UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie
Vliv analogů cytokininů na růst Arabidopsis thaliana v abiotickém stresu
BAKALÁŘSKÁ PRÁCE
Autor:
Barbora Halířová
Studijní program:
B1406 Biochemie
Studijní obor:
Biochemie
Forma studia:
Prezenční
Vedoucí práce:
Mgr. Markéta Gemrotová, Ph.D.
Termín odevzdání práce: 6.5.2011
Prohlašuji, ţe jsem předloţenou bakalářskou práci vypracovala samostatně za pouţití citované literatury.
V Olomouci dne 2.5.2011 --------------------------
Ráda bych poděkovala především vedoucí své bakalářské práce Mgr. Markétě Gemrotové, Ph.D. za odborné vedení, konzultace, cenné rady a připomínky při zpracování této práce. Dále bych chtěla poděkovat Mgr. Lukáši Spíchalovi, Ph.D., Mgr. Janě Kláskové a Mgr. Jaroslavu Nislerovi, Ph.D. za cenné rady, které mi během mé práce poskytli. A v neposlední řadě děkuji celé Laboratoři růstových regulátorů.
-2-
Bibliografická identifikace: Jméno a příjmení autora
Barbora Halířová
Název práce
Vliv analogů cytokininů na růst Arabidopsis thaliana v abiotickém stresu
Typ práce
Bakalářská
Pracoviště
Katedra biochemie
Vedoucí práce
Mgr. Markéta Gemrotová, Ph.D.
Rok obhajoby práce
2011
Abstrakt
Cytokininy jsou rostlinné hormony, které hrají klíčovou roli v ţivotních procesech rostlin. Ovlivňují buněčné dělení, vývoj a růst rostlinných orgánů, podílejí se na oddálení senescence a zvyšují odolnost rostlin vůči stresům. Hlavním tématem této práce bylo pozorování vlivu analogů cytokininů na rostlinu Arabidopsis thaliana, která byla vystavena stresu kadmiem. Jako analoga cytokininů byly testovány 6-(2-hydroxy-3-methylbenzylamino)purin (PI-55), coţ je antagonista cytokininů a 2-chlor-6-(3methoxyanilino)purin
(INCYDE),
který
je
inhibitorem
degradace cytokininů. Byl zkoumán efekt těchto látek na fenotyp rostlin vystavených stresu, efekt na mnoţství fotosyntetických poškození
pigmentů
membrán,
(chlorofyly,
mnoţství
karotenoidy),
fenolických
látek
a flavonoidů. Dále byl také sledován vliv INCYDE a PI-55 na
aktivitu
enzymů
polyfenoloxidasy,
katalasy
a peroxidasy. Stanovení byla provedena na rostlinách pěstovaných
v tekutém
v hydroponickém
½
kultivačním
MS
médiu
systému.
a U
také obou
zkoumaných látek byl pozorován jak pozitivní, tak negativní efekt na testované aspekty v závislosti na jejich koncentraci. Klíčová slova
Cytokininy, analoga cytokininů, abiotický stres
Počet stran
55
Počet příloh
0
Jazyk
Český
-3-
Bibliographical identification: Autor’s first name
Barbora Halířová
and surname Title
Effects of analouges of cytokinins on growth of Arabidopsis thaliana in the presence of abiotic stress
Type of thesis
Bachelor
Department
Department of biochemistry
Supervisor
Mgr. Markéta Gemrotová, Ph.D.
The year of presentation
2011
Abstract
Cytokinins are plant hormones that play a key role in the life processes of plants. They affect cell division, plant growth and development and are involved in delaying senescence and increasing plant resistance to stress. The main focus of this work was study of the effect of cytokinin analogues on Arabidopsis thaliana, that was exposed to cadmium stress. The cytokinin analogues 6 - (2-hydroxy-3-methylbenzylamino) purine (PI-55), an cytokinin antagonist, and 2-chloro-6-(3-methoxyanilino) purine (INCYDE), an inhibitor of degradation of cytokinins, were used in this study. The effect of the compounds were studied on the phenotype of plants exposed to stress, the amount of photosynthetic pigments (chlorophylls, carotenoids), membrane damage,
the
amount
of
total
phenolics
and flavonoids.
Futhermore, the effect of INCYDE and PI-55 on the activity of polyphenololoxidase,
catalase
and
peroxidase
was
also
examined. The determination was performed on plants grown in the liquid ½ MS medium and in the hydroponic cultivation system. For the both investigated compounds, the positive and negative effect on the tested aspects, depending on the concentration, was observed. Keywords
Cytokinins, analouges of cytokinins, abiotic stress
Number of pages
55
Number of
0
appendices Language
Czech
-4-
Obsah Cíle práce
7
Teoretická část
8
1. Fytohormony
9
1.1. Cytokininy
9
1.1.1. Biosyntéza cytokininů
10
1.1.2. Degradace cytokininů
11
1.1.3. Signalizace cytokininů
11
1.1.4. Cytokininy a abiotický stres
12
1.1.5. Analoga cytokininů
13
2. Stres u rostlin
14
2.1. Abiotický stres – těţké kovy
16
2.1.1. Příjem těţkých kovů
17
2.1.2. Efekt těţkých kovů na rostliny
17
2.1.3. Odolnost a detoxifikace těţkých kovů rostlinami
19
2.1.3.1. Fenolické látky
20
2.1.3.2. Flavonoidy
21
2.1.3.3. Antokyany
21
2.1.3.4. Reaktivní formy kyslíku
21
Praktická část
24
3. Materiál a přístroje
25
4. Metody
26
4.1. Kultivace rostlin na tekutém ½ MS médiu
26
4.2. Pěstování A. thaliana v hydroponii
26
4.3. Stanovení peroxidace membránových lipidů
27
4.4. Stanovení celkových fenolických látek
27
4.5. Stanovení chlorofylu a karotenoidů
28
4.6. Stanovení flavonoidů
28
4.7. Stanovení specifické aktivity enzymů
29
5. Výsledky
30
5.1. Hodnocení fenotypu rostlin
30
5.2. Mnoţství fotosyntetických pigmentů
31
5.3. Peroxidace membránových lipidů
35
-5-
5.4. Stanovení fenolických látek
38
5.5. Stanovení flavonoidů
40
5.6. Stanovení specifické aktivity enzymů
42
6. Závěr a diskuze
46
7. Seznam pouţitých zkratek
49
8. Seznam pouţité literatury
50
-6-
Cíle práce: •
Zpracování rešerše na téma cytokininy a abiotický stres u Arabidopsis thaliana
•
Optimalizace hydroponického systému pěstování Arabidopsis thaliana
•
Hodnocení fenotypu rostlin Arabidopsis thaliana vystavených účinku abiotického stresu a inhibitoru metabolismu nebo percepce cytokininů
•
Kvantifikace látek zapojených do oxidativního poškození m embrán a stanovení celkových fenolických látek, flavonoidů a aktivity enzymu polyfenoloxidasy, katalasy a peroxidasy
-7-
Teoretická část
-8-
1.
Fytohormony Látky, které regulují růstové a vývojové procesy u rostlin označujeme jako
růstové regulátory. Ty je moţno rozdělit do dvou skupin, a to na fytohormony (rostlinné hormony) a další látky s regulační aktivitou. V závislosti na koncentraci mohou mít tyto látky jak stimulační tak inhibiční účinek. Existuje šest skupin endogenních rostlinných hormonů. Jedná se o cytokininy, auxiny, gibereliny, kyselinu abscisovou, strigolaktony a ethylen, které v rostlinách působí ve velmi nízkých koncentracích. Další látky s regulační aktivitou nejsou jiţ řazeny mezi fytohormony, protoţe účinkují aţ ve vyšších koncentracích. Do této skupiny látek se řadí brassinosteroidy, polyaminy, kyselina jasmonová a velká skupina fenolických látek (Procházka et al., 1998).
1.1. Cytokininy Přírodní cytokininy (CK) jsou N6-substituované deriváty adeninu. Podle postranního řetězce na N6 mohou být aromatické nebo isoprenoidní (Mok & Mok, 2001). U obou skupin jsou drobné rozdíly ve struktuře postranního řetězce, jako je nepřítomnost nebo naopak přítomnost hydroxylové skupiny a její stechiometrická pozice („Obr.1“; Sakakibara, 2006).
N6-(Δ2-isopentenyl)adenin
trans-zeatin
(iP)
(tZ)
-9-
benzyladenin
meta-topolin
(BA)
(mT)
Obr. 1: Příklady struktur přírodních isoprenoidních a aromatických cytokininů. Jsou uvedeny jejich triviální názvy a zkratky. Cytokininy jako rostlinné hormony plní celou řadu funkcí. Podílejí se na regulaci proliferace a diferenciace rostlinných buněk, na oddálení senescence a také na zvýšení produktivity plodin. Dále stimulují růst nadzemních částí rostlin, jsou negativním regulátorem růstu kořenů. CK se podílejí na regulaci růstu postranních pupenů, apikální dominanci a klíčení semen (Mok & Mok, 1994).
1.1.1.
Biosyntéza cytokininů
Dosud byly popsány jen dráhy biosyntézy isoprenoidních cytokininů, a to buď rozpadem modifikované tRNA a nebo N-prenylací adenosin 5´-fosfátu (AMP, ADP, ATP) na atomu N6 pomocí enzymu isopentenyltransferasa (IPT). Existují dva typy isopentenyltransferas, adenylát IPT (EC 2.5.1.27, Blackwell & Horgan, 1993; Kakimoto, 2001; Takei et al., 2001) přenášející prenylový zbytek na N6 atom AMP, ADP nebo ATP a tRNA IPT (EC 2.5.1.8), která modifikuje stejným způsobem adenin v tRNA. Prenylové
donory
mohou
být
dimethylalyl
difosfát
(DMAPP)
nebo
hydroxymethylbutenyl difosfát (HMBDP). IPT má proměnlivou substrátovou specifitu v závislosti na isoformě a původu enzymu (Sakakibara, 2006). Do biosyntézy cytokininů u rostliny Arabidopsis thaliana je zapojeno 8 IPT genů. Adenylát-IPT jsou AtIPT1, AtIPT3 aţ AtIPT8 (Kakimoto, 2001). AtIPT1, AtIPT3, AtIPT5 a AtIPT8 jsou lokalizovány v plastidech, zatímco AtIPT4 a AtIPT7 se nacházejí v cytosolu a v mitochondriích (Kasahara et al., 2004). Rostlinné isopentenyltransferasy pouţívají jako akceptor prenylu dominantně ATP nebo ADP před AMP (Kakimoto, 2001). AtIPT2 a AtIPT9 patří mezi tRNA-IPT enzymy, které modifikují specifické tRNA.
- 10 -
Aromatické cytokininy vykazují sice silnou cytokininovou aktivitu, ale jejich dráhy biosyntézy a degradace nebyly zatím objasněny.
1.1.2. Na
Degradace cytokininů ireverzibilní
degradaci
cytokininů
se
podílí
enzym
cytokininoxidasa/dehydrogenasa (CKX, EC 1.5.99.12). Jeho aktivitu poprvé změřili v extraktu z tabáku (Pačes et al., 1971). U Arabidopsis thaliana bylo nalezeno několik isoenzymů, které jeví odlišné biochemické vlastnosti. AtCKX2, AtCKX4 a AtCKX6 projevují největší aktivitu k isopentenyladeninu a trans-zeatinu. Další formy enzymu CKX dávají přednost jiným substrátům, jako jsou glykosidy a nukleotidy (Galuszka et al., 2007). CKX je enzym, který ve své molekule kovalentně váţe flavin adenin dinukleotid (FAD), který plní funkci koenzymu. Atomovou absorpční analýzou bylo zjištěno, ţe CKX nemá ve své struktuře ţádný těţký kov (Bilyeu et. al., 2001).
1.1.3.
Signalizace cytokininů
Cytokininové signály přicházejí do buňky přes dvou komponentový systém, který je sloţen z histidinkinasy (HK) a regulátoru odpovědi (RR). Většina histidinkinas jsou transmembránové receptory, které mají extracelulárně umístěné domény určené k vnímání signálu (tzv. input domain) a domény v cytoplasmě, které umoţňují přenos signálu přes membránu (transmitter domain). RR jsou charakteristické tím, ţe obsahují přijímací doménu (receiver domain) a většina z nich také výstupní doménu (tzv. efektor; „Obr.2“; Kakimoto, 2003).
Obr. 2: Obecný model dvou komponentového systému (Kakimoto, 2003) Pokud histidinkinasa rozpozná odpovídající signál, dochází k fosforylaci. Fosfátová skupina je následně přenesena na regulátor odpovědi, kde způsobí konformační změny, coţ umoţní expresi efektorových proteinů (Kakimoto, 2003).
- 11 -
U Arabidopsis thaliana se v signální dráze uplatňují histidinkinásové receptory CRE1/AHK4, AHK2, AHK3. U Arabidopsis thaliana jsou regulátory odpovědi kódovány 22 geny, z čehoţ 11 genů kóduje A-typ ARRs a 11 genů B-typ ARRs. A-typ ARRs má přijímací doménu s krátkým C-terminálním prodlouţením, zatímco B-typ má přijímací doménu s dlouhým C-terminálním prodlouţením. Na rozdíl od A-typu ARRs nejsou ARRs B-typu indukované působením cytokininů (Kakimoto, 2003). Hladina B-typu RR je stálá a jsou to aktivátory transkripce cílových genů, mezi které patří i A-typ RR působící jako negativní zpětná vazba v cytokininové signální dráze (Heyl & Schműlling, 2003).
1.1.4.
Cytokininy a abiotický stres
Geny, které kódují proteiny signální dráhy cytokininů, jsou rozdílně ovlivňovány různými druhy abiotického stresu. Stres chladem rychle zvyšuje expresi A-typu ARRs a naopak sniţuje expresi všech tří cytokininových receptorů. To naznačuje úlohu cytokininů v reakci na stres chladem, ovšem cytokininy nejsou pravděpodobně zapojeny do rychlé reakce na tento stres (Argueso et al., 2009). Pokud je rostlina vystavena suchu, tak vzniklá dehydratace způsobí sníţení hladiny isoprenoidních cytokininů (zeatin, zeatin ribosid) v xylémové míze, zatímco u aromatických cytokininů je pozorován trend opačný. Z aromatických cytokininů detekovali v xylémové míze hlavně benzyladenin. Zvýšená koncentrace aromatických cytokininů můţe bránit senescenci listů během období sucha nebo můţe zvýšit hladinu prolinu, který působí jako osmotický protektant v reakci na vodní stres (Alvarez et al., 2008). Nedávno bylo prokázáno, ţe také během osmotického stresu hrají roli Arabidopsis histidinkinasy. AHK receptorové mutanty jsou mnohem odolnější vůči tomuto stresu. Výsledky ukazují, ţe AHK2 a AHK3 mutanti mají vysokou toleranci vůči suchu a salinitě (Tran et al., 2010). Dále bylo prokázáno, ţe IPT-geneticky mutované rostliny tabáku jsou odolnější vůči suchu (Rivero et al., 2007). Byl zkoumán vliv stresu u kukuřice na aktivitu CKX. Zjistilo se, ţe stres neměl okamţitý účinek na aktivitu CKX, ale byl pozorován významný pokles aktivity tohoto enzymu v kořenové tkáni tři hodiny po vystavení rostliny osmotickému nebo salinitnímu stresu (Vyroubalová et al., 2009).
- 12 -
Analoga cytokininů
1.1.5.
BA
PI-55
INCYDE
Obr. 3: Strukturní vzorce zkoumaných analogů cytokininů. BA benzyladenin, 6-(2hydroxy-3-methylbenzylamino)purin jako PI-55 a 2-chlor-6-(3-methoxyanilino)purin jako INCYDE Od doby kdy byly objeveny cytokininy, bylo identifikováno velké mnoţství látek, jejichţ účinek je agonistický či antagonistický. Mezi cytokininové antagonisty patří například 6-(2-hydroxy-3-methylbenzylamino)purin (PI-55), jehoţ struktura je odvozena od aromatického cytokininu 6-benzylaminopurinu. PI-55 ovlivňuje signální dráhu cytokininů a jeho hlavním cílem je receptor CRE1/AHK4, na kterém kompetuje s přirozenými cytokininy, a tak zabraňuje přenosu signálu skrz tyto histidinkinasy. PI-55 se podílí na urychlování klíčení semen Arabidopsis thaliana, podporuje růst kořenů a tvorbu postranních kořenů (Spíchal et al., 2009). PI-55 účinkuje i na další rostliny, zvětšuje kořenový systém a zmírňuje negativní účinek těţkého kovu kadmia během růstu Rumex crispus a Bulbine natalensis (Gemrotová et al., 2011, nepublikovaná data). Mezi analoga cytokininů patří také 2-chlor-6-(3-methoxyanilino)purin (INCYDE , inhibitor of cytokinin degradation, „Obr.3“). Zatímco tato látka jen velmi slabě aktivuje receptory AHK3 a AHK4, na úrovni inhibice AtCKX2 vykazuje silnou aktivitu (Zatloukal et al., 2008). Tato látka byla mimo jiné krystalizována společně s kukuřičným enzymem ZmCKX1, coţ potvrdilo stejnou vazbu v aktivním místě CKX, jako v případě přirozeného cytokininu (Spíchal et al., nepublikovaná data). Látky s podobnými účinky jsou potenciálním nástrojem k cílené modulaci hladin endogenních cytokininů nebo k ovlivnění jejich signálních drah, coţ umoţňuje regulovat růst a vývoj rostlin vedoucí k zajímavým fenotypovým změnám.
- 13 -
2.
Stres u rostlin Rostliny jsou během svého ţivota ovlivňovány variabilními podmínkami vnějšího
prostředí. Nepříznivé odchylky v prostředí, ve kterém se rostliny vyskytují, se označují jako stresové faktory. Pojmem stres se označuje stav, kdy jsou rostliny pod vlivem těchto stresových faktorů, přičemţ je obvyklé, ţe rostlina je vystavena více stresovým faktorům najednou (záření, sucho, teplo). Podle druhu stresových faktorů můţe být rostlina vystavena stresu biotickému a abiotickému. Biotický stres: Patogeny (viry, mikroorganismy, houby) Herbivoři Vzájemné ovlivňování (parazitismus, alelopatie) Abiotický stres: A)
Fyzikální: Působení větru Nadměrné nebo nedostatečné záření (UV, viditelné) Extrémní teploty (horko, chlad)
B)
Chemický: Vystavení nedostatku nebo nadbytku vody Nedostatek kyslíku Nedostatečné mnoţství ţivin Nadbytek iontů solí v půdě Toxické látky Pokud je rostlina vystavena působení některého ze stresových faktorů, dochází
ke spouštění řetězce reakcí, který je označován jako stresová reakce („Obr.4“). Na začátku působení stresového faktoru dochází k narušení základních rostlinných funkcí a buněčných struktur a nastává tzv. poplachová fáze. Pokud je působení stresového faktoru v souladu s přeţitím rostliny a nemá letální účinky, dochází k mobilizaci kompenzačních mechanismů a rostlina přechází do restituční fáze. Kompenzační systémy umoţňují zvýšit odolnost vůči danému stresovému faktoru, rostlina si vytvoří určitou odolnost a je tedy ve fázi maximální rezistence. Při dlouhodobém vystavení rostliny stresu dochází k vyčerpání a tím i k poklesu rezistence. Vzhledem k rozmanitosti stresových faktorů je však také stresová odpověď u rostlin velmi rozmanitá, a proto existuje velké mnoţství odchylek od ideálního průběhu stresové reakce. Reakce rostlin na stres závisí jak na intenzitě a délce působení stresoru, tak i na genetických vlastnostech rostliny, které se označují jako adaptační vlastnosti (Procházka et al., 1998).
- 14 -
Utuţování
Maximální rezistence
Fáze vyčerpání
Normální stav
Začátek stresu
Restituční fáze
Poplachová fáze Obr.4: Idealizovaný průběh stresové reakce (převzato z Procházka et al., 1998).
U rostlin vystavených stresu dochází k tvorbě osmoregulačních sloučenin, jako jsou cukry, jednoduché dusíkaté látky a polyalkoholy. Na zvýšení odolnosti vůči působení stresového faktoru má vliv tvorba a odstraňování reaktivních forem kyslíku, tvorba fytohormonů, z nichţ se v největší míře jedná o ethylen, kyselinu abscisovou, kyselinu jasmonovou, methyljasmonáty a polyaminy. Další odpovědí na stres je tvorba stresových proteinů, jejichţ indukce je vázána na působení určitého stresového faktoru. Mezi tyto stresové proteiny patří HSP (heat-shock proteins), proteiny indukované chladem (cold-induced proteins), dehydratací (dehydration-induced proteins), patogeny (pathogenesis-related proteins, PRP) a proteiny indukované sníţenou koncentrací kyslíku (anaerobic stress proteins, ASP; Procházka et al., 1998).
- 15 -
2.1. Abiotický stres – těžké kovy Označení těţké kovy se pouţívá pro prvky, které mají hustotu větší neţ 5 g/cm3. Mezi těţké kovy patří arsen, stříbro, kadmium, kobalt, chrom, měď, rtuť, ţelezo, zinek, vanad a celá řada dalších prvků (Adriano, 2001). Těţké kovy mohou být jak esenciální, tak neesenciální mikroprvky. Mezi esenciální patří například ţelezo, zinek a měď, které jsou nezbytné pro správný vývoj a růst rostlin. Deficit mikroprvků můţe způsobit poruchy fyziologických procesů. Mezi neesenciální zařazujeme prvky jako kadmium, olovo a rtuť (Cuypers et al., 2009). U minerálních látek, zejména u esenciálních prvků, existuje souvislost mezi růstem rostlin a koncentrací daného prvku („Obr.5“).
Růst
Optimum
Deficitní zóna
Toxická zóna
Koncentrace kovu Obr. 5: Vztah mezi růstem rostliny a koncentrací esenciálních kovů (převzato od Macnair, 1993). V oblasti deficitní zóny má rostlina nedostatek minerálů a má omezený růst. Se zvyšující koncentrací se růst zlepšuje. Pokud má rostlina optimální mnoţství minerálů je i její růst optimální. Pokud mnoţství kovu přesáhne adekvátní úroveň, stává se pro rostlinu toxický. V toxické zóně je růst inhibován (Macnair, 1993).
- 16 -
2.1.1.
Příjem těžkých kovů
Převáţná většina kovů včetně těţkých je přijímána kořeny, ale rizikové prvky se mohou do rostliny dostávat také skrz listy mimokořenovým příjmem z atmosféry. Distribuce těţkých kovů v kořenech a nadzemních částech rostlin se liší mezidruhově, ale i v rámci jednoho druhu (Procházka et al., 1998). Například u tabáku je aţ 80 % z přijatého Cd v listech (Mench et al., 1989). Příjem je způsoben nedostatečnou selektivitou transportérů (Procházka et al., 1998). U rostlin se můţeme setkat s celou řadou přenašečů podílejících se na příjmu a translokaci těţkých kovů. První typem transportérů jsou P typy ATPas pro přenos těţkých kovů (HMAs = heavy metal ATPases). Během reakce dochází k vytvoření fosforylovaného meziproduktu a odtud je odvozeno, ţe se jedná o P-typy. Některé z nich přenášejí jednomocné nebo dvojmocné ionty. Dále se jedná o ABC transportéry (ATP-binding cassete), z nichţ většina jsou proteiny, které fungují jako primární pumpy poháněné hydrolýzou ATP. Slouţí také k přenosu kadmia ve formě chelátů. Nramps (natural rezistence associated macrophage proteins) jsou integrální membránové proteiny. U Arabidopsis thaliana bylo objeveno 6 druhů těchto přenašečů. Umoţňují příjem kadmia, ţeleza a maganu. CDF transportéry (Cation diffusion facilitator) jsou proteiny umoţňující transport těţkých kovů, především kadmia, kobaltu a zinku. ZIP transportéry (ZRT, IRT-like proteins) jsou proteiny podílející se na přenosu ţeleza, zinku, manganu a kadmia. Kationt/H+ antiportéry se podílejí na udrţování rovnováhy koncentrace Na+ a Ca2+ iontů. Transportér CAX2 umoţňuje přenos především vápníku, kadmia a manganu (Hall & Williams, 2003).
2.1.2.
Efekt těžkých kovů na rostliny
Těţké kovy interagují s mnoha buněčnými komponenty a tím narušují normální fungování metabolismu, coţ způsobuje závaţné poškození buňky a v krajním případě aţ smrt. Mohou se vázat přes sulfhydrylové nebo fosfátové skupiny a tím dochází k narušení funkce enzymů a proteinů.
SH Enzym SH
S + M2+ ( kovový iont )
M + 2H+
Enzym S
Kadmium patří mezi nejjedovatější těţké kovy. Jeho toxicita spočívá především ve schopnosti nahrazovat kovy přirozeně obsaţené v metaloproteinech. Metaloenzymy mohou obsahovat Fe, Co, Mn, Mg, Zn a další, které mohou být substitucí inhibovány.
- 17 -
Zinek je součástí mnoha důleţitých metaloenzymů, jako je alkoholdehydrogenasa, adenosintrifosfatasa, amylasa a další. Díky chemické podobnosti je kadmium schopno zinek z těchto enzymů vytěsnit a nahradit ho. Enzym obsahující kadmium se pak stává inaktivním (Prasad, 2004). Kadmium inhibuje enzymy zapojené do asimilace dusíku, jako je nitrátreduktasa a nitritreduktasa, čímţ dochází ke sníţení obsahu nitrátů v rostlině (Gouia et al. 2000). Kadmium v niţších koncentracích má mírně stimulační účinek, ovšem v koncentracích vyšších neţ 10-2 mol/l klíčení zcela zastavuje (Sawidis, 2008). Rostliny vystavené působení těţkých kovů mají redukovanou nadzemní biomasu i kořeny. Se zvyšující se koncentrací se tento efekt zesiluje. Účinek těţkých kovů na mnoţství biomasy byl potvrzen např. u Arachis hypogaea L., kde v porovnání s mědí a zinkem působilo nejsilněji kadmium (Shi & Cai, 2009). U Triticum aestivum L. byla pozorována inhibice růstu kořene a sníţení kořenové i nadzemní biomasy. Negativní efekt byl pozorován uţ při koncentraci 265 μM Cd, kdy došlo ke zkrácení délky kořene o 40 %. U rostlin pěstovaných v ţivném roztoku obsahujícím 1 mM Cd došlo ke zkrácení kořene o 60 % (Ouzounidou et al., 1997). Kadmium má také negativní vliv na krycí pletiva. U rostlin vystavených vysokým koncentracím kadmia lze pozorovat zejména chlorózy, červenohnědé zbarvení listů, zvýšený výskyt trichomů a uzavřené průduchové buňky (Barceló et al., 1988). Těţké kovy způsobují Fe-chlorózy. Kovy jako je nikl, měď a kadmium inhibují III
Fe reduktasu, coţ způsobuje sníţení tvorby FeII, které je pro proces fotosyntézy nezbytné. Naopak kovy jako mangan, olovo a zinek mají pouze malý vliv na aktivitu tohoto enzymu (Alcántara et al., 1994). Kadmium ovlivňuje proces fotosyntézy také inhibicí enzymu ribulosa-1,5bisfosfátkarboxylasy (RUBISCO), který je klíčovým enzymem Calvinova cyklu (Siedlicka et al., 1997). Dále má vliv na fotosyntetické pigmenty. Rostliny, které byly vystaveny působení kadmia, obsahovaly sníţené mnoţství chlorofylu i karotenoidů (Larsson et al., 1998). Těţké kovy mají také negativní vliv na proces dýchání u rostlin. Cd inhibuje otevírání průduchů a důsledkem toho je zvýšení hustoty průduchů na horní nebo dolní epidermis (Sanita di Toppi & Gabbrielli, 1999; Shi & Cai, 2008). Těţké
kovy
způsobují
poškození
buněčných
membrán
peroxidací
membránových lipidů (Vanhoudt et al., 2008). Výrazný efekt má také kadmium na strukturu DNA. Můţe docházet k přímé interakci, kdy vznikají kovalentní vazby mezi Cd2+ a DNA, a nebo se jedná o nepřímé oxidační poškození DNA vlivem zvýšení oxidantů v buňce a produkcí volných radikálů (Hossain & Huq, 2002).
- 18 -
2.1.3.
Odolnost a detoxifikace těžkých kovů rostlinami
Odolnost rostlin vystavených působení těţkých kovů se liší nejen mezidruhově, ale i v rámci jednoho druhu. Obecně však rostliny disponují několika mechanismy, které je ochraňují před působením těţkých kovů. Mezi tyto mechanismy patří mykorhiza, která zmírňuje působení toxicity těţkých kovů. Jako ochrana před těţkými kovy se uplatňují především pektiny v buněčné stěně, které ve své struktuře obsahují kyselinu galakturonovou. Záporně nabité karboxylové skupiny jsou schopné poutat kationty těţkých kovů (Procházka et al., 1998). Důleţitou roli hraje také plasmatická membrána při homeostázi iontů, včetně těţkých kovů. Vstup toxických iontů do buňky můţe být znesnadněn zvýšenou selektivitou transportních proteinů (Procházka et al., 1998; Hall, 2002). Rostliny vystavené různým formám stresu produkují stresové proteiny. Tyto proteiny jsou zvýšeně exprimovány hlavně při teplotě vyšší neţ je optimální, ale jsou produkovány i při stresu těţkými kovy (Hall, 2002). Pokud se jiţ těţké kovy dostanou do rostlinné buňky, můţou se vázat na kyselinu citronovou, jablečnou či šťavelovou. Obdobnou funkci můţe vykonávat i aminokyselina histidin nebo fytin. Fytin je vápenato-hořečnatá sůl myoinositolhexafosfátu. Fytin můţe být rozptýlen v matrix nebo je uloţen v agregátech zvaných globoidy. Metallothioneiny jsou molekuly, které obsahují velké mnoţství cysteinů a podílejí se na udrţování homeostázy esenciálních prvků. Na cysteinových zbytcích dochází díky thiolovým skupinám –SH k navázání kovových iontů (Rauser, 1999). Díky této vlastnosti se můţou podílet na chelatizaci toxických kovů (převáţně kadmium a rtuť) a účastní se ochrany před oxidativním poškozením buňky (Gasic & Korban, 2006). Kromě metallothioneinů existují i tzv. „metallothionein-like“ proteiny. Většina z nich je sloţena z 63 aţ 83 aminokyselin a jedná se tedy spíše o peptidy (Kotrba et al., 1999). Další skupinou molekul, které chrání buňku před toxickými kovy a jsou bohaté na cystein, jsou fytochelatiny. Základní struktura je (γ-Glu-Cys) n -X , kde n = 2 aţ 11 a X jsou aminokyseliny Gly, Ala, Glu nebo Ser. Tyto peptidy se nacházejí v cytoplazmě, kde na sebe váţou těţké kovy a přenášejí je do vakuoly (Vacek et al., 2003). Glutathion (GSH) a jeho homology jsou prekurzory fytochelatinů (Kotrba et al., 1999). Na aktivitu enzymu fytochelatin syntasy má vliv přítomnost některých iontů těţkých kovů („Obr.6“). Fytochelatiny jsou vytvářeny při vystavení iontům Ag+, Bi3+, Pb2+, Zn2+, Cu2+, Hg2+. Největší aktivita fytochelatin syntasy byla pozorována jako odpověď na působení Cd2+ (Grill et al., 1989). Některé prvky jako Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Al3+ nebo Fe2+ syntézu fytochelatinů neindukují (Kotrba et al., 1999).
- 19 -
Obr. 6: Syntéza fytochelatinů (PC) v závislosti na přítomnost Cd2+ a lokalizace komplexu Cd2+-PC (Kotrba et al., 1999) Kadmium vstupuje do cytoplasmy (1), kde aktivuje fytochelatin syntasu (2) a vytváří se fytochelatin (PC). Fytochelatin reaguje s Cd2+ (3) a vzniká komplex Cd2+-PC. Tento komplex je transportován do vakuoly (4). Ve vakuole dochází k uvolnění Cd2+ z komplexu s fytochelatinem. Cd2+ můţe být vázán vakuolárními ligandy a fytochelatiny jsou degradovány. Kadmium můţe vakuolu opustit díky Cd2+/H+ antiportu (7) (Kotrba et al., 1999).
2.1.3.1.
Fenolické látky
Fenolické látky jsou sekundární metabolity. Jsou syntetizované především z kyseliny
skořicové,
která
je
vytvářena
z fenylalaninu
působením
enzymu
fenylalaninamoniaklyasa (PAL, EC 4.3.1.5). K fenolickým látkám patří jednoduché fenoly, benzoové kyseliny, fenylpropanoidy a flavonoidy. Koncentrace fenolických látek se zvyšuje, kdyţ je rostlina infikována nebo poraněna, za nízkých teplot a pokud je vystavena nízkým nutričním podmínkám. Zvýšená hladina fenolických látek byla pozorována také u rostlin vystavených stresu těţkými kovy. Většina z nich má antimikrobiální účinky. Fenolické látky jsou významné pro své antioxidační účinky a schopnosti chelatovat těţké kovy. Fenolické antioxidanty jsou schopné inhibovat
- 20 -
peroxidaci lipidů vychytáváním lipidových alkoxylových radikálů. Tato schopnost je závislá na struktuře molekul, na počtu a poloze hydroxylových skupin v molekulách. Tento efekt fenolických látek byl v největší míře pozorován u flavonoidů (Michalak, 2006).
2.1.3.2.
Flavonoidy
Flavonoidy jsou fenolické látky (sekundární metabolity), které rozdělujeme do dvou skupin vzhledem k jejich strukturní odlišnosti. Jedná se o flavonoidy a isoflavonoidy. Obě základní struktury obsahují 15 uhlíků (C15). Isoflavonoidy jsou odvozeny od 1,2-difenylpropanu, zatímco flavonoidy od 1,3-difenylpropanu. Velká většina flavonoidů obsahuje ve své struktuře jako základní skelet 2-fenylchroman nebo 3-fenylchroman. Flavonoidy jsou látky, které mají velkou strukturní i funkční rozmanitost. Mají antimykotickou a insekticidní aktivitu, regulují buněčnou proliferaci, dokáţí chelatovat těţké kovy, působí jako antioxidanty chránící rostlinu před oxidačním stresem způsobeným vysokou hladinou těţkých kovů atd. (Tahara, 2007). Flavonoidy mohou přímo odstraňovat aktivní formy kyslíku (superoxidový, hydrogenperoxidový, hydroxylový radikál a singletový kyslík). Jejich antioxidační účinnost spočívá především ve schopnosti poskytovat elektrony nebo vodíkové atomy (Michalak, 2006).
2.1.3.3.
Antokyany
Antokyany jsou ve vodě rozpustné pigmenty, které absorbují zelené a ţluté světlo o vlnových délkách 500-600 nm a jsou odpovědné za červené zbarvení listů rostlin. Listy zbarvené antokyany přitahují nebo naopak odpuzují některé ţivočišné druhy, ochraňují fotosyntetický aparát, chrání rostliny před účinky UV-B záření, sniţují oxidační zatíţení listu. Antokyany se podílejí na zvyšování tolerance vůči stresu, dále také zvyšují odolnost vůči chladu a těţkým kovům (Gould, 2004).
2.1.3.4.
Reaktivní formy kyslíku (ROS)
Úloha těchto látek můţe mít v rostlinách do značné míry rozporuplný charakter. ROS vznikají jako toxické produkty během působení určitých stresových faktorů, a proto rostliny potřebují celou řadu účinných systémů, které umoţňují jejich deaktivaci. Na druhou stranu mohou slouţit jako ochranné signály v době, kdy je rostlina vystavena stresu, a proto je vhodné jejich hladinu udrţovat na konstantní hodnotě. Aktivní formy kyslíku vznikají během procesů, které probíhají v organelách a především v jejich membránách. Mezi hlavní organely tvorby ROS patří chloroplasty, kde dochází k absorpci světelného záření a zároveň je v nich zvýšená koncentrace kyslíku, který vzniká v procesu fotolýzy vody. Ve fotosystému I díky Mehlerově reakci vzniká
- 21 -
superoxid, ze kterého se mohou posléze vytvořit hydroxylové radikály a peroxid vodíku. Pokud je rostlina pod vlivem různých stresových faktorů, dochází ke zvýšené tvorbě ROS v chloroplastech a tím se zvyšuje riziko poškození tylakoidů. K tvorbě superoxidu můţe docházet i ve fotosystému II, přičemţ zde by fotoredukce kyslíku mohla mít i pozitivní funkci. Chrání fotosystém II před fotoinhibičním poškozením, a to zejména díky rozptýlení excitační energie. Mezi další organely, ve kterých dochází k tvorbě reaktivních forem kyslíku patří mitochondrie, peroxisomy, glyoxysomy a mikrosomy. Negativní vliv ROS spočívá především v peroxidaci membránových lipidů. K tomuto
procesu
mají největší dispozice
lipidy,
které
mají
vysoký obsah
nenasycených mastných kyselin. K poškození můţe dojít i u některých aminokyselin, proteinů a nukleových kyselin. Mechanismů ochrany buňky před poškozením reaktivními formami kyslíku existuje celá řada. Mezi systémy přímé deaktivace patří karotenoidy, které mají schopnost odstranit singletový kyslík z protein-pigmentových komplexů chloroplastů. Dojde tak ke vzniku excitovaného tripletového stavu karotenoidu, který se však velmi snadno vrací do stavu základního tím, ţe se uvolní teplo. Další sloučenina, která je schopna přímé deaktivace singletového kyslíku a podílí se na ochraně membránových lipidů před peroxidací je α-tokoferol. Na ochraně před ROS se podílejí specializované enzymy a enzymové systémy. K těm patří zejména superoxiddismutasa (SOD, EC 1.15.1.1), která katalyzuje reakci, během níţ dochází k přeměně superoxidu na peroxid vodíku. U rostlin se setkáváme se třemi typy superoxiddismutasy. Jedná se o Cu/Zn-SOD, Mn-SOD a Fe-SOD. Touto cestou vzniklý peroxid vodíku je následně rozkládán katalasou (CAT,
EC 1.11.1.6), která
se nachází v peroxisomech
a glyoxysomech a nebo enzymem askorbátperoxidasou (AP, EC 1.11.1.11), která je součástí chloroplastů a někdy ji nalezneme i v cytosolu. K reakci, která je katalyzována AP je potřebný askorbát. Během reakce katalyzované AP dochází ke vzniku dehydroaskorbátu, k jehoţ regeneraci buňka potřebuje glutathion. Jelikoţ se v chloroplastech nachází velké mnoţství askorbátu a glutathionu, má tento mechanismus ochrany před ROS zásadní úlohu („Obr.7“; Procházka et al., 1998). Kromě zmíněné isoformy askorbátperoxidasy existuje několik dalších druhů peroxidas. Jedná se o bromoperoxidasu vyskytující se u řas a mořských bezobratlých, chloroperoxidasu u hub, cytochrom c peroxidasu u aerobně ţijících kvasinek, iodoperoxidasu
u
řas,
glutathion
peroxidasu
(EC
1.11.1.9),
laktoperoxidasu,
myeloperoxidasu. Peroxidasy jsou enzymy, jejichţ primární funkcí je oxidace molekul na úkor peroxidu vodíku. Tyto enzymy jsou schopné katalyzovat oxidace i v přítomnosti jiných látek neţ je peroxid vodíku, jako je například kyslík. V důsledku jejich činnosti dochází ke značným změnám barvy. Peroxidasa je enzym, který se vyskytuje ve více
- 22 -
isoformách. Peroxidasy a isoperoxidasy mohou být purifikovány z celé řady rostlinných materiálů a bylo zjištěno, ţe se výrazně neliší velikostí, absorpčním spektrem a aktivitou. Jsou sloţeny z bezbarvého glykoproteinu a hnědočerveného ferriporfirinu. Peroxidasy reagují s celou řadou látek a vytvářejí s nimi stabilní komplexy, které mohou být detekovány spektrofotometricky. Jako substráty jim slouţí guajakol, pyridoxal, pyrogallol, 3-hydroxyflavon, dihydroxyfenylalanin a další. Peroxidasy jsou enzymy, které silně reagují na změny podmínek v prostředí, na napadení organismu (houbami, viry, bakteriemi) a na poškození organismu. Peroxidasy reagují na tyto vlivy změnou aktivity nebo změnou počtu isoforem. Peroxidasy jsou přímo či nepřímo zapojeny do celé řady fyziologických procesů, jako je senescence, apikální dominance, odolnost vůči chladu, dormance, rezistence vůči parazitům a další (Gaspar et al., 1982). Pozitivní vliv aktivních forem kyslíku spočívá v reakci při napadení rostliny patogenem. Peroxid vodíku v kooperaci s kyselinou salicylovou indukuje tvorbu některých stresových proteinů. Kyselina salicylová je schopna inaktivovat katalasu, čímţ se koncentrace peroxidu vodíku můţe dočasně zvýšit. Pokud tvorba ROS podléhá kontrole, mohou mít reaktivní formy kyslíku i antimikrobiální účinek a mohou přispívat ke zpevnění buněčné stěny a tím se podílejí na zvýšení rezistence rostliny vůči různým stresovým faktorům (Procházka et al., 1998).
2 O2- + 2 H+
superoxiddismutasa H2O2
H2O
O2 askorbát
askorbátperoxidasa
dehydroaskorbát
glutathion (ox)
monodehydroaskorbát
dehydroaskorbátreduktasa
glutathionreduktasa 2 NADPH
dehydroaskorbát
askorbát
glutathion (red)
2 NADP+
Obr. 7: Enzymová cesta odbourávání superoxidu v rostlinách (převzato z Procházka et al., 1998)
- 23 -
Praktická část
- 24 -
3.
Materiál a přístroje
Chemikálie: Dusičnan
draselný,
tetrahydrát
dusičnanu
vápenatého,
dihydrogenfosforečnan
amonný, heptahydrát síranu manganatého, kyselina boritá, tetrahydrát chloridu manganatého, pentahydrát síranu měďnatého, monohydrát molybdenanu sodného, heptahydrát
síranu
zinečnatého,
heptahydrát
síranu
ţeleznatého,
ethylendiaminotetraoctan sodný (Na2-EDTA), dusičnan kademnatý, chlorid kademnatý, uhličitan sodný, kyselina thiobarbiturová, methanol, ethanol, sacharosa, agar, MES(2(N-morpholino)ethanesulfonová
kyselina),
MS
(Murashige
a
Skoog
médium),
dimethylsulfoxid (DMSO), chlorid hlinitý, Folin-Ciocalteu činidlo, dodekahydrát hydrogenfosforečnanu
disodného,
dihydrát
dihydrogenfosforečnanu
sodného,
pyrogallol, peroxid vodíku, hovězí sérový albumin , guajakol ( Sigma-Aldrich ) Quecetin dihydrát, kyselina galová, kyselina trichloroctová ( Fluka )
6-(2-hydroxy-3-methylbenzylamino)purin (PI-55) , 2-chlor-6-(3-methoxyanilino)purin (INCYDE) byly originálně připraveny v Laboratoři růstových regulátorů PřF UP, Olomouc, ČR Přístrojové vybavení: Autokláv, flow box, elekromagnetická míchačka, fytotron, spektrofotometr (Synergy H4 hybrid reader),Thermomixer comfort (Eppendorf), kulový mlýnek (Retsch, MM 301), centrifuga (Scan speed 1730 MR) Rostlinný materiál: Semena Arabidopsis thaliana ekotyp Columbia.
- 25 -
4.
Metody
4.1.
Kultivace rostlin Arabidopsis thaliana na tekutém ½ MS médiu + 0,1% sacharosa Rostliny byly kultivovány v tekutém ½ MS médiu s 0,1 % sacharosou,
pH výsledného roztoku bylo upraveno na 5,8 pomocí KOH. Na tekutém médiu byl zkoumán růst Arabidopsis thaliana na látkách samotných, ale také v přítomnosti kadmia. Kultivace rostlin byla prováděna ve dvou provedeních A) v 6-ti jamkových deskách a B) v Erlenmayerových baňkách. Do kaţdé jamky 6-ti jamkové destičky byly napipetovány 3 ml tekutého ½ MS média. V Erlenmayerových baňkách bylo 20 ml tekutého ½ MS média. Semínka A. thaliana byla vysterilizována pomocí směsi 70% ethanolu s 0,01% tritonem a resuspendována do agarosy. Do baněk i jamek bylo napipetováno 100 µl suspenze semínek. Látky byly testovány ve třech koncentracích a vţdy ve třech biologických opakováních. Koncentrace INCYDE byly1 nM, 10 nM a 50 nM, u PI-55 1, 10 a 100 nM. Látky byly aplikovány samostatně nebo v přítomnosti 90 µM kadmia. 90 µM Cd s čistým rozpouštědlem DMSO bylo pouţito jako kontrola. Erlenmayerovy baňky a 6-ti jamkové desky byly kontinuálně třepány při 25°C (16 h světlo, 8 h tma). Po 14 dnech byly rostliny sklizeny a zamraţeny do -80°C. Reprezentativní vzorky rostlin byly nafoceny pod binokulárem. V programu Scion Image byla změřena přesná délka kořene a prýtu.
4.2.
Pěstování A. thaliana v hydroponii Vysterilizovaná semínka (70% ethanol + 0,01% triton) byla pěstována
v Hoagland médiu. Médium bylo připraveno ze zásobních vodných roztoků, tak aby výsledná koncentrace látek byla: 0,505 mM KNO3; 0,15 mM Ca(NO3)2·4H2O; 0,1 mM NH4H2PO4; 0,1 mM MgSO4·7H2O; 4,63 μM H3BO3; 0,91μM MnCl2·4H2O; 0,03 μM CuSO4·5H2O; 0,06 μM Na2MoO4·H2O; 0,16 μM ZnSO4·7H2O; 1,64 μM FeSO4·7H2O; 0,81 μM Na2-EDTA (Karen Smeets et al., 2008). Do 96-ti jamkové desky bylo napipetováno 150 µl Hoaglandu a 1 semínko na kaţdou jamku. Desky byly v alobalu (ve tmě) umístěny do lednice, při 4 °C na 4 dny. Po inkubaci v lednici byly semínka ponechány 1 den při 25°C. Následně byla semínka přenesena do plastových sadbovačů na rockwool pěstební substrát. Na kaţdý rockwool byla přenesena 2 semínka. Sadbovače byly umístěny do minipařenišť s Hoagland médiem. Pěstování
- 26 -
probíhalo ve fytotronu při 25 °C a definovaných světelných podmínkách (16 h den, 8 h tma). Ţivný roztok byl obměněn po sedmi dnech. Po 14 dnech od výsevu semen na rockwool byly rostliny přeneseny do stresových podmínek a pěstebních nádob o objemu 1,9l. V průběhu růstu byly rostliny neustále provzdušňovány. Kaţdý rockwool byl upraven tak, aby na něm rostla jedna rostlina. Rostliny byly pěstovány v následujících roztocích Hoagland média: 1, 10 a 100 nM PI-55 s 90 µM CdCl2; 1, 10 a 50 nM INCYDE s 90 µM CdCl2; DMSO s 90 µM CdCl2 a jako kontrola DMSO. První odběr vzorků rostlin byl proveden po třech dnech od změny podmínek (Cd stres) a finální sklizeň po 10 dnech. Nadzemní části rostlin byly odváţeny po 50 mg do ependorfek, zamraţeny a uchovány při -80°C do dalších analýz. 4.3.
Stanovení peroxidace membránových lipidů Stanovení peroxidace membránových lipidů bylo provedeno dle metody Heath
& Packer (1968) s úpravami pro měření v mikrotitrační destičce. Stanovení je zaloţeno na kvantifikaci markeru oxidativního poškození membrán – malondialdehydu (MDA). Vzniklý MDA tvoří s kyselinu thiobarbiturovou (TBA) červený komplex s absorpčním maximem při vlnové délce 532 nm. Komplex MDA – TBA lze kvantifikovat na základě známého extinčního koeficientu 155 mM-1cm-1. 50 mg rostlinného materiálu bylo homogenizováno s 500 µl 80% methanolu (kulový mlýnek, 3 minuty, 24,5 Hz). Po homogenizaci byl homogenizát centrifugován 4 minuty při 27237 RCF. Pro měření byl odebrán supernatant. K 100 µl supernatantu bylo přidáno 100 µl destilované vody a 100 µl roztoku 0,1% kyseliny trichloroctové a 0,5% kyseliny thiobarbiturové. Roztoky byly protřepány a inkubovány po dobu 30 minut při 95 °C. Po inkubaci se vzorky vytemperovaly a poté byly znovu centrifugovány 4 minuty při 27237 RCF. Vzorky byly přepipetovány do 96-ti jamkové mikrotitrační destičky po 200 µl a byla změřena absorbance při 532 nm s korekcí při 600 nm. 4.4.
Stanovení celkových fenolických látek Fenolické látky byly stanoveny podle metody Singleton & Rossi (1965)
s modifikacemi pro měření v mikrotitrační destičce. Stanovení celkových fenolických látek je zaloţeno na reakci „fenolických látek“ s Folin-Ciocalteu činidlem. Kvantifikace spočívá ve srovnání vzorku se standardem kyseliny galové a proto se výsledky uvádí v ekvivalentech kyseliny galové (GAE – Gallic Acid Equivalents). Byl připraven rostlinný extrakt v 100 % methanolu (kulový mlýnek, 3 minuty, 24,5 Hz). Na 50 mg bylo pouţito 500 µl 100% methanolu. Pro samotné stanovení bylo 30 µl extraktu napipetováno do
- 27 -
ependorfky a doplněno na objem 500 µl destilovanou vodou. K takto naředěnému extraktu bylo přidáno 25 µl Folin-Ciocalteu činidla ( 2M ) a 975 µl roztoku 2 % NaCO 3. Obdobně byly připraveny jednotlivé body kalibrační řady standardu kyseliny galové, kde místo extraktu bylo napipetováno 1, 3, 5, 10, 15, 20, 25 a 30 µl 1% roztoku kyseliny galové. Roztoky byly protřepány a inkubovány při laboratorní teplotě. Po 30 minutách byla změřena absorbance při 750 nm. Měření bylo provedeno ve třech opakováních. 4.5.
Stanovení množství chlorofylu a karotenoidů Stanovení bylo provedeno dle Hendry & Grime, 1993 s modifikacemi pro
měření v mikrotitrační destičce. K 50 mg rostlinného materiálu bylo přidáno 500 µl 96% ethanolu. Materiál se nechal přes noc odbarvovat v termomixéru při 25 °C za neustálého třepáni 300 rpm. Poté byly vzorky centrifugovány 10 minut při 27237 RCF, odebrán supernatant a byla změřena absorbance při 663 nm, 645 nm a 480 nm. Měření bylo provedeno ve třech opakováních. Mnoţství chlorofylů a karotenoidů bylo vypočteno dle následujících vzorců: Chlorofyl a [mM] = (12,7 x A663 ) – ( 2,69 x A645 ) Chlorofyl b [mM] = (22,9 x A645 ) – ( 4,68 x A663 ) Karotenoidy [mM] = (A480 + (0,114 x A663 ) – (0,638 x A645 )) / 112,5 4.6.
Stanovení flavonoidů Stanovení celkových flavonoidů bylo provedeno dle metody A. Arvouet-Grand
et al. (1994) s modifikacemi pro měření v mikrotitrační destičce. K 50 mg rostlinného materiálu bylo napipetováno 500 µl 100% methanolu a byla provedena extrakce v kulovém mlýnku (3 minuty a 24,5 Hz). Po centrifugaci (10 minut, 27237 RCF) byl odebrán supernatant. Do kaţdé jamky 96-ti jamkové mikrotitrační destičky bylo napipetováno 100 µl extraktu a 100 µl 2% chloridu hlinitého v 100 % ethanolu ve třech opakováních. Jako standard bylo místo extraktu napipetováno 100 µl 100 µM, 75 µM, 50 µM, 25 µM, 12,5 µM, 6,125 µM, 3,125 µM, 1 µM quercetinu. Proto se výsledky uvádí v ekvivalentech quercetinu (QE). Kalibrační řada byla měřena ve dvou opakováních. Jako blank byl změřen vzorek obsahující 100 µl 2% chloridu hlinitého v 100% ethanolu a 100 µl 100% methanolu. Po 10 minutách inkubace při laboratorní teplotě byla změřena absorbance při 415 nm.
- 28 -
4.7.
Stanovení aktivit enzymů peroxidasy, polyfenoloxidasy a katalasy Aktivita peroxidasy byla měřena podle Chance & Maehly (1955) a aktivita
polyfenoloxidasy byla měřena podle Saffar A. et al., 2009 s lehkou modifikací pro mikrotitrační destičky. Aktivita
katalasy se měřila v křemenné kyvetě podle Aebi
(1984). Pro stanovení enzymů byl připraven extrakt z 50 mg rostlinného materiálu a 2 ml 0,1 M ledového fosfátového pufru (pH 6,8). Vzorky byly homogenizovány ve vychlazeném kulovém mlýnku 2 minuty při 24,5 Hz. Poté byly extrakty centrifugovány při 4°C a 27237 RCF po dobu 10 minut. Supernatant byl uchováván po celou dobu na ledu. V těchto extraktech byly stanoveny celkové proteiny dle Bradforda (1976). Měření bylo provedeno ve třech opakováních, jako standard byl pouţit hovězí sérový albumin (BSA). Byla změřena absorbance při vlnové délce 595 nm. Celkové proteiny byly následně pouţity pro výpočet specifických aktivit jednotlivých enzymů. Stanovení peroxidasy Pro stanovení peroxidasy bylo pouţito 199 µl reakční směsi a 1 µl extraktu na kaţdou jamkou 96-ti jamkové desky. Reakční směs obsahovala 20 mM guajakol, 25 mM fosfátový pufr pH 6,8 a 40 mM peroxid vodíku. Byla sledována změna absorbance při 470 nm kaţdých 30 s po dobu 5 minut. Pro stanovení aktivity peroxidasy byl pouţit extinční koeficient 0,0266 M-1cm-1. Jako blank slouţil pufr, peroxid vodíku a guajakol. Stanovení polyfenoloxidasy Pro stanovení polyfenoloxidasy se k 187 µl reakční směsi obsahující 10 mM pyrogallol a 25 mM fosfátový pufr (pH 6,8) přidalo 13 µl extraktu. Poté byla měřena absorbance při 420 nm v 30 s intervalech aţ do 5 minut. Pro stanovení aktivity polyfenoloxidasy byl pouţit extinční koeficient 0,00247 M-1cm-1. Jako blank slouţil pufr a pyrogallol. Stanovení katalasy Pro stanovení katalasy bylo pouţito 990 µl reakční směsi obsahující 50 mM fosfátový pufr (pH 6,8) a 30 mM peroxid vodíku. K zahájení reakce bylo přidáno 10 µl extraktu a bylo provedeno promíchání. Poté byla ihned změřena absorbance při 240 nm a to v čase 0 a poté kaţdou minutu aţ do 3 minut. Pro stanovení aktivity katalasy byl pouţit extinční koeficient 0,040 M-1cm-1. Jako blank slouţil pufr a peroxid vodíku.
- 29 -
5.
Výsledky
Nelze zveřejnit
- 30 -
Nelze zveřejnit
- 31 -
Nelze zveřejnit
- 32 -
Nelze zveřejnit
- 33 -
Nelze zveřejnit
- 34 -
Nelze zveřejnit
- 35 -
.
Nelze zveřejnit
- 36 -
Nelze zveřejnit
- 37 -
Nelze zveřejnit
- 38 -
Nelze zveřejnit
- 39 -
Nelze zveřejnit
- 40 -
Nelze zveřejnit
- 41 -
Nelze zveřejnit
- 42 -
Nelze zveřejnit
- 43 -
Nelze zveřejnit
- 44 -
Nelze zveřejnit
- 45 -
6.
Závěr a diskuze
Nelze zveřejnit
- 46 -
Nelze zveřejnit
- 47 -
Nelze zveřejnit
- 48 -
7.
Seznam použitých zkratek
ABA
kyselina abscisová
AHK
Arabidopsis histidinkinasa
AP
askorbátperoxidasa
ARR
Arabidopsis regulátor odpovědi
AtCKX
Arabidopsis cytokininoxidasa/dehydrogenasa
AtIPT
Arabidopsis isopentenyltransferasa
BA
benzyladenin
BSA
hovězí sérový albumin
CAT
katalasa
CK
cytokininy
CKX
cytokininoxidasa/dehydrogenasa
DMAPP
dimethylalyl difosfát
FAD
flavin adenin dinukleotid
GAE
ekvivalent kyseliny galové
HK
histidinkinasa
HMBDP
hydroxymethylbutenyl difosfátu
iP
N6-(Δ2-isopentenyl)adenin
IPT
isopentenyltransferasa
mT
meta-topolin
MTs
metallothioneiny
PAL
fenylalaninamoniaklyasa
PC
fytochelatiny
QE
ekvivalent quercetinu
ROS
reaktivní formy kyslíku
RR
regulátor odpovědi
SOD
superoxiddismutasa
tZ
trans-zeatin
HSP
proteiny indukované zvýšenou teplotou
PRP
proteiny indukované patogeny
ASP
proteiny indukované sníţenou koncentrací kyslíku
HMAs
heavy metal ATPases
ABC
ATP-binding cassete
Nramps
natural rezistence associated macrophage proteins
CDF
Cation diffusion facilitator
ZIP
ZRT, IRT-like proteins
- 49 -
8.
Seznam použité literatury
Adriano Domy C. (2001) Trace elements in terrestrial environments, pp. 2-5, SpringerVerlag, New York.
Aebi, H. (1984) Catalase. In: L. Packer(Ed), methods in enzymology, Academic pres, Orlando, 105, 121-126. Alcátara E., Romera F.J., Canete M., De la Guardia M. (1994) Effects of heavy metals on both induction and function of roor Fe(III) reductase in Fe-deficient cucumber (Cucumis sativus L.) plants. J. Exp. Bot. 45, 1893-1898.
Alvarez S., Marsh E.L. Schroeder S.G., Schachtman P. (2008) Metabolomic and proteomic changes in the xylem sap of maize under drought. Plant, cell & environment 31, 325-340.
Ammar W.B., Nouairi I., Zarrouk M., Ghorbel M.H., Jemal F. (2008) Antioxidative response to cadmium in roots and leaves of tomato plants. Biol. Plant. 52, 727-731. Argueso C.T., Ferreira F.J., Kieber J.J. (2009) Environmental perception avenue: the interaction
of
cytokinin
and
environmental
response
pathways.
Plant,
cell
& environment 32, 1147-1160. Arvouet-Grand A., Vennat B., Pourrat A., Legret P. (1994) Standardization of propolis extract and identification of principal constituents. Journal de pharmacie de Belgique 49, 462-468. Barceló J., Vázquez M.D., Poschenrieder Ch. (1988) Structural and ultrastructural disorders in cadmium-treated bush bean plants (Phaseolus vulgaris L.). New Phytol. 108, 37-49. Bilyeu K.D., Cole J.L., Laskey J.G., Riekhof W.R., Esparza TJ. Kramer M.D. Morris R.O. (2001) Molecular and biochemical charakterization of a cytokinin oxidase from maize. Plant Physiol. 125, 378-386.
Blackwell J.R., Horgan R.
(1993)
Cloned Agrobacterium
tumefaciens ipt1
product, DMAPP: AMP isopentenyl transferase. Phytochemistry 34, 1477-1481.
- 50 -
gene
Bradford M.M. (1976) A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye-binding. Anal Biochem 72, 248-254.
Chance B., Maehly A.C. (1955) Assay of catalases and peroxidases. Methods Enzymol 2, 764-817. Cuypers A., Smeets K., Vangronsveld J. (2009) Heavy metal stress in plants, v knize Plant stress biology, editor Heribert Hirt, pp. 161-178, Willey-WCH Verlag GmbH&Co.KGaA, Weinheim. Ekmekci Y., Tanyolac D., Ayhan B. (2008) Effects of cadmium on antioxidant enzyme and photosynthetic activities in leaves of two maize cultivars. J. Plant Physiol. 165, 600-611. Galuszka P., Popelková H., Werner T., Frébortová J., Pospíšilová H., Mik V., Kőllmer I., Schműlling T., Frébort I. (2007) Biochemical charakterization of cytokinin oxidases/dehydrogenases from Arabidopsis thaliana expresses in Nicotiana tabacum L. J. Plant Growth Regul. 26, 255-267. Gasic K., Korban S.S. (2006) Heavy metal stress, v knize Physiology and Molecular Biology of Stress Tolerance in Plants, editoři Madhava Rao K.V., Raghavendra A.S., Janardhan Reddy K., pp. 219-254, Springer, Netherlands.
Gaspar T., Penel C., Thorpe T., Greppin H. (1982) Peroxidases 1970-1980: A survey of their biochemical and physiological roles in higher plants, Genéve. Gemrotová M., Kulkarni M.G., Stirk W.A., van Standen J., Spíchal L. (2011) Cytokinin analogs protects seedling development of medicinal plants in the presence of cadmium. (manuscript in prep.)
Gouia H., Ghorbal M.H., Meyer Ch. (2000) Effect of cadmium on activity of nitrate reductase and on other enzymes of the nitrate assimilation pathway in bean. Plant Physiol. Biochem. 38, 629-638. Gould K.S. (2004) Nature´s swiss army knife: The diverse protective roles of anthocyanins in leaves. J. Biomed. Biotechnol. 5, 314-320.
- 51 -
Grill E., Lőffler S., Winnacker Ernest-L., Zenk M.H. (1989) Phytochelatins, the heavymetal-binding peptides of plants, are synthesized from glutathione by a specific y-glutamylcysteine dipeptidyl transpeptidase (phytochelatin synthase). Biochemistry 86, 6838-6842. Hall J.L. (2002) Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerance. J. Exp. Bot. 53, 1-11.
Hall J.L., Williams L.E. (2003) Transition metal transporters in plants. J. Exp. Bot. 54, 2601-2613. Hossain H., Huq F. (2002) Studies on the interaction between Cd2+ ions and DNA. J. Inorg. Biochem. 90, 85-96. Heath R.L., Packer L. (1968) Photoperoxidation in isolated chloroplasts : I. Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation. Arch. Biochem. Biophys. 125, 189-198. Henry G.A.F., Grime J.P (1993) Methods in comparative plant ecology – A laboratory manual. pp. 148-152, Chapman and Hall, London.
Heyl A., Schmülling T. (2003) Cytokinin signal perception and transduction. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 480-488.
Kakimoto T. (2001) Identification of plant cytokinin biosynthetic enzymes as dimethylallyl diphosphate:ATP/ADP isopentenyltransferases. Plant Cell Physiol. 42, 677-685.
Kakimoto T. (2003) Perception and signal transduction of cytokinins. Annu. Rev. Plant Biol. 54, 605-627. Kasahara H., Takei K., Ueda N., Hishiyama S., Yamaya T., Kamiya Y., Yamaguchi S., Sakakibara H. (2004) Distinct isoprenoid origins of cis- and trans-zeatin biosyntheses in Arabidopsis. J. Biol. Chem. 279, 14049-14054. Kotrba P., Macek T., Ruml T. (1999) Heavy metal-binding peptides and proteins in plants. Collect. Czech. Chem. Commun. 63, 1057-1086.
- 52 -
Larsson E.H., Bornman J.F., Asp H. (1998) Influence of UV-B radiation and Cd2+ on chlorophyll fluorescence, growth and nutrient content in Brassica napus. J. Exp. Bot. 49, 1031-1039. Macnair M.R. (1993) The genetics of metal tolerance in vascular plants. New Phytol. 124, 541-559.
Mench M., Tancogne J., Gomez A., Juste C. (1989) Cadmium bioavailability to Nicotiana tabacum L., Nicotiana rusticana L., and Zea mays L. grow in soil amended or not amended with cadmium nitrate. Biol. Fertil. Soils 8, 48-53. Michalak A. (2006) Phenolic compounds and their antioxidant activity in plants growing under heavy metal stress. Pol. J. Environ. Stud. 15, 523-530. Mok DW, Mok MC (2001) Cytokinin metabolism and action. Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant. Mol. Biol. 52, 89–118. Mok, M.C., (1994) Cytokinins and plant development – an overview. In: Mok, D.W.S., Mok, M.C. (Eds.), Cytokinins: Chemistry, Activity and Function. CRC Press, Boca. Ouzounidou G., Moustakas M., Eleftheriou E.P. (1997) Physiological and ultrastructural effecs of cadmium on wheat (Triticum aktivum L.). Arch. Environ. Contam. Toxicol. 32, 154-160. Pačes V., Werstiuk E., Hall R.H. (1971) Conversion of N6-(Δ2-isopentenyl)adenosine to adenosine by enzyme activity in tobacco tissue. Plant Physiol.48, 775-778.
Prasad M.N.V. (2004) Heavy metal stress in plants: From biomolecules to ecosystem, pp. 98-100, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg. Procházka S., Macháčková I., Krekule J., Šebánek J. a kolektiv (1998) Fyziologie rostlin, pp. 29-45, 240-241, 412-430, Academia, Praha.
Rauser W.E. (1999) Structure and function of metal chelators produced by plants. Cell Biochem. Biophys. 31, 19-48.
- 53 -
Rivero R.M., Kojima M., Gepstein A., Sakakibara H., Mittler R., Gepstein S., Blumwald E. (2007) Delayed leaf senescence induces extreme drought tolerance in a flowering plant. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 19631–19636.
Saffar A., Bagherieh Najjar M.B., Mianabadi M. (2009) Activity of antioxidant enzymes in response to cadmium in Arabidopisis thaliana. Journal of biological sciences 9 (1), 44-50.
Sakakibara H. (2006) Cytokinins:Activity, biosynthesis and translocation. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 431-449.
Sanita di Toppi L., Gabbrielli R. (1999) Response to cadmium in higher plants. Environ. Exp. Bot. 41, 105-130.
Sawidis T. (2008) Effect of cadmium on pollen germination and tube growth in Lilium longiflorum and Nicotiana tabacum. Protoplasma 233, 95-106.
Shi G.R., Cai Q.S. (2008) Photosynthetic and anatomic responses of peanut leaves to cadmium stress. Photosynthetica 46, 627-630.
Shi G., Cai Q. (2009) Leaf plasticity in peanut (Arachis hypogaea L.) in response to heavy metal stress. Environ. Exp. Bot. 67, 112-117. Siedlicka A., Krupa Z., Samuelsson G., Öquist G., Gardestrőm P. (1997) Primary carbon metabolism in Phaseolus vulgaris plants under Cd/Fe interaction. Plant Physiol. Biochem. 35, 951-957. Singleton
V.L.,
Rossi,
J.A.,
(1965)
Colorimetry
of
total
phenolics
with
phosphomolybdic–phosphotungstic acid reagents. Am. J. Enol. Vitic. 16, 144–158. Skórzyńska-polit E., Krupa Z. (2006) Lipid peroxidation in Cadmium-treated Phaseolus coccineus plants. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 50, 482-487.
Smeets K., Ruytinx J., Van Belleghem F., Semane B., Lin D., Vangronsveld J., Cuypers A. (2008) Critical evaluation and statistical validation of hydroponic culture system for Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. Biochem. 46, 212-218.
- 54 -
Spíchal L., Werner T., Popa I., Riefler M., Schműlling T., Strnad M. (2009) The purine derivative PI-55 blocks cytokinin action via receptor inhibition. FEBS J. 276, 244-253.
Spichal, L., Werner, T., Galuszka, P., Zatloukal, T., Kopecny, D., Briozzo, P., Nisler, J., Gruz, J., Frebortova, J., Schmulling, T., Strnad, M. Characterization and
biological
activity
of
novel
purine-derived
inhibitor
of
cytokinin
oxidase/dehydrogenase and its potential use for in vivo studies. (nepublikovaná data)
Tahara S. (2007) A journey of twenty-five years through the ecological biochemistry of flavonoids. Biosci. Biotechnol. Biochem. 71, 1387-1404.
Takei K., Sakakibara H., Sugiyama T. (2001)
Identification
of
genes
encoding
adenylate isopentenyltransferase, a cytokinin biosynthesis enzyme, in Arabidopsis thaliana. J. Biol. Chem. 276, 26405-26410. Tran L-S.P., Shninozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2010) Role of cytokinin responsive two-component system in ABA and osmotic stress signalings. Plant Signaling & Behavior 5:2, 148-150.
Vacek J., Kizek R., Klejdus B., Havel L. (2003) Fytochelatiny a jejich role pro detoxifikaci těţkých kovů:biosyntéza, regulace a transport. Biologické listy 68, 133-153. Vanhoudt N., Vandenhove H., Smeets K., Remans T., Van Mees M., Wannijn J., Vangronsveld J., Cuypers A. (2008) Effect of uranium and phosphate concentrations on oxidative stress related responses induced in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. Biochem. 46, 987-996. Vyroubalová Š., Václavíková K., Turečková V., Novák O., Šmehilová M.,Hluska T., Ohnoutková L., Frébort I., Galuszka P. (2009) Characterization of new maize genes putatively involved in CK metabolism and their expression during osmotic stress in relation with cytokinin levels. Plant Physiol.151, 433–447. Zatloukal M., Gemrotová M., Doleţal K., Havlíček L., Spíchal L., Strnad M. (2008) Novel potent inhibitors of A. thaliana cytokinin oxidase/dehydrogenase. Bioorg. Med. Chem. 16, 9268-9275.
- 55 -
