nespavosti. Zatímco ty, které spadají do kategorie dlouhé doby eliminace, jsou používány k léčbě úzkosti. BZP mohou být dále děleny na základě struktury, a to do dvou hlavních skupin: jednoduché 1,4-BZP (Bromazepam, Clonazepam, Diazepam, Chlordiazepoxid, Lorazepam, Medazepam, Nitrazepam, Oxazepam, Tetrazepam) a heterocyklické 1,4-BZP (Alprazolam, Midazolam, Triazolam). Základní organická struktura BZP je vytvořena připojením benzenového kruhu na diazepinový v poloze pět (Riss et al., 2008) (Obr. 1).
-4-
Tab. 1: Dělení podle průměrné doby vylučování Název
Průměrný poločas [hod]
Rozmezí hodnot [hod] < 5 hod
Ultrakrátký poločas Midazolam
1.8
1.3-2.4
Triazolam
2.6
1.8-3.9
Krátký až střední poločas
6-12 hod
Alprazolam
11
6-16
Oxazepam
12
7-25
Bromazepam
12
10-19
Lorazepam
12
10-20 > 12 hod
Dlouhý poločas Tetrazepam
14.5
3-26
Chlordiazepoxid
18
10-29
Nitrazepam
28
26-33
Diazepam
32
14-61
Clonazepam
34
19-42
Medazepam
118
36-200
Jednotlivé údaje v tabulce byli převzaty ze zdroje Rang & Dale´s et al., 2009.
R1
R2 diazepinové jádro
N
R4
R3 benzenové jádro
Obr. 1: Základní chemická struktura 1,4-BZP Obrázek byl vytvořen pomocí programu ChemSketch.
-5-
3.1.3 Syntéza BZP je možné syntetizovat více než jedním způsobem. Syntéza heterocyklických 1,4-BZP (Alprazolam, Midazolam, Triazolam) začíná nukleofilní substitucí hydrazinu na 2,6-dichloro-4-fenylchinolin (a). Povařením vzniklého produktu 2-hydrazo-6-chlór-4-fenylchinolinu (b) s o-acetátem (c) je získán meziprodukt triazolochinolin
(d).
Účinkem
jodistanu
sodného
a
oxidu
ruteničitého
vznikne
hydroxymethylový meziprodukt (e), který je dále vystaven působení formaldehydu (f) a bromací (g) je přeměněn na bromomethyltriazol (h). Tento pak s amoniakem spontánně cyklizuje na Alprazolam (i) (Vardanyan et al., 2006) (Obr. 2).
b
a N
N
Cl NH2NH2
Cl
d NH
N N
N
NH2
CH3C(OEt) 3
Cl
H3C
NaIO4 / RuO2
Cl
c
H3C
N
N O
Cl
H3C
N
CH2O PBr3
O
Cl
N N
N
N
f
H3C
N
N Br
NH3 N
Cl
g
h
e
i
Obr. 2: Syntéza Alprazolamu Jednotlivé kroky syntézy jsou převzaty z článku Vardanyan et al., 2006. Struktury byly vytvořeny za použití programu ChemSketch.
-6-
Veškeré
jednoduché
1,4-BZP
jsou
tvořeny
podle
následujícího
schématu
(Vardanyan et al., 2006) (Obr. 3). Pokud produkt obsahuje ve své molekule NO2 skupinu na C7, tato bývá přidána až v posledním kroku syntézy a to záměnou za chlór. Farmakologické vlastnosti BZP jsou dány typem molekuly navázané na určité místo na struktuře (např. anxiolytické vlastnosti jsou dány přítomností elektronegativní skupiny na C7) a jsou navíc podporovány fenylovou skupinou na C5. Syntéza začíná redukcí sloučeniny 2-chlor-2´-nitrobenzofenonu (a) na sloučeninu 2-chloro-2´-amonibenzofenon (b). Tento je následně amidován 2-bromoacetyl bromidem (c), čímž se vytváří bromoacetamid (d), který je následně pomocí amoniaku přeměněn na aminoacetamid (e). Po reakci s pyridinem dochází k cyklizaci a vzniku meziproduktu 5-(2-chlorofenyl)-2,3-dihydro-1H-1,4-benzodiazepin-2-on (f). Nitrací (dusičnan draselný v kyselině sírové) tohoto meziproduktu pak získáme Clonazepam (g). Br a
d
b NO2
NH2
O
NH
O Cl
O
O
c Cl
+
Cl
Br
Br O
NH2 O H N
NH NH3
H N
O
O
HNO3
O
N Cl
N
O 2N
Cl
Cl
e
f
g
Obr. 3: Syntéza Clonazepamu Jednotlivé kroky syntézy jsou převzaty z článku Vardanyan et al., 2006. Struktury byly vytvořeny za použití programu ChemSketch.
-7-
Určitě by zde neměla chybět syntéza jednoho z nejvíce užívaných psychofarmak, a to diazepamu (Obr. 4). Není výjimkou, že i tento BZP lze připravit několika způsoby. Jedním z nich je cyklokondenzace 2-amino-5-chlorobenzofenonu s hydrochloridem ethyl-glycinátu (Vardanyan et al., 2006).
H N
NH2 O
Cl
Cl
+ H3C
O O
H3C
O
O
N
N
(CH3O)2SO2
Cl
N
NH2 HCl
Obr. 4: Syntéza Diazepamu Jednotlivé kroky syntézy jsou převzaty z článku Vardanyan et al., 2006. Struktury byly vytvořeny za použití programu ChemSketch.
3.1.4 Vlastnosti Tato kapitola zahrnuje nejdůležitější vlastnosti charakteristické pro vybrané BZP. Od vlastností fyzikálně-chemických (Tab. 2a-2d), až po farmakologické a farmakokinetické (Tab. 4). Dále je zde zahrnuta charakteristika jednotlivých testovaných BZP (Tab. 3) a jejich klinické údaje (Tab. 5a-5c), které jsou nesmírně důležité při užívání léku. Údaje ve všech tabulkách byly shromážděny pomocí těchto internetových zdrojů: http://www.sukl.cz/ (staženo dne 22.1.2010), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (staženo dne 25.1.2010),
http://www.drug-encyclopedia.eu/DW_EN/benzodiazepines.shtml (staženo dne
15.12.2009), http://www.rxlist.com/ (staženo dne 22.1.2010), http://www.medic8.com/ (staženo dne 22.1.2010), http://www.benzo.org.uk/bzequiv.htm (staženo dne 10.12.2009). Třípísmenné zkratky u jednotlivých BZP byly vytvořeny pro vlastní potřebu a přehlednost práce. Strukturní vzorce byly vytvořeny programem ChemSketch.
-8-
Tab. 2a: Fyzikálně-chemické vlastnosti benzodiazepinů Benzodiazepin
Strukturní vzorec
Sumární
Barva,konzistence
vzorec H3C
Alprazolam
N N
(ALP)
N
C17H13ClN4
Bílý krystalický prášek
N
Cl
Bromazepam
O
H N
Světle žlutý C14H10BrN3O
(BRO)
krystalický prášek
N
Br
N
Clonazepam
O
H N
Světle žlutý C15H10ClN3O3
(CLO)
krystalický prášek
N
NO2
Cl
H3C
Diazepam
N
(DIA) Cl
Bezbarvá
O
C16H13ClN2O N
-9-
krystalická sloučenina (roztok)
Tab. 2b: Fyzikálně-chemické vlastnosti benzodiazepinů Benzodiazepin
Strukturní vzorec
Sumární
Barva,konzistence
vzorec H
Chlordiazepoxid (CDX)
Oranžovo-žlutá
N
N
CH3
C16H14ClN3O
až žlutá
+
N
Cl
O
H N
Lorazepam
-
O
(LOR)
Bílý prášek OH
C15H10Cl2N2O2
N
Cl
Cl
H3C
Medazepam
Světle žlutý,
N
(MED)
H3C
(MID)
žlutý krystalický prášek
N
Cl
Midazolam
C16H15ClN2
Bílá až světle
N
C18H13ClFN3
N
žlutá krystalická sloučenina (vodný roztok)
Cl
N F
- 10 -
Tab. 2c: Fyzikálně-chemické vlastnosti benzodiazepinů Benzodiazepin
Strukturní vzorec
Sumární
Barva,konzistence
vzorec H N
Nitrazepam
O
Šedivý až žlutý C15H11N3O3
(NIT) N
O 2N
H N
Oxazepam
O
(OXA)
Bílý krystalický OH
H3C
C16H17ClN2O
H3C
prášek
Bílý krystalický
N N N
Cl
žlutý krystalický
N
Cl
(TRI)
prášek
Světle žlutý nebo
O
N
(TET)
Triazolam
C15H11ClN2O2
N
Cl
Tetrazepam
roztok
N Cl
- 11 -
C17H12Cl2N4
prášek
Tab. 3: Charakterizace léku BZP
Obchodní název
Rok
Uvedení
první
léku do
syntézy
klinické
Výrobce(firma)
praxe ALP
Xanax, Neurol,
1973
1981
Henex, Frontin BRO
Lexaurin
Pfizer, Hofman La Roche
70.léta
----
Hofman La Roche
----
1997
Hofman La Roche
1960
1963
Hofman La Roche
1955
1959
Tarchomiňskie Zaklady
19.stol. CLO
Antelepsin, Rivotril,Klonopin
DIA
Apaulin, Seduxen, Stesolid, Valium
CDX
Defobin, Elenium
Farmaceutyczne LOR
Loram, Tavor,
1971
1977
Ativan MED
Ansilan, Rusedal
MID
Dormicum, Fulsed
NIT
Magadon, Apodorm
OXA
Serax, Serenid,
Haupt Pharma Münster GmbH, Wyeth Pharmaceuticals
----
----
Lek Pharmaceuticals, D.D.
1976
1981
Hofma La Roche
1965
1980
Zentiva
1960
Zentiva
----
Serepax, Oxascand TET
Myolastan
TRI
Halcion
„Polfa“ S.A.
---1969
---1977
Sanofi-Aventis Pfizer, Hofman LA Roche
- 12 -
Tab. 4: Farmakologické a farmakokinetické vlastnosti BZP
Rozmezí
Rozmezí
Poločas
Účinek na organismus
terapeutické
toxické
vylučování
(primární účinek)
koncentrace
koncentrace
[mg/L]
[mg/L]
[hod]
ALP
0.005-0.08
0.1-0.4
6-12
++++- (anxiolytický)
BRO
0.05-0.2
0.3-0.4
10-20
++++- (anxiolytický)
CLO
0.004-0.08
0.1
18-50
+-++- (anxiolytický, antikonvulzivní)
DIA
0.2-2.5
3.0-5.0
20-100
++-+- (anxiolytický)
CDX
0.4-3.0
3.0-20.0
5-30
++-++ (anxiolytický)
LOR
0.02-0.25
0.3-5.0
10-20
+++++ (anxiolytický)
MED
0.1-1.0
N.A.
36-200
++++- (anxiolytický)
MID
0.04-0.25
1.0-1.5
1.3-2.4
+++++ (hypnotický)
NIT
0.03-0.1
0.2-3.0
15-38
+++++ (hypnotický)
OXA
0.2-1.5
2.0
4-15
+++++ (anxiolytický)
TET
0.05-0.6
N.A.
3-26
++++- (myorelaxační)
TRI
0.002-0.02
N.A.
1.8-3.9
+++++ (hypnotický)
Vysvětlivky: +++++ anxiolytický, hypnotický/sedativní, antikonvulzivní, myorelaxační, amnestický N.A. není známo
- 13 -
Tab. 5a: Klinické údaje BZP
Indikace
Dávkování
Nežádoucí účinky Toxické účinky
ALP
stavy úzkosti,
Stavy úzkosti:
únava,
syndrom deprese,
0,25–0,5 mg 3x denně sucho v ústech,
panické onemocnění
Panické onemocnění:
problémy s koordinací,
0,5 mg 3x denně
podrážděnost, deprese zmatenost, ospalost, dušnost, těžká slabost, snížené reflexy, tachykardie
BRO
závažný stupeň
1,5-3 mg 2-3x denně
sedativní účinky,
úzkosti
Závažné případy:
ospalost, závratě
60 mg denně
zmatenost, hluboký spánek, svalová slabost, zhoršené reflexy, ztráta paměti, zástava dechu
CLO
epilepsie,
Záchvaty:
deprese, úzkost,
panické onemocnění
0,5 mg 3x denně
nespavost
Panické onemocnění: 0,25 2x denně
poškození CNS – nystagmus, tremor, ataxie, somnolence
DIA
stavy úzkosti,
20-60 mg i.m., i.v.
svalový třes
ospalost, závratě, zvracení, porucha rovnováhy, zmatenost, útlum, sebevražedné sklony parestézie v okolí úst, necitlivost jazyka, závratě, hučení v uších, poruchy zraku, svalový třes, křeče
- 14 -
Tab. 5b: Klinické údaje BZP
Indikace
Dávkování
Nežádoucí účinky Toxické účinky
CDX
stavy úzkosti,
Lehké případy:
pocity malátnosti,
bolesti hlavy,
20-40 mg 2-4 denně
únavy, ospalosti a
třesy (senilní i
Těžké případy:
závratí
esenciální)
50-100 mg 2-4 denně
zmatenost, výrazná slabost, spavost, dušnost, snížené reflexy až kóma
LOR
stavy úzkosti a
1-10 mg denně
deprese
ospalost, závratě, porucha rovnováhy, bolest hlavy, zvracení, halucinace zmatenost, pomalé reflexy, hluboký spánek, malátnost
MED
podrážděnost,
20-30 mg denně
únava, závratě, svalová
nervozita, nespavost
slabost, bolesti hlavy,
psychosomatické
poruchy paměti
poruchy GIT,srdce a
poruchy vědomí, nízký
oběhové soustavy
krevní tlak, pomalé reflexy, mělké dýchání až kóma
MID
léčba nespavosti,
Příprava na operaci: ospalost, prodloužená
k anestézii popř.
0,5-2,5 mg denně
sedace, snížení
zklidnění před
Endoskopie:
ostražitosti, zmatenost,
operací
3-5 mg denně
halucinace, euforie
Epilepsie: 10 mg denně
zmatenost, nízký krevní tlak, závratě, snížení motorových funkcí (reflexy, koordinace), mělké dýchání, bezvědomí až smrt
- 15 -
Tab. 5c: Klinické údaje BZP
Indikace
Dávkování
Nežádoucí účinky Toxické účinky
NIT
nespavost různého
Nespavost:
spavost, svalová
charakteru
5-30 mg denně
slabost, bolest hlavy
Anxiolytikum:
po probuzení, kožní
5-7,5 mg denně
reakce spánek trvající 1-2 dny, závratě
OXA
zmírnění nervozity,
Úzkost:
závratě, ospalost,
napětí, úzkosti a
10-30 mg denně
nesrozumitelná řeč
neklidu, zmírnění
Nespavost a úzkost:
abstinenčních
15-25 mg denně
příznaků při
Abstinenční syndrom:
odvykací alkoholové
30-120 mg denně
kúře TET
zmatenost, ospalost, dušnost, chvění, slabost, snížené reflexy, nejasná řeč
stavy se zvýšeným
Ambulantní pacienti: závratě, somnolence,
svalovým napětím,
100 mg denně
svalová hypotonie
bolestivé
Hospitalizování:
hluboký spánek až kóma
či omezující
150 mg denně
pohyblivost TRI
u krátkodobě
0,125-0,25 mg denně
závratě, snížená
nespavosti
koordinace, rozmazané
(7-10 denní)
vidění nesrozumitelná řeč, mělké dýchání, hluboký spánek zpomalené dýchání, hluboký spánek
- 16 -
Údaje o dávkování (Tab. 5a-5c) je vždy individuální a proto by se mělo přizpůsobit potřebám pacienta (zvýšení, snížení). Dávkování, způsob podání, frekvence dávek a délka léčby závisí na tělesné hmotnosti, věku, celkovém zdravotním stavu, reakci na přípravek, a zda je nutné současně užívat jiné léky. Obecně platí, že starší pacienti a lidé, kteří mají ještě jiné zdravotní problémy, by měli začít s nižším dávkováním a pokud je dávkování bez komplikací, může se u nich postupně dávka navyšovat. Při jakýchkoliv vedlejších účincích na daný lék by měla být dávka snížena. Pokud pacient neužívá léky dlouhodobě, neměli by se objevit abstinenční příznaky. Pokud se však příznaky projeví, je namístě postupné snižování dávkování. Výčet nejvíce se vyskytujících nežádoucích účinků je uveden v Tab. 5.
3.2 Mechanismus účinku na centrální nervovou soustavu (CNS) Mechanismus účinku BZP, tzn., jakým způsobem spouštějí jednotlivé pochody v lidském organismu, je velice dobře známý. Tento molekulární proces probíhá přes receptor kyseliny γ-aminomáselné (GABA). Podle typu vazby na receptor GABA se dále dělí na A, B nebo C.
3.2.1 Kyselina γ-aminomáselná Kyselina γ-aminomáselná byla prvně syntetizována roku 1883. Teprve roku 1950 se zjistilo, že tato látka, která není součástí bílkovin a není ani α-aminokyselinou, je důležitým inhibičním neurotransmiterem, který se vyskytuje v CNS savců, kde kontroluje vzrušivost neuronů. Vyskytuje se jako amfoterní iont, což znamená, že má ve své struktuře jak deprotonovanou karboxylovou skupinu, tak protonovanou aminoskupinu (Obr. 5). Její konformace závisí na prostředí, ve kterém se vyskytuje (Devashis et al., 1988). GABA interaguje se dvěma typy receptorů: receptorem GABAA a receptorem GABAB. B
O +
H3N CH2 CH2 CH2 C O
Obr. 5: Struktura kyseliny γ - aminomáselné
- 17 -
-
3.2.2 GABAA - receptor GABAA receptor je ionotropní transmembránový proteinový receptor umístěný v neuronových membránách CNS (Chebib et al., 1999). Tento receptor navíc funguje jako iontový kanál (D´Hulst et al., 2009) (Obr. 6). Je to heteromer a skládá se z pěti podjednotek (Obr. 7). Mezi těmito podjednotkami GABAA se nachází dvě vazebná místa pro endogenní ligand GABA a to mezi podjednotkami α a β (Sigel E., 2002) a jedno allosterické vazebné místo pro různé léky (BZP, barbituráty, ethanol, …) mezi podjednotkami α a γ (Sigel E., 2002) (Obr. 7). Na toto místo receptoru GABAA se BZP váží s vysokou afinitou. Pro každou podjednotku existuje mnoho isoforem (např. α1-6, β1-3, γ1-3, δ, ε, π, θ a ρ1-3) (Riss et al., 2008). Většina GABAA receptorů (obsahují podjednotky α1, α2, α3 nebo α5) je citlivá na 1,4-BZP. Existují však i receptory (obsahují podjednotku α4 nebo α6), které na BZP citlivé nejsou (GABAB a GABAC) (Derry et al., 2004). B
Obr. 6: Umístění 3D struktury GABAA receptorového proteinu Obrázek byl převzat z internetových stránek http://en.wikipedia.org/wiki/GABAA_receptor (staženo dne 15.12.2009).
- 18 -
Obr. 7: Schematická struktura GABAA receptorového proteinu Obrázek znázorňuje schematickou strukturu GABAA receptoru s vyznačenými vazebnými místy pro GABA a BZP a s rozmístěním jednotlivých podjednotek (2 x α1, 2 x β2 a 1 x γ2), které vytvářejí kanál pro chloridové ionty. Obrázek byl převzat z internetových stránek http://en.wikipedia.org/wiki/GABAA_receptor (staženo dne 15.12.2009).
Navázání BZP na GABAA zesiluje účinek GABA a tím dochází ke zvýšení allosterického (tlumivého/inhibičního) účinku neurotransmiteru kyseliny γ-aminomáselné (GABA) (Costa et al., 2002). To má za následek zvýšení propustnosti chloridových iontů, což následně vede k hyperpolarizaci příslušné buňky (zvyšování membránového potenciálu) (Lüllmann, 2004) v důsledku zvýšení koncentrace chloridových iontů uvnitř buňky. Rozdíl v účinku jednotlivých BZP je pouze v tom, který z nich a jak silně se na receptor váže. Výsledkem jsou pak rozdílné farmakologické vlastnosti. Stejným mechanismem účinku jako BZP působí též barbituráty. Avšak tyto látky se od BZP značně odlišují a to v charakteru jejich účinku. BZP totiž působí výrazně hlouběji do psychického dění (Lüllmann et al., 2004). To může způsobit nejen pocit uvolnění, kvůli kterému se léky využívají, ale také pocity lhostejnosti. Z toho důvodu byly také tyto léky pacienty odmítány jakožto hypnotika a upřednostňovali se v tomto směru více barbituráty (Narimatsu et al., 2006). Velký zvrat u BZP nastal při zavedení čtvrtého kruhu, což zvýšilo metabolickou labilitu a tím i rychlost eliminace. A to natolik, že vznikla použitelná hypnotika.
- 19 -
3.2.3 GABAB, GABAC - receptor GABAB receptor je tzv. metabotropický receptor. Obsahuje G-protein a sedm B
transmembránových domén, které jsou selektivně aktivovány pomocí kyseliny 3-aminopropyl fosforné a blokovány kyselinou 3-amino-2-(4-chlorofenyl) propylfosfornou (Riss et al., 2008). GABAC receptory jsou selektivně aktivovány látkami, které jsou strukturně podobné kyselině γ-aminomáselné (GABA). Struktura GABAC receptoru je totožná se strukturou GABAA. Taktéž se skládá z pěti podjednotek, které utvářejí kanálek pro vstup chloridových iontů. Na druhou stranu ale tyto podjednotky nejsou regulovány BZP, steroidy nebo barbituráty jako GABAA . (Chebib et al., 1999).
3.3 Biotransformace Je
změna
struktury
chemické
látky
působením
živého
organismu
(Ferenčík et al., 2000) a to na takovou formu, aby byla snadno odstranitelná z organismu.
3.3.1 Absorpce a distribuce léčiv Xenobiotikum, nebo-li „látka organismu cizorodá“ (v našem případě BZP), je v organismu na místo svého působení transportováno cestou krevního řečiště a to za pomoci specifických transportérů (např. albumin). Než se ale vůbec dostane taková látka na místo svého působení, musí ve většině případů nejprve vstoupit do krve. Výjimku tvoří buňky epitelů, které se nacházejí na povrchu dané tkáně (plíce, kůže, žaludek). V tomto případě xenobiotika působí na tkáň přímo. Do krevního řečiště se tyto látky dostávají trojí cestou: pokožkou, respiračním systémem a v neposlední řadě také trávicím ústrojím. Velice důležité pro vstup xenobiotika do organismu jsou zdroje, ve kterých se látky vyskytují a fyzikálně-chemické vlastnosti. Pokud bychom to brali z pohledu na člověka, pak mezi zdroje patří vzduch, voda a potrava. Z fyzikálně-chemických vlastností jsou to těkavost, reaktivita a rozpustnost ve vodě a tucích. Tyto vlastnosti mohou značně narušit správný chod organismu, což pak způsobuje snadnější propustnost cizorodých látek. (Například látka reaktivní může způsobit poškození sliznice, což pak usnadňuje snazší vstup pro cizorodé látky) (Dostálek, 2006). Když už je tedy látka v krevním řečišti, dochází k jejímu transportu do cílového orgánu, tkáně, respektive buněk. Různý cíl xenobiotika představuje různě dlouhou dobu transportu. Z toho také vyplývá, že každý orgán, tkáň, buňka má různě velký rozsah poškození.
- 20 -
Otázkou je proč. Odpověď se skrývá v krevních kapilárách. Jejich stěna je složena z endotelových buněk, které nasedají na bazální membránu. A právě bariéra mezi endotelem a membránou je značně rozdílná v různých částech těla. Například u pankreatu vytvářejí síť krevních kapilár, které propouštějí pouze nízkomolekulární látky. Zatímco u jater mají podobu sítě, kterou mohou procházet i makromolekuly. Z toho důvodu jsou také játra při chronických otravách nejvíce poškozena (Dostálek, 2006). Samotný transport cizorodých látek do buněk probíhá čtyřmi způsoby: a) Aktivní transport: částice je přenášena pře
membránu proti gradientu svého
elektrochemického potenciálu pomocí energie ve formě ATP (primární) nebo aktivním transportem H+ (sekundární) volná difúze – částice je přenášena přes membránu ve směru gradientu. b) Zprostředkovaná difúze: částice je přenášena přes membránu ve směru gradientu za pomoci přenašečů. c) Endocytosa: částice je přenášena pomocí váčku (endosomu) -
vchlípení buněčné
membrány a její následné odškrcení za vzniku endosomu.
3.3.2 Osud xenobiotik v organismu Jak již bylo naznačeno, hlavním orgánem pro biotransformaci u obratlovců jsou játra, jelikož většina enzymů potřebných pro katalýzu reakce je vázána v hepatocytech. Látky jsou vylučovány podle své polarity a ionizovatelnosti. Hydrofilní, polární a ionizovatelné látky jsou vylučovány ledvinami. Naproti tomu lipofilní metabolity jsou z ledvin znovu vstřebány krví do jater, kde jsou transformovány na polárnější metabolity, které již mohou být vyloučeny močí z organismu ven (Fukasawa et al., 2007). Cílem metabolických přeměn je tedy z látek hydrofobních udělat látky hydrofilní, které jsou z krve lehce odstraněny ledvinami a nemusí tedy být dále transformovány složitou cestou. Cizorodé látky jsou v játrech metabolizovány čtyřmi základními reakcemi: oxidace, redukce, hydrolýza a konjugace (Ferenčík et al., 2000). Biotransformace jako taková je proces zahrnující 3 fáze. Avšak ještě donedávna tomu tak nebyl a tento děj měl pouze fáze dvě. 3.3.2.1. I.Fáze (oxidačně/redukční) První fáze biotransformace probíhá v endoplazmatickém retikulu (ER) buňky. Během této fáze dochází buď k zavádění nebo odkrytí skupin (-COOH, -OH, -NH2), které jsou schopné konjugace, tzn., že látky jsou strukturně přeměňovány na látky více polární pomocí oxidace (epoxidace, aromatická a alifatická hydroxylace, dealkylace, N-oxidace, oxidativní deaminace), redukce (reduktivní dehalogenace, nitroredukce, azoredukce) a hydrolytickými reakcemi
- 21 -
(Vrzal et al., 2004). Pokud by se měly reakce seřadit podle priority, pak v této fázi dochází nejčastěji k zavádění reaktivních skupin za pomoci oxidace. V této fázi mohou vzniknout méně toxické či více toxické produkty oproti původní látce za účasti enzymů z rodin hydrolas a oxidoreduktas. Reakce I.fáze biotransformace jsou katalyzovány za účasti velké řady enzymů. Nejdůležitější biotransformační reakcí této fáze je však oxidace na enzymatickém systému cytochromu P450 (CYP), který odpovídá za oxidaci přibližně 75% léčiv (Zuber et al., 2002). Mezi další enzymy první fáze patří flavinové monooxygenasy, alkoholdehydrogenasy, aldehyddehydrogenasy, karbonylreduktasy, peroxidasy, xanthinoxidasy, karboxylesterasy, aj. (Knejzlík et al., 2000). Z výčtu výše jmenovaných enzymů se budeme v této práci nadále zabývat pouze CYP, který bude detailně popsán v kapitole 3.4. 3.3.2.2. II.Fáze (konjugační) Druhá fáze probíhá většinou v cytosolu. Během této fáze dochází ke konjugaci (syntetická reakce) reaktivní skupiny pomocí nízkomolekulárních endogenních látek (kyselina glukuronová, glutathion, sulfát, cystein, acetát), čímž dochází k produkci velmi polárních metabolitů, které jsou schopny eliminace (Klaassen et al., 2008). V této fázi vznikají vždy netoxické produkty. Pokud cizorodá látka obsahuje ve své struktuře reaktivní skupinu, rovnou vstupuje do fáze druhé. II.fáze zahrnuje tyto konjugační reakce a enzymy, které je katalyzují: glukuronidace (UDP-glukuronosyl transferasy (UGT)), sulfatace (sulfo-transferasy (ST)), vznik kyseliny merkapturové (glutathion S-transferasy (GST)), N-methyltransferasy,
thiopurin
methylace (methyltransferasy (MT) -
S-methyltransferasy,
katechol
O-methyltransferasy),
acetylace (N-acetyltransferasy (NAT)) (Vrzal et al., 2004). UGT, ST a GT jsou enzymy, které se vyskytují v několika isoformách. Každý z těchto enzymů upřednostňuje vlastní substráty, způsob regulace a tkáňově specifickou expresi (Vrzal et al., 2004). 3.3.2.3 III. Fáze (transmembránový transport) Fáze III byla nedávno popsána jako transmembránový export. Ten zahrnuje transmembránové proteiny fungující jako pumpy, které odstraňují cizorodé látky a produkty fáze II z buňky, tudíž snižují jejich koncentraci uvnitř buněk. Mezi nejdůležitější zástupce III. fáze patří P-glykoprotein, OATP (organické anionty přenášející polypeptidy) a OCT (organický kationtový přenašeč) (Vrzal et al., 2004).
- 22 -
3.4 Cytochrom P450 Pojem „cytochrom P450“ se v literatuře poprvé objevil roku 1962 (Dostálek, 2006). Cytochromy P450 (CYP) jsou biotransformační enzymy zodpovědné za detoxikaci xenobiotik, ale také za aktivaci látek netoxických na látky vysoce jedovaté. CYP tvoří tzv. „superrodinu“ enzymů, které obsahují ve své molekule hem. Je známo více než 2000 cytochromů. U člověka je v současné době známo 57 genů a více než 58 pseudogenů, které jsou dále rozděleny na 18 rodin a 43 podrodin genů CYP, které se od sebe liší katalytickou aktivitou a substrátovou specifitou (Pávek a Dvořák, 2008).
3.4.1 Názvosloví Název cytochrom P450 je odvozen podle hodnoty maxima svého absorpčního spektra. Označení „P450“ značí, že se jedná o pigment, který po redukci hemového železa oxidem uhelnatým absorbuje při 450 nm. Jelikož do „nadrodiny“ cytochromu P450 patří velký počet enzymů, bylo pro přehlednost roku 1996 vytvořeno systematické názvosloví, které je založeno na podobnosti aminokyselinové (AMK) sekvence apoproteinu (Nelson et al., 2009). Značení tohoto názvosloví se řídí podle několika jednoduchých pravidel. Příslušnost k této „superrodině“ enzymů se označuje zkratkou CYP (cytochrom P450). Za zkratkou CYP následuje arabská číslice 1-118 udávající příslušnou genovou rodinu (např.CYP1A2). Pokud mají dva cytochromy P450 sekvenční podobnost daného proteinu > 40% patří do stejné rodiny. Dále následuje velké písmeno A-Q udávající podrodinu (CYP1A2). Toto se opět řídí pravidlem sekvenční podobnosti, pokud je > 55% patří enzymy do stejné podrodiny. Nakonec opět arabská číslice, která udává konkrétní isoformu (CYP1A2). Pro rozlišení genů se využívá kurzívy (CYP1A2) (Fukasawa et al., 2007). Ačkoli bylo pomocí tohoto systematického názvosloví identifikováno více než 50 isoforem CYP, pouze pět z nich se zdá být zodpovědných za většinu z veškeré aktivity CYP, (Fukasawa et al., 2007) (Tab. 6).
3.4.2 Lokalizace a struktura Enzymatický systém CYP je u eukaryot pevně vázán na membrány ER a mitochondrií, zatímco u bakterií se tento systém nachází v rozpustné formě v cytosolu. Na membránu mitochondrií jsou vázány většinou enzymy rodiny CYP11 a CYP27. CYP jsou lokalizovány především v játrech, ale také v nosní sliznici, plicích, GIT a ledvinách. Hodnoty CYP v jednotlivých lidských tkáních nelze považovat za absolutní, protože závisí na mnoha
- 23 -
faktorech. Jsou to např. výživa, věk, pohlaví, kouření, konzumace alkoholu, vliv vnějšího prostředí, působení podávaných léků, aj. (Dostálek, 2006). CYP disponuje monooxygenázovou aktivitou a je schopen metabolizovat lipofilní xenobiotika. Jde o hemoprotein typu b. Písmeno „b“ označuje strukturu, která je tvořena jedním polypeptidovým řetězcem a porfyrinovým kruhem (tzv. protoporfyrinem IX), ale také substituenty navázanými na protoporfyrinovém jádře. V porfyrinovém kruhu je čtyřmi ligandy vázán železitý ion. Pátým ligandem je thiolátový anion pocházející z AMK cysteinu. Tento ligand je vázán k vlastnímu enzymu. Šestým a zároveň posledním ligandem hemu se v průběhu reakce stává molekula kyslíku (Dostálek, 2006). Tab. 6: Aktivita jednotlivých isoforem „superrodiny“ cytochromu P450 Isoforma
Aktivita (%)
CYP3A4/5
36
CYP2D6
19
CYP2C8
16
CYP1A1/2
11
CYP2C19
8
Údaje byli převzaty z článku Fukasawa et al., 2007.
3.4.3 Funkce cytochromu P450 CYP, nebo-li jaterní mikrosomální monooxygenasa, je klíčovým enzymem monooxygenačních dějů. Tyto enzymy jsou charakteristické tím, že váží molekulární kyslík, přičemž každý atom kyslíku má svou vlastní cestu. Jeden atom kyslíku je zabudován do molekuly substrátu a druhý je redukován ve formě vody (Baliharová, 2003). Obecně můžeme funkci tohoto systému popsat pomocí rovnice (Obr. 8). Během „katalytického cyklu CYP“ dochází k navázání xenobiotického substrátu (L) na oxidovanou formu CYP s navázaným Fe3+ na komplex L-Fe3+, který je jednoelektronovou redukcí (NADPH:cytochrom P450 reduktasa) přeměněn na komplex L-Fe2+. K tomuto komplexu se váže kyslík a vzniká ternární komplex L-Fe2+-O2. Ten je dále oxidován a teprve přes několik dalších dílčích kroků je zpětně získán monooxygenásový produkt, který se regeneruje CYP (Dostálek, 2006) (Obr. 9). NADPH:cytochrom P450 reduktasa je flavoproteinový enzym, který obsahuje dvě prostetické skupiny: flavinmononukleotid (FMN) a flavinadenindinukleotid (FAD) (Obr. 10). FAD je akceptorem elektronů z NADPH + H+ a donorem elektronů pro FMN, ten je pak
- 24 -
donorem elektronů pro CYP. Tento enzym tedy přenáší elektrony z NADPH na komplex substrát-CYP. Enzym je lokalizován na cytosolické straně ER. RH + NADPH + H+ + O2
ROH + NADP+ + H2O
Obr. 8: Obecná rovnice vyjadřující funkci mikrosomálního monooxygenásového systému
O2 2H+ NADPH
oxidovaný flavoprotein L-Fe 2+
L-Fe 2+ - O2
NADPH: cytochrom P450 reduktasa
L-Fe NADP+
+ voda
cytochrom P450 3+
Fe
3+
oxidovaná látka
redukovaný flavoprotein xenobiotický substrát (L)
Obr. 9: Zjednodušené schéma katalytického cyklu cytochromu P450 Obrázek je převzat z publikace Dostálek, 2006.
Obr. 10: Struktura flavoproteinového enzymu s vazbou NADPH a cytochromu P450 Převzato z internetového vyhledávače obrázků http://www.google.com/ (staženo dne 20.12.2009).
- 25 -
3.4.4 Vybrané podrodiny cytochromu P450 Klíčovou úlohu I.fáze biotransformace hrají rodiny CYP1, CYP2, a CYP3. Každá z těchto rodin má několik důležitých podrodin, které jsou jmenovány dále. V závorkách jsou pak uvedeny typické substráty jednotlivých podrodin. Mezi nejdůležitější členy rodiny CYP1 u člověka patří CYP1A1 (teofylin) a CYP1A2 (kofein). Nejdůležitějšími členy rodiny CYP2 u člověka jsou CYP2A6 (kumarin), CYP2B6 (cyklofosfamid), CYP2C8 (kyseliny acetylsalicylová), CYP2C9 (warfarin), CYP2C19 (diazepam), CYP2D6 (kodein), CYP2E1 (chloroform) a CYP2F1. A rodina CYP3 zahrnuje pouze čtyři členy: CYP3A4 (kortikoidy), CYP3A5, CYP3A7 a CYP3A43 (Pávek et al., 2008). Z výše zmíněných isoforem jsme se zaměřily na ty, které se nacházejí v lidských játrech a jejich aktivita je regulována indukcí exprese. Mezi enzymy takto regulovatelnými jsou nejhojněji zastoupeny podrodiny CYP1A2 a CYP3A4. 3.4.4.1 Podrodina CYP1A Zástupci této podrodiny jsou CYP1A1 a CYP1A2. Obě tyto formy se podílejí na biotransformačních procesech u člověka, katalyzují podobné reakce a mají 70% shodnou AMK sekvenci (Dostálek, 2006). CYP1A1 je primárně umístěn mimo jaterní tkáň: plíce, mozek, GIT, srdce. Avšak i v játrech se vyskytuje jeho velmi nízká hladina. Tento enzym je exprimován extrahepatálně a to pouze v přítomnosti induktorů, mezi které patří polycyklické aromatické uhlovodíky (PAU) jako je 3-methylcholantren (3-MC) a halogenované aromatické uhlovodíky (HAU) jako je 2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-p-dioxin (TCDD). Je to jeden z nejdůležitějších detoxifikačních enzymů a to kvůli své široké substrátové specifitě a distribuci po celém těle (Pávek et al., 2008). Na druhou stranu ale může vytvářet vysoce karcinogenní metabolity a to díky oxidaci PAU (Baliharová, 2003). CYP1A2 je jaterní enzym, který je indukovatelný stejně jako CYP1A1. Je to třetí nejvíce zastoupená isoforma cytochromů v játrech. Substráty, které vyvolávají expresi tohoto enzymu, jsou stejné jako u CYP1A1. Tento enzym navíc metabolizuje několik klinicky významných léků, jako je kofein, tizanidin, zolmitriptan a tacrin (Pávek et al., 2008). Dráha signalizace u obou isoforem je řízena přes aryluhlovodíkový jaderný receptor (AhR) (Obr. 11).
- 26 -
Ligand
Ligand
Cytosol
1 hsp90 hsp90
AhR
p23
XAP H2O2
AhR Ligand 4
AhR
Reaktivní metabolity O
ARNT
Ligand
2
5 CYP1A
TAF Ligand SRC-1 RNA AhR ARNT TBP pol II
AhRR
AhRR ARNT Kancerogeneze
DRE Jádro
3
Obr. 11: Signalizace AhR 1 – vstup ligandu do buňky a jeho následná vazba na cytosolický komplex AhR-hsp90-hsp90p23-XAP (protein interagující s AhR) → disociace chaperonů (hsp90, p23 = co-chaperon) a transport komplexu ligand-AhR do jádra; 2 – heterodimerizace AhR a ARNT (jaderný přenašeč AhR) a následná vazba na specifickou oblast DNA (DRE) za pomoci příslušných koaktivátorů a transkripčních faktorů; 3 - aktivace transkripce a spuštění genů pro CYP1A a AhRR; 4 – transport AhR z jádra do cytosolu a jeho následná degradace proteasom – ubiquitinovým systémem; 5 – mechanismus zpětné vazby za účasti AhRR (represor AhR), tvorba heterodimeru AhRR-ARNT brání vazbě AhR s ARNT, tzn., že dochází k inaktivaci transkripce. Obrázek převzat z článku Vrzal et al., 2004. Obrázek je sestrojen pomocí programu Microsoft PowerPoint.
- 27 -
3.4.4.2 Podrodina CYP3A Genová rodina cytochromu P450 3A (CYP3A) zahrnuje 4 členy: CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7 a CYP3A43, které jsou tandemově uspořádány na chromozomu 7. Podrodina CYP3A patří mezi nejuniverzálnější biotransformační systémy, které pomáhají odstranit velké množství léčiv z těla ven (Martínez-Jiménez et al., 2007) a je nejdůležitější u savců, protože velká většina z jejích zástupců je obsažena v játrech. Nejdůležitějším členem této podrodiny je enzym CYP3A4. Tento enzym je vůbec nejdůležitějším pro metabolismus léčiv u člověka, a to nejen kvůli svému množství v játrech u dospělého jedince (podílí se na metabolismu více než 50% běžně užívaných léků jako je imunosupresivum cyklosporin, antibiotikum erytromycin, glykosid digitoxin, antikoagulancium warfarin, benzodiazepiny midazolam a diazepam, aj.), ale hlavně proto, že se účastní metabolismu velké většiny léčiv, u kterých není známa jejich metabolická dráha (Anzenbacher et al., 2001; Mizuno et al., 2008; Martínez-Jiménez et al., 2007). Nicméně je tento enzym také zodpovědný za tvorbu reaktivních metabolitů (flutamid, trazodon, troglitazon), které vedou k poškození jater (Mizuno et al., 2008). Kromě jater se tato isoforma nachází také v tenkém střevě. Navíc tento enzym katalyzuje 6β-hydroxylaci kortisolu a testosteronu a patří mezi látky, které aktivují karcinogeny (aflatoxin B1) (Martínez-Jiménez et al., 2007). Enzym CYP3A4 má oproti CYP1A1 velmi nízkou substrátovou specifitu. Exprese tohoto enzymu probíhá v játrech a je řízena pregnanovým jaderným X receptorem (PXR) (Obr. 12). Transkripční regulace je „centrem“ mnoha klinicky důležitých mezilékových interakcí. CYP3A5 se vyskytuje jako CYP3A4 v játrech a tenkém střevě u dospělých jedinců, navíc pak v játrech plodu. CYP3A7 je hlavní enzym nacházející se v lidském plodu a jeho exprese je snižována po narození (Martínez-Jiménez et al., 2007). Vyskytují se ale případy, kdy se CYP3A7 nachází v játrech dospělých jedinců (Tateishi et al., 1999). CYP3A43 je nejnovější člen genové rodiny CYP3A, který byl objeven v játrech, ledvinách, prostatě a pankreatu, ale v mnohem menší míře než je tomu u CYP3A4 a proto je nepravděpodobné, že by přispíval k eliminaci léčiv. Výše zmiňované geny podrodiny CYP3A jsou regulovány odlišnými vývojovými a tkáňově-specifickými mechanismy (Martínez-Jiménez et al., 2007).
- 28 -
Ligand 1a Cytosol
Ligand
2a PXR
hsp90
CCRP
1b Ligand PXR
koaktivátory
RXR 3a,3b HDAC korepresory
PXR
Ligand koaktivátory PXR RXR
RXR prPXRE
2b
HAT
4a,4b
RNA pol II
prPXRE Jádro
korepresory
Obr. 12: Signalizace PXR Tato dráha signalizace může mít dvojí cestu. 1a – vstup ligandu do buňky; 2a – navázání ligandu na cytosolický komplex PXR-hsp90-CCRP (cytoplazmatický protein udržující konstitutivní androstanový receptor = CAR) → disociace chaperonů (hsp90) a následný transport komplexu PXR-ligand do jádra; 3a – heterodimerizace PXR s retinoidním X receptorem (RXR) a následná vazba heterodimeru na specifickou oblast DNA (prPXRE); 4a – vazba koaktivátorů, které váží HAT (histonová acetylasa), ta rozvolňuje chromatin a spouští transkripci. Pokud se ovšem v jádře nachází neaktivní heterodimer PXR/RXR (tzn., že váže korepresory), dráha signalizace je neaktivní. Může však dojít k aktivaci tohoto komplexu. 1b – vstup ligandu do buňky a jeho navázání na komplex; 2b 3b - navázání koaktivátorů; 4b – aktivace genové exprese. Obrázek sestaven podle údajů z následujícího zdroje: ( Pávek a Dvořák, 2008). Obrázek je sestrojen pomocí programu Microsoft PowerPoint.
- 29 -
uvolnění korepresorů;
3.5 Regulace enzymů katalyzujících biotransformační reakce xenobiotik Výše dvě zmíněné rodiny CYP1 a CYP3 jsou regulovány transkripčním mechanismem. Ve všeobecném modelu transkripční regulace cytochromu P450, receptor interaguje v cytosolu s ligandem o nízké molekulové hmotnosti, čímž dojde ke změnám konformace receptoru, které umožňují vazbu na specifickou sekvenci DNA a následnou transkripci proteinů (Vrzal et al., 2004). Na regulaci exprese biotransformačních enzymů se podílí několik receptorů: pregnanový X receptor (PXR), konstitutivní androstanový receptor (CAR), aryluhlovodíkový receptor (AhR), retinoidní X receptor (RXR), receptor pro vitamín D (VDR), receptor pro kyselinu trans-retinovou (RAR) a glukokortikoidní receptor (GR) (Honkakoski et al., 2000). V této práci se budeme nadále zabývat pouze úlohou PXR a AhR v regulaci vybraných CYP.
3.5.1 Aryluhlovodíkový receptor (AhR) AhR je ligandem spouštěný transkripční faktor, který kontroluje expresi lidských CYP1A1, CYP1A2 a CYP1B1 a patří do rodiny transkripčních faktorů (TF) PAS (Per-ARNT-Sim). Na regulaci exprese se dále podílejí ARNT (jaderný přenašeč AhR) a AhRR (represor AhR). Tyto TF mají charakteristický strukturální motiv se dvěma α-helixy, které jsou odděleny nehelikální smyčkou, tzv. „basický helix-smyčka-helix“ (bHSH). bHSH se nachází v N-terminální oblasti struktury. Gen pro AhR je lokalizován na 7. chromozomu. Tento chromozom zahrnuje 12 exonů, které kódují 848 proteinů AMK s teoretickým množstvím 96,147 Da. Běžnými ligandy AhR jsou polycyklické aromatické uhlovodíky (PAU) jako např. benzo(a)pyren, benzantraceny a halogenované aromatické uhlovodíky (HAU) jako např. 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD), dibenzofurany (Vrzal et al., 2004; Pávek a Dvořák, 2008). 3.5.1.1 Funkce AhR Neaktivní (bez ligandu) AhR je lokalizován v multiproteinovém komplexu v cytosolu. Tento komplex je složen z jednoho AhR, dvou chaperonů hsp90 (proteiny teplotního šoku), malého proteinu p23 (co-chaperon) a proteinu XAP nebo AIP (protein interagující s AhR). Jednotlivé proteiny se podílejí na maskování NLS (jaderný lokalizační signál), což má za následek zadržování AhR v cytosolu. Kromě NLS, ale AhR obsahuje ve své struktuře také NES (jaderný exportní signál), který hraje svou úlohu při odstraňování AhR z jádra. Například
- 30 -
chaperon hsp90 brání transkripční aktivaci, ale na druhou stranu udržuje AhR v takové konformaci, která usnadňuje navázání ligandu (Vrzal et al., 2004). Ligand vstupuje do buňky a váže se na komplex AhR-hsp90-hsp90-p23-XAP (Obr. 11, 1), čímž dochází k disociaci chaperonů a vzniklý komplex AhR-ligand je transportován do jádra, kde dochází k jeho rychlé heterodimerizaci s ARNT (Obr. 11, 2). Tento heterodimer se následně váže na specifickou oblast DNA (dioxin responsivní element = DRE s jadernou sekvencí 5´-TNGCGTG-3´) (Mimuraa et al., 2003) (Obr. 11, 2). Heterodimer AhR/ARNT získává další koaktivátory (např. SRC-1, NCOA2) a váže se s TBP (TATA-binding protein) a několika TAF (přidružené faktory TBP), čímž dochází ke spuštění transkripce a spuštění genů pro CYP1A (Pávek a Dvořák, 2008) (Obr. 11, 3). Po splnění funkce v jádře je AhR je transportován z jádra do cytosolu, kde je degradován proteasom – ubiquitinovým systémem (Obr. 11, 4). Během regulace dochází také k mechanismu zpětné vazby pomocí AhRR. AhRR je umístěn v jádře, neváže ligand (TCDD), ale je jím indukován. Hraje důležitou roli jako kompetitivní inhibitor heterodimerizace AhR-ARNT (Obr. 11, 5). Pokud AhRR vytvoří vazbu s ARNT, nemůže AhR vytvářet heterodimer s ARNT, což brání spuštění transkripce. Dimer AhRR-ARNT je tedy transkripčně inaktivní dimer.
3.5.2 Pregnanový receptor (PXR) PXR, též známý jako NR1I2 (jaderný receptor, podrodina 1, skupina I, člen 2) je jaderný receptor, který je důležitou součástí tělních obranných mechanismů proti toxickým látkám, včetně látek cizorodých (xenobiotik). Jeho hlavní funkcí je „vytušit“ přítomnost cizorodých a toxických látek a zareagovat na ně zvýšením regulace exprese proteinů, které se podílejí na detoxikaci a odstranění těchto látek z těla. Tento receptor je aktivován velkým množstvím endogenních a exogenních chemických látek včetně steroidů, antibiotik, antimykotik, žlučových kyselin, aj. (Kliewer et al., 2002). Podrodina NR1I (kam patří PXR) hraje klíčovou roli v transaktivaci enzymů katalyzujících biotransformační reakce xenobiotik. Struktura jaderných receptorů (JR) této podrodiny zahrnuje 3 domény: nestálou AMK doménu na N-konci, centrální DNA vazebnou doménu (vysoce konzervovaná) a vazebnou doménu pro ligand na C-konci. Ve struktuře JR (v našem případě PXR) jsou dvě domény, které jsou schopné transkripce: AF-1 (activation function 1), která je umístěna na N-konci domény a AF-2 lokalizovaná na části vazebné domény pro ligand (C-konec) (Pávek a Dvořák, 2008). Běžným ligandem PXR je rifampicin.
- 31 -
3.5.2.1 Funkce PXR PXR řídí expresi monooxygenas CYP3A, kam se řadí i CYP3A4, který hraje velmi důležitou roli v metabolismu xenobiotik. V regulaci exprese CYP3A4 hrají důležitou roli i další transkripční faktory, např.: LETFs (liver-enriched transcription factors), HNF1α (hepatocyte nuclear factor 1 alpha), HNF3γ (hepatocyte nuclear factor 3 gamma), HNF4α (hepatocyte nuclear factor 4 alpha), C/EBPα (CCAAT/enhancer binding protein alpha) a C/EBPβ (CCAAT/enhancer binding protein beta) (Kliewer et al., 2002). Receptor je umístěn v multiproteinovém komplexu v cytosolu. Tento komplex je složen z jednoho PXR, jednoho chaperonu hsp90 a jednoho CCRP (cytoplazmatický protein udržující CAR). Aby došlo k aktivaci jaderného receptoru, musí se ligand nejprve dostat do cytosolu (Obr. 12, 1a). Ligandy jsou malé lipofilní částice a proto jsou snadno transportovány do buňky buď pasivní difúzí, nebo vazbou na některý z přenašečů. V cytosolu se pak ligand váže na komplex PXR-hsp90-CCRP, čímž dochází k disociaci chaperonů a vzniklý komplex PXR-ligand je transportován do jádra, kde dochází k jeho rychlé heterodimerizaci s RXR (retinoidní X receptor) (Obr. 12, 3a/b). Heterodimer PXR/RXR se následně váže na specifickou oblast DNA (prPXRE) (Obr. 12, 3a, 3b) a získává koaktivátory (např. NCOA1, NCOA2, aj.), které váží HAT (histonová acetylasa) (Obr. 12, č.4a, 4b). HAT rozvolňuje chromatin, čímž dochází k aktivaci genu přes RNA polymerasu II (Pávek a Dvořák, 2008). V jádře se ale také může nacházet neaktivní heterodimer RXR/PXR (bez ligandu), který je v komplexu s korepresory (např. SMRT), které shromažďují HDAC (histonová deacetylasa). Deacetylace histonů vede ke kondenzaci chromatinu a tím k transkripční represi genu. Pokud však dojde k navázání ligandu na tento komplex (Obr. 12, 1b), dojde k uvolnění korepresů (Obr. 12, 2b), navázání koaktivátorů (Obr. 12, 3b) a transkripční aktivaci genové exprese (Obr. 12, 4b).
3.6 Metabolismus benzodiazepinů To jakým způsobem se cizorodé látky (v našem případě BZP) dostávají do organismu a distribuují na místo svého působení a také jejich osud v organismu, bylo detailně popsáno v kapitole 3.4 (biotransformace). V této kapitole se budeme zabývat jejich vlastním metabolismem. Všechny BZP jsou metabolizovány a to tak, aby byly snadněji vylučovány z organismu. Metabolismus jednotlivých BZP je rozdílný (Obr. 13). Nicméně se všechny metabolické cesty protínají v jednom bodě a tím je konjugace, kdy vznikají glukuronové konjugáty, které jsou následně vylučovány do moči.
- 32 -
Metabolismus probíhá přes dealkylaci (fáze 1) a konjugaci (fáze 2). V mnoha případech je dealkylace výsledkem tvorby farmakologicky aktivních sloučenin, která probíhá v játrech. Z podávaného BZP může vzniknout jedna ale i několik farmakologicky aktivních sloučenin (Dailey, 2003). Farmakologicky aktivní sloučeninou je také Nordazepam. Tyto látky mají dlouhý účinek uvnitř organismu. Nordazepam je tvořen z několika různých BZP (MED, DIA, CDX) a má 60 hodinový účinek uvnitř organismu. Jinak je tomu u látek, které jsou metabolizovány přímo přes konjugaci s glukuronidem (ALP, BRO, CLO, LOR, TRI, MID, OXA, respektive temazepam). Ty mají krátkodobý účinek v organismu (Lüllmann et al., 2004; Rang et al., 2007). Ze schématu je patrné, že OXA je velkou křižovatkou různých metabolických drah.
MEDAZEPAM
DIAZEPAM
CHLORDIAZEPOXID CYP3A4/3A5/2B6
Desmethylchlordiazepoxid *
[1]
Demoxepam *
[1] CYP3A4/3A5/2C19
Nordiazepam * [1]
CYP3A4/3A5/2C19
OXAZEPAM *
[1]
CYP3A4/2C19/3A5 CYP2C8/2C9/2B6
Temazepam
UGT1A9/2B7
LORAZEPAM
TRIAZOLAM
MIDAZOLAM
[2,5]
UGT2B15
[2,5] UGT2B15
CYP3A4
CYP3A4/5
[3]
[3,5]
K O N J U G A C E
CYP3A4/5
[3]
CYP1A2/2D6 CYP3A4/5
ALPRAZOLAM
BROMAZEPAM [4,5]
CLONAZEPAM
INAKTIVNÍ PRODUKTY MOČ
Obrázek 13 Metabolismus benzodiazepinů. * farmakologicky aktivní sloučenina Jednotlivé reakce byli převzaty z níže uvedené literatury: [1] Acikgöz et al., 2009; [2] de Leon J. (2003); [3] Fukasawa et al., 2007; [4] Chouinard et al., 1999; [5] Riss et al., 2008.
- 33 -
4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 4.1 Materiál 4.1.1 Chemikálie 4.1.1.1 Izolace RNA, reverzní transkripce na cDNA, RT-PCR TRI REAGENT®
Molecular Research Center, Inc.
TR 118
Chloroform
SIGMA
C 2432
Isopropanol
Lachner
20037-ATO
75% ethanol (kvasný, rafinovaný, jemný,
Moravský lihovar Kojetín, a.s.
5032317
zvláštně denaturovaný za využití 1% lékařského benzínu) Náhodné primery
TAKARA
Reverzní transkriptasa (M-MuLV)
FINNZYMES
F-572L
RNase inhibitor
TAKARA
2311A
dATP
TAKARA
4026
dTTP
TAKARA
4029
dCTP
TAKARA
4028
dGTP
TAKARA
4027
dNTP
10x reakční pufr Primery F+R
3801
FINNZYMES
F-572B
CYP3A4 1
Generi Biotech, Hradec Králové
CYP1A1
2
Generi Biotech, Hradec Králové
CYP1A2
3
Generi Biotech, Hradec Králové
GAPDH
4
Generi Biotech, Hradec Králové
MasterPLUS SYBR Green I
Roche
Rifampicin
SIGMA
R 3501
Dimethylsulfoxid
SIGMA
D 8418
2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin
ULTRA Scientific
RPI029S
03515885001
___________________________________________________________________________ 1
2
sekvence forward primeru pro CYP3A4
5´-TTCAGCAAGAAGAACAAGGACAA-3´
sekvence reverse primeru pro CYP3A4
5´-GGTTGAAGAAGTCCTCCTAAGC-3´
sekvence forvard primeru pro CYP1A1 sekvence reverse primeru pro CYP1A1
3
4
5´-TCCGGGACATCACAGACAGC-3´ 5´-ACCCTGGGGTTCATCACCAA-3´
sekvence forward primeru pro CYP1A2
5′-CATCCCCCACAGCACAACAA-3′
sekvence reverse primeru pro CYP1A2
5′-TCCCACTTGGCCAGGACTTC-3′
sekvence forward primeru pro GAPDH
5´- CTGGAAAGAATGTCTTGATTGTGG-3´
sekvence reverse primeru pro GAPDH
5´-TTTGGATTATACTGCCTGACCAAG-3´
- 34 -
4.1.1.2 Gene Reporter Assay Originální médium DMEM + GlutamaxTM -I
GIBCO®
Neesenciální aminokyseliny
SIGMA
Fetální bovinní sérum
PAA
Penicilin / Streptomycin
SIGMA
P4333
Trypanová modř
SIGMA
T6146
FuGENE® HD transfekční reagent
Roche
0,25% TRYPSIN-EDTA
SIGMA
5x lyzační pufr
Roche
Reportérový plasmid s promotorovou oblastí pro
31966-021 M7145 A15-104
04709691001 T4049 11897675001
Morel et al., 1998
CYP1A1 (p1A1-luc)
dar od Pharm.
Reportérový plasmid s kompletní promotorovou
Dr. Petra Pávka,
oblastí pro CYP3A4 (p3A4-luc)
Hradec Králové
Pávek P. et al., 2009 Pávek P. et al., 2009
Expresní vektor pro PXR pro CYP3A4 (hPXR) Složení roztoku 10x PBS v 500 ml: 40 g NaCl
SIGMA
S 5886
1 g KCl
SIGMA
P 5405
16,05 g Na2HPO4.12H2O
MERCK
106573
1 g KH2PO4.12H2O
MERCK
104871
Roztok nakalibrujeme na pH 7,4-7,5 a necháme vyautoklávovat. Z 10x PBS si připravujeme 1x PBS. Roztok pro luciferázu: 5 mg D-luciferinu
SIGMA
L 6152
9,6 mg ATP
SIGMA
A 6419
6,83 mg CoA
SIGMA
C 4282
168 mg DTT
SIGMA
43815
1,32 mL 1M tris-acetátu (pH 7,8)
SIGMA
T 8280
1,23 mg EDTA
SIGMA
E 5134
30,3 mg MgSO4.7H2O
SIGMA
M5921
Jednotlivé složky slijeme dohromady, doplníme do 30 mL destilovanou vodou a zamrazíme na -20 °C.
- 35 -
Příprava komerčního živného média DMEM + GlutamaxTM –I pro linii HepG2: Komerčně dodané médium DMEM + GlutamaxTM –I obsahuje pyruvát a 4,5 g/L glukosy. Do média musí být dále dodány tyto složky: 50 mL 10% fetálního bovinního séra, 5 mL roztoku penicilin/streptomycin a 5 mL neesenciálních aminokyselin. S médiem pracujeme vždy ve sterilním prostředí.
4.1.2 Přístroje a vybavení Autokláv PS20A
Chirana, ČR
Váhy AFP210L
Adam, Velká Británie
Třepačka yellow line TTS2
Maneko, ČR
Centrifuga spectrafuge 16M
Labnet International, USA
Centrifuga Mini
Labnet International, USA
Centrifuga BR4i
Jouan, Francie
Centrifuga chlazená universal 32R
Laboratorní přístroje, ČR
Lednice
Calex, ČR
Deep Freezer VXE 380
Jouan, Francie
Box skříňový mrazící SAN
Sanyo, Japonsko
Výrobník šupinkového ledu F100
Compact, ČR
DRI-BLOCKS 2D
Techne, UK
Culture incubator Mitre 4000 series
Contherm, Nový Zéland
NanoDrop 1000 Spectrofotomether
Thermo Scientific, USA
Box laminární PV-100
Telstar, Španělsko
Box laminární biohazard Faster BH-ER
Chemos, ČR
Cyklér Rotor-Gene 3000A
Corbett Research, Austrálie
Light Cycler 2.0
Roche, Švýcarsko
Spektrofotometr Leader Synergy HT
BIO-TEK, ČR
Mikroskop T2 103411
Olympus, ČR
- 36 -
4.2 Metody 4.2.1 Kvantifikace genové exprese 4.2.1.1 Primární kultura lidských hepatocytů Hepatocyty byly získány resekcí jaterní tkáně od multiorgánových dárců. Vzorky lidských jater využívané v této diplomové práce, byly získány od třech pacientů (multiorgánových dárců) a pro potřeby této práce byly dále označované jako LH 28, LH 29 a LH 31. Vzorek LH 28 byl od muže ve věku 48 let, LH 29 byl muž ve věku 74 let a LH 31 byla taktéž muž ve věku 28 let. Tyto byly následně izolovány podle daného postupu (Pichard-Garcia et al., 2002) na Lékařské Fakultě v Olomouci. Dále byly buňky vloženy do kultivačního média (Isom et al., 1985), které bylo obohaceno o fetální bovinní sérum (2%). Po jednodenní inkubaci bylo sérové médium vyměněno za bezsérové. V bezsérovém médiu byla kultura stabilizována 48-72 hodin při 37°C (5% CO2). Poté byly buňky inkubovány s ALP (0,05 mg/L a 0,5 mg/L), BRO (0,1 mg/L a 0,5 mg/L), CLO (0,05 mg/L a 0,5 mg/L), DIA (1 mg/L a 5 mg/L), CDX (2 mg/L a 20 mg/L), LOR (0,2 mg/L a 5 mg/L), MED (0,5 mg/L a 5 mg/L), MID (0,2 mg/L a 2 mg/L), NIT (0,05 mg/L a 5 mg/L), OXA (1 mg/L a 5 mg/L), TET (0,5 mg/L a 5 mg/L), TRI (0,01 mg/L a 0,5 mg/L), rifampicinem (10 μm), 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxinem (5 nM) a DMSO (0,1% v/v). Takto připravené kultury byly vloženy do inkubátoru na 24 hodin (37 °C, 5% CO2, 95% vlhkosti).
4.2.1.2 Izolace RNA z lidského vzorku jater K izolaci RNA lidského vzorku byl využit TRI Reagent®. Biologický vzorek, o obsahu cca 2 miliony buněk, byl homogenizován v 1 ml TRI reagentu a inkubován 5 min při pokojové teplotě. Přidáním 200 μl chloroformu na 1 ml TRI Regentu byl homogenát rozdělen mezi vodnou a organickou fázi. Vzorek byl pečlivě promíchán (60 s) a inkubován 10 min při pokojové teplotě. Po inkubaci byla provedena centrifugace (13 000 RPM/15 min/4°C), při níž došlo k rozdělení složek do jednotlivých fází. RNA se nacházela ve vodné fázi (horní vrstva), DNA v interfázi a proteiny v organické fázi (dolní vrstva). Dále se pracovalo pouze s RNA a to tak, že byla odpipetována vodná fáze do nové eppendorfky. K vodné fázi bylo přidáno 500 μl isopropanolu a vzorek byl krátce zvortexován. Následovala 10 min inkubace při pokojové teplotě a centrifugace (13 000 RPM/13 min/4°C), při které mělo dojít k vysrážení RNA na dně kepu („pellet“). Poté byla RNA 2x promyta, což bylo provedeno slitím roztoku, přidáním 1 ml 75% etanolu a centrifugací (13 000 RPM/5 min/4°C). Nakonec byla RNA rozpuštěna v RNAse free vodě (součást setu MasterPLUS SYBR Green I společnosti Roche, kat.č. 03515885001).
- 37 -
Nejprve se musel opět slít roztok a následně bylo přidáno množství vody úměrné velikosti pelletu. Inkubovalo se 5 min při 65°C. Takto připravená RNA se dala zamrazit do -80°C Z každého vzorku RNA (BZP + pozitivní a negativní kontrola) byly odebrány 2 µl a napipetovány na čidlo přístroje NanoDrop 1000. U každého vzorku byla změřena absorbance při 260 nm. Současně byla měřena čistota RNA (což je podíl hodnot absorbancí při 260 nm a 280 nm), která by měla být v rozmezí hodnot 1,8-2,0.
4.2.1.3 Přepis na cDNA Podle naměřené absorbance byly připraveny roztoky RNA s přečištěnou vodou do celkového objemu 5 µl/1000 ng RNA. Ke každému vzorku byl přidán 1 µl náhodného primeru (koncentrace 100 pmol/µl) a vzorky se inkubovaly 5 min při 65 °C. Následně byly ochlazeny na ledu a krátce centrifugovány. Ke každému vzorku bylo pak přidáno 6 µl MIXu (Tab. 7). Tab. 7: Příprava MIXu pro transkripci RNA na cDNA Reagencie
1 vzorek/µl
M-MuLV (reverzní transkriptasa)
0.6
Inhibitor RNasy
0.3
dNTP (10mM zásobní roztok)
0.6
10x reakční pufr
1.2
Přečištěná voda
3.3
Celkem
6.0
Vzorky byly krátce zcentrifugovány, inkubovány 1hod při 42 °C a pak 10 min při 65 °C. Po inkubaci, byly teď již přepsané cDNA vzorky, vloženy na led. cDNA byla naředěna 5x a zvortexována. Pokud s připravenou cDNA nebyla ihned prováděna PCR, byla vložena do mrazáku na -80 °C.
- 38 -
4.2.1.4 Polymerázová řetězová reakce v reálném čase (RT-PCR) Nejprve byla připravena reakční směs pro PCR. Bylo smícháno 7 µl MIXu (Tab. 8) a 3 µl cDNA. Jako primery, byly použity CYP1A2, CYP3A4 a GAPDH. Během PCR byly prováděny 3 kroky, které se cyklicky opakovaly, čímž docházelo k namnožení úseku DNA (exponenciálně) ohraničeného primery. Prvně probíhala denaturace DNA, kdy se reakční směs zahřívala na teplotu 95°C/10s. Při této teplotě došlo k přerušení vodíkových můstků, které udržovali DNA ve formě dvoušroubovice, což pak mělo za následek vznik jednovláknové DNA. Dalším krokem byl annealing, kdy se teplota snižovala na 65°C/7s pro CYP1A2 a CYP3A4 nebo na 68°C/7s pro GAPDH, což umožnilo navázání primerů (komplementárně) na cílová místa DNA. Na primery se pak navázala termostabilní polymerázy (optimum aktivity při 72°C/17s), která byla součástí reakční směsi. Posledním krokem byla fáze prodlužování (elongace). V tomto kroku proběhla samotná syntéza DNA. Tab. 8: Příprava MIXu pro PCR pro přístroj Rotor-Gene 3000A a LightCycler 2.0 Reagencie
1 vzorek/µl
5 µM primer (F+R)
1
Směs Sybr green a ostatní
2
komponenty (kit Roche) PCR voda
4
Celkem/µl
7
4.2.1.5 Statistické vyhodnocení testovaných vzorků Všechny testované látky byly měřeny v dubletu a byl u nich určen Cp (crossing point) (CYP1A2 a CYP3A4), což je oblast cyklu PCR, při které hodnota fluorescence přesáhne prahovou hodnotu (tzv. „treshold“). Od aritmetického průměru Cp hodnot CYP1A2 a CYP3A4 byl odečten aritmetický průměr Cp hodnot GAPDH (glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa), který sloužil jako housekeeping gen. Tímto byla získána hodnota delta Ct. Dále byla od hodnoty delta Ct daného BZP odečtena hodnota delta Ct negativní kontroly (UT, DMSO), čímž získáme hodnotu delta delta Ct. Tato hodnota byla dosazena do vztahu: y = a x, kde a = 2 a byla získána hodnota fold induction, což je násobek indukce oproti negativní kontrole.
- 39 -
4.2.2 Gene Reporter Assay 4.2.2.1 Princip metody Tato metoda využívá reportérových genů, které se staly neocenitelným pomocníkem při studiu genové exprese. V současné době jsou široce využívány v oblasti biomedicíny, farmaceutickém výzkumu, molekulární biologii a biochemii. Reportérový konstrukt je složen ze dvou funkčních částí (Obr. 14). Z DNA sekvence, která poskytuje informace o proteinu, který je produkován (luciferasa). Druhou z nich je pak specifická DNA sekvence, která je spojená s kódovanou oblastí a reguluje transkripci genu (promotor).
DNA
promotor
luciferázový reportérový gen
mRNA transkript
transkripce
luciferasa translace luciferasa oxidace
světlo luciferásový substrát
Obr. 14: Princip metody Gene Reporter Assay Luciferásový reportérový gen je vnesen do buněčné DNA a za procesu transkripce a translace je získán translační produkt (luciferasa), který je velice dobře detekovatelný a kvantifikovatelný. Na obrázku je znázorněn luciferásový vektor jako rovinný konstrukt, ve skutečnosti je to však konstrukt kruhový, tj. plasmidová DNA. Obrázek byl vytvořen pomocí programu PowerPoint.
- 40 -
Cílem této metody je tedy měření regulačního potenciálu neznáme sekvence DNA. To lze provést spojením promotorové sekvence s lehce detekovatelným reportérovým genem (v našem případě genem pro luciferasu). Dalšími běžnými reportérovými geny jsou β-galaktosidasa a β-glukuronidasa. Při měření exprese proteinu reportérového genu jsou využívány tři detekční metody: luminiscence (v našem případě), absorbance a fluorescence (Kajsa et al., 2006; Bronstein et al., 1994). Uvádí se, že nejuniverzálnějším a nejběžnějším reportérovým genem je luciferasa, která pochází ze světlušky rodu Photinus Pyralis, která se vyskytuje na území Severní Ameriky. Protein nevyžaduje žádnou posttranslační modifikaci pro aktivitu enzymů, není toxický ani ve vysoké koncentraci (in vivo) a může být využit jak u prokaryotických, tak u eukaryotických buněk. Luminiscence je dána oxidací luciferinu za přítomnosti ATP, hořčíku a kyslíku při vlnové délce 562 nm (Bronstein et al., 1994) (Obr. 16). Výhody luciferásového měření: vysoká citlivost, absence luciferasy uvnitř většiny typů buněk, široký dynamický rozsah, rychlost a nízké náklady.
Luciferin
Luciferin
O2
+ Luciferasa
Luciferasa + ATP
Oxyluciferin
PPi
Luciferasa CO2
AMP
+ +
Světlo
+ AMP
Obr. 16: Rovnice oxidace luciferinu Obrázek je převzat z článku Bronstein et al., 1994.
4.2.2.2 Příprava buněk hepatocellulárního karcinomu pro Gene Reporter Assay Pro toto měření byly využity buňky hepatocellulárního karcinomu, konkrétně linie HepG2 (ECACC No. 85011430). Buňky této linie mají přisedlý způsob růstu, tzn., že jsou adherentní a nezačnou proliferovat, dokud se nepřichytí na stěnu kultivační nádoby. Tento krok je klíčový pro další manipulaci s touto linií. Životnost buněk je udržována pomocí kultivačního média Gibco DMEM + Glutamax TM
– I, obohaceného o další komponenty (viz str. 36).
- 41 -
Médium v kultivační láhvi bylo odsáto. Buňky byly opláchnuty 10 mL sterilního roztoku 1x PBS (fosfátový pufr). Roztok byl pipetován po stěně nádoby, aby nedošlo k uvolnění buněk ze stěny kultivační láhve. PBS bylo po chvíli odsáto. Do kultivační nádoby o ploše 75 cm2 byl na povrch buněk napipetován 1 mL komerčního roztoku trypsinu a tento byl rozlit po celém povrchu. Kultivační láhev s trypsinem byla inkubována v inkubátoru (37 °C, 5% CO2, 95% vlhkosti) po dobu 2-3 min. Po inkubaci byla láhev vyndána z inkubátoru a poklepem byly buňky uvolněny z povrchu kultivační láhve. V této fázi jsme měli v kultivační nádobě 1 mL buněčné suspenze, ke které bylo přidáno 9 mL sérového média. Sérové médium obsahuje antitrypsin, který má za úkol inaktivovat trypsin. Směs buněk byla důkladně promíchávána, dokud nám nevznikl homogenní roztok buněk. Nyní jsme měli v láhvi 10 mL suspenze buněk. Následujícím krokem bylo počítání buněk, za využití Bürkerovy komůrky a trypanové modři. Podle počtu buněk v 1 mL byla část suspenze použita pro experiment a část buněk byla ponechána na kultivaci. K suspenzi, která byla dána na kultivaci, bylo přidáno potřebné množství sérového média.
4.2.2.3 Počítání buněk hepatocellulárního karcinomu Aby bylo možné rozlišit mrtvé buňky od živých, bylo nutné je obarvit trypanovou modří. Tato barvička se inkorporuje do mrtvých buněk, čímž bylo možné následně buňky spočítat. Pokračovali jsme v předešlém kroku, kde byla nachystána suspenzi buněk. Z této suspenze bylo odebráno 10 μL do malé eppendorfky a k tomu bylo přidáno 90 μL trypanové modři. Směs byla promíchána pipetováním. 10 μL této směsi bylo napipetováno na Bürkerovu komůrku a byly počítány živé buňky (neobarvené) pod mikroskopem v deseti čtvercích ohraničených trojitou čarou. Hodnoty byly zprůměrovány. Výsledná hodnota byla vynásobena faktorem 105 /1 mL buněčné suspenze. A to proto, že čtverec komůrky má rozměr 1 x 1 mm a hloubku 0,1 mm, což dává 0,1 mm3 (tedy 10-4 mL) a jelikož byla suspenze navíc desetkrát naředěna barvící směsí. Výsledek byl tedy pak udáván jako počet buněk na 1 mL buněčné suspenze.
4.2.2.4 Vlastní měření reportérového genu pro luciferasu Samotná transfekce trvá 3 dny. Před začátkem práce bychom měli mít ve sterilní falkoně připravenou suspenzi buněk, u které známe počet buněk na 1 mL. Transfekce se provádí lipofekcí pomocí FuGENE® HD. Každou látku (BZP) nasazujeme v tripletu. 1. den byla připravena transfekční směs obsahující tyto základní poměry komponent pro výsev na 24-jamkovou destičku: 300 ng plasmidu 1A1-FL nebo 300 ng plasmidu 3A4-luc a
- 42 -
100 ng expresního vektoru pro PXR + 30 μL originálního média („OPTIMUM“) + 0,9 μL FuGENE® HD. Připravili jsme si dvě sterilní zkumavky z tvrdého plastu. Do první zkumavky bylo napipetováno potřebné množství roztoku plasmidu (o známé koncentraci) pro všechny reakce (300 ng x počet inkubací). Do druhé bylo napipetováno originální médium pro všechny reakce (30 μL x počet inkubací) a FuGENE® HD, taktéž pro všechny reakce (0,9 μL x počet inkubací). Směs byla promíchána a ponechána 5 minut při pokojové teplotě. Poté byla směs média a FuGENU® HD přepipetována do zkumavky s plasmidem. Opět byla důkladně promíchána a inkubována 20 minut při pokojové teplotě. Mezitím bylo do sterilní falkony napipetováno takové množství suspenze buněk, aby bylo přítomno zhruba 70 000 buněk na 1 jamku (70 000 buněk x počet inkubací). Dané množství bylo doplněno sérovým médiem a to do objemu, aby jedna jamka obsahovala 0,5 mL suspenze buněk (500 μL x počet inkubací). Po 20 minutách inkubace byla směs originální bezsérové médium + plasmid + FuGENU® HD přepipetována do sterilní falkony, kde bylo připravené určité množství suspenze. Směs byla promíchána a do každé jamky na 24 jamkové destičce bylo pipetováno 500 μL. Před tím než jsme dali destičky do inkubátoru, byla pod mikroskopem zkontrolována přítomnost buněk v náhodně vybraných jamkách. 2. den ráno bylo sérové médium vyměněno za bezsérové. Sérové médium bylo odsáto z jamek destičky a do každé jamky bylo pipetováno po 500 μL média bez fetálního bovinního séra. Destičky byly inkubovány 5 hodin v inkubátoru. Během této doby byly připraveny 1000x naředěné zásobní roztoky BZP (3 x 500 μL bezsérového média + 1,5 μL BZP). Po 5 hodinách inkubace bylo odsáto médium a vyměněno za čerstvé s naředěnými koncentracemi testovaných látek. Do každé jamky bylo pipetováno po 500 μL. Destičky byly inkubovány 24 hodin v inkubátoru. 3. den bylo provedeno samotné stanovení luminiscence (Reporter Gene Assay). Po 24 hodinách byly vyndány destičky z inkubátoru. Pod mikroskopem bylo zkontrolováno, zda je inkubace nezabíjí. Tento krok jako jediný mohl být proveden v nesterilním prostředí. Médium bylo vyklepnuto z destičky a jednotlivé jamky byly promyty od proteinů roztokem 1x PBS. Roztok byl aplikován po stěně jamky. Opět byl roztok vyklepnut a do každé jamky bylo pipetováno 100 μL lyzačního pufru. Destička byla uzavřena víkem, obalena lepicí páskou a na 15 minut zamražena v -80 °C, aby došlo k lýze buněk. Mezitím byl v termostatu rozehřát luciferázový roztok, který je skladován při -20 °C. Po 15 minutách byla destička vyndána a ponechána při pokojové teplotě, dokud nedošlo k rozmrznutí roztoku v jednotlivých jamkách. Jednotlivé jamky byly zhomogenizovány, čímž byly rozbity makroskopické shluky buněk. Pro samotné měření byla připravena deska na měření luminiscence a do každé jamky bylo napipetováno 7 μL lyzační směsi a těsně před měřením bylo přidáno 70 μL luciferázového pufru.
- 43 -
4.2.2.5 Statistické vyhodnocení testovaných vzorků Všechny testované látky byly měřeny v tripletu a veškeré údaje získané od všech vzorků byly zpracovány v programu Microsoft Excel. Z každého triplikátu vzorku byl vypočítán aritmetický průměr ± směrodatná odchylka, byla provedena korelace vůči pozadí a vypočtena hodnota fold indukce. Každý vzorek byl srovnán s negativní kontrolou (NC) pomocí párového T-testu (studentův test) a všechny hodnoty s pravděpodobností menší než 0,05 byly označeny za statisticky odlišné (signifikantní).
4.3 Výsledky 4.3.1 Účinek benzodiazepinů na expresi CYP1A1, CYP1A2 a CYP3A4 mRNA v primární kultuře lidských hepatocytů (RT-PCR) V první polovině této studie byl zkoumán účinek BZP za použití typických aktivátorů PXR a AhR receptorů, tj. rifampicinu pro PXR a dioxinu pro AhR. Tím byla detekována úroveň exprese CYP3A4 mRNA a CYP1A2 mRNA a následně byla porovnávána s expresí vyvolanou výše zmiňovanými BZP. Pro tyto účely byly využity tři odlišné primární kultury lidských hepatocytů, které byly inkubovány výše zmíněnými sloučeninami po dobu 24 hodin (viz kapitola 4.2.1.1). U každého z testovaných BZP byly aplikovány dvě koncentrace: terapeutická a toxická (pod pojmem toxická koncentrace se rozumí taková koncentrace v plasmě, která se vyskytuje u pacientů předávkovaných těmito léky). Ze získaných výsledků je patrné, že CYP1A2 mRNA vykazuje nevýznamnou indukci u testovaných BZP s výjimkou ALP (0,5 mg/L) u vzorku LH29, jehož indukce je 20-ti násobně zvýšena oproti ostatním BZP (Obr. 18). Aktivátor 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) pro CYP1A2 vykazuje silnou indukci CYP1A2 mRNA u všech třech testovaných kultur. Jeho hladina se však mezi jednotlivými kulturami významně liší. Hodnota indukce TCDD u vzorku LH28 je 122x vyšší vůči negativní kontrole (NC) (Obr. 17), u LH29 až 700x vyšší (Obr. 18) a u LH31 100x vyšší vůči NC (Obr. 19).
- 44 -
Obr. 17: Relativní exprese CYP1A2 mRNA – lidské hepatocyty – LH28 Kultura lidských hepatocytů (LH28) byla vystavena účinku Alprazolamu (ALP; 0,05 mg/L a 0,5 mg/L), Bromazepamu (BRO; 0,1 mg/L a 0,5 mg/L), Clonazepamu (CLO; 0,05 mg/L a 0,5 mg/L), Diazepamu (DIA; 1 mg/L a 5 mg/L), Chlordiazepoxidu (CDX; 2 mg/L a 20 mg/L), Lorazepamu (LOR; 0,2 mg/L a 5 mg/L), Medazepamu (MED; 0,5 mg/L a 5 mg/L), Midazolamu (MID; 0,2 mg/L a 2 mg/L), Nitrazepamu (NIT; 0,05 mg/L a 5 mg/L), Oxazepamu (OXA; 1 mg/L a 5 mg/L), Tetrazepamu (TET; 0,5 mg/L a 5 mg/L), Triazolamu (TRI; 0,01 mg/L a 0,5 mg/L), pozitivní kontrole (2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxinu = TCDD; 5 nM) a negativní kontrole (DMSO = dimethylsulfoxidu; 0,1% v/v) po dobu 24 hodin. Výsledky byly získány ze dvou nezávislých měření a jsou v grafu vyjádřeny jako fold induction, což je násobek indukce vůči negativní kontrole (DMSO). * - hodnota je statisticky odlišná (signifikantní) od hodnoty negativní kontroly (DMSO) (p < 0,05) (pravděpodobnost získaná ze studentova testu). Graf byl sestrojen za pomoci programu Microsoft Excel a CorelDraw.
- 45 -
Obr. 18: Relativní exprese CYP1A2 mRNA – lidské hepatocyty – LH29 Kultura lidských hepatocytů (LH29) byla vystavena účinku Alprazolamu (ALP; 0,05 mg/L a 0,5 mg/L), Bromazepamu (BRO; 0,1 mg/L a 0,5 mg/L), Clonazepamu (CLO; 0,05 mg/L a 0,5 mg/L), Diazepamu (DIA; 1 mg/L a 5 mg/L), Chlordiazepoxidu (CDX; 2 mg/L a 20 mg/L), Lorazepamu (LOR; 0,2 mg/L a 5 mg/L), Medazepamu (MED; 0,5 mg/L a 5 mg/L), Midazolamu (MID; 0,2 mg/L a 2 mg/L), Nitrazepamu (NIT; 0,05 mg/L a 5 mg/L), Oxazepamu (OXA; 1 mg/L a 5 mg/L), Tetrazepamu (TET; 0,5 mg/L a 5 mg/L), Triazolamu (TRI; 0,01 mg/L a 0,5 mg/L),
pozitivní kontrole (2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxinu = TCDD; 5 nM) a
negativní kontrole (DMSO = dimethylsulfoxidu; 0,1% v/v) po dobu 24 hodin. Výsledky byly získány ze dvou nezávislých měření a jsou v grafu vyjádřeny jako fold induction, což je násobek indukce vůči negativní kontrole (DMSO). * - hodnota je statisticky odlišná (signifikantní) od hodnoty negativní kontroly (DMSO) (p < 0,05) (pravděpodobnost získaná ze studentova testu). Graf byl sestrojen za pomoci programu Microsoft Excel a CorelDraw.
- 46 -
Obr. 19: Relativní exprese CYP1A2 mRNA – lidské hepatocyty – LH31 Kultura lidských hepatocytů (LH31) byla vystavena účinku Alprazolamu (ALP; 0,05 mg/L a 0,5 mg/L), Bromazepamu (BRO; 0,1 mg/L a 0,5 mg/L), Clonazepamu (CLO; 0,05 mg/L a 0,5 mg/L), Diazepamu (DIA; 1 mg/L a 5 mg/L), Chlordiazepoxidu (CDX; 2 mg/L a 20 mg/L), Lorazepamu (LOR; 0,2 mg/L a 5 mg/L), Medazepamu (MED; 0,5 mg/L a 5 mg/L), Midazolamu (MID; 0,2 mg/L a 2 mg/L), Nitrazepamu (NIT; 0,05 mg/L a 5 mg/L), Oxazepamu (OXA; 1 mg/L a 5 mg/L), Tetrazepamu (TET; 0,5 mg/L a 5 mg/L), Triazolamu (TRI; 0,01 mg/L a 0,5 mg/L),
pozitivní kontrole (2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxinu = TCDD; 5 nM) a
negativní kontrole (DMSO = dimethylsulfoxidu; 0,1% v/v) po dobu 24 hodin. Výsledky byly získány ze dvou nezávislých měření a jsou v grafu vyjádřeny jako fold induction, což je násobek indukce vůči negativní kontrole (DMSO). * - hodnota je statisticky odlišná (signifikantní) od hodnoty negativní kontroly (DMSO) (p < 0,05) (pravděpodobnost získaná ze studentova testu). Graf byl sestrojen za pomoci programu Microsoft Excel a CorelDraw.
Dalším krokem této části byla analýza indukce CYP1A1 mRNA a to z toho důvodu, že CYP1A1 je gen závislý pouze na AhR oproti CYP1A2, který je kontrolován i jinými faktory či receptory, jako např. glukokortikoidním receptorem (Vrzal et al., 2009). Měřením byly získány
- 47 -
analogické výsledky, jako tomu bylo u CYP1A2. Pro srovnání s předešlým měřením: ALP (0,5 mg/L) zde opět vykazuje silnou indukci CYP1A1 mRNA (60x vyšší vůči NC) u vzorku LH29 (Obr. 21). Indukce CYP1A1 mRNA za pomoci aktivátoru TCDD byla opět několikanásobně vyšší (374x u LH28, 1574x u LH29 a 832x u LH31) (Obr. 20 - 22).
Obr. 20: Relativní exprese CYP1A1 mRNA – lidské hepatocyty – LH28 Kultura lidských hepatocytů (LH28) byla vystavena účinku Alprazolamu (ALP; 0,05 mg/L a 0,5 mg/L), Bromazepamu (BRO; 0,1 mg/L a 0,5 mg/L), Clonazepamu (CLO; 0,05 mg/L a 0,5 mg/L), Diazepamu (DIA; 1 mg/L a 5 mg/L), Medazepamu (MED; 0,5 mg/L a 5 mg/L), Nitrazepamu (NIT; 0,05 mg/L a 5 mg/L), pozitivní kontrole (2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-pdioxinu = TCDD; 5 nM) a negativní kontrole (DMSO = dimethylsulfoxidu; 0,1% v/v) po dobu 24 hodin. Výsledky byly získány ze dvou nezávislých měření a jsou v grafu vyjádřeny jako fold induction, což je násobek indukce vůči negativní kontrole (DMSO). * - hodnota je statisticky odlišná (signifikantní) od hodnoty negativní kontroly (DMSO) (p < 0,05) (pravděpodobnost získaná ze studentova testu). Graf byl sestrojen za pomoci programu Microsoft Excel a CorelDraw.
- 48 -
Obr. 21: Relativní exprese CYP1A1 mRNA – lidské hepatocyty – LH29 Kultura lidských hepatocytů (LH29) byla vystavena účinku Alprazolamu (ALP; 0,05 mg/L a 0,5 mg/L), Bromazepamu (BRO; 0,1 mg/L a 0,5 mg/L), Clonazepamu (CLO; 0,05 mg/L a 0,5 mg/L), Diazepamu (DIA; 1 mg/L a 5 mg/L), Medazepamu (MED; 0,5 mg/L a 5 mg/L), Nitrazepamu (NIT; 0,05 mg/L a 5 mg/L), pozitivní kontrole (2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-pdioxinu = TCDD; 5 nM) a negativní kontrole (DMSO = dimethylsulfoxidu; 0,1% v/v) po dobu 24 hodin. Výsledky byly získány ze dvou nezávislých měření a jsou v grafu vyjádřeny jako fold induction, což je násobek indukce vůči negativní kontrole (DMSO). * - hodnota je statisticky odlišná (signifikantní) od hodnoty negativní kontroly (DMSO) (p < 0,05) (pravděpodobnost získaná ze studentova testu). Graf byl sestrojen za pomoci programu Microsoft Excel a CorelDraw.
- 49 -
Obr. 22: Relativní exprese CYP1A1 mRNA – lidské hepatocyty – LH31 Kultura lidských hepatocytů (LH31) byla vystavena účinku Alprazolamu (ALP; 0,05 mg/L a 0,5 mg/L), Bromazepamu (BRO; 0,1 mg/L a 0,5 mg/L), Clonazepamu (CLO; 0,05 mg/L a 0,5 mg/L), Diazepamu (DIA; 1 mg/L a 5 mg/L), Medazepamu (MED; 0,5 mg/L a 5 mg/L), Nitrazepamu (NIT; 0,05 mg/L a 5 mg/L), pozitivní kontrole (2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-pdioxinu = TCDD; 5 nM) a negativní kontrole (DMSO = dimethylsulfoxidu; 0,1% v/v) po dobu 24 hodin. Výsledky byly získány ze dvou nezávislých měření a jsou v grafu vyjádřeny jako fold induction, což je násobek indukce vůči negativní kontrole (DMSO). * - hodnota je statisticky odlišná (signifikantní) od hodnoty negativní kontroly (DMSO) (p < 0,05) (pravděpodobnost získaná ze studentova testu). Graf byl sestrojen za pomoci programu Microsoft Excel a CorelDraw.
Posledním z testovaných genů byl CYP3A4. Jeho nejvýznamnějším aktivátorem je rifampicin (RIF). Tento způsoboval silnou indukci CYP3A4 mRNA u všech třech testovaných kultur. Hodnoty se však tolik nelišily, jako tomu bylo u CYP1A1/2. Vzorek LH28 vykazoval 45-ti násobek vůči NC (Obr. 23), LH29 62 násobek (Obr. 24) a LH31 21 násobek vůči NC (Obr. 25). Mezi jednotlivými kulturami lidských hepatocytů byly naměřeny odlišné indukce testovaných BZP vůči CYP3A4. Například DIA a CDX mají mírně zvýšenou hodnotu CYP3A4 mRNA u vzorku LH29 a LH31, nikoliv však u LH28. Naopak tomu bylo u MED a MID v kulturách LH29 a LH31, kdy byla zaznamenána výrazná indukce CYP3A4 mRNA (Obr. 24 a 25).
- 50 -
Z naměřených dat můžeme konstatovat, že až na výjimky (MED a NIT → CYP1A2 mRNA, ALP a MED → CYP1A1 mRNA a MED, MID → CYP3A4 mRNA) testované BZP neindukují CYP1A1/2 a CYP3A4 mRNA. Nicméně je velmi důležité, aby byly brány v potaz rozdíly mezi jednotlivými kulturami lidských hepatocytů. Dalším důležitým kritériem je to, že hepatocyty jsou buňky schopné metabolizace. Proto jsme hodnotili sílu indukce jak pro původní léčivo, tak pro jeho další metabolity.
Obr. 23: Relativní exprese CYP3A4 mRNA – lidské hepatocyty – LH28 Kultura lidských hepatocytů (LH28) byla vystavena účinku Alprazolamu (ALP; 0,05 mg/L a 0,5 mg/L), Bromazepamu (BRO; 0,1 mg/L a 0,5 mg/L), Clonazepamu (CLO; 0,05 mg/L a 0,5 mg/L), Diazepamu (DIA; 1 mg/L a 5 mg/L), Chlordiazepoxidu (CDX; 2 mg/L a 20 mg/L), Lorazepamu (LOR; 0,2 mg/L a 5 mg/L), Medazepamu (MED; 0,5 mg/L a 5 mg/L), Midazolamu (MID; 0,2 mg/L a 2 mg/L), Nitrazepamu (NIT; 0,05 mg/L a 5 mg/L), Oxazepamu (OXA; 1 mg/L a 5 mg/L), Tetrazepamu (TET; 0,5 mg/L a 5 mg/L), Triazolamu (TRI; 0,01 mg/L a 0,5 mg/L), pozitivní kontrole (rifampicinu = RIF; 10 μM) a negativní kontrole (DMSO = dimethylsulfoxidu; 0,1% v/v) po dobu 24 hodin. Výsledky byly získány ze dvou nezávislých měření a jsou v grafu vyjádřeny jako fold induction, což je násobek indukce vůči negativní kontrole (DMSO). * - hodnota je statisticky odlišná (signifikantní) od hodnoty negativní kontroly (DMSO) (p < 0,05) (pravděpodobnost získaná ze studentova testu). Graf byl sestrojen za pomoci programu Microsoft Excel a CorelDraw.
- 51 -
Obr. 24: Relativní exprese CYP3A4 mRNA – lidské hepatocyty – LH29 Kultura lidských hepatocytů (LH29) byla vystavena účinku Alprazolamu (ALP; 0,05 mg/L a 0,5 mg/L), Bromazepamu (BRO; 0,1 mg/L a 0,5 mg/L), Clonazepamu (CLO; 0,05 mg/L a 0,5 mg/L), Diazepamu (DIA; 1 mg/L a 5 mg/L), Chlordiazepoxidu (CDX; 2 mg/L a 20 mg/L), Lorazepamu (LOR; 0,2 mg/L a 5 mg/L), Medazepamu (MED; 0,5 mg/L a 5 mg/L), Midazolamu (MID; 0,2 mg/L a 2 mg/L), Nitrazepamu (NIT; 0,05 mg/L a 5 mg/L), Oxazepamu (OXA; 1 mg/L a 5 mg/L), Tetrazepamu (TET; 0,5 mg/L a 5 mg/L), Triazolamu (TRI; 0,01 mg/L a 0,5 mg/L), pozitivní kontrole (rifampicinu = RIF; 10 μM) a negativní kontrole (DMSO = dimethylsulfoxidu; 0,1% v/v) po dobu 24 hodin. Výsledky byly získány ze dvou nezávislých měření a jsou v grafu vyjádřeny jako fold induction, což je násobek indukce vůči negativní kontrole (DMSO). * - hodnota je statisticky odlišná (signifikantní) od hodnoty negativní kontroly (DMSO) (p < 0,05) (pravděpodobnost získaná ze studentova testu). Graf byl sestrojen za pomoci programu Microsoft Excel a CorelDraw.
- 52 -
Obr. 25: Relativní exprese CYP3A4 mRNA – lidské hepatocyty – LH31 Kultura lidských hepatocytů (LH31) byla vystavena účinku Alprazolamu (ALP; 0,05 mg/L a 0,5 mg/L), Bromazepamu (BRO; 0,1 mg/L a 0,5 mg/L), Clonazepamu (CLO; 0,05 mg/L a 0,5 mg/L), Diazepamu (DIA; 1 mg/L a 5 mg/L), Chlordiazepoxidu (CDX; 2 mg/L a 20 mg/L), Lorazepamu (LOR; 0,2 mg/L a 5 mg/L), Medazepamu (MED; 0,5 mg/L a 5 mg/L), Midazolamu (MID; 0,2 mg/L a 2 mg/L), Nitrazepamu (NIT; 0,05 mg/L a 5 mg/L), Oxazepamu (OXA; 1 mg/L a 5 mg/L), Tetrazepamu (TET; 0,5 mg/L a 5 mg/L), Triazolamu (TRI; 0,01 mg/L a 0,5 mg/L), pozitivní kontrole (rifampicinu = RIF; 10 μM) a negativní kontrole (DMSO = dimethylsulfoxidu; 0,1% v/v) po dobu 24 hodin. Výsledky byly získány ze dvou nezávislých měření a jsou v grafu vyjádřeny jako fold induction, což je násobek indukce vůči negativní kontrole (DMSO). * - hodnota je statisticky odlišná (signifikantní) od hodnoty negativní kontroly (DMSO) (p < 0,05) (pravděpodobnost získaná ze studentova testu). Graf byl sestrojen za pomoci programu Microsoft Excel a CorelDraw.
- 53 -
4.3.2
Účinek
benzodiazepinů
na
aktivaci
AhR
a
PXR
xenoreceptorů
v hepatocellulárním karcinomu (Gene Reporter Assay) Na základě získaných dat byl v druhé polovině této studie zkoumán účinek BZP na schopnost transaktivovat promotor pro CYP1A1 a CYP3A4 v lidských nádorových liniích, za pomoci metodiky Gene Reporter Assay. Pro tyto účely byla využita lidská nádorová linie odvozená od karcinomu jater (HepG2). Testování probíhalo tak, že do buněk byly lipofekcí transfekovány plasmidy obsahující promotorovou oblast pro dané geny (p1A1-luc, p3A4-luc), za kterou je fúzován gen pro luciferasu. (Zvýšená luciferasová aktivita nám pomůže odhalit, zda pozorování z hepatocytů jsou dána transkripční aktivací anebo jsou důsledkem jiných faktorů, jako například variability donorů či metabolismu, který probíhá intenzivně v hepatocytech, ale výrazně méně v buněčné nádorové linii.) Dále byly na buňky aplikovány jednotlivé BZP, pozitivní kontrola (RIF 10 μm, TCDD 5 nM) a negativní kontrola (DMSO 0,1% v/v) a buňky byly takto inkubovány po dobu 24 hodin. Po 24 hodinách byly buňky lyzovány, byla měřena luciferásová aktivita a standardizována na miligram proteinu. Pro každý reportérový plasmid bylo provedeno měření v triplikátu. Z hodnot byl následně proveden aritmetický průměr ± směrodatná odchylka. Výsledky byly statisticky vyhodnocovány v programu Microsoft Excel za pomoci Studentova testu. Výsledky ukázaly, že aktivátor AhR (TCDD) silně transaktivuje reportér pro p1A1-luc (130-ti násobné zvýšení vůči NC). Nicméně žádný z testovaných BZP nevykazuje významný účinek (Obr. 26). Podobné výsledky byly získány také pro PXR, kdy aktivátor (RIF) tohoto receptoru vykazoval silnou transaktivaci reportéru pro p3A4-luc (4 násobné zvýšení vůči NC). Avšak opět žádný z testovaných BZP nevykazoval významnou transaktivaci p3A4-luc (Obr. 27). Pokud bychom měli učinit závěr a porovnat výsledky obou měření, můžeme říci, že účinky BZP na reportérový plasmid p1A1-luc jsou shodné s expresí CYP1A1/2 mRNA v lidských hepatocytech. Co ale nemůžeme potvrdit je to, že indukce CYP3A4 mRNA pomocí MID a MED v primárních lidských hepatocytech probíhá přes PXR. Můžeme pouze uvažovat z jakého důvodu tomu tak je. Jedním z možných vysvětlení je to, že lidské hepatocyty jsou buňky, které disponují významnou metabolickou aktivitou ve srovnání s buněčnou linií HepG2. Kromě toho, současné studie tvrdí, že aktivace promotoru CYP3A4 závisí na přítomnosti transkripčních faktorů rodiny NF I. A právě tyto nemuseli být dostatečně zastoupeny v HepG2 buňkách (Vrzal et al., 2010).
- 54 -
Obr. 26: Transaktivace reportérového plasmidu pCYP1A1-luc v HepG2 buňkách Do HepG2 buněk byl lipofekčně transfekován FuGENE HD s 300 ng/jamku plasmidu p1A1-luc. Následovala 16 hodinová stabilizace a pak byly buňky vystaveny účinku Alprazolamu (ALP; 0,05 mg/L a 0,5 mg/L), Bromazepamu (BRO; 0,1 mg/L a 0,5 mg/L), Clonazepamu (CLO; 0,05 mg/L a 0,5 mg/L), Diazepamu (DIA; 1 mg/L a 5 mg/L), Medazepamu (MED; 0,5 mg/L a 5 mg/L), Midazolamu (MID; 0,2 mg/L a 2 mg/L), Nitrazepamu (NIT; 0,05 mg/L a 5 mg/L), pozitivní kontrole (2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxinu = TCDD; 5 nM) a negativní kontrole (DMSO = dimethylsulfoxidu; 0,1% v/v) po dobu 24 hodin. Po 24 hodinách byly buňky lyzovány a byla změřena luciferásová aktivita. Výsledky byly získány ze třech nezávislých měření a jsou v grafu vyjádřeny jako fold activation, což je násobek indukce vůči negativní kontrole (DMSO). * - hodnota je statisticky odlišná (signifikantní) od hodnoty negativní kontroly (DMSO) (p < 0,05) (pravděpodobnost získaná ze studentova testu). Graf byl sestrojen za pomoci programu Microsoft Excel a CorelDraw.
- 55 -
Obr. 27: Transaktivace reportérového plasmidu pCYP3A4-luc v HepG2 buňkách Do HepG2 buněk byl lipofekčně transfekován FuGENE HD s 300 ng/jamku plasmidu p3A4-luc a 100 ng/jamku hPXR. Následovala 16 hodinová stabilizace a pak byly buňky vystaveny účinku Alprazolamu (ALP; 0,05 mg/L a 0,5 mg/L), Diazepamu (DIA; 1 mg/L a 5 mg/L), Chlordiazepoxidu (CDX; 2 mg/L a 20 mg/L), Lorazepamu (LOR; 0,2 mg/L a 5 mg/L), Medazepamu (MED; 0,5 mg/L a 5 mg/L), Midazolamu (MID; 0,2 mg/L a 2 mg/L), Nitrazepamu (NIT; 0,05 mg/L a 5 mg/L), pozitivní kontrole (rifampicinu = RIF; 10 μM) a negativní kontrole (DMSO = dimethylsulfoxidu; 0,1% v/v) po dobu 24 hodin. Po 24 hodinách byly buňky lyzovány a byla změřena luciferásová aktivita. Výsledky byly získány ze třech nezávislých měření a jsou v grafu vyjádřeny jako fold activation, což je násobek indukce vůči negativní kontrole (DMSO). * - hodnota je statisticky odlišná (signifikantní) od hodnoty negativní kontroly (DMSO) (p < 0,05) (pravděpodobnost získaná ze studentova testu). Graf byl sestrojen za pomoci programu Microsoft Excel a CorelDraw.
- 56 -
4.4 Diskuse V této práci byla testována sada vybraných BZP (Alprazolam, Bromazepam, Chlordiazepoxid,, Clonazepam, Diazepam, Lorazepam, Nitrazepam, Oxazepam, Tetrazepam a Triazolam) na možnost vyvolávat mezilékové interakce založené na indukci cytochromu P450 a schopnost transaktivovat promotor pro CYP1A1 a CYP3A4. Z výsledků je patrné, že výše zmíněné BZP nejsou induktory cytochromu P450 na úrovni mRNA, z čehož lze vyvodit, že pravděpodobně nezpůsobují mezilékové interakce na úrovni indukce P450. U dvou z testovaných BZP (Medazepam, Midazolam) byla pozorována slabá schopnost indukovat CYP3A4 mRNA. Na první pohled je jistě zarážející výrazná variabilita v hodnotách fold indukce jednotlivých benzodiazepinů mezi kulturami hepatocytů. Tato variabilita může jednak odrážet genotypickou variabilitu jednotlivých kultur danou např. polymorfismem jednotlivých komponent
transkripční
mašinerie
participujících
v regulaci
exprese
studovaných
biotransformačních enzymů anebo i vliv faktorů prostředí, jímž byl dárce vystaven před úmrtím. V neposlední řadě je třeba uvažovat intenzivní metabolismus hepatocytů, které účinek jedné látky přemění na účinek směsi několika rozličných látek, tj. metabolitů parentální sloučeniny, každé s odlišnými farmakodynamickými účinky. Statisticky nevýznamná schopnost transaktivace CYP3A4 a CYP1A1 promotorů některými BZD (Obr. 26 a 27) jen potvrzuje zjištění, že tyto látky nejsou schopny významných mezilékových interakcí daných transkripční aktivací PXR a AhR receptorů. Zejména díky tomu, že HepG2 buňky nejsou schopné výrazného metabolismu, můžeme posoudit vliv parentálních sloučenin. A tak pozorování na kulturách lidských hepatocytů svědčí spíše pro významný vliv metabolismu. V mnoha studiích bylo prokázáno, že velká většina farmakokinetických interakcí léčiv pochází buď od ligandem- / léčivem- indukované exprese enzymů metabolizujících léčiva skrz xenoreceptory AhR, PXR a CAR (Pávek a Dvořák, 2008) nebo inhibicí katalytické aktivity CYP. Z tohoto důvodu je v současné době každý lék testován na schopnost transaktivovat jednotlivé xenoreceptory před jejich uvedením na trh. Proto je vcelku překvapivé, že na trhu můžeme najít také několik látek, které se řadí právě mezi induktory cytochromu P450 (např. barbituráty, omeprazol, aj.). Je tedy pravděpodobné, že mohou být objeveny ještě další interakce mezi léčivy, které jsou v současné době využívány a nebyli testovány. Jako příklad lze uvést zjištění, že kyselina valproová, která je široce využívána jako antikonvulsivum, je silným aktivátorem PXR a následkem toho i induktorem CYP3A4 (Červený et al., 2007). Toto zjištění tak může mít dalekosáhlé následky např. pro pacienty s neurologickými potížemi, které využívají toto léčivo k zvládání depresivních stavů.
- 57 -
5. ZÁVĚR V této studii byl vyšetřován účinek 12 na trhu běžně využívaných BZP na schopnost transaktivovat xenosensory AhR a PXR. U každého z BZP byly použity 2 koncentrace: terapeutická koncentrace a toxická koncentrace. Bylo zjištěno, že testované BZP nejsou induktory CYP1A1/2 mRNA a ani netransaktivují p1A1-luc promotor v buňkách HepG2. Dále bylo zjištěno, že testované BZP (s výjimkou Medazepamu a Midazolamu) jsou také inaktivní vůči PXR, jak bylo demonstrováno pomocí exprese CYP3A4 mRNA v kultuře lidských hepatocytů a metody Reporter Gene Assay (transaktivace promotoru p3A4-luc v buňkách HepG2). Závěrem lze tedy říci, že Alprazolam, Bromazepam, Clonazepam, Chlordiazepoxid, Diazepam, Lorazepam, Nitrazepam, Oxazepam, Tetrazepam a Triazolam mohou být považovány za bezpečné léky, jelikož neaktivují xenoreceptory AhR a PXR a neindukují hlavní enzymy metabolizující léčiva. Oproti tomu Midazolam a Medazepam jsou aktivátory PXR, což by mělo být bráno v úvahu při předepisování a aplikaci těchto léků pacientům.
- 58 -
6. POUŽITÁ LITERATURA Acikgöz A., Karim N., Giri S., Schmidt-Heck W., Bader A. (2009) Two compartment Model of Diazepam Biotransformation in an Organotypical Culture of Primary Human Hepatocytes. Toxicology and Applied Pharmacology 234: 179-191. Anzenbacher P., Aneznbacherová E. (2001) Cytochromes P450 and Metabolism of Xenobiotics. Cellular and Molecular Life Sciences 58: 737-747. Baliharová V. (2003) Modulace aktivit cytochromů P450 benzimidazolovými anthelmintiky. Doktorská disertační práce, FF UK Hradec Králové. Berson A., Wolf C., Chachaty C., Fisch C., Fau D., Eugene D., Loeper J., Gauthier JC, Beaune P., Pompon D. (1993) Metabolic Activation of the Nitroaromatic Antiandrogen Flutamide by Rat and Human Cytochromes P-450, Including Forms Belonging to the 3A and 1A Subfamilies. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 265:366-372. Bronstein I., Fortin J., Stanley PE, Stewart GSAB, Kricka LJ (1994) Chemiluminiscent and Bioluminiscent Reporter Gene Assays. Analytical Biochemistry 219, 169-181. Costa E., Auta J., Grayson DR, Matsumoto K., Pappas GD, Zhang X., Guidotti A. (2002) GABAA Receptors and Benzodiazepines: a Role for Dendritic Resident Subunit mRNAs. Neuropharmacology 43, 925-937. Červený L., Švecová L., Anzenbacherová E., Vrzal R., Štaud F., Dvořák Z., Ulrichová J., Anzenbacher P., Pávek P. (2007) Valproic Acid Induces CYP3A4 a MDR1 Gene Expression by Activation of Constitutive Androstane Receptor and Pregnane X Receptor Pathways. Drug Metabolism and Disposition 35: 1032-1041. Dailey JW (2003) Sedative-Hypnotic and Anxiolytic drugs. In Modern Pharmacology with Clinical Applications (Craig ChR, Stitzel RE), pp. 355-363, Lippincott Williams & Wilkins, USA.
- 59 -
Derry
JM,
Dunn
SM,
Davies
M
(2004)
Identification
of
a
Residue
in
the
Gamma-Aminobutyric Acid Type A Receptor Alpha Subunit that Differentially Affects Diazepam-Sensitive
and
-Insensitive
Benzodiazepine
Site
Binding.
Journal
of
Neurochemistry 88 (6): 1431–8. Devashis M., Sephali G. (1988) Conformation, Electrostatic Potential and Pharmacophoric Pattern of GABA (Gamma-Aminobutyric Acid) and Several GABA Inhibitors. Journal of Molecular Structure: THEOCHEM 180: 125-140. D´Hulst C., Atack JR, Kooy RF (2009) The Complexity of the GABAA Receptor Shapes unique pharmacological profiles. Drug Discovery Today 14 (17-18), 866-875. Dikeos DG, Theleritis CG, Soldatos CR (2008) Benzodiazepines: Effects on Sleep. In Sleep Disorders: Diagnosis and Therapeutics (Pandi-Perumal SR, ed.), pp. 220–2, Informa Healthcare, Londýn. Dostálek M. a kol. (2006) Farmakokinetika, pp. 83-124, Grada Publishing a.s., Praha. Enna SJ, McCarson KE, Neto FL, Gomes JF, Castro-Lopes JM, Krogsgaard-Larsen P., Frølund B., Liljefors M., Benes FM, Gisabella B., Costa E., Dong E., Grayson DR, Ruzicka WB, Simonini MV, Veldic M., Guidotti A., Roberts E., Macdonald RL, Kang JQ, Gallagher MJ, Feng HJ, Boehm SL, Ponomarev I., Blednov YA, Hartus RA, Koop GF, Sieghart W., Clausen RP, Madsen K., Larsson OM, Schousboe A., Johnston GAR, Hanrahan JR, Chebib M., Duke RK, Mewett KN (2006) GABA, pp. 266-270, Elsevier, Kalifornie, USA. Ferenčík M., Škárka B., Novák M., Turecký B. (2000) Biochémia, pp. 881-887, Alfa, Bratislava. Fukasawa T., Suzuki A., Otani K. (2007) Effects of Genetic Polymorphism of Cytochrome P450 Enzymes on the Pharmacokinetics of Benzodiazepines. Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics 32: 333-341. Guengerich FP (1995) Human Cytochrome P-450 Enzymes. In Cytochrome P-450 (PR Ortiz de Montellano ed.), pp. 473-535, New York Premium, New York. Hampl F., Rádl S., Paleček J. (2007) Farmakochemie, pp. 111-205, VŠCHT, Praha, ČR.
- 60 -
Honkakoski P., Negishi M. (2000) Regulation of Cytochrome P450 (CYP) Genes by Nuclear Receptors. Biochemical Journal 347: 321-37. Chebib M., Johnston GAR (1999) The ′ABC′ of GABA receptors: a brief review. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 26: 937-940. Chouinard G., Lefko-Singh K., Tebou E. (1999) Metabolism of Anxiolytics and Hypnotics: Benzodiazepines, Buspirone, Zoplicone, and Zolpidem. Cellular and Molecular Neurobiology 19: 533-552. Kalgutkar AS, Henne KR, Lame ME, Vaz AD, Collin C., Soglia JR, Zhao SX, Hop CE (2005) Metabolic Activation of the Notricyclic Antidepressant Trazodone to Electrophilic QuinoneImine and Epoxide Intermediates in Human Liver Microsomes and Recombinant P4503A4. Chemico- Biological Interactions 155:10-20. Klaassen CD, Louis J., Casarett L., Doull J. (2008) Toxicology: The Basic Science of Poisons, pp. 133 – 143, McGraw-Hill Medical, New York, USA. Kliewer SA, Goodwin B., Willson TM (2002) The Nuclear Pregnane X Receptor: A Key Regulator of Xenobiotic Metabolism. Endocrine Reviews 23 (5): 687-702. Knejzlík Z., Káš J., Ruml T. (2000) Mechanismus vstupu xenobiotik do organismu a jejich detoxikace. Chemické Listy 94: 913-918. Kremers P. (2002) In Vitro Tests for Predicting Drug-Drug Interactions: The Need for Validated Procedures. Pharmacology & Toxikology 91, pp. 209-217. Leon DJ (2003) Glucuronidation Enzymes, Genes and Psychiatry. International Journal of Neuropsychopharmacology 6: 1: 57-72. Lincová D., Farghali H., a kol. (2005). Základní a aplikovaná farmakologie, pp. 154 – 159, Galén, Praha, ČR. Lüllmann H., Mohr K., Wehling M. (2004) Farmakologie a toxikologie, pp. 363-415, Grada Publishing, a.s., Praha, ČR.
- 61 -
Martínez-Jiménez CP, Jover R., Donato MT, Castell JV, Gómez-Lechón MJ (2007) Trascriptional Regulation and Expression of CYP3A4 in Hepatocytes. Current Drug Metabolism 8: 185-194. Mimuraa J., Kuriyama YF (2003) Functional Role of AhR in the Expression of Toxic Effects by TCDD. Journal of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology 1619: 263-268. Mizuno K., Katoh M., Okumura H., Nakagawa N., Negishi T., Hashizume T., Miki, Nakajima, Yokoi T. (2008) Metabolic Activation of Benzodiazepines by CYP3A4. Drug Metabolism and Disposition 37: 345-351. Morel Y., Barouki R. (1998) Down-Regulation of Cytochrom P450 1A1 Gene Promoter by Oxidative Stress. The Journal of Biological Chemistry 273: 26969-26976. Narimatsu E., Niiya T., Kawamata M., Namiki A. (2006) The Mechanisms of Depression by Benzodiazepines, Barbiturates and Propofol of Excitatory Synaptic Transmissions Mediated by Adenosine Neuromodulation. Masui (The Japanese Journal of Anesthesiology) 55 (6): 684–91. Nelson DR, Kamataki T., Waxman DJ, Guengerich FP, Estabrook RW, Feyereisen R., Gonzalez FJ, Coon MJ, Gunsalus IC, Gotoh O., Okuda K., Nebert DW (1993) The P450 Superfamily: Update on New Sequences, Gene Mapping, Accession Numbers, Early Trivial Names of Enzymes, and Nomenclature. DNA and Cell Biology 12 (1): 1-51. Pávek P., Dvořák Z. (2008) Xenobiotic-Induced Transcriptional of Xenobiotic Metabolizing Enzymes of the Cytochrome P450 Superfamily in Human Extrahepatic Tissues. Current Drug Metabolism 9, 129-143. Pávek P., Pospěchová K., Švecová L., Syrová Z., Stejskalová L., Blažková J., Dvořák Z., Blahoš J. (2010) Intestinal Cell-Specific Vitamin D Receptor (VDR)-Mediated Transcriptional Regulation of CYP3A4 Gene. Biochemical Pharmacology 79 (2): 277-87. Persson KP, Ekehed S., Otter Ch., Mareike Lutz ES, McPheat J., Masimirembwa CM, Anderson TB (2006) Evaluation of Human Liver Slices and Reporter Gene Assays as Systems for Predicting the Cytochrome P450 Induction Potential of Drugs in Vivo in Humans. Pharmaceutical Research 23: 56-69.
- 62 -
Rang H., Dale M., Ritter J., Flower R. (2007) Pharmacology, pp. 536-542, Elsevier, Inc., Churchill Livingstone. Riss J., Cloyd J., Gates J., Collins S. (2008) Benzodiazepines in Epilepsy: Pharmacology and Pharmacokinetics. Acta Neurologica Scandinavica118: 69-86. Shimada T., Yamazaki H., Mimura M., Inui Y., Guengerich FP (1994) Interindividual Variations in Human Liver Cytochrome P-450 Enzymes Involved in the Oxidation of Drugs, Carcinogens and Toxic Chemicals: Studies with Liver Microsomes of 30 Japanese and 30 Caucasians. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 270: 414-423. Sigel E. (2002) Mapping of the Benzodiazepine Recognition Site on GABAA Receptors. Current Topics in Medicinal Chemistry 2 (8): 833–9 Sumalatha Y., Reddy TR, Reddy PP, Satyanarayana B. (2009) A Simple, Efficient and Scalable Synthesis of Hypnotik Agent, Zolpidem. ARKIVOC – Free Journal of Organic Chemistry (ii) 315-320. Šípal Z., Anzenbacher P., Peč P., Pospíšil J., Růžička I. (1992) Biochemie, pp. 350-354, SPN Praha. Tateishi T., Watanabe M. Moriya H. Yamaguchi S. Sato T., Kobayashi, S. (1999) No Ethnic Difference between Caucasian and Japanese Hepatic Samples in the Expression Frequency of CYP3A5 and CYP3A7 Proteins. Biochemical Pharmacology 57(8), 935-939. Vardanyan R., Hruby VJ (2006) Synthesis of Essential Drug, pp. 70-131, Elsevier B.V., London, UK. Vrzal R., Daujat-Chavanieu M., Pascussi JM, Ulrichová J., Maurel P., Dvořák Z. (2007) Microtubules-Interfering Agents Restrict Aryl Hydrocarbon Receptor-Mediated CYP1A2 Iduction in Primary Cultures of Human Hepatocytes via c-jun-N-terminal Kinase and Glucocorticoid Receptor. European Journal of Pharmacology 581: 244-254. Vrzal R., Ulrichová J., Dvořák Z. (2004) Aromatic Hydrocarbon Receptor Status in the Metabolism of Xenobiotics under Normal and Pathophysiological Conditions. Biomedical Papers 148 (1): 3-10.
- 63 -
Vrzal R., Stejskalová L., Monostory K., Maurel P., Bachleda P., Pávek P., Dvořák Z. (2009) Dexamethasone Controls Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR)-mediated CYP1A1 and CYP1A2 Expression and Activity in Primary Cultures of Human Hepatocytes. ChemicoBiological Interactions 179: 288-296. Yamamoto Y., Yamazaki H., Ikeda T., Watanabe T., Iwabuchi H., Nakajima M., Yokoi T. (2002) Formation of a Novel Quinone Epoxide Metabolite of Troglizatone with Cytotoxicity to HepG2 cells. Drug Metabolism and Disposition 30: 55-60. Zuber R., Anzenbacherová E., Anzenbacher P. (2002) Cytochromes P450 and Experimental Models of Drug Metabolism. Journal of Cellular and Molecular Medicíně 6(2): 189-98.
- 64 -
INTERNETOVÉ ZDROJE Ashton CH (2007) Benzodiazepine Equivalence Table [online] (staženo dne 10.12.2009). Dostupné z: http://www.benzo.org.uk/bzequiv.htm Bignell, J. (2008) History of Benzodiazepine [online] Medications (staženo dne 1.12.2009). Dostupné z: http://www.emslive.com/articles/28/1/History-of benzodiazepine/Page1.html http://www.drug-encyclopedia.eu/DW_EN/benzodiazepines.shtml (staženo dne 15.12.2009) http://en.wikipedia.org/wiki/GABAA_receptor (staženo dne 15.12.2009) http://www.medic8.com/ (staženo dne 22.1.2010) http://www.medic8.com/medicines/Medazepam.html http://www.medic8.com/medicines/Tetrazepam.html http://www.medic8.com/medicines/Midazolam.html
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (staženo dne 25.1.2010) http://www.rxlist.com/ (staženo dne 22.1.2010) http://www.rxlist.com/xanax-drug.htm, http://www.rxlist.com/ambien-drug.htm http://www.rxlist.com/klonopin-drug.htm, http://www.rxlist.com/diazepam-injection-drug.htm http://www.rxlist.com/ativan-drug.htm, http://www.rxlist.com/midazolam-injection-drug.htm http://www.rxlist.com/serax-drug.htm, http://www.rxlist.com/halcion-drug.htm
http://www.sukl.cz/ (staženo dne 22.1.2010) http://www.sukl.cz/_download/spc/SPC100769.doc, http://www.sukl.cz/download/spc/SPC93739.doc, http://www.sukl.cz/_download/spc/SPC93739.doc,http://www.sukl.cz/_download/spc/SPC59119.doc, http://www.sukl.cz/_download/spc/SPC20212, http://www.sukl.cz/_download/spc/SPC9088.doc, http://www.sukl.cz/_download/spc/SPC57562.doc,http://www.sukl.cz/download/spc/SPC106820.doc
- 65 -
7. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK AF-1/2
domény jaderného receptoru PXR
AHR
aryluhlovodíkový receptor
AhRR
represor aryluhlovodíkového receptoru
ALP
alprazolam
AMK
aminokyselina
ARNT
jaderný přenašeč aryluhlovodíkového receptoru
bHSH
bazický helix-smyčka-helix
BRO
bromazepam
BZP
benzodiazepin
CAR
konstitutivní androstanový receptor
CCRP
cytoplazmatický protein udržující konstitutivní androstanový receptor
cDNA
komplementární deoxyribonukleová kyselina
CDX
chlordiazepoxid
C/EBPα/β
transkripční faktor regulace exprese CYP3A4
CLO
clonazepam
CNS
centrální nervový systém
CYP
cytochrom P450
CYP1/2/3
rodiny cytochromu P450
CYP1A1/2
členové podrodiny CYP1A cytochromu P450
CYP2A6
člen podrodiny CYP2A cytochromu P450
CYP3A4/5/7/43
členové podrodiny CYP3A cytochromu P450
CYP2B6
člen podrodiny CYP2B cytochromu P450
CYP2C8/9/19
členové podrodiny CYP2C cytochromu P450
CYP2D6
člen podrodiny CYP2D cytochromu P450
CYP2E1
člen podrodiny CYP2E cytochromu P450
CYP2F1
člen podrodiny CYP2F
DIA
diazepam
DMEM
Dulbecco´s modified Eagle´s medium
DTP
deoxyribonukleotid trifosfát
DRE
dioxin responsivní element
DTT
dithiothreitol
EDTA
etylendiamintetraoctová kyselina
F/R primer
forward/reverse primer
GABA
kyselina γ-aminomáselná
- 66 -
GABAA,B,C
receptor kyseliny γ-aminomáselné
GAPDH
glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa
GR
glukokortikoidní receptor
GRA
Gene Reporter Assay
GSH
redukovaná forma glutathionu
GST
glutathion S-transferasa
HAT
histonová acetylasa
HAU
halogenované aromatické uhlovodíky
HDAC
histonová deacetylasa
HepG2
hepatokarcinomová linie
HNF1α
transkripční faktor regulace exprese CYP3A4
HNF3γ
transkripční faktor regulace exprese CYP3A4
HNF4α
transkripční faktor regulace exprese CYP3A4
hPXR
expresní vektor pro PXR pro CYP3A4
JR
jaderný receptor
LETF
transkripční faktor regulace exprese CYP3A4
LH28/29/31
vzorky lidských jater od třech různých pacientů
LOR
lorazepam
3-MC
3-methylcholantren
MED
medazepam
MID
midazolam
MT
methyltransferasa
NAT
N-acetyltransferasa
NC
negativní kontrola
NCOA1/2
koaktivátory PXR
NES
jaderný exportní signál
NIT
nitrazepam
NLS
jaderný lokalizační signál
NR1I2
jaderný receptor (podrodina1, skupina I, člen 2)
OATP
organický anion přenášející polypeptidy
OCT
organický kationtový přenašeč
OXA
oxazepam
p1A1-luc
reportérový plasmid pro CYP1A1
p3A4-luc
reportérový plasmid pro CYP3A4
PAPS
3-fosfoadenosin-5-fosfosulfát
PAS
transkripční faktory, které kontrolují expresi lidských cytochromů
- 67 -
PAU
polycyklické aromatické uhlovodíky
PBS
fosfátový pufr
PC
pozitivní kontrola
PXR
pregnanový X receptor
RAR
receptor pro kyselinu trans- retinovou
RH
substrát
RH-Fe2+
komplex redukované formy cytochromu a substrátu
RH-Fe3+
komplex oxidované formy cytochromu a substrátu
RIF
rifampicin
ROH
oxidovaný substrát
RT-PCR
polymerázová řetězová reakce v reálném čase
RXR
retinoidní X receptor
SMRT
korepresor PXR
ST
sulfo-transferasa
TCDD
2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-p-dioxin
TET
tetrazepam
TF
transkripční faktor
TRI
triazolam
UGT
UDP-glukuronosyl transferasa
VDR
receptor pro vitamín D
XRE
xenobiotický responsivní element
- 68 -
8. PŘÍLOHA Vrzal R., Kubešová K., Pávek P., Dvořák Z. (2010) Benzodiazepines Medazepam and Midazolam are Activators of Pregnane X Receptor and Weak Inducers of CYP3A4: Investigation in Primary Cultures of Human Hepatocytes and Hepatocarcinoma Cell Lines. Toxikology Letters 193: 183-188.
- 69 -
Toxicology Letters 193 (2010) 183–188
Contents lists available at ScienceDirect
Toxicology Letters journal homepage: www.elsevier.com/locate/toxlet
Benzodiazepines medazepam and midazolam are activators of pregnane X receptor and weak inducers of CYP3A4: Investigation in primary cultures of human hepatocytes and hepatocarcinoma cell lines Radim Vrzal a , Katerina Kubesova a , Petr Pavek b , Zdenek Dvorak a,∗ a b
Department of Cell Biology and Genetics, Faculty of Science, Palacky University Olomouc, Slechtitelu 11, 783 71 Olomouc, Czech Republic Department of Pharmacology and Toxicology, Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Kralove, Heyrovskeho 1203, 50005 Hradec Kralove, Czech Republic
a r t i c l e
i n f o
Article history: Received 18 November 2009 Received in revised form 7 January 2010 Accepted 8 January 2010 Available online 18 January 2010 Keywords: Human hepatocytes Cytochrome P450 Benzodiazepines Enzyme induction
a b s t r a c t Benzodiazepines have wide-spread used in pharmacotherapy for their anxiolytic, myorelaxant, hypnotic, amnesic and anticonvulsive properties. Despite benzodiazepines are used in clinics over 50 years, they have not been surprisingly tested for capability to induce major drug-metabolizing cytochromes P450. In the current study, we have examined the potency of Alprazolam, Bromazepam, Chlordiazepoxide, Clonazepam, Diazepam, Lorazepam, Medazepam, Midazolam, Nitrazepam, Oxazepam, Tetrazepam and Triazolam to induce CYP1A2 and CYP3A4 in primary cultures of human hepatocytes. Benzodiazepines were tested in therapeutic concentrations and in concentrations corresponding to their plasma levels in intoxicated patients. We found weak but significant induction of CYP3A4 mRNA by Midazolam and Medazepam, while other benzodiazepines did not induce CYP3A4 expression. None of the tested compounds induced CYP1A2 mRNA in three independent human hepatocytes cultures. In addition, employing gene reporter assays with transiently transfected hepatocarcinoma cells, we found that tested benzodiazepines did not activate aryl hydrocarbon receptor (AhR), whereas Midazolam and Medazepam slightly activated pregnane X receptor (PXR). Consistently, two-hybrid mammalian assay using hybrid fusion plasmids GAL4-PXR ligand-binding domain (LBD) and VP16-SRC-1-receptor-interacting domain (RID) confirmed PXR activation by Midazolam and Medazepam. In conclusion, Alprazolam, Bromazepam, Chlordiazepoxide, Clonazepam, Diazepam, Lorazepam, Nitrazepam, Oxazepam, Tetrazepam and Triazolam can be considered as safe drugs in term of their inability to induce PXR- and AhR-dependent cytochrome P450 enzymes CYP1A2 and CYP3A4. Medazepam and Midazolam slightly activated pregnane X receptor and displayed weak potency to induce CYP3A4 mRNA in human hepatocytes. © 2010 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.
1. Introduction Benzodiazepines (BZD) comprise a large group of psychoactive drugs, that are massively used in human pharmacotherapy for their anxiolytic, hypnotic, myorelaxant, amnesic and anticonvulsive properties. The mechanisms of BZD action at molecular level involve binding of BZD to specific BZD-binding site at gammabutyric acid receptor A (GABAA ), which works as ligand-gated channel for Cl− ions (Cloos and Ferreira, 2009; D’Hulst et al.,
Abbreviations: AhR, Aryl hydrocarbon receptor; ALP, Alprazolam; BRO, Bromazepam; CAR, Constitutive Androstane Receptor; CDX, Chlordiazepoxide; CLO, Clonazepam; CYP, Cytochrome P450; DIA, Diazepam; DMSO, Dimethylsulfoxide; HepG2, Human Caucasian Hepatocarcinoma Cells; LOR, Lorazepam; MED, Medazepam; MID, Midazolam; NIT, Nitrazepam; OXA, Oxazepam; PXR, pregnane X receptor; RIF, Rifampicin; TCDD, 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin; TET, Tetrazepam; TRI, Triazolam. ∗ Corresponding author. Tel.: +420 58 5634903; fax: +420 58 5634905. E-mail address:
[email protected] (Z. Dvorak). 0378-4274/$ – see front matter © 2010 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved. doi:10.1016/j.toxlet.2010.01.004
2009). Binding of BZD to GABAA promotes the effects of GABA on GABAA receptor and consequently increases the conductance of Cl− across the neuronal cell membrane, increases membrane potential and inhibits neuronal firing (Rudolph and Mohler, 2006). Benzodiazepines are in clinical practice for about half of century. The first BZD, chlordiazepoxide, was synthesized in 1955 by Leo Sternbach (Hoffmann – La Roche) and it was introduced to the market in 1960 under brand name Librium (Sternbach, 1979). Very famous and wide-spread rapidly became a chlordiazepoxide successor diazepam (Valium, Hoffmann – La Roche; released in 1963). In the current pharmacotherapy, there are available many benzodiazepine derivatives and they are very frequently used drugs. It is well known that many xenobiotics, including drugs, cause pharmacokinetic drug–drug interactions involving activation of xenoreceptors PXR (Pregnane X Receptor), CAR (Constitutive Androstane Receptor) and AhR (aryl hydrocarbon receptor), and consequently induce drug-metabolizing enzymes. Xenoreceptors are also important regulators of many endogenous metabolic pathways, including carbohydrate and lipid homeostasis, metabolism of
184
R. Vrzal et al. / Toxicology Letters 193 (2010) 183–188
eicosanoids, cholesterol, bile acid, vitamin D, steroid hormones, etc. (Pascussi et al., 2008; Wada et al., 2009). It is therefore surprising that there is lack of information in the scientific literature on possible pharmacokinetic drug interactions by BZD, the drugs that are used for a long time and in a long term (Sinz et al., 2006). Indeed, we have recently described the effects of several currently used drugs on cytochromes P450 induction. While some of them were found inactive in terms of AhR or PXR activation, e.g. hypnotic Zolpidem (Bachleda et al., 2009), we found that anticonvulsive valproic acid and azole antimycotics (econazole, miconazole, oxiconazole, clotrimazole) are activators of PXR (Cerveny et al., 2007; Svecova et al., 2008), and that phytoceutical drug berberine is an activator of AhR (Vrzal et al., 2005). Another example is induction of cytochromes CYP1A1/2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C9/19 and CYP3A4 by glucocorticoid dexamethasone (Onica et al., 2008; Pascussi et al., 2003; Vrzal et al., 2009). Therefore, we tested whether the most often used benzodiazepines have the capacity to activate AhR and PXR xenoreceptors and consequently induce major drug-metabolizing cytochromes P450. Benzodiazepines were tested in therapeutic concentrations and in concentrations corresponding to their plasma levels in intoxicated patients (Schulz and Schmoldt, 2003). We analyzed the effects of Alprazolam, Bromazepam, Chlordiazepoxide, Clonazepam, Diazepam, Lorazepam, Medazepam, Midazolam, Nitrazepam, Oxazepam, Tetrazepam and Triazolam, on CYP1A1, CY1A2 and CY3A4 mRNAs induction in primary cultures of human hepatocytes. In addition, we measured the transactivation potency of tested benzodiazepines against AhR and PXR in HepG2 cells, using gene reporter assays. We also performed mammalian twohybrid assay to assess the capacity of benzodiazepines to promote formation of PXR-SRC1 complex. We found that Midazolam and Medazepam are weak PXR activators and CYP3A4 inducers, while other tested BZD were inactive towards PXR-CYP3A4. None of the compounds tested was AhR activator and/or CYP1A2 inducer. Collectively, our data reveal no potency of tested BZD to cause pharmacokinetic interactions in terms of their interactions with AhR- and/or PXR-dependent induction of major drug-metabolizing cytochromes P450. Weak PXR activation and CYP3A4 induction by Midazolam and Medazepam should be taken in account by clinicians when applying or prescribing these drugs. 2. Materials and methods 2.1. Materials LightCycler FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I and FuGENE 6 transfection reagent were from Roche Diagnostic Corporation (Intes Bohemia, Czech Republic). Collagen-coated culture dishes were from BD Biosciences (Le Pont de Claix, France). 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin was from Ultra Scientific (RI, USA). Oligonucleotide primers used in RT-PCR reactions were from Invitrogen. Rifampicin and DMSO were from Sigma–Aldrich (Prague, Czech Republic). Benzodiazepines standards were a generous gift from Dr. Peter Ondra (Department of Forensic Medicine and Medical Law, Faculty Hospital Olomouc, Czech Republic). All other chemicals were of the highest quality commercially available. 2.2. Primary human hepatocytes Hepatocytes were prepared from liver tissue, resected from multiorgan donors. Tissue acquisition protocol was in accordance with the requirements issued by local ethical commission in the Czech Republic. Human liver tissues used in this study were obtained from three patients (multiorgan donors): LH28 (male, 48 years), LH29 (male; 74 years) and LH31 (male, 28 years). Hepatocytes were isolated and cultured as previously described (Pichard-Garcia et al., 2002). Culture medium was enriched for plating with 2% fetal calf serum (v/v). The medium was exchanged for a serum-free medium the day after and the culture was allowed to stabilize for an additional 48 h. Thereafter, cells were treated for 24 h with Alprazolam (0.05 mg/L and 0.5 mg/L), Bromazepam (0.1 mg/L and 0.5 mg/L), Chlordiazepoxide (2 mg/L and 20 mg/L), Clonazepam (0.05 mg/L and 0.5 mg/L), Diazepam (1 mg/L and 5 mg/L), Lorazepam (0.2 mg/L and 5 mg/L), Medazepam (0.5 mg/L and 5 mg/L), Midazolam (0.2 mg/L and 2 mg/L), Nitrazepam (0.05 mg/L and 5 mg/L), Oxazepam (1 mg/L and 5 mg/L), Tetrazepam (0.5 mg/L and 5 mg/L), Triazolam (0.01 mg/L and
0.5 mg/L), rifampicin (10 M), 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (5 nM) and/or vehicle (DMSO; 0.1%, v/v). Cultures were maintained at 37 ◦ C and 5% CO2 in a humidified incubator. 2.3. mRNA determination and quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (qRT-PCR) Total RNA was isolated using TRIZOL Reagent (Invitrogen). cDNA was synthesized from 200 ng of total RNA using M-MLV Reverse Transcriptase (Finnzymes) at ◦ 42 C for 60 min in the presence of random hexamers (GE Healthcare). One tenth was used for qRT-PCR amplification using the Light Cycler apparatus (Roche Diagnostic Corporation, Intes Bohemia, Czech Republic). The levels of CYP1A1, CYP1A2, CYP3A4 and GAPDH mRNAs were determined as we described elsewhere (Dvorak et al., 2008; Pavek et al., 2007). The measurements were performed in duplicates. We verified after each run of RT-PCR that the melting curve of the amplified fragments monitored by the light cycler presented a single peak, as expected. The data were normalized per glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) as a housekeeping gene and further processed by delta–delta mathematic method assuming Pfaffl coefficient to be 2. 2.4. Gene reporter assays 2.4.1. Cell lines Human hepatocellular carcinoma cells HepG2 (ECACC No. 85011430) were cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% FCS, 100 U/mL streptomycin, 100 g/mL penicillin, 4 mM l-glutamine, 1% non-essential amino acids, and 1 mM sodium pyruvate. The human Mz-Hep-1 hepatocellular carcinoma cell line was kindly donated by Dr. Ramiro Jover, Unidad de Hepatología Experimental, Hospital La Fe, Valencia, Spain. The cell line was maintained in the antibiotic-free Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS). Cells were maintained at 37 ◦ C and 5% CO2 in a humidified incubator. 2.4.2. Plasmids p1A1-luc plasmid containing 5 -flanking region (−1566 to +73) of human CYP1A1 gene subcloned into the KpnI–HindIII double-digested pGL3-Basic vector (Promega, Madison, WI) upstream of the firefly luciferase reporter gene was a generous gift from Dr. Robert Barouki (INSERM U490, Paris, France). A chimeric p3A4-luc reporter construct containing the basal promoter (−362/+53) with proximal PXR response element and the distal xenobiotic responsive enhancer module (−7836/−7208) of the CYP3A4 gene 5 -flanking region inserted to pGL3-Basic reporter vector was described (Goodwin et al., 1999). The expression plasmid for human PXR receptor, pSG5-PXR, was kindly provided by Dr. S. Kliewer (University of Texas, Dallas, TX). The mammalian two-hybrid fusion plasmids GAL4-PXR-LBD and VP16-SRC-1-receptor-interacting domain (RID) were a generous gift from Dr. A. Takeshita (Toranomon Hospital, Tokyo, Japan); (Takeshita et al., 2002). The luciferase reporter construct pG5luc vector was purchased from Promega. 2.4.3. Transient transfection and luciferase gene reporter assays HepG2 cells were transiently transfected by lipofection (FuGENE 6) with 300 ng/well of reporters (p1A1-luc or p3A4-luc) and 100 ng/well of expression plasmid (hPXR) in 24-well plates, as we described elsewhere (Dvorak et al., 2008). Following 16 h of stabilization, the cells were treated for 24 h with Alprazolam (0.05 mg/L and 0.5 mg/L), Bromazepam (0.1 mg/L and 0.5 mg/L), Chlordiazepoxide (2 mg/L and 20 mg/L), Clonazepam (0.05 mg/L and 0.5 mg/L), Diazepam (1 mg/L and 5 mg/L), Lorazepam (0.2 mg/L and 5 mg/L), Medazepam (0.5 mg/L and 5 mg/L), Midazolam (0.2 mg/L and 2 mg/L), Nitrazepam (0.05 mg/L and 5 mg/L), rifampicin (10 M), 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD; 5 nM) and/or vehicle (DMSO; 0.1%, v/v). After the treatments, cells were lysed and luciferase activity was measured and standardized per milligram of protein. Protocol for mammalian two-hybrid assay has been described in our previous report (Svecova et al., 2008). Transient transfection assays were carried out using Lipofectamine2000 reagent (Invitrogen) according to the manufacturer’s instruction. MZ-Hep1 cells (5 × 104 ) were seeded into 48-well plates. The pGAL4–PXR-LBD (50 ng/well) and pVP16-SRC-1-RID or empty pVP16 (50 ng/well) fusion constructs were transfected along with pG5luc vector (200 ng/well) and pRL-TK (20 ng/well) into MZ-Hep1 cells. One day after transfection cells were treated for 24 h with Alprazolam (0.5 mg/L), Bromazepam (0.5 mg/L), Chlordiazepoxide (20 mg/L), Clonazepam (0.5 mg/L), Diazepam (5 mg/L), Lorazepam (5 mg/L), Medazepam (5 mg/L), Midazolam (2 mg/L), Nitrazepam (5 mg/L), Oxazepam (5 mg/L), Tetrazepam (5 mg/L), Triazolam (0.5 mg/L), rifampicin (10 M) and/or vehicle (DMSO; 0.1%, v/v). Luminescence activities were determined with a Genios Plus luminometer (Tecan, Grödig, Austria) in cell lysate using a commercially available luciferase detection system (Dual Luciferase Reporter Assay Kit; Promega). 2.5. Statistics Results were expressed as mean ± standard deviation. Pair Student’s pair test was applied to all analyses.
R. Vrzal et al. / Toxicology Letters 193 (2010) 183–188
185
Fig. 1. Effects of benzodiazepines on CYP3A4 mRNAs expression in primary cultures of human hepatocytes. Human hepatocytes cultures LH28, LH29 and LH31 were treated for 24 h with Alprazolam (0.05 mg/L and 0.5 mg/L), Bromazepam (0.1 mg/L and 0.5 mg/L), Chlordiazepoxide (2 mg/L and 20 mg/L), Clonazepam (0.05 mg/L and 0.5 mg/L), Diazepam (1 mg/L and 5 mg/L), Lorazepam (0.2 mg/L and 5 mg/L), Medazepam (0.5 mg/L and 5 mg/L), Midazolam (0.2 mg/L and 2 mg/L), Nitrazepam (0.05 mg/L and 5 mg/L), Oxazepam (1 mg/L and 5 mg/L), Tetrazepam (0.5 mg/L and 5 mg/L), Triazolam (0.01 mg/L and 0.5 mg/L), rifampicin (RIF; 10 M), 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD; 5 nM) and/or vehicle (DMSO; 0.1%, v/v). RT-PCR analyses of CYP3A4 mRNAs are shown. The data are mean ± SD from duplicate measurements and are expressed as fold induction over DMSO-treated cells. The data were normalized per GAPDH mRNA levels. *Value is significantly different from DMSO-treated cells (p < 0.05).
186
R. Vrzal et al. / Toxicology Letters 193 (2010) 183–188
Fig. 2. Effects of benzodiazepines on transactivation of p3A4-luc reporter plasmid in HepG2 cells. HepG2 cells were transiently transfected by lipofection (FuGENE 6) with 300 ng/well of p3A4-luc and 100 ng/well of hPXR plasmids. Following 16 h of stabilization, the cells were treated for 24 h with Alprazolam (0.05 mg/L and 0.5 mg/L), Bromazepam (0.1 mg/L and 0.5 mg/L), Chlordiazepoxide (2 mg/L and 20 mg/L), Clonazepam (0.05 mg/L and 0.5 mg/L), Diazepam (1 mg/L and 5 mg/L), Lorazepam (0.2 mg/L and 5 mg/L), Medazepam (0.5 mg/L and 5 mg/L), Midazolam (0.2 mg/L and 2 mg/L), Nitrazepam (0.05 mg/L and 5 mg/L), rifampicin (RIF; 10 M) and/or vehicle (DMSO; 0.1%, v/v). After the treatments, cells were lysed and luciferase activity was measured and standardized per milligram of protein. The data are mean ± SD from triplicate measurements and are expressed as fold induction over DMSO-treated cells. *Value is significantly different from DMSO-treated cells (p < 0.05).
3. Results 3.1. Effects of benzodiazepines on CYP1A1, CYP1A2 and CYP3A4 mRNAs expression in primary cultures of human hepatocytes – real time PCR In the first series of experiments, we examined the effects of tested benzodiazepines on AhR- and PXR-dependent induction of CYP1A2 mRNA and CYP3A4 mRNA, respectively. For this purpose, we treated three different primary human hepatocytes cultures (for details see Section 2) with tested compounds for 24 h. We applied two concentration of benzodiazepines, i.e. corresponding to their therapeutic plasma levels and to the plasma levels in patients intoxicated by these drugs (Tentamen Suicidi) (Schulz and Schmoldt, 2003). In parallel, hepatocytes were treated with the model activators of PXR and AhR, i.e. rifampicin (RIF; 10 M) and 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD; 5 nM), respectively. Of the benzodiazepines tested, no significant induction of CYP1A2 mRNA was observed, with exception of approximately 20fold increase of CYP1A2 mRNA by Alprazolam (0.5 mg/L) in human hepatocytes culture LH29. The prototypic CYP1A2 inducer TCDD caused strong induction of CYP1A2 mRNA in all hepatocytes cultures, and the intensity of induction varied between the cultures (122× in LH28, 700× in LH29, 100× in LH31). We further analyzed the induction of CYP1A1 mRNA, an AhR-dependent gene, the expression of which is much more potent in response to AhR activators. We observed analogical induction profile as in case of CYP1A2, i.e. only Alprazolam (0.5 mg/L) caused significant induction of CYP1A1 mRNA (approx. 60-fold) in LH29 human hepatocytes culture. Induction of CYP1A1 mRNA by TCDD was 374-fold, 1574fold and 832-fold, in LH28, LH29 and LH30 culture, respectively (data not shown). The typical CYP3A4 inducer RIF caused strong induction of CYP3A4 mRNA in all hepatocytes cultures, and the intensity of induction slightly varied between the cultures (45× in LH28, 62× in LH29, 21× in LH31). The effects of benzodiazepines on PXRdependent CYP3A4 induction varied between individual human hepatocytes cultures. We observed slight non-significant increase of CYP3A4 mRNA by Lorazepam in all three cultures. Similarly, Diazepam and Chlordiazepoxide slightly and non-significantly
increased CYP3A4 mRNA in cultures LH29 and LH31. Significant induction of CYP3A4 mRNA was achieved by Midazolam and Medazepam in cultures LH29 and LH31 (Fig. 1). The data obtained indicate that tested benzodiazepines, except of midazolam and medazepam, have no drug-interaction potential with respect to CYP1A1/2 and CYP3A4 mRNAs induction. However, the results must be interpreted with respect to inter-individual variability between the individual primary cultures. In addition, human hepatocytes are fully metabolically competent cells; therefore, we evaluate induction potency not only for maternal drug but also for its metabolites. 3.2. Effects of benzodiazepines on transactivation of AhR and PXR xenoreceptors in human hepatoma HepG2 cells – gene reporter assays In second series of experiments, we examined the effects of benzodiazepines on transcriptional activities of AhR and PXR receptors by gene reporter assays. For this purpose, human hepatocarcinoma cells HepG2 were transiently transfected with p1A1-luc and/or p3A4-luc reporter plasmids and hPXR vector. Thereafter, cells were treated for 24 h with benzodiazepines, rifampicin (RIF; 10 M) and 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD; 5 nM) (for details see Section 2). While typical AhR activator TCDD strongly transactivated p1A1-luc reporter (approx. 130-fold increase), the tested benzodiazepines had no significant effects in this assay (data not shown). Similarly, we did not observe significant transactivation of p3A4luc reporter by any of the compounds tested, whereas p3A4-luc was strongly activated by typical PXR activator rifampicin (Fig. 2). The effects of BZD on p1A1-luc are consistent with CYP1A1/2 mRNAs expression in human hepatocytes. However, we did not confirm by gene reporter assay that CYP3A4 mRNA induction in primary human hepatocytes by midazolam and medazepam occurs via PXR. This discrepancy could be due to the effects of benzodiazepine metabolites since human hepatocytes are fully metabolically competent cells in comparison with HepG2 cell line. Additionally, recent study suggested that the level of activation of the CYP3A4 promoter depends on the presence of members of the NF I transcription factor family, which might not be present at sufficient levels in HepG2 cells (Riffel et al., 2009).
R. Vrzal et al. / Toxicology Letters 193 (2010) 183–188
187
Fig. 3. Effects of benzodiazepines on transactivation of human PXR by mammalian two-hybrid assay in MZ-Hep1 cells. Cells were transiently transfected by lipofection (Lipofectamine2000) with pGAL4–PXR-LBD (50 ng/well) and pVP16-SRC-1-RID or empty pVP16 (50 ng/well) fusion constructs along with pG5luc vector (200 ng/well) and pRL-TK (20 ng/well). One day after transfection, cells were treated for 24 h with Alprazolam (0.5 mg/L), Bromazepam (0.5 mg/L), Chlordiazepoxide (20 mg/L), Clonazepam (0.5 mg/L), Diazepam (5 mg/L), Lorazepam (5 mg/L), Medazepam (5 mg/L), Midazolam (2 mg/L), Nitrazepam (5 mg/L), Oxazepam (5 mg/L), Tetrazepam (5 mg/L), Triazolam (0.5 mg/L), rifampicin (10 M) and/or vehicle (DMSO; 0.1%, v/v). Luminescence activity was determined in cell lysate using Dual Luciferase Reporter Assay Kit. The data are mean ± SD from triplicate measurements and are expressed as fold induction over DMSO-treated cells. *Value is significantly different from DMSO-treated cells (p < 0.05).
3.3. Effects of benzodiazepines on interaction between hPXR and SRC1 – mammalian two-hybrid assay We used the mammalian two-hybrid assay to evaluate whether tested benzodiazepines promote interaction of hPXR ligandbinding domain with SRC-1 co-activator. In agreement with CYP3A4 mRNA expression in human hepatocytes (Fig. 1), midazolam (p < 0.01) and medazepam (p < 0.05) yielded the strongest effects on interaction of PXR with SRC-1 in comparison with vehicle-treated control experiments, if pGAL4-PXR-LBD and pVP16-SRC1-RID were co-transfected into MZ-Hep1 cells. Clonazepam and tetrazepam also activated (N.S.) luciferase reporter construct in the experiments. These data confirm that midazolam and medazepam interact with PXR ligand-binding domain and stimulate interaction with SRC-1 co-activator. 4. Discussion In the current paper we demonstrate that common benzodiazepines including Alprazolam, Bromazepam, Chlordiazepoxide, Clonazepam, Diazepam, Lorazepam, Nitrazepam, Oxazepam,
Tetrazepam and Triazolam are not inducers of major drugmetabolizing cytochromes P450 at the level of mRNAs and thereby they are not likely to cause pharmacokinetic drug–drug interactions based on P450s induction. In contrast, we observed weak potency of Midazolam and Medazepam to promote PXR interaction with SRC-1 co-activator and consequently to induce CYP3A4 mRNA. These findings are, in particular, supported by: (i) analyzes of CYP1A1, CYP1A2 and CYP3A4 mRNAs expression in primary cultures of human hepatocytes; (ii) gene reporter assays in HepG2 cells transfected with p1A1-luc and/or p3A4-luc reporters and hPXR expression vector; (iii) mammalian two-hybrid assay determining physical interaction between hPXR and SRC-1. The majority of pharmacokinetic drug interactions originate from ligand- (drug-) inducible expression of drug-metabolizing enzymes, which occurs via xenoreceptors AhR, PXR and CAR (Pavek and Dvorak, 2008) and/or from inhibition of CYP activities by the drug. For this reason, new drugs are extensively tested for capability to transactivate xenoreceptors, before their introduction to the market. Surprisingly, there are several drugs currently used in the human pharmacotherapy that are inducers of cytochromes P450 enzymes. The examples are omeprazole, carbamazepine, pheny-
188
R. Vrzal et al. / Toxicology Letters 193 (2010) 183–188
toine or barbiturates (Pascussi et al., 2005; Gerbal-Chaloin et al., 2006). The interactions between the currently used drugs that have not been required to be tested for induction of xenoreceptors and AhR/PXR are revealed non-systematically. For instance, we have recently examined the effects of several drugs on PXR activation in human hepatocytes and cancer cell lines. We found that widely used anticonvulsive valproic acid is strong activator of PXR and inducer of CYP3A4 (Cerveny et al., 2007), while hypnotic drug zolpidem did not activate PXR (Bachleda et al., 2009).In the present paper, we investigated the effects of 12 commonly used benzodiazepine-type drugs on the activation of AhR and PXR xenoreceptors. We used two concentrations of the drug, referring to the therapeutic blood levels and the blood levels occurring in the patients after intoxications (Tentamen Suicidi) (Schulz and Schmoldt, 2003). We found that tested benzodiazepines are not inducers of CYP1A1 and CYP1A2 mRNAs in primary human hepatocytes. Consistently, tested compounds did not transactivate p1A1-luc promoter as revealed by gene reporter assays in HepG2 cells. With exception of midazolam and medazepam, tested benzodiazepines were also inactive towards PXR, as revealed by CYP3A4 mRNA expression in human hepatocytes, p3A4-luc transactivation in HepG2 cells and two-hybrid mammalian assay on interaction between PXR and SRC-1 in MZ-Hep1 (Figs. 1–3).In conclusion, Alprazolam, Bromazepam, Chlordiazepoxide, Clonazepam, Diazepam, Lorazepam, Nitrazepam, Oxazepam, Tetrazepam and Triazolam may be considered as the safe drugs since they do not activate xenosensors AhR and PXR and do not induce major drug-metabolizing enzymes. The possible consequences of PXR activation by midazolam and medazepam should be taken in account, when prescribing or applying these drugs to the patients. Conflict of interest statement The authors declare that there are no conflicts of interest. Acknowledgements Our laboratory is supported by the grants from the Grant Agency of the Czech Republic GACR304/10/0149 (to Z.D.), GACR303/07/0128 (to P.P.) and GACR305/08/P089 (to R.V). References Bachleda, P., Vrzal, R., Pivnicka, J., Cvek, B., Dvorak Z, 2009. Examination of Zolpidem effects on AhR- and PXR-dependent expression of drug-metabolizing cytochromes P450 in primary cultures of human hepatocytes. Toxicol. Lett. 191, 74–78. Cerveny, L., Svecova, L., Anzenbacherova, E., Vrzal, R., Staud, F., Dvorak, Z., Ulrichova, J., Anzenbacher, P., Pavek, P., 2007. Valproic acid induces CYP3A4 and MDR1 gene expression by activation of constitutive androstane receptor and pregnane x receptor pathways. Drug Metab. Dispos. 35 (7), 1032–1041. Cloos, J.M., Ferreira, V., 2009. Current use of benzodiazepines in anxiety disorders. Curr. Opin. Psychiatry 22 (1), 90–95. D’Hulst, C., Atack, J.R., Kooy, R.F., 2009. The complexity of the GABAA receptor shapes unique pharmacological profiles. Drug Discov. Today 14 (17–18), 866–875.
Dvorak, Z., Vrzal, R., Henklova, P., Jancova, P., Anzenbacherova, E., Maurel, P., Svecova, L., Pavek, P., Ehrmann, J., Havlik, R., Bednar, P., Lemr, K., Ulrichova, J., 2008. JNK inhibitor SP600125 is a partial agonist of human aryl hydrocarbon receptor and induces CYP1A1 and CYP1A2 genes in primary human hepatocytes. Biochem. Pharmacol. 75 (2), 580–588. Gerbal-Chaloin, S., Pichard-Garcia, L., Fabre, J.M., Sa-Cunha, A., Poellinger, L., Maurel, P., Daujat-Chavanieu, M., 2006. Role of CYP3A4 in the regulation of the aryl hydrocarbon receptor by omeprazole sulphide. Cell. Signal. 18 (5), 740– 750. Goodwin, B., Hodgson, E., Liddle, C., 1999. The orphan human pregnane X receptor mediates the transcriptional activation of CYP3A4 by rifampicin through a distal enhancer module. Mol. Pharmacol. 56 (6), 1329–1339. Onica, T., Nichols, K., Larin, M., Ng, L., Maslen, A., Dvorak, Z., Pascussi, J.M., Vilarem, M.J., Maurel, P., Kirby, G.M., 2008. Dexamethasone-mediated up-regulation of human CYP2A6 involves the glucocorticoid receptor and increased binding of hepatic nuclear factor 4{alpha} to the proximal promoter. Mol. Pharmacol. 73 (2), 451–460. Pascussi, J.M., Dvorak, Z., Gerbal-Chaloin, S., Assenat, E., Maurel, P., Vilarem, M.J., 2003. Pathophysiological factors affecting CAR gene expression. Drug Metab. Rev. 35 (4), 255–268. Pascussi, J.M., Robert, A., Nguyen, M., Walrant-Debray, O., Garabedian, M., Martin, P., Pineau, T., Saric, J., Navarro, F., Maurel, P., Vilarem, M.J., 2005. Possible involvement of pregnane X receptor-enhanced CYP24 expression in drug-induced osteomalacia. J. Clin. Invest. 115 (1), 177–186. Pascussi, J.M., Gerbal-Chaloin, S., Duret, C., Daujat-Chavanieu, M., Vilarem, M.J., Maurel, P., 2008. The tangle of nuclear receptors that controls xenobiotic metabolism and transport: crosstalk and consequences. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48, 1–32. Pavek, P., Cerveny, L., Svecova, L., Brysch, M., Libra, A., Vrzal, R., Nachtigal, P., Staud, F., Ulrichova, J., Fendrich, Z., Dvorak, Z., 2007. Examination of glucocorticoid receptor alpha-mediated transcriptional regulation of P-glycoprotein, CYP3A4, and CYP2C9 genes in placental trophoblast cell lines. Placenta 28 (10), 1004– 1011. Pavek, P., Dvorak, Z., 2008. Xenobiotic-induced transcriptional regulation of xenobiotic metabolizing enzymes of the cytochrome P450 superfamily in human extrahepatic tissues. Curr. Drug Metab. 9 (2), 129–143. Pichard-Garcia, L., Gerbal-Chaloin, S., Ferrini, J.B., Fabre, J.M., Maurel, P., 2002. Use of long-term cultures of human hepatocytes to study cytochrome P450 gene expression. Methods Enzymol. 357, 311–321. Riffel, A.K., Schuenemann, E., Vyhlidal, C.A., 2009. Regulation of the CYP3A4 and CYP3A7 promoters by members of the nuclear factor I transcription factor family. Mol. Pharmacol. 76 (5), 1104–1114. Rudolph, U., Mohler, H., 2006. GABA-based therapeutic approaches: GABAA receptor subtype functions. Curr. Opin. Pharmacol. 6 (1), 18–23. Schulz, M., Schmoldt, A., 2003. Therapeutic and toxic blood concentrations of more than 800 drugs and other xenobiotics. Pharmazie 58 (7), 447–474. Sinz, M., Kim, S., Zhu, Z., Chen, T., Anthony, M., Dickinson, K., Rodrigues, A.D., 2006. Evaluation of 170 xenobiotics as transactivators of human pregnane X receptor (hPXR) and correlation to known CYP3A4 drug interactions. Curr. Drug Metab. 7 (4), 375–388. Sternbach, L.H., 1979. The benzodiazepine story. J. Med. Chem. 22 (1), 1–7. Svecova, L., Vrzal, R., Burysek, L., Anzenbacherova, E., Cerveny, L., Grim, J., Trejtnar, F., Kunes, J., Pour, M., Staud, F., Anzenbacher, P., Dvorak, Z., Pavek, P., 2008. Azole antimycotics differentially affect rifampicin-induced pregnane X receptor-mediated CYP3A4 gene expression. Drug Metab. Dispos. 36 (2), 339–348. Takeshita, A., Taguchi, M., Koibuchi, N., Ozawa, Y., 2002. Putative role of the orphan nuclear receptor SXR (steroid and xenobiotic receptor) in the mechanism of CYP3A4 inhibition by xenobiotics. J. Biol. Chem. 277 (36), 32453–32458. Vrzal, R., Stejskalova, L., Monostory, K., Maurel, P., Bachleda, P., Pavek, P., Dvorak, Z., 2009. Dexamethasone controls aryl hydrocarbon receptor (AhR)-mediated CYP1A1 and CYP1A2 expression and activity in primary cultures of human hepatocytes. Chem. Biol. Interact. 179 (2–3), 288–296. Vrzal, R., Zdarilova, A., Ulrichova, J., Blaha, L., Giesy, J.P., Dvorak, Z., 2005. Activation of the aryl hydrocarbon receptor by berberine in HepG2 and H4IIE cells: biphasic effect on CYP1A1. Biochem. Pharmacol. 70 (6), 925–936. Wada, T., Gao, J., Xie, W., 2009. PXR and CAR in energy metabolism. Trends Endocrinol. Metab. 20 (6), 273–279.
