UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI. Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie

Dehydrosilybin jako protonofor: vztah struktury k biologické aktivitě

DIPLOMOVÁ PRÁCE

Autor:

Hana Popelková

Studijní program:

N1406 Biochemie

Studijní obor:

Biochemie

Forma studia:

Prezenční

Vedoucí práce:

doc. Mgr. Martin Modrianský, Ph.D.

Termín odevzdání práce: duben 2011

„Prohlašuji, že jsem předloženou diplomovou práci vypracovala samostatně za použití citované literatury.“

V Olomouci dne .............................

-2-

Chtěla bych na tomto místě poděkovat svému školiteli doc. Mgr. Martinovi Modrianskému Ph.D. za rady a pomoc při vypracování mé diplomové práce, Ing. Evě Gabrielové Ph.D. za cenné rady a poskytování buněk na experimenty. Mgr. Martinovi Jabůrkovi za významnou pomoc a odborné rady při práci s oxygrafem a Ing. Radkovi Gažákovi, Ph D. za poskytnuté deriváty dehydrosilybinu. Dále bych také chtěla poděkovat všem pracovníkům Ústavu lékařské chemie a biochemie LF UP Olomouc za to, že mi umožnili vypracovat diplomovou práci na svém pracovišti. Tato práce vznikla za finanční podpory výzkumného záměru MSM6198959216 a grantu LF_2010_022.

-3-

Bibliografická identifikace:

Jméno a příjmení autora

Bc. Hana Popelková

Název práce

Dehydrosilybin jako protonofor: vztah struktury k biologické aktivitě

Typ práce

Diplomová

Pracoviště

Ústav lékařské chemie a biochemie Univerzity Palackého v Olomouci

Vedoucí práce

doc. Mgr. Martin Modrianský, Ph.D.

Rok obhajoby práce

2011

Abstrakt

Dehydrosilybin je jedním z flavonolignanů obsažených v extraktu ze semen ostropestřce mariánského, který vykazuje významné cytoprotektivní účinky. Tyto jsou přisuzovány

schopnosti

flavonolignanů

působit

jako

antioxidanty. Dehydrosilybin snižuje produkci kyslíkových radikálů

v mitochondriích,

přičemž

vykazuje

účinky

podobné odpřahovačům oxidativní fosforylace spíše než jednoduché vychytávání radikálů. Naše data naznačují, že dehydrosilybin není skutečným ionoforem podobně jako CCCP, ale podobné účinky zřejmě souvisí s jeho interakcí s mitochondriálními proteiny. V této interakci jsou důležité hydroxylové

funkční

skupiny

přítomné

v molekule

dehydrosilybinu, naše data poukazují na obzvláštní důležitost -OH skupiny v pozicích 3 a 7. Na základě těchto dat je vytvořena hypotéza o přenosu H+ iontů přes mitochondriální membránu s pomocí dehydrosilybinu. Klíčová slova

Liposomy, mitochondrie, kardiomyocyty, dýchací řetězec, polyfenoly, odpřažení, reaktivní kyslíkové formy

Počet stran

77

Počet příloh

0

Jazyk

Český

-4-

Bibliographical identification: Author’s first name and

Bc. Hana Popelková

surname Title

Dehydrosilybin as a protonophore: structure activity relationship.

Type of thesis

Diploma

Department

Department of Medical Chemistry and Biochemistry of University Palacky in Olomouc

Supervisor

doc. Mgr. Martin Modrianský, Ph.D.

The year of presentation

2011

Abstract

Dehydrosilybin is one of flavonolignans present in the Silybum Marianum seed extract, which displays significant cytoprotective activity. This cytoprotective activity is linked to the tentative antioxidant activity of flavonolignans. Dehydrosilybin lowers the production of oxygen radicals in mitochondria while it shows uncoupler-like activity rather than simple radical scavenging. Our data shows that dehydrosilybin is not a true ionophore resembling CCCP, but its uncoupler-like activity is probably linked to its interaction with mitochondrial proteins. Important role in this interaction play hydroxyl groups present in the dehydrosilybin molecule, our data point to a particular role of –OH groups in positions 3 and 7. Based on the data a hypothesis on H+ ions transfer across

mitochondrial

membrane

mediated

dehydrosilybin is presented. Keywords

mitochondria, respiratory chain, polyphenol, uncoupling, reactive oxygen species

Number of pages

77

Number of appendices

0

Language

Czech

-5-

by

OBSAH 1

CÍLE PRÁCE................................................................................................................- 7 -

2

ÚVOD...........................................................................................................................- 8 -

3

TEORETICKÁ ČÁST...................................................................................................- 9 3.1

Mitochondrie....................................................................................................- 9 -

3.2

Elektrontransportní řetězec a oxidativní fosforylace......................................- 11 Komponenty dýchacího řetězce.......................................................- 11 -

3.2.2

ATP-synthasa a chemiosmotická teorie...........................................- 18 -

3.3

Produkce reaktivních kyslíkových radikálů mitochondriemi...........................- 19 -

3.4

Endogenní enzymatická ochrana buňky proti ROS.......................................- 24 -

3.5

Endogenní neenzymatická ochrana buňky proti ROS...................................- 26 -

3.6

Exogenní neenzymatická ochrana buňky proti ROS.....................................- 28 -

3.7 4

3.2.1

3.6.1

Vitamíny............................................................................................- 28 -

3.6.2

Polyfenoly.........................................................................................- 29 -

3.6.3

Odpřahovače (uncouplery)...............................................................- 31 -

Patologie ischemicko-reperfuzniho poškození..............................................- 32 -

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST.........................................................................................- 35 4.1

4.2

4.3

Materiály........................................................................................................- 35 4.1.1

Biologický materiál............................................................................- 35 -

4.1.2

Kultivační média, roztoky, pufry a sonda..........................................- 35 -

4.1.3

Silybin, 2,3-dehydrosilybin a jeho deriváty........................................- 36 -

Metody...........................................................................................................- 37 4.2.1

Příprava malých unilamelárních liposomů........................................- 37 -

4.2.2

Zhodnocení potenciálu na membráně liposomů...............................- 37 -

4.2.3

Izolace srdečních mitochondrií.........................................................- 38 -

4.2.4

Stanovení bílkovin metodou Bradfordové.........................................- 38 -

4.2.5

Zhodnocení mitochondriálního transmembránového potenciálu......- 39 -

4.2.6

Respirometrie s vysokým rozlišením (HRR).....................................- 41 -

4.2.7

Kultivace buněčných linií..................................................................- 41 -

4.2.8

Stanovení počtu buněk.....................................................................- 41 -

4.2.9

Zhodnocení membránového potenciálu na celých buňkách.............- 42 -

Výsledky........................................................................................................- 43 4.3.1

Zhodnocení potenciálu na membráně liposomů...............................- 43 -

4.3.2

Zhodnocení mitochondriálního transmembránového potenciálu......- 44 -

4.3.3

Respirometrie s vysokým rozlišením (HRR).....................................- 48 -

4.3.4

Zhodnocení membránového potenciálu na celých buňkách.............- 53 -

5

DISKUZE....................................................................................................................- 59 -

6

ZÁVĚR.......................................................................................................................- 61 -

7

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK............................................................................- 65 -

8

SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY............................................................................- 67 -

-6-

1 CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE 1.1

Shrnout základní poznatky o dýchacím řetězci mitochondrií a tvorbě reaktivních kyslíkových forem v mitochondriích

1.2

Shrnout poznatky o endogenní a exogenní ochraně buňky a antioxidační aktivitě polyfenolů

1.3

Otestovat, zda je dehydrosilybin pravým protonoforem

1.4

S využitím methylovaných derivátů 2,3-dehydrosilybinu zjistit, která –OH skupina této sloučeniny je odpovědná za její chování podobné protonoforům

-7-

2 ÚVOD Diplomová práce se zabývá biologickými účinky dehydrosilybinu, polyfenolu, který snižuje produkci kyslíkových radikálů a ovlivňuje membránový potenicál mitochondií. Za použití tří systémů: liposomů, mitochondrií a celých buněk jsme se pokusili navrhnout hypotézu mechanismu, kterým dehydrosilybin dovoluje přenos H+ iontů přes vnitřní

mitochondriální

membránu

a

popsat

důležitost

hydroxylových

skupin

dehydrosilybinu, které jsou v tomto procesu zapojeny. Mitochondrie jsou významným fyziologickým zdrojem reaktivních kyslíkových radikálů (ROS), které způsobují oxidační poškození biolomekul, mají vliv na stárnutí buněk a jsou jednou z možných příčin vzniku a rozvoje mnoha onemocnění typu Parkinsonovy

choroby,

Alzheimerovy

choroby,

revmatických

onemocnění,

aterosklerozy, diabetes mellitus a ischemických chorob srdečních. Kardiomyocyty ve velké míře využívají mitochondrie jako zdroj energie pro neutuchající kontrakce srdečního svalu. Jsou tedy vystaveny poškozujícím účinkům ROS, především během reperfuze. Ischemická choroba srdeční je příčinou takřka třetiny úmrtí v České republice. Další příčinou úmrtí jsou kardiovaskulární komplikace, provázející řadu kardiochirurgických výkonů. Ochrana srdce proti ischemicko-reperfuznímu poškození může být zajištěna pre- nebo post-conditioningem, ve kterém hrají důležitou roli právě ROS. Modulovat tvorbu ROS je možné v podstatě dvěma mechanismy, a to slabým odpřažením buněčného dýchání nebo inhibicí dýchacího řetězce. Flavonolignany silybin a dehydrosilybin, které patří mezi polyfenoly, vykazují antioxidační vlastnosti. Dehydrosilybin snižuje tvorbu ROS a v kardiomyocytech působí jako slabý odpřahovač. Chemické odpřažení v podstatě napodobuje ischemický preconditioning. Nízké koncentrace polyfenolů dosažené v krevní plazmě na základě konzumace potravin s potřebným obsahem polyfenolů mohou vyvolat stejné kardioprotektivní účinky jako syntetické odpřahovače oxidativní fosforylace dinitrofenol (DNP) nebo fluorofenylhydrazon (FCCP).

-8-

3 TEORETICKÁ ČÁST

3.1

Mitochondrie Mitochondrie (Obr. 1) jsou organely, které byly poprvé popsány na konci 19.

století. Vyskytují se téměř ve všech typech buněk rostlin i živočichů (u člověky jsou vyjímkou např. erytrocyty), a téměř u všech eukaryotních mikroorganismů. Velikost a tvar mitochondrií je proměnlivý a značně závislý na jejich původu a metabolickém stavu. Obvykle mají elipsoidní tvar a délka se pohybuje v rozmezí 0,5 - 10 µm. (Voet & Voetova, 1995) Uvnitř buňky vytvářejí mitochondrie dynamickou síť a pomocí speciálních proteinů je regulována rovnováha mezi spojováním (fusion) a dělením (fission) mitochondrionu v závislosti na momentálním stavu buňky. (Benard et al., 2007) Počet mitochondrií v buňce je také velmi rozdílný, od 20 do 0,5 milionu. (Vodrážka, 2007) Orgány bohaté na mitochondrie jsou např. srdce a játra. Mitochondrie jsou vytvořeny z vnitřní a vnější membrány, které mají klíčovou roli v mitochondriálních

dějích.

Tyto

membrány

vytvářejí

dva

oddělené

prostory

v mitochondrii, velký vnitřní prostor zvaný matrix a užší mezimembránový prostor. Přibližně polovina mitochondriálních proteinů je tkáňově specifická (Mootha et al., 2003) Vnější mitochondriální membrána je tvořena z 50 % fosfolipidy a z 50 % proteiny. Je charakteristická velkým množstvím kanálotvorného proteinu porinu a vyznačuje se vysokou permeabilitou pro všechny molekuly až do velikosti okolo 5000 daltonů, je tedy téměř chemicky ekvivalentní cytosolu. Dalšími proteiny, které se vyskytují ve vnější membráně, jsou enzymy mitochondriální syntézy lipidů a enzymy, které přeměňují lipidy na formy, které jsou pak metabolizovány v matrix. Vnější membrána je nepropustná pro proteiny. Pro přenos proteinů do mezimembránového prostoru mitochondrie jsou zde TOM a SAM komplexy. Oproti tomu vnitřní mitochondriální membrána je tvořena z fosfolipidů jen asi z 24 % a proteiny z 76 %. Vnitřní membrána vytváří početné vchlípeniny nazývané kristy, které výrazně zvětšují její povrch (Alberts et al., 2002). Charakteristickým lipidem vnitřní mitochondriální membrány je kardiolipin (bisfosfatidylglycerol), který představuje asi 20 % z celkového množství lipidů. Na vnitřní mitochondriální membráně jsou lokalizovány proteiny transportu elektronů, dále ATP-synthasa a transportní proteiny umožňující transport metabolitů mezi matrix a cytosolem (Voet & Voetová 1995).

-9-

Vnitřní membrána je selektivně propustná pouze pro některé látky, jejichž vstup zajišťují specifické přenašeče. Např. pro transport proteinů jsou známé TIM 23 a TIM 22 komplexy, které zajišťují transport proteinů z cytosolu pocházející z jaderné DNA a jejich zabudování do vnitřní membrány mitochondrie, a OXA komplex, který zabudovává do vnitřní membrány proteiny syntetizované v matrix mitochondrie z mitochondriální DNA (mt-DNA). Matrix mitochondrie obsahuje vysoce koncentrovanou směs enzymů, z nichž důležitou roli v metabolismu zaujímají enzymy oxidace pyruvátu a mastných kyselin a enzymy katalyzující reakce citrátového cyklu. Dále je v matrix v několika kopiích lokalizovaná mitDNA, kódující u člověka sekvenci dvou rRNA, 22 tRNA genů a 13 genů kódujících proteiny, které jsou podjednotkami proteinů dýchacího řetězce. Jsou to: cytochrom c oxidasa, NADH-dehydrogenasa, koenzym Q a ATP-synthasa. Mitochondrie

jsou

místem

oxidačního

metabolismu

eukaryot.

Buňka

prostřednictvím oxidativní fosforylace získává asi 90 % energie potřebné pro metabolické pochody. Na rozdíl od glykolýzy, kterou se produkuje asi jen 10 % energie. Oxidativní fosforylace je sice vývojově mladší děj, zato více účinný. Mitochondrie hrají důležitou roli i z hlediska programované buněčné smrti. Jsou také místem produkce volných kyslíkových radikálů, které významně ovlivňují stárnutí a délku buněčného života (Skulachev, 2007).

Vnější membrána Vnitřní membrána matrix

Kristy

Mezimebránový prostor Obrázek 1. Reprezentační elektronový fotomikrograf neporušené mitochondrie. (Upraveno podle (Chuang, 2010)).

- 10 -

3.2

Elektrontransportní řetězec a oxidativní fosforylace Život vyšších organismů je absolutně závislý na přísunu kyslíku. Kyslík je

využíván při respiraci, což je děj, při němž buňky získávání energii ve formě ATP (Murray et al., 2002). Složky elektrontransportního řetězce (ETCH) jsou zanořeny do vnitřní mitochondriální membrány, která musí být neporušená. Elektrony do dýchacího řetězce jsou přinášeny molekulami NADH a FADH2, které pocházejí z citrátového cyklu, kde dochází k jejich redukci. Elektrony pak řadou oxidačně-redukčních reakcí procházejí ETCH a jsou přeneseny na molekulární kyslík, který redukují na vodu. Energie, která se uvolňuje při tomto ději, je využita na čerpání protonů do mezimembránového prostoru. Takto je vytvořen protonový gradient, který je využit jako pohon pro tvorbu ATP pomocí ATP-synthasy (Luzikov, 2009). Požadavky na spřažení transportu protonů a elektronů s oxidativní fosforylací byly vysloveny ve 2. polovině 20. století v chemiosmotické teorii (Mitchell, 1961). Respirační řetězec savčích mitochondrií je sestaven z více než dvaceti samostatných nosičů elektronů, které jsou seskupeny do čtyř polypeptidových komplexů. Tři z nich I., III. a IV. komplex fungují jako protonová pumpa ženoucí protony během postupu redukčních ekvivalentů ve směru zvyšujícího se redoxního potenciálu. Sekvence a struktura těchto komplexů je již objasněna (Nicholls & Ferguson, 1992).

3.2.1 Komponenty mitochondriálního dýchacího řetězce Elektrony v dýchacím řetězci jsou přenášeny mezi komplexy směrem od nižších k vyšším standardním redukčním potenciálům v rozsahu 1,1 V, a to z páru NAD+ /NADH na pár O2/H2O. Většina reakcí v dýchacím řetězci je reversibilní. Aktuální potenciál Eh redoxního páru musí mít přibližně stejnou hodnotu jako standardní potenciál Em. Počáteční transfer elektronů z citrátového cyklu do ETCH zprostředkovává kofaktor NADH/NAD+, který je dostatečně mobilní a může tedy pendlovat mezi matrixovými dehydrogenasami citrátového cyklu a respiračním řetězcem ukotveným na vnitřní mitochondriální membráně. Em redoxního páru je -320 mV. Některé

dehydrogenasy,

jako

sukcinátdehydrogenasa,

s,n-glycerolfosfát

dehydrogenasa a elektrony-transferující flavoprotein, mají standardní potenciál blízký 0 mV. Přímá redukce NAD+ není z termodynamického hlediska možná a tyto enzymy přenáší elektrony do dýchacího řetězce přímo a z toho důvodu musejí být ukotveny v membráně. (Obr. 2) Redoxní přenašeče ETCH jsou: flavoproteiny, ty mají vázané jako prostetickou skupinu FAD a FMN a podstupují (2H+ + 2e-) redukci. Cytochromy s porfyrinem jako prostetickou skupinou podstupují jednoelektronové redukce stejně jako Fe-S proteiny

- 11 -

(nehemové železo), ubichinon, volný, v tucích rozpustný kofaktor, podstupuje v ETCH redukci (2H+ + 2e-) a v poslední řadě proteinově vázaná měď je redukována z Cu2+ na Cu+ (Nicholls & Ferguson, 1992). Elektrony v ETCH se pohybují od negativnějších potenciálů k pozitivnějším ve sledu redoxních systémů a energie je uvolňována postupně, po částech. Část energie je využita k syntéze ATP, zbytek se uvolňuje ve formě tepla. Postupného uvolňování energie je dosaženo průchodem elektronů a protonů přes enzymové komplexy oxidoreduktas, které mají stoupající hodnoty redoxního potenciálu od hodnoty -0,32 V (vstup aktivovaných atomů kyslíku) po hodnotu + 0,82 V (redoxní potenciál kyslíku) (Voet & Voetová 1995). Tyto komplexy označujeme jako: - komplex I (NADH-UQ oxidoreduktasa) - komplex II (sukcinátdehydrogenasa) - komplex III (UQ-cytochrom c oxidoreduktasa) - komplex IV (cytochrom c oxidasa) Tyto čtyři enzymatické komplexy jsou pevně zakotveny ve vnitřní mitochondriální membráně. Volně pohyblivé přenašeče v ETCH jsou ubichinon (UQ), redukovaná forma ubichonol (QH2) též nazývaný koenzym Q (u savčích mitochondrií UQ10) a ve vodě rozpustný cytochrom c pohybující se v mezimembránovém prostoru (Nicholls & Ferguson, 1992).

Obrázek 2. Schéma mitochondriálního řetězce transportu elektronů znázorňující přenos elektronů +

+

(červeně) a pumpování protonů (modře). NAD a FAD jsou redukovány v citrátovém cyklu na NADH a FADH2 (nevyobrazeno). V procesu oxidativní fosforylace, procházejí elektrony z NADH (a FADH2) elektron-transportním řetězcem na koncový akceptor – kyslík, který redukují na vodu. Při transportu elektronů je generován gradient protonů přes vnitřní mitochondriální membránu, který je využit k pohonu tvorby ATP pomocí ATP-synthasy. QH2 a Q označují ubichinol a ubichinon (Upraveno podle (Sun et al., 2005))

- 12 -

Komplex I (NADH-UQ oxidoreduktasa, EC 1.6.5.3) Komplex I je největší a nejméně prostudovaná komponenta mitochondriálního dýchacího řetězce, skládá se ze dvou domén ve tvaru L. Hydrofobní doména je zakotvena v membráně a je orientována paralelně, jeho hydrofilní část zasahuje do matrix. Komplex I je složen z více než třiceti polypeptidů a redoxní centrum obsahuje jednu molekulu flavinu FMN a až sedm Fe/S center (Chen et al., 2009). Komplex I katalyzuje přenos dvou elektronů z NADH, které pochází z citrátového cyklu, na ubichinon v reakci, která je spjatá s translokací protonů přes membránu. Stechiometrie translokace je 4H+/2e-. Tento přenos je inhibován rotenonem a piericidinem A. Čtyři Fe/S centra, označována jako N-1, N-2, N-3 a N-4, byla objevena v mitochondriích hovězího srdce a vláknité plísně Neurospora crassa. N-1 je 2Fe/2S, zbylé tři jsou 4Fe/4S centra. Standardní redoxní potenciál centra N-2 je v rozmezí od 20 do –160 mV (v závislosti na zdroji komplexu), ostatní jsou více negativní: -330mV (N-1), -230 mV (N-3) a -300 mV (N-4) (naměřené hodnoty pro N. crassa). Vzhledem k naměřeným hodnotám Em by mohl být tok elektronů v pořadí NADH →FMN→N→FMN→N1→N4→N3→N2→UQ. →N4→N3→N2→UQ (Brand et al., 2004). (Obr. 3)

Obrázek 3. Topologické zobrazení mitochondriálního komplexu I se znázorněním toku elektronů. Obrázek znázorňuje tok elektronů mitochondriálním komplexem I z NADH přes FMN a Fe/S centra (N1N6) na ubichinon (CoQ) (Převzato od(Lenaz & Genova, 2010)).

- 13 -

Komplex II (sukcinátdehydrogenasa, EC 1.3.5.1) Kromě komplexu I jsou elektrony na UQ přenášeny ještě dalšími třemi cestami. Jednou z nich je komplex II, který přebírá elektrony ze sukcinátu; druhou je ETF (electron-transfering flavoprotein) dodávající elektrony z FADH2, vzniklého při β-oxidaci mastných kyselin a třetí způsob transportu elektronů je prostřednictvím enzymu snglycerolfosfátdehydrogenasy. První dvě cesty jsou lokalizovány na matrixové straně membrány, poslední z nich se nachází na cytosolové straně membrány. Standardní redoxní

potenciál

elektronů

v těchto

třech

případech

je

blízký

0

mV

a

z termodynamického hlediska tak nedochází k translokaci protonů (Nicholls & Ferguson, 1992). Komplex II je opět sestaven z několika polypeptidů. Dva největší představují dimer sukcinátdehydrogenasy. Další menší podjednotky obsahují kovalentně vázaný FAD, jedno centrum 2Fe/2S, jedno centrum 4Fe/4S a jedno 3Fe/4S. Na menší polypeptid

je

asociován

cytochrom

b560

v ekvimolárním

množství

s FAD.

Předpokládan postup elektronu je ve směru FADH2→2Fe/2S →4Fe/4S →3Fe/4S→ →cyt b→ →UQ (Chen et al., 2009).(Obr.4)

Obrázek 4. Struktura mitochondriálního komplexu II. se znázorněním toku elektronů Stužkový model komplexu II je navrstven na poloprůhledném molekulárním modelu tohoto komplexu. Modře je znázorněn FAD vazebný protein (Fp), béžově je zobrazen Fe-S protein, oranžově a růžově jsou znázorněny transmembránové proteiny CybL a CybS. Část komplexu zanořená do membrány je znázorněna šedým páskem. Na pravé straně je zobrazen tok elektronů od FAD přes [2Fe-2S], [4Fe-4S], [3Fe-4S] centra a hem b na ubichinon (UQ) spolu se vzdálenostmi a redoxním potenciálem. Tok elektronů je naznačen šipkami (Převzato od (Sun et al., 2005)).

- 14 -

Komplex III (cyt bc1 komplex nebo UQ-cytochrom c oxidoreduktasa, EC 1.10.2.2) Komplex III katalyzuje transfer elektronů z UQ na cytochrom c a reakce je spojena s translokací protonu. Komplex III byl nalezen rovněž v mnoha bakteriích a je v mnoha ohledech podobný plastochinol-plastocyanin-oxidoreduktase nebo cytochrom bf komplexu. Cyt bc1 komplex je složen ze tří polypeptidových řetězců nesoucích redoxní skupiny, Fe-S proteiny, zvané Rieskeho protein po jeho objeviteli, dále cyt c1 a cyt b. Rieskeho protein obsahuje 2Fe/2S klastr připojený k polypeptidu chelatací jednoho Fe ke dvěma cysteinovým residuím a druhého Fe ke dvěma histidinovým residuím. Cytochrom c1 a Rieskeho protein jsou lokalizovány na cytosolové straně membrány. Cytochrom b je transmembránový protein a váže dva hemy. Jeden hem b566, Em -100 mV, je lokalizován na cytosolové straně membrány. Druhý hem b560, Em +50 mV, je umístěn na matrixové straně membrány. Komplex III katalyzuje přenos elektronů z ubichinolu na cytochrom c, spojený s translokací protonů dějem zvaným Q cyklus. Pro vysvětlení můžeme Q cyklus rozdělit do tří kroků. Krok 1: oxidace UQH2 na radikál UQ•- (Qo) První elektron z UQH2 je transferován na Rieskeho protein, 2 protony jsou uvolněny do cytoplasmy a vzniká semichinonový radikál UQ•– na vazebném místě Qo v blízkosti cytosolové strany membrány. Druhý elektron je transferován na hem b566 na cytosolové straně. Elektron přijatý Rieskeho proteinem je předán na cyt c1, cyt c a cytochrom oxidasu. Krok 2: redukce UQ na UQ•- (Qi), Em pro UQ•-/UQ je -160 mV Hem b566 (Em -100 mV, cytosolová strana) odevzdá elektron na hem b560 (Em +50 mV, matrixová strana) navzdory protikladnému membránovému potenciálu ∆Ψ 150 mV. Druhé chinonové vazebné místo, Qi, je v blízkosti hemu b560. Váže UQ, který •přijímá elektron z redukovaného hem b560 za tvorby semichinonového radikálu UQ . Vzhledem k hodnotě Em redoxního páru UQ.-/UQ se tento děj jeví termodynamicky •neuskutečnitelný. Afinita vazebného místa pro UQ je však vyšší než pro UQ, 300x násobný rozdíl ve vazebné energii posunuje aktuální redox potenciál U UQ

•-

/UQ do

pozitivnější hodnoty. Krok 3: redukce UQ•- na UQH2 (Qi) Případ, kdy je obsazené místo semichinonovým radikálem v vazebném místě Qi. ve druhé části cyklu (Obr. 5) je druhá molekula UQH2 oxidovaná v Qo vazebném

- 15 -

místě a opakuje se Krok 1 (jeden elektron na cyt c1 a druhý na hem b560 •prostřednictvím hemu b566). Tento druhý elektron dokončuje redukci UQ na UQH2 a z matrix přijímá dva protony a UQH2 se vrací do chinonového poolu a cyklus je dokončen (Trumpower, 1990).

Obr.5 Q-cyklus. Komplex III se skládá z Fe-S proteinů a dvou typů cytochromu b: bL a bH. V modelu Qcyklu jsou vyznačena dvě vazebná místa pro ubichinon, Qo ( cytosolová strana) a Qi (matrixová strana). První elektron je přenesen z ubichinolu přes Fe-S protein na cytochrom c, druhý elektron je přenesen nejprve na cytochrom bL z, něj na cytochrom bH a poté na ubichinon (Q), nebo semiubichinonový aniont •-

UQ (nevyznačen) na vazebném místě Qi. Během jednoho kompletního Q cyklu se oxiduje jedna molekula ubichinolu na ubichinon, dvě molekuly cytochromu c se redukují, dva protony jsou zpotřebovány z mytrixové strany a do mezimembránového prostoru jsou uvolněny čtyři protony. (Upraveno podle (Mulkidjanian, 2005)).

- 16 -

komplex IV (cytochrom c oxidasa, EC 1.9.3.1) Komplex III přenáší elektrony na cyt c. Cyt c je periferní protein lokalizovaný na vnější straně vnitřní mitochondriální membrány. Obsahuje jeden asymetricky uložený hem, který je větší částí skryt v hydrofobní štěrbině a jeden jeho kraj je exponovaný do roztoku, kde se nachází skupina lysinových residuí (konkrétně 13, 86 a 87), která jsou zodpovědná za transfer elektronu jak na, tak z hemu. U mitochondrií je cyt c redukován bc1 komplexem a oxidován cytochrom c oxidasou. Finálním krokem elektron-transportního řetězce v mitochondriích je transfer čtyř elektronů z redukovaného cyt c na pool O2 za vzniku H2O, který je katalyzován enzymem cytochrom c oxidasou: O2 + 4e- + 4H+ → 2H2O Cytochrom c oxidasa (Obr. 6) pracuje jako protonová pumpa o stechiometrii 1H+/e-. Struktura cytochrom c oxidasy je velice komplikovaná. Obsahuje spektrálně odlišné hemy a, hem a a hem a3 a alespoň dva atomy mědi CuA a CuB. Enzym je složen z více než deseti podjednotek, přičemž tři největší z nich jsou kódovány mitDNA. Elektron je nejprve přenesen z cyt c na první redukční centrum CuA lokalizované poblíž cytosolové strany membrány, další centra hem a3 a CuB jsou lokalizovány v blízkosti matrixové strany, kde dochází k redukci O2. Na vazebné místo pro kyslík se také snad vážou ligandy jako CO, CN- a N3-, které tímto způsobem inhibují respiraci. (Babcock & Wikstrom, 1992)

Obrázek 6. Struktura mitochondriálního komplexu IV. Čtyři elektrony z cytochromu c vážou molekulu kyslíku za vzniku vody. Přenos elektronů na kyslík kovovými ionty navázanými na protein. (Upraveno podle (Karu & Afanas'eva, 1995)).

- 17 -

3.2.2 ATP-synthasa a chemiosmotická teorie Transfer elektronů dýchacím řetězcem je spojen s pumpováním protonů komplexy

I,

III

a

IV

přes

vnitřní

mitochondriální

membránu

z matrix

do

mezimembránového prostoru. Tok protonů má za následek: 1. generování pH gradientu přes vnitřní mitochondriální membránu, pH v matrix je vyšší než pH v cytosolu, kde je pH obvykle blízké 7. 2. generování gradientu elektrického napětí (membránový potenciál) přes vnitřní mitochondriální membránu, kde uvnitř je negativní potenciál a venku pozitivní potenciál. pH gradient (∆pH) žene H+ zpět do matrix, tím zesiluje efekt membránového potenciálu (∆ Ψ), který táhne protony zpět přes komplex ATP-synthasy. Součet ∆pH a ∆ Ψ, čili protonmotivní síla (PMF, ∆p) může být měřena v milivoltech (mV). U typické buňky je PMF respirující mitochondrie v rozmezí hodnot 180 až 190 mV a je tvořena z membránového potenciálu 160 až 170 mV a pH gradientu okolo 0,3 až 0,5 jednotek (Alberts et al., 2002). Chemiosmotická teorie byla vytvořena profesorem Petrem Michellem v roce 1961. Mitochondriální F1F0-ATP synthasa je membránový protein, skládající se z hlavové části, zvané F1 ATPasa, a transmembránového přenašeče protonů, zvaného F0. Obě části, F1 i F0 jsou složeny z několika podjednotek. Rotující stopka je ukotvena k rotoru, složeného z 10 – 14 podjednotek v membráně. Stator je otočen do matrix mitochondrie a je složen z transmembránových podjednotek, spojených s ostatními podjednotkami prodlouženým ramenem. Hlava ATP-synthasy je složena ze šesti podjednotek. Tři z nich obsahují vazebné místo pro ADP a anorganický fosfát. Přeměna na ATP je řízena změnou mechanické energie na energii chemické vazby způsobenou změnami v proteinové konformaci rotující části komplexu. (Alberts et al., 2002). Pro translokaci protonů přes vnitřní membránu byly navrženy dva mechanismy: redoxní smyčka a protonová pumpa. Mechanismus redoxní smyčky byl původně navržený Peterem Mitchellem (Mitchell, 1961). Principielně je tento mechanismus založen na redukci redoxního centra přenašeče, který přenáší jak elektrony, tak protony na matrixové straně membrány a jeho reoxidace následujícím centrem za uvolnění protonů na cytosolové straně membrány. Takovýmito přenašeči jsou v dýchacím řetězci FMN a CoQ. Mechanismus protonové pumpy je založen na změně konformace proteinu spojené s redoxní reakcí. Na matrixové straně membrány dojde k navázání n protonů na postranní řetězce aminokyselin, což způsobí konformační změnu. Reoxidací na cytosolové straně membrány dojde k uvolnění protonů do

- 18 -

mezimembránového prostoru s opětnou změnou konformace pumpy. (Voet & Voetová 1995)

3.3

Produkce reaktivních kyslíkových radikálů mitochondriemi Volné radikály jsou atomy, molekuly nebo ionty schopny samostatné existence,

které obsahují jeden nebo více nepárových elektronů ve valenčním orbitalu. Radikály reagují s neradikálními komponenty buňky v reakcích typu: (1) X• + HY →HX + Y• (2) X• + Y → [ X – Y]• Volné radikály se pak mohou chovat jako iniciátoři a propagátoři řetězové reakce. Biologickým příkladem je lipidová peroxidace (Evans & Halliwell, 1999). V těle savců je produkována řada reaktivních radikálů kyslíku a dusíku (tab. 1) (Evans & Halliwell, 1999). Důležitým zdrojem kyslíkových reaktivních částic (ROS) je právě dýchací řetězec mitochondrií. První zmínka v literatuře o tom, že mitochondrie produkují ROS, pochází již z roku 1966. Průlomovou se stala práce Brittona Chance a jeho spolupracovníků, ve které poukazují na produkci peroxidu vodíku izolovanými mitochondriemi (Chance et al., 1979). Reaktivní kyslíkové částice přispívají k řadě patologických procesů zahrnujících stárnutí, apoptosu nebo buněčné poškození během ischemie a reperfuse. Elektrontransportní řetězec je hlavním zdrojem ROS u normálně metabolizující buňky, přičemž rychlost produkce ROS mitochondriemi se zvyšuje při různých patologických stavech jako je hypoxie, ischemie, reperfuse a chemická inhibice mitochondriální respirace. (Chen et al., 2003) ROS jsou látky, které obsahují kyslík a mají silné redukční vlastnosti. Jak již bylo řečeno, důležitým zdrojem ROS je dýchací řetězec mitochondrií, kde primárně vzniká superoxidový radikál (O2• ) a sekundárně peroxid vodíku (H2O2) a také vysoce reaktivní hydroxylová radikál HO• (Fridovich, 1986).

- 19 -

Tabulka 1. Přehled některých reaktivních forem kyslíku a dusíku v lidském těle. (upraveno podle (Darley-Usmar & Halliwell, 1996))

REAKTIVNÍ FORMY KYSLÍKU Volné radikály

Látky které nejsou volnými radikály

Superoxid, O2•

Peroxid vodíku, H2O2

Hydroxylový radikál, HO•

Kyselina chlorná, HOCl

Peroxyl, ROO•

Ozon, O3

Alkoxyl, RO•

Singletový kyslík, 1O2

Hydroperoxyl, HO2• REAKTIVNÍ FORMY DUSÍKU Oxid dusnatý, NO•

Kyselina dusitá, HNO3

Oxid dusičitý, NO2•

Nitrosylový kation, NO+ Nitrosylový anion, NOOxid dusitý, N2O3 Peroxynitrit, ONOOAlkylperoxynitrit, ROONO-

Superoxid vzniká jednoelektronovou redukcí molekulárního kyslíku O2. V literatuře se uvádí, že v lidském těle mohou být vyprodukovány až 2 kg superoxidu za jeden rok, u atletů a lidí s chronickými infekcemi dokonce ještě více. Kromě mitochondrií je superoxid produkován ještě i aktivovanými fagocyty jako neutrofily, monocyty a eosinofily jako součást mechanismu, kterou zneškodňují cizorodé částice napadající tělo (Evans & Halliwell, 1999). Superoxid je v buňce rychle enzymaticky redukován na peroxid vodíku enzymem superoxiddismutasou (SOD), nebo spontánní disproporcionací (Fridovich, 1986). H2O2 není radikál a s biomolekulami reaguje poměrně pomalu. V buňce je redukován enzymy katalasou nebo glutathionperoxidasou na vodu. V přítomnosti přechodných kovů (např. Fe

2+

nebo

Cu+) je však rychle

redukován na vysoce reaktivní hydroxylový radikál HO• (Camello-Almaraz et al., 2006) mechanismem známým jako Fentonova reakce (Cantu et al., 2009). V přítomnosti Fe3+ a superoxidového radikálu dochází k Haber-Weissově reakci:

- 20 -

mechanismus Haber-Weissovy reakce (Khan & Kasha, 1994): (3) O2• + H2O2 → HO• + OH- + O2 (4) Fe3+ + O2• → Fe2+ + O2

mechanismus Fentonovy reakce (Evans & Halliwell, 1999): (5) Fe2+ + H2O2 → HO•+ OH- + Fe3+ V literatuře se uvádí, že na tvorbu ROS neúplnou redukcí je spotřebováno 0,1 – 4 % kyslíku, který se vyskytuje v dýchacím řetězci (Richter, 1988). Mitochondrie dospělého člověka pojmou denně přibližně 400 litrů O2 a přemění ho na vodu čtyřelektronovou redukcí v dýchacím řetězci. Když je pouhých 0,1% z tohoto množství kyslíku přeměněno chemicky jednodušší jedno-elektronovou redukcí, vyprodukuje mitochondrie 0,4 litru superoxidového radikálu (Skulachev, 2007) (Obr. 7) Jako hlavní producenti superoxidového radikálu jsou v literatuře uváděny komplexy I (NADH-UQ oxidoreduktasa) a III (UQ-cytochrom c oxidoreduktasa). Ty produkují malé množství O2• jako vedlejší produkt oxidativní fosforylace (Camello-Almaraz et al., 2006). Superoxid produkovaný komplexem I je uvolňován do matrix mitochondrie. Komplexem mezimebránového

III

je

prostoru.

produkován Velikost

jak

částečně

produkce

do

kyslíkových

matrix, radikálů

tak

i

do

komplexy

dýchacího řetězce je závislá na druhu tkáně a na metabolickém stavu mitochondrie. (Boveris & Chance, 1973). Například u plně respirující mitochondrie ze srdečního svalu (která je charakterizovaná prudkým tokem elektronů, rychlou syntézou ATP, částečnou depolarizací a zmenšením poměru NADH/NAD+, odpovídá energetickému stavu 3) je převládajícím producentem superoxidu komplex III a generace superoxidu je závislá na rychlosti toku elektronů (Camello-Almaraz et al., 2006). Komplex I produkuje u normálně respirující mitochondrie, kde jsou elektrony přenášeny z NADH přímo na substráty a poměr NADH/NAD+ je relativně malý, pouze velmi malé množství superoxidu. Ke zvýšení produkce dochází při inhibici dýchacího řetězce následkem poškození, mutace, ischemie, ztrátě cytochromu c nebo vlivem nahromadění NADH, způsobené nízkou spotřebou ATP. Vlivem nízké respirační •rychlosti se zvýší poměr NADH/NAD+ , který vede ke zvýšené produkci O2 (energetický stav 4) (Murphy, 2009). Druhý mechanismus, kterým je produkováno velké množství O2• je během RET (reverzního elektronového transportu). RET nastává při nízké respiraci a nízké produkci ATP, kdy jsou v přítomnosti vysoké

- 21 -

protonmotivní síly hnány elektrony z CoQH2 zpět na komplex I, kde mohou redukovat NAD+ na NADH. Tento děj je pozorován např. u mitochondirí, které využívají sukcinát, jako substrát komplexu II. Rotenon, známý inhibitor dýchacího komplexu I. inhibuje komplex ve vazebném místě pro CoQ. V případě prvního mechanismu, dochází po inhibici rotenonem k zvýšení produkce superoxidu. V případě druhého mechanismu naopak k zastavení tvorby (Murphy, 2009). V matrix je superoxidový anion okamžitě přeměněný enzymem Mn-SOD (superoxiddismutasa) na H2O2 a v mezimembránovém prostoru enzymem Zn- nebo Cu-SOD (Turrens, 2003). Výše popsané mechanismy byly stanoveny na základě výsledků experimentů ze studií s izolovanými mitochondriemi.

Obrázek 7. Hlavní mechanismus tvorby reaktivních kyslíkových forem (ROS) v mitochondrii. -

Redukované substráty syntetizované metabolickými drahami přenášejí elektrony (e ) na komplexy I a II -

elektron-transportního řetězce. Hlavními centry produkce superoxidového radikálu (O2• ) jsou komplexy I a III, ačkoliv malé množství vzniká i na komplexech II a IV. Ubichinon (Q) je redukován na ubichinol (QH2) za současného přenesení elektronu na cytochrom c (Cy c). Vznikající semiubichinonový radikál (Q*) je oxidován zpět na ubichinon cytochromem b (Cy b). V tomto místě může dojít k přenosu elektronů na kyslík -

-

za vzniku O2• . Inhibicí myxothiazolem (Myx) dojde ke snížení produkce O2• , protože se zamezí vzniku Q*, *

zatímco inhibicí antimycinem A (Ant A) se jeho produkce zvýší, zvýšením hladiny Q . Rotenon inhibuje tok -

elektronů z komplexu I na komplex III a zvyšuje produkci O2• . Vyobrazená je pouze vnitřní mitochondriální membrána. (Převzato od (Camello-Almaraz et al., 2006))

Mezi produkcí reaktivních kyslíkových radikálů a antioxidační ochranou existuje v buňce rovnováha. Při nedostatku antioxidantů nebo vlivem velké nadprodukce ROS dojde k porušení této rovnováhy a buňka je vystavena oxidačnímu stresu, kdy obecně dochází k poškození buňky ve třech základních typech, a to: peroxidace lipidů (LPO), oxidace proteinů a mutace DNA, resp. mitDNA. Nejcitlivějším místem pro atak radikálu v molekule mastné kyseliny je -CH2- skupina obklopená z obou stran dvojnou vazbou. Z toho důvodu často podléhají LPO polynenasycené mastné kyseliny, které jsou

- 22 -

součástí fosfolipidové buněčné membrány (Bokov et al., 2004). Iniciátorem LPO je vysoce reaktivní hydroxylová radikál, který vzniká z peroxidu vodíku v přítomnosti Fe2+ (reakce č.5 - Fentonova reakce) (Aruoma et al., 1989). LPO je řetězová reakce, po iniciaci radikálem následuje propagace a zakončena je terminací, tedy vytvořením neradikálového produktu, např. účinkem antioxidantů (vitamin E) (Schneider, 2009). Produkty lipidové peroxidace jsou mutagenní epoxidy, hydroxyperoxidy, lipidové alkoxyly a peroxylové radikály (Ames et al., 1993). Vzniklé lipidové hydroperoxidy mohou poškozovat buňku dvěma způsoby. Buď mohou narušit fluiditu membrány a funkci membránových proteinů, což může ohrozit funkci celé buňky, nebo může dojít ke vzniku reaktivních aldehydů jako je 4-hydroxynonenal (4-HNE) a malondialdehyd (MDH) (Girotti, 1998), který může napadnout další buněčné makromolekuly jako proteiny a DNA (Ran et al., 2007). Cílem ROS u proteinů jsou téměř všechny aminokyseliny, přičemž methionin a cystein jsou extrémně náchylné k oxidačnímu stresu (Bokov et al., 2004). Oxidativním poškozením DNA dochází ke zlomům vlákna, DNA-DNA a DNA-protein crosslink nebo změnu báze DNA, což má za následek syntézu poškozených proteinů, které mohou mít vliv na funkčnost buňky. mitDNA je vzhledem ke své lokalizaci a nedostatku histonů citlivější na oxidativní poškození než jaderná DNA. Studie zabývající se Alzheimerovým onemocněním uvádějí jako marker oxidativního poškození DNA 8-hydroxy-2-deoxyguanosin, který vzniká hydroxylací C8 guaninu (Markesbery & Lovell, 2007). Oxidační poškození biopolymerů reaktivními kyslíkovými částicemi hraje podle Harmanové hypotézy volných radikálů hlavní roli v oslabování vitálních funkcí se stárnutím. S tím se shodují nálezy zvýšené produkce hladiny oxidativně poškozené DNA, proteinů a lipidů a zároveň snížení hladiny antioxidační ochrany v závislosti na stáří (Skulachev, 2007).

- 23 -

Tabulka 2. Komponenty buňky poškozené reaktivními kyslíkovými částicemi. (Zadak et al., 2009)

Komponenty buňky poškozené reaktivními kyslíkovými částicemi Lipidy

peroxidace polynenasycených mastných kyselin v organele peroxidace lipidů (cholesterol) v buněčné membráně peroxidace (modifikace) low density lipoprotein (LDL) rozvoj atherosklerosy

Proteiny

oxidativní poškození skupin -SH (oxidace enzymů s obsahem -SH), inaktivace enzymů oxidativní poškození apolipoproteinu B - rozvoj atherosklerosy

Uhlovodíky

depolymerizace polysacharidů

Nukleové

hydroxylace bazí

kyseliny

cross-linkage štěpení vláken DNA

Důsledky

3.4

mutace, inhibice proteinů, syntézy nukleotidů a mastných kyselin

Endogenní enzymatická ochrana buňky proti ROS Buňka má vyvinutý obranný mechanismus přirozené detoxikace nebo zhasnutí

volného radikálu, který je v těle vyprodukován. Do endogenní enzymatické ochrany buňky spadají tyto enzymy: superoxiddismutasa (SOD) (Fridovich, 1986), katalasa, glutationperoxidasa (GPx) a glutationreduktasa (GRd). (Tab. 2) SOD katalyzuje dismutaci O2• na H2O2 v reakci: (6) O2• + O2• + H+ → H2O2 + O2

popsanou McCordem a Fridovichem před více než 25 lety (McCord & Fridovich, 1969). V současnosti jsou u savců známy tři isoformy SOD. Pro mitochondriální matrix je typická SOD obsahující mangan, Mn-SOD, označovaná také jako SOD2 (Weisiger & Fridovich, 1973). SOD1 (CuZn-SOD) se vyskytuje převážně v cytoplasmě a v oblasti jádra (Crapo et al., 1992) a SOD3 (EC-SOD) je převládající extracelulární antioxidační enzym (Marklund et al., 1982). Protože SOD produkuje H2O2, pracuje ve spojení s enzymy, které peroxid vodíku odstraňují. Tím je například hemoprotein katalasa,

- 24 -

obsahující čtyři hemové skupiny, která rozkládá peroxid vodíku (Maehly & Chance, 1954) v reakci: (7) H2O2 → H2O + O2. Dalším důležitým enzymem, který vystupuje v antioxidační ochraně buňky před reaktivními kyslíkovými radikály je glutathionperoxidasa (GPx). Tento selenoenzym katalyzuje redukci H2O2 a lipidových hydroperoxidů reakcí typu: (8) ROOH + 2GSH → ROH + H2O + GSSG, a tím ochraňuje biomembrány a další důležité kompartmenty buňky proti oxidačnímu poškození (Little & O'Brien, 1968). Jsou známy čtyři typy glutathionperoxidasy, které nesou ve své molekule selen. Nejhojnější je GPx1, která je exprimována ve všech buňkách. GPx2 je exprimována v gastrointestinálním traktu a GPx3 v plazmě. GPx4 je známá jako glutathionperoxidasa fosfolipidových hydroxyperoxidů. Je exprimována plošně a je klíčovým enzymem detoxifikace lipidových hydroxyperoxidů (Girotti, 1998). Všechny čtyři typy GPx mohou redukovat peroxid vodíku, alkylové peroxidy a hydroperoxidy mastných kyselin. Avšak pouze GPx4 je schopna redukovat hydroperoxidy v lipoproteinech a lipidových komplexech odvozených od cholesterolu, cholesterylových esterů a fosfolipidů (Brigelius-Flohe, 1999). GPx4 má malou velikost a velký hydrofobní povrch, který jí umožňuje interagovat s komplexy lipidů v membráně, a tím detoxikovat lipidové hydroxyperoxidy. Dalším způsobem odstraňování lipidových hydroxyperoxidů z fosfolipidových hydroperoxidů v membráně je přes spřaženou reakci s fosfolipasou A2 (PLA2) a GPx1. PLA2 nejprve odtrhne hydroxyperoxid mastné kyseliny z fosfolipidového hydroxyperoxidu v membráně a GPx1 poté redukuje hydroperoxid mastné kyseliny na alkohol a vodu. Z pohledu kinetiky, má však GPx4 vyšší afinitu k membránovým fosfolipidovým hydroperoxidům než PLA2 (Antunes et al., 1995). Z toho důvodu je GPx4 považována za primární enzymatický obranný systém proti oxidačnímu poškození buněčných membrán (Brigelius-Flohe, 1999). Glutathion (GSH)

je

z disulfidu

glutathionu

(GSSG)

regenerován

působením

enzymu

glutathionreduktasy, který je závislí na dostupnosti NADPH (Meister, 1988). Tabulka 3. Přehled enzymů endogenní ochrany buňky proti ROS. Upraveno podle (Evans & Halliwell, 1999)

Enzym Superoxiddismutasa

Katalyzovaná reakce 2O2• + 2H+ → H2O2 + O2

Glutathionperoxidasa

2GSH + H2O2 → GSSG + 2H2O

Glutathionreduktasa

GSSG + NADPH + H+ → 2GSH + NADP+

Katalasa

2H2O2 → 2 H2O+ O2

- 25 -

3.5

Endogenní neenzymatická ochrana buňky proti ROS Kromě výše uvedených enzymů se na antioxidační ochraně buňky před

nepříznivým

vlivem

volných

kyslíkových

radikálů

podílejí

i

další

endogenní

neenzymatické komponenty buňky. Látky, které omezují aktivitu redikálů, zabraňují jeho vzniku nebo ho převádí do méně reaktivních, případně nereaktivních stavů, jsou obecně nazývány antioxidanty (Sies, 1997). Endogenní antioxidanty si organismus syntetizuje sám. Hlavním neenzymatickým antioxidantem v lidském těle, který hraje zásadní roli při udržování několika biochemických pochodů je koenzym Q (CoQ) nebo-li ubichinon. Je lokalizován ve všech tkáních a buňkách, a to především ve vnitřní mitochondriální membráně. Chemicky se jedná o 1,4-benzochinon s isoprenovým řetězcem. Lidský ubichinon obsahuje převážně 10 isoprenylových jednotek, je tedy označován jako CoQ10. Důležitou fyziologickou funkci má CoQ v elektron-transportním řetězci, kde přenáší elektrony z komplexů I a II na komplex III. Zároveň však vystupuje jako v tucích rozpustný antioxidant a scavenger volných kyslíkových radikálů. V metabolismu buňky má ještě i další funkce (Turunen et al., 2004). Antioxidační účinek CoQ je zprostředkován především jeho redukovanou formou, tedy ubichinolem (Ernster & Dallner, 1995). Vzhledem k lokalizaci a lipofilitě látky spočívá jeho hlavní úloha v inhibici lipidové peroxidace (Bentinger et al., 2007). Primárně zabraňuje produkci lipidového peroxylového radikálu (LOO•) během iniciace přímou reakcí s LOO•. Zároveň také regeneruje nejvýznamnější lipofilní antioxidant, vitamín E, z αtokoferoxylového radikálu (podobně jako askorbát), a tím předchází propagaci lipidové peroxidace (Mukai et al., 1990). Na druhou stranu má CoQ také prooxidační vlastnosti, kdy ve formě semiubichinolového radikálu může vytvářet superoxidový radikál v dýchacím řetězci (viz kapitola 3.3). Glutathion (GSH) je tripeptid (γ-glutamylcysteinylglycin) a obecně se v buňce uplatňuje při detoxifikaci léků a xenobiotik, má tedy rozmanité funkce. Spolu s GSSG udržuje redoxní rovnováhu v buňce a díky redoxním vlastnostem páru GSH/GSSG se účastní regulace buněčného cyklu (Blokhina et al., 2003). Z pohledu antioxidační ochrany vystupuje jako kofaktor GSH-peroxidas, kde je během redukce peroxidu vodíku přeměněn na disulfid glutathionu (GSSG) (Kletzien et al., 1994). Dále je kofaktorem dehydroaskorbát reduktasy (DHA), což je enzym schopný regenerovat askorbát z oxidačního produktu dehydroaskorbátu, přičemž donorem elektronu je GSH. Dehydroaskorbát vzniká sledem reakcí askorbátu a volných radikálů. Tento mechanismus redukce oxidované formy zpět na kyselinu askorbovou umožňuje udržovat stálou hladinu askorbátu v buňce (Pompella et al., 2003). Dále reaguje neenzymově

s peroxidem

vodíku,

singletovým

- 26 -

kyslíkem,

superoxidovým

a

hydroxylovým radikálem. Významnou funkcí glutathionu je udržování thiolových skupin enzymů v redukované formě, čímž zabraňuje jejich inaktivaci (Pompella et al., 2003). Dalším endogenním antioxidantem je indolamin melatonin, který působí jako vychytávač reaktivních radikálů a antioxidant, který má schopnost proniknout všemi morfofyziologickými bariérami a proniknout do všech částí buňky. Antioxidační kapacita melatoninu zahrnuje jak přímé zneškodnění toxického volného radikálu, tak nepřímé s využitím buněčného receptoru (Reiter, 2000). Při přímé reakci melatoninu s hydroxylovým radikálem vzniká poměrně nově objevený metabolit, a to cyklický 3hydroxymelatonin. Ten je vylučován močí savců, v závislosti na množství melatoninu vzniklého endogenně nebo exogenně přijatého a na úrovni oxidativního stresu (Tan et al., 1998). Díky tomu by mohl být cenným biomarkerem tvorby hydroxylového radikálu in vivo, a zároveň i užitečným klinickým indexem oxidačního stavu jednotlivce nebo přítomnosti onemocnění způsobeného volnými radikály (Reiter, 2000). Tím však jeho antioxidační účinek nekončí. Je schopen neutralizovat také peroxid vodíku, singletový kyslík (1O2), nitroxid (NO•) a peroxynitritový anion (ONOO ) (Pryor & Squadrito, 1995). Jak bylo uvedeno výše, melatonin působí na zneškodňování reaktivních radikálů také nepřímo, a to buď zvyšováním hladiny mRNA nebo aktivity hlavních antioxidačních enzymů (SOD, GPx, ...) Další skupinou neenzymových antioxidačních systémů jsou proteiny, které vážou ionty přechodných kovů. Železo je esenciální prvek nezbytný pro život, avšak jeho nadbytek působí toxicky. Ionty železa se účastní vzniku volných kyslíkových radikálů v Haber-Weissově (Fe3+ → Fe2+) a následně ve Fentonově reakci (Fe2+ → Fe3+) (kapitola 3.3). Vazbu iontů železa ve formě Fe3+ a jeho transport na místo potřeby zajišťuje transferrin, glykoprotein syntetizovaný v játrach. Intracelulární zásobu železa představuje ferritin. Za jeden den je u člověka katabolisováno asi 20 ml červených krvinek, čímž se do těla uvolní asi 25 mg železa. Transferrin a ferritin toto volné železo váže a snižuje tím jeho potencionální toxicitu (Takami & Sakaida, 2011). Protein ceruloplazmin neenzymaticky oxiduje ionty Fe2+ na Fe3+ a umožňuje tak vazbu železitých iontů na transferrin (Yoshida et al., 2000). Některé studie uvádějí možnou souvislost mezi poklesem ceruloplazminu (Boll et al., 2008) s rozvojem Alzheimerovy a Parkinsonovy nemoci (Torsdottir et al., 2010), (Boll et al., 2008). Metalothioneiny tvoří rodinu malých proteinů bohatých na cystein. Buňku chrání proti oxidačnímu stresu a jako metalochaperony jsou zapojeny do udržování homeostázy zinku a mědi

a

(Sutherland & Stillman, 2011) zneškodňují superoxidový a hydroxylový radikál (Kumari et al., 1998). Kyselina močová je tradičně považovaná za inertní koncový metabolit degradace purinu u člověka. Avšak mnohé práce dokazují, že se jedná také o

- 27 -

selektivní antioxidant, schopný reakce s hydroxylovým radikálem a kyselinou chlornou, za své přeměny na neškodný produkt (alantoin, glyoxylát, močovinu, oxalát) (Becker, 1993). α-lipoová kyselina, (vitamín B13) vzniká v těle prostřednictvím metabolismu syntézy mastných kyselin. Působí jako koenzym některých mitochondriálních dehydrogenas

(pyruvát

dehydrogenasy

a

α-ketoglutarát

dehydrogenasy).

Její

antioxidační účinky jsou známé již někdy z roku 1959 (Rosenberg & Culik, 1959). Kyselina lipoová se chová jako scavenger hydroxylového radikálu, radikálu kyseliny chlorné a singletového kyslíku. Také je schopna chelatovat přechodné kovy Cu2+, Mn2+ a Zn2+ (Sigel et al., 1978).

3.6

Exogenní neenzymatická ochrana buňky proti ROS Látky podílející se na exogenní neenzymatické ochraně buňky se dostávají do

organismu z vnějšího prostředí. Jedná se o velkou skupinu látek zahrnující např vitaminy, polyfenoly a odpřahovače (protonofory). 3.6.1 Vitaminy Kyselina askorbová (vitamín C) , α-tokoferol (vitamín E) a karotenoidy (βkaroten – provitamín A) hrají také důležitou roli v ochraně před poškozením způsobeným volnými radikály. Kyselina askorbová je jedním z nejdůležitějších ve vodě rozpustných antioxidantů buňky. Její antioxidační ochrana spočívá ve vychytávání (scavengingu) ROS jako jsou superoxidový a hydroxylový radikál a singletový kyslík. Zároveň je vitamin C považován za tak zvaný „chain-breaking scavenger“ pro peroxylový radikál. Působí rovněž synergicky s vitamínem E. Vitamín C je schopný regenerovat α-tokoferol z tokoferolového radikálu, který vzniká reakcí s jinými (Halliwell, 1996). α-tokoferol je pro člověka nejdůležitější v tucích rozpustný chainbreaking antioxidant. Je lokalizován ve fosfolipidové dvouvrstvě buněčných membrán. Nejdůležitější funkcí vitaminu E jakožto antioxidantu je ochrana buňky před lipidovou peroxidací. Má totiž schopnost přímo zhášet peroxylový radikál, čímž zamezuje propagaci lipidové peroxidace během autooxidace. Zdá se tedy, že oba tyto vitamíny, C a E, snižují následky lipidové peroxidace nebo jí přímo zamezují (Halliwell, 1989). Karotenoidy jsou také velice silnými antioxidanty. Bývají spojovány se zhášením dvou ROS, a tím je singletový molekulární kyslík a peroxylový radikál. Početné epidemiologické studie odhalily, že se zvyšující se spotřebou stravy bohaté na kyselinu askorbovou, α-tokoferol a karotenoidy souvisí zmenšování rizika pro rozvoj některých

- 28 -

degenerativních onemocnění, jako jsou různé typy karcinomu, kardiovaskulární nebo oftalmologická onemocnění (Anderson & Phillips, 1999), (Stahl & Sies, 2005). 3.6.2 Polyfenoly Polyfenoly jsou běžnou součástí stravy rostlinného původu a hlavní skupinou antioxidantů v potravě. Největším zdrojem polyfenolů je ovoce (Scalbert & Williamson, 2000) V potravě bylo identifikováno několik set různých polyfenolů. Rozdělují se na flavonoidy, fenolické kyseliny, stilbeny a lignany. Přírodní flavonoidy se nejčastěji vyskytují ve formě O-glykosidů, obsahují tedy ve své molekule necukernou součást (aglykon) a cukernou složku. Flavonoidy se dále rozdělují na flavony, flavonoly, flavanoly, flavanony, isoflavony, proanthokyanidiny a anthokyanidy (Manach et al., 2004). Biodostupnost polyfenolů se výrazně liší jeden od druhého, takže polyfenoly, které jsou nejvíce zastoupeny v dietě, nemusí nutně dosahovat nejvyšších koncentrací aktivních metabolitů v cílové tkáni. Metabolit přítomný v krvi se obvykle liší od původního polyfenolu, který prošel trávicím traktem a játry. Z různých studií zaměřených na kinetiku a rozsah vstřebávání u dospělých po podání čisté dávky rostlinného extraktu nebo celé potraviny vyplývá, že koncentrace celkového metabolitu v plazmě se pohybuje v rozmezí od 0 do 4 µmol/l s příjmem 50 mg aglykonového ekvivalentu. Nejlépe se vstřebávají isoflavony a kyselina gallová, za nimi následují katechiny, flavanony a glukosidy quercetinu. Hůře se vstřebávají proanthokyanidiny, gallolyované čajové katechiny a anthokyaniny (Manach et al., 2005). O polyfenolických antioxidantech v potravě je obecně známo, že mohou pomáhat

snižovat

výskyt

různých

druhů

rakoviny,

kardiovaskulárních

a

neurodegenerativních onemocnění a poškození DNA a dokonce mohou mít vlastnosti zpomalující stárnutí (Obrenovich et al.). Mechanismus účinku je pro různé polyfenolické antioxidanty odlišný. Mohou ovlivňovat rozmanité molekulární cíle přímou aktivací receptorů, které mohou být nezávislé na jejich antioxidační aktivitě. Mimo to mohou působit na signální transdukční dráhy (Romier et al., 2009). Kromě přímého zhášení ROS (Obr. 8) mohou některé polyfenoly chelatovat ionty přechodných kovů (Fe2+, Cu+), čímž také přispívají ke snížení oxidačního stresu (Kumamoto et al., 2001). Polyfenoly se dávají často do kontextu s tzv. “Francouzským paradoxem“. Francie a Itálie jsou dva hlavní evropští producenti vína a lidé žijící v těhcto zemích trpí relativně nízkým výskytem akutních srdečních příhod, navzdory jejich jídelníčku bohatému na nasycené tuky. Jedním vysvětlením pro Francouzský paradox může být v tom, že středomořská strava je bohatá na ovoce, vlákninu a vitamíny (Labinskyy et al., 2006). Dalším faktem však je, že červené víno obsahuje polyfenoly. A zejména flavonoidy

- 29 -

mají specifické antioxidační vlastnosti, kterým se přikládá zodpovědnost za ochranu těchto lidí před infarktem (Nojiri et al., 2004). Flavonoidy fungují jako donory elektronů pro vhodné volné radikály podle jejich redoxního potenciálu. Redoxní potenciál flavonoidových radikálů je nižší než redoxní potenciál alkylových peroxylových radikálů. Flavonoidy jsou tedy efektivní chain-breaking antioxidanty při oxidačních procesech způsobených peroxylovými radikály (Jovanovic et al., 1996).

katechin (oxidovaný)

katechin (redukovaný)

Obr. 8 . Přiklad katechinu jako scavengeru ROS/RNS. (Převzato a upraveno podle (Obrenovich et al., 2010)).

Fenolické kyseliny se rozdělují do dvou skupin: na deriváty kyseliny benzoové a deriváty kyseliny skořicové. Kyselina benzoová se vyskytuje v jedlých rostlinách ve velmi malém množství s výjimkou červeného ovoce, ředkve a cibule (Tomás-Barberán & Clifford, 2000). Čaj je zase důležitým zdrojem kyseliny gallové. Nejhojněji zastoupeným derivátem kyseliny skořicové je kyselina kávová, která bývá v ovoci zastoupena z 75% -100% z celkového množství fenolických kyselin. Další významnou fenolickou kyselinou je kyselina ferulová, která je nejvíce zastoupena v zrnech obilovin (Hatcher & Kruger, 1997). Mezi nejzastoupenější flavonoidy patří flavonoly. Ve výživě člověka je dominantně zastoupen quercetin a kaempferol. Obvykle jsou přítomny v poměrně nízké koncentraci (≈15 – 30 mg/kg čerstvé váhy). Bohatšími zdroji těchto flavonolů je cibule, kapusta, pórek, brokolice a borůvky. Červené víno obsahuje také asi 45 mg flavonolů/L (Opie & Lecour, 2007). V těchto zdrojích se nacházejí buď volné nebo vázané cukernými jednotkami. Quercetin mimo jiné vykazuje efekt růstového inhibitoru tumorových buněk (Mu et al., 2007). Flavanony byly nalezeny v rajčatech a v aromatických potravinách jako je máta. Ve velkých koncentracích jsou však přítomny pouze v citrusových plodech. Nejznámější zástupci této skupiny jsou naringenin v grapefruitech, hesperetin v pomerančích a eriodictiol v citronech (Manach et al., 2004). Isoflavony jsou svoji strukturou velmi podobné estrogenu. Také prokazují pseudohormonální vlastnosti, jsou schopny vazby

- 30 -

na estrogenový receptor, takže jsou označovány jako fytoestrogeny. Výskyt isoflavonů je omezen prakticky pouze na luštěniny, především sóju. Základní isoflavony sójových bobů jsou genistein, daidzein a glycitein. Obsah isoflavonů v sojových bobech se pohybuje v rozmezí 580-3800 mg/kg čerstvé váhy (Reinli & Block, 1996). Hlavními flavanoly jsou katechiny. Katechiny je možné nalézt v různých druzích ovoce, přítomny jsou také v červeném víně, ale nejbohatšími zdroji jsou zelený čaj a čokoláda (Lakenbrink et al., 2000). Proanthokyanidiny, známé také jako kondenzované taniny, jsou dimery, oligomery a polymery katechinů (Guyot et al., 1998). Kondenzované taniny jsou zodpovědny za astringentní účinky. Běžným zdrojem jsou grepy, broskve, jablka, hrušky, víno, čaj (Santos-Buelga & Scalbert, 2000). Anthokyanidy jsou červená barviva rozpuštěná ve šťávě vakuol epidermální tkáně květin a ovoce (Davies & Mazza, 1993). Běžně jsou v potravě dostupné v červeném víně, v různých druzích obilovin a kořenové zelenině (Es-Safi et al., 2002). Stilbeny se nacházejí v potravě pouze ve velmi malém množství. Avšak známým stilbenem je resveratrol, u kterého byly prokázány antikarcinogení účinky (Bertelli et al., 1998). Zároveň vykazuje i silné antioxidační účinky. Nejlépe popsaný je antioxidační efekt resveratrolu na inhibici LDL oxidace (Frankel et al., 1993). 3.6.3 Odpřahovače (uncouplery) Odpřažení (uncoupling) respirace je děj, při kterém dojde pomocí přírodních nebo uměle vytvořených ionoforů, obvykle přenašečů protonů (protonoforů), ke snížení mitochondriálního membránového potenciálu (∆Ψ), což má pozitivní vliv na produkci reaktivních kyslíkových radikálů (ROS) v mitochondrii (Skulachev, 1998). Snížení protonového gradientu má za následek zrychlení přenosu elektronů ve snaze vyrovnat způsobené odpřažení. Tvorba ROS předčasným přenosem elektronů na kyslík je tak minimalizována. Severin a kol. poukazují, že mezi ∆Ψ a tvorbou ROS je velká závislost. Při malém snížení ∆Ψ (10 – 15 %) poklesla rychlost produkce ROS o desetinu. Snížení membránového potenciálu dosáhli přídavkem velmi malého množství protonoforu (Korshunov et al., 1997). V tomto případě došlo k mírnému odpřažení (mild uncoupling), které má pozitivní vliv na délku života Drosophily (Caldeira da Silva et al., 2008), ovšem dlouhodobé vystavení buněk nebo organismu vlivu odpřahovačů je toxické (Severin et al., 2010). Přirozenými odpřahovači v buňce jsou odpřahující proteiny (uncoupling proteins, UCPn), které jsou lokalizovány ve vnitřní mitochondriální membráně a patří mezi integrální membránové přenašeče (Walker & Runswick, 1993). Odpřahující proteiny se účastní několika důležitých fyziologických a patologických procesů. Pravděpodobně se účastní prevence tvorby ROS a s tím spojené prevence

- 31 -

degenerativních onemocnění a stárnutí (UPC2) (Brand et al., 2004), dále procesů horečky, regulace tělesné váhy, hrají roli v regulačních procesech apoptosy a diabetes mellitus II. typu (Chan et al., 2004) a také se účastní adaptivní termoregeneze (UPC1 – termogenin) (Nicholls & Locke, 1984). V současné době je známo také velké množství synteticky vytvořených odpřahovačů jako je 2,4-dinitrofenol (DNP) nebo SF6847, FCCP a CCCP (Skulachev, 1998), které mají schopnost snižovat produkci ROS. Obecně se jedná o velmi slabé kyseliny. Podobné účinky mohou vykazovat polyfenolické sloučeniny, které jsou také velmi slabými kyselinami a vliv na membránový potenciál je znám již u quercetinu (Ortega & Garcia, 2009), galanginu (Dorta et al., 2008) a dehydrosilybinu (Gabrielová et al, 2010). Dehydrosilybin zřejmě nefunguje stejným mechanismem jako např. CCCP nebo DNP, ale je asociován s adenin-nukleotidovým transportérem, případně jiným mitochondriálním aniontovým přenašečem (Gabrielova et al., 2010).

3.7

Patologie ischemicko-reperfuzního poškození Ischemické onemocnění srdce představuje různorodou skupinu patologických

jevů, které jsou způsobeny nedostatečným průtokem krve srdeční tkání. Během reperfuze produkují mitochondrie nadbytek ROS, což může poškodit kardiomyocyty (Zweier & Talukder, 2006). Kardiomyocyty mohou aktivovat endogenní transkripční program citlivý na kyslík, který moduluje mitochondriální aktivitu, když je myokard v oblasti akutní nebo chronické ischemie vystaven nízké koncentraci kyslíku. Tato biologická odpověď je řízena propyl hydroxylasou (PHDs), která funguje jako kyslíkový senzor, a transkripčními faktory HIFs (hypoxia-inducible factors). Touto cestou se aktivuje skupina genů, které vedou k přeprogramování metabolismu buňky. Během ischemie dochází k akumulaci kyseliny mléčné a s tím je spojeno snižování pH v buňce. Buňka se pak snaží tento pokles pH zvrátit aktivací Na+/H+ antiportru, což vede ke zvýšení intracelulární koncentrace [Na+], neboť Na+/ K+ ATPasa je inhibovaná úbytkem ATP. Následkem zvýšení [Na+] dojde i ke zvýšení intracelulární koncentrace [Ca2+], protože je inhibovaný nebo obrácený Na+/Ca2+ antiporter. Během ischemie dochází v myokardu k produkci ROS (Levraut et al., 2003), a to převedším u slabé ischemie, kdy je do tkání ještě dodáván zbytkový kyslík. ROS jsou produkovány v dýchacím řetězci komplexy I a III, ale při ischemii je hlavním producentem xanthinoxidasa, která katalyzuje přeměnu adenosinu na xanthin (Pacher et al., 2006). Po dlouhotrvající ischemii je snížen membránový potenciál vnitřní mitochondriální membrány kardiomyocytu a ATP synthasa ve snaze tento potenciál zvýšit hydrolyzuje ATP. Zvýšená koncentrace [Ca2+] a hladina ROS v kombinaci s úbytkem ATP způsobí postupnou ztrátu buněčné integrity, protože opravné procesy závislé na ATP přestanou

- 32 -

být účinné (Silverman & Stern, 1994). Zotavení nebo nekrosa tkáně při reperfuzi závisí na délce ischemické periody. Po krátkodobé ischemii jsou mitochondrie schopny tvořit ATP a slabé poškození tkáně může být opraveno. Pokud je však ischemie dlouhodobá, zotavení už není možné a reperfuze způsobí další poškození srdeční tkáně (Cadenas et al., 2010). Zvyšující se dysfunkce mitochondrie během reperfuze hraje centrální roli v rozvoji nekrózy a apoptózy. Reperfuze je spojena s agresivní produkcí ROS, ty způsobí oxidativní poškození makromolekul včetně nenasycených mastných kyselin, především kardiolipinu. Následkem oxidačního poškození dojde k inhibici aktivity dýchacího řetězce. Kombinace účinků ROS a zvýšená koncentrace [Ca2+] vede k otevření mPTP (mitochondrial permeability transition pore) (Garcia-Dorado et al., 2006). Do buňky pak mohou pronikat molekuly menší < 1,5 kDa, včetně protonů, což způsobí kolaps mitochondriálního membránového potenciálu. Otevření kanálů a volný tok nízkomolekulárních látek přes vnitřní mitochondriální membránu způsobí bobtnání mitochondrie, membrána může prasknout, uvolní se cytochrom c a další pro-apoptické proteiny, které takto zpravidla iniciují buněčnou smrt. Během prvních pár minut reperfuze, která následuje za ischemií, dochází u buněk k nekróze. Infarkt se vytváří v místech smrštěného pásku nekrotických buněk složených z hyperkontraktilních kardiomyocytů (Barrabes et al., 1996). Přestože přesný mechanismus není ještě znám, hlavním faktorem zapojeným v hyperkontrakci, je obnovení syntézy ATP v přítomnosti vysokého cytosolického [Ca2+] (Nayler, 1981), (Kaplan et al., 1992). Jednou z možností ochrany srdce je pre- a post-conditioning. Podstatou standardního ischemického preconditioningu (IPC) je adaptace myokardu na ischemický stres, který je způsobený krátkými periodami ischemie (Hausenloy & Yellon, 2010). První fáze (okno) se projeví okamžitě po stimulaci IPC a do 1 – 2 hodin úplně odezní (klasický, časný IPC). Druhá fáze kardioportekce se dostaví po 12 – 24 hodinách, a poslední po 48 – 72 hodinách (Second Window of Protection [SWOP], opožděná IPC). Molekulární podklad časné a opožděné fáze IPC se liší. V první fázi dochází k aktivaci adenosinového receptoru, aktivaci proteinkinasy C a otevření mitochodriálního adenosin-trifosfátového K kanálu (KATP). Na druhé fázi se podílí aktivace COX-2 a genů kódujících proteiny pro několikadenní ochranu (Mn-SOD, iNOS). Aby byl IPC účinný, musí nastat před počátkem srdeční ischemie. Z klinického hlediska má tedy využití u plánovaných chirurgických zásahů do kardiovaskulárního systému, např. před operací aortokoronárního bypassu, transplantace srdce a koronární angioplastikou, kdy lze očekávat ischemicko-reperfuzní epizody.

- 33 -

Kontrolovaná reperfuze, neboli modulování podmínek reperfuze, způsobuje ochranu ischemickému srdci. Takováto kontrolovaná reperfuze může být považována za tvz. ischemický postconditionig (POC) (Bopassa et al., 2005). Na rozdíl od preconditioningu jsou u postconditioningu krátké ischemické epizody aplikovány až po dlouhé ischemické periodě, tj. na začátku reperfuze. Tyto periody jsou nejkratší u malých druhů (10 -15 sec, potkani, myši) a delší u větších druhů (30 sec, pes, králík) u člověka 60 sec (Staat et al., 2005). Poprvé byly kardioprotektivní účinky postconditioningu demonstrovány na psím modelu a výsledky prokázaly že POC zmírňuje následky ischemického poškození. Různé studie naznačují, že kardioprotekce pomocí POC a IPC fungují na podobných principech a signálech, detailní mechanismus však ještě není zcela znám (Zhao & Vinten-Johansen, 2006). Jedním z mechanismů, které byly navrženy ve spojení s kardioprotekcí je i slabé odpřažení

oxidativní

fosforylace.

Chemické

odpřažení

v podstatě

napodobuje

ischemický preconditioning jsou-li použity velmi nízké koncentrace syntetických odpřahovačů (Brennan et al., 2006a; Brennan et al., 2006b). Podobně nízké koncentrace polyfenolů v dietě mohou mít stejné kardioprotektivní účinky jako DNP nebo FCCP, tím, že vyvolávají krátkodobé odpřažení oxidativní fosforylace. Krátké trvání odpřažení může souviset s obvykle rychlým metabolismem polyfenolů.

- 34 -

4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 4.1 Materiály 4.1.1 Biologický materiál Buňky HepG2 buněčná linie je odvozená z jaterní tkáně pacienta s dobře diferencovaným hepatocelulárním karcinomem (ECACC No. 85011430) Primární potkaní neonatální kardiomyocyty byly izolovány a poskytnuty Ing. Evou Gabrielovou, PhD. Mitochnodrie Mitochondrie byly izolovány ze srdcí laboratorních potkanů kmene Wistar (250 - 300 g) zakoupených od firmy Biotest (Konárovice, ČR). Veškerá práce se zvířaty byla prováděna s povolením Etické komise

LF UP v Olomouci v souladu s mezinárodní

legislativou.

4.1.2 Kultivační média, roztoky, pufry a sonda Liposomy Intravesikulární pufr - NaCl 150 mM, Na2HPO4.12H2O 9 mM, KH2PO4 1,5 mM, KCl 0,15 mM; pH 7,4 Médium pro liposomy - KCl 150 mM, Na2HPO4.12H2O 9 mM, KH2PO4 1,5 mM; pH 7,4 Mitochondrie Izolační purf pro mitochndrie A - 500 ml; KCl 180 mM, MOPS 5 mM, EGTA 2 mM, pH 7,2, alkalizace přídavkem KOH Izolační purf pro mitochondrie B - 200 ml pufru A + 0,5 mg/ml BSA Respirační purf - KCl 120 mM, K-MOPS 5 mM, K-EGTA 1 mM, KH2PO4 0,5 mM a MgCl2 0,5 mM, pH 7,2 Směs substrátů – 5mM sukcinát, 1mM malát, 5mM pyruvát

Buňky Kultivační médium pro buněčnou linii HepG2 – DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) +/- glukosa 4,5 g/L; k tomu přidáno 2 mM L-Glutamin, galaktosa 4,5 g/L, 1 mM pyruvát, NEAA (neesenciální aminokyseliny), 10 % FBS, 100 µl/ml penicilin a 100 µl/ml streptomycin Kultivační médium pro primární potkaní kardiomyocyty – DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), 10 % koňské sérum, 5 % fetální telecí sérum, 100 µl/ml penicilin a 100 µl/ml streptomycin Sonda JC-1 - 5,5‘,6,6‘ – tetrachloro – 1,1’,3, 3‘ – tetraethylbenzimidazolokarbokyanin jodid

- 35 -

4.1.3 Silybin, 2,3-dehydrosilybin a jeho deriváty Silybin a 2,3-dehydrosilybin jsou součástí polyfenolové směsi silymarinu, extraktu z mléka semen bodláku Silibum marianum. Ten je znám již dlouhou dobu v lidovém léčitelství pro své hepatoprotektivní účinky. V silymarinu jsou nejvíce zastoupeny flavonolignany 60 – 70%. Majoritní složkou je silybin, následuje isosilybin, silychristin a silydianin (Pradhan & Girish, 2006). 2,3-dehydrosilybin se vyskytuje v minoritním množství (Huber et al., 2008). V diplomové

práci

jsem

používala

silybin,

2,3-dehydrosilybin

a

jeho

methylované deriváty připravené Ing. Radkem Gažákem, Ph.D. (Mikrobiologický ústav AVČR) Jedná se o směs dvou diastereoizomerů A a B přibližně v poměru 1:1

A H O

CH2OH

H HO

O O

H OH

OCH 3

H

OH

OH

O

B H O R3

CH2OH

O O

OCH3

H

R1 R2

R4

O

Obrázek 9. Chemická struktura silybinu (A) a 2,3-dehydrosilybinu (B).

-R1

-R2

-R3

-R4

2,3-dehydrosilybin

-OH

-OH

-OH

-OH

3-O-methyl-2,3-dehydrosilybin

-OCH3

-OH

-OH

-OH

5-O-methyl-2,3-dehydrosilybin

-OH

-OCH3

-OH

-OH

7-O-methyl-2,3-dehydrosilybin

-OH

-OH

-OCH3

-OH

20-O-methyl-2,3-dehydrosilybin

-OH

-OH

-OH

-OCH3

3,7-di-O-methyl-2,3-dehydrosilybin

-OCH3

-OH

-OCH3

-OH

3,20-di-O-methyl-2,3-dehydrosilybin

-OCH3

-OH

-OH

-OCH3

7,20-di-O-methyl-2,3-dehydrosilybin

-OH

-OH

-OCH3

-OCH3

Tabulka 4. Přehled mono- a di-methylovaných derivátů 2,3-dehydrosilybinu

- 36 -

4.2 Metody 4.2.1 Příprava malých unilamelárních liposomů Malé

unilamelární

liposomy

byly

připraveny

ze

směsi

lipidů

1,2-dipalmitoylfosfatidylcholinu (DPPC) (Avanti Polar Lipids, USA) rozpuštěním v chloroformu (20mg/ml). 0,5 ml směsi lipidů bylo odpařeno ve skleněné zkumavce v proudu dusíku. Doba odpařování byla cca 10 minut. Poté byl k odpařené směsi připipetován 1 ml intravesikulárního pufru ( NaCl 150 mM, Na2HPO4.12H2O 9 mM, KH2PO4 1,5 mM, KCl 0,15 mM; pH 7,4). Směs byla za občasného protřepání zahřívána na vodní lázni o teplotě 45 0C po dobu 10 minut, kdy došlo k rozpuštění lipidů a vytvoření mléčného zbarvení. Poté byla směs odebrána Hamiltonovou pipetou, která byla následně umístěna do předem vyhřátého Avanti

®

Mini-Extruderu. Směs lipidů

byla cca 10 x prohnána přes extruder, ve kterém byla vložena membrána Nucleopore Track-Etch Membrane Whatman s póry o průměru 1,0 µm. Směs s vytvořenými unilamelárními liposomy byla poté umístěna do ledu, aby došlo k jejich „uzavření“.

4.2.2 Zhodnocení potenciálu na membráně liposomů Pro zhodnocení vlivu testovaných látek na membráně liposomů byla použita sonda JC-1 (5,5‘,6,6‘ – tetrachloro – 1,1’,3, 3‘ – tetraethylbenzimidazolokarbokyanin jodid). Fluorescence byla měřena na luminiscenčním spektrometru PERKIN ELMER LS50-B. JC-1 je kationaktivní barvivo, které se akumuluje v liposomech v závislosti na potenciálu, což se projevuje změnou ze zelené fluorescence (525 nm) na červenou (590 nm). V důsledku toho je depolarizace liposomální membrány udána snížením poměru červené/zelené fluorescence. Změna barvy fluorescence je způsobena tvorbou červeně fluoreskujících J-agregátů v přítomnosti vysokého potenciálu. Poměr zelené a červené fluorescence je závislý pouze na membránovém potenciálu. Je nezávislý na rozměrech, tvaru a hustotě liposomů, které mohou ovlivnit jednosložkový fluorescenční signál. V našich experimentech byla excitační vlnová délka nastavena na 488 nm a bylo zaznamenáno emisní spektrum v rozsahu 510 až 620 nm. Protože testované látky interferují s takto nastaveným měřením, absorbují v oblasti 450 nm, změnili jsme nastavení tak, že excitační vlnová délka byla 535 nm a emisní spektrum bylo zaznamenáno v rozsahu 550 – 620 nm. Připravené liposomy (25 µl/ml) byly umístěny do média (KCl 150 mM, Na2HPO4.12H2O 9 mM, KH2PO4 1,5 mM; pH 7,4) a byla přidána 0,5 µM fluorescenční sonda JC-1. Po změření spektra (λEx = 535 nm, λEm = 595 nm) bylo přidáno určité

- 37 -

množství testované látky nebo valinomycinu nebo CCCP a změřeno spektrum ve stejném rozsahu. Množství J-agregátů v % vzhledem ke kontrolnímu vzorku bylo vypočteno dle vztahu: % = F595 (testovaná látka) – F595 (CCCP) / F595 (lipo) – F595 (CCCP) kde F595 (lipo) je intenzita fluorescence ve směsi obsahující pufr 2, liposomy a JC-1; F595 (CCCP) je intenzita fluorescence po přidání CCCP; F595 (testovaná látka) je intenzita fluorescence po přidání testované látky.

4.2.3 Izolace sdrečních mitochondrií Mitochondrie byly izolovány z potkaního srdce (samice 400 – 450 g). Potkani byli uspáni intramuskulárním podáním kombinace přípravků Narketan 10 (účinná látka ketamin 100 mg/ml) – celkové anestetikum dávkované 1,2 ml/kg, a Xylazin 2% (účinná látka xylazin hydrochlorid 23,3 mg/ml) – myorelaxant dávkovaný 0,8 ml/kg. Srdce bylo po vyjmutí ihned umístěno do 50 ml kádinky s 15 ml Pufru A (500 ml; KCl 180 mM, MOPS 5 mM, EGTA 2 mM, pH 7,2, alkalizace přídavkem KOH). Kádinka byla uložena do ledu. Poté bylo srdce rychle pomocí nůžek rozstříháno na několik kousků a krvavý pufr byl slit. Dále bylo přidáno 10 ml Pufru B (200 ml pufru A + 0,5 mg/ml BSA) a srdce bylo rozmělněno na velmi malé kousky. Rozsekaná suspenze byla homogenizována v ledu při 17500 ot/min (Tkáňový homogenizátor IKA ULTRA-TURRAX). Následně bylo přidáno 20 ml pufru B a znovu byla provedena homogenizace. Homogenát byl slit do předchlazené 40 ml centrifugační kyvety a byl centrifugován 5 minut při 500 x g Centrifuga ROTINA 38R, Hettich (chlazená). Supernatant byl přelit přes jemnou gázu do jiné předchlazené 40 ml centrifugační kyvety a opět centrifugován 10 minut při 8000 x g. Poté byl supernatnt vylit a sraženina byla resuspendována v přibližně 0,5 ml Pufru A pomocí pipety, doplněna do 40 ml pufrem A a znovu centrifugována 5 minut při 500 x g. Supernatant (obsahující zlomky mitochondrií) byl opatrně slit do nové, předchlazené 40 ml centrifugační kyvety a centrifugován 10 minut při 8000 x g. Na závěr byl slit supernatant a usazenina byla resuspendována v 800 µl Pufru A.

4.2.4 Stanovení bílkovin metodou Bradfordové Rozsah metody 25 – 250 µg/ml, použité roztoky: 0,5 mg/ml BSA ve vodě, 0,01% (m/v) Coomassie Brilliant Blue G-250 (100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 (Serva) bylo rozpuštěno v 50 ml 95% ethanolu, přidáno 100 ml 85% kyseliny fosforečné a doplněno vodou do 1000 ml. Barvivo bylo skladováno při 4oC.

- 38 -

Tabulka 5 Schéma přípravy standardů pro kalibraci. BSA: roztok bovinního sérového albuminu v koncentraci 0,5 mg/ml; Cf BSA: finální koncentrace bovinního sérového albuminu v příslušném standardu.

blank

std1

std2

std3

std4

std5

std6

BSA (µl)

0

25

50

100

150

200

250

voda (µl)

500

475

450

400

350

300

250

0

0,025

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

Cf BSA (mg/ml)

Standardy byly naředěny do mikrozkumavek (Tab. 5) a přepipetovány po 7 µl v dubletu na 96-jamkovou desku. Vzorky byly naředěny 20x, 40x, a 100x do mikrozkumavek a rovněž přepipetovány po 7 µl vzorku na desku. Ke standardům a vzorkům bylo přidáno 200 µl činidla. Absorbance byla změřena při 595 nm do 5 minut po smíchání.

4.2.5 Zhodnocení mitochondriálního transmembránového potenciálu Pro zhodnocení vlivu testovaných látek na transmembránový potenciál byla rovněž použita sonda JC-1, fluorescence byla měřena na luminiscenčním spektrometru PERKIN ELMER LS50-B. JC-1 může být použita jako indikátor mitochondriálního potenciálu v různých typech buněk, včetně myocytů a neuronů, v neporušené tkáni a izolovaných mitochondriích. JC-1 vykazuje větší specifičnost pro mitochondriální potenciál, než pro potenciál plasmatické membrány a následnou odezvu na depolarizaci než ostatní kationaktivní barviva jako DiOC6 a rhodamin (Salvioli et al., 1997). Poměr zelené a červené fluorescence je závislý pouze na membránovém potenciálu. Je nezávislý na rozměrech, tvaru a hustotě mitochondrií, které mohou ovlivnit jednosložkový fluorescenční signál. V našich experimentech byla excitační vlnová délka nastavena na 488 nm a bylo zaznamenáno emisní spektrum v rozsahu 510 až 620 nm. Po přidání směsi substrátů (5 mM sukcinát, 1 mM malát, 5 mM pyruvát) dochází k poklesu píku 535 nm (zelená fluorescence) a naopak vzrůstá pík 595 nm (červená fluorescence) (Obr. 14). Protože testované látky interferují s takto nastaveným měřením, absorbují v oblasti 450 nm, změnili jsme nastavení tak, že excitační vlnová délka byla 535 nm a emisní spektrum bylo zaznamenáno v rozsahu 550 – 620 nm. Izolované mitochondrie (0,1 mg/ml) v respiračním pufru (KCl 120 mM, K-MOPS 5 mM, K-EGTA 1 mM, KH2PO4 0,5 mM a MgCl2 0,5 mM, pH 7,2) byly preinkubovány se sondou JC-1 (0,5 µM) 1 min. Po změření spektra (λEm = 535 nm, λEx = 550 -620 nm) byla přidána směs substrátů (5 mM sukcinát, 1 mM malát, 5 mM pyruvát) a po 2

- 39 -

min bylo znovu změřeno spektrum ve stejném rozsahu. Poté bylo přidáno určené množství testované látky nebo CCCP a změřeno spektrum ve stejném rozsahu. Množství J-agregátů v % vzhledem ke kontrolnímu vzorku bylo vypočteno dle vztahu: % = F595 (látky) – F595 (mito) / F595 (sukc) – F595 (mito) kde F595 (mito) je intenzita fluorescence ve směsi obsahující respirační pufr, itochondrie a JC-1; F595 (sukc) je intenzita fluorescence po přidání sukcinátu; F595 (látky) je intenzita fluorescence po přidání testované látky.

1000 900

1

fluorescence (a.u.)

800 700 600 500

7

7

400 300 1

200 100 0 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 610 620 630 vlnová délka (nm)

Obrázek 10. Emisní spektrum sondy JC-1 v mitochondriích. Šipky ukazují posun obou píků JC-1 po přidání směsi substrátů (5 mM sukcinát, 1 mM malát, 5 mM pyruvát)) v čase, mezi jednotlivými záznamy emisního spektra uplynulo 25 sekund. 1. spektrum (černá); 2. spektrum (růžová); 3. spektrum (oranžová); 4. spektrum (modrá); 5. spektrum (zelená); 6. spektrum (červená); 7. spektrum (hnědá)

- 40 -

4.2.6 Respirometrie s vysokým rozlišením Spotřeba kyslíku izolovanými mitochondriemi současně s koncentrací kyslíku byla měřena na přístroji OROBOROS Oxygraph-2k (Oroboros, Innsbruck, Austria). Izolované mitochondrie byly umístěny do respiračního média (KCl 120 mM, K-MOPS 5 mM, K-EGTA 1 mM, KH2PO4 0,5 mM a MgCl2 0,5 mM, pH 7,2) vyhřátého na 30 0C s přídavkem respiračních substrátů, pyruvát (5mM), plus malát (1mM), plus sukcinát (5mM). Tím bylo dosaženo respirace mitochondrií. Poté byl přidán příslušný derivát dehydrosilybinu (2,5 µM) a v závěru pro kontrolu FCCP, který způsobil úplné odpřažení.

4.2.7 Kultivace buněčných linií Buněčná linie HepG2 byla kultivována v 25 cm2 lahvi s 10 ml kultivačního média (DMEM médium +/- glukosa 4,5 g/L; k tomu přidáno 2 mM L-Glutamin, galaktosa 4,5 g/L, 1 mM pyruvát, NEAA (neesenciální aminokyseliny), 10 % FBS, 100 µl/ml penicilin a 100 µl/ml streptomycin) a lahve byly uloženy v inkubátoru nasyceném vodními parami při 37°C v atmosféře vzduchu s 5% CO2. Médium bylo měněno každých 24 72 hod. Po dosažení konfluence 70 – 80% byly buňky pasážovány. Použitá buněčná linie je adherentní, proto musela být od povrchu lahve nejprve oddělena trypsinizací. Buňkám bylo odsáto kultivační médium a byly opláchnuty sterilním PBS (5 ml). Uvolnění buněk bylo umožněno přidáním 1 ml roztoku trypsinu s EDTA po dobu 2 3 min. při

37 °C. Po této době došlo k uvolnění buněk ode dna. Následně bylo

přidáno 9 ml kultivačního média (došlo k inaktivaci trypsinu). Následně byly buňky spočítány pomocí barvení trypanovu modří s využitím Bürkerovy komůrky a rozděleny do nových kultivačních lahví, případně vysety na 24 nebo 96-ti jamkové desky a využity v experimentech. Buňky byly v experimentech používány mezi 1 - 20 pasáží.

4.2.8 Stanovení počtu buněk Počet buněk v buněčné suspenzi byl stanovován pomocí barvení trypanovou modří. Buněčná suspenze (10 µl) byla smíchána s trypanovou modří (90 µl) a směs byla nanesena do Bürkerovy komůrky (10 µl) a překryta krycím sklíčkem. Buňky byly počítány pod světelným mikroskopem (CK2-TR; Olympus, Japonsko). Koncentrace živých buněk v suspenzi byla vypočtena dle vztahu: Počet buněk v ml = počet buněk v 0,1 ml x 10000 x ředění

- 41 -

4.2.9 Zhodnocení membránového potenciálu na celých buňkách Pro stanovení změn membránového potenciálu byla opět použita sonda JC-1.. Buňkám kultivovaným na 24 nebo 96-ti jamkových deskách bylo odsáto kultivační médium a přidáno kultivační médium s přídavkem testované látky příslušné koncentrace, anebo CCCP nebo valinomycinu ve výsledné koncentraci 1 µM. Buňky byly inkubovány 2,5 hod v inkubátoru při 37°C. Poté bylo médium opět odsáto, buňky 2 x promyty vyhřátým PBS a byly přidáno růstové médium obsahující fluorescenční sondu JC-1 (1µM) a inkubovány 20 minut při 37°C. následně bylo médium odsáto a buňky byly překryty vrstvou čerstvého kultivačního média. Změnu flourescence jsem měřila na

readeru Sunrise (Tecan, Rakousko). Při excitaci 488 nm sonda emituje

zelenou fluorescenci (535 nm) při nízkém potenciálu membrány a červenou (595 nm) při vysokém potenciálu membrány. Intenzity fluorescence byly změřeny každá zvlášť. Mitochondriální depolarizace byla stanovena jako pokles poměru intenzity flourescence červená/zelená.

- 42 -

4.3 Výsledky 4.3.1 Zhodnocení potenciálu na membráně liposomů Sledováním vlivu testovaných látek na membránový potenciál liposomů byla testována hypotéza, že se 2,3-dehydrosilybin

chová jako protonofor. Silybin v tomto případě

sloužil jako kontrolní látka, u které jsme nepředpokládali účinek na membránový potenciál. Mono- a dimethylované deriváty 2,3-dehydrosilybinu byly součástí studia vztahu struktury a biologické aktivity. Cílem experimentu bylo zjistit, jestli se zvyšující se koncentrací derivátu bude membránový potenciál ovlivněn různým způsobem. Složení intravesikulárního pufru bylo NaCl 150 mM, Na2HPO4.12H2O 9 mM, KH2PO4 1,5 mM, KCl 0,15 mM; pH 7,4. Složení média KCl 150 mM, Na2HPO4.12H2O 9 mM, KH2PO4 1,5 mM; pH 7,4. Transmembránový elektrický potenciál liposomů byl ustanoven přídavkem valinomycinu (1 µM). Silybin a 2,3-dehydrosilybin byly testovány v celé koncentrační řadě 0,1; 0,2; 0,5; 1; 5; 10; 15; 25 µM a mono- a di-methylované deriváty byly testovány v celé koncentrační řadě 0,1; 0,2; 0,5; 1; 5; 10; 20 µM. Všechny z testovaných látek ovlivňovaly membránový potenciál podobně jako CCCP, které jsme použili pro vynulování potenciálu (Obr. 11). Problematické je to vzhledem k účinkům

120 100 80 60 40

et D 7m

et D

H SB 20 -m et D H SB 3, 7m et D H 3, SB 20 -m et D HS 7, 20 B -m et D HS B

SB H

SB H 5m

et D 3m

D

H

SB

SB

os om

y

20 0

lip

množství agregátů JC-1 (%)

silybinu, u kterého jsme předpokládali zanedbatelný vliv na membránový potenciál.

[deriváty] 20 µM, [SB] a [DHSB] 25 µM Obrázek 11. Vliv silybinu, dehydrosilybinu, mono- a di-methylovaných derivátů na membránový potenciál malých unilamelárních liposomů. Graf znázorňuje změny množství J-agregátů sondy JC-1 v λEm = 595 po přídavku valinomycinu a následně přídavku uvedené koncentrace silybinu (SB), 2,3dehydrosilybinu (DHSB), respektive příslušného mono- a di-methylovaného derivátu dehydrosilybinu. Jako kontrolní hodnota fluorescence byla použita intenzita v přítomnosti liposomů bez jakéhokoliv přídavku (liposomy), pro srovnání byla změřena hodnota fluorescence v případě přídavku CCCP (neuvedeno).

- 43 -

4.3.2 Zhodnocení mitochondriálního transmembránového potenciálu Z výsledků mé bakalářské práce vyplynulo, že 2,3-dehydrosilybin výrazně snižuje michondriální potenciál, což se projevilo snižováním poměru červené/zelené fluorescence po přídání různých koncentrací a silybin vykazoval velmi slabý vliv na membránový potenciál až od koncentrace 25 µM. Tyto výsledky se při dalších měřeních v diplomové práci potvrdily (Obr. 12), silybin (panel A) a 2,3-dehydrosilybin (panel B) byly testovány v koncentračním rozsahu 0,1; 0,2; 0,5; 1; 5; 10; 15; 25 µM. 2,3-dehydrosilybin snižoval poměr červené/zelené fluorescence při koncetraci 25 µM až na úroveň 45 % kontroly a silybin nevykazoval v nižších koncentracích žádný efekt, snížení poměru červené/zelené fluorescence docházelo na úroveň 80 % v případě nejvyšší koncentrace, tedy 25 µM. Pro srovnání jsme u každého měření použili syntetický odpřahovač CCCP, který vždy způsobí úplné odpřažení membránového potenciálu, tedy sníží poměr červené/zelené fluorescence na minimální hodnotu. Mono- a di-methylované deriváty 2,3-dehydrosilybinu byly testovány v koncentrační řadě 0,1; 0,2; 0,5; 1; 5; 10; 20 µM. Žádný efekt na poměr červené/zelené fluorescence nevykazoval 7-O-methyl-2,3-dehydrosilybin (panel E).. Podobný efekt vykazoval i 3,7-O-methyl-2,3-dehydrosilybin (panel G), který rovněž membránový potenciál nijak signifikantně neovlivňoval. V případě 3-O-methyl-2,3-dehydrosilybinu (panel C), 5-O-methyl-2,3-dehydrosilybinu (panel D) a 20-O-methyl-2,3-dehydrosilybinu (panel F)

však docházelo v určitých vyšších koncentracích ke zvýšení poměru

červené/zelené fluorescence. při těchto koncentracích se CCCP, které bylo přidáno na závěr každého měření, nechovalo standardním způsobem a nevykazovalo odpřažení membránového potenciálu. Usoudili jsme, že tyto deriváty v těchto vyšších koncentracích mohou způsobovat poškození mitochondrií, které pravděpodobně nekontrolovatelně bobtnají, dochází k porušení jejich membrány a následkem nereagují na přídavek CCCP poklesem potenciálu. Tyto výsledky jsme poté potvrdili měřením spotřeby kyslíku na oxygrafu, kde u těchto látek docházelo ve vyšších koncentrací k zastavení dýchání mitochondrií (viz. níže). 3-O-methyl-2,3-dehydrosilybin (panel C) a 3,7-O-methyl-2,3-dehydrosilybin (panel C) poměr červené/zelené fluorescence neovlivňovaly. Ostatní deriváty: 5-Omethyl-2,3-dehydrosilybin (panel D), 20-O-methyl-2,3-dehydrosilybin (panel F), 3,20-Omethyl-2,3-dehydrosilybin (panel H) a 7,20-O-methyl-2,3-dehydrosilybin (panel I) vykazovaly různé úrovně snížení poměru červené/zelené fluorescence.

- 44 -

A

B

C

- 45 -

D

E

F

- 46 -

G

H

I

Obrázek 12. Vliv silybinu, dehydrosilybinu, mono- a di-methylovaných derivátů na mitochondriální potenciál izolovaných srdečních potkaních mitochondrií. Graf znázorňuje změny množství J-agregátů sondy JC-1 v λEm = 595 po přídavku směsi substrátů (5 µM sukcinát, 1 µM malát a 5 µM pyruvát) a následně přídavku uvedené koncentrace testovaných látek. Silybin (panel A). 2,3-dehydrosilybin (panel B), 3-O-methyl-2,3-dehydrosilybin (panel C), 5-O-methyl-2,3-dehydrosilybin (panel D), 7-O-methyl-2,3dehydrosilybin (panel E), 20-O-methyl-2,3-dehydrosilybin (panel F), 3,7-O-methyl-2,3-dehydrosilybin (panel G), 3,20-O-methyl-2,3-dehydrosilybin (panel H), 7,20-O-methyl-2,3-dehydrosilybin (panel I)

- 47 -

4.3.3 Respirometrie s vysokým rozlišením (HRR) Pomocí HRR jsme se pokusili vyřešit atypické navyšování membránového potenciálu, které jsme pozorovali u vyšších koncentrací některých derivátů 2,3dehydrosilybinu. Sledovali jsme vliv silybinu, 2,3-dehydrosilybinu a jeho mono- a dimethylovaných derivátů na rychlost respirace izolovaných srdečních mitochondrií. Úbytek koncentrace kyslíku znázorňuje modrá křivka, tok kyslíku znázorňuje červená křivka. Po odpřažení mitochondriálního dýchacího řetězce, přídavek protonoforu FCCP, se mitochondrie snaží tento efekt vykompenzovat zrychlenou respirací (Obr. 13). Spotřeba

koncentrace

kyslíku

respirujícími

mitochondriemi

se

výrazně

zvyšovala po přídavku 2,3-dehydrosilybinu (panel B), 20-O-methyl-2,3-dehydrosilybinu (panel F) a 3,20-O-methyl-2,3-dehydrosilybin (panel H). Naopak žádný efekt na spotřebu kyslíku nevykazoval silybin (panel A), 7-O-methyl-2,3-dehydrosilybin (panel E),

3,7-O-methyl-2,3-dehydrosilybin (panel G), 7,20-O-methyl-2,3-dehydrosilybin

(panel I) a téměř žádný efekt nevykazoval ani 5-O-methyl-2,3-dehydrosilybin (panel D). Přídavek 3-O-methyl-2,3-dehydrosilybinu (panel C) vyvolal zvýšenou spotřebu kyslíku pouze do koncentrace 5 µM. S dalším zvýšením koncentrace 3-O-methyl-2,3dehydrosilybinu došlo k prudkému snižování spotřeby kyslíku, zřejmě vlivem poškození mitochondrií. V závěru každého experimentu bylo pro srovnání přídáno FCCP, jakožto syntetického odpřahovače, který spotřebu kyslíku ještě razantně zvýšil. Výjímku tvoří 3O-methyl-2,3-dehydrosilybin,

5-O-methyl-2,3-dehydrosilybin,

20-O-methyl-2,3-

dehydrosilybin a 3,20-O-dimethyl-2,3-dehydrosilybin. V těchto případech zřejmě dochází k poškození mitochondrií, které způsobují příslušné koncentrace daných derivátů 2,3-dehydrosilybinu.Grafy C až I vznikly za vydatné pomoci Mgr. Martina Jabůrka Ph.D., který se danou problematikou dlouhodobě zabývá a je zkušeným uživatelem přístroje OROBOROS Oxygraph-2k .

- 48 -

A

B

- 49 -

C

D

E

- 50 -

F

G

H

- 51 -

I 180

150 150 120 100 90 50

O 2 F lu x p e r V (A ) [p m o l/(s *m l)]

O 2 C o n c e n tra tio n (A ) [n m o l/m l]

200

60 0 0:00

0:04

0:08 S10

S10

0:12 Range [h:min]: 0:25 S10

S10

0:16 S10

S10

0:20 FCCP

0:25 Off

Obrázek 13. Vliv silybinu, 2,3-dehydrosilybinu a mono- a di-methylovaných derivátů na spotřebu kyslíku v izolovaných srdečních mitochondriích. V grafech pro silybin (panel A) a 2,3-dehydrosilybin (panel B), znázorňuje první přídavek mitochondrie, druhý a třetí přídavek testovanou látku (2,5 µM), třetí a čtvrtý přídavek znázorňuje FCCP (0,5 µM). V grafech C až I, 3-O-methyl-2,3-dehydrosilybin (panel C), 5O-methyl-2,3-dehydrosilybin (panel D), 7-O-methyl-2,3-dehydrosilybin (panel E), 20-O-methyl-2,3dehydrosilybin (panel F), 3,7-O-methyl-2,3-dehydrosilybin (panel G), 3,20-O-methyl-2,3-dehydrosilybin (panel H), 7,20-O-methyl-2,3-dehydrosilybin (panel I) znázorňují prvních 5 až 6 svislých linií přídavek testované látky (2,5 µM), předposlední přídavek FCCP (0,5 µM) a poslední Off – ukončení experimentu.

- 52 -

4.3.4 Zhodnocení membránového potenciálu na celých buňkách Pro ověření vlivu testovaných látek na mitochondriální potenciál jsme provedli identické koncentrační řady na celých buňkách. První experimenty jsme prováděli na lidské hepatomové linii HepG2, které byly kultivovány s příslušným médiem s obsahem glukosy 4,5 mg/L. Výsledky ale neprokazovaly žádný efekt testovaných látek na potenciál, tj. nepozorovali jsme žádné změny ve fluorescenci JC-1, a to ani po přídavku CCCP, jakožto syntetického odpřahovače. Protože o buněčných liniích rakovinového původu je známo, že i za aerobních podmínek využívají téměř výhradně glykolýzu, pokusili jsme se přimět buňky HepG2 k výraznějšímu využívání mitochondrií záměnou glukosy v kultivačním médiu za galaktosu ve stejné koncentraci. Ani tehdy však k výraznější respiraci nedošlo, respektive nepozorovali jsme změny ve fluorescenci JC1 ani po přidání ionoforů. Dalšími buněčnými liniemi, které jsem používala, byly CaCO2 a H9c2. Avšak ani v případě těchto linií se nepodařilo zaznamenat žádnou reakci na přídavek ionoforů ve formě změn fluorescence JC-1. Výsledky nejsou v diplomové práci uvedeny. Pro další experimenty jsme zvolili kardiomyocyty, protože se jedná o primární buňky, tedy nikoliv proliferující buněčnou linii odvozenou od maligního onemocnění. Kardiomyocyty jsou bohaté na mitochondrie, protože je využívají jako zdroj energie pro neutuchající kontrakci srdečního svalu. Neonatální potkaní kardiomyocyty jsme inkubovali 2,5 hod se silybinem nebo 2,3-dehydrosilybinem v koncentrační řadě 0,1; 0,2; 0,5; 1; 5; 10; 15; 25 µM a mono- a di-methylovanými deriváty v koncentrační řadě 0,1; 0,2; 0,5; 1; 5; 10; 20 µM (Obr. 14). Výrazný vliv na snížení membránového potenciálu celých buněk jsme prokázali u 2,3-dehydrosilybinu, EC50 = 5,1 µM (panel B), a u 5-O-methyl-2,3-dehydrosilybinu, kde EC50 = 5,5 µM (panel D). 7-O-methyl-2,3-dehydrosilybin, EC50 = 11 µM (panel E), a 3-O-methyl-2,3-dehydrosilybin, EC50 = 12 µM (panel C), vykazovali mírnější ovlivnění membránového potenciálu. Ještě menšího ovlivnění potenciálu bylo dosaženo u 3,20O-methyl-2,3-dehydrosilybinu, EC50 = 18,8 µM (panel H), 7,20-O-methyl-2,3dehydrosilybinu, EC50 = 21,9 µM (panel I), 20-O-methyl-2,3-dehydrosilybinu, EC50 = 35,5 µM (panel F), a 3,7-O-methyl-2,3-dehydrosilybinu, EC50 = 62,5 µM (panel G). Žádný efekt nevykazoval pouze silybin (panel A).

- 53 -

A

B

- 54 -

C

D

- 55 -

E

F

- 56 -

G

H

- 57 -

I

Obrázek 14. Vliv silybinu, dehydrosilybinu, mono- a di-methylovaných derivátů na membránový potenciál potkaních neonatáních kardiomyocytů. Buňky byly inkubovány s uvedenými koncentracemi testovaných látek. Graf znázorňuje poměr červené/zelené fluorescence sondy JC-1 při excitaci λEx = 488 nm. V buněčných kulturách byly také obsaženy kontrolní buňky a buňky inkubované s 1 µM CCCP a 1 µM valinomycinem, kdy ionofory sloužily pro stanovení úrovně fluorescence při zhrouceném potenciálu (v grafu neuvedeno). Křivka představuje nelineární regresi, na základě které byly vypočteny hodnoty EC50. Silybin (panel A). 2,3-dehydrosilybin (panel B), 3-O-methyl-2,3-dehydrosilybin (panel C), 5-O-methyl-2,3dehydrosilybin (panel D), 7-O-methyl-2,3-dehydrosilybin (panel E), 20-O-methyl-2,3-dehydrosilybin (panel F), 3,7-O-methyl-2,3-dehydrosilybin (panel G), 3,20-O-methyl-2,3-dehydrosilybin (panel H), 7,20-O-methyl2,3-dehydrosilybin (panel I)

- 58 -

5 DISKUZE V těle savců je běžně produkována ředa reaktivních forem kyslíku (Evans & Halliwell, 1999). Hlavním zdrojem ROS je elektron-transportní řetězec normálně metabolizující buňky, přičemž rychlost produkce mitochondriemi se zvyšuje při různých patologických stavech jako je hypoxie, ischemie, reperfuze a chemická inhibice mitochondriální respirace (Chen et al., 2003). Buňka má vyvinutý obranný mechanismus přirozeného odstranění volného radikálu, který je v těle vyprodukován. Kromě enzymů a endogenních antioxidantů se na ochraně buněk před škodlivým vlivem ROS podílejí i látky z vnějšího prostředí, mezi které se řadí kromě vitamínů i polyfenoly. Polyfenoly jsou hojně zastoupené antioxidanty v dietě člověka a jako takové mohou přispívat ke zmírnění nebo prevenci rozvoje chorob. Například v silymarinu, polyfenolovém extraktu ze semen ostropestřce mariánského (Silibum marianum), který je již dlouhou dobu znám v lidovém léčitelství pro své hepatoprotektivní účinky, je obsaženo mimo jiných i minoritní množství 2,3dehydrosilybinu (Pradhan & Girish, 2006), na který jsme se v diplomové práci zaměřili. Přestože je za hlavní vlastnost polyfenolů považována jejich antioxidační aktivita, mohou tyto látky působit i řadou jiných mechanismů, tedy nejen pouhým vychytáváním ROS. Polyfenoly jsou schopny působit také jako odpřahovače, respektive způsobit disipaci gradientu v mitochondriích (Dorta et al., 2008). Mírné odpřažení oxidativní fosforylace je považováno za organismu prospěšné (Caldeira da Silva et al., 2008), syntetické odpřahovače mají při velmi nízkých koncentracích kardioprotektivní účinky (Brennan et al., 2006a), a proto se i dnes věnuje pozornost hledání vhodných derivátů známých odpřahovačů (Blaikie et al., 2006). Cílem experimentální části diplomové práce bylo zjisitit, zda je 2,3dehydrosilybin pravým protonoforem a s pomocí mono- a di-methylovaných derivátů 2,3-dehydrosilybinu

objasnit,

která

–OH

skupina

přítomná

v molekule

2,3.dehydrosilybinu, je odpovědná za jeho chování podobné protonoforům. Diplomová práce navazovala na práci bakalářskou, kde bylo experimentálně prokázáno, že silybin a 2,3-dehydrosilybin v závislosti na koncentraci snižují produkci ROS v izolovaných mitochondriích, což korespondovalo s publikovanými daty o antioxidační aktivitě obou látek (Gazak et al., 2007). Unilamelární liposomy jsme použili jako nejjednodušší model pro otestování možnosti protonoforetického chování 2,3-dehydrosilybinu Testovanými látkami byly silybin, 2,3-dehydrosilybin a skupina derivátů 2,3-dehydrosilybinu, který byl selektivně methylován v pozici obvyklé –OH skupiny (Tab. 4). V našem systému byl nastaven gradient draslíku o hodnotě 180 mV směrem ven z liposomů. Přidání valinomycinu,

- 59 -

přenašeče draslíku, umožňuje disipaci tohoto gradientu, ale pouze v případě, je-li přítomen také protonofor (např. CCCP), který dovoluje tok protonů opačným směrem. Jedná se o elektroneutrální transport draslíku, který je možno sledovat na úbytku červené

fluorescence

sondy

JC-1.

Pokud

je

2,3-dehydrosilybin

skutečným

protonoforem, pak bude vykazovat stejný účinek jako CCCP, avšak při vyšší koncentraci. Přestože 2,3-dehydrosilybin vykazoval očekávaný účinek a účinky jeho mono- a dimethylovaných derivátů se různým způsobem lišily, nemůžeme z těchto experimentů vyvodit důležitost jednotlivých OH skupin v 2,3-dehydrosilybinu. Důvodem je zcela nečekaný účinek silybinu, který by se podle těchto experimentů choval jako protonofor. Vysvětlení pro toto chování nemáme, je však možné, že lipofilita použitých látek ovlivňovala v takto jednoduchém systému integritu liposomů, a tím tvorbu Jagregátů, nikoliv disipaci gradientu draslíku. Jako další vysvětlení se nabízí přímá interakce testovaných látek se sondou JC-1, avšak následující experimenty s použitím stejné sondy vždy ukázaly velmi slabý účinek silybinu na tvorbu J-agregátů. Liposomy nám tedy neumožnily prokázat, zda je 2,3-dehydrosilybin skutečně protonofor. Složitějším modelem jsou izolované mitochondrie, jednak díky mnohem větší ploše membrány a také přítomnosti velkého množství proteinů. Sledováním vlivu na membránový potenciál izolovaných mitochondrií pomocí sondy JC-1 (Obr. 12) jsme nejprve ověřili, zda bude 2,3-dehydrosilybin snižovat množství J-agregátů, tedy způsobovat disipaci mitochondriálního potenciálu, a silybin nikoliv. Na rozdíl od liposomů byl účinek silybinu na tvorbu J-agregátů v mitochondriích velmi slabý, kdežto 2,3-dehydrosilybin způsoboval markantní úbytek J-agregátů. Deriváty s methoxy skupinou v pozici 3, v pozici 5 a v pozici 7, tedy 3-O-methyl-2,3-dehydrosilybin, 5-Omethyl-2,3-dehydrosilybin a 7-O-methyl-2,3-dehydrosilybin, nevykazovaly žádný vliv na membránový potenciál. 20-O-methyl-2,3-dehydrosilybin vykazoval slabší účinek než 2,3-dehydrosilybin. Dimethylované deriváty pak vykazovaly účinek srovnatelný se silybinem. To nás vedlo k domněnce, že důležitým faktorem pro účinek 2,3dehydrosilybinu je mesomerní efekt všech čtyř OH skupin v molekule. Z těchto je pak 20-OH nejméně důležitá, eliminace jedné ze zbývajících tří OH skupin pak ruší účinek podobný odpřahovačům. U těchto experimentů jsme zaznamenali i další jev, kdy u monomethylovaných derivátů, kromě 7-O-methyl-2,3-dehydrosilybinu, s narůstající koncentrací docházelo ke zvýšení tvorby J-agregátů. Tento jev jsme považovali za artefakt vyvolaný změnou v účinku CCCP, které bylo použito pro srovnání jakožto syntetický odpřahovač a intenzita fluorescence naměřená po jeho přidání vstupuje do výpočtu množství Jagregátů. Dalším možným vysvětlením je bobtnání nebo naopak smršťování mitochondrií v přítomnosti derivátů 2,3-dehydrosilybinu.

- 60 -

Srovnávací experiment na mitochondriích byl proveden na Oxygrafu, kde jsme stanovovali spotřebu kyslíku izolovanými mitochondriemi po inkubaci s příslušnými deriváty (Obr. 13). U 7-O-methyl-2,3-dehydrosilybinu byl výsledek potvrzen a koncentrace kyslíku se ani po opakovaných přídavcíh 2,5 µM látky nezvyšovala, což naznačuje, že nedocházelo k žádnému odpřažení elektron-transportního řetězce. 3-Omethyl-2,3-dehydrosilybin sice zvýšenou spotřebu prokázal, ale po druhém přídavku (5 µM) docházelo k prudkému snížení respirace a ani FCCP už další odpřažení nevytvořil. Tato skutečnost naznačuje, že vyšší koncentrace dané látky způsobuje již zmíněný účinek na objem a integritu mitochondrií. Téměř stejný účinek vykazoval také 20-Omethyl-2,3-dehydrosilybin a podobný, avšak mnohem slabší, je zřetelný i u 5-O-methyl2,3-dehydrosilybinu. Tyto výsledky ukazují na klíčovou úlohu 7-OH skupiny, jejíž methylace, ať už samotné nebo v kombinaci s dalšími, eliminuje chování 2,3dehydrosilybinu jako odpřahovače. Potenciálně toxický účinek nás vedl k posouzení vlivu testovaných látek na mitochondriální potenciál v celých buňkách. Stanovený vliv methylovaných derivátů 2,3-dehydrosilybinu na membránový potenciál kardiomyocytů (Obr. 14) za použití sondy JC-1 pouze podpořil kooperativitu všech čtyř OH skupin přítomných v molekule. Všechny tři dimethylované deriváty totiž vykázaly slabší účinek na membránový potenciál než 2,3-dehydrosilybin. Z těchto experimentů plyne, že skupina 5-OH není důležitá pro účinek 2,3-dehydrosilybinu, skupiny 3-OH a 7-OH ovlivňují účinek 2,3dehydrosilybinu jen částečně. Naopak 20-OH je asi nejdůležitější pro zachování účinku mateřské látky. U silybinu nebyl dle očekávání prokázán žádný vliv na potenciál buňky.

6 ZÁVĚR Z výsledků vyplývá, že 2,3-dehydrosilybin způsobuje snížení energetického stavu kardiomyocitů, snižuje membránový potenciál izolovaných mitochondrií a zároveň zvyšuje rychlost respirace izolovaných mitochondrií. 2,3-dehydrosilybin se podle naměřených výsledků skutečně chová jako odpřahovač schopný přenosu H+ iontů přes mitochondriální membránu, čímž odpřáhne tvorbu protonového gradientu od syntézy ATP. Nemůžeme však vyvrátit možnost, že je skutečným protonoforem. Nicméně výsledky na systémech obsahujících proteiny naznačují, že přítomnost proteinů je důležitá pro účinek podobný odpřahovačům. Hypoteticky by mohl 2,3-dehydrosilybin provádět přenos protonů s využitím proteinů podobně jako mastné kyseliny interagující s odpřahujícím proteinem UcP1 (Garlid et al., 1996). Z experimentů na mitochondriích se ve smyslu odpřažení jeví jako důležité skupiny 3-OH, 5-OH a 7-OH, proto jsme navrhli model, ve kterém jsou tyto skupiny orientovány v membráně směrem k její hydrofilní části (Obr. 15). Na

- 61 -

mezimembránové straně dvojvrstvy, kde je vyšší lokální koncentrace H+, je 2,3dehydrosilybin ve formě neiontové sloučeniny a díky své celkové hydrofobicitě se může v mitochondriální membráně otáčet, tzv. flip-flop. Na matrixové straně, kde je naopak nižší lokální koncentrace H+, by mohlo dojít k ionizaci, tedy ztrátě protonu. Anion by se pak s pomocí proteinu, který by eliminoval iontový charakter, mohl v membráně otočit zpět tak, aby nabitá část směřovala k mezimembránové straně lipidové dvojvrstvy. Zde může opět dojít k protonizaci, následně otočení molekuly v membráně flip-flopem a deprotonizaci na matrixové straně s cyklickým opakováním. Selektivní methylace 2,3dehydrosilybinu by znemožňovala ionizaci a taktéž ovlivňovala orientaci molekuly v lipidové dvojvrstvě. Ověření naší hypotézy může být dosaženo s využitím techniky proteoliposomů.

- 62 -

- 63 -

Obrázek 15 Hypotetický model přenosu protonů 2,3-dehydrosilybinem.

- 64 -

7 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK 4-HNE

4-hydroxynonenal

Ant A

antimycin A

ATP

adenosintrifosfát

BSA

bovinní sérový albumin

CCCP

karbonyl kyanid-m-chlorfenylhydrazon

CoQ

ubichinon, koenzym Q, UQ

cyt b

cytochrom b

cyt c

cytochrom c

DiOC6

3,3’-dihexyloxakarbokyanin jodid

DMEM

Dulbeccova modifikace Eaglova média

DNP

dinitrofenol

DPPC

1,2-dipalmitoylfosfatidfylcholin

EDTA

ethylendiamintetraoctová kyselina

EGTA

ethylenglykoltetraoctová kyselina

Eh

aktuální potenciál

Em

standardní potenciál

ETF

electron-transfering flavoprotein

ETCH

elektron-transportní řetězec

FADH2

flavinadenindinukleotid

FCCP

karbonyl kyanid(trifluoromethoxy)fenylhydrazon

FMN

flavinmononukleotid

GPx

glutathion peroxidasa

GRd

glutathion reduktasa

GSH

glutathion

GSSG

disulfid glutathionu

HIFs

hypoxia-inducible factor, transkripční faktor

IPC

ischemický preconditioning

JC-1

5,5’,6,6‘-tetrachloro-1,1‘,3,3‘-tetraethylbenzimidazolokarbokyanin jodid

LPO

lipidová peroxidace

MDH

malondialdehyd

mitDNA mitochondriání DNA MOPS

kyselina 3-(N-morfolin)propansulfonová

Myx

myxothiazol

- 65 -

NADH

nikotinamidadenindinukleotid

NADPH nikotinamidadenindinukleotid fosfát NEAA

neesenciální aminokyseliny

PBS

fosfátový izotonický tlumivý roztok

PHDs

propyl hydroxylasa

PLA2

fosfolipasa A2

PMF

protonmotivní síla

POC

ischemický postconditioning

ROS

reaktivní kyslíkové částice

Rot

rotenon

SF6847 3,5-di-tert-butyl-4-hydroxybenzylidenmalononitril SOD

superoxiddismutasa

UPCn

odpřahující proteiny

UQ

ubichinon, koenzym Q, CoQ

Val

valinomycin

- 66 -

8 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. (2002) Molecular biology of the cell, pp. 769-828, Gerland Publishing, New York. Ames B. N., Shigenaga M. K., Hagen T. M. (1993) Oxidants, antioxidants, and the degenerative diseases of aging. Proc Natl Acad Sci U S A 90, 7915-7922. Anderson D., Phillips B. J. (1999) Comparative in vitro and in vivo effects of antioxidants. Food Chem Toxicol 37, 1015-1025. Antunes F., Salvador A., Pinto R. E. (1995) PHGPx and phospholipase A2/GPx: comparative importance on the reduction of hydroperoxides in rat liver mitochondria. Free Radic Biol Med 19, 669-677. Aruoma O. I., Halliwell B., Laughton M. J., Quinlan G. J., Gutteridge J. M. (1989) The mechanism of initiation of lipid peroxidation. Evidence against a requirement for an iron(II)-iron(III) complex. Biochem J 258, 617-620. Babcock G. T., Wikstrom M. (1992) Oxygen activation and the conservation of energy in cell respiration. Nature 356, 301-309. Barrabes J. A., Garcia-Dorado D., Ruiz-Meana M., Piper H. M., Solares J., Gonzalez M. A., Oliveras J., Herrejon M. P., Soler Soler J. (1996) Myocardial segment shrinkage during coronary reperfusion in situ. Relation to hypercontracture and myocardial necrosis. Pflugers Arch 431, 519-526. Becker B. F. (1993) Towards the physiological function of uric acid. Free Radic Biol Med 14, 615-631. Benard G., Bellance N., James D., Parrone P., Fernandez H., Letellier T., Rossignol R. (2007) Mitochondrial bioenergetics and structural network organization. J Cell Sci 120, 838-848. Bentinger M., Brismar K., Dallner G. (2007) The antioxidant role of coenzyme Q. Mitochondrion 7 Suppl, S41-50. Bertelli A., Bertelli A. A. E., Gozzini A., Giovannini L. (1998) Plasma and tissue resveratrol concentrations and pharmacological activity. Drugs under Experimental and Clinical Research 24, 133-138.

- 67 -

Blaikie F. H., Brown S. E., Samuelsson L. M., Brand M. D., Smith R. A., Murphy M. P. (2006) Targeting dinitrophenol to mitochondria: limitations to the development of a selflimiting mitochondrial protonophore. Biosci Rep 26, 231-243. Blokhina O., Virolainen E., Fagerstedt K. V. (2003) Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivation stress: a review. Ann Bot 91 Spec No, 179-194. Bokov A., Chaudhuri A., Richardson A. (2004) The role of oxidative damage and stress in aging. Mech Ageing Dev 125, 811-826. Boll M. C., Alcaraz-Zubeldia M., Montes S., Rios C. (2008) Free copper, ferroxidase and SOD1 activities, lipid peroxidation and NO(x) content in the CSF. A different marker profile in four neurodegenerative diseases. Neurochem Res 33, 1717-1723. Bopassa J. C., Michel P., Gateau-Roesch O., Ovize M., Ferrera R. (2005) Lowpressure reperfusion alters mitochondrial permeability transition. Am J Physiol Heart Circ Physiol 288, H2750-2755. Boveris A., Chance B. (1973) The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochem J 134, 707-716. Brand M. D., Affourtit C., Esteves T. C., Green K., Lambert A. J., Miwa S., Pakay J. L., Parker N. (2004) Mitochondrial superoxide: production, biological effects, and activation of uncoupling proteins. Free Radic Biol Med 37, 755-767. Brennan J. P., Berry R. G., Baghai M., Duchen M. R., Shattock M. J. (2006a) FCCP is cardioprotective at concentrations that cause mitochondrial oxidation without detectable depolarisation. Cardiovasc Res 72, 322-330. Brennan J. P., Southworth R., Medina R. A., Davidson S. M., Duchen M. R., Shattock M. J. (2006b) Mitochondrial uncoupling, with low concentration FCCP, induces ROSdependent cardioprotection independent of KATP channel activation. Cardiovasc Res 72, 313-321. Brigelius-Flohe R. (1999) Tissue-specific functions of individual glutathione peroxidases. Free Radic Biol Med 27, 951-965. Cadenas S., Aragones J., Landazuri M. O. (2010) Mitochondrial reprogramming through cardiac oxygen sensors in ischaemic heart disease. Cardiovasc Res 88, 219228.

- 68 -

Caldeira da Silva C. C., Cerqueira F. M., Barbosa L. F., Medeiros M. H., Kowaltowski A. J. (2008) Mild mitochondrial uncoupling in mice affects energy metabolism, redox balance and longevity. Aging Cell 7, 552-560. Camello-Almaraz C., Gomez-Pinilla P. J., Pozo M. J., Camello P. J. (2006) Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+ signaling. Am J Physiol Cell Physiol 291, C1082-1088. Cantu D., Schaack J., Patel M. (2009) Oxidative inactivation of mitochondrial aconitase results in iron and H2O2-mediated neurotoxicity in rat primary mesencephalic cultures. PLoS One 4, e7095. Crapo J. D., Oury T., Rabouille C., Slot J. W., Chang L. Y. (1992) Copper,zinc superoxide dismutase is primarily a cytosolic protein in human cells. Proc Natl Acad Sci U S A 89, 10405-10409. Darley-Usmar V., Halliwell B. (1996) Blood radicals: reactive nitrogen species, reactive oxygen species, transition metal ions, and the vascular system. Pharm Res 13, 649662. Davies A. J., Mazza G. (1993) Copigmentation of Simple and Acylated Anthocyanins with Colorless Phenolic-Compounds. Journal of Agricultural and Food Chemistry 41, 716-720. Dorta D. J., Pigoso A. A., Mingatto F. E., Rodrigues T., Pestana C. R., Uyemura S. A., Santos A. C., Curti C. (2008) Antioxidant activity of flavonoids in isolated mitochondria. Phytother Res 22, 1213-1218. Ernster L., Dallner G. (1995) Biochemical, physiological and medical aspects of ubiquinone function. Biochim Biophys Acta 1271, 195-204. Es-Safi N. E., Cheynier V., Moutounet M. (2002) Interactions between cyanidin 3-Oglucoside and furfural derivatives and their impact on food color changes. Journal of Agricultural and Food Chemistry 50, 5586-5595. Evans P., Halliwell B. (1999) Free radicals and hearing. Cause, consequence, and criteria. Ann N Y Acad Sci 884, 19-40. Frankel E. N., Kanner J., German J. B., Parks E., Kinsella J. E. (1993) Inhibition of Oxidation of Human Low-Density-Lipoprotein by Phenolic Substances in Red Wine. Lancet 341, 454-457.

- 69 -

Fridovich I. (1986) Superoxide dismutases. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 58, 6197. Gabrielova E., Jaburek M., Gazak R., Vostalova J., Jezek J., Kren V., Modriansky M. (2010) Dehydrosilybin attenuates the production of ROS in rat cardiomyocyte mitochondria with an uncoupler-like mechanism. J Bioenerg Biomembr 42, 499-509. Garcia-Dorado D., Rodriguez-Sinovas A., Ruiz-Meana M., Inserte J., Agullo L., Cabestrero A. (2006) The end-effectors of preconditioning protection against myocardial cell death secondary to ischemia-reperfusion. Cardiovasc Res 70, 274-285. Garlid K. D., Orosz D. E., Modriansky M., Vassanelli S., Jezek P. (1996) On the mechanism of fatty acid-induced proton transport by mitochondrial uncoupling protein. J Biol Chem 271, 2615-2620. Gazak R., Walterova D., Kren V. (2007) Silybin and silymarin--new and emerging applications in medicine. Curr Med Chem 14, 315-338. Girotti A. W. (1998) Lipid hydroperoxide generation, turnover, and effector action in biological systems. J Lipid Res 39, 1529-1542. Guyot S., Marnet N., Laraba D., Sanoner P., Drilleau J. F. (1998) Reversed-phase HPLC following thiolysis for quantitative estimation and characterization of the four main classes of phenolic compounds in different tissue zones of a French cider apple variety (Malus domestica var. Kermerrien). Journal of Agricultural and Food Chemistry 46, 1698-1705. Halliwell B. (1989) Tell me about free radicals, doctor: a review. J R Soc Med 82, 747752. Halliwell B. (1996) Vitamin C: antioxidant or pro-oxidant in vivo? Free Radic Res 25, 439-454. Hatcher D. W., Kruger J. E. (1997) Simple phenolic acids in flours prepared from Canadian wheat: Relationship to ash content, color, and polyphenol oxidase activity. Cereal Chemistry 74, 337-343. Hausenloy D. J., Yellon D. M. (2010) The second window of preconditioning (SWOP) where are we now? Cardiovasc Drugs Ther 24, 235-254.

- 70 -

Huber A., Thongphasuk P., Erben G., Lehmann W. D., Tuma S., Stremmel W., Chamulitrat W. (2008) Significantly greater antioxidant anticancer activities of 2,3dehydrosilybin than silybin. Biochim Biophys Acta 1780, 837-847. Chan C. B., Saleh M. C., Koshkin V., Wheeler M. B. (2004) Uncoupling protein 2 and islet function. Diabetes 53 Suppl 1, S136-142. Chance B., Sies H., Boveris A. (1979) Hydroperoxide metabolism in mammalian organs. Physiol Rev 59, 527-605. Chen J. Q., Cammarata P. R., Baines C. P., Yager J. D. (2009) Regulation of mitochondrial respiratory chain biogenesis by estrogens/estrogen receptors and physiological, pathological and pharmacological implications. Biochim Biophys Acta 1793, 1540-1570. Chen Q., Vazquez E. J., Moghaddas S., Hoppel C. L., Lesnefsky E. J. (2003) Production of reactive oxygen species by mitochondria: central role of complex III. J Biol Chem 278, 36027-36031. Chuang Y. C. (2010) Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in seizure-induced neuronal cell death. Acta Neurol Taiwan 19, 3-15. Jovanovic S. V., Steenken S., Hara Y., Simic M. G. (1996) Reduction potentials of flavonoid and model phenoxyl radicals. Which ring in flavonoids is responsible for antioxidant activity? J Chem Soc, Perkin Trans 2 11, 2497-2504. Kaplan P., Hendrikx M., Mattheussen M., Mubagwa K., Flameng W. (1992) Effect of ischemia and reperfusion on sarcoplasmic reticulum calcium uptake. Circ Res 71, 1123-1130. Karu T. I., Afanas'eva N. I. (1995) [Cytochrome c oxidase as the primary photoacceptor upon laser exposure of cultured cells to visible and near IR-range light]. Dokl Akad Nauk 342, 693-695. Khan A. U., Kasha M. (1994) Singlet molecular oxygen in the Haber-Weiss reaction. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 12365-12367. Kletzien R. F., Harris P. K., Foellmi L. A. (1994) Glucose-6-phosphate dehydrogenase: a "housekeeping" enzyme subject to tissue-specific regulation by hormones, nutrients, and oxidant stress. FASEB J 8, 174-181.

- 71 -

Korshunov S. S., Skulachev V. P., Starkov A. A. (1997) High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS Lett 416, 15-18. Kumamoto M., Sonda T., Nagayama K., Tabata M. (2001) Effects of pH and metal ions on antioxidative activities of catechins. Biosci Biotechnol Biochem 65, 126-132. Kumari M. V., Hiramatsu M., Ebadi M. (1998) Free radical scavenging actions of metallothionein isoforms I and II. Free Radic Res 29, 93-101. Labinskyy N., Csiszar A., Veress G., Stef G., Pacher P., Oroszi G., Wu J., Ungvari Z. (2006) Vascular dysfunction in aging: potential effects of resveratrol, an antiinflammatory phytoestrogen. Curr Med Chem 13, 989-996. Lakenbrink C., Lapczynski S., Maiwald B., Engelhardt U. H. (2000) Flavonoids and other polyphenols in consumer brews of tea and other caffeinated beverages. J Agric Food Chem 48, 2848-2852. Lenaz G., Genova M. L. (2010) Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject. Antioxid Redox Signal 12, 9611008. Levraut J., Iwase H., Shao Z. H., Vanden Hoek T. L., Schumacker P. T. (2003) Cell death during ischemia: relationship to mitochondrial depolarization and ROS generation. Am J Physiol Heart Circ Physiol 284, H549-558. Little C., O'Brien P. J. (1968) An intracellular GSH-peroxidase with a lipid peroxide substrate. Biochem Biophys Res Commun 31, 145-150. Luzikov V. N. (2009) Principles of control over formation of structures responsible for respiratory functions of mitochondria. Biochemistry (Mosc) 74, 1443-1456. Maehly A. C., Chance B. (1954) The assay of catalases and peroxidases. Methods Biochem Anal 1, 357-424. Manach C., Scalbert A., Morand C., Remesy C., Jimenez L. (2004) Polyphenols: food sources and bioavailability. Am J Clin Nutr 79, 727-747. Manach C., Williamson G., Morand C., Scalbert A., Remesy C. (2005) Bioavailability and bioefficacy of polyphenols in humans. I. Review of 97 bioavailability studies. Am J Clin Nutr 81, 230S-242S.

- 72 -

Markesbery W. R., Lovell M. A. (2007) Damage to lipids, proteins, DNA, and RNA in mild cognitive impairment. Arch Neurol 64, 954-956. Marklund S. L., Holme E., Hellner L. (1982) Superoxide dismutase in extracellular fluids. Clin Chim Acta 126, 41-51. McCord J. M., Fridovich I. (1969) Superoxide dismutase. An enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein). J Biol Chem 244, 6049-6055. Meister A. (1988) On the discovery of glutathione. Trends Biochem Sci 13, 185-188. Mitchell P. (1961) Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. Nature 191, 144-148. Mootha V. K., Bunkenborg J., Olsen J. V., Hjerrild M., Wisniewski J. R., Stahl E., Bolouri M. S., Ray H. N., Sihag S., Kamal M., et al. (2003) Integrated analysis of protein composition, tissue diversity, and gene regulation in mouse mitochondria. Cell 115, 629-640. Mu C., Jia P., Yan Z., Liu X., Li X., Liu H. (2007) Quercetin induces cell cycle G1 arrest through elevating Cdk inhibitors p21 and p27 in human hepatoma cell line (HepG2). Methods Find Exp Clin Pharmacol 29, 179-183. Mukai K., Kikuchi S., Urano S. (1990) Stopped-flow kinetic study of the regeneration reaction of tocopheroxyl radical by reduced ubiquinone-10 in solution. Biochim Biophys Acta 1035, 77-82. Mulkidjanian A. Y. (2005) Ubiquinol oxidation in the cytochrome bc1 complex: reaction mechanism and prevention of short-circuiting. Biochim Biophys Acta 1709, 5-34. Murphy M. P. (2009) How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J 417, 1-13. Murray R. K., Granner D. K., Mayes P. A. (2002) Harperova biochemie, pp. 118-120, H&H, Praha. Nayler W. G. (1981) The role of calcium in the ischemic myocardium. Am J Pathol 102, 262-270. Nicholls D. G., Ferguson S. J. (1992) Bioenergetics 2, 2 end, pp. 315-360, Academic Press, London.

- 73 -

Nicholls D. G., Locke R. M. (1984) Thermogenic mechanisms in brown fat. Physiol Rev 64, 1-64. Nojiri S., Daida H., Inaba Y. (2004) Antioxidants and cardiovascular disease: Still a topic of interest. Environ Health Prev Med 9, 200-213. Obrenovich M. E., Nair N. G., Beyaz A., Aliev G., Reddy V. P. The role of polyphenolic antioxidants in health, disease, and aging. Rejuvenation Res 13, 631-643. Obrenovich M. E., Nair N. G., Beyaz A., Aliev G., Reddy V. P. (2010) The role of polyphenolic antioxidants in health, disease, and aging. Rejuvenation Res 13, 631-643. Opie L. H., Lecour S. (2007) The red wine hypothesis: from concepts to protective signalling molecules. Eur Heart J 28, 1683-1693. Ortega R., Garcia N. (2009) The flavonoid quercetin induces changes in mitochondrial permeability by inhibiting adenine nucleotide translocase. J Bioenerg Biomembr 41, 4147. Pacher P., Nivorozhkin A., Szabo C. (2006) Therapeutic effects of xanthine oxidase inhibitors: renaissance half a century after the discovery of allopurinol. Pharmacol Rev 58, 87-114. Pompella A., Visvikis A., Paolicchi A., De Tata V., Casini A. F. (2003) The changing faces of glutathione, a cellular protagonist. Biochem Pharmacol 66, 1499-1503. Pradhan S. C., Girish C. (2006) Hepatoprotective herbal drug, silymarin from experimental pharmacology to clinical medicine. Indian J Med Res 124, 491-504. Pryor W. A., Squadrito G. L. (1995) The chemistry of peroxynitrite: a product from the reaction of nitric oxide with superoxide. Am J Physiol 268, L699-722. Ran Q., Liang H., Ikeno Y., Qi W., Prolla T. A., Roberts L. J., 2nd, Wolf N., Van Remmen H., Richardson A. (2007) Reduction in glutathione peroxidase 4 increases life span through increased sensitivity to apoptosis. J Gerontol A Biol Sci Med Sci 62, 932942. Reinli K., Block G. (1996) Phytoestrogen content of foods--a compendium of literature values. Nutr Cancer 26, 123-148. Reiter R. J. (2000) Melatonin: Lowering the High Price of Free Radicals. News Physiol Sci 15, 246-250.

- 74 -

Richter C. (1988) Do mitochondrial DNA fragments promote cancer and aging? FEBS Lett 241, 1-5. Romier B., Schneider Y. J., Larondelle Y., During A. (2009) Dietary polyphenols can modulate the intestinal inflammatory response. Nutr Rev 67, 363-378. Rosenberg H. R., Culik R. (1959) Effect of Alpha-Lipoic Acid on Vitamin-C and VitaminE Deficiencies. Archives of Biochemistry and Biophysics 80, 86-93. Salvioli S., Ardizzoni A., Franceschi C., Cossarizza A. (1997) JC-1, but not DiOC6(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells: implications for studies on mitochondrial functionality during apoptosis. FEBS Lett 411, 77-82. Santos-Buelga C., Scalbert A. (2000) Proanthocyanidins and tannin-like compounds nature, occurrence, dietary intake and effects on nutrition and health. Journal of the Science of Food and Agriculture 80, 1094-1117. Scalbert A., Williamson G. (2000) Dietary intake and bioavailability of polyphenols. J Nutr 130, 2073S-2085S. Severin F. F., Severina, II, Antonenko Y. N., Rokitskaya T. I., Cherepanov D. A., Mokhova E. N., Vyssokikh M. Y., Pustovidko A. V., Markova O. V., Yaguzhinsky L. S., et al. (2010) Penetrating cation/fatty acid anion pair as a mitochondria-targeted protonophore. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 663-668. Schneider C. (2009) An update on products and mechanisms of lipid peroxidation. Mol Nutr Food Res 53, 315-321. Sies H. (1997) Oxidative stress: oxidants and antioxidants. Exp Physiol 82, 291-295. Sigel H., Prijs B., McCormick D. B., Shih J. C. (1978) Stability and structure of binary and ternary complexes of alpha-lipoate and lipoate derivatives with Mn2+, Cu2+, and Zn2+ in solution. Arch Biochem Biophys 187, 208-214. Silverman H. S., Stern M. D. (1994) Ionic basis of ischaemic cardiac injury: insights from cellular studies. Cardiovasc Res 28, 581-597. Skulachev V. P. (1998) Uncoupling: new approaches to an old problem of bioenergetics. Biochim Biophys Acta 1363, 100-124.

- 75 -

Skulachev V. P. (2007) A biochemical approach to the problem of aging: "megaproject" on membrane-penetrating ions. The first results and prospects. Biochemistry (Mosc) 72, 1385-1396. Staat P., Rioufol G., Piot C., Cottin Y., Cung T. T., L'Huillier I., Aupetit J. F., Bonnefoy E., Finet G., Andre-Fouet X., et al. (2005) Postconditioning the human heart. Circulation 112, 2143-2148. Stahl W., Sies H. (2005) Bioactivity and protective effects of natural carotenoids. Biochim Biophys Acta 1740, 101-107. Sun F., Huo X., Zhai Y., Wang A., Xu J., Su D., Bartlam M., Rao Z. (2005) Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II. Cell 121, 10431057. Sutherland D. E., Stillman M. J. (2011) The "magic numbers" of metallothionein. Metallomics. Takami T., Sakaida I. (2011) Iron regulation by hepatocytes and free radicals. J Clin Biochem Nutr 48, 103-106. Tan D. X., Manchester L. C., Reiter R. J., Plummer B. F., Hardies L. J., Weintraub S. T., Vijayalaxmi, Shepherd A. M. (1998) A novel melatonin metabolite, cyclic 3hydroxymelatonin: a biomarker of in vivo hydroxyl radical generation. Biochem Biophys Res Commun 253, 614-620. Tomás-Barberán A. F., Clifford M. N. (2000) Dietary hydroxybenzoic acid derivatives – nature, occurrence and dietary burden. J Sci Food Agric 80, 1024–1032. Torsdottir G., Kristinsson J., Snaedal J., Sveinbjornsdottir S., Gudmundsson G., Hreidarsson S., Johannesson T. (2010) Case-control studies on ceruloplasmin and superoxide dismutase (SOD1) in neurodegenerative diseases: a short review. J Neurol Sci 299, 51-54. Trumpower B. L. (1990) The protonmotive Q cycle. Energy transduction by coupling of proton translocation to electron transfer by the cytochrome bc1 complex. J Biol Chem 265, 11409-11412. Turrens J. F. (2003) Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol 552, 335-344.

- 76 -

Turunen M., Olsson J., Dallner G. (2004) Metabolism and function of coenzyme Q. Biochim Biophys Acta 1660, 171-199. Vodrážka Z. (2007) Biochemie, pp. 21-32, Academia, Praha. Voet J., Voetova J. G. (1995) Biochemistry, pp. 599-628, John Wiley & Sons, Canada. Walker J. E., Runswick M. J. (1993) The mitochondrial transport protein superfamily. J Bioenerg Biomembr 25, 435-446. Weisiger R. A., Fridovich I. (1973) Mitochondrial superoxide simutase. Site of synthesis and intramitochondrial localization. J Biol Chem 248, 4793-4796. Yoshida K., Kaneko K., Miyajima H., Tokuda T., Nakamura A., Kato M., Ikeda S. (2000) Increased lipid peroxidation in the brains of aceruloplasminemia patients. J Neurol Sci 175, 91-95. Zadak Z., Hyspler R., Ticha A., Hronek M., Fikrova P., Rathouska J., Hrnciarikova D., Stetina R. (2009) Antioxidants and vitamins in clinical conditions. Physiol Res 58 Suppl 1, S13-17. Zhao Z. Q., Vinten-Johansen J. (2006) Postconditioning: reduction of reperfusioninduced injury. Cardiovasc Res 70, 200-211. Zweier J. L., Talukder M. A. (2006) The role of oxidants and free radicals in reperfusion injury. Cardiovasc Res 70, 181-190.

- 77 -