UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie
Příprava plasmidových konstruktů pro studium lokalizace kukuřičných cytokinindehydrogenas
BAKALÁŘSKÁ PRÁCE
Autor:
Patricie Johnová
Studijní program:
B1406 Biochemie
Studijní obor:
Biochemie
Forma studia:
Prezenční
Vedoucí práce:
Mgr. David Zalabák
Termín odevzdání práce:
13. 5. 2013
,,Prohlašuji, že jsem předloženou bakalářskou práci vypracovala samostatně za použití citované literatury.“
V Olomouci dne 13. 5. 2013
Poděkování Ráda bych poděkovala svému vedoucímu práce Mgr. Davidu Zalabákovi za věnovaný čas, odborné vedení, důkladné vysvětlení dané problematiky, všestrannou pomoc, cenné rady a především za trpělivost, které mi pomohly k dokončení bakalářské práce. Dále bych chtěla poděkovat také ostatním zaměstnancům Oddělení molekulární biologie za jejich vstřícný přístup při práci.
2
Bibliografická identifikace: Jméno a příjmení autora Název práce Typ práce Pracoviště Vedoucí práce Rok obhajoby práce Abstrakt
Klíčová slova Počet stran Počet příloh Jazyk
Patricie Johnová Příprava plasmidových konstruktů pro studium lokalizace kukuřičných cytokinindehydrogenas Bakalářská Oddělení molekulární biologie, CRH Mgr. David Zalabák 2013 Cytokinindehydrogenasy (CKX) jsou enzymy, které katalyzují ireverzibilní degradaci rostlinných hormonů cytokininů a hrají důležitou roli v regulaci jejich hladiny. V rostlinách jsou CKX proteiny kódovány malými genovými rodinami s různým počtem členů: 7 AtCKX genů bylo objeveno v Arabidopsis thaliana, 13 ZmCKX v kukuřici a 11 OsCKX v rýži. Jednotlivé isoformy CKX se liší v biochemických vlastnostech, úrovní exprese a také subcelulární lokalizací. Bylo zjištěno, že právě rozdílná subcelulární lokalizace CKX má významný dopad na fenotyp transgenních rostlin overexprimujících zmíněné isoformy. Subcelulární lokalizace CKX a různá hladina cytokininů v jednotlivých buněčných kompartmentech tedy zřejmě hraje důležitou roli při vývoji a růstu rostlin. Přítomnost signálního peptidu na N-terminálním konci značí sekreci CKX do apoplastu, vakuol nebo jiných buněčných organel. Naopak jeho nepřítomnost určuje lokalizaci proteinu v cytosolu.V Arabidopsis byla analýzou pomocí CKX-GFP fúzních proteinů zjištěna apoplastická lokalizace AtCKX2,4 a 6, cytosolární AtCKX7 a sekrece dvou isoforem do vakuol (AtCKX1 a 3). Naproti tomu z kukuřičných CKX byla doposud provedena charakterizace pouze ZmCKX1, sekretované do apoplastu a nesekretované ZmCKX10, lokalizované v cytosolu. Cílem této práce byla příprava plasmidových konstruktů obsahující vybrané ZmCKX-GFP fúzní geny (C-terminální fúze), které budou dále použity na studium jejich buněčné lokalizace. Prvním krokem byla PCR amplifikace 7 isoforem ZmCKX (3, 4a, 4b, 5, 8, 10 a 12). Po úspěšné amplifikaci a izolaci genů ZmCKX3 a ZmCKX5, byla provedena rekombinační BP reakce za účelem získání vstupních vektorů pDONR207:ZmCKX. Finální GFP expresní vektory pGWB5:ZmCKX byly připraveny rekombinační LR reakcí mezi destinačním vektorem pGWB5 a pDONR207:ZmCKX5, respektive dalšími již dříve připravenými vstupními vektory pENTR2B: ZmCKX1, ZmCKX2, ZmCKX6, ZmCKX8 a ZmCKX9. Sekvenční analýza potvrdila správnost všech zmíněných konstruktů a mohou být tedy použity pro studium lokalizace. Arabidopsis thaliana, cytokinin, CKX, kukuřice, subcelulární lokalizace, GFP. 56 Český
3
Bibliographical identification: Author’s first name and surname Title Type of thesis Department Supervisor The year of presentation Abstract
Keywords Number of pages Number of appendices Language
Patricie Johnová Preparing of plasmid constructs for localization study of maize cytokinin dehydrogenases Bachelor Department of molecular biology, CRH Mgr. David Zalabák 2013 Cytokinin dehydrogenases (CKX) are enzymes catalyzing irreversible degradation of cytokinin phytohormones and play an important role in regulation of cytokinin level. In plants, CKX are encoded by small gene families with a varyring number of members: 7 AtCKX genes were found in Arabidopsis thaliana, 13 ZmCKX in maize and 11 OsCKX in rice. Indiviual CKX isoforms have different biochemical features, expression profiles and subcelullar localization. It was shown that distinct subcellular CKX localization has a strong impact on phenotype of CKX overexpressor transgenic plants. Distinct CKX localization as well as cytokinin level within respective cell compartments plays an important role in plant growth and development. Presence of the signal peptide at N-terminus indicate the secretion of CKX to apoplast, vacuole and or other cell compartments. On the other hand, lack of the signal peptide results in the CKX retention in the cytosol. Analysis of AtCKX-GFP fusion proteins from Arabidopsis revealed apoplastic localization of AtCKX2, 4 and 6; two of them were secreted to vacuole (AtCKX1 and 3), and one non-secreted AtCKX7 was targeted to the cytosol. On the other hand, there was only two ZmCKX characterized from maize: apoplastic ZmCKX1 and cytosolic ZmCKX10. The aim of this work was to prepare plasmid constructs carrying selected ZmCKX-GFP fusion genes (C-terminal fusion), which can be further used for study of its subcellular localization. The first step was PCR amplification of 7 ZmCKX isoforms (3, 4a, 4b, 5, 8, 10 and 12). Only two of them were successfully amplified (ZmCKX3 and ZmCKX5). After the isolation, the amplicons were used for BP recombination and thus entry clones pDONR207:ZmCKX were prepared. Final GFP expression clones pGWB5:ZmCKX were prepared by recombinant LR reaction using destination vector pGWB5 and pDONR207:ZmCKX5, and other previously prepared entry clones pENTR2B-ZmCKX1, ZmCKX2, ZmCKX6, ZmCKX8 and ZmCKX9. Accuracy of all discussed expression clones was confirmed by sequencing analysis, so that they can be used for localization study. Arabidopsis thaliana, cytokinin, CKX, maize, subcellular localization, GFP. 56 Czech 4
Obsah 1
CÍLE PRÁCE ........................................................................................................................ 7
2
TEORETICKÁ ČÁST .......................................................................................................... 8 2.1
Úvod .............................................................................................................................. 8
2.2
Cytokininy..................................................................................................................... 9
2.2.1
Struktura a jednotliví zástupci............................................................................... 9
2.2.2
Isoprenoidní cytokininy ........................................................................................ 9
2.2.3
Aromatické cytokininy........................................................................................ 10
2.3
Metabolismus cytokininů ............................................................................................ 11
2.3.1
Biosyntéza ........................................................................................................... 11
2.3.2
Degradace - cytokinindehydrogenasy ................................................................. 14
2.3.2.1
Klasifikace enzymu a elektronové akceptory ................................................. 14
2.3.2.2
Struktura CKX ................................................................................................ 15
2.3.2.3
Aktivita a substrátová specifita CKX.............................................................. 17
2.3.2.4
Lokalizace CKX.............................................................................................. 18
2.3.3
3
Inaktivace cytokininů - glykosyltransferasy ....................................................... 22
2.3.3.1
Konjugace na adeninovém kruhu .................................................................... 22
2.3.3.2
Konjugace na isoprenoidním řetězci ............................................................... 22
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST............................................................................................... 24 3.1
Materiál ....................................................................................................................... 24
3.2
Metody ........................................................................................................................ 25
3.2.1
Izolace plasmidové DNA za použití soupravy QIAprep Spin Miniprep............. 25
3.2.2
Izolace plasmidové DNA pomocí alkalické lyze (za použití pufrů P1, P2 a P3) 26
3.2.3
Polymerasová řetězová reakce (PCR) ................................................................. 26
3.2.4
Elektroforetická separace DNA v agarosovém gelu ........................................... 29
3.2.5
Extrakce DNA fragmentů z agarosového gelu.................................................... 29
3.2.6
Rekombinační klonování pomocí Gateway technologie ..................................... 29
3.2.6.1
BP reakce – sestrojení vstupního vektoru (“entry“ klonu).............................. 30
3.2.6.2
LR reakce – sestrojení expresního vektoru (klonu) ........................................ 31
3.2.7
Elektroporace E. coli ........................................................................................... 32
3.2.8
Štěpení restrikčními endonukleasami ................................................................. 32
3.2.8.1
Restrikční analýza DNA ................................................................................. 32
3.2.8.2
Linearizace vektoru ......................................................................................... 35
3.2.9
Purifikace DNA................................................................................................... 35
3.2.10
Kultivace buněk E. coli a příprava LB média ..................................................... 35 5
Výsledky a diskuse ..................................................................................................... 36
3.3
3.3.1
Amplifikace genů ZmCKX .................................................................................. 36
3.3.2
Izolace plasmidů pGEM-T Easy:ZmCKX ........................................................... 36
3.3.3
Optimalizace podmínek PCR .............................................................................. 36
3.3.4
Izolace fragmentů genů ZmCKX3 a ZmCKX5 z agarosového gelu ..................... 40
3.3.5
Příprava vstupního vektoru pDONR207:ZmCKX 3 a pDONR207:ZmCKX 5 .... 41
3.3.5.1
Provedení rekombinační BP reakce ................................................................ 41
3.3.5.2
Ověření správnosti konstruktů pomocí colony PCR a restrikce ..................... 41
3.3.6
4
Příprava expresních vektorů pGWB5:ZmCKX ................................................... 43
3.3.6.1
Provedení rekombinační LR reakce ................................................................ 44
3.3.6.2
Ověření správnosti konstruktů pomocí colony PCR a restrikce ..................... 44
ZÁVĚR ............................................................................................................................... 49
Seznam použité literatury ........................................................................................................... 50 Seznam zkratek ........................................................................................................................... 56
6
1 CÍLE PRÁCE
Zpracování literární rešerše na téma cytokininy, metabolismus cytokininů se zaměřením na cytokinindehydrogenasy.
Klonování ZmCKX genů do pDONR207 vektoru BP reakcí (Gateway technologie).
Překlonování ZmCKX genů z pDONR207 do vektorů nesoucích GFP pro C-terminální fúzi pomocí LR reakce (Gateway technologie).
Sekvenční analýza – ověření správnosti klonovaných genů.
7
2 TEORETICKÁ ČÁST 2.1 Úvod Existence látek, které se podílejí v nízkých koncentracích na regulaci růstu rostlin, byla prokázána již v 19. století v experimentu holandského biologa Fritze Wenta. Went demonstroval účinek látky, která aktivovala růst rostlinného materiálu. Tato látka (auxin) byla později identifikována jako kyselina indol-3-octová. Dnes jsou rostlinné hormony definovány jako přirozeně se vyskytující látky a fungující při velmi nízkých koncentracích. Tyto látky jsou ve většině případů transportovatelné v celém rostlinném těle a váží se na specifické receptorové proteiny. Mezi hlavní skupiny rostlinných hormonů dělených na základě chemické struktury patří: auxiny, cytokininy, gibberliny, etylen, kyselina abscisová, brassinosteroidy a další (Frébort et al., 2011). V posledních letech byly objasněny důležité mezery v porozumění metabolismu a signalizace hormonů cytokininů. Pokroku bylo dosaženo identifikací klíčových genů kódujících enzymy, které kontrolují rozhodující kroky jejich biosyntézy, degradace, translokace a signalizace (Werner & Schmülling, 2009). Manipulace s těmito geny může být potenciálně využita pro zvýšení výnosu zemědělsky významných plodin nebo např. ke zvýšení odolnosti vůči stresu apod. Prozatím nebyla do oběhu vypuštěna žádná komerční transgenní plodina se změněnou hladinou cytokininů (Zalabák et al., 2013). V teoretické části této práce se zabývám obecnou charakteristikou cytokininů, dále pak jejich metabolismem a především katabolickými enzymy cytokinindehydrogenasami. Praktická část je pak věnována klonování genů kódujících kukuřičné cytokinindehydrogenasy a přípravě plasmidových konstruktů, které budou dále sloužit pro studium jejich subcelulární lokalizace. Kukuřice je modelovou jednoděložnou rostlinou a zároveň patří mezi nejdůležitější obilniny používané zejména jako krmivo pro dobytek, ale také jako zdroj pro výrobu biopaliv. Výsledky by tudíž mohly přispět k objasnění mechanismů regulace hladiny cytokininů a rozšířit tak vědomosti o metabolismu cytokininů u jednoděložných rostlin.
8
2.2 Cytokininy Cytokininy jsou všudypřítomné rostlinné hormony a mají zásadní význam v různých fázích růstu a vývoje rostlin. Podílejí se na vývoji, morfogenezi a mnoha fyziologických procesech rostlin a to napříč celou rostlinnou říší (Sakakibara, 2006). Prvním objeveným cytokininem jakožto faktorem buněčného dělení byl kinetin (Miller et al., 1955). Cytokininy poté byly definovány jako látky schopné stimulovat buněčné dělení – cytokinezi (odtud název) a vykonávat další růstově regulační funkce stejným způsobem jako kinetin (Skoog & Armstrong, 1970). Nicméně dnes se termínem cytokininy označují všechny molekuly s podobnou strukturou bez ohledu na to, jak aktivní jsou (Frébort et al., 2011). Rozhodující funkce cytokininů při růstu a vývoji rostlin je dána tím, že hrají důležitou roli při regulaci senescence listů, apikální dominance, proliferace kořenů, fylotaxe, reprodukční způsobilosti a výživové signalizaci. Je také známo, že se účastní udržování meristematické aktivity. Nedávné studie metabolismu a signalizace cytokininů odhalily série genů zahrnutých v těchto procesech, což umožnilo navrhnout modely pro jejich regulaci (Hirose et al., 2008).
2.2.1 Struktura a jednotliví zástupci Přirozeně se vyskytující cytokininy jsou deriváty adeninu, které mají na N6 - pozici buď isoprenoidní anebo aromatický postranní řetězec (Mok & Mok, 2001; Strnad, 1997). Mezi isoprenoidní cytokininy (Obr. 1) patří isopentenyladenin (iP), jeho hydroxylované deriváty cisZeatin (cZ) či trans-Zeatin (tZ) a dihydrozeatin (DZ), tedy redukovaný zeatin. Zatímco isoprenoidní cytokininy jsou v přírodě široce rozšířené, aromatické deriváty byly dlouhou dobu považovány za výhradně syntetické látky (Frébort et al., 2011). Kinetin (N6-furfuryladenin) byl objeven jako degradační produkt DNA vyvolávající buněčné dělení a izolován byl ze staré nebo autoklávované DNA spermatu sledě a brzlíku telete (Miller et. al, 1955). Jeho výskyt v rostlinném materiálu byl však prokázán až o více než 40 let později a to např. v sušeném kokosu (Barciszewski et al., 1996), stejně tak v čerstvém endospermu kokosu (Ge et al., 2005).
2.2.2 Isoprenoidní cytokininy Cytokininy typu isopentenyladeninu (N6-(Δ2-isopentenyl)adenin) a trans-zeatinu byly považovány za převládající formy v rostlinách ve srovnání s cis-isomery, které jsou přítomny pouze v malém množství s velmi nízkou nebo žádnou biologickou aktivitou.
9
Nicméně v dalších letech byly cis-isomery identifikovány jako dominantní cytokininy v celé řadě rostlin, např. v kukuřici, rýži, cizrně aj. Převážně v dormantních semenech a apikálních pupenech se objevuje také dihydrozeatin (Frébort et al., 2011).
2.2.3 Aromatické cytokininy V přírodě byly aromatické cytokininy (Obr. 2), deriváty benzyladeninu (6benzylaminopurin, BA), nalezeny v polovině 70. let 20. st ve zralých listech topolu (Horgan et al., 1973). Podle českého výrazu topol byly nazvány jednotlivé deriváty BA jako topoliny. Mimo již zmíněný benzyladenin mezi aromatické cytokininy patří vysoce aktivní meta-topolin, méně aktivní ortho-topolin a jejich methoxy-deriváty (Strnad, 1997). Přítomnost topolinů byla později zjištěna i u jiných rostlinných druhů, např. v Arabidopsis (Tarkowská et al., 2003) nebo hrachu (Gaudinová et al., 2005). Cytokininy se v rostlinách nachází nejen jako volné base, ale také ve formě nukleotidů, nukleosidů a glykosidů. Bylo potvrzeno, že cytokininové nukleobase jsou primárními ligandy pro cytokininové receptory, zatímco jejich konjugáty s cukry jsou méně aktivní nebo inaktivní (Sakakibara, 2006).
cis-zeatin
trans-zeatin
N6-(Δ2-isopentenyl)adenin
dihydrozeatin
N3-(Δ2-isopentenyl)adenin
N6-furfuryladenin (kinetin)
Obrázek 1: Isoprenoidní cytokininy. Upraveno podle Bajguz & Piotrowska, 2009.
10 N6-benzyladenin
N6-(ortho-hydroxybenzyl)-adenin (ortho-topolin)
N6-(meta-hydroxybenzyl)-adenin (meta-topolin)
N6-(Δ2-isopentenyl)adenin
N6-benzyladenin
N3-(Δ2-isopentenyl)adenin
N6-(ortho-hydroxybenzyl)-adenin (ortho-topolin)
N6-furfuryladenin (kinetin)
N6-(meta-hydroxybenzyl)-adenin (meta-topolin)
Obrázek 2: Aromatické cytokininy. Upraveno podle Bajguz & Piotrowska, 2009.
2.3 Metabolismus cytokininů 2.3.1 Biosyntéza Prvním krokem biosyntézy isoprenoidních cytokininů (Obr. 3) je N-prenylace adenosin5´-fosfátu (AMP, ADP či ATP) na N6-pozici. Klíčovým enzymem katalyzujícím tuto reakci je adenosinfosfát isopentenyltransferasa (IPT, EC 2.5.1.27) (Kakimoto, 2001; Takei et al., 2001). Substráty sloužící jako donory isoprenoidního postranního řetězce jsou dimethylallyl pyrofosfát (DMAPP) a (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl difosfát (HMBDP) (Krall et al., 2002; Sakakibara et al., 2005). Primárními produkty reakce jsou příslušné isopentenyladenosin-5´fosfáty (iPMP, iPDP, iPTP) (Kakimoto, 2003). Poprvé byla isopentenyltransferasová aktivita zaznamenána ve vzorku enzymu pocházejícího ze slizu hlenky Dictyostelium discoideum, kdy při reakci došlo k přenosu isoprenoidního řetezce z DMAPP na AMP za vzniku isopentenyladenosin-5´-monofosfátu (iPMP). Jednalo se o první demonstraci syntézy cytokininů in vitro (Taya et al., 1978). Jiné substráty (ADP, ATP, cAMP) než AMP jako akceptory isoprenoidního řetězce nefungovaly. Teprve o několik let později byla IPT prokázána v bakterii Agrobacterium tumefaciens, která infikuje rostliny za tvorby nádorů, kdy se část Ti-plamidu zabudovává do genomu rostliny. Tato část tzv. T-DNA obsahuje mimo jiné gen tmr zodpovědný za produkci cytokininu. Klonováním genu tmr a jeho expresí v bakterii Escherichia coli bylo prokázáno, že tmr kóduje bakteriální IPT která katalyzuje produkci isopentenyladenosin-5´-monofosfátu (iPMP) z DMAPP a AMP. Tedy, stejně jako v případě D. discoideum, produktem enzymatické reakce katalyzované bakteriální IPT je isopentenylovaný AMP, nikoli ATP nebo ADP (Kakimoto et al., 2003). Předpokládalo se tedy, že cytokininy jsou v rostlinách produkovány isopentenylací AMP pomocí DMAPP za katalýzy adenylát isopentenyltransferasy.
11
Nicméně další studie u Arabidopsis ukázaly, že IPT u rostlin využívají jako akceptory isoprenylové skupiny spíše ATP nebo ADP, a jako donor je upřednostňován taktéž DMAPP (Takei et al., 2001; Kakimoto, 2001). Doposud byly identifikovány genové rodiny IPT u několika druhů vyšších rostlin: sedm u Arabidopsis (AtIPT1, AtIPT3 až AtIPT8), taktéž sedm v rýži (Sakamoto et al., 2006) a devět IPT genů v kukuřici (Brugiére et al., 2008; Vyroubalová et al., 2009). Pro vznik cytokininů tZ-typu jsou předpokládány dvě možné biosyntetické dráhy, a to dráha závislá na iP-nukleotidu a nezávislá na iP-nukleotidu (Obr. 3). V prvním případě je isoprenoidní řetězec iP-nukleotidu dále hydroxylován monooxygenasou cytochromem P450, přičemž vznikají tZ-nukleotidy. Dva takové enzymy, CYP735A1 a CYP735A2, byly objeveny u Arabidopsis (Takei et al., 2004). Druhá možná cesta syntézy tZ spočívá v přímém vzniku tZnukleotidu přenosem hydroxylovaného postranního řetězce z prekurzoru HMBDP na adeninový kruh, katalyzovaném IPT (Åstot et al., 2000; Sakakibara et al., 2005). Která z drah má větší význam zřejmě závisí na původu donorů isoprenoidního řetězce, ale také na jejich dostupnosti v rostlině (Frébort et al., 2011). Oba prekurzory (DMAPP, HMBDP) jsou produkty methylerithritol-fosfátové dráhy probíhající v plastidech (MEP), kdy sledem mnoha reakcí vzniká HMBDP, který může být v menší míře dále redukován na DMAPP. Oba produkty mohou sloužit jako prekurzory cytokininů, nicméně hladina HMBDP v plastidech je asi 5x vyšší než DMAPP. (Sakakibara et al., 2005). Naproti tomu produktem mevalonátové dráhy (MVA), která je lokalizována v cytosolu je pouze DMAPP (Lombard and Moreira, 2011). Pro vznik cytokininů cZ-typu doposud nebyla v rostlinách identifikována žádná cis-hydroxylasa ani žádný isoprenoidní prekursor mající hydroxylovou skupinu v cis-pozici (Frébort et al., 2011). Nicméně předpokládá se, že možným zdrojem cZ by mohla být degradace prenylované tRNA. Bylo totiž zjištěno, že některé druhy tRNA mající antikodony komplementární ke kodonům začínajících uridinem jako např. tRNALeu či tRNASer přenáší prenylovaný adenosin připojený k antikodonu. Jelikož prenylová část obsahuje hydroxylovanou skupinu, tRNA může do určité míry přispívat k produkci cytokininů. Enzymy které katalyzují prenylaci tRNA, se nazývají tRNA-isopentenyltransferasy (Golovko et al., 2002). První rostlinné IPT byly identifikovány u modelové rostliny Arabidopsis thaliana, jejíž genom kóduje sedm AtIPT a dvě tRNA-isopentenyltransferasy AtIPT2 a AtIPT9(zatím nebyla detekována) (Takei et al., 2001; Kakimoto et al., 2001; Golovko et al., 2002). Pomocí GFP fúze byla odhalena subcelulární lokalizace AtIPT proteinů (Obr. 3). Jednotlivé IPT isoenzymy jsou distribuovány ve více buněčných kompartmentech. Lokalizace AtIPT1, 3, 5 a 8 v plastidech je v souladu s dominantní rolí MEP dráhy poskytující prekurzor pro biosyntézu cytokininů typu tZ a iP. Naproti tomu AtIPT4 nacházející se v cytosolu a AtIPT7 v mitochondriích naznačuje, že může být k syntéze cytokininů využit také DMAPP z MVA dráhy (Kasahara et al., 2004). 12
Jak již bylo uvedeno výše, pro vznik cytokininů cZ-typu se předpokládá biosyntéza z tRNA, ale také možná možná isomerace tZ na cZ. Lokalizace tRNA-IPT AtIPT2 v cytosolu naznačuje využití DMAPP pocházejícího z MVA dráhy (Kasahara et al., 2004). Analýzou AtIPT::GUS (β-glukurodinasa) fúzních genů byla zjištěna exprese jednolivých isoforem v pletivech Arabidopsis. Ukázalo se, že jsou exprimovány v různých typech buněk a pletiv, čímž byla vyvrácena hypotéza, že cytokininy jsou produkovány především v kořenech. (Miyawaki et al., 2004). Produkce cytokininů v různých typech rostlinných pletiv byla potvrzena i v kukuřici pomocí expresní profilace IPT genů (Vyroubalová et al., 2009). Bylo také zjištěno, že exprese IPT je zvýšena auxiny (AtIPT5, AtIPT7) a nitráty (AtIPT3) (Miyawaki et al., 2004). Hladina AtIPT3 je také závislá na dostupnosti dalších živin jako jsou např. sulfáty, fosfáty a železo (Hirose et al., 2008). Posledním krokem de novo syntézy cytokininů, kdy vznikají málo aktivní nukleotid mono-, di- nebo trifosfáty nebo popř. uvolněním cytokininů z tRNA vedoucího k nukleotidmonofosfátům, je jejich hydrolytická aktivace. Ta je přímo zprostředkována enzymem, který byl objeven v rýži a pojmenován Lonely guy (LOG). Jedná se o ribosid-5´-monofosfát fosforibohydrolasu, která štěpí cytokinin ribosid-5´-monofosfát za uvolnění biologicky aktivních cytokininových nukleobasí a ribosy-5´-monofosfátu (Kurakawa et al., 2007). Dále byla genová rodina LOG objevena a analyzována v Arabidopsis. Celkem bylo objeveno a charakterizováno sedm genů kódujících AtLOG enzymy, které aktivují cytokininy. Pomocí transgenních linií Arabidopsis, overexprimujících AtLOG geny byla in vivo potvrzena schopnost katalyzovat aktivaci cytokininů. Byly také připraveny triple knock out mutanty log3log4log7, které mají inaktivní zmíněné tři LOG geny. Tyto triple mutanti na rozdíl od single nebo double mutantů neprojevují signifikatní změnu fenotypu, vykazují opožděný vývoj květů, sníženou výšku rostliny a naopak zvýšenou produkci adventivních kořenů ve srovnání s wild typem. Expressní profil jednotlivých AtLOG promoterů exprimujících gen GUS je prostorově a kvantitativně odlišný, nicméně pokrývá téměř všechny části rostlinného těla. Silná exprese byla zjištěna např. v apikálním meristému stonku (AtLOG1, AtLOG4) nebo v kořenové pokožce v elongační zóně (AtLOG7). Subcelulární lokalizace AtLOG proteinů (Obr. 3) fúzovaných na Ckonci s GFP ukázala stejně jako kontrolní necílený GFP protein typickou distribuci fluorescenčního signálu v cytosolu a jádře, na rozdíl od OsLOG, které jsou lokalizovány pouze v cytosolu (Kuroha et al., 2009; Kurakawa et al., 2007).
13
AtCKX2 AtCKX4 AtCKX6 Plastid
MEP dráha
AtIPT3 AtIPT5 AtIPT8
HMBDP
Apoplast
MVA dráha Mitochondrie
DMAPP
tZ
iPDP
iPDP
AtIPT7
DMAPP
tRNA
iP
AtIPT2 V cZ
tZ
Jádro AtIPT4 AtCKX7
Vakuola AtCKX1 AtCKX3 ZOGs
AtLOGs ZOGs
ZOGs AtLOGs Cytosol
Obrázek 3: Shrnutí biosyntézy cytokininů a distribuce metabolických enzymů v buňce Arabidospis thaliana. Podle Kasahara et al., 2004 a Frébort et al., 2011.
2.3.2 Degradace - cytokinindehydrogenasy Cytokinindehydrogenasy (CKX) jsou jediné známé enzymy, které katalyzují ireversibilní degradaci cytokininů a mají tak důležité postavení v regulaci jejich koncentrace v rostlinách. Inaktivace molekuly hormonu je dosaženo štěpením N6- substituovaného postranního řetězce cytokininů a jejich ribosidů za vzniku adeninu či adenosinu a příslušného aldehydu odvozeného od postranního řetězce (Frébort et al., 2011).
2.3.2.1 Klasifikace enzymu a elektronové akceptory Pačes et al. (1971) se poprvé zabývali mechanismem degradace cytokininů za účelem porozumění jejich působení, udržování růstu a rozvoje rostlinných pletiv. Prokázali enzymovou aktivitu v surovém extraktu tabákového pletiva za použití N6-(Δ2 isopentenyl)-adenosinu s radioaktivně značeným C14 jako substrátu.
14
Získaný produkt adenosin (adenin) byl důkazem oxidativního štěpení N6- substituovaného postranního řetězce cytokininů. Následně byla aktivita enzymu potvrzena také v kukuřici. Vzhledem k tehdejšímu předpokladu, že při reakci je vyžadována přítomnost kyslíku jakožto elektronového akceptoru, byl enzym klasifikován jako cytokininoxidasa (Whitty and Hall, 1974). Izolace enzymu CKX byla poprvé provedena v r. 1999 z kukuřičných zrn, dostal označení ZmCKX1 (z lat. Zea mays). Zároveň byl vyvrácen předpoklad, že CKX patří mezi aminooxidasy obsahující měď, nýbrž s největší pravděpodobností se jedná o flavoprotein, obsahující jako kofaktor flavinadenindinukleotid (FAD) Klonování genu kódujícího kukuřičnou CKX se stalo důležitým mezníkem a umožnilo tak jejich identifikaci v dalších druzích rostlin (Houba-Hérin et al., 1999; Morris et al., 1999). Studie domnělých cytokininoxidas z pšeničných a ječmenných zrn ukázaly, že kyslík není při degradační reakci vyžadován, a co víc, že nevzniká peroxid vodíku, takže enzym se chová spíše jako dehydrogenasa než oxidasa. Dalším důkazem byl také vliv použitých umělých elektronových akceptorů na změnu aktivity CKX. Ukázalo se, že v případě analogů ubichinonu se aktivita zvýšila až na 15-násobek, při použití 2,6-dichlorofenol-indofenolu (DCPIP) pak dokonce až na 20-násobek. Zajímavé také bylo, že když se porovnaly hodnoty aktivit CKX získané za anaerobních a aerobních reakčních podmínek, tak míra degradace substrátu byla stejná v obou případech. Přítomnost peroxidu vodíku jakožto produktu oxidativní degradace cytokininů
nebyla
potvrzena.
Tato
zjištění
vedla
k
reklasifikaci
enzymu
jako
cytokinindehydrogenasa (EC 1.5.99.12) (Galuszka et al., 2001). Stejně tak studie elektrochemických vlastností a aktivity ZmCKX1 potvrdily, že ačkoli molekulární kyslík by mohl vzhledem k jeho vysokému redoxnímu potenciálu (+0,82 V) být možným elektronovým akceptorem, tak velmi neochotně reaguje s redukovaným ZmCKX1, na rozdíl od dalších sloučenin, z nichž některé značně zvýšily aktivitu ZmCKX1, a to zejména p-chinony zahrnující analogy ubichinonu (Q0, Q1, 1,4-naftochinon) a také syntetický elektronový akceptor (DCPIP) (Frébortová et al., 2004). Nedávno byla izolována z floemové šťávy kukuřice sloučenina, která zvyšuje degradaci iP kukuřičnou CKX. Jedná se o hydroxamovou kyselinu - 2,4-dihydroxy-7-methoxy-1,4benzoxazin-3-on, která po oxidativním štěpení laccasou nebo peroxidasou generuje volné radikály, které slouží jako účinné elektronové akceptory pro CKX (Frébortová et al., 2010).
2.3.2.2 Struktura CKX Molekulární hmotnost CKX proteinů vypočítaná ze sekvence aminokyselin se pohybuje v rozmezí 56 - 64,9 kDa. Rozdíly v hmotnosti jsou pravděpodobně způsobeny posttranslačními úpravami enzymů, kdy dochází k jejich glykosylaci (Schmülling et al., 2003).
15
Sekvenční a biochemickou analýzou CKX se ukázalo, že se jedná o flavoenzymy patřící do třídy oxidoreduktas, jež zahrnují oxidasy (elektronovým akceptorem je molekula kyslíku) a dehydrogenasy (využívají jiné elektronové akceptory). Společným znakem této třídy enzymů je přítomnost kovalentně navázané molekuly FAD, která se napojuje přes 8-methylovou skupinu isoalloxazinového kruhu na histidinový zbytek na N-terminálnním konci enzymu. CKX vykazují stejně jako enzymatická třída flavoenzymů vanillyl-alkohol oxidas dvoudoménovou topologii, mající doménu, která váže FAD a druhou doménu s vazebným místem pro substrát (Fraaije et al., 1998). Krystalová struktura byla poprvé stanovena pro ZmCKX1 (Obr. 4) (Malito et al, 2004), poté pro AtCKX7 (Bae et al., 2008), přičemž struktura obou enzymů je velmi podobná a vykazuje vysoce konzervované aktivní místo.
Obrázek 4: Celková struktura monomeru ZmCKX. Převzato z Malito et al., 2004. Doména vázající FAD (modrá), doména vázající substrát (červená), FAD (žlutě) a iP (černě). Aktivní místo CKX se skládá z vnitřní dutiny lemované flavinovým kruhem, do které se zachycuje postranní alifatický řetězec substrátu. Na povrchu proteinu se nachází vazebné místo pro adeninový kruh cytokininu mající trychtýřovitý tvar, přičemž adenin je vmezeřen mezi zbytky nepolárních aminokyselin (Malito et al., 2004). Katalytická reakce (Obr. 5) začíná přenosem hydridového iontu z α-uhlíku cytokininu na atom N5 flavinadenindinukleotidu. Následuje odejmutí protonu z N6 atomu cytokininu, které zprostředkovává aspartát sloužící jako katalytická base, a dochází k utvoření iminového meziproduktu, který poté hydrolyzuje na adenin a aldehyd odvozený od příslušného postranního řetězce (Popelková et al., 2006). 16
Adenin
Isopentenyladenin
3-methyl-2-butenal
Elektronový akceptor
Obrázek 5: Mechanismus degradace cytokininů pomocí CKX. Upraveno podle Werner et al., 2006. (A) Schéma degradační reakce. (B) Schéma oxidace substrátu.
2.3.2.3 Aktivita a substrátová specifita CKX Jednotlivé isoformy CKX enzymů se značně liší v substrátové specifitě. V Arabidopsis byla detailně prozkoumána oxidasová/dehydrogenasová aktivita u sedmi genů AtCKX exprimovaných v transgenních rostlinách tabáku (Galuszka et al., 2007). Všech sedm enzymů se chovalo spíše jako dehydrogenasy, vykazovaly značně zvýšenou aktivitu v přítomnosti umělých elektronových akceptorů (prekurzory ubichinonu Q10, DCPIP), a žádný z enzymů se nedal označit za strikně cytokininoxidasu. AtCKX2 a jeho nejbližší paralog AtCKX4 (sekretované do apoplastu) vykazovaly srovnatelně vysokou enzymatickou aktivitu za použití volných basí isoprenoidních cytokininů (iP, zeatin(obě isoformy)) jako substrátů při neutrálním pH. Podobně je to u pravděpodobně sekretovaných AtCKX5, 6 (v důsledku velmi nízké aktivity téměř nedetekovatelné) (Werner et al., 2003) a také dobře prozkoumaného ZmCKX1 (Frébortová et al., 2004). Naproti tomu AtCKX1 protein vykazoval nejvyšší aktivitu při slabě kyselém pH s vysokou preferencí pro cytokininové ribosidy a N6(2-isopentenyl)adenin 9-glukosid (iP9G), což je v souladu s jeho vakuolární lokalizací (pH~5,5). Stejná preference pro iP9G byla zjištěna také u cytosolární AtCKX7. V případě proteinu AtCKX3 je pravděpodobné, že preferuje degradaci cytokininových nukleotidů, které byly předtím považovány za rezistentní vůči aktivitě CKX.
17
Aromatické cytokininy byly degradovány velmi nízkou reakční rychlostí (Galuszka et al., 2007). Další studie nesekretovaných AtCKX (1, 3 a 7) ukázaly, že ještě lepším substrátem pro AtCKX1 než iP9G jsou tZ-trifosfáty (až 96x větší aktivita než iP) a také iP-trifosfáty (30x větší aktivita) (Kowalska et al., 2010). Podobná preference pro tZ a iP9G byla pozorována u cytosolické ZmCKX10 zatímco apoplastické ZmCKX1 a AtCKX2 degradují tZ nejefektivněji a v přítomnosti iP9G a iP-monofosfátů vykazují velmi nízkou aktivitu (Šmehilová et al., 2009; Galuzska et al., 2007). U AtCKX3 se neprojevila nějak silná preference k žádnému ze studovaných cytokininů, přesto však upřednostňuje iP-fosfáty a ribosidy nad volnými basemi. Vakuolární enzymy (AtCKX1 a AtCKX3) jednoznačně přednostně degradují iPTP, o něco méně iPDP a než iPMP, zeatin-mono- a difosfáty. Totéž bylo zjištěno u AtCKX7, nicméně s mnohem vyšší aktivitou vůči iPDP a iPTP. Naproti tomu degradace di- a trifosfátů sekretovanými enzymy ZmCKX1 a AtCKX2 je tak nízká, že se blíží detekčnímu limitu (Kowalska et al., 2010).
2.3.2.4 Lokalizace CKX Cytokinindehydrogenasy i přes nízkou sekvenční homologii napříč jednotlivými druhy rostlin, obsahují několik vysoce konzervovaných domén – asi 1/3 všech pozic aminokyselin. Mimo největší část konzervovaných regionů, která se nachází na doméně pro navázání FAD kofaktoru, byly nalezeny také vysoce konzervované motivy na C- a N- konci. Vysoký stupeň variability sekvencí mezi těmito konzervovanými motivy a jejich specifičnost pro CKX enzymy, značí jejich funkční důležitost (Schmüling et al., 2003). Sekvence na N- konci jsou zodpovědné za odlišné směřování proteinů v rostlinné buňce, tedy různou buněčnou lokalizaci. Obecně platí, že většinou pouze jedna isoforma CKX je směřována do cytosolu a všechny ostatní jsou lokalizovány v apoplastu nebo vakuolách (Obr. 3). Odlišná subcelulární lokalizace (Obr. 3)má pravděpodobně vliv na funkci enzymu a je nezbytná pro objasnění fyziologických následků narušené rovnováhy cytokininů po genetické manipulaci rostlin (Werner et al., 2003). U modelové dvouděložné rostliny Arabidopsis thaliana byla provedena analýza šesti z celkových sedmi AtCKX proteinů. Pro všechny studované isoformy (AtCKX2, AtCKX4, AtCKX5 a AtCKX6) kromě AtCKX7 byl pomocí predikčních nástrojů (TargetP, iPSORT) předpovězen hydrofobní N-terminální signální peptid značící směřování do endoplasmatického retikula (ER) a následný transport do apoplastu (sekreční dráhou) nebo v případě AtCKX1 a AtCKX3 do mitochondrií. K potvrzení/vyvrácení této hypotézy, byly připraveny transgenní rostliny Arabidopsis exprimující AtCKX1, 2 a 3-GFP proteiny s C-terminální fúzí pod kontrolou 35s promotoru. V epidermálních buňkách listové čepele byl signál AtCKX2-GFP distribuován jako tenká linie podél okraje buňky a jádra (Obr. 6, D, E), což odpovídá lokalizaci 18
v ER. Tento fakt byl dále podpořen ještě expresí AtCKX2-GFP v epidermálních buňkách řapíku (Obr. 6, F), přičemž byly rozpoznány vřetenovité útvary jako typický vzor lokalizace v ER. Vzhledem k tomu, že AtCKX2 neobsahuje ER-retenční motiv, je pravděpodobné, že byl již protein sekretován. Tento předpoklad podpořila také již dřívější studie, kdy byla potvrzena extracelulární enzymatická aktivita AtCKX2 v buňkách kvasinek (Werner et al., 2001). Naproti tomu u epidermálních buněk listů exprimujících vysoké hladiny AtCKX3-GFP došlo k akumulaci fluorescence ve velkých centrálních vakuolách (Obr. 6, G, H), přičemž byly na periferii viditelné struktury podobné ER, značící sekreci AtCKX3-GFP z lumenu ER do vakuol. Stejně tak byla potvrzena vakuolární lokalizace AtCKX3-GFP v kořenových buňkách (Obr. 6, I, J). Naopak AtCKX1-GFP (Obr. 6, K) vykazovala síť endoplasmatického retikula v epidermálních buňkách listů, ale ve vakuolách nebyla detekována. Nicméně ve vakuolách především malých kořenových buněk cévních svazků byla fluorescence AtCKX1-GFP zaznamenána. Je možné, že vakuolární směřování AtCKX1 je specifické jen pro určité typy buněk, ale důvodem byla pravděpodobně nízká intenzita exprese. Konečným cílem AtCKX1 a AtCKX3 je tedy vakuola, naopak AtCKX2 je směřována do endoplasmatického retikula (Werner et al. 2003). Chybějící signální peptid v případě AtCKX7 určuje jeho lokalizaci v cytosolu, což potvrzuje také intracelulární exprese rekombinantního proteinu v heterologním expresním systému bakterie E. coli a kvasinky Pichia pastoris (Kowalska et al., 2010).
Obrázek 6: Subcelulární lokalizace AtCKX-GFP fúzních proteinů. Werner et al., 2003.
19
Konstitutivní overexprese jednotlivých AtCKX v Arabidopsis a tabáku vyústila ve významné změny fenotypu v důsledku snížené hladiny cytokininů. Overexprese odhalila opačnou roli CKX v regulaci růstu a vývoje kořene a stonku (Werner et al., 2003). Galuszka et al. (2005) se zabývali subcelulární lokalizací CKX u modelu jednoděložných rostlin kukuřice (Zea mays). ZmCKX1, jehož gen byl jako první CKX naklonován a je významným zástupcem genové rodiny v kukuřici. Bylo zjištěno, že ZmCKX1 je konzistentně sekretován do apoplastu vyvíjejícíh se kukuřičných zrn. Za použití imunochemického barvení byl ZmCKX1 detekován v apoplastu v těsné blízkosti buněčné stěny, bez ohledu na typ pletiva. Největší hustota zbarvení byla objevena v aleuronové vrstvě zrn, embryu a ve stopkách květů. Dále byla testována aktivita ZmCKX1 histochemickou detekcí v reproduktivních a vegetativních pletivech kukuřice, přičemž jako substrát sloužil N6-(2isopentenyl)adenin/adenosin a elektronový akceptor DCPIP. Minimální aktivita CKX byla zjištěna v perikarpu, kdežto největší aktivita (>100x větší než v perikarpu) byla detekována v aleuronové vrstvě vzdálené od embrya. V porovnání s reproduktivními pletivy, byla aktivita CKX v kořenech kukuřičných semenáčků velmi nízká. Nicméně v rostoucích sazenicích byla aktivita detekována také ve floemových buňkách stonku. Lokalizace enzymu v jednotlivých pletivech byla provedena pomocí polyklonální protilátky připravené proti peptidovému fragmentu ZmCKX1. Pomocí konfokální mikroskopie bylo ukázáno, že distribuce ZmCKX1 je ve všech pletivech konzistentní a je situována do apoplastu. Tento výsledek je v souladu s hypotézou formulovanou již v r. 1999 (Morris et al., 1999) na základě přítomnosti N-terminálního signálního peptidu. Dalším zkoumaným CKX proteinem, u které bylo předpovězeno, že postrádá signální peptid, byl ZmCKX10. Šmehilová et al. (2009) popsali biochemické vlastnosti a zjistili, že jsou odlišné od sekretované ZmCKX1. Zaměřili se také na subcelulární lokalizace, přičemž zjistili, že je odlišná od apoplastické ZmCKX1 (Obr. 7). Ke studiu lokalizace těchto dvou isoforem využili C-terminální GFP fúzi. Zmíněné fúzní proteiny byly transientně exprimovány v rajčatových koříncích (tomato hairy roots). Mikroskopickou analýzou transgenních kořínků pak byla prokázána cytosolická lokazilace ZmCKX10, zatímco fluorescenční signál ZmCKX1 byl viditelný pouze po obvodu buněk, značící apoplastickou lokalizaci. Aby byla vyvrácena možnost, že ZmCKX1 je lokalizována na plasmatické membráně byly buňky ošetřeny cellulasou. Uvolnění protoplastů vedlo k vymizení fluorescencčního signálu, což vylučuje možné interakce mezi ZmCKX1 a plasmatickou membránou.
20
kořenové buňky rajčete
protoplasty rajčatového kořene
GFP
ZmCKX10-GFP
ZmCKX1-GFP
Obrázek 7: Subcelulární lokalizace ZmCKX-GFP fúzních proteinů. Šmehilová et al., 2009). Co se týče fenotypu transgenních kořínků rajčete overexprimujících dané ZmCKX-GFP isoformy, tak nebyly zaznamenány žádné morfologické změny. Jediným rozdílem byla míra produkce tkáně. Kořínky overexprimující ZmCKX1-GFP se formovaly rychleji, což vyústilo ve větší tkáňovou produkci, v porovnání z wild typem. Naproti tomu u ZmCKX10-GFP overexprimujících kořínků, byl viditelný retardovaný růst a tedy nízká tkáňová produkce. Ačkoli je zřejmé, že cytosolická ZmCKX10 má zcela opačné vlastnosti jako apoplastická ZmCKX1, do budoucna by bylo vhodné provést overexpresi cytosolických CKX v celé rostlině, a nahlédnout tak hlouběji do fyziologických následků kompartmentizace degradace cytokininů (Šmehilová et al., 2009).
21
2.3.3 Inaktivace cytokininů - glykosyltransferasy Homeostáze biologicky aktivních cytokininů v rostlinných pletivech musí být neustále udržována a je nezbytná pro normální růst a vývoj rostlin. Kromě biosyntézy cytokininů (IPT) a jejich ireversibilní degradace (CKX), hraje v udržování homestáze důležitou roli glykosylace cytokininů. Enzym UDP-glykosyltransferasa (UGT, EC 2.4.1.X) katalyzuje reakci, kdy dochází ke konjugaci cukru (glukosa, xylosa z uridin difosfátu) na cytokinin, za vzniku inaktivní formy cytokininů N- nebo O-glykosidů (popř. O-xylosidů) (Frébort et al., 2011).
2.3.3.1 Konjugace na adeninovém kruhu N-glykosylací vznikají N3, N7 N9- glykosidy, vykazující nízkou aktivitu při biologických testech a jsou zřídka metabolizovány. Předpokládá se, že se jedná o ireversibilní deaktivační proces (Frébort et al., 2011), nicméně bylo zjištěno, že rekombinantní AtCKX preferují isopentenyladenin-9-glukosid jako substrát (Galuszka et al., 2007). V Arabidopsis byla charakterizována multigenová rodina UGT, z níž pouze dva geny (UGT76C1, UGT76C2) kódují aktivní enzym se schopností N-glykosylace na pozicích N7 N9, přičemž nejlepšími substráty jsou N6-isopentelnyl- a N6-benzyladenin (Hou et al., 2004).
2.3.3.2 Konjugace na isoprenoidním řetězci Cytokininy mající na postranním řetězci hydroxylovou skupinu (zeatiny, topoliny) podléhají O-glykosylacím. O-glykosidy (spolu s N3-glykosidem kinetinu) mohou být na rozdíl od N7- a N9-glykosidů zpětně deglykosylovány pomocí enzymů β-glukosidas (EC 3.2.1.21). βglukosidasy byly klonovány z kukuřice a lokalizovány v kořenovém meristému kukuřičných semenáčků, a mohou se in vivo podílet zásobování vyvíjejícího se embrya aktivními cytokininy. Jelikož mohou být tyto konjugáty zpětně převedeny na aktivní formu cytokininů, jsou považovány za velmi důležité zásobní formy, vhodné pro transport a jako forma odolná proti degradaci CKX enzymy (Brzobohatý et al., 1993). Přísná substrátová specifita vůči cytokininům a donorům cukru značí, že konjugační proces s glukosou (UDP-Glc) nebo xylosou (UDP-Xyl) je přesně regulován během vývoje rostliny. O-glykosylace je stereo-specifická, takže např. O-glykosyltransferasa kódována genem ZOG1 z Phaseolus lunatus má vysokou afinitu k trans-zeatinu a donorem cukru může být jak UDP-Glc tak UDP-Xyl, zatímco isoenzymy cisZOG1 s cisZOG2 pocházející ze Zea mays preferují jako substrát výhradně cis-zeatin a nejsou schopny přenosu xylosy z UDP-Xyl (Veach et al., 2003). Zajímavé je, že O-glykosyltransferasy z Arabidopsis nerozlišují mezi oběma isomery a jsou schopny oba glykosylovat stejně efektivně (Hou et al., 2004). Přepokládaná lokalizace O-glykosidů je převážně ve vakuolách, nicméně přítomnost trans-zeatin O-glykosytransferasy byla zaznamenána jak v jádře tak cytoplasmě a byla spojena 22
také s cytoplasmatickou membránou a buněčnou stěnou kořenových buněk kukuřice (Bajguz&Poitrowska, 2009; Li et al., 2001). Bylo prokázáno, že většina β-glukosidas využívá široké spektrum substrátů, nejen konjugáty cytokininů. Nízká specifita k substrátům naznačuje, že hydrolýza cytokininových konjugátů není tak přísně regulována ve srovnání se syntézou O-glykosidů. Avšak enzym izolovaný z řepky (Brassica napus) vykazuje značnou aktivitu vůči zeatin-O-glykosidu. βglukosidasa izolovaná z kukuřice kódovaná genem Zm-p60. 1 štěpí biologicky inaktivní cytokininové konjugáty jako jsou O-β-glykosylzeatin a N3-β-glykosylkinetin. In situ imunolokalizačními experimenty byl tento protein nalezen v plastidech kolem cévních svazků koleoptilu, což může naznačovat jeho roli v transportu cytokininů (Kristoffersen et al., 2000).
23
3 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 3.1 Materiál Na polymerázovou řetězovou reakci ( PCR) byly použity 5x Phusion HF (HighFidelity) pufr (New England Biolabs/NEB), Phusion HF DNA Polymerasa (NEB), deoxynukleotidtrifosfáty (10 mM dNTPs), dimethylsulfoxid (DMSO), 4 M betain nebo v případě colony PCR 2x Immomix obsahující Immolasu DNA Polymerasu (Bioline). Elektroforeza byla provedena v 1 % agarosovém gelu v 1x TAE pufru (40 mM Tris-acetát, 1mM EDTA, pH=8,0) s přidaným ethidiumbromidem. Ke vzorkům byl přidán vzorkový pufr 6x DNA Loading Dye (Fermentas/Ferm) a jako standard molekulové hmotnosti byl použit GeneRuler 1kb DNA Ladder (Ferm). Při rekombinačních reakcích (Gateway cloning) byly použity enzymové směsi BP clonasa II a LR clonasa II (Invitrogen), TE pufr (10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8,0) a pro ukončení reakce byla přidána proteinkinasa K (Invitrogen). Ověřovací restrikční reakce byly provedeny za použití následujících restrikčních enzymů: ApaI (Takara/Tak), AvrII (NEB), BamHI (Tak), BfaI (NEB), BstXI (Tak), HindIII (Tak), EcoRI (Ferm), NdeI (NEB), SalI (NEB), SmaI (Tak), PstI (Ferm), XhoI (Tak). Ke kultivaci bakteriálních kultur E. coli se používalo Luria-Bertani (LB) High-salt médium (10 g/l trypton, 10 g/l NaCl, 5 g/l kvasničný extrakt, pH=7,2), popř. pevné LB médium s 1,5 % agarem. Transformace byla provedena do elektrokompetentních buněk E. coli TOP 10 (Invitrogen), které byly poté kultivovány v SOC médiu. Antibiotika přidávaná do médií: ampicilin (Amp, 100 mg/l), gentamycin (Gen, 15 mg/l), kanamycin (Kan, 50 mg/l) či hygromycin (Hyg, 50 mg/l). Izolace a purifikace DNA materiálu (plasmidy, PCR produkty) byly provedeny pomocí těchto komerčních souprav: o
MinElute Gel Extraction Kit (50) (QIAGEN)
o
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) (QIAGEN)
o
Wizard SV Gel and PCR clean-up system (Promega)
Izolace plasmidových konstruktů na kontrolní restrikce metodou alkalické lýze byla provedena s pomocí pufrů P1 (50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 100 µg/ml RNAsa A, pH=8,0), P2 (200 mM NaOH, 1 % SDS), P3 (3 M octan draselný, pH=5,5), vysrážení DNA 100 % isopropanolem a následné promytí 70 % ethanolem (-20 ⁰C).
24
Dále byla používána sterilní či nuclease-free voda (PCR, restrikce, sekvenace), 50 % glycerol na přípravu stocků bakteriálních kultur nesoucí dané plasmidy. Přístrojové vybavení: o
Centrifuga Rotanta 460R (Hettich, Německo)
o
Centrifuga stolní (Eppendorf, ČR)
o
Digestoř (Forlab, Valašské Meziřící)
o
Elektroporátor ECM 399 (BTX, USA)
o
Elektroforetická komůrka na horizontální elektroforesu (Biometra, Německo)
o
Flow - box
o
Inkubátor (65 ⁰C) (Memmert, Německo)
o
Inkubátor (37 ⁰C)
o
Spektrofotometr NAS 99 (ACT gene, USA)
o
Termoblok Thermomixer komfort (Eppendorf, Německo)
o
Termocycler T - personal (Biometra, Německo)
o
Termocycler T – gradient (Biometra, Německo)
o
Transiluminátor UV Superbright (Vilber Lourmat, Francie)
o
Třepačka inkubovaná Heidolph unimax 1010 (Heidolph, Německo)
A další pracovní pomůcky laboratoří Oddělení molekulární biologie (pipety, …).
3.2 Metody 3.2.1 Izolace plasmidové DNA za použití soupravy QIAprep Spin Miniprep LB médium s příslušným selekčním antibiotikem bylo naočkováno bakteriální kulturou E. coli nesoucí daný plasmid a kultivováno přes noc na třepačce při 37 ⁰C. Poté bylo odebráno 5 ml bakteriální kultury a centrifugováno 10 min při 4700 rpm v 15 ml zkumavkách (Falcon) nebo 3 min při >8000 rpm ve 2 ml mikrozkumavkách (Eppendorf), supernatant byl odstraněn. Pelet bakteriálních buněk byl použit pro izolaci plasmidu. Izolace byla provedena přesně podle přiloženého manuálu. Eluce byla provedena 20 µl sterilní vody. Koncentrace DNA byla stanovena pomocí spektrofotometru NAS 99.
25
3.2.2 Izolace plasmidové DNA pomocí alkalické lyze (za použití pufrů P1, P2 a P3) Tento způsob izolace plasmidové DNA byl používán k izolaci vzorků na kontrolní reakce jako je colony PCR či restrikce. Bakteriální kultura E. coli (2 ml) byla centrifugována 1 min při 13000 x g (všechny kroky). Pelet byl resuspendován ve 300 µl pufru P1. Dále bylo přidáno 300 µl pufru P2, obsah zkumavky by několikerým převrácením promíchán a ponechán 5 min stát. Následně bylo přidáno 300 µl roztoku P3, vzorek byl opět jemně promíchán a ponechán 5 min na ledu. Poté následovala centrifugace 10 min při 4 ⁰C. Supernatant byl přelit do čistých mikrozkumavek a bylo přidáno 500 µl isopropanolu. Po promíchání byl vzorek opět centrifugován 10 min při laboratorní teplotě. Supernatant byl opatrně odpipetován a vzniklá sraženina DNA byla promyta 500 µl 70 % etanolu o teplotě -20 ⁰C. Dále byla provedena centrifugace 5 min při 4 ⁰C, supernatant byl opatrně odpipetován a zkumavky byly ponechány 10 min v laminárním boxu, aby se odpařil všechen zbytkový etanol. Na závěr byla sraženina DNA resuspendována ve 20 µl sterilní vody.
3.2.3 Polymerasová řetězová reakce (PCR) Polymerasová řetězová reakce (PCR, z angl. Polymerase Chain Reaction) byla provedena buď s Phusion HF DNA Polymerasou, s nebo bez přídavku aditiv (1,3 M betain, 1,3 % DMSO), nebo v případě kontrolních reakcí s Immolasovou DNA Polymerasou. Teplotní průběh PCR reakcí byl následující. Tabulka 1: Podmínky PCR při použití Phusion HF DNA Polymerasy.
1. 2. 3. 4. 5.
Krok Počáteční denaturace Denaturace Annealing Extenze Závěřečná extenze
Čas 30 s 10 s 20 s 50 s 10 min
Teplota 98 ⁰C 98 ⁰C 68 ⁰C 72 ⁰C 72 ⁰C
Opakování 1 35 1
Tabulka 2: Složení reakční směsi při použití Phusion HF DNA Polymerasy bez přídavku aditiv. Složka H2O 5x Phusion HF pufr dNTPs (10 mM) fw primer (10 µM) rev primer (10 µM) Templát (plasmid ~ 200 ng/µl) Phusion HF DNA Polymerasa Celkový objem
Objem [µl] / 1 reakce 12,4 4 0,4 1 1 1 0,2 20 26
Tabulka 3: Složení reakční směsi při použití Phusion HF DNA Polymerasy s přídavkem aditiv. Složka H2O 5x Phusion HF pufr dNTPs (10 mM) 4M Betain DMSO fw primer (10 µM) rev primer (10 µM) Templát (plasmid ~ 200 ng/µl) Phusion HF DNA Polymerasa Celkový objem
Objem [µl] / 1 reakce 12,4 4 0,4 6,5 0,25 1 1 1 0,2 20
Reakční směs byla připravována na ledu a jako poslední byla vždy přidána DNA Polymerasa. Voda použitá v reakci byla nuclease-free a templát byl zředěn 100x, 200x, 500x či 1000x, v závislosti na původní koncentraci DNA. Tabulka 4: Podmínky PCR při použití Immolasové DNA Polymerasy. Krok 1. Aktivace, Počáteční denaturace 2. Denaturace 3. Annealing 4. Extenze 5. Závěřečná extenze
Teplota
Čas
Opakování
95 ⁰C
10 min
1
95 ⁰C 68 ⁰C 72 ⁰C 72 ⁰C
15 s 30 s 1 min 10 min
Tabulka 5: Složení reakční směsi při použití Immolasové DNA Polymerasy. Složka 2x Immomix H2O fw primer (10 mM) rev primer (10 mM) Templát (plasmidová DNA) Celkový objem
Objem [µl] / 1 reakce 10 7 1 1 1 20
Reakční směs 2x Immomix již obsahuje DNA Polymerasu a další potřebné složky.
27
35 1
Sekvence primerů použitých pro PCR: ZmCKX3 – forward primer: 5´-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCAGACCATGAAGCCGCCATCATCACTGG-3´ ZmCKX3 – reverse primer 5´-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCAAAGGCAATGGCAGTGACGC-3´ ZmCKX4a+b – forward primer: 5´-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCAGAACCATGACGCGGTGCCTCATGTTC-3´ ZmCKX4a – reverse primer: 5´-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCGAGTCGGCCGCGAGCG-3´ ZmCKX4b – reverse primer: 5´-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCGAGTCGGCGACGAGCG-3´ ZmCKX5 – forward primer: 5´-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCAGAACCATGGCTAGAGCTACGACCTCC-3´ ZmCKX5 – reverse primer: 5´-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTGAGGCAAGTAGCGGGGACG-3´ ZmCKX8 – forward primer: 5´-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCAGAACCATGGCAAGAAGGACTCGTTTCG3´ ZmCKX8 – reverse primer: 5´-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGGCAGAAGCAATGCCAGATGAC-3´ ZmCKX10 – forward primer: 5´-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCAGAACCATGATGCTCGCGTACATGGACC3´ ZmCKX10 – reverse primer: 5´-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCACGGCGACGGACGCCG-3´ ZmCKX12 – forward primer: 5´-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCAGAACCATGGAGGGCAAGGTGCTGTGC-3´ ZmCKX12 – reverse primer: 5´-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCATCGGGCTCGAGGAGGAG-3´ Zeleně jsou označena attB1 (f-primer) a attB2 (r-primer) místa.
28
3.2.4 Elektroforetická separace DNA v agarosovém gelu 1 % roztok agarosy byl připraven rozpuštěním 5 g agarosy v 500 ml TAE pufru (pH=8,0) a následným rozvařením. 1% agarosu je pak možné uchovávat při 65°C. Roztok (65 ⁰C) byl nalit do horizontální elektroforetické vaničky, do roztoku byl přimíchán ethidiumbromid a vložen hřebínek k vytvoření jamek. Po ztuhnutí byl gel přesunut do elektroforetické komůrky, převrstven TAE pufrem tak, aby byl gel zcela ponořen a poté byl z gelu opatrně vyjmut hřebínek. Ke vzorku DNA (PCR produkty, plasmidové konstrukty, restrikční směsi) byl přidán vzorkový pufr 6x Loading dye a poté byl nanesen do jamky gelu. Pro stanovení velikosti fragmentů DNA bylo do jedné z jamek naneseno 5 µl standardu molekulové hmotnosti (1 kb DNA ladder). Po nanesení všech vzorků (20 µl) byla elektroforetická komůrka uzavřena připojena ke zdroji napětí. Separace probíhala při 120 V cca 20-30 min, v případě větších fragmentů déle. Na závěr byl gel přenesen na UV-transiluminátor a byl pořízen snímek pomocí dokumentačního systému Alpha Digi a programu Alpha DigiDoc RT.
3.2.5 Extrakce DNA fragmentů z agarosového gelu K extrakci fragmentů DNA po elektroforeze byl použit MinElute Gel Extraction kit. Po provedení elektroforézy byl gel položen na transiluminátor, krátce osvícen UV zářením a fragmenty DNA odpovídající velikosti byly vyřezány sterilním skalpelem a vloženy do mikrozkumavek. Poté byla stanovena hmotnost vyřezaného gelu. Izolace DNA pak probíhala přesně podle přiloženého manuálu. V posledním kroku byla provedena eluce DNA pomocí 10 µl 4x zředěného EB pufru. Koncentrace DNA byla změřena pomocí spektrofotometru NAS 99.
3.2.6 Rekombinační klonování pomocí Gateway technologie Gateway technologie je univerzální klonovací metoda vlastněná společností Invitrogen a funguje na principu reversibilní rekombinační reakce, kdy nejsou zapotřebí restrikční enzymy a přitom je zachována orientace vloženého fragmentu a čtecí rámec. Taktéž odpadá nutnost ligace a dalších dílčích kroků (např. purifikace PCR produktů, restrikčních fragmentů) či screening nepočitatelných kolonií a tím obtížné hledání požadovaného klonu. Rekombinační reakce probíhá při pokojové teplotě, je rychlá a dosahuje úspěšnosti klonování >99 %. Jakmile je jednou vložen požadovaný fragment DNA do Gateway vektoru, může být přemístěn do mnoha dalších expresních vektorů, což poskytuje obrovskou flexibilitu a usnadnění pracovního postupu. 29
Technologie byla vyvinuta na základě využití výhod bakteriofága λ, který nese specifický úsek DNA umožňující rekombinaci – tzv. attP místo (P – z angl. phage) a bakterie E. coli mající krátkou sekvenci DNA – tzv. místo attB (B – z angl. bacteria). Základem klonování Gateway technologií jsou BP a LR reakce. Při BP reakci se rekombinuje část jedné molekuly DNA – již zmíněné attB místo, které je ohraničeno vždy dvěma místy attB1 a attB2, s druhou molekulou DNA obsahující attP místo, ohraničeném místy attP1 a attP2. Výsledkem jsou hybridní rekombinační místa attL a attR. Opačná LR reakce mezi místy attL a attR ústí ve vystřižení DNA fága a znovuobnovení attB a attP sekvencí. BP reakcí (Obr. 8)vzniká vstupní vektor s místy attL, který se dále může použít na přípravu expresního klonu pomocí LR reakce (Obr. 9), kdy je požadovaný gen vystřižen ze vstupního klonu a jeho přemístěním do destinačního vektoru vzniká expresní klon. Reakce jsou katalyzovány enzymovými mixy BP clonasa II a LR clonasa II (zdroj: www.invitrogen.com).
3.2.6.1 BP reakce – sestrojení vstupního vektoru (“entry“ klonu)
attB1
attB2
attP1
attP2
kkkkkjk gen
ccdB Donorový vektor
PCR produkt
BP clonasa
attL1
attL2
attR1
gen
attR2 ccdB
Vstupní vektor
Vedlejší produkt
Obrázek 8: Schéma BP reakce. Na rekombinační BP reakci byly použity produkty PCR – jednotlivé ZmCKX geny ohraničené specifickými attB místy (vneseny pomocí specifických primerů), donorový vektor pDONR207 a enzymový mix BP clonasa II. Reakce byla nastavena v celkovém objemu 10 µl – nejprve byl přidán TE pufr, poté PCR produkt (100 ng), pDONR207 (300 ng). Směs byla zahřáta na 45 °C 5 min, poté byla přidána BP clonasa II (2 µl) a inkubována přes noc při 25 ⁰C. Pro zastavení reakce byla přidána proteinasa K (1 µl) a směs byla inkubována 10 min při 37 ⁰C.
30
3.2.6.2 LR reakce – sestrojení expresního vektoru (klonu)
attL1
attL2
attR1
attR2
gen
ccdB
Vstupní vektor
Destinační vektor
LR clonasa
attB1
attB2
attP1
gen
attP2 ccdB
Expresní vektor
Vedlejší produkt
Obrázek 9: Schéma LR reakce. K provedení LR reakce byly použity vstupní klony připravené během této bakalářské práce (pDONR207:ZmCKX5) a vstupní klony připravené již dříve (pENTR 2B:ZmCKX1, 2, 6, 8, 9). Jako destinační vektor byl vybrán vektor pGWB5 obsahující gen pro C- terminální GFP (z angl. green fluorescent protein). Produktem reakce jsou tedy fúzní geny ZmCKX–GFP. Do reakční směsi byly přidány tyto složky: vstupní klon (50 ng), destinační vektor (200 ng), TE pufr, a směs byla inkubována 5 min při 45 ⁰C. Ihned poté byla přidána LR clonasa II (2 µl) a následovala inkubace přes noc při 25 ⁰C. Po proběhnutí LR reakce byla přidána proteinasa K (1 µl) a směs byla inkubována 10 min při 37 ⁰C. Po rekombinačních reakcích byla provedena transformace buněk E. coli TOP 10 a následná kultivace na pevném LB médiu. Selekce vybraných konstruktů byla zajištěna jak přídavkem antibiotik obsahujících gentamycin (pDONR207:ZmCKX) nebo kanamycin s hygromycinem (pGWB5:ZmCKX), tak vektory (donorový, destinační) nesoucí gen ccdB. Plasmidy obsahující ccdB gen, jehož produkt je toxický pro standardní kmeny E. coli (kromě kmene DB 3.1) nejsou produkovány. Na pevném médiu narostou tedy jen ty kolonie, které obsahují připravené konstrukty, u kterých došlo během rekombinace k vystřižení ccdB genu.
31
3.2.7 Elektroporace E. coli Buňky E. coli TOP 10 byly po vytažení z mrazáku (- 80 ⁰C ) krátce ponechány na ledu, poté byl přidán 1 µl izolovaného plasmidu (vstupní, expresní klon), směs se opatrně promíchala špičkou pipety a byla napipetována do předem vychlazených elektroporačních kyvet a ponechána několik minut na ledu. Následně byla provedena elektroporace (1800 V, 5 ms). Po proběhnutí elektrického impulsu bylo k buňkám okamžitě přidáno cca 500 µl SOC media. Kultura byla přenesena do čisté mikrozkumavky a kultivována na třepačce při 37 ⁰C po dobu 12 h. Po kultivaci byla kultura centrifugována 2-3 min při 3000 rpm. Část supernatantu byla odlita a ve zbytku (cca 200 µl) byl pelet znovu resuspendován a rozetřen na Petriho misky s pevným LB mediem. Kultivace probíhala do dalšího dne při 37 ⁰C, dnem vzhůru.
3.2.8 Štěpení restrikčními endonukleasami Restrikce byly využity k ověření přítomnosti klonovaného fragmentu ve vektoru a také k linearizaci destinačního vektoru před LR reakcí.
3.2.8.1 Restrikční analýza DNA Pro ověření správnosti připraveného konstruktu pDONR207:
ZmCKX3
a
pDONR207:ZmCKX5 získaných BP reakcí byly vybrány restrikční enzymy AvrII a BstXI; PstI a HindIII respektive ApaI a SmaI; BamHI. Optimální podmínky reakce byly zjištěny pomocí aplikace DoubleDigest (dostupného na www.neb.com). Restrikční analýzy byly nastaveny podle následujících podmínek. Tabulka 6: Restrikce pDONR207:ZmCKX3 – složení reakční směsi. Restrikce AvrII a BstXI Složka Objem [µl] 10 x NEB pufr 3 2 Templát 2,6 (1 µg DNA) AvrII 0,4 BstXI 0,2 100 x BSA Nuklease-free H2O 14,8 Celkový objem 20 37 ⁰C Reakční teplota
Restrikce PstI a HindIII Složka Objem [µl] 10 x NEB pufr 2 2 Templát 2,6 (1 µg DNA) HindIII 0,2 PstI 0,2 100 x BSA 0,2 Nuklease-free H2O 14,8 Celkový objem 20 37 ⁰C Reakční teplota
32
Tabulka 7: Restrikce pDONR207:ZmCKX5 – složení reakční směsi. Restrikce ApaI a SmaI Složka Objem [µl] 10 x NEB pufr 4 2 Templát 2,5 (1 µg DNA) ApaI 0,2 SmaI 0,2 100 x BSA 0,2 Nuklease-free H2O 14,9 Celkový objem 20 Reakční teplota 25 ⁰C
Restrikce BamHI Složka Objem [µl] 10 x NEB pufr 3 2 Templát 2,5 (1 µg DNA) BamHI 0,2 100 x BSA Nuklease-free H2O Celkový objem Reakční teplota
0,2 15,1 20 37 ⁰C
Jednotlivé restrikční enzymy byly přidány do směsi zároveň a inkubace probíhala do dalšího dne při dané teplotě. Poté byla provedena elektroforeza a kontrola štěpení DNA a velikosti fragmentů pomoci UV-transiluminátoru. Stejným
způsobem
pGWB5:ZmCKX1,
byly
ověřeny
pGWB5:ZmCKX2,
konstrukty
připravené
pGWB5:ZmCKX5,
LR
reakcí
tedy:
pGWB5:ZmCKX6,
pGWB5:ZmCKX8 a pGWB5:ZmCKX9. Ve všech případech kromě pGWB5:ZmCKX5, byly použity stejné restrikční enzymy, se kterými byly dané geny klonovány do pENTR2B vektoru (ohraničující jednotlivé úseky genů). Jako negativní kontrola byl na restrikční reakci použit i samotný vektor pGWB5. Tabulka 8: Restrikce pGWB5:ZmCKX1, pGWB5:ZmCKX2, pGWB5:ZmCKX6, pGWB5 enzymy EcoRI a SalI – složení reakčních směsí. pGWB5:ZmCKX1 pGWB5:ZmCKX2 Složka 10 x NEB pufr 3 Templát EcoRI SalI 100 x BSA Nuklease-free H2O Celkový objem
2 10 0,2 0,3 0,2 7,3 20
2 5 0,2 0,3 0,2 12,3 20
33
pGWB5:ZmCKX6 Objem [µl] 3 19 0,2 0,3 0,3 7,2 30
pGWB5 2 3,5 0,2 0,3 0,2 13,8 20
Tabulka 9: Restrikce pGWB5:ZmCKX5 a pGWB5 enzymy BsiWI a HindIII-složení reakčních směsí. Složka 10 x NEB pufr 2 Templát BsiWI HindIII 100 x BSA Nuklease-free H2O Celkový objem
pGWB5:ZmCKX5 Objem [µl] 2 10 0,2 0,3 7,5 20
pGWB5 2 3,5 0,2 0,3 14 20
Tabulka 10: Restrikce pGWB5:ZmCKX8 a pGWB5 enzymy BfaI a EcoRI – složení reakčních směsí. Složka 10 x NEB pufr 4 Templát BfaI EcoRI 100 x BSA Nuklease-free H2O Celkový objem
pGWB5:ZmCKX8 Objem [µl] 2 11,2 0,3 0,2 6,3 20
pGWB5 2 3,5 0,3 0,2 14 20
Tabulka 11: Restrikce pGWB5:ZmCKX9 a pGWB5 enzymy EcoRI a NdeI – složení reakčních směsí. Složka 10 x EcoRI pufr Templát EcoRI NdeI 100 x BSA Nuklease-free H2O Celkový objem
pGWB5:ZmCKX9 Objem [µl] 2 10 0,2 0,3 7,5 20
pGWB5 2 3,5 0,2 0,3 14 20
Všechny restrikční směsi konstruktů pGWB5:ZmCKX (kromě pGWB5:ZmCKX5) byly inkubovány při teplotě 37 ⁰C přes noc. Pouze u konstruktu pGWB5:ZmCKX5byl nejprve přidán enzym HindIII,inkubován 2 h při 37 ⁰C a poté byl přidán enzym BsiWI a směs byla inkubována při 55 ⁰C do dalšího dne. Do reakce bylo přidáno cca 5 µg DNA.
34
3.2.8.2 Linearizace vektoru Podle doporučeného návodu (Gateway manual) byl destinační vektor pGWB5 před sestrojením LR reakce nejprve linearizován enzymem XhoI pro zvýšení účinnosti LR reakce. Restrikční místo XhoI je pro všechny vektory pGWB unikátní a štěpí přímo mezi att místy Gateway kazety (v ccdB genu). Tabulka 12: Linearizace vektoru pGWB5 enzymem XhoI – složení reakční směsi. Složka 10 x K pufr (Takara) pGWB5 (c~113 ng/ µl) XhoI Nuklease-free H2O Celkový objem Reakční teplota
Objem [µl] 5 30 0,8 14,2 50 37 ⁰C
Linearizace byla nastavena přes noc a inkubována při 37°C.
3.2.9 Purifikace DNA Linearizovaný pGWB5 vektor byl přečištěn pomocí soupravy Wizard SV Gel and PCR clean-up system (podle přiloženého manuálu). Naštěpený plasmid byl eluován 20 µl sterilní H2O. Koncentrace DNA byla změřena na spektrofotometru NAS 99.
3.2.10 Kultivace buněk E. coli a příprava LB média LB médium bylo připraveno rozpuštěním 5 g tryptonu, 5 g NaCl a 2,5 g kvasničného extraktu v 500 ml destilované vody. Hodnota pH byla upravena na hodnotu 7,2 pomocí roztoku NaOH. Poté bylo médium vysterilizováno v autoklávu. V případě pevného LB média bylo ještě před autoklávováním přidáno 7,5 g agaru (finální konc. 1,5 %). Do 500 ml vychladlého média bylo vždy přidáno příslušné antibiotikum: 50 µl ampicilinu (výsledná konc. 100 µg/ml), 50 µl kanamycinu (výsledná konc. 50 µg/ml), 75 µl gentamycinu (výskl. konc. 15 µg/ml), 62 µl hygromycinu (výsledná konc. 50 µg/ml) nebo kombinace antibiotik. Koncentrace zásobních roztoků antibiotik jsou uvedeny v kapitole Materiál. Očkování tekutého média bakteriální kulturou nebo roztěr na misky s pevným médiem byl vždy proveden sterilně ve flow-boxu. Kultivace buněk E. coli probíhala vždy přes noc (max. 16 h) při teplotě 37 ⁰C, a to buď na třepačce (tekuté LB) nebo v inkubátoru (pevné LB).
35
3.3 Výsledky a diskuse 3.3.1 Amplifikace genů ZmCKX Jako templát pro PCR reakci byly použity geny ZmCKX zaklonované ve vektoru pGEM-T easy. Primery použité pro amplifikaci ZmCKX genů nesly attB místa. Reverse primer byl navržen tak, aby vynechal terminační kodon. Výsledkem reakce tedy byl PCR produkt ohraničený attB místy a postrádající terminační kodon, což umožnilo následnou C-terminální GFP fúzi v destinačním pGWB5 vektoru. Po izolaci templátu bylo provedeno několik PCR reakcí s proof-reading Phusion DNA Polymerasou. Vzhledem k vysokému obsahu GC bazí v templátových genech bylo nutné optimalizovat podmínky PCR reakcí. Byla testována různá aditiva, teplota nasednutí primerů – gradientová PCR a různé DNA Polymerasy. I přes značné úsilí se podařilo získat amplikony pouze genů ZmCKX3 a ZmCKX5.
3.3.2 Izolace plasmidů pGEM-T Easy:ZmCKX LB médium obsahujcí antibiotikum ampicilin bylo naočkováno kulturou E. coli nesoucí vektor pGEM-T Easy s těmito geny: ZmCKX4a, ZmCKX4b, ZmCKX3, ZmCKX5, ZmCKX8, ZmCKX10 a pTYB12:ZmCKX12. Oba vektory nesou gen pro rezistenci vůči ampicilinu. Po kultivaci byly jednotlivé plasmidy vyizolovány pomocí soupravy QIAprep Spin Miniprep. Izolované plasmidy posloužily jako templát pro následné PCR reakce. Získané koncentrace: ZmCKX4a ZmCKX4b ZmCKX3 ZmCKX5 ZmCKX8 ZmCKX10 ZmCKX12
566,5 ng/µl 240,4 ng/µl 483,6 ng/µl 299,3 ng/µl 81 ng/µl 183,9 ng/µl 101,1 ng/µl
3.3.3 Optimalizace podmínek PCR Nejdříve byla provedena PCR s Phusion DNA Polymerasou (Tab. 1) bez přídavku aditiv (Tab. 2), přičemž došlo k amplifikaci pouze genu ZmCKX3 (Obr. 10). Proto byla další PCR provedena s přídavkem 1,3 % betainu a 1,3 % DMSO (Tab. 3), tentokrát už vznikly amplikony genů ZmCKX3 a ZmCKX5 (Obr. 11). U ostatních genů byla pozorována nespecifická nebo žádná amplifikace (ZmCKX8). Proto s geny ZmCKX4a, ZmCKX4b a ZmCKX10 byla provedena gradientová PCR, přičemž amplikony byly velmi nespecifické nebo vůbec žádné (Obr. 12).
36
Pokusili jsme se dále optimalizovat PCR podmínky za použití jiné Polymerasy (Immolasová DNA Polymerasa) za současného snížení teploty annealingu na 58 ⁰C a různého množství templátové DNA. Výsledkem byla možná amplifikace genu ZmCKX4b, ale při snížení množství templátu byly jasně viditelné 2-3 různé fragmenty neodpovídající velikosti genu. Dále byly optimalizovány podmínky pro amplifikaci genu ZmCKX12 pomocí gradientové PCR. Byly zkoušeny různé teploty nasednutí primerů,nicméně produkty PCR nebyly dostatečně specifické a nešlo již dále zvyšovat teplotu nasedání primerů. Z toho důvodu jsem dále pracovala pouze s geny ZmCKX3 a ZmCKX5.
1500 bp
ZmCKX3 1575 bp
1000 bp
M
1
2
3
4
5
6
7
Obrázek 10: Agarosová elektroforeza PCR produktů ZmCKX genů za použití Phusion HF Polymerasy, bez přídavku aditiv. Zleva: M – 1 kb GeneRuler DNA Ladder,1-7: ZmCKX3, ZmCKX4a, ZmCKX4b, ZmCKX5, ZmCKX8, ZmCKX10 a negativní kontrola (H2O). Separováno v 1% agarosovém gelu, při napětí 120 V.
37
1500 bp 1000 bp
ZmCKX3 1575 bp
M
1
2
ZmCKX5 1746 bp
3
4
5
6
7
Obrázek 11: Agarosová elektroforeza PCR produktů ZmCKX genů za použití Phusion HF Polymerasy, s přídavkem aditiv. Zleva: M – 1 kb GeneRuler DNA Ladder, 1-7: ZmCKX3, ZmCKX4a, ZmCKX4b, ZmCKX5, ZmCKX8, ZmCKX10 a kontrola (H2O). Separováno v 1% agarosovém gelu, při napětí 120 V.
68⁰C 69,7⁰C 72⁰C 68⁰C 69,7⁰C 72⁰C 68⁰C 69,7⁰C 72⁰C 69,7 ⁰C
1500 bp 1000 bp
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Obrázek 13: Agarosová elektroforeza PCR produktů genů ZmCKX4a, ZmCKX4b, ZmCKX10 po gradientové PCR za použití Phusion HF DNA Polymerasy, s přídavkem aditiv. Zleva: M – 1 kb GeneRuler DNA Ladder, 1-3: ZmCKX4a, 4-6: ZmCKX4b, 7-9: ZmCKX10 a 10: negativní kontrola (H2O). Separováno v 1% agarosovém gelu, při napětí 120 V.
38
200 x zř.
1000 x zř.
ZmCKX4b 1602 bp 1500 bp 1000 bp
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Obrázek 14: Agarosová elektroforeza PCR produktů genů ZmCKX4a, ZmCKX4b, ZmCKX8 a ZmCKX10 za použití Immolasové DNA Polymerasy a změny teploty nasednutí primerů na 58 ⁰C. Zleva: M – 1 kb GeneRuler DNA Ladder, 1-4 (vzorky zředěné 200 x): ZmCKX4a, ZmCKX4b, ZmCKX8, ZmCKX10, 5-8 (vzorky zředěné 1000 x) ZmCKX4a, ZmCKX4b, ZmCKX8, ZmCKX10 a 9: kontrola (H2O). Separováno v 1% agarosovém gelu, při napětí 120 V. 67,5⁰C 68⁰C 69,7⁰C 71,5⁰C
67,5⁰C 68⁰C 69,7⁰C 71,5⁰C
1500 bp
1000 bp
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
M
Obrázek 15: Agarosová elektroforeza PCR produktu genu ZmCKX12 po gradientové PCR za použití Phusion HF DNA Polymerasy, bez a s přídavkem aditiv. Zleva: M – 1 kb GeneRuler DNA Ladder., 1-5: ZmCKX12(bez aditiv), 6-10: ZmCKX12(s aditivy), 5 a 10: negativní kontrola (voda), M – 1 kb GeneRuler DNA Ladder. Separováno v 1% agarosovém gelu, při napětí 120 V.
39
68⁰C
69,7⁰C
72 ⁰C
1500 bp 1000 bp
M
1
2
3
4
Obrázek 16: Agarosová elektroforeza PCR produktu genu ZmCKX12 po gradientové PCR za použití Phusion HF DNA Polymerasy s přídavkem aditiv. Zleva: M – 1 kb GeneRuler DNA Ladder, 1-3: ZmCKX12, 4: negativní kontrola (H2O). Separováno v 1% agarosovém gelu, při napětí 120 V.
3.3.4 Izolace fragmentů genů ZmCKX3 a ZmCKX5 z agarosového gelu Byla provedena PCR genů ZmCKX3 a ZmCKX5 s Phusion HF DNA Polymerasou, které byly po elektroforetické separaci (Obr. 17) vyřezány z agarosového gelu a přečištěny pomocí soupravy Wizard SV Gel and PCR clean-up system a nakonec byla spektrofotometricky změřena koncentrace DNA: ZmCKX3:
109,1 ng/µl
ZmCKX5:
92,4 ng/µl
40
1500 bp 1000 bp
ZmCKX3 1575 bp
M
1
ZmCKX5 1746 bp
2
3
4
5
M
Obrázek 17: Agarosová elektroforeza PCR produktu genů ZmCKX3 a ZmCKX5 za použití Phusion HF DNA Polymerasy, s přídavkem aditiv. Zleva: M – 1 kb GeneRuler DNA Ladder, 1-2: ZmCKX3, 3-4: ZmCKX5, 5: negativní kontrola (H2O), M – 1 kb GeneRuler DNA Ladder. Separováno v 1% agarosovém gelu, při napětí 120 V.
3.3.5 Příprava
vstupního
vektoru
pDONR207:ZmCKX
3
a
pDONR207:ZmCKX 5 Pomocí Gateway technologie rekombinačního klonování byly sestrojeny plasmidové konstrukty pDONR207:ZmCKX 3 a pDONR207:ZmCKX 5a jejich správnost byla ověřena pomocí colony PCR a restrikční analýzou. Následně byly dané konstrukty poslány na sekvenční analýzu s vhodně zvolenými primery. Správná sekvence zaklonovaného genu byla potrvzena pouze u konstruktu pDONR207:ZmCKX 5. U pDONR207:ZmCKX3 chyběla sekvence cca 30 bp, což může být způsobeno např. vzniklou mutací v genové sekvenci.
3.3.5.1 Provedení rekombinační BP reakce Na rekombinační reakci byly použity geny ZmCKX3, ZmCKX5 izolované z agarosového gelu a donorový vektor pDONR207 izolovaný pomocí soupravy QIAprep Spin Miniprep Kit (konc. – 110 ng/µl). Reakce byla nastavena přesně podle Gateway manuálu (viz Metody). Rekombinační směs byla použita pro transformaci elektrokompetetních buněk E. coli TOP 10 a následně kultivována na agarových plotnách s gentamycinem. Nárůst na miskách byl okolo 80 bakteriálních kolonií na miskách (nátěr 80 % transformovaných buněk). Od každého vzorku bylo přeočkováno 10 kolonií do tekutého LB média s gentamycinem.
3.3.5.2 Ověření správnosti konstruktů pomocí colony PCR a restrikce Po kultivaci byla provedena colony PCR za použití Immolasové DNA Polymerasy. Jako templát sloužily napěstovné bakteriální kultury (Obr.18, 19). Ve všech deseti testovaných 41
koloniích kultury E.coli byly přítomny fragmenty odpovídající ZmCKX genům, ale v případě ZmCKX3 došlo zřejmě ke kontaminaci kontroly (čistá kultura E.coli TOP10) nebo primerů.
1500 bp 1000 bp
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Obrázek 18: Agarosová elektroforeza colony PCR kolonií testovaných na přítomnost plasmidového konstruktu pDONR207:ZmCKX3 (Immolasová DNA Polymerasa). Zleva: M -1 kb GeneRuler DNA Ladder, 1-10: ZmCKX3, 11 – kontrola (čistá kultura E. coli TOP10). Separováno v 1% agarosovém gelu, při napětí 120 V.
1500 bp 1000 bp
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Obrázek 19: Agarosová elektroforeza colony PCR kolonií testovaných na přítomnost plasmidového konstruktu pDONR207:ZmCKX5 (Immolasová DNA Polymerasa). Zleva: M-1 kb GeneRuler DNA Ladder, 1-10: ZmCKX5, 11 – negativní kontrola (čistá kultura E. coli TOP10). Separováno v 1% agarosovém gelu, při napětí 120 V. Byla vybrána jedna pozitivní kultura od každého konstruktu a ověřena pomocí restrikční analýzy (Obr. 20). Konstrukty byly izolovány pomocí alkalické lyze a byla provedena restrikční 42
reakce (Tab. 6, 7). Získané fragmenty měly odpovídající velikost, ale u konstruktu pDONR207:ZmCKX5 je na snímku z elektroforézy zřetelný band o velikosti cca 500 bp, který mohl být způsoben nespecifickým štěpením restrikčních enzymů.
ZmCKX3
ZmCKX5
4000 bp 3000 bp
1000 bp 750 bp
M
1
2
3
4
M
Obrázek 20: Agarosová elektroforeza – kontrola připravených plasmidových konstruktů pDONR207:ZmCKX3
restrikčními
enzymy:
AvrII,
BstXI
a
HindIII,
PstI
a
pDONR207:ZmCKX5 enzymy ApaI, SmaI a BamHI. Zleva: M– 1 kb GeneRuler DNA Ladder, -1 – AvrII, BstXI – velikost fragmentů 766 bp a 3982 bp; 2 – HindIII, PstI – 854 bp, 3894 bp; 3 – ApaI, SmaI – 1039 bp, 3835 bp; 4 – BamHI – 711 bp a 4208 bp, M – 1 kb GeneRuler DNA Ladder. Separováno v 1% agarosovém gelu, při napětí 120 V. Nakonec byly vybrané vzorky znovu přeočkovány, kultivovány a izolovány za použití QIAprep Spin Miniprep Kit a poslány na sekvenční analýzu. Spektrofotometricky změřená koncentrace DNA byla následující:
pDONR207:ZmCKX3
403,6 ng/µl
pDONR207:ZmCKX5
264,1 ng/µl
3.3.6 Příprava expresních vektorů pGWB5:ZmCKX Pomocí LR reakce byly sestrojeny plasmidové konstrukty pGWB5:ZmCKX1, pGWB5:ZmCKX2,
pGWB5:ZmCKX5,
pGWB5:ZmCKX6,
pGWB5:ZmCKX8
a
pGWB5:ZmCKX9. Připravené expresní vektory (Obr. 21) byly ověřeny opět pomocí colony PCR a restrikčními reakcemi. Sekvenční analýza potvrdila správnost zaklonovaných genů ZmCKX ve vektoru pGWB5. Sekvenační primery byly zvoleny tak, aby umožnily přečtení nukleotidové sekvence přesahující sekvenci genu. Sekvenací bylo potvrzeno, že gen kódující
43
ZmCKX navazuje na sekvenci genu pro GFP (je zachován čtecí rámec) a vzniká tak fúzní gen (C-terminální fúze).
CAMV 35S
attB1
Signální peptid
ZmCKX
attB2
GFP
Promoter pGWB5:ZmCKX (̴ 19.2 kb)
Obrázek 21: Schéma výsledného expresního vektoru. (Pozn.: Signální peptid je přítomen pouze u sekretovaných isoforem ZmCKX.)
3.3.6.1 Provedení rekombinační LR reakce Na rekombinační LR reakci byl použit vstupní vektor pDONR207:ZmCKX5 připravený v této práci, dále vstupní vektory připravené v dřívějších pracích obsahující geny ZmCKX1, ZmCKX2, ZmCKX6, ZmCKX8 a ZmCKX9. Destinační vektor byl linearizován restrikčním enzymem XhoI (Tab. 12) a poté přečištěn pomocí soupravy Wizard SV Gel and PCR clean-up systém. Získaná koncentrace byla 137,8 ng/µl. LR reakce byla nastavena podle Gateway manuálu (vit Metody). Následovala transformace buněk E. coli TOP 10, kultivace na agarových plotnách a přeočkování selektovaných kolonií do tekutého LB média. Pro selekci požadovaných plasmidů byly použity antibiotika hygromycin a kanamycin. Nárůst bakteriálních kolonií na miskách byl cca 1000 (roztěr 90 % transformovaných buněk) a cca 200 (roztěr 10 % transformovaných buněk). Od každého vzorku bylo přeočkováno 5-15 kolonií.
3.3.6.2 Ověření správnosti konstruktů pomocí colony PCR a restrikce Nejdříve byla provedena colony PCR za využití Immolasové DNA Polymerasy (Obr. 22-24). Jako templát sloužily přeočkované bakteriální kolonie. U všech vzorků došlo k amplifikaci fragmentu odpovídající velikosti ZmCKX genu. Pouze u amplikonu genu ZmCKX8 (Obr. 24) nebyly po elektroforetické separaci bandy moc viditelné pravděpodobně v důsledku nízké koncentrace nebo složitosti templátu. Vzhledem k předchozím zkušenostem s optimalizací podmínek PCR pro ZmCKX geny, je zřejmé, že to mohlo být způsobeno např. nevhodnou teplotou nasednutí primerů. Nicméně výsledek je průkazný.
44
1500 bp 1000 bp
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Obrázek 22: Agarosová elektroforeza colony PCR kolonií testovaných na přítomnost plasmidového konstruktu pGWB5:ZmCKX2 (Immolasová DNA Polymerasa). Zleva: M – 1 kb GeneRuler DNA Ladder, 1-8: ZmCKX2 (1560 bp), 9 – kontrola (čistá kultura E. coli TOP10). Separováno v 1% agarosovém gelu, při napětí 120 V.
ZmCKX1
ZmCKX5
ZmCKX6
1605 bp
1746 bp
1623 bp
1500 bp 1000 bp
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12 13
14
15
16
Obrázek 23: Agarosová elektroforeza colony PCR kolonií testovaných na přítomnost plasmidových konstruktů pGWB5:ZmCKX pomocí colony PCR (Immolasová DNA Polymerasa). Zleva: M – 1 kb GeneRuler DNA Ladder ,1-5: ZmCKX1, 6-10: ZmCKX5 , 11-15: ZmCKX6, 9 – kontrola (čistá kultura E. coli TOP10). Separováno v 1% agarosovém gelu, při napětí 120 V.
45
ZmCKX8
ZmCKX9
1621 bp
1701 bp
1500 bp 1000 bp
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Obrázek 24: Agarosová elektroforeza colony PCR kolonií testovaných na přítomnost plasmidových konstruktů pGWB5:ZmCKX pomocí colony PCR (Immolasová DNA Polymerasa). Zleva: M – 1 kb GeneRuler DNA Ladder, 1-5: ZmCKX8, 6-10: ZmCKX9. Separováno v 1% agarosovém gelu, při napětí 120 V.
Byly vybrány pozitivní vzorky připravených expresních klonů, znovu byla provedena kultivace a izolace plasmidů metodou alkalické lyze. S izolovaným plasmidy byly nastaveny restrikční reakce (Tab. 8-11) a po elektroforetické separaci (Obr. 25-27) se potvrdila přítomnost genů ZmCKX ve vektoru pGWB5. Velikost získaných fragmentů po štěpení plasmidů z expresních klonů restrikčními endonukleasami byla porovnána s fragmenty získanými po naštěpení samotného vektoru pGWB5. Restrikční analýzou byla prokázána správnost připravených konstruktů. V případě vektoru pGWB5:ZmCKX8 byly nevhodně zvoleny restrikční enzymy BfaI a EcoRI a výsledkem bylo velké množství naštěpených fragmentů DNA. Proto byla provedena restrikce znovu, tentokrát s enzymy NdeI a EcoRI stejně jako u vektoru pGWB5:ZmCKX9, přičemž výsledek byl shodný s restrikcí tohoto vektoru.
46
10000 bp
3000 bp 1500 bp 1000 bp 750 bp
pGWB5:ZmCKX2 M
1
2
3
4
pGWB5 5
6
7
Obrázek 25: Agarosová elektroforeza – kontrola připraveného plasmidového konstruktu pGWB5:ZmCKX2 restrikčními enzymy EcoRI a SalI. Zleva: M – 1 kb GeneRuler DNA Ladder, 1-6: pGWB5:ZmCKX2 (fragmenty: 1560 bp, 2940 bp a 14621 bp - zbytek vektoru), 7 – negativní kontrola pGWB5 (fragmenty 1128 bp, 2940 bp a 13623 bp). Separováno v 1% agarosovém gelu, při napětí 120 V.
ZmCKX1
ZmCKX6
ZmCKX5
ZmCKX8
ZmCKX9
10000 bp
4000 bp 3000 bp
3000 bp 2000 bp 1500 bp
2000 bp
1000 bp 750 bp
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12 13
14
M
Obrázek 26: Agarosová elektroforeza – kontrola připravených plasmidových konstruktů pGWB5:ZmCKX. Zleva: M – 1 kb GeneRuler DNA Ladder, 1-5:restrikce enzymy EcoRI a SalI (fragmenty 1560 bp, 2940 bp a 14621 bp - zbytek vektoru), 5 – negativní kontrola pGWB5 (1128 bp, 2940 bp a 13623 bp). 6-8: restrikce enzymy BsiWI a HindIII (2093 bp, 15626 bp), 8 – kontrola pGWB5 (~19200 bp), 9-11: restrikce BfaI a EcoRI, 12-14: restrikce enzymy EcoRI a NdeI (1701 bp, 2740 bp, 3199 bp a 11660 bp), 14 – kontrola pGWB5 (3199 bp, 4000 bp a 10492 bp), M – 1 kb GeneRuler DNA Ladder. Separováno v 1% agarosovém gelu, při napětí 120 V.
47
10000 bp 3500 bp 3000 bp 1500 bp
M
1
2
Obrázek 27: Agarosová elektroforeza – kontrola připraveného plasmidového konstruktu pGWB5:ZmCKX8 restrikřními enzymy EcoRI a NdeI. Zleva: M – 1 kb GeneRuler DNA Ladder, 1-2: pGWB5:ZmCKX8 (fragmenty 1621 bp, 2740 bp, 3199 bp a 11640 bp). Separováno v 1% agarosovém gelu, při napětí 120 V. Po restrikční analýze byly vybrány pozitivní vzorky expresních vektorů, znovu napěstovány a vyizolovány za použití QIAprep Spin Miniprep Kit. Koncentrace DNA byla změřena pomocí spektrofotometru: pGWB5:ZmCKX1
40,8 ng/µl
pGWB5:ZmCKX2
46 ng/µl
pGWB5:ZmCKX5
46,8 ng/µl
pGWB5:ZmCKX6
39,8 ng/µl
pGWB5:ZmCKX8
42,1 ng/µl
pGWB5:ZmCKX9
39,4 ng/µl
Koncentrace plasmidů nebyla moc vysoká, vzhledem k tomu, že se jedná o tzv. low-copy plasmidy a navíc jsou poměrně velké (sestrojené konstrukty měly velikost přibližně 19 200 bp). Nicméně koncentrace byla dostačující pro sekvenční analýzu. Správnost sekvence všech plasmidových konstruktů byla sekvenací potvrzena, zejména jsme se soustředili na přechod mezi ZmCKX geny a genu kódujícího GFP (na C-konci).
48
4 ZÁVĚR Byla vypracována literární rešerše na téma cytokininy – základní charakteristika, zástupci,
funkce,
metabolismus
cytokininů
se
zaměřením
na
degradaci
pomocí
cytokinindehydrogenas a jejich charakteristiku. V praktické části jsem se nejprve zabývala optimalizací podmínek PCR pro amplifikaci genů kódujících kukuřičné cykinindehydrogenasy. Izolované plasmidy pGEM-T easy nesoucí geny ZmCKX3, 4a, 4b, 5, 8, 10 a 12 byly použity jako templát pro PCR reakci. Primery nesly specifická attB místa pro následné klonování a byl vynechán terminační kodon (umožňující fúzi genů s GFP). Podařilo se mi získat amplikony pouze dvou genů – ZmCKX3 a ZmCKX5 při použití aditiv (betain, DMSO) a Phusion HF DNA Polymerasy. Po izolaci fragmentů genů ZmCKX3, 5 z agarosového gelu, byla provedena rekombinační BP reakce (Gateway technologie)
s
donorovým
vektorem
pDONR207.
Následovala
transformace
elektrokompetentních buněk E. coli TOP 10 a selekce kolonií na kultivačním médiu. Správnost získaných vstupních vektorů pDONR207:ZmCKX3 a pDONR207:ZmCKX5 byl ověřena pomocí colony PCR a restrikční analýzy. Sekvenční analýza potvrdila správnost pouze konstruktu pDONR207:ZmCKX5. Dalším krokem byla rekombinační LR reakce (Gateway technologie), jejímž cílem bylo zaklonování genů ZmCKX do destinačního vektoru pGWB5 obsahující gen pro GFP. Na reakci byly použity pDONR207:ZmCKX5 a další vstupní vektory pENTR:ZmCKX1, 2, 6, 8 a 9 (připravené již dříve). Opět následovala transformace buněk E. coli a následná selekce. Stejně jako v předchozím případě byly provedeny kontrolní reakce – colony PCR a restrikční analýza, které spolu se sekvenční analýzou potvrdily správnost připravených expresních vektorů pGWB5:ZmCKX. Celkem tedy bylo připraveno šest expresních vektorů, které budou dále použity pro studium subcelulární lokalizace ZmCKX. V této studii bude využit heterologní expresní systém, zřejmě transgenní rajčatové kořínky (tomato hairy roots), nebo suspenzní buněčná kultura Arabidopsis LER, v kombinaci se skenovací konfokální mikroskopií.
49
Seznam použité literatury Åstot C., Doležal K., Nordström A., Wang Q., Kunkel T., Moritz T.,Chua N-H. (2000) An alternative cytokinin biosynthesis pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 14778–14783.
Bae E., Bingman CA., Bitto E., Aceti DJ., Philips GN. Jr. (2008) Crystal structure of Arabidopsis thaliana cytokinin dehydrogenase. Proteins 70, 303–306.
Bajguz A., Piotrowska A. (2009) Conjugates of auxin and cytokinin. Phytochemistry 70, 957– 69.
Barciszewski J., Siboska GE., Pedersen BO., Clark BF., Rattan SI. (1996) Evidence for the presence of kinetin in DNA and cell extracts. FEBS Lett. 393, 197–200. Brugière N., Humbert S., Rizzo N., Bohn J., Habben JE. (2008) A member of the maize isopentenyl transferase gene family, Zea mays isopentenyl transferase 2 (ZmIPT2), encodes a cytokinin biosynthetic enzyme expressed during kernel development. Cytokinin biosynthesis in maize. Plant Mol.Biol. 67, 215–229. Brzobohatý B., Moore I., Kristoffersen P., Bako L., Campos N., Schell J., Palme K. (1993) Release of active cytokinin by a beta-glucosidase localized to the maize root-meristem. Science 262, 1051–1054.
Fraaije MW., Van Berkel WJ., Benen JA., Visser J., Mattevi A. (1998). A novel oxidoreductase family sharing a conserved FAD-binding domain. Trends Biochem. Sci. 23, 206–207. Frébort I., Kowalska M., Hluska T., Frébortová J., Galuszka P. (2011) Evolution of cytokinin biosynthesis and degradation. J. Exp. Bot. 62, 2431–2452. Frébortová J., Fraajie MW., Galuszka P., Šebela M., Peč P., Hrbáč J., Novák O., Bilyeu KD., English JT., Frébort I. (2004) Catalytic reaction of cytokinin dehydrogenase: preference for quinones electron acceptors. Biochem. J. 380, 121–130. Frébortová J., Novák O., Frébort I., Jorda R. (2010) Degradation of cytokinins by maize cytokinin dehydrogenase is mediated by free radicals generated by enzymatic oxidation of natural benzoxazinones. Plant J. 61, 467–481.
50
Galuszka P, Frébort I., Šebela M., Sauer P., Jacobsen S., Peč P. (2001) Cytokinin oxidase or dehydrogenase? Mechanism of cytokinin degradation in cereals. Eur. J. Biochem. 268, 450– 461. Galuszka P., Frébortová J., Luhová L., Bilyeu KD., English JT., Frébort I. (2005) Tissue localization of cytokinin dehydrogenase in maize: possible involvement of quinone species generated from plant phenolics by other enzymatic systems in the catalytic reaction. Plant Cell Physiol. 46, 716–728. Galuszka P., Popelková H., Werner T., Frébortová J., Pospíšilová H., Mik V., Köllmer I., Schmülling
T.,
Frébort
I.
(2007)
Biochemical
characterization
of
cytokinin
oxidases/dehydrogenases from Arabidopsis thaliana expressed in Nicotiana tabacum L. J. Plant Growth Regul. 26, 255–267. Gaudinová A., Dobrev PI., Šolcová B., Novák O., Strnad M., Friedecký D., Motyka V. (2005) The involvement of cytokinin oxidase/dehydrogenase and zeatin reductase in regulation of cytokinin levels in pea (Pisum sativum L.) leaves. J. Plant Growth Regul. 24, 188–200.
Ge L., Yong JW., Goh NK., Chia LS., Tan SN., Ong ES. (2005). Identification of kinetin and kinetin riboside in coconut (Cocos nucifera L.) water using a combined approach of liquid chromatographytandem mass spectrometry, high performance liquid chromatography, capillary electrophoresis. J. Chromatogr. B. 829, 26–34.
Golovko A., Sitbon F., Tillberg E., Nicander B. (2002) Identification of a tRNA isopentenyltransferase gene from Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 49, 161–169.
Hirose N., Takei K., Kuroha T., Kamada-Nobusada T., Hayashi H., Sakakibara H. (2008) Regulation of cytokinin biosynthesis, compartmentalization and translocation. J. Exp. Bot. 59, 75–83.
Horgan R., Hewett EW., Purse JG., Wareing PF. (1973) A new cytokinin from Populus robusta. Tetrahedron Lett. 14, 2827–2828.
Hou B., Lim EK., Higgins GS., Bowles DJ. (2004) N-Glucosylation of cytokinins by glycosyltransferases of Arabidopsis thaliana. J. Biol. Chem. 279, 47822–47832.
51
Houba-Hérin N., Pethe C., d’Alayer J., Laloue M. (1999) Cytokinin oxidase from Zea mays: purification, cDNA cloning and expression inmoss protoplasts. Plant J. 17, 615–626.
Kakimoto T. (2001) Identification of plant cytokinin biosynthetic enzymes as dimethylallyl diphosphate: ATP/ADP isopentenyltransferases. Plant Cell Physiol. 42, 677–685.
Kakimoto T. (2003). Biosynthesis of cytokinins. J. Plant Res. 116, 233–239.
Kasahara H., Takei K., Ueda N., Hishiyama S., Yamaya T., Kamiya Y., Yamaguchi S., Sakakibara H. (2004) Distinct isoprenoid origins of cis- and trans-zeatin biosyntheses in Arabidopsis. J. Biol. Chem. 279, 14049–14054. Kowalska M., Galuszka P., Frébortová J., Šebela M., Béres T., Hluska T., Šmehilová M., Bilyeu KD., Frébort I. (2010) Vacuolar and cytosolic cytokinin dehydrogenases of Arabidopsis thaliana:heterologous expression, purification and properties. Phytochemistry 71, 1970–1978.
Krall L., Raschke M., Zenk MH., Baron C. (2002) The Tzs protein from Agrobacterium tumefaciens C58 produces zeatin riboside 5’-phosphate from 4-hydroxy-3-methyl-2-(E)-butenyl diphosphate and AMP. FEBS Lett. 527, 315–318. Kristoffersen P., Brzobohaty B., Höhfeld I., Bako L., Melkonian M., Palme K. (2000) Developmental regulation of the maize Zm-p60.1 gene encoding a β-glucosidase located to plastids. Planta 210, 407–415.
Kurakawa T., Ueda N., Maekawa M., Kobayashi K., Kojima M., Nagato Y., Sakakibara H., Kyozuka J. (2007) Direct control of shoot meristem activity by a cytokinin-activating enzyme. Nature 445,652–655.
Kuroha T., Tokunaga H., Kojima M., Ueda N., Ishida T., Nagawa S., Fukuda H., Sugimoto K., Sakakibara H. (2009) Functional analyses of LONELY GUY cytokinin-activating enzymes reveal the importance of the direct activation pathway in Arabidopsis. Plant Cell 21, 3152– 3169.
Li Y., Baldauf S., Lim EK., Bowles DJ. (2001) Phylogenetic analysis of the UDPglycosyltransferase multigene family of Arabidopsis thaliana. J. Biol. Chem. 276, 4338–4343.
52
Lombard J., Moreira D. (2011) Origins and early evolution of the mevalonate pathway of isoprenoid biosynthesis in the three domains of life. Mol. Biol. Evol. 28, 87–99.
Malito E., Coda A., Bilyeu KD., Fraaije MW., Mattevi A. (2004) Structures of Michaelis and product complexes of plant cytokinin dehydrogenase: implications for flavoenzyme catalysis. J. Mol. Biol. 341, 1237–1249.
Miller CO., Skoog F., Von Saltza MH., Strong FM. (1955) Kinetin, a cell division factor from deoxyribonucleic acid. J. Am. Chem. Soc. 77, 1392–1392.
Miyawaki K., Matsumoto-Kitano M., Kakimoto T. (2004) Expression of cytokinin biosynthetic isopentenyltransferase genes in Arabidopsis: tissue specificity and regulation by auxin, cytokinin and nitrate. Plant J. 37, 128–138.
Mok DWS., Mok MC. (2001) Cytokinin metabolism and action. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 52, 89–118.
Morris RO., Bilyeu KD., Laskey JG., Cheikh NN. (1999) Isolation of a gene encoding a glycosylated cytokinin oxidase from maize. Biochem. Biophys. Res. Commun. 255, 328–333. Pačes V., Werstiuk E., Hall RH. (1971) Conversion of N6-(Δ2-isopentenyl)adenosine to adenosine by enzyme activity in tobacco tissue. Plant Physiol. 48, 775–778. Popelková H., Fraaije MW., Nová k O., Frébortová J., Bilyeu KD., Frébort I. (2006) Kinetic and chemical analyses of the cytokinin oxidase/dehydrogenase catalysed reaction: correlations with the crystal structure. Biochem. J. 398, 113–124.
Sakakibara H. 2006. Cytokinins: activity, biosynthesis, and translocation. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 431–439.
Sakakibara H., Kasahara H., Ueda N., Kojima M., Takei K., Hishiyama S., Asami T., et al. (2005). Agrobacterium tumefaciens increases cytokinin production in plastids by modifying the biosynthetic pathway in the host plant. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 9972–9977.
Sakamoto T., Sakakibara H., Kojima M., Yamamoto Y., Nagasaki H., Inukai Y., et al. (2006) Ectopic expression of KNOTTED1-like homeobox protein induces expression of cytokinin biosynthesis genes in rice. Plant. Physiol. 142, 54–62. 53
Schmülling T., Werner T., Riefler M., Krupková E., Bartrina y Manns I. (2003) Structure and function of cytokinin oxidase/ dehydrogenase genes of maize, rice, Arabidopsis and other species. J. Plant Res. 116, 241–252.
Skoog F., Armstrong DJ. (1970) Cytokinins. Annu. Rev. Plant Physiol. 21, 359–384.
Strnad M. (1997) The aromatic cytokinins. Physiol. Plant. 101, 674-688. Šmehilová M., Galuszka P., Bilyeu KD., Jaworek P., Kowalska M., Šebela M., Sedlářová M., English JT., Frébort I. (2009). Subcellular localization and biochemical comparison of cytosolic and secreted cytokinin dehydrogenase enzymes from maize. J. Exp. Bot. 60, 2701–2712.
Takei K., Sakakibara H., Sugiyama T. (2001) Identification of genes encoding adenylate isopentenyltransferase, a cytokinin biosynthesis enzyme, in Arabidopsis thaliana. J. Biol. Chem. 276, 26405–26410.
Takei K., Yamaya T., Sakakibara H. (2004) Arabidopsis CYP735A1 and CYP735A2 encode cytokinin hydroxylases that catalyze the biosynthesis of trans-zeatin. J. Biol. Chem. 279, 41866–41872. Tarkowská D., Doležal K., Tarkowski P., Åstot C., Holub J., Fuksová K., Schmülling T., Sandberg G., Strnad M. (2003) Identification of new aromatic cytokinins in Arabidopsis thaliana and Populus x canadensis leaves by LC-(1)ESI-MS and capillary liquid chromatography/frit-fast atom bombardment mass spectrometry. Physiol. Plant. 117, 579–590. Taya Y., Tanaka Y., Nishimura S. (1978) 5’-AMP is a direct precursor of cytokinin in Dictyostelium discoideum. Nature 271, 545–547. Veach YK., Martin RC., Mok DWS., Malbeck J., Vaňková R., Mok MC. (2003) OGlucosylation of cis-zeatin in maize. Characterization of genes, enzymes and endogenous cytokinins. Plant Physiol. 131, 1374–1380. Vyroubalová S., Václavíková K., Turečková V., Novák O., Šmehilová M., Hluska T., Ohnoutková L., Frébort I., Galuszka P. (2009) Characterization of new maize genes putatively involved in cytokinin metabolism and their expression during osmotic stress in relation to cytokinin levels. Plant Physiol. 151, 433–447.
54
Werner T., Köllmer I., Bartrina I., Holst K., Schmülling T. (2006) New insights into the biology of cytokinin degradation. Plant Biol. 8, 371–81.
Werner T., Motyka V., Laucou V., Smets R., van Onckelen H. (2003) Cytokinin-deficient transgenic Arabidopsis plants show multiple developmental alterations indicating opposite functions of cytokinins in the regulation of shoot and root meristem activity. Plant Cell 15, 1–20. Werner T., Motyka V., Strnad M., Schmülling T. (2001) Regulation of plant growth by cytokinin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 10487–10492. Werner T., Schmülling T. (2009) Cytokinin action in plant development. Curr. Opin. Plant Biol. 12, 527–538.
Whitty CD., Hall RH. (1974) A cytokinin oxidase in Zea mays. Can. J. Biochem. 52, 787–799. Zalabák D., Pospíšilová H., Šmehilová M., Mrízová K., Frébort I., Galuszka P. (2013) Genetic engineering of cytokinin metabolism: prospective way to improve agricultural traits of crop plants. Biotechnol. Adv. 31, 97-117.
55
Seznam zkratek ADP AMP At ATP BA CKX cZ DCPIP DMAPP DMSO DZ FAD GFP GUS HMBDP iP
adenosin-5-difosfát adenosin-5-monoosfát Arabidopsis thaliana isopentenyladenin benzyladenin cytokinindehydrogenasa cis-zeatin 2,6-dichlorofenol-indofenol dimethylallyl pyrofosfát dimethylsulfoxid dihydrozeatin flavinadenindinukleotid green fluorescent protein β-glucuronidasa (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl difosfát isopentenyladenin
iP9G iPDP iPMP IPT
N6(2-isopentenyl)adenin 9-glukosid isopentenyladenosin-5´-difosfát isopentenyladenosin-5´-monofosfát isopentenyltransferasa
iPTP LOG Oz tmr tZ UDP UGT Zm ZOG
isopentenyladenosin-5´-trifosfát ribosid-5´-monofosfát fosforibohydrolasa (Lonely guy) Oryza sativa tumour morphology root trans-zeatin uridindifosfát UDP-glykosyltransfersa Zea mays O-glykosyltransferasa
56
