UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA BIOLOGIE IMUNOLOGIE. Imunomodulační vlastnosti vitaminu D3 Immunomodulatory properties of vitamin D3

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA BIOLOGIE IMUNOLOGIE

Bc. Anna Urbanová

Imunomodulační vlastnosti vitaminu D3 Immunomodulatory properties of vitamin D3 Diplomová práce Školitel: prof. MUDr. Ilja Stříž, CSc. Praha 2013

Prohlášení

Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu.

V Praze,

Podpis

Poděkování Chtěla bych poděkovat svému školiteli, prof. MUDr. Iljovi Střížovi, CSc., za odborné vedení během vypracovávání této diplomové práce, cenné rady a věnovaný čas strávený při konzultacích. Dále bych chtěla poděkovat Mgr. Evě Brabcové za cenné připomínky a věnovaný čas, který mi poskytla při psaní této diplomové práce, a RNDr. Aleně Sekerkové za uvedení do problematiky průtokové cytometrie a dále celému týmu klinické imunologie IKEM. Na závěr bych chtěla poděkovat své rodině za její podporu po celou dobu mého studia.

Obsah 1

Abstrakt.................................................................................................................... 4

2

Abstract .................................................................................................................... 5

3

Seznam použitých zkratek ...................................................................................... 6

4

Úvod ......................................................................................................................... 8

5

Zdroje vitamínu D3 .................................................................................................. 9

6

Metabolismus vitamínu D 3 ..................................................................................... 9

7

Regulace produkce vitamínu D3 ........................................................................... 11

8

Receptor pro vitamín D3 ....................................................................................... 14

9

Vitamín D3 vázající protein ................................................................................... 16 9.1

Struktura proteinu vázajícího vitamín D3 ..................................................... 16

9.2

Homologie proteinu vázajícího vitamín D3 .................................................. 17

9.3

Polyformismy proteinu vázající vitamín D3 .................................................. 17

9.4

Funkce proteinu vázající vitamín D3 ............................................................. 17

10

Vitamín D a imunitní systém ................................................................................ 19

10.1

Modulace přirozené imunity ........................................................................ 20

10.1.1 Exprese cathelicidinu ............................................................................... 20 10.1.2 Protein vázající vitamín D3 a jeho vliv na odpověď monocytů vůči 25(OH)D3 a 1,25(OH)2D3 .................................................................................................. 21 10.2

Modulace adaptivní imunity ......................................................................... 22

10.2.1 Vliv vitamínu D3 na buňky adaptivní imunity ......................................... 23 10.2.2 Mechanismus represe produkce Interleukinu 12 vitamínem D3.......... 24 10.3

Vitamín D3 a astma ........................................................................................ 26

10.4

Vitamín D3 a alergie ....................................................................................... 28

11

Deficience vitamínu D3 a jeho důsledky .............................................................. 29

12

Charakteristika měřených povrchových markerů ............................................... 30 1

13

Cíle práce ............................................................................................................... 33

14

Materiál a metody................................................................................................. 33

14.1

Tkáňové kultury: THP-1 buňky ...................................................................... 33

14.2

Příprava THP-1 buněk k pokusu.................................................................... 34

14.3

Izolace monocytů z periferní lidské krve...................................................... 34

14.4

Průtoková cytometrie ................................................................................... 36

14.5

Stanovení solubilní CD14 v supernatantech THP-1 buněk po stimulaci

vitamínem D3 metodou ELISA .............................................................................................. 36 14.6

Stanovení IL-8 v supernatantech THP-1 buněk po stimulaci vitamínem D3

metodou Luminex ................................................................................................................ 37 14.7

Posouzení vlivu vitamínu D3 na životnost THP-1 buněk ............................. 38

14.7.1 Stanovení živých a mrtvých THP-1 buněk po stimulaci vitamínem D3 na základě průniku propidium jodidu do buněk ................................................................. 38 14.7.2 Rozlišení časně a pozdně apoptotických THP-1 buněk po stimulaci vitamínem D3 pomocí Annexinu V .................................................................................. 38 14.8 15

Statistika ......................................................................................................... 39

Výsledky ................................................................................................................. 40

15.1

Exprese CD14 u THP-1 buněk po stimulaci vitamínem D3 .......................... 40

15.2

Exprese CD14 u monocytů po stimulaci vitamínem D3............................... 41

15.3

Exprese CD54 u THP-1 buněk po stimulaci vitamínem D3 .......................... 42

15.4

Exprese CD54 u monocytů po stimulaci vitamínem D3............................... 43

15.5

Exprese HLA-DR u THP-1 buněk po stimulaci vitamínem D3 ...................... 44

15.6

Exprese HLA-DR u monocytů po stimulaci vitamínem D3 ........................... 45

15.7

Exprese CD16 a CD36 u THP-1 buněk po stimulaci vitamínem D3 ............ 46

15.8

Exprese CD16 a CD36 u monocytů po stimulaci vitamínem D3 ................. 47

15.9

Exprese CD163 u THP-1 buněk po stimulaci vitamínem D3 ........................ 48

15.10

Exprese CD163 u monocytů po stimulaci vitamínem D3 ......................... 49 2

15.11

Změny v expresi CD14 po stimulaci vitamínem D 3 u přisedlých a

nepřisedlých THP-1 buněk ................................................................................................... 50 15.12

Množství sCD14 u THP-1 buněk po stimulaci vitamínem D3 .................. 51

15.13

Množství IL-8 u THP-1 buněk po stimulaci vitamínem D 3 ....................... 52

15.14

Množství

IL-8

u

THP-1

buněk

po

stimulaci

vitamínem

D3

a lipopolysacharidem ........................................................................................................... 53 15.15

Rozdělení živých a mrtvých THP-1 buněk po stimulaci vitamínem D3 na

základě průniku propidium jodidu do buněk ..................................................................... 54 15.16

Časně a pozdně apoptotické THP-1 buňky po stimulaci vit.D3 ............... 57

16

Diskuze ................................................................................................................... 60

17

Závěr....................................................................................................................... 63

18

Použitá literatura................................................................................................... 64

3

1

Abstrakt Vitamín D3 je důležitý pro udržení správné koncentrace Ca2+ v plazmě. Je proto

nezbytný pro správný vývoj a růst kostí. Vitamín D3 má ale i řadu imunomodulačních účinků. Cílem naší práce bylo ohodnotit a porovnat vliv vitamínu D3 na expresi vybraných povrchových markerů (CD14, CD54, HLA-DR, CD16, CD36 a CD163) u THP-1 buněk a monocytů získaných z lidské periferní krve. Dalšími cíli bylo posouzení vlivu vitamínu D3 na životnost THP-1 buněk a změření produkce solubilní CD14 a IL-8 u THP-1 buněk pod vlivem vitamínu D3. Buňky byly stimulovány pěti různými koncentracemi vitamínu D3 po dobu 24, 48 a 72 hod. Vyšší použité koncentrace vitamínu D3, tj. 100 nM a 1000 nM výrazně zvýšily expresi CD14 u THP-1 buněk v čase 48 a 72 hod trvání stimulace. U monocytů z periferní lidské krve bylo zvýšení exprese CD14 po stimulaci vitamínem D3 fyziologicky nevýznamné. Zároveň s rostoucí koncentrací vitamínu D3 výrazně rostla produkce sCD14 u THP-1 buněk. Množství sCD14 bylo nejvyšší v čase 72 hod po stimulaci nejvyšší použitou koncentrací vitamínu D3. Se vzrůstající koncentrací vitamínu D3 rostlo množství IL-8 u THP-1 buněk. Toto množství bylo nejvyšší v čase 48 hod trvání stimulace, poté kleslo. Vyšší koncentrace vitamínu D3 zvýšily u THP-1 buněk expresi CD54. U monocytů z periferní lidské krve nikoliv. Vitamín D 3 neměl žádný vliv na expresi HLA-DR, CD16, CD36 a CD163 u THP-1 buněk a monocytů z periferní lidské krve. Žádný vliv na životnost THP-1 buněk nebyl u žádné z použitých koncentrací vitamínu D 3 pozorován.

Klíčová slova: vitamin D3, makrofágy, regulace, cytokiny

4

2

Abstract Vitamin D3 is important for keeping the right concetration of Ca2+ in plasma.

Therefore it is essential for proper bone growth and development. Nevertheless, vitamin D3 has also a number of immunomodulating effects. Our thesis has been targeted on evaluation and comparison of vitamin D3 influence on expression of chosen surface markers (CD14, CD54, HLA-DR, CD16, CD36 and CD163) with THP-1 cells and monocytes gained from human peripheral blood. Other aims have been analysing the vitamin D3 influence on longevity of THP-1 cells and measuring the soluble CD14 and IL-8 production with THP-1 cells under the vitamin D3 influence. The cells have been stimulated with five different concentrations of vitamin D 3 for the time 24, 48 and 72 hours. Higher used concetrations of vitamin D3, i.e. 100 nM and 1000 nM have increased the expression of CD14 with THP-1 cells in the time 48 and 72 hours of the stimulation time. With the monocytes from peripheral human blood the increase of the CD14 expression hasn´t been remarkable from the physiological point of view. Together with the vitamin D3 concentration increase the sCD14 production with THP­1 cells was considerably higher. The sCD14 was the highest in the time 72 hours after the stimulation with the highest used vitamin D3 concetration. The IL-8 quantity with THP-1 cells was getting higher together with increasing vitamin D3 concetration. This amount was the highest in the time 48 hours of the stimulation time, then it decreased. Higher vitamin D 3 concentrations increased the CD54 expression with THP-cells. Neverheless, it hasn´t been observed with the peripheral human blood. Vitamin D3 had no impact on HLA-DR, CD16, CD36 and CD163 expression with THP-1 cells and monocytes from peripheral human blood. No influence on the THP-1 cells longevity has been seen with either of vitamin D 3 concentration.

Key words: vitamin D3, macrophages, regulation, cytokines

5

3

Seznam použitých zkratek

1,25(OH)2D3

1alpha, 25-dihydroxyvitamin D3

25(OH)D3

25-hydroxyvitamin D 3

7-AAD 7-DHC ADCC AFM AFP ALB Anova AP-1 APC CAMP CBG Cdk C/EBP CsA CYP24A1 CYP27B1 CYP2R1 DBP DC E2F ECD EDTA ELISA FBS FGF-23 FITC FS Gc-globulin GH H3K27 H4ac HDAC3 HLA-DR ICAM-1 IFN Ig IGF IL LFA-1 LL37

7-aminoaktinomycin T-dehydrocholesterol Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity α-albumin/afamin α-fetoprotein Albumin analysis of variance activator protein-1 antigen presenting cells Cathelicidin cortizol binding globulin cyclin-dependent kinase CCAAT/enhancer-binding protein Cyclosporin A 24-Hydroxylase 25-Hydroxyvitamin D3 1-alpha-hydroxylase Vitamin D3 25-hydroxylase vitamin D binding protein dendritic cells transcription factors energy coupled dye Ethylenediaminetetraacetic acid Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay fetal bovine serum fibroblast growth factor-23 fluorescein isothiocyanate forward scatter group-specific component growth hormon histone H3 lysine 27 acetylated Histone H4 histone deacetylase 3 human leukocyte antigen DR intercellular adhesion molecule 1 Interferon Immunoglobulin insulin like growth hormon Interleukin leukocyte function-associated antigen-1 Cathelicidin 6

LBP LPS Mac-1 MAF MHC mRNA miRNA NCOR2 NF-кB NK NOD2 PAMPs PBMC PBS PE pRb PTH RA RAP RE RSV RXR SC siRNA SLE SMRT TFB Th THP-1 TLR TNF Treg TSS VDR VDREs

LPS-binding protein Lipopolysaccharides CD11b/CD18 macrofage activating factor major histocompatibility complex messenger Ribonucleic acid micro Ribonucleic acid nuclear receptor co-repressor 2 nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells natural killer cells nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2 pathogen-associated molecular patterns peripheral blood mononuclear cell phosphate buffered saline Phycoerythrin retinoblastoma protein parathyroid hormone rheumatoid arthritis receptor associated protein Religion respiratory syncytial virus retinoid X receptor side scatter silent Ribonucleic acid systemic lupus erythematosus mediator for retinoid or thyroid-hormone receptors thyroxin binding globulin helper T cell human acute monocytic leukemia cell line toll-like receptor tumor necrosis facor T regulatory lymfocytes transcription start site vitamin D receptor vitamin D response elements

7

4

Úvod 1α25-dihydroxyvitamín D 3 - 1,25(OH)2D3 známý také jako kalcitriol, je aktivní

formou vitamínu D3. Je to sekosteroidní hormon, který je u lidí postupně syntetizován v kůži, játrech a ledvinách. Další z metabolitů je 25(OH)D3 neboli kalcidiol. 1,25(OH)2D3 je hlavní kalcitropní hormon, který udržuje správnou koncentraci Ca2+ v plazmě. Hraje významnou roli v regulaci resorbce vápníku a fosforu ze střeva a udržuje tak správnou koncentraci vápníku a fosforu v krvi, což je důležité pro správný vývoj a růst kostí. Hospodaření s vápníkem a fosforem je rovněž regulováno kalcitoninem a parathormonem (Dusso, Brown and Slatopolsky 2005). Vitamín D3 se významně podílí na regulaci imunitního systému. Díky vitamínu D3 dochází v přítomnosti bakteriální či virové infekce k indukci anti-mikrobiálních peptidů zejména cathelicidinu, což má za následek zabití patogenu (Gombart 2009). V jeho přítomnosti dochází k posunu rovnováhy směrem k Th2 (T helper cells) buňkám (Overbergh et al. 2000b) a T regulačním buňkám (Baeke et al. unpublished) na úkor Th1 buněk (Lemire et al. 1995a) a Th17 buněk (Penna and Adorini 2000). Vitamín D3 má také vliv na produkci různých cytokinů (Almerighi et al. 2009). Ovlivňuje maturaci dendritických buněk různými způsoby, což má za následek ovlivnění imunitní odpovědi, protože tyto dendritické buňky pak nejsou schopny aktivovat buňky adaptivní imunity (Berer et al. 2000). Napříč různými populacemi je rozšířená deficience vitamínu D a s tím související příslušné zdravotní problémy. Vitamín D není příliš rozšířen v potravinách, které konzumujeme. Předávkovat se vitamínem D ze slunečního záření nelze, protože v těle se včas zastaví přeměna do jeho aktivní formy. Pokud ale přeci jen dojde k hypervitaminose vitamínu D, dojde k narušení metabolismu vápníku a fosforu, což vede k hyperkalcémii, kalcifikaci měkkých tkání, zúžení cév a někdy i ke smrti. Existuje také synteticky vyráběný vitamín D, který často maminky dávají svým dětem do věku jejich 12 měsíců jako tzv. Infadinové kapičky.

8

5

Zdroje vitamínu D3 U lidí může být vitamín D 3 získán ze stravy nebo endogenní produkcí v epidermální

vrstvě kůže za přítomnosti UVB záření. V podstatě se tedy jedná spíše o pro-hormon. Vitamín D3 získávají lidé z velké části ze slunečního záření a jen přibližně z 10 % z potravy (Lamberg-Allardt 2006). Existují dvě formy vitamínu D: nejdůležitější je vitamín D 3 (cholekalciferol), který se nachází v živočišné stravě. Je například hojně obsažen v oleji z tresčích jater, zatímco vitamín D2 (ergokalciferol) je přítomný v jídlech rostlinného původu. Tyto 2 formy se odlišují strukturou postranních řetězců. Fyziologické účinky obou forem se ale příliš neliší (Lamberg-Allardt 2006). Kromě syntézy vitamínu D3 v kůži patří mezi další důležité zdroje vitamínu D3 rybí tuk a mořské ryby a v malé míře vaječné žloutky a máslo. Mateřské a kravské mléko je naopak chudé na vitamín D3 (Lamberg-Allardt 2006). U těhotných žen se aktivní vitamín D3 tvoří také v placentě. Efektivnost produkce estrogenu a progesteronu, což jsou hormony nutné pro udržení těhotenství, je ovlivněna dostupností vitamínu D3 (Barrera et al. 2007).

6

Metabolismus vitamínu D3 Po expozici UVB záření dochází v kůži k přeměně 7-dehydrocholesterolu (7­DHC)

na pre-vitamín D3, který je následně spontánní termální izomerací přeměněn na vitamín D3 (cholekalciferol) (Holick 2003). Tedy vitamín D3 může být získán ze stravy nebo z pre­vitamínu D3. Cholekalciferol se za normálních podmínek ukládá z více než 50 % do tukové tkáně, která tak slouží jako důležitá zásobárna vitamínu D 3. Protože jsou vitamín D3 a jeho metabolity lipofilní látky, musejí být transportovány pomocí specifických transportních systémů. Po termální izomeraci je vitamín D3 navázán na vitamín D vázající protein (DBP – vitamin D binding protein) a je transportován cirkulací do jater (Zhang et al. 2010). K tomu, aby se z vitamínu D3 stala aktivní látka ovlivňující cílové tkáně, je potřeba, aby molekula vitamínu D3 byla dvakrát hydroxylována. V játrech je vitamín D3 jaterní 25­hydroxylázou (CYP2R1) na uhlíku hydroxylován na 25(OH)D3. 25(OH)D3 je poté v ledvinách podruhé hydroxylován 1-α-hydroxylázou (CYP27B1) v proximálním tubulu

9

na aktivní formu 1,25(OH)2D3. 1,25(OH)2D3 je nejaktivnější přirozeně se vyskytující derivát vitamínu D3 (Dusso et al. 2005). 25(OH)D3 má poločas života přibližně dva týdny a je považován za nejdůležitější indikátor hladiny vitamínu D3. Aktivní 1,25(OH)2D3 má poločas života přibližně 4-6 hodin (Baeke et al. 2010). DBP spolu s 25(OH)D3 může být internalizován buňkami skrze megalin zprostředkovanou endocytickou cestu v ledvinových (Nykjaer et al. 1999) a prsních tkáních (Rowling et al. 2006). Ke zjištění toho, zda i v monocytech dochází k endocytóze DBP skrz megalin, byl použit antagonista megalinu RAP (receptor associated protein) a fluorescentně značený DBP. Výsledkem nebyl žádný vliv antagonisty megalinu na endocytózu u monocytů narozdíl od megalin pozitivních BN16 buněk (Chun et al. 2010). Megalin je 600 kDa velký transmembránový endocytotický receptor. Je kolokalizován s dalším endocytotickým receptorem cubilinem a je silně exprimován v renálním proximálním tubulu. Cubilin je 460 kDa velký receptor bez transmembránové domény. Oba receptory jsou důležité pro vstřebávání proteinů včetně albuminu (Christensen and Birn 2001). Pro udržení správné hladiny 25(OH)D3 a pro doručení 25(OH)D3 k CYP27B1 a tudíž k převedení 25(OH)D3 na 1,25(OH)2D3 je důležitá endocytóza komplexu DBP­25(OH)D3 zprostředkovaná megalinem a cubilinem. Metabolity vázané na DBP jsou vstřebávány megalinem do proximálních tubulárních buněk ledviny. Předpokládá se, že megalin s ionty kalcia stimuluje vychytávání 25(OH)D3 epiteliálními buňkami, které produkují 1,25(OH) 2D3. U myší s absencí megalinu dochází k vysoké močové exkreci 25(OH)D3 a DBP a tudíž k deficienci vitamínu D3 (Nykjaer et al. 1999).

10

7

Regulace produkce vitamínu D3 Ledvinová produkce 1,25(OH)2D3 mitochondriální 1-α-hydroxylázou (CYP27B1) je

kontrolována několika mechanismy. Může docházet ke zvyšování nebo ke snižování produkce 1,25(OH)2D3. Aktivita CYP27B1 je pozitivně regulována prostřednictvím kalcia, fosfátu, parathyroidního hormonu (PTH), kalcitoninu, růstového hormonu (GH – growth hormon) a růstového hormonu podobný inzulinu (IGF – insulin like growth factor). Negativně je ledvinová produkce 1,25(OH) 2D3 regulována prostřednictvím fosfátu, fibroblastového růstového faktoru 23 (FGF-23 – fibroblast growth factor), enzymem klotho a samotným 1,25(OH)2D3 (Dusso et al. 2005). 1,25(OH)2D3 udržuje správnou hladinu Ca2+ v plazmě. Pokud dojde k hypokalcémii, která indukuje sekreci parathyroidního hormonu parathyroidními žlázami, dojde ke stimulaci CYP27B1 aktivity, a tak dochází k produkci 1,25(OH)2D3. 1,25(OH)2D3 následně snižuje renální exkreci kalcia, zvyšuje vstřebávání kalcia ve střevě, stimuluje maturaci osteoklastů a dochází k uvolňování kalcia z kostí. Po dosažení správné hladiny kalcia není dále stimulována aktivita CYP27B1 (Dusso et al. 2005). Homeostáza vápníku závisí na aktivitě osteoblastů a osteoklastů v kosti. Schopnost 1,25(OH)2D3 stimulovat expresi 24-hydroxylázy (CYP24A1) slouží jako negativní zpětná vazba. Díky mitochondriální 24-hydroxyláze totiž dochází k prvnímu kroku katabolismu vitamínu D3 a tím nedochází k jeho nadbytku (Meyer, Goetsch and Pike 2010). FGF-23 je důležitý regulátor sérových hladin 1,25(OH) 2D3 a fosfátu. FGF-23 je sekretován v kostech osteocyty a osteoblasty v rámci odpovědi na zvýšenou hladinu 1,25(OH)2D3 nebo fosforu. FGF-23 snižuje ledvinovou produkci 1,25(OH) 2D3 a inhibuje ledvinové vstřebávání fosfátu (Liu et al. 2006b). U pacientů s chronickou nemocí ledvin hladina 1,25(OH)2D3 postupně klesá (Levin et al. 2007). Může za to ztráta ledvinové hmoty a 1α – hydroxylázy zodpovědné za konverzi 25(OH)D3

na

aktivní

metabolit.

Dále

dochází

k redukci

glomerulární

filtrace

a k neadekvátnímu doručení 25(OH)D3 k renální 1α – hydroxyláze v buňkách proximálního tubulu. Tyto pacienty často doprovází hyperfosfatémie, deficience 1,25(OH)2D3, hypokalcémie a sekundární hyperparathyroidismus. Produkce FGF-23 postupně stoupá s klesající ledvinovou funkcí (Gutierrez et al. 2005). Dochází ke zvýšené syntéze FGF-23, což je kompenzační mechanismus udržující fosfátové hladiny v rámci fyziologických mezí. 11

FGF-23 zvyšuje močovou exkreci fosfátů (Shimada et al. 2004) a snižuje střevní vstřebávání fosfátů (Miyamoto et al. 2005). Dále dochází u těchto pacientů k hypersekreci PTH sloužící jako kompenzační mechanismus udržující správné hladiny vápníku. To někdy může vést k autonomní PTH sekreci a sekundárnímu hyperparathyroidismu (Rodriguez, Nemeth and Martin 2005). V roce 2001 byla objevena exprese CYP27B1 mRNA nebo proteinová exprese mimo ledvin také v kůži, lymfatických uzlinách, epiteliálních buňkách a parasympatických gangliích v tlustém střevu. Dále v pankreatických ostrůvkách, dřeni nadledvinek, na některých místech v mozku a v deciduálních a trofoblastických buňkách placenty (Zehnder et al. 2001). Také různé typy buněk imunitního systému včetně makrofágů, DC (dendritic cells), B a T lymfocytů exprimují CYP27B1, zatímco dendritické buňky exprimují navíc i CYP2R1 (Hewison et al. 2003). Exprese CYP27B1 monocyty a makrofágy je silně zvýšena v přítomnosti IFN-γ (interferon), LPS (lipopolysaccharides) vázající se na TLR-4 (Toll-like receptor-4), lipoproteinu

z Mycobacterium

tuberculosis

spouštějící

kaskádu

přes

TLR2/1

a v přítomnosti virových infekcí (Liu et al. 2006a). V dendritických buňkách je exprese CYP27B1 silně zvýšena při jejich maturaci, zatímco T a B lymfocyty silně zvyšují expresi CYP27B1 při aktivaci (Chen et al. 2007). Nediferenciované monocyty a makrofágy jsou vysoce citlivé k indukci CYP24A1 zprostředkované 1,25(OH)2D3, zatímco diferenciované/aktivované makrofágy nejsou (Kreutz et al. 1993). Extrarenální CYP27B1 je regulována jinak než renální. Na rozdíl od renální produkce, není produkce zvýšena prostřednictvím kalcia a PTH, ale je závislá na imunitních signálech a na vhodné koncentraci substrátu 25(OH)D 3. Navíc není pozorována žádná negativní zpětná vazba samotným 1,25(OH)2D3 (Overbergh et al. 2000a).

12

Obr.1 Metabolismus a význam vitamínu D3 Pod vlivem UVB záření dochází v kůži k přeměně 7-dehydrocholesterolu na previtamín D3, který je následně spontánní termální izomerací přeměněn na vitamín D3 (cholekalciferol). Tedy vitamín D3 může být získán ze stravy nebo z pre-vitamínu D3. Vitamín D3 podstupuje dvě hydroxylace k tomu, aby se z něho stal aktivní vitamín D3. První hydroxylace je v játrech, kde díky jaterní 25­hydroxyláze (CYP2R1) je na uhlíku hydroxylován na 25(OH)D3. 25(OH)D3 je poté v ledvinách hydroxylován 1­α­hydroxylázou (CYP27B1) na aktivní formu 1,25(OH)2D3. 1,25(OH)2D3 pak působí ve střevě, kde zvyšuje vstřebávání Ca2+ a fosforu. V kostech 1,25(OH)2D3 zvyšuje mineralizaci kostí. Zralé osteoblasty obsahují jaderné receptory pro 1,25(OH)2D3. Vitamín D3 stimuluje produkci, zrání a mineralizaci kolagenní matrix a dochází tak ke vzniku osifikované tkáně. Pokud nedochází k příjmu dostatečného množství vápníku ve stravě, 1,25(OH)2D3 stimuluje aktivitu osteoklastů zvýšením expese osteoklastogenních faktorů v osteoblastech, a tak dochází k uvolňování kalcia z kostí. Byla prokázána inverzní korelace mezi přísunem vitamínu D 3 a rizikem pro vznik rakoviny tlustého střeva, prsu a prostaty. 1,25(OH)2D3 má protirůstový a prodiferenciační efekt na velké množství typů buněk. Vitamín D 3 má rovněž důležitý imunoregulační význam v imunitním systému a je důležitý v obraně proti intracelulárním patogenům. Jeho imunoregulační význam je zahrnut jak v přirozené, tak v adaptivní imunitě.

13

8

Receptor pro vitamín D3 Receptor pro vitamín D3 je ligandem aktivovaný transkripční faktor, který patří

do superrodiny jaderných receptorů (Carlberg et al. 1993). VDR (vitamin D receptor) se skládá ze dvou domén: z DNA vázající domény a z C terminální ligand vázající domény. Receptor váže s velkou afinitou 1,25(OH)2D3. Pokud dojde k navázání ligandu na ligand vázající doménu na receptoru, dojde k heterodimerizaci receptoru s retinoidním X receptorem (RXR – retinoid X receptor). Následně dojde k navázání tohoto komplexu na příslušné elementy na DNA odpovídající vitamínu D3 (VDREs - vitamin D response elements) do promotorové oblasti a k ovlivnění exprese konkrétních genů. VDREs jsou charakterizovány jako přímé repetice hexamerních PuG(G/T)TCA motivů oddělených 3bp (DR3) v promotorovém regionu VDREs (Dusso et al. 2005). Je evidentní, že i 25(OH)D3 se váže na VDR a ovlivňuje tak synergisticky s 1,25(OH)2D3 expresi příslušných genů (Lou et al. 2010). Vedle ledvin, kostí, střev a kůže se VDR nachází v podstatě ve všech lidských tkáních. Exprese byla například nalezena v mozku, reprodukčním systému, očích, srdci, β-buňkách, svalech, tukových tkáních, thyroidních, nadledvinkových a parathyroidních žlázách a v buňkách imunitního systému (Bikle 2009). To nasvědčuje skutečnosti, že vitamín D3 je zodpovědný za mnohem více pochodů v těle, než pouze udržování správné hladiny Ca2+ a fosfátu v těle. Tomu svědčí i fakt, že v různých buňkách například v keratinocytech, buňkách imunitního systému, v kostních buňkách, ale i v prsních buňkách, prostatě a v buňkách rakoviny tlustého střeva je známa přítomnost enzymu CYP27B1 schopného přeměnit 25(OH)D3 na 1,25(OH)2D3 (Verstuyf et al. 2010). Ukázalo se, že 1,25(OH)2D3 podporuje diferenciaci buněk a naopak inhibuje proliferaci buněk. Mechanismus je takový, že 1,25(OH) 2D3 má vliv jak přímo, tak nepřímo na regulátory buněčného cyklu a brání buňkám přechodu z G1 do S fáze. Dochází tak k nakumulování buněk v G1 fázi. 1,25(OH)2D3 indukuje expresi různých inhibitorů cyklin­dependentních kináz (Cdk) jako je p15, p19, p21, p27. Tyto inhibitory blokují aktivitu cyklin/Cdk komplexů (Cyklin D1, 2, 3/Cdk4-6; Cyklin E/Cdk2). Inhibitor Cdk­p21(waf/cip1) obsahuje odpovědné elementy pro vitamín D3 a je tak přímo aktivován 1,25(OH)2D3 na jeho promotoru. Dále bylo zjištěno, že 1,25(OH)2D3 indukuje potlačení miR181 a to vede k akumulaci p27(kip1)22 - Cdk inhibitoru. Dále má 1,25(OH) 2D3 za následek potlačení exprese cyklinů (cyklin D a cyklin E), a tak dochází k redukování cyklin/Cdk 14

aktivity. Díky snížené cyklin/Cdk aktivitě dochází k hypofosforylaci tzv. pocket proteinů, kam patří retinoblastomový protein pRb, p107 a p130. Tyto proteiny jsou zodpovědné za znehybnění přechodu buňky z G1 do S fáze skrz regulaci E2F-odpovědných genů. Díky působení 1,25(OH)2D3 zůstávají E2F4 a E2F5 asociovány s hypofosforylovanými pocket proteiny p107 a p130 a chovají se jako transkripční represory v buňkách ve fázi G1. Díky hypofosforylovanému pRb nedochází k uvolnění transkripčních faktorů E2F 1-3 a ty pak nejsou schopny ovlivňovat promotorové regiony na genech buněčného cyklu, a tak iniciovat přechod z G1 do S fáze. Následkem toho všeho dochází k zablokování buněčného cyklu (Verstuyf et al. 2010). U VDR-/- myší je následkem mutace v genu pro VDR přítomna hyperproliferace v tlustém střevě a v prsních žlázách. Tyto myši jsou predisponované ke vzniku rakoviny v přítomnosti karcinogenního agents. Podávání 1,25(OH)2D3 s jeho inhibičním efektem na proliferaci by mohlo významně pomoci v léčbě nádorů (Verstuyf et al. 2010).

15

9

Vitamín D3 vázající protein

9.1

Struktura proteinu vázajícího vitamín D3 Vitamín D vázající protein (DBP – vitamin D binding protein) je hlavní přenašeč

vitamínu D3 a jeho metabolitů v plazmě. Tento protein je také znám pod názvem Gc­globulin (group-specific component). Aminokyselinová sekvence je složena ze 458 aminokyselin, které jsou uspořádány do tří domén a 16 aminokyselinové hlavní sekvence (Cooke and David 1985). Syntéza, která se nachází v játrech, je závislá na estrogenu a zvyšuje se během těhotenství (Bouillon et al. 1981). Denní produkce DBP je kolem 10 mg/kg a koncentrace DBP v plazmě činí u zdravých jedinců 300 ­ 600 μg/ml (Kawakami et al. 1981). Gen pro DBP je součástí genové rodiny, která dále zahrnuje gen pro albumin (ALB), gen pro α-fetoprotein (AFP) a gen pro α-albumin/afamin (AFM) (Cooke and Haddad 1989). Všechny geny jsou převážně syntetizovány v játrech a jsou lokalizovány na dlouhém raménku chromozomu 4. Vzdálenost genu pro DBP od ostatních členů rodiny je více než 1,5 Mb (Song et al. 1999). Na proteinové sekvenci DBP jsou známé dva vázající regiony. Jedním z nich je vitamín D3 vázající doména (mezi 35. a 49. aminokyselinovými zbytky) a aktin vázající doména (mezi 373. a 403. aminokyselinovými zbytky) (Song et al. 1999). DBP se liší od ostatních hydrofóbních přenašečských systémů tím, že koncentrace DBP je vyšší než jeho ligand. Koncentrace DBP je 5 × 10-6 M, naproti tomu koncentrace jeho hlavního ligandu 25(OH)D3 činí 5 × 10-8 M. DBP má krátký poločas (2,5 dne) ve srovnání s 25(OH)D3 (Cooke and Haddad 1989). Koncentrace DBP se na rozdíl od jiných plazmových proteinů během života nemění (Bouillon et al. 1981). Přítomnost DBP není omezena jen na některé tkáně, ale jeho přítomnost zahrnuje široké spektrum tkání. To znamená, že jeho funkce zahrnuje rozsáhlé spektrum účinků na buňky a tkáně.

16

9.2

Homologie proteinu vázajícího vitamín D3 Gen pro DBP je člen multigenního klastru, který zahrnuje dále již výše zmíněné geny

pro ALB, AFP a AFM. ALB a AFP vznikly genovou duplikací a později byla odhalena na základě homologních nukleotidů a aminokyselinové sekvence homologie s DBP (Cooke and Haddad 1989). Předpokládá se, že před 700 milióny lety došlo ke ztrojení vnitřního 192 aminokyselinového regionu ancestrálního genu, které mělo za následek vznik této genové rodiny. Vznikl tak gen pro DBP a geny pro ALB, AFP a AFM (Cooke and Haddad 1989). DBP, ALB a AFP obsahují sérii vysoce konzervovaných cysteinových reziduí. Jediný rozdíl ve struktuře DBP oproti ostatním je zkrácení třetí domény o 124 aminokyselin (Ray et al. 1991).

9.3

Polyformismy proteinu vázající vitamín D3 Lidský DBP je velmi polymorfní protein. V lidské populaci jsou známé tři alely a asi

120 různých variant v rámci různách ras. Jedná se o Gc1F, Gc1S a Gc2 alelu (Cleve and Constans 1988). To, že se v rámci různých populací liší alely, může být následkem různé míry expozice UV záření. Typickým znakem všech populací je menší zastoupení Gc2 alely ve srovnání s Gc1 alelou. Existuje jediná populace s naprostou absencí Gc2 alely a to je populace na Sahaře. Bílá populace se vyznačuje relativně nižší frekvencí Gc1F alely a vyšší frekvencí Gc1S alely. Američané tmavé pleti a Afričané mají vysoké zastoupení Gc1F alely. Ve srovnání s černochy mají běloši vyšší frekvenci Gc2 alely. Tmavý a žlutý typ barvy pleti je charakteristický nižší mírou penetrace UV záření do kůže, a tak vyšší náchylností ke vzniku křivice (Kamboh and Ferrell 1986). Existuje šest různých kombinací tří hlavních alelických variant DBP: Gc1F-1F, Gc1F1S, Gc1F-2, Gc1S-1S, Gc2-1S a Gc2-2 (Chun et al. 2010).

9.4

Funkce proteinu vázající vitamín D3 Hlavní funkcí DBP je vázání, solubilizace a transport vitamínu D3 a jeho metabolitů

(Daiger, Schanfield and Cavalli-Sforza 1975). Oba metabolity vitamínu D 3 se váží s různou afinitou na DBP. 1,25(OH)2D3 se váže s nížší afinitou na DBP než 25(OH)D3 a to činí 1,25(OH)2D3 snadno biologicky dostupným (White and Cooke 2000). 17

Vazebná místa na DBP jsou normálně okupovány ligandem z 2 %, naproti tomu jiné přenašečské proteiny, například TGB (thyroxin binding globulin) a CBG (cortizol binding globulin) mají obsazená místa z 50 %. Frakce navázaného ligandu 25(OH)D3 je 88%. Je možné, že důvod, proč je přítomen takový přebytek DBP je ten, že se tak tělo brání možné intoxikaci vitamínem D3. Další možný důvod je ten, že DBP může sloužit jako cirkulující rezervoár 25(OH)D3 (Cooke and Haddad 1989). Téměř všechny metabolity vitamínu D3 cirkulují navázané na DBP. Metabolity vázané na DBP jsou méně citlivé k jaternímu metabolismu a následné žlučové exkreci. To značně prodlužuje jejich poločas života. Nenavázaný vitamín D3 je více přístupný k cílovým tkáním a dochází tak k jejich ovlivňování, narozdíl od toho vázaný vitamín D3 má omezený přístup k cílovým tkáním. Pouze 12 – 15 % cirkulujícího vitamínu D3 se váže na albumin (Safadi et al. 1999). Narozdíl od Dbp-/- myší, které jsou normálně fertilní a mají normální velikost, lidé s naprostou absencí DBP nejsou životaschopní. U Dbp-/- myší jsou koncentrace v séru 25(OH)D3 a 1,25(OH)2D3 významně nižší než u wild typu myší. Pokud dojde u Dbp-/- myši k přetížení organizmu vitamínem D 3, nedochází u nich v takové míře k hyperkalcémii, jak by tomu bylo u zdravých myší (Nykjaer et al. 1999). Jinou důležitou funkcí DBP je zabránění polymerace G-aktinu do F-aktinu. Při smrti buňky dochází k uvolnění G aktinu do cirkulace z buňky, který tak může polymerovat a způsobit vaskulární obstrukce. DBP pracuje spolu s gelsolinem a váže s vysokou afinitou G­aktin, který tak nemůže polymerovat (Van Baelen, Bouillon and De Moor 1980). Podle některých in vitro studií má DBP význam i v aktivaci makrofágů. Dochází k tomu tak, že DBP je deglykosylován T a B buněčnými glykosidázami na DBP-MAF (macrofage activating factor) (Yamamoto and Kumashiro 1993). DBP rovněž váže mononenasycené a nasycené mastné kyseliny (Williams, Van Alstyne and Galbraith 1988).

18

10 Vitamín D3 a imunitní systém Existuje stále více důkazů potvrzující to, že vitamín D3 hraje velký význam v regulaci různých složek imunitního systému a hraje důležitou roli v obraně proti infekcím a autoimunitním chorobám. Receptor pro vitamín D 3 byl nalezen téměř ve všech buňkách imunitního systému včetně neutrofilů, makrofágů, dendritických buněk, aktivovaných CD4+ a CD8+ lymfocytů a B lymfocytů. Zatímco naivní T buňky exprimují málo VDR, u aktivovaných T buněk se exprese VDR významně zvětšuje (Provvedini et al. 1983). Naproti tomu diferenciace monocytů do makrofágů nebo do dendritických buněk je spojena se snížením exprese VDR, tudíž jsou tyto zralé buňky méně citlivé na 1,25(OH)2D3 (Hewison et al. 2003).

Obr.2 Imunomodulační účinky vitamínu D3 (převzato od Baeke et al. 2010) 19

10.1

Modulace přirozené imunity Buňky monocytoidní linie jsou schopné produkovat a využívat 1,25(OH)2D3.

Nadměrná syntéza 1,25(OH)2D3 makrofágy se klinicky manifestuje nemocí nazvanou granulomatózní sarkoidóza. Zvýšené množství 1,25(OH)2D3 může vést k hyperkalcémii (Burke, Rybicki and Rao 2010). Studie ukázaly, že 1,25(OH)2D3 indukuje anti-mykobakterální aktivitu u lidských monocytů a makrofágů (Gombart 2009). 1,25(OH)2D3 má diferenciační efekt na monocyty­ty pak zrají v makrofágy (Griffin, Xing and Kumar 2003). Zároveň v nich hormon zvyšuje chemotaktickou a fagocytární aktivitu (Xu et al. 1993). Negativní zpětná vazba díky CYP24A1 popsaná výše se zdá být defektní v makrofázích. V makrofázích bylo pozorováno, že dochází k alternativnímu sestřihu CYP24A1 transkriptu kódující enzym, kterému chybí důležitá amino-terminální mitochondriální cílová sekvence (Ren et al. 2005). To je výhodné, pokud dojde k napadení pomalu se replikujícím intracelulárním patogenem jako je M. tuberculosis. Tento poznatek může vysvětlovat mechanismus nadměrné produkce 1,25(OH) 2D3 v makrofázích u sarkoidózy.

10.1.1

Exprese cathelicidinu

Pokud dojde k navázání PAMPs (Pathogen-associated molecular patterns) na TLR2/1 na monocytech a makrofázích, zvýší se produkce enzymu CYP27B1, který začne produkovat 1,25(OH)2D3. Rovněž aktivace signální dráhy přes TLR2/1 indukuje expresi VDR, na který se naváže 1,25(OH)2D3 (Liu et al. 2006a). Podobně pokud dojde k navázání LPS na TLR4, dojde k indukci produkce CYP27B1 (Stoffels et al. 2006). 1,25(OH)2D3 silně indukuje expresi CAMP (cathelicidin) v buňkách různého typu in vitro i in vivo. Po navázání 1,25(OH)2D3 na VDR dojde k heterodimerizaci receptoru s RXR. Transkripčním cílem RXR a VDR komplexu je gen pro anti-mikrobiální peptid cathelicidin (LL37) (Wang et al. 2004). Dochází tak k indukci exprese cathelicidinu a zabití M. tuberculosis (Liu et al. 2006a). Cathelicidiny zahrnují rodinu savčích proteinů obsahujícího C-terminální kationickou antimikrobiální doménu. Tato doména se stává aktivovanou po odtržení od N-terminální kationické

části

holoproteinu.

Funkce

cathelicidinů 20

zahrnuje

široké

spektrum

antimikrobiálních aktivit. Lidský

cathelicidin LL37

má

chemotaktickou aktivitu

pro neutrofily, monocyty, mastocyty a T buňky. Také indukuje degranulaci mastocytů (Zanetti 2004). Lidé s nízkým množstvím 25(OH)D3 jsou více náchylní k infekcím a doplnění 25(OH)D3 těmto lidem mělo za následek zlepšení imunitní odpovědi vůči M. tuberculosis skrz TLR2/1 indukovanou expresi LL37 (Adams et al. 2009). Zatímco IFN-γ zvyšuje TLR2/1 dependentní indukci signalizace 1,25(OH)2D3 v makrofázích, IL-4 tuto signalizaci silně potlačuje (Edfeldt et al. 2010). 1,25(OH)2D3 indukuje také expresi jiného anti-mikrobiálního peptidu a to defenzinu β2. Muramyl dipeptid, produkt z Gram-pozitivních a Gram-negativních bakterií, indukuje aktivaci NOD2 receptoru (Nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2), který stimuluje transkripční faktor NF-кB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) indukující expresi genu pro defenzin β2 (Wang et al. 2010). Podle studie od Yuk et al. má 1,25(OH)2D3 schopnost v lidských monocytech a makrofázích indukovat autofágii vedoucí k destrukci M. tuberculosis (Yuk et al. 2009). Vedle toho také 1,25(OH)2D3 inhibuje expresi TLR2 a TLR4 na monocytech, které jsou pak méně citlivější k PAMPs. Tato inhibice se jeví jako negativní zpětná vazba k tomu, aby nedocházelo k nadměrné indukci exprese anti-mikrobiálních peptidů (Sadeghi et al. 2006).

10.1.2

Protein vázající vitamín D3 a jeho vliv na odpověď monocytů vůči 25(OH)D3 a 1,25(OH)2D3

25(OH)D3 je nejvýznamnějším cirkulujícím ukazatelem pro množství vitamínu D 3 v krvi. Toto množství je značně rozdílné v rámci lidské populace. Důležitý faktor v regulaci množsví 25(OH)D3 v séru a tedy v dostupnosti 1,25(OH)2D3 buňkám je DBP. Biologická odpověď na přítomnost 25(OH)D3 může být silně ovlivněna DBP. Výsledky ze studie od Rene F. Chun et al. z roku 2010 ukazují, že DBP významně ovlivňuje odpověď monocytů na přítomnost 25(OH)D3 a 1,25(OH)2D3. U monocytů kultivovaných v médiu obsahující myší sérum bez DBP (DBP -/-) byla po 6 hodinách po přidání 2-200 nM 25(OH)D3 nebo 0,02-2 nM 1,25(OH)2D3 indukována exprese cathelicidinu a CYP24A. Tato indukce byla u buněk kultivovaných v médiu obsahující 21

sérum z DBP+/- myší zeslabena. Pokud se přidalo vyšší množství 25(OH)D3 nebo 1,25(OH)2D3, byl modulační efekt DBP popřen a došlo k indukci cathelicidinu. Studie dále ukázala, že v nepřítomnosti TLR ligandů, které by indukovali expresi CYP27B1, nebo v nepřítomnosti IL-15, dochází u buněk už první den k bazální konverzi 25(OH)D3 na 1,25(OH)2D3. DBP gen existuje ve třech základních alelických formách: Gc1F, Gc1S a Gc2. Vliv jednotlivých forem DBP na 25(OH)D3 indukovanou expresi cathelicidinu se liší. Srovnání dárců s alespoň jednou formou Gc1F (Gc1F-1F, Gc1F-1S a Gc1F-2) s těmi bez Gc1F formy (Gc1S-1S, Gc2-1S a Gc2-2) ukázalo, že monocyty těch dárců bez Gc1F formy byly téměř dvakrát citlivější vůči 25(OH)D3. Metabolity vitamínu D 3 jsou biologicky aktivní, pokud jsou nevázané na DBP. Proto evolucí vzniky nízkoafinitní alely GBP, aby se zvýšila odpověď monocytů na 25(OH)D3 a mohla se tak indukovat exprese cathelicidinu a zabití patogenu. Ancestrální DBP alela – Gc1F – podstoupila dvě aminokyselinové změny: D416E změna dala vznik Gc1S a T420K změnou vznikla Gc2 alela. Původní Gc1F alela má velkou afinitu vůči 25(OH)D3. Vznik dvou nízkoafinitních alel Gc1S a Gc2 mělo za následek více volného 25(OH)D3 (Chun et al. 2010).

10.2

Modulace adaptivní imunity APC (antigen presenting cells) představují důležitou část adaptivní imunity

a na jejich povrchu se nacházejí MHC komplexy (Major histocompatibility complex), které jsou pro spuštění adaptivní imunitní odpovědi klíčové. 1,25(OH)2D3 má velký vliv na T buněčnou odpověď tím, že moduluje dendritické buňky – nejvýznamnější APC. 1,25(OH)2D3 inhibuje maturaci DC tím, že sníží povrchovou expresi MHC glykoproteinů II. třídy a také expresi kostimulačních molekul (CD40, CD80, CD86) nezbytných pro aktivace T a B lymfocytů (Berer et al. 2000). Tyto DC vystavené působení 1,25(OH)2D3 mají zmenšenou kapacitu spustit proliferaci T buněk (Penna and Adorini 2000). Podobně i monocyty/makrofágy mají po expozici 1,25(OH)2D3 snížené antigen prezentující schopnosti, protože je u nich rovněž snížena exprese MHC glykoproteinů II. třídy a kostimulačních molekul (Xu et al. 1993).

22

Během diferenciace monocytů do dendritických buněk dochází ke snížení exprese CD14 – markeru monocytů a zároveň dochází ke zvýšení exprese markeru dendritických buněk – CD1a. 1,25(OH)2D3 inhibuje tuto diferenciaci do CD1a+ dendritických buněk a udržuje expresi CD14 (Berer et al. 2000). Je známo, že CD14 je koreceptor TLR4 a gen pro CD14 je cílovým genem pro 1,25(OH)2D3 (Oberg, Botling and Nilsson 1993) . Podle studie od Piemonti et al. 1,25(OH)2D3 může hrát důležitou roli ve vázání a zpracovávání antigenů a tak iniciovat imunitní odpověď. Podle této studie může 1,25(OH)2D3 totiž zvyšovat endocytotickou aktivitu DC tím, že zvyšuje expresi manosového receptoru na DC, což je molekula zodpovědná za vychytávání antigenů (Piemonti et al. 2000). U DC vystavených působení 1,25(OH)2D3 nebo VDR-agonistů dochází ke změně u tří hlavních

proteinových

skupin

zahrnutých

v proteinové

biosyntéze/proteolýze,

metabolismu a cytoskeletární struktuře (Ferreira et al. 2009).

10.2.1

Vliv vitamínu D3 na buňky adaptivní imunity

Podle výsledků z in vitro studií 1,25(OH)2D3 inhibuje polarizaci CD4+ buňky na Th1 buňky (Lemire et al. 1995a) a současně podporuje vývoj Th2 buněk (Overbergh et al. 2000b). 1,25(OH)2D3 snižuje produkci IL-12 dendritickými buňkami. Tento cytokin je důležitý pro vývoj Th1 buněk. 1,25(OH)2D3 rovněž inhibuje vývoj Th17 buněk tím, že snižuje produkci IL-23 dendritickými buňkami, který je důležitý pro přeměnu na Th17 buňky. 1,25(OH)2D3 brání T buňkám produkci Th1 cytokinů (IL-2 a IFN-γ), Th17 cytokinů (IL-17 a IL-21) a stimuluje produkci Th2 cytokinu (IL-4) (Penna and Adorini 2000). Vitamín D3 kromě toho podporuje produkci IL-10 dendritickými buňkami a tak upřednostňuje vývoj CD4+CD25highCD127low T regulačních lymfocytů (Treg lymfocyty), které zabraňují nadměrné aktivaci efektorových T buněk a udržují toleranci vůči tělu vlastním tkáním (Baeke et al. unpublished). Také

bylo

pozorováno,

že

Treg

lymfocyty

indukované

1,25(OH)2D3

a dexamethasonem exprimují ve vysoké míře TLR9 a pokud dojde k aktivaci receptoru ligandem, dojde ke zrušení supresorové aktivity Treg buněk. Děje se to zřejmě proto, aby mohlo dojít ke zlikvidování infekčního agents (Urry et al. 2009).

23

1,25(OH)2D3 ovlivňuje také B buňky. Hormon blokuje diferenciaci plazmatických buněk, IgG a IgM produkci, proliferaci B buněk a vznik paměťových B buněk. Rovněž indukuje B buněčnou apoptózu (Chen et al. 2007). U krysího modelu, kde byla provedena transplanatace ledvin, 1,25(OH) 2D3 spolu s cyklosporinem A (CsA) zabraňoval sekreci Th1 prozánětlivých cytokinů v séru a ve štěpu. Kombinace těchto dvou látek silně snížila množství IL-2 a IL-12 v porovnání s terapií, kdy byl použit pouze CsA. Při použití 1,25(OH)2D3 se množství Th2 cytokinů IL-4 a IL-10 zvýšilo. V přítomnosti samotného CsA nikoli (Redaelli et al. 2002). Podávání

VDR

agonistů

s

jejich

imunomodulačním

efektem

pacientům

po transplantaci by mohl být významný krok, protože by tak bylo možné při jejich podávání snížit množství imunosupresivní látky a tak zredukovat řadu vedlejších efektů imunosupresiv. Bylo by potřeba podání umělých analogů 1,25(OH)2D3, aby nedocházelo k hyperkalcémii.

10.2.2

Mechanismus

represe

produkce

Interleukinu

12

vitamínem D3

10.2.2.1

Charakteristika Interleukinu 12

Interleukin 12 (IL-12) je heterodimerický prozánětlivý cytokin. Jeho dvě podjednotky se jmenují p35 a p40 a jsou kódovány dvěma rozdílnými geny. Tento cytokin IL-12p70 se stává biologicky aktivní až po spojení podjednotek p35 a p40 (Wolf et al. 1991). Podjednotka p40 je shodná s podjednotkou IL-23, což je stejně jako IL-12 další prozánětlivý cytokin (Louis et al. 2010). IL-12 je hlavní diferenciační faktor pro Th1 buňky. Má podobné účinky jako IL-2, ale narozdíl od IL-2, IL-12 není nikdy produkován T lymfocyty. IL-12 je produkt APC. Tato exprese je odpovědí na přítomnost bakteriálních antigenů a intracelulárních patogenů spouštějící imunitní odpověď přes TLR-4. IL-12 je důležitý v obraně proti intracelulárním patogenům, zvyšuje aktivitu NK buněk (natural killer cells), je to růstový faktor pro T lymfocyty a zvyšuje expresi IFN-γ. Receptor pro IL-12 se skládá z α a β řetězce (Vandenbroeck et al. 2004). 24

Protože je IL-12 prozánětlivý cytokin a jeho nadměrná exprese způsobuje vývoj chronických zánětů a autoimunitních chorob jako je například revmatoidní artritida, psoriáza, Crohnova choroba a rozstroušená skleróza, je potřeba regulačních mechanismů zabraňující jeho nadměrné expresi. Jedním z regulačních mechanismů je zřejmě právě 1,25(OH)2D3.

10.2.2.2

Mechanismus represe genu IL-12B vitamínem D3

Bylo zjištěno, že 1,25(OH)2D3 inhibuje produkci IL-12 v aktivovaných makrofázích (Lemire 1995b). 1,25(OH) 2D3 a jeho represivní efekt je asociován s proximálním promotorem genu pro IL-12 – IL-12B. Žádné VDRE v rámci genu pro IL -12 – IL-12B a IL­12A nalezeny až do nedávna nebyly. V promotoru genu IL-12B byla ale nalezena vazebná

místa

pro

NF-кB

a další

transkripční

faktory

jako

například C/EBP

(CCAAT/enhancer-binding protein) a AP-1 (activator protein-1), skrze které dochází k indukci produkce IL-12. Studie od Petry Gynther et al. z roku 2011 zjistila přítomnost několika VDREs v rámci genu pro IL-12 a dále zkoumala mechanismy 1,25(OH) 2D3 – dependentní represe IL-12B. Tato studie zkoumala efekt 1,25(OH)2D3 na expresi IL-12B mRNA. Modelem byly THP-1

buňky, což jsou

buňky

lidské akutní

monocytické leukémie.

Bazální

exprese interleukinu 12B mRNA byla malá, proto byl k THP-1 buňkám přidán LPS. Přidání 1,25(OH)2D3 způsobilo až 2,5 × menší expresi IL-12B mRNA v prvních šesti hodinách. Navíc expresní profil vykazoval cyklický charakter. Nejnižší exprese IL-12B mRNA byla naměřena po 24 hodinách s 12,2 × nižší expresí než byla bazální exprese. To samé bylo naměřeno i na primárních monocytech­represivní efekt 1,25(OH)2D3 není tedy spojen jen s kultivovanými buňkami. Exprese TLR-4 se po přidání témeř nezměnila. Pokud byl 1,25(OH)2D3 přidán k buňkám dříve než LPS, exprese TLR-4 se rovněž nezměnila a represe IL-12B mRNA byla větší než u buněk, ke kterým byl nejdříve přidán LPS a pak až 1,25(OH)2D3. Ke zjištění toho, zda je tato represe díky 1,25(OH) 2D3 závislá na VDR, či ne, byla před měřením exprese IL-12B mRNA použita siRNA, která umlčela gen pro VDR. VDR­specifická siRNA zapříčinila naprosté zrušení represivního efektu vitamínu D 3, zatímco nespecifická kontrola nikoli. 25

ChiP analýzou, kde byla použita protilátka proti VDR, byly objeveny v rámci 10kB IL­12B promotoru čtyři VDR vázající regiony (5, 13, 17 a 20), které dohromady obsahují šest domnělých VDREs (REs 1-6). Z toho pouze u RE2 (region 5) a RE5 (region 17) bylo zjištěno in vitro i in vivo VDR-RXR navázání a významná 1,25(OH)2D3 – dependentní down­regulace. RE2 vázal VDR-RXR heterodimer mnohem silněji než RE5. 1,25(OH)2D3 způsobuje rovněž nábor represivních proteinů jako je HDAC3 (Histone deacetylase 3) a NCOR2/SMRT (nuclear receptor co-repressor 2/ mediator for retinoid or thyroid-hormone receptors) do regionu 5 (RE2), regionu 17 (RE5) a TSS (transcription start site). Tento komplex represivních proteinů má za následek snížení histonové acetylace a zvýšení histonové methylace. V nepřítomnosti 1,25(OH)2D3 je chromatin v těchto regionech acetylován, je tedy přístupný k transkripci. Nábor VDR, RXR, HDAC3 a NCOR2/SMRT do RE2 a RE5 má cyklický charakter. Množství H4ac (Acetylated Histone H4), což je marker aktivního chromatinu, významně klesá v regionu 5 a TSS v rámci prvních 30-40 minutách po přidání 1,25(OH)2D3. Naopak množství represivního markeru H3K27 (histone H3 lysine 27) se v regionech 5 a TSS zvyšuje a maximálních hodnot dosahuje v čase po 70-90 minutách. Podle těchto výsledků má podávání 1,25(OH)2D3 v regionech 5 a TSS (a v menší míře také v regionu 17) za následek epigenetické změny a posun z permisivního chromatinu na méně permisivní chromatin. Výsledkem toho nedochází k expresi genu pro IL-12. Chromatinové změny vyvolané represivními proteiny mohou blokovat vazbu NF-кB do regionů, a tím zabraňovat aktivaci transkripce genu IL-12B. Na začátku zánětu má podávání 1,25(OH)2D3 za následek cyklickou down­regulaci exprese IL-12B. Tak dojde k udržení správné hladiny IL-12 a posléze dochází k up-regulaci IL­10, který doslova vypne IL-12B gen, a tak nedojde k vleknoucímu zánětu (Gynther et al. 2011).

10.3

Vitamín D3 a astma Podle většiny studií má vitamín D3 ochranný vliv před vznikem astmatu. Deficience

vitamínu D3 koreluje se zvýšeným výskytem astmatu a alergických onemocnění. Převaha astmatických syndromů byla pozorována u těch pacientů s nižší hladinou vitamínu D 3 a u dětí, jejichž matky měly nízký přísun vitamínu D 3 během těhotenství (Brehm et al. 2009). 26

Na druhou stranu jsou i studie, podle kterých je doplňování vitamínu D3 rizikovým faktorem pro vznik astmatu a dalších onemocnění. Například podle jedné studie z Finska doplňování vitamínu D3 dětem v prvním roce života bylo spojené s významně vyšším výskytem astmatu, atopie a alergické rýmy ve věku jejich 31 let v porovnání s kontrolami, u kterých nedocházelo k doplňování vitamínu D3 v raném věku (Hyppönen et al. 2004). Deficience vitamínu D 3 může oslabit plicní obranný systém a může tak dojít ke zhoršení astmatu zapříčiněné infekcí dýchacích cest. Astmatici mají slabou antivirovou imunitní odpověď, což je činí podstatně náchylnějšími k infekcím. Nízká úroveň 25(OH)D3 v séru koreluje se zvýšeným rizikem onemocnění rhinovirovými a RSV (respiratory syncytial virus) infekcemi u dětí s astmatem (Jartti et al. 2010). Studie od Zosky et al. provedená na zvířecím modelu ukázala, že deficience vitamínu D3 má za následek zhoršení funkce plic především změny v jejich objemu. To naznačuje tomu, že existuje přímá asociace mezi obstruktivním onemocněním plic a množstvím vitamínu D3 (Zosky et al. 2011). Vitamín D3 brání remodelaci dýchacích cest tím, že potlačuje proliferaci buněk dýchacího hladkého svalu a nepřímo potlačuje expresi TNF-α, který hraje důležitou roli při vývoji astmatu (Song, Qi and Wu 2007). Další studie poukázala na asociaci mezí nízkou úrovní vitamínu D3 a zvýšenou reakcí dýchacích cest a vyšším počtem eozinofilů a IgE (Brehm et al. 2009). Různé množství vitamínu D3 a varianty VDR a DBP představují dohromady rizikový faktor pro vznik astmatu (Bossé et al. 2009). Bylo prokázáno, že vitamín D3 ovlivňuje protiastmatickou terapii. Tato terapie představuje především užívání glukokortikoidů. Podle in vitro studie od Searing et al. byla pozorována asociace mezi nižším množstvím vitamínu D3 a nutností většího množství užívání inhalovaných nebo orálních glukokortikoidů. Tato asociace může být vysvětlena tím, že nedostatek vitamínu D3 zhoršuje průběh astmatu, nebo také tím, že vitamín D3 určitým způsobem ovlivňuje přímo glukokortokoidy. Tudíž jsou při nedostatku vitamínu D3 potřeba vyšší dávky k dosažení terapeutického efektu (Searing et al. 2010).

27

10.4

Vitamín D3 a alergie Protože má vitamín D 3 důležitou roli ve vývoji imunitní tolerance a integrity

epiteliální bariéry, mohl by existovat vztah mezi nedostatkem vitamínu D 3 a stále se zvyšujícím výskytem potravinových a kožních alergií. Vitamín D3 je rovněž zahrnut v kožních onemocněních jako například psoriáza a ekzém. Je pozorováno, že atopičtí pacienti mají mírnější průběh onemocnění v létě. Nelze vyloučit, že to je i díky většímu vystavení slunečnímu záření, a tím větší produkci vitamínu D3. Studie od Peroni et al., která byla provedena na dětech, našla jasnou asociaci mezi nedostatkem vitamínu D3 a vážností atopické dermatitidy (Peroni et al. 2011). Nicméně výsledky různých studií týkající se vitamínu D 3 a alergií se liší. Studie od Back et al. prokázala, že vysoký přísun 25(OH)D3 v raném dětství koreluje se zvýšeným rizikem vzniku atopické dermatitidy u dětí v jejich šesti letech (Bäck et al. 2009). Existují i studie ohledně kopřivky v souvislosti s vitamínem D3, i když těch je podstatně méně. Studie od Goetz et al. zkoumala možný terapeutický efekt vitamínu D3 na léčbu kopřivkových syndromů. U 70 % pacientů deficientních pro vitamín D3 s kopřivkovými symptomy došlo po léčbě vitamínem D3 k výraznému zlepšení (Goetz 2011). Existuje jedna studie zkoumající možné spojení mezi vitamínem D 3 a kontaktní dermatitidou, která je provedená na myším modelu. Tato studie srovnává kontaktní hypersenzitivní odpověď u těch myší s normální hladinou vitamínu D3 a těch myší, které jsou deficientní pro vitamín D3. Ve skupině s normální hladinou vitamínu D 3, samičky vykazovaly větší hypersenzitivní odpověď ve srovnání se samečky. Deficientní samečci měli významně větší kontaktní hypersenzitivní odpověď ve srovnání s normálními samečky. Je zajímavé, že nebyl pozorován žádný rozdíl mezi deficientními samičkami a normálními samičkami (Malley et al. 2009).

28

11 Deficience vitamínu D3 a jeho důsledky Předpokládá se, že velká část lidské populace je alespoň mírně vitamín D 3 deficientní. U zdravých lidí se koncentrace 25(OH)D3 pohybuje mezi 30 – 50 ng/ml. Pokud je množství 25(OH)D3 v séru menší než 20 ng/ml, jedná se o deficienci. Pokud se toto množství pohybuje mezi 21 a 29 ng/ml, mluvíme o nedostatku vitamínu D 3 (Malabanan, Veronikis and Holick 1998). Klasickým případem deficience vitamínu D 3 je křivice u dětí. Může být způsobena nevhodnou stravou chudou na vitamín D3 nebo nedostatkem slunečního záření. U dospělých je to osteomalácie neboli měknutí kostí. Nízké množství vitamínu D3 koreluje se zvýšeným výskytem autoimunitních chorob jako je rozstroušená skleróza, RA (Rheumatoid arthritis) (Holick, 2007) a SLE (Systemic lupus erythematosus) (Cutolo and Otsa 2008). Dosažení správné hladiny vitamínu D 3 je nejúčinnější pomocí UVB expozice, protože vitamínu D3 přítomného ve stravě není mnoho. U pacientů s chronickým onemocněním ledvin je pozorováno snížené množství 25(OH)D3. Jen 15 % pacientů s tímto onemocněním vykazuje adekvátní množství 25(OH)D3 v čase transplantace (Ducloux et al. 2008). Následkem zhoršené ledvinové funkce dochází k hypokalcémii a hyperfosfatémii. Aby se udržela optimální hladina kalcia v séru, dochází k hypersekreci PTH. PTH stimuluje kost k uvolnění kalcia a fosfátu, zabraňuje ledvinovou exkreci kalcia a vstřebávání fosfátu a indukuje 1α­hydroxylázu, což má za následek produkci 1,25(OH)2D3. V některých případech může dojít až k hypersekreci PTH. Populace tmavé a žluté barvy pleti jsou charakteristické nížší penetrací UV záření, a tak jsou náchylnější ke vzniku křivice. Předpokládá se, že milióny dětí po celém světě mají nízký obsah vitamínu D3 v krvi. Může to být díky několika faktorům: více stráveného času uvnitř, používaní opalovacích krému kvůli prevenci před rakovinou kůže a také vnitřní faktory včetně obsahu melaninu v kůži a nižší produkce/vyšší destrukce vitamínu D 3 v kůži.

29

12 Charakteristika měřených povrchových markerů V této práci byl hodnocen vliv nejrůznějších koncentrací vitamínu D3 na expresi vybraných povrchových markerů, a to CD54, CD14, HLADR, CD16, CD36 a CD163. CD54 (ICAM-1 – intercellular adhesion molecule - 1) je transmembránový glykoprotein patřící k rodině imunoglobulinů. Molekulová hmotnost CD54 se pohybuje od 80 do 114 kD v závislosti na stupni glykosylace molekuly CD54, která se liší u jednotlivých typů buněk. Protein CD54 obsahuje pět extracelulárních domén podobných imunoglobulinům, které jsou zodpovědné za interakce buňka-buňka a buňka-matrix (van de Stolpe and van der Saag 1996). CD54 zprostředkovává buněčnou adhezi vazbou na integriny CD11a/CD18 (LFA-1) a na CD11b/CD18 (Mac-1). Tyto integriny patří do β2 subrodiny.

CD54

je

buňkách.

Adhezivní

exprimovaná interakce

na hematopoetických zproztředkované

i na nehematopoetických

ICAM-1

jsou

nezbytné

pro transendoteliální migraci leukocytů do místa zánětu a za aktivaci T­lymfocytů, kde ICAM-1 působí jako koaktivační signál (Roebuck and Finnegan 1999). CD54 je konstitutivně exprimován na povrchu fibroblastů, leukocytů, keratocytů, endoteliálních buněk a epiteliálních buněk. V přítomnosti prozánětlivých cytokinů jako je IL-1β, TNF-α a IFN-γ se exprese CD54 silně zvyšuje. Rovněž se exprese CD54 zvyšuje v přítomnosti virové infekce a při buněčném stresu (van de Stolpe and van der Saag 1996).

CD14 je 55 kD velký glykoprotein exprimovaný převážně na monocytech, makrofázích

a neutrofilech.

CD14

byl

poprvé

charakterizován

jako

receptor

zprostředkovávájící interakci lipopolysacharidu (LPS, endotoxin) s buňkami, a tak signalizující přítomnost gram-negativní bakterie. Navázání LPS na CD14 vede k produkci TNF-α, IL-6 a IL-8 (Wright et al. 1990). CD14 existuje ve dvou formách: v solubilní nebo membránové formě. Membránová CD14 je navázána na membránu pomocí glykosylfosfatidylinositolové kotvy (Wright et al. 1990). LPS je nejdříve rozeznán LBP (LPS­binding protein) a tento komplex LPS-LBP je posléze navázán na CD14. Po objevení několika buněčných typů, které neexprimují CD14 a přesto jsou citlivé na přítomnost LPS, se přišlo na to, že existuje kromě membránové formy i solubilní forma CD14. Molekulová hmotnost solubilní CD14 je menší než membránové formy a pravděpodobně vzniká enzymatickým štěpením membránové CD14 (Bazil et al. 1989). Solubilní CD14 zastává úlohu v signalizaci na přítomnost LPS v případě, kdy buňky 30

exprimují málo nebo vůbec neexprimují membránovou CD14. V přítomnosti LPS dochází pravděpodobně k navázání solubilní CD14 na jiné proteiny na povrchu buňky, a tím k transdukci signálu (Frey et al. 1992). Protein CD14 se skládá z jedenácti repetic bohatých na leuciny, které se rovněž nacházejí v TLR, a jsou důležité pro vázání PAMP. Krystalická struktura CD14 odhalila, že CD14 má tvar podobný podkově, podobně jako TLR-4. K vazbě LPS dochází v místě žlábku podkovy (Anas, van der Poll and de Vos 2010).

Obr. 3 CD14 rozpoznává a váže na sebe LPS z gramnegativních bakterií, lipoteichoovou

kyselinu z gram-pozitivních bakterií, lipoarabinomannan z mykobakterií, dsRNA a F­glykoprotein z respiračních syncytiálních virů. Protože CD14 nemá transmembránovou doménu a tudíž není schopen sám iniciovat buněčnou odpověď, spolupracuje společně s TLR. Vázání LPS na CD14 je regulováno LBP (Anas, van der Poll and de Vos 2010).

31

HLA-DR (human leukocyte antigen) je MHC II povrchový receptor, který je u lidí kódován

na

chromozomu

6.

Je

to

αβ

heterodimer

nacházející

se

na antigen ­ prezentujících buňkách. Hlavní funkcí HLA-DR je prezentovat peptidy pocházejících od extracelulárních antigenů pomocným T-lymfocytům a vyvolat tak proti škodlivým antigenům imunitní odpověď (Brown et al. 1993).

CD16 (FcγRIII) je nízkoafinitní Fc receptor važící IgG. Nachází se na NK buňkách, makrofázích a polymorfonukleárních buňkách. Zprostředkovává cytotoxicitu NK buněk závislou na protilátkách (ADCC – Antibody – Dependent Cell – Mediated Cytotoxicity). CD16 existuje ve dvou formách: FcγRIIIa a FcγRIIIb (Ravetch and Perussia 1989).

CD36 je integrální membránový protein, který se nachází na velkém počtu buněk včetně monocytů, makrofágů, krevních destiček, endoteliálních buněk a na některých typech epidermálních buněk (Tandon et al. 1989). CD36 patří do skupiny B „scavenger“ receptorů a spoluzodpovídá za fagocytózu apoptotických neutrofilů a modifikovaných nízko densitních lipoproteinů (Endemann et al. 1993).

CD163 je „scavenger“ receptor pro hemoglobin-haptoglobinové komplexy (Fabriek, Dijkstra and van den Berg 2005) a některé bakterie (Fabriek et al. 2009). Jedná se o typ I transmembránového proteinu o molekulární hmotnosti 130 kD. Patří do skupiny B „scavenger“ receptorů do superrodiny bohatou na cystein. Předpokládá se, že CD163 je specifickým markerem pro monocyty/makrofágy vykazující protizánětlivé vlastnosti (M2 podskupina makrofágů). Vedle povrchové CD163 existuje i solubilní CD163 (Van Gorp, Delputte and Nauwynck 2010). Makrofágy exprimující CD163 produkují protizánětlivý cytokin IL-10, který vede k utlumení imunitních reakcí (Mayer et al. 2010).

32

13 Cíle práce 1) ohodnotit a porovnat vliv vitamínu D3 na expresi povrchových markerů CD54, CD14, HLA-DR, CD16, CD36 a CD163 u THP-1 buněk a monocytů získaných z periferní lidské krve 2) změřit expresi solubilní CD14 a IL-8 u THP-1 buněk pod vlivem vitamínu D3 3) posoudit vliv vitamínu D3 na životnost THP-1 buněk

14 Materiál a metody Tato práce se zabývá vlivem vitamínu D 3 na THP-1 buňky a monocyty izolované z periferní lidské krve. THP-1 buňky byly kultivovány v termostatu a vhodná koncentrace buněk byla udržována pasážováním přibližně dvakrát do týdne. Monocyty byly získány izolací z periferní lidské krve. Na začátku pokusů byla měřena viabilita buněk na přístroji Vi-Cell XR. V průběhu pokusů byly buňky značeny propidium jodidem pro zjištění změny životnosti buněk po stimulaci vitamínem D 3 a měřeny na průtokovém cytometru. Pro rozlišení časně a pozdně apoptotických buněk po stimulaci vitamínem D3 byly buňky značeny Annexinem V a 7-AAD a měřeny na průtokovém cytometru. Exprese vybraných povrchových markerů (CD54, CD14, HLADR, CD16, CD36 a CD163) byla měřena na průtokovém cytometru podle standardního protokolu. Měření stejných povrchových markerů bylo pro srovnání provedeno i na monocytech získaných izolací z lidské periferní krve. Pro měření hladiny solubilní CD14 a IL-8 ze supernatantů pod vlivem vitamínu D3 byla použita THP-1 linie buněk. Produkce solubilní CD14 byla měřena metodou ELISA a produkce IL-8 metodou Luminex.

14.1

Tkáňové kultury: THP-1 buňky THP-1 linie buněk (human acute monocytic leukemia cell line) je lidská permanentní

buněčná linie, která byla odvozena z periferní krve jeden rok starého chlapce s akutní monocytickou leukémií. Tato buněčná linie obsahuje Fc a C3b receptory, ale žádné cytoplazmatické a povrchové imunoglobuliny (Tsuchiya et al. 1980).

33

THP-1 buňky jsou velké kulaté buňky rostlé v suspenzi. Po rozmražení se buňky kultivují v médiu RPMI 1640 + 2 mM L-Glutamin (PAA Laboratoires GmbH) + 10% FBS (fetal bovine serum - PAA Laboratoires GmbH). Pro zabránění vzniku bakteriální kontaminace se do média přídává penicilin a streptomycin (Pen Strep, Gibco). Buňky se uchovávají v koncentraci přibližně 2 - 9 × 105 buněk/ml v termostatu ve 37 °C a 5 % CO2. Tato požadovaná koncentrace buněk byla udržována pasážováním dvakrát do týdne a viabilita neklesla pod 85 % živých buněk.

14.2

Příprava THP-1 buněk k pokusu Před provedením experimentu byly THP-1 buňky odebrány z kultivační láhve,

zcentrifugovány 5 minut při 1200 otáček/min, pokojové teplotě a nejvyšším stupni zrychlení i brzdě centrifugy. Supernatant byl odsán a peleta byla resuspendována. K buňkám bylo přidáno čerstvé médium (RPMI 1640 + 10% FBS), aby výsledná koncentrace buněk byla kolem 1 × 106 buněk/ml. Koncentrace a viabilita buněk byla měřena na ViCell XR (Becman Coulter). Buňky byly přeneseny do 24 jamkové destičky. Objem jedné jamičky byl 2 ml. Do jednotlivých jamek byl přidán vitamín D 3

(Sigma­Aldrich) v pěti různých koncentracích (0,1 nM; 1 nM; 10 nM; 100 nM a 1000 nM). Po 24, 48 a 72 hodinách se buňky zcentrifugovaly a odebraly se supernantanty (včetně času 0).

14.3

Izolace monocytů z periferní lidské krve Periferní krev od dárců byla v prvním kroku promíchána a naředěna v poměru 1:1

v PBS (Phosphate buffered saline - IKEM). Zředěná krev byla v 50ml centrifugační zkumavce navrstvena na Ficoll-Paque (GE Healthcare) v poměru 1 : 1 : 2 (krev : PBS : Ficoll) a centrifugována 30 min při 1800 otáček/min, pokojové teplotě a nejnižším stupni zrychlení a zpomalení centrifugy. Pasteurovou pipetou byl odebrán prstenec mononukleárních buněk na rozhraní Ficoll a plazmy a přenesen do nové 50ml centrifugační zkumavky. Následně byly buňky promyty: zkumavka s odebraným prstencem byla doplněna do 50 ml PBS a centrifugována 10 min při 1200 otáčkách/min, 34

4 °C a při malém stupni zrychlení a nejvyšší brzdě centrifugy. Supernatant byl odebrán a peleta buněk resuspendována v PBS a přenesena do 15ml centrifugační zkumavky. Buňky byly podruhé promyty: zkumavka s buňkami byla doplněna do 15 ml PBS a centrifugována 5 min při 1200 otáček/min, 4 °C a nejvyšším stupni zrychlení a brzdě centrifugy. Buňky byly stejně jako v případě THP-1 buněk přeneseny do 24 jamkové destičky. Objem jedné jamičky byl 2 ml. Do jednotlivých jamek byl přidán vitamín D 3

(Sigma­Aldrich) v pěti různých koncentracích (0,1 nM; 1 nM; 10 nM; 100 nM a 1000 nM). Po 24, 48 a 72 hodinách se buňky zcentrifugovaly a byly měřeny vybrané povrchové markery (včetně času 0). Pro odtržení monocytů ze dna kultivační láhve byla použita Trypsin-EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid, Sigma-Aldrich).

Obr.4 Izolace buněk z periferní krve na gradientu Ficoll (převzato z www.miltenyibiotec.com)

35

14.4

Průtoková cytometrie Průtoková cytometrie je metoda, která umožňuje souběžné měření a analýzu

fyzikálních a chemických vlastností buňky nebo jiných částic během jejich průchodu laserovým paprskem. V ten okamžik, kdy buňka prochází paprskem, dochází k rozptylu a lomu světla. Tento jev je podle směru a úhlu lomu označován jako přímý rozptyl forward scatter (FS) a boční rozptyl - side scatter (SS). FS je charakterizován lomem světla a je úměrný velikosti buňky. Úhel bočního rozptylu (SS) je ukazatel vnitřní buněčné struktury respektive granularity. Kromě parametrů lomu a rozptylu světla je zjišťována také fluorescence procházejících buněk. Fluorescenční barviva - fluorochromy navázané na analyzované buňky absorbují světlo určité vlnové délky vyzařované laserem a následně vyzařují část absorbovaného světla o jiné vlnové délce. Podle intenzity fluorescence jsme pak schopni říct, zda naše buňky exprimují na svém povrchu náš zkoumaný znak. THP-1 buňky a monocyty izolované z lidské periferní krve (100 μl, přibližně 1× 106 buněk/ml)

byly

značeny

monoklonálními

protilátkami

konjugovanými

s fluorochromem. K buňkám byly přidány následující monoklonální protilátky (5 μl nebo 10 μl): CD54 – PE (phycoerythrin, BD Biosciences), CD14 – FITC (fluorescein isothiocyanate, Beckman Coulter), HLA-DR – PE (Beckman Coulter), CD16 – ECD (energy coupled dye, Beckman Coulter), CD36 – FITC (Beckman Coulter), CD163 (klon GHI – PE a klon RM3/1 – PE, Biolegenda). Byly použity dva klony monoklonální protilátky CD163, protože klon GHI značí nativní monocyty, zatímco klon RM3/1 zralé makrofágy. Buňky byly inkubovány s protilátkami 20 minut při laboratorní teplotě v temnu. K měření výše zmíněných molekul byly použity průtokové cytometry Becman Coulter CYTOMICS FC 500 a Cyan ADP DAKO.

14.5

Stanovení solubilní CD14 v supernatantech THP-1 buněk po stimulaci vitamínem D3 metodou ELISA ELISA (z angl. Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) je jedna z nejpoužívanějších

imunologických metod sloužící k detekci specifických protilátek a antigenů. Je založena na imunoenzymatické reakci. V této práci bylo metodou ELISA (R&D Systems) měřeno množství solubilní CD14 v supernatantech THP-1 buněk po stimulaci vitamínem D3. 36

100 μl standardů a 100 μl vzorků, což byly v našem případě supernantanty THP­1 buněk odebíraných v čase 0, 24, 48 a 72 hodin po stimulaci vitamínem D3, bylo napipetováno do protilátkou potažených jamek v 96 jamkové destičce a inkubováno 3 hodiny při laboratorní teplotě v temnu. Poté byla destička několikrát promyta promývacím roztokem, bylo přidáno 200 μl sekundární protilátky s navázaným konjugátem a inkubováno 1 hodinu v temnu. Destička byla opět několikrát promyta, poté bylo přidáno 200 μl substrátu a destička byla inkubována 30 min v temnu. Po uplynutí této doby bylo do každé jamky napipetováno 50 μl stop roztoku. Absorbance byla odečtena na spektrofotometru při vlnové délce 450 nm a referenční vlnové délce 540 nebo 570 nm.

14.6

Stanovení IL-8 v supernatantech THP-1 buněk po stimulaci vitamínem D3 metodou Luminex Metodou Luminex (R&D Systems) bylo měřeno množství IL-8 (Interleukin 8)

v supernatatentech THP-1 buněk. IL-8 je chemoatraktant, který působí na adherenci a migraci buněk. Je to produkt celé řady buněk a má antivirové účinky. Metoda Luminex je založená na přítomnosti mikropartikulí. Každá mikropartikule je potažená protilátkou proti antigenu, který chceme ve vzorku detekovat. V našem případě byly použity mikropartikule s anti-IL-8 protilátkou. Do 96 jamkové destičky bylo napipetováno po 50 μl vzorků, což byly v našem případě supernatanty THP-1 buněk odebíraných v čase 0, 24, 48 a 72 hod po stimulaci vitamínem D 3 a supernatanty THP-1 buněk po stimulaci vitamínem D3 a LPS (lipopolysaccharides). LPS (Escherichia coli, Sigma­Aldrich) byl k buňkám přidat v koncentraci 100 ng/ml. Dále bylo do destičky napipetováno po 50 μl standardů a do každé jamky bylo přidáno po 50 μl mikropartikulí. Poté, co došlo k 3 hodinové inkubaci destičky překryté fólií při laboratorní teplotě, byla odsáta tekutina vakuovou pumpou a destička byla několikrát promyta promývacím roztokem. Do každé jamky bylo přidáno po 50 μl sekundární protilátky s navázaným s biotinem. Poté došlo k 1 hodinové inkubaci destičky překryté fólií. V dalším kroku byla destička opět několikrát promyta promývacím roztokem na vakuové pumpě a bylo přidáno po 50 μl streptavidin – PE. Streptavidin – PE se váže na biotin konjugovaný se sekundární protilátkou. Po půlhodinové inkubaci byla destička promyta promývacím 37

roztokem na vakuové pumpě a naše vzorky byly resuspendovány se 100 μl promývacím roztokem. Poté, co byly vzorky přepipetovány na měřící destičku, byla destička změřena na přístroji Luminex. Každá skupina mikropartikulí má jinou intenzitu fluorescence, proto jsme schopni touto metodou měřit množství až několik desítek cytokinů najednou.

14.7

Posouzení vlivu vitamínu D3 na životnost THP-1 buněk Pro posouzení vlivu vitamínu D3 na životnost THP-1 buněk byl k buňkám přidán

propidium jodid a k rozlišení časně a pozdně apoptotických THP-1 buněk byly buňky značeny Annexinem V – FITC a 7-AAD (7-aminoaktinomycin).

14.7.1

Stanovení živých a mrtvých THP-1 buněk po stimulaci vitamínem D3 na základě průniku propidium jodidu do buněk

Propidium jodid je fluorescenční barvička hojně využívaná jednak v průtokové cytometrii, k posouzení viability buněk nebo v mikroskopii ke značení jader. Propidium jodid se interlakuje s malou nebo žádnou preferencí mezi báze nukleových kyselin. Propidium jodid je permanentně vylučován z živých buněk, a tak můžeme rozlišit živé buňky od mrtvých buněk. K THP-1 buňkám po stimulaci vitamínem D3 bylo přidáno 10 μl propidium jodidu. Vzorky s propidium jodidem byly 20 minut inkubovány při laboratorní teplotě v temnu a poté změřeny na průtokovém cytometru podle standardního protokolu.

14.7.2

Rozlišení časně a pozdně apoptotických THP-1 buněk po stimulaci vitamínem D3 pomocí Annexinu V

Pro zjištění toho, zda naše nejvyšší použitá koncentrace vitamínu D3 (c = 1000 nM) není pro buňky toxická, byla měřena životnost buněk po stimulaci vitamínem D3 na přístroji Vi­cell, který nám rozliší mrtvé a živé buňky. Tato metoda je založena na průniku trypanové modři pouze do mrtvých buněk, které nejsou schopné tuto barvičku vyloučit ven z buňky. Také byly buňky značeny propidium jodidem. 38

Tyto dvě metody nám ale nedokáží rozlišit časně apoptotické a pozdně apoptotické buňky. Proto jsme buňky označili Annexinem V – FITC a 7-AAD, které nám detekují časně a pozdně apoptotické buňky. Annexin se váže na fosfatidylserin, což je fosfolipid, který se normálně nachází na vnitřní straně plazmatické membrány. Pokud se buňka dostane do apoptózy, fosfatidylserin se dostává na vnější stranu membrány a buňka se tak stává „chutnější“ pro makrofágy. 7-AAD je fluorescenční chemická sloučenina s velkou afinitou pro DNA. 7-AAD neprochází skrz membránu, proto značí DNA jen u buněk s porušenou cytoplazmatickou membránou, jako jsou například nekrotické buňky. Živé buňky na sebe neváží Annexin V ani 7-AAD. Buňky, které na sebe váží Annexin V, jsou časně apoptotické a buňky, které na sebe váží Annexin V a zároveň i 7-AAD jsou pozdně apoptotické. V prvním kroku došlo k promytí buněk ledově chlazeným PBS a buňky byly centrifugovány 5 min při 500 × g při 4 °C. Buněčná peleta byla resuspendována v ledově vychlazeném Binding Bufferu na koncentraci 5 × 10 6 – 10 × 106 buněk/ml. 100 μl analyzované buněčné suspenze bylo napipetováno do zkumavek obsahujících 10 μl Annexinu V – FITC a 20 μl 7-AAD. Došlo k 15 min inkubaci v temnu a na ledu. V posledním kroku bylo do každé zkumavky přidáno 400 μl ledově chlazeného Binding Bufferu a vortexováno. Binding Buffer obsahuje Ca+2 ionty nezbytné pro navázání Annexinu na buňky. Do půl hodiny byly vzorky změřeny na průtokovém cytometru podle standardního protokolu.

14.8

Statistika Pro statistické vyhodnocení bylo využito testu ANOVA (one way analysis of variance)

a pro srovnání jednotlivých skupin s kontrolní skupinou byla použita Dunnettova metoda.

39

15 Výsledky 15.1

Exprese CD14 u THP-1 buněk po stimulaci vitamínem D3 Graf 1 Na prvním grafu je patrné, že pokud byly THP-1 buňky stimulovány vyššími

koncentracemi vitamínu D 3, tj. 10 nM, 100 nM a 1000 nM, došlo k výraznému nárůstu exprese CD14. Koncentrace 0,1 nM vitamínu D3 neměla na buňky žádný vliv­je srovnatelná s kontrolou. Ve 24 hod je už patrný nárůst intenzity fluorescence CD14 po stimulaci následujících koncentrací vitamínu D3 – 10 nM (p < 0,01)**, 100 nM (p < 0,01)** a 1000 nM (p < 0,001)***. V čase 48 hod byla exprese po stimulaci 100 nM a 1000 nM ještě vyšší (p < 0,05)* a nejvyšší exprese CD14 byla dosažena po stimulaci 10 nM (p < 0,05)*, 100 nM (p < 0,01)** a 1000 nM (p < 0,05)* v čase 72 hod. U kontroly a koncentrace 0,1 nM vitamínu D 3 se exprese CD14 s rostoucím časem změnšuje. Dochází tak ke zrání buněk a s tím související ztrátě exprese CD14. Vyšší koncentrace vitamínu D 3 udržují expresi CD14. Exprese CD14 – FITC byla měřena na průtokovém cytometru. Směrodatné odchylky byly vypočítány z triplikátu.

Nárůst exprese CD14 u THP-1 buněk po stimulaci vitamínem D 3 120

x mean CD14

100 80 v čase 0 hod

60

v čase 24 hod v čase 48 hod

40

v čase 72 hod 20 0 kontrola

0,1

1

10

koncentrace vitamínu D3 [nM]

40

100

1000

15.2

Exprese CD14 u monocytů po stimulaci vitamínem D3 Graf 2 Pro porovnání toho, zda má vitamín D3 podobný vliv na expresi CD14

u monocytů z lidské periferní krve jako u THP-1 buněk, byla také u nich měřena míra exprese CD14 po stimulaci pěti koncentracemi vitamínu D3. S rostoucím časem rostla exprese CD14. Na zvýšení exprese CD14 měly největší vliv menší koncentrace vitamínu D3 než u THP-1 buněk, a to 1 nM a 10 nM. Nejvyšší exprese byla dosažena rovněž v čase 72 hod. Nejvyšší dosažená hodnota x meanu CD14 byla téměř 300. U THP-1 buněk byla hodnota x meanu CD14 téměř 80. Přesto, že je z grafu patrné, že koncentrace 1 nM a 10 nM zvyšují expresi CD14 u monocytů z lidské periferní krve, tento rozdíl není statisticky významný. I když všechny tři provedené pokusy vycházely podobně, data obsahují velké směrodatné odchylky. Je to pravděpodobně tím, že byla použita krev od tří různých dárců. Exprese CD14 – FITC byla měřena na průtokovém cytometru. Směrodatné odchylky byly vypočítány z triplikátu.

Nárůst exprese CD14 u monocytů po stimulaci vitamínem D 3 400,00 350,00

x mean CD14

300,00 250,00 v čase 0 hod

200,00

v čase 24 hod

v čase 48 hod

150,00

v čase 72 hod 100,00 50,00

0,00 kontrola

0,1

1

10

koncentrace vitamínu D3 [nM]

41

100

1000

15.3

Exprese CD54 u THP-1 buněk po stimulaci vitamínem D3 Graf 3 V grafu 3 je znázorněna míra exprese CD54 po stimulaci vitamínem D 3.

Koncentrace 0,1 nM neměla na buňky žádný vliv - je srovnatelná s kontrolou. Pokud byly THP-1 buňky stimulovány vyššími koncentracemi vitamínu D3 (10 nM, 100 nM a 1000 nM), došlo k nárůstu exprese CD54. V čase 24 hod rostla exprese CD54 po stimulaci 10 nM (p < 0,05)*, 100 nM (p < 0,01)** a 1000 nM (p < 0,001)***. Nejvyšší míra exprese byla dosažena v čase 48 hod po stimulaci 100 nM a 1000 nM. Tady jsou ale veliké směrodatné odchylky, a tudíž je to statisticky nevýznamné. V čase 72 hod exprese CD54 opět poklesla, ale stále byl patrný významný rozdíl mezi kontrolou a koncentracemi 100 nM (p < 0,05)* a 1000 nM (p < 0,01)**. Exprese CD54­PE byla měřena na průtokovém cytometru. Směrodatné odchylky byly vypočítány z triplikátu.

Nárůst exprese CD54 u THP-1 buněk po stimulaci vitamínem D 3 25,00

x mean CD54

20,00

15,00 v čase 0 hod v čase 24 hod 10,00

v čase 48 hod v čase 72 hod

5,00

0,00 kontrola

0,1

1 10 100 koncentrace vitamínu D3 [nM]

42

1000

15.4

Exprese CD54 u monocytů po stimulaci vitamínem D3 Graf 4 U monocytů z lidské periferní krve byl rozdíl v expresi CD54 po stimulaci

vitamínem D 3 fyziologicky nevýznamný. Nejvyšší dosažená hodnota x meanu CD54 byla téměř 80. To je přibližně pětkrát více než nejvyšší hodnota x meanu CD54 dosažená u THP-1 buněk. Exprese CD54 – PE byla měřená na průtokovém cytometru. Směrodatné odchylky byly vypočítány z triplikátu.

Exprese CD54 u monocytů po stimulaci vitamínem D 3 120,00

100,00

x mean CD54

80,00

v čase 0 hod

60,00

v čase 24 hod v čase 48 hod

40,00

v čase 72 hod

20,00

0,00 kontrola

0,1

1 10 100 koncentrace vitamínu D3 [nM]

43

1000

15.5

Exprese HLA-DR u THP-1 buněk po stimulaci vitamínem D3 Graf 5 Na grafu 5 je znázorněna intenzita fluorescence HLA-DR u THP-1 buněk

po stimulaci pěti koncentracemi vitamínu D3 v čase 72 hod. Nebyla pozorována žádná změna v expresi HLA-DR po stimulaci vitamínem D3. Exprese se neměnila ani v průběhu času. Exprese HLA-DR - PE byla měřena na průtokovém cytometru. Tento pokus byl proveden třikrát, pokaždé se stejnými výsledky.

X Mean HLADR

44

Kontrola v čase 0

2,21

Kontrola v čase 72 hod

2,16

0,1 nM v čase 72 hod

1,88

1 nM v čase 72 hod

2,07

10 nM v čase 72 hod

1,97

100 nM v čase 72 hod

1,76

1000 nM v čase 72 hod

2,45

15.6

Exprese HLA-DR u monocytů po stimulaci vitamínem D3 Graf 6 Na grafu 6 je znázorněna intenzita fluorescence HLA-DR u monocytů

z periferní lidské krve po stimulaci pět koncentracemi vitamínu D 3. Monocyty z lidské periferní krve vykazovaly v čase 0, tj v čase izolace z plné krve, nízkou expresi HLA-DR. V čase 72 hod se exprese zvýšila, ale zdá se, že vitamín D 3 na zvýšení exprese neměl žádný vliv. Kontrola je srovnatelná se vzorkem, kde byly buňky stimulovány nejvyšší použitou koncentraci (1000 nM). Exprese HLA-DR – PE byla měřena na průtokovém cytometru. Tento pokus byl proveden třikrát, pokaždé se stejnými výsledky. X Mean HLADR

45

Kontrola v čase 0

2,35

Kontrola v čase 72 hod

18,71

0,1 nM v čase 72 hod

9,85

1 nM v čase 72 hod

10,53

10 nM v čase 72 hod

10,18

100 nM v čase 72 hod

10,93

1000 nM v čase 72 hod

14,01

15.7

Exprese

CD16 a CD36 u THP-1 buněk po stimulaci

vitamínem D3 Graf 7 Na následujích dvou obrázcích je znázorněna intenzita fluorescence CD16 a CD36 u THP-1 buněk po stimulaci pěti koncentracemi vitamínu D3 v čase 72 hod. THP-1 buňky byly negativní na expresi CD16 (A) a vykazovaly velmi nízkou expresi CD36 (B). Exprese CD16 ani CD36 se nezměnila po stimulaci vitamínem D3. Exprese CD16 – ECD a CD36 – FITC byla měřena na průtokovém cytometru. Tento pokus byl proveden třikrát, pokaždé se stejnými výsledky.

A X Mean CD16 Kontrola v čase 0

0,38

Kontrola v čase 72 hod

0,25

0,1 nM v čase 72 hod

0,23

1 nM v čase 72 hod

0,20

10 nM v čase 72 hod

0

100 nM v čase 72 hod

0

1000 nM v čase 72 hod

0

B X Mean CD36

46

Kontrola v čase 0

2,49

Kontrola v čase 72 hod

1,92

0,1 nM v čase 72 hod

1,84

1 nM v čase 72 hod

1,60

10 nM v čase 72 hod

1,90

100 nM v čase 72 hod

2,00

1000 nM v čase 72 hod

2,22

15.8

Exprese

CD16

a

CD36

u

monocytů

po stimulaci

vitamínem D3 Graf 8 Na následujích dvou obrázcích je znázorněna intenzita fluorescence CD16 a CD36 u monocytů z lidské periferní krve po stimulaci pěti koncentracemi vitamínu D 3 v čase 72 hod. Monocyty vykazovaly velmi nízkou expresi CD16 (A) podobně jako THP-1 buňky. Exprese CD16 se nezměnila po stimulaci vitamínem D 3. Naproti tomu měly monocyty z periferní krve výrazně vyšší expresi CD36 (B) než THP-1 buňky. Zdá se, že vitamín D3 neměl na expresi CD36 rovněž žádný vliv. Exprese CD16 – ECD a CD36 – FITC byla měřena na průtokovém cytometru. Tento pokus byl proveden třikrát, pokaždé se stejnými výsledky. A X Mean CD16 Kontrola v čase 0

4,11

Kontrola v čase 72 hod

2,67

0,1 nM v čase 72 hod

4,54

1 nM v čase 72 hod

1,54

10 nM v čase 72 hod

1,07

100 nM v čase 72 hod

3,97

1000 nM v čase 72 hod

1,00

B X Mean CD36

47

Kontrola v čase 0

109,26

Kontrola v čase 72 hod

52,19

0,1 nM v čase 72 hod

131,95

1 nM v čase 72 hod

90,81

10 nM v čase 72 hod

100,09

100 nM v čase 72 hod

125,12

1000 nM v čase 72 hod

88,19

15.9

Exprese CD163 u THP-1 buněk po stimulaci vitamínem D3 Graf 9 Na dolních dvou obrázcích vidíme expresi CD163 u THP-1 buněk v čase

72 hod. Buňky byly stimulovány pěti koncentracemi vitamínu D3. K detekci exprese CD163 byly použity dva klony monoklonální protilátky, a to CD163 (GHI) a CD163 (RM3/1). První dolní obrázek (A) znázorňuje míru exprese CD163 (GHI). Druhý obrázek (B) znázorňuje míru exprese CD163 (RM3/1). THP-1 buňky neexprimovaly vůbec nebo velmi slabě CD163. Vitamín D3 expresi CD163 neovlivnil. Exprese CD163­PE byla měřena na průtokovém cytometru. Tento pokus byl proveden třikrát, pokaždé se stejnými výsledky. A X Mean CD163 (GHI) Kontrola v čase 0

0,38

Kontrola v čase 72 hod

0,45

0,1 nM v čase 72 hod

0,27

1 nM v čase 72 hod

0

10 nM v čase 72 hod

0

100 nM v čase 72 hod

0

1000 nM v čase 72 hod

0

B X Mean CD163 (RM3/1)

48

Kontrola v čase 0

1,14

Kontrola v čase 72 hod

1,37

0,1 nM v čase 72 hod

0,79

1 nM v čase 72 hod

1,23

10 nM v čase 72 hod

1,30

100 nM v čase 72 hod

1,23

1000 nM v čase 72 hod

1,33

15.10

Exprese CD163 u monocytů po stimulaci vitamínem D3

Graf 10 Na dalších dvou obrázcích je znázorněna exprese CD163 u monocytů z periferní lidské krve v čase 72 hod po stimulaci pěti koncentracemi vitamínu D 3. K detekci CD163 byly rovněž použity dva klony monoklonální protilátky, CD163 (GHI) a CD163 (RM3/1). V prvním obrázku (A) vidíme nízkou expresi CD163 (GHI), ale exprese je vyšší než u THP-1 buněk. Exprese CD163 (RM3/1) je podstatně vyšší než CD163 (GHI) (B). Klon RM3/1 se narozdíl od klonu GHI váže na zralé makrofágy. To by odpovídalo tomu, že v čase 72 hod byla u buněk exprese vyšší než v čase 0, tj. v čase izolace z plné krve. Ani v jednom případě vitamín D3 pravděpodobně expresi neovlivnil. Exprese CD163 – PE byla měřena na průtokovém cytometru. Tento pokus byl proveden třikrát, pokaždé se stejnými výsledky. A X Mean CD163 (GHI) Kontrola v čase 0

4,42

Kontrola v čase 72 hod

5,49

0,1 nM v čase 72 hod

9,77

1 nM v čase 72 hod

2,94

10 nM v čase 72 hod

2,84

100 nM v čase 72 hod

8,07

1000 nM v čase 72 hod

3,10

B X Mean CD163 (RM3/1)

49

Kontrola v čase 0

6,37

Kontrola v čase 72 hod

17,82

0,1 nM v čase 72 hod

30,97

1 nM v čase 72 hod

20,64

10 nM v čase 72 hod

25,79

100 nM v čase 72 hod

18,21

1000 nM v čase 72 hod

27,80

15.11

Změny

v expresi

CD14

po

stimulaci vitamínem

D3

u přisedlých a nepřisedlých THP-1 buněk Graf 11 THP-1 buňky jsou buňky, které rostou v suspenzi - nepřisedají. Malé procento buněk v průběhu pokusů přisedlo na dno destičky. Počet přisedlých buněk byl ale stejný u kontrol i u buněk s přidaným vitamínem D3. To, že malé procento buněk přisedlo, se dělo pravděpodobně kvůli přenosu buněk z kultivační láhve do destičky. Nebylo pozorováno, že by vitamín D3 u buněk indukoval adherenci. Tyto přisedlé buňky se ale mohly lišit expresí CD14 od buněk, které nepřisedly. Z tohoto důvodu byla u těchto přisedlých buněk měřena exprese CD14. THP-1 buňky byly stimulovány dvěma vybranými koncentracemi vitamínu D3, a to 10 nM a 1000 nM. V grafu jsou znázorněny exprese CD14 v čase 72 hod. Žádné změny v expresi CD14 u nepřisedlých (A) a přisedlých (B) buněk pozorovány nebyly. Exprese CD14 – FITC byla měřena na průtokovém cytometru. Tento pokus byl proveden dvakrát, pokaždé se stejnými výsledky. A Kontrola v čase 0 Kontrola v čase 72 hod 10 nM v čase 72 hod 1000 nM v čase 72 hod

X Mean CD14 10,08 17,40 41,67 66,53

Kontrola v čase 0 Kontrola v čase 72 hod 10 nM v čase 72 hod 1000 nM v čase 72 hod

X Mean CD14 9,91 11,94 33,83 69,50

B

50

15.12

Množství sCD14 u THP-1 buněk po stimulaci vitamínem D3

Graf 12 Pro zjištění toho, zda zvýšená exprese CD14 u THP-1 buněk po stimulaci vyššími koncentracemi vitamínu D3 koreluje i se zýšeným množstvím solubilní CD14, bylo měřeno množství sCD14 v supernatantech THP-1 buněk. THP-1 buňky byly stimulovány pěti různými koncentracemi vitamínu D3 (c = 0,1 nM; 1 nM; 10 nM; 100 nM a 1000 nM) a v časech 0, 24, 48 a 72 hod byly odebírány supernatanty, ve kterých byla metodou ELISA měřena koncentrace sCD14. Z grafu 12 je zřejmé, že se vzrůstající koncentrací vitamínu D3 významně vzrůstá koncentrace solubilní CD14. Koncentrace sCD14 je nejvyšší v supernatantech buněk po stimulaci vitamínem D3 v čase 72 hodin. Potvrdilo se, že stimulace vitamínem D3 má za následek jednak zvýšení exprese povrchové CD14, tak i zvýšení množství solubilní CD14. Směrodatné odchylky byly vypočítány z triplikátu. V čase 24, 48 a 72 hod po stimulaci vitamínem D3 (c = 10 nM, 100 nM a 1000 nM) je p < 0,001***.

16000000

Nárůst množství sCD14 u THP-1 buněk po stimulaci vitamínem D3

koncentrace sCD14 [ρg/ml]

14000000 12000000

v čase 0 hod v čase 24 hod

10000000 8000000

v čase 48 hod v čase 72 hod

6000000 4000000

2000000 0 kontrola

0,1

1

10

koncentrace vitamínu D3 [nM]

51

100

1000

15.13

Množství IL-8 u THP-1 buněk po stimulaci vitamínem D3

Graf 13 THP-1 buňky byly stimulovány pěti různými koncentracemi vitamínu D3 (c = 0,1 nM; 1 nM; 10 nM; 100 nM a 1000 nM) a v časech 0, 24, 48 a 72 hod byly odebírány supernatanty, ve kterých byla metodou Luminex měřena koncentrace IL-8. Se vzrůstající koncentrací vitamínu D3 rostlo množství IL-8 v supernatantech THP-1 buněk. V čase 24 hod je patrný významný rozdíl mezi kontrolou a koncentracemi 10 nM (p < 0,01)**, 100 nM (p < 0,01)**, a 1000 nM (p < 0,001)***. Nejvyššího množství IL-8 bylo dosaženo v čase 48 hod po stimulaci 100 nM (p < 0,05)* a 1000 nM (p < 0,01)**. Poté množství IL-8 kleslo. Navzdory poklesu v čase 72 hod je stále znát rozdíl mezi kontrolou a koncentracemi 100 nM (p < 0,05)* a 1000 nM (p < 0,05)*. Směrodatné odchylky byly vypočítány z dubletu.

900

Nárůst množství IL-8 u THP-1 buněk po stimulaci vitamínem D3

koncentrace IL-8 [ρg/ml]

v čase 0 hod 800

v čase 24 hod

700

v čase 48 hod v čase 72 hod

600 500 400 300 200 100 0 kontrola

0,1

1

10

koncentrace vitamínu D3 [nM]

52

100

1000

15.14

Množství IL-8 u THP-1 buněk po stimulaci vitamínem D3 a lipopolysacharidem

Graf 14 Z našich výsledků z předchozího grafu (graf 13) jsme došli k závěru, že vyšší koncentrace vitamínu D3 stimulují produkci IL-8. Ví se, že LPS stimuluje produkci IL-8. V tomto experimentu jsme chtěli zjistit, zda LPS spolu s vitamínem D3 stimuluje produkci IL-8 a zda je množství IL-8 větší než v případě samotné stimulace LPS. THP-1 buňky byly stimulovány nejdříve samotným LPS a poté naráz LPS a dvěma koncentracemi vitamínu D3 (10 nM a 1000 nM). V čase 0, 24, 48 a 72 hod byly odebírány supernatanty. Množství IL-8 bylo měřeno metodou Luminex. Samotný LPS výrazně zvýšil množství IL-8 v čase 24 hod (p < 0,01)** a v čase 48 hod (p < 0,05)*. Nejvyššího množství bylo dosaženo v čase 48 hodin. Jestliže byly buňky stimulovány lipopolysacharidem a zároveň koncentrací 10 nM (p < 0,01)** nebo 1000 nM (p < 0,001)*** vitamínu D3, množství IL-8 bylo v čase 24 hod výrazněji vyšší než v případě samotného LPS. Koncentrace 1000 nM vitamínu D 3 spolu s LPS zvýšila výrazněji více množství IL-8 než koncentrace 10 nM s LPS. Nejvyššího množství IL-8 bylo dosaženo po stimulaci LPS + 10 nM (p < 0,001)*** a LPS + 1000 nM (p < 0,001)*** v čase 48 hod. V čase 72 hod bylo množství IL-8 nejvyšší po stimulaci 1000 nM + LPS (p < 0,05)*, ale bylo výrazně nižší než v čase 48 hod. Směrodatné odchylky byly vypočítány z dubletu. Koncentrace přidaného LPS byla 100 ng/ml.

Nárůst množství IL-8 u THP-1 buněk po stimulaci vitamínem D 3 a LPS 4000

koncentrace IL-8 [ρg/ml]

3500 3000

v čase 0 v čase 24 v čase 48

2500

v čase 72

2000 1500 1000 500 0 kontrola

LPS 10 +LPS koncentrace vitamínu D3 [nM]

53

1000 +LPS

15.15

Rozdělení živých a mrtvých THP-1 buněk po stimulaci vitamínem D3 na základě průniku propidium jodidu do buněk

Graf 15 Pro posouzení toho, zda nejvyšší použité koncentrace vitamínu D3 mají nebo nemají vliv na životnost THP-1 buněk, byly buňky označeny propidium jodidem (PI). Na průtokovém cytometru byla posléze měřena intenzita fluorescence PI. Vlevo dole vidíme rozdělení THP-1 buněk na základě FS × SS v čase 0. Buňky ve skupině F představují živé buňky a buňky ve skupině G mrtvé (A). Na pravém obrázku vidíme intenzitu fluorescence propidium jodidu u všech buněk. V čase 0 bylo okolo 11 % buněk pozitivních na PI, tedy buněk, které nebyly schopné vyloučit PI, protože měly porušenou cytoplatmatickou membránu (B). Tento experiment byl proveden třikrát, pokaždé se stejnými výsledky.

A

B

54

Graf 16 Na dolních dvou obrázcích je kontrolní skupina buněk v čase 72 hod. Na prvním obrázku jsou THP-1 buňky rozdělené na základě FS × SS (A). Na druhém obrázku vidíme 8,20 % buněk pozitivních na PI (B). Tento experiment byl proveden třikrát, pokaždé se stejnými výsledky.

A

B

55

Graf 17 Zde vidíme THP-1 buňky v čase 72 hod po stimulaci nejvyšší použitou koncentraci vitamínu D3 (1000 nM). Na levém obrázku jsou buňky rozdělené na základě FS × SS (A) a na pravém je znázorněna intenzita fluorescence PI u buněk po stimulaci 1000 nM (B). Není patrný žádný výrazný rozdíl v průniku PI do buněk mezi kontrolou a vzorkem, kde byly buňky stimulovány nejvyšší použitou koncentrací vitamínu D3. Tento experiment byl proveden třikrát, pokaždé se stejnými výsledky.

A

B

56

15.16

Časně a pozdně apoptotické THP-1 buňky po stimulaci vit.D3

Graf 18 Dolní dva obrázky představují THP-1 buňky v čase 0, kde nalevo jsou buňky rozdělené na základě FS × SS a kde buňky ze skupiny A představují živé buňky (A). Tyto buňky pak jsou pak vpravo rozděleny na časně a pozdně apoptotické buňky (B). Buňky ve skupině N3 jsou živé – nevážou na sebe Annexin ani nejsou 7­AAD pozitivní. Buňky ve skupině N4 jsou pozitivní na Annexin – jsou to buňky časně apoptotické. Buňky ve skupině N2 mají porušenou cytoplazmatickou membránu, tudíž jsou pozitivní jak na Annexin, tak na 7-AAD, který tak může procházet skrz membránu a vázat se na DNA. Tyto buňky jsou pozdně apoptotické. Buňky pozitivní pouze na 7-AAD (skupina N1) jsou nekrotické. V čase 0 máme 1 % časně apoptotických buněk a 0,2 % pozdně apoptotických buněk. Tento experiment byl proveden dvakrát, pokaždé se stejnými výsledky. A

B

ča

57

Graf 19 Na levém obrázku vidíme THP-1 buňky rozdělené na základě FS × SS v čase 72 hod (A). Buňky ze skupiny A jsou napravo rozdělené na časně a pozdně apoptotické buňky (B). Tento experiment byl proveden dvakrát, pokaždé se stejnými výsledky.

A

B

J

58

Graf 20 Zde jsou THP-1 buňky po stimulaci 1000 nM v čase 72 hod. Není patrný žádný rozdíl v rozdělení časně a pozdně apoptotických buněk po působení nejvyšší použité koncentraci vitamínu D 3. Vlevo jsou buňky rozdělené na základě FS × SS (A) a vpravo jsou buňky ze skupiny A rozdělené na časně a pozdně apoptotické buňky (B).

A

B

59

16 Diskuze Vitamín D3 má řadu imunomodulačních účinků. Proto bylo cílem naší práce posouzení vlivu vitamínu D 3 na dva vybrané typy buněk, a to na THP-1 buňky a monocyty izolované z lidské periferní krve. Posuzovanými znaky byla exprese několika vybraných povrchových markerů (CD54, CD14, HLA-DR, CD16, CD36 a CD163), produkce solubilní CD14 a IL-8 u THP-1 buněk a vliv vitamínu D 3 na životnost THP-1 buněk. V roce 1996 bylo publikováno, že vitamín D3 u THP-1 buněk zvyšuje expresi CD14 a že THP-1 buňky pod vlivem vitamínu D3 neadherují (Schwende et. al 1996). Naše práce toto potvrdila. Ke stimulaci buněk bylo použito pět různých koncentrací vitamínu D3 (c = 0,1 nM; 1 nM; 10 nM; 100 nM a 1000 nM). V našich experimentech došlo v čase 24 hod po působení vyšších koncentrací vitamínu D3 k menšímu nárůstu exprese CD14, která se výrazně zvýšila v čase 48 a 72 hod. Mezi časy 48 a 72 hod nebyl ve zvýšení expresi CD14 výrazný rozdíl, a proto je pravděpodobné, že by v čase 96 hod nedošlo k dalšímu velkému zvýšení exprese. Z našich výsledků je patrné, že vitamín D3 působí až ve vyšších koncentracích, protože nejmenší použitá koncentrace (c = 0,1 nM) byla srovnatelná s kontrolou. Koncentrace 1 nM zvýšila velmi málo expresi CD14, ale až od koncentrace 10 nM a dál byl rozdíl statisticky významný. THP-1 buňky jsou suspenzní buňky, ale v průběhu pokusů existovalo malé procento buněk, které přisedlo na dno destičky. Vitamín D3 neměl vliv na adherenci THP-1 buněk, protože se tomu dělo i u kontrol. Exprese CD14 byla u těchto přisedlých buněk stejná jako u nepřisedlých. K přisednutí malého počtu buněk mohlo dojít proto, že byly buňky z důvodu pokusu přeneseny z kultivační láhve do jiné destičky. U monocytů z lidské periferní krve zvýšená exprese CD14 po stimulaci vitamínem D3 v naší práci potvrzena nebyla. S rostoucím časem rostla exprese CD14, ale nemůžeme říct, zda na tom měl podíl i vitamín D3. Intenzita fluorescence CD14 byla u všech vzorků mnohem vyšší než u THP-1 buněk. U výsledků jsou ale veliké směrodatné odchylky. Je to pravděpodobně z části i kvůli tomu, že byla použita krev od tří různých dárců a u těchto dárců byla výchozí exprese CD14 vždy trochu jiná. Bylo popsáno, že monocyty tím, jak zrají v DC, ztrácí expresi CD14 a vitamín D3 potlačuje zrání do DC a udržuje expresi CD14 (Berer et al. 2000). Toto v naší práci u monocytů povrzeno nebylo, u THP-1 buněk ano.

60

Dalším cílem naší práce bylo změřit produkci solubilní CD14 v supernatantech THP-1 buněk pod vlivem vitamínu D 3. Pokud totiž pod vlivem vitamínu D3 dochází k indukci exprese CD14, je pravděpodobné, že by mohlo zároveň docházet i k indukci solubilní CD14. V naší práci jsme potvrdili, že se vzrůstající koncentrací vitamínu D3 významně roste produkce solubilní CD14. Množství solubilní CD14 bylo nejvyšší v čase 72 hod po stimulaci nejvyšší použité koncentraci vitamínu D3, tj. 1000 nM. CD14 společně s TLR váže LPS z gram-negativních bakterií, a tak signalizuje přítomnost LPS (Wright et al. 1990). Solubilní forma CD14 zastává signalizační úlohu v případě, že buňka exprimuje málo nebo vůbec žádnou CD14 na svém povrchu (Frey et al. 1992). Na základě našich výsledků je možné říci, že by vitamín D3 mohl hrát klíčovou roli v obraně proti různým infekcím, protože zvyšuje expresi CD14 a velmi silně zvyšuje produkci solubilní CD14. Dalším zkoumaným znakem byla CD54 – intercelulární adhezivní molekula, ICAM. CD54 zprostředkovává buněčnou adhezi vazbou na integriny CD11a/CD18 (LFA-1) a na CD11b/CD18 (Mac-1) (Roebuck and Finnegan 1999). V přítomnosti prozánětlivých cytokinů, virové infekce a při buněčném stresu se exprese CD54 zvyšuje (van de Stolpe and van der Saag 1996). Pokud byly THP-1 buňky stimulovány vyššími koncentracemi vitamínu D3, došlo ke zvýšení exprese CD54. Následkem zvýšené exprese CD54 vlivem vitamínu D3 by tak mohlo docházet k větší efektivnosti v odstranění různých infekcí. Na expresi u monocytů z periferní krve neměl vitamín D3 vliv. Exprese HLA-DR se po stimulaci vitamínem D 3 u THP-1 buněk a monocytů z periferní krve nezměnila. THP-1 buňky vykazovaly žádnou nebo velmi nízkou expresi CD16, CD36 a CD163. Na expresi CD16, CD36 a CD163 neměl vitamín D3 žádný vliv. Je to pravděpodoběně kvůli tomu, že v přítomnosti infekce se nezvyšuje exprese těchto tří znaků a nepodílejí se tak přímo na aktivaci buňky. Monocyty z periferní krve by měly být pozitivní na CD36, což se v našem případě potvrdilo. Podobně jako THP-1 buňky měly nízkou expresi CD16. Byly použity dva klony monoklonální protilátky CD163­GHI a RM3/1, protože jen RM3/1 se váže na zralé makrofágy. Oproti času 0, kdy došlo k izolaci monocytů z periferní krve, měly buňky v čase 72 vyšší expresi CD163 (RM3/1). To by odpovídalo tomu, že došlo s přibývajícím časem ke zrání monocytů. Vitamín D3 tuto expresi neovlivnil.

61

Dalším předpokladem bylo, že by mohl vitamín D 3 u THP-1 buněk zvýšit produkci chemoatraktantu IL-8. Podle našich výsledků vyšší použité koncentrace vitamínu D 3 zvýšily produkci IL-8 u THP-1 buněk. Nejvyšší množství bylo dosaženo v čase 48 hod po stimulaci 100 nM a 1000 nM. Pokud byly THP-1 buňky stimulovány samotným LPS (100 ng/ml), zvýšila se produkce IL-8. Množství IL-8 bylo nejvyšší v čase 48 hod trvání stimulace. Což bylo dokázáno i jinými autory (Wright et al. 1990). Pokud byly THP-1 buňky stimulovány vitamínem D3 spolu s LPS, výrazně stouplo množství IL-8 než v přítomnosti samotného LPS nebo v přítomnosti samotného vitamínu D3. Množství IL-8 bylo nejvyšší v čase 48 hod po stimulaci 1000 nM vitamínu D3 + LPS. Toto je v rozporu s pokusem od jiných autorů, kde byly THP-1 buňky a lidské monocyty stimulovány vitamínem D3 (10 nM, 100 nM a 1000 nM) a o dvě hodiny později LPS (200 ng/ml). V čase 24 a 48 hod byla v supernatantech buněk měřena koncentrace IL-8 metodou ELISA. V jejich pokusu nebyl pozorován žádný vliv vitamínu D3 na množství IL-8 v supernatantech buněk (Kuo et al 2010). Tato práce přispěla k bližšímu poznání účinků vitamínu D 3 na myeloidní linii buněk.

62

17 Závěr Je jisté, že vitamín D3 má v těle řadu dalších funkcí, nejen udržování správného vývoje a růstu kostí. Diplomová práce se zabývala vlivem vitamínu D 3 na expresi několika povrchových molekul u THP-1 buněk a monocytů z lidské periferní krve a na produkci solubilní CD14 a IL-8 u THP-1 buněk. Naše práce potvrdila, že vitamín D3 zvyšuje u THP-1 buněk expresi CD14 a prokázala, že u nich zároveň silně indukuje produkci solubilní CD14. Dále naše práce prokázala vliv vitamínu D3 na zvýšenou expresi CD54 a produkci IL-8 u THP-1 buněk. Všechny tyto molekuly mají důležitou úlohu v boji s různými infekcemi, a proto by podávání vitamínu D3 mohlo výrazně zlepšit efektivitu v tomto boji. Expresi HLA-DR, CD16, CD36 a CD163 vitamín D3 neovlivnil. Neměla by se podceňovat přítomnost deficience vitamínu D3 u spousty lidí na světě. Protože správné podávání vitamínu D3 by tak mohlo přispět kromě léčby křivice i v léčbě různých infekcí, astamatu, kožních a potravinových alergií, RA, SLE i rozstrošené sklerózy.

63

18 Použitá literatura Adams, J. S., S. Ren, P. T. Liu, R. F. Chun, V. Lagishetty, A. F. Gombart, N. Borregaard, R. L. Modlin & M. Hewison (2009) Vitamin d-directed rheostatic regulation of monocyte antibacterial responses. J Immunol, 182, 4289-95. Almerighi, C., A. Sinistro, A. Cavazza, C. Ciaprini, G. Rocchi & A. Bergamini (2009) 1Alpha,25-dihydroxyvitamin D3 inhibits CD40L-induced pro-inflammatory and immunomodulatory activity in human monocytes. Cytokine, 45, 190-7. Anas, A., T. van der Poll & A. F. de Vos (2010) Role of CD14 in lung inflammation and infection. Crit Care, 14, 209. Baeke, F., T. Takiishi, H. Korf, C. Gysemans & C. Mathieu (2010) Vitamin D: modulator of the immune system. Curr Opin Pharmacol, 10, 482-96. Barrera, D., E. Avila, G. Hernández, A. Halhali, B. Biruete, F. Larrea & L. Díaz (2007) Estradiol and progesterone synthesis in human placenta is stimulated by calcitriol. J Steroid Biochem Mol Biol, 103, 529-32. Bazil, V., M. Baudys, I. Hilgert, I. Stefanová, M. G. Low, J. Zbrozek & V. Horejsí (1989) Structural relationship between the soluble and membrane-bound forms of human monocyte surface glycoprotein CD14. Mol Immunol, 26, 657-62. Berer, A., J. Stöckl, O. Majdic, T. Wagner, M. Kollars, K. Lechner, K. Geissler & L. Oehler (2000) 1,25-Dihydroxyvitamin D(3) inhibits dendritic cell differentiation and maturation in vitro. Exp Hematol, 28, 575-83. Bikle, D. (2009) Nonclassic actions of vitamin D. J Clin Endocrinol Metab, 94, 26-34. Bossé, Y., M. Lemire, A. H. Poon, D. Daley, J. Q. He, A. Sandford, J. H. White, A. L. James, A. W. Musk, L. J. Palmer, B. A. Raby, S. T. Weiss, A. L. Kozyrskyj, A. Becker, T. J. Hudson & C. Laprise (2009) Asthma and genes encoding components of the vitamin D pathway. Respir Res, 10, 98. Bouillon, R., F. A. Van Assche, H. Van Baelen, W. Heyns & P. De Moor (1981) Influence of the vitamin D-binding protein on the serum concentration of 1,25dihydroxyvitamin D3. Significance of the free 1,25-dihydroxyvitamin D3 concentration. J Clin Invest, 67, 589-96. Brehm, J. M., J. C. Celedón, M. E. Soto-Quiros, L. Avila, G. M. Hunninghake, E. Forno, D. Laskey, J. S. Sylvia, B. W. Hollis, S. T. Weiss & A. A. Litonjua (2009) Serum vitamin D levels and markers of severity of childhood asthma in Costa Rica. Am J Respir Crit Care Med, 179, 765-71. Brown, J. H., T. S. Jardetzky, J. C. Gorga, L. J. Stern, R. G. Urban, J. L. Strominger & D. C. Wiley (1993) Three-dimensional structure of the human class II histocompatibility antigen HLA-DR1. Nature, 364, 33-9. Burke, R. R., B. A. Rybicki & D. S. Rao (2010) Calcium and vitamin D in sarcoidosis: how to assess and manage. Semin Respir Crit Care Med, 31, 474-84. Bäck, O., H. K. Blomquist, O. Hernell & B. Stenberg (2009) Does vitamin D intake during infancy promote the development of atopic allergy? Acta Derm Venereol, 89, 2832. Carlberg, C., I. Bendik, A. Wyss, E. Meier, L. J. Sturzenbecker, J. F. Grippo & W. Hunziker (1993) Two nuclear signalling pathways for vitamin D. Nature, 361, 657-60. Chen, S., G. P. Sims, X. X. Chen, Y. Y. Gu & P. E. Lipsky (2007) Modulatory effects of 1,25dihydroxyvitamin D3 on human B cell differentiation. J Immunol, 179, 1634-47. Christensen, E. I. & H. Birn (2001) Megalin and cubilin: synergistic endocytic receptors in renal proximal tubule. Am J Physiol Renal Physiol, 280, F562-73. 64

Chun, R. F., A. L. Lauridsen, L. Suon, L. A. Zella, J. W. Pike, R. L. Modlin, A. R. Martineau, R. J. Wilkinson, J. Adams & M. Hewison (2010) Vitamin D-binding protein directs monocyte responses to 25-hydroxy- and 1,25-dihydroxyvitamin D. J Clin Endocrinol Metab, 95, 3368-76. Cleve, H. & J. Constans (1988) The mutants of the vitamin-D-binding protein: more than 120 variants of the GC/DBP system. Vox Sang, 54, 215-25. Cooke, N. E. & E. V. David (1985) Serum vitamin D-binding protein is a third member of the albumin and alpha fetoprotein gene family. J Clin Invest, 76, 2420-4. Cooke, N. E. & J. G. Haddad (1989) Vitamin D binding protein (Gc-globulin). Endocr Rev, 10, 294-307. Cutolo, M. & K. Otsa (2008) Review: vitamin D, immunity and lupus. Lupus, 17, 6-10. Daiger, S. P., M. S. Schanfield & L. L. Cavalli-Sforza (1975) Group-specific component (Gc) proteins bind vitamin D and 25-hydroxyvitamin D. Proc Natl Acad Sci U S A, 72, 2076-80. Ducloux, D., C. Courivaud, J. Bamoulid, A. Kazory, G. Dumoulin & J. M. Chalopin (2008) Pretransplant serum vitamin D levels and risk of cancer after renal transplantation. Transplantation, 85, 1755-9. Dusso, A. S., A. J. Brown & E. Slatopolsky (2005) Vitamin D. Am J Physiol Renal Physiol, 289, F8-28. Edfeldt, K., P. T. Liu, R. Chun, M. Fabri, M. Schenk, M. Wheelwright, C. Keegan, S. R. Krutzik, J. S. Adams, M. Hewison & R. L. Modlin (2010) T-cell cytokines differentially control human monocyte antimicrobial responses by regulating vitamin D metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A, 107, 22593-8. Endemann, G., L. W. Stanton, K. S. Madden, C. M. Bryant, R. T. White & A. A. Protter (1993) CD36 is a receptor for oxidized low density lipoprotein. J Biol Chem, 268, 11811-6. Fabriek, B. O., C. D. Dijkstra & T. K. van den Berg (2005) The macrophage scavenger receptor CD163. Immunobiology, 210, 153-60. Fabriek, B. O., R. van Bruggen, D. M. Deng, A. J. Ligtenberg, K. Nazmi, K. Schornagel, R. P. Vloet, C. D. Dijkstra & T. K. van den Berg (2009) The macrophage scavenger receptor CD163 functions as an innate immune sensor for bacteria. Blood, 113, 887-92. Ferreira, G. B., E. van Etten, K. Lage, D. A. Hansen, Y. Moreau, C. T. Workman, M. Waer, A. Verstuyf, E. Waelkens, L. Overbergh & C. Mathieu (2009) Proteome analysis demonstrates profound alterations in human dendritic cell nature by TX527, an analogue of vitamin D. Proteomics, 9, 3752-64. Frey, E. A., D. S. Miller, T. G. Jahr, A. Sundan, V. Bazil, T. Espevik, B. B. Finlay & S. D. Wright (1992) Soluble CD14 participates in the response of cells to lipopolysaccharide. J Exp Med, 176, 1665-71. Goetz, D. W. (2011) Idiopathic itch, rash, and urticaria/angioedema merit serum vitamin D evaluation: a descriptive case series. W V Med J, 107, 14-20. Gombart, A. F. (2009) The vitamin D-antimicrobial peptide pathway and its role in protection against infection. Future Microbiol, 4, 1151-65. Griffin, M. D., N. Xing & R. Kumar (2003) Vitamin D and its analogs as regulators of immune activation and antigen presentation. Annu Rev Nutr, 23, 117-45.

65

Gutierrez, O., T. Isakova, E. Rhee, A. Shah, J. Holmes, G. Collerone, H. Jüppner & M. Wolf (2005) Fibroblast growth factor-23 mitigates hyperphosphatemia but accentuates calcitriol deficiency in chronic kidney disease. J Am Soc Nephrol, 16, 2205-15. Gynther, P., S. Toropainen, J. M. Matilainen, S. Seuter, C. Carlberg & S. Väisänen (2011) Mechanism of 1α,25-dihydroxyvitamin D(3)-dependent repression of interleukin12B. Biochim Biophys Acta, 1813, 810-8. Hewison, M., L. Freeman, S. V. Hughes, K. N. Evans, R. Bland, A. G. Eliopoulos, M. D. Kilby, P. A. Moss & R. Chakraverty (2003) Differential regulation of vitamin D receptor and its ligand in human monocyte-derived dendritic cells. J Immunol, 170, 538290. Holick, M. F. (2003) Vitamin D: A millenium perspective. J Cell Biochem, 88, 296-307. Holick, M. F. (2007) Vitamin D deficiency. N Engl J Med, 357, 266-81. Hyppönen, E., U. Sovio, M. Wjst, S. Patel, J. Pekkanen, A. L. Hartikainen & M. R. Järvelinb (2004) Infant vitamin d supplementation and allergic conditions in adulthood: northern Finland birth cohort 1966. Ann N Y Acad Sci, 1037, 84-95. Jartti, T., O. Ruuskanen, J. M. Mansbach, T. Vuorinen & C. A. Camargo (2010) Low serum 25-hydroxyvitamin D levels are associated with increased risk of viral coinfections in wheezing children. J Allergy Clin Immunol, 126, 1074-6, 1076.e1-4. Kamboh, M. I. & R. E. Ferrell (1986) Ethnic variation in vitamin D-binding protein (GC): a review of isoelectric focusing studies in human populations. Hum Genet, 72, 28193. Kawakami, M., C. B. Blum, R. Ramakrishnan, R. B. Dell & D. S. Goodman (1981) Turnover of the plasma binding protein for vitamin D and its metabolites in normal human subjects. J Clin Endocrinol Metab, 53, 1110-6. Kreutz, M., R. Andreesen, S. W. Krause, A. Szabo, E. Ritz & H. Reichel (1993) 1,25dihydroxyvitamin D3 production and vitamin D3 receptor expression are developmentally regulated during differentiation of human monocytes into macrophages. Blood, 82, 1300-7. Kuo, Y. T., Kuo, C. H., Lam, K. P., Chu, Y. T., Wang, W. L., Huang, C. H., Hung, C. H. (2010) Effects of vitamin D3 on expression of tumor necrosis factor-alpha and chemokines by monocytes. J Food Sci, 75, H200-4. Lamberg-Allardt, C. (2006) Vitamin D in foods and as supplements. Prog Biophys Mol Biol, 92, 33-8. Lemire, J. M., D. C. Archer, L. Beck & H. L. Spiegelberg (1995a) Immunosuppressive actions of 1,25-dihydroxyvitamin D3: preferential inhibition of Th1 functions. J Nutr, 125, 1704S-1708S. Lemire, J. M. (1995b) Immunomodulatory actions of 1,25-dihydroxyvitamin D3. J Steroid Biochem Mol Biol, 53, 599-602. Levin, A., G. L. Bakris, M. Molitch, M. Smulders, J. Tian, L. A. Williams & D. L. Andress (2007) Prevalence of abnormal serum vitamin D, PTH, calcium, and phosphorus in patients with chronic kidney disease: results of the study to evaluate early kidney disease. Kidney Int, 71, 31-8. Liu, P. T., S. Stenger, H. Li, L. Wenzel, B. H. Tan, S. R. Krutzik, M. T. Ochoa, J. Schauber, K. Wu, C. Meinken, D. L. Kamen, M. Wagner, R. Bals, A. Steinmeyer, U. Zügel, R. L. Gallo, D. Eisenberg, M. Hewison, B. W. Hollis, J. S. Adams, B. R. Bloom & R. L. Modlin (2006a) Toll-like receptor triggering of a vitamin D-mediated human antimicrobial response. Science, 311, 1770-3. 66

Liu, S., W. Tang, J. Zhou, J. R. Stubbs, Q. Luo, M. Pi & L. D. Quarles (2006b) Fibroblast growth factor 23 is a counter-regulatory phosphaturic hormone for vitamin D. J Am Soc Nephrol, 17, 1305-15. Lou, Y. R., F. Molnár, M. Peräkylä, S. Qiao, A. V. Kalueff, R. St-Arnaud, C. Carlberg & P. Tuohimaa (2010) 25-Hydroxyvitamin D(3) is an agonistic vitamin D receptor ligand. J Steroid Biochem Mol Biol, 118, 162-70. Louis, S., C. A. Dutertre, L. Vimeux, L. Fery, L. Henno, S. Diocou, S. Kahi, C. Deveau, L. Meyer, C. Goujard & A. Hosmalin (2010) IL-23 and IL-12p70 production by monocytes and dendritic cells in primary HIV-1 infection. J Leukoc Biol, 87, 645-53. Malabanan, A., I. E. Veronikis & M. F. Holick (1998) Redefining vitamin D insufficiency. Lancet, 351, 805-6. Malley, R. C., H. K. Muller, M. Norval & G. M. Woods (2009) Vitamin D3 deficiency enhances contact hypersensitivity in male but not in female mice. Cell Immunol, 255, 33-40. Mayer, A., S. Lee, F. Jung, G. Grütz, A. Lendlein & B. Hiebl (2010) CD14+ CD163+ IL-10+ monocytes/macrophages: Pro-angiogenic and non pro-inflammatory isolation, enrichment and long-term secretion profile. Clin Hemorheol Microcirc, 46, 217-23. Meyer, M. B., P. D. Goetsch & J. W. Pike (2010) A downstream intergenic cluster of regulatory enhancers contributes to the induction of CYP24A1 expression by 1alpha,25-dihydroxyvitamin D3. J Biol Chem, 285, 15599-610. Miyamoto, K., M. Ito, M. Kuwahata, S. Kato & H. Segawa (2005) Inhibition of intestinal sodium-dependent inorganic phosphate transport by fibroblast growth factor 23. Ther Apher Dial, 9, 331-5. Nykjaer, A., D. Dragun, D. Walther, H. Vorum, C. Jacobsen, J. Herz, F. Melsen, E. I. Christensen & T. E. Willnow (1999) An endocytic pathway essential for renal uptake and activation of the steroid 25-(OH) vitamin D3. Cell, 96, 507-15. Oberg, F., J. Botling & K. Nilsson (1993) Functional antagonism between vitamin D3 and retinoic acid in the regulation of CD14 and CD23 expression during monocytic differentiation of U-937 cells. J Immunol, 150, 3487-95. Overbergh, L., B. Decallonne, D. Valckx, A. Verstuyf, J. Depovere, J. Laureys, O. Rutgeerts, R. Saint-Arnaud, R. Bouillon & C. Mathieu (2000a) Identification and immune regulation of 25-hydroxyvitamin D-1-alpha-hydroxylase in murine macrophages. Clin Exp Immunol, 120, 139-46. Overbergh, L., B. Decallonne, M. Waer, O. Rutgeerts, D. Valckx, K. M. Casteels, J. Laureys, R. Bouillon & C. Mathieu (2000b) 1alpha,25-dihydroxyvitamin D3 induces an autoantigen-specific T-helper 1/T-helper 2 immune shift in NOD mice immunized with GAD65 (p524-543). Diabetes, 49, 1301-7. Penna, G. & L. Adorini (2000) 1 Alpha,25-dihydroxyvitamin D3 inhibits differentiation, maturation, activation, and survival of dendritic cells leading to impaired alloreactive T cell activation. J Immunol, 164, 2405-11. Peroni, D. G., G. L. Piacentini, E. Cametti, I. Chinellato & A. L. Boner (2011) Correlation between serum 25-hydroxyvitamin D levels and severity of atopic dermatitis in children. Br J Dermatol, 164, 1078-82. Piemonti, L., P. Monti, M. Sironi, P. Fraticelli, B. E. Leone, E. Dal Cin, P. Allavena & V. Di Carlo (2000) Vitamin D3 affects differentiation, maturation, and function of human monocyte-derived dendritic cells. J Immunol, 164, 4443-51.

67

Provvedini, D. M., C. D. Tsoukas, L. J. Deftos & S. C. Manolagas (1983) 1,25dihydroxyvitamin D3 receptors in human leukocytes. Science, 221, 1181-3. Ravetch, J. V. & B. Perussia (1989) Alternative membrane forms of Fc gamma RIII(CD16) on human natural killer cells and neutrophils. Cell type-specific expression of two genes that differ in single nucleotide substitutions. J Exp Med, 170, 481-97. Redaelli, C. A., M. Wagner, D. Günter-Duwe, Y. H. Tian, P. F. Stahel, L. Mazzucchelli, R. A. Schmid & M. K. Schilling (2002) 1alpha,25-dihydroxyvitamin D3 shows strong and additive immunomodulatory effects with cyclosporine A in rat renal allotransplants. Kidney Int, 61, 288-96. Ren, S., L. Nguyen, S. Wu, C. Encinas, J. S. Adams & M. Hewison (2005) Alternative splicing of vitamin D-24-hydroxylase: a novel mechanism for the regulation of extrarenal 1,25-dihydroxyvitamin D synthesis. J Biol Chem, 280, 20604-11. Rodriguez, M., E. Nemeth & D. Martin (2005) The calcium-sensing receptor: a key factor in the pathogenesis of secondary hyperparathyroidism. Am J Physiol Renal Physiol, 288, F253-64. Roebuck, K. A. & A. Finnegan (1999) Regulation of intercellular adhesion molecule-1 (CD54) gene expression. J Leukoc Biol, 66, 876-88. Rowling, M. J., C. M. Kemmis, D. A. Taffany & J. Welsh (2006) Megalin-mediated endocytosis of vitamin D binding protein correlates with 25-hydroxycholecalciferol actions in human mammary cells. J Nutr, 136, 2754-9. Sadeghi, K., B. Wessner, U. Laggner, M. Ploder, D. Tamandl, J. Friedl, U. Zügel, A. Steinmeyer, A. Pollak, E. Roth, G. Boltz-Nitulescu & A. Spittler (2006) Vitamin D3 down-regulates monocyte TLR expression and triggers hyporesponsiveness to pathogen-associated molecular patterns. Eur J Immunol, 36, 361-70. Safadi, F. F., P. Thornton, H. Magiera, B. W. Hollis, M. Gentile, J. G. Haddad, S. A. Liebhaber & N. E. Cooke (1999) Osteopathy and resistance to vitamin D toxicity in mice null for vitamin D binding protein. J Clin Invest, 103, 239-51. Schwende, H., Fitzke, E., Ambs, P., Dieter, P. (1996) Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and 1`,25-dihydroxyvitamin D3. J Leukoc Biol, 59, 555-61. Searing, D. A., Y. Zhang, J. R. Murphy, P. J. Hauk, E. Goleva & D. Y. Leung (2010) Decreased serum vitamin D levels in children with asthma are associated with increased corticosteroid use. J Allergy Clin Immunol, 125, 995-1000. Shimada, T., H. Hasegawa, Y. Yamazaki, T. Muto, R. Hino, Y. Takeuchi, T. Fujita, K. Nakahara, S. Fukumoto & T. Yamashita (2004) FGF-23 is a potent regulator of vitamin D metabolism and phosphate homeostasis. J Bone Miner Res, 19, 429-35. Song, Y., H. Qi & C. Wu (2007) Effect of 1,25-(OH)2D3 (a vitamin D analogue) on passively sensitized human airway smooth muscle cells. Respirology, 12, 486-94. Song, Y. H., A. K. Naumova, S. A. Liebhaber & N. E. Cooke (1999) Physical and meiotic mapping of the region of human chromosome 4q11-q13 encompassing the vitamin D binding protein DBP/Gc-globulin and albumin multigene cluster. Genome Res, 9, 581-7. Stoffels, K., L. Overbergh, A. Giulietti, L. Verlinden, R. Bouillon & C. Mathieu (2006) Immune regulation of 25-hydroxyvitamin-D3-1alpha-hydroxylase in human monocytes. J Bone Miner Res, 21, 37-47. Tandon, N. N., R. H. Lipsky, W. H. Burgess & G. A. Jamieson (1989) Isolation and characterization of platelet glycoprotein IV (CD36). J Biol Chem, 264, 7570-5. 68

Tsuchiya, S., M. Yamabe, Y. Yamaguchi, Y. Kobayashi, T. Konno & K. Tada (1980) Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer, 26, 171-6. Urry, Z., E. Xystrakis, D. F. Richards, J. McDonald, Z. Sattar, D. J. Cousins, C. J. Corrigan, E. Hickman, Z. Brown & C. M. Hawrylowicz (2009) Ligation of TLR9 induced on human IL-10-secreting Tregs by 1alpha,25-dihydroxyvitamin D3 abrogates regulatory function. J Clin Invest, 119, 387-98. Van Baelen, H., R. Bouillon & P. De Moor (1980) Vitamin D-binding protein (Gc-globulin) binds actin. J Biol Chem, 255, 2270-2. van de Stolpe, A. & P. T. van der Saag (1996) Intercellular adhesion molecule-1. J Mol Med (Berl), 74, 13-33. Van Gorp, H., P. L. Delputte & H. J. Nauwynck (2010) Scavenger receptor CD163, a Jack-ofall-trades and potential target for cell-directed therapy. Mol Immunol, 47, 165060. Vandenbroeck, K., I. Alloza, M. Gadina & P. Matthys (2004) Inhibiting cytokines of the interleukin-12 family: recent advances and novel challenges. J Pharm Pharmacol, 56, 145-60. Verstuyf, A., G. Carmeliet, R. Bouillon & C. Mathieu (2010) Vitamin D: a pleiotropic hormone. Kidney Int, 78, 140-5. Wang, T. T., B. Dabbas, D. Laperriere, A. J. Bitton, H. Soualhine, L. E. Tavera-Mendoza, S. Dionne, M. J. Servant, A. Bitton, E. G. Seidman, S. Mader, M. A. Behr & J. H. White (2010) Direct and indirect induction by 1,25-dihydroxyvitamin D3 of the NOD2/CARD15-defensin beta2 innate immune pathway defective in Crohn disease. J Biol Chem, 285, 2227-31. Wang, T. T., F. P. Nestel, V. Bourdeau, Y. Nagai, Q. Wang, J. Liao, L. Tavera-Mendoza, R. Lin, J. W. Hanrahan, S. Mader, J. H. White & J. H. Hanrahan (2004) Cutting edge: 1,25-dihydroxyvitamin D3 is a direct inducer of antimicrobial peptide gene expression. J Immunol, 173, 2909-12. White, P. & N. Cooke (2000) The multifunctional properties and characteristics of vitamin D-binding protein. Trends Endocrinol Metab, 11, 320-7. Williams, M. H., E. L. Van Alstyne & R. M. Galbraith (1988) Evidence of a novel association of unsaturated fatty acids with Gc (vitamin D-binding protein). Biochem Biophys Res Commun, 153, 1019-24. Wolf, S. F., P. A. Temple, M. Kobayashi, D. Young, M. Dicig, L. Lowe, R. Dzialo, L. Fitz, C. Ferenz & R. M. Hewick (1991) Cloning of cDNA for natural killer cell stimulatory factor, a heterodimeric cytokine with multiple biologic effects on T and natural killer cells. J Immunol, 146, 3074-81. Wright, S. D., R. A. Ramos, P. S. Tobias, R. J. Ulevitch & J. C. Mathison (1990) CD14, a receptor for complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS binding protein. Science, 249, 1431-3. Xu, H., A. Soruri, R. K. Gieseler & J. H. Peters (1993) 1,25-Dihydroxyvitamin D3 exerts opposing effects to IL-4 on MHC class-II antigen expression, accessory activity, and phagocytosis of human monocytes. Scand J Immunol, 38, 535-40. Yamamoto, N. & R. Kumashiro (1993) Conversion of vitamin D3 binding protein (groupspecific component) to a macrophage activating factor by the stepwise action of beta-galactosidase of B cells and sialidase of T cells. J Immunol, 151, 2794-802.

69

Yuk, J. M., D. M. Shin, H. M. Lee, C. S. Yang, H. S. Jin, K. K. Kim, Z. W. Lee, S. H. Lee, J. M. Kim & E. K. Jo (2009) Vitamin D3 induces autophagy in human monocytes/macrophages via cathelicidin. Cell Host Microbe, 6, 231-43. Zanetti, M. (2004) Cathelicidins, multifunctional peptides of the innate immunity. J Leukoc Biol, 75, 39-48. Zehnder, D., R. Bland, M. C. Williams, R. W. McNinch, A. J. Howie, P. M. Stewart & M. Hewison (2001) Extrarenal expression of 25-hydroxyvitamin d(3)-1 alphahydroxylase. J Clin Endocrinol Metab, 86, 888-94. Zhang, J., D. M. Habiel, M. Ramadass & R. R. Kew (2010) Identification of two distinct cell binding sequences in the vitamin D binding protein. Biochim Biophys Acta, 1803, 623-9. Zosky, G. R., L. J. Berry, J. G. Elliot, A. L. James, S. Gorman & P. H. Hart (2011) Vitamin D deficiency causes deficits in lung function and alters lung structure. Am J Respir Crit Care Med, 183, 1336-43.

Internetové zdroje: www.miltenyibiotec.com

70