UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI. Přírodovědecká fakulta Katedra Biochemie

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Přírodovědecká fakulta Katedra Biochemie

Imobilizace proteinů na magnetické nanočástice a jejich praktické použití

DISERTAČNÍ PRÁCE Autor:

Mgr. Michaela Pečová

Studijní program:

P1416 Biochemie

Studijní obor:

Biochemie

Forma studia:

Prezenční

Vedoucí práce:

prof. Mgr. Marek Šebela, Dr.

Termín odevzdání práce: 19.2.2013

Prohlašuji, že jsem předloženou disertační práci vypracovala samostatně za použití citované literatury. V Olomouci dne 19.2.2013 …………….

Poděkování Chtěla bych srdečně poděkovat svému školiteli prof. Mgr. Marku Šebelovi, Dr. za odborné vedení, za cenné rady a konzultace, které mi poskytl při řešení a vypracování předložené disertační práce. Děkuji také konzultantům prof. RNDr. Radku Zbořilovi, Ph.D. a doc. RNDr. Ludmile Zajoncové, Ph.D. za odborné diskuse k danému tématu. Dále děkuji za obětavou spolupráci Regionálnímu centru pokročilých technologií a materiálů PřF, UP v Olomouci. Konkrétně děkuji Mgr. Kateřině Polákové, Ph.D., Mgr. Jiřímu Tučkovi, Ph.D., Mgr. Zdence Markové, Mgr. Kateřině Holé, Mgr. Janu Čudovi za odbornou pomoc při řešení daného tématu. Za spolupráci na zahraniční studijní stáži bych chtěla poděkovat prof. Fabio Vianellovi z Univerzity v Padove.

-2-

Bibliografická identifikace: Jméno a příjmení autora


Název práce

Imobilizace proteinů na magnetické nanočástice a jejich praktické využití

Typ práce

disertační

Pracoviště

Katedra biochemie PřF UP

Vedoucí práce


Rok obhajoby práce

2013

Abstrakt Předložená disertační práce je zaměřena na imobilizaci proteinů na magnetické nanočastice a jejich praktické využití. První část teorie se zabývá vlastnostmi magnetických nanočástic oxidů železa, jejich přípravou, modifikací povrchu nanočástic a jejich strukturní, magnetickou, morfologickou a velikostní charakterizací. V další části teorie jsou popsány typy imobilizačních technik, chemické modifikace trypsinu a bioaplikace nanočástic oxidů železa zahrnující imobilizace proteinů, především trypsinu (EC 3.4.21.4), a jeho využití pro MALDI-TOF peptidové mapování. Z dalších aplikací je uvedeno

využití

nanočástic

pro

konstrukci

amperometrického

biosensoru

a

nanomedicínské obory patřící mezi in vivo aplikace. Druhá část práce se zabývá charakterizací enzymu sulfitoxidasy (EC 1.8.3.1) a jejím využitím pro stanovení siřičitanů v potravinářském průmyslu pomocí amperometrického biosensoru. Experimentální část je zaměřena na chemickou modifikaci hovězího trypsinu pomocí cyklodextrinů nebo biotinylačního činidla. Hodnota molekulové hmotnosti trypsinových

konjugátů

byla

zhodnocena

pomocí

SDS-PAGE

a

MALDI-TOF

hmotnostní spektrometrie. Trypsin a jeho konjugáty byly kovalentně imobilizovány na povrch různých typů nanočástic magnetitu. Magnetometrická měření nanometrických materiálů

byla

provedena

pomocí

supravodivého

kvantového

interferenčního

magnetometru (SQUID). Velikost nanočástic, morfologické a povrchové vlastnosti byly zhodnoceny pomocí technik elektronové mikroskopie. Volná a imobilizovaná forma trypsinu byla podrobena měření teplotní stability, pH optima, operační stability a stability při skladování. Byla rovněž stanovena vazebná kapacita funkcionalizovaných částic pro trypsin. Termostabilní imobilizované konjugáty trypsinu byly aplikovány pro rychlé a účinné štěpení proteinů v roztoku. Nanočástice biogenního magnetitu s imobilizovanou aminoxidasou a peroxidasou byly zvoleny pro konstrukci enzymové elektrody pro stanovení aminů. Dále byla z kuřecích jater izolována sulfitoxidasa. Hlavními kroky izolace byla příprava acetonového prášku a jeho extrakce, srážení

-3-

síranem amonným, denaturace zahříváním a dialýza. Následovalo přečištění pomocí iontově výměnné chromatografie (Macro-Prep High Q, Resource Q), gelové permeační chromatografie (Superdex HR 10/30) a adsorpční chromatografie (Bio-Scale CHT5-I keramický hydroxyapatit). Sulfitoxidasa (stejně jako ostatní proteiny izolované v této práci) byla analyzována pomocí SDS-PAGE a potvrzena pomocí MALDI-TOF peptidového mapování. Výsledný enzym byl kovalentně imobilizován na povrch zlaté elektrody a vyzkoušen pro potenciální stanovení siřičitanů v biologických vzorcích pomocí amperometrického biosensoru. Klíčová slova

bioelektroda, imobilizace a modifikace proteinů, magnetotaktické bakterie, magnetické mikro- a nanočástice, peptidové mapování, proteomika, trypsin, stabilita enzymů; purifikace proteinů, siřičitany, sulfitoxidasa

Počet stran

207

Počet příloh

5

Jazyk

Český

-4-

Bibliographical identification: Autor’s first name and surname


Title

Immobilization of proteins on magnetic nanoparticles and their practical applications

Type of thesis

Ph.D.

Department

Department of Biochemistry, Faculty of Science

Supervisor


The year of presentation

2013

Abstract This Ph.D. thesis is focused on the immobilization of proteins on magnetic nanoparticles and their practical applications. In the beginning of a theoretical introduction, there are properties of nanoparticles of iron oxides described together with their preparation, surface modification and structural, magnetic, morphological and size characterization. Furthermore, immobilization techniques, chemical modification of trypsin and bioapplications of nanoparticles of iron oxides including immobilization of proteins, especially trypsin (EC 3.4.21.4), and their applications for MALDI-TOF peptide mass fingerprinting are mentioned. The usability of nanoparticles for the construction of an amperometric biosensor and in vivo applications within nanomedicine fields are described. The second part of the thesis deals with characterization of enzyme sulfite oxidase (EC 1.8.3.1) and its utilization for the determination of sulfite in food industry by means of an amperometric biosensor. The experimental part of the thesis is focused on chemical modification of bovine trypsin using cyclodextrins or a biotinylating agent. Molecular mass values of the resulting trypsin conjugates were evaluated by SDS-PAGE and MALDI-TOF MS. Both trypsin and its conjugates were covalently immobilized on the surface of different types of magnetite nanoparticles. Magnetometric measurements of the nanometric materials were performed by SQUID. Particle size, morphological and surface properties were evaluated using techniques of electron microscopy. All free and immobilized forms of trypsin were characterized by measurements of thermostability, pH optimum, operational and storage stability. Moreover, the binding capacity for trypsin of the functionalized magnetic particles was determined. The thermostable immobilized conjugates of trypsin were applied for a rapid and efficient in-solution digestion of proteins. Biogenic magnetite nanoparticles with attached amine oxidase and peroxidase were chosen for the construction of a carbon-paste electrode. In addition, a sulfite oxidase was isolated from chicken liver. The procedure of isolation

-5-

involved acetone powder preparation and its extraction, ammonium sulfate precipitation, heat denaturation and dialysis. This was followed by ion-exchange chromatography (Macro-Prep High Q, Resource Q), gel permeation chromatography (Superdex HR 10/30) and adsorption chromatography (Bio-Scale CHT5-I ceramic hydroxyapatite). The obtained sulfite oxidase (as well as other proteins isolated in this study) was analyzed by SDS-PAGE and confirmed by MALDI-TOF peptide mass fingerprinting. The resulting enzyme was immobilized on the surface of a gold electrode and tested for possible determination of sulfite in biological samples using an amperometric biosensor. Keywords

bioelectrode, immobilization and modification of proteins, magnetotactic bacteria, magnetic microand nanoparticles, peptide mass fingerprinting, proteomics, trypsin, stability of enzymes; protein purification, sulfite, sulfite oxidase

Number of pages

207

Number of appendices

5

Language

Czech

-6-

OBSAH Cíle práce

10

ČÁST I – Imobilizace proteinů na magnetické nanočástice a jejich praktické využití

11

1. Úvod

12

2. Teoretická část

14

2.1. Magnetické nanočástice oxidů železa – magnetit, maghemit

14

2.2. Příprava magnetických mikro- a nanočástic oxidů železa

16

2.2.1. Metody syntézy magnetických částic oxidů železa

16

2.2.2. Izolace magnetosomů z magnetotaktických bakterií

18

2.3. Povrchová modifikace magnetických nanočástic

20

2.4. Charakterizace magnetických nanočástic oxidů železa

21

2.5. Imobilizace proteinů na magnetické nosiče

23

2.5.1. Typy imobilizačních technik

24

2.6. Biologické aplikace magnetických nanočástic oxidů železa

28

2.6.1. Proteiny imobilizované na magnetických nosičích

29

2.6.2. Proteomika – imobilizace proteolytických enzymů

30

2.6.2.1. Hovězí trypsin – pojem, vlastnosti a výskyt

31

2.6.2.2. Chemické modifikace proteolytických enzymů

32

2.6.2.3. Využití imobilizovaného trypsinu pro MALDI-TOF peptidové mapování

35

2.6.3. Imobilizace mikrobiálních buněk jako celobuněčných biokatalyzátorů

38

2.6.4. Využití magnetických nanočástic pro konstrukci amperometrického

39

biosensoru 2.6.5. Nano-medicínské obory

42

2.6.5.1. Kontrastní látky pro MRI

42

2.6.5.2. Magnetické nosiče léčiv

43

2.6.5.3. Metoda magnetické hyperthermie

44

3. Materiál a metody

45

3.1. Materiál

45

3.2. Příprava a modifikace magnetických mikro- a nanočástic oxidů železa

45

3.2.1. Příprava biogenního magnetitu modifikovaného chitosanem

45

3.2.2. Příprava syntetických nanočástic magnetitu modifikovaných chitosanem

46

3.2.3. Příprava silanizovaných syntetických nanočástic magnetitu

47

3.2.4. Enkapsulace nanočástic magnetitu do prostředí celulosy

47

3.3. Chemické modifikace hovězího trypsinu

48

-7-

3.3.1. Glykace trypsinu prostřednictvím cyklodextrinů

48

3.3.2. Biotinylace trypsinu s využitím aminoskupin

48

3.4. SDS-PAGE

49

3.5. Stanovení molekulové hmotnosti proteinů pomocí MALDI-TOF MS

50

3.6. Imobilizace trypsinu na magnetické nosiče

50

3.6.1. Glutaraldehydová metoda

50

3.6.2. Karbodiimodová metoda

51

3.6.3. Epoxidová metoda

51

3.6.4. Jodistanová metoda

52

3.6.5. Bioafinitní interakce

53

3.7. Charakterizace magnetických částic

53

3.7.1. Superconducting QUantum Interference Device – SQUID

53

3.7.2. Transmisní a skenovací elektronová mikroskopie

54

3.8. Stanovení aktivity, vazebné kapacity částic, teplotní stability a hodnoty pH optima trypsinu

56

3.9. Stanovení operační a funkční stability trypsinu a stability při skladování

57

3.10. MALDI-TOF peptidové mapování („peptide mass fingerprinting“, PMF)

58

3.11. Příprava bioelektrod s využitím nanočástic magnetitu

59

3.11.1 Cyklická voltametrie a chronoamperometrie

61

4. Výsledky a diskuse

62

4.1. Stanovení molekulové hmotnosti modifikovaného trypsinu

62

4.2. Charakterizace magnetických částic

64

4.2.1. SQUID

64

4.2.2. TEM a SEM

68

4.3. Specifická aktivita, vazebná kapacita částic, teplotní stabilita a pH optimum trypsinu

76

4.4. Stanovení operační a funkční stability trypsinu a stability při skladování

81

4.5. MALDI-TOF peptidové mapování

87

4.6. Příprava bioelekrody s obsahem nanočástic magnetitu

92

4.6.1. Cyklická voltametrie a chronoamperometrie

92

4.6.2. Stanovení kinetických parametrů oxidoreduktas

97

4.6.3. TEM analýza imobilizovaných oxidoreduktas

99

5. Závěr

100

6. Použitá literatura

102

ČÁST II – Izolace sulfitoxidasy z kuřecích jater

113

7. Úvod

114

7.1. Charakterizace enzymu sulfitoxidasy

115

-8-

7.2. Siřičitany – význam jejich stanovení

116

8. Materiál a metody

119

8.1. Materiál

119

8.2. Izolace sulfitoxidasy z kuřecích jater

119

8.3. Chromatografická purifikace kuřecí sulfitoxidasy

119

8.4. Stanovení aktivity sulfitoxidasy, SDS-PAGE

119

8.5. MALDI-TOF peptidové mapování

121

8.6. Imobilizace kuřecí sulfitoxidasy na povrch zlaté elektrody

121

9. Výsledky a diskuse

122

9.1. Extrakce sulfitoxidasy z kuřecích jater

122

9.2. Chromatografická purifikace sulfitoxidasy z kuřecích jater

122

9.3. Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF peptidového mapování

124

9.4. Imobilizace kuřecí sulfitoxidasy na povrch zlaté elektrody

126

10. Závěr

131

11. Použitá literatura

132

12. Seznam použitých zkratek

134

13. Životopis

136

14. Přílohy

139

14.1. Superparamagnetic maghemite nanoparticles from solid-state synthesis – Their functionalization towards peroral MRI contrast agent and magnetic carrier for trypsin immobilization 14.2. Biologicky aktivní látky imobilizované na magnetických nosičích a jejich využití v biochemii a biotechnologiích 14.3. Thermostable Trypsin Conjugates Immobilized to Biogenic Magnetite Show a High Operational Stability and Remarkable Reusability for Protein Digestion 14.4 Surface engineering of iron oxide nanoparticles isolated from Magnetospirillum gryphiswaldense for biochemical and biomedical applications 14.5. Purification of chicken liver sulfite oxidase: a study on performance of conventional chromatography

-9-

Cíle práce



vypracovat literární rešerši o magnetických mikro- a nanočásticích oxidů železa, metody přípravy magnetitových a maghemitových nanočástic, jejich funkcionalizace

povrchu,

charakterizace

a

bioaplikace;

přehled

imobilizačních technik, využití imobilizovaného trypsinu v proteomice a aplikace nanočástic magnetitu pro konstrukci bioelektrod amperometrického biosensoru; charakterizace enzymu sulfitoxidasy a význam monitorování siřičitanů v potravinářském průmyslu



provést

chemickou

modifikaci

hovězího

trypsinu

prostřednictvím

cyklodextrinů nebo biotinylačních činidel. Porovnání trypsinových konjugátů s nativní formou enzymu



kovalentně imobilizovat trypsin a jeho konjugáty na bakteriální a syntetické nanočástice magnetitu s různými typy funkcionalizující vrstvy. Provést charakterizaci

nanočástic

magnetizačního

měření

s

(SQUID),

imobilizovanými pomocí

proteiny

transmisní

a

pomocí skenovací

elektronové mikroskopie oproti nanočásticím bez přítomnosti proteinu; charakterizace imobilizovaného trypsinu a jeho konjugátů v porovnání s volnou formou enzymu (teplotní stabilita, pH optimum, stabilita při skladování)



aplikovat modifikovaný trypsin imobilizovaný na biogenním magnetitu pro MALDI-TOF peptidové mapování



připravit bioelektrody pro amperometrický biosensor na bázi modifikované uhlíkové pasty s obsahem magnetitu s imobilizovanými oxidoreduktasami; její potenciální využití pro stanovení biogenních aminů v potravinářském průmyslu



purifikovat sulfitoxidasu z kuřecích jater a její kovalentní imobilizace na zlatou elektrodu pro stanovení siřičitanů v biologických vzorcích

- 10 -

ČÁST I IMOBILIZACE PROTEINŮ NA MAGNETICKÉ NANOČÁSTICE A JEJICH PRAKTICKÉ VYUŽITÍ

- 11 -

1. Úvod Nanotechnologie a nanomateriály představují v dnešní době nové možnosti rozvoje v řadě oborů lidské činnosti. Nanotechnologiemi se rozumí aplikace vědeckého poznání vedoucí k syntéze, manipulaci a použití materiálů v rozmezí 1 – 100 nm, které vykazují nové unikátní vlastnosti, takové, které se u objemových protějšků těchto nanomateriálů nevyskytují (Filipová et al., 2012). Jde o nové moderní technologie, které se rozšířily po celém světě a nachází využití téměř ve všech vědeckých i průmyslových oborech (Invernizzi, 2011). Ukazuje se, že tyto nadstandardní technologie a materiály přinesou převrat také v biomedicíně jako magnetické nosiče cytostatik či jako kontrastní látky, v informačních technologiích, při čištění pitných a podzemních vod s využitím nanofiltrů, ale i v potravinářském průmyslu jako nové obalové materiály. Během posledních let se rozšiřují nanotechnologie z laboratoří do průmyslu a konkrétních aplikací. Často používanými magnetickými materiály se staly nanočástice oxidů železa, které představují vysoce atraktivní nanomateriály nejen v průmyslu, ale především v biomedicíně a to pro své výhodné magnetické, elektrické, katalytické a netoxické vlastnosti. V případě nanočástic oxidů železa se využívá oxid železnato-železitý (Fe3O4 zvaný magnetit) a oxid železitý (-Fe2O3 zvaný maghemit) (Pankhurst et al., 2003). Jednou ze specifických výhod těchto nanomateriálů je možnost jejich cílené manipulace prostřednictvím vnějšího magnetického pole. Důležitými posuzovanými parametry nanočástic jsou biokompatibilita, biodegradabilita, netoxičnost, chemická stabilita, velká plocha povrchu a rozměr částic (Marková et al., 2012). Z důvodu zlepšení biokompatibility a pro omezení mezičásticových interakcí je povrch nanočástic oxidů železa chemicky modifikován (Ansari & Husain, 2012; Selim et al., 2007). Jako materiály pro úpravu povrchu nanočástic lze aplikovat chitosan a jeho deriváty (Kalkan et al., 2012), polyethylenglykol, dextran, celulosu nebo agarosu. Cílem obalových materiálů je také zavedení vhodných funkčních skupin na povrch nanočástic (funkcionalizace) pro následnou imobilizaci biosubstancí (Hong et al., 2007). Z aplikací in vivo se nabízí využití nanočástic jako kontrastních látek při magnetické rezonanci MRI (angl. „Magnetic Resonance Imaging“), nosičů kancerostatik, léčba tumorů a magnetická hyperthermie (Ma et al., 2003). Nanočástice oxidů železa lze připravit syntetickými metodami, jsou však i komerčně dostupné. Nanometrické oxidy železa vytváří tzv. procesem biomineralizace také řada mikroorganismů, ze kterých se dané nanočástice izolují a upravují pro příslušné bioaplikace (Faivre & Schüler, 2008). Vhodně povrchově modifikované nanočástice lze využít pro imobilizaci různých enzymů. V proteomickém výzkumu nabývá významu imobilizace proteasy trypsinu (EC

- 12 -

3.4.21.4). Z důvodu nízké teplotní stability trypsinu a nežádoucí autolýzy se provádí jeho chemická modifikace a následná imobilizace na pevné nosiče (Sun et al., 2012; Šebela et al., 2006). Z dalších tříd enzymů lze imobilizovat např. oxidoreduktasy využitelné

při

konstrukci

enzymových

elektrod

(Gasparini et al., 1994; Sinigaglia et al., 2012).

- 13 -

amperometrických

biosensorů

2. Teoretická část 2.1. Magnetické nanočástice oxidů železa – magnetit, maghemit Magnetické nanočástice oxidů železa jsou středem velkého zájmu pro své potenciální použití v biologických disciplínách, lékařství, v oblastech biotechnologií, v environmentálních technologiích a analytických aplikacích. V přírodě nacházíme oxidy železa v různých strukturních formách. Oxidy železa se staly součástí řady minerálů a archeologických nálezů. K přípravě nosičů lze zvolit nejrůznější materiály, nejčastěji oxidy železa – -Fe2O3, Fe3O4, čisté kovy (Fe, Co, Ni) a jejich slitiny (Suh et al., 2006) nebo ferity. Magnetické nanočástice oxidů železa (obr. 1) vykazují velikost v rozmezí 1 – 100 nm, které vykazují velký povrch a tím větší vazebnou kapacitu pro navázání různých biosubstancí. V současné době se nanočástice oxidů železa stávají žádaným materiálem v oboru nanotechnologií. Nejznámějším a často používaným magnetickým oxidem železa je černý ferimagnetický minerál – magnetit (Fe3O4) obsahující ionty Fe2+ i Fe3+. Tento nerost byl prokázán také v meteoritech pocházejících z Marsu. Magnetit se vyskytuje u mikroorganismů, ale i u eukaryot, jako jsou ryby, plazi, ptáci a savci, kde napomáhá k orientaci podle směru magnetického pole Země. Zajímavostí je, že magnetit byl nalezen i v mozku člověka (Kirschvink et al., 1992). První biomineralizovaný magnetit, který sloužil jako radula zubů chitonů byl objeven v roce 1962 H. A. Lowenstamem u mořského plže třídy Polyplacophora (chroustnatky), kde typickým zástupcem je Chiton olivaceus (Wal et al., 2000). Hojně se také využívá syntetický maghemit (-Fe2O3), představující jeden ze čtyř strukturních polymorfů oxidu železnatého (kromě -Fe2O3 hematit, -Fe2O3, a - Fe2O3), které ovšem nevykazují žádoucí magnetické vlastnosti (Tuček et al., 2006). Maghemit představuje kvůli své spinelové struktuře se dvěma podmřížkami typického představitele ferimagnetických látek, které udílejí velkou susceptibilitu vzorkům, v nichž jsou obsaženy, tudíž se maghemit stal důležitým magnetickým materiálem v medicíně a v průmyslu. Maghemit je teplotně nestabilní a v rozmezí teplot 600 – 1300 K se transformuje na hematit. Pro některé bioaplikace lze zvolit speciální magnetické kapaliny tzv. ferrofluidy, což je koloidální suspenze jemných magnetických nanočástic (magnetit, maghemit) ve vhodné nemagnetické kapalině (Šafaříková & Šafařík, 1995). Ferrofluidy bývají označovány jako tekuté magnety. Hlavní výhodou magnetických nanomateriálů je možnost cílené manipulace působením vnějšího magnetického pole, (obr. 2) (Safarik & Safarikova, 2009). V praxi se používají různé typy magnetických separátorů (obr. 3).

- 14 -

A)

B)

Obr. 1. A) Snímek ze skenovací elektronové mikroskopie (SEM) magnetických nanočástic Fe3O4; B) Snímek z transmisní elektronové mikroskopie (TEM) magnetických nanočástic -Fe2O3 (Li et al., 2010; Kluchová et al., 2009).

Obr. 2. Zobrazení magnetické separace bakteriálních nanočástic cíleným působením vnějšího magnetického pole.

Obr. 3. Různé typy magnetických separátorů používaných pro laboratorní účely.

- 15 -

2.2. Příprava magnetických mikro- a nanočástic oxidů železa V současné době je k dispozici celá řada syntetických metod pro přípravu magnetických mikro- a nanočástic oxidů železa, které mohou být potenciálně využívány v medicíně, biologických vědách a biotechnologiích. Metody syntézy jsou zaměřeny na přípravu práškových materiálů, které obsahují mikro- nebo nanočástice magnetitu, maghemitu, směsných oxidů železa nebo feritů. Často se připravují i magnetické kapaliny tzv. ferrofluidy a provádí se syntéza magnetických částic přímo v prostředí polymerního materiálu, který stabilizuje, disperguje a vhodně modifikuje povrch částic pro další bioaplikace (Laurent et al., 2008). Magnetické mikro- a nanočástice oxidů železa nabízí i celá řada komerčních firem. Zajímavou možností přípravy vysoce čistého magnetitu o uniformní velikosti je izolace magnetosomů z magnetotaktických bakterií.

2.2.1. Metody syntézy magnetických částic oxidů železa Ze syntetických metod přípravy částic oxidů železa pro bioaplikace se často využívají chemické reakce zahrnující termické rozklady prekurzorů obsahujících železo, sol-gel reakce, srážecí reakce solí železa, sonochemické syntézy, aerosolové, elektrochemické a mikroemulzní techniky a laserová pyrolýza aj. (Laurent et al., 2008). Jednou z nejvíce používaných metod syntézy částic magnetitu nebo maghemitu ve velkém množství je jednoduchá a účinná metoda tzv. koprecipitace (spolusrážení), kdy dochází k reakci železnatých a železitých iontů v bazickém prostředí. Pro kompletní precipitaci je požadováno pH v rozmezí hodnot 8 – 14, stechiometrický poměr 2:1 (Fe3+/Fe2+) a nepřítomnost vzdušného kyslíku. Tyto uvedené podmínky jsou vyžadovány z toho důvodu, že magnetit je nestabilní a citlivý k oxidaci. V přítomnosti kyslíku je magnetit transformován na maghemit (Thanh, 2011). Chemickou reakci přípravy Fe3O4 ukazuje obr. 4. Z reakčních podmínek je důležitá hodnota pH, teplota, iontová síla, typ použité soli a poměr koncentrací železnatých a železitých iontů. Na těchto faktorech závisí tvar a velikost vzniklých oxidů železa. Hlavní výhodou koprecipitačního procesu je zisk částic ve velkém množství. Koprecipitační metody poskytují většinou částice rozdílné velikosti. Monodisperzity částic lze docílit přídavkem chelatujících organických aniontů (kyseliny olejová, glukonová nebo citronová) anebo polymerů jako je dextran, karboxydextran a polyvinylalkohol. První kontrolovaná příprava superparamagnetických částic oxidu železa s použitím FeCl3 a FeCl2 v alkalickém prostředí byla provedena Massartem (Massart, 1981). Při Massartově procesu přípravy vodných magnetických kapalin se částice stabilizují přítomností kyseliny chloristé nebo hydroxidu tetramethylamonia.

- 16 -

Další hojně využívanou možností může být mikroemulzní technika, při které termodynamicky stálá disperze dvou nemísitelných fází vyrobí micely obklopující magnetické částice. Vhodnou úpravou velikosti nitra micely obsahující vodnou fázi může být řízena velikost vzniklých částic. Při provedení sol-gel reakce se prekurzor podrobí sadě hydrolytických a polymeračních reakcí, vzniklá koloidní suspenze se převádí na viskózní gel a pak na pevný materiál (Xu et al., 2009). Magnetické mikro- a nanočástice s vhodně modifikovaným povrchem jsou i komerčně dostupné, ovšem pro denní výzkumné účely jsou poměrně finančně náročné. Mezi hlavní firmy, které vyrábí magnetické nosiče patří Advanced Magnetics (USA) a Miltenyi Biotec (Německo). Nanočástice magnetitu nabízí firma Sigma-Aldrich (Německo), lze zakoupit i modifikované magnetické mikročástice s amino- nebo karboxyskupinou, ale i mikročástice funkcionalizované biotinem nebo streptavidinem. Českým výrobcem magnetických nosičů (obr. 5) modifikovaných např. celulosou je firma Iontosorb – Bead Cellulose Derivates (www.iontosorb.cz).

Fe2+ + 2 Fe3+ + 8 OH4 Fe3O4 + O2

Fe3O4 + 4 H2O 6 Fe2O3

Obr. 4. Schéma přípravy magnetitu koprecipitací železnatých a železitých iontů v bazickém prostředí. Transformace magnetitu na maghemit v přítomnosti kyslíku (Thanh et al., 2011).

Obr. 5. SEM snímek makroporezních magnetických mikročástic modifikovaných celulosou (http://www.iontosorb.cz/; http://www.rcptm.com/).

- 17 -

2.2.2.

Izolace magnetosomů z magnetotaktických bakterií Zajímavou metodou přípravy unikátních magnetických nanočástic uniformní

velikosti (50 – 100 nm) je produkce tzv. magnetosomů (částice magnetitu obalené fosfolipidovou membránou) magnetotaktickými bakteriemi (MTB). MTB byly poprvé izolovány v roce 1975 z rybniční vody R. Blakemorem. Magnetosomy bakterie tvoří pomocí biomineralizace, což je proces, při kterém organismy produkují biogenní minerály, které se stávají součástí jejich organismu. Biogenní magnetit je významný hlavně pro budoucí potenciální aplikace v lékařství i jiných oborech, proto se jeho produkcí zabývá několik výzkumných týmů. Podle typu prostředí, ve kterém se mikroorganismy nachází, tvoří uvnitř buňky magnetit (Fe3O4) nebo greigit (Fe3S4). Magnetit se vyskytuje u bakterií, které žijí aerobně, krystalky greigitu nebo pyritu u mikroorganismů, které žijí v sulfidické a anaerobní zóně. MTB tvoří různé morfologické typy zahrnující vibria, koky, spirály a tyčky (Schüler  Frankel, 1999). Různé druhy MTB produkují rozdílné tvary, velikost a uspořádání magnetosomů. Na druhu a kmenu dané bakterie a na typu přírodních a růstových podmínkách závisí výsledný tvar, velikost a složení magnetických krystalů. MTB patří mezi gramnegativní prokaryota a nachází se v mnoha prostředích po celém světě. MTB mohou být sladkovodní i mořské a pohybují se podél geomagnetického pole Země. Magnetosomy tvoří mechanismus, který pomáhá k orientaci bakterií tzv. magnetotaxi, když bakterie je vytržena z místa s optimálními a životně důležitými podmínkami. S využitím „magnetitového kompasu“ bakterie hledá nejvhodnější prostředí k životu (Schüler, 1999). Magnetosomy uvnitř bakterie mohou být rozptýlené anebo uspořádané v řetízku. Kultivovatelné MTB patří do rodu Magnetospirillum. Mezi nejznámější kultivovatelné kmeny řadíme M. gryphiswaldense MSR-1 (obr. 6), M. magnetotacticum MS-1 a M. magnetotacticum AMB-1 (Schleifer et al., 1991; Matsunaga et al., 1991). Magnetosomální membrána je složena z fosfolipidů. Z anorganického pohledu obsahuje prvky uhlík, fosfor a vápník, z organických látek jsou nejdůležitější transmembránové proteiny. Zajímavými proteiny membrány, které nebyly nalezeny v buněčných orgánech jiných mikroorganismů je Mag A, Mam a Msm (Jogler & Schüler, 2007). Magnetosomální membrána je znázorněna na obr. 7. Magnetosomy se získávají v laboratorních podmínkách kultivací vhodných kmenů MTB a následnou izolací, nebo lze využít možnosti genového inženýrství. Závěrem lze říci, že tvorba specifických magnetických nanokrystalů je ohromujícím příkladem, jak jednoduchý mikroorganismus tvoří anorganické struktury na základě informací kódovaných v genomu. Nanokrystaly magnetitu se nachází i u vyšších organismů včetně člověka.

- 18 -

0,5 m

Obr. 6. Snímek bakterie Magnetospirillum gryphiswaldense, která obsahuje magnetosomy seskupené do řetízku (Schüler  Frankel, 1999).

25 nm

Obr. 7. Magnetosomy vyizolované z Magnetospirillum gryphiswaldense. Krystalky magnetitu mají v průměru 42 nm. Šipka označuje magnetosomální membránu, kterou je biogenní magnetit obklopen (Schüler  Frankel, 1999).

- 19 -

2.3. Povrchová modifikace magnetických nanočástic Magnetické nanočástice oxidů železa vykazují reaktivní a poměrně velkou plochu povrchu (řádově 100 m2.g-1). Aby nedocházelo k nežádoucím povrchovým jevům, provádí se chemická modifikace povrchu nanočástic, která navíc umožnuje zvýšit jejich využitelnost v řadě aplikací. Velký povrch částic je vhodný pro navázání biologicky významných látek. Obecně platí, čím je magnetická nanočástice menší, tím vyšší vykazuje vazebnou kapacitu pro navázání biokomponent. Pro imobilizaci biologicky významných látek na povrch magnetických částic je nutné jejich povrch chemicky modifikovat určitými chemickými komponentami, které umožní vytvořit vazbu pro navázání specifických biomolekul a zároveň se povrch modifikuje pro aplikace in vivo. Povrch částic se obaluje nejčastěji organickými látkami, jedná se o tzv. funkcionalizující obal (obr. 8; Tuček et al., 2006). Jako povrchové materiály se používají přírodní a syntetické polymery, organické a anorganické materiály nebo některé vitaminy (biotin). Především pro biomedicínské aplikace musí používané povrchové materiály splňovat řadu důležitých kriterií. Při in vivo aplikaci musí být zajištěna biokompatibilita, biodegradabilita a netoxičnost funkcionalizujícího obalu. Povrchová modifikace dále zabraňuje mezičásticové interakci a chrání magnetické jádro před chemickou transformací. Příkladem může být agregace nemodifikovaných nanočástic a adsorpce proteinů plazmy v krevním řečišti. Takové nanočástice jsou okamžitě eliminovány makrofágy, ještě dříve, než se dostanou k cílové buňce. Z tohoto důvodu se částice pro lékařské aplikace často modifikují polyethylenglykolem (PEG) (Zhang et al., 2002). V chemických oborech a biotechnologiích je chemická modifikace povrchu částic požadována pro imobilizaci biomolekul z důvodu obsahu příslušných funkčních (aktivních) skupin. Po povrchové modifikaci jsou magnetické vlastnosti ovlivněny nejen vlastnostmi magnetického jádra, ale i vlastnostmi diamagnetického funkcionalizujícího obalu (Lemarchand et al., 2004). Jako povrchové materiály se často používají přírodní látky zahrnující chitin, chitosan a jeho deriváty, dextran, alginát, celulosu, agarosu, škrob, želatinu aj. Častým obalujícím materiálem je biopolymer chitosan (Kalkan et al., 2012), což je deacetylovaná forma chitinu. Chitosan se vyznačuje výbornými biologickými, chemickými a fyzikálními vlastnostmi a jeho reaktivní amino- a hydroxyskupiny jsou využitelné pro imobilizaci biokomponent (Verheul et al., 2009). Ze skupiny syntetických sloučenin se pro povrchovou modifikaci používají PEG, polyvinylalkohol, polyethylenimin a polyvinylpyrrolidon. Zajímavou technikou je silanizace povrchu magnetických částic s využitím silanizačních činidel jako je -aminopropyltriethoxysilan (APTES), glycidoxypropyltriethoxysilan, 3-(2-

- 20 -

imidazolin-1-yl)propyltriethoxysilan (IMEO) a tetraethyl orthosilikát (TEOS) (Can et al., 2009; Ma et al., 2003; Oztürk et al., 2007). B B

B

Magnetická částice

Funkcionalizující obal

MPs

B

F

B

B

B

Biomolekula

B

Obr. 8. Povrchová modifikace magnetické částice maghemitu nebo magnetitu pro následnou imobilizaci biomolekul (upraveno podle Tuček et al., 2006). (MPs – magnetická částice oxidu železa; F – funkcionalizující obal; B – biomolekula).

2.4. Charakterizace magnetických nanočástic oxidů železa Pro charakterizaci fyzikálních a chemických vlastností připravených nanočástic se používá řada experimentálních technik. Velikostní a strukturní vlastnosti jsou analyzovány metodami jako je rentgenová difrakce XRD (angl. „X-RAY Diffraction“), skenovací a transmisní elektronová mikroskopie SEM (angl. „Scanning Electron Microscopy“)

a

TEM

(angl.

„Transmission

Electron

Microscopy”).

Studium

magnetických a povrchových vlastností umožňují metody SQUID, Mössbauerova spektroskopie či analýza specifického povrchu BET (angl. „Brunauer Emmet Teller“). Specifická charakterizace globálních magnetických vlastností nanočástic se provádí s použitím magnetometrů, jedná se o tzv. magnetizační měření. Moderní metodou je měření na magnetometru zvaném SQUID (angl. „Superconducting QUantum

Interference

Device“)

založeném

na

supravodivém

kvantovém

interferenčním jevu. Magnetické vlastnosti systému nanometrických částic jsou určeny zejména povrchovými jevy a jevy spojenými s konečným rozměrem částic (Tuček et al., 2006). Konečné magnetické chování je ovlivněno mezičásticovými interakcemi, pórovitostí, defekty a uspořádáním vakancí ve struktuře částic. Pokud jsou popsané jevy přítomny, dochází ke snížení saturační magnetizace. Pro studium povrchu magnetických částic modifikovaných diamagnetickou slupkou se určuje parametr magnetizačního měření citlivý na změnu mezičásticové interakce dipól-dipólové povahy a výměnného typu. Pokud je povrch částic modifikován, dochází ke změně

- 21 -

výsledného chování částic, které je především spojeno se změnou mezičásticových interakcí. Změny v magnetickém chování daného materiálu se projevují u hysterezní smyčky, dochází ke změně maximální magnetizace a průběhu smyčky. Určuje se hodnota saturační magnetizace (MS), což je fyzikální veličina a definuje maximální hodnotu magnetizace dosažitelnou pro určitý materiál. V případě, že je funkcionalizující vrstva tvořena nemagnetickým materiálem, lze nepřímo stanovit ze změny maximální magnetizace přibližně procentuální zastoupení nemodifikované částice v hmotnostní jednotce daného modifikovaného systému (Belessi et al., 2008). Zajímavou technikou je měření teplotních závislostí magnetizace materiálu, tzv. magnetizační křivka chlazená v nulovém magnetickém poli ZFC (angl. „Zero-FieldCooled“) a magnetizační křivka chlazená v magnetickém poli FC (angl. „Field-Cooled“). ZFC a FC křivky jsou citlivé na dynamiku magnetických relaxačních jevů vyskytujících se u magnetických nanočásticových systémů, proto lze jejich vzájemným porovnáním stanovit magnetické chování systému interagujících či neinteragujících povrchově obalených částic. Omezení mezičásticových interakcí v důsledku modifikace částic je pak patrné z odlišného průběhu zejména FC křivky (Dormann et al., 2007). Infračervená spektroskopie (IČ) je jednou z technik pro identifikaci a strukturní charakterizaci organických molekul, ale i pro stanovení anorganických sloučenin. Pomocí IČ je charakterizována vazba mezi částicemi magnetických materiálů a funkcionalizující vrstvou. Informace o procentovém zastoupení obalového materiálu na povrchu částic a tepelnou stabilitu studovaného materiálu může poskytnout termická analýza (TG/DTA). Měření specifického povrchu daného materiálu lze provést metodou BET. Charakteristické techniky prováděné u magnetických nanočástic prezentuje obr. 9.

Obr. 9. Přehled hlavních charakteristických technik pro funkcionalizované magnetické nanočástice (upraveno podle Thanh, 2011).

- 22 -

2.5. Imobilizace proteinů na magnetické nosiče Magnetické mikro- a nanočástice oxidů železa představují vhodný magnetický nosič pro imobilizaci proteinů. Imobilizace biomolekul se provádí celou řadou způsobů jako u nemagnetických nosičů. Mnoho žádaných proteinů (enzymů) se vyznačuje vysokou cenou, proto byly vynalezeny různé techniky imobilizace proteinů na pevné a nerozpustné anorganické nebo organické materiály, aby mohly být použity opakovaně. Imobilizační techniky se využívají nebo jsou známé v různých oborech. Imobilizované proteiny, především enzymy, představují mnoho výhod oproti volným formám. Z ekonomického pohledu je to několikanásobné použití proteinu a jeho regenerace. Po imobilizaci může dojít ke zvýšení enzymové rigidity, teplotní stability, širšího rozmezí hodnot optimální teploty a pH, stability při skladování a ve většině případů dochází ke změnám hodnot kinetických parametrů (Km a V) (Tang et al., 2007). Existuje mnoho technik pro imobilizaci proteinů. Podle typu vazby lze imobilizace rozdělit na fyzikální a chemické. Z fyzikálních postupů se nejčastěji používá přímá adsorpce na povrch nosiče, inkluze do gelů a enkapsulace. Mezi postupy chemické se řadí kovalentní imobilizace na nerozpustné materiály a retikulace enzymů bifunkčmími činidly (Ladero et al., 2000). Hlavní typy imobilizace jsou uvedeny na obr. 10. Z jiného pohledu se mohou imobilizace dělit na reverzibilní, kdy lze biokatalyzátor oddělit od nosiče za daných podmínek a nosič je možné použít opakovaně, nebo irreverzibilní, při kterých nelze enzym oddělit, aby nedocházelo k degradaci enzymu nebo nosiče. V každém případě je důležité zachovat biologickou aktivitu enzymů i po imobilizaci. Často může docházet ke ztrátě části aktivity enzymů, důvodem může být zásah vazby do aktivního místa enzymu a sterické zábrany (Saudagar  Singhal, 2004).

Obr. 10. Přehled hlavních imobilizačních technik; A-kovalentní vazba; B-zachycení v gelu nebo polymeru; C-enkapsulace; D-zesíťování (crosslinking); E-přímá adsorpce; F-bioafinitní vazba (upraveno podle Brena & Batista-Viera, 2006).

- 23 -

2.5.1. Typy imobilizačních technik Mezi nejstarší typy imobilizace patří jednoduchá a cenově výhodná přímá fyzikální adsorpce na nosič, která je ovšem málo spolehlivá a méně stabilní, avšak je možné ji využít pro reverzibilní imobilizaci proteinů (Bayramoglu et al., 2008). Enzymy se navazují na nosiče prostřednictvím van der Waalsových sil nebo hydrofóbních a elektrostatických interakcí. Jinou fyzikální technikou je zachycení proteinů do magnetické

polymerní

gelové

matrice

tvořené

např.

syntetickými

polymery

(polyakrylamid), kolagenními proteiny (želatina) nebo polysacharidy (agar, alginát). Matrice vytváří prostředí podobné fyziologickým podmínkám, je omezena denaturace proteinů a zůstává zachována jejich biologická funkce. Jednou z nevýhod může být uvolnění imobilizovaného proteinu do prostředí z dané matrice. Příkladem této techniky může být vznik alginátových kuliček kapáním suspenze polymer-enzym do prostředí, které obsahuje např. Ca2+ ionty (Safarik et al., 2008). Jinou používanou možností je enkapsulace (zapouzdření) biomolekul do vhodné matrice. Při enkapsulaci se vytváří polymerní matrix chránící biologicky aktivní látky (např. enzymy) proti vnějším oxidačním vlivům. Důležitým kritériem je příprava matrice s vhodnou velikostí pórů, aby substrát

a

produkt

mohly

volně

difundovat.

Zároveň

by

nemělo

docházet

k nežádoucímu uvolnění enzymu do prostředí. V případě použití magnetických částic je vhodné nejprve enzym imobilizovat na pevný povrch a následně provést enkapsulaci do příslušného prostředí. I když je přímá adsorpce proteinu velmi jednoduchá a rychlá, nejčastěji používanou technikou imobilizace stále zůstává spolehlivější a stabilnější vytvoření kovalentní vazby. Tento typ imobilizace vyžaduje přítomnost funkčních skupin nosiče (NH2, -COOH, -OH, -SH, nebo -CONH2). U proteinů se využívají obdobné funkční skupiny (-NH2, -COOH, -SH, -OH nebo cyklus tyrosinu a histidinu). Na základě dostupných povrchových funkčních skupin nosiče se volí vhodná aktivační činidla. Nosiče modifikované –NH2 skupinou se aktivují bifunkčními činidly. Nejčastějším aktivačním činidlem aminoskupin se stal glutaraldehyd (GA). Ten nejprve aktivuje povrchovou aminoskupinu nosiče za vzniku nestabilní Schiffovy báze, poté dochází k reakci s aminoskupinou proteinu (obr. 11). Nezreagované aldehydové skupiny se inaktivují působením ethanolaminu nebo glycinu. Pokud je požadována stabilní vazba, doporučuje se redukce Schiffovy báze působením kyanoborohydridu nebo borohydridu sodného (Skládal, 2002). GA se rovněž používá i k vytvoření příčné vazby (zesíťování; angl. „cross-linking“) biomolekul. K dispozici jsou homo- i heterobifunkční činidla, která mají shodné či odlišné reaktivní skupiny oddělené raménkem. Důležité je zvolit vhodnou koncentraci činidla, aby nedocházelo k nadměrnému poklesu aktivity enzymu. Z dalších činidel pro aktivaci aminoskupin se používá 1,4-fenylisothiokyanát (Jin et al.,

- 24 -

2010). Pokud jsou k dispozici karboxyskupiny nosiče nebo proteinu, jsou vhodným aktivačním činidlem karbodiimidy (CDI). V laboratorních podmínkách se velmi často používá ve vodě rozpustný 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-karbodiimid (EDC nebo EDAC). Kromě EDC lze využít N,N´-dicyklohexylkarbodiimid (DCC) a N,N´diisopropylkarbodiimid (DIC). Pro imobilizaci citlivých proteinů se používá kombinace CDI a N-hydroxysukcinimidu (NHS) nebo sulfonovaného NHS (sulfo-NHS), který je rozpustnější ve vodě. Vznikající produkt bývá poměrně stabilní (Skládal, 2002). Schéma s využitím EDC a NHS je uvedeno na obr. 12. Je-li dostupná sacharidová komponenta obsahující diolové uspořádání, nabízí se mírná oxidace jodistanem sodným či draselným nebo kyselinou jodistou (obr. 13). Vznikající aldehydové skupiny mohou reagovat s aminoskupinami proteinů za vzniku Schiffových bází. Opět se doporučuje ke stabilizaci vazby redukce Schiffových bází borohydridem sodným. Výsledná aktivita imobilizovaných enzymů vzrůstá s počtem vzniklých aldehydových skupin (Namdeo & Bajpai, 2009). Oxidace jodistanem je využitelná také pro aktivaci proteinů obsahujících postranní sacharidové zbytky, ale i pro RNA (Skládal, 2002). Povrch

nosiče

modifikovaný

hydroxyskupinou

se

aktivuje

s použitím

epichlorhydrinu nebo bromkyanu. Hlavní nevýhodou je vysoká toxicita uvedených sloučenin. K aktivaci hydroxylových skupin na povrchu nosičů modifikovaných často sacharidovou vrstvou (dextran, celulosa, chitosan), lze použít 1,4-butandiol diglycidyl ether (Oakey & Mulcahy, 2004), p-toluensulfonylchlorid nebo karbodiimidazol (Gomes et al., 2006). Přehled významných aktivačních činidel je na obr. 14. Výhodou imobilizace s využitím kovalentní vazby je snadný přístup substrátu k enzymu a enzym by se neměl uvolňovat z nosiče do prostředí. Nevýhodou může být vyšší cena a toxicita řady aktivačních činidel. Jinou možností je afinitní imobilizace, kdy vzniká afinitní vazba mezi aktivovaným nosičem a specifickou skupinou proteinu (avidin-biotin, lektin-sacharidový zbytek, histidin-kovový ion aj). V případě avidin-biotinové interakce magnetické nosiče obsahují na svém povrchu avidin nebo streptavidin, které vykazují vysokou afinitu k biotinu (vitamin B7, vitamin H). Vzniklý komplex biotinu a avidinu je velmi pevný (Kd  10-14 – 10-15 mol.l-1) a odolný vůči silným reakčním podmínkám. Vlastnosti glykoproteinu avidinu a vitaminu H jsou podrobně popsány v kapitole 2.6.2.2. „Chemické modifikace proteinů“. Často se používá i podobný streptavidin, který pochází z bakterie Streptomyces avidinii (Bayer et al., 1990). K provedení imobilizace jsou možné dva postupy. První z nich zahrnuje biotinylaci povrchu magnetických nosičů obsahujících např. –NH2 skupiny vhodným biotinylovaným činidlem, následně se naváže avidin, popřípadě streptavidin a nakonec se váže biotinylovaný protein

- 25 -

(Janolino  Swaisgood, 2002). Druhý způsob představuje imobilizaci avidinu na vhodně upravený povrch magnetického nosiče a navázání biotinylovaného proteinu (Chan et al., 2006). Výsledný magnetický systém avidin-biotin nachází uplatnění hlavně v imunochemických metodách stanovení, ale i v biochemii a jiných oborech. Biotinylovanými proteiny mohou být enzymy, protilátky, hormony aj. Zajímavou možností imobilizace proteinů (enzymů) je použití magnetoliposomů. Využívají se především pro imobilizaci membránově vázaných enzymů, jako je hovězí cytochromoxidasa (EC 1.9.3.1). Imobilizované proteiny se stávají stabilnějšími ve srovnání s volnou formou.

Fe3O4

+

NH2

Nanočástice magnetitu

Protein

O=CH-(CH2)3-CH=O

Fe3O4

N=CH-(CH2)3-CH=O

Glutaraldehyd

Schiffova báze

NH2 Fe3O4

N=CH-(CH2)3-CH=N

Protein

NaBH4

Fe3O4

NH-CH-(CH2)3-CH-NH

Protein

Obr. 11. Schéma kovalentní imobilizace proteinu na magnetické nanočástice Fe3O4 s použitím glutaraldehydu jako aktivačního činidla (upraveno dle Kluchova et al., 2009).

Obr. 12. Schéma imobilizace proteinu s využitím EDC jako aktivačního činidla. Kombinace s NHS vede ke zvýšení účinnosti reakce (Thanh & Green, 2010).

- 26 -

Obr. 13. Oxidace diolového uspořádání kyselinou jodistou (Namdeo & Bajpai, 2009).

a)

b)

c)

d)

e)

f)

g)

Obr. 14. Přehled významných aktivačních činidel pro imobilizaci enzymů a) glutaraldehyd; b) p-toluensulfonylchlorid; c) epichlorhydrin; d) EDC; e) sulfo-NHS; f) NHS; g) 1,4-butandiol diglycidyl ether.

- 27 -

2.6. Biologické aplikace magnetických nanočástic oxidů železa Magnetické nanočástice se staly vysoce žádanými materiály pro své potenciální použití

v různých

oborech

lékařství,

chemie,

biologie

a

ekologie.

Aplikace

magnetických nanočástic se neustále vyvíjí a zdokonaluje v rozmanitém spektru oborů. Aplikace nanočástic lze rozdělit na způsob in vivo (MRI, nosiče léčiv, magnetická hyperthermie, magnetické bioseparace) a in vitro (nosiče biomolekul, purifikace proteinů, bioelektrody, izolace DNA a RNA) (Selim et al., 2007). Magnetické nanočástice jsou vhodným nosičem pro imobilizaci enzymů, peptidů, hormonů, buněk, léků, diagnostických látek a oligonukleotidů (Matsunaga et al., 2004). Z medicínského pohledu lze nanočástice oxidů železa využít jako kontrastní látky při zobrazování metodou magnetické rezonance MRI. Z dalších bioaplikací lze uvést potenciální využití nanočástic

pro

cílený

transport

protinádorových

léčiv,

specifické

uvolňování

terapeutických činidel, magnetická hyperthermie tumorových buněk, magnetické značení buněk, magnetofekce, identifikace antigenů a protilátek, izolace enzymů a nukleových kyselin. Lze imobilizovat i celé buňky (např. kvasinky Saccharomyces cerevisiae aj.), což je ekonomicky výhodnější. Enzymy z daných buněk není nutné purifikovat a příslušné biokatalyzátory jsou stabilnější, protože se vyskytují ve svém přirozeném prostředí (Numanoğlu & Sungur, 2004). Některé typy nanočástic mohou být součástí elektrod různých typů biosensorů. Příkladem využití magnetických nanočástic v molekulární biologii je tzv. magnetofekce, což je transfekční proces, při kterém je do buněk vnesena nukleová kyselina navázána na magnetickém nosiči. Transport magnetického komplexu nukleová kyselina-nanočástice je zajištěn vnějším magnetickým gradientovým polem (Plank et al., 2003). Jinou možností je imobilizace oligodeoxythimidinu na nanočástice a následná selektivní magnetická separace eukaryotní mRNA, která obsahuje na 3‘-konci polyadenylový řetězec (Šafaříková & Šafařík, 1995). Jestliže jsou na povrchu nanočástic navázány ionty Cd2+, Co2+, Ni2+, Zn2+ je možné využít tento magnetický systém pro separaci rekombinantních proteinů s histidinovou kotvou (Benelmekki et al., 2012). Použití nanočástic nabývá významu pro čištění a úpravu podzemních, pitných, odpadních a povrchových vod. Cílem je odstranit chemické a mikrobiální znečištění zahrnující těžké kovy, radioaktivní látky, pesticidy a různé mikroorganismy (Ambashta & Sillanpää, 2010). Pro tyto účely se používají často nanočástice na bázi nulamocného (elementárního) železa, které jsou extrémně reaktivní. Principem metody s použitím nanočástic železa je oxidačněredukční reakce založena na změně oxidačního stavu kontaminujících látek, čímž dochází k poklesu toxicity nebo k přeměně v látku jinou (Satapanajaru et al., 2008).

- 28 -

2.6.1. Proteiny imobilizované na magnetických nosičích Magnetické mikro- a nanočástice oxidů nabízí celou řadu aplikací. Magnetické nosiče se specifickými ligandy lze použít pro purifikaci enzymů. Mezi nejvýznamnější biomolekuly řadíme proteiny, proto se nejčastěji imobilizují na pevné magnetické nosiče. Řízená manipulace a následná separace použitého komplexu je zajištěna vhodným magnetickým separátorem. Imobilizované proteiny, především enzymy, se stávají stabilnější vůči vnějším podmínkám a je možné jejich opakované použití. Reakce s enzymy imobilizovanými na magnetických částicích probíhají většinou v míchaných reaktorech s následnou magnetickou separací, nebo v magneticky stabilizovaných fluidních reaktorech. Biokatalyzátory imobilizované na magnetických nosičích nabývají velkého významu především, když se jedná o velmi drahé enzymy anebo v případě, kdy chceme zamezit přítomnosti enzymu ve výsledném produktu. Z dalších výhod je okamžité ukončení reakce a rychlá separace biokatalyzátoru od produktu. V praxi se využívá hojně imobilizace proteolytických enzymů především proteasy trypsinu (EC 3.4.21.4). Proteasy nacházejí uplatnění v mnoha oborech, jako jsou biotechnologie, proteomika, medicína aj. Pro biotechnologické aplikace se imobilizují lipasy (EC 3.1.1.3). Jejich aplikace spočívá např. při transesterifikaci sojového oleje methanolem za vzniku methylesterů mastných kyselin, které jsou využívány v pohonných směsích známých pod označením „bionafta“ (Xie & Ma, 2009). Pro hydrolýzu škrobu můžeme použít imobilizovanou amylasu (EC 3.2.1.1.), pro výrobu bezlaktosového mléka imobilizovanou galaktosidasu (EC 3.2.1.23) a pro rozklad pektinů navázanou pektinasu (EC 3.2.1.15) (Lei & Bi, 2007). Z oxidoreduktas se imobilizuje lakasa (EC 1.10.3.2), a to pro oxidaci sloučenin jako jsou fenoly, aromatické aminy a další (Rotková et al., 2009). Protilátky

imobilizované

na

magnetických

nosičích

jsou

vhodné

pro

imunoanalýzu biologicky aktivních látek a xenobiotik. Při imunomagnetickém stanovení je požadovaná protilátka imobilizována na magnetických částicích. Imobilizovanou protilátku lze pipetovat do zkumavek a vzniklý komplex antigen-protilátka následně magneticky separovat. Protilátky imobilizované na magnetických nosičích se využívají pro stanovení antigenů. Příkladem je imobilizace protilátky proti -fetoproteinu, což je důležitý tumorový marker krevního séra (Tang et al., 2006). Jinou skupinou proteinů, které lze imobilizovat na magnetické nosiče jsou lektiny, které mají schopnost rozpoznat a vázat sacharidové struktury. Příkladem je imobilizace lektinu konkavalinu A na magnetické částice a jeho následné využití pro specifickou adsorpci kvasničné invertasy (Akkaya et al., 2009). Lze také imobilizovat inhibitory a použít je pro izolaci enzymů. Protein A je schopný vázat Fc úsek

- 29 -

imunoglubulinů, především typu IgG, proto může být imobilizován na pevné nosiče a následně aplikován pro navázání nebo purifikaci protilátek (Graille et al., 2000).

2.6.2. Proteomika – imobilizace proteolytických enzymů Proteomika je věda, která se zabývá studiem proteomu, tedy souborů všech proteinů produkovaných určitou buňkou, tkání nebo organismem v daném čase (Kahn, 1995). Při identifikaci příslušného proteinu mj. vycházíme z jeho počátečního štěpení na peptidy, které se provádí s využitím enzymů nebo chemickou cestou. Molekulová hmotnost vzniklých fragmentů se potom stanovuje hmotnostním spektrometrem s vysokou přesností (Pandey  Mann, 2000). Významnou

skupinou

proteinů,

které

nacházejí

využití

v proteomice,

v biotechnologických procesech i lékařství, jsou proteasy katalyzující hydrolýzu peptidových vazeb v proteinech. Tyto enzymy patří mezi hydrolasy a jsou specifické vůči určitým strukturním znakům polypeptidového řetězce (proteolytické enzymy mají být obecně nazývány peptidasami bez ohledu na velikost substrátu). Dle místa působení rozdělujeme proteasy do dvou hlavních skupin a to na endopeptidasy, které katalyzují hydrolýzu peptidových vazeb uvnitř řetězce a exopeptidasy, které katalyzují hydrolytické odštěpení koncové aminoskupiny (Štosová et al., 2005). Proteasy můžeme klasifikovat na základě dalších kritérií, a to podle původu (rostlinné, živočišné, mikrobiální), podle lokalizace (intracelulární, extracelulární) nebo podle optimálního pH (kyselé, neutrální, alkalické) (Hrčková et al., 2004). Proteasy se podle struktury aktivního místa a výskytu specifického katalytického aminokyselinového zbytku dělí na serinové, cysteinové, aspartátové, threoninové a metaloproteasy (Hartley, 1960; Rawlings  Barret, 1995; Seemüller et al., 1995). Mezi proteolytické enzymy řadíme např. trypsin, chymotrypsin, elastasu, enterokinasu, thrombin, bromelain, ficin, papain, subtilisin, thermolysin aj. (Scott  Eagleson, 1988). Nejčastěji využívaným enzymem v proteomickém výzkumu je endopeptidasa trypsin. Na magnetických nosičích byly imobilizovány proteolytické enzymy jako je trypsin (Li et al., 2007), chymotrypsin (Hong et al., 2007) nebo papain (Liang & Zhang, 2007). Zajímavou aplikací je imobilizace hovězího trypsinu na magnetické nosiče pro následné štěpení proteinů v roztoku a analýzu hmotnostní spektrometrií (Sun et al., 2012).

- 30 -

2.6.2.1. Hovězí trypsin - pojem, vlastnosti a výskyt Trypsin (EC 3.4.21.4) patří mezi serinové endopeptidasy trávicího traktu obratlovců. Trypsin se vyznačuje mírně alkalickým pH a striktní specifitou místa štěpení pro aminokyselinové zbytky lysinu a argininu (Chamrád et al., 2011; Olsen et al., 2004). Trypsin je složen z 223 aminokyselin (AMK), jeho molekulová hmotnost činí 23,3 kDa, optimální hodnota pH je 8 a isoelektrický bod (pI) je 10,5 (Schonburg  Slazman, 2005). Vyskytuje se ve formě -trypsinu, který se štěpením mezi Lys145 a Ser146 může rozložit na dva řetězce -trypsinu (Elsner et al., 2000). Trypsin je produkován buňkami slinivky břišní v inaktivní formě (zymogenu) trypsinogenu, který se skládá z 243 AMK. Odpovídající molekulová hmotnost je 24 kDa a pI 9,4. Trypsin je aktivován z tzv. trypsinogenu ve dvanáctníku dvoustupňovým procesem (obr. 15). Nejprve za katalýzy pomocí enteropeptidasy (EC 3.4.21.9) dojde k odštěpení 14 AMK z N-konce preproenzymu za vzniku proenzymu. Následuje odštěpení N-koncového hexapeptidu

(VDDDDK)

za

vzniku

-trypsinu.

Aktivace

je

také

zrychlována

autokatalyticky vzniklým trypsinem a Ca2+ ionty. Molekula trypsinu obsahuje 6 disulfidových vazeb (Scott  Eagleson, 1988; Walsh  Neurath, 1964). V aktivním místě trypsinu má důležitou roli zbytek histidinový (His57), serinový (Ser195) a zbytek kyseliny asparagové (Asp102). Podíl má také zbytek kyseliny asparagové (Asp189), který je důležitý k uchycení dlouhých kladně nabitých aminokyselinových zbytků lysinu a argininu (Perona & Craik,1997). Jelikož trypsin poskytuje dobře definované kladně nabité peptidové štěpy o vhodné velikosti 10-12 AMK, je v proteomice využíván ke štěpení proteinů na směs štěpných peptidů pro analýzu hmotnostní spektrometrií (Šebela et al., 2006).

Obr. 15. Aminokyselinová sekvence hovězího trypsinogenu (Bos Taurus). Lysin (modrá), arginin (zelená), pre-sekvence (červená), pro-sekvence (fialový ráměček).

- 31 -

2.6.2.2. Chemické modifikace proteolytických enzymů Chemické modifikace se staly jednoduchou a rychlou metodou k úpravě fyzikálně-chemických vlastností proteinů. Jedná se o stabilizaci proteinů, kterou lze rychle pozměnit skupiny. Modifikace proteinů je žádaná z důvodu zvýšení teplotní stability, odolnosti proti působení pH a k potlačení vzniku autolytických štěpů. Modifikaci lze provést reakcí s činidly za tvorby příčné vazby nebo navázáním monomerních či polymerních jednotek (DeSantis & Jones, 1999). Trypsin se stal nejvíce používaným enzymem v proteomickém výzkumu. Trypsinové štěpení proteinového vzorku poskytuje definované peptidové fragmenty, které lze analyzovat s využitím hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF MS nebo ESIMS. Jak již bylo zmíněno, trypsin se vyznačuje striktní specifitou místa štěpení pro aminokyselinové zbytky Lys a Arg. Ovšem použití nativního trypsinu v proteomice přináší dvě hlavní nevýhody. Trypsin se vyznačuje poměrně nízkou teplotní stabilitou, je výrazně inaktivován už při 37°C, což souvisí s jeho nežádoucí rychle probíhající autolýzou v prostředí mírně alkalického pH a v nepřítomnosti stabilizujících Ca2+ iontů (Rice et al., 1977; Sriram et al., 1996). Vznikající autolytické fragmenty se stávají nežádoucími při MS analýze, protože představují rušivé pozadí. Vznik autolytických peptidů lze eliminovat nebo redukovat kovalentní modifikací proteinů. Struktura, typ, velikost enzymu, příslušný typ modifikačního činidla a podmínky modifikační reakce ovlivňují účinnost modifikace enzymu (Venkatesh  Sundaram, 1998). Jako nejjednodušší způsob se jeví acylace a alkylace lysinových zbytků. Konkrétně u trypsinu se provádí chemická modifikace zbytku lysinu a argininu v molekule enzymu. Po modifikaci lysinu a argininu nedochází k proteolytickému štěpení za těmito aminokyselinami. Výsledné trypsinové konjugáty jsou v porovnání s nativním trypsinem odolnější vůči vyšším teplotám a autolýze (Glazer et al., 1962). Po modifikaci může být pozměněna i aktivita enzymu (Elsner et al., 2000). V případě modifikace lysinu příslušná činidla reagují s primární -aminoskupinou lysinu, při modifikaci argininu s jeho guanidiovou skupinou. V molekule hovězího trypsinu je k dispozici 14 Lys a Nkoncové residuum isoleucin, které poskytují celkem 15 reaktivních aminoskupin, které mohou být modifikovány (Šebela et al., 2006). Pokud je cílem modifikovat arginin, jsou v molekule trypsinu přístupné 2 argininové zbytky a příslušná činidla reagují s jeho guanidiovou skupinou. V případě modifikace lysinů se jeho reaktivní aminoskupiny vyskytují mimo aktivní místo trypsinu, nedochází tedy ke ztrátě enzymové aktivity. Pro modifikaci lysinových zbytků se využívají jednoduché aldehydy jako je formaldehyd a acetaldehyd, nebo látky, které lze např. oxidací např. jodistanem sodným převést na aldehydovou formu (sacharidy). Ze sacharidů se používají raffinosa, stachyosa,

- 32 -

maltotriosa, které jsou oxidovány za vzniku polyaldehydů, které reagují s trypsinem (Šebela et al., 2006). Po reakci s trypsinem vzniká Schiffova báze, která je málo stabilní, proto se provádí její redukce za vzniku stabilnějšího produktu. Jako příklad lze uvést oxidaci karboxymethylcelulosy, která obsahuje diolové uspořádání, po oxidaci jsou k dispozici aldehydové skupiny, které reagují s aminoskupinami trypsinu, výsledkem je glykovaný trypsin, viz obr. 16 (Villalonga et al., 2000). Zajímavou cestou je použití cyklodextrinů, což jsou cyklické oligosacharidy, které se vyznačují prstencovou strukturou tvořenou šesti (-) sedmi (-) a osmi (-cyklodextrin) glukosovými zbytky; obr. 17 (Fernández et al., 2002). Další možností je acylace, kdy se provádí reakce s anhydridem kyseliny jantarové za vzniku sukcinylovaného trypsinu. Výsledný sukcinylovaný trypsin vykazuje vysokou stabilitu vůči autolýze (Elsner et al., 2000). Guanylaci trypsinu lze provést s využitím činidla 1-guanyl-3,5-dimethylpyrazolu (Elsner et al., 2000). Lze připravit konjugáty trypsinu s dextranem (Hernández et al., 2006) nebo N-hydroxysukcinimidovým esterem kyseliny octové (Murphy & Fágáin, 1996). Residua argininu se modifikují pomocí dikarbonylových sloučenin jako je biacetyl, fenylglyoxal a jiné (Nurredin & Inagami, 1975; Štosová et al., 2005). Trypsin lze také stabilizovat nitrací povrchových tyrosinových zbytků a následnou redukcí na aminotyrosin (Štosová et al., 2005). Zajímavým způsobem modifikace proteinů je biotinylace, což je vnesení biotinové značky do molekuly proteinu (zde trypsinu). Biotin představuje malou molekulu (Mr = 244,31), která je přítomna ve všech živých buňkách a je důležitým kofaktorem karboxylas (obr. 18A). Po biotinylaci proteinu zůstavají zachovány původní biologické vlastnosti. V současné době jsou dostupná specifická biotinylovaná činidla, jako funkčních skupin proteinů se pro biotinylaci nejčastěji využívají –NH2, –SH, –COOH a –CHO. Jako příklady biotinylačních činidel lze úvest sulfo-NHS-LC-LC-biotin, iodoacetyl-LC-biotin, 5-(biotinamido) pentylamin, biocytin hydrazid a biotin hydrazid. Po úspěšné biotinylaci se trypsin stává opět stabilnější vůči teplotě a autolýze. Je pak možná další stabilizace navázáním na avidinylované pevné nosiče jako jsou například magnetické nanočástice nebo celulosové kuličky (Janolino & Swaisgood, 2002). Avidin je homotetramerní glykoprotein (obr. 18B) vaječného bílku, každá podjednotka se vyznačuje vysokou afinitou pro biotin. Sacharidová složka tvoří zhruba 10 %, komplex avidin-biotin tvoří nejsilnější biochemickou vazbu (Anzai et al., 1994). Jinou možností může být využití nitroavidinu a nitrostreptavidinu, u kterých jsou nitrované tyrosinové zbytky v místě vazby k biotinu (Morag et al., 1996).

- 33 -

Karboxymethylcelulosa – CMC

Polyaldehyd-CMC (Trypsin)

Schiffova báze

Trypsin-CMC-komplex

Obr. 16. Příprava trypsinového konjugátu s využitím karboxymethylcelulosy (upraveno podle Villalonga et al., 2000).

Obr. 17. Chemická struktura tří hlavních typů cyklodextrinů -, - a . B)

A)

Obr. 18. A) Chemická struktura biotinu – formálně kondenzát močoviny a thiofenu se zbytkem kyseliny valerové; B) Struktura avidinu.

- 34 -

2.6.2.3. Využití imobilizovaného trypsinu pro MALDI-TOF peptidové mapování MALDI-TOF peptidové mapování (angl. „peptide mass fingerprinting“, PMF) je jednou z možností jak v proteomice provádět identifikaci proteinu. Proteinové vzorky (jednoduché, nikoli komplexní) jsou podrobeny proteolytickému štěpení v roztoku nebo gelu a následuje měření hmotnostního spektra peptidů v digestu. Sada naměřených peptidových hmotností se využije k vyhledávání v proteinové databázi na principu srovnávání souboru experimentálních dat s počítačem generovanými soubory teoretických peptidových hmotností (dle specifičnosti štěpení použitého proteolytického enzymu) vycházejícími ze sekvencí proteinů v databázi. Experimentálně získaný soubor molekulových hmotností peptidů se pak porovnává s teoretickými peptidovými hmotnostmi. Počítá se tzv. pravděpodobnostní skóre, které odráží shodu naměřených a teoretických hmotností. Podmínkou pro úspěšnou identifikaci je přítomnost proteinu v databázi. Štěpení proteinů se provádí enzymově (např. trypsin) nebo chemicky (BrCN). Zajímavostí je „Shotgun“ proteomika, která zahrnuje obecný postup identifikace proteinů, kdy je neseparovaná směs proteinů nejdříve s využitím enzymů rozštěpena na směs peptidů, následuje vhodná separace (HPLC) a potom sekvenace tandemovou hmotnostní spektrometrií. Často se volí nespecifické enzymy např. proteinasa K (Chmelík, 2005). Použití proteas v proteomice sebou přináší určité limitující faktory, jako je doba požadovaná k dostatečné proteolýze vzorku a rezistence některých proteinů vůči štěpení. Jak již bylo uvedeno, nejvíce používanou proteasou pro štěpení proteinů je serinová endopeptidasa trypsin. Pro aplikaci trypsinu je požadována doba inkubace 424 h, přesto však pro některé proteiny může být štěpení neúčinné (Bark et al., 2001). Samotný průběh štěpení závisí na mobilitě struktury substrátu, kterou můžeme ovlivnit přidáním denaturačních činidel nebo teplotou (Hubbard et al., 1994). Trypsinace vyžaduje určité podmínky, především maximální výtěžek a úplnost štěpení, minimalizaci autolýzy trypsinu, reprodukovatelnost. Z těchto uvedených důvodů se při proteolytickém štěpení v roztoku používá určitý poměr enzym:substrát (např. 1:50 až 1:5). Nejčastěji trypsinace probíhá 12 h při 37°C (Havliš  Shevchenko, 2004). Tyto limitující faktory mohou být redukovány kovalentní imobilizací trypsinu. Provádí se irreverzibilní imobilizace trypsinu na pevné nerozpustné nosiče jako je sklo, membrány, polymery, gelové kuličky, porézní křemíková matrice a porézní monolitické materiály (Li et al., 2007). Vhodně modifikované magnetické mikro- a nanočástice jsou v součastné době velice žádaným a nadstandardním materiálem pro imobilizaci trypsinu, který přináší pro štěpení proteinů řadu výhod. Enzym je možné použít ve

- 35 -

vysoké koncentraci, tím se snižuje požadovaná doba ke štěpení příslušného proteinu. Důležitou výhodou je magnetická separace trypsinu, imobilizovaný enzym je velmi rychle a snadno izolován aplikací vnějšího magnetického pole z proteinového digestu ještě před MS analýzou. Hlavní výhodou je především požadovaná čistota produktu. S využitím

magnetické

separace

dochází

k redukci

či

eliminaci

přítomnosti

autolytických fragmentů trypsinu ve výsledném digestu a následně v hmotnostním spektru. U imobilizovaného trypsinu je zvýšena stabilita k denaturačním činidlům a organickým

rozpouštědlům

(Amankwa



Kuhr,

1993;

Davis

et

al.,

1995).

Z ekonomického pohledu lze imobilizovaný trypsin použít opakovaně. Po imobilizaci trypsinu dochází ke zvýšení teplotní stability, stability při skladování a rozšíření hodnot pH optima. Nízkou teplotní stabilitu trypsinu a nežádoucí autolýzu lze eliminovat také chemickou modifikací trypsinu a následnou imobilizací k povrchu magnetických částic. Příkladem může být kovalentní imobilizace trypsinu na nanočástice magnetitu modifikované –NH2. Po inkubaci proteinů s imobilizovaným trypsinem následuje rychlá magnetická separace, vzniklý supernatant (digest) je analyzován hmotnostní spektrometrií. Výsledkem je hmotnostní spektrum peptidů, v proteinové databázi se provede vyhledávání a nakonec identifikace proteinu; obr. 19 (Jeng et al., 2007). Příklady imobilizace trypsinu na různé typy magnetických částic a jeho aplikace uvádí tab. 1. MNPs

Obr. 19. Trypsin imobilizovaný na nanočásticích magnetitu a jeho následné využití pro štěpení proteinů (upraveno podle Jeng et al., 2007).

- 36 -

Tabulka 1. Příklady imobilizace trypsinu na magnetické nosiče. Magnetický nosič

Aplikace

Literatura

Mikro- a nanočástice

Proteomika – štěpení

Bílková et

modifikované –COOH skupinou

proteinů

al., 2006



Li et al.,

modifikované –NH2 skupinou

proteinů

2007

Silanizované mikročástice


Lin et al.,

magnetitu

proteinů

2007


Proteomika – enzymový

Liu et al.,


mikroreaktor, proteolýza

2007



Jeng et al.,


proteinů

2007

Magnetické kuličky

Studium stability

Bayramoglu et


imobilizovaného trypsinu

al., 2008

Magnetit modifikovaný


Wang et al.,

polyanilinem/uhlíkové duté

proteinů

2008

Křemičitanové mikročástice


Lin et al.,

modifikované epoxy skupinou

proteinů

2008

Magnetické částice


Nel et al.,

modifikované –COOH skupinou

proteinů

2008

Uhlíkové mikročástice

Proteomika – rychlá

Yao et al.,

modifikované -NH2 skupinou

hydrolýza proteinů

2008

Nanočástice maghemitu

Proteomika –

Kluchová et


termostabilní trypsin,

al., 2009

válcovité struktury

hydrolýza proteinů Magnetické mikročástice

Proteomika – hydrolýza

Sun et al.,


proteinů

2012


Charakterizace

Kalska-Szostko

modifikované zlatem a –SH

nanočástic

et al., 2012

skupinou

s imobilizovaným trypsinem

Mikročástice magnetitu

Charakterizace

Maciel et al.,

modifikované

mikročástic

2012

polysacharidovou

s imobilizovaným

komponentou

trypsinem

- 37 -

2.6.3.

Imobilizace

mikrobiálních

buněk

jako

celobuněčných

biokatalyzátorů Mikrobiální buňky obsahují řadu enzymů, které lze využít pro průmyslové aplikace. Pro některé bioaplikace je vhodné použít celobuněčné biokatalyzátory, které tak mohou pracovat v přirozených podmínkách. Enzymy mikrobiálních buněk jsou často stabilnější než biokatalyzátory izolované z rostlinného nebo živočišného materiálu. Buňky mikroorganismů chrání enzymy od vlivů vnějšího prostředí. Výhodou imobilizace celobuněčných biokatalyzátorů je především jejich lepší stabilita, možnost opakovaného použití a nízká cena v porovnání s purifikovanými enzymy (Böyükbayram et al., 2006). Důležitým parametrem je vhodný typ imobilizace. Celobuněčné biokatalyzátory se nejčastěji imobilizují enkapsulací do vhodné biokompatibilní polymerní matrice. Zvolená matrice musí splňovat řadu podmínek, jako je volný pohyb substrátu a produktu biokatalytické reakce, udržet buňky uvnitř struktury, chránit buňky před vlivy vnějšího prostředí jako je teplota, pH a iontová síla. Pokud je zvolena nevhodná matrice, buňky se mohou uvolňovat do prostředí, dochází také k difúzním problémům (Elnashar, 2010). Použitá matrice musí být biokompatibilní a netoxická především pro použití v potravinářském průmyslu. Pro enkapsulaci jsou typické přírodní biopolymery jako je škrob, celulosa a její deriváty, alginát, karagenan, dextran, chitosan a xanthan. Mikroorganismy lze imobilizovat i prostřednictvím kovalentní vazby. V tomto případě nosič musí mít velkou plochu povrchu a obsahovat vhodné funkční skupiny, které se využijí při adhezi buněk. Použitý nosič nesmí negativně ovlivňovat biologickou strukturu a metabolickou aktivitu zvolených buněk. Vhodně zvolené nosiče je možné regenerovat a využít opakovaně pro imobilizační procesy. Často se nemagnetické nosiče s imobilizovanou biokomponentou magneticky modifikují z důvodu snadnější a rychlejší manipulace se systémem. Modifikace buněk magnetickou složkou se provádí různými způsoby. Na povrch buněk se navazují mikroa nanočástice magnetitu nebo maghemitu. Jinou možností je kovalentní imobilizace buněk na magnetické nosiče nebo enkapsulace buněk a částic oxidů železa do biokompatibilního polymeru (Safarikova et al., 2009; Safarik & Safarikova, 2007). Buňky S. cerevisiae modifikované ferrofluidem jsou na obr. 20. Závěrem lze říci, že nadstandardní vlastnosti nosiče s celobuněčným biokatalyzátorem spočívají především v možnosti magnetické separace daného systému a jeho následném odstranění z reakční směsi pro regeneraci. Příkladem aplikace imobilizovaných celobuněčných biokatalyzátorů je enkapsulace nativních buněk Saccharomyces cerevisiae do vhodně zvolené matrice a jejich následné použití pro konverzi disacharidu sacharosy na D-

- 38 -

glukosu a D-fruktosu, jedná se o přípravu invertního cukru (Safarik et al., 2009). Buňky Saccharomyces cerevisiae kromě enzymu invertasy (β-D-fruktofuranosidasa; EC 3.2.1.26) obsahují i katalasu (H2O2:H2O2 oxidoreduktasa; EC 1.11.1.6), která rozkládá H2O2 na netoxický kyslík a vodu (Safarik et al., 2008). Přídavek peroxidu vodíku v potravinářství zamezuje růstu nežádoucích mikroorganismů (bakterie, kvasinky, plísně aj.). Kromě Saccharomyces cerevisiae je možné provést imobilizaci dalších nepatogenních mikroorganismů. Specifický magnetický systém může být použit pro požadovaný biokatalytický proces, výše uvedený systém např. pro potenciální potravinářské aplikace.

Obr.

20.

SEM

snímek

mikrobiálních

buněk

Saccharomyces

cerevisiae

modifikovaných magnetickou kapalinou (Safarikova et al., 2009).

2.6.4.

Využití

magnetických

nanočástic

pro

konstrukci

amperometrického biosensoru Magnetické nanočástice oxidů železa mohou být využity pro imobilizaci enzymů a jiných biosubstancí. Tím je umožněna jejich separace z reakčních směsí. Tato magnetická imobilizace může být aplikována i při konstrukci bioelektrod různých typů

biosensorů,

především

amperometrických.

Nanočástice

oxidů

kovů

s imobilizovanými enzymy (obr. 21) se používají jako biorekogniční vstva (Magro et al., 2012). Příkladem může být amperometrický glukosový biosensor založený na systému Fe3O4@SiO2 (magnetit upravený silanizací)/uhlíkové nanotrubky s imobilizovanou glukosaoxidasou pro detekci glukosy. Řada nanočástic oxidů železa vykazuje katalytický účinek pro rozklad peroxidu vodíku (Lin & Leu, 2005).

- 39 -

Zajímavou možností přípravy jsou pevné elektrody ve formě uhlíkové pasty (CPE – angl. „Carbon Paste Electrode“), které lze v současné době využít v elektroanalytických metodách pro stanovení různých organických i anorganických sloučenin (Švancara et al., 2001). CPE představují binární směs grafitového prášku a vhodné organické pastovací kapaliny ve vhodném poměru. V současné době je preferováno použití cíleně modifikovaných uhlíkových past. Cílená modifikace uhlíkové pasty se provádí rozpuštěním organické látky v pastovací kapalině, anebo vmícháním požadovaného modifikátoru do pasty (Zima et al., 2010). Vhodným modifikátorem mohou být různé typy nanomateriálů od magnetických nanočástic až po nanodrátky lanthanoidů (Daneshgar et al., 2009). Uhlíková pasta může být modifikována biologickou nebo chemickou cestou. Biologicky modifikované uhlíkové pasty zahrnují imobilizované enzymy začleněné v uhlíkové pastě, kdy zkonstruovaný biosensor je využitelný v analýze biologicky významných organických i anorganických sloučenin (Zima et al., 2010). Zvýšení citlivosti elektrod lze dosáhnout inkorporací vhodných nanomateriálů s velkým povrchem i katalytickými vlastnostmi pro studované reakce. Zhotovená pasta se plní do příslušného elektrodového pouzdra. Typické pastové směsi obsahují vysoce vodivý grafit a elektricky nevodivou hydrofobní kapalinu. Organická kapalina slouží k mechanickému spojení grafitových částic. Klasickou kapalinou může být parafínový, minerální nebo silikonový olej. Často používaným zástupcem minerálních olejů je Nujol (Švancara & Schachl, 1999). Homogenizaci grafitového prášku s kapalným pojivem je žádoucí provést v několika etapách. Výslednou uhlíkovou pastu lze ihned použít k přípravě elektrody anebo uskladnit. Pastovací kapalina elektrodovému materiálu poskytuje dobré mechanické, fyzikálně-chemické a elektrochemické vlastnosti. Mechanické vlastnosti zahrnují pevnost a inertnost pasty, z elektrochemického pohledu je to malý šum a nízký zbytkový proud (Zima et al., 2010). Elektrody typu CPE řadíme mezi heterogenní uhlíkové elektrody. Heterogenní systém v důsledku obsahu kapalného pojiva se vyznačuje charakteristickou strukturou, která závisí na kvalitě o obsahu grafitu a pastovací kapaliny. Důležitou vlastností a hlavní výhodou je obnovitelnost povrchu pasty. Obnovení povrchu pasty lze provést vytlačením části pasty z těla elektrody ven a následuje vyhlazení pracovního povrchu (Švancara & Schachl, 1999). V praxi nacházejí uplatnění nejvíce amperometrické biosensory, které jsou založeny na principu měření spotřeby kyslíku nebo vzniku peroxidu vodíku. Tento typ biosensoru zaznamenává změny proudu, které vznikají při biokatalytické reakci (Zajoncová & Pospíšková, 2009). Elektrodový děj je založen na katodové redukci kyslíku (čtyřelektronový proces), anebo anodové oxidaci peroxidu vodíku (obr. 22). Typickým příkladem je Clarkova kyslíková elektroda. Platinový drátek zatavený ve skle

- 40 -

tvoří

pracovní

elektrodu,

jako

referenční

elektrodu

používáme

nejčastěji

-1

argentchloridovou (Ag/AgCl). Roztok chloridu draselného (1 – 3 mol.l ) slouží jako elektrolyt, lze použít i neutrální fosfátový pufr. Redukce kyslíku probíhá při záporném potenciálu (-0,65 V) vůči argentchloridové elektrodě. Důležitou součástí kyslíkové elektrody je membrána propustná pouze pro kyslík, jako materiál se nejčastěji využívá teflon, polypropylen a polyethylen (Skládal, 2002). Hlavní výhodou použití kyslíkové elektrody je specifičnost vůči kyslíku. Předřazenou membránou lze tedy zajistit neprůchodnost interferujících látek, které se vyskytují v reálném vzorku. Nicméně, při měření peroxidu vodíku lze dosáhnout vyšší citlivosti, protože se monitoruje produkce a na začátku měření je hodnota proudu téměř nulová, lze tedy nastavit citlivý rozsah detektoru a určit nízké koncentrace H2O2 i původního analytu (Skládal, 2002). V případě detekce peroxidu vodíku není použita plynopropustná membrána a pracuje se v hodnotách kladného potenciálu, při kterém dochází k oxidaci peroxidu. Obecně jedním z problémů při oxidacích je přítomnost interferujících látek v realných vzorcích (Skládal, 2002). Hlavní nevýhodu těchto látek je jejich nežádoucí oxidace zároveň s analytem a dochází tak ke zvýšení signálu na elektrodě. Mezi snadně oxidovatelné sloučeniny patří kyselina askorbová a močová, paracetamol, ampicilin, dopamin, močovina, cystein aj. Tento problém lze obejít převedením interferujících látek vhodnými reakcemi na formu, která už není elektroaktivní. Jinou možností je předřazení antiinterferenčních membrán. Existuje celá řada různých typů membrán, kterými se pokrývá povrch pracovních elektrod. Cílem použití vhodných membrán je omezení přístupu elektroaktivních látek k pracovní elektrodě (Moatti-Sirat et al., 1992).

Obr. 21. Schéma glukosaoxidasy imobilizované na magnetických nanočásticích s využitím pro konstrukci biosensoru (upraveno podle Magro et al., 2012).

- 41 -

O2 + 2 H2O + 2 ered.

H2O2 + 2 e-

H2O2

ox.

red.

H2O2 + 2 OH-

2 OH-

O2 + 2 e- + 2 H+

Obr. 22. Katodová redukce kyslíku, případně peroxidu vodíku; anodová oxidace peroxidu vodíku (Gülce et al., 2002).

2.6.5. Nano-medicínské obory Nanomedicínské obory se staly jedněmi z předních odvětví výzkumu a vývoje oboru nanomateriálů a nanotechnologií. Tyto obory jsou zaměřeny hlavně na diagnostiku, monitorování léčby a kontrolu pacientů za použití materiálů a struktur navržených na molekulární úrovni. Dnešní výzkum je zaměřen na transport diagnostických

a

terapeutických

látek

umožňujících

odstranit

vedlejší

účinky

standardních léčebných metod a přesně zacílit na určité místo v organismu. Superparamagnetické oxidy železa označované jako SPIO (angl. „Superparamagnetic Iron Oxides“) obsahující nanočástice maghemitu nebo magnetitu vykazují žádoucí magnetické vlastnosti vedoucí k zahřátí, navedení nebo označení buněk za použití vnějšího magnetického pole. Zatímco mnohé z nich se stále experimentálně studují, některé produkty již byly uvedeny na trh. Mezi komerčně dostupné SPIO kontrastní látky pro zobrazení střev pomocí MRI patří např. produkt Lumirem (Markova et al., 2010), pro zobrazení jater Resovist nebo Endorem (http://www.mr-tip.com/serv1.php). Přesně navržený systém magnetické nanočástice/biokompatibilní povrchová vrstva se použije v biomedicíně in vitro (magnetické separace, purifikace nebo selekce požadovaných buněk). Bioaplikace in vivo zahrnují terapeutické metody jako je magnetická hyperthermie a dále diagnostické metody jako je MRI (Pankhurst et al., 2003).

2.6.5.1. Kontrastní látky pro MRI V současné době patří MRI k nejúčinnějším lékařským diagnostickým metodám. Jedná se o neinvazivní metodu pro velice přesné zobrazení tkání v lidském těle i jejich funkčnosti, která na rozdíl od jiných metod založených na aplikaci škodlivého rentgenového či ionizujícího záření využívá vnější magnetické pole. Kontrastní látky obsahující nanočástice magnetitu nebo maghemitu mají obrovský magnetický moment v přítomnosti magnetického pole a navíc se vyznačují nulovou remanentní magnetizací

- 42 -

po vypnutí tohoto pole. Kontrastní látky složené z vhodných nanočástic oxidů železa a funkcionalizující vrstvy (dextran, PEG) představují biokompatibilní a biodegradabilní materiály vhodné k intravenózní aplikaci do organismu. Důležitým parametrem SPIO kontrastních látek je jejich netoxičnost. Jelikož částice kontrastní látky jsou menší než erythrocyty, snadno plynou krevním řečištěm. Potom se pomocí makrofágů uloží do jater (Küpfferovy buňky) a sleziny (Lemarchand et al., 2004). SPIO kontrastní látky jsou degradovány tak, že železo se postupně začleňuje do produkce červených krvinek a jiných relevantních metabolických procesů, popřípadě je vyloučeno z organismu. Je nutné podotknout, že SPIO kontrastní látky byly klinicky testovány a schváleny pro klinickou aplikaci. Obr. 23 představuje rozdíl v kontrastu snímků jater pacienta s tumorem a cirhózou daného orgánu bez použití kontrastní látky (A) a po aplikaci kontrastní látky SPIO (B). Cirhotická játra se nasytí kontrastní látkou SPIO a způsobí negativní signál oblasti na rozdíl od nádoru, který postrádá makrofágy, a proto se aplikovaná kontrastní látka do tumoru nedostane. Po aplikaci kontrastní látky se tedy tumor stává viditelnější (Arnold et al., 2003).

A)

B)

Obr. 23. MRI snímky jater pacienta s cirhózou a tumorem před (A) a po aplikaci kontrastní látky SPIO (B) (upraveno podle Arnold et al., 2003).

2.6.5.2. Magnetické nosiče léčiv V dnešní době jsou cílené nosiče léčiv studovány pro léčbu mnoha typů onemocnění. Současný výzkum je zaměřen na vývoj magnetických nosičů cytostatik především z důvodu závažnosti tumorových onemocnění, jejich častým výskytem a méně účinnou léčbou. Dnešní používaná cytostatika jsou nedostatečně selektivní pro tumorovou tkáň, což se projevuje výraznými nežádoucími vedlejšími účinky. Účinná léčba cytostatiky je tedy omezena, protože dávky pro dosažení úplného terapeutického účinku jsou příliš vysoké. Cílem aplikace magnetických nosičů cytostatik je redukce či eliminace toxicity léčiv, zamezení nežádoucích účinků terapie, prodloužení cirkulace cytostatik v krvi, řízená aktivace, selektivita daného léčiva, ochrana léčiv před

- 43 -

degradací v organismu a zvýšení stability léčiv. Pro úspěšnou léčbu je také velmi důležité řízené uvolňování příslušného léčiva (Hrubý et al., 2006). Magneticky cílená terapie umožňuje navázání léčiv (cytostatik) k biokompatibilnímu magnetickému nanočásticovému nosiči nebo zapouzdření do nanočástic. Výsledný magnetický systém je intravenózně aplikován do těla pacienta. Jedná se o méně invazivní metodu v porovnání

s chirurgickými

metodami

cíleného

doručení

léčiv.

Po

podání

magnetických nanočástic s požadovaným léčivem se aplikuje vnější magnetické pole s velkým gradientem, aby se příslušný komplex (nanočástice-léčivo) zakoncentroval na specifické místo v lidském těle. Požadované léčivo se uvolňuje působením enzymů, změnou fyziologických podmínek, jako je teplota, pH, osmolalita, po čemž následuje odebrání

tumorovou

buňkou.

Vznikající

tumorová

tkáň

se

vyznačuje

řadou

morfologických specifik, na kterých je založeno cílené doručení léčiv. Nutno podotknout, že popsaná bioaplikace je limitována na tumorová onemocnění blízko povrchu těla. Cévní systém tumorové tkáně je více propustný pro velké molekuly, proto se nanočástice nahromadí v tumorové tkáni oproti zdravé tkáni (Nishiyama et al., 2003). V posledních letech došlo k rozvoji výroby magnetických nosičů, optimalizace pokračuje dodnes. V designu protinádorových léčiv jako je 5-fluorouracil, 4épidoxorubicin (Lübbe et al., 2001), doxorubicin (Johnson et al., 2002) a mnoho dalších představují magnetické nano-nosiče intenzivně studovaný přístup. Řada magnetických nosičů cytostatik je ve fázi předklinických a klinických zkoušek.

2.6.5.3. Metoda magnetické hyperthermie Předmětem intenzivního zkoumání vhodně modifikovaných magnetitových nebo maghemitových

nanočástic

(např.

dextranem)

je

aplikace

léčby

tumorových

onemocnění metodou magnetické hyperthermie (Chan et al., 1993). Nabízí se možnost léčby tumorů uměle indukovanou hyperthermií s úmyslem zahřát maligní buňky a nepoškodit buňky zdravé. Metoda magnetické hyperthermie je založena na vystavení magnetických nanočástic účinku střídavého magnetického pole o určité síle a frekvenci. Po aplikaci účinku magnetického pole se příslušné nanočástice rozkmitají, zahřejí a dojde k nekróze příslušného tumoru. Jelikož jsou tumorové buňky velice citlivé k teplotám nad 42°C po dobu působení asi 30 minut, je žádoucí působení nanočástic, které jsou výborným zdrojem tepla a tudíž se vyznačují schopností zničit tumorové buňky. Za ideální teplotu hyperthermie je považována teplota v rozmezí 43 – 45°C (Kuznetsov et al., 2002). Bezprostřední výhodou je, že metoda magnetické hypethermie nepoškozuje zdravé okolní buňky, což je velmi důležité z hlediska bioaplikací. Opět je nutné zdůraznit, že popsaná metoda je vhodná a účinná pro léčbu velmi malých začínajících tumorů.

- 44 -

3. Materiál a metody 3.1. Materiál Avidin z vaječného bílku a hovězí trypsin (BT) byly získány od firmy MP Biomedicals (Aurora, OH, USA). 3-aminopropyltriethoxysilan, celulosa, hydrochlorid benzamidinu, N-benzoyl-DL-arginin-4-nitroanilid (BAPNA), 1,4-butandiol diglycidyl ether, chitosan (LMW, 75-85% deacetylace), -, - a -cyklodextrin, dimethylsulfoxid, hydrochlorid EDC, sulfo-NHS, GA, hydrogenuhličitan amonný, hydrochinon, jodistan sodný,

hydrochlorid

kadaverinu,

kyselina

jodistá,

kyanoborohydrid

sodný

a

tetraethylorthosilikát byly zakoupeny od firmy Sigma-Aldrich (Steinheim, Německo). MALDI matrice -kyano-4-hydroxy skořicová kyselina a sinapová kyselina od firmy Bruker Daltonik (Bremen, Německo). Chemikálie pro SDS-PAGE byly získány od firmy Bio-Rad (Hercules, CA, USA). Bakterie Magnetospirillum gryphiswaldense, kmen MSR-1 (DSM 6361), byla z německé sbírky mikroorganismů a buněčných kultur (Brunswick,

Německo).

Biotinylovaná

činidla

sulfosukcinimidyl-6-[biotinamido]-6-

hexanamidohexanoát (NHS-LC-LC-biotin) a hydrazid biotinu byly od firmy GeneTiCA (ČR). Nanočástice magnetitu byly připraveny ve spolupráci s Regionálním centrem pokročilých technologií a materiálů – RCPTM UP v Olomouci (http://www.rcptm.com/).

3.2. Příprava a modifikace magnetických mikro- a nanočástic oxidů železa 3.2.1. Příprava biogenního magnetitu modifikovaného chitosanem Nanočástice biogenního magnetitu (MNPs) byly izolovány z magnetosomů bakterie

Magnetospirillum

fosfolipidové

membrány.

gryphiswaldense Kultivace

MSR-1

uvedeného

s

následným

kmenu

byla

odstraněním

provedena

za

mikroaerobních podmínek ve fermentoru o objemu 10 l (Heyen & Schüler, 2003). Po kultivaci následovala izolace magnetosomů, byl upraven starší postup (Grunberg et al., 2004). Po izolaci magnetosomů byla odstraněna fosfolipidová membrána pomocí detergentu SDS. Suspenze magnetosomů (1 mg.ml-1 v deionizované vodě) byla posbírána magnetickým separátorem (NdFeB) a resuspendována v 1 ml 1% SDS a inkubována 0,5 h při 98°C. Magnetické nanočástice byly separovány na dno zkumavky, byl odstraněn supernatant a opět napipetován 1 ml 1% SDS, směs byla vložena na 15 minut do ultrazvuku a poté inkubována opět 0,5 h při 98°C. Magnetická část byla separována pomocí vnějšího magnetického pole a pětkrát promyta deionizovanou vodou. Výsledné MNPs byly resuspendovány v deionizované vodě. Povrch nanočástic magnetitu byl modifikován biopolymerem chitosanem (Belessi et al., 2008), který

- 45 -

poskytuje amino (-NH2) a hydroxy (-OH) skupiny využitelné pro imobilizaci proteinů. Zároveň stabilizuje danou strukturu a jsou sníženy mezičásticové interakce. MNPs (separovány magneticky z 20 ml suspenze) byly resuspendovány v 19 ml 1% CH3COOH. K magnetické suspenzi byl napipetován 1 ml 1% chitosanu rozpuštěného v 1% CH3COOH, suspenze byla vložena do ultrazvuku po dobu 15 minut. Následovala inkubace reakční směsi za stálého míchání (300 rpm) 1 h při laboratorní teplotě, aby došlo k obalení (adsorpci biopolymeru) povrchu nanočástic. Suspenze byla pomalu přikapávána do prostředí 50 ml 1 mol.l-1 NaOH. Nakonec byly MNPs magneticky separovány a resuspendovány ve 20 ml deionizované vody.

3.2.2. Příprava syntetických nanočástic magnetitu modifikovaných chitosanem Magnetické nanočástice (Fe3O4) modifikované biopolymerem chitosanem byly připraveny dvoukrokovou syntézou. V prvním kroku byly připraveny syntetické nanočástice magnetitu (RPL) termicky indukovanou reakcí v pevné fázi z komerčního prekurzoru nazývaného BAYFERROX 110. Jedná se o anorganický pigment známý jako železitá červeň (-Fe2O3, hematit). Syntéza probíhala 150 minut v atmosféře vodíku (1 bar) v peci při teplotě 250°C (Cornell & Schwertmann, 2003). Průběh reakce znázorňuje

obr.

24.

V

druhém

kroku

byly

získané

nanočástice

magnetitu

funkcionalizovány biopolymerem chitosanem (Lee et al., 2005). 2 g nanočástic magnetitu byly suspendovány ve 40 ml deionizované vody. Vzniklá suspenze byla vložena do ultrazvuku a inkubována 30 minut při 60°C. Následně byl připraven 1% roztok chitosanu v prostředí 2% CH3COOH za neustálého míchání a zahřát na 60°C. K magnetické suspenzi bylo přidáno 5 ml chitosanu a směs byla vložena do ultrazvuku po dobu 30 minut. Poté byla provedena magnetická separace nanočástic a došlo k vymytí nenavázaného chitosanu. Vodná suspenze byla pomalu přikapávána do prostředí 200 ml 10% NaHCO3 za neustálého míchání. Suspenze byla několikrát promíchána, tím došlo k vysrážení chitosanu a cílené modifikaci povrchu nanočástic. Nakonec byla suspenze nanočástic třikrát promyta deionizovanou vodou a připravena pro příslušné bioaplikace. 250 °C; 150 minut alfa-Fe2O3

H2

Fe3O4

Obr. 24. Schéma syntézy magnetických nanočástic získaných termicky indukovanou reakcí z výchozího materiálu BAYFERROX 110.

- 46 -

3.2.3. Příprava silanizovaných syntetických nanočástic magnetitu Povrch

nanočástic

magnetitu

RPL

získaných

termickým

rozkladem

BAYFERROXU 110 (kap. 3.2.2.) byl modifikován silanizací. Jako silanizační činidla byl použit tetraethylorthosilikát (TEOS) a 3-aminopropyltriethoxysilan (APTES). Uvedená silanizační činidla poskytují povrchu nanočástic -NH2 skupiny pro následnou imobilizaci biokomponent. Nejprve byl povrch magnetických nanočástic modifikován s použitím TEOSu tzv. sol-gelovou metodou, koncentrace částic byla zvolena 8 mg.ml-1 a modifikace probíhala za neustálého míchání 24 h při laboratorní teplotě. Po promytí nanočástic ethanolem následovala funkcionalizace pomocí 0,2% APTESu. Reakce probíhala 18 h při laboratorní teplotě. Po skončení reakce byly nanočástice gradientově (H2O/EtOH) promyty pro zabránění flokulace. Výsledné silanizované nanočástice byly uchovávány v prostředí 0,1 mol.l-1 fosfátového pufru (KPB), pH 7.

3.2.4. Enkapsulace nanočástic magnetitu do prostředí celulosy Enkapsulace magnetických nanočástic RPL do celulosové matrice byla provedena sol-gel metodou podle publikovaného postupu (Luo et al., 2009). Zvolená celulosa obsahuje diolové uspořádání následně využitelné po oxidaci pro imobilizaci proteinů. Celulosa byla rozpuštěna ve směsi NaOH:(NH2)2CO:H2O v hmotnostním poměru 7:12:81. K 16 ml daného roztoku vychlazeného na -12°C bylo postupně za neustálého míchání (1200 rpm) přidáváno 0,64 g celulosy za vzniku průsvitného vysoce viskózního roztoku. Ke vzniklému roztoku celulosy bylo následně přidáno 0,32 g magnetických nanočástic RPL, výsledná směs byla intenzivně dispergována na hrotovém dispergátoru. Potom bylo ke směsi postupně přikapáváno 100 ml parafínového oleje s obsahem povrchově aktivní látky SPAN 80. Výsledná směs byla míchána 15 hodin při laboratorní teplotě. Po uplynutí doby inkubace byl přítomný hydroxid sodný neutralizován koncentrovanou HCl, poté byla směs ještě míchána 1 h při laboratorní teplotě. Následovala centrifugace 5 minut při 7700 rpm. Po centrifugaci byla směs rozdělena do čtyř fází: první fáze na dně centrifugační zkumavky obsahovala enkapsulované magnetické mikročástice, druhá fáze SPAN 80, třetí fáze byla tvořena nemagnetickými celulosovými částicemi a čtvrtá fáze byla tvořena parafínovým olejem. Výsledkem přípravy jsou tedy mikrometrické částice magnetitu enkapsulované v celulosové matrici (CMM). Vzniklé celulosové mikročástice byly magneticky odseparovány a svrchní tři fáze byly opatrně odstraněny. Následovalo promytí acetonem a deionizovanou vodou. Magnetické mikročástice byly skladovány při 4°C v prostředí deionizované vody.

- 47 -

3.3.

Chemické modifikace hovězího trypsinu

3.3.1. Glykace trypsinu prostřednictvím cyklodextrinů Pro chemickou modifikaci lysinových zbytků v molekule trypsinu lze použít aldehydy, respektive polyaldehydy, které vznikají oxidací sacharidů jodistanem sodným nebo kyselinou jodistou. Příslušné polyaldehdy reagují s primární -aminoskupinou lysinu a N-koncovou -NH2 skupinou za vzniku odpovídajících derivátů (Šebela et al., 2006). Chemická modifikace trypsinu byla provedena s využitím cyklických oligosacharidů - cyklodextrinů. Oxidace cyklodextrinů -, - a - (0,75 mmol) byla provedena ve 40 ml deionizované vody jodistanem sodným (4,95; 5,75 a 6,6 mmol). Vzniklé roztoky byly inkubovány 24 h ve tmě při laboratorní teplotě. Po inkubaci byl nezreagovaný jodistan sodný odstraněn přídavkem 2 ml BaCl2. 2H2O (2,5 mmol) za vzniku sraženiny, která byla odstraněna filtrací. Následně byla provedena modifikace trypsinu vzniklými polyaldehydy. Hovězí trypsin (75 mg) byl rozpuštěn v 15 ml 0,25 mol.l-1 KPB, pH 7,8 obsahujícího 10 mmol.l-1 benzamidin, což je kompetitivní inhibitor trypsinu, který brání nežádoucí autolýze. K dané směsi bylo napipetováno 6,52 ml příslušného polyaldehydu a výsledná směs byla inkubována 60 minut při laboratorní teplotě. Pro stabilizaci vzniklého produktu následovala redukce Schiffovy báze přídavkem 8,1 ml 160 mmol.l-1 kyanoborohydridu sodného. Výsledná směs byla promíchána a inkubována 24 h při laboratorní teplotě. Po inkubaci byla provedena dialýza modifikovaného trypsinu proti 0,1% HCOOH při 4°C z důvodu odstranění nezreagovaného činidla a benzamidinu. V oblasti kyselé hodnoty pH je potlačena autolýza trypsinu. Vzniklé konjugáty trypsinu byly zahuštěny v ultrafiltrační cele Amicon s použitím filtru XM 10 na objem 8 ml. Nakonec byly trypsinové konjugáty lyofilizovány a uskladněny při teplotě -80°C.

3.3.2. Biotinylace trypsinu prostřednictvím aminoskupin Biotinylace trypsinu byla provedena s použitím činidla Sulfo-NHS-LC-LC-biotin (sulfosuccinimidyl-6-[biotinamido]-6-hexanamido hexanoát). Délka raménka činí 30,5 Å, přítomnost sulfoskupiny zajišťuje dobrou rozpustnost ve vodě, není tedy nutná přítomnost organických rozpouštědel, jako je DMSO nebo dimethylformamid. Principem biotinylace je reakce primárních aminoskupin (-NH2) a N-koncové -NH2 skupiny v molekule trypsinu s uvedeným činidlem. Schéma biotinylace trypsinu prostřednictvím aminoskupin ukazuje obr. 25. Biotinylační reakce s uvedeným činidlem je vhodné provádět v prostředí pufru, který neobsahuje komponenty s primárními -NH2 skupinami. Reakce probíhá v rozmezí hodnot pH 7-9 za vzniku amidové vazby. Obecně se používá 12x molární nadbytek biotinylovaného činidla pro proteiny o

- 48 -

koncentraci v rozmezí 2-10 mg.ml-1. K provedení biotinylační reakce byl nejprve připraven roztok trypsinu o koncentraci 2 mg.ml-1 v prostředí 50 mmol.l-1 KPB, pH 8 s obsahem 5 mmol.l-1 benzamidinu jako kompetitivního inhibitoru. Ke směsi bylo napipetováno 171 µl 10 mmol.l-1 příslušného biotinylačního činidla rozpuštěného v deionizované vodě. Výsledná směs byla inkubována po dobu 12 h na ledu. Po skončení reakce byla provedena dialýza v prostředí 0,1% HCOOH při 4°C. Vzorky biotinylovaného BT byly skladovány při teplotě -80°C.

Obr. 25. Schéma biotinylace trypsinu prostřednictvím aminoskupin s využitím biotinylovaného činidla Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin.

3.4. SDS-PAGE Po chemické modifikaci trypsinu dochází ke zvýšení jeho molekulové hmotnosti. K ověření molekulové hmotnosti modifikovaného trypsinu byla prováděna SDS-PAGE. K analýze se využívalo diskontinuálního systému se 4% zaostřovacím a 12% dělícím polyakrylamidovým gelem (Laemmli, 1970). Separované proteiny byly vizualizovány barvením pomocí Coomassie Brilliant Blue R-250. Jako komerční standard molekulových hmotností pro SDS-PAGE byla použita následující směs: fosforylasa b z králičího svalu, 97 kDa; hovězí sérový albumin, 66 kDa; ovalbumin z vaječného bílku, 45 kDa; hovězí karboanhydrasa, 30 kDa; sojový trypsinový inhibitor, 20,1 kDa; laktalbumin z kravského mléka, 14,4 kDa.

- 49 -

3.5.

Stanovení molekulové hmotnosti proteinů pomocí MALDI-TOF MS Pro přesné stanovení molekulové hmotnosti trypsinu a jeho konjugátů

posloužila MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie. Jako matrice byla zvolena sinapová kyselina (SA) s přípravou vzorku v provedení tenké vrstvy (Vorm et al., 1994). Metoda je založena na ionizaci analytu smíseného s matricí po laserové desorpci v iontovém zdroji hmotnostního spektrometru (zkratka MALDI – z angl. „Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization“). Ionizace vede k tvorbě jednonásobně nabitých iontů, které jsou analyzovány hmotnostním analyzátorem na základě doby letu ve vakuové trubici (TOF, angl. „Time-of-Flight“). Výsledná naměřená hodnota iontu (m/z) je potom rovna skutečné molekulové hmotnosti stanovovaného proteinu, která je v případě použití pozitivního modu ionizace zvýšená o hmotnost protonu – [M+H]+ (Hardouin, 2007). Na MALDI destičku (Anchorchip 600/96) bylo nejprve napipetováno 0,5 µl roztoku SA (10 mg.ml-1) v acetonu, kapka byla ponechána spontánně vysušit při laboratorní teplotě za vzniku tenké vrstvy krystalů matrice. Pro určení molekulové hmotnosti trypsinu a jeho konjugátů s cyklodextriny (ACD-BT, BCD-BT, GCD-BT) či biotinylované formy (BT-B) byl 1 μl roztoku enzymu (10 mg.ml-1 v 0,1% HCOOH) smíchán se 3 μl SA (10 mg.ml-1 v 0,1 % kyselině trifluoroctové / acetonitrilu, 1:1, v/v). Na již vzniklou vrstvu SA na MALDI destičce bylo napipetováno 0,6 μl příslušné směsi a kapka byla vysušena při laboratorní teplotě. Hmotnostní spektra byla měřena na hmotnostním spektrometru Microflex LRF20 v lineárním módu pro pozitivní ionty s dusíkovým laserem (λ = 337 nm) o pulsní frekvenci 10 Hz. Externí kalibrace byla provedena pomocí molekulových iontů BSA, myoglobinu a cytochromu c. Výsledná hmotnostní spektra, která byla získána z více než 100 jednoduchých laserových impulsů, byla softwarově sečtena a upravena (vyhlazena) pomocí filtru Savitzky-Golay.

3.6. Imobilizace trypsinu na magnetické nosiče 3.6.1. Glutaraldehydová metoda Pokud je k dispozici povrch magnetických nosičů modifikovaný aminoskupinou, je možné využít glutaraldehydovou metodu, při níž se nejčastěji používá 1-10% vodný roztok GA. Toto aktivační činidlo nejprve reaguje svou první -CHO skupinou s aminoskupinami nosiče, druhá -CHO skupina se využívá pro reakci s -NH2 skupinami proteinu. Často se provádí redukce vzniklé Schiffovy báze borohydridem nebo kyanoborohydridem

sodným.

Jako

magnetický

nosič byly

zvoleny

syntetické

nanočástice RPL připravené v laboratoři a upravené silanizací (TEOS, APTES). K 5 mg magnetických nanočástic v mikrozkumavce bylo napipetováno 200 µl 0,05 mol.l-1

- 50 -

KPB, pH 7, a suspenze částic byla vložena do ultrazvuku po dobu 5 minut. Přebývající pufr byl odstraněn a k nanočásticím bylo napipetováno 300 µl 5% GA jako aktivačního činidla. Aktivace povrchu částic probíhala 4 h za neustálého třepání na rotační třepačce [nastavení: Orbital (rpm) 35; 10 s; Reciprocal (deg.) 60°; 10 s; Vibro/pause/ 5°; 5 s] při laboratorní teplotě. Po uplynutí doby inkubace byly nanočástice separovány prostřednictvím vnějšího magnetického pole (NdFeB) na dno mikrozkumavky, nenavázaný GA byl odpipetován a nanočástice byly třikrát promyty promývacím pufrem (0,1 mol.l-1 KPB, pH 7). K promytým nanočásticím bylo napipetováno 300 µl roztoku nativního trypsinu (2 mg.ml-1 v 0,1% HCOOH). Imobilizace probíhala 12 h při 4°C za neustálého třepaní. Po 12 hodinách byl odstraněn nenavázaný trypsin a nanočástice byly třikrát promyty promývacím pufrem. Imobilizace trypsinu byla potvrzena spektrofotometrickým stanovením jeho aktivity. Vzorky byly skladovány v prostředí 0,1% HCOOH při teplotě 4°C. Glutaraldehydová metoda byla také zvolena pro imobilizaci dalších proteinů, jako je avidin, hrachová aminoxidasa a křenová peroxidasa.

3.6.2. Karbodiimidová metoda Nativní trypsin a jeho glykované konjugáty byly kovalentně imobilizovány na povrch bakteriálních MNPs modifikovaných chitosanem s použitím EDC a sulfo-NHS jako aktivačních činidel. Příslušná aktivační činidla jsou vhodná pro tvorbu kovalentní vazby mezi -COOH a -NH2 skupinou. Jelikož trypsinové konjugáty obsahují na řadě svých -aminoskupin v lysinu sacharidové komponenty, byla zvolena metoda karbodiimidová. K 10 mg MNPs bylo přidáno 2,5 mg EDC, 3 mg sulfo-NHS a 1,5 ml 0,05 mol.l-1 KPB, pH 7. Následoval přídavek 2,5 mg trypsinu nebo jeho konjugátů. Výsledná směs byla mírně třepána na rotační třepačce [Orbital (rpm) 35; 10 s; Reciprocal (deg.) 60°; 10 s; Vibro/pause/ 5°; 5 s] 12 h při 4°C. Po imobilizaci byly MNPs magneticky separovány (NdFeB) na dno mikrozkumavky, byla odpipetována nezreagovaná aktivační činidla a zbytek enzymu, částice byly pětkrát promyty promývacím pufrem. Imobilizovaný trypsin byl resuspendován v 0,1% HCOOH a skladován při 4°C. Navázání trypsinu bylo ověřeno spektrofotometrickým stanovením jeho aktivity.

3.6.3. Epoxidová metoda Pro magnetické nosiče modifikované hydroxy (-OH), thiolovými (-SH) nebo amino (-NH2) skupinami lze také využít aktivační činidla obsahující na svých koncích epoxidovou skupinu. Reakce je závislá na reakčních podmínkách, především na

- 51 -

hodnotě pH. Pro tyto účely se používá bisoxiran např. 1,4-butandiol diglycidyl ether (BDE) (Oakey & Mulcahy, 2004). Jako magnetický nosič byly zvoleny syntetické nanočástice RPL modifikované biopolymerem chitosanem. K 5 mg magnetických nanočástic v mikrozkumavce bylo napipetováno 400 µl 3% roztoku BDE jako aktivačního činidla. Výsledná směs byla třepána na rotační třepačce [Orbital (rpm) 35; 10 s; Reciprocal (deg.) 60°; 10 s; Vibro/pause/ 5°; 5 s] 3 h při laboratorní teplotě. Po uplynutí doby inkubace byly nanočástice separovány magnetem (NdFeB) na dno mikrozkumavky, aby došlo k odstranění nenavázaného BDE a částice byly třikrát promyty promývacím pufrem. K promytým částicím bylo napipetováno 500 µl nativního trypsinu (1,5 mg.ml-1 v 0,1 KPB, pH 7). Kovalentní imobilizace probíhala 12 h při 4°C. Po imobilizaci byl odpipetován nenavázaný trypsin a částice byly třikrát promyty. Aktivita imobilizovaného trypsinu byla stanovena spektrofotometricky a vzorky byly skladovány v prostředí 0,1% HCOOH při 4°C.

3.6.4. Jodistanová metoda U magnetických nosičů modifikovaných sacharidovou komponentou s diolovým uspořádáním se nabízí využití oxidace, která vede ke vzniku -CHO skupin využitelných pro imobilizaci proteinů. Principem je reakce -CHO skupin s -NH2 skupinami proteinů za vzniku Schiffovy báze, která se následně redukuje, aby byl výsledný produkt stabilnější. Jinou možností po oxidaci sacharidové složky je biotinylace povrchu částic specifickým biotinylovaným činidlem, které reaguje s -CHO skupinami nosiče. Následuje specifické navázání avidinu nebo streptavidinu a nakonec připojení biotinylovaného proteinu (např. trypsinu). Předpokládanou výhodou je, že výsledný produkt je imobilizován ve větší vzdálenosti od povrchu což zajišťuje omezení sterických zábran pro požadovanou reakci. Povrch magnetických mikročástic modifikovaných celulosou CMM byl nejprve aktivován jodistanem sodným. K 5 mg CMM bylo napipetováno 500 µl 10 mmol.l-1 jodistanu sodného jako oxidačního činidla, aktivace celulosového povrchu mikročástic probíhala 12 h ve tmě při laboratorní teplotě. Po oxidaci celulosy byl odstraněn nezreagovaný

jodistan

sodný

a

mikročástice

byly

třikrát

promyty

studenou

deionizovanou vodou. Jako biotinylované činidlo specifické pro reakci se sacharidy byl zvolen hydrazid biotinu, délka raménka činí 15,7 Å. Činidlo je nutné rozpouštět v organickém rozpouštědle DMSO. Reakce by měla probíhat v prostředí pH hodnot 4-6. Po reakci dochází ke vzniku hydrazonové vazby. Po oxidaci celulosy bylo k promytým mikročásticím napipetováno 150 μl 10 mmol.l-1 hydrazid biotinu a 150 μl 0,05 mol.l-1 KPB, pH 6. Výsledná směs byla třepána na rotační třepačce [Orbital (rpm) 35; 10 s; Reciprocal (deg.) 60°; 10 s; Vibro/pause/ 5°; 5 s] 12 h při laboratorní teplotě. Po 12 h

- 52 -

bylo nadbytečné činidlo odstraněno, mikročástice byly třikrát promyty promývacím pufrem, následoval přídavek 300 μl avidinu (0,5 mg.ml-1 v 0,05 mol.l-1 KPB, pH 6), mikročástice byly třepány 12 h při teplotě 4°C. Poté byl nenavázaný avidin odstraněn, mikročástice byly třikrát promyty a nakonec byl připojen biotinylovaný trypsin. Magnetické mikročástice s biotinylovaným trypsinem byly skladovány v prostředí 0,1% HCOOH v lednici. Pro srovnání byl imobilizován i nativní trypsin, jehož –NH2 skupiny reagují s přítomnými –CHO skupinami, vzniklými po oxidaci celulosového povrchu daných částic.

3.6.5. Bioafinitní interakce Jestliže máme k dispozici povrch magnetických nosičů modifikovaný avidinem, streptavidinem nebo biotinylační značkou, lze využít velmi specifické interakce biotinavidin, jedná se o jednu z nejpevnějších nekovalentních vazeb (KD  10-15 mol.l-1). Nanočástice biogenního magnetitu MNPs byly použity pro imobilizaci avidinu a následného připojení biotinylovaného trypsinu. K 10 mg MNPs bylo napipetováno 300 μl 5% GA, aby došlo k aktivaci -NH2 skupin povrchu nanočástic. Výsledná směs byla inkubována 3 h za neustálého třepání na rotační třepačce [Orbital (rpm) 35; 10 s; Reciprocal (deg.) 60°; 10 s; Vibro/pause/ 5°; 5 s] při laboratorní teplotě. Poté byl nenavázaný GA odstraněn, MNPs byly třikrát promyty promývacím pufrem a následoval přídavek 200 μl avidinu (0,2 mg.ml-1 v 0,05 mol.l-1 KPB, pH 7,5). Výsledná směs byla třepána 8 h při 4°C, poté byl nadbytek avidinu odstraněn, MNPs byly promyty třikrát promývacím pufrem a poté bylo přidáno 200 μl biotinylovaného trypsinu (1 mg.ml-1 v 0,1% HCOOH). Směs byla opět třepána 12 h při 4°C. Nakonec byl odstraněn nenavázaný biotinylovaný trypsin, MNPs byly třikrát promyty a skladovány v kyselém prostředí při 4°C. Navázání biotinylovaného trypsinu bylo potvrzeno stanovením jeho aktivity.

3.7. Charakterizace magnetických částic 3.7.1. Superconducting QUantum Interference Device - SQUID Magnetické chování částic je způsobeno povrchovými jevy a jevy spojenými s konečným

rozměrem

částic.

Konečné

magnetické

chování

je

ovlivněno

mezičásticovými interakcemi, pórovitostí, defekty a uspořádáním vakancí v dané struktuře částic (Tuček et al., 2006). Tyto popsané jevy redukují výsledné hodnoty saturační magnetizace. Povrch magnetických částic se modifikuje organickou nebo anorganickou vrstvou. Po úspěšné modifikaci povrchu částic dochází ke změně výsledného magnetického chování částic, které je způsobeno hlavně změnou

- 53 -

mezičásticových interakcí. Změny v magnetickém chování můžeme pozorovat u hysterezních smyček změnou hodnot maximální magnetizace a samotným průběhem hysterezních křivek. Pokud je povrch částic modifikován diamagnetickou látkou lze ze změny magnetizace nepřímo určit zastoupení samotné nemodifikované částice v hmotnostní jednotce našeho modifikovaného systému (Belessi et al., 2008). Magnetické mikro- a nanočástice oxidů železa byly podrobeny stanovení saturační magnetizace MS. Měření bylo provedeno u nemodifikovaných částic, u částic s funkcionalizovaným povrchem a následně s imobilizovaným proteinem. Jedním z důležitých požadavků měření je, aby vzorky byly v dokonale vysušeném stavu. Magnetické částice byly vysušeny 24 h při laboratorní teplotě. Hysterezní smyčky a příslušné hodnoty MS byly získány měřením na přístroji Superconducting QUantum Interference Device (SQUID, MPMS XL-7, Quantum Design), na obr. 26. Měření magnetických vlastností bylo provedeno při teplotách 5 a 300 K a realizováno v prostředí vnějšího magnetického pole (-7) – (+7) T.

Obr. 26. Superconducting QUantum Interference Device (SQUID, MPMS XL-7, Quantum Design).

3.7.2. Transmisní a skenovací elektronová mikroskopie Velikost částic a jejich morfologie je hodnocena pomocí transmisní elektronové mikroskopie (TEM, angl. „Transmission Electron Microscopy“). Hodnota rozlišovací schopnosti přístroje je kolem 0,2 nm. Provádí se studium hlavně krystalických materiálů, kdy se kontrast zvyšuje orientací objektu tak, že se vlastně zobrazují sloupce několika atomů ve směru optické osy. Připravený vzorek musí být velmi tenký a umístěný ve vakuu. Kontrastu je dosaženo především u biologických vzorků s využitím elektrondensních kontrastních látek. Tyto kontrastní látky obsahují těžké kovy, které místně absorbují nebo rozptylují elektrony, čímž jsou odstraněny ze svazku při

- 54 -

jeho průchodu vzorkem. TEM snímky se vyznačují rozlišením okolo 2 nm (Alberts et al., 2002). Morfologické vlastnosti a velikost magnetických nemodifikovaných nanočástic, částic s upraveným povrchem a následně imobilizovaným proteinem byla zhodnocena pomocí transmisní elektronové mikroskopie. TEM analýza byla provedena s využitím mikroskopu JEM 2010 s urychlovacím napětím 200 kV (obr. 27A). Vzorky byly dispergovány v prostředí 0,1 mol.l-1 KPB, pH 7. Výsledná suspenze byla na 15 minut umístěna do ultrazvuku. Malá kapka ředěné suspenze byla umístěna na pouhlíkovanou měděnou mřížku (obr. 27B) a ponechána vysušit při laboratorní teplotě. Skenovací

elektronová

mikroskopie

(SEM,

angl.

„Scanning

Electron

Microscopy“) se využívá k zobrazení velikosti, tvaru a pro povrchovou topografii příslušného vzorku. Skenující elektronový mikroskop je přístroj určený k analýze povrchů nejrůznějších objektů. Analýza povrchu mikro- a nanočástic byla provedena na skenovacím elektronovém mikroskopu Hitachi SU 6600 při urychlovacím napětí 5 a 15 kV (obr. 28). Vzorky částic byly naneseny na hliníkové podložní kolečko, které na sobě obsahuje nalepenou oboustrannou uhlíkovou lepicí pásku. Pro samotné měření byly vzorky ponechány vysušit při laboratorní teplotě. Nutno podotknout, že při vysychání může vzorek reagovat s okolním prostředím a může tak docházet k jeho oxidaci. Pomocí analytické techniky EDX (angl. „Energy-Dispersive X-ray spectroscopy“) lze stanovit i elementární složení vzorku.

A)

B)

Obr. 27. A) Transmisní elektronový mikroskop JEM 2010; B) pouhlíkovaná mřížka pro TEM analýzu.

- 55 -

Obr. 28. Skenovací elektronový mikroskop SU 6600.

3.8.

Stanovení aktivity, vazebné kapacity částic, teplotní stability a hodnoty pH optima trypsinu Trypsinová aktivita byla stanovena spektrofotometrickou metodou s využitím

umělého

chromogenního

substrátu

N-benzoyl-DL-arginin-4-nitroanilid

(BAPNA)

(Šebela et al., 2006). Příslušný substrát je hydrolyticky štěpen trypsinem za vzniku pnitroanilinu ( = 8270 1/mol.l-1.cm-1), který absorbuje při 405 nm. U stanovení aktivity imobilizovaného trypsinu bylo použito 20 μl suspenze příslušných částic v 0,1% HCOOH. Reakce probíhala 5 minut při teplotě 37°C. Po 60 sekundách byly vždy magnetické částice s imobilizovaným trypsinem magneticky separovány na dno kyvety a byla určena hodnota absorbance supernatantu za minutu. Pro volný trypsin a jeho konjugáty byla zjištěna i specifická aktivita. Koncentrace proteinů byla určena metodou Bradfordové (Bradford, 1976). Z důvodu zjištění množství trypsinu navázaného na magnetických nosičích byla stanovena vazebná kapacita magnetických materiálů, což je množství proteinu navázaného na uvedenou hmotnost nosiče. Ke stanovení koncentrace proteinů před a po imobilizaci byla zvolena metoda Bradfordové. Z rozdílných hodnot koncentrace proteinů před a po imobilizaci byla stanovena vazebná kapacita vztažena na 1 mg částic. Konkrétně byla vazebná kapacita určena ze vztahu (cv . Vv – cs . Vs) / m; kde cv a Vv je koncentrace a objem volného enzymu, cs a Vs je koncentrace a objem supernantantu po imobilizaci, m reprezentuje hmotnost nosiče. Jak je již známo, většina enzymů s rostoucí teplotou denaturuje a tedy ztrácí svou aktivitu. Jelikož se trypsin vyznačuje nízkou teplotní stabilitou, provádí se modifikace lysinů a argininů v molekule trypsinu a popřípadě zakotvení již termostabilnějšího trypsinu na magnetické nosiče. Teplotní stabilita nativního, modifikovaného a následně imobilizovaného trypsinu byla charakterizována při

- 56 -

teplotách 20 – 75°C. Alikvoty vzorků byly inkubovány 30 minut v prostředí 20 mmol.l-1 acetátového pufru, pH 5,25 při teplotách 20, 30, 37, 45, 55, 65 a 75°C. Po uplynutí doby inkubace následovalo prudké ochlazení v ledu a byla určena aktivita příslušných enzymů. Byla stanovena hodnota T50, což je teplota, při které si trypsin zachovává poloviční hodnotu své původní aktivity. Po imobilizaci může docházet ke změně hodnot pH optima nebo pro některé imobilizované enzymy bývá typické širší rozmezí optimální hodnoty pH pro danou reakci. Z toho důvodu byla stanovena hodnota pH optima volných a imobilizovaných enzymů. Stanovení probíhalo v prostředí BrittonRobinsonových pufrech v rozmezí hodnot pH 4,5 – 10,4.

3.9.

Stanovení operační a funkční stability trypsinu a stability při skladování V mírně alkalickém prostředí dochází ke vzniku autolytických štěpů trypsinu a

ke ztrátě části trypsinové aktivity. Důvodem stanovení stability bylo určit, jak dlouho vydrží nativní trypsin aktivní při laboratorní teplotě oproti modifikovaným a imobilizovaným trypsinům v různých časových intervalech. Alikvoty vzorků trypsinu byly inkubovány v prostředí 0,15 mol.l-1 Tris-HCl pufru, pH 8,5 v časech 0,5; 1; 1,5; 2; 4; 6; a 24 h při laboratorní teplotě. Po inkubaci v uvedených časech byla stanovena hodnota trypsinové aktivity a určena hodnota t50, což je čas, ve kterém si trypsin zachovává 50 % své původní aktivity. Chemická modifikace trypsinu a následná imobilizace na pevné nosiče by měla zlepšovat mimo jiné stabilitu enzymu při skladování. Konkrétně trypsin je vhodné skladovat v kyselém prostředí z důvodu zabránění nežádoucí autolýzy. Pro potvrzení zlepšení

stability

bylo

provedeno

měření

stability

při

skladování

nativního,

modifikovaného a imobilizovaného trypsinu. Stabilita při skladování byla určena stanovením zbytkové trypsinové aktivity v týdenních intervalech po dobu šesti týdnů. Volné a imobilizované trypsiny byly skladovány v prostředí 0,1% HCOOH při 4°C. Z ekonomického pohledu je jednou z hlavních výhod imobilizace enzymů možnost jejich opakovaného použití. Ke zjištění ztráty aktivity imobilizovaného enzymu po opakovaném použití byla určena operační stabilita daného systému. U imobilizovaných trypsinů byla stanovena zbytková aktivita po 8 cyklech. Po každém cyklu byl imobilizovaný trypsin magneticky separován, částice byly třikrát promyty 0,05 mol.l-1 KPB, pH 7. Následovalo další stanovení aktivity imobilizovaného trypsinu. Nakonec byla určena trypsinová zbytková aktivita po 8 cyklech použití.

- 57 -

3.10. MALDI-TOF

peptidové

mapování

(„peptide

mass

fingerprinting“, PMF) MALDI-TOF „peptide mass fingerprinting“ je analytická metoda sloužící k identifikaci proteinů. Při této metodě se využívají endopeptidasy, což jsou proteolytické enzymy štěpící uvnitř molekuly proteinu. Principem uvedené metody je proteolytické štěpení proteinu v roztoku nebo v gelu, následuje měření hmotnostních spekter peptidů v digestu. Výsledkem je soubor naměřených peptidových hmotností, který je využit k vyhledávání v proteinové databázi na principu srovnávání souboru experimentálních dat s počítačem generovanými soubory teoretických peptidových hmotností vycházejícími ze sekvencí proteinů v databázi. Trypsin se stal nejčastěji používanou proteasou pro uvedenou metodu. Byla

provedena

studie

účinnosti

štěpení

trypsinu

imobilizovaného

na

magnetických nanočásticích. Jako trypsinový magnetický systém byly použity bakteriální magnetické nanočástice MNPs s imobilizovanými trypsinovými konjugáty ACD-BT, BCD-BT, BT-B a syntetické nanočástice RPL modifikované chitosanem s navázaným trypsinem. Jako modelové proteiny byly zvoleny hovězí sérový albumin (Mr = 66 000), křenová peroxidasa (Mr = 40 000), slepičí lysozym z vaječného bílku (Mr = 14 600). Štěpení uvedených proteinů v roztoku bylo provedeno následujícím postupem. Nejprve byly magnetické částice (10 mg) suspendovány ve 4 ml 0,05 mol.l-1 NH4HCO3. Stejný pufr byl použit pro rozpuštění uvedených standardních proteinů 1000 pmol LYS (1,4 mg.ml-1), HRP (4 mg.ml-1) a BSA (6,6 mg.ml-1). Proteinové vzorky byly upraveny redukcí a následnou alkylací. Jako redukční činidlo byl zvolen 100 mmol.l-1 2merkaptoethanol a alkylace byla provedena pomocí 200 mmol.l-1 jodacetamidu. K roztoku příslušného proteinu bylo nejprve napipetováno 20 μl 100 mmol.l-1 2merkaptoethanolu, roztok byl povařen 10 minut při 70°C. Po ochlazení na laboratorní teplotu bylo přidáno 20 μl 200 mmol.l-1 jodacetamidu a vše inkubováno 30 minut ve tmě při laboratorní teplotě. Následoval přídavek 30 μl 2-merkaptoethanolu a inkubace 10 minut. Poté bylo přidáno 100 μl suspenze MNPs nebo RPL s imobilizovaným trypsinem (100 pmol) k 1 ml roztoku standardního proteinu. Výsledná směs byla inkubována při 37 nebo 50°C na vodní lázni po dobu 1-2 h. Po ukončení reakce byly magnetické částice odseparovány pomocí magnetického separátoru. Získaný supernatant (digest) byl přepipetován do nové čisté mikrozkumavky a přímo analyzován pomocí MALDITOF MS. Pro srovnání bylo provedeno i běžné štěpení proteinů v gelu. Nejprve byly proteinové standardy v množství 100 pmol separovány pomocí SDS-PAGE (10% separační a 4% koncentrační gel). Gely byly po skončení separace barveny Coomassie briliantovou modří a odbarveny destilovanou vodou. Následoval protokol

- 58 -

štěpení v gelu (Shevchenko et al., 2007) pomocí volného trypsinu modifikovaného rafinosou. Pro MALDI-TOF MS analýzu byla jako matrice použita -kyano-4hydroxyskořicová kyselina (CHCA) ve formě saturovaného roztoku v 50 % acetonitrilu / 0,1 % trifluoroctové kyselině (1:2, v/v). Nejprve bylo na MALDI terčík (Anchorchip, 600/96) (obr. 29A), napipetováno 0,6 l příslušného proteinového digestu a 0,6 l roztoku CHCA, vzniklá kapka byly vysušena při laboratorní teplotě. Hmotnostní spektra pozitivně nabitých iontů byla naměřena na spektrometru Microflex LRF20 (obr. 29B) v reflektronovém módu pro pozitivní ionty s dusíkovým laserem (λ = 337 nm) o pulsní frekvenci 10 Hz. Výsledná spektra byla shromažďována z dílčích spekter (100-200 laserových výstřelů), rozsah měřených hodnot m/z činil 500 – 4000. Kalibrace hmotnostního spektrometru byla provedena externě použitím směsi peptidových standardů (Bruker Daltonik). Vyhodnocení spekter bylo provedeno pomocí softwaru FlexAnalysis 2.4 a Biotools 3.0 (Bruker Daltonik) a porovnáno s externí databází proteinových sekvencí NCBInr pomocí programu Mascot Server 2.2 (Matrix Science, London, UK). Graficky byla spektra zpracována pomocí programů ACD/SpecViewer (Advanced Chemistry Development, Toronto, Canada) a OriginPro 7.5 (OriginLab, Northampton, MA, USA).

A)

B)

Obr. 29. A) MALDI terčík Anchorchip 600/96; B) MALDI-TOF hmotnostní spektrometr Microflex LRF20.

3.11. Příprava bioelekrod s využitím nanočástic magnetitu Magnetické nanočástice oxidů železa lze využít jako nosiče biokatalyzátorů pro následnou modifikaci elektrod na bázi uhlíkových past. Dalším důvodem použití nanočástic pro konstrukci elektrod biosensorů je jejich katalytický účinek pro rozklad peroxidu vodíku (Lin & Leu, 2005). Nejprve byla připravena nemodifikovaná elektroda z uhlíkové pasty (CPE), posléze následovala příprava modifikované elektrody z CPE s obsahem nanočástic

- 59 -

biogenního magnetitu obaleného biopolymerem chitosanem. Nakonec byla připravena modifikovaná elektroda s magnetickými nanočásticemi nesoucími imobilizované enzymy. Pro přípravu elektrody z nemodifikované CPE byl použit 1 g grafitového prášku a 1 g silikonového oleje, směs byla důkladně homogenizována 20 minut v třecí misce při laboratorní teplotě. Takto zhotovená pasta byla přenesena do skleněného elektrodového pouzdra a povrch elektrody byl vyhlazen. Výsledná elektroda z uhlíkové pasty byla skladována při teplotě 4°C. V dalším kroku bylo k CPE přidáno 15 % MNPs obalených chitosanem za vzniku modifikované CPE. Pro přípravu modifikované uhlíkové pasty s obsahem biokatalyzátorů byly na magnetické nanočástice MNPs (20 mg) kovalentně imobilizovány oxidoreduktasy, aminoxidasa izolovaná z desetidenních etiolovaných klíčků hrachu setého (Pisum sativum) – AO (0,23 mol.l-1) a křenová peroxidasa HRP (0,2 mol.l-1) s použitím 5% GA jako aktivačního činidla. Podrobný popis imobilizace za účasti GA je uveden v kapitole 3.6.1. Po navázání enzymů na magnetický nosič byla spektrofotometricky stanovena jejich aktivita (Stevanato et al., 1990). Jako substráty byly zvoleny kadaverin pro AO a hydrochinon pro HRP (oba 1 mmol.l-1). Schéma reakce katalyzované AO a HRP je na obr. 30. U volných a imobilizovaných enzymů byly stanoveny kinetické parametry. K tomu účelu byl pro AO zvolen jako substrát kadaverin v rozmezí koncentrací 0,025 – 1 mmol.l-1 a pro HRP hydrochinon v rozmezí 0,01 – 1,5 mmol.l-1. Všechny typy elektrod z uhlíkové pasty byly charakterizovány cyklickou voltametrií a chronoamperometrií. Z morfologického pohledu a velikosti byly MNPs s imobilizovanými enzymy podrobeny TEM analýze. AO

RCH2NH2 + H2O + O2 H2O2 + H2Q

RCHO + H2O2 + NH3

HRP

2 H2O + Q

Obr. 30. Schéma reakce katalyzované AO a HRP imobilizovanými na magnetických nanočásticích (Vianello et al., 2007).

3.11.1. Cyklická voltametrie a chronoamperometrie Charakterizace studovaných elektrod byla provedena cyklickou voltametrií a chronoamperometrií. Cyklická voltametrie se řadí mezi speciální elektrochemické techniky, které jsou často využívány při vývoji a optimalizaci elektrochemických biosensorů.

Jedná

se

o

jednu

z

nejrozšířenějších

technik

pro

studium

elektrochemických systémů a pro zisk kvalitativních informací o elektrochemické

- 60 -

reakci. Výsledkem voltametrie je křivka závislosti proudu na napětí tzv. cyklický voltamogram. Pomocí chronoamperometrie můžeme dostat informace o přechodných elektrodových jevech po skokové změně pracovního potenciálu (Skládal, 2002). Nejprve byla provedena cyklická voltametrie pro systém nemodifikovaná CPE, jako pracovní prostředí byl zvolen 0,1 mol.l-1 KPB, pH 7, a potenciál v rozmezí -0,8 až 0,8 V. Bylo provedeno měření bez přídavku H2O2, poté následovaly přídavky, kde výsledná koncentrace H2O2 v pracovní nádobce byla 3 a 6 mmol.l-1. Stejný postup byl aplikován pro modifikovanou CPE s obsahem magnetických nanočástic. Pro systém CPE s imobilizovanými oxidoreduktasami byl zvolen potenciál v rozmezí -0,4 až 0,5 V a přídavky kadaverinu a hydrochinonu o výsledné koncentraci v pracovní nádobce 0,1 mmol.l-1. Měření bylo provedeno v elektrochemické nádobce o objemu 5 ml v tříelektrodovém

uspořádání:

referentní

argentchloridová

elektroda/pracovní

CPE/pomocná Pt elektroda. Chronoamperometrie pro systémy CPE a modifikovaná CPE byla provedena v prostředí 0,1 mol.l-1 KPB, pH 7. Měření bylo provedeno pro kladnou (0,8 V) a zápornou (-0,1 V) hodnotu potenciálu nastaveného na pracovní elektrodě. V případě použití modifikované CPE s imobilizovanými oxidoreduktasami AO a HRP byl zvolen na pracovní elektrodě potenciál -0,2 V. Vlastnosti připravené elektrody byly zhodnoceny stanovením hodnot limitu detekce biosensoru (LOD), citlivosti elektrody a elektrického šumu. Zpracování cyklických voltamogramů a kalibračních křivek bylo provedeno pomocí programu SigmaPlot (verze 10.0; Jandel Scientific, San Rafael, CA).

- 61 -

4. Výsledky a diskuse 4.1. Stanovení molekulové hmotnosti modifikovaného trypsinu Hovězí trypsin byl chemicky modifikován cyklodextriny, které byly aktivovány jodistanovou metodou za vzniku příslušných polyaldehydů. Následovala reakce vzniklých polyaldehydů s molekulou trypsinu. Nakonec byla provedena dialýza, zahuštění a lyofilizace vzniklých konjugátů trypsinu (ACD-BT, BCD-BT a GCD-BT). Další provedenou modifikací byla biotinylace trypsinu prostřednictvím aminoskupin, jako biotinylační činidlo byla zvolena látka sulfo-NHS-LC-LC-Biotin. Molekulová hmotnost vzniklých konjugátů byla odhadnuta pomocí SDS-PAGE a přesně stanovena měřením pomocí MALDI-TOF MS. Zjištěné hodnoty molekulových hmotností trypsinových konjugátů byly vždy porovnány s původním enzymem. Výsledky SDSPAGE jsou na obr. 31, ze kterého je zřejmé, že došlo ke zvýšení molekulové hmotnosti v porovnání s nativním enzymem. To ukazuje, že glykace nebo biotinylace nativního trypsinu byla úspěšná. Přesné určení molekulové hmotnosti bylo dosaženo pomocí MALDI-TOF MS s použitím sinapové kyseliny jako matrice v provedení tenké vrstvy. Pro BT byla zjištěna molekulová hmotnost 23,2 kDa. Pro trypsinové konjugáty byla naměřena vyšší molekulová hmotnost: 29,8 kDa (ACD-BT), 30,1 kDa (BCD-BT) a 31,1 kDa (GCD-BT). Nativní BT obsahuje celkem 15 aminoskupin (14 Lys a 1 N-koncová aminoskupina) využitelných k chemické modifikaci. Z literatury bylo zjištěno, že maximálně se takto podařilo modifikovat 9 aminoskupin (Šebela et al., 2009). Z naměřených dat v této práci vyplývá, že došlo k modifikaci 6-7 aminoskupin. U biotinylovaného trypsinu byla určena molekulová hmotnost 27,3 kDa. Po navázání biotinylační značky sulfo-NHS-LC-LC-Biotin na aminoskupinu proteinu dochází ke zvýšení molekulové hmotnosti o 452,6 Da, přičemž dochází k odštěpení sulfo-NHS.

- 62 -

STD

1

3

2

4

1‘

3

4

2‘

3‘

4‘

A)

B)

STD

1

2

5

6

Obr. 31. A) SDS-PAGE nativního trypsinu a jeho glykovaných konjugátů. STD (5 l, ↓ 97, 66, 45, 30, 20,1 a 14,4 kDa); (1) – BT (10 g) ; (2) – ACD-BT (3 g) ; (3) – BCD-BT (3 g) ; (4) – GCD-BT (3 g) ; (1‘) – BT (15 g) ; (2‘) – ACD-BT (5 g) ; (3‘) – BCD-BT (5 g) ; (4‘) – GCD-BT (5 g). B) SDS-PAGE trypsinu po reakci s biotinylačním činidlem sulfo-NHS-LC-LC-Biotin. STD (5 l, ↓ 97, 66, 45, 30, 20,1 a 14,4 kDa); BT (10 μg); (2) – BT-B (7,5 μg), (3) – BT-B (7,5 μg); (4) BT-B (10 μg); (5) BT-B (10 μg); (6) BT (7,5 μg).

- 63 -

4.2.

Charakterizace magnetických částic

4.2.1. SQUID U magnetického systému MNPs, RPL (Fe3O4-chitosan) a CMM (Fe3O4celulosa) byly určeny hodnoty saturační magnetizace MS při teplotách 5 a 300 K ve vnějším magnetickém poli v rozmezí (-7) – (+7) T a porovnány se saturační magnetizací příslušného systému s imobilizovaným proteinem. Z naměřených hodnot magnetizace M a z hodnot intenzity magnetického pole H byly získány hysterezní křivky. Nejprve bylo provedeno měření pro biogenní magnetit modifikovaný chitosanem a následovalo měření s trypsinovými konjugáty (ACD-BT, BCD-BT, GCD-BT) imobilizovanými na povrchu bakteriálních magnetických nanočástic. Výsledné hysterezní smyčky znázorňuje obr. 32A a 32B. Naměřené hodnoty saturační magnetizace při teplotách 5 a 300 K, koercivita a saturační remanentní magnetizace pro magnetický systém MNPs jsou shrnuty v tab. 2. Z naměřených výsledků saturační magnetizace při teplotách 5 a 300 K je zřejmé, že po imobilizaci trypsinových konjugátů došlo k poklesu hodnot MS. Z těchto výsledků je vidět, že MNPs obsahují více imobilizovaného enzymu ACD-BT a GCD-BT v porovnání s enzymem BCD-BT. Nejlepších výsledků bylo dosaženo pro systém Fe3O4-chitosan-GCD-BT. Nicméně, ostatní dva typy enzymů vykazují značný pokles hodnot saturační magnetizace, lze tedy konstatovat, že imobilizace trypsinových konjugátu na povrch bakteriálního magnetitu modifikovaného chitosanem byla úspěšná. V případě imobilizace avidinu na povrch MNPs bylo jeho navázání potvrzeno také pomocí SQUIDu, neboť avidin nevykazuje enzymovou aktivitu. Hysterezní smyčky pro systém Fe3O4-chitosan a Fe3O4-chitosan-avidin jsou na obr. 33. Z hysterezních křívek je zřejmé, že po navázání avidinu došlo ke snížení hodnoty saturační magnetizace. Naměřená data jsou uvedena v tab. 3. Další studie magnetizačního měření byla provedena pro systém RPL-chitosan s imobilizovaným nativním trypsinem. Naměřené hysterezní křivky ukazuje obr. 34. Z výsledků můžeme konstatovat, že imobilizace nativního trypsinu na chitosanový povrch syntetických nanočástic byla úspěšná. Nakonec následovalo magnetizační měření pro systém CMM s imobilizovaným nativním a biotinylovaným trypsinem při teplotě 300 K ve vnějším magnetickém poli v rozmezí (-7) – (+7) T a bylo porovnáno s enkapsulovaným Fe3O4 v prostředí celulosy. Výsledné hysterezní smyčky jsou na obr. 35. Získaná data z magnetizačního měření systémů RPL a CMM jsou shrnuta v tab. 4. Z magnetizačního měření lze určit, jak se po povrchové modifikaci nanočástic a po imobilizaci biokomponent mění magnetické vlastnosti daného materiálu. Ze všech výsledků lze konstatovat, že po navázání diamagnetické látky (proteinu) na magnetické

- 64 -

materiály došlo k poklesu hodnot Ms. Nedávná studie (Magro et al., 2012) popisuje pokles hodnoty saturační magnetizace po navázání glukosaoxidasy na nanočástice maghemitu. Změna průběhu hystrezních smyček odpovídá předcházejícím výsledkům s imobilizací trypsinu na magnetitové nanočástice (Li et al., 2007).

Obr. 32. A) Porovnání hysterezích smyček při teplotě 5 K. Systém bakteriální Fe3O4-chitosan (1); Fe3O4-chitosan-BCD-BT (2); Fe3O4-chitosan-ACD-BT (3); Fe3O4chitosan-GCD-BT (4). B) Porovnání hysterezích smyček při teplotě 300 K. Systém Fe3O4-chitosan (1); Fe3O4-chitosan-BCD-BT (2); Fe3O4-chitosan-ACD-BT (3); Fe3O4chitosan-GCD-BT (4).

Obr. 33. Porovnání hysterezních smyček při teplotě 300 K. Systém bakteriální Fe3O4-chitosan (červená) a Fe3O4-chitosan-avidin (modrá).

- 65 -

Tab. 2. Parametry hysterezích smyček vzorků Fe3O4-chitosan, Fe3O4-chitosanACD-BT,

Fe3O4-chitosan-BCD-BT

a

Fe3O4-chitosan-GCD-BT

měřených

při

+

teplotách 5 a 300 K. MS (+7 T) je maximální magnetizace při (+7 T), MS- (-7 T) je maximální magnetizace při (-7 T). HC+ reprezentuje pozitivní koercivitu a HC– negativní koercivitu. MR+ je pozitivní saturační remanentní magnetizace, MR– je negativní saturační remanentní magnetizace.

MS+ (+7 T)

MS- (-7 T)

HC+

HC-

MR+

MR-

 0.001

 0.001

 20

 20

 0.001

 0.001

(K)

(emu/g)

(emu/g)

(Oe)

(Oe)

(emu/g)

(emu/g)

5

80,84

-80,77

206

-207

18,45

-18,48

300

73,58

-73,18

8

-9

1,49

-1,44

5

53,45

-53,40

190

-191

16,13

-16,12

300

48,92

-48,75

11

-12

1,97

-1,87

5

75,43

-75,43

179

-180

16,59

-16,56

300

67,99

-68,01

7

-7

0,97

-1,02

5

31,39

-31,40

214

-215

10,08

-10,09

300

28,60

-28,60

-9

-16

1,92

-1,78

T Vzorek Fe3O4-chitosan Fe3O4-chitosanACD-BT Fe3O4-chitosanBCD-BT Fe3O4-chitosanGCD-BT

Tab. 3. Parametry hysterezních smyček vzorků Fe3O4-chitosan, Fe3O4-chitosanavidin měřených při teplotě 300 K.

Vzorek Fe3O4-chitosan Fe3O4-chitosanavidin

T

MS+ (+7 T)

MS- (-7 T)

HC+

HC-

MR+

MR-

(K)

(emu/g)

(emu/g)

(Oe)

(Oe)

(emu/g)

(emu/g)

300

66,17

-66,08

13,0

-14,0

2,11

-2,06

300

54,16

-54,26

13,0

-14,0

2,14

-2,05

- 66 -

Obr. 34. Porovnání hysterezních smyček při teplotě 300 K. Systém syntetické nanočástice Fe3O4-chitosan (a), Fe3O4-chitosan-trypsin (b).

Obr. 35. Porovnání hysterezních smyček při teplotě 300 K. Systém syntetické částice Fe3O4-celulosa (1), Fe3O4-celulosa-trypsin (2), Fe3O4-celulosa-biotinylovaný trypsin (3).

- 67 -

Tab. 4. Parametry hysterezních smyček vzorků syntetické Fe3O4-chitosan, Fe3O4chitosan-trypsin,

Fe3O4-celulosa,

Fe3O4-celulosa-trypsin,

Fe3O4-celulosa-

biotinylovaný trypsin měřených při teplotě 300 K.

MS+ (+7 T)

MS- (-7 T)

HC+

HC-

MR+

MR-

 0.001

 0.001

 20

 20

 0.001

 0.001

(K)

(emu/g)

(emu/g)

(Oe)

(Oe)

(emu/g)

(emu/g)

300

9,85

-9,83

3

-3

0,06

-0,05

5,88

-5,89

38,37

-37,8

1,95

-1,94

300

32,6

-32,6

307

-306

10,0

-10,0

300

12,9

-12,9

298

-296

3,9

-3,9

300

26,8

-26,8

339

-340

8,3

-8,3

T Vzorek Fe3O4-chitosan Fe3O4-chitosantrypsin Fe3O4-celulosa Fe3O4-celulosatrypsin

300

Fe3O4-celulosabiotinylovaný trypsin

4.2.2. TEM a SEM Velikost a morfologické vlastnosti připravených materiálů byly zhodnoceny pomocí transmisní elektronové mikroskopie. Skenovací mikroskopie byla zvolena pro detekci povrchových vlastností příslušného materiálu. Během srovnávacího měření TEM je vhodné nejprve prostudovat systém modifikovaný pouze povrchovými materiály, teprve poté se provede měření nanomateriálu s imobilizovaným proteinem. Bakterie Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1 použitá pro izolaci MNPs je na obr. 36. Uvnitř bakteriální buňky je vidět řetízek magnetosomů. Obr. 37 ukazuje MNPs nejprve s přítomností cytoplazmatické membrány (A), po odstranění membrány pomocí detergentu SDS (B), po povrchové modifikaci biopolymerem chitosanem (C) a po kovalentní imobilizaci trypsinového konjugátu (D). V další studii byl na MNPs imobilizován avidin. Potvrzením jeho navázání kromě výsledků SQUID je i TEM snímek na obr. 38., v porovnání s pouhou povrchovou modifikací chitosanem. Ze snímků je vidět, že nanočástice biogenního magnetitu vykazovaly velikost  45 nm. Po modifikaci chitosanem je v porovnání s nanočásticemi bez povrchového materiálu vidět jeho tenká vrstva ( 4 nm) obalující povrch magnetických částic. Kromě TEM mikroskopie byla vrstva chitosanu na povrchu biogenního magnetitu potvrzena infračervenou spektroskopií (Marková et al., 2012). V případě navázání proteinu k povrchu MNPs dochází k mírnému zvětšení povrchové vrstvy daného nanomateriálu. V případě

- 68 -

imobilizace proteinů je žádoucí potvrdit imobilizaci i jinými způsoby, např. stanovením enzymové aktivity nebo magnetizačním měřením. SEM snímek biogenního magnetitu modifikovaného chitosanem je uveden na obr. 39. TEM snímky byly také pořízeny pro syntetické nanočástice RPL modifikované chitosanem a nanočástice silanizované pomocí silanizačních činidel TEOS a APTES. Obr. 40A uvádí nemodifikované nanočástice magnetitu, v případě funkcionalizace povrchu chitosanem je vidět tenká vrstva lemující povrch částic (obr. 40B). Po imobilizaci trypsinu došlo k dalšímu obalení povrchu nanočástic (obr. 40C). Povrch nanočástic syntetického magnetitu ukazuje SEM snímek na obr. 41. Silanizované nanočástice jsou uvedeny na obr. 42A, po navázání trypsinu je vidět nárůst enzymové vrstvy na povrchu nanočástic (obr. 42B). Ve studii Kluchová et al. (2009) je na TEM snímku nanočástic maghemitu vidět tenká vrstva chitosanu a dále vrstva imobilizovaného trypsinového konjugátu (RAF-BT). Práce Belessi et al. (2008) obsahuje TEM snímek magnetitu modifikovaného tenkou vrstvou polymerního chitosanu. V případě magnetických mikročástic enkapsulovaných v prostředí celulosy byla velikost částic zhodnocena pomocí optické mikroskopie a jejich povrchové vlastnosti pomocí SEMu. Ze zobrazení v optickém mikroskopu byla určena velikost mikročástic v rozmezí 30 – 50 μm (obr. 43). Povrchové vlastnosti ukazuje obr. 44, kde je vidět porozita daného materiálu. V případě, že by nastala úplná ztráta vody, došlo by ke ztrátě porézního charakteru. Ve studii Luo et al. (2009) byly připraveny podobné mikročástice o velikosti  6 μm a popsány povrchové vlastnosti.

Obr. 36. TEM snímek bakterie Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1 s obsahem intracelulárních částic magnetitu ve formě magnetosomů.

- 69 -

B)

A)

C)

Obr.

D)

37.

TEM

snímky

biogenního

magnetitu

izolovaného

z bakterie

Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1: A) s obsahem fosfolipidové membrány; B) po odstranění membrány pomocí SDS; C) biogenní magnetit modifikovaný chitosanem; D) nanočástice magnetitu modifikované chitosanem a s kovalentně imobilizovaným konjugátem trypsinu (BCD-BT). Navázaný trypsinový konjugát je označen černou šipkou.

- 70 -

A)

B)

Avidin

Obr.

38.

A)

Transmisní

elektronová

mikroskopie

biogenního

magnetitu

modifikovaného polymerem chitosanem. B) Transmisní elektronová mikroskopie biogenního magnetitu modifikovaného chitosanem a s kovalentní imobilizací avidinu.

- 71 -

Obr. 39. SEM snímek biogenního magnetitu modifikovaného chitosanem.

A)

B)

Chitosan

- 72 -

C)

Obr. 40. TEM snímky syntetického magnetitu získaného termickým rozkladem komerčního produktu pod názvem BAYFERROX 110: A) nemodifikované nanočástice magnetitu; B) magnetit modifikovaný chitosanem; C) nanočástice magnetitu funkcionalizované chitosanem s následně imobilizovaným trypsinem (BT).

Obr. 41. SEM snímek syntetického magnetitu získaného termickým rozkladem BAYFERROXU 110 za příslušných uvedených podmínek.

- 73 -

A)

B)

Obr. 42. TEM snímky syntetického magnetitu získaného termickým rozkladem komerčního produktu pod názvem BAYFERROX 110: A) nanočástice magnetitu silanizované pomocí APTES, TEOS; B) silanizovaný magnetit s imobilizovaným trypsinem (BT). Vrstva navázaného trypsinu je označena černou šipkou.

- 74 -

Obr. 43. Magnetické mikročástice magnetitu enkapsulované v prostředí celulosy získané z optického mikroskopu. Velikost magnetických částic je v rozmezí 30 – 50 μm, poměr RPL částic a celulosy byl 1:2.

A)

B)

Obr. 44. A) Povrch mikročástic enkapsulovaných v prostředí celulosy; B) Detailní SEM

snímek

povrchu

magnetických

částic

enkapsulovaných

celulosy, kde jsou vidět porézní vlastnosti daného materiálu.

- 75 -

v prostředí

4.3.

Specifická aktivita, vazebná kapacita částic, teplotní stabilita a pH optimum trypsinu Jelikož chemická modifikace enzymů může výrazně ovlivnit specifickou aktivitu,

byla stanovena její hodnota. Vůči umělému substrátu BAPNA vykazoval nativní trypsin hodnotu specifické aktivity 32 nkat.mg-1, zatímco u konjugátů trypsinu došlo k jejímu poklesu na hodnoty 23,8 (ACD-BT); 24,6 (BCD-BT) a 24,1 (GCD-BT) nkat.mg-1. Po chemické modifikaci trypsinu bývá pokles specifické aktivity v rozmezí 10-30% v porovnání s nemodifikovaným enzymem (Šebela et al., 2006). Množství trypsinu imobilizovaného na magnetickém nosiči bylo stanoveno pro všechny použité typy magnetických materiálů. Pro vzájemné porovnání bylo toto množství přepočteno na 1 mg částic (tab. 5). Toto množství se pohybovalo v rozmezí od 35 do 71 g.mg-1částic. Nejvyšší hodnoty bylo dosaženo při vazbě na částice magnetitu enkapsulované v prostředí celulosy. To lze vysvětlit předpokladem, že po oxidaci celulosového povrchu

je

k dispozici

vysoký

obsah

aldehydových

skupin

přístupných

k aminoskupinám trypsinu za vzniku Schiffovy báze, která je stabilizována redukcí. Čím více je k dispozici aldehydových skupin, tím větší je aktivita imobilizovaného enzymu. Nejméně trypsinu bylo navázáno na silanizované nanočástice magnetitu. Pokud jde o nanočástice modifikované chitosanem, nejlépe se podařilo navázat GCD-BT, a to na biogenní magnetit, což je vidět i z magnetizačního měření SQUID. Z toho logicky vyplývá, že vazebná kapacita magnetických nosičů je různá a závisí na typu i povrchové úpravě a taktéž na konkrétním případu imobilizovaného proteinu a příslušného aktivačního činidla. Ve studii Liu et al. (2007) s nanočásticemi magnetitu modifikovanými aminoskupinou jako nosičem bylo zjištěno navázané množství 86 g.mg-1.

Podobného

výsledku

dosáhli

i

Li

et

al.

(2007),

kde

aminofunkcionalizovaný magnetit a výsledná hodnota činila 78 g.mg-1.

- 76 -

byl

použit

Tab. 5. Množství navázaného trypsinu a jeho konjugátů pro různé magnetické nosiče. Typ magnetického nosiče

Množství navázaného trypsinu g.mg-1částic

MNPs-chitosan-BT

 50

MNPs-chitosan-ACD-BT

 51

MNPs-chitosan-BCD-BT

 42

MNPs-chitosan-GCD-BT

 63

MNPs-chitosan-avidin-BT-B

 53

RPL-chitosan-BT

 40

RPL-TEOS, APTES-BT

 35

CMM-celulosa-BT

 71

CMM-celulosa-avidin-BT-B

 55

Modifikace a imobilizace trypsinu na pevné magnetické nosiče byla v této práci prováděna nejen proto, aby byla potlačena jeho autolýza, ale také z důvodu dosažení větší teplotní stability a z toho plynoucí možnosti provádět efektivnější proteolýzu za vyšší teploty. Zjištěné hodnoty T50 volného a imobilizovaného trypsinu jsou uvedeny v tab. 6. Z výsledků je vidět, že už po samotné modifikaci trypsinu došlo ke zvýšení teplotní stability v porovnání s volnou formou enzymu. V případě, že byl trypsinový konjugát ještě kovalentně navázán na magnetické nosiče nárůst teplotní stability pokračoval. Pro nativní trypsin byla určena T50=41°C, což koresponduje s dříve publikovanými čísly (Šebela et al., 2006). Hodnota T50 pro nemodifikovaný trypsin imobilizovaný na MNPs činila 44°C. Z toho je zřejmé, že i nativní trypsin je po imobilizaci odolnější vůči vyšším teplotám. Pro volné trypsinové konjugáty byla nejvyšší hodnota teplotní stability dosažena v případě GCD-BT (59°C), u imobilizovaných konjugátů a bakteriální magnetický systém bylo dosaženo hodnot až 66°C (BCD-BT a GCD-BT). V případě biotinylovaného trypsinu došlo po navázání na avidinylované MNPs ke zvýšení hodnoty T50 o 8°C oproti volné biotinylované formě. Průběh křivky teplotní stability volného a imobilizovaného trypsinu a jeho konjugátů je znázorněn na obr. 45 a 46. Již samotná chemická modifikace lysinů v molekule trypsinu má pozitivní vliv na teplotní stabilitu, která může být ještě zvýšená navázáním konjugátu na nanočástice magnetitu. Nejméně termostabilní byl volný nemodifikovaný trypsin a trypsin imobilizovaný na silanizovaných nanočásticích magnetitu (T50=43°C). Křivky

- 77 -

teplotní

stability

modifikovaným

trypsinu povrchem

imobilizovaného

na

syntetických

jsou

na

obr.

uvedeny

47.

částicích U

s různě

imobilizovaného

nemodifikovaného trypsinu lze konstatovat, že teplotní stabilita závisí na typu nosiče, jeho povrchové vrstvě a typu aktivačního činidla. Potvrdilo se, že termostabilní konjugáty trypsinu imobilizované na bakteriálních magnetických nanočásticích jsou vhodné pro štěpení proteinů v roztoku za vyšších teplot. Závěrem lze říci, že teplotní stabilita trypsinu je jedním z důležitých parametrů pro jeho další aplikaci např. v proteomickém výzkumu. Studie Murphy & Fágáin (1996) uvádí zvýšení teplotní stability trypsinu po modifikaci N-hydroxysukcinimidovým esterem octové kyseliny, podobných výsledků bylo dosaženo po modifikaci trypsinu dextranem (Hernández et al., 2006). Po chemické modifikaci a následné imobilizaci trypsinu na magnetické nosiče byla stanovena hodnota pH optima. Z literatury je známo, že kovalentní imobilizace může pozměnit hodnotu pH optima (Yang et al., 2004). Pro měření byl zvolen Britton-Robinsonův pufr v rozmezí hodnot pH 4,5 – 10,4. Hodnota pH, při které byla určena nejvyšší trypsinová aktivita, byla označena jako optimální pH. Naměřené hodnoty pH optima trypsinu volného a imobilizovaného na různých typech magnetických nosičů jsou shrnuty v tab. 6. Hodnota pH optima pro volný nemodifikovaný trypsin byla v mírně bazické oblasti (8,5). Po glykaci nebo biotinylaci trypsinu nedošlo k jejímu výraznému posunu. Z tabulky 6 vyplývá, že u některých forem trypsinu došlo k posunu pH optima o 0,5 jednotky, případně pH optimum vykazovalo nezměněnou hodnotu. Chemická modifikace a imobilizace trypsinu tudíž nevede k významnému posunu hodnoty pH optima. To je samozřejmě výhodou pro jeho aplikace (např. v MALDI-TOF peptidovém mapování). Ve studii Bayramoğlu et al. (2008) je po adsorpci trypsinu na magnetické kuličky popsán posun pH optima z hodnoty 7,5 na 8,5. V případě -chymotrypsinu kovalentně imobilizovaného na aminofunkcionalizované nanočástice nedošlo k žádné změně hodnoty pH optima v porovnání s volnou formou (Hong et al., 2007). Naopak, Godjevargova et al. (2000) zmiňují značný posun pH optima imobilizované glukosaoxidasy ve srovnání s volným enzymem.

- 78 -

Tab. 6. Porovnání hodnot T50 a pH optima volného a imobilizovaného trypsinu. Forma trypsinu

T50 (°C)

pH optimum

BT*

41

8,5

ACD-BT*

54

8,5

BCD-BT*

56

8,0

GCD-BT*

59

9,0

BT-B*

48

8,0

MNPs-chitosan-BT**

44

8,0

MNPs-chitosan-ACD-BT**

60

8,5

MNPs-chitosan-BCD-BT**

66

8,5

MNPs-chitosan-GCD-BT**

66

9,0

MNPs-chitosan-avidin-BT-B**

56

8,0

RPL-chitosan-BT**

46

8,5

RPL-APTES-BT**

43

8,0

CMM-celulosa-BT**

46

8,5

CMM-celulosa-avidin-BT-B**

53

8,5

* volná forma, ** imobilizovaná forma

100

MNPs@chitosan-BT MNPs@chitosan-ACD-BT

Zbytková aktivita (%)

90

MNPs@chitosan-BCD-BT

80

MNPs@chitosan-GCD-BT

70

MNPs@chitosan-BT-B

60 50 40 30 20 10 0 20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

Teplota (°C)

Obr. 45. Teplotní stabilita volného trypsinu a jeho konjugátů měřená v prostředí 20 mmol.l-1 acetátového pufru, pH 5,25. Hodnoty T50 jsou shrnuty v tabulce 6.

- 79 -

100



90

MNPs@chitosan-BCD-BT

80

MNPs@chitosan-GCD-BT

70

MNPs@chitosan-BT-B

60 50 40 30 20 10 0 20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

Teplota (°C)

Obr. 46. Teplotní stabilita trypsinu a jeho konjugátů po imobilizaci na bakteriální nanočástice měřená v prostředí 20 mmol.l-1 acetátového pufru, pH 5,25. Hodnoty T50 jsou shrnuty v tabulce 6.

RPL@APTES-BT

100

RPL@chitosan-BT

90

CMM-celulosa-BT


80

CMM-celulosa-BT-B

70 60 50 40 30 20 10 0 20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

Teplota (°C)

Obr. 47. Teplotní stabilita nativního a biotinylovaného trypsinu po imobilizaci na syntetické částice s různě modifikovaným povrchem. Měření bylo provedeno v 20 mmol.l-1 acetátovém pufru, pH 5,25. Hodnoty T50 jsou shrnuty v tabulce 6.

- 80 -

4.4.

Stanovení operační a funkční stability trypsinu a stability při skladování Jelikož se imobilizované enzymy běžně používají pro opakované reakce, byla

studována operační stabilita trypsinu po osmi cyklech přeměny substrátu BAPNA. Po každém cyklu byla měřena zbytková aktivita. Z naměřených hodnot byla stanovena závislost zbytkové aktivity (%) na počtu cyklů opakovaného použití. Průběh křivky operační stability trypsinu a jeho konjugátů imobilizovaných na bakteriálních nanočásticích znázorňuje obr. 48, obdobné závislosti pro enzymy imobilizované na syntetických materiálech jsou na obr. 49. Stanovené hodnoty zbytkových aktivit jsou shrnuty v tab. 7. Z těchto výsledků je vidět, že imobilizovaný trypsin je vhodný pro opakované použití. V žádném případě neklesla trypsinová aktivita po osmi cyklech pod 50 %. Nejlepší hodnoty zbytkové aktivity bylo dosaženo pro celulosové mikročástice s navázaným nativním trypsinem (92,0 %). Naopak nejvyšší ztráta zbytkové aktivity byla vidět u magnetického systému RPL-APTES-BT (64,8 %). V případě trypsinových konjugátů imobilizovaných na biogenním magnetitu byly hodnoty zbytkové aktivity velmi podobné. Po stanovení operační stability imobilizovaného trypsinu lze tedy konstatovat, že operační stabilita závisí na typu magnetického materiálu a jeho povrchové modifikaci, na typu aktivačního činidla při imobilizaci a na druhu imobilizovaného enzymu. Ve studii Maciel et al. (2009) došlo po deseti cyklech u trypsinu imobilizovaného na syntetickém magnetitu ke ztrátě 64,75 % původní aktivity. V případě, že magnetit byl upraven pomocí levanu, ztráta trypsinové aktivity po deseti cyklech byla pouze 16 %. V práci Xi et al. (2005) byly pro imobilizaci trypsinu zvoleny makroporézní chitosanové kuličky. Při použití GA jako aktivačního činidla si trypsin po 4 cyklech zachoval 61 % své původní aktivity. Autoři Sun et al. (2012) použili pro imobilizaci trypsinu superparamagnetické nanočástice upravené

karboxymethyl

chitosanem a obsahující Cu2+ nebo Zn2+. Imobilizovaný trypsin byl podroben operační stabilitě a po šesti cyklech si udržel 61 % (Cu2+) a 74 % (Zn2+) původní trypsinové aktivity. Zbytkovou aktivitu 40 % po 6 reakcích zmiňuje publikace Goradia et al. (2005). Pro trypsin a jeho konjugáty imobilizované na bakteriální nanočástice byla určena funkční stabilita po inkubaci 24 h a ta porovnána s výsledky pro volnou formu enzymu. Měření bylo provedeno při laboratorní teplotě v bazickém prostředí (0,15 mol.l-1 Tris-HCl, pH 8,5). Hodnoty zbytkové aktivity byly určeny po inkubaci alikvotů trypsinu v intervalech 0,5; 1; 1,5; 2; 4; 6 a 24 hodin a byla stanovena hodnota t50, což je čas, za který klesne původní aktivita na polovinu. Naměřené hodnoty t50 jsou uvedeny v tab. 8. Hodnota t50 nemodifikovaného trypsinu byla 0,5 h, po imobilizaci se zvýšila na hodnotu 4 h. Již po chemické modifikaci je vidět, že dochází ke zvýšení hodnot t50

- 81 -

oproti nemodifikované formě. Z tabulky 8 je také zřejmé, že po následné imobilizaci na pevný nosič se stabilita trypsinu dále zvyšuje. Z volných enzymů vykazoval nejlepší stabilitu konjugát BCD-BT. V případě imobilizovaných trypsinových konjugátů byla hodnota t50 vyšší než 24 h. Stabilita volného a imobilizovaného trypsinu při skladování byla zhodnocena měřením zbytkové trypsinové aktivity v týdenních intervalech po dobu šesti týdnů. Volný a imobilizovaný trypsin byly skladovány při teplotě 4°C v prostředí 0,1% kyseliny mravenčí, aby bylo zjištěno, zda nedochází k inaktivaci. Byl studován vliv modifikace trypsinu a jeho imobilizace měřením zbytkové aktivity po 6 týdnech skladování a výsledky porovnány s nemodifikovanou a volnou formou enzymu. U imobilizovaných enzymů byla stabilita při skladování porovnána i v souvislosti s použitými magnetickými nosiči s různým typem povrchových materiálů. Z naměřených hodnot byla určena závislost zbytkové aktivity (%) na čase (dny) skladování. Stabilitu při skladování volného trypsinu a jeho konjugátů ukazuje obr. 50. Průběh křivek pro enzymy imobilizované na biogenním magnetitu a na syntetických magnetických částicích s různě upraveným povrchem je na obr. 51 respektive 52. Nakonec byla stanovena zbytková trypsinová aktivita po 6 týdnech skladování, naměřené hodnoty jsou shrnuty v tab. 7. U volné formy trypsinu si nejvíce zbytkové aktivity po 6 týdnech skladování zachovaly ACD-BT a GCD-BT (59,0 %). Naopak nejvyšší ztráta aktivity byla zjištěna u volného nemodifikovaného trypsinu. Již samotná glykace nebo biotinylace trypsinu vykazuje kladný vliv na stabilitu při skladování oproti nativní formě (tab. 7). V případě, že byl trypsin imobilizován na magnetické nosiče, došlo k dalšímu nárůstu zbytkové aktivity po 6 týdnech skladování. U imobilizovaných enzymů bylo nejlepšího výsledku dosaženo pro systém biogenní magnetit s navázaným GCD-BT, kde ztráta původní trypsinové aktivity byla pouze 10 %. Naopak nejmenší zachování zbytkové aktivity bylo pozorováno pro systém syntetických silanizovaných nanočástic s imobilizovaným nativním trypsinem (54,5 %). Z předložených výsledků můžeme konstatovat, že modifikace a imobilizace trypsinu zvyšuje stabilitu při skladování. Kladný vliv na zachování aktivity trypsinu měly určitě podmínky skladování, jako byla nízká teplota (4°C) a kyselé prostředí (0,1% HCOOH), ve kterém je potlačena nežádoucí autolýza trypsinu. V případě imobilizovaných enzymů je vidět, že stabilita enzymu závisí na typu magnetického nosiče a jeho obalové vrstvy, ale i na typu enzymu a aktivačního činidla. Ve studii Goradia et al. (2005) ztratil volný a imobilizovaný trypsin po 30 dnech skladování při 4°C v mírně kyselém prostředí 70 % respektive 20 % své původní aktivity. Opět je potvrzeno, že kovalentní imobilizace enzymu na pevné nosiče zvyšuje jeho stabilitu. Kladný a žádoucí vliv na stabilitu při skladování má i nízká teplota a kyselé prostředí skladování. Podobná studie Bayramoğlu et al. (2008) popisuje přímou

- 82 -

adsorpci trypsinu na magnetické kuličky. Po 8 týdnech skladování při 4°C a v prostředí 50 mmol.l-1 acetátového pufru, pH 4 imobilizovaný trypsin ztratil 39 % své původní aktivity. Trypsinová aktivita u volné formy byla po 8 týdnech skladování nulová. Práce autorů Anirudhan & Rejeena (2012) popisuje zvýšení stability imobilizovaného trypsinu při skladování v porovnání s volnou formou. Skladování bylo provedeno po dobu tří týdnů při teplotě 4°C v prostředí 50 mmol.l-1 KPB, pH 7,5. Pozitivní efekt na stabilitu při skladování po imobilizaci na magnetické nanočástice byl potvrzen i u dalších enzymů, jako je alkalická fosfatasa (Jin et al., 2010) nebo neutrální lipasa (Tang et al., 2007).

100


95 90 85 80 75


70

MNPs@chitosan-BCD-BT MNPs@chitosan-GCD-BT

65

MNPs@chitosan-BT-B

60 1

2

3

4

5

6

7

8

9

Počet cyklů

Obr. 48. Operační stabilita trypsinu a jeho konjugátů imobilizovaných na biogenním magnetitu modifikovaném biopolymerem chitosanem. Zbytková aktivita trypsinu po 8 cyklech je uvedena v tabulce 7.

- 83 -

100


95 90 85 80 75 70

RPL@APTES-BT

65

RPL@chitosan-BT CMM@celulosa-BT

60

CMM@celulosa-BT-B

55 1

2

3

4

5

6

7

8

9

Počet cyklů

Obr. 49. Operační stabilita trypsinu imobilizovaného na syntetických částicích s různě upraveným povrchem. Zbytková aktivita trypsinu po 8 cyklech je uvedena v tabulce 7.

100


90 80 70 60 MNPs@chitosan-BT

50

MNPs@chitosan-ACD-BT MNPs@chitosan-BCD-BT

40

MNPs@chitosan-GCD-BT MNPs@chitosan-BT-B

30 0

7

14

21

28

35

42

Čas (dny)

Obr. 50. Stabilita volného trypsinu a jeho konjugátů při skladování v prostředí 0,1% HCOOH při teplotě 4°C. Zbytkové aktivity trypsinu po 42 dnech skladování jsou uvedeny v tabulce 7.

- 84 -

100


95 90 85 MNPs@chitosan-BT

80

MNPs@chitosan-ACD-BT MNPs@chitosan-BCD-BT

75

MNPs@chitosan-GCD-BT MNPs@chitosan-BT-B

70 0

7

14

21

28

35

42

Čas (dny)

Obr. 51. Stabilita trypsinu a jeho konjugátů imobilizovaných na bakteriálních nanočásticích při skladování v prostředí 0,1% HCOOH při teplotě 4°C. Zbytkové aktivity trypsinu po 42 dnech skladování jsou uvedeny v tabulce 7.

100


95 90 85 80 75 70 65

RPL@APTES-BT

60

RPL@chitosan-BT CMM@celulosa-BT

55

CMM@celulosa-BT-B

50 0

7

14

21

28

35

42

Čas (dny)

Obr. 52. Stabilita trypsinu imobilizovaného na syntetických nanočásticích různě modifikovaným povrchem při skladování v prostředí 0,1% HCOOH při teplotě 4°C. Zbytkové aktivity trypsinu po 42 dnech skladování jsou uvedeny v tabulce 7.

- 85 -

Tab. 7. Porovnání hodnot zbytkové aktivity trypsinu po 8 cyklech opakování a po 6 týdnech skladování. Forma trypsinu

Zbytková aktivita po 8 cyklech

Zbytková aktivita po 6

(%)

týdnech skladování (%)

BT*

-

48,0

ACD-BT*

-

59,0

BCD-BT*

-

57,5

GCD-BT*

-

59,0

BT-B*

-

50,5

MNPs-chitosan-BT**

70,9

80,0

MNPs-chitosan-ACD-BT**

74,4

87,5

MNPs-chitosan-BCD-BT**

76,7

88,5

MNPs-chitosan-GCD-BT**

72,7

90,0

MNPs-chitosan-avidin-BT-B**

74,7

81,0

RPL-chitosan-BT**

70,6

60,0

RPL-APTES-BT**

64,8

54,5

CMM-celulosa-BT**

92,0

76,0

CMM-celulosa-avidin-BT-B**

89,0

85,0


Tab. 8. Porovnání hodnot t50 pro volný trypsin a imobilizovaný trypsin na biogenním magnetitu. Forma trypsinu

t50 (h)

BT*

0,5

ACD-BT*

21

BCD-BT*

 24

GCD-BT*

24

BT**

4

ACD-BT**

 24

BCD-BT**

 24

GCD-BT**

 24


- 86 -

4.5. MALDI-TOF peptidové mapování Účinnost štěpení imobilizovaného modifikovaného trypsinu byla studována pomocí metody MALDI-TOF peptidového mapování. Jako modelové (standardní) proteiny byly zvoleny hovězí sérový albumin (BSA, 66 kDa), křenová peroxidasa (HRP, 40 kDa) a lysozym z vaječného bílku (LYS, 14 kDa). V případě použití imobilizovaného biotinylovaného trypsinu byla provedena proteolýza v roztoku po dobu 2 h při teplotě 37°C (LYS, HRP). Imobilizované formy trypsinových konjugátů, které vykazovaly poměrně vysokou teplotní stabilitu (tab. 6), byly použity pro štěpení BSA, HRP a LYS v roztoku při teplotě 50°C po dobu 1-2 h v prostředí 50 mmol.l-1 NH4HCO3. Jako MALDI matrice pro následující měření byl zvolen saturovaný roztok CHCA (50 % acetonitril / 0,1 % TFA; 1:2, v/v) a vzorky zpracovány technikou vysušené kapky. MALDI-TOF hmotnostní spektra uvedená na obr. 53A a 53B byla získána po použití BT-B imobilizovaného na biogenním magnetitu. Hmotnostní spektra digestů BSA, HRP a LYS

připravených

pomocí

ACD-BT

respektive

BCD-BT

imobilizovaných

na

bakteriálních nanočásticích jsou na obr. 54A, 54B a 54C. Na základě databázového vyhledávání pomocí programu Mascot Server byly všechny proteiny správně identifikovány.

Výsledky

získané

z databáze

-

hodnoty

pokrytí

sekvence

a

pravděpodobnostního skóre jsou shrnuty v tab. 9. Jako nejlepší magnetický nosič pro imobilizaci trypsinu a jeho následnou aplikaci pro peptidové mapování se jeví biogenní magnetit. Pro srovnání je na obr. 55 uvedeno peptidové hmotnostní spektrum digestu lysozymu z vaječného bílku získané štěpením proteinu v gelu pomocí volné formy trypsinu. Trypsinace probíhala standardním postupem 12 h při teplotě 37°C. V případě použití glykovaného trypsinu imobilizovaného na biogenním magnetitu bylo nejvyšší hodnoty pokrytí sekvence a pravděpodobnostního skóre dosaženo při štěpení lysozymu, naopak nejnižší hodnota skóre byla v případě analýzy digestu křenové peroxidasy. Při aplikaci BT-B imobilizovaného na biogenním magnetitu byla hodnota skóre vyšší pro HRP v porovnání s výsledky pro LYS. Ve studii Li et al. (2010) bylo dosaženo pro BSA pokrytí sekvence pouze 17 %, a to po štěpení nativním trypsinem imobilizovaným na magnetických nanočásticích modifikovaných –NH2 skupinou. Pokud byly zvoleny nanočástice modifikované –SH skupinou, došlo k nárůstu pokrytí sekvence pro BSA na 27 %. Trypsinace probíhala v roztoku 16 hodin při 37°C. Práce Wang et al. (2008) popisuje imobilizaci trypsinu na magnetit modifikovaný polyanilinem, štěpení BSA a LYS probíhalo na vodní lázni 5 minut při 37°C. Hodnoty pokrytí sekvence byly stanoveny na 46 % (BSA) a 63 % (LYS). Jedním z cílů práce bylo připravit termostabilní trypsin imobilizovaný na magnetickém nosiči a posoudit jeho použití pro MALDI-TOF peptidové mapování. Biotinylovaný nebo glykovaný trypsin (konjugáty s cyklodextriny) byly velmi stabilní

- 87 -

oproti volné formě, následnou imobilizací modifikovaného trypsinu na magnetické nanočástice došlo k jeho další stabilizaci. Hlavní výhodou je, že s trypsinem je pak možné manipulovat prostřednictvím vnějšího magnetického pole. Po skončení trypsinace byl imobilizovaný trypsin z digestu odstraněn pomocí magnetického separátoru (NdFeB), tudíž ve výsledném hmotnostním spektru by měly být redukovány či úplně eliminovány nežádoucí autolytické fragmenty trypsinu. Nejčastější autolytické štěpy mají hodnoty (m/z 2163,06 a 2273,18) (Šebela et al., 2006). Z uvedených výsledků je zřejmé, že modifikovaný trypsin imobilizovaný na magnetických nanočásticích je využitelný pro rychlé a účinné štěpení proteinů v roztoku. V hmotnostních spektrech nebyly nalezeny autolytické štěpy, popřípadě měly značně redukovanou intenzitu. Redukce autolytických fragmentů trypsinu má kladný význam pro proteomický výzkum, protože nedochází k rušení stanovení při MS. Další výhodou použití termostabilního modifikovaného imobilizovaného trypsinu je snížení doby proteolýzy (1-2 h) při vyšší teplotě (50°C) oproti standardnímu postupu. Klasické štěpení proteinů s použitím nativního trypsinu probíhá 12 h při teplotě 37°C.

1.1

A)

1239.8

1.0 0.9

Relative intensity

0.8 0.7

1498.9

0.6 0.5 0.4

993.4

*1641.8 1753.9

0.3 0.2

877.0 2163.1 *

0.1 500

1000

1500

2000

2500

Mass (m/z)

- 88 -

3163.6

3000

3500

4000

B)

1.1

1351.7

1.0 0.9

Relative intensity

0.8 0.7 0.6 0.5 0.4

*1039.5 1586.7 1062.5 876.9

0.3 0.2

2072.9

*

2397.1

0.1 500

2620.0 3114.3 3671.7

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Mass (m/z)

Obr. 53. MALDI-TOF peptidové mapování: A) LYS z vaječného bílku; B) HRP. Pro štěpení byl použit BT-B imobilizovaný na avidinylovaném biogenním magnetitu modifikovaném chitosanem. Reakce proběhla v roztoku 2 h při 37°C. LYS: pokrytí sekvence - 50 %, pravděpodobnostní skóre - 53; HRP: pokrytí sekevence - 44 %, pravděpodobnostní skóre - 109.

A)

1.1 1.0 0.9

1639.8

Relative intensity

0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 860.9

0.2

1001.4 1439.7 1138.5 1810.8

0.1 0

.

500

1000

Mass (m/z)

- 89 -

1500

2000

B)

1.1 1586.9

1.0 0.9

Relative intensity

0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3

803.4

0.2 0.1 1000

3671.9

2850.4

2102.0

0

3353.5

2532.1

2000

3000

4000

5000

Mass (m/z)

C)

1.1 1803.8

1.0

Relative intensity

0.9 0.8

1675.7

0.7 0.6 0.5

1045.5 1333.7 993.3

0.4 0.3

2515.0

0.2

2123.8

3163.4

2735.1

0.1

3591.6

0.0 0

1000

2000

3000

4000

Mass (m/z)

Obr. 54. A) MALDI-TOF peptidové mapování: A) BSA; pro štěpení byl použit BCDBT imobilizovaný na biogenním magnetitu, reakce proběhla v roztoku 1 h při 50°C; pokrytí sekvence - 32 %, pravděpodobnostní skóre - 141; B) HRP; pro štěpení byl použit ACD-BT imobilizovaný na biogenním magnetitu, reakce proběhla v roztoku 2 h při 50°C; pokrytí sekvence - 45,1 %, pravděpodobnostní skóre - 116; C) LYS z vaječného bílku; pro štěpení byl použit BCD-BT imobilizovaný na biogenním magnetitu, reakce proběhla v roztoku 1 h při 50°C; pokrytí sekvence - 86,8 %, pravděpodobnostní skóre - 228.

- 90 -

1428.73

1.0 1045.63

1676.86 1754.89

Rel. intenzita

0.8

0.6

0.4

* 936.47

1804.94

874.49

0.2 1821.90

*

0.0 500

+ + +

1000

1500

2000

2500

3000

m/z Obr. 55. A) MALDI-TOF peptidové mapování LYS z vaječného bílku. Pro štěpení byla použita volná forma BT modifikovaného rafinosou (RAF-BT). Štěpení bylo provedeno v gelu 12 h při 37°C; pokrytí sekvence - 61 %, pravděpodobnostní skóre 161. Tab. 9. Srovnání účinnosti štěpení imobilizovaného a volného trypsinu pomocí výsledků MALDI-TOF peptidového mapování. Protein

BSA

HRP

LYS

Pravděpodobnostní skóre

141*

44**; 45,1***

53**; 228*; 161****

Pokrytí sekvence (%)

32*

109**; 116***

50**; 86,8*; 61****

* Imobilizovaný BCD-BT (v roztoku) ** Imobilizovaný BT-B (v roztoku) *** Imobilizovaný ACD-BT (v roztoku) **** Volný RAF-BT (v gelu)

- 91 -

4.6. Příprava bioelektrody s obsahem nanočástic magnetitu 4.6.1. Cyklická voltametrie a chronoamperometrie Charakterizace elektrochemického systému nemodifikovaná CPE, modifikovaná CPE s 15 % obsahem biogenního magnetitu modifikovaného chitosanem a následně s kovalentně imobilizovanými enzymy (AO a HRP) byla provedena cyklickou voltametrií a chronoamperometrií. Elektroda zhotovená z uhlíkové pasty obsahující uvedené oxidoreduktasy

imobilizované

na

bakteriálních

magnetických

nanočásticích

je

zobrazena na obr. 56. Cyklické voltamogramy pro systém nemodifikovaná CPE a modifikovaná CPE s 15 % obsahem magnetických nanočástic jsou na obr. 57 a 58. U obou cyklických voltamogramů je vidět, že po přídavku H2O2, jehož výsledná koncentrace v elektrochemické nádobce byla 3 a 6 mmol.l-1, jsou vidět elektrodové odezvy při určitých hodnotách potenciálu. V případě použití modifikované CPE s imobilizovanou AO a HRP byly zvoleny přídavky kadaverinu a hydrochinonu o výsledné koncentraci v pracovní nádobce 0,1 mmol.l-1. Výsledný cyklický voltamogram je na obr. 59. Z uvedeného voltamogranu je vidět, že k odezvám na elektrodě dochází nejen při kladném, ale i při záporném potenciálu. V praxi však při použití kladného potenciálu během chronoamperometrie nastává riziko oxidace interferujících látek na elektrodě. Tyto látky mohou být přítomny v reálných vzorcích a tudíž se mohou oxidovat zároveň s analytem. V našem případě byl při chronoamperometrii zvolen potenciál -0,2 V.

Obr. 56. Připravená elektroda z modifikované uhlíkové pasty s 15 % obsahem magnetických nanočástic s imobilizovanou AO a HRP.

- 92 -

Obr. 57. Cyklické voltamogramy pro systém nemodifikovaná CPE bez přídavku H2O2 (blank-černá), s přídavky 3 mmol.l-1 (červená) a 6 mmol.l-1 (zelená) H2O2.

Obr. 58. Cyklické voltamogramy pro systém modifikovaná CPE s obsahem magnetických nanočástic bez přídavku H2O2 (blank-černá), s přídavky 3 mmol.l-1 (červená) a 6 mmol.l-1 (zelená) H2O2.

- 93 -

Obr. 59. Cyklické voltamogramy pro systém modifikovaná CPE s obsahem magnetických nanočástic a imobilizovanou aminoxidasou a peroxidasou bez přídavku kadaverinu a hydrochinonu (blank-černá) a s přídavkem 0,1 mmol.l-1 příslušných substrátů (červená).

Po zhodnocení připravených elektrod cyklickou voltametrií následovalo chronoamperometrické měření. Pro nemodifikovanou CPE a modifikovanou CPE s obsahem nanočástic byly zvoleny dvě rozdílné hodnoty pracovního potenciálu 0,8 nebo -0,1 V. V případě modifikované CPE s imobilizovanými AO a HRP bylo měření provedeno při hodnotě potenciálu -0,2 V. U elektrod bez enzymů byly sledovány odezvy po přídavcích H2O2 v rozmezí koncentrací 10-150 mol.l-1 (oxidace) či 1001500 mol.l-1 (redukce). Z naměřených hodnot byly vytvořeny kalibrační křivky, pro představu jsou uvedené kalibrační křivky pro nemodifikovanou CPE při kladném nebo záporném potenciálu, které ukazuje obr. 60A, respektive 60B. Hodnota směrnice odpovídá citlivosti (sensitivitě) elektrody. Cílem bylo připravit enzymovou elektrodu vhodnou pro stanovení biogenních aminů v potravinách. Kromě enzymu AO, byla imobilizována i HRP, která po aminoxidasové reakci katalyzuje oxidaci hydrochinonu na chinon, který může být redukován na elektrodě. Odezvy enzymové elektrody s imobilizovanou AO a HRP po přídavcích kadaverinu (10-100 mol.l-1) a fixní koncentrace hydrochinonu (100 mol.l-1) jsou uvedeny na obr. 61. Příslušnou kalibrační křivku dané elektrody znázorňuje obr. 62. Z kalibračních křivek všech typů elektrod byla stanovena citlivost elektrody, byl určen elektrochemický šum a vypočítána hodnota LOD. Data získaná pro všechny typy elektrod na bázi uhlíkové pasty jsou shrnuta v tab. 10. LOD příslušné elektrody

- 94 -

s oxidoreduktasami byl u hodnoty 0,6 mol.l-1, což je žádoucí pro použití elektrody v praxi. Z uvedených výsledků je vidět, že připravenou enzymovou elektrodu z modifikované uhlíkové pasty by bylo možné aplikovat pro potenciální stanovení biogenních aminů v potravinářském průmyslu. Výhodou tohoto elektrodového systému je, že lze pracovat při hodnotě záporného potenciálu, nedochází tedy k oxidaci rušivých látek na elektrodě a naměřené signály odpovídají měřenému analytu. Studie Gasparini et al. (1994) popisuje přípravu bioelektrody z uhlíkové pasty modifikované Sepharosou s imobilizovanými biokatalyzátory. V případě navázané glukosaoxidasy (EC 1.1.3.4.) z Aspergillus niger byl stanoven LOD pro glukosu 10 mol.l-1. V případě imobilizované hrachové AO a HRP bylo dosaženo hodnoty LOD pro kadaverin 2 mol.l-1 a pro hovězí AO stanovili LOD pro spermin 1 mol.l-1. Měření bylo provedeno při potenciálu 0,2 V a jako mediátor byl zvolen ferrocen.

A

B

Obr. 60. A) Kalibrační křivka – přídavky peroxidu vodíku (10-150 mol.l-1) v prostředí 0,1 mol.l-1 KPB, pH 7 při potenciálu 0,8 V. B) Kalibrační křivka – přídavky peroxidu vodíku (100-1500 mol.l-1) v prostředí 0,1 mol.l-1 KPB, pH 7 při potenciálu -0,1 V. Měření bylo provedeno pro nemodifikovanou CPE.

- 95 -

Obr. 61. Závislost měřeného proudu na čase pro systém modifikované CPE s navázanými enzymy. Postupné přídavky standardního kadaverinu (10-100 mol.l-1) a fixní koncentrace hydrochinonu (100 mol.l-1) v pracovní nádobce. Měření bylo provedeno při hodnotě potenciálu -0,2 V.

Obr. 62. Kalibrační křivka – přídavky kadaverinu (10-100 mol.l-1) v prostředí 0,1 mol.l-1 KPB, pH 7 při potenciálu -0,2 V.

- 96 -

Tab. 10. Shrnutí hodnot citlivosti, elektrochemického šumu a limitu detekce pro nemodifikovanou

CPE,

modifikovanou

CPE

a

modifikovanou

CPE

s imobilizovanými enzymy.

Typ elektrody

E [V]

Přídavky

Citlivost

Elektro. šum

LOD

[mol.l-1]

[nA.mol.l-1]

[nA]

[mol.l-1]

CP

+0,8

H2O2; 10 - 150

0,44

0,2

1,4

CP + Fe3O4

+0,8

H2O2; 10 - 150

0,24

0,1

1,5

CP

-0,1

H2O2; 100 - 1500

0,0007

0,06

252,5

CP + Fe3O4

-0,1

H2O2; 100 - 1500

0,008

0,24

94,8

CP + Fe3O4 + AO + HRP

-0,2

KAD; 10 - 100

0,24

0,05

0,6

HQ; 100

4.6.2. Stanovení kinetických parametrů oxidoreduktas U imobilizovaných oxidoreduktas byly stanoveny kinetické parametry Km a V a porovnány s hodnotami volného enzymu. Stanovení bylo provedeno z důvodu ověření, zda po imobilizaci enzymů na magnetické nosiče dochází ke zvýšení nebo snížení afinity AO a HRP pro substráty kadaverin a hydrochinon. Pro AO byly zvoleny koncentrace kadaverinu v rozmezí 0,025 – 1 mmol.l-1, měření bylo provedeno při  = 555 nm (Stevanato et al., 1990). Pro HRP byly koncentrace hydrochinonu zvoleny v rozmezí 0,01 – 1,5 mmol.l-1 a měření bylo realizováno při  = 245 nm (Vianello et al., 2007). Stanovení kinetických parametrů pro volnou a imobilizovanou AO a HRP představuje obr. 63A a 63B. Naměřené hodnoty kinetických parametrů pro volné a imobilizované oxidoreduktasy jsou shrnuty v tab. 11. Z výsledků je vidět, že u obou typů oxidoreduktas došlo po kovalentní imobilizaci k mírnému zvýšení hodnoty Km, imobilizované enzymy tedy vykazují nižší afinitu k příslušným substrátům. Zvýšené hodnoty Km imobilizovaných enzymů mohou být způsobeny difúzním omezením pro substrát, sterickými zábranami nosiče nebo ztrátou enzymové flexibility, což je důležité pro vazbu substrátu do aktivního místa. Vyhodnocení kinetických parametrů bylo provedeno pomocí programu SigmaPlot (verze 10.0; Jandel Scientific, San Rafael, CA). Ve studii Sinigaglia et al. (2012) došlo po imobilizaci hovězí aminoxidasy na maghemitové nanočástice s rhodaminem B isothiokyanátem ke zvýšení hodnoty Km v porovnání s volnou formou. V práci Stevanato et al. (1989) je vidět, že po imobilizaci vepřové aminoxidasy na Sepharosu také došlo ke zvýšení hodnoty Michaelisovy konstanty, jako substrát byl zvolen kadaverin. V případě navázané křenové peroxidasy

- 97 -

na povrch skla byla hodnota Km po provedení imobilizace snížena (Vianello et al., 2007).

A)

B)

Obr. 63. A) Určení kinetických parametrů volné a imobilizované aminoxidasy; B) Určení kinetických parametrů volné a imobilizované peroxidasy.

Tab. 11. Přehled kinetických parametrů volné a imobilizované aminoxidasy a peroxidasy.

Km [mmol.l-1]

V [A.min-1]

V [M.min-1]

V/Km [min-1]

Volná-AOa

8,49.10-2

6,49.10-1

5,19.10-5

6,1.10-1

Imobilizovaná-AOa

1,63.10-1

1,23.10-1

9,8.10-6

6,0.10-2

Volná HRPb

8,76.10-2

1,42.10-2

6,47.10-7

7,38.10-3

Imobilizovaná-HRPb

2,04.10-1

5,38.10-2

2,44.10-6

1,19.10-2

Enzym

a

substrát kadaverin

b

substrát hydrochinon

- 98 -

4.6.3. TEM analýza imobilizovaných oxidoreduktas Velikost a morfologie nanočástic biogenního magnetitu s imobilizovanou AO a HRP byla zhodnocena pomocí transmisní elektronové mikroskopie (obr. 64). Navázání enzymů na povrch magnetických nanočástic bylo také potvrzeno spektrofotometrickým stanovením aktivity příslušných enzymů.

A)

AO + HRP

B)

Obr. 64. A) TEM snímek nanočástic biogenního magnetitu modifikovaných chitosanem. B) Biogenní magnetit s kovalentně imobilizovanou AO a HRP.

- 99 -

5. Závěr Teoretický úvod první části disertační práce pojednává o magnetických nanočásticích oxidů železa, jejich přípravě, povrchové modifikaci a charakterizaci nanočástic. Navazuje část, která je věnována imobilizačním technikám a bioaplikacím, které zahrnují imobilizaci proteinů a mikrobiálních buněk, využití nanočástic pro konstrukci bioelektrod biosensorů a nano-medicínské obory. Předmětem experimentální části byla chemická modifikace hovězího trypsinu s využitím cyklodextrinů nebo biotinylačního činidla. Měřením molekulové hmotnosti trypsinu metodou MALDI-TOF MS bylo potvrzeno, že se podařilo zmodifikovat 6-7 aminoskupin v molekule trypsinu. Následovala kovalentní imobilizace nativního trypsinu a jeho konjugátů na bakteriální nebo syntetické mikro- nebo nanočástice magnetitu s různými typy funkcionalizující vrstvy. Připravené nanočástice modifikované různými materiály byly charakterizovány z pohledu magnetizačního měření pomocí SQUIDu a porovnány s nanočásticemi po imobilizaci proteinu. Z poklesu hodnot saturační magnetizace bylo potvrzeno, že došlo k navázání diamagnetické látky (proteinu) na povrch nanočástic magnetitu. Imobilizovaný trypsin a jeho konjugáty byly podrobeny měření teplotní stability, pH optima, stability při skladování a operační stability. Trypsinové konjugáty vykazovaly vyšší teplotní stabilitu v porovnání s nativní formou, po navázání na magnetické nosiče byla tato stabilita ještě zvýšena. Po chemické modifikaci a kovalentní imobilizaci trypsinu nedošlo k výrazné změně hodnoty pH optima, což je důležité pro jeho aplikace. Kladný vliv modifikace a imobilizace byl také prokázán při stabilitě trypsinu při skladování. Jednou z výhod imobilizovaných enzymů je možnost jejich opakovaného použití, což bylo také potvrzeno. Biogenní magnetit byl aplikován jako modifikátor elektrody z uhlíkové pasty s obsahem aminoxidasy a peroxidasy pro stanovení aminů v potravinách. Glykovaný nebo biotinylovaný trypsin navázaný na povrchu nanočástic magnetitu byl využit pro MALDI-TOF peptidové mapování. Oproti standardnímu postupu byla zkrácená doba štěpení (1-2 h), neboť při použití termostabilních trypsinových konjugátů mohla být proteolýza provedena za vyšší teploty (50°C). Výsledky hmotnostní spektrometrie byly srovnatelné jako při štěpení proteinů v roztoku standardním postupem (12 h, 37°C). Ve výsledných spektrech byly značně redukovány nežádoucí autolytické štěpy. Vhodným výběrem magnetických nanočástic s imobilizovaným termostabilním trypsinem lze tento enzymový magnetický systém aplikovat jako účinný nástroj

v proteomickém

modifikovaného

výzkumu.

biogenního

Hlavní

magnetitu

předností

izolovaného

této

práce

z bakterie

je

použití

Magnetospirillum

gryphiswaldense MSR-1, jehož unikátními vlastnostmi je chemická čistota, uniformní velikost a velká plocha povrchu. Těmito biogenními nanomateriály se zabývá jen

- 100 -

několik pracovišť na celém světě. Závěrem lze říci, že se nám podařilo navrhnout a zrealizovat vysoce unikátní magnetický systém založený na biogenním magnetitu a aplikovat ho jako vhodný magnetický nosič pro kovalentní imobilizaci vysoce termostabilního trypsinu s následným využitím v proteomice pro MALDI-TOF peptidové mapování. Důležitým přínosem bylo zvýšení teploty a snížení doby proteolýzy a eliminace rušivých autolytických fragmentů trypsinu ve výsledných hmotnostních spektrech. Magnetický systém s imobilizovaným trypsinem vykazoval poměrně vysokou teplotní stabilitu, operační stabilitu, ale i stabilitu při skladování v porovnání s publikovanými výsledky jiných pracovišť.

- 101 -

6. Použitá literatura Akkaya B., Uzun L., Altintas E. B., Candan F., Denizli A. (2009) Concavalin A immobilized monosize and magnetic poly(glycidy methacrylate) beads for use in yeast invertase adsorption. J. Macromol. Sci., Part A: Pure Appl. Chem. 46, 232 – 239. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. (2002) Molecular Biology of the Cell, 4th ed, pp. 560 – 562, Garland Science, New York. Amankwa L. N., Kuhr W. G. (1993) On-line peptide mapping by capillary zone electrophoresis. Anal. Chem. 65, 2693 – 2697. Ambashta R. D., Silanpää M. (2010) Water purification using magnetic assistance: A rewiev. J. Hazard. Mater. 180, 38 – 49. Anirudhan T. S., Rejeena S. R. (2012) Adsorption and hydrolytic activity of trypsin on a carboxylate-functionalized cation exchanger prepared from nanocellulose J. Colloid Interface Sci. 381, 125 – 136. Ansari S. A., Husain Q. (2012) Potential applications of enzymes immobilized on/in nano materials: A review Biotechnol. Adv. 30, 512 – 523. Anzai J., Hoshi T., Osa T. (1994) Avidin-biotin complexation for enzyme sensor applications. Trends. Anal. Chem. 13, 205 – 210. Arnold P., Ward J., Wilson D., Guthrie J. A., Robinson P. J. (2003) Superparamagnetic iron oxide (SPIO) enhancement in the cirrhotic liver: a comparison of two doses of ferumoxides in patients with advanced disease. Magn. Reson. Imaging 21, 695 – 700. Bark S. J., Muster N., Yates J. R., Siuzdak G. (2001) High-temperature protein mass mapping using a thermophilic protease. J. Am. Chem. Soc. 12, 1774 – 1775. Bayramoğlu G., Yilmaz M., Senel A. Ü., Arica M. Y. (2008) Preparation of nanofibrous polymer grafted magnetic poly (GMA-MMA)-g-MAA beads for immobilization of trypsin via adsorption. Biochem. Eng. J. 40, 262 – 274. Bayer E. A., Ben-Hur H., Wilchek M. (1990) Analysis of proteins and glycoproteins on blots. Method. Enzymol. 184, 415 – 429. Belessi V., Zboril R., Tucek J., Mashlan M., Tzitzios V., Petridis D. (2008) Ferrofluids from Magnetic-Chitosan Hybrids. Chem. Mater. 20, 3298 – 3305. Benelmekki M., Xuriguera E., Caparros C., Rodríguez-Carmona E., Mendoza R., Corchero J. L., Lanceros-Mendez S., Martinez Ll. M. (2012) Design and characterization of Ni2+ and Co2+ decorated porous magnetic silica spheres synthetized by hydrothernal-assisted modified-Stöber method for His-tagged proteins separations. J. Colloid Interface Sci. 365, 156 – 162. Bílková Z., Slováková M., Minc N., Fütterer C., Cecal R., Horák D., Beneš M., Potier I., Křenková J., Przybylski M., Viovy J. L. (2006) Functionalized magnetic micro- and nanoparticles: Optimization and application to µ-chip tryptic digestion. Electrophoresis 27, 1811 – 1824.

- 102 -

Böyükbayram A. E., Kiralp S., Toppare L., Yağci Y. (2006) Preparation of biosensors by immobilization of polyphenol oxidase in conducting copolymers and their use in determination of phenolic compounds in red wine. Bioelectrochemistry 69, 164 – 171. Bradford M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248 – 254. Brena B. M., Batista-Viera F. (2006) Immobilization of Enzymes. Methods in Biotechnology: Immobilzation of Enzymes and Cells, (Guisan J. M., ed.), pp. 1-30, Humana Press Inc, Totowa, New Jersey. Can K., Ozmen M., Ersoz M. (2009) Immobilization of albumin on aminosilane modified superparamagnetic magnetite nanoparticles and its characterization. Colloids Surf., B. 71, 154 – 159. Cornell, R. M., Schwertmann, U. (eds.) (2003): The Iron Oxides. Structure, Properties, Reactions, Occurences and Uses. WILEY-VCH GmbH & Co.KGaA, ISBN: 3-52730274-3. Davis M. T., Lee T. D., Ronk M., Hefta S. A. (1995) Microscale immobilized protease reactor columns for peptide mapping by liquid chromatography mass spectral analyses. Anal. Biochem. 224, 235 – 244. Daneshgar P., Norouzi P., Ganjali M. H., Dousty F. (2009) A Dysprosium Nanowire Modified Carbon Paste Electrode for Determination of Nanomplar Level of Diphenhydramin by Continuous Square Wave Voltammetry in Flow Injection System. Int. J. Electrochem. Sci. 4, 444 – 457. DeSantis G., Jones B. (1999) Chemical modification of enzymes for enhanced functionality. Curr. Opin. Biotechnol. 10, 324 – 330. Dormann J. L., Fiorani D., Tronc E. (1997) Magnetic relaxation in fine-particle systems. Adv. Chem. Phys. 98, 283 – 494. Elnashar M. M. M. (2010) Review Article: Immobilized Molecules Using Biomaterials and Nanobiotechnology. J. Biomater. Nanobiotechnol. 1, 61 – 77. Elsner Ch., Grahn S., Bauer S., Ullmann D., Kurth T., Jakubke H. D. (2000) Effects of chemical modification of lysine residues in trypsin. J. Mol. Catal. 8, 193 – 200. Faivre D., Schüler D. (2008) Magnetotactic bacteria and magnetosomes. Chem. Rev. 108, 4875 – 4898. Fernández M., Fragoso A., Cao R., Banos M., Villalonga M. L., Villalonga R. (2002) Stabilization of trypsin by chemical modification with -cyclodextrin monoaldehyd. Biotechnol. Letters 24, 1455 – 1459. Filipová Z., Kukutschová J., Mašlán M. (2012) Rizika nanomateriálů, pp. 5, Univerzita Palackého v Olomouci, ČR. Gasparini R., Scarpa M., Vianello F., Mondovi B., Rigo A. (1994) Renewable miniature enzyme-based sensing devices. Anal. Chim. Acta 294, 299 – 304.

- 103 -

Glazer A. N., Bar-Eli A., Katchalski E. (1962) Preparation and characterization of polytyrosyl trypsin. J. Biol. Chem. 237, 1832 – 1838. Godjevargova T., Konsulov V., Dimov A., Vasileva N. (2000) Behavior of glucose oxidase immobilized on ultrafiltration membranes obtained by copolymerizing acrylonitrile and N-vinylimidazol. J. Membr. Sci. 172, 279 – 285. Gomes F. M., Silva G. S., Pinatti D. G., Conte R. A., Castro H. F. (2005) Wood Cellulignin as an Alternative Matrix for Enzyme Immobilization. Appl. Biochem. Biotechnol. 121-124, 255 – 268. Goradia D., Cooney J., Hodnett B. K., Magner E. (2005) The adsorption characteristics, activity and stability of trypsin onto mesoporous silicates. J. Mol. Catal. B-Enzym. 32, 231 – 239. Graille M., Stura E. A., Corper A. L. Sutton B. J., Taussig M. J., Charbonnier J. B., Silverman G. J. (2000) Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: Structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity. Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5399 – 5404. Grünberg K, Müller E. C., Otto A., Reszka R., Linder D., Kube M., Reinhardt R., Schüler D. (2004) Biochemical and Proteomic Analysis of the Magnetosome Membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense. Appl. Environ. Microb. 70, 1040 – 1050. Gülce H., Gülce A., Yildiz A. (2002) A novel Two-enzyme amperometric electrode for lactose determination. Anal. Sci. 18, 147 – 150. Hardouin J. (2007) Protein sequence information by Matrix-assisted laser desorption/ionization in-source decay mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 26, 672 – 682. Hartley B. S. (1960) Proteolytic enzymes. Annu. Rev. Biochem. 29, 45 – 72. Havliš J., Shevchenko A. (2004) Absolute quantification of proteins in solutions and in polyacrylamide gels by mass spectrometry. Anal. Chem. 76, 3029 – 3036. Hernández K., Fernández L., Gómez L., Villalonga R. (2006) Glycosidation of trypsin with end-group activated dextran. Process Biochem. 41, 1155 – 1159. Heyen U., Schüler D. (2003) Growth and magnetosome formation by microaerophilic Magnetospirillum strains in an oxygen-controlled fermentor. Appl. Microbiol. Biotechnol. 61, 536 – 544. Hong J., Gong P., Xu D., Dong L., Yao S. (2007) Stabilization of -chymotrypsin by covalent immobilization on amine-functionalized superparamagnetic nanogel. J. Biotechnol. 128, 597 – 605. Hrčková M., Šturdík E., Maliar T., Zemanovič J. (2004) Biochemical properties of proteolytic enzymes. Chem. Listy 98, 842 – 850. Hrubý M., Kučka J., Kozempel J., Lebeda O. (2006) Targeted polymeric drug carriers in the therapy of tumor diseases. Chem. Listy 100, 10 – 16.

- 104 -

Hubbard S. J., Eisenmenger F., Thornton J. M. (1994) Modeling studies of the change in conformation required for cleavage of limited proteolytic sites. Protein Sci. 3, 757 – 768. Chamrád I., Strouhal O., Řehulka P., Lenobel R., Šebela M. (2011) Microscale affinity purification of trypsin reduces background peptides in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of protein digests. J. Proteom. 74, 948 – 957. Chan H. T., Do Y. Y., Huang P. L., Chien P. L., Chan T. S., Liu R. S., Huang C. Y., Yang S. Y., Horng H. E. (2006) Preparation and properties of bio-compatible magnetic Fe3O4 nanoparticles. J. Magn. Magn. Mater. 304, 415 – 417. Chan D. C. F., Kirpotin D. B., Bunn P. A. (1993) Synthesis and evaluation of colloidal magnetic iron oxides for the site-specific radiofrequency-induced hyperthermia of cancer. J. Magn. Magn. Mater. 122, 374 – 378. Chmelík J. (2005) Proteomický průvodce. Chem. Listy 99, 883 – 885. Choi J., Lee J. I., Lee Y. B., Hong J. H., Kim I. S., Park Y. K., Hur N. H. (2006) Immobilization of biomolecules on biotinylated magnetic ferrite nanoparticles. Chem. Phys. Lett. 428, 125 – 129. Invernizzi N. (2011) Nanotechnology between the lab and the shop floor: what are the effects on labor? J. Nano. Res. 13, 2249 – 2268. Janolino V. G., Swaisgood H. E. (2002) Trypsin immobilization on derivatized cellulose by biospecific avidin-biotin interaction and characterization of the immobilized activity. J. Food Biochem. 26, 119 – 129. Jeng J., Lin M. F., Cheng F. Y., Yeh C. S., Shiea J. (2007) Using high-concentration trypsin-immobilized magnetic nanoparticles for rapid in situ protein digestion at elevated temperature. Rapid Commun. Mass Spectrom. 21, 3060 – 3068. Jin X., Li J. F., Huang P. Y., Dong X. Y., Guo L. L., Yang L., Cao Y. C., Wei F., Zhao Y. D., Chen H. (2010) Immobilized protease on the magnetic nanoparticles used for the hydrolysis of rapeseed meals. J. Magn. Magn. Mater. 322, 2031 – 2037. Jogler C., Schüler D. (2007) Genetic analysis of magnetosome biomineralization in magnetoreception and magnetosomes in bacteria. (Dirk Schüler) Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2007, p. 133 – 161. Johnson J., Kent T., Koda J., Peterson C., Rudge S., Tapolsky G. (2002) The MTC technology: a platform technology for the site-specific delivery of pharmaceutical agents. Eur. Cells Mater. 3, 12 – 15. Kahn P. (1995) From genome to proteome: looking at a cell´s proteins. Science 270, 369 – 370. Kalkan N. A., Aksoy S., Aksoy E. A., Hasirci N. (2012) Preparation of chitosan-coated magnetite nanoparticles and application for immobilization of laccase. J. Appl. Polym. Sci. 123, 707 – 716. Kalska-Szostko B., Rogowska M., Dubis A., Szymański K. (2012) Enzymes immobilization on Fe3O4-gold nanoparticles. Appl. Surf. Sci. 258, 2783 – 2787.

- 105 -

Kirschvink J. L., Kobayashi-Kirschvink A., Woodford B. J. (1992) Magnetite biomineralization in the human brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7683 – 7687. Kluchova K., Zboril R., Tucek J., Pecova M., Zajoncova L., Safarik I., Mashlan M., Markova I., Jancik D., Sebela M., Bartonkova H., Bellesi V., Novak P., Petridis D. (2009) Superparamagnetic maghemite nanoparticles from solid-state synthesis – Their functionalization towards peroral MRI contrast agent and magnetic carrier for trypsin immobilization. Biomaterials 30, 2855 – 2863. Kuznetsov A. A., Shlyakhtin O. A., Brusentsov N. A., Kuznetsov O. A. (2002) “Smart” mediators for self-controlled inductive heating. Eur. Cells Mater. 3, 75 – 77. Laurent S., Forge D., Port M., Roch A., Robic C., Elst L. V., Miller R. N. (2008) Magnetic Iron Oxide Nanoparticles: Synthesis, Stabilization, Vectorization, Physicochemical Characterizations, and Biological Applications. Chem. Rev. 108, 2064 – 2110. Ladero M., Santos A., García-Ochoa F. (2000) Kinetic modeling of lactose hydrolysis with an immobilized galactosidase from Kluyveromyces fragilis. Enzyme Microb. Technol. 27, 583 – 592. Laemmli U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. Nature, 227, 680 – 685. Lee H., Shao H., Huang Y., Kwak B. (2005) Synthesis of MRI contrast agent by coating superparamagnetic iron oxide with chitosan. IEEE T. Magn. 41, 4102 – 4104. Lei L., Bai Y., Li Y., Yi L., Yang Y., Xia C. (2009) Study of immobilization of lipase onto magnetic microspheres with epoxy groups. J. Magn. Magn. Mater. 321, 252 – 258. Lei Z., Bi S. (2007) The silica coated chitosan particle from a lyaer-by-layer approach for pektinase immobilization. Enzyme Microb. Technol. 40, 1442 – 1447. Lemarchand C., Ruxandra G., Couvreur P. (2004) Polysaccharide-decorated nanoparticles. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58, 327 – 341. Li Y., Xu X., Deng Ch., Yang P., Zhang X. (2007) Immobilization of trypsin on superparamagnetic nanoparticles for rapid and effective proteolysis. J. Proteome. Res. 6, 3849 – 3855. Li B. D., Teoh W. Y., Gooding J. J., Selomulya C., Amal R. (2010) Functionalization strategies for protease immobilization on magnetic nanoparticles. Adv. Funct. Mater. 20, 1767 – 1777. Liang Y. Y., Zhang L. M. (2007) Bioconjugation of papain on superparamagnetic nanoparticles decorated with carboxymethylated chitosan. Biomacromolecules 8, 1480 – 1486. Liu J., Lin S., Qi D., Deng C., Yang P., Zhang X. (2007) On-chip enzymatic microreactor using trypsin-immobilized superparamagnetic nanoparticles for highly efficient proteolysis. J. Chromatogr. A 1176, 169 – 177. Lin M. S., Leu H. J. (2005) A Fe3O4-based chemical sensor for cathodic determination of hydrogen peroxide. Electroanalysis 17, 2068 – 2073.

- 106 -

Lin S., Lin Z., Yao G., Deng C., Yang P., Zhang X. (2007) Development of microwaveassisted protein digestion based on trypsin-immobilized magnetic microspheres for highly efficient proteolysis followed by matrix-assisted laser desorption/ionization timeof-flight mass spectrometry analysis. Rapid Commun. Mass Spectrom. 21, 3910 – 3918. Lin S., Yao G., Qi D., Li Y., Deng C., Yang P., Zhang X. (2008) Fast and efficient proteolysis by microwave-assisted protein digestion using trypsin-immobilized magnetic silica microspheres. Anal. Chem. 80, 3655 – 3665. Lübbe A. S., Alexiou C., Bergemann C. (2001) Clinical applications of magnetic drug targeting. J. Surg. Res. 95, 200 – 206. Luo X., Liu S., Zhou J., Zhang L. (2009) In situ synthesis of Fe3O4/cellulose microspheres with magnetic-induced protein delivery. J. Mater. Chem. 19, 3538 – 3545. Ma M., Zhang Y., Yu W., Shen H. Y., Zhang H. Q., Gu N. (2003) Preparation and characterization of magnetite nanoparticles coated by amino silane. Colloid Surf. A 212, 219 – 226. Maciel J. C., Andrad P. L., Neri D. F. M., Jr.Carvalho L. B., Cardoso C. A., Calazans G. M. T., Aguiar Albino J., Silva M. P. C. (2012) Preparation and characterization of magnetic levan particles as matrix for trypsin immobilization. J. Magn. Magn. Mater. 324, 1312 – 1316. Magro M., Sinigaglia G., Nodari L., Tucek J., Polakova K., Marusak Z., Cardillo S., Salviulo G., Russo U., Stevanato R., Zboril R., Vianello F. (2012) Charge binding of rhodamine derivate to OH- stabilized nanomaghemite – Universal nanocarrier for construction of magnetofluorescent biosensors. Acta Biomater. 8, 2068 – 2076. Markova I., Kluchova K., Zboril R., Mashlan M., Herman M. (2010) Small bowel imaging – still a radiologic approach? Biomed. Pap. 154, 123 – 132. Markova Z., Siskova K., Filip J., Safarova K., Prucek R., Panacek A., Kolar M., Zboril R. (2012) Chitosan-based synthesis of magnetically-driven nanocomposites with biogenic magnetite core, controlled silver size, and high antimicrobial activity. Green Chem. 14, 2550 – 2558. Massart R. (1981) Preparation of aqueous magnetic liquids in alkaline media. IEEE Trans. Magn. 17, 1247 – 1248. Matsunaga T., Sakaguchi T., Tadokoro F. (1991) Magnetite formation by a magnetic bacterium capable of growing aerobically. Appl. Microbiol. Biotechnol. 35, 651 – 655. Matsunaga T., Okamura Y. (2003) Genes and proteins involved in bacterial magnetic particle formation. Trends Microbiol. 11, 536 – 541. Moatti-Sirat D., Capron F., Poitout V., Reach G., Bindra D. S., Zhang Y., Wilson G. S., Thévenot D. R. (1992) Towards continuous glucose monitoring: in vivo evaluation of a miniaturized glucose sensor implanted for several days in rat subcutaneous tissue. Diabetologia 35, 224 – 230.

- 107 -

Morag E., Bayer E. A., Wilchek M. (1996) Immobilized nitro-avidin and nitrostreptavidin as reusable affinity matrices for application in avidin-biotin technology. Anal. Biochem. 243, 257 – 263. Murphy A., Fágáin C. Ó. (1996) Stability characteristics of chemically-modified soluble trypsin. J. Biotechnol. 49, 163 – 171. Namdeo M., Bajpai S. K. (2009) Immobilization of -amylase onto cellulose-coated magnetite (CCM) nanoparticles and preliminary starch degradation study. J. Mol. Catal. B 59, 134 – 139. Nel A. L., Krenkova J., Kleparnik K., Smajda C., Taverna M., Viovy J. L., Foret F. (2008) On-chip tryptic digest with direct coupling to ESI-MS using magnetic particles. Electrophoresis 29, 4944 – 4947. Nikolic T., Kostic M., Praskalo J., Pejic B., Petronijevic Z., Skundric P. (2010) Sodium periodate oxidized cotton yarn as carrier for immobilization of trypsin. Carbohyd. Polym. 82, 976 – 981. Nishiyama N., Okazaki S., Cabral H., Miyamoto M., Kato Y., Sugiyama Y., Nishio K., Matsumura Y., Kataoka K. (2003) Novel cisplatin-incorporated polymeric micelles can eradicate solid tumors in mice. Cancer Res. 63, 8977 – 8983. Numanoğlu Y., Sungur S. (2004) β-galactosidase from Kluyveromyces lactis cell disruption and enzyme immobilization using a cellulose–gelatin carrier system. Process. Biochem. 39, 703 – 709. Nureddin A., Inagami T. (1975) Chemical modification of amino groups and guanidino groups of trypsin. Biochem. J. 147, 71 – 81. Oakey L., Mulcahy P. (2004) Immobilized cofactor derivatives for kinetic-based enzyme capture strategies: direct coupling of NAD(P)+. Anal. Biochem. 335, 316 – 325. Olsen J. V., Ong S. E., Mann M. (2004) Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Mol. Cell. Proteomics 3, 608 – 614. Oztürk N., Günay M. E., Akgöl S., Denizli A. (2007) Silane-Modified Magnetic Beads: Application to Immunoglobulin G Separation. Biotechnol. Prog. 23, 1149 – 1156. Pandey A., Mann M. (2000) Proteomics to study genes and genomes. Nature 405, 837 – 846. Pankhurst Q. A., Connolly J., Jones S. K., Dobson J. (2003) Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine. J. Phys. D: Appl. Phys. 36, R167 – R181. Perona J. J, Craik Ch. S. (1997) Evolutionary Divergence of Substrate Specificity within the Chymotrypsin-like Serine Protease Fold. J. Biol. Chem. 272, 29987 – 29990. Plank C., Schillinger U., Scherer F., Bergemann C., Rémy J. S., Krötz F., Anton M., Lausier J., Rosenecker J. (2003) The Magnetofection Method: Using Magnetic Force to Enhance Gene Delivery. Biol. Chem. 358, 737 – 747. Rawlings N. D., Barret A. J. (1995) Families of aspartic peptidases, and those of unknown catalytic mechanism. Methods Enzymol. 248, 105 – 120.

- 108 -

Rice M. E., Galus Z., Adams R. N. (1983) Graphite paste electrodes: Effects of paste composition and surface states on electron-transfer rates. J. Electroanal. Chem. Interfacial Electrochem. 143, 89 – 102. Rice R. H., Means G. E., Brown W. D. (1977) Stabilization of bovine trypsin by reductive methylation. Biochem. Biophys. Acta 492, 316 – 321. Rotková J., Šuláková R., Korecká L., Zdražilová P., Jandová M., Lenfeld J., Horák D., Bílková Z. (2009) Laccase immobilized on magnetic carriers for biotechnology applications. J. Magn. Magn. Mater. 321, 1335 – 1340. Řezanka P., Záruba K., Král V. (2007) Potenciál modifikovaných nanočástic v analytické chemii. Chem. Listy 101, 881 – 885. Safarik I, Safarikova M. (2007) Magnetically modified microbial cells: A new type of magnetic adsorbents. China Part. 5, 19 – 25. Safarik I., Sabatkova Z., Safarikova M. (2008) Hydrogen Peroxide Removal with Magnetically Responsive Saccharomyces cerevisiae Cells. J. Agric. Food Chem. 56, 7925 – 7928. Safarikova M., Maderova Z., Safarik I. (2009) Ferrofluid modified Saccharomyces cerevisiae cells for biocatalysis. Food Res. Int. 42, 521 – 524. Safarik I, Sabatkova Z., Safarikova M. (2009) Hydrogen Peroxide Removal with Magnetically Responsive Saccharomyces cerevisiae Cells. J. Agric. Food Chem. 56, 7925 – 7928. Safarik I., Safarikova M. (2009) Magnetic nano- and microparticles in biotechnology. Chem. Pap. 63, 497 – 505. Safarik I, Sabatkova Z., Safarikova M. (2009) Invert sugar formation with Saccharomyces cerevisiae cells encapsulated in magnetically responsive alginate microparticles. J. Magn. Magn. Mater. 321, 1478 – 1481. Satapanajaru T., Anurakpongsatom P., Pengthamkeerati P., Boparai H. (2008) Remediation of Atrazine-contaminated Soil and Water by Nano Zerovalent Iron. Water Air Soil Poll. 192, 349 – 359. Saudagar P. S., Singhal R. S. (2004) Curdlan as a support matrix for immobilization of enzymes. Carbohydr. Polym. 56, 483 – 488. Scott T. A., Eagleson M. (1988) Concise Encyclopedia of Biochemistry, Walter de Gruyter, Berlin-New York, USA. Seemüller E., Lupas A., Stock D., Löwe J., Huber R., Baumeister W. (1995) Proteasome from Thermoplasma acidophilum: a threonine protease. Science 268, 579 – 582. Schleifer K. H., Schüler D., Spring S., Weitzenegger M., Amann R., Ludwig W., Koehler M. (1991) The genus Magnetospirillum gen. nov. description of and transfer of Aquaspirillum magnetotacticum to Magnetospirillum magnetotacticum comb.nov. System. Appl. Microbiol. 14, 379 – 385.

- 109 -

Schonburg, D., Salzman, M. (2005) Enzyme Handbook 5, Gesellschaft fur Biotechnologische Forschung. Schüler D. (1999) Formation of magnetosomes in magnetotactic bacteria. J. Molec. Microbiol. Biotechnol. 1, 79 – 86. Schüler D., Frankel R. B. (1999) Bacterial magnetosomes: microbiology, biomineralization and biotechnological applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 52, 464 – 473. Selim K. M. K., Ha Y. S., Kim S. J., Chang Y., Kim T. J., Lee G. H., Kang I. K. (2007) Surface modification of magnetite nanoparticles using lactobionic acid and their interaction with hepatocytes. Biomaterials 28, 710 – 716. Shevchenko A., Tomas H., Havliš J., Olsen J. V., Mann M. (2007) In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat. Protoc. 1, 2856 – 2860. Sinigaglia G., Magro M., Miotto G., Cardillo S., Agostinelli E., Zboril R., Bidollari E., Vianello F. (2012) Catalytically active bovine serum aminoxidase bound to fluorescent and magnetically drivable nanoparticles. Int. J. Nanomed. 7, 2249 – 2259. Skládal P. (2002) Biosensory, pp. 21, 24, 26, 60, 105-106, 120, 125, 127, Masarykova Univerzita, Přírodovědecká fakulta Brno, ČR. Sriram P., Kalogerakis N., Genie L. A. (1996) Experimental determination of the rate of autolysis of trypsin at 37 °C. Biotechnol. Tech. 10, 601 – 606. Stevanato R., Mondovi B., Sabatini S., Rigo A. (1990) Spectrophotometric assay for total polyamines by immobilized amine oxidases. Anal. Chim. Acta 237, 391 – 397. Stevanato R., Porchia M., Befani O., Mondovi B., Rigo A. (1989) Characterization of free and immobilized amino oxidases. Biotechnol. Appl. Biochem. 11, 266 – 272. Suh Y., Jang H. D., Chang H., Kim W. B., Kim H. C. (2006) Size controlled synthesi of Fe-Ni alloy nanoparticles by hydrogen reduction of metal chlorides. Powder Technol. 161, 196 – 201. Sun L., Li Y., Yang P., Zhu G., Dovichi N. J. (2012) High efficiency and quantitatively reproducible protein digestion by trypsin-immobilized magnetic microspheres. J. Chromatogr. A 1220, 68 – 74. Šafaříková M., Šafařík I. (1995) Magnetic biotechnologies. Chem. Listy 89, 280 – 287.

separations

in

biosciences and

Šafařík, I., Šafaříková, M. (2009) Magnetically responsive nanocomposite materials for bioapplications. Solid State Phenom. 151, 88 – 94. Šebela M., Štosová T., Havliš J., Wielsch N., Thomas H., Zdráhal Z., Shevchenko A. (2006) Thermostable trypsin conjugates for high-throughput proteomics: synthesis and performance evaluation. Proteomics 6, 2959 – 2963. Štosová T., Havliš J., Lenobel R., Šebela M. (2005) Proteolytické enzymy: Význam pro proteomiku. Chem. Listy 99, 896 – 905.

- 110 -

Švancara I., Schachl K. (1999) Testing of unmodified carbon paste electrodes. Chem. Listy 93, 490 – 499. Švancara I., Vytřas K., Barek J., Zima J. (2001) Carbon paste electrodes in modern electroanalysis. Anal. Chem. 31, 311 – 345. Tai Y., Wang L., Yan G., Gao J. M., Yu H., Zhang L. (2011) Recent research progress on the preparation and application of magnetic nanospheres. Polym. Int. 60, 976 – 994. Tang Z. X., Qian J. Q., Shi L. E. (2007) Characterizations of immobilized neutral lipase on chitosan nano-particles. Mater. Lett. 61, 37 – 40. Thanh N. T. K. (2011) Magnetic nanoparticles from fabrication to clinical applications, pp. 52, 155, CRC Press, Boca Raton, FL, USA. Thanh N. T. K., Green L. A. V. (2010) Functionalisation of nanoparticles for biomedical applications. Nano Today 5, 213 – 230. Tuček J., Zbořil R., Petridis D. (2006) Maghemite nanoparticles by view of Mössbauer spectroscopy. J. Nanosci. Nanotechnol. 6, 926 – 947. Venkatesh R., Sundaram P. V. (1998) Modulation of stability properties of bovine trypsin after in vitro structural changes with a variety of chemical modifiers. Protein Eng. 11, 691 – 698. Verheul R. J., Amidi M., van Steenbergen M. J., van Riet E., Jiskoot W., Hennink W. E. (2009) Influence of the degree of acetylation on the enzymatic degradation and in vitro biological properties of trimethylated chitosans. Biomaterials 30, 3129 – 3135. Vianello F., Zennaro L., Rigo A. (2007) A coulometric biosensor to determine hydrogen peroxide using a monomolecular layer of horseradish peroxidase immobilized on a glass surface. Biosen. Bioelectron. 22, 2694 – 2699. Villalonga R., Villalonga M. L., Gómez L. (2000) Preparation and functional properties of trypsin modified by carboxymethylcellulose. J. Mol. Catal., B 10, 483 – 490. Villalonga R., Fernández M., Fragoso A., Cao R., Mariniello L., Porta R. (2003) Thermal stabilization of trypsin by enzymic modification with -cyclodextrin derivates. Biotechnol. Appl. Biochem. 38, 53 – 59. Vorm O., Roepstorrff P., Mann M. (1994) Improved resolution and very high sensitivity in MALDI-TOF of matrix surfaces made by fast evaporation. Anal. Chem. 66, 3281 – 3287. Wal P., Giesen H. J., Videler J. J. (2000) Radular teeth as models for the improvement of industrial cutting devices. Mater. Sci. Eng., C 7, 129 – 142. Walsh K. A., Neurath H. (1964) Trypsinogen and chymotrypsinogen as homologous proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 52, 884 – 889. Wang S., Bao H., Yang P., Chen G. (2008) Immobilization of trypsin in polyanilinecoated nano-Fe3O4/carbon nanotube composite for protein digestion. Anal. Chim. Acta 612, 182 – 189.

- 111 -

Xi F., Wu J., Jia Z., Lin X. (2005) Preparation and characterization of trypsin immobilized on silica gel supported macroporous chitosan bead. Process Biochem. 40, 2833 – 2840. Xie W., Ma N. (2009) Immobilized lipase on Fe3O4 nanoparticles as biocatalyst for biodiesel production. Energy Fuels 23, 1347 – 1353. Xu X., Wang J., Yang C., Wu H., Yang F. (2009) Sol-gel formation of -Fe2O3/SiO2 nanocomposites: Effects of different iron raw material. J. Alloys Compd. 468, 414 – 420. Yang Y. M., Wang J. W., Tan R. X. (2004) Immobilization of glucose oxidase on chitosan SiO2 gel. Enzyme Microb. Technol. 34, 126 – 131. Yao G., Qi D., Deng C., Zhang X. (2008) Functionalized magnetic carbonaceous microspheres for trypsin immobilization and the applications to fast proteolysis. J. Chromatogr. A 1215, 82 – 91. Zajoncová L., Pospíšková K. (2009) Membrány pro amperometrické biosensory. Chem. Listy 103, 291 – 301. Zhang Y., Kohler N., Zhang M. (2002) Surface modification of superparamagnetic magnetite nanoparticles and their intracellular uptake. Biomaterials 23, 1553 – 1561. Zima J., Dejmková H., Němcová L. (2010) Praktické aplikace uhlíkových pastových elektrod. Chem. Listy 104, s528 – s532.

Další použité prameny: http://www.iontosorb.cz/ (14.2.2013) http://www.mr-tip.com/serv1.php (14.2.2013) http://www.rcptm.com/ (14.2.2013)

- 112 -

ČÁST II IZOLACE SULFITOXIDASY Z KUŘECÍCH JATER

- 113 -

7. Úvod V potravinářském průmyslu se používají siřičitany jako aditiva, která zamezují hnědnutí potravin, lze je využít i jako antioxidanty, bělící prostředky a látky inhibující mikrobiální růst, ale i částečný růst kvasinek a plísní. Jedná se o skupinu látek, do které řadíme oxid siřičitý a anorganické soli, které mohou uvolňovat SO2 (Bahmani et al., 2010; Sezgintürk & Dinckaya, 2005). Tato skupina sloučenin bývá označována jako tzv. „éčka“ s E kódem E220 – E228 (Situmorang et al., 1999). Tyto sloučeniny jsou jako konzervační látky obsaženy téměř ve všech vínech. Dalšími typickými výrobky, které jsou ošetřeny pomocí siřičitanů je sušené ovoce, pekařské a masné výrobky. Hlavním problémem dnešní populace je, že tyto látky mohou vyvolat nežádoucí účinky u některých jedinců, proto je nutné koncentrace těchto látek pečlivě monitorovat. Závažná situace může nastat u lidí trpících astmatem např. po konzumaci sušeného ovoce, které bylo ošetřené oxidem siřičitým. Studie ukázaly, že potraviny ošetřené siřičitany, ale i výpary z nich mohou vyvolat astmatický záchvat. Podobný problém mohou způsobit i některá léčiva obsahující tyto látky. Kromě astmatu mohou siřičitany vyvolat i alergické reakce (Bahmani et al., 2010). Citliví jedinci na siřičitany by měli eliminovat potraviny a farmaceutické přípravky obsahující tyto látky. Dalšími negativními účinky po požití potravin obsahující siřičitany jsou nevolnost, vyrážka, průjem a angioedém (Kalimuthu et al., 2010). Studiemi bylo také prokázáno, že siřičitany snižují hladinu thiaminu. Další problém současnosti způsobují siřičitany s dalšími sloučeninami síry v životním prostředí ve formě kyselých dešťů. Vysoké koncentrace sirných sloučenin tak negativně ovlivňují život rostlin a živočichů. Z tohoto důvodu je žádoucí sledovat koncentrace siřičitanů nejen v potravinách a alkoholických nápojích, ale i v přírodě. Analýzu siřičitanů lze provést celou řadou analytických metod. Klasický způsob stanovení zahrnují metody chromatografické. Zajímavým způsobem je detekce SO32s využitím biosensorů. Žádané jsou amperometrické biosensory, kdy povrch elektrody obsahuje imobilizovanou sulfitoxidasu (SOX; EC 1.8.3.1) (Zhao et al., 2006). Koncentraci siřičitanů v biologických vzorcích lze stanovit na základě spotřeby kyslíku anebo vzniku peroxidu vodíku. Hlavním významem enzymu sulfitoxidasy je katalytická přeměna siřičitanů na sírany. Sulfitoxidasa se vyskytuje v rostlinné a živočišné populaci, ale i u mikroorganismů. Zdrojem rostlinné sulfitoxidasy jsou např. mladé listy Arabidopsis thaliana. Živočišný enzym byl úspěšně purifikován z hovězích a kuřecích jater (Kipke et al., 1989).

- 114 -

7.1. Charakterizace enzymu sulfitoxidasy Sulfitoxidasa (SOX; EC 1.8.3.1) je enzym ze třídy oxidoreduktas patřící mezi molybdenové proteiny, které se účastní sirného metabolismu živých organismů. Z fyziologického hlediska SOX katalyzuje dvouelektronovou oxidaci siřičitanů na sírany jak je zřejmé z obr. 65 (Hille, 1996). Enzym byl potvrzen u celé řady živých organismů. Živočišný enzym katalyzuje koncovou reakci oxidativní degradace sirných aminokyselin (Cys, Met). U savců je SOX lokalizována v mezimembránovém prostoru mitochondrie a přirozeným akceptorem elektronů je cytochrom c (Oshino & Chance, 1975). Nejvyšší hladiny enzymu se nachází v ledvinách, játrech a srdci (Cabré et al., 1990). Z pohledu strukturního představuje živočišná SOX homodimer, kde každá podjednotka se skládá ze dvou různě odlišných domén s různými elektronovými akceptory. N-koncová doména představuje cytochrom typu b5, ve kterém se nachází nekovalentně vázaný hemový kofaktor, C-koncová doména váže molybdopterinový kofaktor. Rostlinná SOX byla nalezena v mladých listech tabáku, špenátu a huseníčku (Eilers et al., 2001). Rostlinná SOX je odlišná od živočišné, enzym se nachází v peroxisomech a ve své struktuře obsahuje pouze molybdenovou doménu. Tvoří tak jednoduchý Moco enzym pouze s jedním redoxním centrem. Molybdenový kofaktor (Moco) je hlavní složkou molybdoenzymů. Cílem rostlinného enzymu je snižování koncentrace siřičitanů, které vznikají následkem degradace sirných sloučenin anebo ze znečištěného ovzduší (Schrader et al., 2003). Zajímavostí je bakteriální enzym sulfitdehydrogenasa (SDH; EC 1.8.2.1), která oxiduje siřičitany a nachází se v periplasmě (Kappler & Bailey, 2005). U sulfitoxidasy z kuřecích jater byla jako u prvního zástupce této skupiny enzymů určena krystalová struktura a zároveň to byla i první struktura eukaryotního enzymu obsahujícího molybdenový kofaktor. Určení krystalové struktury je důležité pro představu mechanismu funkce SOX, což nabývá významu hlavně pro medicínu, protože nedostatek SOX způsobuje neurologické abnormality (Shih et al., 1977). V aktivním místě živočišného enzymu, do kterého se váže substrát jsou přítomny 3 argininové zbytky (R138, R190, R450), tryptofan W204 a tyrosin Y322 (Feng et al., 2007; Schrader et al., 2003).

SO32- + H2O

SOX

SO42- + 2 H+ + 2 e-

Obr. 65. Dvouelektronová oxidace siřičitanů na sírany za účasti enzymu sulfitoxidasy.

- 115 -

7.2. Siřičitany – význam jejich stanovení Siřičitany se používají řady let jako přidatné látky (aditiva), které zabraňují hnědnutí potravin. Slouží jako konzervační látky, vyznačují se antibakteriálními vlastnostmi, částečně jsou účinné i proti plísním a kvasinkám. V potravinářském průmyslu se používají jednak pro své antibakteriální vlastnosti, ale i z hlediska antioxidační aktivity, čímž zabraňují změnám barvy (hnědnutí) mnoha potravin (Bahmani et al., 2010; Kalimuthu et al., 2010; Sezgintürk & Dinckaya, 2005; Zhao et al., 2006). Siřičitany se využívají jako bělící látky při sušení ovoce a zeleniny, k bělení chmele, hub, řepného cukru a ořechů. Ze sušeného ovoce jsou typické meruňky, ananas a banány. Hlavním cílem použití těchto látek je tedy prodloužení doby trvanlivosti produktů, zvýraznění jejich chuti a barvy aj. Typickým příkladem již z dávných dob je desinfekce nádob (síření sudů) na víno a sklepních prostor za účasti oxidu siřičitého. Ve vinařském průmyslu se tyto látky používají k likvidaci přirozeně se vyskytujících mikroorganismů, poté se teprve aplikuji kvasinky. Účinek SO32- se využívá i při přepravě vinných hroznů. Kromě vína se siřičitany aplikují i při výrobě piva a nealkoholických ovocných nápojů. Další využití nacházíme při výrobě těsta v pekařských výrobcích, dále při výrobě masa a masných výrobků. Siřičitany slouží k dekontaminaci výrobních zařízení a účinkují jako čiřící látky. Tyto látky náleží do skupiny potravinových aditiv zahrnujících oxid siřičitý a anorganické soli, které jej mohou za určitých okolností uvolňovat (Situmorang et al., 1999). Mluvíme o látkách s E kódem s označením E220 – E228 (tab. 12). Současná legislativa nedovoluje používat siřičitany na čerstvém ovoci a zelenině z důvodu, že mohou reagovat s některými vitaminy (vitamin B1, kyselina folová, nikotinamid aj.) a tudíž dochází k jejich nežádoucí ztrátě (Sezgintürk & Dinckaya, 2005). Ve farmaceutickém průmyslu slouží SO32- ke stabilizaci některých léčiv (Sapers, 1993). Z důvodu, že tyto aditiva používaná v potravinářském a farmaceutickém průmyslu mohou být nebezpečné pro citlivé jedince, je žádoucí koncentraci siřičitanů pravidelně monitorovat. U některých lidí mohou přidatné látky (E220 – E228) vyvolat alergické nebo astmatické reakce. Kritickou situaci může způsobit konzumace potravin, které byly popsanými aditivy ošetřeny, tyto látky mohou vyvolat astmatický záchvat anebo skončit až anafylaktickým šokem (Bahmani et al., 2010; Situmorang et al., 1999). Alergické reakce mohou být slabé, ale ve vážnějších případech mohou končit až ohrožením života nebo smrtí. Nesnášenlivost na siřičitany bývá většinou vrozená. Typickými projevy alergické reakce jsou křeče žaludku, nevolnost a dermatologické problémy (Kalimuthu et al., 2010). Předpokládá se, že citlivé odezvy na siřičitany jsou způsobeny nedostatkem mitochondriálního enzymu SOX. Současná legislativa klade důraz na označení přítomnosti SO32- v potravinářských výrobcích od 10 mg.kg-1. Podle Food and

- 116 -

Drug Administration (FDA) potravinářské výrobky a nápoje s obsahem siřičitanů vyšším než 10 mg.kg-1 či 10 mg.l-1 musí obsahovat ochranné štítky (Bahmani et al., 2010; Zhao et al., 2006). Kromě potravinářství je nutné monitorovat koncentrace siřičitanů i v životním prostředí. V ovzduší se oxid siřičitý oxiduje vzdušným kyslíkem za účasti vody na kyselinu sírovou, která je s kyselinou siřičitou příčinou kyselých dešťů. K uvolňování SO2 dochází sopečnou činností nebo spalováním fosilních paliv. Následkem kyselých dešťů je ohrožení rostlin a živočichů, kontaminace vod a půd. Z pohledu potravinářského odvětví a životního prostředí je tedy nutné kontrolovat koncentrace siřičitanů. Ke stanovení těchto látek je k dispozici řada analytických technik. Pro zajímavost lze uvést některé metody, jako je např. Monier-Williamsova destilace nebo metoda jodometrická (Svitel et al., 1998), jiný způsob zahrnuje metody chromatografické jako je např. IEC nebo HPLC (Situmorang et al., 1999). Zajímavou možností je detekce siřičitanů pomocí biosensorů, nejčastěji amperometrických. Výhodou využití biosensorů je rychlost a automatizace stanovení daných látek. Principem stanovení SO32- je záznam spotřeby kyslíku nebo vzniku peroxidu vodíku za účasti enzymu SOX (EC 1.8.3.1), který je imobilizován na povrchu pracovní elektrody (C, Pt, Au). Princip stanovení SO32- s využitím amperometrického biosensoru s imobilizovanou SOX je uveden na obr. 66. Pro efektivnější přenos elektronů z enzymu na elektrodový povrch se používají nízkomolekulární redoxní látky - mediátory, příkladem může ferrocen, methylenová modř, ferrokyanid, hexakyanoželezitan nebo cytochrom c (Skládal, 2002; Svitel et al., 1998). V pracích Sezgintürk & Dinckaya (2005) a Svitel et al. (1998) je popsána konstrukce biosensoru pro stanovení siřičitanů v potravinách. Rostlinná SOX byla získána z Malva vulgaris a poté navázána na povrch pracovní elektrody pomocí GA jako aktivačního činidla. Podobná studie prezentuje kovalentní imobilizaci SOX z kuřecích jater za účasti EDC a NHS pro stanovení siřičitanů ve vínech. V práci je použita polytyraminová membrána k zadržení interferenčních látek přítomných ve vzorcích (Situmorang et al., 1999). Autoři Zhao et al. (2006) popisují stanovení siřičitanů v pivě s využitím amperometrického biosensoru s imobilizovanou kuřecí SOX. Pro přípravu bioelektrody pro stanovení siřičitanů lze zvolit přípravu a následnou imobilizaci rekombinantní SOX (Temple et al., 2010). Často lze imobilizovat organely nebo celé mikrobiální buňky např. Thiobacillus thiooxidans (Svitel et al., 1998), který vykazuje sulfitoxidasovou aktivitu. Mikrobiální siřičitanový sensor byl velmi stabilní a použit pro stanovení SO32- v potravinářství. Pro konstrukci biosensoru pro stanovení siřičitanů lze kromě SOX použít i bakteriální SDH. Autoři Kalimuthu et al. (2010) popisují imobilizaci SDH získanou ze Starkeya novella a cytochromu c na elektrodu zlata pro stanovení siřičitanů v pivě a bílém víně.

- 117 -

Tab. 12. Přehled aditiv s E-kódem (E220 – E 228). Kód

Sloučenina

E220

Oxid siřičitý

E221

Siřičitan sodný

E222

Hydrogensiřičitan sodný

E223

Disiřičitan sodný (Pyrosiřičitan sodný)

E224

Disiřičitan draselný (Pyrosiřičitan draselný)

E226

Siřičitan vápenatý

E227

Hydrogensiřičitan vápenatý

E228

Hydrogensiřičitan draselný (Kyselý siřičitan draselný)

SO32- + O2 + H2O

SOX

SO42- + H2O2

Obr. 66. Reakce katalyzovaná enzymem sulfitoxidasou při stanovení siřičitanů pomocí biosensoru (Sezgintürk & Dinckaya, 2005).

- 118 -

8. Materiál a metody 8.1. Materiál Cysteamin hydrochlorid, EDTA, chitosan, glutaraldehyd, siřičitan sodný, molybdenan sodný dihydrát (Sigma-Aldrich), cytochrom c z koňského srdce MP Biomedicals (Aurora, OH, USA), aceton (Lach-Ner, ČR). Chlazená kuřecí játra byla zakoupena v supermarketu Albert Olomouc ČR.

8.2. Izolace sulfitoxidasy z kuřecích jater Jako výchozí materiál pro izolaci živočišné sulfitoxidasy byla zvolena chlazená kuřecí játra (500 g). Klíčovými kroky izolace bylo vytvoření acetonového prášku (Cohen & Fridovich, 1971), nakrájené kousky jater byly homogenizovány ve 2 l vymrazeného acetonu (-20°C) a vzniklý homogenát byl přefiltrován přes Büchnerovu nálevku. Acetonový prášek byl vysušen v lednici a poté zamražen. Následovala extrakce vzniklého acetonového prášku (120 g) pomocí 10 mmol.l-1 KPB, pH 7,8 s obsahem 0,1 mmol.l-1 EDTA. Vzniklá homogenní směs byla míchána 45 minut, poté byla provedena centrifugace roztoku (17000 g; 20 minut; 4°C). Supernatant byl podroben dvoustupňové frakcionaci síranem amonným. První vysolování bylo provedeno do 20% nasycení, následovala denaturace zahříváním (1 min; 56°C), druhá centrifugace a supernatant byl dosycen síranem do 50% nasycení. Opět byla provedena centrifugace za stejných podmínek, precipitát byl rozpuštěn v 60 ml 25 mmol.l-1 Tris-HCl pufru (pH 8) s obsahem 0,1 mmol.l-1 EDTA. Po centrifugaci byl načervenalý supernatant dialyzován (3 x 2 l) při 4°C ve stejném pufru s přídavkem 2,5 mmol.l-1 molybdenanu sodného. Detailní popis izolace sulfitoxidasy z kuřecích jater je popsán ve formě přiloženého rukopisu (příloha 5).

8.3. Chromatografická purifikace kuřecí sulfitoxidasy Po dialýze následovalo přečištění SOX pomocí chromatografických metod. Jako první byla provedena iontově výměnná chromatografie (IEC) na koloně naplněné médiem Macro-Prep High Q (2,5 x 20 cm). Průtoková rychlost činila 2 ml.min-1. Ekvilibrace byla provedena pomocí 25 mmol.l-1 Tris-HCl pufru (pH 8) a eluce lineárním gradientem (50 ml) 0-1 mol.l-1 NaCl v ekvilibračním pufru. Frakce, ve kterých byla nejvyšší aktivita SOX, byly shromážděny, následovala dialýza, jak je uvedeno výše a zakoncentrování ultrafiltrací (Amicon, 10 kDa). Enzymový roztok byl následovně přečištěn pomocí IEC na koloně Resource Q (střednětlaká chromatografie). Průtoková rychlost činila 1 ml.min-1, byly zvoleny dvě detekční vlnové délky 280 nm (detekce proteinů) a 410 nm, což odpovídá absorpci hemu, který je součástí živočišné SOX.

- 119 -

Ekvilibrační

pufr

byl

zvolen

25

mmol.l-1

Tris-HCl

(pH

8),

eluce

probíhala

programovaným segmentovým gradientem elučního pufru, který navíc oproti ekvilibračnímu obsahoval 1 mol.l-1 NaCl. Nakonec frakce s nejvyšší aktivitou SOX byly shromážděny a zakoncentrovány ultrafiltrací (Amicon, 10 kDa). Podrobný popis provedení IEC chromatografie je uveden v rukopisu (příloha 5). Po IEC následovalo přečištění s využitím gelové permeační chromatografie (GPC) na koloně Superdex 200 HR 10/30. Mobilní fází byl 25 mmol.l-1 Tris-HCl pufr (pH 8) s obsahem 2,5 mmol.l-1 molybdenanu sodného. Průtoková rychlost činila 0,7 ml.min-1, detekční vlnové délky byly opět 280 a 410 nm. Aktivní enzymové frakce byly spojeny a opět zahuštěny (Amicon, 10 kDa). Nakonec byla provedena adsorpční chromatografie na koloně s keramickým hydroxyapatitem Bio-Scale CHT5-I. Jako ekvilibrační pufr byl použit 25 mmol.l-1 Tris-HCl (pH 8), eluce v tomto případě byla provedena pomocí 0,75 mol.l-1 fosfátového pufru, pH 7. Enzymový roztok byl podroben dialýze proti 25 mmol.l-1 TrisHCl pufru (pH 8) s obsahem 2,5 mmol.l-1 molybdenanu sodného. Po ultrafiltraci (Amicon, 10 kDa) byl přečištěný enzym skladován při teplotě -80°C.

8.4. Stanovení aktivity sulfitoxidasy, SDS-PAGE Aktivita SOX byla stanovena metodou, která je založena na redukci elektronového akceptoru cytochromu c (Cohen & Fridovich, 1971). Stanovení bylo provedeno spektrofotometricky  = 550 nm, kdy je sledován přechod cytochromu c z oxidované formy na redukovanou. Reakce byla provedena v prostředí 0,1 mol.l-1 TrisHCl pufru, pH 8,5 s obsahem 1,3.10-4 mol.l-1 EDTA. Reakce byla zahájena přídavkem 20 l Na2SO3 (koncentrace v kyvetě 0,125 mmol.l-1). Reakce probíhala při teplotě 30°C po dobu tří minut. Koncentrace proteinů byla stanovena metodou Bicinchoninovou (Smith et al., 1985). Separace proteinů během purifikace kuřecí SOX byla charakterizována pomocí SDS-PAGE. Ta byla provedena s použitím 4% zaostřovacího a 10% dělícího polyakrylamidového gelu podle Laemmliho (1970). Separované proteiny byly vizualizovány barvením pomocí Bio-Safe Coomassie Stain a odbarveny destilovanou vodou. Jako komerční standard molekulových hmotností pro SDS-PAGE byla použita směs obsahující fosforylasu b z králičího svalu, 97 kDa; hovězí sérový albumin, 66 kDa; ovalbumin z vaječného bílku, 45 kDa; hovězí karboanhydrasu, 30 kDa; sojový trypsinový inhibitor, 20,1 kDa; -laktalbumin z kravského mléka, 14,4 kDa.

- 120 -

8.5. MALDI-TOF peptidové mapování MALDI-TOF peptidové mapování se používá k identifikaci neznámých proteinů, ale i k potvrzení přítomnosti studovaného proteinu (sulfitoxidasy). Proteinový vzorek se podrobí proteolytickému štěpení v roztoku nebo gelu. Nejčastěji se ke štěpení proteinů používá specifická proteasa trypsin. Vzniklé peptidové fragmenty jsou analyzovány hmotnostní spektrometrií MALDI-TOF. Pomocí software je vyhodnoceno získané spektrum a provedeno jeho porovnání s teoretickými hodnotami peptidových hmotností odvozených ze sekvencí v databázi. Úspěšná identifikace je proto založena na výskytu daného proteinu (případně vysoce homologního proteinu) v databázi. Proteinové pásy vizualizované pomocí Bio-Safe Coomassie Stain byly vyřezány pomocí skalpelu z gelu a podrobeny proteinovému štěpení podle standardního postupu (Havliš et al., 2003; Shevchenko et al., 2007). Jako štěpící činidlo byl zvolen modifikovaný trypsin (Šebela et al., 2006). Štěpení probíhalo 12 h při 37°C. Vzniklé digesty byly následně použity pro MALDI-TOF MS analýzu. Jako MALDI matrice byla zvolena CHCA ve formě saturovaného roztoku v 50 % acetonitrilu/ 0,1 % TFA (1:2, v/v). Následující postup je shodný s popisem v kapitole 3.10.

8.6. Imobilizace kuřecí sulfitoxidasy na povrch zlaté elektrody Nejprve byl povrch zlaté elektrody (obr. 67) aktivován 10 mmol.l-1 cysteaminem, kdy jeho přítomná –SH skupina reaguje s povrchem zlata, koncová –NH2 je využitelná pro kovalentní imobilizaci biomolekul. Následovalo navázání 1% polymeru chitosanu rozpuštěného v 2% CH3COOH a nakonec imobilizace kuřecí sulfitoxidasy (0,5 mg.ml-1; 2 μl) za účasti 2,5% GA jako aktivačního činidla. Výsledná elektroda byla charakterizována cyklickou voltametrií a chronoamperometrií. Cyklická voltametrie byla provedena v rozmezí potenciálu -0,8 až 0,8 V v prostředí 0,1 mol.l-1 KPB, pH 7, následovaly přídavky siřičitanu sodného o výsledné koncentraci v pracovní nádobce 1,5 a 3 mmol.l-1. Chronoamperometrie probíhala při potenciálu -0,4 V, přídavky siřičitanu sodného byly v rozmezí koncentrace v reakční nádobce 50-400 μmol.l-1. Pro porovnání byla provedena cyklická voltametrie i chronoamperometrie pro zlatou elektrodu bez přítomnosti enzymu (SOX). Přídavky H2O2 o výsledné koncentraci (3 a 6 mmol.l-1) při voltametrii a chronoamperometrii byly v rozmezí koncentrace 100-1000 mol.l-1.

Obr. 67. Elektroda zlata pro kovalentní imobilizaci sulfitoxidasy z kuřecích jater.

- 121 -

9. Výsledky a diskuse 9.1. Izolace sulfitoxidasy z kuřecích jater Hlavním cílem druhé části předložené práce byla izolace kuřecí sulfitoxidasy z jater pro bioanalytické aplikace. Výsledky, které byly postupně získány při izolaci SOX jsou uvedeny v tab. 1 (Table 1), která je součástí přílohy 5. Z purifikační přiložené tab. 1 je vidět, že během purifikace byl postupně snížen obsah proteinů ve vzorcích a zároveň zvýšena hodnota specifické aktivity. Výsledný enzymový roztok, získaný purifikací z 500 g zmrazených kuřecích jater vykazoval specifickou aktivitu 190,9 nkat.mg-1. Tato hodnota byla stanovena u enzymu dočištěného adsorpční chromatografii na koloně Bio-Scale CHT5-I. Hodnota specifické aktivity dialyzátu po druhé precipitaci vykazovala hodnotu 5,9 nkat.mg-1, což koresponduje se studií Kipke et al. (1989). Při dialýze precipitátu je nutná přítomnost molybdenanového iontu v dialyzačním pufru. Velkou výhodou výchozího materiálu (jater) pro izolaci SOX byla jeho snadná dostupnost a nízká cena. Postup izolace SOX z kuřecích jater byl inspirován studií Kipke et al. (1989), která zahrnuje důležité purifikační kroky, jako je vytvoření acetonového prášku, frakcionace síranem amonným, denaturace zahříváním, dialýza, ultrafiltrace a chromatografické metody. Vychlazený aceton byl použit z důvodu odstranění lipidů.

9.2. Chromatografická purifikace sulfitoxidasy z kuřecích jater Získaný dialyzát po precipitaci hrubého extraktu síranem amonným byl podroben nízkotlaké iontově výměnné chromatografii na koloně s médiem Macro-Prep High Q. Proteinové frakce byly eluovány lineárním gradientem 0-1 mol.l-1 NaCl v ekvilibračním pufru. Po proběhnuté dialýze následovala separace SOX pomocí další IEC na koloně Resource Q, kde eluované proteinové frakce byly monitorovány při vlnových délkách 280 a 410 nm. Proteiny byly eluovány lineárním gradientem 1 mol.l-1 NaCl v ekvilibračním pufru. Chromatogram z kolony Resource Q je na obr. 68. Jednotlivé frakce eluátu byly posbírány a charakterizovány měřením enzymové aktivity. Největší aktivita SOX byla zjištěna v elučním čase 23,3 min. V tomto čase je vidět nárůst absorbance proteinů (280 nm), ale i absorbce hemu, který je součástí SOX. Po ultrafiltraci frakcí s nejvyšší enzymovou aktivitou byla provedena gelová permeační chromatografie na koloně Superdex 200 HR 10/30. K monitorování SOX byly opět zvoleny dvě detekční vlnové délky 280 a 410 nm. Chromatogram získaný z GPC je na obr. 69. Frakce s nejvyšší aktivitou SOX byla eluována v čase 22,1 min. S využitím proteinových standardů (1,35 – 670 kDa) byla určena molekulová hmotnost SOX přibližně na 120 kDa, což je v souladu s prací Feng et al. (2007) i starší publikací

- 122 -

Kessler & Rajagopalan (1972). Posledním purifikačním krokem byla separace pomocí adsorpční chromatografie na koloně Bio-Scale CHT5-I. Byly získány čtyři proteinové frakce a ty analyzovány pomocí SDS-PAGE. 100 80

3.0

60 2.0 40 1.0

Conductivity (mS)

Absorbance (280 or 410 nm)

4.0

20

0.0

0 15

20

25 30 Elution time (min)

35

40

Obr. 68. Iontově výměnná chromatografie kuřecí sulfitoxidasy na koloně Resource Q. Černá šipka znázorňuje eluci požadovaného enzymu v čase 23,3 min.

0.30

0.08

0.06 0.20 0.15

0.04

0.10 0.02

Absorbance (410 nm)

Absorbance (280 nm)

0.25

0.05 0.00

0 10

15

20

25

30

35

Elution time (min)

Obr. 69. Gelová permeační chromatografie sulfitoxidasy z kuřecích jater na koloně Superdex 200 HR 10/30. Šipka zobrazuje posbíranou frakci sulfitoxidasy v elučním čase 22,1 min. Plná čára odpovídá absorbanci při 280 nm a přerušovaná čára absorbanci při 410 nm.

- 123 -

9.3.

Identifikace

proteinů

pomocí

MALDI-TOF

peptidového

mapování Po každém purifikačním kroku byly odebrány vzorky a charakterizovány SDSPAGE (Laemmli, 1970). Elektroferogram separovaných proteinů z jednotlivých purifikačních kroků (hrubý extrakt, dialyzát po precipitaci a frakce z IEC) je na obr. 70. Majoritní proteinové pásy označené velkými písmeny byly podrobeny štěpení proteinů za účasti modifikovaného trypsinu a analyzovány pomocí MALDI-TOF

MS.

Identifikované majoritní proteiny, které se podařilo pomocí databáze a vyhledávacího programu Mascot určit, jsou uvedeny v tab. 13. Některé proteiny se nepodařilo jednoznačně určit. Frakce VI obsahovala požadovanou SOX, získané hmotnostní spektrum peptidů je na obr. 71. Z výsledků je vidět, že kromě SOX lze během purifikace z kuřecích jater získat i jiné enzymy, jako je např. katalasa (EC 1.11.1.6) nebo L-laktát dehydrogenasa (EC 1.1.1.27), které je možné potenciálně využít v bioanalytických aplikacích. Záznamy dalších elektroferogramů po GPC a adsorpční chromatografii a výsledky identifikace majoritních proteinů jsou detailně uvedeny v přiloženém rukopisu (příloha 5).

STD

Obr. 70. SDS-PAGE proteinových vzorků odebraných během purifikace kuřecí sulfitoxidasy. STD – proteinový standard (↓ 97, 66, 45, 30 and 20,1 kDa); I – hrubý extrakt (30 μg); II – dialyzát po precipitaci (25 μg); III – druhý pík eluovaný z kolony

- 124 -

Macro-Prep High Q (12 μg); IV – proteiny nezachycené (flow-through) na koloně Macro-Prep High Q (10 μg); V – první pík z kolony Macro-Prep High Q (10 μg); VI – aktivní frakce eluovaná z kolony Resource Q (viz. obr. 68.) (12 μg).

Tab. 13. Přehled identifikovaných majoritních proteinů získaných pomocí MALDITOF peptidového mapování.

Pás

Identifikovaný protein

A

Aldolasa B

B

Podobnost s betain homocystein methyltransferasou

C

Katalasa

E

Enolasa

F

Ferritin

G

Glutamát dehydrogenasa

GA

Glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasa

GS

Glutathion S-transferasa

I

IMP-cyklohydrolasa + BSA

Ig

IgY-Fc 3-4 fragment

L

L-laktát dehydrogenasa B a A

M

Malát dehydrogenasa 2

P

Fosfoglycerát mutasa 1

R

Kalretikulin

T

Triosafosfát isomerasa

- 125 -

2231.14

Relative intensity

1.0

2110.13

0.8

0.6

1356.86 1384.86

2086.97

0.4

3079.41

1565.92

0.2

0.0 500

2832

827.47 910.48

1000

2767.29 2519.11

1500

2000

2500

3122.65

3000

3500

4000

Mass (m/z) Obr. 71. MALDI-TOF peptidové mapování kuřecí sulfitoxidasy. Bylo provedno štěpení SOX v gelu modifikovaným trypsinem při 37°C přes noc. Jako MALDI matrice byl použit saturovaný roztok CHCA.

9.4. Imobilizace kuřecí sulfitoxidasy na povrch zlaté elektrody Získaná kuřecí SOX byla kovalentně imobilizována za účasti 2,5% GA jako aktivačního činidla na upravený povrch zlaté elektrody. Připravená elektroda s navázanou SOX byla charakterizována cyklickou voltametriíí a chronoamperometrií a porovnána s elektrodou bez přítomnosti enzymu. Záznam cyklické voltametrie systému zlaté elektrody s navázanou SOX bez přídavku a s přídavkem siřičitanu sodného je na obr. 72. Ze záznamu je vidět, že odezvy elektrody na SO32- se vyskytují v oblasti kladného i záporného potenciálu. Při chronoamperometrie je principem měření spotřeba kyslíku či vznik peroxidu vodíku, což odpovídá koncentraci stanovovaného analytu. V případě použití kladného potenciálu se jedná o oxidaci H2O2, což s sebou přináší riziko oxidace elektroaktivních látek na pracovní elektrodě zároveň s analytem, čímž dochází ke zvyšování měřeného signálu, je tedy vhodnější pracovat při záporné hodnotě potenciálu, v našem případě při -0,4 V. Pokud není možnost zvolit pro danou reakci záporný potenciál, je vhodné předřazení antiinterferenční membrány, která nežádoucí látky přítomné v analytu zachytí. V případě použití záporného potenciálu lze stanovit i spotřebu kyslíku s využitím elektrody, která obsahuje speciální membránu (teflon) propustnou pouze pro kyslík (Sezgintürk & Dinckaya, 2005; Skládal, 2002).

- 126 -

Cyklická voltametrie byla provedena i pro systém zlaté elektrody bez přítomnosti enzymu. Záznam cyklických voltamogramů po přídavku H2O2 (3 a 6 mmol.l-1) je uveden na obr. 73. Odezvy elektrody po přídavcích peroxidu vodíku (100-1000 mol.l-1) ukazuje obr. 74 a příslušná kalibrační křivka přídavků H2O2 je vidět na obr. 75. Na základě průběhu cyklické voltametrie byl pro chronoamperometrii opět zvolen záporný potenciál -0,4 V, při kterém nedochází k nežádoucí oxidaci látek na elektrodě. Odezvy enzymové elektrody po přídavcích siřičitanu sodného (50-400 mol.l-1) v prostředí 0,1 mol.l-1 KPB, pH 7 jsou prezentovány na obr. 76. Příslušná kalibrační křivka přídavků SO32- je uvedena na obr. 77. Z přiložených kalibračních křivek obou typů elektrod byla určena citlivost elektrody (sensitivita), elektrochemický šum a LOD. Získaná data jsou shrnuta v tab. 14. Připravená enzymová elektroda pro potenciální stanovení siřičitanů v biologických vzorcích vykazovala odezvy (signály) na přítomnost SO32-. Z výsledků uvedených v tab. 14 je vidět, že hodnoty LOD pro H2O2 nebo SO32- byly poměrně vysoké (51,2; 46,3 mol.l-1). Autorům Situmorang et al. (1999) se při analýze siřičitanů ve vínech s použitím imobilizované kuřecí SOX na pracovní elektrodě (Pt) podařilo dosáhnout LOD pro SO32- 1 mol.l-1. V podobné studii při stanovení obsahu SO32s využitím biosensoru v potravinách byla hodnota LOD stanovena na 2 mol.l-1 (Bahmani et al., 2010). Autoři Sezgintürk & Dinckaya (2005) imobilizovali rostlinnou SOX na kyslíkovou elektrodu, stanovení SO32- bylo provedeno v potravinách a limit detekce byl stanoven na 0,2 mmol.l-1, což je mnohem vyšší oproti předchozím studiím.

Obr. 72. Cyklické voltamogramy pro systém zlatá elektroda s imobilizovanou sulfitoxidasou bez přídavku Na2SO3 (blank-černá), s přídavky 1,5 mmol.l-1 (červená) a 3 mmol.l-1 (zelená) Na2SO3.

- 127 -

Obr. 73. Cyklické voltamogramy pro systém zlatá elektroda bez přídavku H2O2 (blank-černá), s přídavky 3 mmol.l-1 (červená) a 6 mmol.l-1 (zelená) H2O2.

Obr. 74. Závislost měřeného proudu na čase pro systém elektrody zlata. Postupné přídavky peroxidu vodíku v rozmezí koncentrací 100-1000 mol.l-1 v pracovní nádobce. Měření probíhalo při hodnotě potenciálu -0,4 V.

- 128 -

Obr. 75. Kalibrační křivka - přídavky peroxidu vodíku (100-1000 μmol.l-1) v prostředí 0,1 mol.l-1 KPB, pH 7 při potenciálu -0,4 V.

Obr. 76. Závislost měřeného proudu na čase pro systém zlaté elektrody s imobilizovanou kuřecí sulfitoxidasou. Postupné přídavky standardního siřičitanu sodného v rozmezí koncentrací 50-400 mol.l-1 v pracovní nádobce. Měření probíhalo při hodnotě potenciálu -0,4 V.

- 129 -

Obr. 77. Kalibrační křivka - přídavky siřičitanu sodného (50-400 μmol.l-1) v prostředí 0,1 mol.l-1 KPB, pH 7 při potenciálu -0,4 V.

Tab. 14. Shrnutí hodnot citlivosti, elektrochemického šumu a limitu detekce zlaté elektrody bez enzymu a s přítomností kuřecí sulfitoxidasy.

Typ elektrody Elektroda zlata Elektroda zlata + SOX

Přídavky

Citlivost

Elektrochemický šum

LOD

[mol.l-1]

[nA/mol.l-1]

[nA]

[mol.l-1]

H2O2; 100 –1000

0,022

0,4

51,2

SO32-; 50 – 400

0,023

0,4

46,3

- 130 -

10. Závěr Teoretický úvod druhé části disertační práce pojednává o charakterizaci enzymu sulfitoxidasy, navazuje část, která je věnována siřičitanům, které jsou jejími substráty. Je uveden hlavní význam použití siřičitanů jako přidatných látek (aditiv) v potravinách a alkoholických i nealkoholických nápojích. Monitorování obsahu siřičitanů v potravinářském průmyslu je vyžadováno z toho důvodu, že při zvýšených koncentracích těchto látek jsou popsány jejich nežádoucí účinky na lidský organismus, například ve formě alergických reakcí, které mohou končit až ohrožením života jedince. Menší část významu siřičitanů je věnována jejich zvýšenému obsahu a nežádoucím vlivům v životním prostředí ve formě kyselých dešťů. V další části jsou krátce zmíněny analytické metody stanovení siřičitanů v biologických vzorcích včetně stanovení s využitím biosensoru, o které je v dnešní době velký zájem. Experimentální část popisuje izolaci sulfitoxidasy z kuřecích jater a její následnou

purifikaci

pomocí

chromatografických

metod

zahrnujících

iontově

výměnnou, gelovou permeační a adsorpční chromatografii. Čistota konečného enzymového vzorku byla zjištěna pomocí SDS-PAGE a identita kuřecí sulfitoxidasy byla potvrzena hmotnostní spektrometrií. Kromě požadované sulfitoxidasy byly identifikovány i další proteiny metodou MALDI-TOF peptidového mapování. Z výsledků je patrné, že výběrem vhodné metody se podařilo úspěšně vyizolovat sulfitoxidasu z kuřecích jater. Hlavní výhodou popsané izolace je snadno dostupný a levný zdroj (kuřecí játra) pro purifikaci sulfitoxidasy. Pomocí popsaného postupu lze získat sulfitoxidasu ve vysokém stupni přečištění se specifickou aktivitou 190,9 nkat.mg-1. Jako vedlejší výhodu popsané izolace lze zmínit zisk i jiných enzymů pro bioanalytické aplikace, jako je katalasa nebo L-laktát dehydrogenasa. Současná metoda umožňuje rutinní přípravu daných enzymů. Z pohledu bioanalytického využití byla získaná sulfitoxidasa kovalentně imobilizována na povrch zlaté elektrody pro následné stanovení siřičitanů. Zkonstruovaná bioelektroda zlata byla charakterizována cyklickou voltametrií a chronoamperometrií. Výhodou je, že povrch zlaté elektrody snadno reaguje s –SH skupinou např. cysteaminu a jeho koncová –NH2 skupina je využitelná pro imobilizaci enzymů. Výsledná elektroda s imobilizovanou SOX vykazovala odezvy na přítomnost SO32-, nicméně limit detekce byl poměrně vysoký.

- 131 -

11. Použitá literatura Bahmani B., Moztarzadech F., Rabiee M., Tahriri M. (2010) Development of an electrochemical sulfite biosensor by immobilization of sulfite oxidase on conducting polyaniline film. Synthetic Met. 160, 2653 – 2657. Cabré F., Marín C., Cascante M., Canela E. I. (1990) Occurrence and comparison of sulfite oxidase activity in mammalian tissues. Biochem. Med. Metab. Biol. 43, 159 – 162. Cohen H. J., Fridovich I. (1971) Hepatic sulfite oxidase. Purification and properties. J. Biol. Chem. 246, 359 – 366. Eilers T., Schwarz G., Brinkmann H., Witt C., Richter T., Nieder J., Koch B., Hille R., Hänsch R., Mendel R. R. (2001) Identification and biochemical characterization of Arabidopsis thaliana sulfite oxidase. A new player in plant sulfur metabolism. J. Biol. Chem. 276, 46989 – 46994. Feng C., Tollin G., Enemark J. H. (2007) Sulfite oxidizing enzymes. Biochim. Biophys. Acta 1774, 527 – 539. Havliš J., Thomas H., Šebela M., Shevchenko A. (2003) Fast-response proteomics by accelerated in-gel digestion of proteins. Anal. Chem. 75, 1300 – 1306. Hille R. (1996) The mononuclear molybdenum enzymes. Chem. Rev. 96, 2757 – 2816. Kalimuthu P., Tkac J., Kappler U., Davis J. J., Bernhardt P. V. (2010) Highly sensitive and stable electrochemical sulfite biosensor incorporating a bacterial sulfite dehydrogenase. Anal. Chem. 82, 7374 – 7379. Kappler U., Bailey S. (2005) Molecular basis of intramolecular electron transfer in sulfite-oxidizing enzymes is revealed by high resolution structure of a heterodimeric complex of the catalytic molybdopterin subunit and a c-type cytochrom subunit. J. Biol. Chem. 280, 24999 – 25007. Kessler D. L., Rajagopalan K. V. (1972) Purification and properties of sulfite oxidase from chicken liver. Presence of molybdenum in sulfite oxidase from diverse sources. J. Biol. Chem. 247, 6566 – 6573. Kipke C. A., Enemark J. H., Sunde R. A. (1989) Purification of prosthetically intact sulfite oxidase from chicken liver using a modified procedure. Arch. Biochem. Biophys. 270, 383 – 390. Laemmli U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. Nature, 227, 680 – 685. Oshino N., Chance B. (1975) The properties of sulfite oxidation in perfused rat liver; interaction of sulfite oxidase with the mitochondrial respiratory chain. Arch. Biochem. Biophys. 170, 514 – 528. Sapers G. M. (1993) Browning of foods: control by sulfites, antioxidants, and other means. Food Technol. 47, 75 – 84.

- 132 -

Schrader N., Fischer K., Theis K., Mendel R. R., Schwarz G., Kisker C. (2003) The crystal structure of plant sulfite oxidase provides insights into sulfite oxidation in plants and animals. Structure 11, 1251 – 1263. Sezgintürk M. K., Dinckaya E. (2005) Direct determination of sulfite in food samples by a biosensor based on plant tissue homogenate. Talanta 65, 998 – 1002. Shevchenko A., Tomas H., Havliš J., Olsen J. V., Mann M. (2007) In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat. Protoc. 1, 2856 – 2860. Shih V. E., Abroms I. F., Johnson J. L., Carney M., Mandell R., Robb R. M., Cloherty J. P., Rajagopalan K. V. (1977) Sulfite oxidase deficiency. Biochemical and clinical investigations of a hereditary metabolic disorder in sulfur metabolism. N. Engl. J. Med. 297, 1022 – 1028. Situmorang M., Hibbert D. B., Gooding J. J., Barnett D. (1999) A sulfite biosensor fabricated using electrodeposited polytyramine: applications to wine analysis. Analyst 124, 1775 – 1779. Skládal P. (2002) Biosensory, pp. 21, 24, Masarykova Univerzita, Přírodovědecká fakulta Brno, ČR. Smith P. K., Krohn R. I., Hermanson G. T., Mallia A. K., F. H. Gartner F. H., Provenzano M. D., Fujimoto E. K., Goeke N. M., Olson B. J., Klenk D. C. (1985) Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76 – 85. Svitel J., Stredansky M., Pizzariello, Miertus S. (1998) Composite biosensor for sulfite assay: Use of water-insoluble hexacyanoferrate(III) salts as electron-transfer mediators. Electroanalysis 10, 591 – 596. Šebela M., Štosová T., Havliš J., Wielsch N., Thomas H., Zdráhal Z., Shevchenko A. (2006) Thermostable trypsin conjugates for high-throughput proteomics: synthesis and performance evaluation. Proteomics 6, 2959 – 2963. Temple C. A., Graf T. N., Rajagopalan K. V. (2000) Optimization of expression of human sulfite oxidase and its molybdenum domains. Arch. Biochem. Biophys. 383, 281 – 287. Zhao M., Hibbert D. B., Gooding J. J. (2006) Determination of sulfite in beer samples using an amperometric fill and flow channel biosensor employing sulfite oxidase. Anal. Chim. Acta 556, 195 – 200.

- 133 -

12. Seznam použitých zkratek ACD-BT

hovězí trypsin modifikovaný -cyklodextrinem

AO

hrachová aminoxidasa

APTES

3-aminopropyl triethoxysilan

BAPNA

Nα-benzoyl-DL-arginin-4-nitroanilid

BCD-BT

hovězí trypsin modifikovaný -cyklodextrinem

BDE

1,4-butandioldiglycidyl ether

BET

měření plochy povrchu

BSA

hovězí sérový albumin

BT

hovězí trypsin

BT-B

biotinylovaný trypsin

CBB

Coomassie Brilliant Blue

CHCA

α-kyano-4-hydroxyskořicová kyselina

CMC

karboxymethylcelulosa

CPE

elektroda z uhlíkové pasty

DMSO

dimethylsulfoxid

DTA

diferenční termická analýza

EDC

1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-karbodiimid

EDTA

ethylendiamintetraoctová kyselina

ESI

ionizace elektrosprejem

FC

magnetizační křivka chlazená v magnetickém poli

GA

glutaraldehyd

GCD-BT

hovězí trypsin modifikovaný -cyklodextrinem

GPC

gelová permeační chromatografie

H

intenzita magnetického pole

HPLC

vysokoúčinná kapalinová chromatografie

HQ

hydrochinon

HRP

křenová peroxidasa

IEC

iontově výměnná chromatografie

K

Kelvin

KAD

kadaverin

kDa

kilodalton

Km

Michaelisova konstanta

KPB

draselno-fosfátový pufr

LYS

lysozym

LOD

limit detekce

- 134 -

MALDI

laserová ionizace a desorpce za účasti matrice

Moco

molybdenový kofaktor

MRI

zobrazení pomocí magnetické rezonance

MTB

magnetotaktické bakterie

Mr

molekulová hmotnost

MS

hmotnostní spektrometrie

MNPs

bakteriální magnetické nanočástice

MS

saturační magnetizace

NeFeB

neodym-železo-bór magnet

NHS

N-hydroxysukcinimid

Oe

Oersted (jednotka intenzity magnetického pole)

PEG

polyethylenglykol

pI

isoelektrický bod

PMF

peptide mass fingerprinting

Q

chinon

RAF-BT

trypsin modifikovaný rafinosou

RPL

nanočástice magnetitu získané termickým rozkladem

SA

kyselina sinapová

SDH

sulfitdehydrogenasa

SDS

dodecylsulfát sodný

SDS-PAGE

elektroforéza v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného

SEM

skenovací elektronová mikroskopie

SOX

sulfitoxidasa

SPIO

superparamagnetické oxidy železa

SQUID

supravodivý kvantový interferenční magnetometr

Sulfo-NHS

sulfonovaný N-hydroxysukcinimid

T

Tesla

TEM

transmisní elektronová mikroskopie

TEOS

tetraethylorthosilikát

TFA

kyselina trifluoroctová

TG

termogravimetrie

TOF

analyzátor doby letu

V

Volt

XRD

rentgenová difrakce

ZFC

magnetizační křivka chlazená v nulovém magnetickém poli

@

-a (např. modifikovaný povrch nanočástic chitosanem)

- 135 -

13. Životopis Osobní údaje Jméno a příjmení: Titul: Datum narození: Místo narození: Trvalé bydliště: Národnost: Státní příslušnost: Rodinný stav: Zdravotní stav: Telefon: E-mail:

Michaela Pečová Mgr. 10.10.1983 Prostějov Trávnická 2398/63, 79601 Prostějov česká Česká republika svobodná dobrý +420 732 406 598 [email protected]

Vzdělání 1997 - 2003 Reálné gymnázium a základní škola města Prostějova, Studentská 4/2, Prostějov 2003 – 2006 Univerzita Palackého v Olomouci, Přírodovědecká fakulta, studijní obor biochemie – bakalářské studium, téma bakalářské práce: „Stanovení biogenních aminů v biologických tekutinách“ 2006 - 2008 Univerzita Palackého v Olomouci, Přírodovědecká fakulta, studijní obor biochemie – magisterské studium, téma diplomové práce: „Imobilizace trypsinu na magnetické nanočástice a další využití v proteomice“ 2008 – dosud Univerzita Palackého v Olomouci, Přírodovědecká fakulta, studijní obor biochemie – doktorské studium, téma disertační práce: „Imobilizace proteinů na magnetické nanočástice a jejich praktické použití“. Státní doktorská zkouška složena v roce 2012 Obhajoba disertační práce: Termín 26.3.2013 Zaměstnání 2009 – 2011 Univerzita Palackého v Olomouci, Přírodovědecká fakulta, Katedra biochemie, pracovní pozice - vědecký pracovník

- 136 -

2010 – 2012 Centrum regionu Haná pro biotechnologický a zemědělský výzkum, oddělení biochemie proteinů a proteomiky, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého, Olomouc, pracovní pozice – Ph.D. student 2013 Univerzita Palackého v Olomouci, Přírodovědecká fakulta, Katedra buněčné biologie a genetiky, pracovní pozice - vědecký pracovník Zahraniční pobyt-stáž 2010 Tříměsíční zahraniční stáž (22.9. – 19.12.2010): Department of Biological Chemistry, University of Padua, Italy (prof. Fabio Vianello) Projekty 1) Fond rozvoje vysokých škol-FRVŠ (hlavní řešitel) FRVŠ projekt 2792/2011/G4 Název projektu: Zavedení nové úlohy kovalentní imobilizace trypsinu na magnetické nosiče do výuky experimentální metody biochemie 2) Fond rozvoje vysokých škol-FRVŠ (spoluřešitel) FRVŠ projekt 2421/2012/G4 Název projektu: Zavedení nové úlohy využití nativních a modifikovaných mikrobiálních buněk jako celobuněčných biokatalyzátorů do výuky experimentální metody biochemie. Absolvované kurzy 1) 19.4.2012 – Workshop: Izolace a následná transkripce RNA 2) 28.5.2012 – Workshop: Příprava imunomodulačních proteoliposomů 3) 10.-13.9.2012 – Workshop: Klonování a produkce rekombinantního proteinu Další aktivity 1) Realizace odborného workshopu a semináře „Magnetické materiály pro nanobiotechnologie“ v rámci projektu Biolink – Podpora spolupráce mezi akademickou sférou a praxí v oblasti biochemických oborů, 9.-10.11.2011, Olomouc. (http://www.biolink.upol.cz/).

- 137 -

2) Vypracování odborné úlohy toxikologie pro projekt – E-learningová podpora praktické výuky biochemie a imunologie – IMBIO (http://www.imbio.cz/). 3) Realizace odborných workshopů „Nanočástice – metody imobilizace enzymů“ v rámci projektu AescuLab – systematické laboratorní vzdělávání studentů a pracovníků VaV v oblasti Life Sciences s podporou e-learningu (http://www.aesculab.cz/).

- 138 -

14. Přílohy 14.1. Superparamagnetic maghemite nanoparticles from solid-state synthesis – Their functionalization towards peroral MRI contrast agent and magnetic carrier for trypsin immobilization 14.2. Biologicky aktivní látky imobilizované na magnetických nosičích a jejich využití v biochemii a biotechnologiích 14.3. Thermostable Trypsin Conjugates Immobilized to Biogenic Magnetite Show a High Operational Stability and Remarkable Reusability for Protein Digestion 14.4 Surface engineering of iron oxide nanoparticles isolated from Magnetospirillum gryphiswaldense for biochemical and biomedical applications 14.5. Purification of chicken liver sulfite oxidase: a study on performance of conventional chromatography

- 139 -

PUBLIKACE 1 (Příloha 1) Superparamagnetic

maghemite

nanoparticles

from

solid-state

synthesis – Their functionalization towards peroral MRI contrast agent and magnetic carrier for trypsin immobilization Katerina Kluchova, Radek Zboril, Jiri Tucek, Michaela Pecova, Ludmila Zajoncova, Ivo Safarik, Miroslav Mashlan, Ingrid Markova, Dalibor Jancik, Marek Sebela, Helena Bartonkova, Vassiliki Bellesi, Pavel Novak, Dimitris Petridis Biomaterials, 30, 2855 – 2863 (2009)

Biomaterials 30 (2009) 2855–2863

Contents lists available at ScienceDirect

Biomaterials journal homepage: www.elsevier.com/locate/biomaterials

Superparamagnetic maghemite nanoparticles from solid-state synthesis – Their functionalization towards peroral MRI contrast agent and magnetic carrier for trypsin immobilization Katerina Kluchova a, b, Radek Zboril a, b, *, Jiri Tucek b, Michaela Pecova c, Ludmila Zajoncova c, Ivo Safarik b, d, Miroslav Mashlan b, Ingrid Markova e, Dalibor Jancik b, Marek Sebela c, Helena Bartonkova a, Vassiliki Bellesi f, Pavel Novak g, Dimitris Petridis f, ** a

Department of Physical Chemistry, Palacky University, Svobody 26, 771 46 Olomouc, Czech Republic Centre for Nanomaterial Research, Palacky University, Slechtitelu 11, 783 71 Olomouc, Czech Republic c Department of Biochemistry, Palacky University, Slechtitelu 11, 783 71 Olomouc, Czech Republic d Department of Biomagnetic Techniques, Institute of Systems Biology and Ecology, Na Sadkach 7, 370 05 Ceske Budejovice, Czech Republic e Teaching Hospital and F. D. Roosevelt Policlinic, Radiological Department, 97 401 Banska Bystrica, Slovakia f Institute of Materials Science, NCSR ‘‘Demokritos’’, Agia Paraskevi, 15310 Athens, Greece g MEDIHOPE, Mathonova 291/1, 796 04 Prostejov, Czech Republic b

a r t i c l e i n f o

a b s t r a c t

Article history: Received 2 December 2008 Accepted 12 February 2009 Available online 5 March 2009

Nearly monodispersed superparamagnetic maghemite nanoparticles (15–20 nm) were prepared by a one-step thermal decomposition of iron(II) acetate in air at 400 C. The presented synthetic route is simple, cost effective and allows to prepare the high-quality superparamagnetic particles in a large scale. The as-prepared particles were exploited for the development of magnetic nanocomposites with the possible applicability in medicine and biochemistry. For the purposes of the MRI diagnostics, the maghemite particles were simply dispersed in the bentonite matrix. The resulting nanocomposite represents very effective and cheap oral negative contrast agent for MRI of the gastrointestinal tract and reveals excellent contrast properties, fully comparable with those obtained for commercial contrast material. The results of the clinical research of this maghemite–bentonite contrast agent for imaging of the small bowel are discussed. For biochemical applications, the primary functionalization of the prepared maghemite nanoparticles with chitosan was performed. In this way, a highly efficient magnetic carrier for protein immobilization was obtained as demonstrated by conjugating thermostable raffinosemodified trypsin (RMT) using glutaraldehyde. The covalent conjugation resulted in a further increase in trypsin thermostability (T50 ¼ 61 C) and elimination of its autolysis. Consequently, the immobilization of RMT allowed fast in-solution digestion of proteins and their identification by MALDI–TOF mass spectrometry. Ó 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Keywords: Maghemite Solid-state synthesis Abdomen MRI Proteomics Nanocomposites Contrast agent

1. Introduction Due to its spinel structure with two magnetically nonequivalent interpenetrating sublattices, maghemite, g-Fe2O3, exhibits a strong magnetic behavior which has been used practically in various biomedical and biological applications including magnetic resonance

* Correspondence to: Radek Zboril, Centre for Nanomaterial Research, Palacky University, Slechtitelu 11, 783 71 Olomouc, Czech Republic. Tel.: þ420 585634947; fax: þ420 585634958. ** Corresponding author. Tel.: þ30 2106503343; fax: þ30 2106513430. E-mail addresses: [email protected] (R. Zboril), [email protected] (D. Petridis). 0142-9612/$ – see front matter Ó 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved. doi:10.1016/j.biomaterials.2009.02.023

imaging (MRI) contrast enhancement, biomagnetic separations, hyperthermia treatment or magnetic drug targeting [1–11]. Such an extensive use of maghemite nanoparticles originates from their nontoxicity, biocompatibility, biodegradability, low particle dimension, large surface area and suitable magnetic properties. Nevertheless, for in vivo and in vitro applications, the appropriate surface modification of the particles (functionalization) represents a key point to prevent them from agglomeration, chemical destruction and/or to bind further substances (drugs, cells, etc.) to them [1,12–18]. The functionalization process can be achieved either in one chemical step [19–21] or in two steps with primary synthesis of highquality magnetic cores and their secondary surface modification [22,23].

2856

K. Kluchova et al. / Biomaterials 30 (2009) 2855–2863

The use of maghemite nanoparticles as a negative contrast agent in MRI constitutes one of the most frequent applications in medicine. SuperParamagnetic Iron Oxides (SPIO), including nanoparticles of maghemite and/or magnetite, enhance T1 but predominantly T2 relaxation time [1,24–26]. Advances in MRI including an implementation of high gradient scanners and availability of several contrast agents have led to an increasing use of this diagnostic technique for the evaluation of abdominal diseases such as tumors and inflammatory, especially in children [27]. Moreover, the conventional upper and lower endoscopic techniques allow visualization of only the esophagus, stomach plus duodenum and colon plus terminal ileum, respectively, leaving the larger part of the small bowel indiscernible to the gastroenterologists [28]. On the other hand, noninvasive MRI enables to visualize the small bowel. For the purposes of the MRI bowel diagnostics, the negative contrast agents are more frequently used than the positive ones [29]. Negative bowel agents decrease the extent of noise and motion artifacts related to the bowel peristalsis [27,30]. Among the commercially available negative contrast agents, magnetic iron oxide nanoparticles (Lumirem, Abdoscan) [31–36] are often used for the peroral bowel MRI diagnostics. They are usually coated with an insoluble material (siloxane, polystyrene, etc.) and suspended in viscosity-increasing agents (starch or cellulose) to prevent particles from aggregation and to ensure the homogenous contrast distribution throughout the bowel [1,37]. In this work, we describe a highly efficient negative contrast agent composed of superparamagnetic nearly monodispersed maghemite nanoparticles incorporated in a layered aluminosilicate mineral (bentonite). As proved by the results of clinical tests, such a magnetic composite, prepared in two simple steps, could be a very cheap contrast agent for peroral diagnostics of the small bowel. Another important bioapplication of iron oxide nanoparticles is based on their use as a magnetic solid support to immobilize different types of biomolecules including enzymes, antibodies, other proteins and oligonucleotides [38,39]. An important example is the immobilization of trypsin [40], which plays a key role in mass spectrometry (MS)-driven proteomics [41]. In general, trypsin (EC 3.4.21.4) is the protease of choice for protein identification and analysis by peptide mass fingerprinting or peptide sequencing because of its efficiency, reliability, and cleavage specificity [42–44]. However, two major drawbacks hamper the application of trypsin in proteomics. The enzyme shows only a marginal thermostability at 37 C and undergoes a rapid autolysis at basic pH, even in the presence of stabilizing calcium ions [45]. The low thermal stability often limits the application of trypsin in medical and biotechnological processes. A considerable advancement in the enhancement of its thermal stability has been achieved by conjugation with water-soluble polymers or oligosaccharides such as raffinose [45]. Eliminating or reducing the influence of trypsin autolysis in mass spectra can be realized by immobilization of trypsin on a magnetic carrier [41,46]. The immobilization provides many advantages including shorter digestion time, improved storage properties, higher thermal and pH stability, and the possibility of repeated use after magnetic separation from the reaction mixture [47,48]. Up to now, magnetic microparticles have been most frequently used as a magneticcarrier for trypsin [43,49]. To our best knowledge, there are only few reports dealing with such an application of magnetic nanoparticles [41,50]. The authors used amine-functionalized magnetic nanoparticles as a magnetic carrier, which was consequently covalently attached to trypsin using glutaraldehyde. The immobilized trypsin exhibited an excellent digestion efficiency as demonstrated with the peptide mapping analysis of three model proteins. However, the reflection of the trypsin immobilization to its thermostability has not been reported yet.

2. Materials and methods 2.1. Synthesis of maghemite nanoparticles and functionalized nanocomposites Maghemite nanoparticles were synthesized by solid-state isothermal decomposition of iron(II) acetate dihydrate (Sigma Aldrich) in air at 400 C. The iron(II) acetate was homogenized before the synthesis by grinding in an agate mortar resulting in the size distribution of the precursor particles of 1–5 mm. The weight of the precursor powder was 1200 mg and the reaction time was one hour. The maghemite–bentonite (MB) nanocomposite based MRI contrast agent as a phantom was prepared by the following method: 200 mg of the bentonite powder (Sigma Aldrich) was mixed with 20 mg of the as-prepared maghemite nanoparticles in a Petri dish. Then, distilled water was added and the homogenous red-brown gel layer was obtained after continuous stirring. The suspension was then kept in air for two hours, whereupon, the bentonite clay increased its volume due to the intercalation of water and adsorbed the maghemite particles. The maghemite/chitosan/raffinose-modified trypsin (MCRMT) nanocomposites were prepared in three steps. In the first step, the as-prepared maghemite nanoparticles were coated by chitosan providing free primary amino groups on their surface. The coating process was performed following the procedure described in [51]. The successful coating was checked by TEM analysis. In the second step, glutaraldehyde as a coupling agent was covalently bound to the chitosan shell [52]. Magnetic nanoparticles (1 mg) coated with chitosan were dispersed in 100 ml of the working buffer (0.15 mol l1 Tris–HCl, pH 8.5) and sonicated for 5 min. Then, the buffer was removed and 200 ml of 5% glutaraldehyde aqueous solution was gradually added. The sample was shaken at room temperature for 3 h. After that, the chitosancoated maghemite nanoparticles with bound glutaraldehyde were magnetically separated and free glutaraldehyde was removed by repeated washing with the working buffer. In the third step, 100 ml of raffinose-modified trypsin (RMT) in 1 mmol l1 HCl solution, with a concentration of 2 mg ml1, was mixed with well dispersed activated chitosan-modified maghemite nanoparticles. The mixture was shaken at room temperature for 90 min and then was left at 4 C for 12 h undisturbed. The nonreacted RMT was removed by washing as above. A simplified scheme of the RMT immobilization is depicted in Fig. 1. 2.2. Structural, magnetic, morphological and size characterization of as-prepared magnetic nanoparticles and nanocomposites The X-ray powder diffraction experiments were performed with a PANalytical X´Pert PRO instrument (CoKa radiation) equipped with an XĆelerator detector (located at Palacky University in Olomouc, Czech Republic). Samples were spread on a zero-background Si slide and step-scanned in the 2q range of 10–100 in steps of 0.017 for 720 s per step. TEM micrographs were obtained using a JEM2010 microscope (located at Palacky University in Olomouc, Czech Republic), operating at 200 kV with a point-to-point resolution of 1.9 Å. Before measurements, the samples were dispersed in ethanol and the suspension was treated in ultrasound for 10 min.

Fig. 1. A general scheme of trypsin immobilization on chitosan-modified maghemite.

K. Kluchova et al. / Biomaterials 30 (2009) 2855–2863 A drop of very dilute suspension was placed on a carbon-coated grid and allowed to dry by evaporation at ambient temperature. Scanning electron micrographs were performed on field emission SEM (Hitachi, located at Palacky University in Olomouc, Czech Republic) at 0.7 and 4.0 kV. 57Fe Mo¨ssbauer spectrum was measured in a constant acceleration mode with a 57Co(Rh) radioactive source. To distinguish between maghemite and magnetite, the measurements were carried out at 20 K (below the blocking temperature of the superparamagnetic nanoparticles) using closed He cycle cooling system (located at Palacky University in Olomouc, Czech Republic). Surface area of the as-prepared nanopowder was determined by nitrogen adsorption at 77.4 K by the static volumetric technique on a Sorptomatic 1990 (Thermo Finnigan) instrument (located at Palacky University in Olomouc, Czech Republic). Thermogravimetric measurements of the initial iron(II) acetate (TG/DTA) were performed in air with a temperature increase of 5 C/min in the range of 25–400 C using an Exstar 6000 (Seiko Instruments Inc., located at Palacky University in Olomouc, Czech Republic). A superconducting quantum interference device (SQUID, MPMS XL-7, Quantum Design, located at Palacky University in Olomouc, Czech Republic) was used for the magnetic measurements. Hysteresis loops were recorded at 2 and 300 K in the range of external magnetic fields from 7 T to þ7 T.

2857

DL-arginine 4-nitroanilide (BAPNA) at an initial concentration of 1.25 mM [45]. The respective T50 constants were determined, defined here as the temperature at which 50% of the activity is retained after 30 min incubation.

3. Results and discussion 3.1. Maghemite nanoparticles from iron(II) acetate precursor Although the thermal decomposition of suitable Fe-bearing precursors in high boiling solvents (thermolysis) represents a frequent approach to synthesize magnetic (magnetite,

2.3. Bioapplications of nanocomposites 2.3.1. MRI applications with MB nanocomposites In the framework of the small bowel clinical research with the bentonite– maghemite nanocomposite contrast agent, 1000 ml of contrast suspension was administrated orally to the patient. In the optimized conditions, the final contrast dispersion consists of 400 mg of maghemite nanoparticles, 4 g of bentonite matrix, 500 ml of fresh fruity juice (HAMI-fresh squeezed apple/carrot juice), 500 ml water and 80 g of polyethylene glycol (PEG 4000). MRI examinations were performed on a 1.5 T MRI scanner (GE SIGNA HORIZON Lx., located at MEDIHOPE, Prostejov, Czech Republic). For signal detection, the multiphase array coil TORSOPA was employed. The coil was wrapped around the patient in the prone position both for MRI enterography and for magnetic resonance cholangiopancreatography (MRCP). For purposes of MRI enterography, the patient was sipping 1000 ml of the prepared contrast agent 60 min before investigation. The measurement was based on the acquisition of a 2D T2SSFSE sequence in coronal and axial planes with the following parameters: axial plane – TR/TE ¼ 2027/79.7 ms, FOV 38 38 cm2, slice thickness of 5 mm, spacing (sp) 1.0, and matrix 256 256; and coronal plane – TR/TE 2575/295.9 ms, FOV 48 48 cm2, slice thickness of 5 mm, sp 0.0, and matrix 384 320. In the case of MRCP, the patient was sipping 500 ml of the contrast agent 30 min before investigation. Again, a 2D T2SSFSE sequence was acquisited in coronal and axial planes: axial plane – T2SSFSE TR/TE ¼ 2500/120 ms, FOV 40 40, slice thickness 6 mm, sp 2.0, and matrix 256*256; coronal plane – slice thickness 20 mm, TR/ TE ¼ 6000/500 ms, FOV 34*34, and sp0.0. Both measurements were carried under the breath-hold condition. The clinical study was approved by the Institutional ethics commission located in Teaching hospital and F.D. Roosevelt Policlinic in Banska Bystrica, Slovakia. Informed consent was obtained from all patients who participated in this clinical study. 2.3.2. Testing of immobilized RMT for protein digestion The feasibility and performance of the raffinose-modified trypsin immobilized on magnetic carriers (MCRMT composite) were demonstrated by in-solution digestion of bovine serum albumin (BSA). MCRMT composite (1 mg) was dispersed in 500 ml of 50 mmol l1 NH4HCO3 under continuous sonication. A stock solution of BSA (2 mg ml1) was prepared in 50 mmol l1 NH4HCO3. Before trypsin digestion, the dissolved BSA was denatured by heating at 95 C for 15 min followed by rapid cooling in a water–ice bath. After that, 10 ml of the BSA solution was put into a test tube and consequently, 20 ml of the MCRMT suspension and 70 ml of 50 mmol l1 NH4HCO3 were added. No reduction/alkylation was performed. After incubation of the reaction mixture at 37 C for 60 min, MCRMT was separated using NdFeB permanent magnet. The obtained supernatant was analyzed by MS. MALDI probes were prepared by the dried droplet method using an MSP AnchorChip 600/96 microScout target (Bruker Daltonik, located at Palacky University in Olomouc, Czech Republic) and a saturated solution of a-cyano-4-hydroxycinnamic acid in acetonitrile/0.1% TFA (1:2, v/v) as a matrix. Measurements were performed in positive ion reflectron mode on a Microflex MALDI–TOF LRF20 mass spectrometer (Bruker Daltonik, located at Palacky University in Olomouc, Czech Republic). The instrument was calibrated externally with a mixture of peptide standards (Bruker Daltonik). Mass spectra were accumulated from 100 to 200 shots at a laser repetition rate of 10 Hz (the m/z range was 500–4000) and processed by flexAnalysis 2.4 and Biotools 3.0 software (Bruker Daltonik). Protein identification was achieved by database search using the program Mascot Server 2.2 (Matrix Science). The thermostability of unmodified bovine trypsin, RMT and MCRMT were determined by measuring residual activities after incubation in 20 mmol l1 sodium acetate buffer, pH 5.25, at different temperatures (20, 37, 45, 55, 65 and 75 C) for 30 min. Trypsin activity was determined using a chromogenic substrate Na-benzoyl-

Fig. 2. XRD pattern (a) and TEM micrograph (b) of maghemite nanoparticles synthesized from iron(II) acetate precursor. Insets: detail of cubic crystal and SAED pattern.

2858


Fig. 4. SEM image of maghemite nanoparticles adsorbed at the bentonite surface (a); the inset shows a detailed view of individual maghemite nanoparticles; SEM image of the free unmodified bentonite clay is given for a comparison (b).

and TEM data (Fig. 2b). The cubic spinel structure is further confirmed by selected area electron diffraction (SAED) pattern (see Fig. 2b, insets). The 57Fe Mo¨ssbauer spectrum of the as-prepared nanopowder, recorded at 25 K (Fig. 3a), reveals a sextet with hyperfine parameters (d ¼ 0.45 0.01 mm/s, DEQ ¼ 0.00 0.01 mm/s and Bhf ¼ 51 0.3 T) corresponding well to maghemite [59]. In the spectrum, no traces of divalent iron were identified, which excludes the presence of magnetite. Fig. 3. Mo¨ssbauer spectrum measured at 25 K (a) and hysteresis loops taken at 300 and 2 K (b) of the as-prepared maghemite nanoparticles.

maghemite) nanoparticles [53–58], the thermally induced solidstate conversions are only rarely applied [59]. This is related with the difficult control of solid-state reactions occurring usually at higher temperatures and thus resulting in polymorphous mixtures and broad size distributions. A solid-state synthetic route, described here, is based on direct oxidative decomposition of iron(II) acetate in air leading to nearly monodispersed single-phase superparamagnetic maghemite nanoparticles. The conversion of the iron(II) acetate takes place in one step as deduced from TG/DTA analysis (not shown) and is completed at about 300 C. The total weight loss of 54.1%, determined from TG curve, corresponds well to the formation of the Fe2O3 phase (a theoretical weight loss of 54.1%). Detailed isothermal experiments performed at selected temperatures in the range of 320–400 C for 1 h proved that maghemite is the only formed Fe2O3 polymorph. At 400 C, welldeveloped cubic shape crystals with a narrow size distribution (20–25 nm) can be prepared in accordance with XRD (see Fig. 2a)

Fig. 5. Comparison of the negative contrast in the phantom experiments. Top: MB suspension; and bottom: commercial contrast agent (Lumirem). Right: schematic representation of the different functionalization of SPIO nanoparticles.


2859

swelling, sorption, ion exchange and intercalation properties. It carries a layer negative charge, which is compensated by ion exchangeable positive cations [65]. The clay is known to be essentially nontoxic and nonadsorbable, established by the Food and Drug Administration as ‘‘Generally Recognized As Safe’’ (GRAS). Moreover, bentonite itself can act as a T2 relaxation agent [66], similarly to SPIO nanoparticles [1]. The introduced simple procedure (see Experimental) based on the attachment of positively charged maghemite nanoparticles to the negatively charged surface of the bentonite clay (in aqueous environment) resulted in a contrast agent with superior properties in imaging of the small bowel. In the present magnetic nanocomposite, the maghemite nanoparticles are well dispersed on the bentonite surface without any indications of massive agglomeration (see Fig. 4). This fact was also reflected by the homogeneous negative MRI contrast, as proved by the phantom experiments.

Fig. 6. MR enteroclysis in a healthy patient after application of MB contrast agent. T2weighted image.

The magnetic properties of the as-prepared nanomaghemite were monitored by measurement of hysteresis loops at 2 and 300 K (Fig. 3b). The maximum magnetization (Mmax) at the highest applied field is 53.18 emu/g, which is lower than that reported for bulk maghemite (84 emu/g) [60]. This phenomenon is usually observed in nanoparticle interacting systems [61]. Such a reduction of Mmax can be ascribed to surface effects arising from broken symmetry and reduced coordination of atoms lying at the surface of the maghemite particle and also to a high degree of interparticle interactions. At 300 K, the hysteresis loop reveals a superparamagnetic character, which means that the maghemite nanoparticles are still not in a blocked state within the time scale of the magnetization measurements. In summary, we have developed a one-step and cost effective synthetic route allowing to prepare nearly monodispersed superparamagnetic maghemite nanoparticles of well defined structure and cubic shape. The magnetic nanoparticles from the iron(II) acetate precursor can be produced in a large scale and are well dispersible in water. Thus the prepared nanopowder is a promising candidate for the consequent functionalization and applications in biomedicine and biochemistry as discussed below.

3.2. MB nanocomposite as an MRI contrast agent for imaging of gastrointestinal tract Functionalized superparamagnetic iron oxides (SPIO) are well recognized as negative contrast agents with a high applicability in MRI of the liver, spleen, brain, lymph nodes and macrophages [62,63], where they are used by an intravenous way. Concerning their peroral application in the abdominal diagnostics, there are only two commercial agents commonly used (Lumirem, Abdoscan), which consist of agglomerates of maghemite/magnetite nanoparticles coated by siloxane and polystyrene, respectively. The synthesis of these composites is relatively difficult with a low yield resulting in their high price and, thus, limiting their use in daily diagnostic practice. To overcome this drawback, we have used a montmorillonite clay (bentonite) as an insoluble matrix to incorporate the as-prepared maghemite nanoparticles from ferrous acetate on the surfaces of the mineral layers [64]. Bentonite is natural, low-cost, readily available and biocompatible aluminosilicate mineral endowed with unique

Fig. 7. MRCP image of a patient with a tumor of the head of the pancreas acquired without the application of the negative contrast agent (a) and of a patient after hepaticojejunal anastomosis with hepaticolithiasis; here the small bowel signal is fully suppressed due to the application of the MB contrast agent (b).

2860


Fig. 8. TEM image (a) and hysteresis loops (b) of MCRMT nanocomposite nanoparticles. The arrow points at the organic shell (chitosan–trypsin) on the nanoparticles surface.

Fig. 5 compares the negative signal intensity of the MB water suspension (top) with a commercial contrast agent – Lumirem (bottom). In the outer flasks, only water, as a blind sample, is used (a white surrounding of the contrast suspensions). For the purposes of the phantom experiments, the optimized concentration of 0.32 g/l of maghemite nanoparticles was used in both cases. As a key conclusion, the negative contrast effect of both phantoms is comparable and very high. The absence of any artifacts in MRI image of the MB phantom allows to assume a homogenous delineation of the maghemite nanoparticles incorporated in the bentonite matrix within the whole volume of water in the inner flask. For the use in clinical diagnostics, it was necessary to optimize the volume and composition of the final dispersion containing, besides the MB contrast agent in water, also a freshly squeezed juice and PEG 4000. The optimized concentrations of all ingredients (see Experimental) resulted from several pre-clinical tests. Among various tested juices, the commercial apple/carrot freshly squeezed juice for children (HAMI brand) was selected as a viscous liquid, good tasting, and healthy drink. Moreover, the MB material is well miscible with this juice and the maghemite nanoparticles are fully dispersed in the resulting suspension. In standard gastrodiagnostics, the contrast agent must not be digested during the medical examination and moreover, it should be fully secreted from the body without any chemical change. Therefore, we used polyethylenglycol (PEG) as a standard water absorbing agent. The PEG prevents absorption of the water from the bowel lumen through the bowel wall. The first stage of the clinical research with the MB contrast agent was focused on the evaluation of the contrast effect of the small bowel in healthy patients. Fig. 6 demonstrates an MR

enteroclysis obtained in a representative healthy patient from the volunteer group. Evidently, the whole small bowel reveals homogenously reduced signal intensity in T2-weighted images. The lumen is hypo-even anti-tense, aboral side-ileum is homogenously anti-tense. All patients tolerated the contrast agent very well, without any side effects. In the second stage of clinical tests, we examined a group of 50 patients with various abdominal diseases, mainly with a pancreatic tumor or choledocholithiasis (a disease afflicting the bile duct). In all examined patients, the observed suppression of the small bowel signal (the high-quality homogeneous negative contrast) helped significantly in MRI diagnostics of the particular abdominal field, while various artifacts originated from the small bowel signal were observed in the images without MB application. For illustration, Fig. 7a shows an MRCP image of a patient (women, age 84) with a tumor at the head of the pancreas acquired without contrast agent. There are disturbing hypertensive artifacts visible, which originate from the duodenum loop coinciding with the choledoch and pancreatic terminal (see arrows in Fig. 7a). After MB application, these artifacts are reliably removed. Similar promising results were obtained for a patient after hepaticojejunal anastomosis with hepaticolithiasis (women, age 41), where the gall-stone was much clearly observable (see the dark field inside the ring in Fig. 7b) using the prepared contrast agent (see arrows in Fig. 7b). Now the investigations of the group of patients are being gradually completed and statistically evaluated. To conclude this part, we have developed an inexpensive negative oral contrast agent, which can be prepared in a large scale in two simple steps. This agent, exploiting the attachment of the superparamagnetic maghemite nanoparticles from ferrous acetate to the surface of the montmorillonite (bentonite) matrix, provides excellent


negative contrast of the small bowel resulting in superior MRI diagnostics of the adjacent abdominal areas (pancreas and bile duct). 3.3. MCRMT nanocomposite for applications in proteomics The well-known application of trypsin in proteomics is limited by two key factors including its low thermal stability and rapid autolysis under common working conditions (37 C, pH 8.0). The presence of autolytic trypsin fragments in a protein sample digest makes the interpretation of the MALDI–TOF peptide mass fingerprint more difficult especially when the original sample concentration is low. This has a negative impact on the sample identification by database search. As has been shown, the problem of trypsin autolysis can be eliminated by immobilization of the enzyme on magnetic nanoparticles enabling, in this way, the magnetic separation of the enzyme. Concerning the ways to increase trypsin thermostability, a significant progress in our laboratory has been achieved by its chemical modification with periodate-oxidized raffinose [45].

2861

Here we describe immobilization of a raffinose-modified bovine trypsin (RMT) on the suitably functionalized maghemite nanocarrier with the aim to improve the thermostability of trypsin and to stimulate its performance in digestion of protein samples. Initially, we functionalized the magnetic nanoparticles by chitosan [51] allowing the covalent binding of trypsin via primary amino groups and using glutaraldehyde as a linking agent (see Fig. 1). A TEM image of the prepared MCRMT complex is shown in Fig. 8a, where the chitosan–RMT shell (2–4 nm) is well observable. Compared to the cubic crystals observed in the TEM image of the as-prepared maghemite nanoparticles (Fig. 2b), the functionalization by chitosan and consequent attaching of trypsin led to rather globular-shaped composite nanoparticles. It is worthy to mention that the chitosan shell itself is relatively narrow and does not considerably affect the morphology of particles [51]. The magnetic characteristics of the MCRMT complex can be clearly deduced from its hysteresis loops measured at 2 and 300 K (Fig. 8b). At 300 K, no hysteresis is observed, indicating that the assembly of MCRMT nanocomposites behaves in a superparamagnetic manner similarly to the as-prepared maghemite nanopowder. In addition, when comparing the hysteresis loops of maghemite nanoparticles alone (Fig. 3) with that of the MCRMT complex, we can see that the curve for the MCRMT system saturates even at a lower applied magnetic field than that of the starting maghemite nanoparticles. This unambiguously confirms that the chitosan–trypsin shell on the surfaces of the maghemite nanoparticles effectively suppressed the interparticle interactions which generally cause magnetic disorder within the nanoparticle mainly at its surface. Thus, the MCRMT system exhibits a more homogeneous magnetic response towards an applied magnetic fields compared with the as-prepared maghemite nanoparticles. The key results providing information on the thermostability of the prepared MCRMT complex and on the applicability of the chemically modified and immobilized trypsin are shown in Fig. 9. The temperature dependences of the residual activity for free trypsin, RMT and MCRMT (Fig. 9a) illustrate the gradual increase in the thermostability with the determined T50 values of 37, 48 and 61 C, respectively. The value determined for the MCRMT complex is the highest published so far and offers the possibility of substantial shortening of the digestion time with respect to common overnight digestion protocols by an increased reaction rate at higher temperatures (such as 55 C). The ongoing research work is underway in our laboratory. From the viewpoint of the practical applications of the MCRMT complex, it is very important to emphasize its proved high efficiency in protein digestion and the absence of its autolytic peptides in the reaction mixture. Indeed, we did not register any characteristic autolytic peaks of trypsin in MALDI–TOF MS of a digested standard protein (Fig. 9b). 4. Conclusions

Fig. 9. The temperature dependence of the residual activity of free bovine trypsin, RMT and MCRMT (a) and MALDI–TOF peptide mass fingerprint of bovine serum albumin obtained after in-solution digestion by MCRMT at 37 C (b); the dotted arrows indicate the positions where the most frequent autolytic peptides of trypsin (m/z ¼ 2163.056 and 2273.159) should appear.

We describe the thermally induced oxidative decomposition of iron(II) acetate in air as a simple and large scale synthetic route towards magnetic iron(III) oxide nanoparticles with a narrow size distribution and well defined cubic shape. The prepared maghemite nanoparticles can be easily attached to the surface of the bentonite clay resulting in a highly efficient negative oral contrast agent for MRI diagnostics of the small bowel and adjacent abdominal areas including pancreas and choledoch. Additionally, we have exploited chitosan-coated maghemite nanoparticles as a carrier for immobilization of raffinose-modified trypsin. Such immobilized trypsin exhibits the highest thermostability published so far and is applicable for rapid protein digestion at 37–55 C and the subsequent peptide analysis by MALDI–TOF MS. Peptide mass fingerprints of

2862


BSA, which was used as a standard protein, show the absence of trypsin autolytic peptides, which makes the trypsin-functionalized magnetic nanocomposite a promising tool for proteomic research. Acknowledgements This work has been supported by the Projects of the Ministry of Education of the Czech Republic (1M6198959201 and MSM6198959218) and by the Projects of ASCR (KAN115600801) and Grant Agency of the Czech Republic (205/08/0869). References [1] Wang Y-XJ, Hussain SH, Krestin GP. Superparamagnetic iron oxide contrast agents: physicochemical characteristics and applications in MR imaging. Eur Radiol 2001;11:2319–31. [2] Weissleder R, Moore A, Mahmood U, Bhorade R, Benveniste H, Chiocca EA, et al. In vivo magnetic resonance imaging of transgene expression. Nat Med 2000;6:351–5. [3] Levy L, Sahoo Y, Kim KS, Bergey EJ, Prasat PN. Nanochemistry: synthesis and characterization of multifunctional nanoclinics for biological applications. Chem Mater 2002;14:3715–21. [4] Zigeuner RE, Riesenberg R, Pohla H, Hofstetter A, Oberneder R. Isolation of circulating cancer cell from whole blood by immunomagnetic cell enrichment and unenriched immunocytochemistry in vitro. J Urol 2003;2:701–5. [5] Tibbe AS, de Grooth B, Greve J, Liberti P, Dolan G, Terstappen L. Optical tracking and detection of immunomagnetically selected and aligned cells. Nat Biotechnol 1999;17:1210–3. [6] Dobson J. Magnetic micro- and nano-particle-based targeting for drug and gene delivery. Nanomedicine 2006;1:31–7. [7] Van der Zee J. Heating patient: a promising approach? Ann Oncol 2002;13: 1173–84. [8] Pankurst QA, Connoly J, Jones SK, Dobson J. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine. J Phys D Appl Phys 2003;36:R167–81. [9] Corot C, Robert P, Ideé J-M, Port M. Recent advances in iron oxide nanocrystal technology for medical imaging. Adv Drug Deliv Rev 2006;58:1471–504. [10] Berry CC, Curtis ASG. Functionalisation of magnetic nanoparticles for applications in biomedicine. J Phys D Appl Phys 2003;36:198–206. [11] Alexiou C, Jurgons R, Seliger G, Iro H. Medical applications of magnetic nanoparticles. J Nanosci Nanotechnol 2006;6:2762–8. [12] Chouly C, Pouliquen D, Lucet I, Jeune JJ, Jallet P. Development of superparamagnetic nanoparticles for MRI: effect of particle size, charge and surface nature on biodistribution. J Microencapsul 1996;13:245–55. [13] Zhang Y, Kohler N, Zhang M. Surface modification of superparamagnetic magnetite nanoparticles and their intracellular uptake. Biomaterials 2002;23: 1553–61. [14] Gupta AK, Gupta M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials 2005;26:3995–4021. [15] Berry CC, Wells S, Charles S, Curtis ASG. Dextran and albumin derivatised iron oxide nanoparticles: influence on fibroblast in vitro. Biomaterials 2003;24: 4551–7. [16] Sahoo Y, Pizem H, Fried T, Golodnitsky D, Burstein L, Sukenik CN, et al. Alkyl phosphonate/phosphate coating on magnetite nanoparticles: a comparison with fatty acids. Langmuir 2001;17:7907–11. [17] Lewin M, Carlesso N, Tung C-H, Tang X-W, Cory D, Scadden T, et al. Tat peptidederivatized magnetic nanoparticles allow in vivo tracking and recovery of progenitor cells. Nat Biotechnol 2000;18:410–4. [18] Khor E, Lim LY. Implantable applications of chitin and chitosan. Biomaterials 2003;24:2339–49. [19] Lee J, Lee Y, Young JK, Bin Na H, Yu T, Kim H, et al. Simple synthesis of functionalized superparamagnetic magnetite/silica core/shell nanoparticles and their application as magnetically separable high-performance biocatalysts. Small 2008;4:143–52. [20] Zboril R, Bakandritsos A, Mashlan M, Tzitzios V, Dallas P, Trapalis C, et al. Onestep solid state synthesis of capped gamma-Fe2O3 nanocrystallites. Nanotechnology 2008;19. Art.No 095602. [21] Jarrett BR, Frendo M, Vogan J, Louie AY. Size-controlled synthesis of dextran sulfate coated iron oxide nanoparticles for magnetic resonance imaging. Nanotechnology 2007;18. Art.No 035603. [22] Lind K, Kresse M, Debus NP, Muller RH. A novel formulation for superparamagnetic iron oxide (SPIO) particles enhancing MR lymphography: comparison of physicochemical properties and the in vivo behaviour. J Drug Target 2002;10:221–30. [23] Pich A, Bhattacharya S, Ghosh A, Adler HJP. Composite magnetic particles: 2. Encapsulation of iron oxide by surfactant-free emulsion polymerization. Polymer 2005;46:4596–603. [24] Bonnemain B. Superparamagnetic agents in magnetic resonance imaging: physicochemical characteristics and clinical applications – a review. J Drug Target 1998;6:167–74. [25] Muller RN, Gilis P, Moiny M, Roch A. Transverse relaxivity of particulate MRI contrast media: from theories to experiments. Magn Reson Med 1991;22:178–82.

[26] Jung CW, Jacobs P. Physical and chemical properties of superparamagnetic iron oxide MR contrast agents: ferumoxides, ferumoxtran, ferumoxsil. Magn Reson Imaging 1995;13:661–74. [27] Narin B, Ajaj W, Go¨hde S, Langhorst J, Akgo¨z H, Gerken G, et al. Combined small and large bowel MR imaging in patients with Crohn’s disease: a feasibility study. Eur Radiol 2004;14:1535–42. [28] Van Gemert-Horsthuis K, Florie J, Hommes DW, Lavini C, Reitsma JB, Van Deventer SJ, et al. Feasibility of evaluating Crohn’s disease activity at 3.0. J Magn Reson Imaging 2006;24:340–8. [29] Grubnic S, Padhani AR, Revell PB, Husband JE. Comparative efficacy of and sequence choice for two oral contrasts agents used during MR imaging. Am J Roentgenol 1999;173:173–8. [30] Debatin JF, Patak MA. MRI of the small and large bowel. Eur Radiol 1999;9:1523–34. [31] Hahn FF, Stark DD, Lewis J, Saini S, Elizondo G, Weissleder R, et al. First clinical trial of a new superparamagnetic iron oxide for use as an oral gastrointestinal contrast agent in MR imaging. Radiology 1990;175:695–700. [32] Haldemann-Heusler RC, Wight E, Marincek B. Oral superparamagnetic contrast agent (ferumoxsil): tolerance and efficacy in MR imaging of gynecologic diseases. J Magn Reson Imaging 1995;5:385–91. [33] Johnson WK, Stoupis C, Torres GM, Rosenberg EB, Ros RR. Superparamagnetic iron oxide (SPIO) as an oral contrast agent in gastrointestinal (GI) magnetic resonance imaging (MRI): comparison with state-of-the-art computed tomography (CT). Magn Reson Imaging 1996;14:43–9. [34] MacVicar D, Jacobsen TF, Guy R, Husband JE. Phase III trial of oral magnetic particles in MRI of abdomen and pelvis. Clin Radiol 1993;47:183–8. [35] BachGansmo T, Dupas B, Gayet-Delacroix M, Lambrechts M. Abdominal MRI using a negative contrast agent. Br J Radiol 1993;66:420–5. [36] Vlahos L, Gouliamos A, Athanasopoulou G, Kotoulas G, Claus W, Hatziioannou A, et al. A comparative study between Gd-DTPA and oral magnetic particles (OMP) as gastro-intestinal (GI) contrast agents for MRI of the abdomen. Magn Reson Imaging 1994;12:719–26. [37] Lonnemark M, Hemmingsson A, Ericson A, Gundersen HG, Bachgansmo T. Oral superparamagnetic particles for magnetic resonance imaging. Effect in plain and viscous aqueous suspensions. Acta Radiol 1990;31:303–7. [38] Huang SH, Liao MH, Chen DH. Direct binding and characterization of lipase onto magnetic nanoparticles. Biotechnol Prog 2003;19:1095–100. [39] Saiyed ZM, Sharma S, Godawat R, Telang SD, Ramchand CN. Activity and stability of alkaline phosphatase (ALP) immobilized onto magnetic nanoparticles (Fe3O4). J Biotechnol 2007;131:240–4. [40] Jeng J, Lin MF, Cheng FY, Yeh CS, Shiea J. Using high-concentration trypsinimmobilized magnetic nanoparticles for rapid in situ protein digestion at elevated temperature. Rapid Commun Mass Spectrom 2007;21:3060–8. [41] Liu J, Lin S, Qi D, Deng C, Yang P, Zhang X. On-chip enzymatic microreactor using trypsin-immobilized superparamagnetic nanoparticles for highly efficient proteolysis. J Chromatogr A 2007;1176:169–77. [42] Stosova T, Sebela M, Rehulka P, Sedo O, Havlis J, Zdrahal Z. Evaluation of the possible proteomic application of trypsin from Streptomyces griseus. Anal Biochem 2008;376:94–102. [43] Bilkova Z, Slovakova M, Minc N, Fu¨tterer C, Cecal R, Horak D, et al. Functionalized magnetic micro- and nanoparticles: optimization and application to m-chip tryptic digestion. Electrophoresis 2006;27:1811–24. [44] Olsen JV, Ong SE, Mann M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Mol Cell Proteomics 2004;3:608–14. [45] Sebela M, Stosova T, Havlis J, Wielsch N, Thomas H, Zdrahal Z, et al. Thermostable trypsin conjugates for high-throughput proteomics: synthesis and performance evaluation. Proteomics 2006;6:2959–63. [46] Wang C, Oleschuk R, Ouchen F, Li J, Thibault P, Harrison DJ. Integration of immobilized trypsin bead beds for protein digestion within a microfluidic chip incorporating capillary electrophoresis separations and an electrospray mass spectrometry interface. Rapid Commun Mass Spectrom 2000;14:1377–83. [47] Urban PL, Goodall DM, Bruce NC. Enzymatic microreactors in chemical analysis and kinetic studies. Biotechnol Adv 2006;24:42–57. [48] Wang S, Bao H, Yang P, Chen G. Immobilization of trypsin in polyanilinecoated nano-Fe3O4/carbon nanotube composite for protein digestion. Anal Chim Acta 2008;612:182–9. [49] Lin S, Lin Z, Yao G, Deng C, Yang P, Zhang X. Development of microwaveassisted protein digestion based on trypsin-immobilized magnetic microspheres for highly efficient proteolysis followed by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis. Rapid Commun Mass Spectrom 2007;21:3910–8. [50] Li Y, Xu X, Deng C, Yang P, Zhang X. Immobilization of trypsin on superparamagnetic nanoparticles for rapid and effective proteolysis. J Proteome Res 2007;6:3849–55. [51] Belessi V, Zboril R, Tucek J, Mashlan M, Tzitzios V, Petridis D. Ferrofluids from magnetic-chitosan hybrids. Chem Mater 2008;20:3298–305. [52] Li G-Y, Jiang Y-R, Huang K-L, Ding P, Yao L-L. Kinetics of adsorption of Saccharomyces cerevisiae mandelated dehydrogenase on magnetic Fe3O4-chitosan nanoparticles. Colloid Surface A 2008;320:11–8. [53] Hyeon T, Lee SS, Park J, Chung Y, Bin Na H. Synthesis of highly crystalline and monodisperse maghemite nanocrystallites without a size-selection process. J Am Chem Soc 2001;123:12798–801. [54] Yu WW, Falkner JC, Yavuz CT, Colvin VL. Synthesis of monodisperse iron oxide nanocrystals by thermal decomposition of iron carboxylate salts. Chem Commun 2004;123:2306–7.

K. Kluchova et al. / Biomaterials 30 (2009) 2855–2863 [55] Park J, Lee E, Hwang NM, Kang MS, Kim SC, Hwang Y, et al. One-nanometerscale size-controlled synthesis of monodisperse magnetic iron oxide nanoparticles. Angew Chem Int Ed 2005;44:2872–7. [56] Cozzoli PD, Snoeck E, Garcia MA, Giannini C, Guagliardi A, Cervellino A, et al. Colloidal synthesis and characterization of tetrapod-shaped magnetic nanocrystals. Nano Lett 2006;6:1966–72. [57] Roca AG, Morales MP, O’Grady K, Serna CJ. Structural and magnetic properties of uniform magnetite nanoparticles prepared by high temperature decomposition of organic precursors. Nanotechnology 2006;17:2783–8. [58] Kwon SG, Piao Z, Park J, Angappane S, Jo Y, Hwang NM, et al. Kinetics of monodisperse iron oxide nanocrystal formation by ‘‘heating up’’ process. J Am Chem Soc 2007;129:12571–84. [59] Zboril R, Mashlan M, Petridis D. Iron(III) oxides from thermal processes – synthesis, structural and magnetic properties, Mossbauer spectroscopy characterization and applications. Chem Mater 2002;14:969–82.

2863

[60] Dormann JL, Fiorani D, Tronc E. Magnetic relaxation in fine-particle systems. Adv Chem Phys 1997;98:283–94. [61] Batlle X, Labarta A. Finite-size effects in fine particles: magnetic and transport properties. J Phys D Appl Phys 2002;35:R15–42. [62] Chen F, Ward J, Robinson PJ. MR imaging of the liver and spleen: a comparison of the effects on signal intensity of two superparamagnetic iron oxides agents. Magn Reson Imaging 1999;17:549–56. [63] McLachlan, Morris MR, Lucas MA, Fisco RA, Eakins DR, Fowler DR, et al. Phase I clinical evaluation of a new iron oxide MR contrast agent. J Magn Reson Imaging 1994;4:301–7. [64] Mashlan M, Bartonkova H, Kluchova K, Medrik I, Zboril R, Oborny J. Patent no: WO 2008/095450 A2. [65] Cadena F, Garcia R, Peters RW. Adsorption of benzene from aqueous-solutions by bentonite treated with quaternary amines. Environ Prog 1990;9:245–53. [66] Bryant RG, Listinsky JJ. Patent no: 4927624; 1990.

PUBLIKACE 2 (Příloha 2) Biologicky aktivní látky imobilizované na magnetických nosičích a jejich využití v biochemii a biotechnologiích Michaela Pečová, Ludmila Zajoncová, Kateřina Poláková, Jan Čuda, Mirka Šafaříková, Marek Šebela a Ivo Šafařík Chem. Listy, 105, 524 – 530 (2011)

Chem. Listy 105, 524530 (2011)

Referát

BIOLOGICKY AKTIVNÍ LÁTKY IMOBILIZOVANÉ NA MAGNETICKÝCH NOSIČÍCH A JEJICH VYUŽITÍ V BIOCHEMII A BIOTECHNOLOGII MICHAELA PEČOVÁa, LUDMILA ZAJONCOVÁa, KATEŘINA POLÁKOVÁb, JAN ČUDAb, MIRKA ŠAFAŘÍKOVÁc, MAREK ŠEBELAa a IVO ŠAFAŘÍKb,c

Obecnou výhodou magnetických kompozitních materiálů je možnost cílené manipulace působením vnějšího magnetického pole. Spojením magnetických nosičů (jak v podobě magnetických nanočástic s rozměrem pod 100 nm, tak i magnetických mikročástic) s biologicky aktivní látkou lze dosáhnout unikátních vlastností vzniklých materiálů využitelných v biochemii, molekulární a buněčné biologii, (nano)biotechnologii, (nano)medicíně a jinde. Tyto materiály je možné separovat i ze složitých biologických systémů (např. buněčných suspenzí, homogenátů, fermentačních médií apod.). Nejčastějšími materiály pro přípravu magnetických nosičů biologicky aktivních látek jsou biokompatibilní magnetické oxidy železa magnetit a maghemit (případně jejich směsi) a rovněž různé typy feritů, a to ve formě prášků nebo magnetických kapalin. V současné době se věnuje velká pozornost jednodoménovým a superparamagnetickým nanočásticím. Jednodoménové částice obsahují pouze jednu magnetickou doménu, ve které jsou magnetické momenty uspořádány paralelně a výsledný vektor magnetizace je mnohem vyšší než u multidoménových mikročástic. Unikátní magnetické vlastnosti nanočástic spolu s jejich ohromným povrchem (řádově 100 m2 g1) umožňující navázat velké množství ligandů jsou podstatou jejich využití jako efektivních nosičů pro účinnou a rychlou imobilizaci a separaci biologicky aktivních látek. Vzhledem k tomu, že imobilizace nejrůznějších biologicky aktivních látek je jednou z klíčových technik v biochemii a biotechnologiích, budou v tomto stručném přehledném článku podány základní informace o přípravě magnetických nosičů biologicky aktivních látek a jejich možném využití.

a

Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého, Šlechtitelů 11, 783 71 Olomouc, b Regionální centrum pokročilých technologií a materiálů [Katedra fyzikální chemie a Katedra experimentální fyziky], Přírodovědecká Fakulta, Univerzita Palackého, 17. listopadu 12, 771 46 Olomouc, c Oddělení nanobiotechnologie, Ústav systémové biologie a ekologie AV ČR, v. v. i., Na Sádkách 7, 370 05 České Budějovice [email protected] Došlo 7.1.10, přepracováno 9.11.10, přijato 25.11.10. Klíčová slova: magnetické nanočástice a mikročástice, imobilizace, biotechnologie, biologicky aktivní látky, proteiny

Obsah 1. Úvod 2. Syntéza, modifikace a charakterizace magnetických mikročástic a nanočástic 3. Imobilizace biologicky aktivních látek na magnetických nosičích 4. Aplikace biologicky aktivních látek imobilizovaných na magnetických nosičích 4.1. Imobilizované proteiny 4.2. Imobilizované nukleové kyseliny a oligonukleotidy 4.3. Imobilizované sacharidy 4.4. Ostatní imobilizované biologicky aktivní látky 5. Závěr

2. Syntéza, modifikace a charakterizace magnetických mikročástic a nanočástic V souvislosti s rostoucím uplatněním magnetických částic v biologických vědách či biotechnologiích byla vyvinuta a publikována řada metod jejich syntézy. Obecně se metody syntézy zaměřují na přípravu práškových materiálů, obsahujících především mikročástice či nanočástice maghemitu, magnetitu, směsných oxidů železa nebo feritů, na přípravu magnetických kapalin a na syntézu magnetických částic přímo v prostředí obalového, často (bio) polymerního materiálu, jehož úkolem je jejich stabilizace, dispergace a funkcionalizace jejich povrchu. Mezi nejčastější metody syntézy magnetických nanočástic a mikročástic pro bioaplikace patří chemické reakce zahrnující např. srážecí reakce solí železa, termické rozklady prekurzorů obsahujících železo, sol-gel reakce, mikroemulzní techniky, sonochemické syntézy aj. V obsáhlém přehledu Laurentové a spol. je uveden podrobný popis

1. Úvod Magnetické nanočástice a mikročástice jsou středem velkého zájmu pro své potenciální použití v různých biologických disciplínách, biotechnologiích, environmentálních technologiích, medicíně i v analytických aplikacích. Tyto částice mají většinou charakter kompozitních materiálů, které jsou složeny z vlastní fero- nebo ferimagnetické složky (zodpovědné za interakci s vnějším magnetickým polem) a složky většinou diamagnetické (nemagnetické), která zajišťuje požadovanou interakci s biologickými systémy1. 524

Chem. Listy 105, 524530 (2011)

Referát

nejrůznějších technik a metod vedoucích k přípravě magnetických nanočástic oxidů železa i s jejich fyzikálními a chemickými vlastnostmi a biologickými aplikacemi2. Zajímavou metodou přípravy magnetických částic jednotné velikosti je produkce tzv. magnetosomů (částice magnetitu obalené fosfolipidovou membránou) magnetotaktickými bakteriemi3. Nejčastěji využívanou metodou k přípravě částic magnetitu či maghemitu ve velkém množství je tzv. spolusrážení2. Při této metodě reagují železnaté a železité ionty v zásaditých roztocích. Velikost a tvar vzniklých oxidů železa závisí na typu použité soli, reakční teplotě, pH, iontové síle aj. Touto metodou vznikají většinou částice s různou velikostí. Přídavek chelatujících organických aniontů (např. kyseliny citronové nebo olejové), nebo polymerů jako je dextran, škrob či poly(vinylalkohol) umožňuje dosáhnout monodisperzity nanočástic. Při Massartově procesu přípravy vodných magnetických kapalin4 se nanočástice stabilizují přítomností kyseliny chloristé nebo tetramethylamoniumhydroxidu. Pro získání magnetických nanočástic s úzkou distribucí velikosti mohou být využity různé typy syntetických nebo biologických nanoreaktorů, tvořené např. povrchově aktivními látkami, apoferitinem, cyklodextriny, liposomy nebo dendrimery. Účinnou metodou přípravy magnetických nanočástic je mikroemulzní technika, při které termodynamicky stálá disperze dvou nemísitelných fází (např. voda v oleji) vytvoří micely obklopující magnetické nanočástice; velikost vzniklých nanočástic může být řízena úpravou velikosti nitra micely obsahující vodnou fázi. Nanočástice oxidů železa je rovněž možno připravit rozkladem prekurzorů obsahujících železo při zvýšené teplotě5 nebo působením ultrazvuku. Je třeba rovněž zmínit komerčně dostupné vhodně povrchově modifikované magnetické mikročástice a nanočástice. Mezi největší firmy vyrábějící magnetické nosiče patří Invitrogen (mikročástice Dynabeads), Advanced Magnetics (USA) či Miltenyi Biotec (Německo); v České republice je výrobcem celulosových magnetických nosičů firma Iontosorb (Ústí nad Labem). Přehled různých typů komerčních materiálů je možno nalézt ve vybraných přehledných článcích6,7; pro běžné laboratorní účely je ovšem cena většiny těchto produktů vysoká8. Aby se mohly biologicky významné látky navázat na povrch magnetických nanočástic a mikročástic, je třeba jejich povrch modifikovat vhodnými přírodními nebo syntetickými látkami. K tomu se používají zejména přírodní a syntetické polymery, ale je možné využít i některé organické sloučeniny nebo anorganické materiály. Funkcionalizovaná magnetická částice musí splňovat řadu specifických kritérií; mimo jiné musí být biokompatibilní, zároveň musí být potlačeny mezičásticové interakce a musí být umožněna chemická modifikace nezbytná pro následnou imobilizaci biomolekul. Pro funkcionalizaci povrchu magnetických částic stabilizátory se používá např. kyselina citronová nebo alkansulfonáty2. Povrch magnetických nosičů může být rovněž upraven silanizací; jako silanizační činidla se často používají (3-aminopropyl)triethoxysilan (APTES) nebo

glycidyloxypropyltriethoxysilan (GOPS). Silanizace se provádí na povrchu částic, který je zbaven organických látek. Je možno použít tři základní metody silanizace, a to z organické fáze, z vodné fáze (kdy vzniká vrstva stabilnější ve vodném prostředí) nebo odpařováním daného silanu9. Funkční skupiny silanizovaných magnetických částic (např. NH2 pro aktivaci glutaraldehydem) je následně možné využít pro imobilizaci různých biomolekul. Magnetické částice je možno modifikovat vhodnými biopolymery, např. chitosanem, který se vyznačuje výbornými biologickými, chemickými a fyzikálními vlastnostmi10. Přítomné NH2 a OH skupiny mohou být využity pro imobilizaci molekul po jejich vhodné aktivaci. Navíc vykazuje chitosan afinitu k řadě biomakromolekul a iontů. Na magnetických částicích obalených chitosanem byla např. imobilizována lakasa z Pycnoporus sanguineus11. Pro funkcionalizaci magnetických částic se často využívá dextran, případně karboxydextran a (karboxymethyl) dextran. Aktivace dextranu na povrchu magnetické částice se většinou provádí jodistanem sodným. Přitom vznikají příslušné polyaldehydy dextranu, které mohou dále reagovat se skupinou NH2 proteinů12. Vhodným materiálem pro funkcionalizaci magnetických částic jsou i algináty13 nebo škrob či želatina. Ze syntetických polymerů jsou pro modifikace používány zejména poly(ethylenglykol) (PEG) a poly(vinylalkohol) (PVA), které jsou netoxické, biokompatibilní a neimunogenní. Velmi zajímavé využití pro modifikaci magnetických částic mají dendrimery, které umožňují zavést do vytvořeného kompozitního materiálu velké množství funkčních skupin, umožňující posléze imobilizovat velké množství biologicky aktivních látek14. Vytvořené magnetické nanočástice a mikročástice je nutno obvykle důkladně charakterizovat. Pro studium morfologie a velikosti povrchově modifikovaných magnetických nanočástic a mikročástic lze využít transmisní a skenovací elektronovou mikroskopii (TEM, SEM), které poskytují nejen okamžitou obrazovou kvalitativní informaci o povrchu a velikosti částic, ale s vhodnou výbavou (např. EDS – energiově disperzní spektroskopie) je možno provést i lokální analýzu chemického složení. Tímto způsobem je možné studovat i kvalitu a charakter obalové vrstvy. Pro další charakterizaci zkoumaných materiálů slouží magnetizační měření, realizovaná s použitím magnetometrů. V současné době se využívají zejména měření na magnetometru založeném na supravodivém kvantovém interferenčním jevu (SQUID). Pro účely zkoumání modifikace povrchu magnetických nanočástic obalených nemagnetickou vrstvou se zjišťuje parametr magnetizačního měření citlivý na změnu mezičásticové interakce dipól-dipólové povahy a výměnného typu. Vymizení mezičásticových interakcí má vliv na dosažení saturační magnetizace nanočásticového systému při výrazně nižších indukcích vnějšího magnetického pole a také na její maximální hodnotu v porovnání s povrchově nemodifikovanýni nanočásticemi15. Saturační magnetizace je fyzikální veličina a je definována jako maximální hodnota magnetizace dosažitelná pro daný materiál. Hodnotná jsou také měření teplotních závislostí magnetizace materiálu, tzv. ZFC a FC křiv525

Chem. Listy 105, 524530 (2011)

Referát

ky. ZFC křivka vyjadřuje teplotní závislost magnetizace po ochlazení v nulovém magnetickém poli a FC křivka po ochlazení při jisté hodnotě indukce vnějšího magnetického pole. Jejich vzájemným porovnáním pak lze učinit závěr o magnetickém chování systému neinteragujících či interagujících povrchově obalených nanočástic, jelikož ZFC a FC křivky jsou velmi citlivé na dynamiku magnetických relaxačních jevů vyskytujících se zejména u magnetických nanočásticových systémů. Omezení mezičásticových interakcí v důsledku obalování nanočástic je pak patrné z odlišného průběhu zejména FC křivky16. Další metodou k charakterizaci povrchové vrstvy a vazby mezi nanočásticemi magnetických materiálů a obalového materiálu slouží infračervená spektroskopie (IČ), což je analytická technika určená především pro identifikaci a strukturní charakterizaci organických sloučenin a také pro stanovení anorganických látek. Metody termické analýzy (TG/DTA) jsou schopny poskytnout informaci o procentovém zastoupení obalové vrstvy navázané na nanočástice a výsledné tepelné stabilitě studovaného kompozitního materiálu.

vazby se využívají i vhodné funkční skupiny biologicky aktivních látek (NH2, COOH, SH, OH nebo tyrosin a histidin). Je-li povrch nosiče modifikován karboxylovými skupinami, používají se jako aktivační činidla karbodiimidy (CDI), které umožňují klasickou reakci COOH s aminoskupinou imobilizované látky. Nejčastěji se používá hydrochlorid 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] karbodiimidu (EDC nebo EDAC), který je rozpustný ve vodě. Dále se pro aktivaci karboxylových skupin používají N,Nʼ-dicyklohexylkarbodiimid (DCC) a N,Nʼ-diisopropylkarbodiimid (DIC). Kovalentní imobilizace citlivějších proteinů se provádí pomocí CDI a N-hydroxysukcinimidu (NHS) nebo sulfonovaného NHS (sulfoNHS). Oproti reakci jen s CDI je průběh reakce daleko mírnější, nevznikají nežádoucí meziprodukty a vzniklý produkt je poměrně stabilní. Nosič modifikovaný NH2 skupinou se aktivuje bifunkčními činidly, nejčastěji vodným roztokem glutaraldehydu, který je běžně dostupný, dostatečně reaktivní, rozpustný ve vodě a šetrný k proteinům. Glutaraldehyd vytváří kovalentní vazby mezi nosičem a například enzymem, stabilizuje výslednou strukturu a slouží rovněž k zesítění biomolekul. Velmi užitečná technika pro imobilizaci celé řady látek je založena na využití magnetických částic s imobilizovaným avidinem nebo streptavidinem, které vykazují vysokou afinitu pro biotin (vitamin B7, vitamin H). Avidin je glykoprotein vaječného bílku složený ze čtyř stejných podjednotek (homotetramer); každá podjednotka má vazebné místo s vysokou afinitou pro biotin. Častěji se používá streptavidin, což je protein izolovaný z bakterie Streptomyces avidinii; jedná se také o tetramer, není glykosylovaný a vykazuje nižší nespecifické interakce. Biomolekuly určené k imobilizaci (např. nukleové kyseliny a nukleotidy, proteiny, sacharidy) jsou nejdříve biotinylovány (vnesení biotinové skupiny na povrch molekuly) a potom vázány na výše zmíněné nosiče s využitím interakce mezi streptavidinem nebo avidinem a biotinem. Komplex biotinu a streptavidinu (resp. avidinu) je velmi pevný (Kd ~ 1014  1015 mol l1) a odolává i velmi tvrdým reakčním podmínkám20. Další možností pro imobilizaci biologicky aktivních látek je použití magnetoliposomů, které mohou být využity zejména pro imobilizaci membránově vázaných enzymů, např. hovězí cytochrom c oxidasy, kdy jak aktivita, tak stabilita tohoto enzymu se po imobilizaci na magnetoliposomy výrazně zvýšila ve srovnání s volným enzymem21.

3. Imobilizace biologicky aktivních látek na magnetických nosičích Na magnetických nosičích byla imobilizována řada biologicky aktivních látek, jak vysokomolekulárních, tak nízkomolekulárních. Jejich imobilizaci je možné provést celou řadou způsobů, stejně jako u nemagnetických nosičů17,18, jako jsou např. polymerní nebo anorganické částice a filmy. V některých případech lze pro imobilizaci významných proteinů využít přímou fyzikální sorpci na nosič, která je jednou z nejstarších metod a stala se jednoduchým, ekonomicky výhodným a snadným postupem. Fyzikální sorpce je však méně spolehlivá a málo stabilní ve srovnání s imobilizací kovalentními vazbami, někdy však může být použita pro reverzibilní imobilizaci proteinů19. Další používanou fyzikální technikou imobilizace je zabudování biologicky aktivních látek, příp. celých buněk, do magnetické gelové matrice. Matrice jsou tvořeny syntetickými polymery, jako jsou polyakrylamid, polyurethany nebo různé typy pryskyřic, a dále proteiny (želatina, kolagen, vaječný bílek) a polysacharidy (agar, agarosa, karagenany nebo algináty). Gelové matrice mají schopnost zadržovat vodu, což je nutné pro uchování biologické aktivity imobilizovaných látek. Měkké, hydratované a zbobtnalé gely umožňují zakotvení biologicky aktivních látek a buněk. Prostředí gelů je blízké fyziologickým podmínkám a je tak minimalizována denaturace těchto látek a jsou zachovány veškeré biologické funkce zakotveného biologického materiálu. Nevýhodou tohoto postupu může být postupné uvolňování imobilizované látky. Kovalentní imobilizace je nejčastější imobilizační technikou. Vyžaduje, aby nosič obsahoval funkční skupiny, např. NH2, COOH, OH, SH, nebo CONH2. Působením různých činidel se funkční skupiny na povrchu nosiče aktivují pro navázání biomolekul. Pro vytvoření kovalentní

4. Aplikace biologicky aktivních látek imobilizovaných na magnetických nosičích Magnetické nosiče díky svým magnetickým vlastnostem nabízejí rozmanité spektrum aplikací, mimo jiné v různých oblastech biologických věd a biotechnologií2,6,22. Vhodně funkcionalizované magnetické mikročástice či nanočástice slouží jako nosiče enzymů, protilátek, lektinů, ostatních biologicky významných proteinů a pepti526

Chem. Listy 105, 524530 (2011)

Referát

dů, oligonukleotidů a nukleových kyselin, hormonů, léčiv, buněk, diagnostických látek, afinitních ligandů apod.3,22. V biochemii se nabízí využití magnetických částic (zejména s navázanými afinitními ligandy) při izolaci a čištění proteinů23. Značné zpřesnění proteinové analýzy metodou MALDI-TOF MS bylo dosaženo navázáním trypsinu na magnetický nosič5.

s následnou magnetickou separací, nebo v magneticky stabilizovaných fluidních reaktorech. V obou typech reaktorů je možné provádět enzymatické reakce i ve směsích obsahujících částicové nečistoty. Magnetické biokatalyzátory mohou být výhodné zejména v případě, kdy je využíván drahý enzym, nebo v situaci, kdy je nežádoucí přítomnost enzymu v hotovém produktu20. Významnou skupinou enzymů, která nachází široké uplatnění v biotechnologických procesech i v medicíně, jsou proteasy, které štěpí peptidovou vazbu v proteinech. Proteasy byly imobilizovány na mnoho druhů magnetických nosičů, (typické příklady jsou uvedeny v tabulce I). Zajímavou možností je využití trypsinu (EC 3.4.21.4) imobilizovaného na magnetické částice v proteomice ke štěpení proteinů na směs štěpných peptidů, které jsou dále analyzovány hmotnostní spektrometrií. Použití volného trypsinu v proteomice je rutinní, avšak naráží na jistá omezení. Po imobilizaci na magnetické částice lze trypsin i jiné proteasy použít ve vyšší koncentraci, což vede ke zkrácení doby nutné ke štěpení. Následující magnetická separace umožňuje odstranění imobilizovaného trypsinu ze směsi proteinů před další analýzou štěpných peptidů5. Další významnou skupinou enzymů v biotechnologiích jsou lipasy (EC 3.1.1.3.) produkované různými druhy mikroorganismů. Jejich imobilizace na magnetických nosičích byla využita např. při transesterifikaci sojového oleje methanolem za vzniku methylesterů mastných kyselin (které jsou využívány v pohonných směsích známých pod označením „biodiesel“). Imobilizovaná lipasa byla použita

4.1. Imobilizované proteiny Proteiny patří mezi nejvýznamnější biopolymery, vykonávající řadu funkcí v živých organismech. Pro dosažení optimálních vlastností proteinů, zejména při in vitro aplikacích, se často zakotvují na pevné nosiče. Imobilizace na magnetické nosiče umožňuje magnetickou manipulaci a následnou separaci použitého komplexu ve vhodném magnetickém separátoru. Imobilizace enzymů na magnetických nosičích je velmi významná jak z hlediska laboratorních, tak potenciálních biotechnologických aplikací. Navázáním enzymů na magnetické nosiče mohou získat takto modifikované enzymy výhodnější vlastnosti, např. vyšší stabilitu, rozšířený rozsah optimální teploty, pH apod. Imobilizací se může zvýšit aktivita enzymů a často dochází ke snížení Michaelisovy konstanty Km; nižší hodnoty Km ukazují na vyšší afinitu enzymu k substrátu. Imobilizované enzymy je možné používat opakovaně, jsou stálejší při skladování a na rozdíl od volných enzymů je možno s nimi lehce manipulovat17. Reakce s enzymy imobilizovanými na magnetických částicích probíhají většinou v míchaných reaktorech

Tabulka I Příklady proteolytických enzymů imobilizovaných na magnetických nosičích Proteasa

Magnetický nosič

Aplikace

Lit.

Chymotrypsin

Magnetic Glyoxal 4% Agarose Beads 20–75 m magnetické teplotně citlivé latexové mikročástice magnetické nanočástice modifikované poly(ethylenglykolem) magnetická perlová celulosa magnetický derivát poly(ethylenglykolu) magnetické alginátové částice

hydrolýza vepřového pepsinu A

52

vsádková hydrolýza kaseinu

53

zvýšení enzymové aktivity a termostability hydrolýza polyklonálních lidských IgG studium fibrinolýzy

54

studium podmínek pro imobilizaci

57

detekce organických a anorganických xenobiotik hydrolýza proteinů pro proteomiku

58

hydrolýza proteinů pro proteomiku

23

cílená hydrolýza fibrinového koaguala

60

Chymotrypsin Keratinasa (Bacillus subtilis) Papain Plasmin Proteasa (Actinomyces fradiae) Trypsin Trypsin Trypsin (modifikovaný rafinosou) Urokinasa

nanočástice magnetických oxidů železa magnetické křemičitanové mikročástice maghemitové nanočástice pokryté chitosanem magnetit modifikovaný polyethylenglykolem 527

55 56

59

Chem. Listy 105, 524530 (2011)

Referát

opakovaně bez významné ztráty aktivity24. Na magnetických nosičích byla rovněž imobilizována řada amylolytických enzymů, které byly využity např. při kontinuální hydrolýze maltodextrinů v reaktoru s fluidním ložem25 nebo při hydrolýze škrobu26. Na magnetické nosiče se imobilizují také oxidoreduktasy jako je např. lakasa. Lakasa (EC 1.10.3.2) patří do skupiny polyfenoloxidas obsahujících měď, která oxiduje řadu sloučenin (např. fenoly, polyfenoly, aromatické aminy a další), včetně vybraných organických barviv. V práci Rotkové a spol.27 byla provedena imobilizace lakasy z Trametes versicolor a Pycnoporus cinnabarinus na magnetické celulosové mikročástice (125–250 m) s hydroxylovými nebo hydrazidovými funkčními skupinami; největší aktivity navázaného enzymu bylo dosaženo při orientované imobilizaci s využitím sacharidových řetězců enzymu. Kromě enzymů imobilizovaných na magnetických nosičích je rovněž možno pro katalytické účely využít magneticky modifikované buňky (celobuněčné katalyzátory). Buňky Saccharomyces cerevisiae, zabudované do magnetických alginátových mikročástic, nebo modifikované vodnou magnetickou kapalinou, byly použity při rozkladu peroxidu vodíku a konverzi sacharosy na invertní cukr2830. Protilátky (imunoglobuliny) jsou proteiny, které jsou důležitou součástí lidského imunitního systému. Imobilizace protilátek na magnetických mikročásticích nebo nanočásticích opět přináší výhodu v tom, že po skončení reakce může být komplex antigen-protilátka z roztoku odstraněn vhodnou magnetickou separací. Při imobilizaci protilátek je důležité, aby rozpoznávací místo (tzv. Fab oblast) bylo vhodně orientováno a byla tak zachována plná biologická funkce. Z tohoto důvodu není většinou výhodná přímá imobilizace protilátek na aktivovaných nosičích. Lepší výsledky je možno dosáhnout, pokud jsou nejdříve na částicích imobilizovány sekundární protilátky a potom protilátky primární. Sekundární protilátky fungují jako spojkové prvky a navíc umožňují optimální orientaci primárních protilátek. Místo sekundárních protilátek je rovněž možno použít protein A. Protilátky imobilizované na magnetických nosičích je možno s úspěchem využít při vývoji magnetických metod pro imunostanovení biologicky aktivních látek a xenobiotik. Existují dva základní typy, imunomagnetická stanovení a magnetoimunostanovení. Při prvním z nich je protilátka imobilizována na magnetickém nosiči (místo na klasickém nosiči, např. na stěnách jamek v mikrotitračních destičkách). Imobilizovanou protilátku je možno pipetovat do zkumavek a potom magneticky separovat. Při magnetoimunostanovení slouží magnetické částice jako detekovatelná značka (místo např. enzymů, radionuklidů nebo luminiscenčních látek)31. Imobilizované protilátky byly využity pro izolaci a stanovení celé řady antigenů. Jako příklad je možno uvést použití protilátky proti -fetoproteinu (AFP) imobilizované na magnetických nanočásticích. AFP je důležitý tumorový marker v krevním séru; stanovení jeho koncentrace hraje klíčovou roli v klinické praxi, neboť koncentra-

ce AFP je zvýšena u pacientů s karcinomem jater32. V oblasti environmentální analýzy je zajímavé využití komerčních setů RaPID Assays (Strategic Diagnostics, Inc., USA) a Abraxis kits (Abraxis, USA) pro terénní stanovení asi 15 významných herbicidů, insekticidů, antimikrobiálních látek a uhlovodíků. Velmi významné je využití imunomagnetických částic při separaci buněk, např. buněk patogenních bakterií z potravin a klinických vzorků (zejména Salmonella, verotoxigenních kmenů Escherichia coli, Listeria monocytogenes), nádorových buněk, kmenových buněk, parazitních prvoků (Cryptosporidium a Giardia) a pod.7. Lektiny jsou velkou skupinou proteinů, které se vyznačují schopností rozpoznávat a vázat sacharidové struktury s vysokou specificitou a afinitou. Jde o bílkoviny neimunitního původu. Lektiny imobilizované na magnetických nosičích byly využity při frakcionaci erytrocytů33. Konkanavalin A imobilizovaný na magnetických částicích byl použit při adsorpci kvasničné invertasy34. Zajímavé využití má celá řada dalších proteinů a peptidů imobilizovaných na magnetických nosičích; např. imobilizované inhibitory enzymů lze využít zejména pro izolaci enzymů, např. pepsinu35 nebo trypsinu36. Imobilizovaný lidský sérový albumin byl využit při odstranění bilirubinu z krevního séra37 a imobilizovaný protein A lze použít pro navázání nebo izolaci protilátek38. 4.2. Imobilizované nukleové kyseliny a oligonukleotidy Separace nukleových kyselin má nebývalý význam v molekulární biologii. Nukleové kyseliny mohou být separovány s použitím magnetických částic s imobilizovanými oligonukleotidy. Nejčastěji se magneticky separuje eukaryotní mRNA na magnetickém nosiči s navázaným oligodeoxythymidinem. Tento proces je založen na skutečnosti, že většina eukaryotní mRNA obsahuje na svém 3ʼ-konci polyadenylový řetězec (A+), a je tedy možné párování22. Velký význam má i imobilizace aptamerů (krátké řetězce molekul DNA nebo RNA) na magnetických nosičích, protože v řadě případů mohou nahradit protilátky při standardních imunomagnetických separacích, např. při izolaci a detekci nádorových buněk39. 4.3. Imobilizované sacharidy Kovalentní imobilizace sacharidů a jejich derivátů na magnetických nosičích není zcela běžná. Jako příklad můžeme zmínit imobilizaci 4-aminofenyl-β-D-thioglukopyranosidu na silanizovaných magnetických částicích, které byly následně použity pro afinitní separaci βgalaktosidasy40. Magnetické nanočástice s imobilizovanou manosou byly využity pro značení kmenových buněk41. Podstatně významnější jsou magnetické částice modifikované různými polysacharidy, nebo magnetické polysacharidové částice. Tyto částice je možné po vhodné aktivaci použít při imobilizaci vybraných biologicky aktivních látek a rovněž jako specifické adsorbenty pro afinitní chromatografickou separaci různých látek. Magnetický derivát 528

Chem. Listy 105, 524530 (2011)

Referát

5. Kluchova K., Zboril R., Tucek J., Pecova M., Zajoncova L., Safarik I., Mashlan M., Markova I., Jancik D., Sebela M., Bartonkova H., Bellesi V., Novak P., Petridis D.: Biomaterials 30, 2855 (2009). 6. Šafařík I., Šafaříková M.: Monatsh. Chem. 133, 737 (2002). 7. Šafařík I., Šafaříková M.: J. Chromatogr., B 722, 33 (1999). 8. Šafaříková M., Šafařík I.: Chem. Listy 89, 280 (1995). 9. Weetall H. H., Lee M. J.: Appl. Biochem. Biotechnol. 22, 311 (1989). 10. Krajewska B.: Enzyme Microb. Technol. 35, 126 (2004). 11. Jiang D. S., Long S. Y., Huang J., Xiao H. Y., Zhou J. Y.: Biochem. Eng. J. 25, 15 (2005). 12. Hong X., Guo W., Yuang H., Li J., Liu Y. M., Ma L., Bai Y. B., Li T. J.: J. Magn. Magn. Mater. 269, 95 (2004). 13. Šafaříková M., Roy I., Gupta M. N., Šafařík I.: J. Biotechnol. 105, 255 (2003). 14. Pan B. F., Gao F., Gu H. C.: J. Colloid Interface Sci. 284, 1 (2005). 15. Fiorani D., Testa A. M., Lucari F., D'Orazio F., Romero H.: Physica B 320, 122 (2002). 16. Dormann J. L., Fiorani D., Tronc E.: Adv. Chem. Phys. 98, 283 (2007). 17. Cao L. Q.: Carrier-bound Immobilized Enzymes: Principles, Application and Design. Wiley, Weinheim 2005. 18. Bickerstaff G. F. (ed.): Immobilization of Enzymes and Cells. Humana Press, Totowa 1997. 19. Bayramoglu G., Yilmaz M., Senel A. U., Arica M. Y.: Biochem. Eng. J. 40, 262 (2008). 20. Šafařík I., Šafaříková M., v knize: Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers (Häfeli, U., Schutt, W., Teller, J., Zborowski, M., ed.), str. 323. Plenum Press, New York 1997. 21. De Cuyper M., Demeulenaer B., Vandermeeren P., Vanderdeelen J.: Biotechnol. Bioeng. 49, 654 (1996). 22. Safarik I., Safarikova M.: Chem. Pap. 63, 497 (2009). 23. Safarik I., Safarikova M.: Biomagn. Res. Technol. 2, 7 (2004). 24. Xie W. L., Ma N.: Energy Fuels 23, 1347 (2009). 25. Pieters B. R., Bardeletti G., Coulet P. R.: Appl. Biochem. Biotechnol. 32, 37 (1992). 26. Namdeo M., Bajpai S. K.: J. Mol. Catal. B: Enzym. 59, 134 (2009). 27. Rotková J., Šuláková,R., Korecká L., Zdražilová P., Jandová M., Lenfeld J., Horák D., Bílková Z.: J. Magn. Magn. Mater. 321, 1335 (2009) 28. Safarik I., Sabatkova Z., Safarikova M.: J. Magn. Magn. Mater. 321, 1478 (2009). 29. Safarik I., Sabatkova Z., Safarikova M.: J. Agric. Food Chem. 56, 7925 (2008). 30. Safarikova M., Maderová Z., Safarik I.: Food Res. Int. 42, 521 (2009). 31. Kriz K., Gehrke J., Kriz D.: Biosens. Bioelectron. 13, 817 (1998).

chitinu nebo chitosanu byl například použit při izolaci lysozymu z vaječného bílku42 nebo ze zažívacího traktu klíšťáka Ornithodoros moubata43, a rovněž při izolaci lektinu z brambor44. Magnetické alginátové mikročástice byly využity při čištění bakteriální a vepřové -amylasy13. 4.4. Ostatní imobilizované biologicky aktivní látky Na magnetické nosiče byla imobilizována řada dalších biologicky aktivních látek. Jako příklad je možno uvést imobilizaci derivátů porfyrinu, které byly použity při katalýze hydroxylace cyklohexanu45. Imobilizovaný norvankomycin umožnil selektivní separaci bakterií Staphylococcus aureus ze směsi s gramnegativními bakteriemi46. Magnetické nanočástice s imobilizovaným poly-Llysinem47 byly využity pro značení kmenových buněk. Imobilizovaný biotin je možno využít při selektivním navázání avidinu a jeho derivátů48. Zajímavé využití má imobilizovaná kyselina 3-aminofenylboritá, specificky reagující se sloučeninami obsahujícími vicinální hydroxyskupiny, která umožňuje separovat různé typy sacharidů a glykoproteinů49, včetně klinicky významného glykosylovaného hemoglobinu50. Z hlediska potenciálních lékařských aplikací je velice významná imobilizace různých druhů léčiv na magnetické nanočástice51.

5. Závěr Biologicky aktivní látky imobilizované na magnetických mikročásticích a nanočásticích, tvořených zejména oxidy železa, nacházejí uplatnění v mnoha oborech přírodních věd, při analytických aplikacích, v medicíně i v biotechnologiích. Zvláště významnou vlastností je jejich magnetické chování, které dovoluje jejich manipulaci vnějším magnetickým polem. Kombinace magnetických nosičů s biologicky aktivní látkou (například enzymem, protilátkou nebo oligonukleotidem) umožňuje získat účinný nástroj pro biochemický výzkum i v chemických a biotechnologických procesech. Autoři tímto děkují MŠMT za podporu v rámci výzkumného záměru č. MSM 6198959216, projektu Ministerstva průmyslu a obchodu č. 2A-1TP1/094, Operačnímu programu Věda a výzkum pro inovace - Evropský sociální fond (projekt CZ.1.05/2.1.00/03.0058 Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy České republiky) a Výzkumnému záměru ÚSBE AVČR, v.v.i. (AV0Z60870520). LITERATURA 1. Safarik I., Safarikova M.: Solid State Phenom. 151, 88 (2009). 2. Laurent S., Forge D., Port M., Roch A., Robic C., Elst L. V., Muller R. N.: Chem. Rev. 108, 2064 (2008). 3. Matsunaga T., Okamura Y., Tanaka T.: J. Mater. Chem. 14, 2099 (2004). 4. Massart R.: IEEE Trans. Magn. 17, 1247 (1981). 529

Chem. Listy 105, 524530 (2011)

Referát

32. Tang D. P., Yuan R., Chai Y. Q.: Biotechnol. Lett. 28, 559 (2006). 33. Putnam D. D., Namasivayam V., Burns M. A.: Biotechnol. Bioeng. 81, 650 (2003). 34. Akkaya B., Uzun L., Altintas E. B., Candan F., Denizli A.: J. Macromol. Sci., Part A: Pure Appl. Chem. 46, 232 (2009). 35. Filuszová M., Kučerová Z., Tichá M.: J. Sep. Sci. 32, 2017 (2009). 36. Halling P. J., Dunnill P.: Eur. J. Appl. Microbiol. 6, 195 (1979). 37. Uzun L., Denizli A.: J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 17, 791 (2006). 38. Cao Y., Tian W., Gao S. Y., Yu Y. S., Yang W. B., Bai G.: Artif. Cells, Blood Substitutes, Biotechnol. 35, 467 (2007). 39. Smith J. E., Medley C. D., Tang Z. W., Shangguan D., Lofton C., Tan W. H.: Anal. Chem. 79, 3075 (2007). 40. Dunnill P., Lilly M. D.: Biotechnol. Bioeng. 16, 987 (1974). 41. Horák D., Babič M., Jendelová P., Herynek V., Trchová M., Pientka Z., Pollert E., Hájek M., Syková E.: Bioconjugate Chem. 18, 635 (2007). 42. Šafařík I., Šafaříková M.: J. Biochem. Biophys Methods 27, 327 (1993). 43. Kopáček P., Vogt R., Jindrák L., Weise C., Šafařík I.: Insect Biochem. Mol. Biol. 29, 989 (1999). 44. Šafaříková M., Šafařík I.: Biotechnol. Lett. 22, 941 (2000). 45. Fu B., Zhao P., Yu H. C., Huang J. W., Liu J., Ji L. N.: Catal. Lett. 127, 411 (2009). 46. Ke S. J., Ji J.: Chem. J. Chin. Univ. - Chinese 28, 26 (2007). 47. Babič M., Horák D., Trchová M., Jendelová P., Glogarová K., Lesný P., Herynek V., Hájek M., Syková M.: Bioconjugate Chem. 19, 740 (2008). 48. Choi J., Lee J. I., Lee Y. B., Hong J. H., Kim I. S., Park Y. K., Hur N. H.: Chem. Phys. Lett. 428, 125 (2006). 49. Lee J. H., Kim Y. S., Ha M. Y., Lee E. K., Choo J. B.: J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 1456 (2005). 50. Müller-Schulte D., Brunner H.: J. Chromatogr., A 711, 53 (1995). 51. Namdeo M., Saxena S., Tankhiwale R., Bajpai M., Mohan Y. M., Bajpai S. K.: J. Nanosci. Nanotechnol. 8, 3247 (2008).

52. Šustrová B., Novotná L., Kučerová Z., Tichá M.: J. Mol. Catal. B: Enzym. 60, 22 (2009). 53. Chen J. P., Su D. R.: Biotechnol. Prog. 17, 369 (2001). 54. Konwarh R., Karak N., Rai S. K., Mukherjee A. K.: Nanotechnology 20, 10 (2009). 55. Korecká L., Bílková Z., Holcápek M., Královský J., Beneš M., Lenfeld J., Minc N., Cecal R., Viovy J. L., Przybylski M.: J. Chromatogr., B 808, 15 (2004). 56. Takahashi K., Ohwada K., Yoshimoto T., Saito Y., Kodera Y., Matsushima A., Inada Y.: J. Biotechnol. 8, 135 (1988). 57. Burns M. A., Kvesitadze G. I., Graves D. J.: Biotechnol. Bioeng. 27, 137 (1985) 58. Šafařík I., Ptáčková L., Koneracká M., Šafaříková M., Timko M., Kopčanský P.: Biotechnol. Lett. 24, 355 (2002). 59. Lin S., Yao G. P., Qi D. W., Li Y., Deng C. H., Yang P. Y., Zhang X. M.: Anal. Chem. 80, 3655 (2008). 60. Yoshimoto T., Ohwada K., Takahashi K., Matsushima A., Saito Y., Inada Y.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 152, 739 (1988).

M. Pečová a, L. Zajoncová a, K. Polákováb, J. Čudab, M. Šafaříkovác, M. Šebelaa, and I. Šafaříkb,c (a Department of Biochemistry, Faculty of Science, Palacký University, Olomouc, b Regional Centre of Advanced Technologies and Materials, Faculty of Science, Palacký University, Olomouc, c Department of Nanobiotechnology, Institute of Systems Biology and Ecology, Academy of Sciences of the Czech Republic, České Budějovice): Biologically Active Compounds Immobilized on Magnetic Carriers and Their Utilization in Biochemistry and Biotechnology Magnetic microparticles and nanoparticles, composed mainly of iron oxides (magnetite, Fe3O4 and maghemite, -Fe2O3), can be utilized in various biochemical and biotechnological applications. The particles can be easily manipulated by an external magnetic field. They are frequently used as magnetically responsive insoluble supports for immobilization of biologically active compounds, such as enzymes, antibodies, streptavidin and oligonucleotides. Examples of their applications are presented.

530

PUBLIKACE 3 (přijatý manuskript); (Příloha 3) Thermostable

Trypsin

Conjugates

Immobilized

to

Biogenic

Magnetite Show a High Operational Stability and Remarkable Reusability for Protein Digestion Michaela Pečová, Marek Šebela, Zdenka Marková, Kateřina Poláková, Jan Čuda, Klára Šafářová and Radek Zbořil Nanotechnology, (2013) in press

Thermostable Trypsin Conjugates Immobilized to Biogenic Magnetite Show a High Operational Stability and Remarkable Reusability for Protein Digestion M. Pečová1, M Šebela1,3, Z Marková2, K Poláková2, J Čuda2, K Šafářová2 and R Zbořil2,3 1

Department of Protein Biochemistry and Proteomics, Centre of the Region Haná for Biotechnological and Agricultural Research, Faculty of Science, Palacký University, Šlechtitelů 11, 783 71 Olomouc, Czech Republic 2 Regional Centre of Advanced Technologies and Materials, Departments of Physical Chemistry and Experimental Physics, Faculty of Science, Palacký University, Šlechtitelů 11, 783 71 Olomouc, Czech Republic 3 Authors to whom any correspondence should be addressed: M. Šebela: e-mail: [email protected], tel.: +420585634927, fax: +420585634933, and R Zboril: email: [email protected], tel.: +420585634947, fax: +420585634761.

Abstract. In this work, magnetosomes produced by microorganisms were chosen as a suitable magnetic carrier for covalent immobilization of thermostable trypsin conjugates with an expected applicability for efficient and rapid digestion of proteins at elevated temperatures. At first, a biogenic magnetite was isolated from Magnetospirillum gryphiswaldense and its free surface was coated with the natural polysaccharide chitosan containing free amino and hydroxy groups. Prior to covalent immobilization, bovine trypsin was modified by conjugating with α-, β- and γcyclodextrin. Modified trypsin was bound to the magnetic carriers via amino groups using 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide and Nhydroxysulfosuccinimide as coupling reagents. Magnetic biomaterial was characterized by magnetometric analysis and electron microscopy. With regards to their biochemical properties, the immobilized trypsin conjugates showed an increased resistance to elevated temperatures, eliminated autolysis, unchanged pH optimum and a significant storage stability and reusability. Considering these parameters, the presented enzymatic system exhibits properties that are superior to those of trypsin forms obtained by other frequently used approaches. The proteolytic performance was demonstrated during in-solution digestion of model proteins (horseradish peroxidase, bovine serum albumin and hen egg white lysozyme) followed by mass spectrometry. It is shown that both magnetic immobilization and chemical modification enhance the trypsin characteristics making it a promising tool for protein digestion.

Keywords: biogenic magnetite, chitosan, immobilization, MALDI-TOF, proteomics, stability, trypsin PACS numbers: 75.75.-c, 87.14.E-, 87.18.Xr, 87.85.mk, 91.25.fa Running heads: Thermostable Trypsin Conjugates Immobilized to Biogenic Magnetite

1

Submitted to: NANOTECHNOLOGY

1. Introduction Iron oxides nanoparticles, especially of magnetite (Fe 3 O 4 ) or maghemite (γ-Fe 2 O 3 ) nature, and magnetic ferrofluids are widely studied for potential applications in science, medicine and technology [1,2]. When suitably surface-modified, iron-containing nanoparticles may find various applications as carriers for the immobilization of biomolecules as well as mediators in therapy and diagnostics [3–7]. For such purposes, they are usually coated with appropriate polymeric substances such as polysaccharides that make them biocompatible, biodegradable, stable and non-toxic. The surface shell prevents magnetic particles from agglomeration and provides reactive chemical groups for binding biological substances or drugs [8–10]. Chitosan, i.e. poly[β-(1-4)-linked-2-amino-2-deoxy-D-glucose], has become a very attractive coating substance for nanoparticles. It represents a deacetylated product of the natural polymer chitin with better solubility and reactivity. Chitosan has a pK a value of 6.3. Thus, in low pH solutions, most of the amino groups are protonated making chitosan behaving as a water-soluble polyelectrolyte. Once the pH is higher than pK a , the amino groups are deprotonated and chitosan becomes insoluble [11,12, 13]. Magnetic iron oxide nanoparticles are commonly obtained either using synthetic methods or from biological sources. Magnetotactic bacteria produce (by biomineralization) membrane-enveloped crystals of magnetite called magnetosomes. As an example, Magnetospirillum gryphiswaldense can be cultured in the laboratory for the extraction of magnetite crystals with interesting physicochemical properties that make them unique for the application as an excellent solid-phase magnetic carrier (they show well defined structure, morphology and narrow size distribution ranging from 20 to 50 nm) [14, 15] After isolation, the resulting bMNPs have a single magnetic domain of magnetite exhibiting a strong ferrimagnetism, chemical purity and high surface area [15,16]. For that reason, they are well suited for immobilization, separation and delivery techniques [17]. Trypsin (EC 3.4.21.4) is a pancreatic serine endopeptidase, which canonically cleaves peptide bonds at the C-termini of basic arginine and lysine residues [18]. The enzyme has a well-defined specifity and yields peptides of an appropriate size for efficient mass spectrometry analysis. On the other hand, trypsin shows only limited thermostability and undergoes rapid autolysis at moderate basic conditions (pH optimum). These major drawbacks can be suppressed to some extent using chemical modification with oligosaccharides [19]. It is also possible to immobilize trypsin using different approaches such as adsorption [20,21], covalent binding [3,22,23] and gel entrapment using synthetic polymers (acrylamide, polyurethan), proteins (collagen, egg white) or polysaccharides (cellulose, alginates, hyaluronate) [24,25]. Here we describe the isolation of biogenic magnetite from Magnetospirillum gryphiswaldense strain MSR-1, which was subsequently coated with chitosan for trypsin immobilization. Prior to the attachment, trypsin was modified by α-, β- and γ-cyclodextrins activated using periodate oxidation. The novelty of this study resides in the principle of covalent immobilization of a trypsin conjugate with oligosaccharides to biogenic magnetic nanoparticles, which combines a remarkable thermostability of the conjugate with unique physicochemical properties of the magnetic material. To our knowledge, such a system has not yet been reported. This novel and unique enzymatic system with magnetic properties was applied for in-solution digestion of protein samples evaluated by peptide mass fingerprinting. After the chemical modification and covalent immobilization, trypsin bound on the magnetite nanoparticles displayed improved properties like eliminated autolysis, increased resistance to elevated temperatures, unchanged pH optimum and a significant storage stability and reusability. For protein digestion, the immobilized enzyme is applicable in higher concentrations and a reaction time of ≤1 h. Size, morphology and surface shell thickness of the biogenic magnetite prior to and after attaching trypsin were measured using both transmission and scanning electron microscopy. Magnetic behavior of the unmodified and functionalized nanoparticles was analyzed by magnetic measurements. It is shown that both magnetic immobilization and chemical modification enhance the trypsin characteristics making it a promising tool for protein digestion.

2

2. Experimental details 2.1. Chemicals and biological material Bovine trypsin (BT) was from MP Biomedicals (Aurora, OH, USA). Ammonium bicarbonate, benzamidine hydrochloride, Nα-benzoyl-DL-arginine-4-nitroanilide (BAPNA), cyclodextrins, dimethylsulfoxide, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminepropyl) carbodiimide (EDC) hydrochloride, Nhydroxysulfosiccinimide sodium salt (sulfo-NHS), sodium cyanoborohydride, sodium periodate and chitosan LMW (Cat. No. 448869, low molecular weight, 75-85% deacetyladed) were purchased from Sigma-Aldrich Chemie (Steinheim, Germany). α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid was from Bruker Daltonik (Bremen, Germany). Chemicals for electrophoresis were from Bio-Rad (Hercules, CA, USA). The bacterium Magnetospirillum gryphiswaldense, strain MSR-1 (DSM 6361), was purchased from the German Collection of Micoorganisms and Cell Cultures (Brunswick, Germany). All other substances were of analytical purity grade. 2.2. Isolation of biogenic magnetite from bacteria Biogenic magnetite was obtained by the isolation of magnetosomes from Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1 and removal of its natural phospholipidic membrane. Cultivation proceeded under microaerobic conditions as described previously [14] in a 10-L oxystat laboratory fermentor (R’Alf Plus System, Bioengineering AG, Switzerland). Magnetosomes were extracted by a modified protocol of Grunberg et al. [26]. The removal of the magnetosomal membrane and associated organic debris from the magnetic cores was achieved using sodium dodecylsulfate (SDS). Magnetosomes (a suspension of 1 mg.mL-1 in water) were collected by a magnet, resuspended in the same volume of 1% (w/v) SDS and incubated at 98°C for 30 min. As a result, magnetic nanoparticles (MNPs) aggregated at the bottom of the vessel. The supernatant was replaced by a fresh 1% (w/v) SDS and the resulting suspension sonicated for 15 min and incubated at 98°C for an additional time of 30 min. The solid material was again magnetically collected and five times washed with deionised water under a sonication for 15 min. The biogenic MNPs were finally resuspended in deionized water. 2.3. Coating of biogenic magnetite with chitosan The biogenic magnetite was surface-coated following an adopted protocol proposed by Belessi et al. [27]. Biogenic MNPs were magnetically collected from 20 mL of their suspension in water and resuspended in 19 mL of 1% (v/v) acetic acid. Then, 1 mL of 1% (w/v) solution of chitosan LMW in 1% (v/v) acetic acid was added and the suspension was sonicated for 15 min. It was then subjected to shaking (300 rpm) at room temperature for 1 h (Minishaker MS3, IKA) to achieve adsorption of the polymer at the surface of MNPs. Finally, the suspension was slowly dripped to 1 M NaOH under stirring. The coated MNPs were magnetically separated and resuspended in 20 mL of deionized water. The chemical structure of the same magnetite-chitosan system was studied by FT-IR spectroscopy where electrostatic interactions of bacterial MNPs and chitosan via its hydroxyl and/or amino groups were confirmed. [28]. 2.4. Experimental techniques employed for characterization of magnetic nanoparticles The size and morphology of the biogenic magnetite prior to and after functionalization by chitosan and trypsin were determined by transmission electron microscopy (TEM). The microscope used was a JEM-2010 (JEOL Ltd., Tokyo, Japan) model operated at 200 kV with a point-to point resolution of 1.9 Å. Before measurements, the samples were dispersed in water. Then, a drop of the suspension was placed on a carbon-coated grid and dried by evaporation at 85°C. Scanning electron microscopy (SEM) was measured on a Hitachi SU-6600 microscope (Hitachi High-Technologies Corporation, Tokyo, Japan) with an image resolution of 1.2 nm and an accelerating voltage of 30 kV. The magnetic properties of the nanosystem were measured using a superconducting quantum interference device (SQUID) magnetometer, model MPMS XL-7 (Quantum Design, U.S.A). Hysteresis loops were recorded at a temperature of 5 and 300 K in external magnetic fields ranging from – 7 to + 7 T. 2.5. Chemical modification of trypsin by cyclodextrins

3

Bovine trypsin conjugates with periodate-oxidized α-, β- and γ-cyclodextrins (ACD-BT, BCD-BT and GCD-BT, respectively) were prepared following a previous protocol for α-amylase [29]. Both the conjugating reaction and subsequent cyanoborohydride reduction (figure 1a) proceeded in 0.25 M potassium phosphate buffer, pH 7.8, containing 10 mM benzamidine (a trypsin activity inhibitor). The conjugates were finally dialyzed against 0.1% (v/v) formic acid, concentrated by ultrafiltration through a 10-kDa cut-off filter, lyophilized and stored at -80°C [19].

Figure 1. The scheme shows the reaction of trypsin with polyaldehydes derived from cyclodextrins by periodate oxidation in the first step. (a) By a reductive amination in the presence of sodium cyanoborohydride, the oxidized oligosaccharide moieties are bound covalently to trypsin via its primary amino groups. (b) The resulting trypsin conjugate is attached to primary amino groups in chitosan-coated magnetite nanoparticles via its carboxylate residues using the carbodiimide reaction with EDC and sulfo-NHS as coupling agents.

4

2.6. Protein electrophoresis SDS-PAGE was performed using 4% stacking and 12% running polyacrylamide gels according to a standard procedure [30]. The separated proteins were visualized by staining with Coomassie Brilliant Blue R-250, molecular mass markers ranged from 14.4 to 97.0 kDa. 2.7. Immobilization of trypsin on the chitosan magnetic nanoparticles BT and its conjugates were immobilized on the chitosan-coated biogenic MNPs using EDC and sulfoNHS as coupling agents (figure 1b). EDC hydrochloride (2.5 mg) and sulfo-NHS (3 mg) were dissolved in 1.5 mL of 0.05 M phosphate buffer, pH 7.0. Then 10 mg of the MNPs coated with chitosan were added followed by 2.5 mg of trypsin. The resulting mixture was gently shaken at 4°C for 12 h. After immobilization, the nanoparticles were collected by a magnetic separator (NdFeB) and washed five times with the coupling buffer. Finally, the immobilized trypsin was resuspended in 0.1% formic acid and stored at 4°C. Protein concentration was assayed using Bradford’s method [31]. 2.8. Trypsin assays Trypsin activity was assayed spectrophotometrically using an artificial chromogenic substrate Nαbenzoyl-DL-arginine-4-nitroanilide (BAPNA) [19]. In the case of the immobilized enzyme, an aliquot (20 µL) of the suspension in diluted formic acid was used as a sample. The reaction was carried out at 37°C for 5 min. In 1-min cycles, trypsin immobilized on the MNPs was collected magnetically at the bottom of the cuvette and the absorbance at 405 nm of the reaction mixture was read. Thermostability was evaluated by activity assays after incubating enzyme aliquots in 20 mM sodium acetate buffer, pH 5.25, at temperatures from 20 to 75°C for 30 min followed by rapid cooling in water-ice bath. To determine pH optimum, the activity of free and immobilized trypsin was assayed in the pH range of 4.5 to 10.4 (Britton-Robinson buffers). For testing storage stability, both trypsin forms were kept in 0.1 % formic acid at 4°C. Then residual activity was determined once a week. For checking stability in the assay buffer (0.15 M Tris-HCl, pH 8.5), free and immobilized trypsin were incubated at 23°C for different times (0.5; 1; 1.5; 2; 4; 6 and 24 h). Then residual activity was determined. The immobilized trypsin was also tested for the possibility of repeated use. After each activity measurement, it was separated using magnet (NdFeB) and washed three times with 0.05 M phosphate buffer, pH 7.0. The measurement was performed in eight cycles. 2.9. Protein digestion using trypsin immobilized on the biogenic magnetite At first, trypsin immobilized on the MNPs (10 mg) was suspended in 4 mL of 0.05 M NH 4 HCO 3 . Individual standard proteins were dissolved in 1 mL of the same buffer: LYS (1.4 mg.mL-1), HRP (4 mg.mL-1) a BSA (6.6 mg.mL-1). In-solution digestion of protein samples was performed using a common protocol. For reduction of disulfides, 20 µL of 100 mM 2-mercaptoethanol was pipetted and the protein solution was kept at 70°C for 10 min. Then, after cooling down, 20 µL of 200 mM iodoacetamide was added for alkylation. The mixture was incubated in the dark at an ambient temperature for 30 min. Then 30 µL of 2-mercaptoethanol was added for scavenging the unreacted iodoacetamide followed by a 10-min incubation. Later on, an aliquot (100 μL) of the working suspension of immobilized trypsin (∼100 pmol of the enzyme) was added to 1 mL of 0.05 M NH 4 HCO 3 containing the standard protein (1000 pmol). The reaction mixture was incubated in water bath at 50°C for 1-2 h. After digestion, the immobilized trypsin was separated by external permanent magnet and the obtained supernatant was transferred to another tube. The digests were finally analyzed by MALDI-TOF MS. 2.10. MALDI-TOF MS Both peptide mass fingerprinting and intact protein mass determination were performed on a Microflex MALDI-TOF LRF20 mass spectrometer (Bruker Daltonik) essentially as described previously [32]. Intact BT and its conjugates in 0.1% formic acid were used at a concentration of 10 mg.mL-1.

5

3. Results and discussion 3.1. Chemical modification of trypsin by cyclodextrins Prior to immobilization experiments, bovine trypsin was modified by conjugating amino groups with polyaldehyde chains derived from α-, β- and γ-cyclodextrin via periodate oxidation. The molecular mass of BT and its conjugates was estimated by SDS-PAGE [30] (figure 2) and more accurately determined by MALDI-TOF MS. Considering the total number of lysine residues in its sequence plus the N terminus, BT comprises 15 primary amino groups [19]. As a result of the conjugation, the molecular mass of unmodified BT (23.2 kDa) was increased to final values of 29.9, 30.1 and 31.1 kDa for ACD-BT, BCD-BT and GCD-BT, respectively. Calculations of mass differences revealed that the conjugates contained from 6 to 7 sites of glycation.

Figure 2. SDS-PAGE of BT and its conjugates with α-, β- and γ-cyclodextrin. From the left: protein marker (↓ 97, 66, 45, 30, 20.1 and 14.4 kDa), I – BT (10 µg), II – ACD-BT (3 µg), III – BCD-BT (3 µg), IV – GCD-BT (3 µg), V – BT (15 µg), VI – ACD-BT (5 µg), VII – BCD-BT (5 µg), VIII – GCDBT (5 µg). The BT sample appears heterogeneous because of the presence of autolytic fragments.

3.2. Characterization of magnetic nanoparticles The bacterial strain M. gryphiswaldense MSR-1 is able to produce magnetite nanocrystals with sizes of around 45 nm and covered by a phospholipidic membrane [33] as demonstrated by TEM (see figure 3a). Both size and morphological properties of all MNP variants with or without the phospholipidic membrane coated by chitosan only or with immobilized trypsin were characterized by TEM. The efficiency of the membrane removal was checked by TEM imaging (see figure 3b). While the native bacterial MNPs are surrounded by an organic layer and arranged predominantly in a chain-like structure (see figure 3a), no organic layer was determined for bare MNPs while their aggregation was observed (see figure 3b). Synthesis of the magnetite-chitosan composite was performed by a modified crosslinking method [27,34]. Chitosan-conjugated MNPs were obtained by the neutralization of an acidified suspension of magnetite and chitosan, which induced a precipitation of the polysaccharide at the surface of magnetite nanoparticles. TEM images confirmed the presence of a surface chitosan layer (see figure 3c). The identical structure of such magnetite@chitosan hybrid was studied before by FTIR spectroscopy where electrostatic interactions of bacterial MNPs and chitosan via its OH and/or NH groups were confirmed [28]. After attachment of modified trypsin, the functionalized MNPs displayed a thicker organic surface layer than those covered only by chitosan (see figure 3d). Trypsin binding was also confirmed using other methods (magnetization measurements, activity assay). The surface

6

morphology of MNPs with and without the biopolymer chitosan was further evaluated using SEM (see figure 4).

Figure 3. TEM images of (a) biogenic magnetite isolated from Magnetospirullium gryphiswaldense MSR-1 with their phospholipidic membrane; (b) biogenic magnetite after removal of the phospholipidic membrane; (c) biogenic MNPs modified with chitosan; (d) biogenic MNPs coated with chitosan and carrying modified trypsin. The black arrow shows the surface layer containing immobilized trypsin.

Figure 4. SEM image of magnetic nanoparticles isolated from Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1 after their coating with biopolymer chitosan.

7

Results of magnetometric studies performed on the functionalized biogenic magnetite coated either by chitosan or a chitosan shell with the immobilized trypsin (ACD-BT, BCD-BT and GCD-BT) are shown in figure 5. Parameters of the respective hysteresis loops measured at 5 and 300 K are summarized in table 1. When measuring a system of MNPs carrying immobilized trypsin, a decrease in saturation magnetization (M S ) was observed in comparison with magnetite modified only by chitosan (Fe 3 O 4 -chitosan, table 1). This could be considered as an indirect proof of trypsin binding to the chitosan shell of the magnetic carrier. Interestingly, the M S value for Fe 3 O 4 -chitosan-ACD-BT was reduced more than that for Fe 3 O 4 -chitosan-BCD-BT but was increased more than Fe 3 O 4 chitosan-GCD-BT. This may reflect the difference in molecular mass and/or better magnetic shielding of ACD-BT over BCD-BT. The Fe 3 O 4 -chitosan-GCD-BT magnetic system showed the highest decrease in the value of saturation magnetization in comparison with Fe 3 O 4 -chitosan. The studied systems showed superparamagnetic behavior at 300 K and blocking state at 5 K in the time-measuring window of SQUID magnetometer. Magro et al. [35] recently immobilized glucose oxidase to rhodamine-maghemite nanoparticles. The resulting system showed a decreased saturation magnetization in comparison with bare maghemite nanoparticles. The same effect was commonly observed after immobilization of other enzymes [36,37].

Table 1. Parameters of the hysteresis loops of Fe 3 O 4 -chitosan, Fe 3 O 4 -chitosan-ACD-BT, Fe 3 O 4 chitosan-BCD-BT and Fe 3 O 4 -chitosan-GCD-BT at 5 and 300 K.a M S+ (+7 T) is the saturation magnetization at + 7 T, M S– (-7 T) is the saturation magnetization at -7 T, H C+ is the positive coercivity field, H C– is the negative coercivity field, M R+ is the positive remanent magnetization and M R– is the negative remanent magnetization. M S+ (+7 T) M S- (-7 T) H C+ H CM R+ M R± 0.01 ± 0.01 ± 20 ± 20 ± 0.01 ± 0.01 (K) (emu/g) (emu/g) (Oe) (Oe) (emu/g) (emu/g) 5 80.84 -80.77 206 -207 18.45 -18.48 Fe 3 O 4 -chitosan 300 73.58 -73.18 8 -9 1.49 -1.44 Fe 3 O 4 -chitosan- 5 53.45 -53.40 190 -191 16.13 -16.12 ACD-BT 300 48.92 -48.75 11 -12 1.97 -1.87 Fe 3 O 4 -chitosan- 5 75.43 -75.43 179 -180 16.59 -16.56 BCD-BT 300 67.99 -68.01 7 -7 0.97 -1.02 Fe 3 O 4 -chitosan- 5 31.39 -31.40 214 -215 10.08 -10.09 GCD-BT 300 28.60 -28.60 -9 16 1.92 -1.78 a M S+ (+7 T) – saturation magnetization at + 7 T, M S– (-7 T) – saturation magnetization at – 7 T, H C+ – positive coercivity field, H C– – negative coercivity field, M R+ – positive remanent magnetization, M R – negative remanent magnetization. T

Sample

3.3. Activity assays with soluble and immobilized trypsin Thermostability of free and immobilized trypsin was compared by assaying activity towards the artificial substrate BAPNA, which was performed after a 30-min incubation at selected temperatures from the range of 20-75°C. During incubation, the enzymes were kept in 20 mM sodium acetate buffer, pH = 5.25, to prevent analysis. Thermal stability of enzymes represents an important criterion to be considered for evaluation of their applicability. Generally, chemically stabilized and immobilized enzymes have better resistance to higher temperatures than their soluble counterparts [38]. We determined a T 50 constant, which is defined here as a temperature at which 50% of trypsin activity is retained upon 30-min incubation. The value of T 50 for soluble BT was 41°C, which increased to 44°C after immobilization. All soluble trypsin conjugates (ACD-BT, BCD-BT, GCD-BT) showed higher T 50 values (60-70°C) than unmodified BT (table 2) as illustrated in figure 6, which has already been described [19]. In accordance with expectations, the thermostability of the conjugates was further increased up to 67°C (T 50 estimates) after their immobilization to biogenic MNPs (table 2). The thermostability curves for the immobilized trypsin conjugates are rather hyperbolic not sigmoid. When

8

there is a sigmoid curve, the measured protein existed initially as a compact, well-folded structure and it is subjected to a cooperative unfolding reaction at higher temperatures. The non-cooperative melting reaction observed for the immobilized conjugates (which is to some extent observable also for the free conjugates in solution, where the sigmoid shape of the curve is less pronounced than that of the unmodified trypsin) indicates that the protein existed initially as a very flexible, partially unfolded structure or as a heterogeneous population of folded structures [39]. In this case, we suspect the latter is true. It has been shown by intact protein MALDI-TOF MS that the the trypsin conjugates with oligosaccharides are heterogenous by the nature of the glycation reaction (reductive amination) with a statistical distribution of molecular masses reflecting the number of modified amino groups [19]. The observed enhancement in thermostability (see figure 6) was found promising for the use of the functionalized MNPs in a rapid and effective proteolysis at high temperatures. Previous reports describing trypsin modification have usually demonstrated increased thermostability of the modified enzyme [38,40], which is further improved by its immobilization [3].

Figure 5. (a) Comparison of hysteresis loops measured at 5 K for magnetic system: (1) Fe 3 O 4 chitosan, (2) Fe 3 O 4 -chitosan-BCD-BT, (3) Fe 3 O 4 -chitosan-ACD-BT and (4) Fe 3 O 4 -chitosan-GCDBT. (b) Comparison of hysteresis loops measured at 300 K for magnetic system: (1) Fe 3 O 4 -chitosan, (2) Fe 3 O 4 -chitosan-BCD-BT, (3) Fe 3 O 4 -chitosan-ACD-BT and (4) Fe 3 O 4 -chitosan-GCD-BT. Table 2. Comparison of the values of T 50 , t 50 , pH optimum and storage stability for free and immobilized trypsin. Trypsin form

T 50 (°C)

pH optimum

t 50 (h)

BT*

41

8.5

0.5

Residual activity after 6-week storage (%) 48.0

ACD-BT*

54

8.5

21

59.0

BCD-BT*

56

8.0

57.5

GCD-BT*

59

9.0

> 24 24

BT**

44

8.0

4

80.0

ACD-BT**

60

8.5

> 24

87.5

BCD-BT**

66

8.5

> 24

88.5

GCD-BT**

66

9.0

> 24

90.0

* Free trypsin, ** Immobilized trypsin.

9

59.0

The effect of pH on the activity of free and immobilized trypsin was investigated in buffers covering the pH range of 4.5-10.4. Covalent immobilizations may alter pH optima of enzymes [41]. However, in this study, there was no significant change observed. In general, the determined pH optimum values of the immobilized enzymes were found the same or shifted by 0.5 pH unit; Table 2. Neither chemical modification of trypsin by glycation at surface lysine residues nor the subsequent immobilization of the conjugates to chitosan-covered MNPs influenced significantly the pH optimum. This is a big advantage as it may happen that the pH optimum is significantly altered upon immobilization, for example in the case of glucose oxidase immobilized to ultrafiltration membranes [42]. As it has been shown in the original work describing trypsin glycation by activated oligosaccharides [19], this modification brings about a large change not only in the molecular mass but also in the isoelectric point of the enzyme, which is decreased from a basic value (10.5) to slightly acidic or neutral values of 6-7. Conversely, substrate binding at the active is not affected: the K m value for the artificial substrate BAPNA remains unchanged upon the modification [19]. This is consistent with the little change in the pH optimum, which has been observed in this study. Presumably, alterations in the charge distribution arising from the modification concern only the surface of trypsin molecule. a) 100

BT ACD-BT

90

Residual activity (%)

BCD-BT

80

GCD-BT

70 60 50 40 30 20 10 0 20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

Temperature (°C)

b) 100

BT ACD-BT

90


BCD-BT

80

GCD-BT

70 60 50 40 30 20 10 0 20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

Temperature (°C)

Figure 6. Thermal stability of (a) free and (b) immobilized trypsin. Trypsin aliquots were incubated in sodium acetate buffer (20 mM, pH 5.25) on a water bath at temperatures from the range of 20 – 75°C for 30 min. Then the residual activity was assayed; symbol explanation is provided in the inset. The corresponding T 50 values are summarized in table 2. Microsoft Excel 2007 was used for data processing and polynomial functions (with the degree values of 3 to 5 depending on the particular case) were introduced to show trend lines. Intersection points of the trend lines with a horizontal line denoting 50% residual activity were drawn to get T 50 estimates (see dashed representation).

10

Both free and immobilized trypsin was stored in 0.1% v/v formic acid at 4°C. After a 6-week-long storage under these conditions, free BT retained 48%, whereas ACD-BT, BCD-BT and GCD-BT kept almost 60 % of the original activity; table 2. After covalent immobilization of trypsin and its conjugates, their storage stability was improved. The immobilized BT kept 80 % of activity. For ACDBT, BCD-BT and GCD-BT, residual activity values of around 90 % were found (table 2). In accordance with previous findings [20,43], both acidic conditions and low temperature guarantee higher stability of trypsin during its storage. Chemical modification and immobilization then provide an additional positive effect [44]. High storage stability has been reported for trypsin immobilized via simple adsorption [20]. Similar positive results with respect to storage stability have been found for other immobilized enzymes (lipase, glucose oxidase) and magnetic nanoparticles as a carrier [45,46]. Trypsin undergoes autolysis under basic pH, which is accompanied by the loss of its activity [19,38]. Stability against autolysis was studied by incubating the enzyme in the assay buffer for a time period of 24 h. In defined time intervals within this time period, the hydrolytic activity of free and immobilized trypsin was determined. Free BT was inactive already after 4 h of incubation. In contrast, the immobilized enzyme retained 50 % of its original activity after 4 h of incubation at ambient temperature. The studied trypsin conjugates were more stable than BT itself. After 24 h of incubation, they retained about 45 % (ACD-BT), 52 % (BCD-BT) and 50 % (GCD-BT) of the original activity. After immobilization, these values were increased. The immobilized conjugates retained on average 75 % of its residual activity. All trypsin forms were evaluated by determining their t 50 constant (table 2), which is defined here as a time of incubation at a basic pH after which 50% of the original activity is retained. The most important advantage of enzyme immobilization from the point of view of a potential application is the resulting possibility of repeatable use [47]. The residual activity of immobilized BT and its conjugates with oxidized cyclodextrins after repeated reactions with BAPNA in the assay buffer is illustrated in figure 7. After 8 cycles, the immobilized BT, ACD-BT, BCD-BT and GCD-BT retained 71%, 74%, 77% and 73% of the original activity, respectively. In this way, the reusability was confirmed. Maciel et al. [9] immobilized trypsin on magnetic levan particles, and the enzyme lost about 10 % of its original activity after ten cyclic reactions. In another study, immobilized trypsin retained only 43% of its activity after seven cycles [48].

BT

100

ACD-BT


95

BCD-BT GCD-BT

90 85 80 75 70 65 60 1

2

3

4

5

6

7

8

9

Number of cycles

Figure 7. Reusability of the immobilized trypsin measured during repeated hydrolysis of BAPNA. The residual activity was assayed after each cycle; symbol explanation is provided in the inset.

11

3.4. Digestion of protein samples with the immobilized trypsin Trypsin is frequently used in proteomic research as the first-choice protease. However, this application is limited by its low thermostability and rapid autolysis under typical digestion conditions (pH 8.0, 37°C) [19]. The presence of autolytic peptides can be useful for internal calibration [49]. On the other hand, the autolyzate may decrease quality of results with low-concentrated protein digests and obscure protein identification by database search. It is shown here that this drawback can be reduced or totally eliminated by a chemical modification and/or immobilization to the biogenic magnetite. Parallel increases in thermostability and resistance against autolysis were previously achieved by chemical modification of BT with periodate-oxidized cyclodextrins [19]. Such conjugates were in the present study attached covalently to chitosan-modified MNPs using EDC hydrochloride and sulfo-NHS as coupling agents. Then three model proteins were chosen covering a typical mass range of protein separation in 12% polyacrylamide gels, which is commonly used in SDS-PAGE: lysozyme (LYS), horseradish peroxidase (HRP) and bovine serum albumin (BSA); the corresponding molecular masses are 14, 40 and 67 kDa, respectively. All model proteins were digested at 50°C for 1 h (HRP, a glycoprotein, also additionally for 2 h) to test the performance and effectiveness of the immobilized BT conjugates. After digestion, the immobilized enzyme was magnetically separated from the reaction mixture. The resulting tryptic digests were analyzed by MALDI-TOF MS (an illustrative spectrum is shown in figure 8). As there were many peptide fragments generated by digestion, the model proteins were identified unambiguously. The sequence coverage values of 86.8, 45.1 and 32.0 % were obtained for LYS, HRP and BSA, respectively, using the immobilized BCD-BT. The probability-based score values in protein database search using the program Mascot were 228 (LYS), 141 (BSA) and 116 (HRP). All data were comparable with results of a common overnight digestion. Interestingly but not unexpectedly, the two major peaks of BT autolytic peptides (m/z 2163.06 and 2273.18) were not observed at all. A previous study describes covalent immobilization of native trypsin to carboxyl- and amine-functionalized magnetic microspheres using EDC, NHS and glutaraldehyde as coupling reagents [50]. The immobilized enzyme was applied for fast and efficient proteolysis. Digestion of BSA was performed for one minute at ambient temperature. When compared with a conventional digestion protocol (incubation at 37°C for 12 h), the improved digestion resulted in a higher number of peptides providing higher sequence coverage values for protein identification. Similarly, trypsin immobilized onto magnetic carbonaceous microspheres allowed obtaining a protein digestion efficacy comparable to that using the traditional overnight method [51].

Figure 8. MALDI-TOF peptide mass fingerprinting of lysozyme from egg hen white. A lysozyme sample was subjected to in-solution digestion by the immobilized BCD-BT at 50°C for 1 h. The measurement was performed in the reflectron mode for positive ions using CHCA as a matrix with the following database search outputs: sequence coverage = 86.8 %; probability-based score = 228.

12

4. Conclusions In this work, magnetite nanoparticles were isolated from the magnetotactic bacteria Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1. The natural phospholipidic membrane was removed by SDS and the surface of the biogenic magnetite was covered with natural biopolymer chitosan. The obtained magnetite nanoparticles showed a unique magnetic responsivity, cubooctahedral shape and almost uniform size of 30-50 nm thus becoming suitable for immobilization of trypsin using EDC and sulfo-NHS as coupling reagents. Native BT is characterized by drawbacks emerging from its autolysis. For that reason, it was modified by conjugating with cyclodextrins prior to a covalent immobilization to chitosan-coated magnetic nanoparticles. The immobilized trypsin conjugates exhibited largely improved thermostability and storage stability when compared with the soluble enzyme. After immobilization, the optimal pH value was not altered, which is advantageous for keeping traditional in-solution digestion protocols. The described enzymatic system has proven itself applicable for a fast and efficient protein digestion with economic reusability. Considering these parameters, the presented enzymatic system exhibits properties that are superior to those of trypsin forms obtained by other frequently used approaches (table 3). When used, the immobilized trypsin is separated magnetically during a few seconds and the acquired digests are free of autolytic peptides, which reduces autolysisrelated background in mass spectrometry of peptides for protein identification. All the improvements in performance make the described trypsin nanoparticles a promising tool for protein digestion. Table 3. Comparison of present results with data from previous studies Enzyme

Residual activity (6 weeks of storage at acidic pH); in % 48

Residual activity after repeated use (8 cycles); in % -

Typical digestion conditions: temperature (°C)/time 37/16 h

Immobilized conjugate (BCD-BT)a Immobilized trypsin 1a

88.5

77

50/1 h

80

71

37/12 h

Immobilized trypsin 2b

70

ND

25/2 h

Immobilized trypsin 3c

ND

50

ND

Immobilized trypsin 4d

ND

70

37/5 min

Immobilized trypsin 5e

79*

61**

ND

Immobilized trypsin 6f

81***

87**

ND

Immobilized trypsin 7g

50****

ND

ND

Immobilized trypsin 8h

80; 78*****

61; 74******

37/15 min

Free trypsina

a

This work Nanofibrous polymer grafted magnetic poly (GMA-MMA)-g-MAA beads [20] c Magnetite particles [9] d Detonation nanodiamond [52] e Beads of cross-linking chitosan-coated silica gel (activated with glutaraldehyde) [53] f Carboxylate-functionalized cation exchanger prepared from nanocellulose [54] g Crosslinked thermosensitive carriers (type TH8) [55] h Carboxymethyl chitosan nanoparticles treated with Cu (II) and Zn (II) ions [56] * after 30 days in 50 mM Tris-HCl, pH 8.5 ** after 4 cycles only *** after 3 weeks in 50 mM phosphate buffer, pH 7.5 **** after 30 days in 1mM HCl b

13

***** after 1 week, storage condition not shown ****** after 6 cycles only ND stands for „no data available“ Acknowledgements This work was supported by OP RD&I grant no. ED0007/01/01 (Centre of the Region Haná for Biotechnological and Agricultural Research), the Operational Program Research and Development for Innovations – European Regional Development Fund (Project No. CZ.1.05/2.1.00/03.0058) of the Ministry of Education, Youth, and Sports of the Czech Republic, the Operational Program Research and Development for Innovations – KONTAKT II (Project No. LH12085) of the Ministry of Education, Youth, and Sports of the Czech Republic, the Operational Program Research and Development for Innovations – European Social Fund (Project No. CZ.1.07/2.3.00/20.0155) of the Ministry of Education, Youth, and Sports of the Czech Republic, and by the Academy of Sciences of the Czech Republic (Project No. KAN115600801).

References [1] Pankhurst Q A, Connolly J, Jones S K and Dobson J 2003 Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine J. Phys. D: Appl. Phys. 36 R167-81 [2] Safarik I and Safarikova M 2009 Magnetic nano- and microparticles in biotechnology Chem. Pap. 63 497-505 [3] Kluchova K, Zboril R, Tucek J, Pecova M, Zajoncova L, Safarik I, Mashlan M, Markova I, Jancik D, Sebela M, Bartonkova H, Bellesi V, Novak P and Petridis D 2009 Superparamagnetic maghemite nanoparticles from solid-state synthesis – Their functionalization towards peroral MRI contrast agent and magnetic carrier for trypsin immobilization Biomaterials 30 2855-63 [4] Lin J, Lin Y S, Kuo S T, Jiang C M and Wu M C 2009 Purification of soybean amylase by superparamagnetic particles Food Chem. 117 94-8 [5] Ma M, Zhang Y, Yu W, Shen H Y, Zhang H Q and Gu N 2003 Preparation and characterization of magnetite nanoparticles coated by amino silane Colloid Surface A 212 219-26 [6] Pan B F, Gao F and Gu H C 2005 Dendrimer modified magnetite nanoparticles for protein immobilization J. Colloid Interface Sci. 284 1-6 [7] Wilhelm C and Gazeau F 2008 Universal cell labelling with anionic magnetic nanoparticles Biomaterials 29 3161-74 [8] Ansari S A and Husain Q 2012 Potential applications of enzymes immobilized on/in nano materials: A review Biotechnol. Adv. 30 512-23 [9] Maciel J C, Andrad P L, Neri D F M, Jr.Carvalho L B, Cardoso C A, Calazans G M T, Aguiar Albino J and Silva M P C 2012 Preparation and characterization of magnetic levan particles as matrix for trypsin immobilization J. Magn. Magn. Mater. 324 1312-6 [10] Selim K M K, Ha Y S, Kim S J, Chang Y, Kim T J, Lee G H and Kang I K 2007 Surface modification of magnetite nanoparticles using lactobionic acid and their interaction with hepatocytes Biomaterials 28 710-6 [11] Luo X L, Xu J J, Zhang Q, Yang G J and Chen H Y 2005 Electrochemically deposited chitosan hydrogel for horseradish peroxidase immobilization through gold nanoparticles self-assembly Biosens. Bioelectron. 21 190-6 [12] Verheul R J, Amidi M, van Steenbergen M J, van Riet E, Jiskoot W and Hennink W E 2009 Influence of the degree of acetylation on the enzymatic degradation and in vitro biological properties of trimethylated chitosans Biomaterials 30 3129-35 [13] Kalkan N A, Aksoy S, Aksoy E A and Hasirci N 2012 Preparation of chitosan-coated magnetite nanoparticles and application for immobilization of laccase J. Appl. Polym. Sci. 123 707-16 [14] Heyen U and Schüler D 2003 Growth and magnetosome formation by microaerophilic Magnetospirillum strains in an oxygen-controlled fermentor Appl. Microbiol. Biotechnol. 61 536-44 [15] Faivre D and Schüler D 2008 Magnetotactic bacteria and magnetosomes Chem. Rev. 108 4875-98

14

[16] Han L, Li S, Yang Y, Zhao F, Huang J and Chang J 2007 Comparison of magnetite nanocrystal formed by biomineralization and chemosynthesis J. Magn. Magn. Mater. 313 23642 [17] Xie J, Chen K and Chen X 2009 Production, modification and bio-applications of magnetic nanoparticles gestated by magnetotactic bacteria Nano Res. 2 261-78 [18] Olsen J V, Ong S E and Mann M 2004 Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues Mol. Cell. Proteomics 3 608-14 [19] Šebela M, Štosová T, Havliš J, Wielsch N, Thomas H, Zdráhal Z and Shevchenko A 2006 Thermostable trypsin conjugates for high-throughput proteomics: synthesis and performance evaluation Proteomics 6 2959-63 [20] Bayramoğlu G, Yilmaz M, Senel A Ü and Arica M Y 2008 Preparation of nanofibrous polymer grafted magnetic poly (GMA-MMA)-g-MAA beads for immobilization of trypsin via adsorption Biochem. Eng. J. 40 262-74 [21] Peng Z G, Hidajat K and Uddin M S 2004 Adsorption of bovine serum albumin on nanosized magnetic particles J. Colloid Interface Sci. 271 277-83 [22] Jeng J, Lin M F, Cheng F Y, Yeh C S and Shiea J 2007 Using high-concentration trypsinimmobilized magnetic nanoparticles for rapid in situ protein digestion at elevated temperature Rapid Commun. Mass Spectrom. 21 3060-8 [23] Li Y, Xu X, Deng C, Yang P and Zhang X 2007 Immobilization of trypsin on superparamagnetic nanoparticles for rapid and effective proteolysis J. Proteome Res. 6 3849-55 [24] Kim M H, An S, Won K, Kim H J and Lee S H 2012 Entrapment of enzymes into cellulosebiopolymer composite hydrogel beads using biocompatible ionic liquid J. Mol. Catal. B 75 6872 [25] Moreno-Garido I 2008 Microalgae immobilization: Current techniques and uses Bioresour. Technol. 99 3949-64 [26] Grünberg K, Müller E C, Otto A, Reszka R, Linder D, Kube M, Reinhardt R and Schüler D 2004 Biochemical and Proteomic Analysis of the Magnetosome Membrane in Magnetospirillum gryphiswaldense Appl. Environ. Microb. 70 1040-50 [27] Belessi V, Zboril R, Tucek J, Mashlan M, Tzitzios V and Petridis D 2008 Ferrofluids from Magnetic-Chitosan Hybrids Chem. Mater. 20 3298-3305 [28] Markova Z, Siskova K, Filip J, Safarova K, Prucek R, Panacek A, Kolar M and Zboril R 2012 Chitosan-based synthesis of magnetically-driven nanocomposites with biogenic magnetite core, controlled silver size, and high antimicrobial activity Green Chem. 14 2550-8 [29] Morand P and Biellmann J F 1991 Modification of α-amylase from Bacillus licheniformis by the polyaldehyde derived from β-cyclodextrine and α-amylase thermostability FEBS 289 148-50 [30] Laemmli U K 1970 Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4 Nature 227 680-5 [31] Bradford M M 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal. Biochem. 72 248-54 [32] Huliciak M, Vacek J, Sebela M, Orolinova E, Znaleziona J, Janovska M and Kubala M 2012 Covalent binding of cisplatin impairs function of Na+/K+-ATPase Biochem. Pharmacol. 83 1507-13 [33] Schüler D 2002 The biomineralization of magnetosomes in Magnetospirillum gryphiswaldense Int. Microbiol. 5 209-14 [34] Honda H, Kawabe A, Shinkai A and Kobayashi T 1998 Development of chitosan conjugated magnetite for magnetic cell separation J. Ferment. Bioeng. 86 191-6 [35] Magro M, Sinigaglia G, Nodari L, Tucek J, Polakova K, Marusak Z, Cardillo S, Salviulo G, Russo U, Stevanato R, Zboril R and Vianello F 2012 Charge binding of rhodamine derivate to OH- stabilized nanomaghemite – Universal nanocarrier for construction of magnetofluorescent biosensors Acta Biomater. 8 2068-76 [36] Jin X, Li J F, Huang P Y, Dong X Y, Guo L L, Yang L, Cao Y C, Wei F, Zhao Y D and Chen H 2010 Immobilized protease on the magnetic nanoparticles used for the hydrolysis of rapeseed meals J. Magn. Magn. Mater. 322 2031-7 [37] Shaw S Y, Chen Y J, Ou J J and Ho L 2006 Preparation and characterization of Pseudomonas putida esterase immobilized on magnetic nanoparticles Enzyme Microb. Technol. 39 1089-95

15

[38] Murphy A and Fágáin C Ó 1996 Stability characteristics of chemically-modified soluble trypsin J. Biotechnol. 49 163-71 [39] Jha S K and Udgaonkar J B (2007) Exploring the cooperativity of the fast folding reaction of a small protein using pulsed thiol labeling and mass spectrometry J. Biol.Chem. 282 37479-91 [40] Hernández K, Fernández L, Gómez L and Villalonga R 2006 Glycosidation of trypsin with endgroup activated dextran Process Biochem. 41 1155-9 [41] Yang Y M, Wang J W and Tan R X 2004 Immobilization of glucose oxidase on chitosan-SiO 2 gel Enzyme Microb. Technol. 34 126-31 [42] Gogjevargova T, Konsulov V, Dimov A and Vasileva N 2000 Behavior of glucose oxidase immobilized on ultrafiltration membranes obtained by copolymerizing acrylonitrile and Nvinylimidazol J. Membr. Sci. 172 279-85 [43] Goradia D, Cooney J, Hodnett B K and Magner E 2005 The adsorption characteristics, activity and stability of trypsin onto mesoporous silicates J. Mol. Catal. B-Enzym. 32 231-9 [44] Nikolic T, Kostic M, Praskalo J, Pejic B, Petronijevic Z and Skundric P 2010 Sodium periodate oxidized cotton yarn as carrier for immobilization of trypsin Carbohyd. Polym. 82 976-81 [45] Tang Z X, Quian J Q and Shi L E 2007 Characterization of immobilized neutral lipase on chitosan nano-particles Mater. Lett. 61 37-40 [46] Kouassi G K, Irudayaraj J and McCarty G 2005 Activity of glucose oxidase functionalized onto magnetic nanoparticles Biomagn. Res. Technol. 3 1-10 [47] Lei L, Bai Y, Li Y, Yi L, Yang Y and Xia C 2009 Study of immobilization of lipase onto magnetic microspheres with epoxy groups J. Magn. Magn. Mater. 321 252-8 [48] Zhu X, Zhou T, Wu X, Cai Y, Yao D, Xie C and Liu D 2011 Covalent immobilization of enzymes within micro-aqueous organic media J. Mol. Catal. B-Enzym. 72 145-9 [49] Luo Y, Li T, Yu F, Kramer T and Cristea I M 2010 Resolving the composition of protein complexes using a MALDI LTQ orbitrap J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21 34-46 [50] Sun L, Li Y, Yang P, Zhu G and Dovichi N J 2012 High efficiency and quantitatively reproducible protein digestion by trypsin-immobilized magnetic microspheres J. Chromatogr. A 1220 68-74 [51] Yao G, Qi D, Deng C and Zhang X 2008 Functionalized magnetic carbonaceous microspheres for trypsin immobilization and the applications to fast proteolysis J. Chromatogr. A 1215 82-91 [52] Wei L, Zhang W, Lu H and Yang P 2010 Immobilization of enzyme on detonation nanodiamond for highly efficient proteolysis Talanta 80 1298-1304 [53] Xi F, Wu J, Jia Z and Lin X 2005 Preparation and characterization of trypsin immobilized on silica gel supported macroporous chitosan bead Process Biochem. 40 2833-40 [54] Anirudhan T S and Rejeena S R 2012 Adsorption and hydrolytic activity of trypsin on a carboxylate-functionalized cation exchanger prepared from nanocellulose J. Colloid Interface Sci. 381 125-136 [55] Hamerska-Dudra A, Bryjak J and Trochimczuk A W 2007 Immobilization of glucoamylase and trypsin on crosslinked thermosensitive carriers Enzyme Microb. Technol. 41 197-204 [56] Sun J, Ma H, Liu Y, Su Y, Xia W and Yang Y 2012 Improved preparation of immobilized trypsin on superparamagnetic nanoparticles decorated with metal ions Colloid Surf. A-Physicochem. Eng. Asp. 414, 190-7

16

Rozšířený abstrakt (Příloha 4) Nanocon, October 20 – 22, 2009, Roznov pod Radhostem, Czech Republic; EU

Surface

engineering

of

iron

oxide

nanoparticles

isolated

from

Magnetospirillum gryphiswaldense for biochemical and biomedical applications Zdenka Marková, Michaela Pečová, Ludmila Zajoncová, Jiří Zbořil, Radek Zbořil

20. - 22. 10. 2009, Roznov pod Radhostem, Czech Republic, EU

SURFACE ENGINEERING OF IRON OXIDE NANOPARTICLES ISOLATED FROM MAGNETOSPIRILLUM GRYPHISWALDENSE FOR BIOCHEMICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS Zdenka Marková1, Michaela Pečová2, Ludmila Zajoncová2, Jiří Zbořil1, Radek Zbořil1 1

Centre for Nanomaterial Research, Palacký University, Šlechtitelů 11, 783 71 Olomouc, Czech Republic 2 Department of Biochemistry, Faculty of Science, Palacký University, Šlechtitelů 11, 783 71 Olomouc, Czech Republic Abstract: Superparamagnetic iron oxide nanoparticles with appropriate surface modification can be widely used in various applications including magnetic resonance imaging (MRI) diagnostic contrast agents, anticancer therapy using hyperthermia, magnetic drug targeting, protein and enzyme immobilization, cell labeling and separation or RNA and DNA purification. All these biochemical and biomedical applications require nanoparticles exhibiting a high magnetization and narrow size distribution and possessing non-toxicity and biocompatibility. As a result of biologically controlled preparation, biogenic magnetite (Fe3O4) nanoparticles have properties that make them intrinsically distinct from their synthetic counterparts. Magnetotactic bacteria are microorganisms that are able to biomineralize the membrane-enveloped crystals of magnetite called magnetosomes.

Magnetospirillum

gryphiswaldense,

well

laboratory

cultured

organism,

produces

cubooctahedral magnetite crystals ranging in size between 20 and 50 nm. The fermentor cultivation under microaerobic conditions, commonly performed in our lab, leads to the sufficiently high cell yield (OD565nm ~ 1.5) and to the suitable values of the parameter describing the cell magnetism (cmag ~ 1). Magnetosomes are consequently isolated from bacteria by method using a neodynium boron (Nd-B) magnet. In the present work, we coated biogenic magnetite with substances that make them biocompatible, biodegradable, stable, non-toxic and accessible for binding with various active biocomponents depending on particular bioapplication. The natural polymers such as chitosan, N-trimethylchitosan, carboxymethylchitosan or dextran have been used in a coating procedure and the properties of the core-shell systems have been analyzed by TEM, SEM and SQUID magnetic measurements. The magnetite nanoparticles modified by chitosan exhibit the most perfect and complete surface stabilization as evidenced by the narrow and well defined shell. These nanoparticles were successfully tested in the trypsin immobilization for applications in proteomics, where they revealed the superior properties compared to the synthetic counterparts.

1.

INTRODUCTION

Techniques based on using magnetisable solid-phase support have found application in numerous biological fields viz. diagnostics, drug targeting, molecular biology, cell isolation and purification, radio immuno assay, immobilization of pretiens and enzymes, hyperthermia causing agents for cancer therapy, nucleic acid purification etc [1-3]. While a number of suitable methods have been developed for the synthesis of the magnetic particles of various compositions, for example nano-sizes magnetite particles have been synthesized by coprepitation of Fe(II) and Fe(III) in alkaline solution, some magnetic bacteria could synthesize more uniform magnetic particles, which consist of magnetite (Fe3O4) or greigite (Fe3S4) in size and shape compared with artificial magnetite particles.


The increasing effort in this research is reflecting the need for new biomarkers facing the requirements of today’s fast growing biotechnological and pharmaceutical industry [4, 5].

1.1

Magnetotactic bacteria

Magnetotactic bacteria, a special kind of bacteria, were discovered by Blakemore in 1975 [6]. Thus magnetotactic bacteria do not represent a single, defined, taxonomic group. Morphotypes include coccoid to ovoid cells; rods, vibrios, and spirilla of various dimensions; and even multicellular forms. All that have been examined are members of the domain Bacteria and possess cell walls that are characteristic of gramnegative bacteria. [7] These bacteria synthesize intracellular magnetic nano-particles (also called magnetosomes or bacterial magnetic particles (BMPs)), which are enveloped by cytoplasmatic membrane and made of Fe3O4, Fe3S4, Fe2O3 or FeS, etc [8-10]. Several strains of magnetotactic bacteria, including Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1, M. magnetotacticum MS-1 and M. magneticum AMB-1, have been isolated and identified so far [11-13]. A magnetotactic spirillum (strain MSR-1) was isolated from the mud of the entropic river Ryck near Greifswald by Schleifer in 1991. The research of phylogenetic taxonomy demonstrated that MSR-1 is related and belongs to alpha subclass of proteobacteria [14].

1.2

Bacterial magnetic particles; magnetosomes

Single domain bacterial magnetic particles, known as magnetosomes occur in rows 10-20 particles with a defined size of 35-120 nm and are surrounded by a phospholipids’ membrane approximately 2-4 nm in thickness [15]. Each BMP has a single domain of magnetite and are well-dispersed in aqueous solutions because of the enclosing membrane [16]. The magnetite particles are aligned in chains parallel to the cell axis. Each particle possesses a magnetic dipole moment and magnetic interactions between magnetic particles in a chain are oriented parallel to each other along the Earth’s geomagnetic fieldlines and to maintain its position within the boundary of oxic-anoxic zone [17]. This is used by bacteria for navigation, known as magnetotaxis. While magnetotaxis is clearly an important function for magnetosomes, it may not be their only function. Bazylinski and Frankel suggest that the magnetosomes also have unknown physiological function [18]. The molecular mechanism of magnetite biomineralization in bacteria is poorly understood although this process occurs widely in many other organism such as insect [19], birds [20] or migratory fishes [21].One of the models of the crystallization process have been proposed where ferric iron is reduced on the cell surface, taken into the cytoplasm, transferred into vesicles (magnetosome) and finally oxidized to produce magnetite [22]. The morphology of BMP is varied and species-dependent. Three general morphologies of magnetite have been observed in bagnetotactic bacteria using TEM. They include: roughly cuboidal [23]; parallelepipedal [24.25] and tooth-, bullet- or arrowhead-shaped [26, 27]. M. gryphiswaldense produces a chain of cubooctahedral magnetosome particles. The strain has been used as a model organism in a number of studies addressing the physiology and molecular genetics of magnetosome biomineralization and for the development of applications of magnetosomes [13].


Fig. 1. Cell of Magnetospirillum gryphiswaldense obtain a chain of magnetosome

2. MAGNETOSOME PRODUCTION 2.1 Culture Pure cultivation of magnetotactic bacteria is one of the most important biotechnological processes in the application of BMPs. A magnetic bacterium, Magnetospirillum gryphiswaldense, capable of growing aerobically has been successfully isolated [14]. In our initial work, laboratory scale cultivation of these bacteria in 10 l fermentor has been done for the production of BMPs from which approximately 1.5 OD565nm or 0.35 g dry weights of BMPs was yielded per litre of culture. MSR-14 was cultured for 35-40 h in the reported medium [13] using 10 l auto-fermentor under low oxygen concentration conditions.

2.2

Collection of cells and purification of magnetosomes

Bacterial magnetite particles are easily separated and purified from disrupted magnetic bacteria by magnetic separation using a magnet. MSR-1 cell cultures were pelleted by centrifugation and disrupted by several passes through a French pressure cell. Bacterial magnetite from disrupted cells was collected magnetically using a neodynium boron (Nd-B) magnet. Collected bacterial magnetite was washed and used for additional modification.

3.

SURFACE MODIFICATION OF BMPs

Generally, naked nano-sized particles tend to form agglomerates to reduce the energy associated with the high surface area to volume ratio. For many applications it is crucial to develop protection strategies to chemically stabilize the naked nanoparticles against degradation and agglomeration. These strategies comprise grafting of or coating with organic species, including surfactants or polymers, or coating with an inorganic layer, such as silica or polysaccharides. In many cases the protecting shells not only stabilize the nanoparticles, but can also be used for further functionalization depending on the desired application. We have modified several methods [28-30] to assemble these functional molecules over the BMPs surface using chemical techniques. Coating experiments in our laboratory were carried out with biogenic nanoparticles of magnetite. As biocompatible coating materials chitosan, O-carboxymethyl chitosan (CMC), dextrans, Nsubstituted trimethyl chitosan chloride (TMC) and Tween 20 were used. Before all experiments the


membrane of BMPs was removed and substituted by positive detergent agents Cetyltrimethylammonium chloride (CTAC).

3.2.

Examination of purified and modified magnetosomes by TEM

The purified and modified magnetosomes were observed by transmission electron microscopy (TEM, JEOL, Japan).

Fig. 2 Determination of surface modification of biogenic nanoparticles of magnetite by TEM (magnetite was modified by chitosan (A), dextran (B), N-substituted trimethyl chitosan (C) and TWEEN 20 (D)).

4.

USE OF MODIFICATED BMPs AS ENZYME CARRIERS

The use of functional magnetic particles in bioassays facilitates the separation of bound and free analytes by the application of a magnetic field. Magnetic iron oxide nanoparticles are widely used in the development of medical and diagnostic applications such as magnetic resonance imaging (MRI) [33], cell separation [34], drug delivery [35] and hyperthermia [36]. To use these particles for the biotechnological applications, it is important to consider surface modification of magnetic particles with functional molecules such as proteins, antibodies, peptides and DNA. Because of their unique characteristics (narrow-size distribution, a large surface area for reaction, the single magnetic domain size range, etc.) [37] compared to synthetic particles, isolated resp. also modified magnetosome crystals are superior for applications that rely on small amounts of highly functionalized magnetic material with extraordinary magnetic and biochemical characteristics.


The use of BMPs as stable platform for immobilization of proteins resp. enzymes was tried with trypsin. Trypsin (EC 3.4.21.4) is a serine protease found in the digestive system of many vertebrates, where it hydrolyses proteins [38]. Trypsin predominantly cleaves peptide chains at the carboxyl side of the amino acids lysine or arginine, except when either is followed by proline. This enzyme has been used widely in various biotechnological processes and it is commonly used in biological research during proteomics experiments to digest proteins into peptides for mass spectrometry analysis, e.g. in-gel digestion. In our experiments bovine trypsin (BT) was chemically modified with α-cyclodextrine (ACD-BT) and βcyclodextrine (BCD-BT) and all were activated by EDC.HCl (N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylkarbodiimid hydrochloride). Then enzymes were covalently immobilized on surface of biogenic magnetite modified by chitosan. For comparison the activities of free and immobilized enzyme were measured under different conditions. The activity of trypsin was determined with artificial substrate BAPNA (Nα -benzoyl-DL-arginine4-nitroanilide) spectroscopically (λ = 405 nm) (Fig. 3).

NO2

O

O NH

NH

C

C

CH

O

CH2

CH

C

NH

CH2

+

CH2

H2O

NH2

CH2

HN

4-nitroaniline

HN

C H2N

OH

CH2

O

Trypsin

CH2

NO2

C

(yellow)

C NH

H2N

NH

Fig. 3 The schema of trypsin hydrolysis of artificial substrate Nα -benzoyl-DL-arginine-4-nitroanilide.

All enzymes (free and immobilized forms) were characterized in activities, Michaelis’s constants, temperature stabilities T50 [°C] (temperature, in which the enzyme had loose half of activity in comparison whit room temperature) and time-degradation stabilities (time, after which the enzyme had loose half of its activity) (tab.1).

Tab. 1

Comparison the activities of free and immobilized enzyme Free

Immobilized

Enzyme BT

ACD-BT

BCD-BT

BT

ACD-BT

BCD-BT

Km [mM]

2,5

1,7

1,2

1,7

1,3

1,1

T50 [°C]

41

55

56

46

60

64

t50 [h]

0,8

21

>24

3,9

>24

>24

(BT – bovine trypsin, ACD-BT - trypsin modified with α-cyclodextrine and BCD-BT - trypsin modified with βcyclodextrine) in Michaelis’s constants Km [mM], temperature stabilities T50 [°C] and time-degradation stabilities t50 [h]. All characteristics were measured with artificial substrate BAPNA (Nα -benzoyl-DL-arginine4-nitroanilide) spectroscopically (λ = 405 nm).


The positive improve of characteristic by immobilization of trypsin on bacterial nanoparticles of magnetite was determined in all experiments. Additionally we will focus on usage of immobilized enzyme in MALDITOF peptide mass fingerprinting.

LITERATURE [1]

RAMCHAND, C.N. et al. Application of magnetic fluids in medicine and biotechnology. Indian J. Pure Appl. Phys., 2001, 39, 683-686.

[2]

SAFARIKOVA, M., SAFARIK, I. The application of magnetic techniques in bioscience, Magn. Electr., Sep 2001, 10, 223-252.

[3]

SAFARIK, I., SAFARIKOVA, M. Overview of magnetic separations used for biochemical and biotechnological applications. Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers edited by Hafeli. U et al., 1997, 323-340.

[4]

ZOLG, J.W., LANGEN, H. How industry is approaching the research for new diagnostic markers and biomarkers. Mol. Cell. Proteomics, 3, 2004, 345-354.

[5]

AUSTIN, M.J.F., BABISS, L. Commentary: where and how could biomarkers be used in 2016, AAPS J., 8, 2006.

[6]

BLAKEMORE, R.P. Magnetotactic bacteria. Science, 1975, 190, 377-379.

[7]

FRANKEL, R.B., BAZYLINSKI, D.A. Magnetosome Mysteries. ASM News, 2004, 70, 4, 174-183.

[8]

BERNER, R.A. Thermodynamic stability of sedimentary iron sulfide. Am. J. Sci., 1967, 265, 773-785.

[9]

BAZYLINSKI, D.A. et al. Copper association with iron sulfide magnetosomes in a magnetotactic bacterium. Arch. Microbiol., 1993, 160, 35-42.

[10]

BAZYLINSKI, D.A. et al. Fe3O4 and Fe3S4 in a bacterium. Nature, 1993, 366, 218-219.

[11] BLAKEMORE, R.P. MARATEA, D., WOLFE, R.S. Isolation and pure culture of freshwater magnetic spirillum in chemically defined medium. J. Bacteriol., 1979, 140, 720-729. [12]

YANG, C.D. Effect of growth medium composition, iron sources and atmospheric oxygen concentration on production of luciferase-bacterial magnetic particle complex by a recombinant Magnetospirillum magneticum AMB-1. Enzyme Microb. Technol., 2001, 29, 13-19.

[13]

HEYEN, U., SCHULER, D. Growth and magnetosome formation by microaerophilic Magnetospirillum strains in an oxygen-controlled fermentor, 2003, Appl. Microbiol. Biotechnol., 61, 536-544.

[14]

SCHLEIFER, K.H. et al.

The genus Magnetospirillum gen. nov. description of Magnetospirillum

gryphiswaldense sp. nov. and transfer of Aguaspirillum magnetotacticum to Magnetospirillum magnetotacticum comb. nov. syst. Appl. Microbiol., 1991, 14, 379-385. [15]

MATSUNAGA, T. Application of bacterial magnets. Trends Biotech., 1991, 9, 91-95.

[16]

NAKAMURA, N., MATSUNAGA, T. Highly sensitive detection of allergen using bacterial magnetic particles. Anal. Chim. Acta, 1993, 281, 585-589.


[17]

SAIYED, Z.M. Application of magnetic techniques in the field of drug discovery and biomedicine. Biomagn. Res. Technol., 2003, 1, 2.

[18]

BAZYLINSKI, D.A., FRANKEL, R.B. Magnetosome formation in prokaryotes. Nat. Rev. Microbiol., 2004, 2, 217-230.

[19]

GOULD, J.L., KIRSCHVINK, J.L., DEFFEYES, S.K. Bees have magnetic remanence. Science, 1978, 201, 1026-1028.

[20]

WALCOTT, C., GREEN, R.P. Orientation of homing pigeons altered by a change in the direction of an applied magnetic field. Science, 1974, 184, 180-182.

[21]

WALKER, M.M. et al. A candidate magnetic sense organ in the yellowfin tuna, thunnus albacares. Science, 1984, 224, 751-753.

[22]

MANN, S., SPARKS, N.H.C., BOARD, R.G. Magnetotactic bacteria: microbiology, biomineralization, paleomagnetism and biotechnology. Adv. Microbiol. Physiol., 1990, 31, 125-181.

[23]

BALKWILL, D.L., MARATEA, D., BLAKEMORE, R.P. Ultrastructure of a magnetic spirillum. J. Bacteriol., 1980, 141, 1399-1408.

[24]

BAZYLINSKI, D.A., FRANKEL, R.B., JANNASCH, H.W. Anaerobic production of magnetite by a marine magnetotactic bacterium. Nature, 1988, 334, 518-519.

[25]

TOWE, K.M., MOENCH, T.T. Electron-optical characterization of bacterial magnetite. Earth Planet. Sci. Lett., 1981, 52, 213-220.

[26]

MANN, S., SPARKS, N.H.C.,BLAKEMORE, R.P. Ultrastructure and characterization of anisotropic inclusions in magnetotactic bacteria. Proc. R. Soc London, Ser. B, 1987, 231, 469-476.

[27]

MANN, S., SPARKS, N.H.C.,BLAKEMORE, R.P. Structure, morphology and crystal growth of anisotropic magnetite crystals in magnetite crystals in magnetotactic bacteria. Proc. R. Soc London, Ser. B, 1987, 231, 477-487.

[28]

MANN, S., FRANKEL, R.B., BLAKEMORE, R.P. Structure, morphology and crystal growth of bacteria magnetite. Nature, 1984, 310, 405.

[29]

MATSUDA, T. et al. Morphology and structure of biogenic magnetite particles. Nature, 1983, 302, 411.

[30]

DUTZ, S. et al. Influence of dextran coating on magnetic behaviour of iron oxide nanoparticles. J. Magn Magn. Mater., 2007, 311, 51-54.

[31]

HONDA, H. et al. Development of chitosan-conjugated magnetite for magnetic cell separation. J. Ferment. Bioeng., 1998, 86, 191-196.

[32]

BELESSI, V. et al. Ferrofluids from magnetic-chitosan hybrids. Chem. Mater., 2008, 20, 3298-3305.

[33]

GLEICH, B., WEIZENECKER, R.Tomographic imaging using the nonlinear response of magnetic particles. Nature, 2005, 435, 1214-1217.

[34]

MILTENYI, S. et al. High-gradient magnetic cell-separation with macs. Cytometry, 1990, 11, 231- 238.

[35]

PLANK, C. et al. The magnetofection method: using magnetic force to enhance gene delivery. Biol. Chem., 2003, 384, 737-747.


[36]

PARDOE, H. et al. A magnetic resonance imaging based method for measurement of tissue iron concentration in liver arterially embolized with ferrimagnetic particles disigned for magnetic hyperthermia treatment of tumors. Mag. Resonan. Imag., 2003, 21, 483-488.

[37]

BUTLER,

R.F.,

BANERJEE,

S.

Theoretical

single-domain

size

range

in

magnetite

and

titanomagnetite. J. Geophys. res., 1975, 50, 4049. [38]

RAWLINGS, N.D., BARRETT, A.J. Families of serine peptidases. Meth. Enzymol., 1994, 244, 19-61.

Rukopis (manuskript); (Příloha 5) Purification of chicken liver sulfite oxidase: a study on performance of conventional chromatography Michaela Pečová, Beáta Bóka, Martina Tylichová, David Kopečný, Pavlína Halamková, Fabio Vianello and Marek Šebela

The Protein Journal Purification of chicken liver sulfite oxidase: a study on performance of conventional chromatography --Manuscript Draft-Manuscript Number:

JOPC-D-12-00039

Full Title:

Purification of chicken liver sulfite oxidase: a study on performance of conventional chromatography

Article Type:

Original Research

Keywords:

chicken liver; catalase; L-lactate dehydrogenase; liquid chromatography; protein purification; sulfite oxidase

Corresponding Author:

Marek Sebela, Ph.D. Palacky University, Faculty of Science Olomouc, CZECH REPUBLIC

Corresponding Author Secondary Information: Corresponding Author's Institution:

Palacky University, Faculty of Science

Corresponding Author's Secondary Institution: First Author:

Michaela Pecova, Ph.D. student

First Author Secondary Information: Order of Authors:

Michaela Pecova, Ph.D. student Beata Boka, Ph.D. Martina Tylichova, Ph.D. David Kopecny, Ph.D. Pavlina Halamkova, MSc. Fabio Vianello, Prof. Ph.D. Marek Sebela, Ph.D.

Order of Authors Secondary Information: Abstract:

Sulfite oxidase (SOX; EC 1.8.3.1) is an enzyme oxidizing sulfite to sulfate. It belongs to the molybdenum enzymes and contains molybdopterin as a cofactor. Animal liver represents a typical source for SOX isolation. In this work, the enzyme was purified from chilled chicken livers (purchased from a local grocery store), which were found to be a cheap and good starting material. The developed procedure involved the following steps: preparation of an acetone powder and its extraction, ammonium sulfate precipitation with heat denaturation, two steps of ion-exchange chromatography, gel permeation chromatography and hydroxyapatite chromatography. During the purification, protein fractions were analyzed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis with the subsequent peptide mass fingerprinting after in-gel tryptic digestion. Chicken liver SOX was finally obtained as a highly purified protein with specific activity of 200 nkat mg-1. The enzyme could not be purified to electrophoretic homogeneity without compromising the yield. However, the remaining protein contaminants represent no direct interference with sulfite oxidation. As a beneficial side outcome, some other chicken enzymes could be obtained in a high purity (e.g. catalase and L-lactate dehydrogenase).

Powered by Editorial Manager® and Preprint Manager® from Aries Systems Corporation

Cover Letter Click here to download Cover Letter: 120228_The_Protein_Journal_Sebela_manuscript_cover_letter.doc

Department of Biochemistry Faculty of Science, Palacký University Šlechtitelů 11, 783 71 Olomouc Czech Republic

The Protein Journal Editor-in-Chief

February 28, 2012

Dear editor, attached please find a manuscript entitled " Purification of chicken liver sulfite oxidase for bioanalytical applications" by Michaela Pečová, Beáta Bóka, Martina Tylichová, David Kopečný, Pavlína Halamková, Fabio Vianello and Marek Šebela that we wish to submit for publication in the journal Chromatographia. This manuscript describes a novel purification protocol for chicken liver sulfite oxidase, which involves precipitation and chromatographic steps. The text shows the novelty of our approach, which resides in working with a common and cheap starting material and provides a highly purified enzyme. As a beneficial side outcome of the purification procedure, catalase, L-lactate dehydrogenase and also betainehomocysteine methyltransferase could be obtained in a highly purified form. Sulfite oxidase, catalase and L-lactate dehydrogenase have a potential for wide use in bioanalytical applications and the present method allows their routine preparation. I hereby declare on behalf of all co-authors that 1. All co-authors have agreed to submit the manuscript to the journal. 2. The findings have not been published elsewhere. 3. The manuscript is not currently under consideration by another journal. Thank you for considering this manuscript for publication. Sincerely yours

Marek Šebela Phone: +420-585634927 Fax: +420-585634933 E-mail: [email protected] URL: http:// biochemie.upol.cz

*Manuscript Click here to download Manuscript: 120228_Sebela_The_Protein_Journal_submission_main_text.doc

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Purification of chicken liver sulfite oxidase: a study on performance of conventional chromatography Michaela Pečová1, Beáta Bóka2, Martina Tylichová1, David Kopečný1 Pavlína Halamková3, Fabio Vianello4 and Marek Šebela1,*

1

Department of Protein Biochemistry and Proteomics, Centre of the Region Haná for Biotechnological

and Agricultural Research, Faculty of Science, Palacký University, Šlechtitelů 11, CZ-783 71 Olomouc, Czech Republic; 2EGERFOOD Regional Knowledge Centre, Eszterházy Károly College, Leányka str. 6, H-3300 Eger, Hungary; 3Departrment of Biochemistry, Faculty of Science, Palacký University, Šlechtitelů 11, CZ-783 71 Olomouc, Czech Republic; 4Department of Biological Chemistry, University of Padua, Viale G. Colombo 3, I-35121 Padua, Italy

*Corresponding author: [email protected] Tel.: +420 585634927, Fax: +420 585634933

Keywords chicken liver; catalase; L-lactate dehydrogenase; liquid chromatography; protein purification; sulfite oxidase

Abbreviations BHMT, betaine-homocysteine methyltransferase; CHCA, α-cyano-4-hydroxycinnamic acid; EDTA, ethylene diamine tetraacetic acid; MALDI-TOF, matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight; SDH, sulfite dehydrogenase; SOX, sulfite oxidase

1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Abstract Sulfite oxidase (SOX; EC 1.8.3.1) is an enzyme oxidizing sulfite to sulfate. It belongs to the molybdenum enzymes and contains molybdopterin as a cofactor. Animal liver represents a typical source for SOX isolation. In this work, the enzyme was purified from chilled chicken livers (purchased from a local grocery store), which were found to be a cheap and good starting material. The developed procedure involved the following steps: preparation of an acetone powder and its extraction, ammonium sulfate precipitation with heat denaturation, two steps of ion-exchange chromatography, gel permeation chromatography and hydroxyapatite chromatography. During the purification, protein fractions were analyzed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis with the subsequent peptide mass fingerprinting after in-gel tryptic digestion. Chicken liver SOX was finally obtained as a highly purified protein with specific activity of 200 nkat mg-1. The enzyme could not be purified to electrophoretic homogeneity without compromising the yield. However, the remaining protein contaminants represent no direct interference with sulfite oxidation. As a beneficial side outcome, some other chicken enzymes could be obtained in a high purity (e.g. catalase and L-lactate dehydrogenase).

2

1. Introduction 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Sulfite oxidase (SOX; EC 1.8.3.1) is an enzyme, which catalyzes the two-electron oxidation of sulfite to sulfate [1]. This reaction represents the terminal step in the oxidative breakdown of the sulfur-containing amino acids Cys and Met but it is also related to the degradation of exogenously supplied sulfite and sulfur dioxide [2]. SOX belongs to the family of molybdenum enzymes and contains a mononuclear Mo atom coordinated to the dithiolene sulfur atoms of a pterin derivative, named molybdopterin (Moco). The mononuclear Mo enzymes fall into three distinct groups comprising the xanthine oxidase, dimethyl sulfoxide reductase, and sulfite oxidase families [2]. SOX is ubiquitous in vertebrates; in mammals, the expression level is highest in the liver, kidney and heart [3]. In plants, namely the enzymes from Arabidopsis and tobacco have been studied in detail [4]. While animal SOX is localized in the intermembrane space of mitochondria and reacts with cytochrome c as the physiological electron acceptor [5], plant SOX is localized in peroxisomes [6] and produces hydrogen peroxide [7]. In microorganisms, a similar enzyme sulfite dehydrogenase occurs (SDH; EC 1.8.2.1), which does not reduce molecular oxygen [8]. Nevertheless, the literature often reports on bacterial “sulfite oxidases” like, for example, periplasmic enzymes from Thiobacillus ferrooxidans [9], Deinococcus radiodurans [10] or Thermus thermophilus [11]. Several crystal structures have been solved including the enzymes from chicken liver [12], Arabidopsis [13] and human being (cytochrome b5 domain) [14] as well as SDH from the bacterium Starkeya novella [15]. SOXs from plants and vertebrates are homodimers, which, in the case of the vertebrate enzymes, contain a mobile N-terminal cytochrome b5 domain plus a central cofactor domain and a C-terminal dimerization domain. Conversely, the SDH from Starkeya is a heterodimer consisting of a large Mo-binding subunit and a smaller heme c-containing subunit [8]. The molybdenum center of SOX is reduced from the VI to the IV valence state in the reductive halfreaction of the catalytic cycle (i.e., the reaction of enzyme with sulfite), and the reducing equivalents are then transferred individually to the heme center (if it is present, like e.g. in a vertebrate SOX), where they are passed to the final electron acceptor in the oxidative half reaction [1]. It should be noted here that vertebrate SOXs possess only a weak reactivity towards oxygen and use cytochrome c

3

as their preferred electron acceptor [8]. Interestingly, mutations of specific residues at the active sites 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

of both chicken and human enzymes led to their conversion to a nitrate reductase [16]. SOXs have been studied as prospective components of biosensors applicable for the determination of sulfite in food, beverages and other biological materials [17-20]. From the point of view of human medicine, SOX deficiency results in neurological abnormalities, seizures, mental retardation, and dislocation of the ocular lenses that often leads to death at an early age [21]. The phenotype of SOX deficiency can arise from a mutation either in the corresponding gene (isolated SOX deficiency) or in any of several genes involved in the biosynthesis of molybdopterin (Moco deficiency). An arginine mutation (R160Q) has been found to be responsible for the former case [22]. Chicken liver can be considered a cheap and accessible source for the purification of the enzyme. Several purification protocols have been described to date [22-24]. In this work, a modified procedure was developed, which provides a highly purified enzyme after initial steps (acetone powder, extraction, ammonium sulfate pecipitation) followed by four chromatographic separations. As side products

of

the

protocol,

catalase,

L-lactate

dehydrogenase

and

betaine-homocysteine-

methyltransferase can be obtained in a high purity during the ion-exchange chromatography. The method thus allows purifying more enzymes from a single liver extract.

2. Materials and methods

Chemicals and biological material Sodium sulfite (Cat. No. 71989) and sodium molybdate dihydrate (Cat. No. 71756) were purchased from Sigma-Aldrich Chemie (Steinheim, Germany). Horse heart cytochrome c (Cat. No. 101467) was from MP Biomedicals (Aurora, OH, USA). Analytical grade acetone was from LachNer (Neratovice, Czech Republic). All other chemicals were commercial products of analytical purity grade. Chilled chicken livers were purchased in a local grocery store; the country of origin was Czech Republic.

4

Enzyme purification 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

All of the following steps were performed at 0-5 °C. Chicken livers (500 g) were cut into small pieces and disintegrated by a laboratory homogenizer T50 basic Ultra-Turrax (IKA, Staufen, Germany) in 2 L of acetone, which had been chilled in a deep freezer (-20 °C). Then the solid portion was collected by filtration on a Büchner funnel in a few aliquots. The filter cakes were washed by cold acetone and ether and left to dry overnight. On crumbling, the acetone powder (120 g) was extracted by homogenization in 1.5 L of 10 mmol L-1 potassium phosphate buffer, pH 7.8, containing 0.1 mmol L-1 EDTA. After an additional stirring for 45 min, the slurry was centrifuged at 17,000 g for 20 min. The supernatant was subjected to a two-step fractionation by ammonium sulfate. First, it was treated with 20% saturated ammonium sulfate (114 g L-1), stirred for 30 min and then heated in a water bath at 56 °C for 1 min. After rapid cooling in water/ice mixture, it was centrifuged at 17,000 g for 20 min. The supernatant obtained was further treated with 50% saturated ammonium sulfate (189 g L -1), stirred for 30 min and centrifuged at 5,000 g for 60 min. The precipitate was dissolved in 60 mL of 25 mmol L-1 Tris-HCl buffer, pH 8.0, containing 0.1 mmol L-1 EDTA and the solution was clarified by centrifugation at 17,000 g for 20 min. The reddish brown supernatant was dialyzed overnight against 3 x 2 L of the same buffer, additionally containing 2.5 mmol L-1 sodium molybdate. Low-pressure liquid chromatography was conducted on a system consisting of a peristaltic pump P-1, a gradient mixer GP-250, a single path monitor UV-1 operating at 280 nm, a fraction collector Frac-920 and a two-channel recorder REC-112 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden). The whole dialyzate was loaded continuously at a flow rate of 2 mL min-1 onto Macro-Prep High Q medium (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) in a glass column (2.5 x 20 cm), which had been equilibrated with 25 mmol L-1 Tris-HCl buffer, pH 8.0 (buffer A). The column was washed with the same buffer to remove unbound proteins. The retained fraction was eluted with 50 mL of linear gradient from 0 to 100% of buffer B (25 mmol L-1 Tris-HCl buffer, pH 8.0, containing 1 mol L-1 NaCl). Active fractions were pooled and dialyzed as above against the molybdate-containing buffer. The dialyzate was concentrated by ultrafiltration using a 10-kDa cutoff filter. Further separation was achieved on a Resource Q column (6-mL bed volume; GE Healthcare) connected to a BioLogic DuoFlow medium pressure liquid chromatograph equipped with a QuadTec detector (Bio-Rad) and a 2-mL sample loop. Proteins

5

were detected at selected wavelengths of 280 and 410 nm, the column was equilibrated with buffer A. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Separations at a flow rate of 1 mL min-1 were run isocratically in the beginning (8 min), then with an increasing linear gradient from 0 to 20% B for 5 min, from 20 to 45% B for 9 min, from 45 to 100% B for 3 min and then isocratically at 100% B for an additional time of 3 min. This was followed by a decreasing linear gradient from 100 to 0% B in 3 min and a final isocratic step to give the total time of 44 min. Active fractions were pooled and concentrated by ultrafiltration using a 10-kDa cutoff filter. No dialysis was involved prior the subsequent medium-pressure gel permeation chromatography on a Superdex 200 HR 10/30 column (GE Healthcare) monitored at 280 and 410 nm. Sample aliquots (1 mL) were separated at a flow rate of 0.7 mL min-1 in the molybdate-containing dialysis buffer as a mobile phase (monitored at 280 and 410 nm). Active fractions were pooled and concentrated by ultrafiltration using a 10-kDa cutoff filter. The final medium-pressure chromatographic step was performed on a Bio-Scale CHT5-I ceramic hydroxyapatite column (Bio-Rad) equilibrated with buffer A and operated at a flow rate of 2 mL min-1. Separations of sample aliquots (0.5 mL) were run isocratically in the beginning (2 min), then with an increasing linear gradient from 0 to 80% of buffer C (0.75 M potassium phosphate, pH 7.0) for 6 min, from 80 to 100% C for 8 min and then isocratically at 100% C for an additional time of 2.5 min. This was followed with a decreasing linear gradient from 100 to 0% C in 3 min and a final isocratic step to give the total time of 30 min. Active fractions were pooled and dialyzed as above against the molybdate-containing buffer. The dialyzate was concentrated by ultrafiltration (using a 10-kDa cutoff filter. Finally, enzyme aliquots were stored at -80 °C.

Activity and protein assay SOX was routinely assayed on a spectrophotometer LightWave II (Biochrom, Cambridge, UK) by measuring cytochrome c reduction as described [25]. Lactate dehydrogenase was assayed spectrophotometrically with pyruvic acid as a substrate [26]. Protein content in enzyme preparations was determined using bicinchoninic acid assay [27].

6

Molecular mass determination 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Gel permeation chromatography was performed on a Superdex 200 HR 10/30 column (GE Healthcare) connected to a BioLogic Duo Flow liquid chromatograph (Bio-Rad). The column was equilibrated and run with 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.0, containing 150 mM NaCl at a flow rate of 0.7 mL min-1. The molecular mass of the purified SOX was evaluated after calibration of the column with protein standards (1.35, 17, 44, 158 and 670 kDa) purchased from Bio-Rad.

Electrophoresis SDS-PAGE was performed using 4% stacking and 10% resolving polyacrylamide gels according to a standard procedure [28]. Proteins were visualized by the Bio-Safe Coomassie Stain (Bio-Rad), gels were scanned by the computer program LabScan 5.00 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) and processed for images by Paint Shop Pro 8.00 (Jasc Software, Minnetonka, MN, USA).

MALDI-TOF peptide mass fingerprinting and post-source decay analysis Protein bands were excised from Coomassie-stained SDS-PAGE gels. MALDI-TOF peptide mass fingerprinting was conducted after a previous in-gel digestion of samples by modified trypsin [29]. The digestion additionally involved reduction and alkylation steps [30] and proceeded overnight at 37 °C. The instrument used was a Microflex LRF20 MALDI-TOF mass spectrometer (Bruker Daltonik, Bremen, Germany) [31]. The acquired spectra were processed by flexAnalysis 3.0 and Biotools 3.2 software (Bruker Daltonik). Database searches were performed against NCBInr (version available in November

2011) database using the program Mascot

(Matrix Science,

London,

UK;

http://www.matrixscience.com).

3. Results and discussion The aim of this work was to develop a protocol for the isolation of SOX from chicken liver as an inexpensive starting material resulting in the enzyme with a high purity allowing its use in bioanalytical applications. In the related literature, there are several purification methods for chicken

7

liver SOX available, which were reported in the 1960´s-1980´s. Those procedures were based on 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

chromatographic media, which have been gradually replaced by modern materials since that time. We were inspired by four such protocols [22-24, 32] involving a variety of extraction procedures (with or without using the acetone powder), ammonium sulfate precipitation and a few low-pressure chromatography steps. Kipke et al. [23] introduced dialysis of the enzyme against a buffered solution containing sodium molybdate (prior to ion-exchange chromatography), which reconstituted Modepleted enzyme molecules. The final SOX preparation (still with contaminants) was characterized by a specific activity value of 35.4 µmol min-1 mg-1 (= 590 nkat min-1 mg-1). Sullivan et al. [24] employed an affinity chromatography on cytochrome c-Sepharose as the terminal purification step, which increased the specific activity to a value of 75 µmol min-1 mg-1 (= 1250 nkat min-1 mg-1). It is worth mentioning at this place that the reported procedures relied on using fresh or frozen chicken livers. In our case, we were looking for a commonly available starting material such as chilled chicken livers from a local grocery store, which are usually kept at -1 oC for a maximal period of five days (personal communication). Such a material cannot be considered fresh when compared with the liver directly removed from a slaughtered animal but on the other hand it is easily accessible. To remove lipids, the livers were first homogenized in cold acetone. The acetone powder was then treated to obtain a buffered protein extract. At this stage, the specific activity could not be measured using cytochrome c as an electron acceptor, as the assay provided only negligible absorbance values. Following the original protocol by Kipke et al. [23], the extract was subjected to ammonium sulfate precipitation including a thermal denaturation step and then dialyzed. After this treatment, the specific activity reached a value of 5.9 nkat mg-1 (Table 1), which is in agreement with the ref. [23]. The dialyzate was loaded onto an ion-exchanger (Macro-Prep High Q) and after a linear gradient elution, the enzyme solution was collected and dialyzed as above. The subsequent separation on a highresolution Resource Q column is shown in Fig. 1, where the elution of protein fractions was monitored at 280 and 410 nm. The presence of SOX activity in a peak centered at the elution time of 23.3 min correlated well with the increased absorption at 410 nm (referring to a Soret peak of the hemecontaining cytochrome domain in SOX). Fig. 2 provides an overview of the protein composition of all enzyme preparations obtained during

8

the initial purification steps involving acetone powder extraction, ammonium sulfate precipitation, 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

low-pressure ion-exchange chromatography and medium-pressure ion-exchange chromatography. After SDS-PAGE, the most abundant protein components in individual samples were identified by MALDI-TOF peptide mass fingerprinting. In both crude extract and SOX preparation after the ammonium sulfate precipitation, there were enzymes from the degradation metabolism of saccharides registered as well as those from the detoxifying and utilization hepatic pathways (glutathione-Stransferase, catalase, glutamate dehydrogenase, IMP cyclohydrolase). Also betaine homocysteine methyltransferase (BHMT; EC 2.1.1.5) was found to be present in a high amount, which is in agreement with previous reports on its liver content [33] and a general knowledge of its physiological role [34]. Interestingly, the low-pressure ion-exchange chromatography on Macro-Prep High Q medium allowed obtaining L-lactate dehydrogenase (EC 1.1.1.27) or catalase (EC 1.11.1.6) in a high degree of purity. L-Lactate dehydrogenase appeared in the flow-through fraction (the specific activity with pyruvic acid as a substrate was 230 nkat mg-1), whereas catalase was eluted in the first peak coming with the increasing salt concentration in the eluate. Both catalase and L-lactate dehydrogenase are tetrameric proteins in the native state [35, 36]. As these two enzymes represent dominant proteins in the respective fractions and significantly differ from a majority of impurities in their molecular mass (Fig. 2), they could be further purified to a near homogeneity using gel permeation chromatography on Superdex 200 HR. Another possibility would reside in medium-pressure ionexchange chromatography on an anion exchanger. Nevertheless, both catalase and L-lactate dehydrogenase preparations obtained after the chromatography on Macro-Prep High Q already display a sufficient purity for their possible use in bioanalysis (functionalized beads, enzyme membranes, enzyme reactors, etc.). In this way, the present SOX purification procedure seems to be applicable for a parallel purification of other interesting enzymes. However, BHMT was still the major protein in fractions containing SOX activity after ionexchange chromatography (Fig. 2). BHMT is an oligomeric protein, most frequently reported to be a hexamer consisting of 45-kDa subunits [37], which gives a big difference in comparison with the reported molecular mass of chicken liver SOX. Therefore, a gel permeation chromatography on Superdex 200 HR was employed to remove BHMT from the SOX-containing solution collected

9

during the ion-exchange chromatography on Resource Q column (Fig. 3). SOX activity was 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

demonstrated in a peak centered at the elution time of 22.1 min when the absorption was monitored at 410 nm (Fig. 3, panel A). This elution time corresponded to a molecular mass estimate of 110-120 kDa in accordance with the literature [22]. The collected fraction was then separated by SDS-PAGE (Fig. 3, panel B). Among protein bands in the gel, SOX could be identified by MALDI-TOF peptide mass fingerprinting for the first time during the purification procedure (Fig. 4). Its migration time referred to a molecular mass estimate of 55 kDa per subunit. Nevertheless, BHMT was not eliminated completely and the SOX preparation still contained many impurities at this stage. Ceramic hydroxyapatite was chosen for the final purification. Elution of the hydroxyapatite-bound proteins was achieved by a linear gradient of phosphate concentration in the elution buffer. Interestingly, SOX was eluted both in the flow-through fraction and the first peak at the beginning of the linear gradient. This separation showed itself efficient in eliminating BHMT, which could be separated in a near homogeneity (see the SDS-PAGE gel in Fig. 5). This abundant contaminant remained in the SOX preparation only in traces; the other impurities were proteins with no interfering enzymatic activity (Fig. 5). The presence of a protein impurity with a molecular mass of around 40 kDa in final enzyme preparations has also been documented in previously published electropherograms [23]. Practically pure SOX could be obtained here by an additional gel permeation chromatography step on a BioSilect SEC 125-5 column (Bio-Rad). This was tested (not shown) but finally abandoned as it would compromise the final yield. In a typical preparative run, an amount of around 2000 nkat of highly purified SOX was obtained from 500 g of chicken liver, reflecting an overall yield of 21 % of the activity present in the dissolved and dialyzed ammonium sulfate precipitate (Table 1). We demonstrated that commonly available chilled chicken livers can be considered an adequate source for the isolation of SOX. Using our procedure, the enzyme could be obtained in a high purification degree with a specific activity of 200 nkat mg-1, which correlates with previously described results of other authors [23]. As a beneficial side outcome of the purification procedure, catalase, L-lactate dehydrogenase and also BHMT could be obtained in a highly purified form. SOX, catalase and L-lactate dehydrogenase have a potential for wide use in bioanalytical applications [20, 38] and the present method allows their routine preparation.

10

Acknowledgments 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

This work was supported by grants MSM 6198959216 (a Research Plan) and KONTAKT MEB040906 (within a bilateral scientific cooperation of Czech and Republic-Hungary) from the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic and by grant ED0007/01/01 Centre of the Region Haná for Biotechnological and Agricultural Research.

4. References [1] Hille R (1996) Chem Rev 96:2757-2816 [2] Feng C, Tollin G, Enemark JH (2007) Biochim Biophys Acta 1774:527-539 [3] Cabré F, Marín C, Cascante M, Canela EI (1990) Biochem Med Metab Biol 43:159-162 [4] Eilers T, Schwarz G, Brinkmann H, Witt C, Richter T, Nieder J, Koch B, Hille R, Hänsch R, Mendel RR (2001) J Biol Chem 276:46989-46994 [5] Oshino N, Chance B (1975) Arch Biochem Biophys 170:514-528 [6] Nowak K, Luniak N, Witt C, Wüstefeld Y, Wachter A, Mendel RR, Hänsch R (2004) Plant Cell Physiol 45:1889-1894 [7] Hänsch R, Lang C, Riebeseel E, Lindigkeit R, Gessler A, Rennenberg H, Mendel RR (2006) J Biol Chem 281:6884-6888 [8] Kappler U (2011) Biochim Biophys Acta 1807:1-10 [9] Sugio T, Katagiri T, Moriyama M, Zhen YL, Inagaki K, Tano T (1988) Appl Environ Microbiol 54:153-157 [10] D’Errico G, Di Salle A, La Cara F, Rossi M, Cannio R (2006) J Bacteriol 188:694-701 [11] Di Salle A, D’Errico G, La Cara F, Cannio R, Rossi M (2006) Extremophiles 10:587-598 [12] Kisker C, Schindelin H, Pacheco A, Wehbi WA, Garrett RM, Rajagopalan KV, Enemark JH, Rees DC (1997) Cell 91:973-978 [13] Schrader N, Fischer K, Theis K, Mendel RR, Schwarz G, Kisker C (2003) Structure 11:12511263

11

[14] Rudolph MJ, Johnson JL, Rajagopalan KV, Kisker C (2003) Acta Crystallogr Sect D-Biol 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Crystallogr 59:1183-1191 [15] Kappler U, Bailey S (2005) J Biol Chem 280:24999-25007 [16] Qiu JA, Wilson HL, Rajagopalan KV (2012) Biochemistry 51:1134-1147. [17] Svitel J, Stredansky M, Pizzariello A, Miertus S (1998) Electrophoresis 10:591-596 [18] Situmorang M, Hibbert BD, Gooding JJ, Barnett D (1999) Analyst 124:1775-1779 [19] Dinçkaya E, Sezgintürk MK, Akyilmaz E, Ertaş FN (2007) Food Chem 101:1557-1561 [20] Spricigo R, Dronov R, Lisdat F, Leimkühler S, Scheller FW, Wollenberger U (2009) Anal Bioanal Chem 393:225-233 [21] Garrett RM, Johnson JL, Graf TN, Feigenbaum A, Rajagopalan KV (1998) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 95:6394-6398 [22] Kessler DL, Rajagopalan KV (1972) J Biol Chem 247:6566-6573 [23] Kipke CA, Enemark JH, Sunde RA (1989) Arch Biochem Biophys 270:383-390 [24] Sullivan EP Jr, Hazzard JT, Tollin G, Enemark JH (1993) Biochemistry 32:12465-12470 [25] Cohen HJ, Fridovich I (1971) J Biol Chem 246:359-366 [26] Kim MJ, Whitesides GM (1988) J Am Chem Soc 10:2959-2964 [27] Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano MD, Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ, Klenk DC (1985) Anal Biochem 150:76-85 [28] Laemmli UK (1970) Nature 227:680-685 [29] Šebela M, Štosová T, Havliš J, Wielsch N, Thomas H, Zdráhal Z, Shevchenko A (2006) Proteomics 6:2959-2963 [30] Shevchenko A, Thomas H, Havliš J, Olsen JV, Mann M (2007) Nat Protoc 1:2856-2860 [31] Kowalska M, Galuszka P, Frébortová J, Šebela M, Béres T, Hluska T, Šmehilová M, Bilyeu KD, Frébort I (2010) Phytochemistry 71:1970-1978 [32] Brody MS, Hille R (1999) Biochemistry 38:6668-6677 [33] Wang J, Dudman NPD, Lynch J, Wilcken DEL (1991) Clin Chim Acta 204:239-249 [34] Pajares MA, Pérez-Sala D (2006) Cell Mol Life Sci 63:2792-2803 [35] Fita I, Rossmann MG (1985) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 82:1604-1608

12

[36] Grau UM, Trommer WE, Rossmann MG (1981) J Mol Biol 151:289-307 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

[37] Evans JC, Huddler DP, Jiracek J, Castro C, Millian NS, Garrow TA, Ludwig ML (2002) Structure 10:1159-1171 [38] Scheller F, Siegbahn N, Danielsson B, Mosbach K (1985) Anal Chem 57:1740-1743

13

Table 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Purification of sulfite oxidase from 500 g of chilled chicken liver.

Purification

Volume

Total

Total

Specific

Enrichment

Yield (%)

step

(mL)

activity

protein

activity

factor

(nkat)

(mg)

(nkat/mg)

110

9800

1660

5.9

1

100

High Q

10b

6200

470

13.2

2.2

63

Resource Q

10b

3500

160

21.9

3.7

36

5b

3100

45

68.9

11.7

32

2b

2100

11

190.9

32.3

21

Dialyzate after (NH4)2SO4 precipitationa

Macro-Prep

Superdex

200

HR

Ceramic hydroxyapatitec

Footnotes: a

Activity could not be detected in the initial extract

b

Volume of the enzyme solution volume after ultrafiltration

c

Combined flow-through fraction and the first peak at the beginning of the gradient

14

FIGURE LEGENDS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

Figure 1 Ion-exchange chromatography of chicken liver SOX on a Resource Q column. The partially purified enzyme from the low-pressure ion-exchange chromatography (Macro-Prep High Q) was separated at a flow rate of 1 mL min–1. The column was equilibrated with 25 mmol L-1 Tris-HCl buffer, pH 8.0. Elution was performed by a linear gradient of 25 mM Tris-HCl, pH 8.0, containing 1 M NaCl. SOXcontaining fractions were collected in a peak centered at the elution time of 23.3 min (indicated by an arrow). Solid line: absorption at 280 nm; thick solid line: absorption at 410 nm; dashed line: conductivity (referring to the salt gradient).

Figure 2 SDS-PAGE of protein samples from the initial purification steps of chicken liver SOX. From the left, there is the protein marker shown (↓ 97, 66, 45, 30 and 20.1 kDa) and the following samples: I – crude extract (30 µg of protein were loaded), II – dissolved and dialyzed ammonium sulfate precipitate (25 µg), III – 2nd peak eluted from Macro-Prep High Q (12 µg), IV – the flow-through fraction from Macro-Prep High Q (10 µg), V – 1st peak eluted from Macro-Prep High Q (10 µg), VI – the active fraction eluted from Resource Q (see Fig. 1; 12 µg; anticipated position of a SOX band is labeled). Selected results of MALDI-TOF peptide mass fingerprinting are indicated as follows: A – aldolase B, B – similar to betaine homocysteine methyltransferase, C – catalase, E – enolase 1, F- ferritin, G – glutamate dehydrogenase, GA – glyaceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GS – glutathione-Stransferase, I – IMP cyclohydrolase + serum albumin, Ig – Igy-Fc 3-4 fragment, L – L-lactate dehydrogenase B and A, M – malate dehydrogenase 2, P – phosphoglycerate mutase 1, R – calreticulin, T – triose phosphate isomerase.

Figure 3 Gel permeation chromatography of chicken liver SOX on a Superdex 200 HR 10/30 column. (A) The partially purified enzyme from the ion-exhange chromatography on Resource Q (see Fig. 1) was separated at a flow rate of 0.7 mL min–1. The column was equilibrated and run with 25 mmol L-1 TrisHCl buffer, pH 8.0, containing 2.5 mmol L-1 sodium molybdate. SOX-containing fractions were collected in a peak centered at the elution time of 22.1 min (indicated by an arrow). Solid line: absorption at 280 nm; dashed line: absorption at 410 nm. (B) SDS-PAGE of a SOX sample (10 µg) after the gel permeation chromatography. From the left, the gel shows the protein marker (↓ 97, 66, 45, 30 and 20.1 kDa) and the enzyme sample. Arabic numerals denote protein composition of the sample as determined by MALDI-TOF peptide mass fingerprinting: 1 – spectrin α-chain; 2 – a vinculin family protein gi|63880; 3 – acylamino-acid-releasing enzyme; 4 – similar to LOC446287 protein + thioredoxin reductase 3 + serum albumin; 5 – SOX; 6 – peroxisomal acyl-coenzyme A oxidase 1; 7, 8

15

- similar to betaine homocysteine methyltransferase; 9 - similar to MGC82230 protein (an 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65

amidohydrolase); 10 – similar to TruB pseudouridine synthase like protein 1; 11 – phosphoglycolate phosphatase; 12 – proteasome subunit beta; 13 – similar to Prdx3 protein, 14 - not identified.

Figure 4 MALDI-TOF peptide mass fingerprinting of purified chicken liver SOX. A sample of the enzyme was resolved by SDS-PAGE and then subjected to in-gel digestion by modified bovine trypsin at 37 °C overnight. Then MALDI-TOF mass spectra of the digest were recorded using CHCA matrix. A typical peptide map is shown, which matches the sequence deposited in the NCBInr database (gi|3212610). Matched peptides covered 58 % of the sequence.

Figure 5 SDS-PAGE of protein fractions obtained during the chromatography on a Bio-Scale CHT5-I ceramic hydroxyapatite column. The enzyme from the previous gel permeation chromatography on Superdex 200 HR was further separated. From the left, the gel shows the protein marker (↓ 97, 67, 45, 30 and 20.1 kDa) and the following samples: 1st (I), 2nd (II), 3rd (III) and 4th (IV) fraction from the hydroxyapatite chromatography. The fractions refer to the elution times of 3.5, 7.5, 8.0 and 10.4 min and the protein loads were of 2; 2.5; 4 and 2 µg, respectively. MALDI-TOF peptide mass fingerprinting provided the following results: I/1, II/2 and III/4 – SOX; I/2, III/6, IV/1, IV/2 and IV/3 – similar to betaine homocysteine methyltransferase; I/3, II/3, III/7 – similar to MGC82230 protein (an amidohydrolase); I/4, II/5, III/9 – phosphoglycolate phosphatase; II/1, III/3 – serum albumin; II/4, III/8 – similar to TruB pseudouridine synthase like protein 1; III/1 – spectrin α-chain; III/2 – a vinculin family protein gi|63880; III/5 – peroxisomal acyl-coenzyme A oxidase; III/10 – similar to Prdx3 protein; III/11 – a hypothetical protein gi|118084997; IV/4 – not identified by MALDI-TOF peptide mass fingerprinting.

16

Figures Click here to download Figure: 120228_Sebela_The_Protein_Journal_submission_figures.ppt

Pečová et al., Fig. 1

100

80

3.0

60 2.0 40 1.0

20

0.0

0 15

20

25 30 Elution time (min)

35

40

Conductivity (mS)

Absorbance (280 or 410 nm)

4.0



A

B

0.30

0.08

0.06 0.20 0.15

0.04

0.10 0.02 0.05 0.00

0 10

15

20

25

Elution time (min)

30

35

Absorbance (410 nm)

Absorbance (280 nm)

0.25


2231.14

Relative intensity

1.0

2110.13

0.8

0.6

2832

1356.86 1384.86

2086.97

0.4

3079.41 1565.92

0.2

0.0 500

3122.65

827.47 910.48

1000

2767.29 2519.11

1500

2000

2500

Mass (m/z)

3000

3500

4000


UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI. Přírodovědecká fakulta Katedra Biochemie

Recommend Documents